CN113226329A - 识别癌细胞的抗体与链霉亲和素突变体的融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于提供:用于在癌症的治疗或诊断中使用的、识别癌细胞的抗体与链霉亲和素突变体的融合蛋白。根据本发明,提供融合蛋白,该融合蛋白从N末端侧到C末端侧依次具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7所记载的氨基酸序列、接头序列、和SEQ ID NO:1所记载的氨基酸序列(其中,C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部)。
Description
技术领域
本发明涉及识别癌细胞的抗体与链霉亲和素突变体的融合蛋白、以及其利用。
背景技术
亲和素与生物素、或者链霉亲和素与生物素之间的亲和性非常高(Kd=10-15~10-14M),作为生物双分子间的相互作用,这是最强的相互作用之一。目前,亲和素/链霉亲和素-生物素相互作用在生物化学、分子生物学或医学领域被广泛应用。已经设计了将亲和素/链霉亲和素与生物素的高结合能力和抗体分子组合的药物递送方法和预靶向法。关于这些研究,专利文献1中报道了:降低了对天然生物素的亲和性的链霉亲和素突变体、以及对于该对天然生物素呈低亲和性的链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素修饰二聚体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开WO2015/125820。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明以提供用于在癌症的治疗或诊断中使用的、识别癌细胞的抗体与链霉亲和素突变体的融合蛋白作为所应解决的课题。本发明还以提供使用了上述的融合蛋白的、癌症的治疗方法或癌症的诊断方法作为所应解决的课题。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题,本发明人进行了深入研究,结果选择抗CEA抗体和抗HER2抗体作为识别癌细胞的抗体,调制了上述抗体与链霉亲和素突变体的融合蛋白。而且,还发现了:通过使用了上述的融合蛋白、和生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物的光免疫疗法,可抑制癌细胞的生长,从而完成了本发明。
即,根据本发明,提供以下的发明。
<1>融合蛋白,该融合蛋白从N末端侧到C末端侧依次具有SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:7所记载的氨基酸序列、接头序列、和SEQ ID NO:1所记载的氨基酸序列(其中,C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部)。
<2><1>所述的融合蛋白,其中,接头序列的氨基酸数为5~15个氨基酸。
<3><1>或<2>所述的融合蛋白,其中,接头序列由4~14个甘氨酸残基和1个半胱氨酸残基构成。
<4><1>~<3>中任一项所述的融合蛋白,其中,接头序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly或Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly。
<5>融合蛋白,该融合蛋白具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8所记载的氨基酸序列(其中,C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部)。
<6><1>~<5>中任一项所述的融合蛋白,该融合蛋白进一步具有分泌信号序列。
<7>融合蛋白,该融合蛋白具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9所记载的氨基酸序列(其中,C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部)。
<8>核酸,该核酸编码具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8所记载的氨基酸序列(其中,C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部)的融合蛋白。
<9>核酸,该核酸编码具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9所记载的氨基酸序列(其中,C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部)的融合蛋白。
<10>癌症治疗药或癌症诊断药,其包含<1>~<7>中任一项所述的融合蛋白。
<11>癌症的治疗或诊断试剂盒,其包含:(1)<1>~<7>中任一项所述的融合蛋白;以及(2)下述式(1)所示的化合物或其盐与诊断用物质或治疗用物质的缀合物,
[化学式1]
式中,
X1a、X1b、X2a和X2b分别独立地表示O或NH,
Y1和Y2分别独立地表示C或S,
Z1和Z2分别独立地表示O、S或NH,
V1和V2分别独立地表示S或S+-O-,n1和n2分别独立地表示0或1的整数,
L1和L2分别独立地表示二价连接基,
L3是在末端包含可与诊断用物质或治疗用物质结合的官能团的基团,
L4表示三价连接基。
<12><11>所述的试剂盒,其中,诊断用物质或治疗用物质为酞菁染料。
发明效果
根据使用本发明的识别癌细胞的抗体与链霉亲和素突变体的融合蛋白,可抑制癌细胞的生长。
附图说明
[图1]图1显示结构域结构的概略(略图)。
[图2]图2显示CEA-V2122的SDS-PAGE电泳(泳動)CBB染色图像。
[图3]图3显示CEA-Cupid与抗原(CEACAM5)的结合性能评价。
[图4]图4显示CEA-Cupid与生物素修饰体的结合性能评价。
[图5]图5显示基于FITC标记CEA-V2122的细胞染色图像。
[图6]图6显示基于FITC标记CEA-V2122的细胞染色图像MKN45细胞时间系列数据。
[图7]图7显示结合有光活化化合物的生物素修饰体。
[图8]图8显示将CEA-Cupid与结合有光活化化合物的生物素修饰体组合的体外细胞毒性。
[图9]图9显示肿瘤块的大小的变化。
[图10]图10显示将CEA-Cupid与结合有光活化化合物的生物素修饰体组合的体内细胞毒性。
[图11]图11显示将CEA-Cupid与结合有光活化化合物的生物素修饰体组合的体内细胞毒性病理组织图像。
[图12]图12显示使用了抗CEACAM5抗体的病理切片的分析。
[图13]图13显示HER2-V2122结构图。
[图14]图14显示HER2-V2122的SDS-PAGE电泳CBB染色图像。
[图15]图15显示HER2-Cupid与抗原(HER2)的结合性能评价。
[图16]图16显示HER2-Cupid与生物素修饰体的结合性能评价。
[图17]图17显示将HER2-Cupid与结合有光活化化合物的生物素修饰体组合的体外细胞毒性。
具体实施方式
以下,更详细地对本发明进行说明。
<抗体与链霉亲和素突变体的融合蛋白>
本发明的融合蛋白是:从N末端侧到C末端侧依次具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7所记载的氨基酸序列、接头序列、和SEQ ID NO:1所记载的氨基酸序列(其中,C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部)的融合蛋白。本发明的融合蛋白可以是:从N末端侧到C末端侧依次具有抗桥粒芯糖蛋白抗体的氨基酸序列、接头序列、和SEQ IDNO:1所记载的氨基酸序列(其中,C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部)的融合蛋白。
SEQ ID NO:2所记载的氨基酸序列是scFv型抗CEACAM抗体的氨基酸序列。SEQ IDNO:7所记载的氨基酸序列是scFv型抗Her2抗体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1所记载的氨基酸序列是链霉亲和素突变体的氨基酸序列,具体而言,是国际公开WO2015/125820的实施例3(国际公开WO2015/125820的SEQ ID NO:4)(本申请说明书的SEQ ID NO:1)中记载的链霉亲和素突变体LISA314-V2122。
如上所述,本发明的融合蛋白是如上所述识别癌细胞的抗体与链霉亲和素突变体的融合蛋白。
对接头序列没有特别限定,只要达到本发明的效果即可,氨基酸数优选为5~15个氨基酸、更优选为7~13个氨基酸、进一步优选为9~11个氨基酸。
作为接头序列的具体例子,可列举:由4~14个甘氨酸残基和1个半胱氨酸残基构成的序列。作为接头序列,例如可使用(Gly)m-Cys-(Gly)n(m和n分别独立地表示1~13的整数)所示的氨基酸序列。作为接头序列的具体例子,可列举:Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly或Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly,但没有特别限定。
作为本发明的融合蛋白的具体例子,可列举:具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8所记载的氨基酸序列(其中,C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部)的融合蛋白。
本发明的融合蛋白可在其N末端具有分泌信号序列。作为具有分泌信号序列的融合蛋白,可列举:具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9所记载的氨基酸序列(其中,C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部)的融合蛋白。
根据本发明,还提供编码上述的本发明的融合蛋白的核酸(例如,DNA)。作为本发明的核酸的具体例子,可列举:编码具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:8所记载的氨基酸序列(其中,C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部)的融合蛋白的核酸。作为本发明的核酸的又一具体例子,可列举:编码具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9所记载的氨基酸序列(其中,C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部)的融合蛋白的核酸。
编码本发明的融合蛋白的核酸(例如,DNA)可插入到载体中进行使用。为了制造本发明的融合蛋白,可将编码本发明的融合蛋白的核酸插入到表达载体中,并将该表达载体转化到宿主中,从而可使本发明的融合蛋白表达。
在以大肠杆菌为宿主的情况下,作为载体,优选具有复制起点(ori)、还具有用于选择所转化的宿主的基因(例如,耐氨苄青霉素、四环素、卡那霉素或氯霉素等药剂的耐药性基因等)。另外,在表达载体的情况下,优选具有可使本发明的链霉亲和素突变体在宿主中高效率地表达的这样的启动子、例如lacZ启动子或T7启动子等。作为这样的载体,载体的例子可列举:M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress system”(Qiagen)、pEGFP、或pET(这种情况下,宿主优选使用表达T7 RNA聚合酶的BL21)等。
向宿主细胞中引入(导入)载体例如可采用氯化钙法、电穿孔法来进行。另外,可添加用于提高可溶性的标签、例如编码谷胱甘肽S-转移酶或硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白的序列。另外,还可添加以容易纯化为目的而设计的标签、例如多聚组氨酸标签、Myc表位、血凝素(HA)表位、T7表位、Xpress标签或FLAG肽标签、编码其他已知的标签序列的序列。
除大肠杆菌以外,还可列举:来自哺乳动物的表达载体(例如,pcDNA3(Invitrogen公司制造)或pEGF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990,18(17),第5322页)、pEF、pCDM8)、来自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(Gibco-BRL公司制造)、pBacPAK8)、来自植物的表达载体(例如,pMH1、pMH2)、来自动物病毒的表达载体(例如,pHSV、pMV、pAdexLcw)、来自逆转录病毒的表达载体(例如,pZIPneo)、来自酵母的表达载体(例如,“毕赤酵母表达试剂盒”(Invitrogen公司制造)、pNV11、SP-Q01)、来自枯草杆菌的表达载体(例如,pPL608、pKTH50)。
在以CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中的表达为目的的情况下,具有在细胞内表达所必需的启动子、例如SV40启动子(Mulligan等人,Nature(1979)277,108)、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人,Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)、CMV启动子等是必不可少的,进一步优选具有用于挑选向细胞内转化的基因(例如,可通过药剂(新霉素、G418等)判别的这样的耐药性基因)。作为具有这种特性的载体,例如可列举:pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。
对引入载体的宿主细胞没有特别限定,可以是原核生物和真核生物的任一种。例如,可使用大肠杆菌或各种动物细胞等。
在使用真核细胞的情况下,例如可将动物细胞、植物细胞、真菌细胞用于宿主。作为动物细胞,可使用哺乳类细胞、例如CHO细胞、COS细胞、3T3细胞、HeLa细胞、Vero细胞;或昆虫细胞、例如Sf9、Sf21、Tn5等。在动物细胞中,在以大量表达为目的的情况下,特别优选CHO细胞。向宿主细胞中引入载体例如可通过磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用了阳离子脂质体DOTAP(Boehringer Mannheim公司制造)的方法、电穿孔法、脂质转染等方法来进行。
作为植物细胞,例如来自烟草(Nicotiana tabacum)的细胞作为蛋白生产系统而已知,只要对其进行愈伤组织培养即可。作为真菌细胞,已知有:酵母、例如酵母(Saccharomyces)属、例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae);丝状真菌、例如曲霉(Aspergillus)属、例如黑曲霉(Aspergillus niger)。
在使用原核细胞的情况下,可列举:大肠杆菌(E.coli)、例如JM109、DH5α、HB101等,除此以外,还已知枯草杆菌。
利用本发明的核酸转化这些细胞,将所转化的细胞在体外进行培养,从而得到本发明的融合蛋白。培养可按照已知的方法来进行。例如,作为动物细胞的培养液,例如可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此时,还可并用胎牛血清(FCS)等血清补液,也可进行无血清培养。培养时的pH优选为约6~8。培养通常是在约30~40℃下进行约15~200小时,根据需要进行培养基的交换、通气、搅拌。另外,还可添加用于促进细胞生长的生长因子。
<癌症治疗药或癌症诊断药>
本发明的融合蛋白可用作癌症治疗药或癌症诊断药。
根据本发明,提供癌症的治疗或诊断试剂盒,该试剂盒包含:(1)本发明的融合蛋白;以及(2)下述式(1)所示的化合物或其盐与诊断用物质或治疗用物质的缀合物。
通过对患者给予本发明的融合蛋白,可使链霉亲和素突变体特异性地聚集于癌细胞。接下来,通过对患者给予对链霉亲和素突变体具有亲和性的生物素修饰二聚体与诊断用物质或治疗用物质的缀合物,可使诊断用物质或治疗用物质准确地聚集于癌细胞。
或者,还可调制使“本发明的融合蛋白”与“对链霉亲和素突变体具有亲和性的生物素修饰二聚体与诊断用物质或治疗用物质的缀合物”结合而成的复合物,对患者给予该复合物。
<生物素修饰二聚体>
生物素修饰二聚体是下述式(1)所示的化合物或其盐,优选为下述式(2)所示的化合物或其盐。生物素修饰二聚体可使用国际公开WO2015/125820号中记载的化合物。
[化学式2]
[化学式3]
式中,
X1a、X1b、X2a和X2b分别独立地表示O或NH,
Y1和Y2分别独立地表示C或S,
Z1和Z2分别独立地表示O、S或NH,
V1和V2分别独立地表示S或S+-O-,n1和n2分别独立地表示0或1的整数,
L1和L2分别独立地表示二价连接基,
L3是在末端包含可与诊断用物质或治疗用物质(例如,酞菁染料)结合的官能团的基团,
L4表示三价连接基。
式(1)和式(2)中,下述结构:
[化学式4]
所示的部分优选为下述的任一种,但并不限于这些:
[化学式5]
优选X1a、X1b、X2a和X2b表示NH,优选Y1和Y2表示C,优选Z1和Z2表示NH,优选V1和V2表示S。
L1和L2分别独立地优选为由选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO-、-CO-、-O-和碳原子数为1~10的亚烷基的基团的组合构成的二价连接基。
L1和L2分别独立地优选为由选自-CONH-、-NHCO-、-O-和碳原子数为1~10的亚烷基的基团的组合构成的二价连接基。
L1和L2分别独立地优选为由选自-CONH-、-NHCO-和碳原子数为1~10的亚烷基的基团的组合构成的二价连接基。
L4表示三价连接基,优选为:
[化学式6]
或
[化学式7]
(来源于苯的三价连接基或氮原子)。
L3优选为由选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO-、-CO-、-O-和碳原子数为1~10的亚烷基的基团的组合构成的基团,并且是在末端包含氨基的基团。
<生物素修饰二聚体与诊断用物质或治疗用物质的缀合物>
通过使诊断用物质或治疗用物质与生物素修饰二聚体结合,可调制生物素修饰二聚体与诊断用物质或治疗用物质的缀合物。作为诊断用物质或治疗用物质,可列举:荧光色素、化学发光剂、放射性同位素、由金属化合物等构成的敏化剂、由金属化合物等构成的中子捕获剂、酞菁染料、低分子化合物、微泡或纳米泡、蛋白等。可优选使用酞菁染料。
<酞菁染料>
酞菁染料优选为硅酞菁染料。像IRDye(注册商标)700DX这样的酞菁染料的具体例子,例如记载在美国专利第7,005,518号中。
作为酞菁染料,可使用下述式(21)所示的染料,作为一个例子,可使用下述式(22)所示的染料:
[化学式8]
[化学式9]
式中,L21表示二价连接基,R21表示可与式(1)所示的化合物或其盐结合的官能团。
X和Y分别独立地是亲水性基团、-OH、氢原子或取代基。作为这里所说的取代基,可列举:卤原子(氟原子)、包含碳原子的取代基(烃基等)、包含氮原子的取代基(氨基等)等,但没有特别限定。
作为X和Y的具体例子,可列举:
(i)X和Y均为亲水性基团的情况;
(ii)X和Y的一方为亲水性基团,X和Y的另一方为-OH或氢原子的情况;
(iii)X和Y为-OH或氢原子的情况。
对X和/或Y所示的亲水性基团没有特别限定,以下给出一个例子:[化学式10]
作为酞菁染料,可使用IRDye(注册商标)700DX等市售品。本发明中,使用IRDye(注册商标)700DX的NHS酯,使其与具有氨基的生物素修饰二聚体进行反应,从而可制造缀合物。IRDye(注册商标)700DX的其他变种记载在美国专利第7,005,518号中,也可使用它们。
R21表示可与式(1)所示的化合物或其盐结合的官能团。R21优选为可与生物素修饰二聚体上的羧基、胺或硫醇基进行反应并结合的官能团。R21可优选列举:活化酯、卤代酰基、卤代烷基、适当取代的胺、酸酐、羧酸、碳二亚胺、羟基、碘乙酰胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、NHS酯、亚磷酰胺、磺酸酯、硫醇或硫氰酸酯等,但没有特别限定。
L21表示二价连接基,例如可包含:醚、硫醚、胺、酯、氨基甲酸酯、脲、硫脲、氧或酰胺键的任意组合、或者碳-碳单键、碳-碳双键、碳-碳三键或芳族碳-碳键;或者磷-氧、磷-硫、氮-氮、氮-氧、或氮-铂键;或者芳族或杂芳族键。L21优选为由选自-CONH-、-NHCO-、-COO-、-OCO-、-CO-、-O-和碳原子数为1~10的亚烷基的基团的组合构成的基团。
-L21-R21可包含亚磷酰胺基、NHS酯、活性羧酸、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、和碘乙酰胺。
L21包含-(CH2)n-基,式中,n为1~10的整数,优选n为1~4的整数。作为一个例子,-L21-R21为-O-(CH2)3-OC(O)-NH-(CH2)5-C(O)O-N-琥珀酰亚胺基。
<光免疫疗法>
光免疫疗法是指为了在体内破坏特定的细胞而使用光敏剂和照射光的治疗方法。光敏剂在暴露于特异性波长的光时产生可诱发附近的细胞的凋亡、坏死和/或自噬作用的细胞毒性的活性氧种。例如,日本专利6127045号公报中记载了使细胞死亡的方法,该方法包括:使包含细胞表面蛋白的细胞与治疗有效量的一种或多种抗体-IR700分子接触的步骤,且该抗体与该细胞表面蛋白特异性地结合的步骤;以660~740nm的波长、且以至少1Jcm-2的放射剂量对该细胞进行照射的步骤;以及在对该细胞照射的约0~8小时后,使该细胞与一种或多种治疗药接触,由此使该细胞死亡的步骤。日本特表2017-524659号公报中记载了在患有疾病或病态的受试者中诱发细胞毒性的方法,该方法包括:(a)对受试者给予对治疗有效的药剂,该药剂包含在与该受试者的细胞特异性地结合的探针上缀合的IRDye(注册商标)700DX等酞菁染料;以及(b)以有效诱发细胞死亡的量对上述细胞照射适当的激发光。
对受试者给予本发明的融合蛋白、和生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物,以有效诱发细胞生长的抑制或细胞死亡的量对细胞照射激发光,从而可诱发细胞生长的抑制或细胞死亡,来治疗受试者。
优选对受试者给予本发明的融合蛋白、和生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物,以有效诱发细胞生长的抑制或细胞死亡的量对细胞照射激发光,从而可诱发细胞生长的抑制或细胞死亡,来治疗受试者。
作为受试者,包括人和非人哺乳动物,可列举人或小鼠等实验动物。作为受试者,优选患有希望抑制细胞生长或诱发细胞死亡的疾病的受试者,例如可列举具有癌症或实体瘤的受试者。
“癌症”可列举:癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或恶性淋巴瘤。作为癌症的具体例子,可列举:鳞状细胞癌(例如,鳞状上皮细胞癌)、包括小细胞肺癌在内的肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺腺癌和肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞性癌、包括消化系统癌症在内的胃体癌或胃癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾部癌、前列腺癌、外阴部癌、甲状腺癌、肝细胞癌瘤、肛门癌、阴茎癌、以及头颈部癌。
实体瘤无论是良性还是恶性通常是指不含包囊的异常细胞块。作为实体瘤,可列举:神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
作为对受试者的给予(给药)方法,可列举:局部途径、注射(皮下注射、肌肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、肿瘤内注射和静脉内注射等)、口服途径、眼途径、舌下途径、直肠途径、经皮途径、鼻腔内途径、阴道途径和吸入途径等,但并不限于这些。
生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物、和本发明的融合蛋白,分别优选以治疗有效量进行给予。关于上述的缀合物和融合蛋白的各自的治疗有效量,为每60千克给予至少0.5毫克(mg/60kg)、至少5mg/60kg、至少10mg/60kg、至少20mg/60kg、至少30mg/60kg、至少50mg/60kg。例如,在静脉内给予的情况下,为1mg/60kg、2mg/60kg、5mg/60kg、20mg/60kg或50mg/60kg的用量(剂量)等、例如0.5~50mg/60kg。在其他例子中,治疗有效量为至少100μg/kg、至少500μg/kg或至少500μg/kg等、至少10μg/kg,例如,在肿瘤内给予或腹腔内给予的情况下,为100μg/kg、250μg/kg、约500μg/kg、750μg/kg或1000μg/kg的用量等、例如10μg/kg~1000μg/kg。在一个例子中,治疗有效量为以局部用溶液进行给予的10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml或100μg/ml等、20μg/ml~100μg/ml之间等、至少500μg/ml等、至少1μg/ml。
可将上述的给予量通过1次或多次的分割用量(2、3或4次的用量等)或单一制剂进行给予。
生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物、和本发明的融合蛋白,可分别单独给予,也可在药学上可接受的载体的存在下进行给予,还可在其他治疗药(其他抗癌药等)的存在下进行给予。
生物素修饰二聚体与酞菁染料的缀合物、和本发明的融合蛋白,可与循环的肿瘤细胞或实体瘤的细胞等靶细胞或靶组织进行结合。之后,若照射光,则上述缀合物或复合物会吸收光,可损伤或破坏靶细胞或组织。
在光免疫疗法中,照射光的波长优选为660~740nm,例如具有660nm、670nm、680nm、690nm、700nm、710nm、720nm、730nm或740nm的波长。光的照射可通过使用具备近红外(NIR)发光二极管的装置来进行。
光的照射量为至少1J/cm2、例如至少4J/cm2、至少10J/cm2、至少15J/cm2、至少20J/cm2、至少50J/cm2、或至少100J/cm2、例如1~500J/cm2。光照射可实施多次(例如,2、3、4、5、6、7、8、9或10次)。
通过以下的实施例来进一步具体地说明本发明,但本发明并不受实施例的限定。
实施例
<制造例1>
[化学式11]
在1.8mg(1.6μmol)Psyche J中加入3.0mg(1.5μmol)IR Dye 700NHS酯、144μL磷酸氢二钠缓冲液(pH8.4)和120μL二甲基亚砜,用铝箔进行避光,在室温下搅拌24小时。将反应液用水稀释至500μL,所得的稀释液通过反相HPLC(梯度:0%5分钟、0-100%100分钟,乙腈的50mM三乙基乙酸铵水溶液(pH6.5),保留時间=47.2分钟,YMC-Triart C18,流速=3.5mL/分钟)进行纯化,从而得到了目标化合物1(深蓝绿色)。由针对IR700报道的水中694nm的摩尔吸光系数165,000(M-1cm-1)进行定量,算出了收率(1.0μmol,72%)。
LRMS(ESI):m/z 1303[M+2H]2+,869[M+3H]3+
<制造例2>
[化学式12]
在0.375mg(144nmol)化合物1中加入266μL 0.1%甲酸水溶液和133μL乙腈,用旋涡混合器搅拌,进行离心,之后在暗室、37℃的条件下静置90分钟。将其溶液通过反相HPLC(梯度:0%5分钟、0-100%100分钟,乙腈的50mM三乙基乙酸铵水溶液(pH6.5),保留時间=51.6分钟,YMC-Triart C18,流速=3.5mL/分钟)进行纯化,从而得到了目标化合物2(深蓝绿色)。同样地进行定量,算出了收率(48nmol,33%)。LRMS(ESI):m/z 1054[M-H2O+2H]2+,703[M-H2O+3H]3+
<制造例3>
[化学式13]
在0.375mg(144nmol)化合物1中加入266μL 0.1%甲酸水溶液和133μL乙腈,用旋涡混合器搅拌,进行离心,之后在暗室、37℃的条件下静置28小时。将其溶液通过反相HPLC(梯度:0%5分钟、0-100%100分钟,乙腈的50mM三乙基乙酸铵水溶液(pH6.5),保留時间=56.2分钟,YMC-Triart C18,流速=3.5mL/分钟)进行纯化,从而得到了目标化合物3(深蓝绿色)。同样地进行定量,算出了收率(15nmol,10%)。LRMS(ESI):m/z 813[M-H2O+2H]2+,542[M-H2O+3H]3+
实施例1:CEA-V2122蛋白的表达和纯化
V2122是国际公开WO2015/125820的实施例3(国际公开WO2015/125820的SEQ IDNO:4)中记载的链霉亲和素突变体。将V2122的氨基酸序列(在C末端具有6×His标签的序列)记载于序列表的SEQ ID NO:1中。
scFv-V2122是使抗CEACAM5的单链抗体(scFv)与上述的V2122结合而得到的。该scFv型的抗CEACAM5抗体为专利文献US7626011B2中记载的scFv序列。将scFv型的抗CEACAM5抗体的氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO:2中。另外,将CEA-V2122的氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO:3中,所述CEA-V2122的氨基酸序列是将scFv型的抗CEACAM5抗体和V2122通过氨基酸接头(GGGGSGGGG)(SEQ ID NO:11)结合而得到的。
为了表达CEA-V2122融合蛋白,使将用于在大肠杆菌中分泌表达的pelB信号插入N末端、并将6×His-Tag序列插入C末端而得到的CEA-V2122基因序列的DNA密码子在大肠杆菌中优化,进行了人工基因合成。将该氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO:4中、DNA序列记载于序列表的SEQ ID NO:5中。另外,结构域结构的概略见图1。
具体的蛋白表达载体使用了在pETDuet1载体的MCS2中插入有蛋白伴侣skp基因而得到的载体。对于skp基因,根据序列表的SEQ ID NO:6中记载的氨基酸序列,将密码子在大肠杆菌中优化,进行了DNA的人工基因合成。所合成的skp基因使用引物(AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT(SEQ ID NO:12)、TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG(SEQ ID NO:13)),通过PCR进行扩增,使用In-Fusion HD克隆试剂盒,将其克隆到经限制酶NdeI进行了直链化的pETDue1载体的MCS2中,制成了pETDuet_skp。接下来,在pETDuet_skp的MCS1中插入了CEA-V2122基因。具体而言,使用引物(AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC(SEQ ID NO:14)、CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG(SEQ ID NO:15)),通过PCR扩增了人工合成的CEA-V2122基因。另外,使用引物(GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC(SEQ ID NO:16)、AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG(SEQ ID NO:17)),通过PCR将pETDuet_skp进行了直链化。使用In-Fusion HD克隆试剂盒,对通过PCR扩增了的CEA-V2122和已直链化的pETDuet_skp进行克隆。通过测序进行所插入的基因序列的确认,所克隆的载体为pETDuet_CEA-V2122_skp。
为了蛋白表达,将pETDuet_CEA-V2122_skp转化至BL21(DE3)(Nippon Gene公司),在2×YT培养基(SIGMA-ADLRICH公司)中、于37℃下进行一夜的预培养。将已进行预培养的培养基添加在新的培养基中使其稀释100倍,在37℃下进行培养直至OD(600nm)=0.5~2.0。接下来,添加最终浓度为0.5mM的IPTG,在37℃下培养4小时,回收培养上清,之后在4℃下保存。
对于CEA-V2122蛋白,利用添加在C末端的6×His-Tag,通过批量法进行粗纯化。具体而言,将用缓冲液A(50mM TrisHCl、0.2M NaCl、1mM EDTA、5mM咪唑、pH8.0)进行了平衡化的cOmplete His-Tag Purification Resin添加在于4℃下保存的培养上清中,在4℃下搅拌2小时~一夜,进行了与树脂的蛋白结合处理。接下来,将树脂回收到柱中,用缓冲液A进行了20柱容量的洗涤操作。之后,用缓冲液B(50mM TrisHCl、0.2M NaCl、1mM EDTA、400mM咪唑、pH8.0)进行洗脱,并回收了CEA-V2122的粗纯化物。
接下来,利用蛋白L柱,对粗纯化物进行了纯化。具体而言,将1mL Capto L(GEHealthcare Life Sciences)填充至PD-10柱,用10倍柱体积的PBS进行平衡化,之后加载上述的粗纯化物,用10倍柱容积的PBS洗涤,之后用10mM甘氨酸盐酸(pH2.0)进行洗脱,利用Vivaspin Turbo 15(MWCO 100,000)进行了离心浓缩。再使用PD-10(GE Healthcare LifeSciences公司),进行向PBS的缓冲液置换,再利用Vivaspin Turbo 4(MWCO 100,000)进行离心浓缩,制成了最终纯化物。SDS-PAGE电泳后,通过CBB染色进行了四聚体CEA-V2122的纯度检测,结果见图2。SDS-PAGE凝胶使用了Mini-PROTEAN TGX 4-15%(Bio-Rad公司),CBB染色液使用了Bullet CBB Stain One(Ready To Use)(Nacalai Tesque公司)。
由图2确认到:所纯化的CEA-V2122以约150kDa的四聚体作为主要成分。
实施例2:CEA-V2122在SPR中的性能评价
使用表面等离子共振(SPR)测定装置:Biacore T200(GE Healthcare LifeSciences公司),实施了CEA-V2122与抗原CEACAM5的亲和性。具体而言,使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare Life Sciences公司),将重组人CEACAM-5/CD66e Protein,CF(R&DSYSTEMS公司)在传感器芯片(传感芯片)CM5(GE Healthcare Life Sciences公司)上进行固定化操作,配体的最终固定化量为279RU。另外,所纯化的CEA-V2122调整成1E-08M~6.25E-10M的2倍稀释系列,作为分析物。相互作用分析通过单循环动力学(Single-CycleKinetics)分析来获取数据。使用Biacore T200评估软件2.0版,以Bivalent Analyze模式对所得数据实施曲线拟合,得到了ka1=3.208E+5、kd1=3.461E-7的值。另外,在BivalentAnalyze中可通过KD=kd1/ka1进行评价,因此得到了KD=kd1/ka1=3.461E-7/3.208E+5=1.078E-12的评价值。它们的结果见图3。
由图3所示的传感图、KD值确认到:CEA-V2122与CEACAM5强力结合。
另外,CEA-V2122与生物素修饰体的相互作用分析还可利用Biacore T200进行实施。具体的生物素修饰体是国际公开WO2018/07239的实施例1中记载的标题化合物14。另外,具体的分析方法如下。使用胺偶联试剂盒,对传感器芯片CM5设定成目标值5000RU,进行了所纯化的CEA-V2122的固定化。分析物的浓度使用了1E-08M~6.25E-10M的2倍稀释系列的5种。相互作用分析通过单循环动力学分析来获取数据。使用Biacore T200评估软件2.0版,以Bivalent Analyze模式对所得数据实施曲线拟合,得到了ka1=3.792E+4、kd1=4.424E-6的值。另外,在Bivalent Analyze中可通过KD=kd1/ka1进行评价,因此得到了KD=kd1/ka1=3.792E+4/4.424E-6=1.167E-10的评价值。它们的结果见图4。
由图4所示的传感图、KD值确认到:CEA-V2122与生物素修饰体强力结合。
实施例3:使用了FITC标记CEA-V2122的CEACAM5表达细胞株的细胞染色
为了CEACAM5表达阳性的癌细胞株的染色,使用100μg所纯化的CEA-V2122蛋白进行了FITC标记。具体而言,使用荧光素标记试剂盒-NH2(同仁化学研究所),按照操作手册的用法用量来实施标记,以所得产物作为CEA-V2122-FITC。具体的CEACAM5表达阳性的癌细胞株的染色如下。在CELLSTAR,μClear,96孔板(Greiner公司)上接种来源于CEACAM5阳性的人胃癌的MKN-45细胞和来源于CEACAM5阴性的人结肠癌的DLD1细胞使达到2.0×104个细胞/孔,培养一夜。接下来,添加包含20nM CEA-V2122-FITC和1μM Hoechist的培养液使达到100μL/孔,在4℃下反应30分钟,之后利用In Cell Analyzer 6000(GE Healthcare LifeSciences公司)来获取图像。其结果见图5和图6。
由图5所示的结果确认到:CEA-V2122-FITC特异性地识别细胞膜表面的CEACAM5。另外,由图6所示的结果确认到:CEACAM5在CEA-V2122-FITC结合后滞留在细胞膜表面。
实施例4:使用了CEA-V2122和光活化化合物标记生物素修饰体的体外细胞毒性试验
使用光活化化合物标记生物素修饰体、化合物1、化合物2和化合物3,实施了细胞毒性试验。这些化合物是申请号:日本特愿2018-149295中记载的化合物。化合物1、化合物2和化合物3见图7。具体而言,在细胞培养用96孔板上接种MKN45细胞使细胞数达到5×103个细胞/孔、培养液达到50μL/孔,培养一夜。CEA-V2122与光活化化合物标记生物素修饰体的复合物溶液以CEA-V2122与各化合物的摩尔比达到1:2的方式进行混合,在室温下进行10分钟的培养,用培养液进行了浓度调整使CEA-V2122的最终浓度达到10μg/mL。稀释系列以20μg/mL作为开始浓度,4倍稀释系列为4个系列(5.0μg/mL、1.25μg/mL、0.312μg/mL、0.078μg/mL),制成了5个系列的复合物稀释系列溶液。另外,只以不含复合物的培养基作为零对照。
在培养了一夜的细胞中,以50μL/孔向各孔中分别添加复合物稀释系列溶液,使最终浓度为10μg/mL、2.5μg/mL、0.625μg/mL、0.156μg/mL、0.039μg/mL。在复合物添加、1小时后、2小时后,使用发出690±10nm的波长的光的LED,对细胞照射光使达到100J/cm2。之后,培养48小时,使用细胞计数试剂盒-8(同仁化学公司),进行了活细胞数的比较。各条件设为n=3。用法用量按照操作说明书,在试剂添加1.5小时于37℃、CO2培养箱中进行培养后,测定450nm的吸光度,计算平均值,在进行背景校正后,以对照作为100%,计算了各条件下的细胞生长与对照的比例。其结果见图8。
如图8所示,确认到:CEA-V2122与化合物1、化合物2、化合物3的复合物,浓度依赖性地显示出细胞毒性。
实施例5:基于使用了异种移植模型小鼠的CEA-V2122和光活化化合物标记生物素修饰体的体内细胞毒性试验
向裸鼠的皮下移植MKN45细胞,制作了异种移植模型小鼠。购入4周龄的雌性裸鼠,驯养1周后,以细胞数2×105个细胞/只,向皮下移植了细胞。移植后,约10天从尾静脉给予了实验例4中记载的CEA-V2122与光活化化合物标记生物素修饰体化合物1的100μg复合物。使用产生波长690nm的光的LED光源(USHIO OPTO SMICONDUCTORS,INC.,LD690D-66-60-550.)、T-Cube LED Driver(THORLABS,NC0713145)和T-CUBE 15V POWER SUPPLY(THORLABS,TPS001),在给予6小时后照射了690nm的光使达到230J/cm2。在给予复合物24小时后,再次照射了690nm的光使达到230J/cm2。作为光源的肿瘤的体积变化的曲线图见图9。给予复合物5天后的小鼠个体的照片见图10。另外,在给予复合物的第7天对小鼠个体实施安乐死,进行解剖,对肿瘤部分进行了病理分析。具体手法如下。以一块的形式摘出小鼠皮下肿瘤及其周围组织,室温下在4%多聚甲醛溶液(和光纯药,163-20145)中浸渍一夜,将组织进行固定。对于固定后的皮下肿瘤组织,切下约3~5mm厚的部分,制作石蜡包埋块,使用切片机制作了4μm厚的薄切病理标本。
关于苏木精-伊红染色,室温下将薄切病理标本在二甲苯溶液(和光纯药,241-00091)中浸渍10分钟,进行脱石蜡处理,之后实施了苏木精染色(Sakura Finetek,#8650)和伊红染色(Sakura Finetek,#8660)。该结果见图11。
另外,针对CEACAM5的免疫染色如下进行实施。室温下将薄切病理标本在二甲苯溶液(和光纯药,241-00091)中浸渍10分钟,进行脱石蜡处理,之后通过用基于枸橼酸缓冲液(pH=6.0)的高压灭菌处理(121℃、5分钟)进行了抗原激活。之后,室温下在0.3%过氧化氢(和光纯药,081-04215)/甲醇(和光纯药、137-01823)溶液中浸渍10分钟,去除了内源性过氧化物酶。非特异性反应的封闭在2%BSA(Sigma Aldrich、A1470)/磷酸缓冲盐溶液中进行实施。使抗CEACAM5抗体(R&D SYSTEMS、MAB41281)、浓度1/100)在4℃下反应一夜后,使用Histostar(商标)(MBL、#8460)和DAB底物溶液(MBL、#8469),将免疫染色信号可见化,最后实施了基于苏木精(Sakura Finetek、#8650)的核染色。该结果见图12。
由图11和图12确认到:通过给予CEA-V2122与化合物1的复合物、并照射690nm的光,可诱导异种移植模型小鼠的肿瘤的坏死。
实施例6:HER2-V2122蛋白的表达和纯化
V2122是国际公开WO2015/125820的实施例3(国际公开WO2015/125820的SEQ IDNO:4)中记载的链霉亲和素突变体。V2122的氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO:1中。
scFv-V2122是使抗HER2(ERBB2)的单链抗体(scFv)与上述的V2122结合而得到的。该scFv型的抗HER2抗体为Zhang H等人,Therapeutic potential of an anti-HER2single chain antibody-DM1 conjugates for the treatment of HER2-positivecancer.Signal Transduct Target Ther.2017May 19;2:17015.doi:10.1038/sigtrans.2017.15中记载的scFv序列。将scFv型的抗HER2抗体的氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO:7中。另外,将scFv型的抗HER2抗体与V2122通过氨基酸接头(GGGGGSGGGGG)(SEQ ID NO:18)结合而得到的HER2-V2122的结构图见图13,氨基酸序列见序列表的SEQ IDNO:8。
为了表达HER2-V2122融合蛋白,使将用于在大肠杆菌中分泌表达的pelB信号插入N末端、并将6×His-Tag序列插入C末端而得到的HER2-V2122基因序列的DNA密码子在大肠杆菌中优化,进行了人工基因合成。将该氨基酸序列记载于序列表的SEQ ID NO:9中,将DNA序列记载于序列表的SEQ ID NO:10中。
具体的蛋白表达载体使用了在pETDuet1载体的MCS2中插入有蛋白伴侣skp基因的载体。对于skp基因,根据序列表的SEQ ID NO:6中记载的氨基酸序列,将密码子在大肠杆菌中优化,进行了DNA的人工基因合成。所合成的skp基因使用引物(AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT(SEQ ID NO:12)、TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG(SEQID NO:13)),通过PCR进行扩增,使用In-Fusion HD克隆试剂盒,将其克隆到经限制酶NdeI进行了直链化的pETDue1载体的MCS2中,制成了pETDuet_skp。接下来,在pETDuet_skp的MCS1中插入了HER2-V2122基因。具体而言,使用引物(AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC(SEQ ID NO:14)、CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG(SEQ ID NO:15)),通过PCR扩增了人工合成的HER2-V2122基因。另外,使用引物(GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC(SEQ ID NO:16)、AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG(SEQ ID NO:17)),通过PCR将pETDuet_skp进行了直链化。使用In-Fusion HD克隆试剂盒,对通过PCR扩增了的CEA-V2122和已直链化的pETDuet_skp进行了克隆。利用测序进行所插入的基因序列的确认,所克隆的载体为pETDuet_HER-V2122_skp。
为了蛋白表达,将pETDuet_HER2-V2122_skp转化至BL21(DE3)(Nippon Gene公司),在2×YT培养基(SIGMA-ADLRICH公司)中于37℃下进行一夜的预培养。将已进行预培养的培养基添加至新的培养基中使其稀释100倍,在37℃下进行培养直至OD(600nm)=0.5~2.0。接下来,添加最终浓度为0.5mM的IPTG,在37℃下培养4小时,回收培养上清,之后在4℃下保存。
对于HER2-V2122蛋白,利用添加在C末端的6×His-Tag,通过批量法进行了粗纯化。具体而言,将用缓冲液A(50mM TrisHCl、0.2M NaCl、1mM EDTA、5mM咪唑、pH8.0)进行了平衡化的cOmplete His-Tag Purification Resin添加在于4℃下保存的培养上清中,在4℃下搅拌2小时~一夜,进行了与树脂的蛋白结合处理。接下来,将树脂回收到柱中,用缓冲液A进行了20倍柱容量的洗涤操作。之后,用缓冲液B(50mM TrisHCl、0.2M NaCl、1mM EDTA、400mM咪唑、pH8.0)进行洗脱,并回收了HER2-V2122的粗纯化物。
接下来,利用蛋白L柱,对粗纯化物进行了纯化。具体而言,将1mL Capto L(GEHealthcare)填充至PD-10柱,用10倍柱体积的PBS进行平衡化后,加载上述的粗纯化物,用10倍柱体积的PBS洗涤,之后用10mM甘氨酸盐酸(pH2.0)进行洗脱,利用Vivaspin Turbo 15(MWCO 100,000)进行了离心浓缩。再使用PD-10(GE Healthcare),进行向PBS的缓冲液置换,再利用Vivaspin Turbo 4(MWCO 100,000)进行离心浓缩,制成了最终纯化物。通过CBB染色对纯化物进行了四聚体HER2-V2122的纯度检测,结果见图14。SDS-PAGE凝胶使用了Mini-PROTEAN TGX 4-15%(Bio-Rad公司),CBB染色液使用了Bullet CBB Stain One(Ready To Use)(Nacalai Tesque公司)。
由图14确认到:所纯化的HER2-V2122以约150kDa的四聚体作为主要成分。
实施例7:HER2-V2122在SPR中的性能评价
使用表面等离子共振(SPR)测定装置:Biacore T200(GE Healthcare LifeSciences公司),实施了HER2-V2122与抗原CEACAM5的亲和性。具体而言,使用胺偶联试剂盒(GE Healthcare Life Sciences公司),将ErbB2/Fc嵌合、人、重组体、无载体(R&DSYSTEMS、1129-ER-050)在传感器芯片CM5(GE Healthcare Life Sciences公司)上进行固定化操作,配体的最终固定化量为279RU。另外,所纯化的HER2-V2122调整成1E-08M~6.25E-10M的2倍稀释系列,作为分析物。相互作用分析通过单循环动力学分析来获取数据。使用Biacore T200评估软件2.0版,以Bivalent Analyze模式对所得数据实施曲线拟合,得到了ka1=3.857E+5、kd1=1.710E-6的值。另外,在Bivalent Analyze中,可通过KD=kd1/ka1进行评价,因此得到了KD=kd1/ka1=1.710E-6/3.857E+5=4.433E-12的评价值。它们的结果见图15。
由图15所示的传感图和所计算的KD值确认到:HER-V2122识别ErbB2,并与其强力结合。
另外,HER2-V2122与生物素修饰体(制造例1、化学式11所示的化合物)的相互作用分析也利用Biacore T200进行实施。具体而言,使用胺偶联试剂盒,对传感器芯片CM5设定成目标值5000RU,进行了所纯化的HER2-V2122的固定化。分析物的浓度使用了1E-08M~6.25E-10M的2倍稀释系列的5种。相互作用分析通过单循环动力学分析来获取数据。使用Biacore T200评估软件2.0版,以Bivalent Analyze模式对所得数据实施曲线拟合,得到了亲和性的评价值。它们的结果见图16。
实施例8:使用了HER2-V2122和光活化化合物标记生物素修饰体的体外细胞毒性试验
使用光活化化合物标记生物素修饰体、化合物1、化合物2和化合物3,实施了细胞毒性试验。这些化合物是申请号:日本特愿2018-149295中记载的化合物。化合物1、化合物2和化合物3见图7。具体而言,将用包含10%FBS的McCoy’s培养基进行培养的SK-BR-3细胞接种在细胞培养用96孔板上,使细胞数达到5.0×103个细胞/孔、培养液达到50μL/孔,培养一夜。CEA-V2122与光活化化合物标记生物素修饰体的复合物溶液以CEA-V2122与各化合物的摩尔比达到1:2的方式进行混合,在室温下进行10分钟的培养,用培养液进行浓度调整,使HER2-V2122的最终浓度达到10μg/mL。稀释系列以20μg/mL作为开始浓度,4倍稀释系列为4个系列(5.0μg/mL、1.25μg/mL、0.312μg/mL、0.078μg/mL),制成了5个系列的复合物稀释系列溶液。另外,只以不含复合物的培养基作为零对照。
在培养了一夜的细胞中,以50μL/孔向各孔中分别添加复合物稀释系列溶液使最终浓度达到10μg/mL、2.5μg/mL、0.625μg/mL、0.156μg/mL、0.039μg/mL。在复合物添加、1小时后、2小时后,使用发出690±10nm的波长的光的LED,对细胞照射光使达到100J/cm2。之后,培养48小时,使用细胞计数试剂盒-8(同仁化学公司),进行了活细胞数的比较。各条件设为n=3。用法用量按照操作说明书,在试剂添加1.5小时于37℃、CO2培养箱中进行培养,之后测定450nm的吸光度,计算平均值,背景校正后,以对照作为100%,计算了各条件下的细胞生长与对照的比例。其结果见图17。
由图17的结果确认到:HER2-Cupid与光活化化合物标记生物素修饰体的复合物,浓度依赖性地具有细胞毒性。
SEQ ID NO:1
AEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
SEQ ID NO:2(sm3E-scFv序列)
QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:3
QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
SEQ ID NO:4
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
SEQ ID NO:5
ATGAAATATCTGCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCACAGGTTAAACTGGAACAGAGCGGTGCCGAAGTTGTTAAACCGGGTGCAAGCGTTAAACTGAGCTGTAAAGCAAGCGGCTTTAACATCAAAGATAGCTATATGCATTGGCTGCGTCAGGGTCCGGGTCAGCGTCTGGAATGGATTGGTTGGATTGATCCGGAAAATGGTGATACCGAATATGCACCGAAATTTCAGGGTAAAGCAACCTTTACCACCGATACCAGCGCAAATACCGCATATCTGGGTCTGAGCAGCCTGCGTCCGGAAGATACCGCAGTGTATTATTGTAATGAAGGCACCCCGACCGGTCCGTATTATTTCGATTATTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCGAAAATGTTCTGACCCAGAGCCCGAGCAGCATGAGCGTTAGCGTTGGTGATCGTGTTAATATTGCATGTAGCGCAAGCAGCAGCGTTCCGTACATGCACTGGCTGCAGCAGAAACCGGGTAAAAGCCCGAAACTGCTGATTTATCTGACCAGCAATCTGGCAAGCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCGGTAGTGGCACCGATTATAGCCTGACCATTAGCAGCGTGCAGCCTGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGCGTAGCAGTTATCCGCTGACCTTTGGTGGTGGCACCAAACTGGAAATTAAAGGGGGTGGTGGCTCAGGTGGCGGAGGTGCAGAAGCAGGTATTACCGGTACATGGTCAGATCAGCTGGGTGATACCTTTATTGTTACCGCAGGCGCAGATGGTGCACTGACCGGCACCTATGAAAATGCAGTTGGTGGTGCAGAAAGCCGTTATGTGCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGTAGCGGCACCGCACTGGGTTGGACCGTTGCATGGAAAAATAACAGCAAAAATGCACATAGCGCAACCACCTGGTCAGGTCAGTATGTGGGTGGTGCCGATGCCAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGTACAACCAATGCAAATGCCTGGAAAAGTACCCTGGTTGGTCATGATACATTCACCAAAGTTAAACCGAGCGCAGCAAGCCATCATCATCACCATCATTAA
SEQ ID NO:6
MDKIAIVNMGSLFQQVAQKTGVSNTLENEFKGRASELQRMETDLQAKMKKLQSMKAGSDRTKLEKDVMAQRQTFAQKAQAFEQDRARRSNEERGKLVTRIQTAVKSVANSQDIDLVVDANAVAYNSSDVKDITADVLKQVK
SEQ ID NO:7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGGSGGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
SEQ ID NO:9
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGGSGGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH
SEQ ID NO:10
ATGAAATATCTGCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCAGAAGTTCAGCTGGTTGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTAACATTAAAGATACCTATATTCATTGGGTGCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCACGTATTTATCCGACCAATGGTTATACCCGTTATGCCGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCGCAGATACCAGCAAAAATACCGCATACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTAGCCGTTGGGGTGGTGATGGTTTTTATGCAATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCCGGTGGCGGAGGTTCCGGTGGAGGTGGCTCCGGTGGCGGAGGTTCCGATATTCAGATGACCCAGAGTCCGAGCAGCCTGAGCGCAAGCGTTGGTGATCGTGTGACCATTACCTGTCGTGCAAGCCAGGATGTTAATACAGCAGTTGCATGGTATCAGCAGAAACCGGGTAAAGCACCGAAACTGCTGATTTATAGCGCAAGCTTTCTGTATAGCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCCGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCAACCTATTATTGTCAGCAGCATTACACCACACCGCCTACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTTGAAATTAAAGGAGGTGGCGGTGGATCCGGCGGAGGTGGCGGAGCAGAAGCAGGTATTACCGGTACATGGTCAGATCAGCTGGGTGATACCTTTATTGTTACCGCAGGCGCAGATGGTGCACTGACCGGCACCTATGAAAATGCAGTTGGTGGTGCAGAAAGCCGTTATGTGCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGTAGCGGCACCGCACTGGGTTGGACCGTTGCATGGAAAAATAACAGCAAAAATGCACATAGCGCAACCACCTGGTCAGGTCAGTATGTGGGTGGTGCCGATGCCAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGTACAACCAATGCAAATGCCTGGAAAAGTACCCTGGTTGGTCATGATACATTCACCAAAGTTAAACCGAGCGCAGCAAGCCATCATCATCACCATCATTAA
Claims (12)
1.融合蛋白,该融合蛋白从N末端侧到C末端侧依次具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7所记载的氨基酸序列、接头序列、和SEQ ID NO: 1所记载的氨基酸序列,其中,SEQ ID NO:1所记载的氨基酸序列的C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部。
2.权利要求1所述的融合蛋白,其中,接头序列的氨基酸数为5~15个氨基酸。
3.权利要求1或2所述的融合蛋白,其中,接头序列由4~14个甘氨酸残基和1个半胱氨酸残基构成。
4.权利要求1~3中任一项所述的融合蛋白,其中,接头序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly或Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly- Gly-Gly-Gly-Gly。
5.融合蛋白,该融合蛋白具有SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 8所记载的氨基酸序列,其中,C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部。
6.权利要求1~5中任一项所述的融合蛋白,该融合蛋白进一步具有分泌信号序列。
7.融合蛋白,该融合蛋白具有SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 9所记载的氨基酸序列,其中,C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部。
8.核酸,该核酸编码具有SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 8所记载的氨基酸序列的融合蛋白,其中,所述氨基酸序列的C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部。
9.核酸,该核酸编码具有SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 9所记载的氨基酸序列的融合蛋白,其中,所述氨基酸序列的C末端的由6个组氨酸构成的序列氨基酸序列可缺失一部分或全部。
10.癌症治疗药或癌症诊断药,其包含权利要求1~7中任一项所述的融合蛋白。
12.权利要求11所述的试剂盒,其中,诊断用物质或治疗用物质为酞菁染料。
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