CN113956242B - 一种诱导免疫原性细胞死亡的光敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导免疫原性细胞死亡的光敏剂及其制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明所述光敏剂为含有D‑π‑A结构的多苯基吡咯衍生物(命名为MAP‑I)：在吡咯的2,5‑位引入三苯胺作取代基，在吡咯3‑位引入吲哚盐作为线粒体的靶向剂，然后在分子的受体基团上引入重原子碘而得到。本发明所述光敏剂同时具有高的活性氧生成率、刺激细胞产生损伤相关分子模式、体外诱导树突状细胞以及诱导生物体内免疫原性细胞死亡过程的功能，可应用于癌症治疗领域。

Description

一种诱导免疫原性细胞死亡的光敏剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种诱导免疫原性细胞死亡的光敏剂及其制备方法和应用。
背景技术
据世界卫生组织报道，癌症逐渐成为全球发病和死亡的重要原因，严重危害着人们的健康。随着科技的进步和社会的发展，癌症的治疗方法越来越多样化，但大多数患者仍面临着肿瘤转移与复发的问题。因此，任何有效可靠的癌症治疗方法或能提升当前现有治疗方法效力的方法都对癌症患者的治疗具有实际意义。
免疫原性细胞死亡是调节性细胞死亡的一个特定变体，有应激压力驱动，可以诱导针对死亡细胞抗原的适应性免疫。被激活的免疫应答能够产生肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞，消除剩余的肿瘤细胞，杀死潜在的耐药肿瘤和肿瘤干细胞，延长病人的生存期，改善病人的预后。然而目前临床上90％以上的抗肿瘤药物都无法有效诱导免疫原性细胞死亡。因此，设计一种协同治疗策略将免疫原性细胞死亡应用于癌症治疗领域很有必要。
光动力治疗自问世以来，已被广泛应用于肿瘤的治疗。光动力治疗是由光敏剂在恰当波长照射的情况下活化并产生一定的单态氧，从而杀灭肿瘤细胞、破坏肿瘤滋养血管、激活机体抗肿瘤免疫的治疗手段，其相比传统肿瘤治疗拥有精准靶向、创伤小等很多优势。光敏剂作为光动力治疗的一个重要影响因素，其研究进展对于光动力治疗的发展起着非常重要的作用。常见的光敏剂平面性较强，在生物体系下容易发生猝灭，但是具备聚集诱导发光的光敏剂，在生物体系下分子运动受到限制，从而更高效率地产生活性氧。吡咯作为最简单的杂环之一，广泛分布在具有重要性质的天然和非天然化合物中。吡咯结构不仅具有强的给电子性能，而且吡咯环的五个位点均易于化学修饰，因此是一类很好的发光单元。然而基于吡咯来构建的光敏剂却很少。因此基于吡咯开发一种可诱导免疫原性细胞死亡的光敏剂，是一项很重要且有意义的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导免疫原性细胞死亡的光敏剂及其制备方法和应用。本发明所述光敏剂能够诱导免疫原性细胞死亡，可用作潜在的抗肿瘤药物。
本发明提供了一种诱导免疫原性细胞死亡的光敏剂，所述光敏剂的结构式如式I所示：
Figure BDA0003329581850000021
式I。
本发明还提供了上述技术方案所述光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将4-氨基苯甲酸乙酯、2,5-二甲氧基四氢呋喃和第一有机溶剂混合，反应得到4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯；将4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯、N-溴代琥珀酰亚胺和第二有机溶剂混合，反应得到4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯；将4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯、4-硼酸三苯胺、催化剂和第三有机溶剂混合，反应得到第一中间产物；所述第一中间产物的结构式如式1所示：
Figure BDA0003329581850000022
式1；
(2)将所述第一中间产物、三氯氧磷和第四有机溶剂混合，反应得到第二中间产物；所述第二中间产物的结构式如式2所示：
Figure BDA0003329581850000031
式2；
(3)将5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚、碘乙烷和第五有机溶剂混合，反应得到吲哚碘盐；所述吲哚碘盐的结构式如式3所示：
Figure BDA0003329581850000032
式3；
(4)将所述第二中间产物、所述吲哚碘盐和第六有机溶剂混合，反应得到乙基(E)-4-(2,5-双(4-(二苯基氨基)苯基)-3-(2-(1-乙基-5-碘-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-1H-吡咯-1-基)苯甲酸酯；将乙基(E)-4-(2,5-双(4-(二苯基氨基)苯基)-3-(2-(1-乙基-5-碘-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-1H-吡咯-1-基)苯甲酸酯、KPF6和第七有机溶剂混合，反应得到光敏剂MAP-I；所述MAP-I的结构式如式I所示；
所述步骤(1)、(2)和所述步骤(3)没有时间先后顺序的限定。
优选的是，所述步骤(1)中，所述第一有机溶剂包括乙酸；所述4-氨基苯甲酸乙酯和2,5-二甲氧基四氢呋喃的物质的量比为1:(0.8～1.3)；所述4-氨基苯甲酸乙酯和2,5-二甲氧基四氢呋喃反应的时间为10～14h，温度为65～75℃。
所述第二有机溶剂包括二氯甲烷；所述4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯和N-溴代琥珀酰亚胺的物质的量比为1：(2～2.5)；所述4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯和N-溴代琥珀酰亚胺的反应时间为10～14h，温度为25～35℃；
所述第三有机溶剂包括乙腈；所述催化剂包括Pd(PPh3)4；所述4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯、4-硼酸三苯胺和Pd(PPh3)4的物质的量比为1：(2～2.5)：(0.03～0.05)；所述4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯和4-硼酸三苯胺的反应时间为22～26h，温度为75～85℃。
优选的是，所述步骤(2)中，所述第四有机溶剂包括二甲基甲酰胺和二氯甲烷；所述第一中间产物和三氯氧磷的摩尔比为1:(1～1.5)；所述第一中间产物和三氯氧磷反应的时间为10～14h，温度为25～35℃。
优选的是，所述步骤(3)中，所述第五有机溶剂包括乙腈；所述5-碘-2,3,3-四甲基-3H-吲哚和碘乙烷的摩尔比为1:(2.5～4)；所述5-碘-2,3,3-四甲基-3H-吲哚和碘乙烷反应的时间为10～14h，温度为65～75℃。
优选的是，所述步骤(4)中，所述第六有机溶剂包括无水乙醇；所述第七有机溶剂包括四氢呋喃；所述第二中间产物与吲哚碘盐的摩尔比为1:(1～1.3)；所述第二中间产物与吲哚碘盐反应的时间为22～26h，温度为35～45℃；所述KPF6为KPF6饱和水溶液。
本发明还提供了上述技术方案所述光敏剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的光敏剂在制备提高活性氧产生率的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述光敏剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的光敏剂在制备促进树突状细胞成熟的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述光敏剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的光敏剂在制备靶向刺激线粒体生成TFAM蛋白的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述光敏剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的光敏剂在制备诱导免疫原性细胞死亡的药物中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述光敏剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的光敏剂在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤包括靶向标记肿瘤细胞和/或抑制肿瘤细胞。
本发明提供了一种诱导免疫原性细胞死亡的光敏剂。本发明所述光敏剂为含有D-π-A结构的多苯基吡咯衍生物(命名为MAP-I)：在吡咯的2,5-位引入三苯胺作取代基，在吡咯3-位引入吲哚盐作为线粒体的靶向剂，然后在分子的受体基团上引入重原子碘而得到。本发明所述光敏剂同时具有高的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成率、刺激细胞产生损伤相关分子模式(DAMPs)、体外诱导树突状细胞(DCs)以及诱导生物体内免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death，ICD)过程的功能，可应用于癌症治疗领域。
具体的，(1)本发明所述光敏剂表现出更加明显的聚集诱导发光(AIE)效应，并且具有更高的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生率；所述荧光染料具有典型的线粒体靶向性。
(2)本发明所述光敏剂能够在生物体内促进树突状细胞(DCs)的成熟，实现诱导抗肿瘤免疫功能，并且表现出良好的生物相容性。
(3)本发明所述光敏剂能够靶向刺激线粒体生成线粒体转录因子A(TFAM)重组蛋白来实现生物体内免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death，ICD)介导的肿瘤抑制作用。
(4)本发明所述光敏剂同时具有靶向标记和抑制肿瘤细胞的功能，可用作潜在的抗肿瘤药物。
附图说明
图1为本发明提供的MAP-I合成的总反应式；
图2为本发明提供的MAP-I核磁氢谱图；
图3为本发明提供的MAP-I质谱图；
图4为本发明实施例4提供的4T1细胞的激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laserscanning microscope，CLSM)图像；其中，A1、A2、A3：对照组(仅光照处理：照射5min(10mW/cm2，5min))；B1、B2、B3：仅用MAP-I处理；C1、C2、C3：用MAP-I(10μM)处理并照射5min(10mW/cm2，5min)；
图5为本发明实施例4提供的照射5min和培育6h后，4T1肿瘤细胞中细胞活力的CLSM图像(MAP-I的浓度＝10μM)(对照组：仅光照处理)；
图6为本发明实施例5提供的对处理后的4T1细胞上清液中TFAM的定量分析结果图；
图7为对DCs成熟标记物的染色测试以及染色结果图；其中，(A)为DCs成熟模型示意图，用于评估MAP-I的体外ICD免疫原性；(B)为不同实验条件下与4T1细胞共培养过夜后，CD80+/CD86+DC和CD3+/CD8+DC的百分比的定量分析；(对照组：不进行光照和MAP-I处理；光照组：照射5min(10mW/cm2)；MAP-I：MAP-I(10μM)处理30min；MAP-I+光照：MAP-I处理30min并照射5min)；
图8为体内肿瘤免疫模型建立及信号分析；其中，(A)为不同实验条件治疗后第24天的肿瘤图像和体积；(对照组：不进行光照和MAP-I处理；光照组：照射5min(10mW/cm2)；MAP-I：MAP-I(10μM)处理30min；MAP-I+光照：MAP-I处理30min并照射5min)；(B)为脾脏中CD80+/CD86+DC和CD3+/CD8+DC百分比的定量分析。
具体实施方式
本发明提供了一种诱导免疫原性细胞死亡的光敏剂(具有免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death，ICD)效应的近红外(Near infrared radiation，NIR)吡咯衍生物)，所述光敏剂的结构式如式I所示：
Figure BDA0003329581850000061
式I。
本发明还提供了上述技术方案所述光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将4-氨基苯甲酸乙酯、2,5-二甲氧基四氢呋喃和第一有机溶剂混合，反应得到4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯；将4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯、N-溴代琥珀酰亚胺和第二有机溶剂混合，反应得到4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯；将4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯、4-硼酸三苯胺、催化剂和第三有机溶剂混合，反应得到第一中间产物；所述第一中间产物的结构式如式1所示：
Figure BDA0003329581850000062
式1；
(2)将所述第一中间产物、三氯氧磷和第四有机溶剂混合，反应得到第二中间产物；所述第二中间产物的结构式如式2所示：
Figure BDA0003329581850000071
式2；
(3)将5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚、碘乙烷和第五有机溶剂混合，反应得到吲哚碘盐；所述吲哚碘盐的结构式如式3所示：
Figure BDA0003329581850000072
式3；
(4)将所述第二中间产物、所述吲哚碘盐和第六有机溶剂混合，反应得到乙基(E)-4-(2,5-双(4-(二苯基氨基)苯基)-3-(2-(1-乙基-5-碘-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-1H-吡咯-1-基)苯甲酸酯；乙基(E)-4-(2,5-双(4-(二苯基氨基)苯基)-3-(2-(1-乙基-5-碘-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-1H-吡咯-1-基)苯甲酸酯、KPF6和第七有机溶剂混合，反应得到光敏剂MAP-I；所述MAP-I的结构式如式I所示；
所述步骤(1)、(2)和所述步骤(3)没有时间先后顺序的限定。
本发明将4-氨基苯甲酸乙酯、2,5-二甲氧基四氢呋喃和第一有机溶剂混合，反应得到4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯。
在本发明中，4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯合成过程的反应式如式(1)所示：
Figure BDA0003329581850000073
式(1)。
在本发明中，所述第一有机溶剂优选包括乙酸，本发明对所述有机溶剂的体积没有特殊限定，使原料溶解，能够保证反应正常进行即可，后文不再赘述；所述4-氨基苯甲酸乙酯和2,5-二甲氧基四氢呋喃的物质的量比优选为1：(0.8～1.3)，更优选为1:1；所述4-氨基苯甲酸乙酯和2,5-二甲氧基四氢呋喃反应的时间优选为10～14h，更优选为12h，温度优选为65～75℃，更优选为70℃。具体的，本发明将4-氨基苯甲酸乙酯、2,5-二甲氧基四氢呋喃和乙酸混合后，优选进行回流。回流后，本发明优选进行冷却，更优选冷却至室温，本发明中所述的室温优选指25～35℃，后文提及的室温同上，后文不再赘述。冷却后，本发明优选除去溶剂，将残余物溶解在二氯甲烷中。溶解后，本发明优选使用蒸馏水进行洗涤，洗涤的次数优选为三次，洗涤后，本发明优选用二氯甲烷进行萃取。萃取后，本发明优选将有机相进行干燥，本发明所述干燥的方法优选为无水硫酸镁法，本发明用无水MgSO4干燥后，优选进行减压抽滤，取滤渣得到粗产物。得到粗产物后，本发明优选通过凝胶色谱法进行纯化，在本发明中，所述纯化优选使用二氯甲烷和石油醚的混合溶剂作为洗脱剂。在本发明中，二氯甲烷与石油醚的体积比优选为1:(4～6)。
得到4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯后，本发明将4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯、N-溴代琥珀酰亚胺和第二有机溶剂混合，反应得到4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯。
在本发明中，4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯合成过程的反应式如式(2)所示：
Figure BDA0003329581850000081
式(2)。
在本发明中，所述第二有机溶剂优选包括二氯甲烷；所述4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯和N-溴代琥珀酰亚胺的物质的量比优选为1：(2～2.5)，更优选为1:2；所述4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯和N-溴代琥珀酰亚胺的反应时间优选为10～14h，更优选为12h，温度优选为25～35℃，更优选为30℃。本发明所述反应前，优选将4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯和N-溴代琥珀酰亚胺分别用二氯甲烷溶解；溶解后，本发明优选在搅拌下，缓慢将N-溴代琥珀酰亚胺的二氯甲烷溶液滴入4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯的二氯甲烷溶液中。本发明所述反应优选在室温条件下进行，时间更优选为12h。在本发明中，所述反应后，优选还包括洗涤、萃取、干燥、过滤、蒸馏、纯化的操作。具体的，本发明所述反应得到的溶液优选用水洗涤。用水洗涤后，本发明优选使用二氯甲烷进行萃取，取有机相，用无水MgSO4进行干燥，干燥后，将干燥后的固液混合物优选进行抽滤、抽滤后取滤渣进行真空蒸馏，本发明真空蒸馏的作用是除去溶剂。除去溶剂后，本发明优选通过凝胶色谱法对除去溶剂后的固体进行纯化，本发明优选使用二氯甲烷和石油醚的混合溶剂作为洗脱剂，所述二氯甲烷与石油醚的体积比优选为1:(5～7)。
得到4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯后，本发明将4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯、4-硼酸三苯胺、催化剂和第三有机溶剂混合，反应得到第一中间产物；所述第一中间产物的结构式如式1所示：
Figure BDA0003329581850000091
式1。
在本发明中，所述第一中间产物的合成过程的反应式如式(3)所示：
Figure BDA0003329581850000092
式(3)。
在本发明中，所述第三有机溶剂优选包括乙腈；所述催化剂优选包括Pd(PPh3)4；所述4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯、4-硼酸三苯胺和Pb(PPh3)4的物质的量比优选为1:(2～2.5)：(0.03～0.05)，更优选为1:2.25:0.08；所述4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯和4-硼酸三苯胺的反应时间优选为22～26h，更优选为24h，温度优选为75～85℃，更优选为80℃。本发明将4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯、4-硼酸三苯胺、催化剂和第三有机溶剂混合后，优选加入饱和碳酸钾水溶液，在本发明中，所述饱和碳酸钾水溶液的作用为提供一个碱性的反应环境。本发明所述反应优选在保护气氛中进行，本发明对提供所述保护气氛的保护气体种类没有特殊限定，具体可以为氮气。本发明所述反应完成后，优选冷却至室温，冷却后，优选除去溶剂。除去溶剂的残余物本发明优选进行萃取、洗涤和干燥，所述萃取优选使用二氯甲烷进行，萃取后，取有机相，将有机相与水混合，进行洗涤，洗涤后，本发明优选将有机层进行无水硫酸镁干燥。干燥后，本发明优选减压去除溶剂，得到粗产物。得到粗产物后，本发明优选通过凝胶色谱法进行纯化。本发明所述纯化过程优选使用二氯甲烷和石油醚的混合溶剂作为洗脱剂。在本发明中，所述二氯甲烷与石油醚的体积比优选为1:(4～6)。
本发明将所述第一中间产物、三氯氧磷和第四有机溶剂混合，反应得到第二中间产物；所述第二中间产物的结构式如式2所示：
Figure BDA0003329581850000101
式2。
在本发明中，所述第二中间产物的合成过程的反应式如式(4)所示：
Figure BDA0003329581850000102
式(4)。
在本发明中，所述第四有机溶剂优选包括二甲基甲酰胺和二氯甲烷；所述第一中间产物和三氯氧磷的摩尔比优选为1:(1～1.5)，更优选为1:1.1；所述第一中间产物和三氯氧磷反应的时间优选为10～14h，更优选为12h，温度为25～35℃，更优选为30℃。使用二甲基甲酰胺和二氯甲烷作为第四有机溶剂时，本发明优选将三氯氧磷用二甲基甲酰胺溶解，所述溶解的条件优选为：在0℃将三氯氧磷缓慢滴入二甲基甲酰胺中，并在室温下搅拌1h；本发明优选将第一中间产物用二氯甲烷进行溶解。本发明所述第一中间产物和三氯氧磷分别溶解后，本发明优选将三氯氧磷二甲基甲酰胺溶液与第一中间产物二氯甲烷溶液混合。在本发明中，所述反应优选在搅拌条件下进行。本发明所述反应后，优选倒入水中并用二氯甲烷萃取。本发明加水的作用是洗涤。本发明使用二氯甲烷进行萃取后，优选取有机相，使用无水MgSO4进行干燥。本发明所述干燥后，优选进行抽吸过滤，所述抽吸过滤取滤渣，本发明所述抽吸过滤后，优选进行真空蒸馏，得到粗产物。本发明得到粗产物后，优选通过凝胶色谱法进行纯化，本发明所述纯化优选使用二氯甲烷和石油醚的混合溶剂作为洗脱剂，洗脱后得到白色产物。在本发明中，所述二氯甲烷与石油醚的体积比优选为1:(1～3)。
本发明将5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚、碘乙烷和第五有机溶剂混合，反应得到吲哚碘盐；所述吲哚碘盐的结构式如式3所示：
Figure BDA0003329581850000111
式3。
在本发明中，所述吲哚碘盐的合成过程的反应式如式(5)所示：
Figure BDA0003329581850000112
式(5)。
在本发明中，所述第五有机溶剂优选包括乙腈；所述5-碘-2,3,3-四甲基-3H-吲哚和碘乙烷的摩尔比优选为1:(2.5～4)，更优选为1：3.125；所述5-碘-2,3,3-四甲基-3H-吲哚和碘乙烷反应的时间优选为10～14h，更优选为12h，温度优选为65～75℃，更优选为70℃。具体的，本发明优选将5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚和碘乙烷溶解在乙腈中。本发明所述反应优选以回流的形式进行。本发明所述反应后，优选还包括冷却、过滤和洗涤的操作。在本发明中，所述冷却优选冷却至室温，优选25～35℃，更优选30℃。本发明所述冷却后优选进行过滤，取滤渣，得到粗品。本发明优选使用二氯甲烷和乙醇的混合溶剂对粗品进行洗涤，得到紫色固体产物。在本发明中，所述乙醇与二氯甲烷的体积比为优选为1:(4～6)，更优选为1:5。
本发明将所述第二中间产物、所述吲哚碘盐和第六有机溶剂混合，反应得到乙基(E)-4-(2,5-双(4-(二苯基氨基)苯基)-3-(2-(1-乙基-5-碘-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-1H-吡咯-1-基)苯甲酸酯。
在本发明中，所述乙基(E)-4-(2,5-双(4-(二苯基氨基)苯基)-3-(2-(1-乙基-5-碘-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-1H-吡咯-1-基)苯甲酸酯的合成过程的反应式如式(6)所示：
Figure BDA0003329581850000121
式(6)。
在本发明中，所述第六有机溶剂优选包括无水乙醇；所述第二中间产物与吲哚碘盐的摩尔比优选为1:(1～1.3)，更优选为1:1.08；所述第二中间产物与吲哚碘盐反应的时间优选为22～26h，更优选为24h，温度优选为35～45℃，更优选为40℃。本发明优选将第二中间产物和吲哚碘盐溶于无水乙醇进行反应。在本发明中，所述反应优选以回流的方式进行。本发明所述反应后，优选包括冷却和除去溶剂的操作。本发明除去溶剂后，优选再与四氢呋喃混合进行后续的置换反应。
本发明将乙基(E)-4-(2,5-双(4-(二苯基氨基)苯基)-3-(2-(1-乙基-5-碘-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-1H-吡咯-1-基)苯甲酸酯、KPF6和第七有机溶剂混合，反应得到光敏剂MAP-I；所述MAP-I的结构式如式I所示。
在本发明中，以乙基(E)-4-(2,5-双(4-(二苯基氨基)苯基)-3-(2-(1-乙基-5-碘-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-1H-吡咯-1-基)苯甲酸酯为原料，制备MAP-I的合成过程的反应式如式(7)所示：
Figure BDA0003329581850000122
式(7)。
在本发明中，所述第七有机溶剂优选包括四氢呋喃；所述KPF6优选为KPF6饱和水溶液。上述除去溶剂后，本发明优选将乙基(E)-4-(2,5-双(4-(二苯基氨基)苯基)-3-(2-(1-乙基-5-碘-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-1H-吡咯-1-基)苯甲酸酯溶于四氢呋喃，溶解后，本发明优选加入KPF6饱和水溶液。在本发明中，KPF6饱和水溶液的作用为置换出I-离子生成KI。在本发明中，所述置换优选在搅拌条件下进行。本发明所述置换反应后，优选除去溶剂(旋转蒸发)，得到粗产物。本发明优选通过硅胶柱色谱对粗产物进行纯化。在本发明中，所述纯化优选使用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂作为洗脱剂，洗脱得到深红色固体。在本发明中，所述甲醇与二氯甲烷的体积比优选为1:(8～15)，更优选为1:(9～12)。
在本发明中，以第二中间产物为原料，制备所述光敏剂MAP-I的总体合成过程的反应式如式(8)所示：
Figure BDA0003329581850000131
式(8)。
本发明还提供了上述技术方案所述光敏剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的光敏剂在制备提高活性氧产生率的药物中的应用。本发明所述光敏剂表现出更加明显的聚集诱导发光(AIE)效应，并且具有更高的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生率；所述荧光染料具有典型的线粒体靶向性。
本发明还提供了上述技术方案所述光敏剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的光敏剂在制备促进树突状细胞成熟的药物中的应用。本发明所述光敏剂能够在生物体内促进树突状细胞(DCs)的成熟，实现诱导抗肿瘤免疫功能，并且表现出良好的生物相容性。
本发明还提供了上述技术方案所述光敏剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的光敏剂在制备靶向刺激线粒体生成TFAM蛋白的药物中的应用。本发明所述光敏剂能够靶向刺激线粒体生成线粒体转录因子A(TFAM)重组蛋白来实现生物体内免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death，ICD)介导的肿瘤抑制作用。
本发明还提供了上述技术方案所述光敏剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的光敏剂在制备诱导免疫原性细胞死亡的药物中的应用。本发明所述光敏剂能够用于生物体内免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death，ICD)，且能够用于生物体内免疫原性细胞死亡介导的肿瘤抑制作用。
本发明还提供了上述技术方案所述光敏剂或上述技术方案所述制备方法制备得到的光敏剂在制备抗肿瘤药物中的应用，所述抗肿瘤包括靶向标记肿瘤细胞和/或抑制肿瘤细胞。本发明所述光敏剂同时具有靶向标记和抑制肿瘤细胞的功能，可用作潜在的抗肿瘤药物。
在本发明中，所述诱导免疫原性细胞死亡的光敏剂功能的验证优选使用以下方法：
(1)细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)测试以及诱导细胞凋亡的方法
4T1细胞加入MAP-I孵育后，在光源照射后加入稀释的2’,7’-二氯二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针并置于Confocal下观察。
4T1细胞与MAP-I孵育后，在光源照射后培养箱中避光过夜培养。第二天向细胞培养液中加入稀释的AM和PI探针(AM和PI分别作为活细胞和死细胞探针)，置于Confocal下观察。
当4T1细胞仅用MAP-I处理或者只有光照的条件下，细胞并没有产生绿色荧光。用MAP-I处理的4T1细胞并且在激光照射后，可以看到明亮的细胞内绿色荧光；只有光照或者MAP-I单独存在下4T1细胞均发出绿色荧光，证明细胞活性较高，而当MAP-I和光照同时存在下，细胞核部位表现出红色荧光证实细胞已经死亡。结果表明在激光刺激下，MAP-I光敏剂能够在细胞内生成ROS并且实现对细胞的杀伤。
(2)刺激细胞损伤相关分子模式(DAMPs)的释放
4T1细胞加入MAP-I孵育后，在光源下照射不同时间后置于培养箱中避光过夜培养。第二天离心后按照ELISA试剂盒(购自GenwayBiotech，货号为Tfam ELISA Kit(Mouse)(GWB-KBBOW9))分析得到样品吸光度和标准曲线。
当MAP-I和光照同时存在的情况下能够显著诱导4T1细胞产生大量的线粒体转录因子A(TFAM)重组蛋白，且光照5分钟所诱导的蛋白含量远远高于光照2分钟。结果表明MAP-I能够诱导细胞产生DAMPs，为诱导生物体内的ICD过程提供了充足的蛋白信号。
(3)体外诱导树突状细胞(DCs)的成熟
从6周Balb/c雄性小鼠腿骨中分离取得未成熟的骨髓来源的树突细胞(BMDC)，在培养皿中加入细胞悬液、GM-CSF和IL-4。将4T1细胞分为四组(对照组、光照组、MAP-I和MAP-I+光照)，并在不同实验条件下进行处理，加入BMDC共同过夜培养。第二天离心后对DC成熟的标记物CD86、CD80、CD8和CD3染色，然后用流式细胞分选技术(FACS)来进行测试。
“MAP-I+光照”实验组的CD80+/CD86+ DC和CD3+/CD8+ DC的百分比要远远高于其他三个实验组。结果表明，经MAP-I和光照处理的肿瘤细胞能够有效促进体外DCs的成熟。
(4)生物体内ICD诱导的肿瘤抑制作用：
取六周Balb/c雄性小鼠分成四组(对照组、光照组、MAP-I和MAP-I+光照)。并分别在小鼠右侧淋巴注射经过不同处理后的4T1细胞，在第4天重复以上步骤，第7天均注射4T1细胞。在第21天处死每组小鼠，并分离腋窝淋巴和脾脏组织用于流式细胞术分析。
光照组和“MAP-I”组的4T1细胞植入小鼠皮下后，会迅速成为肿瘤块，但“MAP-I+光照”实验组的小鼠，在第7天植入4T1细胞后，激活的免疫系统迅速识别“新”的4T1细胞进行吞噬，使其不具备成为肿瘤的能力。结果证明，用“MAP-I+光照”处理的细胞疫苗能有效地增强小鼠抵抗活4T1癌细胞攻击的能力；并且，“MAP-I+光照”实验组的CD80+/CD86+ DC和CD3+/CD8+ DC的百分比要远远高于其他三个实验组。这些结果表明，经过“MAP-I+光照”处理的肿瘤细胞在体内可以有效活化CD8+等T淋巴细胞。
在本发明中，步骤(1)所述4T1细胞的浓度优选为105～106个/mL；所述MAP-I的加入量优选为5～30μM；所述孵育时间优选为20～60min；所述光照强度优选为10mW/cm2，光照时间优选为5min；所述孵育时间优选为20～60min。
在本发明中，步骤(2)所述4T1细胞的浓度优选为105～106个/mL；所述MAP-I的加入量优选为5～30μM；所述光照强度优选为10mW/cm2，光照时间优选为5min；所述孵育时间优选为20～60min。
在本发明中，步骤(3)所述骨髓细胞浓度优选为1×106/mL；所述GM-CSF和IL-4的浓度分别优选为18～25ng/mL和4～5.5ng/mL；所述细胞悬液、GM-CSF和IL-4的加入量优选为10mL。
在本发明中，步骤(4)所述4T1细胞的浓度优选为106个/mL，加入量为100μL；所述MAP-I的使用量优选为10μM。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种诱导免疫原性细胞死亡的光敏剂及其制备方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
(1)第一中间产物的合成：
将4-氨基苯甲酸乙酯(1.6519g，10.00mmol)和2,5-二甲氧基四氢呋喃(1.3216g，10.00mmol)溶于25mL乙酸中，然后回流12h。冷却至室温后除去溶剂，将残余物溶解在二氯甲烷中。用水洗涤三次并用二氯甲烷萃取。用无水MgSO4干燥并通过减压抽滤得到粗产物，通过凝胶色谱法纯化，使用二氯甲烷/石油醚(1/5，Vd/Vp)混合物作为洗脱剂，得到4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯。
将4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯(1.0970g，5.10mmol)加入25mL的二氯甲烷中。N-溴代琥珀酰亚胺(1.7694g，10.00mmol)溶于5mL二氯甲烷，在搅拌下缓慢滴入4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯的二氯甲烷溶液中，在室温下反应12h。将该溶液用水洗涤并用二氯甲烷萃取，用无水MgSO4干燥并通过抽滤、真空蒸馏除去溶剂，通过凝胶色谱法纯化，使用二氯甲烷/石油醚(1/6，Vd/Vp)混合物作为洗脱剂，得到4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯。
将4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯(0.7458g，2.00mmol)、4-硼酸三苯胺(1.3011g，4.50mmol)和Pb(PPh3)4(0.0924g，0.08mmol)溶于20mL乙腈中，然后加入5mL饱和K2CO3水溶液。在氮气保护下于80℃搅拌24h，冷却至室温后除去溶剂。残余物用二氯甲烷萃取并用水洗涤，有机层用无水MgSO4干燥，减压除去溶剂得到粗产物。通过凝胶色谱法纯化，使用二氯甲烷/石油醚(1/5，Vd/Vp)混合物作为洗脱剂，得到第一中间产物。
(2)第二中间产物的合成：
在0℃将三氯氧磷(200μL，2.20mmol)缓慢滴入二甲基甲酰胺(24mL)中，并在室温下再搅拌1h。向上述溶液中加入第一中间产物(0.7343g，2.00mmol)的二氯甲烷溶液。混合物在室温搅拌12h，将反应液物倒入水(250mL)中，并用二氯甲烷萃取；然后将二氯甲烷相用无水MgSO4干燥并通过抽吸过滤，取滤渣，然后通过真空蒸馏蒸发溶剂。粗产物通过凝胶色谱法纯化，使用二氯甲烷/石油醚(1/2，Vd/Vp)作为洗脱剂，得到白色产物，简称第二中间产物。
(3)吲哚碘盐的合成：
将5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚(0.5710g,2.00mmol)和碘乙烷(0.5mL,6.25mmol)溶解在5mL乙腈中，然后回流12h。冷却至0℃后，过滤取滤渣得粗品，再用乙醇和二氯甲烷的混合溶剂(1/5，Ve/Vd)洗涤3次，得到紫色固体产物，简称吲哚碘盐。
(4)MAP-I的合成：
将第二中间产物(0.2377g，0.60mol)和吲哚碘盐(0.2866g，0.65mol)在15mL无水乙醇中回流24h，得到反应混合物乙基(E)-4-(2,5-双(4-(二苯基氨基)苯基)-3-(2-(1-乙基-5-碘-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-1H-吡咯-1-基)苯甲酸酯。将反应混合物冷却至室温后除去溶剂，溶解在5mL的四氢呋喃中，然后在体系中加入5mL的KPF6饱和水溶液。搅拌30min后，除去溶剂得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱纯化，使用甲醇/二氯甲烷混合物(1/10,Vm/Vd)作为洗脱剂，即得到所述光敏剂，称其为MAP-I。
上述合成过程的反应式如图1所示。
通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征得到的核磁氢谱和质谱数据如下：
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.27(s,1H),7.95(s,4H),7.61(s,2H),7.44-7.22(m,11H),7.19-6.94(m,16H),6.93-6.72(m,4H),4.53(s,2H),4.32(s,2H),1.58(s,6H),1.39(s,3H),1.31(s,3H).HR-MS(ESI,m/z)Calcd for C63H54IN4O2 +[M]+:1025.32860,found:1025.32825,error-0.34ppm。MAP-I的核磁氢谱图如图2所示，MAP-I质谱图如图3所示。
说明深红色固体是本发明所述的MAP-I。
实施例2
MAP-I的合成
(1)第一中间产物的合成：
将4-氨基苯甲酸乙酯(1.6519g，10.00mmol)和2,5-二甲氧基四氢呋喃(1.0573g，8.00mmol)溶于25mL乙酸中，然后回流12h。冷却至室温后除去溶剂，将残余物溶解在二氯甲烷中。用水洗涤三次并用二氯甲烷萃取。用无水MgSO4干燥并通过减压抽滤得到粗产物，通过凝胶色谱法纯化，使用二氯甲烷/石油醚(1/5，Vd/Vp)混合物作为洗脱剂，得到4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯。
将4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯(1.0970g，5.10mmol)加入25mL的二氯甲烷中。N-溴代琥珀酰亚胺(1.4155g，8.00mmol)溶于5mL二氯甲烷，在搅拌下缓慢滴入4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯的二氯甲烷溶液中，在室温下反应12h。将该溶液用水洗涤并用二氯甲烷萃取，用无水MgSO4干燥并通过抽滤、真空蒸馏除去溶剂，通过凝胶色谱法纯化，使用二氯甲烷/石油醚(1/6，Vd/Vp)混合物作为洗脱剂，得到4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯。
将4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯(0.7458g，2.00mmol)、4-硼酸三苯胺(1.1565g，4.00mmol)和Pb(PPh3)4溶(0.0693g，0.06mmol)于20mL乙腈中，然后加入5mL饱和K2CO3水溶液。在氮气保护下于80℃搅拌24h，冷却至室温后除去溶剂。残余物用二氯甲烷萃取并用水洗涤，有机层用无水MgSO4干燥，减压除去溶剂得到粗产物。通过凝胶色谱法纯化，使用二氯甲烷/石油醚(1/5，Vd/Vp)混合物作为洗脱剂，得到第一中间产物。
(2)第二中间产物的合成：
在0℃将三氯氧磷(182μL，2.00mmol)缓慢滴入二甲基甲酰胺(24mL)中，并在室温下再搅拌1h。向上述溶液中加入第一中间产物(0.7343g，2.00mmol)的二氯甲烷溶液。混合物在室温搅拌12h，将反应液物倒入水(250mL)中，并用二氯甲烷萃取；然后将二氯甲烷相用无水MgSO4干燥并通过抽吸过滤，取滤渣，然后通过真空蒸馏蒸发溶剂。粗产物通过凝胶色谱法纯化，使用二氯甲烷/石油醚(1/1，Vd/Vp)作为洗脱剂，得到白色产物，简称第二中间产物。
(3)吲哚碘盐的合成：
将5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚(0.5710g,2.00mmol)和碘乙烷(0.4mL,5mmol)溶解在5mL乙腈中，然后回流12h。冷却至0℃后，过滤取滤渣得粗品，再用乙醇和二氯甲烷的混合溶剂(1/4，Ve/Vd)洗涤3次，得到紫色固体产物，简称吲哚碘盐。
(4)MAP-I的合成：
将第二中间产物(0.2377g，0.60mol)和吲哚碘盐(0.2645g，0.65mol)在15mL无水乙醇中回流24h，得到反应混合物乙基(E)-4-(2,5-双(4-(二苯基氨基)苯基)-3-(2-(1-乙基-5-碘-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-1H-吡咯-1-基)苯甲酸酯。将反应混合物冷却至室温后除去溶剂，溶解在5mL的四氢呋喃中，然后在体系中加入5mL的KPF6饱和水溶液。搅拌30min后，除去溶剂得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱纯化，使用甲醇/二氯甲烷混合物(1/9,Vm/Vd)作为洗脱剂，即得到所述光敏剂，称其为MAP-I。通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征得到的核磁氢谱和质谱数据如下：
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.27(s,1H),7.95(s,4H),7.61(s,2H),7.44-7.22(m,11H),7.19-6.94(m,16H),6.93-6.72(m,4H),4.53(s,2H),4.32(s,2H),1.58(s,6H),1.39(s,3H),1.31(s,3H).
说明深红色固体是本发明所述的MAP-I。
实施例3
MAP-I的合成
(1)第一中间产物的合成：
将4-氨基苯甲酸乙酯(1.6519g，10.00mmol)和2,5-二甲氧基四氢呋喃(1.5859g，12.00mmol)溶于25mL乙酸中，然后回流12h。冷却至室温后除去溶剂，将残余物溶解在二氯甲烷中。用水洗涤三次并用二氯甲烷萃取。用无水MgSO4干燥并通过减压抽滤得到粗产物，通过凝胶色谱法纯化，使用二氯甲烷/石油醚(1/5，Vd/Vp)混合物作为洗脱剂，得到4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯。
将4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯(1.0970g，5.10mmol)加入25mL的二氯甲烷中。N-溴代琥珀酰亚胺(2.1233g，12.00mmol)溶于5mL二氯甲烷，在搅拌下缓慢滴入4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯的二氯甲烷溶液中，在室温下反应12h。将该溶液用水洗涤并用二氯甲烷萃取，用无水MgSO4干燥并通过抽滤、真空蒸馏除去溶剂，通过凝胶色谱法纯化，使用二氯甲烷/石油醚(1/6，Vd/Vp)混合物作为洗脱剂，得到4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯。
将4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯(0.7458g，2.00mmol)、4-硼酸三苯胺(1.4457g，5.00mmol)和Pb(PPh3)4溶(01155g，0.10mmol)于20mL乙腈中，然后加入5mL饱和K2CO3水溶液。在氮气保护下于80℃搅拌24h，冷却至室温后除去溶剂。残余物用二氯甲烷萃取并用水洗涤，有机层用无水MgSO4干燥，减压除去溶剂得到粗产物。通过凝胶色谱法纯化，使用二氯甲烷/石油醚(1/5，Vd/Vp)混合物作为洗脱剂，得到第一中间产物。
(2)第二中间产物的合成：
在0℃将三氯氧磷(273μL，3.00mmol)缓慢滴入二甲基甲酰胺(24mL)中，并在室温下再搅拌1h。向上述溶液中加入第一中间产物(0.7343g，2.00mmol)的二氯甲烷溶液。混合物在室温搅拌12h，将反应液物倒入水(250mL)中，并用二氯甲烷萃取；然后将二氯甲烷相用无水MgSO4干燥并通过抽吸过滤，取滤渣，然后通过真空蒸馏蒸发溶剂。粗产物通过凝胶色谱法纯化，使用二氯甲烷/石油醚(1/4，Vd/Vp)作为洗脱剂，得到白色产物，简称第二中间产物。
(3)吲哚碘盐的合成：
将5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚(0.5710g,2.00mmol)和碘乙烷(0.64mL,8mmol)溶解在5mL乙腈中，然后回流12h。冷却至0℃后，过滤取滤渣得粗品，再用乙醇和二氯甲烷的混合溶剂(1/6，Ve/Vd)洗涤3次，得到紫色固体产物，简称吲哚碘盐。
(4)MAP-I的合成：
将第二中间产物(0.2377g，0.60mol)和吲哚碘盐(0.3439g，0.78mol)在15mL无水乙醇中回流24h，得到反应混合物乙基(E)-4-(2,5-双(4-(二苯基氨基)苯基)-3-(2-(1-乙基-5-碘-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-1H-吡咯-1-基)苯甲酸酯。将反应混合物冷却至室温后除去溶剂，溶解在5mL的四氢呋喃中，然后在体系中加入5mL的KPF6饱和水溶液。搅拌30min后，除去溶剂得到粗产物，将其通过硅胶柱色谱纯化，使用甲醇/二氯甲烷混合物(1/12,Vm/Vd)作为洗脱剂，即得到所述光敏剂，称其为MAP-I。通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征得到的核磁氢谱和质谱数据如下：
1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝8.27(s,1H),7.95(s,4H),7.61(s,2H),7.44-7.22(m,11H),7.19-6.94(m,16H),6.93-6.72(m,4H),4.53(s,2H),4.32(s,2H),1.58(s,6H),1.39(s,3H),1.31(s,3H)。
说明深红色固体是本发明所述的MAP-I。
实施例4
细胞内ROS测试以及诱导细胞凋亡的研究
(1)2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)测试ROS
在细胞培养皿上接种105个/mL的4T1细胞至80％铺满，加入10μMMAP-I孵育30min后，在10mW/cm2的光强下照射5min，向细胞培养液中加入稀释的DCFH-DA探针(稀释1000倍)。置于Confocal下观察。
图4为4T1细胞的激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanningmicroscope，CLSM)图像；其中，A1、A2、A3：对照组(仅光照处理：照射5min(10mW/cm2，5min))；B1、B2、B3：仅用MAP-I处理；C1、C2、C3：用MAP-I(10μM)处理并照射5min(10mW/cm2，5min)。
由图4可知，当4T1细胞仅用MAP-I处理或者只有光照的条件下，细胞并没有产生绿色荧光。用MAP-I处理的4T1细胞并且在激光照射后(10mW/cm2，5min)，可以看到明亮的细胞内绿色荧光，且荧光强度是对照组和未光照组的约4.5倍。
(2)AM-PI染色实验
在细胞培养皿上接种105个/mL的4T1细胞至80％铺满，加入10μM的MAP-I孵育30min，分两次共照射5min后，于培养箱中避光过夜培养，第二天向细胞培养液中加入稀释的AM(2μM)和PI(5μM)探针。置于Confocal下观察。
图5为照射5min和培育6h后，4T1肿瘤细胞中细胞活力的CLSM图像(MAP-I的浓度＝10μM)(对照组：仅光照处理)；
选择AM和PI分别作为活细胞和死细胞染料对细胞进行染色，只有光照或者MAP-I单独存在下4T1细胞均发出绿色荧光，证明细胞活性较高。由图5可知，而当MAP-I和光照同时存在下，细胞核部位表现出红色荧光证实细胞已经死亡。结果表明在激光刺激下，MAP-I光敏剂能够在细胞内生成ROS并且实现对细胞的杀伤。
实施例5
实现生物体内ICD介导的肿瘤抑制作用
(1)刺激细胞DAMPs的释放
TFAM是一种高度丰富的线粒体蛋白，在各种类型的细胞死亡和组织损伤中与原型核DAMPs在结构上相关，是一种诱导ICD的重要蛋白。
将105个/mL的4T1细胞种植于培养皿上，加入10μM的MAP-I孵育30min后在10mW/cm2的光强下照射不同时间，之后避光放置于培养箱中过夜培养。第二天取培养液用10KDa的浓缩管进行离心浓缩20min，分别得到标准曲线和样品吸光值。
图6为对处理后的4T1细胞上清液中TFAM的定量分析结果图。如图6所示，从左到右对照组(不进行光照也不进行MAP-I处理)、MAP-I组、光照组、MAP-I+光照组(2分钟)和MAP-I+光照组(5分钟)的TFAM表达量分别为0.00206ng/mL、0.02612ng/mL、0.2268ng/mL、0.31821ng/mL和1.09828ng/mL。当MAP-I和光照同时存在的情况下能够显著诱导4T1细胞产生大量的TFAM蛋白，且光照5min所诱导的蛋白含量远远高于光照2min。结果表明MAP-I能够诱导细胞产生DAMPs，为诱导生物体内的ICD过程提供了充足的蛋白信号。
(2)体外诱导DCs的成熟
DCs是一种重要的抗原提呈细胞，它的成熟是肿瘤细胞能够发生ICD诱导抗肿瘤免疫过程的关键环节。
图7为对DCs成熟标记物的染色测试以及染色结果图；其中，(A)为DCs成熟模型示意图，用于评估MAP-I的体外ICD免疫原性；(B)为不同实验条件下与4T1细胞共培养过夜后，CD80+/CD86+DC和CD3+/CD8+DC的百分比的定量分析；(对照组：不进行光照也不进行MAP-I处理；光照组：照射5min(10mW/cm2)；MAP-I组：MAP-I(10μM)处理30min；MAP-I+光照组：MAP-I处理30min并照射5min)；
图7中的A实验流程的模型示意图，取6周Balb/c雄性小鼠腿骨，得到未成熟的骨髓来源的树突细胞(BMDC)，准备好已经80％贴壁的4T1细胞以四组不同的实验条件进行处理。将未成熟的BMDC吹打于细胞液中，转移至4T1细胞培养皿过夜培养。第二天吹打得到的细胞，经过离心洗去培养液，将细胞与Anti-CD80/FITC和Anti-CD86/PE混合并置于冰上，对DC成熟的标记物CD86、CD80、CD8和CD3染色40min，用PBS离心洗去多余抗体，然后用流式细胞分选技术(FACS)来进行测试。
如图7中的B所示，“MAP-I+光照”实验组的CD80+/CD86+ DC(≈30.8％)和CD3+/CD8+DC(≈25.5％)的百分比要远远高于其他三个实验组(对照组≈5.1％，6.0％；光照组≈6.4％，5.8％；MAP-I≈5.7％，5.4％)。这些结果表明，经MAP-I和光照处理的肿瘤细胞能够有效促进体外DCs的成熟。
(3)生物体内诱导ICD过程
取六周Balb/c雄性小鼠分成四组，每组5只，分别命名为“对照组、光照组、MAP-I和MAP-I+光照”。分别在小鼠右侧淋巴注射：对照组注射4T1细胞(106个/mL，100μL)；光照组注射光照5min的4T1细胞(106个/mL，100μL)；“MAP-I”组注射与MAP-I(10μM)共培养的4T1细胞(106个/mL，100μL)；“MAP-I+光照”组注射与MAP-I(10μM)共培养30min、光照5min的4T1细胞(106个/mL，100μL)。将第一次注射记为第0天，之后在第4天重复以上步骤，并在第7天的四组均注射正常4T1细胞，中间不断观察并通过直尺测量肿瘤大小，直到第21天。在第21天处死每组小鼠，并分离腋窝淋巴和脾脏组织用于流式细胞术分析。
图8为体内肿瘤免疫模型建立及信号分析；其中，(A)为不同实验条件治疗后第24天的肿瘤图像和体积；(对照组：不进行光照也不进行MAP-I处理；光照组：照射5min(10mW/cm2)；MAP-I组：MAP-I(10μM)处理30min；MAP-I+光照组：MAP-I处理30min并照射5min)；(B)为脾脏中CD80+/CD86+DC和CD3+/CD8+DC百分比的定量分析。
如图8所示，只有MAP-I和光照处理的4T1细胞植入小鼠皮下后，会迅速成为肿瘤块，但MAP-I与4T1共培养并用光照处理的实验组的细胞免疫小鼠，在第7天植入4T1细胞后，激活的免疫系统迅速识别“新”的4T1细胞进行吞噬，使其不具备成为肿瘤的能力。结果证明，用“MAP-I+光照”处理的细胞疫苗能有效地增强小鼠抵抗活4T1癌细胞攻击的能力；“MAP-I+光照”实验组的CD80+/CD86+ DC(≈30.1％)和CD3+/CD8+ DC(≈26.4％)的百分比要远远高于其他三个实验组(对照组≈8.5％，11.5％；光照组≈9.2％，13.4％；MAP-I≈7.5％，12.5％)。这些结果表明，“MAP-I+光照”处理的肿瘤细胞在体内可以有效活化CD8+等T淋巴细胞。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种光敏剂在制备提高活性氧产生率或促进树突状细胞成熟的药物中的应用，其特征在于，所述光敏剂的结构式如式I所示：
Figure FDA0003745407890000011
2.一种光敏剂在制备靶向刺激线粒体生成TFAM蛋白的药物中的应用，其特征在于，所述光敏剂的结构式如式I所示：
Figure FDA0003745407890000012
3.一种光敏剂在制备诱导免疫原性细胞死亡的药物中的应用，其特征在于，所述光敏剂的结构式如式I所示：
Figure FDA0003745407890000013
4.如权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述光敏剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将4-氨基苯甲酸乙酯、2,5-二甲氧基四氢呋喃和第一有机溶剂混合，反应得到4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯；将4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯、N-溴代琥珀酰亚胺和第二有机溶剂混合，反应得到4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯；将4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯、4-硼酸三苯胺、催化剂和第三有机溶剂混合，反应得到第一中间产物；所述第一中间产物的结构式如式1所示：
Figure FDA0003745407890000021
(2)将所述第一中间产物、三氯氧磷和第四有机溶剂混合，反应得到第二中间产物；所述第二中间产物的结构式如式2所示：
Figure FDA0003745407890000022
(3)将5-碘-2,3,3-三甲基-3H-吲哚、碘乙烷和第五有机溶剂混合反应得到吲哚碘盐；所述吲哚碘盐的结构式如式3所示：
Figure FDA0003745407890000023
(4)将所述第二中间产物、所述吲哚碘盐和第六有机溶剂混合，反应得到乙基(E)-4-(2,5-双(4-(二苯基氨基)苯基)-3-(2-(1-乙基-5-碘-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-1H-吡咯-1-基)苯甲酸酯；将乙基(E)-4-(2,5-双(4-(二苯基氨基)苯基)-3-(2-(1-乙基-5-碘-3,3-二甲基-3H-1λ4-吲哚-2-基)乙烯基)-1H-吡咯-1-基)苯甲酸酯、KPF6和第七有机溶剂混合，反应得到光敏剂MAP-I；所述MAP-I的结构式如式I所示；
所述步骤(1)和所述步骤(3)没有时间先后顺序的限定。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，所述第一有机溶剂为乙酸；所述4-氨基苯甲酸乙酯和2,5-二甲氧基四氢呋喃的物质的量比为1：(0.8～1.3)；所述4-氨基苯甲酸乙酯和2,5-二甲氧基四氢呋喃反应的时间为10～14h，温度为65～75℃；
所述第二有机溶剂为二氯甲烷；所述4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯和N-溴代琥珀酰亚胺的物质的量比为1:(2～2.5)；所述4-(1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯和N-溴代琥珀酰亚胺的反应时间为10～14h，温度为25～35℃；
所述第三有机溶剂为乙腈；所述催化剂为Pd(PPh3)4；所述4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯、4-硼酸三苯胺和Pd(PPh3)4的物质的量比为1:(2～2.5)：(0.03～0.05)；所述4-(2,5-二溴-1H-吡咯-1-基)苯甲酸乙酯和4-硼酸三苯胺的反应时间为22～26h，温度为75～85℃。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，所述第四有机溶剂为二甲基甲酰胺和二氯甲烷；所述第一中间产物和三氯氧磷的摩尔比为1:(1～1.5)；所述第一中间产物和三氯氧磷反应的时间为10～14h，温度为25～35℃。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，所述第五有机溶剂为乙腈；所述5-碘-2,3,3-四甲基-3H-吲哚和碘乙烷的摩尔比为1:(2.5～4)；所述5-碘-2,3,3-四甲基-3H-吲哚和碘乙烷反应的时间为10～14h，温度为65～75℃。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，所述第六有机溶剂为无水乙醇；所述第七有机溶剂为四氢呋喃；所述第二中间产物与吲哚碘盐的摩尔比为1:(1～1.3)；所述第二中间产物与吲哚碘盐反应的时间为22～26h，温度为35～45℃；所述KPF6为KPF6饱和水溶液。
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