CN108070275B - 方酸染料类化合物、制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了方酸染料类化合物、制备方法及用途。该方酸染料类化合物为式I所示的化合物，其中的R1和R2、m以及n具有说明书中所记载的含义。该方酸染料类化合物具有吸收波长长、吸收强度高、生物毒性小等特点，能够满足光敏剂的要求。
Description
技术领域
本发明涉及光敏剂领域，具体地，涉及方酸染料类化合物、制备方法及用途。
背景技术
光动力治疗(Photodynamic therapy，PDT)是利用光敏剂分子选择性地聚集在肿瘤细胞中，在特定波长的光照射下，光敏剂分子通过光化学反应和能量传递过程将光能转化为分子内能，在有氧条件下，产生多种活性氧，通过不可逆的氧化作用攻击细胞膜、线粒体、溶酶体等细胞结构和蛋白质、脂类等生物大分子物质甚至损伤DNA的分子结构，引起脂质过氧化、酶的失活和蛋白质的变性、交联以至结构的改变，从而破坏细胞(肿瘤细胞)的结构和功能。活性氧(reactive oxygen species，ROS)包括单线态氧(1O2)、氧自由基、羟自由基等。PDT与三大传统的肿瘤治疗手段相比，光动力学治疗癌症的方法具有副作用小，选择性高的优点。
光敏剂本身并无毒性，但当其在特定波长的光照且有氧的环境中，即能产生出使癌细胞失去活性的致命的毒性物质。因此，只有吸收了光敏剂的细胞，且有光和氧时才会产生毒性效应。而光敏剂分子首先是选择性地聚集在肿瘤细胞中的，再通过特定的对病变组织部位进行光照并保持其他部位处于暗环境中，实现PDT的双重选择。因此，PDT只会对病灶起作用而不会影响其它部位。对靶组织及损伤程度具有可选择性，可减少正常组织的损伤。光动力作用的发生需要光敏剂、适当波长的光、适当浓度的氧和适当的温度四个条件同时存在。
然而，目前的光敏剂以及可以用于光动力治疗的光敏剂化合物，仍有待改进。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
理想的光敏剂需要满足下列要求：化学组成单一，结构明确且性质稳定；在肿瘤中达到最大浓度的时间短，代谢快；在600-800nm波长范围内有较强的吸收，以利于采用穿透性强的光源进行照射；单线态氧及其他活性氧物质产率高；对生物体安全无毒，暗毒性低，只有在光照下才具有细胞毒性作用，药物能被癌组织特异性吸收和贮存，皮肤光毒作用小；代谢快，副作用少。而目前的光敏剂仍不能完全满足上述要求。发明人经过深入研究以及大量实验发现，方酸染料是一类具有长的吸收和发射波长的花菁类染料，其在近红外区具有尖锐和强烈的紫外吸收以及优异的光学性质，如良好的光稳定性、摩尔消光系数大、荧光量子产率高、吸收和发射波长位于近红外区等。因此，方酸染料类化合物适于做为光敏剂使用。
本发明旨在至少在一定程度上解决以上相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出一种方酸染料类化合物。该方酸染料类化合物为式I所示的化合物：
其中，R1和R2分别独立地为H、羟基、任选取代的氨基、羧基、酯基、酰胺、烷基或烷氧基；m和n分别独立地为0、1、2、3或者4。具有上述结构的方酸染料类化合物具有与人血清蛋白结合较弱、吸收波长以及荧光发射波长较长，生物组织穿透能力强、生物毒性小等优点的至少之一。
根据本发明的实施例，所述烷基为C1-10的直链烷基、支链烷基、取代环烷基或为取代的含有杂原子的环烷基。
根据本发明的实施例，所述杂原子包括O、S、以及N的至少之一。
根据本发明的实施例，所述任选取代的氨基为氨基或C1-6的烷基双取代氨基。
根据本发明的实施例，R1和R2分别独立地为H、羟基、氨基、羧基、甲酰胺基、甲酯基或异丙基。
根据本发明的实施例，所述方酸染料类化合物为式(1)～(28)所示的化合物：
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备前面所述的方酸染料类化合物的方法。该方法包括：使式(II)所示化合物与式(III)所示化合物反应，以便获得所述方酸染料类化合物：
其中，所述R为所述R1或者所述R2，P为0、1、2、3或者4。该方法能够简单、快捷、成本低廉的获得上述方酸染料类化合物。
根据本发明的实施例，式(II)所示化合物与式(III)所示化合物的所述反应是在100～150摄氏度下进行的，所述反应时间为20～36小时。
根据本发明的实施例，式(II)所示化合物是由方酸乙二酯与在无水苯中，与丙二腈以及三乙胺反应获得的。
根据本发明的实施例，式(III)所示化合物是由2-甲基-1,3-苯并噻唑与RX反应获得的，所述反应的温度为100～150摄氏度，反应时间2～8小时，其中，X为Cl、Br或者I。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种光敏剂。根据本发明的实施例，该光敏剂含有前面所述的方酸染料类化合物。由此，该光敏剂具有与人血清蛋白结合较弱、吸收波长以及荧光发射波长较长，生物组织穿透能力强、生物毒性小等优点的至少之一。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述的方酸染料类化合物或所述的光敏剂在制备药物中的用途，所述药物用于光动力疗法治疗肿瘤。
附图说明
图1显示了根据本发明实施例的化合物的光谱学性能测试结果；
图2显示了根据本发明实施例的化合物与人血清白蛋白结合能力的测试结果；
图3显示了根据本发明实施例的化合物产生单线态氧能力的测试结果；
图4显示了根据本发明实施例的化合物暗毒性的测试结果；
图5显示了根据本发明实施例的化合物光毒性的测试结果；
图6显示了根据本发明实施例的化合物细胞膜通透性实验的测试结果；
图7显示了根据本发明实施例的化合物细胞内成像的测试结果；
图8显示了根据本发明实施例的化合物的细胞凋亡实验的测试结果；
图9显示了根据本发明实施例的化合物活体成像的测试结果；
图10显示了根据本发明实施例的化合物采用静脉注射和腹腔注射后的组织分布结果；
图11显示了根据本发明实施例的化合物的光动力学治疗实验的测试结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种方酸染料类化合物。该化合物具有符合式I所示的通式的化合物。
其中，R1和R2分别独立地为H、羟基、任选取代的氨基、羧基、酯基、酰胺、烷基或烷氧基，m和n分别独立地为0、1、2、3或者4。也即是说，R1和R2可以相同，也可以不同。m以及n的取值也可以相同，也可以不相同。
根据本发明的实施例，R1和R2可以分别独立地为C1-10的直链烷基、支链烷基、取代或为取代的含有杂原子的环烷基。当R1或R2分别独立地为含有杂原子的环烷基时，环烷基中的杂原子可以为O、S、以及N的至少之一。具体的，R1和R2可以分别独立地为碳数小于6的直链或支链烷基。根据本发明的另一些实施例，R1和R2还可以分别独立的为氨基，或是为烷基取代的氨基。根据本发明的具体实施例，R1和R2可以分别独立地为C1-6的烷基双取代氨基。
根据本发明的实施例，R1和R2还可以分别独立地为H、羟基、氨基、羧基、甲酰胺基、甲酯基或异丙基。
根据本发明的一些实施例，上述方酸染料类化合物还可以为式(1)～(28)所示的化合物：
上述化合物的吸收波长在600～800nm，因此可采用穿透性较强的光进行照射，有利于提高光动力学治疗的效果；其荧光发射波长位于700～900nm，处于近红外区。具有上述结构的方酸染料类化合物具有吸收波长、吸收强度高、生物毒性小等特点，能够满足光敏剂的要求。
根据本发明的实施例，将上述双氰甲叉基功能化的方酸染料类化合物(做为光敏剂)导入肿瘤发生部位，使肿瘤细胞与该化合物直接作用，并对肿瘤细胞实施波长650至750nm的激光照射。在光照作用下，光敏剂对肿瘤细胞表现出明显的生长抑制，诱导肿瘤细胞发生凋亡。当给药浓度为10μmol/L时，肿瘤细胞生长抑制率可高达80％以上。并且，在细胞模型和荷瘤小鼠模型中，均验证了上述方酸染料类化合物用于光动力学治疗的可行性，并取得了较为理想的效果。
在本发明的另一方面，本发明提出了制备前面所述的方酸染料类化合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使式(II)所示化合物与式(III)所示化合物反应：
其中，R为前面描述的R1或者R2，P可以为0、1、2、3或者4。由此，可以获得前面所述的芳酸类染料化合物。
具体的，根据本发明的实施例，上述R可以为H、羟基、任选取代的氨基、羧基、酯基、酰胺、烷基或烷氧基。本领域技术人员可以根据需要制备的前面描述的芳酸类染料化合物的具体结构，对R的类型进行选择。例如，根据本发明的具体实施例，R可以为C1-10的直链烷基、支链烷基、取代或为取代的含有杂原子的环烷基，其中，杂原子可以为O、S、以及N的至少之一；或者，R可以为氨基，或是为烷基取代的氨基，例如，可以为C1-6的烷基双取代氨基。根据本发明的一些实施例，R还可以为H、羟基、氨基、羧基、甲酰胺基、甲酯基或异丙基。
根据本发明的实施例，式(II)所示化合物与式(III)所示化合物发生反应的反应温度可以为100～150摄氏度，反应时间可以为20～36小时。例如，根据本发明的具体实施例，反应温度可以为120摄氏度，反应时间可以为24小时。可以采用甲苯、正丁醇以及喹啉的混合溶液做为溶剂，加入式(II)所示化合物和式(III)所示化合物并使式(II)所示化合物和式(III)所示化合物发生反应。当反应体系冷却至室温后，将反应后的溶液加入到过量的乙醚中进行离心。离心分离出的沉淀经硅胶色谱柱以及液相色谱进行分离之后，即可获得前面所述的方酸染料类化合物。
根据本发明的实施例，式(II)所示化合物可以是由方酸乙二酯与在无水苯中，与丙二腈以及三乙胺反应获得的，方酸乙二酯、丙二腈以及三乙胺在无水苯中的浓度可以相同。具体的，将方酸乙二酯溶解在无水苯中并不断搅拌，加入丙二腈后五分钟内逐滴加入三乙胺，形成乳浊液。乳浊液在室温下搅拌30分钟后旋转蒸发掉溶剂，即可获得式(II)所示化合物的粗品。粗品用硅胶柱色谱纯化后即可获得式(II)所示化合物。
式(III)所示化合物可以是由2-甲基-1,3-苯并噻唑与RX反应获得的，其中，X为Cl、Br或者I。反应的温度可以为100～150摄氏度，反应时间2～8小时。根据本发明的具体实施例，可以将2-甲基-1,3-苯并噻唑与RX混合后，在120摄氏度下反应5小时。混合物中，2-甲基-1,3-苯并噻唑与RX的浓度可以相等。随后，可以相反应后的混合物中加入大量的石油醚并过滤，获得的沉淀即为式(III)所示化合物。
上述方法合成步骤简单，成本低廉，合成周期较短，有利于快速、高效制备前面描述的方酸染料类化合物。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种光敏剂。根据本发明的实施例，该光敏剂含有前面所述的方酸染料类化合物。由此，该光敏剂具有与人血清蛋白结合较弱、吸收波长以及荧光发射波长较长，生物组织穿透能力强、生物毒性小等优点的至少之一。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述的方酸染料类化合物或所述的光敏剂在制备药物中的用途，所述药物用于光动力疗法治疗肿瘤。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下面所描述的实施例，除非另有说明，所有的温度定为摄氏度。所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
实施例1：化合物E1的合成：
(1)将340mg方酸二乙酯溶解在9mL的无水苯中并不断搅拌，加入132mg丙二腈后五分钟内逐滴加入0.26mL三乙胺。乳浊液在室温下搅拌30分钟后旋转蒸发掉溶剂，粗产品用硅胶柱色谱纯化，乙酸乙酯：甲醇＝10:1作为淋洗剂，得到500mg的化合物A，产率86％。化合物A的结构如下：
化合物A的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz，MeOD)δ4.73(q，J＝7.1Hz，2H)，3.24(q，J＝7.3Hz，5H)，1.46(t，J＝7.1Hz，3H)，1.33(t，J＝7.3Hz，8H)。
(2).2-甲基-1，3-苯并噻唑与4-溴丁酸甲酯混合后(混合溶液中2-甲基-1，3-苯并噻唑与4-溴丁酸甲酯的了浓度均为6.7mmol)，在120摄氏度下加热5小时；反应完毕后加入大量石油醚，过滤沉淀得到最终产品化合物B1的质量为1.1g，产率61％。化合物B1的结构为：
化合物B1的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.72(s,1H)，8.44(d,1H)，7.79(s,1H)，7.88(d,1H)，7.21(d,1H)，4.74(m,2H)，3.21(s,3H)，2.3l(t,2H)，1.90(m,2H)，1.68(m,2H)，2.35(s,3H)。
(3)以甲苯：正丁醇：喹啉＝5:5:1为溶剂，将542mg的化合物B1和291mg化合物A加入到100ml溶剂中，在配有分水器的装置中反应8小时。冷却至室温后，反应体系加入到过量的乙醚中，离心的分离出沉淀，以二氯甲烷：甲醇＝4:1作为淋洗剂，用硅胶柱色谱分离得到化合物E1的粗产品。粗产品使用高效液相色谱分离，以0.1mM的醋酸三乙胺/甲醇做淋洗剂梯度洗脱，产率为45％。化合物E1的结构为：
化合物E1的核磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)7.96(3H,m,J 16.2,8.2),7.67(1H,s),7.52(1H,s),7.35(1H,d,J 7.5),7.27(2H,d,J 8.4),6.14(1H,s),4.22(1H,s),3.74(6H,s),3.56(4H,t),2.00(4H,s),1.24(4H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+624.14959，与计算获得的C33H28N4O5S2[M]+624.15011相符。
实施例2：化合物E2的合成：
(1)步骤(1)同实施例1。
(2)步骤(2)同实施例1，所不同的是，采用碘甲烷代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B2，产率：95％。化合物B2的结构为：
化合物B2的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.49(d,1H),8.19(d,1H),7.98(s,1H),7.35(s,1H),7.09(s,1H)，4.39(s,3H)，3.79(s,3H)。
(3)步骤(3)同实施例1，所不同的是，采用实施例1中获得的化合物B1和步骤(2)中获得的化合物B2的混合物(摩尔比为1:1)代替化合物B1，得到化合物E2产品。产率：52％，化合物E1的结构为：
化合物E2的核磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,HDMSO)7.96(2H,d,J 7.8),7.67(2H,d,J 8.3),7.55(2H,t,J7.2),7.36(2H,t,J7.5),7.21(1H,s),6.64(1H,s),6.14(2H,s),3.73(6H,s),2.04(4H,m).
HRMS(EI-TOF)[M]+538.11291，与计算获得的C29H22N4O3S2[M]+538.11333相符。
实施例3：化合物E3的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例2相同。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是用化合物B2代替化合物B1，得到化合物E3，产率：63％。化合物E3的结构为：
化合物E3的核磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.42(2H,d,J 8.4),8.29(2H,d,J 8.5),7.92(2H,t,J7.8),7.81(2H,t,J 7.7),7.19(1H,s),6.65(1H,s),4.20(6H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+452.07582，与计算获得的C25H16N4OS2[M]+452.07655相符。
实施例4：化合物E4的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B4，产率：20％。化合物B4结构式为：
化合物B2的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.72(s,1H)，8.44(d,1H)，7.79(s,1H)，7.88(d,1H)，7.21(d,1H)，4.74(m,2H)，3.21(s,3H)，2.3l(t,2H)，1.90(m,2H)，2.35(s,3H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B4代替化合物B1，得到化合物E4产品。产率：31％。化合物E4的结构为：
化合物E4的核磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,HDMSO)8.18(2H,d,J 7.8),7.34(2H,d,J 8.3),7.56(2H,t,J7.2),7.48(2H,t,J7.5),7.29(1H,s),7.21(1H,s),3.45(6H,s),2.74(8H,m).
HRMS(EI-TOF)[M]+596.12883，与计算获得的C31H24N4O5S2[M]+596.11881相符。
实施例5：化合物E5的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B5。产率：21％，化合物B5结构式为：
化合物B5的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.72(s,1H)，8.44(d,1H)，7.79(s,1H)，7.88(d,1H)，7.21(d,1H)，4.74(m,2H)，3.21(s,3H)，1.90(m,2H)，2.35(s,3H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B5代替化合物B1，得到化合物E5产品，产率：15％；化合物E5的结构为：
化合物E4的核磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,HDMSO)8.60(2H,t,J 7.2),7.99(2H,d,J 8.3),7.88(2H,d,J7.8),7.29(1H,s),7.56(2H,t,J 7.5),7.21(1H,s),3.66(6H,s),2.74(4H,m).
HRMS(EI-TOF)[M]+568.62837，与计算获得的C31H20N4O5S2[M]+568.62200相符。
实施例6：化合物E6的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用4-溴丁酸代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B6。产率：60％。化合物B6结构式为：
化合物B6的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.20(br.s,1H),8.32,8.44(2d,2H,J＝8.5,a r＝8.2)；7.79,7.88(2m,2H)；4.74(m,2H)；3.21(s,3H)；2.3l(t,2H)；1.90(m,2H)；1.68(m,2H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B6代替化合物B1，得到化合物E6产品。产率：37％。化合物E6的结构为：
化合物E6的核磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,HDMSO)12.01(2H,s),8.60(2H,t,J 7.2),7.99(2H,d,J 8.3),7.88(2H,d,J 7.8),7.56(2H,t,J 7.5),7.48(1H,s),7.21(1H,s),2.3(8H,m),1.89(4H,m).
HRMS(EI-TOF)[M]+596.62368，与计算获得的C31H24N4O5S2[M]+596.67600相符。
实施例7：化合物E7的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用4-溴丙酸代替4-溴丁酸甲酯，反应完毕后加入大量石油醚，过滤沉淀，然后用氢溴酸水解得到化合物B7。产率：45％。
化合物B7结构式为：
化合物B7的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.38(br.s,1H)；8.40,8.48(2d,2H)；7.81,7.92(2m,2H),4.75(m,2H)；3.23(s,3H)；2.55(t,2H)；2.10(m,2H)。
(3)步骤(3与实施例1相同，所不同的是，用化合物B7代替化合物B1，得到化合物E7产品。产率：22％；化合物E7的结构为：
化合物E7的核磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,HDMSO)12.27(2H,s),8.60(2H,t,J 7.2),7.88(2H,d,J 8.3),7.78(2H,d,J 7.8),7.55(2H,t,J 7.5),7.34(1H,s),7.31(1H,s),2.6(8H,m).
HRMS(EI-TOF)[M]+568.63670，与计算获得的C31H20N4O5S2[M]+568.62200相符。
实施例8：化合物E8的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用4-溴乙酸甲酯代替4-溴丁酸甲酯，反应完毕后加入大量石油醚，过滤沉淀，然后用氢溴酸水解得到化合物B8。产率：29％。化合物B8结构式为：
化合物B8的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.38(br.s,1H)，8.40,8.48(2d,2H)，7.81,7.92(2m,2H)，4.75(m,2H)，3.23(s,3H)，2.55(t,2H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，采用化合物B8代替化合物B1，得到化合物E8产品。产率：25％。化合物E8的结构为：
化合物E8的核磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,HDMSO)12.22(2H,s),8.60(2H,t,J 7.2),8.23(2H,d,J 8.3),7.78(2H,d,J 7.8),7.55(2H,t,J 7.5),7.44(1H,s),7.42(1H,s),2.6(4H,m).
HRMS(EI-TOF)[M]+540.55019，与计算获得的C27H16N4O5S2[M]+540.56800相符。
实施例9：化合物E9的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用4-溴丁酸甲酰胺代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B9。产率：30％。化合物B7结构式为：
化合物B7的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.6(d,1H),8.23(dd,1H),7.99(d,J＝8.2Hz,1H),7.5(dd,1H),7.34(d,1H),5.01(t,2H)，2.8(s,3H)，2.34(t,2H)，2.31(s,3H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是采用化合物B9代替化合物B1，得到化合物E9产品。产率：15％；化合物E9的结构为：
化合物E9的核磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.60(2H,m),7.88(1H,s),7.52(1H,s),7.34(1H,d,J 7.5),7.53(2H,s)7.29(2H,d,J 8.4),6.74(1H,s),5.02(1H,s),3.77(6H,s),3.56(4H,t),2.34(4H,s),1.24(4H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+622.70195，与计算获得的C33H30N6O3S2[M]+622.76200相符。
实施例10：化合物E10的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B10。产率：19％。化合物B8结构式为：
化合物B8的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.6(d,1H),8.23(dd,1H),7.99(d,J＝8.2Hz,1H),7.5(dd,1H),7.34(s,1H),5.31(d,J＝8.2Hz,2H),2.92(d,2H),2.8(s,3H)，2.35(s,3H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是用化合物B8代替化合物B1，得到化合物E10产品。产率：38％。化合物E10的结构为：
化合物E10的核磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.62(2H,m),7.79(1H,s),7.56(1H,s),7.23(1H,d,J 7.5),7.33(2H,s)7.29(2H,d,J 8.4),6.60(1H,s),6.02(1H,s),3.77(6H,s),3.56(4H,t),2.24(4H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+594.75109，与计算获得的C31H26N6O3S2[M]+594.70800相符。
实施例11：化合物E11的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B11。产率：13％。化合物B11结构式为：
化合物B11的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.6(d,1H),8.23(dd,1H),7.99(d,J＝8.2Hz,1H),7.5(dd,1H),7.34(s,1H),5.44(d,J＝8.2Hz,2H),2.8(s,3H)，2.35(s,3H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B11代替化合物B1，得到化合物E11产品。产率：21％；化合物E11的结构为：
化合物E11的核磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.62(2H,m),7.79(1H,s),7.56(1H,s),7.23(1H,d,J 7.5),7.33(2H,s)7.29(2H,d,J 8.4),6.60(1H,s),6.02(1H,s),3.77(6H,s),3.56(4H,t),2.24(4H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+594.75109，与计算获得的C31H26N6O3S2[M]+594.70800相符。
实施例12：化合物E12的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物D12。产率：19％。化合物B12结构式为：
化合物B12的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.56(d,1H),8.43(dd,1H),7.59(d,J＝8.2Hz,1H),7.25(dd,1H),7.34(d,1H),5.11(t,2H)，4.14(t,2H)，3.48(s,2H)，2.32(t,2H)，1.51(s,3H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是用化合物B12代替化合物B1，得到化合物E12产品。产率：22％；化合物E12的结构为：
化合物E12的核磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.23(2H,m),7.98(1H,s),7.48(1H,s),7.34(1H,d,J 7.5),7.53(2H,s)7.29(2H,d,J 8.4),6.07(1H,s),5.02(1H,s),4.14(2H,s),3.56(4H,t),2.34(4H,s),1.24(4H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+568.70153，与计算获得的C31H28N4O3S2[M]+568.71000相符。
实施例13：化合物E13的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B13。产率：11％。化合物B13结构式为：
化合物B13的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.56(d,1H),8.43(dd,1H),7.59(d,J＝8.2Hz,1H),7.25(dd,1H),7.34(d,1H),5.11(t,2H)，4.14(t,2H)，3.48(s,2H)，2.32(t,2H)，1.51(s,3H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是用化合物B13代替化合物B1，得到化合物E13产品。产率：12％；化合物E13的结构为：
化合物E13的核磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.53(2H,m),7.79(1H,s),7.57(1H,s),7.34(1H,d,J 7.5),7.53(2H,s)7.29(2H,d,J 8.4),6.07(1H,s),5.02(1H,s),4.55(2H,s),3.56(4H,t),2.34(4H,s),1.24(4H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+540.67213，与计算获得的C29H24N4O3S2[M]+540.65600相符。
实施例14：化合物E14的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B14。产率：23％，化合物B14结构式为：
化合物B14的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(d,1H),8.13(dd,1H),7.89(d,J＝8.2Hz,1H),7.34(d,1H),7.25(dd,1H),5.86(t,2H)，4.38(t,2H)，3.72(t,2H)，2.35(s,3H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B14代替化合物B1，得到化合物E14产品。产率：25％；化合物E14结构为：
化合物E14磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.23(2H,m),7.98(1H,s),7.87(1H,s),7.54(1H,d,J 7.5),7.43(2H,s)7.29(2H,d,J 8.4),6.25(1H,s),6.02(1H,s),4.55(2H,s),3.46(4H,t),3.14(4H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+512.640235，与计算获得的C27H20N4O3S2[M]+512.60200相符。
实施例15：化合物E15的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B15。产率：15％。化合物B15结构式为：
化合物B15的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(d,1H),8.17(dd,1H),7.85(d,J＝8.2Hz,1H),7.34(d,1H),7.25(dd,1H),5.01(t,2H)，3.38(t,2H)，3.23(t,3H)，2.73(s,3H)，2.03(s,2H)，1.73(s,2H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是用化合物B15代替化合物B1，得到化合物E15产品。产率：26％，化合物E15结构为：
化合物E15磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.63(2H,m),7.79(1H,s),7.56(1H,s),7.50(1H,d,J 7.5),7.53(2H,s)7.29(2H,d,J 8.4),6.07(1H,s),5.02(1H,s),4.14(2H,s),3.56(4H,t),3.23(6H,s),2.34(4H,s),1.67(4H,s)1.24(4H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+596.77013，与计算获得的C33H32N4O3S2[M]+596.76400相符。
实施例16：化合物E16的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B16。产率：31％；化合物B16结构式为：
化合物B16的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.73(d,1H),8.23(dd,1H),7.89(d,J＝8.2Hz,1H),7.34(d,1H),7.25(dd,1H),5.01(t,2H)，3.35(t,2H)，3.23(t,3H)，2.73(s,3H)，2.2(s,2H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B16代替化合物B1，得到化合物E16产品。产率：24％；化合物E16结构为：
化合物E14磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.61(2H,m),7.87(1H,s),7.56(1H,s),7.54(1H,d,J 7.5),7.51(2H,s)7.21(2H,d,J 8.4),6.57(1H,s),6.02(1H,s),4.14(2H,s),3.56(4H,t),3.23(6H,s),2.22(4H,s),1.24(4H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+568.79043，与计算获得的C31H28N4O3S2[M]+568.71000相符。
实施例17：化合物E17的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B17。产率：23％；化合物B17结构式为：
化合物B17的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.56(d,1H),8.03(dd,1H),7.89(d,J＝8.2Hz,1H),7.54(d,1H),7.12(dd,1H),4.41(t,2H)，4.11(t,2H)，3.23(t,3H)，2.73(s,3H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是用化合物B17代替化合物B1，得到化合物E17产品。产率：32％，化合物E17结构为：
化合物E17磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.61(2H,m),7.87(1H,s),7.56(1H,s),7.54(1H,d,J 7.5),7.51(2H,s)7.21(2H,d,J 8.4),6.57(1H,s),6.02(1H,s),4.14(2H,s),3.56(4H,t),3.23(6H,s),2.22(4H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+540.68403.，与计算获得的C29H24N4O3S2[M]+540.65600相符。
实施例18：化合物E18的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B18。产率：19％。化合物B18结构式为：
化合物B18的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.61(d,1H),8.27(dd,1H),7.82(d,J＝8.2Hz,1H),7.34(d,1H),7.12(dd,1H),5.21(t,2H)，2.68(t,2H)，2.32(t,3H)，2.73(s,2H)，2.03(s,2H)，1.53(s,2H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B18代替化合物B1，得到化合物E18产品。产率：24％；化合物E18结构为：
化合物E14磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.632(2H,m),7.89(1H,s),7.56(1H,s),7.56(2H,s)7.29(2H,d,J 8.4),6.07(1H,s),5.02(1H,s),3.56(4H,t),3.23(4H,s),2.34(4H,s),1.67(4H,s),1.54(4H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+596.77013，与计算获得的C33H32N4O3S2[M]+596.76400相符。
实施例19：化合物E19的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B19。产率：25％，化合物B19结构式为：
化合物B19的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.32(d,1H),8.12(dd,1H),7.98(d,J＝8.2Hz,1H),7.13(d,1H),7.02(dd,1H),5.51(t,2H)，2.78(t,2H)，2.23(t,3H)，2.13(s,2H)，1.61(s,2H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B19代替化合物B1，得到化合物E19产品。产率：17％；化合物E19结构为：
化合物E19磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.63(2H,m),7.89(1H,s),7.64(1H,s),7.56(2H,s)7.29(2H,d,J 8.4),5.77(1H,s),5.102(1H,s),3.56(4H,t),2.73(4H,s),1.67(4H,s),1.54(4H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+538.659713，与计算获得的C29H26N6OS2[M]+538.68800相符。
实施例20：化合物E20的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B20。产率：25％，化合物B20结构式为：
化合物B20的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.62(d,1H),8.31(dd,1H),7.89(d,J＝8.2Hz,1H),7.33(d,1H),7.10(dd,1H),5.15(d,2H)，2.65(t,2H)，2.33(t,3H)，1.56(s,2H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B20代替化合物B1，得到化合物E20产品。产率：12％；化合物E20结构为：
化合物E19磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.63(2H,m),7.89(1H,s),7.64(1H,s),7.56(2H,s)7.29(2H,d,J 8.4),6.61(1H,s),5.802(1H,s),3.56(4H,t),2.73(4H,s),1.54(4H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+510.68593，与计算获得的C27H22N6OS2[M]+510.63400相符。
实施例21：化合物E21的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B21。产率：22％，化合物B21结构式为：
化合物B21的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.62(d,1H),8.31(dd,1H),7.89(d,J＝8.2Hz,1H),7.33(d,1H),7.10(dd,1H)，2.35(s,3H)，1.77(s,6H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B21代替化合物B1，得到化合物E21产品。产率：28％；化合物E21结构为：
化合物E21磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.63(2H,m),7.89(1H,s),7.61(1H,s),7.56(2H,s)7.29(2H,d,J 8.4),6.61(1H,s),5.802(1H,s),3.16(6H,t),3.19(6H,s),1.54(2H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+508.61085，与计算获得的C29H24N4OS2[M]+508.65800相符。
实施例22：化合物E22的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B22。产率：31％，化合物B22结构式为：
化合物B22的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.60(d,1H),8.23(dd,1H),7.79(d,J＝8.2Hz,1H),7.43(d,1H),7.21(dd,1H)，4.13(t,2H)，2.35(s,3H)，1.57(d,3H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B22代替化合物B1，得到化合物E22产品。产率：51％；化合物E22结构为：
化合物E22磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.63(2H,m),7.89(1H,s),7.61(1H,s),7.56(2H,s)7.29(2H,d,J 8.4),6.61(1H,s),5.802(1H,s),1.54(4H,s),1.16(6H,t).
HRMS(EI-TOF)[M]+480.68015，与计算获得的C27H20N4OS2[M]+480.60400相符。
实施例23：化合物E23的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B23。产率：59％，化合物B23结构式为：
化合物B23的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.60(d,1H),8.23(dd,1H),7.79(d,J＝8.2Hz,1H),7.45(d,1H),7.31(dd,1H)，5.13(t,2H)，2.35(s,3H)，2.07(s,2H)，0.97(d,3H)。所述的化合物D23的结构为：
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B23代替化合物B1，得到化合物E23产品。产率：53％；化合物E23结构为：
化合物E23磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.60(2H,m),8.23(2H,m),7.56(2H,s)7.29(2H,d,J 8.4),6.61(1H,s),5.802(1H,s),3.77(4H,s),1.54(4H,s),0.96(6H,t).
HRMS(EI-TOF)[M]+508.64081，与计算获得的C29H24N4OS2[M]+508.65800相符。
实施例24：化合物E24的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例1相同，所不同的是，采用
代替4-溴丁酸甲酯，得到无色固体化合物B24。产率：79％，化合物B24结构式为：
化合物B24的核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.60(d,1H),8.23(dd,1H),7.79(d,J＝8.2Hz,1H),7.45(d,1H),7.31(dd,1H)，5.21(t,2H)，2.35(s,3H)，2.07(s,2H)，1.27(s,2H)，0.87(d,3H)。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B24代替化合物B1，得到化合物E24产品。产率：67％；化合物E24结构为：
化合物E24磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO)8.52(2H,m),8.23(2H,m),7.56(2H,s)7.29(2H,d,J 8.4),6.61(1H,s),5.02(1H,s),3.77(4H,s),1.49(4H,s),1.31(4H,s),0.89(6H,t).
HRMS(EI-TOF)[M]+536.70281，与计算获得的C31H28N4OS2[M]+536.71200相符。
实施例25：化合物E25的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例21及实施例1相同。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B21及B1的1:1混合物代替化合物B1，得到化合物E25产品。产率：23％；化合物E25结构为：
化合物E25磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,HDMSO)7.96(2H,d,J 7.8),7.67(2H,d,J 8.3),7.55(2H,t,J7.2),7.36(2H,t,J7.5),7.21(1H,s),6.64(1H,s),3.73(3H,s),2.83(1H,s),2.46(2H,s),2.04(4H,m),1.19(6H,s).
HRMS(EI-TOF)[M]+566.65813，与计算获得的C31H26N4O3S2[M]+566.69400相符。
实施例26：化合物E26的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例22及实施例1相同。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B22及B1的1:1混合物代替化合物B1，得到化合物E26产品。产率：30％；化合物E26结构为：
化合物E26磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,HDMSO)8.67(2H,d,J 7.8),7.76(2H,d,J 8.3),7.55(2H,t,J7.2),7.36(2H,t,J7.5),7.01(1H,s),6.64(1H,s),5.00(2H,m),4.02(2H,m),3.73(3H,s),2.32(2H,m),2.04(2H,m),1.04(3H,m).
HRMS(EI-TOF)[M]+552.68131，与计算获得的C30H24N4O3S2[M]+552.66700相符。
实施例27：化合物E27的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例23及实施例1相同。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B23及B1的1:1混合物代替化合物B1，得到化合物E27产品。产率：33％；化合物E27结构为：
化合物E27磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,HDMSO)8.67(2H,d,J 7.8),7.76(2H,d,J 8.3),7.55(2H,t,J7.2),7.36(2H,t,J7.5),7.01(1H,s),6.64(1H,s),5.00(2H,m),4.02(2H,m),3.73(3H,s),2.44(4H,m),2.32(2H,m),1.04(3H,m).
HRMS(EI-TOF)[M]+566.65182，与计算获得的C31H26N4O3S2[M]+566.69400相符。
实施例28：化合物E28的合成：
(1)步骤(1)与实施例1相同。
(2)步骤(2)与实施例24及实施例1相同。
(3)步骤(3)与实施例1相同，所不同的是，用化合物B24及B1的1:1混合物代替化合物B1，得到化合物E27产品。产率：45％；化合物E28结构为：
化合物E28磁氢谱以及高分辨质谱(HRMS(EI-TOF))数据如下：
1H NMR(400MHz,HDMSO)8.67(2H,d,J 7.8),7.76(2H,d,J 8.3),7.55(2H,t,J7.2),7.36(2H,t,J7.5),7.01(1H,s),6.64(1H,s),5.00(2H,m),4.02(2H,m),3.73(3H,s),2.44(4H,m),2.32(2H,m),1.23(2H,m),0.96(3H,m).
HRMS(EI-TOF)[M]+580.72586，与计算获得的C32H28N4O3S2[M]+580.72100相符。
光谱学性能测试
对前面所述实施例中合成的化合物的光谱学性能进行测试。采用DMSO为溶剂，配置不同浓度的E1、E2、或E3化合物的溶液，以及E1、E2、E3的水溶液。对上述溶液进行紫外吸收检测，结果如图1所示。E1、E2、E3在690nm左右具有强烈的吸收峰，则可以确定上述化合物的激发波长在690nm左右。
采用690nm为激发波长，检测上述溶液的荧光发射光谱。结果如图1所示。如图所示，E1、E2、E3化合物的荧光发射波长在700～750nm左右。
与人血清白蛋白结合能力测试
人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)主要由肝脏合成，是人血浆中的丰度非常高的蛋白质，其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量为66kDa。成熟的人血清白蛋白是一个心形分子，由3个结构相似的α-螺旋结构域组成。血清白蛋白是血浆中最丰富的载体蛋白，可以与许多内源和外源性化合物结合，而药物与HSA结合往往导致药物有效浓度降低，因此研究药物分子与蛋白质间的相互作用具有重要的意义。
对化合物E1、E2、E3与人血清蛋白结合能力进行测试：
采用二甲基亚砜作为溶剂，分别配置浓度为10mM的E1、E2以及E3母液备用。进行测试时，用PBS缓冲液将母液稀释成不同浓度的溶液用于测试。人血清白蛋白(HSA)溶解在PBS缓冲溶液中配成100μmol/L的储存母液，再经PBS稀释成不同浓度用于测试。
为了研究E1、E2、E3与人血清白蛋白(HSA)相互作用的情况，我们进行了紫外和荧光滴定实验。4μmol/L分别配置的E1、E2、E3与不同浓度的HSA溶液，将E1、E2、E3溶液与上述HSA溶液混合，在室温放置半小时后测量紫外吸收光谱。如图2所示，与不同浓度的HSA溶液混合后，E1、E2、E3在650nm处单体的紫外吸收峰均没有出现增强，而且始终没有出现其他的新吸收峰。采用含磺酸基的对照分子CSTS与上述不同浓度的HSA混合作为对照，不同浓度的CSTS溶液与HSA混合后的吸收光谱出现明显的增强和波长位移。由此可见，化合物E1、E2、E3几乎不与HSA结合。CSTS化合物结构式如下所示：
荧光滴定实验中所用蛋白浓度与紫外吸收测试的蛋白浓度一致。如图2所示，加入HSA前后，E1、E2、E3荧光发射光谱未出现显著的变化，而对照分子CSTS与HSA混合后荧光光谱出现明显的增强，说明E1、E2、E3与HSA之间没有相互作用或相互作用非常微弱。这些实验表明，E1、E2、E3与HSA之间结合能力较弱，有利于运送至靶组织，适合于用做光动力学肿瘤治疗中的光敏剂。对化合物E4～E28进行以上测试，其与HSA之间的结合均较弱。
产生1O2能力测试
在生物体内，光敏剂在一定波长光辐射下与分子氧通过光动力反应生成单线态氧(1O2)，产生的1O2可以杀伤肿瘤细胞。因此，单线态氧的生成效率是比较和评价PDT过程中光敏剂活性的重要指标之一。1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)是一种常用的单线态氧的测试剂，单线态氧能够导致DPBF的荧光猝灭。利用波长为690nm的激光照射DPBF的DMF溶液40秒，在410m处吸收峰强度变化很小(不到10％)，说明DPBF的DMF溶液自身具有稳定的发光性能。采用该吸收强度作为基准，测试加入了E1、E2、E3化合物以及对照分子CSTS的DPBF的DMF溶液的相对吸收强度，以测试上述化合物产生单线态氧的能力。具体的，向DPBF的DMF溶液中分别加入E1，E2，E3的溶液以及CSTS(作为对照试验)后，再照射690nm的激光，发现随时间增加，在410m处吸收峰的吸光强度逐渐减弱：照射40s后CSTS组降低65％左右，而E1，E2及E3降低75％左右。当加入单线态氧(1O2)抑制剂Vc后，发现所有在410m处吸收峰逐没有明显的变化(图3)，说明上述410nm处的吸收强度的变化是由光照后生成的单线态氧产生的。由此，说明合成的方酸衍生物E1、E2以及E3经光照都可以产生单线态氧，且其产生单线态氧的能力均强于CSTS，可以作为光敏剂。对化合物E4～E28进行以上测试，上述化合物产生单线态氧的能力均较强。
暗毒性测试
采用A549(non-small cell lung cancer)细胞、MCF-7(breast cancer)细胞、PC-3(prostate cancer)细胞、A549T(Taxol-resistant A549subline)细胞、HCT-8(coloncancer)细胞、K562细胞和Lovo细胞检测上述实施例中制备的方酸类染料化合物的细胞暗毒性。上述细胞均在细胞培养基DMEM(Hyclone)含10％胎牛血清(FBS，Gibco)和1％青链霉素孵育。细胞在培养箱中37℃，5％CO2条件下常规培养。
在每个96孔板中每孔接种5000个细胞(细胞株为MCF-7、HCT-8、PC-3、A549、K562及A549T)，含有细胞的培养液每孔体积100微升。接种过细胞的96孔板在37摄氏度的恒温箱中放置24小时后，每孔加入不同体积的E1母液，控制孔中E1的终浓度为定值，每个浓度平行做三次，空白对照中加入1μL的DMSO，调零孔(不含细胞)中可不加或加等体积的培养液，继续培养。48小时后弃除旧培养液，用pH 7.4的PBS缓冲液洗两遍，加入110μL含CCK-8的溶液(Dojindo Molecular Technologies,Inc)(100μL培养液+10μL含CCK-8的溶液)，37℃温浴30～60min后，利用多功能酶标仪测定450nm波长的吸收值，计算细胞存活率，并测定IC50值。
重复如上操作，检测化合物的细胞暗毒性。以孔中化合物(E1、E2、E3)终浓度为100μmol/L为例(检测结果如图4所示)，所有化合物(E1、E2以及E3)在浓度100μmol/L都没有毒性，说明这方酸类化合物基本没有暗毒性。同时由于其近红外吸收等优良的光学特性，使其适合作为光动力学治疗所用的光敏剂。
光毒性测试
细胞培养：37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养24小时后，吸除旧培养液，然后用PBS液轻轻洗涤2～3次，接着加入一定浓度的化合物E1、E2、E3或CSTS对照化合物(化合物的浓度均由2到10μmol/L。)的新培养基，然后用690nm的激光照射细胞，处理后将细胞重新置入培养箱中培养；24小时后弃除培养液，用pH 7.4的PBS缓冲液洗两遍，加入110μL含CCK-8的溶液(Dojindo Molecular Technologies,Inc)(100μL培养液+10μL含CCK-8的溶液)，以便进行细胞存活率的测试。加入CCK-8后，37℃温浴30～60min，然后利用多功能酶标仪测定450nm波长的吸收值，计算细胞存活率。如图5所示，以乳腺癌细胞MCF-7为例，随化合物E1，E2，E3浓度的升高MCF-7细胞的存活率降低。结果表明本发明所述的双氰甲叉基功能化的方酸化合物在体外对肿瘤细胞株具有较强的光毒性。因此本发明所述的双氰甲叉基功能化的方酸染料类化合物可用于作为光敏剂用于光动力学治疗。发明人对上述实施例中制备的其他化合物进行光毒性测试，其对于体外肿瘤细胞株均具有较强的光毒性。
细胞膜通透性实验
细胞培养：将LoVo细胞接种到12孔板中孵育24-48h。
向上述LoVo细胞中加入10μmol/L的化合物E1，E2及E3分别孵育两小时，先用完全培养基洗涤两遍、再用PBS洗两遍后，用流式细胞仪分析细胞中荧光的强度，细胞中荧光的强度间接的反应E1、E2以及E3进入细胞的量。参考图6，通过数据分析，我们发现在活细胞中这4个化合物进入细胞中的量的顺序为：E1>E2>E3>CSTS，而且对照分子CSTS基本不能进入细胞(CSTS进入细胞中的荧光强度与空白组(BLANK)基本相同)。这与化合物对MCF 7细胞的光毒性顺序是一致的，说明进入细胞核中的量与光毒性成正相关性。这些结果说明丁酸甲酯可以增强方酸染料类化合物的脂溶性从而容易穿透细胞膜。
细胞内成像测试
利用激光共聚焦显微镜研究上述实施例合成的化合物进入细胞的量及在细胞的定位情况。采用MCF-7细胞进行以下测试：
细胞在成像的前置于直径为20mm的玻璃基底细胞培养皿(MatTek Co.)培养24h。MCF-7细胞培养24小时后，将化合物E1和E2(0.5μmol/L)及溶酶体染料探针Lyso-TrackerRed加入DMEM培养基中孵育2h，接着用PBS缓冲液(pH＝7.4)洗细胞三次，以去除游离的探针(Lyso-Tracker Blue)。荧光成像用100倍的油镜，结果采用Olympus FV10-ASW 1.6viewer软件处理。其中化合物的激发波长为635nm，Lyso-Tracker Blue的激发波长为405nm。采用Mito Tracker green替代Lyso-Tracker Blue做为荧光探针，重复上述实验步骤。MitoTracker green的激发波长为488nm。
细胞成像结果如图7所示。在0.5μM的浓度下E1、E2均能够进入细胞，但是此浓度下化合物CSTS不能进入细胞。通过与溶酶体以及线粒体共染结果发现E1，E2和E3主要定位在溶酶体上，少量定位在线粒体上。
细胞凋亡实验
为了进一步研究化合物诱导肿瘤细胞凋亡中的作用，我们选取了化合物E1利用Annexin-V和碘化丙碇(PI)双染法检测诱导Jarkut细胞凋亡和坏死情况。收集正常培养细胞和经化合物E1(10μmol/L)光照处理(光照剂量为3.6J/cm2)后细胞，再培养0,1,3,6,12及24小时后，细胞用4摄氏度预冷的PBS洗涤3次，用500μL1×结合缓冲液重新悬浮细胞，然后分别加入5μLAnnexin V-FITC、5μLPI，混匀，室温避光15min后进行流式细胞检测，同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作阴性对照。结果如图8所示，在光照处理初期(0h)未见凋亡或死亡的细胞，随着时间的增加E1加光照处理组的细胞凋亡和坏死数量上升(右上以及右下细胞数量随时间的增加而增加)：早期细胞凋亡(右下)和晚期凋亡和坏死细胞数量(右上)分别最高上升到20.0％(3h)和55.6％(24h)。培养24h后70％的细胞处于死亡或凋亡状态(图中左上、右上、右下相加)。其中早期细胞凋亡在3个小时候达到最高，然后慢慢降低；而晚期凋亡和坏死由0小时到24小时一直增加。上述结果表明：E1通过激光激发产生ROS进而损伤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡，最终死亡。
活体成像
采用H1299(lung adenocarcinoma)细胞进行活体成像实验。细胞接种于RPMI-1640培养基(Corning)(含10％胎牛血清(FBS，Gibco)和1％青链霉素)，在培养箱中于37℃，5％CO2条件下常规培养。雌性免疫缺陷小鼠购自上海SLRC动物实验有限公司(5-6周大小)。为了形成人肺癌肿瘤模型～2×106的H1299，H1299细胞分散100μL的PBS中后，接种在老鼠的右后背侧皮下。活体成像实验采取肿瘤内部注射当肿瘤尺寸长到约0.5cm3时，采用50μL浓度为5mmol/L的E1进行给药，使用IVIS Lumina XR在注射后0.5、1、2、6、12、24、48、72h后分别成像。肿瘤注射后结果如图9所示，随着时间增加，E1在肿瘤部位逐渐扩散。24h后，E1可分布于整个肿瘤，72h在肿瘤处依然有富集。除了在肿瘤处有富集，还会在肾处代谢富集。
除去肿瘤内注射的方式，采用尾静脉注射和腹腔注射的方式，化合物E1也可以作用于肿瘤部位。尾静脉注射和腹腔注射后药物的组织定位实验结果如图10所示，图中组织从左上至右下分别为：肝、肺、脾、肾、心和肿瘤。参考图10中的(a)，尾静脉注射24h后，除心和脾脏外，肝、肾、肺和肿瘤都有荧光信号。参考图10中的(b)，腹腔注射72h后，除心脏外，肝、肾、脾、肺和肿瘤都仍有荧光信号。由此可以说明，上述化合物采用尾静脉注射和腹腔注射的方式，也可以作用于肿瘤部位。
光动力治疗
当肿瘤尺寸达到约0.2cm3时将小鼠分为四组，每组有七只，分别为A组：只注射PBS(PBS only)；B组：注射PBS和光照(PBS+light)；C组：将50μL的浓度为5mmol/L的E1化合物注射在肿瘤小鼠的肿瘤内部(E1)，D组：将50μL的浓度为5mmol/L E1化合物注射在肿瘤小鼠的肿瘤内部并光照(E1+light)。使用MW-GX-690激光器由光纤导出690nm的激光于注射24h后对肿瘤进行照射，激光强度为500mW/cm2。在24小时后进行第二次光照。每天使用游标卡尺测量肿瘤的尺寸。肿瘤体积的计算公式为：V＝(length×width2)/2。当肿瘤尺寸到达1.5厘米的时候，将小鼠人道处理。结果如图11所示，D组小鼠14天后肿瘤远小于其他组；肿瘤生长曲线显示D组小鼠肿瘤基本不生长，说明E1具有明显的光动力学治疗效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一实施方案”、“另一实施方案”、“示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施方案以及实施例，可以理解的是，上述实施方案、实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施方案、实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (7)
1.一种方酸染料类化合物，其特征在于，所述方酸染料类化合物为式(1)、式(2)、式(4)～式(8)、式(15)～式(17)、式(21)～式(23)以及式(25)～式(28)所示的化合物：
2.一种制备权利要求1所述的方酸染料类化合物的方法，其特征在于，包括：使式(II)所示化合物与式(III)所示化合物反应，以便获得所述方酸染料类化合物：
其中，所述R和所述P是相对于权利要求1所述的化合物的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，式(II)所示化合物与式(III)所示化合物的所述反应是在100～150摄氏度下进行的，所述反应时间为20～36小时。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，式(II)所示化合物是由方酸乙二酯在无水苯中，与丙二腈以及三乙胺反应获得的。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，式(III)所示化合物是由2-甲基-1,3-苯并噻唑与R(CH2)pX反应获得的，所述反应的温度为100～150摄氏度，反应时间2～8小时，
其中，X为Cl、Br或者I。
6.一种光敏剂，其特征在于，含有权利要求1所述的方酸染料类化合物。
7.权利要求1所述的方酸染料类化合物或权利要求6所述的光敏剂在制备药物中的用途，所述药物用于光动力疗法治疗肿瘤。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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