CN110240611B - 靶向egfr过度表达肿瘤细胞内质网的光敏剂制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向EGFR过度表达肿瘤细胞的内质网光敏剂及其制备方法。在酞菁母环的轴向上通过水溶性的烷氧长链以共价键的方式连接小分子靶点药物埃罗替尼（N‑(3‑乙炔苯基)‑[6,7‑二(2‑甲氧基乙氧基)]喹唑啉‑4‑胺），以改善其两亲性、生物相容性和提高光敏剂对肿瘤细胞的选择靶向性；在酞菁母环轴向的另一端引入靶向内质网基团可以使得光敏剂在细胞内选择性地靶向内质网，提高光动力作用效率。该类化合物结构单一，合成路线成熟，组成确定，不存在异构体，产品容易分离提纯，同时该配合物不容易聚集，有利于提高细胞摄取率。

Description

靶向EGFR过度表达肿瘤细胞内质网的光敏剂制备方法及其 应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及靶向EGFR过度表达肿瘤细胞的内质网光敏剂及其制备方法。
背景技术
随着医疗科学技术的不断发展与进步，人类已经在很多疾病的治疗方面取得了突破性进展，但是在治疗癌症方面仍然显得力不从心，癌症依然是严重威胁着人类生命健康的主要疾病之一。尽管目前癌症的治疗方法有很多，但绝大多数的治疗方式只能是达到初期治愈和延缓的目的并且面临着一系列亟待解决的问题，而光动力治疗癌症因其固有的时空选择性和无耐药性等独特的优势逐渐成为癌症治疗的热门研究领域。光动力治疗是指在组织内氧气分子存在情况下，用特定波长的激光照射富集于病变组织内的光敏剂然后促其发生一系列的光物理和光化学过程从而产生具有极强细胞毒性的氧化物，进而进行相关疾病的诊断和治疗。
光动力治疗的治疗作用过程是：首先，将一定剂量的光敏剂注入到患者体内，经过一定时间后，待光敏剂相对选择性富集于病变组织后，然后用与光敏剂相匹配的激光照射病变组织，光敏剂会在光的激发下发生一系列的光物理和光化学反应，从而将细胞内的氧气分子转变成高毒氧化物质活性氧，其中主要是单线态氧，进而杀死病变细胞和组织，从而达到治疗疾病的目的。其中，光敏剂是光动力治疗中的核心关键物质，而酞菁类化合物又被世界广泛认为是目前最具有临床应用价值的第二代光敏剂。
小分子靶点药物抑制剂是目前分子靶向肿瘤治疗研究的热点之一，随着不同的靶向小分子结构抑制剂被筛选和合成出来，其中不少小分子靶向抑制剂已经被批准进入临床试验甚至上市，并且在抗肿瘤药物市场占据一定份额，取得非常显著治疗效果，它的未来发展潜力无限。小分子抑制剂的主要是通过阻断治疗过程中信号转导通路、异常活化的激酶以及生长因子等途径，进而抑制肿瘤的生长，最终达到治疗的目的。作为ErbB家族的成员，表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）在细胞生长增殖、细胞存活、细胞迁移和细胞分化中都扮演着不可替代的重要角色，是最具有价值的药物靶点之一。目前， FDA已经审核批准了一批 EGFR 小分子靶向抑制剂，其中大多数化合物属于喹唑啉类—现已研究发现的选择性最好、活性最高的要属苯胺喹唑啉类小分子化合物，其主要作用于EGFR。目前已有数个该类小分子抑制剂被批准上市，还有大量正处于研究开发阶段或是已经进入临床试验的化合物。其中，常用的小分子靶点药物有吉非替尼、埃罗替尼、伊马替尼、达沙替尼、舒尼替尼和他莫替芬等。埃罗替尼（Erlotinib）是目前研究和使用最为广泛的小分子靶点药物之一，它是一种选择性表皮生长因子受体酪氨酸激酶（EGFR-TK）抑制剂（属于小分子化合物），通过抑制EGFR酪氨酸激酶活性而妨碍肿瘤的生长、转移和血管的生成，并增加肿瘤细胞的凋亡。近些年来，研究人员开始探索将光动力癌症治疗的光敏与小分子靶点药物轭合达到联合治疗或者靶向肿瘤治疗的目的。
在过去的十多年中，化学家们一直致力于研究和设计靶向细胞器如线粒体、溶酶体和细胞核等相关的抗癌药物。相比于之前的肿瘤细胞水平的靶向，亚细胞靶向治疗癌症实现了更为精准和更具有针对性的治疗。尤其在线粒体靶向癌症治疗方面，研究者取得了一系列重要研究成果，在克服癌症治疗的乏氧、化疗耐药性和治疗效率低下问题上发挥了巨大作用。与其他亚细胞器作为靶标相比，内质网因其在细胞信号传导中的复杂作用而在抗癌药物中相关的研究鲜有报道。而内质网是细胞内除核酸以外的一系列重要的生物大分子，如蛋白质、脂类(如甘油三酯) 和糖类的合成基地。内质网在参与生物合成，传感，信号传递尤其是在蛋白质合成、折叠和翻译后修饰以及细胞内的钙离子动态平衡中发挥着不可代替的重要作用。内质网的蛋白质折叠能力的扰动通过线粒体途径最终导致内质网应激导致细胞死亡。或者当内质网受到外在刺激应及时，内质网中调控钙离子并启动Caspase-8相关的细胞调亡程序。因此，在癌症细胞中选择性破坏内质网的功能将是一种有潜力的新策略用于癌症治疗。
基于内质网靶向药物的探索与研究，结合小分子靶点药物和光动力癌症治疗，本发明提出了在酞菁类光敏剂上分别以共价键的方式引入小分子靶点药物和内质网靶向基团得到一种新型配合物的设想，即合成了一种具有选择性地靶向表皮生长因子受体（EGFR）过度表达的肿瘤细胞的内质网成功实现细胞和亚细胞器精准双重靶向光动力光敏剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向EGFR过度表达的肿瘤细胞表面受体和内质网的双重靶向的氮杂芳香向不对称取代配合物及其制备方法，在酞菁母核的轴向上引入以水溶性的烷氧长链连接的小分子靶点药物埃罗替尼N-(3-乙炔苯基)-[6,7-二(2-甲氧基乙氧基)]喹唑啉-4-胺，同时在酞菁母环轴向的另一端引入内质网靶向基团，以改善其两亲性、生物相容性和提高其肿瘤的靶向能力。这种分子设计策略可以使得光敏剂选择性地精准定位于EGFR过度表达的肿瘤细胞的内质网，提高靶向的专属性和精准性，提高光动力生物活性。该类化合物结构组成确定，不存在异构体，合成路线成熟且简单，产品容易分离提纯。同时，靶向配体的引入可以防止配合物聚集，有利于其充分发挥光动力活性，也有助于被肿瘤细胞摄取。本发明合成工艺简单，副反应少，原料易得，成本低，有利于工业化生产。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种靶向EGFR过度表达肿瘤细胞内质网的光敏剂，其化学结构式如下：
Figure 675102DEST_PATH_IMAGE001
（M为Si或Sn）
其中，
Figure 819645DEST_PATH_IMAGE002
、
Figure 41810DEST_PATH_IMAGE003
。
一种靶向EGFR过度表达肿瘤细胞的内质网光敏剂的制备方法，包括以下步骤：
在装有磁力搅拌装置、回流冷凝装置和导气管装置的100 mL双颈圆底烧瓶中，依次将物质的量比为1：1的二氯酞菁硅或二氯酞菁锡和化合物6b加入到反应体系中，加入10ml无水甲苯，再向其中加入氢化钠，在氮气保护下120 ℃下加热回流反应2 h， 然后，用10ml 重蒸甲苯将化合物5b加入到反应体系中，继续在120 ℃加热回流反应4 h，反应结束后，用体积比为50:1到10:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂过中性氧化铝柱，然后过四氢呋喃的凝胶柱，再用乙酸乙酯为洗脱剂过中性氧化铝柱，收集得到蓝绿色的固体，即为目标产物。
上述步骤中化合物6b的制备方法为：将2.4 mmol埃罗替尼和2.4 mmol 2-（2-（2-叠氮基乙氧基）乙氧基）乙-1-醇溶解在10 ml THF中，然后将120 mg CuSO4·5H2O和240 mg抗坏血酸钠的混合物加入1.0 ml EtOH和1.0 ml水的溶液中加入到反应体系中，将反应混合物在室温下搅拌24小时，反应完成后，用二氯甲烷和水萃取三次，结合有机层，干燥，减压蒸发除去溶剂；最后以CH2 Cl2：MeOH = 10：1（v / v）为淋洗剂通过硅胶柱色谱法进一步分离纯化得到化合物6b。
上述步骤中化合物5b的制备方法，包括以下步骤：
（1）在250 ml 圆底烧瓶中按物质的量之比为1:1.2:3 依次加入4-羟基苯甲酸甲酯、溴丙炔和无水K2CO3，向其中加入150 ml 丙酮作溶剂； 然后在氮气保护下将反应体系回流搅拌过夜反应；待反应结束后，用布氏漏斗将K2CO3过滤除去，在减压条件将滤液下浓缩除去溶剂，粗产物用二氯甲烷和水萃取洗涤三次；然后结合有机层用无水Na2SO4干燥除水，过滤除去Na2SO4后，将滤液减压浓缩；最后以CH2Cl2作为洗脱剂通过硅胶柱色谱法进一步分离纯化得到化合物1b；
（2）将3 mmol化合物1b溶于100 ml甲醇中，然后用4 ml水将15 mmol氢氧化钠溶解加入到反应体系中，在氮气保护条件下80℃搅拌反应8小时，反应结束后，减压蒸发除去溶剂，将残余物与水混合，然后用HCl溶液将混合物的pH调节至1，将混合物用乙酸乙酯萃取洗涤三次，结合有机相并用无水Na2SO4干燥，过滤除去Na2SO4后，将滤液减压浓缩，最后以乙酸乙酯作为洗脱液，通过硅胶柱色谱法进一步分离纯化得到化合物2b；
（3）将25 mmol乙二胺溶解在100 ml CH2Cl 2中，在冰水浴条件下用二氯甲烷将对5mmol甲基苯磺酰氯溶解用恒压滴液漏斗缓慢逐滴加入到反应体系，在室温条件下搅拌过夜反应，反应完成后，将混合物在减压条件下浓缩除去溶剂，最后以CH2Cl2：MeOH=10：1（v / v）作为洗脱剂通过硅胶柱色谱进一步分离纯化得到化合物3b；
（4）将2 mmol化合物2b溶解在无水CH2Cl2中, 依次加入4 mmol EDCI和4 mmolHoBt，在冰水浴条件下搅拌反应3小时，然后向溶液中加入3 mmol化合物3b和4 mmol Et3N在室温条件下搅拌过夜反应；待反应结束后，将混合物用HCl水溶液萃取洗涤三次，合并有机层并用无水MgSO4干燥，过滤并在减压条件下浓缩，最后以CH2Cl2：MeOH=20：1 (v / v）为洗脱剂通过硅胶柱色谱进一步分离纯化得到化合物4b；
（5）将0.8 mmol化合物4b和0.8 mmol 2-（2-（2-叠氮基乙氧基）乙氧基）乙-1-醇溶解在5ml THF中，将40 mg CuSO 4·5H2O和80 mg抗坏血酸钠的混合物加入0.5ml EtOH和0.5ml水中，将反应混合物在室温下搅拌24小时，反应完成后，用二氯甲烷和水萃取，结合有机相干燥并减压蒸发除去溶剂，最后以CH2Cl2：MeOH = 10：1（v / v）作为淋洗剂通过柱色谱法进一步分离纯化得到化合物5b。
上述一种靶向EGFR过度表达肿瘤细胞的内质网光敏剂的应用：靶向EGFR过度表达肿瘤细胞的内质网光敏剂用于制备抗肿瘤光敏药物。
本发明的显著优点在于：
（1）目标化合物结构单一，不存在异构体，产物容易分离纯化；
（2）所合成的化合物中以聚乙二醇链通过共价键连接功能基团，提高了光敏剂的两亲性和生物相溶性，有利于作为光动力药物应用于临床光动力治疗肿瘤；
（3）合成方法简单，反应条件温和，副反应少，原料低廉易得，成本低，有利于工业化生产；
（4）大大提高了光敏剂的靶向性和智能化，同时光动力抗癌活性和效率显著提高。
附图说明
图1为实施例1、对比例1和对比例2的合成路线图。
图2为无光条件下化合物对A549人肺腺癌细胞的剂量依赖曲线。 EB代表小分子靶点药物埃罗替尼，ER代表靶向内质网基团，Pc代表光敏剂硅酞菁。
图3为有光条件下化合物对A549人肺腺癌细胞的剂量依赖曲线。 EB代表小分子靶点药物埃罗替尼，ER代表靶向内质网基团，Pc代表光敏剂硅酞菁。
图4为无光条件下化合物对PC9人肺癌细胞的剂量依赖曲线。EB代表小分子靶点药物埃罗替尼，ER代表靶向内质网基团，Pc代表光敏剂硅酞菁。
图5为有光条件下化合物对PC9人肺癌细胞的剂量依赖曲线。EB代表小分子靶点药物埃罗替尼，ER代表靶向内质网基团，Pc代表光敏剂硅酞菁。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图即实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种靶向EGFR过度表达肿瘤细胞的内质网光敏剂的制备方法，步骤如下：
化合物1b 的合成
在250 ml 圆底烧瓶中依次加入4-羟基苯甲酸甲酯（0.913 g，6 mmol）、溴丙炔（0.857 g，7.2 mmol）和无水K2CO3（2.484g，18 mmol），向其中加入150 ml 丙酮作溶剂。 然后, 在氮气保护下将反应体系回流搅拌过夜反应。 待反应结束后，用布氏漏斗将K2CO3过滤除去，在减压条件将滤液下浓缩除去溶剂，粗产物用二氯甲烷和水萃取洗涤三次。 然后，结合有机层用无水Na2SO4干燥除水，过滤除去Na2SO4后，将滤液减压浓缩。最后，以CH2Cl2作为洗脱剂通过硅胶柱色谱法进一步分离纯化得到白色固体1.130 g。产率为：69.5%。1H NMR(400 MHz, Chloroform-d) δ 8.01 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.00 (d, J = 8.4 Hz, 2H),4.75 (s, 2H), 3.89 (s, 3H), 2.55 (t, J = 2.2 Hz, 1H)。
化合物2b的合成
将化合物1b（1.620 g，3 mmol）溶于100 ml甲醇中。然后，用4 ml水将氢氧化钠（0.600 g，15 mmol）溶解加入到反应体系中。 在氮气保护条件下80℃搅拌反应8小时。反应结束后，减压蒸发除去溶剂，将残余物与水混合，然后用HCl溶液将混合物的pH调节至1，将混合物用乙酸乙酯萃取洗涤三次。 结合有机相并用无水Na2SO4干燥，过滤除去Na2SO4后，将滤液减压浓缩。最后，以乙酸乙酯作为洗脱液，通过硅胶柱色谱法进一步分离纯化得到白色固体1.004 g。 产率为：95.0％。 1H NMR（400MHz，DMSO-d6）δ12.66（s，1H），7.91（d，J =7.2Hz，2H），7.07（d，J = 7.6Hz，2H），4.89（s，2H），3.62 （d，J = 2.5Hz，1H）。
化合物 3b的合成
首先，将乙二胺（1.500 g，25 mmol）溶解在100 ml CH2Cl 2中。然后，在冰水浴条件下用二氯甲烷将对甲基苯磺酰氯（0.953g，5 mmol）溶解用恒压滴液漏斗缓慢逐滴加入到反应体系统。在室温条件下搅拌过夜反应。 通过TLC跟踪监测反应。 反应完成后，将混合物在减压条件下浓缩除去溶剂。 最后，以CH2Cl2：MeOH（10：1 v / v）作为洗脱剂通过硅胶柱色谱进一步分离纯化得到白色粘稠状固体846 mg。产率为79.0％。 1H NMR（400MHz，CDCl3）δ7.76（d，J = 7.4Hz，2H），7.27（d，J = 7.6Hz，2H），4.80（s，3H），3.04（d，J = 4.6Hz，2H），3.01-2.91（m，2H），2.39（s，3H）。
化合物4 b的合成
将化合物2b（352 mg，2 mmol）溶解在无水CH2Cl2中, 依次加入EDCI（765 mg，4mmol）和HoBt（540 mg，4 mmol）。在冰水浴条件下搅拌反应3小时。然后向溶液中加入3b（450mg，3 mmol）和Et3N（486 mg，4 mmol, 在室温条件下搅拌过夜反应。待反应结束后，将混合物用HCl水溶液萃取洗涤三次，合并有机层并用无水MgSO 4干燥，过滤并在减压条件下浓缩。最后，以CH2Cl2：MeOH（20：1 v / v）为洗脱剂通过硅胶柱色谱进一步分离纯化得到白色粘稠固414 mg，产率为67.2％。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.77 – 7.69 (m, 4H), 7.26(t, J = 2.8 Hz, 2H), 6.95 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 2H), 6.87 (s, 1H), 4.72 (d, J= 2.4 Hz, 2H), 3.54 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 3.17 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.55 (t, J= 2.5 Hz, 1H), 2.39 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.81, 160.09,143.48, 136.60, 129.78, 128.98, 126.95, 126.88, 114.53, 78.00, 76.17, 55.81,42.99, 39.90, 21.50. HRMS (ESI) m/z calcd C19H20N2O4S [M+Na]+: 395.1041, found395.1036。
化合物5b的合成
将化合物4b（246 mg，0.8 mmol）和2-（2-（2-叠氮基乙氧基）乙氧基）乙-1-醇（140mg，0.8 mmol）溶解在5 ml THF中。将CuSO 4·5H2O（40 mg）和抗坏血酸钠（80 mg）的混合物加入EtOH（0.5 ml）和水（0.5 ml）中。将反应混合物在室温下搅拌24小时。反应完成后，用二氯甲烷和水萃取，结合有机相干燥并减压蒸发除去溶剂。最后，以CH2Cl2：MeOH = 10：1作为淋洗剂通过柱色谱法进一步分离纯化得到白色油状物质301mg。产率：78.0％. 1H NMR(400 MHz, Chloroform-d) δ 7.90 (s, 1H), 7.72 (dd, J = 8.5, 3.9 Hz, 4H), 7.24(d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.09 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.30(s, 1H), 5.23 (s, 2H), 4.57 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 3.88 (t, J = 4.9 Hz, 2H),3.70 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.58 (s, 4H), 3.53 (q, J = 7.0, 5.9 Hz, 4H), 3.16(t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.38 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, Chloroform-d) δ 167.85,160.72, 143.36, 143.17, 136.81, 129.72, 129.07, 126.91, 126.68, 124.70,114.43, 72.45, 70.41, 70.09, 69.18, 61.65, 61.48, 50.31, 42.97, 39.86, 21.45.HRMS (ESI) m/z calcd for C25H33N5O7S [M+Na]+:570.1998, found: 570.1989。
化合物6b的合成
首先，将埃罗替尼（0.944 mg，2.4 mmol）和2-（2-（2-叠氮基乙氧基）乙氧基）乙-1-醇（420 mg，2.4 mmol）溶解在10 ml THF中。然后将CuSO 4·5H2O（120 mg）和抗坏血酸钠（240 mg）的混合物加入EtOH（1.0 ml）和水（1.0 ml）中加入到反应体系中。将反应混合物在室温下搅拌24小时。反应完成后，用二氯甲烷和水萃取三次，结合有机层，干燥，减压蒸发除去溶剂。最后，以CH2Cl2：MeOH = 10：1为淋洗剂通过硅胶柱色谱法进一步分离纯化得到黄色油状物质1.268 g。产率为：93.0％. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.56 (s, 1H), 8.16(s, 1H), 7.97 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.66 (d, J = 7.6 Hz, 1H),7.54 (s, 1H), 7.42 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.22 (s, 1H), 4.59 (t, J = 4.4 Hz,2H), 4.38 – 4.33 (m, 2H), 4.28 – 4.23 (m, 2H), 3.89 (d, J = 4.1 Hz, 2H), 3.84(s, 4H), 3.81 – 3.77 (m, 2H), 3.66 (d, J = 1.7 Hz, 4H), 3.64 – 3.59 (m, 2H),3.50–3.45 (m, 6H)。
EB-ER-Pc的合成
将二氯化硅（IV）酞菁（122 mg，0.20mmol），化合物6b（114 mg，0.20 mmol）和NaH（23 mg，1.00 mmol）依次加入到15 ml无水甲苯中,在氮气保护条件下反应混合物在120 ℃下搅拌反应2小时。然后，加入化合物5b（110 mg，0.2 mmol）,继续在120 ℃条件下继续搅拌反应 6小时。反应完成后，减压除去溶剂。并将残余物重新溶解在CH2Cl2中。然后通过色谱法纯化，使用CH2Cl2：MeOH（15：1 v/v）作为洗脱剂，得到肿瘤特异靶向和内质网双重靶向的轴向不对称取代硅酞菁配合物EB-ER-Pc，为蓝绿色固体。产量：40mg，12％。1H NMR (400 MHz,DMSO-d 6) δ 9.64 (dt, J = 5.1, 2.2 Hz, 8H), 8.47 (dt, J = 5.3, 2.2 Hz, 8H),8.26 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 7.68 (dd, J = 7.2, 4.7 Hz, 8H), 7.65 (d, J = 1.8Hz, 2H), 7.36 (d, J = 7.9 Hz, 4H), 7.33 (d, J = 1.7 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 7.6Hz, 4H), 5.76 (d, J = 1.7 Hz, 3H), 4.75 (s, 4H), 4.09 (t, J = 5.3 Hz, 4H),3.28 (q, J = 6.7 Hz, 4H), 3.09 (t, J = 5.3 Hz, 4H), 2.88 (d, J = 6.6 Hz, 4H),2.35 (d, J = 6.1 Hz, 10H), 1.58 (d, J = 5.0 Hz, 4H), 0.31 (t, J = 5.2 Hz,4H), -2.05 (d, J = 5.3 Hz, 4H)。HRMS (ESI) m/z calcd for C85H83N19O14Si [M]＋:1653.5857, found:1653.5073. EB-ER-Pc的结构如下：
Figure 433435DEST_PATH_IMAGE004
对比例1
PEG-Pc的合成
将二氯硅（IV）酞菁（122 mg，0.20 mmol），三乙二醇单甲醚（328 mg，2.00 mmol）和NaH（23 mg，1.00 mmol）加入到150 ml双颈瓶中，再加入15mL甲苯作为反应溶剂。然后，将反应混合物在氮气保护条件下120 oC反应24个小时。反应完成后，减压除去溶剂，并将残余物重新溶解在CH 2 Cl 2中。然后通过通过柱色谱进一步分离纯化，以CH 2Cl 2：MeOH（15：1）作为洗脱剂，得到蓝色固体PEG-Pc95mg，产率为54.0％。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.68(dd, J = 5.6, 3.1 Hz, 8H), 8.52 (dd, J = 5.8, 2.9 Hz, 8H), 3.02 (d, J = 4.3Hz, 10H), 2.83 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 2.31 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 1.59 (t, J =5.1 Hz, 4H), 0.33 (t, J = 5.3 Hz, 4H), -2.04 (t, J = 5.2 Hz, 4H)。PEG-Pc的结构如下：
Figure 722334DEST_PATH_IMAGE005
对比例2
EB-Pc的合成
将二氯化硅（IV）酞菁（122 mg，0.20 mmol），6b（227 mg，0.40 mmol）和NaH（23mg，1.00mmol）用15 ml 无水甲苯溶解，然后将反应混合物在氮气保护下120℃搅拌反应24 个小时。反应完成后，减压除去溶剂，并将残余物重新溶解在CH2Cl2中，通过柱色谱法进一步分离纯化，以CH2Cl 2：MeOH（15：1）作为洗脱剂，得到蓝色固体EGFR-Pc 117mg， 产率为35.0％。1HNMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.61 (dd, J = 5.7, 3.1 Hz, 8H), 9.47 (s, 2H), 8.45(q, J = 4.4, 3.0 Hz, 10H), 8.06 (s, 2H), 7.88 (s, 2H), 7.85 (d, J = 8.1 Hz,2H), 7.76 (s, 2H), 7.25 – 7.17 (m, 4H), 7.03 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 4.29 (p, J= 4.2 Hz, 8H), 4.15 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 3.77 (d, J = 4.8 Hz, 8H), 3.37 (d, J= 1.7 Hz, 12H), 3.15 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 2.37 (s, 4H), 1.57 (t, J = 4.9 Hz,4H), 0.33 (t, J = 5.1 Hz, 4H), -2.03 (t, J = 5.0 Hz, 4H). HRMS (ESI) m/zcalcd for C88H86N20O14Si [M+H] +:1675.6480, found:1675.6425。EB-Pc的结构式如下：
Figure 590058DEST_PATH_IMAGE006
细胞毒性实验
光动力光敏剂的细胞毒性实验通常包括光毒性和暗毒性两部分实验。通常采用MTT法 (四氮唑盐还原法)测定。MTT（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐）检测原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性的MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而在死细胞中并无琥珀酸脱氢酶，因此不会生成甲瓒。用二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中生成的甲瓒，然后用酶标仪在490 nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数量范围内，MTT结晶形成的量与活细胞数量成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，证明活细胞数量越多（如果是测定的是药物毒性，则表示药物毒性越小）。
细胞处理过程：用0.25 wt % 的胰蛋白酶将生长状态良好的贴壁细胞消化后，再用新制培养基（含10 % 胎牛血清）配制成细胞密度为5.0×104 cells/mL细胞悬液，然后在96孔培养板内每孔加入100 μL细胞悬浊液（约含5000个肿瘤细胞），置于37 ℃，5% CO2 培养箱内培养12 h，待细胞贴壁后加药；
受试样品组：用DMF（含5 % 的蓖麻油）将实施例1制得的酞菁预先配制为浓度为1.0 mmol/L药物储备液，所有配制的药液均经有机膜（0.22 µm）过滤处理，使用时用新制培养基将酞菁储备液稀释为不同的浓度梯度；每个药物浓度平行设定6个复孔，每孔中加入100 µL含药培养基后置于培养箱内孵育24 h。
细胞空白对照是指除了不加光敏剂外，只加入同等体积的细胞悬浊液，其他条件与受试样品组保持一致。
溶剂空白对照是指对照组不加细胞，只加入同等体积且不含药物的培养基，其他条件与受试样品组保持一致。
暗毒实验：药物与细胞共同孵育培养24小时后，移除含药的旧培养基，用无菌PBS洗涤三次，每孔再加入100 μL新制培养基。然后每孔再加入10 μL 浓度为 4 mg·ml-1 的MTT溶液，在37 ℃条件下继续孵育培养4 h。结束后，用移液枪小心弃去上清液，然后每孔再加入100 μL DMSO溶解甲瓒晶体，放在摇床震荡20 min 使甲瓒完全溶解后，用酶标仪测定吸收为490 nm波长下的OD值。
光毒实验：药物与细胞共同孵育培养24小时后，移除含药的旧培养基，用无菌PBS洗涤三次，每孔加入100 µL新鲜培养基，然后用波长为670 nm的激光（照射能量密度为 1.5J·cm-2）对细胞进行照射2分钟；光照完毕后，将96孔板放置于37 ℃，5% CO2的培养箱内，继续培养24个小时。结束后，每孔再加入10 μL 浓度为 4 mg·ml-1 的MTT溶液，在37 ℃条件下继续孵育培养4 h。然后，用移液枪小心弃去上清液，然后每孔再加入100 μL DMSO溶解甲瓒晶体，放在摇床震荡20 min 使甲瓒完全溶解后，用酶标仪测定吸收为490 nm波长下的OD值。
采用MTT法测定了实施例1、对比例1、对比例2三种酞菁光敏剂对A549人肺腺癌细胞和PC-9人肺癌细胞细胞的杀伤曲线；即在光照和无光照条件下细胞对三种酞菁光敏剂的剂量依赖曲线，如图2到图5。光照波长为670 nm，光照能量密度为1.5 J·cm-2，数据由三次独立的平行实验得到，以Mean ± SEM方式处理。
由实验数据可知，在无光条件下化合物ER-EB-Pc, EB-Pc和PEG-Pc均都未表现出细胞毒性，显现出目标化合物本身在所使用的药物浓度梯度下对肿瘤细胞没有任何抑制能力。在光照条件下三种化合物对两种肿瘤细胞均表现出抑制能力，其中ER-EB-Pc其对肿瘤细胞的抑制能力均大于对照化合物EB-Pc 和PEG-Pc，表现出了更为显著的细胞增殖抑制能力。因此，目标化合物EB-ER-Pc表现出了高效的光动力抗癌活性和理想的靶向选择性。基于此，目标化合物EB-ER-Pc已经达到新型高效靶向智能化光敏剂的标准，有望被应用开发为高效的抗癌光敏药物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1.一种靶向EGFR过度表达肿瘤细胞内质网的光敏剂，其特征在于：其化学结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
，M为Si
R1为
Figure DEST_PATH_IMAGE002
、
R2为
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
2.一种如权利要求1所述的靶向EGFR过度表达肿瘤细胞的内质网光敏剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在装有磁力搅拌装置、回流冷凝装置和导气管装置的100 mL双颈圆底烧瓶中，依次将物质的量比为1:1的酞菁二氯化硅和化合物6b加入到反应体系中，加入10 ml无水甲苯，再向其中加入氢化钠，在氮气保护下120 ℃下加热回流反应2 h， 然后，用10 ml 重蒸甲苯将化合物5b加入到反应体系中，继续在120 ℃加热回流反应6 h，反应结束后，用体积比为50:1到10:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂过中性氧化铝柱，然后过四氢呋喃的凝胶柱，再用乙酸乙酯为洗脱剂过中性氧化铝柱，收集得到蓝绿色的固体，即为目标产物；
所述化合物6b的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
所述化合物5b的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述化合物6b的制备方法为：将2.4mmol埃罗替尼和2.4 mmol 2-（2-（2-叠氮基乙氧基）乙氧基）乙-1-醇溶解在10 ml THF中，然后将120 mg CuSO 4·5H2O和240 mg抗坏血酸钠的混合物加入1.0 ml EtOH和1.0 ml水的溶液中加入到反应体系中，将反应混合物在室温下搅拌24小时，反应完成后，用二氯甲烷和水萃取三次，合并有机层，干燥，减压蒸发除去溶剂；最后以CH2 Cl2:MeOH=10:1 v/v为淋洗剂通过硅胶柱色谱法进一步分离纯化得到化合物6b。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述化合物5b的制备方法，包括以下步骤：
（1）在250 ml 圆底烧瓶中按物质的量之比为1:1.2:3 依次加入4-羟基苯甲酸甲酯、溴丙炔和无水K2CO3，向其中加入150 ml 丙酮作溶剂； 然后在氮气保护下将反应体系回流搅拌过夜反应；待反应结束后，用布氏漏斗将K2CO3过滤除去，在减压条件将滤液浓缩除去溶剂，粗产物用二氯甲烷和水萃取洗涤三次；然后合并有机层用无水Na2SO4干燥除水，过滤除去Na2SO4后，将滤液减压浓缩；最后以CH2Cl2作为洗脱剂通过硅胶柱色谱法进一步分离纯化得到化合物1b，其结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
；
（2）将3 mmol化合物1b溶于100 ml甲醇中，然后用4 ml水将15 mmol氢氧化钠溶解加入到反应体系中，在氮气保护条件下80℃搅拌反应8小时，反应结束后，减压蒸发除去溶剂，将残余物与水混合，然后用HCl溶液将混合物的pH调节至1，将混合物用乙酸乙酯萃取洗涤三次，合并有机相并用无水Na2SO4干燥，过滤除去Na2SO4后，将滤液减压浓缩，最后以乙酸乙酯作为洗脱液，通过硅胶柱色谱法进一步分离纯化得到化合物2b，其结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
；
（3）将25 mmol乙二胺溶解在100 ml CH2Cl2中，在冰水浴条件下用二氯甲烷将5mmol甲基苯磺酰氯溶解用恒压滴液漏斗缓慢逐滴加入到反应体系，在室温条件下搅拌过夜反应，反应完成后，将混合物在减压条件下浓缩除去溶剂，最后以CH2Cl2:MeOH=10:1v/v作为洗脱剂通过硅胶柱色谱进一步分离纯化得到化合物3b，其结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
；
（4）将2 mmol化合物2b溶解在无水CH2Cl2中, 依次加入4 mmol EDCI和4 mmol HoBt，在冰水浴条件下搅拌反应3小时，然后向溶液中加入3 mmol化合物3b和4 mmol Et3N在室温条件下搅拌过夜反应；待反应结束后，将混合物用HCl水溶液萃取洗涤三次，合并有机层并用无水MgSO4干燥，过滤并在减压条件下浓缩，最后以CH2Cl2:MeOH=20:1 v / v为洗脱剂通过硅胶柱色谱进一步分离纯化得到化合物4 b，其结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
；
（5）将0.8 mmol化合物4b和0.8 mmol 2-（2-（2-叠氮基乙氧基）乙氧基）乙-1-醇溶解在5 ml THF中，将40 mg CuSO 4·5H2O和80 mg抗坏血酸钠的混合物加入0.5ml EtOH和0.5 ml水中，将反应混合物在室温下搅拌24小时，反应完成后，用二氯甲烷和水萃取，合并有机相干燥并减压蒸发除去溶剂，最后以CH2Cl2:MeOH=10:1v/v作为淋洗剂通过柱色谱法进一步分离纯化得到化合物5b。
5.一种如权利要求1所述的靶向EGFR过度表达肿瘤细胞的内质网光敏剂的应用，其特征在于：靶向EGFR过度表达肿瘤细胞的内质网光敏剂用于制备抗肿瘤光敏药物。
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