CN114306624B - 一种新型光敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型光敏剂及其制备方法和应用，其制备方法包括如下步骤：D‑生物素的甲醇悬浊液中加入氯化亚砜，室温下搅拌过夜，直至反应液澄清透明，减压蒸馏后得到白色固体；将其分散到甲醇中，边搅拌边缓慢滴加水合肼，加热，反应10‑18h；冷却至室温，减压蒸馏，倒入甲醇，抽滤，用甲醇洗涤数次，得到白色粉末状的化合物Ⅰ；氮气气氛下，将终端带羧基的光敏剂化合物Ⅱ溶解在无水DMF中，0℃下，加入EDCI、HOBt与DIEA反应2小时后，加入化合物Ⅰ，室温搅拌24h；减压蒸馏，纯化后得化合物Ⅲ。本发明所制备的新型光敏剂能够解决光动力治疗中对于氧气的高度依赖性的问题，在常氧和乏氧状态下都具有良好的治疗效果。

Description

一种新型光敏剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及光敏剂技术领域，特别涉及一种新型光敏剂及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤已经成为当今人类生命健康的重大威胁，如何有效地诊断和治疗癌症是相关学者一直致力于研究的热点。光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)作为一种新型的、非侵入式的治疗方法，具有肿瘤靶向性、暗毒性低、治疗时间短以及重复性高等优势。

光敏剂(Photosensitizers,PS)可以将光能转化为活性氧物种(ROS)来诱导细胞凋亡和组织损伤。根据不同的光化学反应过程，PDT主要有两个类型：一型PDT和二型PDT。其中，后者是目前大多数光敏剂的主导机制。但是，基于生成¹O₂的二型PDT高度依赖周围的氧气，这与肿瘤乏氧的固有特性相冲突。而一型PDT能够在缺氧环境下表现良好。这是因为与二型途径中激发态光敏剂直接把能量转移到O₂不同，一型机制是激发态光敏剂通过电子转移将电子或氢质子转移给周围的底物，从而产生自由基物种(如超氧阴离子自由基O₂ ^-·，过氧化物O₂ ^2-，羟基自由基OH·等)。在这些自由基中，过量的O₂ ^-·是最具毒性的ROS之一，它可以与蛋白质、DNA和脂质反应，对细胞造成不可逆的损害。此外，O₂ ^-·可以参与超氧化物歧化酶(SOD)介导的歧化反应，这将实现O₂的再利用并引发其他高毒性ROS的形成。

然而目前关于如何诱导或增强光敏剂的一型光动力机制的策略还很匮乏。因此，开发应对肿瘤乏氧的光敏剂的制备方法具有重要意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种新型光敏剂及其制备方法和应用，以达到解决光动力治疗中对于氧气的高度依赖性的问题，在常氧和乏氧状态下都具有良好的治疗效果的目的。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种新型光敏剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)D-生物素的甲醇悬浊液中加入氯化亚砜，室温下搅拌过夜，直至反应液澄清透明，减压蒸馏后得到白色固体；将其分散到甲醇中，边搅拌边缓慢滴加水合肼，加热至60-80℃，反应10-18h；冷却至室温，减压蒸馏，倒入甲醇，抽滤，用甲醇洗涤数次，得到白色粉末状的化合物Ⅰ；

(2)氮气气氛下，将终端带羧基的光敏剂化合物Ⅱ溶解在无水DMF中，0℃下，加入EDCI、HOBt与DIEA反应2小时后，加入化合物Ⅰ，室温搅拌24h；减压蒸馏，纯化后得到新型光敏剂化合物Ⅲ；

上述方案中，所述化合物Ⅱ选自DCF-TFM、FL、PpIX。

上述方案中，步骤(1)中，所述生物素、氯化亚砜、水合肼的摩尔比为1：(3～5)：(5～10)。

上述方案中，步骤(2)中，所述化合物Ⅱ与EDCI、HOBt、DIEA以及化合物Ⅰ的摩尔比为1：(1～6)：(1～6)：(1～3)：(0.8～4)。

一种如上所述的制备方法制得的新型光敏剂。

一种如上所述的制备方法制得的新型光敏剂在光动力治疗中的应用。

通过上述技术方案，本发明提供的新型光敏剂及其制备方法和应用具有如下有益效果：

本发明将具有肿瘤靶向性的生物素单元共价修饰到终端带羧基的光敏剂的分子结构中，由于肿瘤靶向结构单元(D-生物素)独特的富电子特征，可以诱发或增强该类光敏剂的一型光动力治疗的机制，使得一型和二型光动力机制同时起作用。

本发明制得的新型光敏剂可以解决光动力治疗过程中存在的对于氧气严重依赖的问题，实现了低氧肿瘤微环境的高效治疗。

同时，本发明不仅适用于延迟荧光光敏剂，也适用于临床用的原卟啉光敏剂PpIX，展现出突出的普适性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1制得的光敏剂化合物Ⅲa的高分辨质谱表征图。

图2为实施例1制得的光敏剂化合物Ⅲa的核磁共振氢谱表征图。

图3为实施例2制得的光敏剂化合物Ⅲb的高分辨质谱表征图。

图4为实施例2制得的光敏剂化合物Ⅲb的核磁共振氢谱表征图。

图5为实施例3制得的光敏剂化合物Ⅲc的高分辨质谱表征图。

图6为实施例3制得的光敏剂化合物Ⅲc的核磁共振氢谱表征图。

图7为光敏剂化合物Ⅲa与化合物Ⅱa在乙醇中的吸收以及发射光谱图，(a)为吸收光谱图，(b)为发射光谱图。

图8为光敏剂化合物Ⅲb与化合物Ⅱb在乙醇中的吸收以及发射光谱图，(a)为吸收光谱图，(b)为发射光谱图。

图9为光敏剂化合物Ⅲc与化合物Ⅱc在乙醇中的吸收以及发射光谱图，(a)为吸收光谱图，(b)为发射光谱图。

图10为光敏剂化合物在乙醇中的¹O₂产生速率曲线图，(a)为化合物Ⅲa与化合物Ⅱa，(b)为化合物Ⅲb与化合物Ⅱb，(c)为化合物Ⅲc与化合物Ⅱc。

图11为光敏剂化合物Ⅲa、化合物Ⅱa以及化合物Ⅱa与化合物Ⅰ的混合物在水中的O₂ ^-·产生能力曲线图，(a)为化合物Ⅲa，(b)为化合物Ⅱa，(c)为化合物Ⅱa与化合物Ⅰ等摩尔比混合。

图12为光敏剂化合物Ⅲb、化合物Ⅱb以及化合物Ⅱb与化合物Ⅰ的混合物在水中的O₂ ^-·产生能力曲线图，(a)为化合物Ⅲb，(b)为化合物Ⅱb，(c)为化合物Ⅱb与Ⅰ等摩尔比混合。

图13为光敏剂化合物Ⅲc、化合物Ⅱc以及化合物Ⅱc与化合物Ⅰ的混合物在水中的O₂ ^-·产生能力曲线图，(a)为化合物Ⅲc，(b)为化合物Ⅱc，(c)为化合物Ⅱc与化合物Ⅰ等摩尔比混合。

图14为光敏剂化合物Ⅲa对生物素表达水平不同的两种细胞的共聚焦荧光成像图。

图15为光敏剂化合物Ⅱa对生物素表达水平不同的两种细胞的共聚焦荧光成像图。

图16为光敏剂化合物Ⅲa在常氧(21％)和乏氧(1％)情况下，对MCF-7细胞的暗毒性图。

图17为光敏剂化合物Ⅲa在常氧(21％)和乏氧(1％)情况下，对MCF-7细胞的光毒性图。

图18为常氧(21％)和乏氧(1％)情况下，有无光照时光敏剂化合物Ⅲa、化合物Ⅱc、化合物Ⅲc诱导MCF-7细胞内活性氧的产生情况。

图19为为常氧(21％)和乏氧(1％)下，有无光照时光敏剂化合物Ⅲa、化合物Ⅱc、化合物Ⅲc诱导MCF-7细胞内O₂ ^-·的产生情况。

图20为光敏剂化合物的循环伏安曲线，(a)为化合物Ⅲa与化合物Ⅱa，(b)为化合物Ⅲb与化合物Ⅱb，(c)为化合物Ⅲc与化合物Ⅱc。

图21为三重态光敏剂化合物Ⅲa的不同构型，(a)为最优构型，(b)为最高占有轨道构型，(c)为最低空轨道构型。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

(1)化合物Ⅰ的合成

D-生物素(300mg,1.23mmol)的10mL甲醇悬浊液中加入氯化亚砜(0.3mL,4.0mmol)，室温下搅拌过夜，直至反应液澄清透明。减压蒸馏后得到白色固体。将其分散到10mL甲醇中，边搅拌边缓慢滴加水合肼(0.48mL,10mmol)，加热至70℃，反应12h。冷却至室温，减压蒸馏，倒入大量冰冷的甲醇，抽滤，用甲醇洗涤三次，得到白色粉末状的化合物Ⅰ。

(2)化合物Ⅲa的合成

氮气气氛下，将化合物Ⅱa(DCF-TFM,20.4mg,0.025mmol)溶解在5mL无水DMF中，0℃下，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(24mg,0.125mmol)，1-羟基苯并三唑(HOBt)(17mg,0.125mmol)与N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(12.4μL,0.075mmol)反应2h后，加入化合物Ⅰ(13mg,0.05mmol)，室温搅拌24h。减压蒸馏，采用柱色谱法(甲醇/二氯甲烷的体系＝1/8)纯化后得到光敏剂化合物Ⅲa。化合物Ⅲa的高分辨质谱表征图和核磁共振氢谱表征图分别如图1和图2所示。

实施例2

(1)化合物Ⅰ的合成同实施例1。

(2)化合物Ⅲb的合成

氮气气氛下，将化合物Ⅱb(FL,50mg,0.065mmol)溶解在5mL无水DMF中，0℃下，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(62.8mg,0.33mmol)，1-羟基苯并三唑(HOBt)(44mg,0.33mmol)与N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(32μL,0.2mmol)反应2h后，加入化合物Ⅰ(33.5mg,0.13mmol)，室温搅拌24h。减压蒸馏，采用柱色谱法(甲醇/二氯甲烷体系＝1/8)纯化后得到光敏剂化合物Ⅲb。化合物Ⅲb的高分辨质谱表征图和核磁共振氢谱表征图分别如图3和图4所示。

实施例3

(1)化合物Ⅰ的合成同实施例1。

(2)化合物Ⅲc的合成

氮气气氛下，将化合物Ⅱc(PpIX,30mg,0.053mmol)溶解在3mL无水DMF中，0℃下，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(10.56mg,0.053mmol)，1-羟基苯并三唑(HOBt)(7.43mg,0.053mmol)与N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(8.75μL,0.053mmol)反应2h后，加入化合物Ⅰ(15.3mg,0.05mmol)，室温搅拌24h。减压蒸馏，采用柱色谱法(甲醇/二氯甲烷体系＝1/8)纯化后得到光敏剂化合物Ⅲc。化合物Ⅲc的高分辨质谱表征图和核磁共振氢谱表征图分别如图5和图6所示。

图7为光敏剂化合物Ⅲa与化合物Ⅱa在乙醇中的吸收以及发射光谱，图8为光敏剂化合物Ⅲb与化合物Ⅱb在乙醇中的吸收以及发射光谱，图9为光敏剂化合物Ⅲc与化合物Ⅱc在乙醇中的吸收以及发射光谱。如图7-9所示，光敏剂化合物Ⅲ与化合物Ⅱ的吸收和发射光谱几乎一致，生物素的引入并不会影响光敏剂的光物理性质。特别地，化合物Ⅲa在400-700nm范围内具有更广泛的吸收，使其成为捕获白光的理想光敏剂。并且化合物Ⅲa的最大发射可达到750nm。同时生物素的引入赋予了化合物Ⅲa靶向肿瘤细胞的能力。由此可见，化合物Ⅲa在近红外生物成像和图像引导白光诱导的光动力治疗恶性肿瘤方面具有应用前景。

图10为不同光敏剂在乙醇中的¹O₂产生速率曲线图。选择¹O₂诱捕剂1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)进行¹O₂检测。记录20mW/cm²白光(400-800纳米)照射下，DPBF在412nm处的吸光度随时间的下降。从图中可以看出，DPBF在化合物Ⅲ与化合物Ⅱ的分别作用下的降解速率几乎不变。说明生物素的引入并没有影响光敏剂单线态氧的产生能力。

图11为光敏剂化合物Ⅲa、化合物Ⅱa以及化合物Ⅱa与化合物Ⅰ的混合物在水中的O₂ ^-·产生能力曲线图，图12为光敏剂化合物Ⅲb、化合物Ⅱb以及化合物Ⅱb与化合物Ⅰ的混合物在水中的O₂ ^-·产生能力曲线图，图13为光敏剂化合物Ⅲc、化合物Ⅱc以及化合物Ⅱc与化合物Ⅰ的混合物在水中的O₂ ^-·产生能力曲线图。选择O₂ ^-·捕获剂氯化硝基四氮唑兰(NBT)进行O₂ ^-·检测。记录20mW/cm²白光(400-800纳米)照射下，NBT在260nm处的吸光度随时间的下降。化合物Ⅱ在光照下O₂ ^-·的产生明显少于化合物Ⅲ。并且化合物Ⅱ与化合物Ⅰ等摩尔比混合之后的结果与单独化合物Ⅱ在光照下产生O₂ ^-·的能力几乎没有变化，表明由生物素共价修饰的光敏剂对O₂ ^-·的产生有积极的影响。特别地，与化合物Ⅱa、化合物Ⅱb相比，化合物Ⅱc是众所周知的典型的一型PS，其在较长时间的照射下也没有产生明显的O₂ ^-·。因此，化合物Ⅲc的O₂ ^-·生成能力应归因于生物素的引入。这种出乎意料的生物素化策略表明，生物素化光敏剂可以同时具有O₂ ^-·和¹O₂的产生能力，从而缓解传统PDT对氧气的依赖性。

图14和图15分别为光敏剂化合物Ⅲa以及化合物Ⅱa对生物素表达水平不同的两种细胞的共聚焦荧光成像。结果表明：化合物Ⅲa(10μM)与生物素受体阴性(COS-7，非洲绿猴肾源细胞)细胞和生物素受体阳性(MCF-7，乳腺癌细胞)细胞分别孵育4h后，前者中没有荧光出现，而后者细胞内有明显的荧光出现。化合物Ⅱa(10μM)与这两种细胞分别孵育4h后，两种细胞中均未出现荧光。由此可见，生物素的引入赋予了光敏剂Ⅲa肿瘤靶向能力。

图16为光敏剂化合物Ⅲa在常氧(21％)和乏氧(1％)情况下，对MCF-7细胞的暗毒性图，图17为光敏剂化合物Ⅲa在常氧(21％)和乏氧(1％)情况下，对MCF-7细胞的光毒性图。光动力实验中采用12W的白光(400-800nm)LED，光密度为20mW/cm²，光照时间为10min。结果表明：黑暗条件下，化合物Ⅲa对MCF-7几乎没有毒性，展示了化合物Ⅲa良好的生物相容性。而在光照条件下，对MCF-7细胞有显著的抑制作用。另外，在乏氧条件下化合物Ⅲa对肿瘤细胞的抑制作用仍能达到50％以上。这表明化合物Ⅲa的光细胞毒性主要归因于低氧条件下产生的其他ROS。根据图10的结果，其他ROS应该是O₂ ^-·。由此可见，化合物Ⅲa可以有效缓解光动力治疗对氧气的高度依赖性。

图18为常氧(21％)和乏氧(1％)下，有无光照时光敏剂化合物Ⅲa(a)、化合物Ⅱc(b)、化合物Ⅲc(c)诱导MCF-7细胞内活性氧的产生情况。选择2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为活性氧指示剂，可被ROS氧化成DCF，发出绿色荧光。常氧条件下，光照组均观察到DCF的荧光，这意味着MCF-7细胞中化合物Ⅲa、化合物Ⅱc、化合物Ⅲc的光活化均可使细胞内ROS水平升高。即使在缺氧环境中，DCF的明显荧光仍然在MCF-7细胞中检测到，这突出表明氧气对化合物Ⅲa和化合物Ⅲc产生活性氧的能力并没有严重的影响。相比之下，乏氧下，化合物Ⅱc经过光照没有产生任何活性氧物质。这意味着生物化的光敏剂提供了其他的ROS而不仅仅是¹O₂来杀死肿瘤细胞。

图19为常氧(21％)和乏氧(1％)下，有无光照时光敏剂化合物Ⅲa、化合物Ⅱc、化合物Ⅲc诱导MCF-7细胞内O₂ ^-·的产生情况。选择二氢乙锭(DHE)作为O₂ ^-·检测试剂，其氧化产物可插入DNA，发出红色荧光。无论是常氧还是乏氧，经过光照化合物Ⅲa和Ⅲc都可诱导MCF-7细胞内O₂ ^-·的产生，而典型的二型光敏剂化合物Ⅱc不可以。表明生物素的共价引入的确可以诱导O₂ ^-·的产生。并且O₂ ^-·还可以被细胞内的超氧化物歧化酶(SOD)催化，并通过Haber-Weiss反应和Fenton反应转化为其他高细胞毒性的自由基(如OH·)，实现O₂的再利用。这种涉及O₂ ^-·产生的一型机制将为PDT提供更令人满意的疗效。

图20为生物素化效应的机制探索，循环伏安曲线以二茂铁(Fc)作为外部标准。如图20所示，所有这三种带有生物素化的光敏剂都显示出比它们相应的没有生物素化的光敏剂更低的还原电位。光敏剂还原电势的阳极移动有利于它们接受电子，这使它们更有可能通过一型机制产生更多的O₂ ^-·。

一型PDT机制如下所示：

³光敏剂^＊+基质→基质^-·+光敏剂^-·

光敏剂^-·+氧气→光敏剂+O₂ ^-·

如图21所示的构型，三重态PS通过接受相邻底物的电子并将外部电子传递给氧以形成O₂ ^-·。根据理论计算的结果，化合物Ⅲa的折叠构象支持生物素部分和PS部分之间可以发生更有效的电子转移。因此，生物素以分子内的方式充当了一个富含电子的底物，这有利于向一型PDT机制倾斜。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种光敏剂，其特征在于，其结构式如下所示：

所述光敏剂包括如下三种：

所述光敏剂的制备方法包括如下步骤：

(1)D-生物素的甲醇悬浊液中加入氯化亚砜，室温下搅拌过夜，直至反应液澄清透明，减压蒸馏后得到白色固体；将其分散到甲醇中，边搅拌边缓慢滴加水合肼，加热至60-80℃，反应10-18h；冷却至室温，减压蒸馏，倒入甲醇，抽滤，用甲醇洗涤数次，得到白色粉末状的化合物Ⅰ；

(2)氮气气氛下，将终端带羧基的光敏剂化合物Ⅱ溶解在无水DMF中，0℃下，加入EDCI、HOBt与DIEA反应2小时后，加入化合物Ⅰ，室温搅拌24h；减压蒸馏，纯化后得到新型光敏剂化合物Ⅲ；

2.根据权利要求1所述的一种光敏剂，其特征在于，所述化合物Ⅱ选自DCF-TFM、FL、PpIX；所述DCF-TFM、FL、PpIX的结构式分别如Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc所示：

3.根据权利要求1所述的一种光敏剂，其特征在于，步骤(1)中，所述生物素、氯化亚砜、水合肼的摩尔比为1：(3～5)：(5～10)。

4.根据权利要求1所述的一种光敏剂，其特征在于，步骤(2)中，所述化合物Ⅱ与EDCI、HOBt、DIEA以及化合物Ⅰ的摩尔比为1：(1～6)：(1～6)：(1～3)：(0.8～4)。

5.一种如权利要求1所述的光敏剂在制备光动力学药物中的应用。

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