CN111057063B

CN111057063B - 一种用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物及其制备方法

Info

Publication number: CN111057063B
Application number: CN201911315394.9A
Authority: CN
Inventors: 薛金萍; 陈涓涓; 袁干坤; 吕回回; 姚梦雨
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN111057063A

Abstract

本发明公开了一种用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物及其制备方法。本发明利用修饰后的达沙替尼的羧基，通过酯化反应将其连接在酞菁衍生物的羟基上。利用小分子靶向药达沙替尼的靶向功能，可以准确定位在白血病细胞，从而实现药物的精准靶向，结合酞菁的光动力效果，对白血病起到更加高效的杀伤作用。该化合物合成方法简单，原料易得，成本低，副反应少，产率较高，易提纯，有利于工业化生产。

Description

一种用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物及其制备方法

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物设计、合成领域，具体涉及一种用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物及其制备方法。

背景技术

白血病是造血系统的恶性疾病，俗称“血癌”，是国内十大高发恶性肿瘤之一，其发病率居于中国各类肿瘤第七位，发病率为4.7/10万人口，欧美国家为6.4/10万人口。死亡率占各类肿瘤的第六位，是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。白血病的特点为造血组织中某一类的白血病细胞在骨髓或其他造血组织中发生恶性增生，并浸润体内各器官、组织，导致正常细胞受抑制，产生各种症状。目前，急性白血病患者居血液系统疾病住院总人数之首位。现在对于白血病的治疗一般是通过化疗，虽然随着技术的进步，改善了化疗问题，但现在的化疗治疗法依然会对人体造成一定的副作用。因此，对新型有效的精准治疗方法的研究仍迫在眉睫。

小分子靶向药物因其在体的有效性和明确的靶向性逐渐成为抗肿瘤研究的热点。达沙替尼作为新型的白血病化疗药具有很好的靶向和治疗效果，用于已经治疗，包括甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate/Gleevec)耐药或不能耐受的慢性骨髓性白血病所有病期(慢性期、加速期、淋巴系细胞急变期和髓细胞急变期)的成人患者。同时，FDA也经正常程序批准达沙替尼治疗对其他疗法耐药或不能耐受的费城染色体阳性的急性淋巴细胞性白血病成人患者。酞菁类光敏剂具有很好的光动力效果，在肿瘤治疗领域已受到越来越广泛的关注和研究，但其存在着溶解性差，缺乏靶向性等缺点。因此，我们通过三缩四乙二醇链将酞菁光敏剂和小分子靶向药达沙替尼结合，解决了酞菁类光敏剂的溶解性和靶向性问题，大大提高了光动力治疗效果，实现了化疗光动力治疗的联合作用，开辟了一种新型有效的治疗急性白血病的药物的道路。

发明内容

本发明的目的在于提供用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物的制备方法，其通过将小分子靶向药达沙替尼与三缩四乙二醇链修饰的酞菁光敏剂共价连接，使光敏剂对白血病细胞具备特异性杀伤，得到了一种具有较高生物相容性，较好靶向性，毒副作用小的新型药物；本发明合成的化合物结构单一，不存在异构体，产品容易提纯；合成方法比较简单，副反应少，产率较高，原料易得，成本低，有利于工业化生产。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物的制备方法包括以下步骤：

（1）将

、

按摩尔比1:1加入至15mL N,N-二甲基甲酰胺中，常温条件搅拌溶解，然后滴加入1.8当量的三乙胺，常温反应48h；真空旋干有机溶剂，然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到黄白色固体化物KD1，其化学结构为：

；

（2）将

0.87g、无水碳酸钾2.75g, 溶解于15mL 无水乙腈中，反应加热至70℃时，将

0.97g加入到反应体系中，随后升温至85℃回流7h，N₂保护；反应完成后，真空旋干溶剂，用二氯甲烷溶解，饱和食盐水萃取，收集有机层并真空旋干，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离，得到淡白色固体化合物KD2，其化学结构为：

；

（3）将步骤（2）得到的KD2、

按摩尔比1:10加入至10mL无水正戊醇中，升温至100℃搅拌溶解，直到溶液变澄清，然后再加入5当量的无水醋酸锌，升温至130℃，待溶液变为浅绿色时，向反应体系中加入0.8mLDBU，继续反应7h，反应过程中N2保护，反应后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到绿色固体化合物KD3，其化学结构为

；

（4）将步骤（1）得到的KD1、EDCI按摩尔比1:1加入至无水DMF中，反应搅拌20min，随后滴加入1当量DMF溶解的KD3以及0.01当量的DMAP，常温反应24h，反应过程中N2保护，反应后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到绿色固体KD4，即为用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物，其化学结构为：

。

光动力治疗（Photodynamic Therapy，PDT)是一种新型、微创的肿瘤治疗方法。其基本要素包括光敏剂、一定波长的光和分子氧。光敏剂作为光动力治疗的催化剂，是光动力治疗的核心。理想的光敏剂最好满足以下几条：组分单一，结构明确，性质稳定；特异靶向性强；暗毒性弱而光毒性强；光敏化能力强，单线态氧量子产率高；最长激发波长位于近红外区，在光动力治疗窗口（650-800 nm）有较强吸收。酞菁衍生物因具有优良的光物理、光化学性质（较高的摩尔消光系数和荧光量子产率，对化学环境较不敏感等）而成为理想的光敏剂之一。本发明合成了在近红外区具有较强吸收的酞菁类衍生物，通过三缩四乙二醇的修饰增加了其溶解性，从而增强了单线态氧量子产率和光毒性。

本发明首先将达沙替尼羧基化，然后通过合成三缩四乙二醇和三硝基邻苯二甲腈单体，再到酞菁母体，再通过酯化反应，得到靶向药修饰后的酞菁类衍生物KD4。本发明以小分子靶向药与三缩四乙二醇链修饰的酞菁光敏剂为研究对象，以人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞CCRF-CEM为受试细胞株，展开了其体外和体内抗白血病活性的研究。

本发明的显著优点在于：

（1）三缩四乙二醇链能增强酞菁光敏剂分子的两亲性，当其修饰到酞菁光敏剂上能有效增强癌细胞对酞菁光敏剂的摄取，提高光动力治疗的效果；同时其最大吸收位于红光区，激发光穿透组织能力较强，光动力治疗时不易造成皮肤光毒性，是较为理想的光敏剂。

（2）小分子靶向药修饰后的酞菁衍生物的对白血病细胞的靶向性更强，并对其表现出一定的化疗作用，而对正常组织无明显杀伤。

（3）目标化合物结构单一，不存在异构体，产物容易纯化。

（4）合成方法简单，副反应少，原料易得，成本低，有利于工业化生产。

附图说明

图1为不同药物组的肿瘤体积变化曲线图。

具体实施方式

下面结合对比例和实施例对本发明做进一步的阐述，但不是对本发明的限定。

实施例1

（1）将

、

；1H NMR (400 MHz, DMSO) δ11.45 (s, 1H), 9.89 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.38 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.27(dd, J = 10.6, 7.5 Hz, 2H), 6.06 (s, 1H), 4.15 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.50 (s,4H), 2.58 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.49 (s, 8H) , 2.40 (s, 3H), 2.23 (s, 3H)..13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 172.60 (s), 165.63 (s), 162.93 (d, J = 18.8 Hz),160.41 (s), 157.43 (s), 141.34 (s), 139.30 (s), 134.03 (s), 132.93 (s),129.48 (s), 128.62 (s), 127.47 (s), 126.18 (s), 83.12 (s), 61.97 (s), 58.95(s), 56.42 (s), 53.18 (s), 52.86 (s), 44.04 (s), 29.29 (s), 26.05 (s), 18.79(s). HRMS (ESI): m/z calcd for [M + H]⁺C₂₆H₃₁ClN₇O₅S, 588.1790; found,588.1806。

（2）将

；1H NMR (400 MHz, DMSO)δ7.86 (t, J =8.0 Hz, 1H), 7.68 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 4.56 (s, 1H), 4.38 (s, 2H), 3.82 (s,2H), 3.63 (s, 2H), 3.51 (dd, J = 15.2, 7.7 Hz, 8H), 3.41 (s, 2H).13C NMR (101MHz, DMSO) δ 161.47 (s), 136.22 (s), 126.28 (s), 119.33 (s), 116.27 (s),115.86 (s), 114.12 (s), 103.46 (s), 72.81 (s), 70.58 (s), 70.31 (s),70.28(s),70.23v, 69.94 (s), 68.98 (s), 60.69 (s). HRMS(ESI): m/z calcd for [M + H]⁺C₁₆H₂₁ N₂O₅, 321.1445; found, 321.1447。

（3）将步骤（2）得到的KD2、

；1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.25 (dd, J =9.8, 6.6 Hz, 4H), 9.20 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 9.11 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.75(d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.16 (dt, J = 16.8, 5.8 Hz, 6H), 7.97 (t, J = 7.6 Hz,1H), 7.58 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.82 (m, 2H), 4.53 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.37(m, 2H), 4.07 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.76 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.59(m, 2H),3.49 (dd, J = 5.6, 4.1 Hz, 2H), 3.42 (m, 2H), 3.38 (s, 2H).HRMS (ESI): m/zcalcd for [M + H] ⁺C₄₀H₃₃N₈O₅Zn, 769.184; found, 769.1884

（4）将步骤（1）得到的KD1、EDCI按摩尔比1:1加入至无水DMF中，反应搅拌20min，随后滴加入1当量DMF溶解的KD3以及0.01当量的DMAP，常温反应24h，反应过程中N2保护，反应后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到绿色固体KD4，即为用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物；其化学结构为：

，

1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 11.47 (s, 1H), 9.91 (s, 1H), 9.25 – 8.92 (m,6H), 8.61 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.18 – 8.05 (m, 6H), 7.87 (t, J= 7.6 Hz, 1H), 7.44 (dd, J = 23.6, 4.9 Hz, 2H), 7.29 (dd, J = 7.7, 4.7 Hz,2H), 6.00 (s, 1H), 4.79 – 4.71 (m, 2H), 4.38 – 4.30 (m, 2H), 4.05 (dd, J =10.6, 6.1 Hz, 6H), 3.74 (dd, J = 5.8, 3.9 Hz, 2H), 3.68 – 3.46 (m, 8H), 3.41(d, J = 19.6 Hz, 4H), 2.48 (s, 4H), 2.41 (d, J = 7.5 Hz, 4H), 2.39 (s, 3H),2.26 (s, 3H).HRMS (ESI): m/z calcd for [M + H]⁺C₆₆H₆₁N₁₅O₉SZnCl, 1338.3450;found, 1338.3472。

对照药物M的制备方法;

将化合物

、

按摩尔比1:10加入至10mL无水正戊醇中，升温至100℃搅拌溶解，直到溶液变澄清，然后再加入5当量的无水醋酸锌，升温至130℃，待溶液变为浅绿色时，向反应体系中加入0.8mLDBU，继续反应7h，反应过程中N2保护。反应后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到绿色固体化合物M，其化学结构为

。

应用例1

对实施例1制得的用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物的离体光动力活性进行了研究。光敏剂的细胞毒性实验通常包括光毒性和暗毒性两部分，采用CCK-8法测定。检测原理是CCK-8试剂中含有WST–8:化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。根据测得的OD值，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

CCK-8实验：

a. 细胞铺板：选取生长状态良好的CCRF-CEM细胞，稀释细胞使细胞密度为1×10⁵个/ mL，使用排枪将细胞均匀加入至96孔板中，每个浓度数据设置6个复孔，每孔加入180μL细胞悬液。

b. 加药：配制药物浓度分别为1 mM，0.5 mM，0.25mM，0.125 mM，0.0625 mM，0.03125mM，的DMSO母液（含5% CEL)。量取1μL母液稀释至1 mL 1640培养基中，最终得对数浓度依次为1μM，0.5μM，0.25μM，0.125μM ，0.0625μM ，0.03125μM。相对应的药物孔中，加入20μL的对应药物浓度，最终使得药物梯度为 0.1μM，0.05μM，0.025μM，0.0125μM ，0.00625μM ，0.003125μM。96孔板放在细胞培养箱中继续培养过夜，使细胞摄取药物。

c. 光毒暗毒实验：吸出旧的培养基置于500 μL的离心管中，1000rpm离心4min，然后弃去上清液，用200 μL新的培养基重悬并转移到新的96孔板中。光毒实验中，使用670 nmLED灯光照2 min后放入培养箱过夜。对照组暗毒实验，更换新的培养基后，无需光照，放培养箱培养过夜。

d. OD值的检测：培养结束后，用移液枪每个孔中加入配制好的CCK-8溶液20 μL，并在摇床上震荡5min，随后将96孔板继续放入培养箱中培养4 h。用酶标仪测定溶液在450nm处的OD值。

我们采用CCK-8法测定了用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物，在光照和无光照条件下，对人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞CCRF-CEM的杀伤效果，光照波长为670 nm，光照能量密度为2.4 J·cm^-2。由实验数据可知：在无光照条件下，药物浓度为0.1μM时，用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物对细胞无明显的杀伤作用；而在光照条件下，药物组和对照组在0.1 μM时对细胞则均表现出很强的光毒性，其半数抑制浓度（IC₅₀值）分别为0.010μmol和0.013μmol（见表1）。

表1 三缩四乙二醇链修饰的酞菁类衍生物以及对照药物的IC₅₀值

应用例2

对实施例1制得的用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物的体内的光动力活性进行研究。光敏剂的体内光动力活性通过药物对人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞CCRF-CEM肿瘤裸鼠模型的抑瘤效果体现。

抑瘤率实验：

（1）取生长状态良好的CCRF-CEM细胞，经过离心重悬细胞并将细胞密度调整为5×10⁸个/mL。小鼠前肢右侧经75%酒精消毒后，皮下接种细胞悬液200 μL，待肿瘤的平均尺寸达到100 mm³后进行实验。

（2）将小鼠分为4组（KD4组、M组、DS组，生理盐水组），每组5只小鼠。给药前，称量裸鼠体重和测量肿瘤大小，随后每只小鼠按分组分别静脉注射相应药物（75μM，200 μL）和生理盐水溶液，给药6h后，使用670 nm激光器照射肿瘤区域10 min，同时每天固定时间点称量体重和测量肿瘤体积。（V=0.5×L×W²；L、W分别表示肿瘤的长度与宽度)

我们通过制备的用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物，在光照条件下，对人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞CCRF-CEM肿瘤裸鼠模型的抑制效果进行实验，以此体现药物在体内的光动力活性。由实验数据可知：在光照条件下，KD4药物表现出很强的光毒性，肿瘤体积逐渐变小。而对照药物和其他对照组对肿瘤的光动力效果较差，肿瘤体积呈不可控式增长（见附图1）。该实验结果表明：用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物对小鼠体内肿瘤组织表现出较强光动力效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物，其特征在于：所述酞菁衍生物的化学结构式为：

；

所述用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物的制备方法：所述酞菁衍生物是通过三缩四乙二醇将酞菁分子与小分子靶向药达沙替尼共价连接得到用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物；

所述制备方法具体包括以下步骤：

(1)将

、

按摩尔比1:1加入至15 mL N,N-二甲基甲酰胺中，常温条件搅拌溶解，然后滴加入1.8当量的三乙胺，常温反应48h；真空旋干有机溶剂，然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到黄白色固体化物KD1，其化学结构为：

；

(2)将

；

(3)将步骤（2）得到的KD2、

；

(4)将步骤（1）得到的KD1、EDCI按摩尔比1:1加入至无水DMF中，反应搅拌20min，随后滴加入1当量DMF溶解的KD3以及0.01当量的DMAP，常温反应24h，反应过程中N2保护，反应后减压旋干；然后以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，硅胶柱层析分离得到绿色固体KD4，即为用于急性淋巴细胞白血病的靶向光动力治疗的酞菁衍生物。