CN107429075B - 可激活的双组份光敏剂 - Google Patents

可激活的双组份光敏剂 Download PDF

Info

Publication number
CN107429075B
CN107429075B CN201580073178.1A CN201580073178A CN107429075B CN 107429075 B CN107429075 B CN 107429075B CN 201580073178 A CN201580073178 A CN 201580073178A CN 107429075 B CN107429075 B CN 107429075B
Authority
CN
China
Prior art keywords
group
ser
gly
ala
activator
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580073178.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107429075A (zh
Inventor
M·P·布吕什
贺建军
王弈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carnegie Mellon University
Original Assignee
Carnegie Mellon University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carnegie Mellon University filed Critical Carnegie Mellon University
Publication of CN107429075A publication Critical patent/CN107429075A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107429075B publication Critical patent/CN107429075B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A61N5/0613—Apparatus adapted for a specific treatment
    • A61N5/062—Photodynamic therapy, i.e. excitation of an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C211/00—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C211/43—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/34—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups
    • C07C233/35—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/36—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/34—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups
    • C07C233/35—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/40—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to an acyclic carbon atom of a carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
    • C09B11/04—Diaryl- or thriarylmethane dyes derived from triarylmethanes, i.e. central C-atom is substituted by amino, cyano, alkyl
    • C09B11/10—Amino derivatives of triarylmethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
    • C09B11/04—Diaryl- or thriarylmethane dyes derived from triarylmethanes, i.e. central C-atom is substituted by amino, cyano, alkyl
    • C09B11/10—Amino derivatives of triarylmethanes
    • C09B11/22—Amino derivatives of triarylmethanes containing OH groups bound to an aryl nucleus and their ethers and esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A61N2005/0658—Radiation therapy using light characterised by the wavelength of light used
    • A61N2005/0659—Radiation therapy using light characterised by the wavelength of light used infrared
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

本文提供了一种双组份光敏剂，其在暴露于近红外光激发时显示出转染的HEK细胞和亲和体靶向的A431癌细胞的鲁棒和选择性杀伤作用。自由的MG2I是一种纯而稳定的荧光；其易于合成和修饰，并且对细胞显示无毒性。与传统的光敏剂不同，染料和FAP本身在结合之前就没有光敏作用。同时与其他活化方法不同，所述活化步骤通过加入荧光团而不是目标分子的存在来实现，需要“主动”活化而不是“被动”激活。该方法提供了在靶向位点局部开启和选择性生成单线态氧的能力，并且可用于各种分子靶体。

Description

可激活的双组份光敏剂
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2014年11月17日提交的美国临时申请号为62/123,489的权益，其全部内容通过引用并入本文。
关于联邦基金的声明
本发明是由国家卫生研究院授予的授权号为1R01EB017268的政府支持。政府对本发明享有一定的权利。
本发明提供了在光动力疗法中有益的组合物，及相关的方法。
光动力疗法对于癌症来说是最小侵袭性和多位点特异性治疗方法之一，其利用光敏剂的光诱导性毒性来降低癌症的发展。当暴露于相应波长的光中时，光敏剂能够产生活性氧自由基(ROS)，其能够干扰细胞代谢过程中多个关键过程，从而导致细胞坏死和/或凋亡，并最终导致靶组织的破坏。特别地，光动力治疗的最小入侵性和非局部毒性为局部表面恶性和癌变前肿瘤的治疗提供了很好的替代方案。
常规的光敏剂显示出肿瘤选择性缺失的缺点，这导致对正常组织的严重非靶向损伤，并且限制了其在肿瘤治疗中的应用。研究人员最近试图通过将光敏剂与肿瘤相关部分(第三代光敏剂)缀合的方法来改善肿瘤特异性。例如，光敏剂已与对肿瘤相关抗原特异性的单克隆抗体(mAb)缀合，使得光敏剂-mAb能够被选择性地递送到肿瘤部位。但是，大尺寸的抗体导致缓慢的清除速率和有限的组织穿透力。此外，通过mAb的高度特异性抗原识别通常会受到高比例光敏剂替代物的影响，其会改变这些缀合物的总电荷和生物分布。
为了降低对附近正常组织的非特异性光毒性，一种方法是开发一种光敏剂，其只有在光照和细胞特异性靶向存在的情况下才能被激活用于ROS生成。所述细胞靶向步骤通过引导ROS产生并抑制对异常组织的损伤来提供可控的光动力疗法。因此，由于非活性光敏剂的细胞毒性低，其对周围非靶组织的损伤被最小化。Spring B.Q.等人报道了一种用于靶向A431癌细胞的可激活光免疫疗法，其中多个自猝灭光敏剂与抗EGFR抗体缀合。在缀合后，光敏剂的光毒性和荧光被溶酶体蛋白水解激活会增强7倍(Spring BQ等人，Selectivetreatment and monitoring of disseminated cancer microrometransases in vivousing dual-function，activatable immunoconjugates.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111，E933-E942(2014))。因此，需要一种有效率、安全和有效的光动力疗法。迫切滴需要对光敏剂进行改进用以获得更高的ROS-生成效率，更好的光稳定性、更好的特异性以及更大的通用性。
发明内容
为了解决这些问题，本发明包含一种可激活的基因编码的染料-蛋白质双组份光敏剂。在近红外照射下，一种通过荧光激活蛋白(FAPdL5)结合的典型的二碘化物改性孔雀石绿色氟代(MG2I)能够产生单线态氧，其引起急性细胞毒性并导致细胞死亡。本发明在这里所描述的双组份光敏剂的用途是通过与基因靶向不同细胞区室的FAP的有效的和特异性的细胞杀伤性特性进行证明，并且已经成功地用于光消融幼虫/成年斑马鱼的心脏功能。在另一个实施例中，一种FAP-标记的亲和探针被应用于系统中用以有选择地杀死癌细胞。体内研究已经显示本发明在此所述的化合物及方法能够有效地降低在裸鼠中生长的A431肿瘤。总体而言，双组份光敏剂系统的靶向光动力治疗策略和设计由于近红外吸收和荧光读数允许其在光动力学治疗期间在组织和体内可视化中的应用。根据在研究中使用的燃料及光剂量，它还可以有利于稳定细胞和转基因动物的选择，用于成像、光消融或光敏作用研究。
根据本发明的一个方面，提供了一种重原子改性孔雀石绿衍生物，其具有结构：
Figure GDA0001393278760000031
其中，X和X’各自独立地是重原子，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自独立地是H或者F，R11、R12、R13和R14各自独立地是甲基、H、氮杂环丙烷或氮杂环丁烷，其中当R11、R12、R13、和/或R14是氮杂环丙烷或氮杂环丁烷时，R11和R12形成一个单环和/或R13和R14形成一个单环，并且当R选自-H、-OH、-COO-、-SO3 -、-PO4 -、-NO2、-NH2、-N(CH3)(R15)、-OR16、烷基、乙醚、聚醚、PEG1-30、-(C1-C4 alkyl)-R17时，含有N、S或O原子的杂环，被炔基、氰基、和碳水化合物基团取代，其中R15和R16是直链或支链烷基；直链或支链C1-6烷基；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)；具有2至6个酰胺基团的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)；聚(C1-C4亚烷基二醇)；具有2至30个或者2-10个C1-C4亚烷基二醇基团的聚(C1-C4亚烷基二醇)；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)：聚(C1-C4亚烷基二醇)二嵌段共聚物；具有2至6个酰胺基团以及2至10个C1-C4亚烷基二醇基团的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)：聚(C1-C4亚烷基二醇)二嵌段共聚物；磺酰基或者双-磺酰基-封端的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)，可选地具有2至6个酰胺基团；二牛磺酸支链的聚(C1-C4烷基酰胺),可选地具有2至6酰胺基团；丁酸乙酯；C1-6烷基C1-6链烷酸酯；-(CH2)n-C(O)-O-(CH2)m-CH3，其中n＝1-4且m＝0-3，并且其中R17选自H,-OH、-COO-、-SO3 -、-PO4 -、-NO2或者-NH2。在一方面，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、和R1是H。在另一方面，X和X’各自独立地是Br、I、As、Se、Ga、Ge、或Sb，例如X和X’各自独立地是Br或I，或者X和X’是I。在另一方面，R11、R12、R13和R14各自独立地是甲基或H，或者R11、R12、R13和R14是甲基。在另一方面，在另一方面，R是-OR16，并且R16是丁酸乙酯。在另一方面，所述重原子改性孔雀石绿衍生物具有如下结构：
Figure GDA0001393278760000041
或者
Figure GDA0001393278760000051
在另一方面，本发明提供了一种靶向且杀死细胞的方法，包括：将细胞与一种靶向活化剂组合物进行接触，其中所述靶向活化剂组合物包含靶向基团和活化剂基团，其中所述靶向基团有选择地与细胞的目标化合物进行结合，所述活化剂基团有选择地与重原子改性孔雀石绿衍生物进行结合，依据本发明在这里所描述的另一方面，具有一种激发波长因而当与靶向活化剂结合且暴露在激发波长的光下时，所述重原子改性孔雀石绿衍生物产生单线态氧；将细胞与所述所述重原子改性孔雀石绿衍生物进行接触；并且将所述细胞暴露于所述靶向活化剂-连接的重原子改性孔雀石绿衍生物的激发波长的光下。所述光能够通过任意发光装置产生，所述发光装置例如灯、发光二极管或者激光器，如本领域那些技术人员所公知的。根据其中一个方面，所述活化剂基团是一种scFv活化剂基团和一种靶向基团的融合蛋白。在其中一个方面，所述scFv是一种L5-MG scFv肽，可选择地为SEQ ID NOS:1-4。在另一方面，所述靶向基团是对表皮生长因子受体具有选择性(有选择地与在本发明上下文中所描述的应用中进行结合)，例如，HER1(人表皮生长因子受体1)或者HER2(人表皮生长因子受体2)。在其中一个方面，所述靶向活化剂包括一种选自SEQ ID NOS:1-4,10-15、17和18的序列。
依据本发明的另一方面，提供了一张试剂盒，包括：一种第一容器，所述第一容器含有依据本发明在这里所描述的任意一个方面所述的重原子改性孔雀石绿衍生物；以及在所述第一容器或者一种第二容器中的靶向活化剂组合物，所述靶向活化剂组合物包含一种选择性结合细胞目标化合物的靶向基团，以及一种选择性结合重原子改性孔雀石绿衍生物的活化剂基团，其具有激发波长从而当在药物学上可接受的赋形剂中通过靶向活化剂结合且暴露于在激发波长下的光中时所述重原子改性孔雀石绿衍生物生成单线态氧。根据其中一个方面，所述活化剂基团scFv活化剂基团和一种靶向基团的融合蛋白。在其中一个方面，所述scFv是一种L5-MG scFv肽，可选择地为SEQ ID NOS:1-4。在另一方面，所述靶向基团是对表皮生长因子受体具有选择性(有选择地与在本发明上下文中所描述的应用中进行结合)，例如，HER1(人表皮生长因子受体1)或者HER2(人表皮生长因子受体2)。在其中一个方面，所述靶向活化剂包括一种选自SEQ ID NOS:1-4,10-15、17和18的序列。
在另一方面，本发明提供了一种靶向并杀死患者体内细胞的方法，包括：为所述患者给药有效剂量的活化剂组合物，所述活化剂组合物包含一种选择性结合细胞目标化合物的靶向基团，以及一种选择性结合重原子改性孔雀石绿衍生物的活化剂基团，依据本发明在这里所描述的另一方面，其具有激发波长从而当通过结合靶向活化剂且暴露于在激发波长下的光中时所述重原子改性孔雀石绿衍生物生成单线态氧；为所述患者给药有效剂量的所述重原子改性孔雀石绿衍生物；并且将所述细胞暴露于靶向活化剂-连接的重原子改性孔雀石绿衍生物的激活波长中，从而杀死所述细胞。根据其中一个方面，所述活化剂基团scFv活化剂基团和一种靶向基团的融合蛋白。在其中一个方面，所述scFv是一种L5-MGscFv肽，可选择地为SEQ ID NOS:1-4。在另一方面，所述靶向基团是对表皮生长因子受体具有选择性(有选择地与在本发明上下文中所描述的应用中进行结合)，例如，HER1(人表皮生长因子受体1)或者HER2(人表皮生长因子受体2)。在其中一个方面，所述靶向活化剂包括一种选自SEQ ID NOS:1-4,10-15、17和18的序列。
附图说明
附图1A和1B给出了本发明在这里所描述的两种类型的重原子改性孔雀石绿衍生物。
附图2A和2B给出了用于生物传感器激活的scFvs(SEQ ID NOS:1-4)的示例性肽序列。连字符表示核心序列。在附图1B(SEQ ID NOS:5-7)中给出了其他的FAP。
附图3A描述了编码L5-MG E52D pPNL6融合蛋白(SEQ ID NO:8)的构建体的DNA序列。附图3B和3C描述了构建体pPNL6L5-MG E52D。附图3D和3E共同描述了编码L5-MG E52D的构建体的区域，其映射到pPNL6L5-MG E52D(SEQ ID NO:9)的相关部分的核苷酸序列上。
附图4显示了MG和MG2I酯的化学结构，以及在本发明中所描述的双组份光敏剂的机理。
附图5描述了在实施例中所描述的方案I，MG2I的合成方法。
附图6显示了MG2I-FAP复合物的归一化荧光光谱。
附图7A-7C：附图7A)MG-dL5和MG2I-dL5的测量值，附图7B)1μM MG2I和具有5μMdL5(较短波长吸收峰)的MG2I的吸收光谱，附图7C)使用Cy5作为标准(实心圆)的MG2I-dL5(实心方块)的荧光量子产率测量值。
附图8显示了MG2I-FAP复合物的单线态氧量子产率测量值。
附图9A和9B显示了PLCδ1PH区域的FAP-TAP介导的光诱导蛋白失活。
附图10显示了具有表达DL5(40x物镜，42J/cm2)的膜的MG2I的光敏作用。
附图11阐明了所述MG2I-FAP复合物诱导具有在线粒体(mito-dL5)和细胞核(nls-dL5)中表达的FAP的细胞死亡(640nm,40x objective,120J/cm2)。
附图12显示了靶向MG2I-FAP的膜的剂量依赖性杀死作用。
附图13显示了单线态氧诱导的细胞光毒性作用，其能够通过叠氮化钠但不能过氧化氢酶或超氧化物歧化酶进行抑制。
附图14显示了使用DHE进行细胞核ROS检测。
附图15阐明了使用双组份FAP光敏剂可实现的癌细胞靶向可激活光动力疗法的方法。
附图16A和16B给出了下文所述(SEQ ID NOS:10-15)的AffiFAP肽的序列。
附图17显示了选择性癌细胞杀死作用。首先添加AffiFAP/FAP，并允许细胞靶向30分钟，然后添加MG2I/MG-酯并且再培养30分钟(在所述过程中不需要洗涤)。在1min照射(60x物镜,2.43W/cm2)之后，使用死/活工作溶液来替换细胞培养基。在1hr染色后，进行双色活力荧光测定。
附图18显示了SKBR3癌症细胞的可选择性杀死。首先将100nM HER2缀合的dL5添加到细胞中，之后添加100nM MG2I。
附图19显示了幼虫状态的斑马鱼从0hpi(照射后的小时数)值96hpi的表型发展。MG2I-FAP诱导了转基因斑马鱼的心脏功能的光消融。在MG2I-FAP组中，所述幼虫线路了一系列可见的缺陷：大心脏水中、小眼睛、以及塌陷的非功能性心室。在两个对照组中，生长正常。比例尺＝1000μm并且可应用到所有的图像中。
附图20显示了MG2I-AffiFAP的体内光动力疗法的应用，其降低了裸鼠模型的A431肿瘤生长。
具体实施方式
除了在操作实施例中，或者其中另作说明时，在说明书和权利要求中使用的表达成分的量、反应条件等的全部数值在所有情况下可以理解为可以术语“大约”来修饰。因此，除非有相反含义的说明，本说明书和所述权利要求书中所示的数量参数都为近似值，其可以通过本发明所期望获得的性质而改变。最低程度并且不是图限定权利要求范围等同物原则的应用，各个数值参数至少限制在所报道的有效数值的范围内并且通过采用一般舍入方法来理解。
虽然阐述本发明的数值范围和参数都是近似值，但是在具体的实施例中所提到的数值都是尽可能精准报告的。然而，任何数值固有地含有必然从在他们的各自试验测量中测得的标准偏差所引起的一定误差。此外，当本发明给出变化范围的数值区间时，可以预期到可以使用包括所列举数值的这些数值的任何组合。
此外，应当理解的是，在这里所述的任何数值范围旨在包括归入到其中的所有子范围。例如，“1至10”的范围旨在包含在所列出的最小值1与所列出的最大值10之间(并且包括该端值)的所有子范围，也就是说，具有等于或大于1的最小值和等于或小于10的最大值的所有子范围。
针对本发明中所提供的定义，这些定义涉及这些单词或短语的单词形式、同义词以及语法变体。
如在本发明中所使用的，术语“聚合物组合物”是一种包含一种或多种聚合物的组合物。作为一种种类，“聚合物”包括，但不限于，均聚物、杂聚物、共聚物、嵌段聚合物并且可以是天然的以及合成的。均聚物含有一种类型的结构单元或者单体，然而共聚物包含超过一种类型的单体。
一种聚合物“包括”或“衍生自”所述单体，如果是那样，则将单体合并到所述聚合物中。因此，所述聚合物包含的合并的单体不同于合并到聚合物中之前的单体，因为至少在所述单体合并期间，在聚合过程中被修饰的某些基团例如末端基团，被改变、去除、和/或前一，并且某些键可能会被添加、去除和/或修饰。一种合并的单体被称为该单体的“残基”。一种聚合物被称为包含一种特定类型的键，如果该键存在于所述聚合物中。除非另有说明，针对聚合物化合物的分子量指的是平均分子重量(Mw)。作为一个实施例，所述聚(乙二醇)的分子量，具有11个乙二醇残基的平均，用数据Mw表示。“基团”指的是分子、化合物或者组合物的一部分，并且包括在较大聚合物中的残基或者一组残基，例如在下文所述的。
“烷基”涉及含有1至大约20个碳原子的支链、支链或者环状烃基子集团，例如但不限于C1-3、C1-6、C1-10基团，例如但不限于支链、支链烷基基团，比方说甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等等。“取代的烷基”是指在1个或多个，例如1、2、3、4、5或甚至6个位置上被取代的烷基，所述取代基被连接在任意可去的原子上用于产生一种稳定的化合物，具有如这里所描述的取代基。“任选取代的烷基”指的是烷基或取代的烷基。“卤素”、“卤代”以及“卤化物”指的是-F,-CI,-Br和/或–I。“烃”指的是一种化合物，由只有C和H原子构成的基团或部分。
“亚烷基”和“取代的亚烷基”分别指的是二价烷基和二价取代的烷基，包括，但不限于，乙烯(-CH2-CH2-)。“任选取代的亚烷基”指的是亚烷基或者取代的亚烷基。一种聚醚指的是一种聚合物，其包含多个醚基团，例如聚(亚烷基氧化物)，包括基团–[O-R-]n，其中n指的是从2至100或更多的整数，例如2至100，或者5-20，或者从2至小于25的任何整数。正如对聚醚的了解，如本发明所述的任何聚合物化合物，n或者类似引用，是依据多分散的分子群体进行计算的，其中n代表引用基团的单元平均数，其通过聚亚烷基或者聚合物化合物的Mw作为参考来确定。分子群体在一定公差范围内具有分散性(分散性，是通过平均分子量除以数均分子量而计算得出)，所述公差指的是生产如本发明在这里所描述的组合物产品可接受的公差，例如用于气体-分离目的。
“芳基”，单独地或者组合地，指的是芳香族的单环或者双环环系例如苯基或者萘基。“芳基”还包括芳香族环系，其任选地与环烃基环稠和。“取代的芳基”指的是一种芳基，其独立地被一种或多种可连接到任何可获得的原子上的取代基取代，从而形成一种稳定的化合物，其中所述取代基指的是本发明所述的取代基。“任选取代的芳基”指的是芳基或者取代的芳基。“亚芳基”指的是二价芳基，并且“取代的亚芳基”指的是二价取代的芳基。“任选取代的亚芳基”指的是亚芳基或者取代的亚芳基。如在本发明中所使用的，“苯酚”基团指的是羟苯基，例如一种包含羟苯基基团的肽主链。
“聚醚”可以是任何聚(烯烃基)，并且在其中一个方面，聚(C2-C6亚烷基二醇)，具有结构–[R1-O]n–，其中，R1是直链或支链亚烷基，例如C2-C8亚烃基，或者两种或多种不同亚烃基(C2-C8亚烃基)的混合物。n能够哦依据组合物的最终应用二进行改变，例如从2至100，从2至50，从2至25，从5至20或者从8至15.
“重原子改性孔雀石绿衍生物”指的是具有下述结构的组合物：
Figure GDA0001393278760000121
其中X和X’，各自独立的是重原子。“重原子”指的是一种原子，其能够在荧光下产生重原子效应的原子(参见，例如Guilbault,G.G.,Ed.,Practical Fluorescence,SecondEdition,Marcel Dekker,Inc..New York,New York(1990),pp.88-92)。具体来说，重原子具有量子产率降低以及系统件交叉增加的通用效应。一些重原子的实施例包括卤素Br和I，以及一些其他原子，例如，As、Se、Ga、Ge和Sb。在其中一个方面，所述重原子是Br或I，并且在某些情况下，X和X’都是I。
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自独立地是H或F，以任意组合或排列方式。在R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10的一个或多个上的F具有至少转化所述组合物的吸光度和激发光谱的作用。在其中一个方面，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10全部都是H。其他的实施例如下表所示：
表1
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10
F F H H H H H H H H
H H H F H H F H H H
H H H F H F F H F H
H H H F F H F F H H
H H F H H H H F H H
下文给出了多种氟化孔雀石绿衍生物的特性。
表2
Figure GDA0001393278760000131
MG上的氟化物导致x波段的多种红色偏移，从10nm至80nm。然而y波段的偏移取决于氟化位置，当氟取代基是在苯环上时，能够观察到具有降低的强度的蓝色偏移。如果二氨基环上的氢用氟进行取代，那么y波段则随着强度的增加而进行红移，并且所述x和y波段更加接近。当其与dL5结合时，MG-4F(R1,R2,X,X’＝F)酯在750nm下具有发射最大值，
R11、R12、R13和R14各自独立的是甲基、H、氮杂环丙烷或者氮杂环丁烷。当R11、R12、R13和/或R14是氮杂环丙烷
Figure GDA0001393278760000141
或者氮杂环丁烷
Figure GDA0001393278760000142
时，R11和R12形成一个单环和/或R13和R14形成一个单环。
R选自-H、-OH、-COO-、-SO3 -、-PO4 -、-NO2、-NH2、-N(CH3)(R15),-OR16,烷基、乙醚基、聚醚、PEG1-30,-(C1-C4烷基)-R17、含N、S或O原子的杂环基、取代的乙炔基团、氰基和碳水化合物基团，其中R15和R16：直链或者支链烷基；直链或者支链C1-6C1-6烷基；链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)；具有2至6个酰胺基团的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)；聚(C1-C4亚烷基二醇)；具有2至30(例如2-10个)C1-C4亚烷基二醇基团的聚(C1-C4亚烷基二醇)；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺):聚(C1-C4亚烷基二醇)二嵌段共聚物；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)：聚(C1-C4亚烷基二醇)二嵌段共聚物，其具有2至6个酰胺基团以及2至10个C1-C4亚烷基二醇基团；磺酰基或者双-磺酰基-封端的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)，可选地具有2至6酰胺基团；二牛磺酸支链的poly(C1-C4烷基酰胺)，可选地具有2至6酰胺基团；丁酸乙酯；C1-6烷基C1-6链烷酸酯；-(CH2)n-C(O)-O-(CH2)m-CH3，其中n＝1-4且m＝0-3，其中R17选自H,-OH,-COO-,-SO3 -,-PO4 -,-NO2或-NH2。
所述化合物的非限制性实施例为结构(III)和结构(IV)：
Figure GDA0001393278760000151
其他化合物的非限制性实施例在附图1A和1B中给出，其中X和X’独立地是重原子，并且在其中一个方面，X和X’独立地是Br和/或I，并且在另一方面，X和X’都是碘代。
本发明提供了一种体内或者体外杀死细胞的方法，以及用于杀死细胞的化合物和组合物。根据本发明的一个方面，提供了一种靶向且杀死细胞的方法。所述方法包括将细胞与一种靶向活化剂组合物进行接触，所述靶向活化剂组合物包括选择性与细胞的靶向化合物结合的靶向基团，以及选择性与具有激发波长的重原子改性孔雀石绿衍生物结合的活化剂基团，从而当通过结合靶向活化剂且暴露于在激发波长下的光中时，所述重原子改性孔雀石绿衍生物生成单线态氧；将细胞与所述重原子改性孔雀石绿衍生物进行接触；并且将细胞暴露于靶向活化剂-连接的重原子改性孔雀石绿衍生物的靶向活化剂-连接的重原子改性孔雀石绿衍生物的光中。所述重原子改性孔雀石绿衍生物是任意的重原子改性孔雀石绿衍生物。在另一方面，本发明提供了在患者体内靶向且杀死细胞的方法，用于例如癌症、增生、自身免疫性疾病、免疫疾病和感染的治疗。
如在本发明中所使用的，“细胞”可以是自体的、同种异体的或者异种细胞，例如癌症细胞、免疫细胞、细菌细胞、真菌细胞、寄生虫细胞以及病毒感染细胞。
在本发明所描述的用于靶向并杀死细胞的方法中，将所述靶向活化剂以及重原子改性孔雀石绿衍生物一定剂量应用/给药用来选择性地杀死目标细胞。针对每种特异性靶向活化剂及重原子改性孔雀石绿衍生物，及所属有效剂量可以改变，并且与任何药物产品一样的量/剂量，受最小有效剂量和最大安全剂量的限制。所述靶向活化剂及重原子改性孔雀石绿衍生物的有效范围是在1pM(皮摩尔，也就是说皮摩尔升-1)及10mM(毫摩尔)范围内，例如在1nM(纳摩尔)和1mM之间，或者在100μM(微摩尔)和1mM之间，包括增量，例如100μM、200μM、250μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、750μM、800μM、900μM或者1mM。所述靶向活化剂和重原子改性孔雀石绿衍生物的剂量可以是相同或者不同的。在其中一个方面，所述靶向活化剂和重原子改性孔雀石绿衍生物是在给药患者之前或者在于细胞接触之前进行组合。
当体外对细胞进行给药时，所述靶向活化剂加入到培养物中，然后通过任意方法任选用细胞进行洗涤。然后将所述重原子改性孔雀石绿衍生物添加到培养物中，并且也通过任意方法任选用细胞进行洗涤。然后将所述细胞暴露于所述结合的重原子改性孔雀石绿衍生物的激发波长的光中，在一种强度下并且用于持续有效地杀死靶向细胞，优选对非靶向细胞具有最小影响。每次添加的时间、细胞与给药组合物接触的持续时间以及曝光于光源下的持续时间使得该方法的功效得以保留并且可能变化很大。
当给药患者时，所述组合物是提供于一种药学上可接受的赋形剂或药剂学上可接受的载体。赋形剂指的是一种作为药物活性成分的载体的非活性物质。虽然“非活性”，但是赋形剂可以促进且有助于增加一种药物产品中有效成分的递送或生物利用度。有用的赋形剂的非限制性实施例包括：抗粘附剂、粘合剂、流变改进剂、涂层、分解质、乳化剂、油、缓冲器、盐、酸、基、填充物、稀释剂、溶剂、味道、着色剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、阻氧化剂、吸附剂、维生素、甜味剂等等，如制药/合成领域中科获得的。
用于递送药物产品的有效剂型包括：静脉内、肌肉内或者腹膜内溶液，口服片剂或液体，局部软膏或霜剂以及投币装置(例如贴剂)。虽然任何递送途径对于本发明所述的化合物和组合物都是可适用的，但是肠胃外递送是预期的。在一个实施方案中，所述化合物是一种包含活性成分(即靶向活化剂和重原子改性孔雀石绿衍生物)的无菌溶液、以及溶剂例如水、盐水、乳酸林格氏溶液或者磷酸盐缓冲盐水(PBS)。其他的赋形剂，例如聚乙二醇、乳化剂、盐和缓冲剂亦可包含在所述溶液中。在一个实施方案中，所述组合物是一种可注射溶液或凝胶，其被注射在一种位点上，其中细胞靶向是期望的，例如在肿瘤的位点上。
所述重原子改性孔雀石绿衍生物，可以作为药学上可接受的盐被给与。药学上可接受的盐通常施用于药物应用，因为他们在水中的溶解度大于初始化合物或碱性化合物的溶解度。这些盐具有药学上可接受的阴离子或阳离子。此外，交换层析可被用于改变所述组合物的抗衡离子。合适的药学上可接受的酸加成盐包括，但不限于，无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、偏磷酸盐、硝酸和硫酸盐，以及有机酸盐，例如乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、乙醇酸盐、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、甲磺酸盐、琥珀酸盐、对甲苯磺酸盐和酒石酸盐。合适的药学上可接受的碱式盐包括但不限于铵盐、碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(如镁盐和钙盐)，以及氨基甲酸(2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇)盐、二乙醇胺盐、赖氨酸或乙二胺盐。药学上可接受的盐可以通过任何有用的方法由本发明所述的化合物进行制备，如在化学和制药领域中所公知的。
所述靶向活化剂和重原子改性孔雀石绿衍生物可以向患者给药一次、两次或多次，例如，如用于有效治疗患者所需要的那样。多于一种不同的靶向活化剂可以在同一时间或不同时间进行给药，所述靶向活化剂具有不同的靶向基团但是具有相同或者不同的活化剂基团。使用多于一个具有不同靶向基团的靶向活化剂允许靶向多于一个患者体内细胞上的标记，从而增加了功效同时降低了癌症细胞逃避治疗的能力。所述治疗方法的好处在于可以产生大量的不同靶向活化剂，其具有在靶向细胞的/上的相同或者不同的标志物上不同的靶向决定因素。因此，靶向活化剂的各种进展或组合可被应用于不同的治疗方法中。
如上文所描述的，在其中一个方面，所述靶向活化剂首先给药于患者，然后将所述重原子改性孔雀石绿衍生物给药于所述患者。在另一人方面，所述靶向活化剂和重原子改性孔雀石绿衍生物在给药于患者之前进行与组合。
根据本发明所述的另一个方面，提供了一种“试剂盒”。试剂盒包括适用于，例如使用、存储、和分发试剂盒单元的包装。包装包括盒子(例如塑料、金属和/或纸板等)、容器、袋子(例如塑料、纸和/或锡箔/聚酯播磨)、管子等等。所述试剂盒的元件可以是任何形式。化学化合物，例如所述靶向活化剂和/或所述重原子改性孔雀石绿衍生物可以以液体、干燥、冻干、结晶、玻璃化或任何合适的形式进行运输。搜书试剂盒的化学化合物通常分布在容器中，所述容器是任意地用于运输、存储且任选地使用所述化合物的合适的容器，例如瓶，烧瓶，小瓶，试管，微量离心管，医疗/计量注射器，静脉内(IV)包等。
靶向活化剂是一种二价结合组合物，包括一种活化剂基团(活化剂)，其能够结合所述孔雀石绿衍生物，使得当所述孔雀石绿衍生物通过靶向活化剂结合并且在针对所述衍生物、波长的激发波长内的光进行照射时，产生ROS也就是所述单线态氧。搜书八下活化剂还包括一种用于结合靶体的靶向基团，例如一种化合物或者癌细胞的特征性细胞标记物；病毒、细菌、真菌或寄生虫抗体；受体；细胞结合性免疫球蛋白，分化抗原簇(CD)标记物/抗原等等。活化剂和靶向基团都可以以任何形式结合实际，例如，但不限于，抗体(多科同或单克隆)、抗体片段，抗体模拟物如亲和体、affilins、affimers、affitins、alphabodies、anticalins、avimers、darpins、fynomers、单抗体、核酸配体(例如，适体)、基因工程蛋白、抗原、抗原决定部位、半抗原，或任何靶向特异性结合试剂。其次，在其中一个方面，所述靶向活化剂是一种但稠和蛋白，同时包括活化剂基团及靶向基团，其如在下文实施例中所示的那些，使scFv FAP与稠和蛋白中的靶向亲和体进行结合。或者，所述活化剂基团可以通过任何有熊的化学发明或者甚至是通过亲和力与靶向基团连接。
在一个实施方案中，所述活化剂基团指的是scFv片段，例如SEQ ID NOS:1-4中之一的L5-MG scFv片段(统称为L5-MG scFv肽，参见附件2A)，或者其串联或多重重复，并且任选地进一步包括靶向基团的氨基酸序列(也称为选择性成分)。其他的scFv片段在附图2B中给出(SEQ ID NOS:5-7)。活化剂以及靶向基团(当其存在时)的串联或多次重复可以通过太监直接连接，也可以在重复部分之间包含中间连接体，所述中间连接体基本不会影响活化剂以及靶向基团(当其存在时)的连接及激活功能。合适的连接体的实施例是短肽序列，其是与活化剂和任选地靶向基团连续编码的，例如(GGGGS,SEQ ID NO:16)。在另一个实施方案中，所述活化剂包括一种单链抗体，并且在另一个实施方案中，所述活化剂包括一种连接的抗体重链成组分和/或轻链组分的工程化组合，其包括一种抗体抗原结合位点(辅助位点)。
在其中一个方面，所述活化剂基团到与靶向基团共价连接。所述活化剂可以标准技术中的任意一种共价连接至靶向基团。例如，所述活化剂可通过在两个分支上的一个或多个反应基团之间的化学键从而直接连接至靶向基团。作为替换地，所述活化剂基团可通过在靶向基团上的氨基基团连接至靶向基团。在另一个实施方案中，所述活化剂和靶向基团存在于连续的融合蛋白上。合适的连接体包括，例如化学基团、氨基酸、或两个或多个氨基酸的链、核苷酸或两个或多个多聚核苷酸的链、聚合物链、以及多糖。在一个实施例中，所述活化剂通过具有马来酰亚胺基团的连接体连接至靶向基团。连接体可以是，例如，同官能团的(包含相同类型的反应性基团)、异官能团的(包含不同的反应性基团)、或者光反应性的(包含在光照下成为反应性的基团)。多种光反应基团是已知的基团，例如在氮烯族中的基团。
一个或多个活化剂可被连接至靶向基团上的一个或多个位置上。例如，两个或多个分子的相同活化剂可以被连接至在单个靶向基团分子上的不同位置上。作为选择地，两种或多种不同的活化剂可被连接至在单个靶向基团分子上的不同位置上。例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多活化剂被连接至靶向基团上的不同位点上。所述一个或多个活化剂被连接到靶向基团，从而用于维持活化剂和靶向基团的活性。在某些实施方案中，所述活化剂进一步包括一种基团，其对于靶向基团是特异性的。例如，所述活化剂可以连接至半抗原、抗体片段或其他的结合试剂等，其对于靶向基团是特异性的。
在其中的一个方面，所述活化剂指的是一种结合试剂、结合配偶体、配体、FAP或者类似物，其与孔雀绿衍生物以任何方式相互作用，例如通过与孔雀绿衍生物进行结合，从而以使所述绿衍生物产生单线态氧。最佳地，如果所述活化剂没有结合至孔雀绿衍生物，那么所述孔雀绿衍生物将不产生单线态氧，或者当不结合至所述活性剂时，其将不直接产生单线态氧。应当认识到的是，在孔雀绿衍生物没有与活化剂结合的情况下，可能存在低水平的单线态氧产物，但是当孔雀绿衍生物与活化剂结合时，背景产物应该会显著少于获得的产物水平。优选地，在活化剂结合的孔雀绿衍生物的单线态氧产物中的“增益”是至少10倍、100倍、1000倍、10,000倍或者甚至更多。在一个最佳的实施方案中，所述孔雀绿衍生物将不会产生单线态氧，除非其与活性剂进行结合，或者在现实世界中其更有可能基本上不会产生单线态氧，除非其与活化剂进行结合。在实际应用中，将会有一定程度的背景单线态氧产生，虽然它优选是非实质的。
正如在本发明实施例中所描述的，活化剂的一种非限制性实施方案为FAP(荧光激活肽)，一种通过任何方式产生的二肽，其结合至孔雀绿衍生物化合物，从而用于通过在给定的激发波长和强度下的衍生物增加单线态氧的生成。FAP的其中一个实施方案是一种scFv片段，其获自酵母细胞表面展示文库，并且使所述受体活化从而发出荧光。酵母展示文库的应用以及表达FAP的特异性克隆的识别、容许所述特异性克隆的定向进化从而产生了在给定的孔雀绿衍生物中具有期望活性的衍生物。下文描述了与父母的scFV L5-MG和进化衍生物FAPs L5-MG E52D、L5-MG L91S以及L5-MG E52D L91S相关的实施例。
正如本领域普通技术人员所显而易见的，存在多种用于生成合适的活化剂及靶向基团的方法。使用酵母显示文库的选择和进化对于生成有用的FAP是一种有效机制，正如scFV L5-MG以及进化的衍生物FAPs L5-MG E52D、L5-MG L91S和L5-MG E52D L91S所揭示的。关于这些多肽的开发的及制备的进一步详细内容在WO 2008/092041中提供。显而易见的是，活化剂可以是肽，但也可以是其他的分子，例如核苷酸或其衍生物，例如适体。分子文库，例如小分子、天然分子、合成分子等的文库，也可以通过简单地将孔雀绿衍生物暴露于化合物，并且确定该化合物是否可以有效地激活如本发明中所述的孔雀绿衍生物来容易地筛选受体的活化作用。所述孔雀绿衍生物可以针对随机多肽的文库或者结合试剂的文库(比方说scFv片段或其他抗体片段)来进行筛选。通过细菌，酵母，噬菌体等表达的蛋白/肽片段或实体的表达文库，能够通过菌落荧光、荧光激活细胞分选(FACS)进行筛选，或者通过与表面结合的孔雀绿衍生物和随后保留的噬菌体、细胞等的扩增进行结合来筛选。显示/表达文库的生长、繁殖、选择和突变是众所周知的。许多商业的显示/表达文库是可获得的，并且其使用功能在本领域普通技术人员范围内是可行的。
专利WO 2008/092041，其全部内容已通过引用并入本文中，不仅详细描述了L5-MGFAP的制备，而且还具体描述了通过活化剂的选择、评估和使用的大量ITA方法。在所述参考文献中，得到获自太平洋西北国家实验室的重组人scFv的酵母细胞表面显示文库，并且所述克隆最初通过一个或多个循环的FACS进行排序，分离活化期望荧光团的细胞。然后，所述FACS-筛选的细胞通过亲和性选择或进一步细胞分选进行进一步富集。
所述活化剂可以是任何分子、化合物或者组合物，其能够选择性地与孔雀绿衍生物相互作用从而使得孔雀绿衍生物产生单线态氧。所述活化剂的非限制性实施例包括：多肽、核苷酸(例如寡核苷酸、cDNA分子或者基因组DNA片段)、碳水化合物或其他合适的有机或无机分子。
所述靶向基团结合、互相作用、或者复制一种或多种细胞或生物体的组分。用于所述靶向基团的示例性的靶向分子包括，例如，残基组织分化和/或生长的分子、细胞通讯、细胞分裂、细胞运动、癌症细胞标记物以及其他在细胞内或细胞之间发生的细胞功能，包括调解分子例如生长因子、细胞因子、形态发生因子、神经递质等等。在某些实施方案中，靶向分子可以是骨形态发生蛋白质、胰岛素样生长因子(IGF)、和/或刺猬蛋白和Wnt多肽家族的成员。
所述活化剂和靶向基团可以是双功能化合物的一部分，例如融合(嵌合)蛋白质、或者单功能组分的组合，例如一种减料组合物，其中活化剂通过连接基团连接到靶向基团。所述活化剂和靶向基团可以是类似的化学实体，正如双功能嵌合蛋白、两个连接的scFv片段或者结合之蛋白质、抗体或其他多肽的scFv活化剂。他们也可以是不同的化学实体，如在活化剂是多肽的情况下，例如scFv片段，并且所述靶向基团是一种核苷酸，例如适体、模板印记材料、代谢物、脂质、多糖、病毒粒子等等。
在某些实施方案中，所述活化剂和/或所述靶向基团是一种抗体或者抗体片段。例如，活化剂可以是单克隆抗体、或者其衍生物或类似物，包括但不限于：Fv片段、单链Fv(scFv)片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单域抗体、骆驼胶化抗体和抗体片段、人源化抗体和抗体片段，以及上述的多价版本；多价活化剂包括但不限于：单特异性抗体或双特异性抗体，例如二硫键稳定的Fv片段，scFv串联((scFv)2片段)、双抗体、三抗体或四抗体，其通常共价连接或以其他方式稳定(即，亮氨酸拉链或螺旋稳定)scFv片段；与一种需要的靶向分子天然相互作用的受体分子。
在一个实施方案中，所述活化剂和/或所述靶向基团是一种抗体。抗体的制备可以通过然和数量已知的用于生成单克隆抗体的方法来完成。这些方法通常包括动物特别是小鼠的棉衣作用步骤；与一种期望的免疫原(例如，所述的靶向分子或其片段)。当小鼠被免疫并且优选用所需的免疫原加强一次或多次，单克隆抗体生成的杂交瘤可以依据泵领域所供职的方法(参见，例如Kuby,Janis,IMMUNOLOGY,Third Edition,pp.131-139,W.H.Freeman&Co.(1997),用于单克隆抗体生成的总体概述)进行制备或筛选。
抗体及其他结合试剂的制备变得非常巨大。结合抗体识别和噬菌体暂时技术的体外方法允许扩增和选择具有特异性结合能力的抗体或其他结合试剂。这些方法通常比通过传统单克隆抗体制备方法制备的杂交瘤要复杂的多。结合表位归类于小有机化合物例如溴尿苷和磷酸酪氨酸至长度为7-9个氨基酸数量级的寡肽尺寸的尺寸范围内。
在其中一个方面，所述或化解和/或所述靶向基团指的是一种抗体片段。抗体片段的选择和合成可以通过任何数量的公知方法完成。噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、mRNA展示以及核糖体展示方法可以应用于鉴别和克隆所需的抗体片段。重组技术可被应用于生成抗体片段活化剂，其针对所需的靶向分子特异性，包括，例如，Fab片段、具有工程化的分子间二硫键的Fvs，用于稳定VH-VL对，scFv或双抗体片段。
在某些实施方案中，所述活化剂包括一种多肽序列，其具有至少大约85％，至少大约90％，至少大约95％，大约96％，大约97％，大约98％，大约99％或者大约100％的序列，所述序列与附图2A的多肽序列中的人任意其中之一具有同一性。产生所述活化剂的载体可以以WO 08/092041中所描述的那样进行制备，具有编码附图2A中的多肽的氨基酸或者在pPNL6及其同系物(例如，附图3A-3E中的SEQ ID NO:9)的侧翼HA和c-myc表位之间的框架中插入其他活化剂序列，并且被用于转染如本发明所描述的宿主细胞以及如在WO 08/092041中所描述的宿主细胞。
使用展示方法的scFv抗体片段的制备，包括噬菌体，细菌，酵母，核糖体和mRNA展示方法，能够被用于生产如本发明在这里所描述的所述活化剂和/或靶向基团。如在下文中所描述的，酵母展示方法可被用于产生下文中所描述的火炬阿基。例如，在Boder,et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci USA 97:10701-5；Swers,et al.(2004)Nucl.Acids.Res.32:e36以及Yeast Display scFv Antibody Library User’s Manual,Pacific NorthwestNational Laboratory,Richland,WA 99352,Revision Date:MF031112中所描述的酵母展示方法。
核糖体展示还是一种用于生产所述活化剂和/或所述靶向基团的有效方法。核糖体展示是一种用于进行体外蛋白质进化从而产生能够与一种期望的配体结合的蛋白质的技术。所所述过程引起翻译的蛋白质，其与它们的mRNA祖细胞相关，所述mRNA祖细胞被用于，作为一种复合物，结合至一种选择步骤中的固定化配体。所述mRNA编码任意的多肽，并且所述多样性远远超过噬菌体和酵母展示系统的多样性。然后，所述与配体很好结合的mRNA-蛋白质混合物，逆转录为cDNA，并且它们的序列通过PCR进行扩增。最终的结果是，一种核苷酸序列能够被用于产生紧密结合的蛋白质。(例如参见，Hanes J,Plückthun A(1997)Proc Natl Acad Sci USA 91:4937–4942；He M,Taussig M J(1997)Nucleic AcidsRes 25:5132–5134；以及In Vitro Protein Expression Guide,PROMEGA(2005),pp-29-33,Chapter 6,Ribosome Display)
核糖体展示还开始于一种DNA序列或者用于编码一种特异性蛋白质的序列的天然文库。所述序列被转录，并且然后在体外转化为蛋白质。但是，所述用于编码结合蛋白的特定文库的DNA文库与缺少终止密码子的间隔序列进行基因融合。当进行翻译时，所述间隔序列仍然与肽基tRNA结合并且占据核糖体通道，并且因此允许感兴趣的蛋白质突出至核糖体之外并且进行折叠。所形成的是一种mRNA、核糖体和蛋白质的复合物，其能够与表面结合的配体进行结合。这种复合物随着温度的降低以及阳离子如Mg2+而稳定。
在随后的结合或移动阶段器件，所述核糖体复合物被引入到表面结合配体。中可以通过某些方式实现，例如使用一种有含有配体的树脂床的亲和层析柱、具有固定的表面结合配体的96孔板或已经用配体包被的磁珠。所述结合良好的复合物被固定化。随后使用高盐浓度、螯合剂或者移动配体的结合体洗脱，具有蛋白质的结合基序的复合物允许mRNA解离。然后，所述mRNA逆转录至cRNA，经过邮编，并且已更大的选择压力反复地提供至所述过程中，用于更好地分离结合体。
由于所述过程完全是在体外发生，因此核糖体展示方法相比于其他的选择技术有两个主要优势。第一，所述文库的多样性不受细菌细胞的转化效率的限制，但仅仅是通过哦试管中存在的核糖体和不同mRNA分子的数量来进行限制。第二，任意的突变能够在每个选择循环之后容易地被引入，因为没有文库必须在任何多样化步骤之后进行转录。这允许在某几代中结合蛋白的容易的定向转化。
在某些展示方法中，例如噬菌体和酵母展示，VH和VL链的文库是经由B-细胞的mRNA进行制备，不论是自然的或者是免疫的动物(例如小鼠、兔子、山羊或其他动物)，或者甚至是经由多克隆或者单克隆杂交瘤的B-细胞。所述mRNA是通过已知的方法进行逆转录，使用polyA引物或者小鼠免疫球蛋白特异性引物，通常特异与所需的VH和VL链相邻的序列，用于产生cDNA。所需要的VH和VL链通常使用VH和VL特异性引物组通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增，且被结合到一起，通过连接体进行分离。VH和VL特异性引物组是市场上可买到的，例如来自加利福尼亚州的La Jolla的Stratagene,Inc.公司。选择的VH-连接体-VL产物(编码的scFv片段)被选择并且通过PCR进行扩增。限制性位点被引入至VH-连接体-VL产物的末端，通过具有包含限制性位点的引物的PCR，并且所述scFv片段被插入至用于噬菌体展示的合适的表达载体(通常为一种质粒)中。其他的片段，例如一种Fab’片段，可以被克隆至噬菌体展示载体中，用于在噬菌体颗粒上的表面表达。所述噬菌体可以是任意的噬菌体，例如λ，但通常是丝状噬菌体，例如fd和M13，通常是M13。
在展示载体中，VH-连接体-VL序列呗克隆至表面蛋白中(例如，对于M13，表面蛋白g3p(pHI)或者g8p，最典型地为g3p)。展示系统也包括噬菌体系统，其基于含有噬菌体表面蛋白基因(例如，M13的g3p和g8p)以及噬菌体复制起点。为了生产噬菌体颗粒，含有噬菌粒的细胞用辅助噬菌体进行补救，提供用于噬菌体产生所需的剩余蛋白质。噬菌体载体只能被包装至所得到的噬菌体颗粒中，因为噬菌粒的复制相对于辅助噬菌体DNA的复制是非常有利的。用于抗体生产的噬菌粒包装系统是市场上可以买到的。市场上可买到的噬菌粒包装系统的一个实施例为重组噬菌体抗体系统(RPAS)，所述市场上可买到的噬菌粒包装系统也可以是允许在细菌细胞中的可溶性ScFy片段的制备，所述重组噬菌体抗体系统(RPAS)市场上可自GE Healthcare,Piscataway,NJ公司购买获得，并且所述pSKAN噬菌粒展示系统市场上可自MoBiTec(Boca Scientific,Boca Raton,FL)购买获得。噬菌粒展示系统，它们的构造及筛选方法，除了别的之外，在美国专利号5,702,892、5,750,373、5,821,047和6,127,132中进行详细描述，其各自的全部内容已通过引用并入本发明中。
通常，一旦制备了克隆(例如噬菌体、酵母、细菌、核糖体等)群体，其展示了所述的多肽例如一种抗体片段，表位特异性克隆是通过它们针对所期望的免疫原的亲和性进行选择，并且优选地它们的缺点是用于将免疫原结合克隆从非结合克隆中物理分离。一般来说，所述免疫原被固定值表面，并且所述克隆与所述表面进行接触。非结合克隆被洗脱，此时结合克隆保持结合。结合的克隆被洗脱并被繁殖用于扩增所选择的克隆。通常使用多次亲和力选择的重复循环，通常越来越多地较高严谨度洗涤，用于扩增增加亲和力的免疫原结合克隆。负选择技术也可以被用于选择因缺少对所需靶体的结合。在这种情况下，对非结合(洗涤的)克隆进行扩增。在本发明的上下文中，结合的染色体的荧光可被用作为用于识别克隆的选择性标记。最初可以采用诸如FACS的高通量方法来选择克隆，随后，可以通过荧光成像技术任选地通过检测在培养的菌落中的荧光团。
虽然优选使用来自预先用期望的免疫原进行免疫的动物的脾细胞和/或B淋巴细胞作为cDNA源，通过RT-PCR扩增VH和VL链的序列，天然的(未用目标免疫原进行免疫的)脾细胞和/或B细胞可被用于作为cDNA源用于产生VH和VL链的多克隆组，其通过亲和力进行体外选择，通常通过上文所述的噬菌体展示(噬菌粒)方法。当使用天然的B细胞时，在亲和力选择期间，首次选择步骤的洗涤通常具有非常高的严格性，以避免在多克隆噬菌体文库中可能存在的非常低的复制数量的任何单克隆的丢失。通过这种天然的方法，B细胞可从任何多克隆来源获得，B细胞或者脾细胞cDNA文库还可以是一种cDNA源，其中所述VH和VL链可以进行扩增。例如，合适的小鼠和人类B细胞、淋巴细胞、和脾细胞cDNA文库是通过商业购买可获得的。
所述活化剂和/或靶向基团不必源自于生物来源，例如，来自动物或人类的天然或者免疫的免疫细胞。所述活化剂和/或靶向基团能够从合成肽的组合文库中进行筛选。在美国专利号为5,948,635的专利中对其中一种这样的方法进行了描述，该专利已通过引用全部并入到本文中，其描述了具有在M13的药物基因中随机氨基酸插入的噬菌体文库的制备。这些噬菌体可以通过上文所述的亲和力选择进行克隆扩增。
在培养皿或者培养烧瓶中平移是用于物理地将结合克隆从非结合克隆中分离出来的一种方法。平移可以在96孔板中进行，其中所期望得到的免疫原结构已经被固定。通常用作ELISA板的功能化的96孔板可以购自Pierce of Rockwell，Illinois。其他的用于分离具有期望特可以放在异性的克隆的亲和性方法包括将把分子固定在球珠。所述球珠可以放在圆柱中，并且所述克隆可被连接所述柱上，根据标准程序进行清洗和洗脱。可代替的是，所述球珠可以是磁性的，以便允许将结合颗粒从非结合颗粒中磁性分离。所述免疫原也可以被固定在多孔膜或者基质上，允许所述结合的克隆容易清洗和洗脱。
在某些实施方案中，可能需要使用在亲和力选择过程中的负选择步骤增加对给定的靶向分子或报告分子的活化剂的特异性。例如，活化剂展示克隆可以与一种表面进行接触，所述表面是用于靶向分子或报道分子不同的分子进行官能化的。所述克隆从表面上被洗涤，并且非结合克隆进行生长从而克隆地使非结合克隆的群体进行扩增，从而取消对不所需要的靶向分子特异的克隆。在某些实施方案中，随机合成肽可用于阴性选择步骤。在其它实施方案中，一种或多种具有与孔雀绿衍生物结构向西行的免疫原可被应用于负选择步骤中。
在某些实施方案中，与未突变的活化剂相比，可能需要使活化剂和/或靶向基团的结合区域进行突变并且选择具有优异结合特征的活化剂和/或靶向基团。这可以通过任何标准诱变技术来实现，例如通过在引起错误的条件下用具有Taq聚合酶的PCR进行诱变。在这种情况下，PCR引物在引起突变的条件下可用于扩增(例如)噬菌粒质粒的scFv-或结合试剂编码的序列。然后，如上文所述的那样，将PCR产物克隆到(例如)噬菌粒载体中，并筛选所需的特异性。突变体可能被生成并且从文库中被分离，通过使用例如丙氨酸扫描突变等，通过连接体扫描诱变；通过饱和诱变；通过PCR诱变；或通过随机诱变进行筛选。连接体扫描诱变，特别是在组合设置中，是一种用于识别活化剂的有吸引力的方法。
在其它的实施方案中，活化剂和/或靶向基团可以被修饰以使其更能抵抗蛋白酶的切割。例如，本发明中所述的活化剂的能稳定性包括通过取代在具有D-氨基酸的取代(L)构型中的一种或多种天然存在的氨基酸来增加多肽。在多种实施方案中，所述活化剂的至少1％，5％，10％，20％，50％，80％，90％或100％的氨基酸残基可以是D构型。从L到D氨基酸的切换中和了消化道中发现的许多普遍存在的肽酶的消化能力。可以替换地，本发明所述的活化剂的增强的稳定性可以通过传统肽键的修饰的引入来实现。例如，在多肽骨架中循环环的引入可以赋予增强的稳定性，以便规避许多已知的在胃或其它消化器官和血清中消化多肽的蛋白水解酶的作用。在其它实施方案中，所述活化剂的增强的稳定性可以通过在活化剂的氨基酸之间插入一个或多个右旋氨基酸(例如，右旋苯丙氨酸或右旋色氨酸)来实现，这样的修饰增加了所述活化剂的蛋白酶抗性，而不会影响其与期望的靶分子或报道分子的相互作用的活性或特异性。
在某些实施方案中，可以修饰抗体或其变体，用于如果将其在给药于受试者或者当将其给药于受试者时使其具有较少的免疫原性。例如，如果受试者是人，所述抗体可以是“人源化的”；其中所述杂交瘤衍生的抗体的互补决定区被移植到人单克隆抗体中，例如在美国专利号6,407,213中所描述的那样。此外，转基因小鼠或其他哺乳动物，可被用于表达人源化抗体。这样的人性化可能是部分的或完全的。
在另一个实施方案中，所述活化剂是Fab片段。Fab抗体片段可以通过使用蛋白酶木瓜蛋白酶的免疫球蛋白分子的蛋白水解来获得。所述木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab片段”，其中每一个都具有单个抗原结合位点和残留的“Fc片段”。在另一个实施方案中，所述活化剂是F(ab')2片段。所述F(ab')2抗体片段可以使用酶胃蛋白酶限制蛋白水解从IgG分子进行制备。
在其它实施方案中，所述活化剂可以是一种适体，也称为核酸配体。所述适体是寡核苷酸，其被选择用以特异性结合所需分子结构。所述适体通常是亲和力选择过程的产物，其与噬菌体展示(也称为体外分子进化)的亲和力选择相似。所述过程包括进行亲和力分离的几个串联迭代，例如将一种固体支持物应用于所需免疫原的结合，随后进行聚合酶链式反应(PCR)以扩增与免疫原结合的核酸。因此，每轮的亲和力分离从事了用于成功结合所期望免疫原的核酸群体。以这种方式，一种随机的核酸库可以“经培养的”，用以产生特异性结合靶分子的适体。所述适体通常是RNA，但也可以是DNA或其类似物或衍生物，例如，但不限于肽核酸和硫代磷酸酯核酸。所述适体可以使用“SELEX”方法进行制备，所述方法包括核酸配体的选择，其中所述核酸配体是与靶体相互作用，以期望的方式与那些选择的核酸的扩增进结合的靶体。所述SELEX方法在美国专利号5,475,096以及美国专利号5,270,163以及国际申请号WO 91/19813的专利中进行描述。
所述SELEX方法提供了一种类型的产品，其为核酸分子，每种产品具有独特的序列，并且每种产品具有特异性结合所需目标化合物或分子的性质。在多种实施方案中，所述靶分子可以是，例如，蛋白质、碳水化合物、肽聚糖或小分子。所述SELEX方法还可应用于靶向生物结构，例如细胞表面或者病毒，通过与作为该生物结构组成部分的分子的特异性相互作用。
所述基本的SELEX方法已被修饰，用以实现一些特定的目标。例如，美国专利号5,707,796的专利描述了所述SELEX方法在结合凝胶电泳中的应用，用以选择具有特定结构特征的核酸分子，例如弯曲的DNA。美国专利号5,580,737专利描述了一种用于识别能够在紧密相关的分子之间进行区分的(称为CounterSELEX)的高度特异性核酸配体的方法。美国专利号5,567,588的专利描述了一种基于SELEX的方法，其实现了对目标分子的具有高亲和力和低亲和力的寡核苷酸之间的高效分配。美国专利号5,496,938和美国专利号5,683,867的专利描述了用于在完成SELEX方法之后得到改良的核酸配体的方法。
在某些实施方案中，如本文所述的核酸配体可以包括修饰，其增加它们的稳定性，包括，例如，通过酶如内切核酸酶和外切核酸酶提供增强的降解抗性的修饰，和/或增强或介导核酸配体递送的修饰(例如参见，美国专利5,660,985和美国专利5,637,459)。这些修饰的实施例包括在核糖和/或磷酸酯和/或碱基位置处的化学取代，在多种实施方案中，所述核酸配体的修饰可包括，但不限于，那些提供其它化学基团的修饰，其包含用于核酸配体碱基或整个核酸配体的额外的电荷、极化性、疏水性、氢键、静电相互作用、以及流动性。这些修饰包括，但不限于，2’-位置糖修饰、5’-位置嘧啶修饰、8-位置嘌呤修饰、环外氨基基团的修饰、4-硫嘌呤取代、5-溴代或5-碘代-尿嘧啶取代；主链修饰、硫代磷酸酯或烷基磷酸酯修饰、甲基化、非常规碱基对组合如异碱基异胞啶与异胍等。所述修饰还可以包括3'和5'修饰，如封端。在示例性的实施方案中，所述核酸配体是在嘧啶残基的糖集基团上修饰的2'-氟(2'-F)的RNA分子。
T所述活化剂和/或靶向基团可以是模板印迹材料。所述模板印刷材料是具有一种结构，该结构具有一种外糖层和一种下伏等离子体沉积层。所述外糖层包含凹痕或印记，其在形状上与所需的靶分子或模板互补，以允许模板印迹结构与其互补的靶分子之间的特异性相互作用。所述模板印迹可被用于各种结构的表面，包括，例如，医疗假体(例如人造心脏瓣膜，假肢关节，隐形眼镜和支架)，微芯片(优选硅基微芯片)和设计用于检测特定微生物如病毒或细菌的诊断设备的组件。所述模版印刷材料在美国专利号6,131,580的专利中进行论述，其全部内容已通过引用并入本文。
在某些实施方案中，所述活化剂可以含有促进其分离、固定、识别或检测和/或增加其溶解度的标签或手柄。在多种实施方案中，所述标签可以是多肽、多核苷酸、碳水化合物、聚合物或者一种化学部分以及他们的组合或变体。在某些实施方案中，所述示例性的化学手柄包括，例如，谷胱甘肽S-转移酶(GST)；蛋白A、蛋白G、钙调蛋白结合肽、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、HA、myc、聚精氨酸、聚His、聚His-Asp或FLAG标签。其他的示例性的标签包括多肽，其改变体内蛋白质定位，例如信号肽、III型分泌系统靶向肽、转胞吞作用域、核定位信号等。
在另一个实施方案中，所述活化剂和/或靶向基团可以被修饰，从而使得其跨越细胞膜的速率增加。例如，所述活化剂可以与一种肽进行连接，所述肽促进“胞吞作用”，例如，通过细胞摄取多肽。所述肽可以是HIV反式激活因子(TAT)蛋白质的一部分，例如与TAT的残基37-62或48-60相关的片段，已被观察到通过细胞体外快速吸收的部分(Green andLoewenstein，(1989)Cell 55：1179-1188)。可以替代地，所述内化肽可以衍生自果蝇触角蛋白、或其同系物。同源蛋白触角介体的60个氨基酸长的同源结构域已经被证实通过生物膜转位，并且能够促进与其偶联的异源多肽的易位。因此，所述活化剂可以被融合至一种肽，所述肽由用于胞移作用的果蝇触角或更短片段的大约氨基酸42-58构成(Derossi等人，(1996)和J Biol Chem 271：18188-18193)。所述转胞吞作用多肽还可以是非天然存在的膜-转位序列(MTS)，例如在美国专利号6,248,558的专利中公开的肽序列。
在其中一个方面，其中活化剂/靶向基团是二价的，其包含在一种连续多肽序列中的活化剂和靶向基团，以一种包含任何合适的多肽活化剂和靶向基团的融合(嵌合)蛋白形式。如上所述，所述融合蛋白可以包含至少一个结构域，其增加他的溶解度和/或促进了他的纯化、识别、检测、靶向和/或递送。示例性区域包括，例如，谷胱甘肽S-转移酶(GST)、蛋白A、蛋白G、钙调蛋白结合肽、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、HA、myc、聚精氨酸、聚His、聚His-Asp或FLAG融合蛋白质和标签。另外的示例性结构域包括结构域，其改变了体内蛋白质的定位，例如信号肽、III型分泌系统靶向肽、转胞吞素结构域、核定位信号和靶向基团、即靶分子特异性蛋白质等。在多种实施方案中，本发明所述对的多肽可以包含一种或多种异源融合体。所述多肽可以包含相同融合结构域的多个拷贝，或者可以包含针对两个或多个不同结构域的融合物。所述融合可以在多肽的N末端、多肽的C末端、或同时在多肽的N末端和C末端发生。在活化剂和/或靶向基团多肽之间的连接体序列可以被包括，从而促进了融合蛋白的构建或用于优化融合蛋白的蛋白质表达或结构限制。下文描述了示例性、证明概念的融合蛋白。
通常，编码活化剂和靶向基团的核酸可以被引入宿主细胞，例如通过转染或感染，并且所述宿主细胞在允许活化剂表达的条件下进行培养。将核酸引入原核和真核细胞的方法是本领域所公知的。用于哺乳动物和原核宿主细胞培养的合适的培养基是本领域公知的。在一些情况下，编码本发明多肽的核酸在诱导型启动子的控制下，一旦包含核酸的宿主细胞已经分配一定次数就被诱导。例如，当核酸处于β-半乳糖操纵子和阻遏物的控制下时，当细菌宿主细胞达到约OD6O0 0.45-0.60的密度时，将异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)加入到培养物中。然后，将培养物再生长一段时间以给宿主细胞合成多肽的时间。然后，在分离和纯化多肽之前，将培养物通常冷冻并且可以冷冻储存一段时间。
根据本发明的一个方面，靶向基团是抗体模拟物-具有结合特异性的工程化蛋白。所述工程化的蛋白质靶向药物可以是亲和体、affilins、affimers、affinins、alphabodies、anticalins、avimers、DARPins、fynomer、monobodies。在其中一个方面，所述靶向基团是亲和体。所述亲和体是最初基于金黄色葡萄球菌A的三-α螺旋Z结构域的小蛋白质。亲和体可以商业化应用于许多主要目标，并通过任何数量的宿主细胞/表达系统以可溶性，稳定的形式表达，并且与其它结合试剂一样通过与目标化合物的亲和结合来选择，并且通过根据广泛已知的方法改变它们的一级序列来改变它们的结合。示例性亲和体包括：
her2(ZHER2：342)：VENKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(SEQ ID NO：17)；
EGFR(ZEGFR：1907)：AEAKYAKEMWAAWEEIRNLPNLTGWQMTAFIAKLVDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK(SEQ ID NO：18)
因此，编码全部或部分活化剂和靶向基团的核苷酸序列可被用于产生活化剂和靶向基团的重组形式，通过微生物或真核细胞过程。将序列连接到多核苷酸构建体(例如表达载体)中，并转化、感染或转染到真核(酵母，禽类，昆虫或哺乳动物)或原核(细菌细胞)的宿主中，是标准的方法。根据本发明所述，类似的方法或其修饰可被采用用来制备重组多肽，通过微生物手段或组织培养技术。
“表达”是指来自基因的信息的整体流动(但不限于，用于产生通常用DNA或RNA编码的某些病毒的基因产物的功能遗传单位，并且包含转录启动子和其它顺式作用元件如响应元件和/或增强子，表达的序列通常编码蛋白质(可读框架或ORF)或功能/结构RNA和多聚腺苷酸化序列)，以产生一种基因产物(通常一种蛋白质、任选翻译后的修饰的RNA或者一种功能性/结构性RNA)。通过“指定序列的转录控制下的基因的表达”或者作为替代地，指定的序列的“受控制的基因的表达”，是指来自含有与基因可操作地连接(功能性连接的，通常为顺式)的指定序列的基因的基因表达。所述指定的序列可以是全部或部分转录元件(但不限于，启动子、增强子和应答元件)，并且可以全部或部分调节和/或影响基因的转录。一种认定的基因产品的“用于表达的基因”指的是一种基因，其当放置在合适的环境中时能够表达所述认定的基因产品，也就是说，例如，当转化、转染入细胞时，并且能够表达所述基因产物的基因-例如，并经受适当的表达条件。在组成型启动子“合适条件”的情况下，通常仅需要将基因导入宿主细胞中。在诱导型启动子的情况下，“合适的条件”是指当向表达系统(例如，细胞)施用相应诱导剂的量以有效引起基因表达时。在本发明说明书中所描述的所有核苷酸序列是以5'至3'方向进行提供，并且本发明在此所述的所有氨基酸序列以N-末端至C-末端方向进行提供。
在本发明下文以及WO2008/092041中描述了编码活化剂和靶向基团以及载体、宿主细胞及其培养物的核酸序列的另一个实施方案，以及制备融合蛋白的方法。编码活化剂和/或靶向部分的核酸可以可操作地连接到细菌启动子，例如，厌氧大肠杆菌，NirB启动子或大肠杆菌脂蛋白唇；沙门氏菌pagC启动子，志贺氏菌启动子，Tn10的tet启动子或霍乱弧菌的ctx启动子。能够使用任意其他的启动子。细菌启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。所述信号肽序列可以被添加到构建体中，从而使得所述活化剂从细胞进行分泌。这样的信号肽在本领域中是公知的。在一个实施方案中，由大肠杆菌RNA聚合酶识别的噬菌体T5启动子与lac操纵子抑制组件一起使用以在大肠杆菌中提供严格调节的高水平表达或重组蛋白。在这种系统中，蛋白质表达是在高水平的lac阻遏物存在下被阻断。各种各样的方法和基因构建体可通过商购获得，并且是由本领域普通技术人员以其他方式获知或者可用于生产重组蛋白质和多肽。使用例如真核裂解物，比方说兔网织红细胞裂解物、兔卵母细胞裂解物、人细胞裂解物、昆虫细胞裂解物和小麦胚芽提取物或者甚至合成方法，如众所周知的，可被用于产生本发明在这里所述的多肽。
可以使用植物表达载体。例如，可以使用病毒启动子，例如CaMV的35S RNA和19SRNA启动子，或者TMV的外壳蛋白启动子；或者，植物启动子如RUBISCO的小亚基；或者热休克启动子，例如大豆hsp 17.5-E或hsp 17.3-B。这些构建体可被引入至植物细胞中，使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体；直接DNA转化；显微注射、电穿孔等等。有关所述技术的综述可以参见，例如，Weissbach&Weissbach,1988,Methods for Plant Molecular Biology.、Academic Press,New York,Section VIII,pp.421-463；以及Grierson&Corey,1988,PlantMolecular Biology,2d Ed.,Blackie,London,Ch.7-9。作为替换的，昆虫系统可被用于产生本发明在这里所描述的多肽。在一个这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作表达外源基因的载体。所述病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。在昆虫系统的另一个实施方案中，将所述编码本发明多肽的DNA克隆到多角体启动子下游的pBlueBacIII重组转移载体(Invitrogen,San Diego,Calif.)中，并转染到Sf9昆虫细胞中(源自S.frugiperda卵巢细胞，可获自Invitrogen，San Diego，Calif.)，用来产生重组病毒。在另一个实施方案中，本发明的多肽在转基因动物中制备，使得在某些实施方案中，例如在雌性动物的乳中分泌所述多肽。
用于将遗传物质引入到细胞中的病毒载体，是在相关领域中众所周知的，多种可商业上获得的病毒载体还可被用于将核酸有效地体外引入到细胞中。用病毒载体感染细胞具有以下优点：大部分靶细胞可以接受核酸。此外，由病毒载体中的遗传物质编码的多肽，例如通过病毒载体中所含的核酸，在接受病毒载体核酸的细胞中进行有效表达。有用的病毒载体系统的实施例包括逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒载体通常被理解为可用于体外外源基因的转移，特别是用于哺乳动物。这些载体提供了有效的基因输送到细胞中，并且所述转移的核酸通常被稳定地整合到宿主的染色体DNA中(参见Miller，A.D.(1990)Blood76：271)。
另一种病毒基因传递系统利用腺病毒衍生载体。衍生自腺病毒Ad型5dl324或其他腺病的毒株(例如，Ad2、Ad3、Ad7等)的合适的腺病毒载体是本领域技术人员所公知的。重组腺病毒在某些情况下是有利的，因为他们能够感染非分裂的细胞，并且能够被用于感染各种各样的细胞类型，包括气道上皮细胞、内皮细胞、肝细胞和肌肉细胞。此外，所述病毒颗粒是相对稳定的，并且易于纯化和浓缩，并且如上所述，可以被修饰从来影响感染性谱。此外，导入的腺病毒DNA(和其中包含的外来DNA)不能够被整合到宿主细胞的基因组中，但是保持游离的，从而避免潜在的问题，所述问题的发生可能是由于在引入的DNA整合入宿主基因组(例如，逆转录病毒DNA)的情况下由于插入诱变而发生的。此外，相对于其他基因递送载体，外源DNA的腺病毒基因组的携带能力更大(高达8千碱基)。目前使用的并因此受本发明喜爱的大多数复制缺陷型腺病毒载体对于全部或部分缺失的病毒E1和E3基因，但保留多达80％的腺病毒遗传物质。插入的遗传物质的表达可以由例如E1A启动子，主要是晚期启动子(MLP)以及相关的前导序列、E3启动子或外源添加的启动子序列控制。
用于递送编码本发明多肽的遗传物质的另一种病毒载体系统是腺相关病毒(AAV)。腺相关的病毒是天然存在的缺陷病毒，其需要另一种病毒，例如腺病毒或疱疹病毒，作为有效复制和生产生命周期的辅助病毒。它也是可以将DNA整合到非分裂细胞中的少数病毒之一，并且表现出高频率的稳定整合。包含少至300碱基对的AAV的载体可以被包装并且可以整合。外源DNA的空间可被限制在约4.5kb。一种AAV载体，例如在Tratschin等人(1985)Mol.Cell.Biol.5:3251-3260中所描述的载体，可被用于将DNA引入细胞中。已经使用AAV载体将各种核酸引入到不同的细胞类型中(例如参见，Hermonat等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6466-6470和Flotte等人(1993)J.Biol.Chem.268：3781-3790)。其他的病毒载体系统可以衍生自疱疹病毒、痘苗病毒和几种RNA病毒。
除了如上所述的病毒转移方法之外，还可以使用非病毒方法来引起编码本发明多肽的核酸的表达，例如，在细胞体外或在动物的组织中。基因转移的大多数非病毒方法依赖于哺乳动物细胞用于大分子摄取和细胞内运输的正常机制。非病毒基因传递系统可能依赖于内吞途径用于通过靶向细胞遗传物质的摄取。这种类型的示例性基因递送系统包括脂质体衍生系统、聚赖氨酸缀合物和人造病毒包膜。例如，遗传物质可以被包裹在其表面带正电荷的脂质体(例如，脂蛋白)中，并且任选地被靶标组织的细胞表面抗原抗体标记(Mizuno等人，(1992)No Shinkei Geka 20:547-551；PCT公开号为WO 91/06309的专利；日本专利申请1047381；以及欧洲专利公开EP-A-43075)。例如，可以使用用针对PV相关抗原的单克隆抗体标记的脂质体进行乳头状瘤感染细胞的脂质转染(参见Viae等人(1978)J InvestDermatol 70：263-266；也参见Mizuno等人(1992)Neurol.Med Chir.32：873-876)。
例如，所述基因传递系统包括一种抗体或细胞表面配体，其与基因结合剂如聚赖氨酸交联(参见例如PCT公开WO93/04701)。例如，所述遗传物质可被用于体内转染细胞，使用可溶性多核苷酸载体，其包括一种与聚阳离子缀合的脱唾液酸糖蛋白，例如聚赖氨酸(参见美国专利5,166,320)。能够理解的是，通过介导的内吞作用有效递送核酸构建体，能够使用使用试剂进行增强，所述试剂增强记忆从细胞核内体的逃逸。例如，流感HA基因产品的整个腺病毒或融合肽可用作递送系统的一部分，用于诱导含有DNA的核内体的有效破坏(Mulligan等人，(1993)Science 260-926；Wagner等人，(1992)Proc.Natl.Acad.ScL USA89:7934；以及Christiano等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2122)。
实施例
作为所报道的荧光FAP复合物之一的MG/dL5荧光模块具有皮摩尔亲和力，并且在结合时具有数千倍的荧光激活(Szent-Gyorgyi,C.,等人，Fluorogen-activating single-chain antibodies for imaging cell surface proteins.Nat Biotechnol.26,235–240(2008))。Nat Biotechnol.26,235-240(2008))。通过合理设计，与FAP结合的氟衍生物已经在单分子成像中显示出不同的应用(Saurabh,S.,等人，Multiplexed Modular GeneticTargeting of Quantum Dots.ACS Nano,2014)，通过pH敏感性的受体跟踪(Grover,A.,等人，Genetically Encoded pH Sensor for Tracking Surface Proteins through Endocytosis.Angew.Chem.Int.Ed.51,4838–4842(2012))以及作为重组亲和探针的蛋白质检测(Saunders,M.J.,等人，A Bifunctional Converter:Fluorescein Quenching scFv/Fluorogen Activating Protein for Photostability and Improved Signal to Noisein Fluorescence Experiments.Bioconjug Chem,2014；以及Gallo,E.,等人，Fluorogen-activating scFv biosensors target surface markers on live cells viastreptavidin or single-chain avidin.Mol Biotechnol,2014.56(7):585-90)。
所述3,5-二碘-4-羟基苯甲醛、蒽-9,10-二丙酸二钠盐ADPA，是从VWR国际和Sigma-Aldrich购买获得，来自前沿科学的PEG-过氧化氢酶、PEG-SOD，hoechst染料33342，活/死细胞活力/细胞毒性试剂盒L-3224和二氢乙硫醚(hydroethidine)D11347分别来自Molecular探头。B基础培养基来自Invitrogen.H NMR，并且C NMR数据在Bruker AvanceTM300MHz至500MHz进行记录。质谱获自Thermo-Fisher LCQ ESI/APCI Ion Trap。最终产物通过二氧化硅、中性氧化铝和反相色谱进行纯化，纯度通过UPLC进行测试。在PerkinElmerLambda 45分光光度计上测量各种游离染料和染料-FAP复合物的原始吸光度值。荧光的增强是在Tecan Safire2读书器上的96孔微量培养板中进行测量。通过在Quantamaster单色荧光计(Photon Technology International)上比较PBS7.4中MG2I-dL5复合物与Cy5的综合光谱来确定量子产率。
细胞培养：将HEK、A431和SKBR3细胞(ATCC)培养在DMEM(FisherBrand)中，其补充有10％的胎牛血清(FisherBrand)。为了构建在不同细胞室中表达FAP的细胞系，使用Lipofactamine 2000(Invitrogen)用pcDNA质粒转染HEK细胞。所述转染的细胞通过G418选择两周，然后分选到克隆中用于稳定细胞系。在pcDNA中，L5被克隆至用于膜表面定位的PGFR衍生的跨膜结构域，用于核靶向的核定位信号和用于线粒体标记的COX信号。
单线态氧量子产率的测定：PBS7.4溶液含有0.1mM ADPA，并且在不同时间点，通过660nm的LED光源照射光学匹配的样品，在374/402nm处的荧光降低被记录，然后将数据拟合成线性图，然后使用下述等式从斜率对ΦΔ进行计算。
Figure GDA0001393278760000421
死亡/活细胞活力测定：将400nM染料(MG/MG-2I)与细胞预复合30分钟。照射后，用2μM钙黄绿素AM和4μMEthD-1工作溶液来代替缓冲液。在室温下孵育30分钟后，用细胞进行双色荧光细胞活力试验。
细胞杀伤实验以及细胞死亡数：在照射前30分钟向细胞中加入MG/MG2I(对于A431和SKBR3细胞，在照射前1小时加入缀合FAP的亲和体)。将显微镜和灯箱用作照明源，通过改变光强度或照明时间来实现不同的光剂量。对于死细胞计数，照射后立即用含有1uM碘化丙锭和8uM Hoechst的PBS替换培养基。孵育30分钟后，对细胞进行计数，并且通过PI与Hoechst的比例来确定死亡细胞比例。
二氢乙基异硫脲：在O2 -的存在下，DHE被氧化成2-羟乙胺(EOH)并且结合DNA的中间产物，产生荧光信号。在激发和发射波长分别为488和567nm处，测量EOH荧光。在照射前10分钟内，将细胞暴露于2μM二硫代乙酸铵。
MG2I的合成：本文的方法是设计对氟原子的新的修饰，其可以大幅度增加分子的三线态寿命并从而产生一种ROS可激活的光敏剂。在一个实施例中，将甲基锍、双[4-(二甲基氨基)苯基](4-(3-甲氧基丙基)-3,5-二碘-苯基)-氯化物(MG2I，图4)、一种MG酯的衍生物，以方案1(附图5)中所示路线进行合成。
(1)方案1：将10mmol 3,5-二碘-4-羟基苯甲醛溶解在干燥的5ml DMF中，加入1.1eq(当量)的细粉状K2CO3，并加热至80℃，加热3个小时，将反应混合物冷却至室温并过滤沉淀物。然后在减压条件下除去溶剂，从而得到粗产物，其通过硅胶柱色谱进行纯化，使用己烷/乙酸乙酯(4/1)，产率：94％。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.82(s,1H),8.38(s,2H),4.17(q,2H),4.11(t,2H),2.72(t,2H),2.58(m,2H),1.29(t,3H),13C NMR(100MHz,CDCl3):δ188.1,173.3,162.7,141.6,135.4,91.7,72.4,60.4,80.6,25.3,14.4,MS(EI):m/z(％):488.2。
将5mmol的4-(2,6-二碘-4-甲酰基苯氧基)丁酸乙酯和10mmol的N，N-二甲基苯胺溶解在干燥的50ml的EtOH中，将5mmol的ZnCl2加入到所述溶液中，加热回流2天。反应完成后，将所述反应混合物在减压条件下进行干燥，用硅胶(洗脱液：乙酸乙酯/己烷:1/1)进行纯化，产率：65％。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.55(s,2H),6.96(d,4H),6.69(d,4H),5.25(s,1H),4.19(q,2H),4.03(t,2H),2.96(s,12H),2.71(t,2H),2.26(m,2H),1.3(t,2H),13C NMR(100MHz,CDCl3):δ155.6,149.4,145.7,140.7,131.5,129.8,112.8,90.7,71.9,60.5,53.7,40.9,31.2,25.5,14.4,MS(EI):m/z(％):712.3.。
将1mmol的MG[H]-2I酯溶解在MeCN中，并加热回流，将1.1mmol的对氯醌溶解在热的MeCN中并加入到所述反应中，再进一步回流2-3小时。将反应混合物在减压条件下进行干燥，用硅胶(洗脱液：CHCl 3:MeOH(4:1))进行纯化，产率：90％。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.68(s,2H),7.35(d,4H),7.02(d,4H),4.17(m,4H)3.41(s,12H),2.7(t,2H),2.26(m,2H),1.28(t,3H),13C NMR(100MHz,CDCl3):δ174.2,171.7,161.3,157.2,145,140.6,138.9,128,114.4,91.3,72.8,61.6,41.5,30.9,25.5,14.6,MS(EI):m/z(％):710.3。
值得注意的是，重原子取代，其被认为能够增加自旋轨道耦合以实现有效的系间交叉的重原子取代，不能消除FAP-氟原子相互作用并且不能够显着增加单线态氧代的速率。碘化效应可以在保持FAP-氟原子相互作用的同时产生游离MG的x带的22nm红移。碘化也使MG2I-dL5的激发最大值达到666nm(与在633nm下的MG-dL5相比)达到近红外范围(表1)。MG2I-FAP复合物的归一化荧光光谱在附图6中给出。附图7A-7C描绘了(附图7A)MG-dL5和MG2I-dL5的KD测量，(附图7B)1μMMG2I和MG2I的吸收光谱和(附图7C)使用Cy5作为标准(圆圈)的MG2I-dL5(正方形)的荧光量子产率测定值。
利用这一概念，可以制备一系列卤代孔雀绿衍生物(所述实施例包括Br和I的定向FAP选择。可以发现潜在FAP，其与这些衍生物结合以形成具有相当或更好光敏性的相似图案。
表3-FAP-氟的性质
Figure GDA0001393278760000451
为了测试双组份FAP光敏剂产生单线态氧的能力，使用蒽-9,10-二丙酸(ADPA)，一种常用的单线态氧清除剂。这是通过监测ADPA在374/402nm处的荧光消失来完成的。铝酞菁四磺酸盐(AlPcS4)是用于测定1O2代(ΦΔ＝0.34)的标准。对在660nm处的MG2I-dL5和AlPcS4的光学匹配溶液进行比较，同时将双组份FAP光敏剂的单线态氧量子产率预估为0.13(附图8)。为了进一步证明单线态氧的产生，使用D2O来代替H2O；已知D2O会大大增加了1O2(从4μs至52μs)的寿命，并且对其他活性氧物质的影响很小。在氘代PBS缓冲液中，双组份FAP光敏剂的ADPA漂白率显著提高。这证实了在复合物中单线态氧的特异性生成。重要的是，由于非常短的激发态寿命(<1光敏剂)，游离染料的荧光量子产率和单重态氧量子产率在正常激发条件下都不可检测。这确保游离染料是费荧光的和非光敏的，并且与其他染料定位方法相比，这是一个非常显着的差异(附图4)。此外，通过近红外激发，这种遗传编码的复合物可用于一定范围的肿瘤，并且还可以用作具有公平荧光的肿瘤可视化的工具。
为了评估用于靶向蛋白质失活的FAP-TAPs的效用，我们对在HEK 293细胞中适当照射下的EGFP-PH-KillerRed和EGFP-PH-dL5融合蛋白的膜的释放进行比较。当获自PLCδ1的pleckstrin同源性(PH)结构域被CALI灭活时，其从膜转移到细胞质，增加细胞质/膜EGFP信号(附图9A)。如附图9B所示，用560nm(60x物镜，2.03W/cm2)照射5min后，在KillerRed介导的CALI下的细胞质与膜信号比率变化了37％，与之前的报道相似。在1分钟照射后，KillerRed的荧光显著被漂白(>75％)。与此相反的，在640nm及激光咋舌10秒之后，MG2I-FAP照射导致335％的比率的变化(60x物镜，2.03W/cm2)。MG2I-FAP的进一步照明没有诱导EGFP比例变化，但明显的形态变化和轻微的漂白。通过用PH-KillerRed/PH-FAP共表达EGFP-PH也测定了潜在的附带损伤。虽然照射的时间尺度为～30倍区别时，KillerRed和MG2I-FAP都与目标灭活量成比例地诱导了EGFP-PH的类似灭活，表明MG2I-FAP在CALI条件下类似于KillerRed在空间上受到限制。
对所述光诱导的在HEK细胞上的双组份FAP光敏剂对转染细胞表面FAP细胞毒性进行检测。在照射30分钟之前，向细胞培养基中加入400nM MG2I/MG；将共聚焦显微镜的1分钟连续红光照射施加到细胞(40×物镜，640nm激发，0.76W/cm2)。仅使用MG2I处理并暴露于照明的标记细胞在30分钟内使用LIVE/DEAD细胞活力试剂盒染色死亡，而未标记的细胞则保持健康(附图10)。标记的细胞在非常短的时间内开始失去肿胀和起泡的细胞形态。这证明了来自双组份FAP光敏剂的选择性杀伤作用。MG-dL5和MG2I与野生型HEK细胞单独产生没有观察到光诱导的细胞毒性。此外，非靶向FAP光敏剂对于以相同的光剂量施用的细胞破坏细胞也几乎没有影响。在线粒体和核靶向FAP转染的HEK细胞上观察到了类似的选择性杀伤结果(附图11)。
MG2I-dL5复合物的光敏化不会导致显著的自我漂白，允许高剂量的递送以及对药物摄取和疗效的实时评估。一个灯箱内置发光二极管阵列(LED)，发射660nm(0.089W/cm2)的光；从96孔的cy5漂白实验中，检查到的光分布几乎是均匀的，并且在灯箱中的温度保持在35℃，超过1小时的光照。使用显微镜或灯箱来杀死一半细胞所需要的光剂量大约是相同的值，即50J/cm2。仅在暴露到灯箱中的MG2I处理表达FAP的细胞中也观察到光剂量依赖性杀伤作用(时间或光强度的变化)(附图12)。虽然时间的变化也得出了类似的线性的剂量依赖性的响应，但是光强度的变化意味着一种更复杂的过程。我们的理解是细胞具有单峰氧缓冲的阈值浓度，因此，当单线态氧产生的量超过阈值时，具有低强度照射在延长时间条件下也将对细胞进行破坏。
通过向溶液中加入不同的ROS猝灭剂，进一步描述了MG2I-dL5诱导的细胞毒性的原因。当观察显微镜尺度的影响时，叠氮化钠(NaN3)显示出一种剂量依赖性的抑制细胞死亡；在其高于10mM的浓度下，同时期的细胞毒性作用被完全抑制。同时，高达1000U/mL的过氧化氢酶对拯救细胞死亡几乎没有影响(附图13)。由于已知叠氮化钠将强烈地淬灭单线态氧，过氧化氢酶和SOD更多是超氧化物特异性猝灭剂，结果表明单线态氧是导致细胞毒性对细胞死亡的主要ROS。首先，据信单线态氧与附近的有机分子发生反应，并产生许多过氧化物作为初始产物；这些产生的前体ROS将被传播用来产生其他的反应性产物，进而导致在广泛生理范围内的级联细胞毒性。因此，可以使用不同的ROS传感器来鉴定双组份FAP光敏剂的光敏化后的ROS的后续生成。本文使用在细胞核中用dL5转染的HEK细胞选择作为ROS传感器的二氢乙啶酮(DHE)。DHE是细胞可渗透的并且可以与O2 -反应形成2-羟乙基卟吩，其可插入DNA以在520/610nm处提供荧光。仅在MG2I-dL5标记的细胞中看到非常特异和清楚的DHE信号增加(附图14)。
双组份FAP光敏剂(AffiFAP)构建体及表达
所述双组份FAP光敏剂通过FAP结合的亲核抗体来靶向癌细胞，用以研究其对癌细胞的光毒性(附图15)
DNA构建体.使用大肠杆菌(E.coli)菌株MACH1-T1(Invitrogen)作为用于克隆的宿主。将pET21a载体修饰为包括N-末端的10XHis和GST，随后是HRV3C蛋白酶切割位点。在HRV3C蛋白酶位点之后以5'至3'的顺序引入多个克隆位点，其顺序为HindIII、NheI、BamHI、SpeI、KpnI以及XhoI。分别从pPNL6和pJET1.2扩增FAPdL5:**和亲和体ZEGFR:1907的片段。在构建ZEGFR:19077中，使用HindIII和XhoI位点将亲和力插入修饰的pET21a载体中。在NheI和BamHI位点之间插入FAP以构建FAPdL5:**。在构建FAPdL5**-ZEGFR:1907中，将FAP引入到HindIII和NheI位点之间的载体中；KpnI和XhoI网站之间插入了亲和力。在构建体ZEGFR:1907-FAPdL5**中，使用KpnI、XhoI、HindIII和NheI位点上引入FAP和亲和体。对于构建体ZEGFR:1907-FAPdL5**-ZEGFR:1907，通过HindIII和BamHI位点将亲和体引入ZEGFR:1907-FAPdL5**构建体。ZHER2:342的Affibody构建体通过置换亲和片段建立在ZEGFR:1907构建体上。各种“AffiFAP”多肽的完整序列在图16A和16B(SEQ ID NO：10-15)中提供。
蛋白质表达和纯化.重组蛋白的表达在大肠杆菌菌株Rosetta-gami 2(DE3)(Novagen)中进行。将质粒转化成感受态细胞，用12.5μg/mL四环素，34μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄青霉素在5mL过夜中培养新鲜菌落。然后将5mL培养物加入到500mL LB+GB(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，4g/L NaCl，100mM磷酸盐pH7.2，补充有20mM琥珀酸，0.4％甘油)在37℃下OD为0.8，将温度降至22℃1小时，然后用500μMIPTG诱导培养物，并在22℃下补充0.4％葡萄糖18小时。将细胞沉淀并用冷PBS洗涤一次，然后在-20℃冷冻。将沉淀重悬于3mL洗涤缓冲液A(50mM Tris-Cl pH 7.5，7 750mM NaCl，0.1％Triton X-100,0.02％Tween-20,50mM咪唑)中，并以10,15s脉冲超声处理用15mL洗涤缓冲液A稀释。将该裂解物在20,000g下离心30分钟，并将上清液与Ni-NTA琼脂糖珠(Thermo Fisher)在4℃下摇摆孵育2小时。结合后，珠子用10mL洗涤缓冲液A洗涤，然后放在柱上，用洗涤缓冲液150(与洗涤缓冲液A相同，但含有150mM NaCl)洗涤。使用标记的HRV 3C蛋白酶在4℃下离开His-GST切割FAP亲和力过夜，然后通过与另外的Ni-NTA珠在4℃下孵育2小时除去蛋白酶。通过蛋白水解消化释放的蛋白质作为流过被收集，然后通过快速蛋白质液相色谱(BioLogic DuoFlow，Biorad)在Superdex 75凝胶过滤体系(GE Healthcare)上纯化。通过内毒素去除树脂(Thermo Fisher)从纯化的蛋白质中除去内毒素。使用SDS-PAGE评价纯度，使用DU730UV/vis分光光度计基于280nm处的吸光度(Beckman Coulter Inc.)定量蛋白质。
体外研究(A431细胞)
FAP结合的HER1亲和力用于靶向与野生型HEK细胞混合的细胞培养物中EGFR过表达肿瘤细胞A431。首先将250nM affiFAP加入标记A431细胞，然后加入250nM MG2I/MG。如图17所示，染料与FAP(无EFGR结合)和affiFAP与MG均无明显照射；然而，当加入affiFAP和MG2I时，混合细胞被照射，只有EGFR1表达的肿瘤细胞被杀死；相邻的正常HEK细胞未受伤害。非结合FAP光敏剂在细胞中无明显毒性的结果表明，与临界靶位点的紧密接触对于有效杀灭是必需的；这是因为单线态氧具有非常短的作用半径(<0.02μm)。显示肿瘤细胞需要首先被HER1-dL5亲和力靶向，并且仅在添加MG2I并与affiFAP结合后才能进行光敏化。在FAP缀合的HER2亲和体标记的SKBR3癌细胞中观察到相似的结果(图18)。因此，通过控制肿瘤部位的单线态氧的特异性产生，可以消除对正常细胞的非特异性损伤。此外，整个过程不需要洗涤并具有快速的结合时间，而亲和力据报道具有较短的清除时间(例如：Affibody-DyLight750的半衰期为37.5±2.8分钟)。对目前最先进的光动力治疗的这种改进将具有很大的实用性，例如本文所述的方法和模块化。
亲和体和FAP排序
评估N和C末端融合物，以及两个亲和体的单个FAP，其结合和活化MG-氟原体的性质以及它们与培养细胞上的靶受体的结合。在MG的存在下，所有三种ZEGFR：1907融合探针AF，FA和AFA的荧光扫描在636nm和480nm处具有主要和次要的激发峰，并且在664nm具有单个发射峰，其与荧光光谱一致与F和AF相比，FA和AFA探针显示出增强的荧光强度。基于平衡结合条件下的荧光测量，这三种探针具有亚纳摩尔解离常数，与单独的F相当。与F仅相比，在所有FAP亲和融合蛋白中观察到相关性降低很小但显着降低。没有观察到可检测到的荧光激活或通过亲和力结合荧光单独。因此，所有融合蛋白保留未修饰的FAP的荧光激活特性，并且单独的亲和力不影响荧光素活化。
表4
Figure GDA0001393278760000511
结合到孔雀绿的重组探针亲和力ZEGFR:1907(A)和FAPdL5**(F)的表征。
对于FAP/ZHER2:342探针，所述荧光激发和发射扫描是相对于F。仅有染料的对照显示出无可检测的荧光。所述构建体A和AA也没有显示出MG的显着的荧光激活。亲和力与dL5**的融合将荧光激活降低大约25％。在亲和体-FAP融合构建体上观察到红移。为了测试染料与融合蛋白的结合，对与MG-Btau结合的探针的解离常数进行检测。构建体A和AA在滴定时没有显示出对MG的显着结合。亲和体与dL5**的融合稍微降低了FAP与MG结合的亲和力，但所有构建体的解离常数仍处于纳摩尔范围。
对通过ZEGFR:1907融合探针标记的细胞表面EGFR进行检测，用A431细胞，一种细胞系以高水平表达EGFR，～2000000/细胞。基于活细胞成像，所述三个融合探针AF、FA和AFA都显示出清晰的细胞表面标记，对照蛋白F未能靶向细胞表面。通过平衡结合的荧光，针对AF的细胞表面解离常数估计为122±16nM，FA为101±17nM，并且AFA为37±6nM。
为了验证融合探针中的ZHER2:342亲和力，对细胞表面Kd进行检测，其值对于AF是8.4±1.6nM，针对FA为25.3±4.7nM，并且针对AFA为6.1±1.8nM。通过竞争测定证实FAP/亲和体融合物的结合特异性，其中将未标记的A滴定入恒定浓度的AFA。
动物实验
我们进行了两项动物研究，以验证该方法在体内的有效性。
首先，制备转基因斑马鱼戏，其在心脏特异性肌球蛋白轻链7(myl7，也称为cmlc2)启动子，Tg(myl7：FAP-mCer3)的控制下表达细胞质FAP-mCerulean3(FAP-mCer3)串联蛋白。将受精后48小时的斑马鱼胚胎(hpf)用500nM荧光素(MG2I或MG-酯)处理3小时，然后通过激光照射12分钟(659nm，242mW/cm 2)。在照射后，紧接着用MG2I处理的转基因斑马鱼显示出没有心跳或血液循环的迹象，但是用MG2I处理的MG-酯处理的转基因幼虫和野生型斑马鱼是正常的(附图19)。这表明细胞毒性作用是在表达细胞中MG2I-FAP的光刺激的结果。附图19是如上所述的斑马鱼幼虫的显微照片。其中，白色表示活细胞中细胞质FAP-mCerulean3的存在。
其次，通过携带A431肿瘤的裸小鼠来对MG2I-AffiFAP的有效性进行评估。与EGFRAffiFAP预复合的MG2I进行尾注射以给定一种500nM的最终浓度。注射三(3)小时后，在小鼠的肿瘤部位进行照射(242mW/cm 2)1小时的659nm激光。然后，使肿瘤生长12天(附图20)。所述实验结果表明，MG2I-AffiFAP可有效降低肿瘤生长。
本发明在这里描述了当暴露于近红外光激发时，一种双组份光敏剂，其证明了在体外和体内转染的HEK细胞和亲和体靶向的A431癌症细胞具有的强大且选择性的杀伤作用。游离的MG2I是一种纯粹且稳定的荧光，其能够容易合成和修饰，并且对于细胞无毒性。与传统的光敏剂不同，染料和FAP本身在结合之前就没有光敏作用。与其他活化方法不同，通过添加荧光素而不是靶向分子的存在来实现活化步骤，从而可以发生淬灭基团的离开；一种“主动”激活而不是“被动”激活。该方法提供了在目标位置局部“开启”并选择性地产生单线态氧的能力。重要的是，这种光敏剂系统可用于各种分子靶体。
本发明与广泛已知的光动力疗法和一般光敏剂化合物的方法不同，并且已经根据几个实施例进行了说明和描述，这些实施例旨在在所有方面进行说明而不是对其进行限制。因此，本发明能够在详细实现方面进行许多变化，这可以从本领域普通技术人员所包含的描述中得出。
该发明将在下述所列条款中进一步描述：
条款1.一种靶向并且杀死细胞的方法，包括：
a.将细胞与一种靶向活化剂组合物进行接触，其中所述靶向活化剂组合物包含靶向基团和活化剂基团，其中所述靶向基团有选择地与细胞的目标化合物进行结合，所述活化剂基团有选择地与重原子改性孔雀石绿衍生物进行结合，其具有一种激发波长因而当与靶向活化剂结合且暴露在激发波长的光下时，所述重原子改性孔雀石绿衍生物产生单线态氧；
b.将细胞与所述所述重原子改性孔雀石绿衍生物进行接触；并且
c.将所述细胞暴露于所述靶向活化剂-连接的重原子改性孔雀石绿衍生物的激发波长的光下。
其中，所述重原子改性孔雀石绿衍生物具有如下结构:
Figure GDA0001393278760000541
其中，X和X’各自独立地是重原子，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自独立地是H或者F，R11、R12、R13和R14各自独立地是甲基、H、氮杂环丙烷或氮杂环丁烷，其中当R11、R12、R13、和/或R14是氮杂环丙烷或氮杂环丁烷时，R11和R12形成一个单环和/或R13和R14形成一个单环，并且当R选自-H、-OH、-COO-、-SO3-、-PO4-、-NO2、-NH2、-N(CH3)(R15)、-OR16、烷基、乙醚、聚醚、PEG1-30、-(C1-C4 alkyl)-R17时，含有N、S或O原子的杂环，被炔基、氰基、和碳水化合物基团取代，其中R15和R16是直链或支链烷基；直链或支链C1-6烷基；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)；具有2至6个酰胺基团的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)；聚(C1-C4亚烷基二醇)；具有2至30个或者2-10个C1-C4亚烷基二醇基团的聚(C1-C4亚烷基二醇)；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)：聚(C1-C4亚烷基二醇)二嵌段共聚物；具有2至6个酰胺基团以及2至10个C1-C4亚烷基二醇基团的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)：聚(C1-C4亚烷基二醇)二嵌段共聚物；磺酰基或者双-磺酰基-封端的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)，可选地具有2至6个酰胺基团；二牛磺酸支链的聚(C1-C4烷基酰胺),可选地具有2至6酰胺基团；丁酸乙酯；C1-6烷基C1-6链烷酸酯；-(CH2)n-C(O)-O-(CH2)m-CH3，其中n＝1-4且m＝0-3，并且其中R17选自H,-OH、-COO-、-SO3-、-PO4-、-NO2或者-NH2。
条款2.根据条款1所述的方法，R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R9和R10都是H。
条款3.根据条款1或2所述的方法，X和X’各自独立地是Br,I,As,Se,Ga,Ge或Sb。
条款4.根据条款1或2所述的方法，X和X’各自独立地是Br or I。
条款5.根据条款3所述的方法，X和X’是I。
条款6.根据条款1或2所述的方法，R11、R12、R13和R14各自独立地是甲基或H,或R11、R12、R13和R14均是甲基。
条款7.根据条款1到5中的任一项所述的方法，R是-OR16，且R16是丁酸乙酯。
条款8.根据条款1所述的方法，其中所述重原子改性孔雀石绿衍生物为：
Figure GDA0001393278760000551
Figure GDA0001393278760000561
条款9.根据条款1到8任意一项所述的方法，其中所述活化剂基团是scFv活化剂基团和一种靶向基团的融合蛋白。
条款10.根据条款9所述的方法，其中所述scFv是一种L5-MG scFv肽，可选择地为SEQ ID NOS:1-4。
条款11.根据条款1到10任意一项所述的方法，其中所述靶向基团具有针对表皮生长因子受体的选择性。
条款12.根据条款10所述的方法，其中所述表皮生长因子受体是HER1(人类表皮生长因子受体1)或HER2(人类表皮生长因子受体2)。
条款13.根据条款1到12任意一项所述的方法，其中所述靶向基团包含选自SEQ IDNOS:1-4,10-15,17和18的序列。
条款14.一种重原子改性孔雀石绿衍生物，其具有如下结构：
Figure GDA0001393278760000562
其中，X和X’各自独立地是重原子，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自独立地是H或者F，R11、R12、R13和R14各自独立地是甲基、H、氮杂环丙烷或氮杂环丁烷，其中当R11、R12、R13、和/或R14是氮杂环丙烷或氮杂环丁烷时，R11和R12形成一个单环和/或R13和R14形成一个单环，并且当R选自-H、-OH、-COO-、-SO3-、-PO4-、-NO2、-NH2、-N(CH3)(R15)、-OR16、烷基、乙醚、聚醚、PEG1-30、-(C1-C4 alkyl)-R17时，含有N、S或O原子的杂环，被炔基、氰基、和碳水化合物基团取代，其中R15和R16是直链或支链烷基；直链或支链C1-6烷基；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)；具有2至6个酰胺基团的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)；聚(C1-C4亚烷基二醇)；具有2至30个或者2-10个C1-C4亚烷基二醇基团的聚(C1-C4亚烷基二醇)；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)：聚(C1-C4亚烷基二醇)二嵌段共聚物；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺):具有2至6个酰胺基团以及2至10个C1-C4亚烷基二醇基团的聚(C1-C4亚烷基二醇)；磺酰基或者双-磺酰基-封端的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)，可选地具有2至6个酰胺基团；二牛磺酸支链的聚(C1-C4烷基酰胺),可选地具有2至6酰胺基团；丁酸乙酯；C1-6烷基C1-6链烷酸酯；-(CH2)n-C(O)-O-(CH2)m-CH3，其中n＝1-4且m＝0-3，并且其中R17选自H,-OH、-COO-、-SO3-、-PO4-、-NO2或者-NH2。
条款15.根据条款14所述的重原子改性孔雀石绿衍生物，其中R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R9和R10均是H。
条款16.根据条款14或15所述的重原子改性孔雀石绿衍生物，其中X和X’各自独立地是Br,I,As,Se,Ga,Ge或Sb。
条款17.根据条款14或15所述的重原子改性孔雀石绿衍生物，其中X和X’各自独立地是Br或I。
条款18.根据条款17所述的重原子改性孔雀石绿衍生物，其中X和X’是I。
条款19.根据条款14或15所述的重原子改性孔雀石绿衍生物，其中R11、R12、R13和R14各自独立地市甲基或H,或R11、R12、R13和R14均是甲基。
条款20.根据条款14到19任意其中一项所述的重原子改性孔雀石绿衍生物，其中R是-OR16,且R16是丁酸乙酯。
条款21.根据条款14所述的重原子改性孔雀石绿衍生物，其中所述重原子改性孔雀石绿衍生物为：
Figure GDA0001393278760000581
条款22.一种试剂盒，包括：
a.一种第一容器，所述第一容器含有具有下述结构的重原子改性孔雀石绿衍生物：
Figure GDA0001393278760000591
其中，X和X’各自独立地是重原子，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自独立地是H或者F，R11、R12、R13和R14各自独立地是甲基、H、氮杂环丙烷或氮杂环丁烷，其中当R11、R12、R13、和/或R14是氮杂环丙烷或氮杂环丁烷时，R11和R12形成一个单环和/或R13和R14形成一个单环，并且当R选自-H、-OH、-COO-、-SO3-、-PO4-、-NO2、-NH2、-N(CH3)(R15)、-OR16、烷基、乙醚、聚醚、PEG1-30、-(C1-C4 alkyl)-R17时，含有N、S或O原子的杂环，被炔基、氰基、和碳水化合物基团取代，其中R15和R16是直链或支链烷基；直链或支链C1-6烷基；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)；具有2至6个酰胺基团的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)；聚(C1-C4亚烷基二醇)；具有2至30个或者2-10个C1-C4亚烷基二醇基团的聚(C1-C4亚烷基二醇)；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)：聚(C1-C4亚烷基二醇)二嵌段共聚物；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)；具有2至6个酰胺基团以及2至10个C1-C4亚烷基二醇基团的聚(C1-C4烷基酰胺)；磺酰基或者双-磺酰基-封端的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)，可选地具有2至6个酰胺基团；二牛磺酸支链的聚(C1-C4烷基酰胺),可选地具有2至6酰胺基团；丁酸乙酯；C1-6烷基C1-6链烷酸酯；-(CH2)n-C(O)-O-(CH2)m-CH3，其中n＝1-4且m＝0-3，并且其中R17选自H,-OH、-COO-、-SO3-、-PO4-、-NO2或者-NH2,且在一种药物学上可接受的赋形剂中；以及
b.在第一容器或第二容器中的一种靶向活化剂组合物，其中第二容器包含一种组合物，在一种药物学上可接受的赋形剂中，该组合物一部分是用来有选择性地结合细胞中靶化合物的目标选择部分，另一部分是有选择性地结合了具有一种激发波长的重原子改性孔雀石绿衍生物的目标激活部分，该部分在靶向活化剂结合且暴露于在激发波长下的光中时，所述重原子改性孔雀石绿衍生物将生成单线态氧。
条款23.根据条款22所述的试剂盒，其中R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R9和R10均是H。
条款24.根据条款22或23所述的试剂盒，其中X和X’各自独立地是Br、I、As、Se、Ga、Ge、或Sb。
条款25.根据条款22或23所述的试剂盒，其中X和X’各自独立地是Br或I。
条款26.根据条款25所述的试剂盒，其中X和X’是I。
条款27.根据条款22或23所述的试剂盒，其中R11、R12、R13和R14各自独立地是甲基或H，或R11、R12、R13和R14均是甲基。
条款28.根据条款22到27任意其中一项所述的试剂盒，其中R是-OR16,且R16是丁酸乙酯。
条款29.根据条款22所述的试剂盒，其中所述重原子改性孔雀石绿衍生物为：
Figure GDA0001393278760000611
条款30.根据条款22到29任意其中一项所述的试剂盒，其中所述活化剂基团是一种scFv活化剂基团和一种靶向基团的融合蛋白。
条款31.根据条款30所述的试剂盒，其中所述scFv是一种L5-MG scFv肽，可选择地为SEQ ID NOS:1-4。
条款32.根据条款22到31任意其中一项所述的试剂盒，其中所述靶向基团具有对表皮生长因子受体的选择性。
条款33.根据条款32所述的试剂盒，其中所述表皮生长因子受体是HER1(人类表皮生长因子受体1)或HER2(人类表皮生长因子受体2)。
条款34.根据权利要求22到33任一项所述的试剂盒，其中所述靶向活化剂包括选自SEQ ID NOS:1-4、10-15、17和18的序列。
条款35.一种靶向并杀死患者体内细胞的方法，包括：
a.为所述患者给药有效剂量的活化剂组合物，所述活化剂组合物包含一种选择性结合细胞目标化合物的靶向基团，以及一种选择性结合一种重原子改性孔雀石绿衍生物的活化剂基团，其具有激发波长从而当通过结合靶向活化剂且暴露于在激发波长下的光中时所述重原子改性孔雀石绿衍生物生成单线态氧；
b.为所述患者给药有效剂量的所述重原子改性孔雀石绿衍生物；以及
c.将所述细胞暴露于靶向活化剂-连接的重原子改性孔雀石绿衍生物的激活波长中，从而杀死所述细胞，
其中所述重原子改性孔雀石绿衍生物具有如下结构：
Figure GDA0001393278760000621
其中，X和X’各自独立地是重原子，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自独立地是H或者F，R11、R12、R13和R14各自独立地是甲基、H、氮杂环丙烷或氮杂环丁烷，其中当R11、R12、R13、和/或R14是氮杂环丙烷或氮杂环丁烷时，R11和R12形成一个单环和/或R13和R14形成一个单环，并且当R选自-H、-OH、-COO-、-SO3-、-PO4-、-NO2、-NH2、-N(CH3)(R15)、-OR16、烷基、乙醚、聚醚、PEG1-30、-(C1-C4 alkyl)-R17时，含有N、S或O原子的杂环，被炔基、氰基、和碳水化合物基团取代，其中R15和R16是直链或支链烷基；直链或支链C1-6烷基；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)；具有2至6个酰胺基团的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)；聚(C1-C4亚烷基二醇)；具有2至30个或者2-10个C1-C4亚烷基二醇基团的聚(C1-C4亚烷基二醇)；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)：聚(C1-C4亚烷基二醇)二嵌段共聚物；具有2至6个酰胺基团以及2至10个C1-C4亚烷基二醇基团的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)：聚(C1-C4亚烷基二醇)二嵌段共聚物；磺酰基或者双-磺酰基-封端的直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)，可选地具有2至6个酰胺基团；二牛磺酸支链的聚(C1-C4烷基酰胺),可选地具有2至6酰胺基团；丁酸乙酯；C1-6烷基C1-6链烷酸酯；-(CH2)n-C(O)-O-(CH2)m-CH3，其中n＝1-4且m＝0-3，并且其中R17选自H,-OH、-COO-、-SO3-、-PO4-、-NO2或者-NH2。
条款36.根据条款35所述的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、和R1是H。
条款37.根据条款35或36所述的方法，其中X和X’独立地是Br、I、As、Se、Ga、Ge、或Sb。
条款38.根据条款35或36所述的方法，其中X和X’独立地是Br或I。
条款39.根据条款38所述的方法，其中X和X’是I。
条款40.根据条款35或36所述的方法，其中R11、R12、R13和R14独立地是甲基或H，或者R11、R12、R13和R14是甲基。
条款41.根据条款35到40任意其中一项所述的方法，其中R是-OR16，并且R16是丁酸乙酯。
条款42.根据条款35所述的方法，其中所述重原子改性孔雀石绿衍生物为：
Figure GDA0001393278760000641
条款43.根据条款35到42任意其中一项所述的方法，其中所述活化剂基团是scFv和affibody的融合蛋白。
条款44.根据条款43所述的方法，其中所述scFv是一种L5-MG scFv肽，可选择地为SEQ ID NOS:1-4。
条款45.根据条款35到44任意其中一项所述的方法，其中所述靶向基团是对表皮生长因子受体具有选择性。
条款46.根据条款45所述的方法，其中所述表皮生长因子受体是HER1(人表皮生长因子受体1)或者HER2(人表皮生长因子受体2)。
条款47.根据条款35到46任意一项所述的方法，其中所述靶向活化剂包括一种选自SEQ ID NOS:1-4,10-15、17和18的序列。
序列表
<110>卡内基梅隆大学
贺建军
王弈
M·布吕什
<120>可激活的双组份光敏剂
<130> 65261510165
<150> US 62/123,489
<151> 2014-11-17
<160> 18
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 110
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>荧光团活化肽
<400> 1
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala
35 40 45
Leu Ile Phe Glu Thr Asp Lys Lys Tyr Pro Trp Thr Pro Gly Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Val Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Asp Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu Leu Ser Asp Val Asp
85 90 95
Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser
100 105 110
<210> 2
<211> 110
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>荧光团活化肽
<400> 2
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala
35 40 45
Leu Ile Phe Asp Thr Asp Lys Lys Tyr Pro Trp Thr Pro Gly Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Val Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Asp Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu Leu Ser Asp Val Asp
85 90 95
Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser
100 105 110
<210> 3
<211> 110
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>荧光团活化肽
<400> 3
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala
35 40 45
Leu Ile Phe Glu Thr Asp Lys Lys Tyr Pro Trp Thr Pro Gly Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Val Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Asp Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Val Asp
85 90 95
Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser
100 105 110
<210> 4
<211> 110
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>荧光团活化肽
<400> 4
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Gly Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly
20 25 30
His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala
35 40 45
Leu Ile Phe Asp Thr Asp Lys Lys Tyr Pro Trp Thr Pro Gly Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Val Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Asp Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Val Asp
85 90 95
Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser
100 105 110
<210> 5
<211> 251
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>荧光团活化肽
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asp Gly Asp Gly Ser Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ala Arg Tyr Phe Gly Ser Val Ser Pro Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ile Leu Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
130 135 140
Ile Arg Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ala Thr Trp Leu
165 170 175
Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Ser Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
210 215 220
Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Gly Ser Thr Phe Pro Leu Thr
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Ser
245 250
<210> 6
<211> 130
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>荧光团活化肽
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
His Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Met Tyr Tyr Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Pro Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Phe Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Pro Thr His Tyr Tyr Asp Asn Ser Gly Pro Ile
100 105 110
Pro Ser Asp Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125
Val Ser
130
<210> 7
<211> 109
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>荧光团活化肽
<400> 7
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Thr
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Thr
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Gly Ser Tyr
85 90 95
Val Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Ser
100 105
<210> 8
<211> 250
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>荧光团活化肽 - 融合蛋白
<400> 8
Met Gln Leu Leu Arg Cys Phe Ser Ile Phe Ser Val Ile Ala Ser Val
1 5 10 15
Leu Ala Gln Glu Leu Thr Thr Ile Cys Glu Gln Ile Pro Ser Pro Thr
20 25 30
Leu Glu Ser Thr Pro Tyr Ser Leu Ser Thr Thr Thr Ile Leu Ala Asn
35 40 45
Gly Lys Ala Met Gln Gly Val Phe Glu Tyr Tyr Lys Ser Val Thr Phe
50 55 60
Val Ser Asn Cys Gly Ser His Pro Ser Thr Thr Ser Lys Gly Ser Pro
65 70 75 80
Ile Asn Thr Gln Tyr Val Phe Lys Asp Asn Ser Ser Thr Ile Glu Gly
85 90 95
Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Leu Gln Ala Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Gln
115 120 125
Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr
130 135 140
Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly His
145 150 155 160
Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu
165 170 175
Ile Phe Asp Thr Asp Lys Lys Tyr Pro Trp Thr Pro Gly Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Leu Leu Gly Val Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Asp Ala Gln
195 200 205
Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu Leu Ser Asp Val Asp Gly
210 215 220
Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Gly Ile Leu
225 230 235 240
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
245 250
<210> 9
<211> 813
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>荧光团活化肽-融合蛋白核苷酸序列
<400> 9
aaaaaacccc ggatcgaatt ctacttcata cattttcaat taagatgcag ttacttcgct 60
gtttttcaat attttctgtt attgcttcag ttttagcaca ggaactgaca actatatgcg 120
agcaaatccc ctcaccaact ttagaatcga cgccgtactc tttgtcaacg actactattt 180
tggccaacgg gaaggcaatg caaggagttt ttgaatatta caaatcagta acgtttgtca 240
gtaattgcgg ttctcacccc tcaacaacta gcaaaggcag ccccataaac acacagtatg 300
tttttaagga caatagctcg acgattgaag gtagataccc atacgacgtt ccagactacg 360
ctctgcaggc tagtggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttctg 420
ctagccaggc tgtggtgact caggagccgt cagtgactgt gtccccagga gggacagtca 480
ttctcacttg tggctccagc actggagctg tcaccagtgg tcattatgcc aactggttcc 540
agcagaaacc tggccaagcc cccagggcac ttatatttga caccgacaag aaatatccct 600
ggacccctgg ccgattctca ggctccctcc ttggggtcaa ggctgccctg accatctcgg 660
atgcgcagcc tgaagatgag gctgagtatt actgtttgct ctccgacgtt gacggttatc 720
tgttcggagg aggcacccag ctgaccgtcc tctccggaat tctagaacaa aagcttattt 780
ctgaagaaga cttgtaatag ctcggcggcc gca 813
<210> 10
<211> 313
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>亲和体-荧光团活化肽融合蛋白
<400> 10
Gly Pro Ser Lys Leu Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Met Trp Ala
1 5 10 15
Ala Trp Glu Glu Ile Arg Asn Leu Pro Asn Leu Thr Gly Trp Gln Met
20 25 30
Thr Ala Phe Ile Ala Lys Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu
35 40 45
Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Thr Ser Gly Thr Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser
65 70 75 80
Val Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys
100 105 110
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Phe Asp Thr Asp Lys Lys Tyr
115 120 125
Ser Trp Thr Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Ala Lys Ala
130 135 140
Ala Leu Thr Ile Ser Asp Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr
145 150 155 160
Cys Ser Leu Ser Asp Val Asp Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln
165 170 175
Leu Thr Val Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu
195 200 205
Pro Ser Val Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln
225 230 235 240
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Phe Asp Thr Asp Lys
245 250 255
Lys Tyr Ser Trp Thr Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Ala
260 265 270
Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Asp Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu
275 280 285
Tyr Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Val Asp Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly
290 295 300
Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Leu Glu
305 310
<210> 11
<211> 304
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>亲和体-荧光团活化肽融合蛋白
<400> 11
Gly Pro Ser Lys Leu Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
1 5 10 15
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Gly Thr Gly
20 25 30
Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
35 40 45
Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Phe Asp Thr Asp Lys Lys Tyr Ser Trp
50 55 60
Thr Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Ala Lys Ala Ala Leu
65 70 75 80
Thr Ile Ser Asp Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95
Leu Ser Asp Val Asp Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr
100 105 110
Val Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser
130 135 140
Val Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Gly
145 150 155 160
Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Phe Asp Thr Asp Lys Lys Tyr
180 185 190
Ser Trp Thr Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Ala Lys Ala
195 200 205
Ala Leu Thr Ile Ser Asp Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ser Leu Ser Asp Val Asp Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln
225 230 235 240
Leu Thr Val Leu Ser Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Met Trp Ala
245 250 255
Ala Trp Glu Glu Ile Arg Asn Leu Pro Asn Leu Thr Gly Trp Gln Met
260 265 270
Thr Ala Phe Ile Ala Lys Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu
275 280 285
Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Leu
290 295 300
<210> 12
<211> 367
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>亲和体-荧光团活化肽融合蛋白
<400> 12
Gly Pro Ser Lys Leu Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Met Trp Ala
1 5 10 15
Ala Trp Glu Glu Ile Arg Asn Leu Pro Asn Leu Thr Gly Trp Gln Met
20 25 30
Thr Ala Phe Ile Ala Lys Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu
35 40 45
Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Gly
50 55 60
Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr Val Ser Pro Gly
65 70 75 80
Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Gly Thr Gly Ala Val Thr Ser
85 90 95
Gly His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
100 105 110
Ala Leu Ile Phe Asp Thr Asp Lys Lys Tyr Ser Trp Thr Pro Gly Arg
115 120 125
Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Ala Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Asp
130 135 140
Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Val
145 150 155 160
Asp Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr Val Ser
195 200 205
Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Gly Thr Gly Ala Val
210 215 220
Thr Ser Gly His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
225 230 235 240
Pro Arg Ala Leu Ile Phe Asp Thr Asp Lys Lys Tyr Ser Trp Thr Pro
245 250 255
Gly Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Ala Lys Ala Ala Leu Thr Ile
260 265 270
Ser Asp Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Leu Ser
275 280 285
Asp Val Asp Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
290 295 300
Ser Gly Thr Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Met Trp Ala Ala Trp
305 310 315 320
Glu Glu Ile Arg Asn Leu Pro Asn Leu Thr Gly Trp Gln Met Thr Ala
325 330 335
Phe Ile Ala Lys Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu
340 345 350
Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Leu Glu
355 360 365
<210> 13
<211> 312
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>亲和体-荧光团活化肽融合蛋白
<400> 13
Gly Pro Ser Lys Leu Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
1 5 10 15
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Gly Thr Gly
20 25 30
Ala Val Thr Ser His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Arg Ala Leu Ile Phe Asp Thr Asp Lys Lys Tyr Ser Trp Thr
50 55 60
Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Ala Lys Ala Ala Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Asp Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Leu
85 90 95
Ser Asp Val Asp Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val
100 105 110
Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val
130 135 140
Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Gly Thr
145 150 155 160
Gly Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Phe Asp Thr Asp Lys Lys Tyr Ser
180 185 190
Trp Thr Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Ala Lys Ala Ala
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Asp Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ser Leu Ser Asp Val Asp Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu Ser Ala Ser Gly Ser Thr Ser Gly Thr Val Glu Asn Lys
245 250 255
Phe Asn Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile Ala Leu Leu Pro
260 265 270
Asn Leu Asn Asn Gln Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg Ser Leu Tyr Asp
275 280 285
Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn
290 295 300
Asp Ala Gln Ala Pro Lys Leu Glu
305 310
<210> 14
<211> 311
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>亲和体-荧光团活化肽融合蛋白
<400> 14
Gly Pro Ser Lys Leu Val Glu Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Arg Asn
1 5 10 15
Ala Tyr Trp Glu Ile Ala Leu Leu Pro Asn Leu Asn Asn Gln Gln Lys
20 25 30
Arg Ala Phe Ile Arg Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn
35 40 45
Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Gly
50 55 60
Ser Thr Ser Gly Thr Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
65 70 75 80
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Gly Thr Gly
85 90 95
Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
100 105 110
Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Phe Asp Thr Asp Lys Lys Tyr Ser Trp
115 120 125
Thr Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Ala Lys Ala Ala Leu
130 135 140
Thr Ile Ser Asp Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser
145 150 155 160
Leu Ser Asp Val Asp Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr
165 170 175
Val Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser
195 200 205
Val Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys
225 230 235 240
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Phe Asp Thr Asp Lys Lys Tyr
245 250 255
Ser Trp Thr Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Ala Lys Ala
260 265 270
Ala Leu Thr Ile Ser Asp Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr
275 280 285
Cys Ser Leu Ser Asp Val Asp Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln
290 295 300
Leu Thr Val Leu Ser Leu Glu
305 310
<210> 15
<211> 371
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>亲和体-荧光团活化肽融合蛋白
<400> 15
Gly Pro Ser Lys Leu Val Glu Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Arg Asn
1 5 10 15
Ala Tyr Trp Glu Ile Ala Leu Leu Pro Asn Leu Asn Asn Gln Gln Lys
20 25 30
Arg Ala Phe Ile Arg Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn
35 40 45
Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Gly
50 55 60
Ser Thr Ser Gly Thr Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Val Thr
65 70 75 80
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Gly Thr Gly
85 90 95
Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
100 105 110
Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Phe Asp Thr Asp Lys Lys Tyr Ser Trp
115 120 125
Thr Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Ala Lys Ala Ala Leu
130 135 140
Thr Ile Ser Asp Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser
145 150 155 160
Leu Ser Asp Val Asp Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr
165 170 175
Val Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser
195 200 205
Val Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Ile Leu Thr Cys Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly His Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys
225 230 235 240
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Phe Asp Thr Asp Lys Lys Tyr
245 250 255
Ser Trp Thr Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Ala Lys Ala
260 265 270
Ala Leu Thr Ile Ser Asp Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr
275 280 285
Cys Ser Leu Ser Asp Val Asp Gly Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln
290 295 300
Leu Thr Val Leu Ser Gly Thr Val Glu Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met
305 310 315 320
Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile Ala Leu Leu Pro Asn Leu Asn Asn Gln
325 330 335
Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser
340 345 350
Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro
355 360 365
Lys Leu Glu
370
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>融合蛋白肽连接体
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 17
<211> 58
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>亲和体
<400> 17
Val Glu Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile
1 5 10 15
Ala Leu Leu Pro Asn Leu Asn Asn Gln Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg
20 25 30
Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 18
<211> 58
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>亲和体
<400> 18
Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Met Trp Ala Ala Trp Glu Glu Ile
1 5 10 15
Arg Asn Leu Pro Asn Leu Thr Gly Trp Gln Met Thr Ala Phe Ile Ala
20 25 30
Lys Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55

Claims (26)

1.一种复合物，其包括具有通式I结构的重原子改性孔雀石绿衍生物：
Figure FFW0000023555590000011
其中，X和X’各自独立地是Br或I，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自独立地是H或者F，R11、R12、R13和R14各自独立地是甲基、H、氮杂环丙烷基团或氮杂环丁烷基团，其中当R11、R12、R13、和/或R14是氮杂环丙烷基团或氮杂环丁烷基团时，R11和R12形成一个单环和/或R13和R14形成一个单环，并且其中R选自-OH、-COO-、-SO3 -、-PO4 -、-NO2、-NH2、-N(CH3)(R15)、-OR16、烷基、乙醚基团、聚醚基团、PEG1-30基团、-(C1-C4烷基)-R17、含有N、S或O原子的杂环基、被取代的炔基、氰基和碳水化合物基团，其中R15和R16选自以下基团：直链或支链烷基；直链或支链聚(C1-C4烷基酰胺)；聚(C1-C4亚烷基二醇)；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)：聚(C1-C4亚烷基二醇)二嵌段共聚物；C1-6烷基C1-6链烷酸酯；-(CH2)n-C(O)-O-(CH2)m-CH3，其中n＝1-4且m＝0-3，并且其中R17选自H，-OH、-COO-、-SO3 -、-PO4 -、-NO2或者-NH2；以及
活化剂基团，其选择性地与所述重原子改性孔雀石绿衍生物结合，其中，当二者结合且暴露在激发波长的光下时，所述重原子改性孔雀石绿衍生物产生单线态氧。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中R为-OR16，其中R16为：
丁酸乙酯；或
磺酰基或双-磺酰基-封端的直链或支链聚(C1-C4-烷基酰胺)基团或二牛磺酸支链的聚(C1-C4-烷基酰胺)。
3.根据权利要求1所述的复合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、和R10是H。
4.根据权利要求1所述的复合物，其中X和X’是I。
5.根据权利要求1所述的复合物，其中R11、R12、R13和R14独立地是甲基或H。
6.根据权利要求1所述的复合物，其中R11、R12、R13和R14是甲基。
7.根据权利要求1所述的复合物，其中R是-OR16，并且R16是丁酸乙酯基团。
8.根据权利要求1所述的复合物，其中所述的重原子改性孔雀石绿衍生物具有下述结构：
Figure FFW0000023555590000031
或者
Figure FFW0000023555590000032
9.根据权利要求1所述的复合物，其中R为-OR16，其中R16为：
丁酸乙酯基团；或者
磺酰基或具有2至6个酰胺基团的双-磺酰基-封端的直链或支链聚(C1-C4-烷基酰胺)基团。
10.根据权利要求1所述的复合物，其中R15和R16为直链或支链的C1-6烷基基团。
11.根据权利要求1所述的复合物，其中R15和R16为具有2至6个酰胺基团的直链或支链聚(C1-C4烷基酰胺)基团。
12.根据权利要求1所述的复合物，其中R15和R16为具有2至30个C1-C4亚烷基二醇基团的聚(C1-C4亚烷基二醇)基团。
13.根据权利要求1所述的复合物，其中R15和R16为具有2-10个C1-C4亚烷基二醇基团的聚(C1-C4亚烷基二醇)基团。
14.根据权利要求1所述的复合物，其中R15和R16为具有2至6个酰胺基团以及2至10个C1-C4亚烷基二醇基团的直链或支链聚(C1-C4烷基酰胺)：聚(C1-C4亚烷基二醇)二嵌段共聚物基团。
15.一种靶向活化剂组合物在制备用于靶向且杀死细胞的药物中的应用，其中所述靶向活化剂组合物包含靶向基团和活化剂基团，其中所述靶向基团有选择地与细胞的目标化合物进行结合，所述活化剂基团有选择地与具有通式I结构的重原子改性孔雀石绿衍生物进行结合：
Figure FFW0000023555590000041
其中，X和X’各自独立地是Br或I，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自独立地是H或者F，R11、R12、R13和R14各自独立地是甲基、H、氮杂环丙烷基团或氮杂环丁烷基团，其中当R11、R12、R13、和/或R14是氮杂环丙烷基团或氮杂环丁烷基团时，R11和R12形成一个单环和/或R13和R14形成一个单环，并且其中R选自-OH、-COO-、-SO3 -、-PO4 -、-NO2、-NH2、-N(CH3)(R15)、-OR16、烷基、乙醚基团、聚醚基团、PEG1-30基团、-(C1-C4烷基)-R17、含有N、S或O原子的杂环基、被取代的炔基、氰基和碳水化合物基团，其中R15和R16选自以下基团：直链或支链烷基；直链或支链聚(C1-C4烷基酰胺)；聚(C1-C4亚烷基二醇)；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)：聚(C1-C4亚烷基二醇)二嵌段共聚物；C1-6烷基C1-6链烷酸酯；-(CH2)n-C(O)-O-(CH2)m-CH3，其中n＝1-4且m＝0-3，并且其中R17选自H，-OH、-COO-、-SO3 -、-PO4 -、-NO2或者-NH2，具有一种激发波长因而当与靶向活化剂结合且暴露在激发波长的光下时，所述重原子改性孔雀石绿衍生物产生单线态氧。
16.根据权利要求15所述的应用，其中所述活化剂基团是scFv活化剂基团和一种靶向基团的融合蛋白。
17.根据权利要求16所述的应用，其中所述scFv是一种L5-MGscFv肽。
18.根据权利要求15所述的应用，其中所述靶向基团对于表皮生长因子受体是选择性的。
19.根据权利要求18所述的应用，其中所述表皮生长因子受体是HER1(人表皮生长因子受体1)或者HER2(人表皮生长因子受体2)。
20.根据权利要求15所述的应用，其中所述靶向活化剂包括一种选自SEQ ID NOS：1-4、10-15、17和18的序列。
21.一种试剂盒，包括：
a.一种第一容器，所述第一容器含有具有通式I结构的重原子改性孔雀石绿衍生物：
Figure FFW0000023555590000061
其中，X和X’各自独立地是Br或I，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10各自独立地是H或者F，R11、R12、R13和R14各自独立地是甲基、H、氮杂环丙烷基团或氮杂环丁烷基团，其中当R11、R12、R13、和/或R14是氮杂环丙烷基团或氮杂环丁烷基团时，R11和R12形成一个单环和/或R13和R14形成一个单环，并且其中R选自-OH、-COO-、-SO3 -、-PO4 -、-NO2、-NH2、-N(CH3)(R15)、-OR16、烷基、乙醚基团、聚醚基团、PEG1-30基团、-(C1-C4烷基)-R17、含有N、S或O原子的杂环基、被取代的炔基、氰基和碳水化合物基团，其中R15和R16选自以下基团：直链或支链烷基；直链或支链聚(C1-C4烷基酰胺)；聚(C1-C4亚烷基二醇)；直链或支链的聚(C1-C4烷基酰胺)：聚(C1-C4亚烷基二醇)二嵌段共聚物；C1-6烷基C1-6链烷酸酯；-(CH2)n-C(O)-O-(CH2)m-CH3，其中n＝1-4且m＝0-3，并且其中R17选自H，-OH、-COO-、-SO3 -、-PO4 -、-NO2或者-NH2；以及
b.在所述第一容器或者一种第二容器中的靶向活化剂组合物，所述靶向活化剂组合物包含一种选择性结合细胞目标化合物的靶向基团，以及一种选择性结合重原子改性孔雀石绿衍生物的活化剂基团，其具有激发波长从而当在药物学上可接受的赋形剂中通过靶向活化剂结合且暴露于在激发波长下的光中时所述重原子改性孔雀石绿衍生物生成单线态氧。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述活化剂基团是scFv活化剂基团和一种靶向基团的融合蛋白。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述scFv是一种L5-MG scFv肽。
24.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述靶向基团对表皮生长因子受体具有选择性。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述表皮生长因子受体是HER1(人表皮生长因子受体1)或者HER2(人表皮生长因子受体2)。
26.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述靶向活化剂包括一种选自SEQ ID NOS：1-4、10-15、17和18的序列。
CN201580073178.1A 2014-11-17 2015-11-17 可激活的双组份光敏剂 Active CN107429075B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462123489P 2014-11-17 2014-11-17
US62/123,489 2014-11-17
PCT/US2015/061051 WO2016081440A1 (en) 2014-11-17 2015-11-17 Activatable two-component photosensitizers

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107429075A CN107429075A (zh) 2017-12-01
CN107429075B true CN107429075B (zh) 2022-11-01

Family

ID=56014447

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580073178.1A Active CN107429075B (zh) 2014-11-17 2015-11-17 可激活的双组份光敏剂

Country Status (3)

Country Link
US (2) US10434177B2 (zh)
CN (1) CN107429075B (zh)
WO (1) WO2016081440A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020085767A1 (ko) * 2018-10-22 2020-04-30 한양대학교 산학협력단 암세포 사멸 조성물 및 이의 용도
CN113784714B (zh) * 2019-07-25 2024-04-09 香港科技大学 用于选择性消除细菌并消融癌细胞的aie活性光敏剂
CN110658190A (zh) * 2019-08-28 2020-01-07 湖北工业大学 一种基于光遗传学杀死细胞的led灯
CN114949258A (zh) * 2022-06-17 2022-08-30 南开大学 一种ros响应性自荧光金属配位多功能簇修饰的基因载体的制备方法和应用

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2747824A1 (de) 1977-10-26 1979-05-03 Bayer Ag Verfahren zur herstellung von halogenvinyl-gamma-butyrolactonen
DE3023787A1 (de) 1980-06-25 1982-01-21 Studiengesellschaft Kohle mbH, 4330 Mülheim Verfahren zur erhoehung der inkorporation und der expression von genetischem material in die kerne von intakten zellen mit hilfe von liposomen
US4355023A (en) 1980-09-30 1982-10-19 The Massachusetts General Hospital Antibody fragment compositions and process
US4462334A (en) 1982-08-19 1984-07-31 Kim Ho K Solar animal structure
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4704962A (en) 1985-10-15 1987-11-10 Robert Healey Printing machine
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE3785186T2 (de) 1986-09-02 1993-07-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US5166320A (en) 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
JP2627899B2 (ja) 1987-08-19 1997-07-09 株式会社 ビタミン研究所 遺伝子封入リポソームの製法
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5196193A (en) 1989-10-31 1993-03-23 Ophidian Pharmaceuticals, Inc. Antivenoms and methods for making antivenoms
US5747334A (en) 1990-02-15 1998-05-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Random peptide library
DE69128350T2 (de) 1990-06-11 1998-03-26 Nexstar Pharmaceuticals Inc Nukleinsäureliganden
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
US5567588A (en) 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5683867A (en) 1990-06-11 1997-11-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX
US5496938A (en) 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5707796A (en) 1990-06-11 1998-01-13 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for selecting nucleic acids on the basis of structure
EP0553235A1 (en) 1990-10-01 1993-08-04 The University Of Connecticut Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
AU1922092A (en) 1991-05-03 1992-12-21 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Targeted delivery of genes encoding cell surface receptors
DK0584279T3 (da) 1991-05-14 2001-06-11 Immune Response Corp Inc Målrettet aflevering af gener, som koder for immunogene proteiner
ES2149774T3 (es) 1991-06-05 2000-11-16 Univ Connecticut Aportacion dirigida de genes que codifican proteinas secretoras.
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
EP0666923A1 (en) 1991-09-05 1995-08-16 The University Of Connecticut Targeted delivery of poly- or oligonucleotides to cells
DE69233528T2 (de) 1991-11-25 2006-03-16 Enzon, Inc. Verfahren zur Herstellung von multivalenten antigenbindenden Proteinen
US6238931B1 (en) 1993-09-24 2001-05-29 Biosite Diagnostics, Inc. Fluorescence energy transfer in particles
US5702892A (en) 1995-05-09 1997-12-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Phage-display of immunoglobulin heavy chain libraries
US6008373A (en) 1995-06-07 1999-12-28 Carnegie Mellon University Fluorescent labeling complexes with large stokes shift formed by coupling together cyanine and other fluorochromes capable of resonance energy transfer
US6248558B1 (en) 1998-03-31 2001-06-19 Vanderbilt University Sequence and method for genetic engineering of proteins with cell membrane translocating activity
US6131580A (en) 1998-04-17 2000-10-17 The University Of Washington Template imprinted materials by RFGD plasma deposition
US6358684B1 (en) 1999-08-27 2002-03-19 Pe Corporation UV excitable fluorescent energy transfer dyes
GB0119001D0 (en) 2001-08-03 2001-09-26 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Use of dendrimers and poly-branched molecules to enhance signal in fluorescent assay systems
US20030165918A1 (en) 2001-08-17 2003-09-04 Fuji Photo Film Co., Ltd. Method for detecting nucleic acid
AU2003278832A1 (en) 2002-09-13 2004-04-30 Carnegie Mellon University Optical biosensors and methods of use thereof
US20070254323A1 (en) * 2006-04-21 2007-11-01 Jun Wang Malachite green derivatives for immunoassay reagents to detect malachite green
JP2010500417A (ja) 2006-08-11 2010-01-07 ライフ テクノロジーズ コーポレーション センサータンパク質及びアッセイ方法
US8664364B2 (en) 2007-01-24 2014-03-04 Carnegie Mellon University Optical biosensors
DE102008058088A1 (de) 2008-11-18 2010-05-20 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren zur räumlich hochauflösenden Untersuchung einer mit einer Substanz markierten Struktur einer Probe
WO2010096388A2 (en) 2009-02-18 2010-08-26 Carnegie Mellon University Quenched dendrimeric dyes for bright detection
EP2577309B1 (en) 2010-05-25 2016-11-23 Carnegie Mellon University Targeted probes of cellular physiology
JP6447381B2 (ja) 2015-06-17 2019-01-09 住友電装株式会社 グロメット及びグロメット付ワイヤハーネス

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Fluorinated Analogs of Malachite Green: Synthesis and Toxicity;George A. Kraus等;《Molecules》;20080427;第13卷;第986-994页 *
Fluorocarbanion chemistry. Tris(4-nitro-2,3,5,6-tetrafluorophenyl) methane and Companions;Filler, R.;《Journal of Fluorine Chemistry》;20001231;第102卷(第1-2期);第185-188页 *
Renato Arau＇jo Prates等.Bactericidal effect of malachite green and red laser on Actinobacillus actinomycetemcomitans.《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》.2006,第86卷 *
Steric and electronic effects in basic dyes. IV.Electronic absorption spectra of derivatives ofMalachite Green containing more than one substituentin the phenyl ring;Ferguson, Angus S.; Hallas, Geoffrey;《Journal of the Society of Dyers and Colourists》;19731231;第89卷(第1期);第22-24页 *

Also Published As

Publication number Publication date
US10434177B2 (en) 2019-10-08
WO2016081440A1 (en) 2016-05-26
CN107429075A (zh) 2017-12-01
US20180280510A1 (en) 2018-10-04
US10946098B2 (en) 2021-03-16
US20200078460A1 (en) 2020-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10946098B2 (en) Activatable two-component photosensitizers
JP2020180154A (ja) プロテアーゼ切断耐性、志賀毒素ａサブユニットエフェクターポリペプチド及びそれを含む細胞標的化分子
CA2333833C (en) Specific binding molecules for scintigraphy,conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis
JP6041799B2 (ja) Ｔｒａｉｌｒ２特異的多量体足場
US10391180B2 (en) Self-assembling complex for targeting chemical agents to cells
KR102246800B1 (ko) 조건부 활성 생체 단백질
JP6739132B2 (ja) がんの診断及び処置のための組成物及び方法
US11136367B2 (en) Multi-level specific targeting of cancer cells
US20060193778A1 (en) Receptor-mediated uptake of peptides that bind the human transferrin receptor
ES2357622T3 (es) Péptido etiqueta que contiene cisteína para la conjugación específica de sitio de proteínas.
CN108064247A (zh) 包含志贺毒素a亚基效应物区域的多价cd20结合分子及其富集组合物
JP2008535475A (ja) Ｑ３ｓｐａｒｃ欠失変異体及びその使用
JP2012511029A (ja) アルブミン結合ペプチド介在性の疾患標的化
Futaki et al. Arginine carrier peptide bearing Ni (II) chelator to promote cellular uptake of histidine-tagged proteins
US20240016947A1 (en) Method for conjugating antibody and physiologically active substance
JP2019525743A (ja) 血液脳関門を通過するヒト化抗体及びその使用
UA74134C2 (uk) Антитіло зі специфічною афінністю до характерної антигенної детермінанти ed-b домену фібронектину, його застосування для лікування ангіогенезу, кон&#39;югати та діагностичний набір, до складу якого входить вказане антитіло
Catala et al. Targeted intracellular delivery of trastuzumab using designer phage lambda nanoparticles alters cellular programs in human breast cancer cells
EP4251206A1 (en) Protein derivatives containing unnatural amino acids and branched linkers
Avignolo et al. Internalization via Antennapedia protein transduction domain of an scFv antibody toward c‐Myc protein
KR20130111237A (ko) 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 결합 펩티드
WO2022148491A1 (zh) 一种可组装蛋白原件及其用途
Jia et al. Highly efficient method for intracellular delivery of proteins mediated by cholera toxin-induced protein internalization
KR101875809B1 (ko) 리피바디-항암 단백질 약물 복합체, 그 제조방법 및 용도
Bruce Protein Based Technologies to Identify, Study, and Control Intracellular Processes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant