CN108064247A - 包含志贺毒素a亚基效应物区域的多价cd20结合分子及其富集组合物 - Google Patents

包含志贺毒素a亚基效应物区域的多价cd20结合分子及其富集组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了多价CD20结合分子及其组合物，诸如相对于单价CD20结合分子包含大比例的多价CD20结合分子的富集组合物。本发明的某些多价CD20结合分子包含1)两个或更多个CD20结合区域和2)一个或多个从志贺毒素家族的成员的A亚基来源的志贺毒素效应物多肽区域。本发明的某些多价CD20结合分子及其组合物用于选择性杀死特定细胞类型和用作治疗多种疾病(包括癌症、肿瘤和免疫病症)的治疗剂。本发明的某些多价CD20结合分子及其组合物用于将药剂递送进表达CD20的细胞中，包括用于表达CD20的细胞的细胞内标记、收集诊断信息和监测多种涉及表达CD20的细胞的疾病(诸如癌症、肿瘤和免疫病症)的治疗。

Description

包含志贺毒素A亚基效应物区域的多价CD20结合分子及其富 集组合物
技术领域
本发明涉及包含多个CD20结合区域和任选的一个或多个毒素效应物区域(例如，从志贺毒素家族的成员的A亚基来源的志贺毒素效应物区域)的多价CD20结合分子和富含一种或多种前述分子的组合物。本发明的多价CD20结合分子及其组合物可以用于例如表达CD20的细胞的选择性杀死和用作用于治疗多种疾病、病症和病患(它们包括癌症、肿瘤和/或免疫病症)的治疗剂。
背景技术
从毒素开发有效用作治疗剂的合成的融合蛋白几十年来挑战着科学家(Pastan I等人，Annu Rev Med 58：221-37(2007))。从毒素来源的重组细胞毒性蛋白的效能取决于每种蛋白在不同细胞过程中的效率，所述细胞过程包括受体内化、细胞内按路线发送(intracellular routing)和将酶活性的毒素部分递送胞质溶胶靶底物以便有效地靶向细胞并将其杀死(Du X等人，Cancer Res 68：6300-5(2008)；Pirie C等人，J Biol Chem 286：4165-72(2011))。
已经将天然存在的毒素或截短的毒素片段通过化学缀合或重组蛋白质工程技术与免疫球蛋白结构域或受体配体连接或融合，以希望产生靶向细胞的治疗分子(MooltenF，Cooperband S，Science 169：68-70(1970)；Thorpe P等人，Nature 271：752-5(1978)；Krolick K等人，Proc Natl Acad Sci USA 77：5419-23(1980)；Krolick K等人，CancerImmunol Immunother 12：39-41(1981)；Blythman H等人，Nature 290：145-46(1981)；Chaudhary V等人，Nature 339：394-7(1989)；Strom T等人，Semin Immunol 2：467-79(1990)；Pastan I等人，Annu Rev Biochem 61：331-54(1992)；Foss F等人，Curr TopMicrobiol Immunol 234：63-81(1998))。这样的分子工程改造技术的目的是设计具有下述双重功能的嵌合分子：1)在全身施用后将毒素递送至生物体内的特定细胞类型或位置；和2)使用在真核细胞中有效的细胞毒性机制实现针对特定细胞的靶向细胞毒性。
在用其效力需要细胞内化的治疗剂靶向细胞外CD20抗原中存在一个未解决的问题-如何将结合至细胞表面CD20分子的治疗剂有效地驱动到靶细胞内。CD20是基于抗体的疗法的一种特别有吸引力的靶标，所述疗法基于这样的机制：其中对于治疗剂而言合乎需要的是保留在细胞表面上，因为CD20在被抗体结合以后不会内化。尽管CD20内化的缺乏在以后被证实是细胞类型-和抗体类型-特异性的，一般而言，CD20似乎以比其它细胞表面抗原低得多的速率内化，并且通常被视作一种非内化的细胞外靶标。CD20“会抵抗内化并与它的结合的mAb一起在细胞表面上保留延长的数小时和可能数天的时间段”(Glennie M等人，Mol Immunol 44：3823-37(2007)；参见例如Press O等人，Cancer Res 49：4906-12(1989)；McLaughlin P等人，J Clin Oncol 16：2825-33(1998)；Johnson P，Glennie M，SeminOncol 30：3-8(2003))。
尽管靶向细胞外CD20抗原的基于抗体的疗法是众多的，但是它们因而共同地基于细胞外机制(参见Cheson B，Leonard J，N Engl J Med 359：613-26(2008)；Boross P，Leusen J，Am J Cancer Res 2：676-90(2012))。本领域中存在关于应用CD20作为疗法的细胞外靶标的一个问题，所述疗法的有效性要求治疗剂以CD20介导的方式到达靶细胞的细胞内空间，因为通常发现CD20不容易内化。
依赖于治疗剂(例如，免疫毒素、配体-毒素融合体和免疫-RNA酶)的细胞内化的疗法的有效性取决于它们在靶细胞表面上的靶标的量和与它的靶标复合的表面结合治疗剂的细胞内化速率。具体地，关于CD20，在用内化治疗剂靶向细胞外CD20中存在一个未解决的问题-如何将结合至细胞表面CD20分子的治疗剂有效地驱动到靶细胞内。CD20对细胞内化的一般抵抗意味着，这个未解决的促进有效CD20内化的问题普遍适用于任何表达CD20的靶细胞，包括在它们的细胞表面上表达相对大量的CD20的细胞。
本领域中需要开发靶向表达细胞表面CD20的细胞的有效组合物、治疗分子和治疗方法，其中CD20在治疗剂结合(例如，通过免疫球蛋白结合结构域)后不会有效地内化。具体地，本领域中需要开发靶向CD20的分子，其触发细胞表面CD20分子的快速和有效细胞内化。例如，有效的靶向CD20的、抗肿瘤的和免疫调节性的治疗剂的开发需要活跃地诱导细胞表面表达的CD20分子的细胞内化的免疫毒素，所述CD20分子在细胞内将毒素组分传递至它们的靶标并且能够有效地杀死表达CD20的细胞。这样的靶向细胞的疗法可以用于表达CD20的细胞(例如，某些恶性细胞、B-淋巴细胞(B-细胞)和T-淋巴细胞(T-细胞))的靶向杀死。对当前依赖于细胞外机制(例如，基于免疫球蛋白结构域如可结晶的片段Fc区(Fc区)与Fc受体的相互作用的信号传递功能或补体系统的免疫机制)的靶向CD20的疗法不敏感或产生抗性的患者特别需要新疗法。
因此本领域中需要表现出高效和有效细胞内化、细胞内按路线发送和/或针对表达CD20的细胞的有效细胞毒性的CD20结合分子。具体地，本领域中需要开发靶向细胞表面CD20抗原的有效组合物、治疗剂和治疗方法，所述细胞表面CD20抗原不会天然地以有效的速率内化或在被治疗剂结合后不会。另外，需要获得改进的、靶向细胞的、包含志贺毒素-亚基-A来源的多肽的分子，其自我指导它们自身的细胞内化、细胞内按路线发送和/或表现出有效细胞毒性，其用于杀死特定的表达CD20的细胞类型和用在治疗多种疾病的疗法中，所述疾病是例如通过药剂向靶向的表达CD20的细胞类型的选择性杀死或选择性递送可以治疗的癌症、肿瘤和免疫病症。
发明内容
本发明提供了多价CD20结合分子的多个实施方案及其组合物，其中每个多价CD20结合分子包含1)两个或更多个CD20结合区域，诸如从免疫球蛋白来源的结合区域，和2)从志贺毒素家族的至少一个成员的A亚基来源的至少一个志贺毒素A亚基效应物多肽区域。当CD20被细胞表达在细胞表面处并保持与所述细胞物理偶联时，本发明的多价CD20结合分子的CD20结合区域各自独立地能够特异性地结合CD20的细胞外部分，例如，暴露于细胞外环境的CD20的一部分。
多个CD20结合区域与一个或多个志贺毒素A亚基来源的多肽的连接使得能够工程改造CD20靶向分子，其可以促进细胞表面CD20的快速细胞内化和因而有效地进入表达CD20的细胞的内部。因此，本发明的某些多价CD20结合分子及其组合物可以用于在有一种或多种其它细胞类型存在下基于它的CD20靶向和细胞内化活性将负荷选择性地递送至表达CD20的细胞类型，例如，具有期望的细胞内功能的负荷。另外，本发明的某些多价CD20结合分子及其组合物可以用于在有一种或多种其它细胞类型存在下基于它的CD20靶向活性和细胞内化活性选择性地杀死表达CD20的细胞，例如，通过向靶向的表达CD20的细胞的内部递送在细胞内位置具有细胞毒性的多价CD20结合分子的组分。例如，通过它们向表达CD20的细胞的内部有效地递送催化活性的志贺毒素效应物多肽(其能够有效地路由至胞质溶胶)的能力，本发明的某些多价CD20结合分子可以对表达CD20的细胞是高细胞毒性的。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含(1)两个或更多个CD20结合区域，每个能够特异性地结合CD20分子的细胞外部分；和(2)一个或多个志贺毒素效应物区域，每个包含从志贺毒素家族的至少一个成员的A亚基的氨基酸序列来源的多肽。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含(1)两个或更多个CD20结合区域，每个能够独立地特异性地结合CD20分子的细胞外部分；和(2)一个或多个志贺毒素效应物区域，每个包含从志贺毒素家族的至少一个成员的A亚基的氨基酸序列来源的多肽。在某些其它实施方案中，本发明的多价CD20结合分子不包含免疫球蛋白Fc区或细胞杀死的细胞外机制所需的任何免疫球蛋白结构域(除了抗原结合所需的结构域以外)。在某些其它实施方案中，所述多价CD20结合分子不包含除了(1)6个或更多个CDR或(2)一个或多个单链可变片段以外的任何免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含仅两个志贺毒素效应物区域。
对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，将多价CD20结合分子施用给与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，导致以下一种或多种：(1)将所述多价CD20结合分子内化进细胞内，(2)所述多价CD20结合分子的志贺毒素效应物区域向所述细胞的胞质溶胶的亚细胞按路线发送，(3)破坏所述细胞的核糖体功能，和(4)所述细胞的杀死。对于某些其它实施方案，所述内化在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内发生。对于某些其它实施方案，所述多价CD20结合分子诱导分子复合物的细胞内化，所述分子复合物包含与CD20结合的多价CD20结合分子。对于某些其它实施方案，所述细胞在细胞表面处表达这样的CD20，其(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述细胞与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述细胞是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述细胞选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，将所述多价CD20结合分子施用给多个与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，导致以下活动中的一种或多种：(1)将所述多价CD20结合分子内化进细胞内，(2)所述多价CD20结合分子的志贺毒素效应物区域向所述细胞的胞质溶胶的亚细胞按路线发送，(3)破坏所述细胞的核糖体功能，和(4)所述细胞的杀死。对于某些其它实施方案，所述多价CD20结合分子诱导分子复合物的细胞内化，所述分子复合物包含与CD20结合的多价CD20结合分子。对于某些其它实施方案，在相当于5或38％至50％细胞表面占据的多价CD20结合分子浓度将所述多价CD20结合分子施用给多个与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，所述多价CD20结合分子的大多数在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内内化进所述多个细胞中。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，将多价CD20结合分子施用给表达CD20的细胞后，所述多价CD20结合分子能够造成所述细胞的死亡，即杀死所述细胞。对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，将多价CD20结合分子施用给表达CD20的细胞(所述细胞表达具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分的CD20)后，所述多价CD20结合分子能够造成所述细胞的死亡。对于某些其它实施方案，所述细胞在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞是CD20阳性的细胞。对于某些其它实施方案，所述细胞与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。该细胞杀死活性可以依赖于或不依赖于所述多价CD20结合分子的一个或多个志贺毒素效应物区域的催化活性。
对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，将所述多价CD20结合分子施用给与CD20物理偶联的第一细胞群体和第二细胞群体后，所述多价CD20结合分子对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性效应是相对于所述第二细胞群体的成员的至少3倍大。对于某些其它实施方案，所述第一细胞群体的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述第一细胞群体的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述第一细胞群体的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述第一细胞群体的成员在细胞表面处过表达CD20，所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述第一细胞群体的成员过表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些实施方案，所述第一细胞群体的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述第一细胞群体的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。对于某些实施方案，所述第二细胞群体的成员没有与细胞外CD20物理偶联和/或是CD20阴性的。对于某些实施方案，所述第二细胞群体的成员没有与细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些其它实施方案，所述第二细胞群体的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些实施方案，所述第二细胞群体的成员没有与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，将所述多价CD20结合分子施用给其成员为CD20阳性的第一细胞群体和其成员不是CD20阳性的第二细胞群体后，所述多价CD20结合分子对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性效应是相对于所述第二细胞群体的成员的至少3倍大。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含两个或更多个蛋白性组分(例如蛋白亚基)，其中每个蛋白性组分包含(1)至少一个CD20结合区域，其能够特异性地结合CD20分子的细胞外部分，和，任选地，(2)一个或多个志贺毒素效应物区域，每个包含从志贺毒素家族的至少一个成员的A亚基的氨基酸序列来源的多肽。在某些其它实施方案中，每个蛋白性组分包含(1)仅一个CD20结合区域，其能够特异性地结合CD20分子的细胞外部分，和(2)仅一个志贺毒素效应物区域。在某些其它实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含刚好两个蛋白性组分。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含两个或更多个组分，其中至少一个组分通过一种或多种非共价相互作用与所述多价CD20结合分子结合。在某些其它实施方案中，所述组分中的至少一种是蛋白性的。在某些其它实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含两个或更多个通过一种或多种非共价相互作用直接地或间接地彼此结合的蛋白性组分。在某些其它实施方案中，每个蛋白性组分包含(1)至少一个CD20结合区域，其能够特异性地结合CD20的细胞外部分，和(2)志贺毒素效应物区域。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含至少一个含有免疫球蛋白型结合区域的CD20结合区域。在某些其它实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含含有免疫球蛋白型结合区域的CD20结合区域，所述免疫球蛋白型结合区域包含选自以下的多肽：自主VH结构域、单结构域抗体片段(sdAb)、纳米抗体(nanobody)、从骆驼科来源的重链-抗体结构域(VHH或VH结构域片段)、从软骨鱼来源的重链抗体结构域(VHH或VH结构域片段)、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链可变片段(scFv)、抗体可变片段(Fv)、互补决定区3片段(CDR3)、受限的FR3-CDR3-FR4多肽(FR3-CDR3-FR4)、Fd片段、小模块免疫药物(SMIP)结构域、抗原结合片段(Fab)、犰狳重复多肽(ArmRP)、纤连蛋白来源的第10个纤连蛋白III型结构域(10Fn3)、生腱蛋白III型结构域(TNfn3)、锚蛋白重复基序结构域、低密度脂蛋白受体来源的A-结构域(LDLR-A)、脂质运载蛋白(anticalin)、Kunitz结构域、蛋白-A-来源的Z结构域、γ-B结晶-来源的结构域、泛蛋白-来源的结构域、Sac7d-来源的多肽(affitin)、Fyn-来源的SH2结构域、小蛋白、C-型凝集素-样结构域支架、经工程改造的抗体模拟物和保留结合功能性的前述任一种的任何遗传上操作的相应物。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子不包含免疫球蛋白Fc区或保留Fc区功能的Fc区效应物，所述Fc区功能是例如参与向免疫系统因子、细胞和/或组织的细胞外信号传递。Fc区功能的非限制性例子包括活化T-细胞、刺激炎症介质(诸如细胞因子如TNF-α)的释放、开始补体依赖性的细胞毒性(CDC)、抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)和被包含Fc区的分子在细胞外结合的细胞的吞噬作用。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子不包含任何免疫球蛋白重链恒定区、免疫球蛋白轻链恒定区、免疫球蛋白CL结构域、免疫球蛋白CH1结构域、免疫球蛋白CH2结构域和/或免疫球蛋白CH3结构域。在某些其它实施方案中，所述多价CD20结合分子不包含除了选自以下的免疫球蛋白结构域以外的任何免疫球蛋白结构域：(1)CDR，(2)ABR，和/或(3)存在于自主VH结构域中的任何免疫球蛋白结构域、单结构域抗体结构域(sdAb)、重链抗体结构域片段(VHH片段或VH结构域片段)和单链可变片段(scFv)。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子不包含任何免疫球蛋白结构域或从免疫球蛋白来源的任何多肽。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含至少一个志贺毒素效应物区域，所述效应物区域包含选自以下的多肽或基本上由其组成：(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸75-251；(b)SEQ ID NO∶1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-241；(c)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-251；和(d)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-261。
在本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案中，所述多价CD20结合分子是单体的。在某些其它实施方案中，所述多价CD20结合分子是多聚体的，例如所述分子包含至少两个独立的多肽链（例如蛋白亚基)，所述多肽链直接地或间接地结合以形成单个分子。在某些其它实施方案中，本发明的多聚体的多价CD20结合分子包含两个或更多个蛋白组分，例如，两个或更多个单独的CD20结合蛋白。在某些实施方案中，本发明的多聚体的多价CD20结合分子包含两个或更多个蛋白组分(例如亚基)，所述蛋白组分通过一种或多种非共价相互作用而结合。
在某些实施方案中，本发明的多聚体的多价CD20结合分子包含两个或更多个蛋白组分(例如亚基)，所述蛋白组分通过一种或多种共价相互作用而结合。在某些其它实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含通过一种或多种共价相互作用而结合的两个或更多个蛋白组分(例如，两个或更多个单独的CD20结合蛋白)，其中至少一种共价相互作用是所述蛋白组分的至少两个之间(例如，在不同蛋白亚基之间)的二硫键。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含在SEQ ID NO：1-304中的任一个中所示的分子。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含CD20结合区域，所述CD20结合区域包含含有选自以下的多肽的免疫球蛋白型结合区域：(a)重链可变(VH)结构域，其包含(i)HCDR1，其包含如在SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQID NO：29或SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；(ii)HCDR2，其包含如在SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：36中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；和/或(iii)HCDR3，其包含如在SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31或SEQ IDNO：37中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；和/或(b)轻链可变(VL)结构域，其包含(i)LCDR1，其包含如在SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：38中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；(ii)LCDR2，其包含如在SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；和/或(iii)LCDR3，其包含如在SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：40中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含CD20结合区域，所述CD20结合区域包含SEQ ID NO：47-119和176-248中的任一个的氨基酸1-232、1-233、1-234、1-235、1-236、1-242、1-243、1-244、1-245、1-246、1-252、1-253、1-254、1-255或1-256或基本上由其组成。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含在SEQ ID NO：47-304中的任一个中所示的蛋白，且任选地，所述蛋白进一步包含氨基端甲硫氨酸残基。在某些其它实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含两种蛋白或基本上由其组成，每种蛋白选自在SEQID NO：47-304中所示的多肽中的任一种，且任选地，每种蛋白进一步包含氨基端甲硫氨酸残基。在某些其它实施方案中，所述蛋白选自在SEQ ID NO：47-175中所示的蛋白中的任一种，且进一步包含二硫键，所述二硫键包含在选自以下位置处的半胱氨酸残基：242、482、483、484、490、491、492、493、494、495、499、500、501、502、503、504、505、510、511、512、513和521。
对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，所述多价CD20结合分子对于CD20结合而言是单特异性的。在某些其它实施方案中，存在于所述多价CD20结合分子中的所有CD20结合区域独立地结合相同CD20的相同细胞外部分。在某些其它实施方案中，存在于所述多价CD20结合分子中的所有CD20结合区域以等同特异性独立地结合相同细胞外CD20表位。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含一个或多个单价CD20结合分子组分；且其中在将本发明的多价CD20结合分子施用给与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞群体后，所述多价CD20结合分子表现出的对所述细胞群体的细胞毒性效应比在相同条件下将等同量、质量或摩尔浓度的所述多价CD20结合分子的任一种单价CD20结合分子组分施用给相同CD20阳性细胞群体引起的细胞毒性效应大1.33、1.5、1.75、2、3、5、7.5、10、20、100倍，或大于所述单价CD20结合组分和所述多价CD20结合分子之间的CD20结合价的变化。对于某些其它实施方案，所述细胞群体的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞群体的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述细胞群体的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述细胞群体的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述细胞群体的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含一个或多个单价CD20结合分子组分；且其中在将本发明的多价CD20结合分子施用给表达CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)的CD20阳性细胞群体后，所述多价CD20结合分子表现出的细胞毒性效应比在相同条件下将等同量、质量或摩尔浓度的所述多价CD20结合分子的任一种单价CD20结合分子组分施用给相同CD20阳性细胞群体引起的细胞毒性效应大1.33、1.5、1.75、2、3、5、7.5、10、20、100倍，或大于所述单价CD20结合组分和所述多价CD20结合分子之间的CD20结合价的变化。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含一个或多个单价CD20结合分子组分；且其中在将本发明的多价CD20结合分子施用给与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞群体后，所述多价CD20结合分子表现出的细胞毒性效应比在相同条件下将等同量、质量或摩尔浓度的所述多价CD20结合分子的任一种单价CD20结合分子组分施用给相同CD20阳性细胞群体引起的细胞毒性效应大1.33、1.5、1.75、2、3、5、7.5、10、20、100倍，或大于所述多价CD20结合分子和所述单价CD20结合组分之间关于结合CD20或表达CD20的细胞的平衡结合常数(KD)的变化。对于某些其它实施方案，所述细胞群体的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞群体的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述细胞群体的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述细胞群体的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述细胞群体的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含一个或多个单价CD20结合分子组分；且其中在将本发明的多价CD20结合分子施用给表达CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)的CD20阳性细胞群体后，所述多价CD20结合分子表现出的细胞毒性效应比在相同条件下将等同量、质量或摩尔浓度的所述多价CD20结合分子的任一种单价CD20结合分子组分施用给相同CD20阳性细胞群体引起的细胞毒性效应大1.33、1.5、1.75、2、3、5、7.5、10、20、100倍，或大于所述多价CD20结合分子和所述单价CD20结合组分之间关于结合CD20或表达CD20的细胞的平衡结合常数(KD)的变化。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含一个或多个单价CD20结合分子组分；且其中在将本发明的多价CD20结合分子施用给与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞群体后，所述多价CD20结合分子表现出的细胞毒性效应比在相同条件下将等同量、质量或摩尔浓度的所述多价CD20结合分子的任一种单价CD20结合分子组分施用给相同CD20阳性细胞群体引起的细胞毒性效应大1.33、1.5、1.75、2、3、5、7.5、10、20、100倍，或大于所述多价CD20结合分子和所述单价CD20结合组分之间关于结合CD20或表达CD20的细胞的亲和常数(1/KD)的变化。对于某些其它实施方案，所述细胞群体的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞群体的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述细胞群体的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述细胞群体的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述细胞群体的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含一个或多个单价CD20结合分子组分；且其中在将本发明的多价CD20结合分子施用给表达CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)的CD20阳性细胞群体后，所述多价CD20结合分子表现出的细胞毒性效应比在相同条件下将等同量、质量或摩尔浓度的所述多价CD20结合分子的任一种单价CD20结合分子组分施用给相同CD20阳性细胞群体引起的细胞毒性效应大1.33、1.5、1.75、2、3、5、7.5、10、20、100倍，或大于所述多价CD20结合分子和所述单价CD20结合组分之间关于结合CD20或表达CD20的细胞的亲和常数(1/KD)的变化。
在本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案中，所述CD20结合分子的一个或多个多肽组分包含KDEL家族的成员的羧基端内质网保留/取回信号基序。在某些其它实施方案中，所述羧基端内质网保留/取回信号基序选自KDEL、HDEF、HDEL、RDEF、RDEL、WDEL、YDEL、HEEF、HEEL、KEEL、REEL、KAEL、KCEL、KFEL、KGEL、KHEL、KLEL、KNEL、KQEL、KREL、KSEL、KVEL、KWEL、KYEL、KEDL、KIEL、DKEL、FDEL、KDEF、KKEL、HADL、HAEL、HIEL、HNEL、HTEL、KTEL、HVEL、NDEL、QDEL、REDL、RNEL、RTDL、RTEL、SDEL、TDEL、SKEL、STEL和EDEL。
在本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案中，一个或多个志贺毒素效应物区域包含相对于志贺毒素家族的成员的天然存在的A亚基的突变，所述突变改变所述志贺毒素效应物区域的酶活性，所述突变选自至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换，例如，SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的A231E、R75A、Y77S、Y114S、E167D、R170A、R176K和/或W203A。在某些其它实施方案中，所述突变选自减少或消除催化活性、但是保留至少一种其它志贺毒素效应物功能(例如，诱导细胞内化和/或指导亚细胞按路线发送)的至少一个氨基酸残基缺失、插入或置换。在某些其它实施方案中，所述突变减少或消除所述志贺毒素效应物区域的细胞毒性。
对于所述多价CD20结合分子的某些实施方案，所述多价CD20结合分子可以用于将额外外源物质递送进细胞中。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含额外外源物质。对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，其包含额外外源物质；其中在将所述多价CD20结合分子施用给一个或多个与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，所述多价CD20结合分子在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内内化进所述一个或多个细胞中。对于某些其它实施方案，所述一个或多个细胞在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，一个或多个细胞是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，一个或多个细胞与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，一个或多个细胞是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，一个或多个细胞选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，其包含额外外源物质；其中在将所述多价CD20结合分子施用给一个或多个与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，所述多价CD20结合分子在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内内化进所述一个或多个细胞中并将所述额外外源物质递送进所述细胞的内部。对于某些其它实施方案，所述一个或多个细胞在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，一个或多个细胞是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，一个或多个细胞与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，一个或多个细胞是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，一个或多个细胞选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，其包含额外外源物质；其中在相当于5或38％至50％细胞表面占据的多价CD20结合分子浓度将所述多价CD20结合分子施用给多个与CD20(所述具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，所述多价CD20结合分子的大多数在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内内化进所述多个细胞中。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，其包含额外外源物质；其中在将所述多价CD20结合分子施用给一个或多个与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，所述多价CD20结合分子在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内内化进所述一个或多个细胞中并将所述额外外源物质递送进所述细胞的内部。对于某些其它实施方案，所述一个或多个细胞在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，一个或多个细胞是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，一个或多个细胞与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，一个或多个细胞是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，一个或多个细胞选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，其包含额外外源物质；其中在相当于5或38％至50％细胞表面占据的多价CD20结合分子浓度将所述多价CD20结合分子施用给多个与CD20(所述具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，所述多价CD20结合分子的大多数在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内内化进所述多个细胞中并将所述额外外源物质递送进所述细胞的内部。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
用于将额外外源物质递送进细胞中的本发明的多价CD20结合分子的实施方案各自包含(1)两个或更多个CD20结合区域，每个能够特异性地结合CD20的细胞外部分，和(2)额外外源物质。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含选自以下的额外外源物质：细胞毒性剂、检测促进剂、肽、多肽、蛋白和多核苷酸。在某些其它实施方案中，所述额外外源物质是包含酶的蛋白。在某些其它实施方案中，所述额外外源物质是作为小抑制RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)起作用的多核苷酸。在某些实施方案中，所述额外外源物质是肽，所述肽是抗原，例如，来自病原体。在某些实施方案中，所述抗原包含SEQ ID NO：46或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述抗原源自选自以下的分子：细菌蛋白、在癌症中突变的蛋白、在癌症中异常地表达的蛋白、T-细胞互补决定区多肽和/或病毒蛋白。在某些实施方案中，所述细胞毒性剂是化学治疗剂、细胞毒性的抗生素、烷化剂、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。
本发明也提供了包含本发明的多价CD20结合分子的组合物(多价CD20结合分子组合物)，例如，富含本发明的多价CD20结合分子的组合物和/或含有与单价CD20结合分子相比相对大比例的多价CD20结合分子的组合物。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含本发明的多价CD20结合分子，其中所述组合物包含小于1∶3的单价CD20结合分子浓度∶总CD20结合分子浓度的比率；且其中每个单价CD20结合分子包含仅一个CD20结合区域，该区域能够特异性地结合CD20的细胞外部分且包含至少一个志贺毒素效应物多肽。在某些其它实施方案中，所述多价CD20结合分子组合物包含小于选自以下比率的单价CD20结合分子浓度∶总CD20结合蛋白浓度的比率：1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10和1∶11。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含超过2∶3的多价CD20结合分子浓度∶总CD20结合分子浓度的比率。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含小于选自以下比率的相对大价CD20结合分子浓度∶总CD20结合分子浓度的比率：1∶4、1∶7、1∶11、1∶21、1∶41、1∶71、1∶111和1∶161；其中每个相对大价CD20结合分子包含三个或更多个能够特异性地结合CD20的细胞外部分的CD20结合区域且包含至少一个志贺毒素效应物多肽。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含超过选自以下比率的二价CD20结合分子浓度∶总CD20结合分子浓度的比率：1∶2、2∶3、3∶4、4∶5、5∶6、7∶8、8∶9、9∶10、10∶11、11∶12、12∶13、13∶14和14∶15；其中每个二价CD20结合分子包含(1)仅两个能够特异性地结合CD20的细胞外部分的CD20结合区域和(2)一个或多个志贺毒素效应物多肽。
对于本发明的多价CD20结合分子组合物的某些实施方案，在将所述多价CD20结合分子组合物施用给与CD20物理偶联的第一细胞群体和第二细胞群体后，所述多价CD20结合分子组合物对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性效应是相对于所述第二细胞群体的成员的至少3倍大。对于某些其它实施方案，所述第一细胞群体的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子组合物的多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述第一细胞群体的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述第一细胞群体的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子组合物的多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述第一细胞群体的成员在细胞表面处过表达CD20，所述CD20具有被所述多价CD20结合分子组合物的多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述第一细胞群体的成员过表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子组合物的多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些实施方案，所述第一细胞群体的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述第一细胞群体的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。对于某些实施方案，所述第二细胞群体的成员没有与细胞外CD20物理偶联和/或是CD20阴性的。对于某些实施方案，所述第二细胞群体的成员没有与细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些其它实施方案，所述第二细胞群体的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子组合物的多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些实施方案，所述第二细胞群体的成员没有与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子组合物的任何多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于本发明的多价CD20结合分子组合物的某些实施方案，在将所述多价CD20结合分子组合物施用给其成员为CD20阳性的第一细胞群体和其成员不是CD20阳性的第二细胞群体后，所述多价CD20结合分子组合物对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性效应是相对于所述第二细胞群体的成员的至少3倍大。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含具有一个或多个单价CD20结合分子组分的多价CD20结合分子；且其中在将本发明的多价CD20结合分子组合物施用给与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞群体后，所述多价CD20结合分子组合物表现出的细胞毒性效应比在相同条件下将等同量、质量或摩尔浓度的任一种单价CD20结合分子组分施用给相同CD20阳性细胞群体引起的细胞毒性效应大1.33、1.5、1.75、2、3、5、7.5、10、20、100倍，或大于所述单价CD20结合组分和所述多价CD20结合分子之间的CD20结合价的变化。对于某些其它实施方案，所述细胞群体的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞群体的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述细胞群体的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述细胞群体的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述细胞群体的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含具有一个或多个单价CD20结合分子组分的多价CD20结合分子；且其中在将本发明的多价CD20结合分子组合物施用给表达CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)的CD20阳性细胞群体后，所述多价CD20结合分子组合物表现出的细胞毒性效应比在相同条件下将等同量、质量或摩尔浓度的任一种单价CD20结合分子组分施用给相同CD20阳性细胞群体引起的细胞毒性效应大1.33、1.5、1.75、2、3、5、7.5、10、20、100倍，或大于所述单价CD20结合组分和所述多价CD20结合分子之间的CD20结合价的变化。
对于本发明的多价CD20结合分子组合物的某些实施方案，其包含具有额外外源物质的多价CD20结合分子；其中在相当于5或38％至50％细胞表面占据的多价CD20结合分子浓度将所述多价CD20结合分子组合物施用给多个与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，所述多价CD20结合分子的大多数在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内内化进所述多个细胞中。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于本发明的多价CD20结合分子组合物的某些实施方案，其包含具有额外外源物质的多价CD20结合分子；其中在将所述多价CD20结合分子组合物施用给一个或多个与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，所述多价CD20结合分子在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内内化进所述一个或多个细胞中并将所述额外外源物质递送进所述细胞的内部。对于某些其它实施方案，所述一个或多个细胞在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，一个或多个细胞是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，一个或多个细胞与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，一个或多个细胞是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，一个或多个细胞选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于本发明的多价CD20结合分子组合物的某些实施方案，其包含具有额外外源物质的多价CD20结合分子；其中在相当于5或38％至50％细胞表面占据的多价CD20结合分子浓度将所述多价CD20结合分子组合物施用给多个与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，所述多价CD20结合分子的大多数在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内内化进所述多个细胞中并将所述额外外源物质递送进所述细胞的内部。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
本发明也提供了药物组合物，其包含本发明的多价CD20结合分子和/或本发明的多价CD20结合分子，且包含至少一种药学上可接受的赋形剂或载体；和这样的多价CD20结合分子或包含它的组合物在制备这样的药物组合物中和在如在本文中进一步描述的本发明的方法中的用途。本发明的某些实施方案是包含本发明的任何多价CD20结合分子(例如本发明的多价CD20结合蛋白)和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物。
在本发明的某些实施方案中是包含本发明的多价CD20结合分子的诊断组合物，所述多价CD20结合分子还包含用于收集关于细胞、细胞类型、组织、器官、疾病、障碍、病症、受试者和/或患者的信息的检测促进剂。
除了本发明的多价CD20结合分子及其组合物以外，能够编码本发明的多价CD20结合分子(例如多价CD20结合蛋白)或其多肽组分的多核苷酸是在本发明范围内，以及包含本发明的多核苷酸的表达载体和包含本发明的表达载体的宿主细胞。包含本发明的表达载体的宿主细胞可以用在，例如，通过重组表达生产本发明的多价CD20结合分子或其多肽组分或片段的方法中。类似地，包含本发明的表达载体的宿主细胞可以用在，例如，生产本发明的多价CD20结合分子组合物或其多肽组分的方法中。
本发明也包括被固定化在固体基质上的根据本发明的任何组合物。根据本发明的组合物的这种排列可以用在，例如，如本文中所述的筛选分子的方法中。
另外，本发明提供了杀死细胞的方法，所述方法包括下述步骤：使细胞与本发明的多价CD20结合分子、本发明的多价CD20结合分子组合物和/或本发明的药物组合物接触。对于某些实施方案，所述接触细胞的步骤在体外进行。对于某些其它实施方案，所述接触细胞的步骤在体内进行。对于本发明的杀死细胞的方法的某些实施方案，当接触包含不同细胞的细胞混合物时，所述方法能够比其它细胞和/或细胞类型优先选择性地杀死细胞和/或细胞类型，所述不同细胞在被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域和/或本发明的组合物(例如，本发明的多价CD20结合分子组合物和/或药物组合物)的多价CD20结合分子结合的CD20的细胞表面存在和/或表达水平方面存在差异。
另外，本发明提供了一种诱导多价CD20结合分子细胞内化进与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞中的方法，所述方法包括下述步骤：使所述细胞与本发明的多价CD20结合分子、本发明的多价CD20结合分子组合物、本发明的药物组合物和/或本发明的诊断组合物接触。对于诱导细胞内化方法的某些其它实施方案，所述接触细胞的步骤在体外进行。对于某些其它实施方案，所述接触细胞的步骤在体内(例如，在患者内)进行。对于诱导细胞内化方法的某些其它实施方案，所述多价CD20结合分子的细胞内化在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内发生。对于某些其它实施方案，所述细胞在细胞表面处表达这样的CD20，其(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述细胞与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述细胞是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述细胞选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于某些实施方案，本发明提供了一种诱导多价CD20结合分子细胞内化进多个与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞中的方法，所述方法包括下述步骤：使所述多个细胞与本发明的多价CD20结合分子、本发明的多价CD20结合分子组合物、本发明的药物组合物和/或本发明的诊断组合物接触。对于诱导细胞内化方法的某些其它实施方案，所述接触细胞的步骤在体外进行。对于某些其它实施方案，所述接触细胞的步骤在体内(例如，在患者内)进行。对于诱导细胞内化方法的某些其它实施方案，所述多价CD20结合分子的细胞内化在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内发生。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
类似地，本发明提供了一种内化被本发明的多价CD20结合分子结合的、细胞表面定位的CD20的方法，所述方法包括下述步骤：使具有细胞表面定位的CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)的细胞与本发明的多价CD20结合分子、本发明的多价CD20结合分子组合物、本发明的药物组合物和/或本发明的诊断组合物接触。对于所述内化细胞表面定位的CD20的方法的某些其它实施方案，所述接触细胞的步骤在体外进行。对于某些其它实施方案，所述接触细胞的步骤在体内(例如，在患者内)进行。对于所述内化细胞表面定位的CD20的方法的某些其它实施方案，所述细胞表面定位的CD20的内化在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内发生。对于某些其它实施方案，所述细胞在细胞表面处表达这样的CD20，其(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述细胞与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述细胞是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述细胞选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于某些实施方案，本发明提供了一种内化被本发明的多价CD20结合分子结合的、细胞表面定位的CD20的方法，所述方法包括下述步骤：使多个具有细胞表面定位的CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)的细胞与本发明的多价CD20结合分子、本发明的多价CD20结合分子组合物、本发明的药物组合物和/或本发明的诊断组合物接触。对于所述内化细胞表面定位的CD20的方法的某些其它实施方案，所述接触多个细胞的步骤在体外进行。对于某些其它实施方案，所述接触多个细胞的步骤在体内(例如，在患者内)进行。对于所述内化细胞表面定位的CD20的方法的某些其它实施方案，所述细胞表面定位的CD20的内化在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内发生在所述多个细胞的的大多数细胞中。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于某些实施方案，本发明提供了一种诱导受试者中被多价CD20结合分子结合的、细胞表面定位的CD20的细胞内化的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用本发明的多价CD20结合分子、本发明的多价CD20结合分子组合物、本发明的药物组合物和/或本发明的诊断组合物。
另外，本发明提供了一种用于将外源物质递送到细胞内部的方法，所述方法包括下述步骤：使所述细胞在体外或在体内与包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子、本发明的多价CD20结合分子组合物(其含有包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子)、本发明的药物组合物(其含有包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子)和/或本发明的诊断组合物(其含有包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子)接触。对于某些其它实施方案，所述细胞与CD20物理偶联，所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些其它实施方案，所述细胞在细胞表面处表达这样的CD20，其(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述细胞与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述细胞是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述细胞选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于某些实施方案，本发明提供了一种将外源物质递送到细胞内部的方法，所述方法包括下述步骤：给受试者施用包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子、本发明的多价CD20结合分子组合物(其含有包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子)、本发明的药物组合物(其含有包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子)和/或本发明的诊断组合物(其含有包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子)。对于某些其它实施方案，所述细胞与CD20物理偶联，所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些其它实施方案，所述细胞在细胞表面处表达这样的CD20，其(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述细胞与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述细胞是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述细胞选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于某些其它实施方案，被称作(1)“细胞”、(2)“与CD20物理偶联的细胞”、(3)“在细胞表面表达CD20的细胞”、(4)“CD20阳性的细胞”、(5)“多个细胞”、(6)“多个与CD20物理偶联的细胞”、(7)“细胞群体”、(8)“CD20阳性细胞群体”或(9)“一个或多个细胞”的细胞和细胞群体是这样的细胞或细胞群体：其(a)与细胞外CD20物理偶联；(b)在细胞表面表达CD20，所述CD20(i)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(ii)具有跨膜结构域，和(iii)保持与所述细胞物理偶联；(c)是CD20阳性的；(d)与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分；(e)是B-细胞谱系的后代或成员；和/或(f)是以下一种或多种：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
本发明的任意组合物用于疾病、障碍和/或病症的诊断、预后和/或表征的用途是在本发明范围内。在本发明的某些实施方案中是根据本发明的一种或多种组合物(例如本发明的药物组合物)在癌症、肿瘤、异常生长条件和/或免疫病症的治疗或预防中的用途。在本发明的某些实施方案中是根据本发明的一种或多种组合物(例如本发明的药物组合物)在药物制备中的用途，所述药物用于癌症、肿瘤、异常生长条件和/或免疫病症的治疗或预防。
本发明还提供了治疗受试者中的疾病、障碍和/或病症的方法，所述方法包括下述步骤：给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的多价CD20结合分子、本发明的多价CD20结合分子组合物和/或本发明的药物组合物。对于本发明的这些治疗方法的某些实施方案，要使用本发明的方法治疗的疾病、病症或病患涉及在细胞表面表达CD20的细胞、癌症细胞、肿瘤细胞和/或免疫细胞。对于本发明的这些治疗方法的某些实施方案，要使用本发明的方法治疗的疾病、病症或病患是癌症、肿瘤、异常生长条件和/或免疫病症。对于本发明的这些治疗方法的某些实施方案，要治疗的疾病选自：血液学癌症、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和骨髓瘤。对于本发明的这些治疗方法的某些实施方案，要治疗的免疫病症选自：淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植物排斥、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、格雷夫斯眼病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒症综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化、视神经脊髓炎谱群障碍、N-甲基D-天冬氨酸酯(NMDA)受体脑炎、眼球阵挛肌阵挛综合征(OMS)、阵发性夜间血红蛋白尿、结节性多动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、巩膜炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和血管炎。对于本发明的这些治疗方法的某些实施方案，要治疗的癌症选自：急性髓样白血病(急性髓性白血病或AML)、急性非淋巴细胞白血病、B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-细胞CLL)、B-细胞淋巴瘤、B-细胞非霍奇金淋巴瘤(B-细胞NHL)、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病(BCP-ALL或B-ALL)、B-细胞幼淋巴细胞白血病(B-PLL)、伯基特淋巴瘤(BL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL或DLBL)、滤泡淋巴瘤(FL)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL或HD)、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤(NLPHL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞赘瘤、浆细胞性骨髓瘤、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤(B-LBL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGLL)、T-细胞淋巴瘤(TCL)、T-细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。
在本发明的某些实施方案中是一种生产本发明的多价CD20结合分子和/或多价CD20结合分子组合物的方法，所述方法包括下述步骤：使用亲和纯化步骤(例如，基于壳多糖结合相互作用)纯化多价CD20结合分子或其蛋白组分。对于某些其它实施方案，所述亲和纯化步骤使用壳多糖结合相互作用。对于某些其它实施方案，所述方法的纯化步骤涉及这样的分子：所述分子包含在SEQ ID NO：4-304中所示的分子中的任一种或基本上由其组成。
在本发明的某些实施方案中是一种使用包含检测促进剂的本发明的多价CD20结合蛋白的方法，所述检测促进剂用于收集在疾病、病症或病患的诊断、预后或表征中有用的信息。在本发明的某些实施方案中是一种使用本发明的多价CD20结合蛋白和/或诊断组合物检测细胞的方法，所述方法包括以下步骤：使细胞与本发明的多价CD20结合蛋白和/或诊断组合物接触，和检测所述多价CD20结合分子和/或诊断组合物的存在。对于某些实施方案，所述接触细胞的步骤在体外和/或离体进行。对于某些实施方案，所述接触细胞的步骤在体内进行。对于某些实施方案，所述检测细胞的步骤在体外和/或离体进行。对于某些实施方案，所述检测细胞的步骤在体内进行。
在本发明的某些实施方案中是试剂盒，其包含根据本发明的组合物和任选的使用说明书、额外试剂和/或药物递送装置。
参考以下描述、所附权利要求和附图，会更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点。本发明的前述要素可以单个地组合或自由地除去以便形成本发明的其它实施方案，在下文中没有反对这样的组合或除去的任何陈述。
附图说明
图1(图1A和1B)显示了本发明的示例性多价CD20结合分子的示意图，所述多价CD20结合分子各自包含两个CD20结合区域。图1A显示了本发明的示例性多价CD20结合分子的示意图，其中小垂直线可以代表任意合适类型的分子结合，例如，单个共价键如二硫键或接头，无论是柔性的还是刚性的；且曲线可以代表任意合适类型的分子结合，例如，柔性接头。图1B显示了本发明的示例性多价CD20结合分子的示意图，所述多价CD20结合分子各自包含两个从免疫球蛋白来源的CD20结合区域，且具有由免疫球蛋白来源的CD20结合区域之间的分子间结构域切换引起的非共价分子间结合的实施例。在图1B中，较重的实线代表任意合适类型的分子结合，例如，共价键或接头；且较轻的实线代表CD20结合区域组分的免疫球蛋白来源的结构域之间的连接，例如，单个共价键或50个氨基酸残基接头。图1中的示意图显示了本发明的多价CD20结合分子的示例形式，其可以代表不同的结构形式，包括单体的、异源二聚体的和/或同源二聚体的形式，例如，通过所述分子的两个组分(例如，志贺毒素A亚基效应物区域和/或CD20结合区域)之间的多肽间二硫键稳定化的同源二聚体形式。
图2图示了通过尺寸排阻层析法(SEC)分析的本发明的不同示例性组合物中的本发明的不同示例性多价CD20结合分子的大小。另外，图2显示了通过SEC分析的本发明的不同示例性组合物的纯度。关于三种不同样品的SEC分析，将按毫-吸光度单位(mAU)计的流动穿过SEC柱以后洗脱的物质在280纳米(nm)的紫外线吸光度相对于洗脱体积(mL)绘图。
图3显示了来自在还原或非还原条件下制备的本发明的示例性多价CD20结合分子组合物的本发明的示例性多价CD20结合分子的电泳以后，考马斯染色的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶。图3显示了通过凝胶电泳分析的本发明的不同示例性多价CD20结合分子的大小和在本发明的不同示例性组合物中存在的蛋白性分子的相对纯度。
图4图示了本发明的示例性多价CD20结合分子组合物和单价CD20结合蛋白组合物对CD20阳性的(CD20+)人肿瘤来源的细胞的结合亲和力特征。将代表细胞结合的CD20结合蛋白的量的平均荧光强度相对于分析的多价CD20结合蛋白(按纳克/毫升计，ng/mL)的样品浓度绘图。
图5图示了在体外翻译测定中以蛋白合成的零抑制的百分比计算的本发明的不同示例性多价CD20结合分子和单价CD20结合蛋白的核糖体抑制活性。将零蛋白合成活性的蛋白合成的百分比相对于在分析的每个样品中存在的志贺毒素组分的摩尔浓度(按皮摩尔计)的以10为底数的对数绘图。
图6图示了与包含那些示例性多价CD20结合分子组合物的示例性多价CD20结合分子的单价CD20结合蛋白组分的组合物的细胞毒性相比，示例性多价CD20结合分子组合物对CD20+人来源的肿瘤细胞的细胞毒性。将活细胞的百分比相对于CD20结合蛋白浓度(按纳克/毫升计，ng/mL)的以10为底数的对数绘图。
图7图示了与包含该示例性多价CD20结合分子组合物的示例性多价CD20结合分子的单价CD20结合蛋白组分的组合物相比，示例性多价CD20结合分子组合物对CD20+人肿瘤来源的细胞的细胞毒性。另外，图7显示了包含单价和多价CD20结合分子的混合物的组合物的细胞毒性。将细胞的生存力百分比相对于CD20结合蛋白浓度(按纳克/毫升计，ng/mL)的以10为底数的对数绘图。
图8图示了经纯化的CD20结合蛋白组合物的多种固定比率的混合物对CD20+人肿瘤来源的细胞的细胞毒性。将细胞的生存力百分比相对于CD20结合蛋白浓度(按纳克/毫升计，ng/mL)的以10为底数的对数绘图。
图9图示了一种示例性多价CD20结合蛋白组合物和经纯化的CD20结合蛋白组合物的固定比率混合物对CD20阴性的(CD20-)人肿瘤来源的细胞的细胞毒性。将细胞的生存力百分比相对于CD20结合蛋白浓度(按纳克/毫升计，ng/mL)的以10为底数的对数绘图。
图10图示了在它们的多价CD20结合分子与单价CD20结合蛋白的比例方面存在差异的不同多价CD20结合蛋白组合物对CD20+人肿瘤来源的细胞的细胞毒性(按CD50浓度计)。将不同的固定比率的CD20结合蛋白混合物的CD50值(按纳克/毫升计，ng/mL)相对于在试验的样品中存在的多价(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物的蛋白浓度百分比绘图。另外，图10显示了使用线性回归统计建模拟合至数据点的直线和得到的该拟合线的决定系数(R的平方)。
图11图示了在它们的多价CD20结合分子与单价CD20结合蛋白的比例方面存在差异的不同多价CD20结合蛋白组合物对CD20+人肿瘤来源的细胞的细胞毒性(按CD50浓度计)。将不同的固定比率的CD20结合蛋白混合物的CD50值(按纳克/毫升计，ng/mL)相对于在试验的样品中存在的多价(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物的蛋白浓度百分比绘图。
图12图示了通过尺寸排阻层析法(SEC)分析的存在于本发明的不同示例性多价CD20结合分子组合物中的分子的大小和比例。关于SEC分析，将按毫-吸光度单位(mAU)计的流动穿过SEC柱以后洗脱的物质在280纳米(nm)的紫外线吸光度相对于洗脱时间(分钟)绘图。使用软件鉴别280nm迹线中的各个峰和在280nm的紫外线的每个峰的最大吸光度的保留时间。
具体实施方式
在下文中使用示例性的、非限制性的实施方案和参照附图更充分地描述本发明。但是，本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应被理解为限于下面阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案使得本公开内容更透彻并且将本发明的范围传递给本领域技术人员。
为了可以更容易地理解本发明，在下面定义某些术语。在发明详述内可以发现另外的定义。
如在说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另外清楚地指明，术语“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。
如在说明书和所附权利要求书中使用的，当提及两种物质A和B时，术语“和/或”是指A和B中的至少一种。如在说明书和所附权利要求书中使用的，当提及超过两种物质诸如A、B和C时，术语“和/或”是指A、B、或C中的至少一种，或A、B、或C的任何组合中的至少一种(每种物质以单个或多个可能性存在)。
贯穿本说明书，词语“包含”或变体诸如“包括”或“含有”应理解为暗示包括所述的整数(或组分)或整数(或组分)的组，但是不排除任何其它整数(或组分)或整数(或组分)的组。
贯穿本说明书，术语“包括”用于指“包括、但不限于”。“包括”和“包括、但不限于”互换使用。
术语“氨基酸残基”或“氨基酸”包括对掺入蛋白、多肽或肽中的氨基酸的提及。术语“多肽”包括氨基酸或氨基酸残基的任何聚合物。术语“多肽序列”表示在物理上构成多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基。“蛋白”是包含一个或多个多肽或多肽“链”的大分子。“肽”是尺寸小于约15-20个氨基酸残基的小多肽。术语“氨基酸序列”表示在物理上构成肽或多肽的一系列氨基酸或氨基酸残基，取决于长度。除非另有说明，本文中公开的多肽和蛋白序列从左至右书写，代表它们从氨基端至羧基端的次序。
术语“氨基酸”、“氨基酸残基”、“氨基酸序列”或多肽序列包括天然存在的氨基酸(包括L和D立体异构体(isosteriomer))，且除非另有限制，也包括可以以与天然存在的氨基酸类似方式起作用的天然氨基酸的已知类似物，例如硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、羟脯氨酸8-羟-2，7，10-三氨基癸酸(hypusine)、焦谷氨酸和硒代甲硫氨酸。用如下表A中的简写名称描述在本文中提及的氨基酸：
表A.氨基酸命名法
关于多肽的短语“保守置换”表示多肽的氨基酸组成的变化，所述变化不会实质上不改变整体多肽的功能和结构(参见Creighton，Proteins：Structures and MolecularProperties(W.H.Freeman and Company，New York(第2版，1992))。
本文中使用的术语“表达”及其语法变体表示多核苷酸或核酸翻译成多肽或蛋白。表达的多肽或蛋白可以保留在细胞内，变成细胞表面膜的组分，或者被分泌进细胞外空间中。
如本文中使用的，短语“表达CD20的细胞”的含义包括在细胞表面表达包含跨膜结构域的CD20分子的任何细胞。
如本文中使用的，在至少一个细胞表面表达显著量的CD20的细胞是“CD20阳性细胞”或“CD20+细胞”，并且是与细胞外靶生物分子CD20物理偶联的细胞。在下面在部分III-B中定义了显著量的CD20。
本文中使用的符号“α”是能够与该符号后的生物分子结合的免疫球蛋白型结合区域的简写。符号“α”用于表示免疫球蛋白型结合区域的功能特性，这基于它与该符号后的生物分子结合的能力。
符号“：：”是指在它前面和后面的多肽区域物理地连接在一起以形成连续多肽。
就本发明的目的而言，术语“效应物”是指提供生物活性，诸如细胞毒性、生物信号传递、酶促催化、亚细胞按路线发送、和/或导致一种或多种因子的募集的分子间结合、和/或变构效应。
本文中使用的短语“多价CD20结合分子”表示包含两个或更多个高亲和力CD20结合区域的一个CD20结合分子或多个CD20结合分子，例如，包含两个或更多个CD20结合区域的蛋白，其中每个单独结合区域对CD20的细胞外部分具有10-5至10-12摩尔/升的解离常数。
本文中使用的短语“多价CD20结合蛋白”表示包含两个或更多个高亲和力CD20结合区域的一个CD20结合蛋白分子或多个CD20结合蛋白分子，例如，包含两个或更多个CD20结合区域的蛋白，其中每个单独结合区域对CD20的细胞外部分具有10-5至10-12摩尔/升的解离常数。
就本发明的目的而言，短语“源自”是指，所述多肽区域包含最初在蛋白中发现的氨基酸序列，且其现在可能包含相对于原始序列的添加、缺失、截短、重排或其它改变，只要总功能和结构是基本上保守的。
就本发明的目的而言，志贺毒素效应物功能是由源自志贺毒素A亚基的多肽区域赋予的生物活性。志贺毒素效应物功能的非限制性例子包括细胞内化、亚细胞按路线发送、催化活性和细胞毒性。志贺毒素催化活性包括，例如，核糖体灭活、蛋白合成抑制、N-糖苷酶活性、多核苷酸：腺苷糖苷酶活性、RNA酶活性和DNA酶活性。志贺毒素是核糖体灭活蛋白(RIP)。RIP可以将核酸、多核苷、多核苷酸、rRNA、ssDNA、dsDNA、mRNA(和聚腺苷酸)和病毒核酸脱嘌呤化(参见例如Brigotti M等人，Toxicon 39：341-8(2001)；Brigotti M等人，FASEBJ 16：365-72(2002))。有些RIP表现出抗病毒活性和超氧化物歧化酶活性。已经在体外和在体内观察到志贺毒素催化活性。针对志贺毒素效应物活性的测定的非限制性例子测量蛋白合成抑制活性、脱嘌呤化活性、细胞生长的抑制、细胞毒性、超螺旋化的DNA松弛活性和核酸酶活性。
本文中使用的志贺毒素效应物功能的保留表示，如通过具有再现性的适当定量测定所测量的，与野生型志贺毒素效应物区域对照相当的志贺毒素功能活性水平。对于核糖体抑制，志贺毒素效应物功能是表现出10,000皮摩尔(pM)或更低的IC50。对于在靶阳性细胞杀死测定中的细胞毒性，取决于细胞类型和其对适当的细胞外CD20靶生物分子的表达，志贺毒素效应物功能是表现出1,000纳摩尔(nM)或更低的CD50。
如本文中使用的，“显著的”志贺毒素效应物功能的保留表示，如通过具有再现性的适当定量测定所测量的，与野生型志贺毒素效应物多肽对照相当的志贺毒素功能活性水平。对于体外核糖体抑制，显著的志贺毒素效应物功能是表现出300pM或更低的IC50，取决于核糖体的来源(例如，细菌、古细菌(archaea)或真核生物(藻类，真菌，植物或动物))。与催化灭活的SLT-1A 1-251双重突变体(Y77S/E167D)的100,000pM的IC50相比，这是显著更大的抑制。对于在实验室细胞培养物中的靶阳性细胞杀死测定中的细胞毒性，显著的志贺毒素效应物功能是表现出100、50或30nM或更低的CD50，取决于细胞系和其对适当的细胞外CD20靶生物分子的表达。与单独的没有细胞靶向结合区域的SLT-1A亚基(其具有100-10,000nM的CD50，取决于细胞系)相比，这是对适当的靶细胞系显著更大的细胞毒性。
对于一些样品，由于不能收集必要的数据点进行准确的曲线拟合，IC50或CD50的准确值可能是不可获得的。例如，在理论上，如果在给定样品的浓度系列中分别不发生大于50％的核糖体抑制或细胞死亡，那么不可以确定IC50或CD50。当确定显著的志贺毒素效应物功能活性时，不应该考虑不准确的IC50和/或CD50值。如在来自示例性志贺毒素效应物功能测定(例如，在下文实施例中所述的测定)的数据的分析中描述的不足以准确地拟合曲线的数据不应该被认为代表实际的志贺毒素效应物功能。
不能检测志贺毒素效应物功能的活性可能是由于不适当的表达、多肽折叠、和/或多肽稳定性，而不是缺少细胞进入、亚细胞按路线发送和/或酶活性。志贺毒素效应物功能的测定可能不需要很多本发明的多价CD20结合分子来测量显著量的志贺毒素效应物功能活性。在凭经验确定低或没有效应物功能的潜在的原因与蛋白表达或稳定性相关的程度上，本领域技术人员可以能够使用本领域已知的蛋白化学和分子工程改造技术抵消这些因素，使得志贺毒素功能性效应物活性可以被恢复并测量。例如，基于不适当的细胞的表达可以通过使用不同的表达控制序列进行抵消；不适当的多肽折叠和/或稳定性可以受益于稳定末端序列、或稳定蛋白的三维结构的非效应物区域中的补偿性突变等。当关于单一志贺毒素功能的新测定变得可用时，可以针对任意水平的那些志贺毒素效应物功能(诸如针对是在野生型志贺毒素效应物多肽的活性的某倍活性内)来分析志贺毒素效应物区域或多肽。有意义的活性差异的例子是，例如，这样的志贺毒素效应物区域：其具有野生型志贺毒素效应物多肽的活性的1000倍或100倍或更低；或其具有与功能性敲低或敲除的志贺毒素效应物多肽相比3倍至30倍或更多的活性。
某些志贺毒素效应物功能是不容易测量的，例如，亚细胞按路线发送功能。目前没有常规的定量测定来区分志贺毒素效应物多肽不具有细胞毒性是否是由于不适当的亚细胞按路线发送，但是，在试验可用的时候，可以与适当的野生型志贺毒素效应物区域相比针对任何显著水平的亚细胞按路线发送来分析志贺毒素效应物多肽。
应当指出，即使志贺毒素效应物多肽的细胞毒性相对于野生型减小，但是在实践中，使用减弱的志贺毒素效应物多肽的应用可以与使用野生型志贺毒素效应物多肽的那些应用同样有效或更有效，因为最高效能变体可能表现出不希望的作用，其在效能降低的变体中最小化或减小。野生型志贺毒素效应物多肽是非常有效的，能够仅以到达胞质溶胶的一个分子或被内化的大约40个分子杀死(Tam P，Lingwood C，Microbiology 153：2700-10(2007))。与野生型志贺毒素效应物多肽相比具有甚至相当大地减小的志贺毒素效应物功能(例如，亚细胞按路线发送或细胞毒性)的志贺毒素效应物多肽，对于涉及靶向细胞杀死和/或特定细胞类型的某些亚细胞区室的检测的实际应用可能仍然是足够有效的。并且这样的效应物多肽还可能用于将负荷(例如额外外源物质)递送至某些细胞内位置或亚细胞区室。
关于细胞毒性的多价CD20结合分子的细胞毒性活性，术语“选择性细胞毒性”表示靶向细胞群体和非靶向的旁观者细胞群体之间的相对细胞毒性水平，其可以被表示为靶向细胞类型的半数最大细胞毒性浓度(CD50)与非靶向的细胞类型的CD50之比，以显示靶向细胞类型的细胞杀死的优先性作为选择性的度量。
如在本文的说明书和权利要求中使用的，短语“适合所述细胞的生理温度”表示本领域已知的和/或技术人员可鉴别的落在适合该特定细胞或细胞类型的健康生长、繁殖和/或功能的范围内的温度；其对应于所述细胞的来源物种的体核温度；和/或对应于包含所述细胞的健康活生物体。例如，约37℃的温度对于许多哺乳动物细胞而言是适当的，取决于物种。
就本发明的目的而言，短语“包含与CD20结合的多价CD20结合分子的分子复合物的内化”是指所述多价CD20结合分子的细胞内化是CD20介导的，因为所述内化开始于在细胞外位置形成复合物的多价CD20结合分子和细胞表面CD20且终止于所述多价CD20结合分子和CD20分子进入细胞中然后所述多价CD20结合分子从所述多价CD20结合分子已经结合的CD20分子解离。
就本发明的目的而言，短语“天然地存在于细胞表面上的CD20”是指，细胞使用它自身的蛋白合成机制表达CD20分子并使用它自身的细胞内按路线发送机制将所述CD20分子定位至细胞表面，使得所述CD20分子与所述细胞物理偶联，且所述CD20分子的至少一部分可从细胞外空间(即在细胞的表面上)接触。
就本发明的某些实施方案的目的而言，在以下情况下认为细胞内化是快速的：如在相同温度使用相同细胞类型通过相同测定所确定的，在相同CD20占据百分比，与现有技术参考分子的内化时间相比，由于本发明的多价CD20结合分子的结合，使发生内化的时间缩短。
如在本文的说明书和权利要求中使用的，短语“快速细胞内化”表示，如通过本领域中已知的或本文描述的许多细胞内化测定中的任一种所测得的，与细胞外CD20抗原或细胞表面定位的CD20分子的细胞内化所需的平均时间相比，本发明的多价CD20结合分子减少细胞外CD20抗原或细胞表面定位的CD20分子的细胞内化的平均时间的能力。
如在本文的说明书和权利要求中使用的，短语“快速内化”包括，与基础CD20内化速率和/或施用本领域已知会结合CD20的细胞外部分的免疫球蛋白-型结合分子(例如单克隆抗体)以后分子结合诱导的CD20的内化速率相比可以测定的内化。短语“快速细胞内化”的范围意图包括，平均而言，比当试验具有Fc区的CD20-特异性抗体或免疫球蛋白来源的蛋白分子时所观察到的那些更快的内化速率。一般而言，可以将内化速率常数定义为将CD20-特异性的目标结合分子施用给CD20阳性细胞以后发生以下情况的时间：50％的细胞表面CD20抗原、CD20分子和/或CD20-特异性的结合分子在给定的施用的浓度、质量、摩尔浓度或CD20占据调节过的浓度和在特定温度内化至特定细胞类型。通过技术人员已知的多种方法(参见例如Press O等人，Blood.83：1390-7(1994)；Golay J等人，Blood 98：3383-9(2001)；Goulet A等人，Blood 90：2364-75(1997)；Manches O等人，Blood 101：949-54(2003)；HessG等人，Biochim Biophys Acta 1773：1583-8(2007)；Baskar S等人，Clin Cancer Res 14：396-404(2008)；Luqman M等人，Blood 112：711-20(2008))，可以测定细胞表面CD20内化，无论是基础地还是响应于CD20结合分子的施用。
就本发明的某些实施方案的目的而言，在以下情况下认为细胞内化是快速的：与利用充分表征的识别CD20抗原的抗体(诸如αCD20单克隆抗体1H4)(Haisma H等人，Blood92：184-90(1999))的结合的靶CD20分子的内化时间相比，由本发明的多价CD20结合分子的结合引起的发生内化的时间缩短。例如，CD20抗原(尽管对于细胞类型和抗体类型而言是可变的)的内化计时通常不会在结合以后大约6小时或更多之前开始达到最大水平。因而，贯穿本说明书使用的术语“快速”意图指示，本发明的多价CD20结合分子在小于6小时中进入一个或多个表达CD20的和/或CD20阳性的细胞。在某些实施方案中，快速可以快至小于约30分钟，但是还可以包括约1小时至约2小时、至约3小时、至约4小时、至约5小时的范围；约2小时至约3小时、至约4小时、至约5小时的范围；约3小时至约4小时、至约5小时的范围；和约4小时至约5小时的范围。
就本发明的目的而言，关于包含两个或更多个连接在一起的组分的分子，短语“一个或多个非共价键”包括连接所述组分的键的类型，当将所述分子从天然蛋白折叠条件改变至蛋白变性条件时，在某些分子中可以观察到所述键被消除(即，不再连接两个或更多个组分)。例如，当使用本领域已知的和/或本文描述的用于测定蛋白性分子的大小的技术(例如，电泳和/或层析测定)时，在天然蛋白折叠条件(例如pH-缓冲的环境意图与真核细胞的内质网腔或生物体内的细胞外环境类似)下作为单一大小物质出现的多组分分子也可以视作在变性条件下和/或处于变性条件以后由两种或更多种较小尺寸的蛋白性分子组成。“蛋白变性”条件是技术人员已知的，且包括显著地不同于天然蛋白折叠条件的条件，例如，具有高温(例如，大于50摄氏度)的环境和/或以化学变性剂和/或去污剂(例如，1-10％十二烷基硫酸钠、聚山梨酯、十二烷基肌氨酸钠和其它去污剂，无论是离子的、非离子的、两性离子的和/或离液的)的存在为特征的那些。
如本文中使用的，关于描述蛋白和/或蛋白性分子，术语“单体的”表示仅包含一个多肽组分的分子，所述多肽组分由单个连续多肽(不论它的二级结构或三级结构)组成，所述连续多肽可以由核糖体从单个多核苷酸模板合成，包括在以后形成环状结构的连续直链多肽。相反，多聚体分子可以包含两个或更多个多肽(例如亚基)，所述多肽在一起不会形成可以由核糖体从单个多核苷酸模板合成的多聚体的单个连续多肽。
如本文中使用的，关于描述蛋白和/或蛋白性分子，术语“多聚体的”表示包含两个或多个结合在一起和/或连接在一起的单独多肽组分的分子，例如，由两个组分组成的分子，每个组分本身是连续多肽。例如，分子的组分之间的结合或连接可以包括1)一种或多种非共价相互作用；2)一种或多种翻译后共价相互作用；3)一种或多种共价化学缀合；和/或4)一种或多种共价相互作用，其产生包含非直链多肽的单个分子，例如，由两个或更多个多肽组分的排列产生的支链或环状多肽结构。由于通过核糖体从单个多核苷酸模板合成的单个连续多肽中的一个或多个肽键的蛋白水解性裂解而包含两个不连续多肽的分子是“多聚体的”和非“单体的”。
本文中使用的短语“CD20结合分子组合物”表示这样的组合物：其包含至少一类CD20结合分子，且可以通常包含两类或更多类CD20结合分子，其中每类CD20结合分子在所述组合物中具有可重复测量的表现，例如，至少1％(按质量)的最丰富类型的CD20结合分子。短语“CD20结合分子组合物”包括这样的组合物：其仅包含一类CD20结合分子，不存在其它类型的蛋白性分子(例如包含占存在的总蛋白性分子的100％的单一类型的CD20结合分子的组合物)。
前言
本发明提供了用于细胞靶向的多价CD20结合分子，其包含与多个异源CD20结合区域结合的志贺毒素-亚基-A来源的区域。另外，本发明提供了富含本发明的多价CD20结合分子的组合物(例如与单价CD20结合分子相比包含相对大比例的多价CD20结合分子的组合物)。本发明基于下述发现：以从对表达CD20的细胞的结合亲和力和/或CD20结合价的差异不可预测到的方式，几种多价CD20结合分子对表达CD20的细胞的细胞毒性远远大于单价CD20结合蛋白组分(参见下文实施例)。
如在实施例中更详细地描述的，与使用等量的单价CD20结合变体及其某些组合物测量的结果相比，某些示例性多价CD20结合分子及其组合物表现出意外地大的细胞毒性潜能。不受理论的约束，与某些1)单价CD20结合分子及其组合物、2)缺乏毒素效应物区域(例如，志贺毒素A亚基效应物多肽)的多价CD20结合分子和/或包含含有志贺毒素A亚基效应物多肽的单价CD20结合分子与总CD20结合分子的高比例的组合物相比，本发明的多价CD20结合分子及其组合物可能具有改善的以下能力：内化进表达CD20的细胞中，在细胞内按路线发送至特定亚细胞区室和/或将活性毒素效应物多肽区域(例如，志贺毒素A亚基效应物多肽)递送至胞质溶胶。
I.本发明的多价CD20结合分子的一般结构
本发明提供了用于靶向细胞内化进表达CD20的细胞类型中的多种多价CD20结合分子。本发明的CD20结合分子包含1)两个或更多个CD20结合区域，每个能够特异性地结合CD20的细胞外部分，和2)至少一个志贺毒素效应物区域，其包含从志贺毒素家族的至少一个成员的A亚基的氨基酸序列来源的多肽。多个细胞靶向CD20结合区域与志贺毒素-亚基-A-来源的区域的连接使得有效志贺毒素细胞毒性能够特异性地靶向CD20+细胞类型。本发明也提供了多种包含大比例的本发明的多价CD20结合分子的组合物，其用于涉及靶向细胞内化进表达CD20的细胞类型中的用途。
本发明的某些多价CD20结合分子及其组合物是细胞毒性的，而其它则不是，例如，用于标记表达CD20的细胞的内部。本发明的某些多价CD20结合分子及其组合物可以将额外外源物质递送进表达CD20的细胞中，且可以独立于志贺毒素效应物区域的活性导致或不导致细胞毒性。
A.本发明的多价CD20结合分子的CD20结合区域
本发明的多价CD20结合分子包含两个或更多个CD20结合区域，其中每个结合区域包含能够特异性地结合CD20分子的细胞外部分的肽或多肽区域。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含两个或更多个CD20结合区域，其中每个结合区域包含能够特异性地结合CD20分子的细胞外部分的肽或多肽区域，所述CD20分子与细胞物理结合。所述CD20结合区域可以包含一个或多个不同的肽或多肽部分，诸如随机地产生的肽序列、天然存在的配体或其衍生物、免疫球蛋白来源的结构域、作为免疫球蛋白结构域的替代物的经工程改造的支架等。
就本发明的目的而言，术语“CD20结合区域”表示本发明的分子的蛋白性(例如，肽和/或多肽)区域，其能够以高亲和力(例如，具有10-5至10-12摩尔/升的关于CD20的解离常数)特异性地结合CD20分子的细胞外部分。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子的结合区域包含能够选择性地和特异性地结合CD20的细胞外部分的多肽，所述CD20在细胞表面处表达且与细胞物理结合。在某些实施方案中，所述CD20结合区域包含CD20分子的天然存在的配体或其保留与CD20的细胞外部分的结合功能性的衍生物。根据某些其它实施方案，所述CD20结合区域包含能够以高亲和力与CD20的细胞外部分结合的合成配体。
尽管名称CD20可能表示来自多个物种的具有有关结构和多肽序列的多种蛋白，但是为了本发明的目的，术语“CD20”表示存在于哺乳动物中的B-淋巴细胞抗原CD20蛋白，其确切序列可能基于异形体稍微变化并在个体之间变化。如本领域中公认的，CD20的替代名称包括B-淋巴细胞表面抗原B1、Leu-16和Bp35。例如，在人类中，CD20表示由优势多肽序列UnitProt P11836和NCBI accession NP 690605.1代表的蛋白；但是，可能存在不同的异形体和变体。已经描述了来自不同物种(诸如来自蝙蝠、猫、牛、狗、小鼠、绒猴和大鼠)的CD20蛋白的多肽序列，且可以基于遗传同源性通过生物信息学在众多其它物种中预测(例如已经在不同的灵长类动物中预测CD20，所述灵长类动物包括狒狒、猕猴、长臂猿、黑猩猩和大猩猩)(参见NCBI蛋白数据库(National Center for Biotechnology Information，U.S.))。技术人员将能够鉴别哺乳动物中的CD20相关蛋白，即使它不同于所述序列。
CD20由处于某些细胞发育阶段的B-细胞表达，所述B-细胞导致非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)；但是，CD20不在造血干细胞上或成熟的浆细胞上表达(van Meerten T等人，Clin Cancer Res 12：4027-35(2006))。CD20的一个有吸引力的特征是，它代表淋巴瘤细胞的一种准通用靶标，因为在大约90％的B-细胞非霍奇金淋巴瘤上表达(Anderson K等人，Blood 63：2825-33(1984)；Press O等人，Cancer Res 49：4906-12(1989)；Press O等人，Blood.83：1390-7(1994)；Manches O等人，Blood 101：949-54(2003))。CD20的其它有吸引力的特征是它在淋巴瘤细胞的质膜上的高表达和它的紧密靠近质膜的多个细胞外CD20抗原性表位(Teeling J等人，J Immunol 177：362-71(2006)；LimS等人，Haematologica 95：135-43(2010))。
CD20分子的细胞外部分表示，当CD20分子存在于细胞膜中时(例如，在细胞表面处天然地表达的CD20分子)，它的暴露于细胞外环境的结构的一部分。在该背景下，暴露于细胞外环境是指，CD20分子的组成部分可被例如抗体或至少比抗体小的结合部分接近，所述结合部分是诸如单结构域抗体结构域、纳米抗体、从骆驼科或软骨鱼来源的重链抗体结构域、单链可变片段或免疫球蛋白的任何数目的经工程改造的替代支架(参见下文)。向细胞外环境的暴露或对与细胞物理偶联的CD20的一部分的可达性，可以由技术人员使用本领域众所周知的方法凭经验确定。应当指出，凭经验证实CD20的某个部分(基于它在CD20内的表位定位，据预测它不可被细胞外空间中的抗体接近)可被单克隆抗体接近(Teeling J等人，J.Immunol.177：362-71(2006))。
CD20结合区域可以源自抗体或抗体样结构；但是，预见到来自其它来源的替代支架作为在本发明范围内的CD20结合区域的来源。在某些实施方案中，所述CD20结合区域源自免疫球蛋白来源的结合区域，诸如抗体互补位。在某些其它实施方案中，所述CD20结合区域包含这样的免疫球蛋白型结合区域：其为非源自任何免疫球蛋白结构域的经工程改造的多肽。
根据一个具体的、但是非限制性的方面，所述CD20结合区域可以包含免疫球蛋白型结合区域。本文中使用的术语“免疫球蛋白型结合区域”表示能够结合一个或多个靶生物分子(诸如抗原或表位)的多肽区域。免疫球蛋白型结合区域在功能上由它们的结合靶分子的能力来限定，并且本发明的所有免疫球蛋白型结合区域能够结合CD20。免疫球蛋白型结合区域通常源自抗体或抗体样结构；但是，预见到来自其它来源的替代支架在该术语的范围内。
免疫球蛋白(Ig)蛋白具有被称为Ig结构域的结构域。Ig结构域的长度范围为约70-110个氨基酸残基并且拥有特征性Ig折叠，其中通常7-9个反平行的β链排列为两个形成夹心-样结构的β片。Ig折叠通过夹心的内表面上的疏水氨基酸相互作用和链中半胱氨酸残基之间的高度保守的二硫键来稳定。Ig结构域可以是可变的(IgV或V-集合)、恒定的(IgC或C-集合)或中间的(IgI或I-集合)。一些Ig结构域可能与互补性决定区或互补决定区(CDR)有关，所述CDR也被称作抗原结合区(ABR)，对于抗体与它们的表位的结合的特异性而言是重要的。Ig-样结构域也存在于非免疫球蛋白蛋白中，并且基于此被分类为Ig蛋白超家族的成员。HUGO基因命名委员会(HGNC)提供了含有Ig-样结构域的家族的成员的清单。
本文中使用的术语“重链可变(VH)结构域”或“轻链可变(VL)结构域”分别表示任何抗体VH或VL结构域(例如人VH或VL结构域)及其至少保留相应天然抗体的定性抗原结合能力的任何衍生物(例如，从天然鼠VH或VL结构域来源的人源化VH或VL结构域)。VH或VL结构域由被三个CDR或ABR中断的“框架”区组成。所述框架区用于对齐CDR用于特异性结合抗原的表位。从氨基端到羧基端，VH和VL结构域均包含以下框架(FR)和CDR区域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。对于骆驼科VHH片段、软骨鱼的IgNAR、VNAR片段、以及它们的衍生物，存在包含相同基本排列的单一重链可变结构域：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
免疫球蛋白型结合区域可以是抗体或其抗原结合片段的多肽序列，其中例如通过分子工程改造或文库筛选，所述氨基酸序列已经与天然抗体或非免疫球蛋白蛋白的Ig-样结构域的氨基酸序列有所不同。因为重组DNA技术和体外文库筛选在免疫球蛋白型结合区域的产生中的关联性，可以重新设计抗体以获得期望的特征，诸如较小的尺寸、细胞进入(cell entry)、或其它治疗改善。可能的变化有很多，并且范围可以为从仅一个氨基酸的改变到例如可变区的完全重新设计。通常，将做出可变区的改变以便改善抗原结合特征、改善可变区稳定性、或降低免疫原性应答的可能。
存在众多根据本发明预见到的结合CD20的细胞外部分的免疫球蛋白型结合区域。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白型结合区域源自免疫球蛋白结合区域，诸如能够结合CD20的细胞外部分的抗体互补位。在某些其它实施方案中，所述免疫球蛋白型结合区域包含经工程改造的多肽，其不是源自任何免疫球蛋白结构域，但是其通过提供与CD20的细胞外部分的高亲和力结合象免疫球蛋白结合区域一样起作用。该经工程改造的多肽可以任选地包括多肽支架，所述多肽支架包含来自如本文中所述的免疫球蛋白的互补决定区或基本上由其组成。
在现有技术中存在众多免疫球蛋白来源的结合区域和非免疫球蛋白经工程改造的多肽，其可用于将本发明的多价CD20结合分子靶向至表达CD20的细胞。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子的免疫球蛋白型结合区域选自：自主VH结构域、单结构域抗体结构域(sdAb)、从骆驼科来源的重链抗体结构域(VHH片段或VH结构域片段)、从骆驼科VHH片段或VH结构域片段来源的重链抗体结构域、从软骨鱼来源的重链抗体结构域、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)、VNAR片段、单链可变(scFv)片段、纳米抗体(nanobodies)、由重链和CH1结构域组成的Fd片段、全突变的Fvs(pFv)、单链Fv-CH3微体、二聚体的CH2结构域片段(CH2D)、Fc抗原结合结构域(Fcab)、分离的互补决定区3(CDR3)片段、受限的框架区3、CDR3、框架区4(FR3-CDR3-FR4)多肽、小模块免疫药物(SMIP)结构域、scFv-Fc融合体、多聚化scFv片段(双体、三体、四体)、二硫键稳定化的抗体可变(Fv)片段、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的二硫键稳定化的抗原结合(Fab)片段、二价纳米抗体、二价微体、二价F(ab’)2片段(Fab二聚体)、双特异性的串联的VHH片段、双特异性的串联的scFv片段、双特异性的纳米抗体、双特异性的微体和前述物质的保留它的互补位和结合功能的任何遗传上操作的相应物(参见Ward E等人，Nature 341：544-6(1989)；Davies J，Riechmann L，Biotechnology(NY)13：475-9(1995)；Brinkmann U等人，J Mol Biol 268：107-17(1997)；Reiter Y等人，Mol Biol290：685-98(1999)；Riechmann L，Muyldermans S，J Immunol Methods 231：25-38(1999)；Tanha J等人，J Immunol Methods 263：97-109(2002)；Vranken W等人，Biochemistry 41：8570-9(2002)；Jespers L等人，J Mol Biol 337：893-903(2004)；Jespers L等人，NatBiotechnol 22：1161-5(2004)；To R等人，J Biol Chem 280：41395-403(2005)；Saerens D等人，Curr Opin Pharmacol 8：600-8(2008)；Dimitrov D，MAbs 1：26-8(2009)；Weiner L，Cell 148：1081-4(2012)；Ahmad Z等人，Clin Dev Immunol 2012：980250(2012))。存在多种包含源自免疫球蛋白的恒定区的多肽的结合区域，例如，经工程改造的二聚体Fc结构域、单体Fcs(mFcs)、scFv-Fcs、VHH-Fcs、CH2结构域、单体CH3s结构域(mCH3s)、合成地重新程序化的免疫球蛋白结构域和/或免疫球蛋白结构域与配体的杂化融合体(Hofer T等人，ProcNatl Acad Sci USA 105：12451-6(2008)；Xiao J等人，J Am Chem Soc 131：13616-13618(2009)；Xiao X等人，Biochem Biophys Res Commun 387：387-92(2009)；Wozniak-Knopp G等人，Protein Eng Des Sel 23 289-97(2010)；Gong R等人，PLoS ONE 7：e42288(2012)；Wozniak-Knopp G等人，PLoS ONE 7：e30083(2012)；Ying T等人，J Biol Chem 287：19399-408(2012)；Ying T等人，J Biol Chem 288：25154-64(2013)；Chiang M等人，J Am ChemSoc 136：3370-3(2014)；Rader C，TrendsBiotechnol 32：186-97(2014)Ying T等人，Biochimica Biophys Acta 1844：1977-82(2014))。
根据某些其它实施方案，结合区域包含免疫球蛋白结构域的经工程改造的替代支架。本领域中已知经工程改造的替代支架，其表现出与免疫球蛋白来源的结构类似的功能特征，诸如靶生物分子的高亲和力和特异性结合，并且可以为某些免疫球蛋白结构域提供改善的特征，例如，更大的稳定性或降低的免疫原性。通常，免疫球蛋白的替代支架小于20千道尔顿(kDa)，由单个多肽链组成，缺少半胱氨酸残基，并且表现出相对高的热力学稳定性。
对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，所述免疫球蛋白型结合区域选自包括以下成员的集合：经工程改造的犰狳重复多肽(ArmRP)；经工程改造的纤连蛋白来源的第10个纤连蛋白III型(10Fn3)结构域(单抗体、AdNectinsTM或AdNexinsTM)；经工程改造的生腱蛋白来源的生腱蛋白III型结构域(CentrynsTM)；经工程改造的含有锚蛋白重复基序的多肽(DARPinsTM)；经工程改造的低密度-脂蛋白-受体来源的A结构域(LDLR-A)(AvimersTM)；脂质运载蛋白(anticalins)；经工程改造的蛋白酶抑制剂来源的Kunitz结构域；经工程改造的蛋白-A来源的Z结构域(AffibodiesTM)；经工程改造的γ-B结晶-来源的支架或经工程改造的泛蛋白-来源的支架(Affilins)；Sac7d-来源的多肽(或affitins)；经工程改造的Fyn来源的SH2结构域和经工程改造的抗体模拟物和前述物质的保留它的结合功能性的任何遗传上操作的相应物(A，Plückthun A，J Mol Biol 305：989-1010(2001)；Xu L等人，Chem Biol9：933-42(2002)；Wikman M等人，Protein Eng Des Sel 17：455-62(2004)；Binz H等人，Nat Biotechnol 23：1257-68(2005)；Hey T等人，Trends Biotechnol 23：514-522(2005)；Holliger P，Hudson P，NatBiotechnol 23：1126-36(2005)；Gill D，Damle N，Curr Opin Biotech 17：653-8(2006)；Koide A，Koide S，Methods Mol Biol 352：95-109(2007)；Byla P等人，J Biol Chem 285：12096(2010)；Zoller F等人，Molecules 16：2467-85(2011)；Alfarano P等人，ProteinSci 21：1298-314(2012)；Madhurantakam C等人，Protein Sci 21：1015-28(2012)；Varadamsetty G等人，JMol Biol 424：68-87(2012))。例如，经工程改造的Fn3(CD20)是一种经工程改造的替代支架CD20结合区域，其表现出对表达CD20的细胞的高亲和力结合(Natarajan A等人，Clin Cancer Res 19：6820-9(2013))。
在本发明的某些实施方案中，缩合上免疫球蛋白型结合区域源自纳米抗体或单结构域免疫球蛋白来源的区域VHH。通常，纳米抗体由在骆驼科和软骨鱼(软骨鱼纲)中发现的种类的天然存在的单个单体可变结构域抗体(sdAb)的片段构成。通过截短单个单体可变结构域以制备更小的和更稳定的分子(例如，IgNAR、VHH和VNAR构建体)，从这些天然存在的抗体工程改造出纳米抗体。由于它们的小尺寸，纳米抗体能够结合完整抗体不可接近的抗原。在本发明的某些实施方案中，所述免疫球蛋白型结合区域源自纳米抗体或单结构域免疫球蛋白来源的区域VHH，其表现出对CD20的细胞外部分的特异性高亲和力结合。
根据某些其它实施方案，本发明的CD20结合分子的免疫球蛋白型结合区域包含这样的免疫球蛋白来源的结合区域：其不包含Fc区或保留Fc区效应物功能的任何Fc区效应物结构域。对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，所述多价CD20结合分子不包含Fc区或保留Fc功能的Fc区效应物结构域(参见下面Fc功能的实施例)。
本文中使用的短语“Fc区”表示可结晶的片段区域或Fc(片段，可结晶的区域)，其为存在于免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白同种型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)中的多肽结构域。Fc区与免疫系统的补体系统和/或存在于免疫细胞(例如，T-细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞(巨噬细胞)、肥大细胞、嗜中性粒细胞和天然杀伤细胞(NK细胞))上的Fc受体相互作用。Fc区效应物功能包括活化T-细胞、刺激炎症介质(诸如细胞因子如TNF-α)的释放、开始补体依赖性的细胞毒性(CDC)、抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)、最终的吞噬作用和可能的免疫接种效应。可以将Fc区工程改造成重组多肽和蛋白，例如，抗原结合片段与合成的F(ab’)2和Fcab中的Fc区的融合体。
不包含任何Fc区或保留Fc区效应物功能的Fc区效应物结构域的本发明的CD20结合分子可以与在其它受试者中(诸如免疫活性的患者中)同样好地在具有受损的Fc-FcyR依赖性的机制的受试者(诸如免疫受损的患者)中起作用。
以上CD20结合区域中的任一种可以用作本发明的组分，只要所述CD20结合区域组分对CD20的细胞外部分具有10-5至10-12摩尔/升的解离常数，优选地小于200nM。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含从蛋白性毒素来源的毒素效应物区域，例如，志贺毒素家族的志贺毒素A亚基。
B.本发明的多价CD20结合分子的志贺毒素效应物区域
就本发明的目的而言，短语“志贺毒素效应物区域”表示从志贺毒素家族的至少一个成员的志贺毒素A亚基来源的多肽区域，其中所述志贺毒素效应物区域能够表现出至少一种志贺毒素功能。志贺毒素功能包括，例如，促进细胞进入、使脂质膜变形、刺激网格蛋白介导的胞吞作用、指导倒退运输、指导亚细胞按路线发送、避免细胞内降解、催化灭活核糖体、实施细胞毒性和实施细胞生长抑制作用。
志贺毒素家族的成员表示在结构上和在功能上相关的天然存在的蛋白毒素的家族的任何成员，特别是从痢疾志贺菌(S. dysenteriae)和大肠杆菌(E.coli)分离的毒素(Johannes L，W，Nat Rev Microbiol 8：105-16(2010))。例如，志贺毒素家族包括从痢疾志贺菌血清型1中分离的真志贺毒素(Stx)，从肠出血性大肠杆菌的血清型分离的志贺样毒素1变体(SLT1或Stx1或SLT-1或Slt-I)，以及从肠出血性大肠杆菌的血清型分离的志贺样毒素2变体(SLT2或Stx2或SLT-2)。SLT1与Stx相差仅一个残基，并且二者都已经被称作佛罗细胞毒素或Vero细胞毒素(VT)(O’Brien A等人，Curr Top Microbiol Immunol180：65-94(1992))。尽管SLT1和SLT2变体在氨基酸序列水平上彼此仅有约53-60％的相似性，但是它们共享志贺毒素家族的成员共有的酶活性和细胞毒性机制(Johannes，Nat RevMicrobiol 8：105-16(2010))。已经描述了超过39种不同的志贺毒素，诸如定义的亚型Stx1a、Stx1c、Stx1d和Stx2a-g(Scheutz F等人，J Clin Microbiol 50：2951-63(2012))。志贺毒素家族的成员并不天然地限于任何细菌物种，因为编码志贺毒素的基因可以经由水平基因转移在细菌物种之间扩散。作为物种间转移的一个例子，在从患者分离的溶血不动杆菌(A.haemolyticus)的菌株中发现了志贺毒素(Grotiuz G等人，J Clin Microbiol 44：3838-41(2006))。一旦编码志贺毒素的多核苷酸进入新的亚种或物种，就假定志贺毒素氨基酸序列能够由于遗传漂变和/或选择压力而形成轻微的序列变化，同时仍然保持志贺毒素家族的成员共有的细胞毒性机制。
本发明的多价CD20结合分子的志贺毒素效应物区域包含源自从它的天然志贺毒素B亚基的任何形式解离的志贺毒素A亚基的多肽或基本上由其组成。另外，本发明的多价CD20结合分子不包含含有天然志贺毒素B亚基的功能性结合结构域或基本上由其组成的任何多肽。相反，所述多价CD20结合分子的志贺毒素A亚基来源的区域在功能上与异源结合区域关联以实施细胞靶向。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子的志贺毒素效应物区域可以包含全长志贺毒素A亚基(例如SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ ID NO：2)或SLT-2A(SEQ IDNO：3))或基本上由其组成，应当指出，天然存在的志贺毒素A亚基可以包含在它们的氨基端处含有约22个氨基酸的信号序列的前体形式，所述信号序列被除去以产生成熟的志贺毒素A亚基，并且是技术人员可识别的。在其它实施方案中，本发明的志贺毒素效应物区域包含比全长志贺毒素A亚基更短的截短的志贺毒素A亚基或基本上由其组成。
志贺样毒素1A亚基截短体是催化活性的，能够在体外酶促地灭活核糖体，且当在细胞内表达时是细胞毒性的。表现出完整酶活性的最小志贺毒素A亚基片段被证实是由Slt1A的残基1-239组成的多肽。尽管据报道保留实质催化活性的志贺毒素A亚基的最小片段是StxA的残基75-247，在真核细胞内从头表达的StxA截短体仅需要直到残基240以到达胞质溶胶和产生核糖体的催化灭活。
志贺毒素效应物区域通常可以小于全长志贺毒素A亚基。优选的是，志贺毒素效应物区域保留从氨基酸位置77至239的多肽区域(SLT-1A(SEQ ID NO：1)或StxA(SEQ ID NO：2))或志贺毒素家族成员的其它A亚基的等同物(例如(SEQ ID NO：3)的77-238)。例如，在本发明的某些实施方案中，源自SLT-1A的志贺毒素效应物区域可以包含SEQ ID NO：1的氨基酸75-251、SEQ ID NO：1的氨基酸1-241、SEQ ID NO：1的氨基酸1-251、或SEQ ID NO：1的氨基酸1-261，或者基本上由其组成。在某些其它实施方案中，源自StxA的志贺毒素效应物区域可以包含SEQ ID NO：2的氨基酸75-251、SEQ ID NO：2的氨基酸1-241、SEQ ID NO：2的氨基酸1-251、或SEQ ID NO：2的氨基酸1-261，或者基本上由其组成。在某些其它实施方案中，源自SLT-2的志贺毒素效应物区域可以包含SEQ ID NO：3的氨基酸75-251、SEQ ID NO：3的氨基酸1-241、SEQ ID NO：3的氨基酸1-251、或SEQ ID NO：3的氨基酸1-261，或者基本上由其组成。
在本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案中，志贺毒素效应物区域与天然存在的志贺毒素A亚基相差至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40个或更多个氨基酸残基(但是仍然保留至少85％、90％、95％、99％或更多氨基酸序列同一性)。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含从志贺毒素以外的蛋白性毒素来源的毒素效应物区域。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含单功能的志贺毒素效应物区域。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子不包含志贺毒素效应物区域。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含从志贺毒素家族的成员以外的毒素来源的毒素效应物区域，例如，从志贺毒素以外的ABx毒素、志贺毒素以外的核糖体灭活蛋白毒素、相思豆毒蛋白、炭疽毒素、Aspfl、bouganin、异株腹泻毒蛋白、cholix毒素、封闭蛋白、白喉毒素、白树毒素、热不稳定的肠毒素、米托洁林、百日咳毒素、美洲商陆抗病毒蛋白、天人菊素、假单胞菌外毒素A、局限曲菌素、蓖麻蛋白、皂草素、sarcin和subtilase细胞毒素(参见例如，WO 2015/113005；WO 2015/120058)。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子不包含毒素效应物区域或从毒素来源的任何多肽。
在本发明的多价CD20结合分子的以上实施方案中，CD20结合区域和毒素效应物多肽区域(which may be细胞毒性和/或harbor one或more突变s altering，reducing，或消除ing催化活性和/或细胞毒性)可以直接彼此连接和/或适当地经由一个或多个本领域众所周知的和/或本文描述的接头(例如，能够在本发明的多价CD20结合分子的其它蛋白性组分之间遗传上融合的蛋白性接头)彼此连接。
任选地，本发明的多价CD20结合分子还可以包含羧基端内质停留/取回信号基序，例如，在多价CD20结合分子的蛋白性组分(例如蛋白组分)的羧基端处的氨基酸KDEL。
C.连接本发明的多价CD20结合分子的组分的键
本发明的多价CD20结合分子的各个肽、多肽和/或蛋白组分(例如，CD20结合区域和志贺毒素效应物区域)可以经由一个或多个本领域众所周知的和/或本文描述的接头适当地彼此连接。本发明的多价CD20结合分子的蛋白和多肽组分(例如，多链结合区域)可以适当地彼此连接或经由一个或多个本领域众所周知的接头连接至本发明的多价CD20结合分子的其它多肽组分。本发明的多价CD20结合分子的肽组分(例如，抗原肽和KDEL家族内质网停留/取回信号基序)可以适当地经由一个或多个本领域众所周知的接头(诸如蛋白性接头)连接至本发明的另一个组分。
合适的接头通常是允许本发明的多价CD20结合分子的每个多肽组分以特定三维结构折叠的那些接头，所述特定三维结构非常类似于在没有任何接头或其它组分的情况下单独生产的多肽组分。合适的接头包括单个氨基酸、肽、多肽和缺乏前述任一种的接头，诸如各种非蛋白性的碳链，无论是分支的还是环状的(参见例如Alley S等人，BioconjugChem 19：759-65(2008)；Ducry L，Stump B，BioconjugChem 21：5-13(2010))。
合适的接头可以是蛋白性的，且包含一个或多个氨基酸、肽、和/或多肽。蛋白性接头适合用于重组融合蛋白和化学连接的缀合物。蛋白性接头通常具有约2至约50个氨基酸残基，例如，约5至约30个或约6至约25个氨基酸残基。选择的接头的长度取决于多种因素，例如，选择所述接头所期望的一种或多种性质。
合适的接头可以是非蛋白性的，例如，化学接头。多种本领域已知的非蛋白性接头可以用于将CD20结合区域连接至志贺毒素效应物区域，诸如经常用于将免疫球蛋白多肽缀合至异源多肽的接头。例如，使用它们的氨基酸残基的功能侧链和碳水化合物部分(例如，羧基、胺、巯基、羧酸、羰基、羟基和/或环状环基)，可以将本发明的多价CD20结合分子的组分连接在一起。例如，二硫键和硫醚键可以用于连接两个或更多个蛋白。另外，非天然的氨基酸残基可以与其它功能侧链诸如酮基一起使用(参见例如Axup J等人，Proc Natl AcadSci USA 109：16101-6(2012))。非蛋白性化学接头的例子包括、但不限于：(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸-N-琥珀酰亚胺基酯，硫代乙酸-S-(N-琥珀酰亚胺基)酯(SATA)，N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-cu-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)，4-(2-吡啶基二硫基)-戊酸-N-琥珀酰亚胺基酯(SPP)，4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC或MCC)，(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯，4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯，-6-(α-甲基-α-(吡啶基二硫醇)-甲苯酰氨基)己酸磺基琥珀酰亚胺基酯，3-(-2-吡啶基二硫基)-丙酸-N-琥珀酰亚胺基酯(SPDP)，6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基)己酸琥珀酰亚胺基酯，6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙酰氨基)己酸磺基琥珀酰亚胺基酯，马来酰亚胺基己酰基(MC)，马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基(MC-vc-PAB)，3-马来酰亚胺基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，α-烷基衍生物，sulfoNHS-ATMBA(磺基琥珀酰亚胺基N-[3-(乙酰基硫基)-3-甲基丁酰基-β-丙氨酸])，磺基二氯苯酚，2-亚氨基硫杂环戊烷，3-(2-吡啶基二硫基)-丙酰基酰肼，Ellman氏试剂，二氯三嗪酸，和S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸。
合适的接头(无论是蛋白性的还是非蛋白性的)可以包括，例如，蛋白酶敏感的、环境氧化还原电位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可切割的和/或热敏感的接头。
可以选择蛋白性接头用于掺入本发明的多价CD20结合分子(其为重组的融合蛋白)的实施方案中。例如，本发明的多价CD20结合蛋白的蛋白性组分可以通过一个或多个接头连接，所述接头包含一个或多个氨基酸、肽和/或多肽。对于本发明的重组融合多价CD20结合蛋白，接头通常包含约1-50个氨基酸残基，优选约5-30个氨基酸残基。通常，蛋白性接头包含大多数具有极性的、不带电荷的和/或带电荷的残基的氨基酸残基，例如，苏氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和丙氨酸。蛋白性接头的非限制性例子包括丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸(ASGGPE)、缬氨酸-甲硫氨酸(VM)、丙氨酸-甲硫氨酸(AM)、AM(G2-4S)xAM，其中G是甘氨酸，S是丝氨酸，且x是1-10的整数。
基于期望的性能可以选择蛋白性接头。记住特定特征的技术人员可以选择蛋白性接头，诸如以优化融合蛋白的折叠、稳定性、表达、溶解度、药代动力学性能、药效动力学性能和/或在融合构建体的背景下融合的结构域的活性(相对于相同结构域自身的活性)中的一种或多种。例如，基于柔性、刚度和/或切割性可以选择蛋白性接头。技术人员在选择接头时可以使用数据库和接头设计软件工具。可以选择某些接头以优化表达。可以选择某些接头以促进相同CD20结合分子之间(以形成同多聚体)或不同CD20结合分子之间(以形成杂多聚体)的分子间相互作用(参见例如图1)。例如，可以选择蛋白性接头，其允许本发明的多价CD20结合分子的蛋白性组分之间的期望的非共价相互作用，例如，与二聚体和其它更高级多聚体的形成有关的相互作用(参见例如图1)。
柔性的蛋白性接头经常具有大于12个氨基酸残基的长度，且富含小的、非极性的氨基酸残基、极性的氨基酸残基和/或亲水的氨基酸残基，例如，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸。可以选择柔性的蛋白性接头以增加组分之间的空间分离和/或允许组分之间的分子内相互作用。例如，多种“GS”接头是技术人员已知的，且由多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸组成，有时在重复单元中，例如、(GxS)n、(SxG)n、(GGGGS)n和(G)n，其中x是1-6，且n是1-30(参见例如WO 96/06641)。柔性的蛋白性接头的非限制性例子包括GKSSGSGSESKS、EGKSSGSGSESKEF、GSTSGSGKSSEGKG、GSTSGSGKSSEGSGSTKG、GSTSGSGKPGSGEGSTKG、SRSSG和SGSSC。
刚性的蛋白性接头经常是坚硬的α-螺旋结构且富含脯氨酸残基和/或一个或多个在战略上放置的脯氨酸。可以选择刚性的接头以防止连接的组分之间的分子内相互作用。
可以选择合适的接头以允许组分的体内分离，例如，由于切割和/或环境特异性的不稳定性。体内可切割的蛋白性接头能够通过蛋白水解加工和/或还原环境(经常在生物体内的特定部位或在特定细胞类型内)而解连。体内可切割的蛋白性接头经常包含蛋白酶敏感的基序和/或由一个或多个半胱氨酸对形成的二硫键。可以将体内可切割的蛋白性接头设计成对仅存在于生物体中的某些位置、细胞内的区室的蛋白酶敏感，和/或仅在某些生理学或病理学状况下变得有活性(例如，涉及具有异常高水平的蛋白酶，在某些疾病部位过表达的蛋白酶，和由病原性微生物特异性地表达的蛋白酶)。例如，存在本领域已知的蛋白性接头，其被仅存在于细胞内的蛋白酶、仅存在于特定细胞类型内的蛋白酶和仅在病理学状况(如癌症或炎症)下存在的蛋白酶切割，例如，R-x-x-R基序和AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM。
在本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案中，可以使用这样的接头：其包含一个或多个蛋白酶敏感的位点以提供存在于靶细胞内的蛋白酶的切割。在本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案中，可以使用不可切割的接头以在施用给脊椎动物生物体以后降低不希望的毒性。
合适的接头可以包括，例如，蛋白酶敏感的、环境氧化还原电位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可切割的和/或热敏感的接头，无论是蛋白性的还是非蛋白性的。
合适的可切割的接头可以包括含有本领域已知的可切割基团的接头，例如，由以下文献指出的接头：Zarling D等人，J Immunol 124：913-20(1980)；Jung S，Moroi M，Biochem Biophys Acta 761：152-62(1983)；Bouizar Z等人，Eur J Biochem 155：141-7(1986)；Park L等人，J Biol Chem 261：205-10(1986)；棕色ing J，Ribolini A，J Immunol143：1859-67(1989)；Joshi S，Burrows R，J Biol Chem265：14518-25(1990)。
合适的接头可以包括pH敏感的接头。例如，可以由于它们在较低pH环境中的不稳定性而选择某些合适的接头以提供在靶细胞的亚细胞区室内的解离。例如，包含一个或多个三苯甲基、衍生化的三苯甲基、双马来酰亚胺othoxy丙烷基团、己二酸二酰肼基和/或酸不稳定的转铁蛋白基团的接头可以提供本发明的多价CD20结合分子的组分(例如多肽组分)在具有特定pH范围的环境中的释放。可以选择在特定pH范围被切割的某些接头，所述特定pH范围对应于组织之间的生理pH差异，例如，肿瘤组织的pH低于健康组织中的pH。
光可切割的接头是在暴露于某些波长范围的电磁辐射(诸如可见范围内的光)后被切割的接头。光可切割的接头可以用于在暴露于某些波长的光以后释放本发明的多价CD20结合分子的组分(例如多肽组分)。光可切割的接头的非限制性例子包括硝基苄基(作为半胱氨酸的光可切割的保护基)、硝基苄氧基碳酰氯交联剂、羟丙基甲基丙烯酰胺共聚物、甘氨酸共聚物、荧光素共聚物和甲基罗丹明共聚物。光可切割的接头可以在连接组分以形成本发明的多价CD20结合分子(其被设计成用于治疗可以使用纤维光学暴露于光的疾病、病症和病患)中具有特定用途。
在本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案中，使用任何数目的技术人员已知的方式，包括共价键和非共价键中的任一种或二者，将CD20结合区域连接至志贺毒素效应物区域。经由一个或多个本领域众所周知的和/或本文描述的接头，可以使CD20结合区域的各个多肽亚组分(例如免疫球蛋白CDR、ABR、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和/或VHH区域)适当地彼此连接。
在本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案中，所述分子包含CD20结合区域，该区域是具有连接重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域的接头的scFv。存在众多本领域已知适合用于此目的的接头，例如，15-残基(Gly4Ser)3肽。可以用于形成非共价多价结构的合适scFv接头包括GGS、GGGS(Gly3Ser或G3S)、GGGGS(Gly4Ser或G4S)、GGGGSGGG、GGSGGGG、GSTSGGGSGGGSGGGGSS和GSTSGSGKPGSSEGSTKG。
用于连接本发明的多价CD20结合分子的组分的合适方法可以是通过目前本领域已知的用于实现该目的的任意方法，只要所述连接不会实质上阻碍CD20结合区域的结合能力、多价CD20结合分子的细胞内化、和/或志贺毒素效应物区域的期望的志贺毒素效应物功能，如通过适当的测定(包括通过本文描述的测定)所测量的。
D.多价CD20结合分子的结构例子
本发明的多价CD20结合分子的一般结构是模块的，因为多种不同的CD20结合区域可以与相同的或不同的志贺毒素效应物区域一起使用以提供细胞毒性、白细胞郁滞、诊断剂和/或外源物质递送向多种不同的表达CD20的细胞类型的细胞靶向。技术人员会明白，任何两个或更多个CD20结合区域(每个能够结合CD20的细胞外部分)可以与志贺毒素效应物区域结合以产生本发明的多价CD20结合分子。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或22个单独CD20结合区域。
本发明的多价CD20结合分子可以包含多个多价结构(参见例如图1)。例如，可以如下建立多价结构：使用共价和/或非共价相互作用使多个组分结合到一起以形成本发明的多价CD20结合分子。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子是两个或更多个蛋白性亚基的多聚体复合物，例如，二聚体、三聚体、四聚体、双体、三体、四体等。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含两个或更多个CD20结合区域，因为所述多价CD20结合分子的两个或更多个组分化学地连接或缀合在一起。例如，可以使用化学接头将两个或更多个CD20结合蛋白缀合在一起以形成多价CD20结合分子(参见例如Wolff E等人，Cancer Res 53：2560-5(1993)；Ghetie M等人，Proc Natl Acad Sci USA94：7509-14(1997)；Ghetie M等人，Blood 97：1392-8(2001))。
本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案包含含有两个或更多个组分分子的多聚体结构，所述组分分子可以是相同的或不同的。本文中使用的命名法(X)n表示包含组分(X)的整数(n)个拷贝或由其组成的分子。例如，包含两个相同单价CD20结合多肽亚基的二聚体蛋白可以被称作同源二聚体或(CD20结合单体)2。另一个实施例是多价蛋白的混合物，每种蛋白包含三个或更多个相同多肽“X”亚基，其在本文中被称作(X)2+n，其中“n”表示正整数，且“2+n”的值代表存在的蛋白分子的每个蛋白的CD20结合区域的数目，因而描述了存在于单一蛋白组合物中的多个不同的多价蛋白物质。
本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案是多聚体的，包含两个或更多个CD20结合分子，例如，同源二聚体、同源三聚体和同源四聚体等。例如，两个或更多个单价CD20结合多肽可以化合以形成本发明的多价CD20结合分子(参见例如图1)。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含两个或更多个组分，每个包含至少一个CD20结合区域，因为非共价分子间结合源自两个或更多个组分之间的结构域切换，这产生具有多聚体结构的多价CD20结合分子(参见例如图1B)。例如，可以将免疫球蛋白结构域之间的蛋白结构域切换工程改造并优化为产生精确多聚体结构的机制(参见例如Arndt K等人，Biochemistry 37：12918-26(1998)；Holliger P等人，Proc Natl Acad SciUSA 90：6444-8(1993)。
技术人员可以使用多种基于scFv的多肽相互作用工程改造本发明的多聚体多价CD20结合分子，例如，基于scFv的二聚体的、三聚体的、四聚体的复合物等。例如，scFv中接头的长度可以影响基于非共价的多聚体多价结构的自发组装。通常，通过有利于分子间结构域切换胜过链内结构域配对，12个氨基酸或更低的接头(包括任何接头的缺失)会促进包含scFv的多肽或蛋白多聚化成较高分子量物质(参见例如，Huston J等人，MethodsEnzymol 203：46-88(1991)；Holliger P等人，Proc Natl Acad Sci USA 90：6444-8(1993)；Stemmer W等人，Biotechniques 14：256-65(1993)；Whitlow M等人，Protein Eng6：989-95(1993)；Desplancq D等人，Protein Eng 7：1027-33(1994)；Whitlow M等人，Protein Eng 7：1017-26(1994)；Alfthan K等人，Protein Eng 8：725-31(1995)；IliadesP等人，FEBS Lett 409：437-41(1997)；Kortt A等人，Biomol Eng 18：95-108(2001)；Todorovska A等人，J Immunol Methods 248：47-66(2001)；Tomlinson I，Holliger P等人，Methods Enzymol 326：461-79(2001)；Dolezal O等人，Protein Eng 16：47-56(2003))。但是，根本不具有接头的scFv或具有15个氨基酸残基的示例性长度的接头可以多聚化(Whitlow M等人，Protein Eng 6：989-95(1993)；Desplancq D等人，Protein Eng 7：1027-33(1994)；Whitlow M等人，Protein Eng 7，1017-26(1994)；Alfthan K等人，ProteinEng 8：725-31(1995))。技术人员可以鉴别使用本领域已知的和/或本文描述的技术制备和/或纯化的多聚体结构。
另外，经工程改造的具有额外共价键的结构可以用于使自发地组装的多聚体结构稳定化(参见例如Glockshuber R等人，Biochemistry 29：1362-7(1990))。例如，半胱氨酸残基在特定位置处的引入可以用于制备二硫键稳定化的结构如Cys-二抗体、scFv’多聚体、VHH多聚体、VNAR多聚体和IgNAR多聚体，例如，通过添加下述氨基酸残基GGGGC和SGGGGC(TaiM等人，Biochemistry 29：8024-30(1990)；Caron P等人，J Exp Med 176：1191-5(1992)；Shopes B，J Immunol 148：2918-22(1992)；Adams G等人，Cancer Res 53：4026-34(1993)；McCartney J等人，Protein Eng 18：301-14(1994)；Perisic O等人，Structure 2：1217-26(1994)；George A等人，Proc Natl Acad Sci USA 92：8358-62(1995)；Tai M等人，CancerRes(Suppl)55：5983-9(1995)；Olafsen T等人，Protein EngDes Sel 17：21-7(2004))。因而，技术人员使用二硫键和/或通过在某些位置添加或除去半胱氨酸残基以控制某些二硫键的位置可以制备或稳定本发明的多价CD20结合分子。
在某些实施方案中，本发明的CD20结合分子的多价结构包含两个或更多个结合CD20的细胞外部分的免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子可以包含单个连续多肽链或由其组成。例如，单链二价scFv(有时被称作串联的scFv(taFv))、单链双体(scDb)和串联双体(tanDb或Tandab)代表从单个连续多肽制备的多价结合蛋白(参见例如Mack M等人，Proc Natl Acad Sci USA 92：7021-5(1995)；Kipriyanov S等人，J Mol Biol 293：41-56(1999)；Cochlovius，B等人，Cancer Res 60：4336-41(2000)；T等人，Protein Eng 14：815-23(2001)；Jendreyko N等人，J Biol Chem 278：47812-9(2003)；Kipriyanov S等人，J Mol Biol 330：99-111(2003)；Miller K等人，JImmunol 170：4854-61(2003)；Meng R等人，Clin Cancer Res 10：1274-81(2004)；Schlereth B等人，Cancer Res 65：2882-9(2005)；Huang T，Morrison S，J Pharmacol ExpTher 316：983-91(2006)；Liu X等人，Int Immunopharmacol 6：791-9(2006)；Shen J等人，J Biol Chem 281：10706-14(2006)；Shen J等人，J Immunol Methods 318：65-74(2007)；Wu C等人，Nat Biotech 25：1290-7(2007)；Li B等人，Cancer Res 68：2400-8(2008))。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含在两个或更多个CD20结合区域之间的接头以及在CD20结合区域的组分之间的一个或多个二硫键(无论是在接头的近侧还是远侧)，诸如在两个免疫球蛋白区域之间的二硫键，其需要在那两个免疫球蛋白区域之间的免疫球蛋白结构域切换结合(参见例如Glockshuber R等人，Biochemistry.29：1362-7(1990))。
可替换地，使用自我结合或彼此多聚化的多肽结构域可以将两个或多个多肽链连接在一起(参见例如US 6,329,507)。例如，羧基端多聚化结构域的添加已经被用于构建包含免疫球蛋白结构域(例如，scFv、自主VH结构域、VHH、VNAR和IgNAR)的多价蛋白。技术人员已知的自我结合结构域的例子包括免疫球蛋白恒定结构域(诸如凸起-进入-孔洞、静电操纵和IgG/IgA链交换)、免疫球蛋白Fab链(例如(Fab-scFv)2和(Fab’scFv)2)、免疫球蛋白Fc结构域(例如(sc双体-Fc)2、(scFv-Fc)2和scFv-Fc-scFv)、免疫球蛋白CHX结构域、免疫球蛋白CH1-3区域、免疫球蛋白CH3结构域(例如(sc双体-CH3)2，LD微抗体(minibody)和Flex-微抗体(minibody))、免疫球蛋白CH4结构域、CHCL结构域、两亲的螺旋束(例如scFv-HLX)、螺旋-转角-螺旋结构域(例如scFv-dHlx)、卷曲螺旋结构(包括亮氨酸拉链和软骨寡聚体基质蛋白(例如scZIP))、与A激酶锚蛋白(AKAP)锚定结构域(AD)(也被称作“入坞并锁定”或“DNL”)组合的cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)二聚化和入坞结构域(DDD)、抗生蛋白链菌素、Vero细胞毒素B多聚化结构域、来自p53的四聚化区域和芽孢杆菌RNA酶-芽孢杆菌RNA酶抑制剂相互作用结构域(Pack P，Plückthun A，Biochemistry 31：1579-84(1992)；Holliger P等人，Proc Natl Acad Sci USA 90：6444-8(1993)；Kipriyanov S等人，Hum AntibodiesHybridomas 6：93-101(1995)；de Kruif J，Logtenberg T，J Biol Chem 271：7630-4(1996)；Hu S等人，Cancer Res 56：3055-61(1996)；Kipriyanov S等人，Protein Eng 9：203-11(1996)；Rheinnecker M等人，J Immunol 157：2989-97(1996)；Tershkikh A等人，Proc Natl Acad Sci USA 94：1663-8(1997)；Müller K等人，FEBS Lett 422：259-64(1998)；Cloutier S等人，Mol Immunol 37：1067-77(2000)；Li S等人，Cancer ImmunolImmunother 49：243-52(2000)；Schmiedl A等人，Protein Eng 13：725-34(2000)；Schoonjans R等人，J Immunol 165：7050-7(2000)；Borsi L等人，Int J Cancer 102：75-85(2002)；Deyev S等人，Nat Biotechnol 21：1486-92(2003)；Wong W，Scott J，Nat RevMol Cell Biol 5：959-70(2004)；Zhang J等人，J Mol Biol 335：49-56(2004)；Baillie G等人，FEBS Letters 579：3264-70(2005)；Rossi E等人，Proc Natl Acad Sci USA 103：6841-6(2006)；Simmons D等人，J Immunol Methods 315：171-84(2006)；Braren I等人，Biotechnol Appl Biochem 47：205-14(2007)；Chang C等人，Clin Cancer Res 13：5586-91s(2007)；Liu M等人，Biochem J 406：237-46(2007)；Zhang J等人，Protein Expr Purif65：77-82(2009)；Bell A等人，Cancer Lett 289：81-90(2010)；Iqbal U等人，Br JPharmacol 160：1016-28(2010)；Asano R等人，FEBS J 280：4816-26(2013)；Gil D，SchrumA，Adv Biosci Biotechnol 4：73-84(2013))。
在某些实施方案中，从抗体或Fab片段工程改造本发明的多价CD20结合分子的结构。例如，使用技术人员已知的方案可以工程改造多价CD20结合分子(参见例如Shuford W等人，Science 252：724-7(1991)；Caron P等人，J Exp Med 176：1191-5(1992)；Shopes B，J Immunol 148：2918-22(1992)；Wolff E等人，Cancer Res 53：2560-5(1993))。
在本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案中，所述多价CD20结合分子的所有细胞靶向结合区域是相同的和/或共享相同的结合特异性。在这样的实施方案中，本发明的多价CD20结合分子是单特异性的-意味着它包含以高亲和力结合相同细胞外CD20靶生物分子、在相同CD20靶生物分子中的重叠细胞外表位和/或在CD20靶生物分子中的相同细胞外表位的CD20结合区域。技术人员用可得到的方法可以确定两个结合区域是否结合相同CD20的细胞外部分靶生物分子，例如，使用竞争性结合测定经验地确定或基于已知表位和/或免疫的肽序列的重叠预测地确定。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子可以包含以高亲和力结合不相同表位(无论是不重叠的还是重叠的)的结合区域。本发明的多价CD20结合分子可以包含对不重叠的表位具有高结合亲和力的结合区域。可以如下制备本发明的多特异性的多价CD20结合分子：使用两个或更多个不同的结合区域，例如，呈双体、三体、串联形式的两个不同scFv、VHH、VNAR和/或IgNAR(包括串联的二-scFv、串联的三-scFv和scFv-Fc串联体)、单链双体(scDb)、串联的Fv、双特异性的scFv(双-scFv)、scFv2、(Fab’)3、四聚体(scFv2)2、scFv2-Fc以及具有不同特异性的scFv、VHH、VNAR和/或IgNAR的组合(Adams G等人，Cancer Res 53：4026-34(1993)；Mallender W等人，J Biol Chem 269：199-206(1994)；Todorovska A等人，J Immunol Methods 248：47-66(2001)；Korn T等人，J Gene Med 6：642-51(2004)；Lu D等人，J Biol Chem 280：19665-72(2005)；Schneider M等人，Eur J Immunol 35：987-95(2005)；Wittel U等人，Nucl Med Biol 32：157-64(2005)；Semenyuk E等人，Biochimie89：31-8(2007))。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子可以包含单个连续多肽组分，其与它自身或另一种蛋白多聚化以形成多聚体结构。例如，单链二价scFv(有时被称作串联的scFv(taFv))、单链双体(scDb)和串联的双体(tanDb或Tandab)可以被表达为单个连续多肽链(Mack M等人，Proc Natl Acad Sci USA 92：7021-5(1995)；Kipriyanov S等人，J MolBiol 293：41-56(1999)；Cochlovius，B等人，Cancer Res 60：4336-41(2000)；T等人，Protein Eng 14：815-23(2001)；Kipriyanov S等人，J Mol Biol 330：99-111(2003)；Schlereth B等人，Cancer Res 65：2882-9(2005))。这些多价结构可以经工程改造以多聚化成较高等级较高价结构，例如，四价F(ab’)2、(taFv)2和(scDb)2结构(参见Todorovska A等人，J Immunol Methods 248：47-66(2001))。
包含两个scFv(其由于可变区的分子间配对通过非共价相互作用相连)的结构是技术人员已知的，例如，双体、微抗体和二价微抗体，它们都可以是单特异性的或双特异性的(Holliger，P等人，Proc Natl Acad Sci USA 90：6444-8(1993)；Pack P等人，Biotechnology(NY)11：1217-7(1993)；Tai M等人，Cancer Res(Suppl)55：5983-9(1995)；Atwell J等人，Mol Immunol 33：1301-12(1996)；Rheinnecker M等人，J Immunol 157：2989-97(1996)；Schier R等人，J Mol Biol 255：28-43(1996)；Adams G等人，Br J Cancer77：1405-12(1998)；Todorovska A等人，J Immunol Methods 248：47-66(2001)；Büthler P等人，Cancer Immunol Immunother 57：43-52(2008))。已经观察到众多scFv单体由于自我结合天然地形成多聚体或寡聚体(例如双体、三体和四体)，且对于包含3-12个氨基酸残基的接头的scFv结构，大多数形式是二聚体(Essig N等人，J Mol Biol 234：897-901(1993)；Griffiths A等人，EMBO J 12：725-34(1993)；Holliger P等人，Proc Natl Acad Sci USA90：6444-8(1993)；Whitlow M等人，Protein Eng 6：989-95(1993)；Desplancq D等人，Protein Eng 7：1027-33(1994)；Whitlow M等人，Protein Eng 7，1017-26(1994)；Kortt A等人，Protein Eng 10：423-33(1997)；Arndt K等人，Biochemistry 37：12918-26(1998)；Atwell J等人，Protein Eng 12：597-604(1999))。
一般而言，含有5-10个氨基酸残基或更低的相对短接头的scFv结构具有更大的同二聚化倾向(Arndt K等人，Biochemistry 37：12918-26(1988)；Holliger P等人，ProcNatl Acad Sci USA 90：6444-8(1993)；Perisic O等人，Structure 2：1217-26(1994)；Atwell J等人，Mol Immunol 33：1301-12(1996)；Iliades P等人，FEBS Lett 409：437-41(1997)；Kortt A等人，Protein Eng 10：423-33(1997)；Metzger D等人，Protein Eng 10：423-33(1997)；Pei X等人，Proc Natl Acad Sci USA 94：9637-42(1997)；Atwell J等人，Protein Eng 12：597-604(1999)；Denton G等人，Cancer Immunol Immunother 48：29-38(1999)；Le Gall F等人，FEBS Lett 453：164-8(1999)；Atwell J等人，Protein Eng 12：597-604(1999)；Dolezal，O等人，Protein Eng 13：565-74(2000)；Nielsen U等人，CancerRes 60：6434-40(2000)；Todorovska A等人，J Immunol Methods 248：47-66(2001)；Wu A等人，Protein Eng 14：1025-33(2001)；Arndt M等人，FEBS Lett 578：257-61(2004)；LeGall F等人，J Immunol Methods 285：111-27(2004))。相反，具有包含至少12个氨基酸残基的接头的scFv主要形成单体，仅小部分经历自发多聚化(Nielsen U等人，Cancer Res60：6434-40(2000)；Denton G等人，Cancer Immunol Immunother 48：29-38(1999)；KorttA等人，Biomol Eng 18：95-108(2001)；T等人，Protein Eng 14：815-23(2001))。
三个氨基酸残基或更少的接头的应用可以促进多聚化成比二聚体形式更大的较高级结构。如果scFv具有小于3个残基的接头，那么可以有利于三聚化(Iliades P等人，FEBS Lett 409：437-41(1997))；Kortt A等人，Biomol Eng 18：95-108(2001)；TodorovskaA等人，J Immunol Methods 248：47-66(2001)；Arndt M等人，FEBS Lett 578：257-61(2004))。此外，具有非常短的接头(例如，2个氨基酸残基或更低的接头)的scFv经常形成三聚体和/或三聚体和四聚体的混合物(Pei X等人，Proc Natl Acad Sci USA 94：9637-42(1997)；Hudson P，Kortt A，J Immunol Methods 231：177-89(1999)；Dolezal O等人，Protein Eng 13：565-74(2000)；Power B等人，Protein Sci 12：734-47(2003)；Le Gall F等人，J Immunol Methods 285：111-27(2004))。在某些具有短接头的安排中，可以有利于四聚体(Dolezal O等人，Protein Eng 13：565-74(2003)；Arndt M等人，FEBS Lett 578：257-61(2004))。缺少任何接头(即具有0氨基酸残基的接头长度)的scFv可以形成多聚体结构。例如，在VH前面具有VL的可变结构域的直接连接可以有利于四体的形成(Iliades P等人，FEBS Lett 409：437-41(1997))，而在VL前面的VH可以有利于三聚体(Kortt A等人，Protein Eng 10：423-33(1997))。
除了接头长度以外，可变结构域的取向可以影响多聚化特征(Huston J等人，ProcNatl Acad Sci USA 85，5879-83(1988)；Padlan E，Mol Immunol 31：169-217(1994)；Kortt A等人，Protein Eng 10：423-33(1997)；Dolezal，O等人，Protein Eng 13：565-74(2000)；Carmichael J等人，J Mol Biol 326：341-51(2003)；Arndt M等人，FEBS Lett578：257-61(2004))。已经提出，VL-VH取向表现出形成比反向取向更高分子量寡聚体的更大趋势，因为VL-VH取向是更受限的(Kortt A等人，Protein Eng 10：423-33(1997)；Dolezal，O等人，Protein Eng 13：565-74(2000)；Plückthun A，Pack P，Immunotechnology 3：83-105(1997))。
相同接头已经在它对scFv多聚化的影响方面随VH和VL取向而表现出差异，例如，影响二聚体形式与三聚体形式的相对比例(Le Gall F等人，FEBS Lett 453：164-8(1999)；Arndt M等人，FEBS Lett 578：257-61(2004)；Le Gall F等人，J Immunol Methods 285：111-27(2004))。
使用特定铰链和共价地连接的多个VHH链(串联)，已经将骆驼科VHH免疫球蛋白结构域多聚化(Fraile S等人，Mol Microbiol 53：1109-21(2004)；Zhang J等人，J Mol Biol335：49-56(2004))。使用某些铰链或半胱氨酸介导的二硫键稳定化，已经将来自软骨鱼纲的免疫球蛋白结构域(诸如IgNAR)多聚化(参见例如Simmons等人，J Immunol Methods315：171-84(2006))。
因而，通过共价或非共价的分子工程改造策略，例如，涉及单链串联排列的共价策略，涉及半胱氨酸-介导的、二硫键稳定化的多聚体的共价策略，和/或涉及二聚化结构域、接头选择和/或可变结构域次序的非共价策略，可以控制包含多个免疫球蛋白结构域的多价CD20结合分子的产生。当制备是本发明的多价CD20结合分子的结构时，可以组合多个策略(例如，接头相关的非共价多聚化和共价二硫键稳定化)(参见例如Lu D等人，J ImmunolMethods 279：219-32(2003))。
为了本发明的目的，毒素效应物区域和两个或更多个CD20结合区域相对于彼此或本发明的整个多价CD20结合分子的具体次序或取向不是固定的。可以以任意次序排列本发明的多价CD20结合分子的组分，前提条件是，不会消除CD20结合区域和毒素效应物区域的期望活性。期望的活性包括：给多价CD20结合分子提供例如结合表达CD20的细胞的能力；快速地诱导细胞内化；造成有效的内化；细胞内按路线发送至期望的亚细胞区室；造成白细胞郁滞；造成细胞毒性；选择性地杀死表达CD20的细胞；将外源物质递送进细胞内部；诊断疾病、病症或病患；和/或治疗有此需要的患者中的疾病、病症或病患。
E.存在于本发明的组合物中的多价CD20结合分子与一种或多种其它CD20结合分 子的相对比例的确定
使用本领域众所周知的和/或本文描述的技术，例如，用于分析蛋白性分子的层析、电泳、电层析、毛细管、离心、等电聚焦和微流体技术，技术人员可以确定在本发明的组合物内的不同分子物质的比率、百分比和/或相对比例。例如，通过对蛋白样品进行前述方法中的任一种产生的不同“峰”或“带”的大小和/或强度可以用于计算组合物内的不同大小的CD20结合分子的相对比率。
因为本发明的所有组合物包含至少一种含有至少一个蛋白性组分的多价CD20结合分子，技术人员可以使用本领域已知的技术来确定蛋白性分子的相对比例。例如，通过技术人员已知的氨基酸分析/氨基酸定量技术可以确定本发明的组合物内的不同蛋白性分子物质的比例(参见例如Bio-Synthesis，Inc.，Lewisville，TX，U.S.)。在另一个实施例中，使用技术人员已知的和/或本文描述的层析、电泳、电层析和/或密度-梯度超速离心技术，例如，通过凝胶电泳和结果的密度测定分析，可以确定本发明的组合物内的不同大小的蛋白性分子的相对比例。
技术人员可以使用本领域已知的和/或本文描述的软件方法来执行特别是从氨基酸定量、层析、电泳、电层析和密度-梯度超速离心测定得到的数据的分析，以确定存在于本发明的组合物中的不同分子物质的比例。例如，技术人员可以使用本领域已知的软件方法来执行层析、电泳和/或电层析数据(例如，尺寸排阻层析(SEC)数据)的峰-积分分析，以便对比存在于本发明的组合物中的不同分子物质的相对比例。通过使用分子大小迁移标准品(例如，凝胶过滤并离子交换标准品)和可能存在于本发明的组合物中的分子物质的知识，可以估计峰中的分子物质的大小并可以推断峰中的分子物质的身份。可替换地或另外，技术人员已知的和/或本文描述的补充方法(例如十二烷基硫酸钠、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或质谱法)可以用于确定在某些峰中包含的分子。
峰积分计算可以用于确定多种曲线特征，包括峰面积、保留时间、峰高、峰宽度和峰面积与总峰面积的百分比。对于任何峰积分分析，可以首先计算基线，例如，使用与空白曲线(例如从溶剂或流动相空白运行收集的数据)组合的自动计算、空白曲线减法或零基线。在某些情形下，可以调节某些设置，例如，结构宽度、基线噪音参数、基线斜率限度或阈值斜率设置、最大基线限度、和/或数据点之间的最小距离。对于任何层析、电泳和/或电层析数据分析，可以将分析的范围限制于某些保留时间范围(例如，以避免柱包含体积和/或避免超出排阻限度的来自保留时间的数据)。在适当的情况下可以执行峰窗口限度的用户编辑和峰分配的拒绝，或通过改变设置如最小面积和/或最小高度。
技术人员已知的和/或本文描述的氨基酸定量、层析、电泳、电层析和/或密度-梯度超速离心方法可以用于确定：1)本发明的组合物内的不同CD20结合分子的相对浓度比，2)本发明的组合物内的不同CD20结合分子的相对摩尔比，3)本发明的组合物内的不同CD20结合分子的相对质量比，和/或4)本发明的组合物内的不同CD20结合分子的相对摩尔浓度比。例如，本发明的组合物中的多价CD20结合分子的相对比例可以表达为如下计算出的百分比(无论是浓度、容积摩尔数、质量还是质量摩尔数)：将总多价CD20结合分子除以总蛋白性物质，再乘以100。可替换地，使用总多价CD20结合分子物质的测量结果与另一种分子物质(不论它是不同的多价CD20结合分子物质还是非-CD20结合分子物质)的测量结果的比率，可以将本发明的组合物中的多价CD20结合分子的相对比例表达为浓度、容积摩尔数、质量或质量摩尔数的比率。
在下面的实施例中，使用CD20结合分子组合物的快速蛋白液相层析法尺寸排阻(FPLC-SEC)和高效液相层析法尺寸排阻(HPLC-SEC)分析来确定存在的不同大小的多价CD20结合分子的相对量以及多价CD20结合分子与其它分子(如单价CD20结合分子)的相对量，例如，确定存在于所述组合物中的单价、二价和更高价CD20结合蛋白性物质之间的比率。
本领域已知的技术人员可以用于确定本发明的组合物内的不同分子物质的比率和/或百分比的方法的一个例子是动态光散射或光子相关光谱法(参见例如，Lamkemeyer T等人，FEBS J 273：3393-410(2006)；Rousselot M等人，FEBS J 273：4055-71(2006)；Bruneaux M等人，Curr Protein Pept Sci 9：15-80(2008))。
本领域已知的技术人员可以用于确定本发明的组合物内的不同分子物质的比率和/或百分比的方法的另一个例子是Protein 230 Assay，其使用运行Agilent 2100Expert软件的Agilent Bioanalyzer(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA，U.S.)。所述Protein 230 Assay可以用于估计本发明的多价CD20结合分子组合物的量、分子量和纯度。所述Protein 230 Assay会产生呈现为具有“带”的凝胶状图像和/或具有“峰”的电泳图谱的数据。可以使用已知标志物大小的标准物阶梯来制备用于每个分析的标准凝胶状和电泳图谱。然后，使用样品在测定中的迁移行为来预测尤其是它的大小。可以使用激光诱导的荧光强度来估计样品、单个带和/或峰中的蛋白量。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含本发明的多价CD20结合分子，其中所述组合物包含小于1∶3的单价CD20结合蛋白浓度；总CD20结合分子浓度的比率；且其中每个单价CD20结合蛋白包含仅一个CD20结合区域，其能够特异性地结合CD20的细胞外部分且包含至少一个志贺毒素效应物多肽。在某些其它实施方案中，所述多价CD20结合分子组合物包含小于选自以下比率的单价CD20结合蛋白浓度∶总CD20结合分子浓度的比率：1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10和1∶11。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含超过2∶3的多价CD20结合蛋白浓度∶总CD20结合蛋白浓度的比率。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含小于选自以下比率的相对大价CD20结合蛋白浓度∶总CD20结合蛋白浓度的比率：1∶4、1∶7、1∶11、1∶21、1∶41、1∶71、1∶111和1∶161；其中每个相对大价CD20结合蛋白包含三个或更多个能够特异性地结合CD20的细胞外部分的CD20结合区域且包含至少一个志贺毒素效应物多肽。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含超过选自以下比率的二价CD20结合分子浓度∶总CD20结合分子浓度的比率：1∶2、2∶3、3∶4、4∶5、5∶6、7∶8、8∶9、9∶10、10∶11、11∶12、12∶13、13∶14和14∶15；其中每个二价CD20结合分子包含(1)仅两个能够特异性地结合CD20的细胞外部分的CD20结合区域和(2)一个或多个志贺毒素效应物多肽。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含本发明的多价CD20结合分子，其中所述组合物包含小于1∶3的单价CD20结合分子质量∶总CD20结合分子质量的比率；且其中每个单价CD20结合分子包含仅一个CD20结合区域，该区域能够特异性地结合CD20的细胞外部分且包含至少一个志贺毒素效应物多肽。在某些其它实施方案中，所述多价CD20结合分子组合物包含小于选自以下比率的单价CD20结合分子质量∶总CD20结合蛋白质量的比率：1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10和1∶11。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含超过2∶3的多价CD20结合分子质量∶总CD20结合分子质量的比率。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含小于选自以下比率的相对大价CD20结合分子质量∶总CD20结合分子质量的比率：1∶4、1∶7、1∶11、1∶21、1∶41、1∶71、1∶111和1∶161；其中每个相对大价CD20结合分子包含三个或更多个能够特异性地结合CD20的细胞外部分的CD20结合区域且包含至少一个志贺毒素效应物多肽。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含超过选自以下比率的二价CD20结合分子质量∶总CD20结合分子质量的比率：1∶2、2∶3、3∶4、4∶5、5∶6、7∶8、8∶9、9∶10、10∶11、11∶12、12∶13、13∶14和14∶15；其中每个二价CD20结合分子包含(1)仅两个能够特异性地结合CD20的细胞外部分的CD20结合区域和(2)一个或多个志贺毒素效应物多肽。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含本发明的多价CD20结合分子，其中所述组合物包含小于1∶1.5的单价CD20结合分子摩尔浓度∶总CD20结合分子摩尔浓度的比率；且其中每个单价CD20结合分子包含仅一个CD20结合区域，该区域能够特异性地结合CD20的细胞外部分且包含至少一个志贺毒素效应物多肽。在某些其它实施方案中，所述多价CD20结合分子组合物包含小于选自以下比率的单价CD20结合分子摩尔浓度∶总CD20结合蛋白摩尔浓度的比率：1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7和1∶8。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含超过1∶1.5的多价CD20结合分子摩尔浓度∶总CD20结合分子摩尔浓度的比率。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含小于选自以下比率的相对大价CD20结合分子摩尔浓度∶总CD20结合分子摩尔浓度的比率：1∶2、1∶3.5、1∶5、1∶11、1∶21、1∶36、1∶55和1∶59；其中每个相对大价CD20结合分子包含三个或更多个能够特异性地结合CD20的细胞外部分的CD20结合区域且包含至少一个志贺毒素效应物多肽。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含超过选自以下比率的二价CD20结合分子摩尔浓度∶总CD20结合分子摩尔浓度的比率：1∶1.5、2∶3、3∶4、4∶5、5∶6、7∶8、8∶9、9∶10、10∶11、11∶12、12∶13、13∶14和14∶15；其中每个二价CD20结合分子包含(1)仅两个能够特异性地结合CD20的细胞外部分的CD20结合区域和(2)一个或多个志贺毒素效应物多肽。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含本发明的多价CD20结合分子，其中所述组合物包含小于1∶1.5的单价CD20结合分子质量摩尔数∶总CD20结合分子质量摩尔数的比率；且其中每个单价CD20结合分子包含仅一个CD20结合区域，该区域能够特异性地结合CD20的细胞外部分且包含至少一个志贺毒素效应物多肽。在某些其它实施方案中，所述多价CD20结合分子组合物包含小于选自以下比率的单价CD20结合分子质量摩尔数∶总CD20结合蛋白质量摩尔数的比率：1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7和1∶8。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含超过1∶1.5的多价CD20结合分子质量摩尔数∶总CD20结合分子质量摩尔数的比率。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含小于选自以下比率的相对大价CD20结合分子质量摩尔数∶总CD20结合分子质量摩尔数的比率：1∶2、1∶3.5、1∶5、1∶11、1∶21、1∶36、1∶55和1∶59；其中每个相对大价CD20结合分子包含三个或更多个能够特异性地结合CD20的细胞外部分的CD20结合区域且包含至少一个志贺毒素效应物多肽。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含超过选自以下比率的二价CD20结合分子质量摩尔数∶总CD20结合分子质量摩尔数的比率：1∶1.5、2∶3、3∶4、4∶5、5∶6、7∶8、8∶9、9∶10、10∶11、11∶12、12∶13、13∶14和14∶15；其中每个二价CD20结合分子包含(1)仅两个能够特异性地结合CD20的细胞外部分的CD20结合区域和(2)一个或多个志贺毒素效应物多肽。
F.分子稳定性、组合物稳定性、控制多聚化和使聚集最小化
对于某些应用，本发明的组合物中的多价CD20结合分子∶总CD20结合分子的相对比例的稳定性对于组合物的有效性而言可能是重要的。例如，在某些医学应用中，本发明的多价CD20结合分子与单价CD20结合分子的相对比例的稳定性可能是重要的。在某些应用中，二价CD20结合分子与较高价CD20结合分子的相对比例的稳定性可能是重要的。在某些应用中，二价CD20结合分子与非二价CD20结合分子的相对比例的稳定性可能是重要的。
对于某些实施方案，本发明的多价CD20结合分子的一些或全部组分的受控多聚化的一个或多个步骤可以用于生产本发明的组合物。
对于某些应用，CD20结合分子的不希望的聚集和/或多聚化的最小化或以其它方式控制对于本发明的某些组合物而言可能是重要的。例如在某些蛋白性治疗剂中，治疗分子的聚集和/或多聚化可以在某些情形下增加蛋白性治疗剂在接受者中的不希望的免疫应答的风险。具体地，CD20结合分子聚集和/或多聚化成较高分子量复合物可以增加某些CD20结合分子组合物向某些接受者施用以后不希望的免疫应答的风险。另外，错误折叠的蛋白和降解的蛋白产物可以表现出与它们的适当折叠的相应物相比增加的免疫原性。
由于所有这些原因和取决于具体应用，技术人员会明白是否需要考虑：1)本发明的组合物的多价CD20结合分子的稳定性，和2)存在于本发明的组合物中的不同CD20结合分子的比率的稳定性。例如，在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子及其组合物是受控多聚化和/或某些纯化步骤的结果。类似地，在某些实施方案中，将本发明的多价CD20结合分子工程改造以消除或降低某些多聚化可能性。在某些实施方案中，将设计本发明的多价CD20结合分子以避免不希望的聚集体的形成，例如，在某些贮存条件(如在水溶液中在8、4、2、-4、-10、-20或-25℃)下。
对于本发明的组合物的某些应用，可能合乎需要的是，使本发明的组合物中的以下物质的量最小化：1)高分子量多价CD20结合分子(例如大于175、180、190、200或250kDa或更大的分子)；2)非常多价的CD20结合分子(即包含5个或更多个CD20结合区域的分子)；3)CD20结合分子的多聚体，所述CD20结合分子是代表#1的高分子量多价CD20结合分子和/或代表#2的非常多价的CD20结合分子(例如CD20结合分子的某些大的非共价多聚体)；3)错误折叠的蛋白(例如，错误折叠的CD20结合蛋白或其蛋白组分)；和/或4)降解产物(例如多价CD20结合分子的蛋白性组分的不希望的蛋白片段，例如，志贺毒素效应物区域或CD20结合区域的多肽片段)。例如，使在上面作为#1至#4列出的任何类型的分子的量最小化的原理可能是用于医学应用，其中某些量的这些分子的存在可能增加本发明的组合物的接受者中不希望的抗原反应和/或免疫原性反应的潜力，例如，通过展现新表位的这些分子的存在或通过形成更容易被接受者的免疫系统鉴别为外来物的重复基序。
技术人员可以使用常规方法来评估本发明的多价CD20结合分子和/或存在于本发明的组合物中的分子的多聚化状态。技术人员可以使用常规方法使本发明的组合物中的CD20结合分子聚集体、高分子量CD20结合蛋白多聚体、错误折叠的CD20结合蛋白和CD20结合蛋白降解产物的存在或相对比例最小化。
在本发明的组合物的某些实施方案中，使多价CD20结合分子的二价、三价和/或四价形式的相对比例最大化，诸如通过从单价CD20结合蛋白进一步纯化掉较高分子量CD20结合分子、错误折叠的CD20结合蛋白和/或蛋白降解产物。
技术人员可以使用常规方法来制备本发明的多价CD20结合分子及其组合物。技术人员可以使用常规方法来稳定化本发明的组合物中的某些多价CD20结合分子与其它分子的相对比例，包括CD20结合分子的不同多聚体形式的比例，例如，共价地连接的多聚体多价CD20结合分子与非共价地连接的多聚体多价CD20结合分子的比例(参见例如Gil D，SchrumA，Adv Biosci Biotechnol 4：73-84(2013)；WO2005000898)。例如，可以控制和/或最小化在本发明的组合物中的CD20结合分子的多聚化，例如，通过选择某些接头来连接和/或结合存在于本发明的组合物中的CD20结合分子的不同组分和/或亚基。例如，在某些实施方案中，将本发明的多价CD20结合分子的CD20结合区域工程改造以使不希望的分子间结合、多聚体和/或聚集体的形成最小化，例如，通过使用二硫键稳定化的scFv、Fv片段或Fab(参见例如Reiter Y等人，J Biol Chem 269：18327-31(1994)；Kuan C，Pastan I，Biochemistry35：2872-7(1996)；Almog O等人，Proteins 31：128-38(1998)；Schoonjans R等人，JImmunol 165：7050-7(2000)；Olafsen T等人，Protein Eng Des Sel 17：21-7(2004)；GilD，Schrum A，Adv Biosci Biotechnol4：73-84(2013)；U.S.20120283418)；基础环连接(参见例如Brinkmann U等人，J Mol Biol 268：107-17(1997))；和/或其它修饰，诸如带电荷的残基、聚糖和/或免疫球蛋白-结构域截短的添加(参见例如Gong R等人，Mol Pharm 10：2642-52(2013)；Lee C等人，Trends Biotechnol 31：612-20(2013))。
在本发明的某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含这样的CD20结合区域：其为被工程改造成不会聚集的scFv，例如，通过使用较短的接头(通常小于12个氨基酸残基)和/或二硫键稳定化的接头，所述接头连接所述scFv的重链和轻链区域(参见例如，Brinkmann U等人，Proc Natl Acad Sci USA 90：7538-42(1993)；Whitlow M等人，ProteinEngineering 6：989-95(1993)；Reiter Y等人，Biochemistry 33：5451-9(1994)；Gong R等人，Molecular Pharmaceutics 10：2642-52(2013))。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物使具有大于2的价的某些多价CD20结合分子相对于其它CD20结合分子的比例最小化。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含的具有大于4的价的多价CD20结合分子的相对百分比是所述组合物中总CD20结合分子的15％、10％、7.5％、5％、2％、1％或更低。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含的具有大于3的价的CD20结合分子与其它CD20结合分子的相对百分比是所述组合物中总CD20结合分子的15％、10％、7.5％、5％、2％、1％或更低。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物包含的具有大于2的价的CD20结合分子的百分比是所述组合物中总CD20结合分子的15％、10％、7.5％、5％、2％、1％或更低。
在某些实施方案中，本发明的组合物使具有刚好两个CD20结合区域的多价CD20结合分子∶总CD20结合分子的相对比例最大化。因而，在某些实施方案中，本发明的组合物包含的具有仅两个CD20结合区域的CD20结合分子的比例是所述组合物中的总CD20结合分子的80％、85％、88％、90％、92％、93％或更多。
对于某些应用，可能合乎需要的是，维持在本发明的多价组合物中的多价CD20结合分子的稳定性(例如，在多价CD20结合分子的组分和/或亚基之间的结合和/或连接的稳定性)，例如，以使在配制、贮存(例如，在8、4、2、-4、-10、-20或-25℃在水溶液中贮存)过程中和/或在施用给接受者以后的降解最小化。技术人员可以使用众所周知的方法使本发明的多价CD20结合分子的组分或亚基分离最小化，例如，通过使用在志贺毒素效应物多肽和结合区域之间的高稳定性连接和/或通过工程改造多价CD20结合分子的组分、区域或亚区之间或单价CD20结合蛋白之间的二硫键以产生本发明的多价CD20结合蛋白(参见例如GilD，Schrum A，Adv Biosci Biotechnol 4：73-84(2013))。技术人员可以使用分子间二硫键的添加或维持来稳定本发明的多价CD20结合分子的某些CD20结合区域(参见例如Glockshuber R等人，Biochemistry 29：1362-7(1990)；Stanfield R等人，Science 305：1770-3(2004)；Hagihara Y等人，J Biol Chem 282：36489-95(2007)；Chan P等人，Biochemistry 47：11041-54(2008)；Saerens D等人，J Mol Biol 478-88(2008)；HussackG等人，PLoS One 6：e28218(2011)；Govaert J等人，J Biol Chem 287：1970-9(2012)；KimD等人，Protein Eng Des Sel 25：581-9(2012)；Gil D，Schrum A，Adv Biosci Biotechnol4：73-84(2013)；McConnell A等人，Protein Eng Des Sel 25：581-9(2013)；Feige M等人，Proc Natl Acad Sci USA 111：8155-60(2014)；Hagihara Y，Saerens D，Biochim BiophysActa 1844：2016-2023(2014)；Kim D等人，Mabs 6：219-35(2014))。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含这样的CD20结合区域：其包含免疫球蛋白结构域和/或具有结构域内二硫键(例如，在某些免疫球蛋白的B和Fβ链之间天然地存在的二硫键和/或在免疫球蛋白的或由其来源的它们的重链和轻链之间的二硫键)的Ig折叠结构。但是，在本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案中，所述分子是非常稳定的，尽管它们不包含结构域内二硫键或在一个或多个CD20结合区域内的任何结构域内二硫键(参见例如Proba K等人，Biochemistry 37：13120-7(1998)；A，PlückthunA，Biochemistry 37：13120-7(1998)；A，Plückthun A，FEBS Lett 427：357-61(1998)；Ramm K等人，J Mol Biol 290：535-46(1999)；Tanaka T，Rabbitts T，J Mol Biol376：749-57(2008))。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含这样的多价CD20结合分子：其具有在不同多肽链的志贺毒素效应物区域内所含的两个或更多个半胱氨酸残基之间的一个或多个二硫键。在某些实施方案中，本发明的组合物包含具有5个二硫键的蛋白性的二聚体多价CD20结合分子，例如，这样的二聚体多价CD20结合分子，其包含：1)四个分子内二硫键，其代表每个免疫球蛋白来源的CD20结合区域两个二硫键，且其中每个二硫键包含一对半胱氨酸残基，且其中每对的一个半胱氨酸残基是在免疫球蛋白重链来源的结构域内，且所述对的其它半胱氨酸残基是在免疫球蛋白轻链来源的结构域内；和2)一个桥连两个志贺毒素效应物区域的分子间二硫键，其中所述二硫键发生在一对半胱氨酸残基之间，其中所述对的每个半胱氨酸残基是在志贺毒素效应物区域内，但是所述志贺毒素效应物区域是在代表本发明的多价CD20结合蛋白的不同亚基的不同多肽链内。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含从免疫球蛋白来源的CD20结合区域，其已经用某些骆驼科VHH“四联体”突变进行工程改造以改善可溶性、改善稳定性和/或以其它方式“骆驼源化”所述结合区域(参见例如Vincke C等人，J Biol Chem 284：3273-84(2009)；Perchiacca J等人，Proteins 79：2637-47(2011)；Gil D，Schrum A，AdvBiosci Biotechnol 4：73-84(2013))。
II.本发明的多价CD20结合分子的具体结构变化的例子
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含1)两个或更多个蛋白性的CD20结合区域，每个区域能够独立地特异性地结合CD20的细胞外部分；和2)一个或多个志贺毒素效应物区域，所述区域包含从志贺毒素家族的至少一个成员的A亚基的氨基酸序列来源的多肽。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含两个或更多个含有免疫球蛋白-型多肽的CD20结合区域，所述多肽针对与CD20+细胞的细胞表面的特异性和高亲和力结合进行了选择(参见例如下文表9)。
在本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案中，所述CD20结合区域包含选自以下的多肽：a)重链可变(VH)结构域，其包含i)HCDR1，其包含如在SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；ii)HCDR2，其包含如在SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：36中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；和iii)HCDR3，其包含如在SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；和b)轻链可变(VL)结构域，其包含i)LCDR1，其包含如在SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：38中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；ii)LCDR2，其包含如在SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQID NO：27、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；和iii)LCDR3，其包含如在SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：40中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成。在某些其它实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含CD20结合区域，所述CD20结合区域包含SEQ ID NO：47-119和176-248中的任一个的氨基酸1-232、1-233、1-234、1-235、1-236、1-242、1-243、1-244、1-245、1-246、1-252、1-253、1-254、1-255或1-256或基本上由其组成。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含一个或多个志贺毒素效应物区域，每个包含选自以下的多肽或基本上由其组成：(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQID NO：3的氨基酸75-251；(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-241；(c)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-251；和(d)SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-261。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含一个或多个志贺毒素效应物区域，所述区域包含选自以下至少一种的置换：如在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3和/或SEQ ID NO：4所示的多肽中定位的A231E、R75A、Y77S、Y114S、E167D、R170A、R176K和W203A。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含两种蛋白或基本上由其组成，且包含至少一个二硫键。在某些其它实施方案中，所述二硫键是在一对半胱氨酸残基之间，其中所述对的第一个半胱氨酸残基位于第一个志贺毒素效应物多肽区域中的SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2所示的多肽的氨基酸残基242或261处或SEQ ID NO：3所示的多肽中的氨基酸残基位置241或260处，且所述对的第二个半胱氨酸残基位于第二个志贺毒素效应物多肽区域的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的多肽的氨基酸残基242或261处或SEQ IDNO：3所示的多肽的氨基酸残基位置241或260处(参见例如图1)。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含在SEQ ID NO：47-304中的任一个中所示的蛋白，且任选地，所述蛋白进一步包含氨基端甲硫氨酸残基。在某些其它实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含两种蛋白或基本上由其组成，每种蛋白选自在SEQID NO：47-304中所示的多肽中的任一种，且任选地，每种蛋白进一步包含氨基端甲硫氨酸残基。在某些其它实施方案中，所述两种蛋白中的每一种选自在SEQ ID NO：47-175中所示的蛋白中的任一种，且所述多价CD20结合分子还包含5个二硫键，每个二硫键连接一对半胱氨酸残基的巯基；且其中所述5个二硫键中的4个涉及在所述蛋白的CD20结合区域的免疫球蛋白结构域内的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基连接至相同CD20结合区域的免疫球蛋白结构域中的另一个半胱氨酸残基，且其中所述5个二硫键的剩余二硫键涉及在SEQ ID NO：47-175所示的两种蛋白中的第一种蛋白的在选自242、482、483、484、490、491、492、493、494、495、499、500、501、502、503、504、505、510、511、512、513和521的位置处的半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基连接至在SEQ ID NO：47-175所示的两种蛋白中的第二种蛋白的选自242、482、483、484、490、491、492、493、494、495、499、500、501、502、503、504、505、510、511、512、513和521的位置处的半胱氨酸残基。
在本发明范围内包括使用本发明的多价CD20结合分子的蛋白的片段、变体和/或衍生物，例如，含有两个或更多个功能性CD20结合区域的蛋白，且甚至更优选地两个能够以高亲和力结合CD20的细胞外部分的CD20结合区域(例如如使用CD20结合区域的KD所确定的，所述KD用表达CD20的细胞凭经验测量或体外用CD20靶分子测量)。例如，尽管本发明提供了可以结合CD20的多肽，以10-5至10-12摩尔/升、优选地小于200nM的解离常数结合CD20的细胞外部分的任何结合区域可以适合用于制备本发明的多价CD20结合分子以及本发明的有关组合物和方法。
III.本发明的多价CD20结合分子及其组合物的一般功能
本发明提供了多种多价CD20结合分子及其组合物，其中每个多价CD20结合分子包含1)两个或更多个用于细胞靶向的CD20结合区域；和2)至少一个志贺毒素效应物多肽区域。多个细胞靶向CD20结合区域与志贺毒素亚基A来源的区域的连接使得能够实现有效志贺毒素细胞毒性和/或白细胞郁滞的细胞类型特异性靶向、以及将外源物质(例如，细胞内细胞毒性剂)递送进CD20+细胞类型的内部的能力。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子及其组合物可以用于将有效志贺毒素细胞毒性、白细胞郁滞、负荷的快速细胞内递送、或其它细胞内化功能靶向至多种表达CD20的细胞类型。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子能够结合与特定细胞类型的细胞表面结合的细胞外CD20分子并快速地进入那些细胞。一旦内化到靶向细胞内，本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案就能够将细胞毒性的志贺毒素效应物多肽片段按路线发送进靶细胞的胞质溶胶中。一旦在靶向细胞的胞质溶胶中，本发明的细胞毒性的多价CD20结合分子的某些实施方案就能够酶促地灭活核糖体、干扰细胞体内稳态和最终杀死细胞。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子及其组合物可以用于将额外外源物质递送进表达CD20的细胞中，例如，肽、多肽、蛋白、多核苷酸和检测促进剂以标记靶细胞的内部用于收集诊断上有用的信息。
A.通过靶向志贺毒素细胞毒性实现的CD20+细胞杀死
因为志贺毒素家族的成员适合杀死真核细胞，包含志贺毒素效应物区域的多价CD20结合分子可以表现出有效细胞杀死活性。志贺毒素家族的成员的A亚基包含一旦进入细胞的胞质溶胶中就能杀死真核细胞的酶促结构域。本发明的多价CD20结合分子及其组合物的某些实施方案利用该细胞毒性机制。本发明的多价CD20结合分子及其组合物的某些实施方案通过它们的志贺毒素效应物区域表现出细胞靶向的细胞毒性。
在本发明的多价CD20结合分子及其组合物的某些实施方案中，在接触与细胞外CD20(其具有被本发明的多价CD20结合分子的结合区域、本发明的多价CD20结合分子、和/或其组合物结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，能够造成所述细胞的死亡。在某些其它实施方案中，造成所述细胞的死亡的能力需要细胞内机制，例如，毒素效应物区域的催化活性。
使用本发明的细胞毒性的多价CD20结合分子和/或其组合物，在表达CD20的靶细胞(诸如离体操作的靶细胞、在体外培养的靶细胞、在体外培养的组织样品内的靶细胞和/或体内靶细胞)的不同条件下，可以完成表达CD20的细胞的杀死。
CD20在细胞表面处的表达不需要是本发明的细胞毒性的多价CD20结合分子和/或其组合物实现靶向细胞杀死所天然的。靶细胞对CD20的细胞表面表达可以是感染、病原体的存在和/或细胞内微生物病原体的存在的结果。靶细胞对CD20的表达可以是人工的或经工程改造的，例如，通过病毒表达载体感染以后被迫的或诱导的表达，参见例如腺病毒系统、腺相关病毒系统和逆转录病毒系统。诱导CD20的表达的一个例子是通过将细胞暴露于电离辐射而诱导的CD20的上调。
通过本领域众所周知的方法可以确定特定细胞类型或细胞群体是否在细胞表面处表达CD20。例如，使用抗-CD20抗体的FACS方法和免疫组织化学方法是本领域已知的，可以用作确定在细胞表面表达CD20的细胞(CD20+细胞)且因而确定哪些细胞具有与它们物理偶联的特定细胞外CD20靶生物分子的测定。另外，使用本领域已知的方法，包括、但不限于本文中所述的方法，可以测定在CD20+细胞类型的细胞表面处的CD20表达的密度。
本发明的多价CD20结合分子对不同靶细胞的有效性和效能可能受它们在靶细胞表面上的CD20靶抗原的密度、它们与CD20的表位结合相互作用的位置、不同靶细胞的细胞表面结合的CD20的CD20内化速率和不同靶细胞的细胞内路径影响。
细胞外CD20靶标的细胞表面呈现和/或密度可能影响本发明的某些多价CD20结合分子或其组合物可能最适当地使用的用途。细胞之间的某些细胞外CD20靶标的细胞表面呈现和/或密度的差异可能定量地和定性地改变本发明的给定多价CD20结合分子或其组合物的内化和/或细胞毒性。使用技术人员已知的方法，诸如通过使用荧光激活细胞分选术(FACS)、流式细胞计量术技术，可以确定CD20和/或某些CD20表位在特定细胞或细胞群体上的总细胞表面呈现。
基于FACS的、用于确定特定细胞类型的细胞外CD20抗原的细胞表面呈现的测定的一个实施例如下。用荧光团(例如，荧光素衍生物如异硫氰酸荧光素(FITC)、Alexa染料如Alexa488或一些其它荧光标签)标记抗-CD20抗体。将目标细胞类型的细胞群体培养，并在1x 106细胞/毫升(mL)的密度收获和用0.1-1.0毫克(mg)/mL(mg/mL)的标记的抗-CD20抗体在冰上处理30分钟。然后，将冷的处理过的细胞洗涤2次以除去未结合的抗体。可替换地，使用未标记的抗-CD20抗体并通过第二抗体(例如，与荧光团(例如，Alexa488或FITC)缀合的抗-小鼠IgG)检测。使用直接免疫荧光来量化细胞外CD20的量，诸如通过使用FACS装置。
例如，与其它细胞表面靶标相比，细胞表面CD20经常被B-细胞以高水平表达，诸如在每个细胞250,000个细胞表面CD20分子的水平，这会提供本发明的多价CD20结合分子的细胞外CD20靶标的大密度。
对于所述多价CD20结合分子及其组合物的某些实施方案，在接触与细胞外CD20(其具有被所述多价CD20结合分子的结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后杀死所述细胞的能力可能依赖于或不依赖于所述多价CD20结合分子的一个或多个志贺毒素效应物区域的催化活性。在本发明的多价CD20结合分子及其组合物的某些实施方案中，在接触与细胞外CD20(其具有被所述多价CD20结合分子的结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物能够造成所述细胞的死亡。在某些其它实施方案中，本发明的多价CD20结合分子(1)包含缺乏催化活性和/或不能通过志贺毒素效应或其介导的核糖体灭活机制造成所述细胞的死亡的志贺毒素效应物区域；或(2)不包含任何志贺毒素效应物区域。
与单价CD20结合分子和/或其缺乏本发明的多价CD20结合分子或具有比本发明的富集组合物(即，本发明的多价CD20结合分子组合物)更低的本发明的多价CD20结合分子∶总CD20结合分子的比例的组合物相比，本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案及其富集组合物意外地表现出巨大细胞靶向的细胞毒性潜能。不受理论的约束，本发明的单价CD20结合分子和多价CD20结合分子之间的功能的CD20结合价相关的改善以被认为不仅是CD20结合价效应的结果的方式源自多价CD20结合结构，而是相反，似乎源自不存在于单价CD20结合变体中的本发明的多价CD20结合结构的从头性质。不受理论的约束，与单价CD20结合变体相比意外地以定性和/或定量方式表现出更大细胞毒性潜能的本发明的多价CD20结合分子及其富集组合物可能表现出这样的细胞毒性效能水平，这归因于例如以下分子效率的提高：1)细胞内化进表达CD20的细胞，2)细胞内化以后在细胞内按路线发送至某些亚细胞区室，和/或3)将志贺毒素效应物多肽递送至胞质溶胶。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含一个或多个单价CD20结合分子组分；且其中在将本发明的多价CD20结合分子或其组合物施用给与CD20(其具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞群体(例如CD20+细胞)后，所述多价CD20结合分子表现出的细胞毒性效应比在相同条件(例如，相同温度、细胞密度和测定持续时间)下将等同量、质量或摩尔浓度的所述多价CD20结合分子的任一种单价CD20结合分子组分施用给相同类型的CD20阳性细胞群体所引起的细胞毒性效应大1.33、1.5、1.75、2、3、5、7.5、10、20、100倍，或大于(1)所述单价CD20结合组分和所述多价CD20结合分子之间的CD20结合价的变化；(2)所述多价CD20结合分子和所述单价CD20结合组分之间关于结合CD20或表达CD20的细胞的平衡结合常数(KD)的变化；和/或(3)所述多价CD20结合分子和所述单价CD20结合组分之间关于结合CD20或表达CD20的细胞的亲和常数(1/KD)的变化。对于某些其它实施方案，所述细胞群体的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，其中每个CD20结合区域与所述多价CD20结合分子分离地试验，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞群体的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述细胞群体的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些其它实施方案，所述细胞群体的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些其它实施方案，所述细胞群体的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
B.在不同细胞的混合物中的选择性细胞毒性
本发明的细胞毒性的多价CD20结合分子及其组合物可用于在有非靶向的细胞或“旁观者”细胞存在下消除特定细胞类型群体。例如，本发明的细胞毒性的多价CD20结合分子及其组合物可用于通过消除表达CD20的细胞(其在一个或多个细胞表面处表达升高水平的CD20)来治疗某些肿瘤、癌症和/或生长异常。通过将使用多个高亲和力CD20结合区域的酶活性的志贺毒素区域的递送靶向表达CD20的细胞，可以将志贺毒素细胞杀死活性限制为在有两个或更多个细胞类型(其中至少一个细胞类型群体表达比至少一个其它细胞类型群体更多的CD20)存在下优先杀死在细胞表面表达CD20的CD20表达细胞类型(例如CD20+细胞)，例如，某些肿瘤或恶性浆细胞。
在某些实施方案中，本发明的细胞毒性的CD20结合分子能够选择性地或优先地造成两个或更多个不同细胞类型的混合物内的特定细胞类型的死亡。这会实现与不表达细胞外CD20的“旁观者”细胞类型相比高优先性(诸如3倍细胞毒性效应)的对特定细胞类型的靶向细胞毒性活性。
在某些实施方案中，将本发明的多价CD20结合分子施用给细胞类型的混合物，与缺少所述多价CD20结合分子的结合区域的细胞外CD20靶标的细胞类型相比，所述多价CD20结合分子能够选择性地杀死表达CD20的细胞，所述细胞展示细胞外CD20靶标。
在某些实施方案中，在将本发明的细胞毒性的多价CD20结合分子施用给细胞类型的混合物以后，与缺少细胞外CD20靶生物分子的任何细胞表面表达的细胞相比，所述细胞毒性的多价CD20结合分子能够选择性地杀死表达细胞外CD20靶生物分子的CD20+细胞。
基于靶细胞和非靶细胞之间的细胞外CD20靶标表达的不同水平，在有其它细胞(包括其它CD20阳性细胞)存在下，本发明的多价CD20结合分子或其组合物可以杀死某些CD20阳性的细胞类型。例如，可以杀死在健康的细胞之中的过表达CD20的细胞，无论所述健康的细胞是否表达CD20。
“过表达”靶生物分子的细胞包括，与相同组织类型的健康细胞相比具有显著更高水平的在它的细胞表面处物理偶联的靶生物分子的细胞。过表达可以由多种情况造成，例如，基因扩增、增加的转录、增加的翻译、减少的CD20脱落、和/或减少的CD20靶生物分子的除去。技术人员使用本领域已知的方法可以确定特定靶生物分子的过表达。
使用技术人员已知的多种方法，例如，FACS方法，可以确定细胞表面上的细胞外CD20靶生物分子的水平。如本文中使用的，在细胞表面处表达的细胞外CD20的显著量是通过FACS分析测得大于10,000、20,000、30,000、40,000或50,000平均荧光强度(MFI)，取决于细胞类型。
本发明的细胞毒性的多价CD20结合分子可用于减少或消除特定细胞类型群体。例如，本发明的细胞毒性的多价CD20结合分子可用于通过消除在一个或多个细胞表面处表达升高水平的CD20的CD20+细胞(例如被表征为过表达CD20的细胞)来治疗某些肿瘤、癌症和/或生长异常。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子可以用于将细胞毒性活性靶向至特定细胞类型，与CD20+的、但是以比靶细胞更低的细胞表面量或密度表达细胞表面CD20的“旁观者”细胞类型相比具有高优先性，诸如具有至少3倍细胞毒性效应。如果细胞外CD20被未靶向的细胞类型以足够低的量表达，CD20的表达可以不是一种细胞类型独有的。因而，可以在其中一些CD20+细胞类型是旁观者细胞的多种CD20+细胞类型的混合物(诸如具有不同CD20表达水平的CD20+细胞类型的混合物)中完成一种CD20阳性细胞类型的优先杀死，任选地，还在有CD20阴性的细胞存在下。这会实现与不表达显著量的CD20或不暴露显著量的细胞毒性的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标的“旁观者”细胞类型相比对高表达CD20细胞类型的优先细胞杀死，诸如3倍细胞毒性效应。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子对与细胞外CD20靶标物理偶联的细胞类型群体的细胞毒性活性是对没有与显著量的细胞外CD20靶标(其被该多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域特异性地结合)物理偶联的细胞类型群体的细胞毒性活性的至少3倍。根据本发明，可以以以下(a)与(b)的比率(a/b)的方式量化选择性细胞毒性：(a)对与显著量的本发明的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标物理偶联的细胞群体的细胞毒性，(b)对没有与显著量的本发明的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标物理偶联的细胞类型的细胞群体的细胞毒性。
在某些实施方案中，所述细胞毒性比率指示，与不表达细胞外CD20靶标或没有与显著量的细胞外CD20靶标(其被本发明的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域特异性地结合)物理偶联的细胞群体或细胞类型相比，对表达本发明的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标或与其物理偶联的细胞群体或细胞类型的选择性细胞毒性高至少3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍、1000倍或更高。例如，在将本发明的某些多价CD20结合分子施用给就细胞外CD20靶生物分子的存在和/或多肽序列而言存在差异的两个不同细胞群体后，所述多价CD20结合分子能够造成与细胞外CD20靶生物分子(其被多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域结合)物理偶联的细胞类型的细胞死亡，例如，以比结合没有与多价CD20结合分子的CD20结合区域的细胞外CD20靶标物理偶联的细胞类型的CD50小至少3倍的CD50。
在本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案中，在将所述多价CD20结合分子施用给两个不同细胞群体类型后，所述多价CD20结合分子能够造成由半数最大细胞毒性浓度(CD50)定义的第一细胞群体(其成员在细胞表面表达CD20)的细胞死亡，其剂量比相同多价CD20结合分子对第二细胞群体(其成员不表达CD20、不表达显著量的CD20或没有暴露显著量的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标)的CD50剂量低至少3倍。
根据本发明，可以以以下(a)与(b)的比率(a/b)的方式量化选择性细胞毒性：(a)对CD20+细胞群体的细胞毒性，(b)对CD20阴性细胞群体的细胞毒性。在某些实施方案中，所述细胞毒性比率指示，与CD20-细胞或CD20-细胞群体相比对CD20+细胞的群体或CD20+细胞群体高至少3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍或1000倍的选择性细胞毒性。例如，将多价CD20结合分子的某些实施方案施用给两个就细胞外CD20靶生物分子的存在而言不同的细胞群体类型，所述多价CD20结合分子能够造成CD20靶生物分子阳性细胞的细胞死亡，其CD50比对CD20靶生物分子阴性细胞的CD50小至少3倍。
在生物体内的具体CD20表达水平可以限于独特的细胞、组织、细胞类型、病症、疾病状态、障碍和/或细胞背景。在许多疾病状态中涉及的细胞(例如，恶性免疫细胞、肿瘤细胞和癌细胞)可以过表达CD20。
在某些实施方案中，将本发明的多价CD20结合分子组合物施用给细胞类型的混合物，与缺少本发明的组合物的多价CD20结合分子的细胞外CD20靶标的细胞类型相比，所述多价CD20结合分子组合物能够选择性地杀死展示细胞外CD20靶标的表达CD20的细胞。
在某些其它实施方案中，将本发明的多价CD20结合分子组合物施用给两个在细胞外CD20靶标的存在和/或多肽序列方面存在差异的细胞类型群体，所述多价CD20结合分子组合物能够造成细胞死亡，如通过对CD20+靶细胞群体的半数最大细胞毒性浓度(CD50)所定义的，例如，在比相同多价CD20结合分子组合物对CD20-细胞群体的CD50剂量低至少3倍的剂量。
根据本发明，可以以以下(a)与(b)的比率(a/b)的方式量化选择性细胞毒性：(a)对CD20+细胞群体的细胞毒性，(b)对CD20-细胞群体的细胞毒性。在某些实施方案中，所述细胞毒性比率指示，与CD20-细胞或CD20-细胞群体相比对CD20+细胞的群体或CD20+细胞群体高至少3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍或1000倍的选择性细胞毒性。例如，将本发明的多价CD20结合分子组合物的某些实施方案施用给两个就细胞外CD20靶生物分子的存在而言不同的细胞群体类型，所述多价CD20结合分子组合物能够造成CD20靶生物分子阳性细胞的细胞死亡，其CD50比对CD20靶生物分子阴性细胞的CD50小至少3倍。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物能够选择性地或优先地造成两个或更多个不同的细胞类型的混合物内的特定细胞类型的死亡。这会实现与不表达任何显著量的适当细胞外CD20靶标的“旁观者”细胞类型(例如，CD20阴性的细胞)相比高优先性(诸如至少3倍细胞毒性效应)的对特定细胞类型靶向细胞毒性活性。这会实现与不表达显著量的适当CD20靶标或没有在细胞表面暴露显著量的适当CD20靶标的“旁观者”细胞类型相比高优先性(诸如至少3倍细胞毒性效应)的对在细胞表面处表达CD20的特定细胞类型的靶向细胞杀死。
使用技术人员已知的多种方法，例如，FACS方法，可以确定在细胞或细胞群体的表面上表达的细胞外CD20的水平。如本文中使用的，在细胞表面处表达的细胞外CD20的显著量是通过FACS分析测得大于10,000、20,000、30,000、40,000或50,000平均荧光强度(MFI)，取决于细胞类型。
可替换地，本发明的某些多价CD20结合分子及其组合物能够与“旁观者”细胞类型相比以高优先性(诸如至少3倍细胞毒性效应)使细胞毒性活性靶向特定细胞类型，所述“旁观者”细胞类型是CD20+的，但是以比靶细胞更低的细胞表面量或密度表达CD20。因而，可以在其中一些CD20+细胞类型是旁观者细胞的多个CD20+细胞类型的混合物(诸如具有不同CD20表达水平的CD20+细胞类型的混合物)中完成一个CD20阳性细胞类型的优先杀死，且任选地还在有CD20阴性的细胞存在下。
在某些实施方案中，对与细胞外CD20靶标物理偶联的细胞类型群体的细胞毒性活性比对没有与显著量的本发明的细胞毒性的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标物理偶联的细胞类型群体的细胞毒性活性高至少3倍。根据本发明，可以以以下(a)与(b)的比率(a/b)的方式量化选择性细胞毒性：(a)对与显著量细胞毒性的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标物理偶联的细胞群体的细胞毒性，(b)对没有与显著量细胞毒性的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标物理偶联的细胞类型的细胞群体的细胞毒性。在某些实施方案中，所述细胞毒性比率指示，与不表达细胞外CD20靶标或没有与显著量的细胞毒性的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标物理偶联的细胞群体或细胞类型相比，对表达细胞外CD20靶标或与细胞毒性的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标物理偶联的细胞群体或细胞类型高至少3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍或1000倍的选择性细胞毒性。例如，将本发明的多价CD20结合分子组合物的某些实施方案施用给两个就细胞外CD20靶生物分子的存在而言不同的细胞群体类型，所述多价CD20结合分子组合物能够造成与一个或多个它的CD20结合区域的细胞外CD20靶生物分子物理偶联的细胞类型的细胞死亡，其CD50比没有与它的CD20结合区域的细胞外CD20靶标物理偶联的细胞类型的CD50小至少3倍。
在本发明的多价CD20结合分子组合物的某些实施方案中，将所述多价CD20结合分子组合物施用给两个不同细胞群体类型，所述多价CD20结合分子组合物能够造成由半数最大细胞毒性浓度(CD50)定义的第一细胞群体(其成员在细胞表面表达CD20)的细胞死亡，其剂量比相同多价CD20结合分子组合物对第二细胞群体(其成员不表达CD20、不表达显著量的CD20或没有暴露显著量的多价CD20结合分子组合物的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标)的CD50剂量低至少3倍。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物对在细胞表面处表达CD20的细胞类型群体的细胞毒性活性比对没有与任何细胞外CD20靶标(其被多价CD20结合分子组合物的多价CD20结合分子特异性地结合)物理偶联的细胞类型群体的细胞毒性活性高至少3倍。
根据本发明，可以以以下(a)与(b)的比率(a/b)的方式量化选择性细胞毒性：(a)对表达实施方案的CD20结合区域的细胞外CD20靶标的细胞群体的细胞毒性，(b)对没有与实施方案的CD20结合区域的任何细胞外CD20靶标物理偶联的细胞类型的细胞群体的细胞毒性。在某些实施方案中，所述细胞毒性比率指示，与不表达CD20的细胞群体或细胞类型相比，比表达CD20的细胞群体或细胞类型高至少3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍或1000倍的选择性细胞毒性。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子组合物对与细胞外CD20靶标物理偶联的细胞类型群体的细胞毒性活性比没有与显著量的细胞外CD20靶标(其被多价CD20结合分子组合物的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域特异性地结合)物理偶联的细胞类型群体的细胞毒性活性高至少3倍。根据本发明，可以以以下(a)与(b)的比率(a/b)的方式量化选择性细胞毒性：(a)对与显著量的本发明的细胞毒性的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标物理偶联的细胞群体的细胞毒性，(b)对没有与显著量的细胞毒性的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标物理偶联的细胞类型的细胞群体的细胞毒性。在某些实施方案中，所述细胞毒性比率指示，与不表达细胞外CD20靶标或没有与显著量的细胞外CD20靶标(其被本发明的细胞毒性的组合物的多价CD20结合分子的任意CD20结合区域特异性地结合)物理偶联的细胞群体或细胞类型相比，对表达细胞外CD20靶标或与本发明的组合物的细胞毒性的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标物理偶联的细胞群体或细胞类型高至少3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、750倍、1000倍或更多的选择性细胞毒性。例如，在将本发明的某些多价CD20结合分子组合物施用给两个就细胞外CD20靶生物分子的存在和/或多肽序列而言不同的细胞群体后，所述多价CD20结合分子组合物能够造成与细胞外CD20靶生物分子(其被所述组合物的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域结合)物理偶联的细胞类型的细胞死亡，例如，其CD50比对没有与所述组合物的任何多价CD20结合分子的细胞外CD20靶标物理偶联的细胞类型的结合的CD50小至少3倍。
在本发明的多价CD20结合分子组合物的某些实施方案中，在将所述多价CD20结合分子组合物施用给两个不同细胞群体类型后，所述多价CD20结合分子组合物能够造成由半数最大细胞毒性浓度(CD50)定义的第一细胞群体(其成员在细胞表面表达CD20)的细胞死亡，其剂量比相同多价CD20结合分子组合物对第二细胞群体(其成员不表达CD20、不表达显著量的CD20或没有暴露显著量的多价CD20结合分子组合物的任何细胞毒性的多价CD20结合分子的至少一个CD20结合区域的细胞外CD20靶标)的CD50剂量低至少3倍。
在不同的条件下，和在有非靶向的CD20-旁观者细胞存在下，诸如离体操作的细胞类型的混合物、与细胞类型的混合物一起体外培养的组织、或在体内在有多个细胞类型存在下(例如原位，在多细胞生物体内的天然位置，或在多细胞生物体内的疾病基因座)，该优先细胞杀死功能允许本发明的某些多价CD20结合分子及其组合物杀死靶向的CD20+细胞。
在某些实施方案中，在将本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物施用给细胞类型的混合物后，与缺乏细胞外CD20靶生物分子的任何细胞表面表达的细胞相比，所述多价CD20结合分子和/或其组合物能够选择性地杀死表达细胞外CD20靶生物分子的CD20+细胞。通过使用高亲和力CD20结合区域将酶活性的志贺毒素区域的递送靶向特定细胞类型，可以将该有效的和选择性的细胞杀死活性限制于仅杀死生物体内的表达CD20的细胞。
在本发明的某些实施方案中，将本发明的多价CD20结合分子及其组合物用于杀死疾病、病症或病患中的CD20+细胞，所述疾病、病症或病患涉及具有异常高的CD20表达和/或异位CD20表达的细胞。为了细胞杀死和/或白细胞郁滞，本发明的多价CD20结合分子及其组合物可以靶向不同类型的表达CD20的细胞。例如，存在不同类型的在不同生物学过程(包括自身免疫病症、肿瘤B-细胞增殖和超敏反应应答)中起作用的CD20+细胞。
C.额外外源物质向靶细胞内部的递送
除了直接细胞杀死以外，本发明的多价CD20结合分子及其组合物任选地可以用于将额外外源物质递送进靶细胞内部。额外外源物质的递送可以用于例如细胞毒性的功能、细胞生长抑制性的功能、信息收集功能和/或诊断功能。本发明的细胞毒性的多价CD20结合分子的无毒变体或任选的有毒变体可以用于将额外外源物质递送至和/或标记与细胞外CD20分子物理偶联的细胞的内部。为了接收外源物质，本发明的多价CD20结合分子可以靶向在一个或多个细胞表面处表达CD20的不同类型的细胞和/或细胞群体。本发明的功能组分是模块的，因为多种志贺毒素效应物区域和额外外源物质可以与多种CD20结合区域连接以制备本发明的不同多价CD20结合分子，其适合用于不同用途，诸如肿瘤细胞的非侵袭性体内成像。
因为细胞毒性的或无毒的多价CD20结合分子及其催化灭活形式能够进入与CD20分子物理偶联的细胞，所以本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案可以用于将额外外源物质递送进靶向的CD20+细胞类型的内部。在一个意义上，整个多价CD20结合分子是将进入靶细胞中的外源物质；因而，所述“额外”外源物质是与核心(多价CD20结合分子本身)连接但是并非核心的异源物质，所述核心仅由实现快速细胞内化和/或向期望的细胞内区室的有效亚细胞按路线发送所需的最少组分组成。
本文中使用的“额外外源物质”表示一种或多种分子，其经常一般不存在于天然CD20+靶细胞内，其中本发明的多价CD20结合分子可以用于将这样的物质特异性地运输进细胞内部。
额外外源物质的非限制性例子是细胞毒性剂、肽、多肽、蛋白、多核苷酸、小分子化学治疗剂、放射性核素和检测促进剂。
本发明的细胞毒性的CD20结合分子的无毒变体及其组合物或任选的有毒变体可以用于递送额外外源物质和/或标记与CD20分子(其被本发明的多价CD20结合分子结合)物理偶联的细胞的内部。为了杀死和/或接收外源物质(诸如检测促进剂)，本发明的多价CD20结合分子及其组合物可以靶向在细胞表面表达CD20的不同类型的细胞和/或细胞群体。本发明的系统是模块的，因为多种志贺毒素效应物区域和额外外源物质可以与相同结合区域连接以提供不同用途，例如，肿瘤细胞和/或免疫细胞的内部的非侵袭性体内成像。
在本发明的多价CD20结合分子及其组合物的某些实施方案中，为了将额外外源物质递送进细胞内部，所述额外外源物质是细胞毒性剂，例如，小分子化学治疗剂、细胞毒性的抗生素、烷化剂、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂和/或微管蛋白抑制剂。细胞毒性剂的非限制性例子包括氮杂环丙烷、顺铂、四嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、长春花生物碱、紫杉烷、喜树碱、依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌、替尼泊苷、新生霉素、阿柔比星、蒽环类抗生素、放线菌素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、多拉司他汀、美坦辛、多西他赛、阿霉素、卡奇霉素、耳他汀、吡咯并苯并二氮杂环庚三烯、卡铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨、丝裂霉素C、紫杉醇、1，3-双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲(BCNU)、利福平、顺铂、甲氨蝶呤和吉西他滨。
在某些实施方案中，所述额外外源物质包含蛋白或多肽，包括酶。在某些其它实施方案中，所述额外外源物质是核酸，例如，作为小抑制RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)起作用的核糖核酸。在某些实施方案中，所述额外外源物质是抗原，诸如从细菌蛋白、病毒蛋白、在癌症中突变的蛋白、在癌症中异常表达的蛋白或T-细胞互补决定区来源的抗原。例如，外源物质包括抗原，诸如被细菌感染的抗原呈递细胞所特有的那些抗原，和能够作为外源抗原起作用的T-细胞互补决定区。在某些实施方案中，所述额外外源物质包含促细胞凋亡的肽、多肽或蛋白，例如，BCL-2、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶、细胞色素、颗粒蛋白酶B、细胞凋亡诱导因子(AIF)、BAX、tBid(截短的Bid)和促细胞凋亡的片段或其衍生物(参见例如Ellerby H等人，Nat Med 5：1032-8(1999)；Mai J等人，Cancer Res 61：7709-12(2001)；Liu Y等人，Mol Cancer Ther 2：1341-50(2003)；Perea S等人，Cancer Res 64：7127-9(2004)；B等人，Cell Death Differ 13：576-85(2006)；Kwon M等人，Mol CancerTher 7：1514-22(2008)；Wang F等人，Clin Cancer Res 16：2284-94(2010)；Kim J等人，JVirol 85：1507-16(2011))。外源物质的其它例子包括比抗原性肽更大的蛋白，诸如酶。包含蛋白的外源物质可以任选地包含一种或多种抗原，无论是技术人员已知的还是未知的。
在本发明的多价CD20结合分子及其组合物的某些实施方案中，为了将额外外源物质递送进细胞内部，所述额外外源物质是一种或多种放射性核素，例如，211At、131I、125I、90Y、111In、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32p、60C和/或Lu的放射性同位素。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含要递送进细胞中的额外外源物质，且所述多价CD20结合分子包含在SEQ ID NO：51-52、59-61、64-65、71-73、76-77、82-83、88-89、94、100、106、109-112、115-118、124、132、140、145、150、156、162、168、171、174、180-181、189-190、193-194、200-202、205-206、211-212、217-218、223、229、235、238-241、244-247、253、261、269、274、279和285中的任一个中所示的蛋白；且任选地，所述蛋白还包含氨基端甲硫氨酸残基。在某些其它实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含两种蛋白或基本上由其组成，每种蛋白选自在SEQ ID NO：51-52、59-61、64-65、71-73、76-77、82-83、88-89、94、100、106、109-112、115-118、124、132、140、145、150、156、162、168、171、174、180-181、189-190、193-194、200-202、205-206、211-212、217-218、223、229、235、238-241、244-247、253、261、269、274、279和285中所示的多肽中的任一种；且任选地，每种蛋白进一步包含氨基端甲硫氨酸残基。在某些其它实施方案中，所述蛋白选自在SEQ ID NO：51-52、59-61、64-65、71-73、76-77、82-83、88-89、94、100、106、109-112、115-118、124、132、140、145、150、156、162、168、171和174中所示的蛋白中的任一种，且还包含二硫键，所述二硫键包含在选自以下位置处的半胱氨酸残基：242、482、483、484、490、491、492、493、494、495、499、500、501、502、503、504、505、510、511、512、513和521。
对于某些实施方案，在将所述多价CD20结合分子和/或其组合物施用给一个或多个与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，所述多价CD20结合分子内化进一个或多个所述细胞中并将额外外源物质递送进所述细胞或至少一些所述细胞的内部。
对于本发明的多价CD20结合分子及其组合物的某些实施方案，可以将细胞内化速率测量为在细胞内观察到本发明的多价CD20结合分子和/或大多数细胞与所述多价CD20结合分子和/或其组合物接触时的施用后时间(平均而言)。例如，抗-CD20单克隆抗体利妥昔单抗通常在37℃在大约16-18小时以后达到最大细胞内化，且因而，在本发明的上下文中，“快速内化”将指示，平均而言，在相同温度和受体占据水平，比关于利妥昔单抗观察到的内化速率快几小时的内化速率。
对于某些实施方案，在将所述多价CD20结合分子和/或其组合物施用给一个或多个与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内，所述多价CD20结合分子内化进一个或多个所述细胞并将额外外源物质递送进所述细胞的内部。对于某些其它实施方案，所述细胞在细胞表面表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述细胞与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述细胞是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述细胞选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
就本发明的某些实施方案的目的而言，短语“小于约30分钟”是指，在从使CD20阳性的细胞与本发明的多价CD20结合分子接触的步骤算起30分钟时或之前，观察到在内化测定时程中细胞内CD20、CD20抗原和/或多价CD20结合分子的最大(或半数最大，在某些上下文中)观察量，如在与37℃和50nM多价CD20结合分子类似的条件通过适当测定所确定的。通过对比在不同时间的细胞内积累以发现峰或高原，可以确定最大或半数最大细胞内积累的时间。如果观察到高原，那么可以确定最大细胞内积累是所述高原达到它的最高点时的第一时间。
细胞外CD20细胞表面密度和CD20结合分子的KD可以用于计算给定浓度的CD20结合分子诸如本发明的CD20结合分子或技术人员已知的参照CD20结合分子(例如单克隆抗体)的占据百分比。例如，可以将CD20受体占据确定为以下因素的函数：1)细胞外CD20受体和CD20结合分子之间的结合相互作用，2)可用于结合的细胞外CD20受体的量(例如，浓度或有效浓度)，和3)在给定情形下存在的CD20结合分子的量(例如，质量、浓度或摩尔浓度)。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子相对于本领域已知的CD20抗体的内化速率可以使用在可比较的细胞外CD20受体占据执行的测定来确定，而不是使用在可比较浓度的施用的CD20结合分子(即本发明的多价CD20结合分子和现有技术的参照抗-CD20抗体)执行的测定来确定。可以如下确定CD20受体占据百分比(ROCD20)：使用模型和公式，例如，
其中RO是在内化测定中细胞外CD20的受体占据，KD是目标CD20结合分子与细胞外CD20受体的解离常数，Atot是所述测定中的CD20结合分子的总数，且CD20tot是所述测定中的细胞表面CD20分子的总数(参见例如Muller P，Brennan F，Clin Pharmacol Ther 85：247-58(2009)；US 14/965,882)。
对于本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案，其包含额外外源物质；其中在将所述多价CD20结合分子或其组合物施用给多个与CD20(所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分)物理偶联的细胞后，在相当于5或38％至50％细胞表面占据的多价CD20结合分子浓度，在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内，所述多价CD20结合分子的大多数内化进所述多个细胞中并将所述额外外源物质递送进所述多个细胞的大多数的内部。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述多个细胞的成员是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述多个细胞的成员选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
因为本发明的某些多价CD20结合分子及其组合物表现出特异性的细胞靶向和有效的细胞内化(例如在施用以后30分钟内)，为了杀死细胞的目的，可以将与本发明的多价CD20结合分子缀合的细胞毒性负荷(例如，细胞毒性剂、核糖核酸、抗原和/或促细胞凋亡肽)有效地递送进表达CD20的细胞中。因为本发明的某些多价CD20结合分子及其组合物表现出选择性的细胞靶向和有效的细胞内化(例如在施用以后30分钟内)，为了在有其它细胞(包括表达比靶向的细胞更低水平的CD20的其它表达CD20的细胞)存在下杀死细胞的目的，可以将与本发明的多价CD20结合分子缀合的细胞毒性负荷(例如，细胞毒性剂、核糖核酸、抗原和/或促细胞凋亡肽)选择性地和有效地递送进表达CD20的细胞中。
D.用于诊断功能的信息收集
本发明的某些多价CD20结合分子及其组合物可以用在特定细胞、细胞类型、细胞群体和/或前述任一种的亚细胞区室的体外和/或体内检测中。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子及其组合物用于诊断和治疗，或用于单独的诊断。当将相同细胞毒性的多价CD20结合分子用于诊断和治疗时，可以如下使包含用于诊断的检测促进剂的细胞毒性的多价CD20结合分子变体成为无毒的：通过一个或多个氨基酸置换，例如，本文描述的示例性置换，将它的志贺毒素效应物区域催化灭活。与检测促进剂缀合的本发明的细胞毒性的多价CD20结合分子的无毒形式任选地可以用于诊断功能，诸如用于与包含相同或相关CD20结合区域(用于细胞靶向)的治疗方案联合使用的伴侣诊断。
将本领域已知的检测促进剂与本发明的各种细胞毒性的多价CD20结合分子缀合的能力提供了用于检测癌症、肿瘤和免疫细胞、以及前述对象的亚细胞区室的有用组合物。本发明的多价CD20结合分子及其组合物的这些诊断实施方案可以用于通过本领域已知的多种成像技术和测定进行的信息收集。例如，本发明的多价CD20结合分子的诊断实施方案可以用于通过患者或活组织检查样品中的单个癌细胞、赘生性细胞、恶性肿瘤细胞、非恶性肿瘤细胞、免疫细胞和/或血液学细胞的细胞内细胞器(例如内吞区室、高尔基区室、内质网区室和细胞溶质区室)的成像进行的信息收集。
使用本发明的多价CD20结合分子及其组合物的诊断实施方案(无论是用于诊断应用还是其它应用)，可以收集不同类型的信息。该信息可以用于，例如，诊断CD20阳性的赘生性细胞类型；确定患者的疾病的治疗敏感性；测定抗肿瘤治疗随时间的进展；测定免疫调节治疗随时间的进展；测定抗微生物治疗随时间的进展；评价不希望的CD20+细胞类型在移植物中的存在；和/或评价肿瘤块的外科手术切除以后残余肿瘤细胞的存在。
例如，使用用本发明的多价CD20结合分子及其组合物的诊断变体收集的信息，可能确定患者亚群，然后可以基于使用那些诊断实施方案揭示的他们的独特特征将各个患者进一步归类到亚群中。例如，特定药物或治疗的有效性可能是用于定义患者亚群的一类判据。例如，可以使用本发明的特定细胞毒性的多价CD20结合分子和/或其组合物的无毒诊断变体区分哪些患者属于预期对相同细胞毒性的多价CD20结合分子或其它有关分子的细胞毒性变体做出阳性应答的患者的类别或亚群。因此，使用细胞毒性的多价CD20结合分子和它们的无毒变体、以及它们的组合物进行患者鉴别、患者分级和诊断的有关方法被认为是在本发明范围内。
IV.本发明的多价CD20结合分子的蛋白性组分的变化
技术人员会认识到，可以对本发明的多价CD20结合分子(和编码它们的多核苷酸和/或它们的组分)做出变化，而不减少它们的生物活性，例如通过维持给定的多价CD20结合分子的总结构和功能。例如，有些修饰可以促进表达、促进纯化、改善药代动力学性能、改善蛋白稳定性和/或改善免疫原性。这样的修饰是技术人员众所周知的，且包括，例如，将甲硫氨酸添加在氨基端以提供起始位点，将另外氨基酸放置在任一端上以产生方便地定位的限制位点或终止密码子，和使生化亲和标签与任一端融合以提供方便的检测和/或纯化。一种改善多肽的免疫原性的常见修饰是，在多肽生产以后，除去开始甲硫氨酸残基，其可能在细菌宿主系统中生产过程中被甲酰基化，因为，例如，氨基端甲酰基甲硫氨酸(fMet)的存在可能在脊索动物中诱导不希望的免疫应答。
在本文中还预见到在氨基端和/或羧基端包括另外的氨基酸残基，诸如表位标签或其它部分的序列。所述另外的氨基酸残基可以用于多种目的，包括，例如，促进克隆、表达、翻译后修饰、合成、纯化、检测和/或施用。表位标签和部分的非限制性例子是：壳多糖结合蛋白结构域、肠肽酶切割位点、因子Xa切割位点、FIAsH标签、FLAG标签、绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽-S-转移酶部分、HA标签、麦芽糖结合蛋白结构域、myc标签、聚组氨酸标签、ReAsH标签、strep-标签、strep-标签II、TEV蛋白酶位点、硫氧还蛋白结构域、凝血酶切割位点和V5表位标签。
在某些上述实施方案中，本发明的多价CD20结合分子是这样的变体：其中存在一个或多个引入蛋白性区域中的保守氨基酸置换。本文中使用的术语“保守置换”表示，一个或多个氨基酸被另一个生物学上相似的氨基酸残基替换。例子包括具有相似特征(例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水氨基酸和芳族氨基酸)的氨基酸残基的置换(参见，例如，以下表B)。使用通常不存在于内源哺乳动物肽和蛋白中的残基的保守置换的一个例子是利用例如鸟氨酸、刀豆氨酸、氨基乙基半胱氨酸或另一种碱性氨基酸对精氨酸或赖氨酸残基的保守置换。关于与肽和蛋白中表现型上沉默的置换相关的其它信息，参见，例如，Bowie J等人，Science 247：1306-10(1990)。
表B.保守氨基酸置换的例子
在表B的保守置换方案中，示例性的保守氨基酸置换根据物理化学性质进行分组——I：中性的、亲水的；II：酸和酰胺；III：碱性的；IV：疏水的；V：芳族的、庞大氨基酸，VI亲水的、不带电荷的，VII脂族不带电荷的，VIII非极性的不带电荷的，IX环烯基相关的、X疏水的，XI极性的，XII小的，XIII允许旋转的，和XIV柔性的。例如，保守氨基酸置换包括以下的：1)S可以置换C；2)M或L可以置换F；3)Y可以置换M；4)Q或E可以置换K；5)N或Q可以置换H；和6)H可以置换N。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子或本发明的多价CD20结合分子组合物可以包含这样的蛋白：其与本文中列举的蛋白序列相比具有最多20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸置换，只要所述多价CD20结合分子保留必要的生物活性。
作为如下改变本发明的多价CD20结合分子的蛋白性组分的结果，本文提供的多价CD20结合分子的变体是在本发明范围内：改变一个或多个氨基酸或删除或插入一个或多个氨基酸(例如，在CD20结合区域或志贺毒素效应物区域内)，以便实现期望的性能，例如，改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制作用、改变的免疫原性和/或改变的血清半衰期。本发明的多价CD20结合分子或本发明的多价CD20结合分子组合物的多肽组分还可以具有或没有信号序列。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子的蛋白性组分或本发明的多价CD20结合分子组合物与本文中列举的分子的氨基酸序列中的任一个共享至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性，只要所述蛋白性组分单独地和/或作为本发明的多价CD20结合分子的组分保留可测量的生物活性，诸如细胞毒性、细胞外CD20靶生物分子结合、酶促催化或亚细胞按路线发送。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子的蛋白性组分可以包含本发明的多肽区域的功能片段或变体，所述功能片段或变体与本文列举的多肽序列相比具有最多20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸置换，只要所述被置换的蛋白单独地和/或作为本发明的多价CD20结合分子的组分保留可测量的生物活性。
在某些实施方案中，本发明的组合物的多价CD20结合分子的蛋白性组分与本文列举的蛋白的氨基酸序列中的任一个共享至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的氨基酸序列同一性，只要所述蛋白保留可测量的生物活性，诸如细胞毒性、细胞外CD20靶生物分子结合、酶促催化或亚细胞按路线发送。多价CD20结合分子的CD20结合区域可以不同于本文列举的CD20结合区域的氨基酸序列，只要所述CD20结合区域保留与CD20的细胞外部分的结合功能性。如果CDR或ABR的氨基酸序列是相同的，结合功能性最可能得到保留。例如，多价CD20结合分子是在权利要求范围内，其中所述CD20结合区域包含一个或多个与本文列举的CD20结合区域具有85％氨基酸同一性或基本上由其组成的CD20结合区域，为了确定氨基酸同一性程度的目的，形成CDR或ABR的氨基酸残基被忽视。技术人员使用标准技术可以确定细胞外CD20结合功能性。
本发明还提供了本发明的多价CD20结合分子的变体，其中所述志贺毒素效应物区域与天然存在的志贺毒素A亚基相差多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40个或更多个氨基酸残基(但是不超过保留至少85％、90％、95％、99％或更多氨基酸序列同一性的程度)。因而，从志贺毒素家族的成员的A亚基来源的多肽区域可以包含来自原始序列的添加、缺失、截短或其它改变，只要与天然存在的志贺毒素A亚基维持至少85％、90％、95％、99％或更多的氨基酸序列同一性。
因此，在某些实施方案中，所述志贺毒素效应物区域包含与天然存在的志贺毒素A亚基诸如SLT-1A(SEQ ID NO：1)、StxA(SEQ ID NO：2)和/或SLT-2A(SEQ ID NO：3)具有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％总序列同一性的氨基酸序列或基本上由其组成。
任选地，志贺毒素A亚基的全长或截短形式可以包含一个或多个突变(例如置换、缺失、插入或倒置)。在本发明的某些实施方案中优选的是，所述志贺毒素效应物区域与天然存在的志贺毒素A亚基具有足够的序列同一性以在进入细胞后保留细胞毒性，所述进入是通过众所周知的宿主细胞转化、转染、感染或诱导的方法，或者通过与志贺毒素效应物区域连接的细胞靶向CD20结合区域介导的内化。在志贺毒素A亚基中对于酶活性和/或细胞毒性而言最关键的残基已经映射至以下残基-位置：天门冬素-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170和精氨酸-176以及其它(Di R等人，Toxicon 57：525-39(2011))。在本发明的任一个实施方案中，所述志贺毒素效应物区域可以优选地但不一定在某些位置维持一个或多个保守氨基酸，诸如在StxA、SLT-1A中的位置77、167、170和176处或在其它志贺毒素家族的成员的等同保守位置(其通常是细胞毒性活性所必需的)处发现的那些。使用本领域众所周知的许多测定中的任一种或多种，可以测量本发明的细胞毒性的多价CD20结合分子的造成细胞死亡的能力，例如它的细胞毒性。
在本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案中，为了增加所述分子的志贺毒素效应物区域中的一个或多个的酶活性，可以突变、插入或删除一个或多个氨基酸残基。例如，将Stx1A中的残基-位置丙氨酸-231突变成谷氨酸盐会增加Stx1A的体外酶活性(SuhanM，Hovde C，Infect Immun 66：5252-9(1998))。
在本发明的多价CD20结合分子的某些实施方案中，为了减少或消除所述分子的志贺毒素效应物区域中的一个或多个的催化和/或细胞毒性活性，可以突变或删除一个或多个氨基酸残基。通过突变或截短可以减少或消除志贺毒素家族的成员的A亚基的催化和/或细胞毒性活性。已经证实用酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114和色氨酸-203标记的位置对于Stx、Stx1和Stx2的催化活性而言是重要的。将谷氨酸-167和精氨酸-170突变会消除Slt-I A1在无细胞核糖体灭活测定中的酶活性。在另一个使用Slt-I A1在内质网中的从头表达的方案中，将谷氨酸-167和精氨酸-170突变或将它截短至残基1-239会在该表达水平消除Slt-I A1片段细胞毒性。
在某些实施方案中，可以改变志贺毒素效应物区域以改变它的酶活性和/或细胞毒性，只要所述志贺毒素效应物区域保留一种或多种其它志贺毒素效应物功能。该改变可以导致或不导致改变的志贺毒素效应物区域是其组分的分子的细胞毒性的改变。可能的改变包括志贺毒素效应物区域的选息以下的突变：截短、缺失、倒置、插入、重排和置换。
通过突变或截短可以改变、减小或消除志贺毒素家族的成员的A亚基的细胞毒性。已经证实用酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170、酪氨酸-114和色氨酸-203标记的位置对于Stx、Stx1和Stx2的催化活性而言是重要的。将谷氨酸-167和精氨酸-170突变会消除Slt-I A1在无细胞核糖体灭活测定中的酶活性。在另一个使用Slt-I A1在内质网中的从头表达的方案中，将谷氨酸-167和精氨酸-170突变会在该表达水平消除Slt-I A1片段细胞毒性。截短分析证实，StxA的残基75-268的片段仍然保留显著的体外酶活性。通过胞质溶胶中的从头表达，含有残基1-239的Slt-I A1的截短片段显示出显著的体外酶活性和细胞毒性。截短至残基1-239的Slt-I A1片段在内质网中的表达不是细胞毒性的，因为Slt-I A1截短体不能逆转移至胞质溶胶。
在志贺毒素A亚基中对酶活性和/或细胞毒性而言最关键的残基已经被映射至以下残基位置：天门冬素-75、酪氨酸-77、谷氨酸-167、精氨酸-170和精氨酸-176等。具体地，含有谷氨酸-E167-至-赖氨酸和精氨酸-176-至-赖氨酸突变的Stx2A的双突变构建体被完全灭活；而Stx1和Stx2中的许多单一突变显示出细胞毒性的10倍降低。此外，将Stx1A截短至1-239或1-240会降低它的细胞毒性，并且类似地，将Stx2A截短至保守疏水残基会降低它的细胞毒性。
在志贺毒素A亚基中对于结合真核核糖体和/或真核核糖体抑制而言最关键的残基已经映射至以下残基-位置：精氨酸-172、精氨酸-176、精氨酸-179、精氨酸-188、酪氨酸-189、缬氨酸-191和亮氨酸-233等。
志贺样毒素1A亚基截短体是催化活性的，能够在体外酶促灭活核糖体，并且当在细胞内表达时是细胞毒性的。表现出全酶活性的最小志贺毒素A亚基片段是由Slt1A的残基1-239组成的多肽。尽管据报道保留基本催化活性的志贺毒素A亚基的最小片段是StxA的残基75-247，在真核细胞内从头表达的StxA截短体仅需要直到残基240以从内质网到达胞质溶胶并且造成核糖体的催化灭活。
在包含从SLT-1A(SEQ ID NO：1)或StxA(SEQ ID NO：2)来源的志贺毒素效应物区域的本发明的某些多价CD20结合分子中，这些突变变化包括位置75处的天冬酰胺、位置77处的酪氨酸、位置114处的酪氨酸、位置167处的谷氨酸、位置170处的精氨酸、位置176处的精氨酸的置换和/或位置203处的色氨酸的置换。对于技术人员而言，基于现有技术，这种置换的例子将是已知的，诸如位置75处的天冬酰胺置换为丙氨酸、位置77处的酪氨酸置换为丝氨酸、位置114处的酪氨酸置换为丝氨酸、位置167处的谷氨酸置换为天冬氨酸、位置170处的精氨酸置换为丙氨酸、位置176处的精氨酸置换为赖氨酸、和/或位置203处的色氨酸置换为丙氨酸。
在某些实施方案中，将本发明的多价CD20结合分子去免疫化(参见例如，WO 2015/113005和WO 2015/113007)。在某些实施方案中，本发明的去免疫化的多价CD20结合分子包含在SEQ ID NO：49-51、63-64、75-76、81-82、87-88、93-94、99-100、105-106、111-112、117-118、122-124、131-132、139-140、144-145、149-150、155-156、161-162、167-168、171、174、178-180、192-193、204-205、210-211、216-217、222-223、228-229、234-235、240-241、246-247、251-253、260-261、268-269、273-274、278-279、284-285、290和296中的任一个中所示的蛋白；且任选地，所述蛋白还包含氨基端甲硫氨酸残基。在某些其它实施方案中，本发明的多价CD20结合分子包含两种蛋白或基本上由其组成，每种蛋白选自在SEQ ID NO：49-51、63-64、75-76、81-82、87-88、93-94、99-100、105-106、111-112、117-118、122-124、131-132、139-140、144-145、149-150、155-156、161-162、167-168、171、174、178-180、192-193、204-205、210-211、216-217、222-223、228-229、234-235、240-241、246-247、251-253、260-261、268-269、273-274、278-279、284-285、290和296中所示的多肽中的任一种；且任选地，每种蛋白进一步包含氨基端甲硫氨酸残基。在某些其它实施方案中，所述蛋白选自在SEQ IDNO：49-51、63-64、75-76、81-82、87-88、93-94、99-100、105-106、111-112、117-118、122-124、131-132、139-140、144-145、149-150、155-156、161-162、167-168、171和174中所示的蛋白中的任一种，且还包含二硫键，所述二硫键包含在选自以下位置处的半胱氨酸残基：242、482、483、484、490、491、492、493、494、495、499、500、501、502、503、504、505、510、511、512、513和521。
本发明的多价CD20结合分子可以任选地缀合至一种或多种另外的试剂，诸如本领域已知的治疗剂和/或诊断剂，包括如本文中所述的这样的试剂。
V.本发明的多价CD20结合分子及其组合物的生产、制备和纯化
使用本领域技术人员众所周知的生化工程技术，可以生产本发明的多价CD20结合分子及其组合物。例如，通过标准合成方法，通过使用重组表达系统，或通过任意其它合适的方法，可以制造本发明的多价CD20结合分子及其组合物。可以将本发明的多价CD20结合分子生产为融合蛋白、化学偶联的缀合物和/或它们的组合，例如，与本发明的多价CD20结合分子的一个或多个其它组分共价地连接的融合蛋白组分。因而，可以以多种方式合成本发明的多价CD20结合分子，所述方式包括、例如包括以下步骤的方法：(1)使用标准固相或液相方法、分步地或通过片段组装来合成本发明的多价CD20结合分子的多肽或多肽组分，并且分离和纯化最终的蛋白性化合物产物；(2)在宿主细胞中表达编码本发明的多价CD20结合分子的多肽或多肽组分的多核苷酸，并且从宿主细胞或宿主细胞培养物中回收表达产物；或(3)进行编码本发明的多价CD20结合分子的多肽或多肽组分的多核苷酸的无细胞体外表达，并且回收表达产物；或者通过(1)、(2)或(3)的方法的任意组合以获得本发明的多价CD20结合分子的蛋白性组分的片段，随后将片段结合(例如连接)以获得本发明的多价CD20结合分子的蛋白性组分，并且纯化或回收所述蛋白性组分。例如，使用偶联剂，例如，N，N’-二环hexy碳二亚胺和N-乙基-5-苯基-异噁唑鎓-3＇-磺酸盐(Woodward的试剂K)，可以将多肽和/或肽组分连接在一起。
可能优选的是，借助于固相或液相肽合成来合成本发明的多价CD20结合分子的多肽或多肽组分。可以适当地通过标准合成方法生产本发明的多价CD20结合分子。因而，可以通过例如这样的方法来合成多肽：所述方法包括通过标准固相或液相方法、分步地或通过片段组装来合成多肽，并且将最终的多肽产物分离并纯化。在该背景下，可以参考WO 1998/11125，或尤其是Fields G等人，Principles and Practice of Solid-Phase PeptideSynthesis(Synthetic Peptides，Grant G，编，Oxford University Press，U.K.，第2版，2002)以及其中的合成实施例。
使用本领域众所周知的重组技术，可以制备(生产和纯化)本发明的多价CD20结合分子。一般而言，通过培养用包含编码多核苷酸的载体转化或转染的宿主细胞并且从细胞培养物中回收蛋白来制备所述蛋白的方法被描述于，例如Sambrook J等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，U.S.，1989)；Dieffenbach C等人，PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，N.Y.，U.S.，1995)。任意合适的宿主细胞可以用于生产本发明的多价CD20结合分子的蛋白性组分和/或本发明的多价CD20结合蛋白。宿主细胞可以是被一种或多种表达载体稳定地或瞬时地转染、转化、转导或感染的细胞，所述表达载体驱动本发明的多价CD20结合蛋白和/或本发明的多价CD20结合分子的蛋白性组分的表达。另外，可以如下生产本发明的多价CD20结合蛋白：修饰本文描述的编码本发明的多价CD20结合分子或其蛋白性组分的多核苷酸，这会导致改变一个或多个氨基酸或删除或插入一个或多个氨基酸，以便实现期望的性能，诸如改变的细胞毒性、改变的细胞生长抑制作用、改变的免疫原性和/或改变的血清半衰期。
存在多种表达系统可供选择来生产本发明的多价CD20结合蛋白和/或本发明的多价CD20结合分子的蛋白性组分。例如，用于表达本发明的多价CD20结合蛋白和/或本发明的多价CD20结合分子的蛋白性组分的宿主生物包括：原核生物，诸如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，真核细胞，诸如酵母和丝状真菌(如酿酒酵母(S.cerevtsiae)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、泡盛曲霉(A.awamori)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis))，藻类(如莱茵衣藻(C.reinhardtii))，昆虫细胞系，哺乳动物细胞(如CHO细胞)，植物细胞系，和真核生物诸如转基因植物(如拟南芥(A.thaliana)和本赛姆氏烟草(N.benthamiana))。(参见例如，Pack P，Plückthun A，Biochem istry(Mosc)31：1579-84(1992)；Blanco B等人，J Immunol 171：1070-7(2003)；Sánchez-Arevalo Lobo V等人，Int J Cancer 119：455-62(2006)；Mazor Y等人，Nat Biotechnol 25：563-5(2007)；Schoonooghe S等人，BMCBiotechnol 9：70(2009)；Chan C等人，PLoS One 5：e10261(2010)；Cuesta M等人，TrendsBiotechnol 28：355-62(2010)；Gershenson A，Gierasch L，CurrOpin Struct Biol 21：32-41(2011)；Hutchins B等人，J Mol Biol406：595-603(2011)；Powers G等人，MethodsMol Biol 907：699-712(2012)；Wang L等人，Protein Eng Des Sel 26：417-23(2013)；Blanco-Toribio A等人，Microb Cell Fact 13：116(2014)；Spadiut O等人，Trends Biotechnol 32：54-60(2014)；Turki I等人，Mol Immunol 57：66-73(2014)；Blanco-Toribio A等人，AMB Expr 5：45(2015))；N等人，Drug DiscovToday 20：588-94(2015))。
因此，本发明也提供了根据以上所述方法并且使用以下物质生产本发明的多价CD20结合分子的方法：(i)编码本发明的多价CD20结合分子的蛋白性组分和/或本发明的多价CD20结合蛋白的部分或全部的多核苷酸，(ii)包含至少一种本发明的多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸当引入合适的宿主细胞或无细胞表达系统中时能够编码本发明的多价CD20结合分子和/或本发明的多价CD20结合蛋白的部分或全部，和/或(iii)包含本发明的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。
当使用重组技术在宿主细胞或无细胞系统中表达蛋白时，有利的是，从其它组分诸如宿主细胞因子中分离(或纯化)出期望的蛋白，从而获得高纯度的或基本均质的制品。纯化可以通过本领域众所周知的方法完成，诸如离心技术、萃取技术、层析和分级分离技术(例如，通过凝胶过滤的尺寸分离、通过离子交换柱的电荷分离、疏水相互作用层析法、反相层析法、在硅胶或阳离子交换树脂诸如DEAE等上的层析法、层析聚焦、和蛋白A琼脂糖层析法，以除去污染物)，以及沉淀技术(例如乙醇沉淀或硫酸铵沉淀)。任何数量的生物化学纯化技术可以用于增加本发明的多价CD20结合分子的纯度。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子可以任选地以同多聚体形式(例如两个或更多个相同的CD20结合蛋白的蛋白复合物)或以异多聚体形式(例如两个或更多个不同的CD20结合蛋白的蛋白复合物)纯化。
在下面的实施例中描述了用于生产本发明的多价CD20结合分子及其组合物的方法的非限制性实施例，以及本发明的某些公开的、示例性的、细胞毒性的多价CD20结合分子的生产的具体的、但是非限制性的方面。
VI.被固定化在固体基质上的本发明的分子
本发明的某些实施方案包括被固定化在固体基质上的本发明的分子(例如，多价CD20结合分子或其任何效应物片段)。在本文中预见到的固体基质包括、但不限于微珠、纳米颗粒、聚合物、基体材料、微阵列、微孔滴定板或本领域已知的任何固体表面(参见例如US7,771,955)。根据这些实施方案，使用技术人员已知的技术，可以将本发明的分子共价地或非共价地连接至固体基质，例如，珠子、颗粒或平板(参见例如Jung Y等人，Analyst 133：697-701(2008))。本发明的固定化的分子可以用于使用本领域已知的技术的筛选用途(参见例如Bradbury A等人，Nat Biotechnol 29：245-54(2011)；Sutton C，Br J Pharmacol166：457-75(2012)；Diamante L等人，Protein Eng Des Sel 26：713-24(2013)；HoulihanG等人，J Immunol Methods 405：47-56(2014))。
本发明的分子可以在其上面固定化的固体基质的非限制性例子包括：微珠、纳米颗粒、聚合物、纳米聚合物、纳米管、磁珠、顺磁珠子、超顺磁珠子、抗生蛋白链菌素包被的珠子、反相磁珠、羧基封端的珠子、肼封端的珠子、硅石(钠硅石)珠子和亚氨基二乙酸(IDA)修饰的珠子、醛修饰的珠子、环氧活化的珠子、二氨基二丙胺(DADPA)修饰的珠子(具有伯胺表面基团的珠子)、可生物降解的聚合物珠子、聚苯乙烯基质、氨基-聚苯乙烯颗粒、羧基-聚苯乙烯颗粒、环氧-聚苯乙烯颗粒、二甲基氨基-聚苯乙烯颗粒、羟基-聚苯乙烯颗粒、有色的颗粒、流式细胞计量术颗粒、磺酸盐-聚苯乙烯颗粒、硝酸纤维素表面、补强的硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃表面、活化的玻璃表面、活化的石英表面、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、基于聚丙烯酰胺的底物、聚氯乙烯基质、聚甲基丙烯酸甲酯基质、聚(二甲基硅氧烷)基质、和含有能形成共价键的光反应性物质(诸如氮烯、碳烯和羰基(ketyl)残基)的光聚合物。本发明的分子可以在其上面固定化的固体基质的其它例子是在分子展示系统中常用的，例如，细胞表面、噬菌体和病毒颗粒。
VII.包含本发明的多价CD20结合分子的药物和诊断组合物
本发明提供了多价CD20结合分子，其单独地或与一种或多种另外的治疗剂组合地在药物组合物中用于治疗或预防以下更详细地描述的病患、疾病、病症或症状(例如癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常和免疫病症)。本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的多价CD20结合分子或根据本发明的其药学上可接受的盐或溶剂合物，以及至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。在某些实施方案中，本发明的药物组合物可以包含为同多聚体和/或异多聚体的多价CD20结合分子。本发明的药物组合物可用在治疗、改善、或预防以下更详细地描述的疾病、病患、病症或症状的方法中。预期每种这样的疾病、病患、病症或症状是就根据本发明的药物组合物的应用而言的单独实施方案。本发明还提供了用在至少一种如以下更详细地描述的根据本发明的治疗方法中的药物组合物。
本文中使用的术语“患者”和“受试者”互换使用以表示表现出至少一种疾病、病症或病患的症状、征象和/或指征的任何生物体，通常是脊椎动物诸如人类和动物。这些术语包括哺乳动物诸如灵长类动物、家畜动物(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、伴侣动物(例如猫、狗等)和实验动物(例如小鼠、兔、大鼠等)的非限制性例子。
本文中使用的“治疗”或“处理”及其语法变体表示用于获得有益的或期望的临床结果的方案。该术语可以表示延缓病患、病症或疾病的发作或发展速度，减轻或缓解与其有关的症状，产生病患的全部或部分消退，或者以上任何的一些组合。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括、但不限于：症状的减轻或缓解、疾病程度的降低、疾病状态的稳定(例如不恶化)、疾病进展的推迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及康复(无论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”或“处理”还可以是指相对于在不接受治疗的情况下预期的存活时间延长存活。需要治疗的受试者(例如人)因此可以是已经罹患所讨论的疾病或病症的受试者。术语“治疗”或“处理”包括相对于不存在治疗的情况抑制或减轻病理学状态或症状的严重程度的增加，并且不一定意味着暗示相关疾病、病症或病患的完全停止。关于肿瘤和/或癌症，治疗包括总肿瘤负荷和/或单个肿瘤大小的减小。
本文中使用的术语“防止”、“预防”及其语法变体表示用于预防病患、疾病或病症的发展或者改变病患、疾病或病症的病理学的方案。因此，“预防”可以表示预防或防止的措施。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括、但不限于：预防或减慢疾病的症状、进展或发展，无论是否是可检测的还是不可检测的。需要预防的受试者(例如人)因此可以是尚未罹患所讨论的疾病或病症的受试者。术语“预防”包括相对于不存在治疗的情况减慢疾病的发作，并且不一定意图暗示相关疾病、病症或病患的永久性预防。因此病患的“预防”在某些上下文中可以表示降低发展病患的风险，或者预防或延迟与该病患有关的症状的发展。
本文中使用的“有效量”或“治疗有效量”是在受试者中产生至少一种期望的治疗效果的组合物(例如治疗组合物、化合物或试剂)的量或剂量，诸如预防或治疗靶病患或有益地缓解与该病患有关的症状。最合乎需要的治疗有效量是将会产生由本领域技术人员为有此需要的给定受试者选择的具体治疗的期望效力的量。该量将随技术人员理解的多种因素变化，包括、但不限于，治疗组合物的特征(包括活性、药代动力学、药效动力学和生物利用度)，受试者的生理条件(包括年龄、性别、疾病类型、疾病阶段、一般身体状况、对给定剂量的应答性、和药物的类型)，制剂中一种或多种药学上可接受的载体的性质，和施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过例行实验确定治疗有效量，即通过监测受试者对组合物的施用的应答并且相应地调节剂量(参见例如Remington：The Science andPractice of Pharmacy(Gennaro A，编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，U.S.，第19版，1995))。
诊断组合物包含本发明的多价CD20结合分子和一种或多种检测促进剂。当生产或制备本发明的诊断组合物时，本发明的多价CD20结合分子可以直接地或间接地连接至一种或多种检测促进剂。存在众多技术人员已知的用于将各种检测促进剂掺入、附加和/或缀合至蛋白或分子的蛋白性组分(特别是免疫球蛋白和免疫球蛋白来源的结构域)的标准技术。
本发明的诊断组合物包含本发明的多价CD20结合分子和一种或多种检测促进剂。各种检测促进剂是本领域已知的，诸如同位素、染料、比色测量剂、反差增强剂、荧光剂、生物发光剂和磁性剂。这些试剂可以在任意合适的位置与多价CD20结合分子结合、连接和/或掺入在其中。例如，检测促进剂的连接或掺入可以是通过本发明的多价CD20结合分子的氨基酸残基，或通过本领域已知的某些连接类型，包括通过接头和/或螯合剂。检测促进剂与本发明的诊断组合物的多价CD20结合分子的结合是以这样的方式：在筛选、测定、诊断操作和/或成像技术中，能够检测多价CD20结合分子和其诊断组合物的存在。
存在技术人员已知的众多检测促进剂，它们可以可操作地结合或连接至本发明的多价CD20结合分子用于信息收集方法，诸如用于针对生物体的疾病、病症或病患的诊断和/或预后应用。例如，检测促进剂包括增强图像的造影剂，诸如荧光染料(例如Alexa680、吲哚菁绿和Cy5.5)、同位素和放射性核素，诸如11C、13N、15O、18F、32p、51Mn、52mMn、52Fe、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72As、73Se、75Br、76Br、82mRb、83Sr、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、110In、111In、120I、123I、124I、125I、131I、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、177Lu、186Re、188Re和223R；顺磁离子，诸如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)；金属，诸如镧(III)、金(III)、铅(II)和铋(III)；超声-反差增强剂，诸如脂质体；不透射线的试剂，诸如钡、镓和铊化合物。通过使用中间官能团，诸如螯合剂如2-苄基DTPA、PAMAM、NOTA、DOTA、TETA、其类似物和前述任一种的功能等同物，可以直接地或间接地掺入检测促进剂。
本领域中存在技术人员已知的众多成像方案，诸如在医学领域中常用的非侵袭性体内成像技术，例如：计算机体层摄影术成像(CT scanning)、光学成像(包括直接的、荧光的和生物发光的成像)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)、超声和x-射线计算机体层摄影术成像。
短语“诊断足够量”表示利用的特定测定或诊断技术为了信息收集目的提供适当检测和准确测量的量。通常，用于完整生物体内诊断用途的诊断足够量将是每位受试者每千克(kg)受试者0.001mg至1mg之间与多价CD20结合分子连接的检测促进剂的非累积剂量(mg/kg)。通常，在这些信息收集方法中使用的本发明的多价CD20结合分子的量将尽可能地低，前提条件是，它仍然是诊断足够量。例如，对于在生物体中的体内检测，施用给受试者的本发明的多价CD20结合分子或诊断组合物的量将在可行时尽可能地低。
包含本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物的药物和/或诊断组合物的生产 或制备
本发明的多价CD20结合分子中的任一种的药学上可接受的盐或溶剂合物是在本发明范围内。
术语“溶剂合物”在本发明的上下文中表示在溶质(例如在本发明中，根据本发明的蛋白性化合物或其药学上可接受的盐)和溶剂之间形成的确定化学计量的复合物。在这方面的溶剂可以是，例如，水、乙醇或另一种药学上可接受的、通常为小分子的有机物质，例如，但不限于，乙酸或乳酸。当所讨论的溶剂是水时，这样的溶剂合物通常被称为水合物。
可以将本发明的多价CD20结合分子或其盐配制成为了贮存或施用而制备的药物组合物，所述药物组合物通常包含在药学上可接受的载体中的治疗有效量的本发明的分子或组合物或其盐。术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的药物载体。用于治疗用途的药学上可接受的载体是制药领域中众所周知的，并且描述于例如Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.(A.Gennaro，编，1985))中。本文中使用的“药学上可接受的载体”包括任意的和所有的生理上可接受的(即相容的)溶剂、分散介质、包衣剂、抗微生物剂等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体或稀释剂包括在适合用于口服、直肠、鼻或胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内、真皮内和透皮)施用的制剂中使用的那些。示例性的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。可以在本发明的药物组合物中采用的合适水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、和它们的合适混合物，植物油诸如橄榄油，以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣材料如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂。在某些实施方案中，所述载体适合用于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于所选择的施用途径，可以将本发明的多价CD20结合分子或其它药物组分包被在物质中，所述物质意图保护多价CD20结合分子和/或其化合物免于当通过特定施用途径施用给患者时本发明的活性多价CD20结合分子可能遇到的低pH和其它天然灭活条件的作用。
本发明的药物组合物的制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。以这种形式，将组合物分入含有适当量的活性组分的单位剂量中。单位剂型可以是包装的制剂，含有离散量的制剂的包装，例如，小包片剂、胶囊剂、和在管形瓶或安瓿瓶中的粉剂。单位剂型还可以是胶囊剂、扁囊剂、或片剂本身，或者它可以是适当数量的这些包装形式中的任一种。它可以以单次剂量可注射形式例如以笔的形式提供。可以为任意合适的施用途径和方式配制组合物。皮下或透皮施用模式可以特别适用于本文描述的药物组合物和治疗分子。
本发明的药物组合物还可以含有佐剂诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌操作，和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保防止微生物的存在。组合物中的等渗剂，诸如糖、氯化钠等，也可能是合乎需要的。此外，通过包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射药物形式的延长吸收。
本发明的药物组合物还任选地包括药学上可接受的抗氧化剂。示例性的药学上可接受的抗氧化剂是水溶性的抗氧化剂诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油溶性的抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的不同的多价CD20结合分子或前述任一种的酯、盐或酰胺中的一种或组合，以及至少一种药学上可接受的载体。
治疗组合物通常在制造和储存条件下是无菌和稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体、或适合高药物浓度的其它有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，包括，例如，水、醇诸如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇)、或任何合适的混合物。可以维持适当的流动性，例如，通过使用包衣诸如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸，以及通过本领域众所周知的制剂化学使用表面活性剂。在某些实施方案中，等渗剂(例如糖类，多元醇诸如甘露醇、山梨醇，或氯化钠)可以是在组合物中合乎需要的。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
用于真皮内或皮下应用的溶液或混悬液通常包括以下一种或多种：无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和张度调节剂例如，氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱(诸如盐酸或氢氧化钠)或者含有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐等的缓冲液调节pH。这样的制品可以封装在安瓿瓶、一次用弃注射器或由玻璃或塑料制成的多次剂量管形瓶中。
可以如下制备无菌注射溶液：将所需量的本发明的多价CD20结合分子掺入含有上述成分中的一种或组合的适当溶剂中，当需要时，随后灭菌微滤。通过将活性化合物掺入含有分散介质和其它成分(诸如上述的那些)的无菌媒介物中，可以制备分散体。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(低压冻干法)，其产生活性成分以及来自其无菌过滤溶液的任何另外期望成分的粉末。
当将治疗有效量的本发明的多价CD20结合分子设计为通过例如静脉内、皮肤或皮下注射来施用时，结合剂将呈无热原的、胃肠外可接受的水溶液的形式。考虑到适当的pH、等渗性、稳定性等，用于制备胃肠外可接受的蛋白溶液的方法是在本领域技术内。除了结合剂之外，用于静脉内、皮肤、或皮下注射的优选药物组合物将含有等渗媒介物诸如氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、含有乳酸盐的林格氏注射液、或本领域已知的其它媒介物。本发明的药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂、或本领域技术人员众所周知的其它添加剂。
如本文别处所述，本发明的多价CD20结合分子或其组合物(例如药物或诊断组合物)可以用保护本发明的多价CD20结合分子免于快速释放的载体来制备，诸如受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂、和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备这样的制剂的方法被授予专利或是本领域技术人员通常已知的(参见例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems(Robinson J，编，Marcel Dekker，Inc.，NY，U.S.，1978)。
在某些实施方案中，可以将本发明的组合物(例如药物或诊断组合物)配制成确保在体内的期望分布。例如，血脑屏障排除许多大的和/或亲水的化合物。为了将本发明的治疗分子或组合物靶向至特定体内位置，可以将它配制在例如脂质体中，所述脂质体可以包含被选择性地运输进特定细胞或器官中的一个或多个部分，从而增强靶向药物递送。示例性的靶向部分包括叶酸盐或生物素；甘露糖苷；抗体；表面活性蛋白A受体；p120联蛋白等。
药物组合物包括被设计成用作植入物或微粒系统的胃肠外制剂。植入物的例子是由聚合的或疏水的组分(诸如乳剂、离子交换树脂和可溶性的盐溶液)组成的贮库制剂。微粒系统的例子是微球、微粒、纳米囊、纳米球和纳米颗粒。使用对离子敏感的聚合物，例如，脂质体、polaxamer 407和羟磷灰石，可以制备控释制剂。
使用本领域已知的技术可以生产本发明的药物组合物，使得生产的组合物包含乳剂、脂质体、类脂囊泡、聚合物纳米颗粒和/或固体脂质纳米颗粒(SLN)(参见例如Lakshmi P等人，Venereal Leprol 73：157-161(2007)；A Revolution in Dosage Form Design andDevelopment，Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems(Sezer A，编，InTech，2012))。
VIII.本发明的多核苷酸、表达载体和宿主细胞
除了本发明的多价CD20结合分子及其组合物以外，编码这样的多价CD20结合分子的多核苷酸、这样的多价CD20结合分子的蛋白性组分或其功能部分也被包括在本发明范围内。术语“多核苷酸”等同于术语“核酸”，其中的每一个包括以下的一个或多个：脱氧核糖核酸(DNA)的聚合物、核糖核酸(RNA)的聚合物、使用核苷酸类似物产生的这些DNA或RNA的类似物、以及它们的衍生物、片段和同源物。本发明的多核苷酸可以是单链的、双链的或三链的。这样的多核苷酸被具体公开为包括所有能够编码示例性蛋白的多核苷酸，例如，考虑已知在RNA密码子的第三位中可容忍的但是编码与不同RNA密码子相同的氨基酸的摆动(wobble)(参见Stothard P，Biotechniques 28：1102-4(2000))。
在一个方面，本发明提供了多核苷酸，其编码本发明的多价CD20结合分子(例如本发明的多价CD20结合蛋白)或其组分、片段或衍生物。所述多核苷酸可以包括例如这样的核酸序列：其编码的多肽与包含本发明的多价CD20结合分子的全部或部分的氨基酸序列之一的多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多的同一性。本发明还包括这样的多核苷酸：其包含在严谨条件下与编码本发明的多价CD20结合分子的全部或部分、或其片段或衍生物的多核苷酸杂交的核苷酸序列，或者任何这样的序列的反义物或互补物。
本发明的多核苷酸(或多价CD20结合蛋白)的衍生物或类似物尤其包括这样的多核苷酸(或多肽)分子：其具有与本发明的多核苷酸或多价CD20结合蛋白基本上同源的区域，例如与相同大小的多核苷酸或多肽序列具有至少约45％、50％、70％、80％、95％、98％或甚至99％同一性(具有80-99％的优选同一性)，或当与比对序列进行对比时，其中所述比对通过本领域已知的计算机同源性程序进行。一种示例性的程序是使用默认设置的GAP程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for UNIX，Genetics ComputerGroup，University Research Park，Madison，WI，U.S.)，其使用Smith T，Waterman M，Adv.Appl.Math.2：482-9(1981)的算法。还包括能够在严谨条件下与编码本发明的多价CD20结合蛋白的序列的的互补物杂交的多核苷酸(参见例如Ausubel F等人，CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons，New York，NY，U.S.，1993))，以及以下。严谨条件是本领域技术人员已知的，并且可以在例如Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Sons，NY，U.S.，Ch.Sec.6.3.1-6.3.6(1989))中找到。
本发明还提供了包含本发明范围内的多核苷酸的表达载体。使用本领域众所周知的材料和方法，可以将能够编码本发明的多价CD20结合蛋白的多核苷酸插入已知载体(包括细菌质粒、病毒载体和噬菌体载体)中以产生表达载体。这样的表达载体将包括支持在任何选择的宿主细胞或无细胞表达系统(例如，pTxb1和pIVEX2.3)内生产本发明的预见到的多价CD20结合蛋白所必需的多核苷酸。用于与特定类型的宿主细胞或无细胞表达系统一起使用的、包含特定多核苷酸的表达载体是本领域普通技术人员众所周知的，可以使用例行实验确定，或者可以购买。
本文中使用的术语“表达载体”表示包含一个或多个表达单元的直线或环形的多核苷酸。术语“表达单元”表示编码目标多肽并且能够提供核酸区段在宿主细胞中的表达的多核苷酸区段。表达单元通常包含均处于可操作构型的转录启动子、编码目标多肽的开放读码框和转录终止子。表达载体含有一个或多个表达单元。因而，在本发明的上下文中，编码包含单个多肽链的蛋白(例如在遗传上与志贺毒素效应物区域重组的scFv)的表达载体至少包括所述单个多肽链的表达单元，而包含例如两个或更多个多肽链(例如一个链包含VL结构域，且第二个链包含与毒素效应物区域连接的VH结构域)的蛋白至少包括两个表达单元，所述蛋白的两个多肽链中的每一个具有一个表达单元。对于本发明的多链蛋白的表达，每个多肽链的表达单元还可以单独地包含在不同的表达载体上(例如，可以用已经在其中引入每个多肽链的表达载体的单个宿主细胞实现表达)。
能够指导多肽和蛋白的瞬时或稳定表达的表达载体是本领域众所周知的。表达载体通常包括，但不限于以下一个或多个：异源信号序列或肽、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列，其中的每一个均为本领域众所周知的。任选的调节控制序列、整合序列、和可以采用的可用标记物是本领域已知的。
术语“宿主细胞”表示可以支持表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞诸如大肠杆菌，或者真核细胞(例如酵母、昆虫、两栖动物、鸟或哺乳动物细胞)。使用本领域已知的标准技术，可以实现包含本发明的多核苷酸或能够生产本发明的多价CD20结合蛋白的宿主细胞系的创建和分离。
在本发明范围内的分子和组合物可以包含如下产生的本文描述的多价CD20结合分子的变体或衍生物：通过改变一个或多个氨基酸或者删除或插入一个或多个氨基酸(这可以使它更适合实现期望的性能，诸如被宿主细胞更佳地表达)，修饰编码本发明的多价CD20结合分子的蛋白性组分和/或本发明的多价CD20结合蛋白的多核苷酸。
IX.递送装置和试剂盒
在某些实施方案中，本发明涉及一种装置，其包含用于递送给有此需要的受试者的根据本发明的一种或多种组合物，诸如药物组合物。因而，包含本发明的一种或多种蛋白性组合物(例如本发明的多价CD20结合分子)的递送装置可以用于通过多种递送方法给患者施用根据本发明的组合物，所述递送方法包括：静脉内、皮下、肌肉内或腹膜内注射；口服施用；透皮施用；肺或透粘膜施用；通过植入物、渗透泵、筒或微量泵施用；或通过本领域技术人员公知的其它方式。
试剂盒也在本发明范围内，所述试剂盒包含根据本发明的至少一种组合物和任选的包装和使用说明书。试剂盒可用于药物施用和/或诊断信息收集。本发明的试剂盒可以任选地包含至少一种另外的试剂(例如，标准品、标志物等)。试剂盒通常包括标签，所述标签指示试剂盒的内容物的预期用途。所述试剂盒还可以包含用于检测在样品中或在受试者中的细胞类型(例如肿瘤细胞)或用于诊断患者是否属于对利用如本文中所述的本发明的多价CD20结合分子、组合物或有关方法的治疗策略做出应答的群体的试剂和其它工具。
X.使用根据本发明的组合物的示例性方法
通常，本发明的一个目的是提供药理学上有活性的试剂、以及包含它们的组合物，它们可以用于预防和/或治疗疾病、病症和病患，诸如某些癌症、肿瘤、生长异常、免疫病症、或在本文中提及的其它病理学状况。因此，本发明提供了使用本发明的多价CD20结合分子及其组合物(诸如本发明的药物组合物)的方法，其用于靶向杀死表达CD20的细胞，用于将另外的外源物质递送进某些表达CD20的细胞中，用于标记某些表达CD20的细胞的内部，用于收集诊断信息，和用于治疗如本文中所述的多种疾病、病症和病患。
具体地，本发明的一个目的是提供这样的药理学上有活性的试剂、组合物和/或方法，其与本领域目前已知的试剂、组合物和/或方法相比具有某些优点。因此，本发明提供了使用特征在于特定蛋白性组分的本发明的多价CD20结合分子及其组合物的方法。例如，SEQID NO：1-304所示的分子中的任一个可以具体地用作在下述方法中使用的多价CD20结合分子或组合物的组分。
本发明提供了杀死细胞的方法，所述方法包括下述步骤：使所述细胞在体外或在体内与多价CD20结合分子和/或其组合物接触。在使一个或多个细胞与要求保护的主题组合物之一接触以后，本发明的多价CD20结合分子及其组合物可以用于杀死特定细胞类型。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物可以用于杀死不同细胞类型的混合物中的特定CD20+细胞类型，诸如包含CD20+癌细胞、肿瘤细胞、血液学细胞、免疫细胞和/或受感染的细胞的混合物。
本发明提供了杀死细胞的方法，所述方法包括下述步骤：使细胞与本发明的多价CD20结合分子、本发明的多价CD20结合分子组合物和/或本发明的药物组合物接触；其中所述细胞与CD20物理偶联，所述CD20具有被多价CD20结合分子的两个或更多个结合区域或本发明的组合物的多价CD20结合分子结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述接触细胞的步骤在体外进行。对于某些其它实施方案，所述接触细胞的步骤在体内进行。对于某些其它实施方案，所述细胞在细胞表面处表达CD20，所述CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞是CD20阳性细胞。对于某些实施方案，所述细胞与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述细胞是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述细胞选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
本发明的多价CD20结合分子及其组合物具有多种应用，包括、例如，用于从体外或体内组织除去不希望的CD20+细胞类型，用于调节免疫应答以治疗移植物抗宿主病，和用于净化移植组织的不希望的CD20+细胞类型。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物可以用于杀死不同细胞类型的混合物中的CD20+癌细胞。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物可以用于杀死不同细胞类型的混合物中的特定CD20+细胞类型，诸如在移植前组织中的细胞。在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物可以用于杀死细胞类型的混合物中的特定CD20+细胞类型，诸如用于治疗目的的施用前组织材料中的细胞。
在某些实施方案中，当施用给受试者的体外或体内细胞群体(例如，在需要治疗的患者中)时，单独的或与其它化合物或药物组合物组合的本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物可以表现出有效细胞杀死活性。通过使用高亲和力结合区域将酶活性的志贺毒素区域的递送靶向至CD20，可以使该有效的细胞杀死活性限于特异性地和选择性地杀死生物体内的某些细胞类型，诸如某些CD20阳性的癌细胞、赘生性细胞、恶性肿瘤细胞、非恶性肿瘤细胞和/或免疫细胞。
在人类中，CD20由处于某些细胞发育阶段的正常B-细胞谱系细胞以及众多成熟的B-细胞肿瘤(诸如在NHL和CLL中)表达。另外，CD20由成熟的T-细胞和NK-细胞肿瘤表达。CD20由正常T-细胞以及恶性T-细胞的子集表达，诸如在T-细胞淋巴瘤(TCL)包括蕈样肉芽肿病(MF)、天然杀伤细胞淋巴瘤(NK-细胞淋巴瘤)、周围T-细胞淋巴瘤(PTCL)和皮肤T-细胞淋巴瘤中。在T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGLL)中，CD20由恶性T-细胞表达。
本发明提供了一种在有此需要的患者中杀死CD20+细胞的方法，所述方法包括下述步骤：给所述患者施用至少一种本发明的多价CD20结合分子或其组合物，例如，包含本发明的多价CD20结合分子的药物组合物。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物可用于杀死在细胞表面表达升高水平的CD20的恶性细胞。本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物对于杀死在细胞表面表达升高水平的CD20的赘生性细胞而言是特别有用的。
本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物的某些实施方案可以用于杀死患者中的表达CD20的癌症和/或肿瘤细胞，例如，B-细胞或T-细胞癌症。术语“癌细胞”或“癌性细胞”表示以异常加速的和/或失调的方式生长和分裂的各种赘生性细胞，且是技术人员显而易见的。术语“肿瘤细胞”包括恶性的和非恶性的细胞(例如非癌性的、良性的肿瘤细胞和非癌性的“癌症”干细胞、肿瘤干细胞、恶化前的癌症开始细胞、肿瘤开始细胞或致瘤细胞-它们都可以产生变成恶性肿瘤和/或癌细胞、但是不能独立转移的子代细胞(参见例如Martinez-Climent J等人，Haematologica 95：293-302(2010))。通常，癌症和/或肿瘤可以定义为适合治疗和/或预防的疾病、病症或病患。赘生性细胞经常与以下一种或多种相关：失调的生长、分化的缺失、局部组织侵入、血管生成和转移。可能受益于本发明的方法和组合物的、由癌细胞和/或肿瘤细胞构成的癌症和肿瘤(恶性的或非恶性的)是技术人员显而易见的。本发明可以用于杀死癌症干细胞、肿瘤干细胞、恶化前的癌症开始细胞和肿瘤开始细胞，它们通常是缓慢分裂的并且对癌症治疗如化学疗法和辐射具有抗性。例如，使用本发明的多价CD20结合分子可以诊断和/或治疗具有有限恶性潜力的涉及细胞的病症的以下非限制性例子：单克隆B-细胞淋巴细胞增多(MBL)、局限性滤泡淋巴瘤(局限性FL)、胃结节外边缘区(MALT)淋巴瘤和滤泡内瘤形成(Limpens J等人，Oncogene 6：2271-6(1991)；Liu H等人，Lancet 357：39-40(2001)；Richard P等人，J Clin Pathol 59：995-6(2006)；Roulland S等人，J Exp Med 203：2425-31(2006)；Marti G等人，Br J Haematol 139：701-8(2007)；Aqel N等人，Histopathology 52：256-60(2008)；Rawstron A等人，N Engl J Med359：575-83(2008))。类似地，使用本发明的多价CD20结合分子可以检测和/或治疗癌症开始细胞和/或癌症干细胞，例如，急性髓性白血病(AML)干细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤(B-细胞NHL)开始细胞、慢性髓性白血病(CML)干细胞、霍奇金淋巴瘤(HL或HD)干-样细胞和套细胞淋巴瘤(MCL)开始细胞(参见例如Hope K等人，Nat Immunol 5：738-43(2004)；Wang J，Dick J，TrendsCell Biol 15：494-501(2005)；Ishikawa F等人，Nat Biotechnol 25：1315-21(2007)；Jones R等人，Blood 113：5920-6(2009)；Chen Z等人，Stem Cell Res 5：212-225(2010)；Chomel J等人，Blood 118：3657-60(2011)；Druker B，J Clin Invest121：396-409(2011)；Gerber J等人，Blood 119：3571-7(2012))。
通过靶向被发现与免疫细胞物理偶联的CD20的细胞外部分，本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物的某些实施方案可以用于杀死患者中的免疫细胞(健康的或恶性的)。本发明的多价CD20结合分子及其组合物的某些实施方案可以用于杀死患者中的健康的CD20+免疫细胞。CD20由处于某些细胞发育阶段的正常B-细胞谱系细胞表达(vanMeerten T等人，Clin Cancer Res 12：4027-35(2006))。CD20由正常T-细胞的子集表达(Martin B等人，J Cutan Pathol 38：663-9(2011))。
为了以下目的利用本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物是在本发明范围内：净化患者细胞群体(例如骨髓)的恶性的、肿瘤性的、或在其它方面不希望的T-细胞和/或B-细胞，然后将除去了B-细胞和/或T-细胞的物质重新输入患者中。
为了以下目的利用本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物是在本发明范围内：从取自患者的分离的细胞群体离体除去B-细胞和/或T-细胞。在一个非限制性实施例中，本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物可以用在用于预防器官和/或组织移植排斥的方法中，其中在移植本发明的细胞毒性的多价CD20结合分子和/或其组合物之前灌注供体器官或组织，以便净化器官的不希望的供体B-细胞和/或T-细胞。
为了以下目的利用本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物也是在本发明范围内：从供体细胞群体除去B-细胞和/或T-细胞作为要接受骨髓和/或干细胞移植的患者中针对移植物抗宿主病和耐受性诱导的预防。
通过使用本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物对宿主B-细胞和/或T-细胞的靶向细胞杀死给骨髓接受者提供宿主抗移植物疾病的预防或治疗，是在本发明范围内(参见例如Sarantopoulos S等人，Biol Blood Marrow Transplant 21：16-23(2015))。
另外，本发明提供了治疗患者中疾病、病症或病患的方法，所述方法包括下述步骤：给有此需要的患者施用治疗有效量的至少一种本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物。可以使用该方法治疗的预见到的疾病、病症和病患包括癌症、恶性肿瘤、非恶性肿瘤、生长异常和免疫病症。“治疗上有效剂量”的本发明的组合物的施用可以导致疾病患状的严重程度的降低，无疾病患状阶段的频率和持续时间的增加，或由疾病折磨而导致的损害或残疾的预防。
本发明的组合物的治疗有效量将取决于施用途径、所治疗的哺乳动物的类型、和在考虑中的特定患者的体格特征。这些因素以及它们与确定这种量的关系是医学领域的技术从业人员众所周知的。这种量和施用方法可以进行调节以实现最佳效力，并且可以取决于医学领域的技术人员众所周知的因素，如重量、饮食、并存的药物和其它因素。最适用于人类用途的剂量大小和定量施用方案可以由通过本发明得到的结果指导，并且可以在适当地设计的临床试验中确认。通过常规方式，在实验动物中以低剂量开始并且然后在监测效果的同时增加剂量、以及系统性地改变给药方案，可以确定有效剂量和治疗方案。当为给定受试者确定最佳剂量时，临床医师可以考虑许多因素。这样的考虑因素是技术人员已知的。
可接受的施用途径可以表示在本领域中已知的任何施用途径，包括但不限于气雾剂、肠内、鼻、眼、口服、胃肠外、直肠、阴道或透皮(例如，乳膏、凝胶或软膏的局部施用，或借助于透皮贴剂)。“胃肠外施用”通常与在预期作用部位处的注射有关或与预期作用部位连通，包括眶下、输注、动脉内、囊内、心内、真皮内、肌肉内、腹膜内、肺内、椎管内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、透粘膜或经气管施用。
关于本发明的药物组合物的施用，剂量范围通常将为约0.0001-100毫克/千克(mg/kg)受试者体重，并且更通常为0.01-5mg/kg宿主体重。示例性剂量可以是0.25mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。一个示例性的治疗方案是每天一次或两次施用，或每周一次或两次施用，每两周一次，每三周一次，每四周一次，每月一次，每两个月或三个月一次或者每三至6个月一次。剂量可以由熟练的健康护理专业人员根据需要选择并重新调节以使对于特定患者而言的治疗益处最大化。
本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物通常将会在多种情形下施用给相同患者。单次剂量之间的间隔可以是，例如，1-4天、每周、每月、每两个月或三个月、每六个月、或每年。基于调节活性化合物的血液水平或基于在受试者或患者中存在的其它标志物、适应症或征象，施用之间的间隔也可以是不规律的。本发明的化合物(例如本发明的多价CD20结合分子组合物)的剂量方案包括1mg/kg体重或3mg/kg体重的静脉内施用，其中将化合物每两至四周施用一次达六个剂量，然后以3mg/kg体重或1mg/kg体重每三个月施用一次。
使用本领域已知的多种方法中的一种或多种，可以经由一种或多种施用途径施用本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物。如技术人员将会理解的，施用的途径和/或模式将会根据期望的结果而变化。本发明的多价CD20结合分子组合物、药物组合物和诊断组合物的施用途径包括，例如静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其它胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。在其它实施方案中，本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物可以通过非胃肠外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内地、口服地、阴道地、直肠地、舌下地或局部地。
利用本领域已知的多种医疗装置中的一种或多种，可以施用本发明的治疗性多价CD20结合分子和/或其组合物。例如，在一个实施方案中，可以利用无针皮下注射装置施用本发明的药物组合物。在本领域中具有可用于本发明的众所周知的植入物和模块的例子，包括例如，用于受控速率递送的可植入微量输液泵；用于穿过皮肤施用的装置；用于以精确的输注速率递送的输液泵；用于连续药物递送的可变流可植入输注装置；以及渗透药物递送系统。这些和其它这样的植入物、递送系统、和模块是本领域技术人员已知的。
本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物可以单独施用或者与一种或多种其它治疗剂或诊断剂联合施用。联合治疗可以包括与至少一种其它治疗剂组合的本发明的多价CD20结合分子和/或其药物组合物，所述其它治疗剂基于待治疗的特定患者、疾病或病患而选择。其它这样的药剂的例子包括，尤其是，细胞毒性的抗癌剂或化学治疗剂、抗炎或抗增殖剂、抗微生物或抗病毒剂、生长因子、细胞因子、镇痛药、治疗活性的小分子或多肽、单链抗体、经典抗体或其片段、或调节一个或多个信号传递途径的核酸分子、以及在治疗性或预防性处理方案中互补的或在其它方面有益的类似调节治疗剂。
用本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物对患者的治疗优选地导致靶向的CD20+细胞的细胞死亡和/或靶向的CD20+细胞的生长的抑制。这样，本发明的某些多价CD20结合分子和包含它们的药物组合物将可用在治疗多种病理学病症(其中杀死或除去CD20+靶细胞可能是有益的，例如尤其是癌症、肿瘤、免疫病症和涉及CD20+细胞的生长异常)的方法中。本发明提供了用于抑制细胞增殖和治疗细胞病症(包括瘤形成、过度活跃的B-细胞和过度活跃的T-细胞)的方法。
CD20由在多种恶性肿瘤中涉及的细胞表达，所述恶性肿瘤是例如血液学疾病、风湿性疾病、血液学癌症、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、B-细胞淋巴瘤、B-细胞非霍奇金淋巴瘤(B-细胞NHL)、伯基特淋巴瘤(BL)、B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-细胞CLL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL或DLBL)、滤泡淋巴瘤(FL)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HD)、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤(B-LBL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)和T-细胞淋巴瘤(TCL)、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植物排斥、移植物抗宿主病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒症综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化、结节性多动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和/或血管炎。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物可以用于治疗或预防癌症、肿瘤(恶性的和非恶性的)、生长异常和免疫病症。在另一个方面，以上离体方法可以与以上体内方法组合以提供治疗或预防骨髓移植接受者中的排斥的方法和用于实现免疫耐受的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了治疗哺乳动物受试者(诸如人)中的恶性肿瘤或肿瘤和其它血细胞相关癌症的方法，所述方法包括下述步骤：给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物。
本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物具有多种用途，包括，例如，用于除去不希望的B-细胞和/或T-细胞，用于调节免疫应答以治疗移植物抗宿主病，用作抗病毒剂，用作抗微生物剂，和用于净化移植组织的不希望的细胞类型。本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物通常是抗肿瘤剂——意味着它们能够通过抑制CD20+癌症、肿瘤或肿瘤细胞的生长和/或造成其死亡而治疗和/或预防肿瘤或恶性细胞的发育、成熟或传播。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物用于治疗B-细胞-、浆细胞-、T-细胞-或抗体-介导的疾病或病症，例如血液学疾病、风湿性疾病、血液学癌症、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、B-细胞淋巴瘤、B-细胞非霍奇金淋巴瘤(B-细胞NHL)、伯基特淋巴瘤(BL)、B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-细胞CLL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL或DLBL)、滤泡淋巴瘤(FL)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HD)、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤(B-LBL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)和T-细胞淋巴瘤(TCL)、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植物排斥、移植物抗宿主病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒症综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化、结节性多动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和/或血管炎。
为了杀死患者中B-细胞和/或T-细胞的目的，通过将本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物施用给患者而提供由B-细胞和/或T-细胞介导的疾病或病患的预防或治疗，是在本发明范围内。该用法与准备或调理患者用于骨髓移植、干细胞移植、组织移植或器官移植相容，无论移植的物质的来源，例如人或非人来源。
使用本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物通过宿主T-细胞的CD20+细胞杀死而提供骨髓接受者用于预防或治疗宿主抗移植物疾病，是在本发明范围内。
本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物可以用在治疗癌症的方法中，所述方法包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的蛋白组合物或药物组合物。对于本发明的方法的某些实施方案，正在治疗的病症、疾病或障碍涉及血液学疾病、风湿性疾病、血液学癌症、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、B-细胞淋巴瘤、B-细胞非霍奇金淋巴瘤(B-细胞NHL)、伯基特淋巴瘤(BL)、B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-细胞CLL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL或DLBL)、滤泡淋巴瘤(FL)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HD)、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤(B-LBL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)和T-细胞淋巴瘤(TCL)、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植物排斥、移植物抗宿主病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒症综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化、结节性多动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和/或血管炎。
用本发明的多价CD20结合分子和组合物可以治疗的血液学癌症(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)的亚型的非限制性例子包括急性髓性白血病(急性髓性白血病或AML)、急性非淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、B-细胞非霍奇金淋巴瘤(B-细胞NHL)、B-细胞急性成淋巴细胞性白血病(B-ALL或BCP-ALL)、B-细胞幼淋巴细胞白血病(B-PLL)、B-成淋巴细胞性淋巴瘤(B-LBL)、伯基特淋巴瘤(BL)、非典型伯基特淋巴瘤(非典型BL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、皮肤的B-细胞淋巴瘤(CBCL)、弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL或DLBL)、滤泡淋巴瘤(FL)、毛细胞白血病(HCL)、重链病、霍奇金淋巴瘤(HL或HD)、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病(LG或LYG)、淋巴浆细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘带淋巴瘤(MZL)、多发性骨髓瘤(MM)、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤(NLPHL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、浆母细胞淋巴瘤(PBL)、伴随多中心卡斯尔曼病的浆母细胞淋巴瘤、浆细胞赘瘤、浆细胞性骨髓瘤、原发性渗出性淋巴瘤(PEL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGLL)、T-细胞淋巴瘤(TCL)、周围T-细胞淋巴瘤(PTCL)、T-细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、蕈样霉菌病(MF)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。
本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物可以用在治疗免疫病症的方法中，所述方法包括：给有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物。对于本发明的方法的某些实施方案，所述免疫病症与炎症有关，所述炎症与选自由以下组成的组的疾病有关：淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植物排斥、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、格雷夫斯眼病、桥本甲状腺炎、重链病、溶血性尿毒症综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化、视神经脊髓炎谱群障碍、N-甲基D-天冬氨酸酯(NMDA)受体脑炎、眼球阵挛肌阵挛综合征(OMS)、阵发性夜间血红蛋白尿、结节性多动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、巩膜炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和血管炎。
在本发明的某些实施方案中是使用本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物作为药物组合物或药物的组分，所述药物组合物或药物用于治疗或预防癌症、肿瘤、免疫病症和/或涉及CD20+细胞的生长异常。例如，在减少炎症的努力中，可以用这样的药物治疗在患者的皮肤上呈现的免疫病症。在另一个实施例中，在减小肿瘤大小或完全消除肿瘤的努力中，可以用这样的药物治疗皮肤肿瘤。
对于某些癌症，B-细胞的除去和/或抑制通常可能改善疾病结果，例如，通过排除癌症逃逸促进调节性B-细胞(参见例如Olkhanud P等人，Cancer Res 69：5996-6004(2009)；Olkhanud P等人，Cancer Res 71：3505-15(2011))。
在本发明的某些实施方案中是诱导多价CD20结合分子细胞内化进细胞中和/或内化被本发明的多价CD20结合分子结合的、细胞表面定位的CD20的方法，所述方法包括下述步骤：使所述细胞与本发明的多价CD20结合分子、本发明的多价CD20结合分子组合物、本发明的药物组合物和/或本发明的诊断组合物接触。对于该诱导内化方法的某些实施方案，所述细胞与CD20物理偶联，所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于诱导细胞内化方法的某些其它实施方案，所述接触细胞的步骤在体外进行。对于某些其它实施方案，所述接触细胞的步骤在体内(例如，在患者内)进行。对于诱导细胞内化方法的某些其它实施方案，所述多价CD20结合分子的细胞内化在适合所述细胞的生理温度和/或在约37摄氏度在约5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间内发生。对于某些其它实施方案，所述细胞在细胞表面处表达这样的CD20，其(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述细胞与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述细胞是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述细胞选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于某些实施方案，本发明的方法提供了在患者中诱导被多价CD20结合分子结合的、细胞表面定位的CD20的细胞内化的方法，所述方法包括下述步骤：给所述患者施用本发明的多价CD20结合分子、本发明的多价CD20结合分子组合物、本发明的药物组合物和/或本发明的诊断组合物。
另外，本发明提供了用于将外源物质递送到细胞内部的方法，所述方法包括下述步骤：使所述细胞在体外或在体内与包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子、本发明的多价CD20结合分子组合物(其含有包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子)、本发明的药物组合物(其含有包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子)和/或本发明的诊断组合物(其含有包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子)接触。对于某些其它实施方案，所述细胞与CD20物理偶联，所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些其它实施方案，所述细胞在细胞表面处表达这样的CD20，其(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，(2)具有跨膜结构域，和(3)保持与所述细胞物理偶联。对于某些其它实施方案，所述细胞是CD20阳性的细胞。对于某些实施方案，所述细胞与显著量的细胞外CD20物理偶联，所述细胞外CD20(1)具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分。对于某些实施方案，所述细胞是B-细胞谱系的后代或成员。对于某些实施方案，所述细胞选自：恶性B-细胞、B-细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞骨髓瘤细胞、急性髓性白血病细胞、急性非淋巴细胞白血病细胞、B-细胞慢性淋巴细胞白血病细胞、B-细胞淋巴瘤细胞、B-细胞非霍奇金淋巴瘤细胞、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病细胞、B-细胞幼淋巴细胞白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、慢性髓性白血病细胞、弥漫性大B细胞性淋巴瘤细胞、滤泡淋巴瘤细胞、毛细胞白血病细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、肿瘤浆细胞、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、浆母细胞淋巴瘤细胞、浆细胞性骨髓瘤细胞、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤细胞、恶性T-细胞、T-细胞白血病细胞、T-细胞淋巴瘤细胞、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病细胞、T-细胞幼淋巴细胞白血病、健康的B-细胞谱系细胞和/或健康的T-细胞。
对于某些实施方案，本发明提供了一种将外源物质(例如，用于收集诊断信息的检测促进剂)递送至患者中的细胞的内部的方法，所述方法包括下述步骤：给所述患者施用包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子、本发明的多价CD20结合分子组合物(其含有包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子)、本发明的药物组合物(其含有包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子)和/或本发明的诊断组合物(其含有包含额外外源物质的本发明的多价CD20结合分子)。
在本发明的某些实施方案中是为了收集关于以CD20细胞表面表达为特征的疾病、病症和/或障碍的信息的目的使用本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物(例如本发明的诊断组合物)检测细胞(例如，表达CD20的细胞、CD20阳性的细胞、CD20+细胞类型和/或细胞物理偶联ed with显著量细胞表面CD20)的存在的方法，其特征在于细胞表面可接近的CD20的量的变化，和/或与CD20细胞表面表达的变化有关。所述方法包括，使细胞与诊断足够量的本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物接触以通过测定或诊断技术来检测多价CD20结合分子。
术语“诊断足够量”表示为了信息收集目的通过利用的特定测定或诊断技术提供充分检测和准确测量的量。通常，对于完整生物体内诊断应用而言，诊断足够量是每位受试者在0.1mg至100mg与多价CD20结合分子连接的检测促进剂/千克受试者之间的非累积剂量。通常，在这些信息收集方法中使用的多价CD20结合分子的量将尽可能地低，前提条件是，它仍然是诊断足够量。例如，对于在生物体中的体内检测，施用给受试者的多价CD20结合分子的量将尽可能地低。
与检测促进剂组合的本发明的多价CD20结合分子的细胞类型特异性的靶向会提供检测细胞并获取其图像的方式，所述细胞与细胞外CD20靶生物分子物理偶联。使用本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物对CD20+细胞的成像可以通过本领域已知的任意合适的技术在体外或在体内执行。使用本领域已知的各种方法，包括生物体的全身成像或使用取自生物体的离体样品，可以收集诊断信息。本文中使用的术语“样品”表示任意数目的物品，但不限于，流体诸如血液、尿、血清、淋巴液、唾液、肛门分泌物、阴道分泌物和精液，以及通过活组织检查操作得到的组织。例如，通过技术诸如磁共振成像(MRI)、光学方法(诸如直接的、荧光的和生物发光的成像)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)、超声、x-射线计算机体层摄影术和前述技术的组合，多种检测促进剂可以用于非侵袭性体内肿瘤成像。
在本发明的某些实施方案中是使用本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物(例如本发明的药物和/或诊断组合物)标记或检测CD20+赘生性细胞和/或免疫细胞类型的内部的方法。基于本发明的多价CD20结合分子的进入特定细胞类型中并通过逆向细胞内运输在细胞内按路线发送的能力，特定细胞类型的内部区室被标记用于检测。这可以在患者内在疾病部位在原位细胞上在体内执行，或在从生物体取出的细胞和组织(例如活组织检查材料)上在离体场合体外执行。CD20+细胞、细胞类型和细胞群体的检测可以用在表达升高水平的CD20的肿瘤和免疫细胞的诊断和成像中。本发明的某些多价CD20结合分子和/或其组合物可以用于将CD20+细胞在哺乳动物中的可能积累部位成像或显影。这些方法可以用于鉴别治疗干预以后肿瘤发生或残余肿瘤细胞的部位。
本发明的诊断组合物可以用于将疾病、病症或病患表征为本发明的有关药物组合物潜在地可治疗的。根据本发明的某些组合物可以用于确定患者是否属于对利用本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物或如本文中所述的本发明的有关方法的治疗策略做出应答的集合或非常适合使用本发明的递送装置。
可以在检测出疾病(例如癌症)以后使用本发明的诊断组合物以便更好地表征它，诸如以监测远距离转移、异质性和癌症进展阶段。疾病、病症或感染的表型评估可以帮助在做出治疗决策的过程中的预后和预测。在疾病复发中，本发明的某些方法可以用于辨别局部问题还是全身问题。
本发明的诊断组合物可以用于评估对治疗剂的应答，无论治疗剂的类型，例如小分子药物、生物药物或基于细胞的疗法。例如，本发明的诊断组合物的某些实施方案可以用于测量肿瘤大小的变化、CD20+细胞群体(包括数目和分布)的变化、或监测已经施用给患者的疗法所靶向的抗原以外的标志物。
用于检测CD20+细胞类型的存在的方法的某些实施方案可以用于收集关于疾病、病症和病患的信息，例如，与恶性细胞、肿瘤细胞、癌症细胞有关的细胞，和/或与以下有关的免疫细胞：血液学疾病、风湿性疾病、血液学癌症、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、B-细胞淋巴瘤、B-细胞非霍奇金淋巴瘤(B-细胞NHL)、伯基特淋巴瘤(BL)、B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-细胞CLL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫性大B细胞性淋巴瘤(DLBCL或DLBL)、滤泡淋巴瘤(FL)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HD)、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤(B-LBL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)和T-细胞淋巴瘤(TCL)、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植物排斥、移植物抗宿主病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒症综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化、结节性多动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和/或血管炎。
在某些实施方案中，本发明的多价CD20结合分子和/或其组合物用于诊断和治疗，或仅用于诊断。
组合物的以下非限制性实施例进一步举例说明了本发明，所述组合物包含选择性地细胞毒性的多价CD20结合分子，所述多价CD20结合分子具有从志贺毒素家族的成员的A亚基来源的志贺毒素效应物区域和两个或更多个CD20结合区域，所述CD20结合区域能够结合与特定表达CD20的细胞类型物理偶联的CD20的细胞外部分。
实施例
下述实施例描述了包含志贺毒素A亚基效应物多肽区域的不同多价CD20结合分子。本发明的示例性多价CD20结合分子1)结合至在靶细胞类型(例如，人淋巴瘤细胞)的表面处表达的CD20，2)进入靶细胞并有效地将催化活性的志贺毒素效应物多肽按路线发送至靶细胞的胞质溶胶，从而导致这些表达CD20的细胞的死亡。
本发明的示例性多价CD20结合分子组合物(其相对于单价CD20结合分子富含高比例的多价CD20结合分子)表现出与主要由单价CD20结合蛋白(其为实施例1中所示的本发明的示例性多价CD20结合分子的组分)组成的蛋白组合物相比极大地改善的细胞毒性活性。本发明的示例性多价CD20结合分子组合物的改善的细胞毒性效应不可通过以下来解释：与单价CD20结合分子相比，由多价CD20结合分子变体的CD20结合价的增加引起的细胞毒性的预测增加。
贯穿实施例，术语“CD20结合蛋白”用于表示包含一个或多个重组融合多肽的、志贺毒素A亚基来源的免疫毒素，所述重组融合多肽各自包含1)一个或多个能够以高亲和力结合CD20的细胞外部分的免疫球蛋白-型CD20结合区域，和2)一个或多个志贺毒素效应物多肽区域。在下面实施例中所示的本发明的某些多价CD20结合蛋白是多聚体的，例如，基本上由两个连接在一起的相同单价CD20结合蛋白组成的同源二聚体。
实施例1.本发明的示例性多价CD20结合蛋白和及其富集组合物
通过使用技术人员已知的试剂和技术将多个结合CD20的单链可变片段(scFv)多肽与多个志贺毒素A亚基效应物多肽连接，制备本发明的示例性多价CD20结合分子。在该实施例中，本发明的示例性多价CD20结合分子是多价CD20结合蛋白，其各自包含1)两个或更多个单链可变片段(scFv)结合区域，所述结合区域能够以高亲和力结合细胞外CD20，与1)连接的2)两个或更多个志贺毒素A亚基来源的毒素效应物区域。
使用技术人员已知的技术设计、生产和纯化多价CD20结合蛋白以制备蛋白组合物，其中在所述组合物中的优势蛋白是本发明的多价CD20结合蛋白。例如，示例性组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)2+n主要由为本发明的多价CD20结合蛋白的蛋白组成。如下所示，本发明的示例性多价CD20结合蛋白组合物能够通过它们的多价CD20结合蛋白组分的活性如下选择性地杀死在它们的表面上表达CD20的细胞：内化，将毒素效应物区域按路线发送至胞质溶胶，和将核糖体灭活。
但是，蛋白组合物αCD20-scFv：：SLT-1A(其主要由代表本实施例的多价CD20结合蛋白的组分的单价CD20结合蛋白组成)在宽蛋白浓度范围内没有表现出有效的靶向CD20的细胞毒性。意外地发现单价CD20结合蛋白组合物αCD20-scFv：：SLT-1A在特定浓度是无活性的，所述特定浓度具有与这些示例性多价CD20结合蛋白组合物表现出对CD20表达细胞的有效靶向细胞毒性时本发明的示例性多价CD20结合蛋白组合物的浓度类似的总分子结合水平：CD20表达细胞。这是惊人的，因为所述单价CD20结合蛋白1)具有与示例性多价CD20结合蛋白相同的CD20结合区域和志贺毒素效应物区域，和2)表现出与示例性多价CD20结合蛋白类似的体外催化活性。
A.构建、生产、和纯化细胞毒性的多价CD20结合蛋白以生产组合物(αCD20-scFv：： SLT-1A)n
在该实施例中，志贺毒素效应物区域源自志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)。得到编码SLT-1A的氨基酸1-251的多核苷酸(Cheung M等人，Mol Cancer 9：28(2010))。包含单链可变片段(scFv)的免疫球蛋白型结合区域αCD20-scFv源自被开发成结合人CD20的单克隆抗体，从而建立具有两个被本领域已知的接头分离的免疫球蛋白可变区(VI，和VH)的单链可变片段。将所述免疫球蛋白型结合区域和所述志贺毒素效应物区域在框架内克隆以形成遗传上融合的蛋白。
将编码志贺毒素效应物区域的多核苷酸与编码免疫球蛋白型结合区域αCD20-scFv的多核苷酸一起在框架内克隆，所述志贺毒素效应物区域包含在SEQ ID NO：4中所示的多肽(对应于SEQ ID NO：1的氨基酸1-251)。在某些实验中，本实施例的多价细胞毒性蛋白的亚基的全长编码序列包括编码myc标签或II的多核苷酸以促进检测和/或纯化。使用来自DNA 2.0，Inc.(Menlo Park，CA，U.S.)的服务合成编码示例性蛋白组合物“(αCD20-scFv：：SLT-1A)n”的多价CD20结合蛋白的αCD20-scFv：：SLT-1A融合蛋白亚基(SEQID NO：54)的多核苷酸，或使用标准技术进行克隆。
通过使用本领域已知的细菌系统或无细胞表达系统从编码蛋白αCD20-scFv：：SLT-1A(SEQ ID NO：54)的多核苷酸模板表达蛋白，生产构成蛋白组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)n的组分的CD20结合蛋白。使用本领域已知的标准技术，包括capto-L和壳多糖亲和层析法，完成蛋白纯化。对于某些纯化，将多价CD20结合蛋白在细菌中生产并用IMPACTTM(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)系统(NewEngland Biolabs，Ipswich，MA，U.S.)纯化。根据生产商的说明书执行壳多糖亲和纯化，但是在某些纯化中，执行蛋白L柱层析法步骤，并然后切割内含肽。然后使用层析法通过壳多糖树脂以流穿模式将未切割的物质除去。
纯化以后，使用硫酸铜作为催化剂将(αCD20-scFv：：SLT-1A)n蛋白组合物氧化。然后，使用羟磷灰石(羟基磷灰石)层析法将氧化的(αCD20-scFv：：SLT-1A)n组合物纯化成三种不同的CD20结合蛋白组合物。使用羟磷灰石层析法将(αCD20-scFv：：SLT-1A)n组合物的CD20结合蛋白的不同单体和多聚体形式分离进不同的层析级分，并然后将某些级分合并-一个蛋白集合被命名为“αCD20-scFv：：SLT-1A组合物”，其主要包含单价CD20结合蛋白αCD20-scFv：：SLT-1A(n＝1)；另一个蛋白集合被命名为“(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物”，其主要包含单特异性的二价CD20结合蛋白(n＝2)且代表本发明的示例性多价CD20结合分子组合物；和第三个蛋白集合主要包含不同大小(n＝2、3、4、5、6等)的单特异性的多价CD20结合蛋白，仅含有小量二价CD20结合蛋白的大小。使用第二个羟磷灰石层析法纯化步骤和随后的尺寸排阻层析法步骤和层析级分收集，将第三个蛋白集合进一步纯化以减少单价CD20结合蛋白αCD20-scFv：：SLT-1A和二价CD20结合蛋白的量。将某些包含据估计大于二价CD20结合蛋白的分子大小的级分合并以建立本发明的示例性多价CD20结合分子组合物，其被称作“(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2组合物”(即n+2≥3)。将三个蛋白集合(CD20结合蛋白组合物)分别浓缩。
使用具有24mL床体积的Superdex 200 30/300柱(GE Healthcare，LittleChalfont，Buckinghamshire，U.K.)，通过尺寸排阻层析法(SEC)分析三种CD20结合蛋白组合物(1)αCD20-scFv：：SLT-1A、(2)(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(3)(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2中的每一种的蛋白构成(图2；表1)。对于SEC层析分析，加载每个样品，并然后使至少24mL缓冲液流动穿过所述柱，同时紫外(uv)光检测器监测以毫-吸光度单位(mAU)报告的洗脱物质在280纳米(nm)的吸光度(图2；表1)。通常，当流动穿过用于尺寸排阻层析法的基质时，较小尺寸的分子比较大尺寸的分子延迟，且因此，较小尺寸的分子表现出比较大尺寸的分子更长的SEC保留时间。因而，SEC保留时间的测量可以提供组合物内不同大小的分子组分的相对比例的估计，且因而提供组合物的纯度(关于某些大小的分子组分)。
表1.经纯化的具有αCD20-scFv：：SLT-1A的不同形式的组合物的尺寸排阻层析分析：不同的单体和多聚体αCD20-scFv：：SLT-1A结构的相对比例
*“多聚体＞二聚体”表示比二聚体更大的尺寸的多价CD20结合蛋白多聚体种类
表1显示了通过大小区分的、存在于蛋白组合物中的三类不同CD20结合蛋白的相对比例：1)αCD20-scFv：：SLT-1A类，(2)(αCD20-scFv：：SLT-1A)2类，和(3)(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2类。αCD20-scFv：：SLT-1A组合物包含存在的总蛋白的95％单体CD20结合蛋白，且这些单体CD20结合蛋白中的每一种对于CD20结合而言是单价的。(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物不包含任何可测量的量的单体CD20结合蛋白，而是包含存在的总蛋白的100％非多价CD20结合蛋白。对于(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物，79％的存在的蛋白是二聚体，且21％的存在的蛋白具有大于任何二聚体形式的尺寸的多聚体形式的尺寸。最后，分析表明，(αCD20-scFv：：SLT-1A)2+n组合物主要包含大于二聚体形式的尺寸的分子尺寸的多价CD20结合蛋白(88％的总蛋白具有大于二聚体尺寸的尺寸)，但是该组合物也包含小比例的多价CD20结合蛋白的二聚体形式和甚至更小比例的单体CD20结合蛋白。存在于这三种组合物中的CD20结合蛋白的二聚体形式代表为二价和多聚体的本发明的示例性多价CD20结合蛋白。
还通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析了三种CD20结合蛋白组合物(1)αCD20-scFv：：SLT-1A、(2)(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(3)(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2。使来自三种经纯化的蛋白组合物中的每一种的样品处于42毫摩尔的(mM)二巯基苏糖醇(DTT)的还原条件，并在95℃变性5分钟，以研究连接存在于所述组合物中的多价CD20结合蛋白的蛋白性组分的可还原共价键(例如，半胱氨酸二硫键)的存在。将样品用3X SDS Blue LoadingBuffer(187.5mM Tris-HCl(pH 6.8)，6％质量/体积百分比(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，30％甘油和0.03％(w/v)溴酚蓝，目录号B7703S，New England BioLabs，Inc.，Ipswich，MA，U.S.)或3X SDS Reducing Blue Loading Buffer(187.5mM Tris-HCl(pH 6.8)，6％(w/v)SDS，30％甘油，0.03％(w/v)溴酚蓝，和125mM DTT，目录号B7703S，New England BioLabs，Inc.，Ipswich，MA，U.S.)稀释至1X缓冲液的最终组合物并混合均匀。将样品在95℃加热5分钟，并然后将5微克(μg)蛋白样品/孔加载进4-20％SDS聚丙烯酰胺凝胶的孔中并进行电泳。
在变性条件下通过SDS-PAGE分析还原的和未还原的经纯化的蛋白集合的样品(图3)。图3显示了考马斯染色的4-20％SDS-PAGE凝胶(Lonza，Basel，CH)的图像和编号的凝胶泳道，且图例用相同的各个编号指示向每个泳道中加入哪个样品。由于执行的SDS-PAGE技术的性质，预期存在于样品中的多价CD20结合蛋白的多聚体形式(其亚基仅由于非共价相互作用而结合)在该变性凝胶分析中解离成它们的组分单价蛋白，不论氧化还原态。相反，可能观察到由可还原共价键引起的存在于样品中的多价CD20结合蛋白的多聚体形式(例如，半胱氨酸二硫键依赖性的形式)在还原的样品中解离成蛋白性组分，但是在未还原的样品中不会。但是，在两种情形中，不完全的二硫键还原和/或蛋白变性可以允许多聚体结构的持续。
电泳分析表明，αCD20-scFv：：SLT-1A组合物中的主要蛋白性物质在约55kDa的分子质量迁移(图3)，这是关于SEQ ID NO：54预见到的近似大小，所述SEQ ID NO：54具有与志贺毒素A亚基效应物多肽SLT-1A 1-251融合的抗-CD20scFv。该物质的大小在非还原条件和还原条件之间不变(图3)。这些结果与αCD20-scFv：：SLT-1A组合物中的主要蛋白物质相一致，是本实施例的示例性多价CD20结合蛋白组合物的单体单价CD20结合蛋白组分。
电泳分析表明，(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物中的主要蛋白性物质在约110kDa的分子质量迁移(图3，泳道5)，这是关于由αCD20-scFv：：SLT-1A组合物的刚好两个单体单价CD20结合蛋白组成的二聚体形式预见到的近似大小。还存在小量存在于(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物中的蛋白性物质，其在非还原条件下在约55kDa的分子质量迁移，且可能代表二聚体形式变性以后的单体单价CD20结合蛋白组分αCD20-scFv：：SLT-1A，其源自一个或多个非共价结合，而不是任何共价键，例如，半胱氨酸二硫键。该主要物质的绝大部分的大小在还原条件下变为约55kDa(图3，泳道5)，这与在非还原条件下一个或多个二硫键的存在相一致，对于存在于(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物中的主要蛋白物质，所述二硫键将两个单体单价CD20结合蛋白分子以二聚体形式连接在一起。
电泳分析表明，(αCD20-scFv：：SLT-1A)2+n组合物中的主要蛋白性物质在约55kDa或110kDa的分子质量迁移(图3，泳道7)，这是关于单体单价CD20结合蛋白组分αCD20-scFv：：SLT-1A或由刚好两个单价CD20结合蛋白组分组成的二聚体形式预见到的近似大小。二聚体蛋白物质的绝大部分的大小在还原条件下变成约55kDa(图3，泳道6)，这与在非还原条件下一个或多个二硫键的存在相一致，所述二硫键以(αCD20-scFv：：SLT-1A)2+n组合物中的二聚体形式将两个单价CD20结合蛋白分子连接在一起。
通过在变性条件下的SDS-PAGE凝胶电泳分离的还原的和未还原的样品的对比表明，组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2包括共价和非共价多聚体(图3，泳道4-7)。本发明的多价CD20结合蛋白的这些示例性组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2包含具有共价地连接的蛋白亚基和/或非共价地连接的蛋白亚基的多价CD20结合蛋白。
B.确定存在于本发明的示例性组合物中的多价CD20结合蛋白的细胞结合特征
使用基于荧光的流式细胞计量术测定研究了多价CD20结合蛋白组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2与人肿瘤来源的细胞系的结合特征。针对它们的具有志贺毒素效应物区域的多聚体多价CD20结合蛋白的结合人肿瘤来源的细胞系(其在细胞表面表达人CD20)的能力，分析如上所述生产的蛋白组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2。
将含有CD20阳性的(CD20+)Raii细胞或CD20阴性的(CD20-)U266细胞的样品悬浮于含有1％牛血清白蛋白(BSA)(Calbiochem，San Diego，CA，U.S.)的1X PBS(在下文中被称作“1X PBS+1％BSA”)中，并与100微升(μL)要测定的多价CD20结合蛋白组合物的不同稀释液一起在4摄氏度(℃)温育1小时。温育1小时以后，将包含细胞混合物和多价CD20结合蛋白组合物的样品用1X PBS+1％BSA洗涤2次。然后，将样品与100μL 1X PBS+1％BSA溶液一起在4℃温育1小时，所述溶液包含鼠单克隆抗体抗-SLT-1A(BEI NR-867 BEI Resources，Manassas，VA，U.S.；可与志贺毒素和志贺样毒素1A亚基交叉反应)，其抗体浓度大于存在于每个样品中的总蛋白浓度。将样品用1X PBS+1％BSA洗涤，并然后以相同方式与抗-小鼠IgG第二抗体(其与FITC缀合)一起温育，其抗体浓度大于存在于每个样品中的总蛋白浓度。然后，将样品用1X PBS+1％BSA洗涤2次，再悬浮于200μL 1X PBS中，并进行基于荧光的流式细胞计量术以便测量与细胞结合的蛋白。
如下确定αCD20-scFv：：SLT-1A、(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2样品与人肿瘤来源的细胞系的最大特异性结合(Bmax)和平衡结合常数(KD)。通过使用仅与第二抗体一起温育的细胞样品作为阴性对照门控数据，得到关于所有样品的来自基于荧光的流式细胞计量术的平均荧光强度(MFI)数据。使用Prism软件(GraphPad Software，San Diego，CA，U.S.)将MFI数据相对于“蛋白浓度”绘图(图4)。在标题结合饱和度下使用Prism软件的单位点结合函数[Y＝Bmax*X/(KD+X)]，使用基线校正过的数据计算Bmax和KD。如下为背景校正吸光度(Ab)值：减去为仅含有PBS的孔测量的Ab值。Bmax是在MFI中报告的最大特异性结合。KD是报告的平衡结合常数(按纳克/毫升计，ng/mL)。组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2的KD和Bmax值报告在表2中且显示在图4中。
表2.与单价CD20结合蛋白组合物相比，本发明的示例性多价
αCD20-scFv：：SLT-1组合物对CD20+Raji细胞的结合
(CD20-scFv：：SLT-1A)2与CD20+ Raji细胞的结合的Bmax被测量为约170,000MFI，具有约180ng/mL的KD(表2；图4)。(CD20-scFv：：SLT-1A)n+2与CD20+ Raji细胞的结合的Bmax被测量为约150,000MFI，具有约180ng/mL的KD(表2；图4)。因而，本发明的示例性蛋白组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2(其主要由多聚体多价CD20结合蛋白组成)都表现出与表达人CD20的人细胞(其在细胞表面表达CD20)(例如CD20+人细胞)的高亲和力结合。未知存在于(αCD20-scFv：：SLT-1A)2或(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2组合物中的CD20-scFv：：SLT-1A的任何多聚体形式是否能够同时结合存在于单个表达CD20的细胞的细胞表面处的两种不同的CD20靶生物分子。
C.确定蛋白(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2对体外真核核糖 体的半数最大抑制浓度(IC50)
使用Quick Coupled Transcription/Translation Kit(L 1170Promega，Madison，WI，U.S.)在无细胞体外蛋白翻译测定中确定(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2蛋白组合物的核糖体灭活能力。所述试剂盒包括萤光素酶T7对照DNA和Quick Master Mix。根据生产商的说明书准备核糖体活性反应以建立“TNT”反应混合物。基于SLT-1A组分的摩尔浓度(参见下文)，计算存在于样品中的CD20结合蛋白的浓度。在适当的缓冲液中制备要分析的CD20结合蛋白组合物的一系列10倍稀释物，并为每个样品稀释液建立一系列相同的TNT反应混合物组分。
将在稀释系列中的每个样品与TNT反应混合物中的每一个以及荧光素酶T7对照DNA合并。将试验样品在30℃温育1.5小时。在温育之后，将荧光素酶测定试剂(E1483Promega，Madison，WI，U.S.)加入所有试验样品，并且根据生产商的说明书通过发光测量荧光素酶蛋白翻译的量。通过总蛋白的对数转化摩尔浓度(基于志贺毒素蛋白的标准化摩尔浓度估计)相对于相对发光单位的非线性回归分析，确定翻译抑制的水平。使用统计软件(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)，为试验的每种CD20结合蛋白组合物计算以皮摩尔(pM)值为单位的半数最大抑制浓度(IC50)(图5；表3)。
表3.核糖体灭活分析：本发明的多价CD20结合蛋白相对于单价CD20结合蛋白的代表性半数最大抑制浓度(IC50)
示例性多价CD20结合蛋白组合物(CD20-scFv：：SLT-1A)2和(CD20-scFv：：SLT-1A)n+2对无细胞蛋白合成的抑制作用是强烈的(图5；表3)。剂量依赖性实验确定，在该无细胞测定中存在于(CD20-scFv：：SLT-1A)2和(CD20-scFv：：SLT-1A)n+2中的多价CD20结合分子对蛋白合成的IC50值分别是约5.3pM和11pM(图5；表3)。
D.使用CD20+细胞杀死测定确定多价CD20结合蛋白(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(α CD20-scFv：：SLT-1A)n+2的半数最大细胞毒性浓度(CD50)
使用剂量依赖性实验来确定本发明的示例性多价CD20结合蛋白组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2的CD50值。通过下述CD20+细胞杀死测定来确定(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2组合物的细胞毒性特征。该测定会确定蛋白样品的杀死细胞的能力，所述细胞在细胞表面表达多价CD20结合蛋白的结合区域的CD20靶生物分子。将CD20+Raji细胞和CD20+ST486细胞在20μL细胞培养基中在384-孔平板中铺板(7.5x 103个细胞/孔)。将要试验的多价CD20结合蛋白组合物在1X PBS中10倍稀释，并将5μL稀释物加入384-孔平板内的CD20+和CD20-细胞样品中。将仅含有细胞培养基的对照孔用于基线校正。将细胞样品与蛋白样品或仅缓冲液一起在37℃和在5％二氧化碳(CO2)的气氛中温育3天。根据生产商的说明书使用CellTiter-Luminescent CellViability Assay(G7573Promega Madison，WI，U.S.)使用发光读出确定总细胞存活或生存力百分比。使用下述方程式计算实验孔的生存力百分比：(试验RLU-平均培养基RLU)/(平均细胞RLU-平均培养基RLU)*100。在Prism(GraphPad Prism，San Diego，CA，U.S.)中相对于生存力百分比绘制对数多肽浓度，并使用对数(抑制剂)相对于应答(3参数)分析来确定多价CD20结合蛋白组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2对CD20+细胞的半数最大细胞毒性浓度(CD50)值。
(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物对CD20+ Raji细胞的CD50值为250ng/mL(表4；图6)。组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2对CD20+ Raji细胞的CD50值为约220ng/mL(表4；图6)。相反，单体单价CD20结合蛋白组合物αCD20-scFv：：SLT-1A的CD50值高得多(即有效性更低)，使得在试验的浓度，从曲线的形状不能准确地确定CD50(表4，“NC”表示不可计算；图6)。对于在该测定中试验的蛋白浓度和细胞密度，估计在试验的蛋白的某些浓度，存在的可利用的细胞表面CD20可以被CD20结合蛋白饱和(关于用于估计占据的示例性“RO模型”，参见，Muller P，Brennan F，Clin Pharmacol Ther 85：247-58(2009))。
表4.细胞毒性：本发明的示例性多价CD20结合蛋白组合物对CD20+Raji细胞的代表性半数最大细胞毒性浓度(CD50)
*”NC”(不可计算)指示，基于曲线的形状不可计算准确的CD50。
使用相同的细胞杀死测定，在其它实验中证实(αCD20-scFv：：SLT-1A)2蛋白组合物当在类似的细胞密度和CD20结合蛋白浓度(其包括高达40,000ng/mL的蛋白浓度)试验时对CD20阴性的细胞系(例如，BC-1、U266和H929细胞)是无毒的。还使用相同的细胞杀死测定，单独的SLT-1A(1-251)组分和单体单价CD20结合蛋白组合物αCD20-scFv：：SLT-1A在大至24,000ng/mL的蛋白浓度没有表现出对CD20+Raji细胞的特异性细胞毒性。
单价CD20结合蛋白组合物αCD20-scFv：：SLT-1A的细胞毒性测量表明，与“仅”SLT-1A(1-251)阴性对照样品(其缺乏任何细胞靶向部分如细胞表面受体结合区域)的细胞毒性相比，αCD20-scFv：：SLT-1A在试验的细胞密度和蛋白浓度没有表现出更大的对CD20+ Raji细胞的细胞毒性。因而，单价CD20结合蛋白组合物αCD20-scFv：：SLT-1A仅表现出非特异性的细胞毒性，无论细胞表面标志物表达。综上所述，单价CD20结合蛋白αCD20-scFv：：SLT-1A在试验的蛋白浓度不能杀死CD20+细胞；然而，本发明的示例性多价CD20结合蛋白组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2表现出对表达CD20的细胞特异性的有效的细胞靶向的细胞毒性。
为了进一步研究这些意外的结果，将蛋白组合物αCD20-scFv：：SLT-1A和(αCD20-scFv：：SLT-1A)2混合在一起以形成新组合物，从而试验它们的组分CD20结合蛋白随CD20结合蛋白组分的比率而变化的细胞毒性效能。(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物包含存在的总蛋白的100％多价CD20结合蛋白，且该多价CD20结合蛋白的79％是二价CD20结合蛋白(参见表1，出处同上)。αCD20-scFv：：SLT-1A组合物包含存在的总蛋白的95％单价CD20结合蛋白(参见表1，出处同上)。将逐渐增大的多价CD20结合分子组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2的样品加入单价CD20结合蛋白组合物αCD20-scFv：：SLT-1A的样品中以建立一系列混合的样品，其具有1∶3、1∶1和3∶1的(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物与αCD20-scFv：：SLT-1A组合物的总蛋白浓度比。使用如上所述的CD20+细胞杀死测定试验了固定比率的样品、混合的样品、以及原始的未混合的αCD20-scFv：：SLT-1A和(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物的样品，以确定每个样品对表达CD20的细胞(ST486)的CD50值。结果与未混合的αCD20-scFv：：SLT-1A和(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物的结果一起显示在图7、图8和表5中。另外，使用该测定在试验的浓度，这些样品都没有表现出对CD20阴性细胞的细胞毒性(图9)。
表5.细胞毒性：用逐渐增多的单价αCD20-scFv：：SLT-1A组合物稀释的多价(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物的代表性半数最大细胞毒性浓度(CD50)
图7显示了在任何硫酸铜氧化步骤之前上述本发明的示例性多价CD20结合分子组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2、单价CD20结合蛋白组合物αCD20-scFv：：SLT-1A和“未纯化的”蛋白组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)n的CD20+细胞杀死测定结果。
图8显示了1∶3蛋白浓度比的(αCD20-scFv：：SLT-1A)2：αCD20-scFv：：SLT-1A、1∶1蛋白浓度比的(αCD20-scFv：：SLT-1A)2：αCD20-scFv：：SLT-1A和3∶1蛋白浓度比的(αCD20-scFv：：SLT-1A)2：αCD20-scFv：：SLT-1A的固定比率混合物以及原始的多价CD20结合蛋白组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2的CD20+细胞杀死测定结果。
表5报告了以下样品的CD50值：经纯化的(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物，1∶3蛋白浓度比的(αCD20-scFv：：SLT-1A)2：αCD20-scFv：：SLT-1A的混合物，1∶1蛋白浓度比的(αCD20-scFv：：SLT-1A)2：αCD20-scFv：：SLT-1A的混合物，3∶1蛋白浓度比的(αCD20-scFv：：SLT-1A)2：αCD20-scFv：：SLT-1A的混合物，和“未纯化的”(αCD20-scFv：：SLT-1A)n。表5显示了纯化的多价CD20结合分子组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2对表达CD20的细胞的细胞毒性是纯化的单价CD20结合蛋白组合物αCD20-scFv：：SLT-1A对表达CD20的细胞的细胞毒性的约16倍。表5显示了(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物的细胞毒性是“未纯化的”(αCD20-scFv：：SLT-1A)n组合物(从其中纯化(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物)的约2.3倍。
将表5中的CD50值图示为(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物蛋白在试验的样品中的总蛋白的百分比的函数，并使用简单线性回归统计模型使直线拟合至数据点(图10)。所述直线拟合的决定系数(“R的平方”)为0.8424。在图11中，将表5中显示的CD50值图示为(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物蛋白在样品总蛋白中的百分比的函数。
在表5、图10和图11中报告的结果表明，随着用单价CD20结合蛋白组合物αCD20-scFv：：SLT-1A稀释多价CD20结合蛋白组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2，混合的CD20结合蛋白样品的细胞毒性下降了例如4倍或更大，如通过用CD20+细胞杀死测定测得的CD50值所测定的。图10和11表明，随着多价CD20结合蛋白组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2相对于总CD20结合蛋白浓度的相对蛋白浓度增加，所述混合物对CD20+细胞的细胞毒性效能增加(由较低的CD50值表示)。通过加入越来越多的单价CD20结合蛋白组合物αCD20-scFv：：SLT-1A，以线性方式稀释(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物对CD20+细胞的细胞毒性(参见图8、10和11)。因而，为了实现本发明的多价CD20结合蛋白组合物的更多最大细胞毒性，应当将任何单价CD20结合蛋白(例如，αCD20-scFv：：SLT-1A或(αCD20-scFv：：SLT-1A)n，其中n＝1)的量或单价CD20结合蛋白与总CD20结合蛋白的相对比例最小化或消除，因为单价CD20结合蛋白代表所述组合物的降低细胞毒性的组分，例如，通过作为无细胞毒性的杂质或组分起作用，所述杂质或组分具有比包含它作为组分的多价CD20结合分子显著更低的细胞毒性。
考虑到CD20结合蛋白组合物的单价和多价变体的体外核糖体抑制活性是类似的(参见表3)，预见到由CD20结合价的差异造成的表达CD20的细胞结合的变化将解释单价和多价CD20结合蛋白之间的细胞毒性效能的任何差异。但是，单价CD20结合蛋白组合物αCD20-scFv：：SLT-1A与(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物相比细胞毒性效能的缺乏不可仅仅通过αCD20-scFv：：SLT-1A组合物和(αCD20-scFv：：SLT-1A)2组合物之间的CD20+细胞结合的差异来解释(参见表2和图4)。
使用相同的细胞杀死测定，关于对CD20阴性的H929细胞的细胞毒性分析了CD20结合蛋白组合物的固定比率混合物(图9)。因为由稀释系列产生的曲线的形状，1∶3蛋白浓度比的(αCD20-scFv：：SLT-1A)2：αCD20-scFv：：SLT-1A的混合物、1∶1蛋白浓度比的(αCD20-scFv：：SLT-1A)2：αCD20-scFv：：SLT-1A的混合物和3∶1蛋白浓度比的(αCD20-scFv：：SLT-1A)2：αCD20-scFv：：SLT-1A的混合物对靶阴性细胞的CD50值是不可计算的。因而，固定比率混合物在试验的浓度对CD20阴性的细胞是没有细胞毒性的；然而，试验的每个比率表现出对CD20+细胞的某种水平的靶向细胞毒性(表5；图9)。
另外，如上所述执行CD20+细胞杀死测定以试验包含经纯化的、催化灭活的、二价CD20结合蛋白的蛋白组合物的细胞毒性。如上所述生产包含多价CD20结合蛋白的蛋白组合物用于纯化和生产组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2。由于突变E167D、Y77S或Y77S/E167D在它们的志贺毒素效应物区域中的存在，这些组合物的CD20结合蛋白的志贺毒素效应物多肽区域被催化灭活或催化损害。这些组合物的多价CD20结合蛋白包含具有至少一个上述突变的单价CD20结合蛋白αCD20-scFv：：SLT-1A(SEQ ID NO：54)用于研究催化活性的作用。多价CD20结合蛋白的催化灭活变体在试验的浓度是没有细胞毒性的。不受理论的约束，本实施例的多价CD20结合分子的细胞杀死对催化活性的志贺毒素效应物区域的需要表明，本发明的某些多价CD20结合分子及其组合物的细胞毒性的机制1)是志贺毒素效应物区域依赖性的，2)需要在靶细胞内核糖体灭活的志贺毒素活性，和3)不涉及多价CD20结合分子的任意其它细胞毒性效应，其独立于志贺毒素效应物催化活性，即，在没有志贺毒素效应物区域催化活性存在下，在试验的蛋白浓度，在本实施例的测定中没有观察到多价CD20结合分子的其它细胞毒性效应(例如，独立于志贺毒素效应物区域的细胞外细胞毒性效应)。
E.确定本发明的示例性组合物中的多价CD20结合分子的相对比例
使用技术人员已知的层析和/或电泳方法确定1)在本发明的示例性组合物内的不同CD20结合蛋白的相对蛋白浓度比。
在该实施例中，使用SEC分析来分析存在于本发明的示例性组合物中的不同大小的蛋白性物质的量，例如，计算单价、二价和更高级多价CD20结合物质之间的比率和/或百分比。
使用下述测定执行SEC分析。将样品加载到快速蛋白液相层析法(FPLC)柱上，并使缓冲液流动穿过所述柱，同时以mAU为单位记录洗脱的物质在280nm的吸光度。使用相同的柱和方案，分析已知大小的分子和迁移特征(标准品)以便校准哪些保留时间对应于哪些蛋白大小，和/或从存在于要分析的组合物中的每种单价CD20结合蛋白单体的氨基酸组成预测蛋白大小。使用从商业大小标准品收集的层析数据建立校正曲线以帮助估计样品中的分子物质的大小并将分析聚焦于特定保留时间范围。在高纯度的某些情况下，使用来自SEC分析的在280nm的吸光度测量、存在的主要分子物质的预测分子量和该主要物质的消光系数，估计给定组合物的总蛋白量。
另外，使用还原的样品和未还原的样品的SDS-PAGE和/或毛细管凝胶电泳分析来验证大小、估计相对量和检测存在于给定大小或峰的分子物质中的任何二硫键多聚体结合(参见例如图3)。例如，基于在该峰的保留持续时间内的保留时间收集的层析级分的非还原SDS-PAGE分析，可以估计SEC峰中的分子的大小。
在该实施例中，在本发明的示例性组合物中的所有多价CD20结合蛋白基本上由单价CD20结合蛋白的多聚体形式组成。因而，与物质对应的峰和带：1)与单价CD20结合蛋白相同的大小由单价CD20结合分子组成，2)具有单价CD20结合蛋白的2倍大小由二价CD20结合分子组成，3)具有单价CD20结合蛋白的3倍大小由三价CD20结合分子组成，以此类推。
一些SEC分析涉及用AKTA系统执行的测定(GE Healthcare，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)。使用UNICORNTM控制软件(GEHealthcare，Little Chalfont，Buckinghamshire，U.K.)使用软件的峰积分函数来计算不同大小的物质的蛋白浓度百分比，所述峰积分函数包括基线计算、峰的起点和终点、保留时间和曲线下面积的确定。基于使用校准标准品(例如凝胶过滤标准品如GE Healthcare Life Science的产品28-4038-42Gel Filtration HMW Calibration Kit)确定的预期保留时间，手工指定来自层析分析的280nm迹线中的峰所代表的CD20结合蛋白物质的身份。
其它SEC分析涉及用Waters系统(Waters Corp.，Milford，MA，U.S.)执行的类似测定。使用运行Water Empower 2软件的Waters Alliance HPLC系统(Waters Corp.，Milford，MA，U.S.)执行SEC分析。HPLC系统包括分析型TSKgel G3000SWXL尺寸排阻柱和TSKgel Guard SWXL尺寸排阻保护柱(Tosoh Bioscience LLC，King of Prussia，PA，U.S.)。在使用之前，将柱用流动相(20mM磷酸钠，500mM氯化钠，pH 7.4)以0.5mL/分钟(mL/min)的流速平衡至少30分钟。使100μL流动相的空白样品运行穿过所述柱以检查所述系统是清洁的并适当地工作。然后，分析组合物样品，包括已知蛋白大小标准品(例如商购可得的凝胶过滤标准品如GE Healthcare Life Science的产品28-4038-42Gel Filtration HMWCalibration Kit)的样品。对于每个组合物样品，注射50μg蛋白并将等度泵在22℃的温度在0.5mL/分钟的流速运行30分钟穿过所述柱。
使用Waters系统通过SEC分析存在于本发明的三种不同示例性组合物中的多价CD20结合分子的百分比(参见图12，图A、图B和图C)，这些分析的各种结果显示在表6-8中。在关于Waters系统的该实施例中，(1)约19-20分钟的保留时间代表与二聚体二价CD20结合蛋白(αCD20-scFv：：SLT-1A)2相当的分子大小；(2)约20-22分钟的保留时间代表与单体单价CD20结合蛋白αCD20-scFv：：SLT-1A相当的分子大小；(3)约17-17.5分钟的保留时间代表与三价或四价多聚体CD20结合蛋白相当的分子大小；和4)约17分钟的保留时间代表与多聚体六价CD20结合蛋白相当的分子大小。如下计算二聚体二价CD20结合蛋白(αCD20-scFv：：SLT-1A)2的纯度百分比：将它的峰面积除以14-27分钟的所有峰的总峰面积。如在下式中所示，使用所有峰面积的总和作为分母，确定每个峰与所有峰的百分比(总面积百分比)：(目标峰的曲线下面积)/(在所有峰下的所有面积的总和)x 100。
表6.示例性多价CD20结合分子组合物#1的SEC分析
表7.示例性多价CD20结合分子组合物#2的SEC分析
表8.示例性多价CD20结合分子组合物#3的SEC分析
在表6-8中显示的总面积百分比计算的结果是基于图12、图A-C所示的SEC图谱数据。表6显示了本发明的一种示例性多价CD20结合分子组合物的结果，所述多价CD20结合分子组合物具有大约78％的二价CD20结合蛋白与总蛋白的百分比，以及包含总蛋白的约8％的单价CD20结合蛋白和14％的相对大价CD20结合蛋白。表7显示了本发明的第二种示例性多价CD20结合分子组合物的结果，所述多价CD20结合分子组合物具有大约88％的二价CD20结合蛋白与总蛋白的百分比，以及包含总蛋白的约4.5％的单价CD20结合蛋白和7.5％的相对大价CD20结合蛋白。表8显示了本发明的示例性多价CD20结合分子组合物的结果，所述多价CD20结合分子组合物具有大约90％的二价CD20结合蛋白与总蛋白的百分比，以及包含总蛋白的约5％的单价CD20结合蛋白和5％的相对大价CD20结合蛋白。
使用上述的SEC-HPLC，Waters系统测定，在18个月时间段中的59个不同时间分析了本发明的一种示例性多价CD20结合分子组合物(“多价CD20结合分子组合物#1”)。使用如上所述的软件分析确定峰面积和总峰面积，将最小保留时间设定在约14分钟(接近排阻限度，此时分子因为太大而不具有穿透分级分离凝胶的任何显著概率)，并将最大保留时间设定在约22-27分钟(取决于凝胶过滤标准标志物的校准测量和多价CD20结合分子组合物的溶剂)，这接近尺寸小于多肽的分子从柱流出的时间。得到的经验测量结果产生描述峰#3(本发明的二价CD20结合蛋白)面积与总峰(总蛋白)面积之比(总面积百分比)的数据集(n＝59)，具有77.40(％)的平均值、77.72(％)的中位值、76.10(％)的模型、1.533的标准差和1.982的相对标准差。示例性多价CD20结合分子组合物#1的一种示例性单个分析显示在表6和图12-图A中。
F.使用动物模型确定多价CD20结合分子组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(α CD20-scFv：：SLT-1A)n+2的体内作用
使用技术人员已知的方法，使用动物模型确定示例性组合物(αCD20-scFv：：SLT-1A)2和(αCD20-scFv：：SLT-1A)n+2对CD20+肿瘤和/或免疫细胞的体内作用(参见例如WO2014/164680)。使用不同的小鼠品系试验本发明的多价CD20结合分子及其组合物在静脉内施用以后对小鼠中的异种移植肿瘤的作用，所述异种移植肿瘤源自向那些小鼠中注射入赘生性细胞，所述人赘生性细胞在它们的细胞表面的至少一个上表达CD20。使用非人灵长类动物来试验多价CD20结合分子组合物在静脉内施用以后对CD20+B-细胞群体的作用。
概要
令人惊奇地，本发明的多价CD20结合分子(其各自包含靶向细胞的CD20结合区域和志贺毒素A亚基效应物多肽区域)与它们的单价蛋白组分相比表现出表达CD20的细胞杀死活性的意外改善。
鉴于它们的类似的核糖体灭活活性，预见到单价和多价变体之间的细胞毒性潜能的差异主要(如果不是完全地)通过所述变体的结合表达CD20的细胞的能力的差异来解释。本实施例的二价CD20结合分子组合物(CD20-scFv：：SLT-1A)2和单价CD20结合蛋白组合物αCD20-scFv：：SLT-1A之间的结合表达CD20的细胞的KD值的差异是约3倍，其中二价CD20结合分子组合物表现出更低的KD值或大约3倍的结合亲和力(表2；图4)。因而，如果CD20结合分子的细胞毒性效能与细胞结合的KD的直接相关，那么预测所述单价CD20结合蛋白组合物的细胞毒性比示例性二价CD20结合分子组合物对CD20+细胞的细胞毒性低至多3倍-意味着单价CD20结合蛋白的预期CD50值应当不超过示例性二价CD20结合分子组合物的CD50值的约3倍。
但是，相反地发现，单价CD20结合蛋白组合物没有表现出在多价CD20结合分子(其具有相同的单价CD20结合蛋白作为它的唯一组分)的组合物的细胞毒性的10倍内的细胞毒性。令人惊奇地，如上述的测定所证实的，细胞毒性的差异定性地增加，并且该细胞毒性的差异(尽管在10倍内)仍然有待准确地量化。不受理论的约束，本实施例的多价CD20结合蛋白组合物的增加的细胞毒性可能由多价CD20结合分子相对于单价CD20结合分子在做以下一个或多个的能力方面的定性变化造成：1)内化进表达CD20的细胞中，例如，以相对巨大的效率；2)细胞内按路线发送至有利于实施志贺毒素效应物多肽介导的细胞毒性的亚细胞区室，例如，以相对巨大的效率；和/或3)将志贺毒素效应物多肽递送至其中存在多价CD20结合分子的细胞的胞质溶胶，例如，以相对巨大的效率。
实施例2.从志贺毒素来源的多价CD20结合分子和不同的免疫球蛋白型结合区域及其富集组合物
在该实施例中，用从志贺毒素来源的多价CD20结合蛋白制备本发明的示例性组合物。志贺毒素效应物区域源自志贺样毒素1的A亚基(SLT-1A)(SEQ ID NO：1)、志贺毒素(StxA)(SEQ ID NO：2)和/或志贺样毒素2(SLT-2A)(SEQ ID NO：3)，或选自本领域已知的志贺毒素效应物(参见例如，WO 2005/092917、WO 2007/033497、US 2013/196928、WO 2014/164680、WO 2014/164693、WO 2015/113005、WO 2015/113007、WO 2015/138435、WO 2015/138452、US 2015/259428、WO 2015/191764和US 14/965882，它们中的每一篇通过引用整体并入本文)。免疫球蛋白型结合区域源自选自表9的CD20结合分子，并且其结合CD20的细胞外部分。本实施例的示例性多价CD20结合分子使用本领域已知的技术制备和/或如在以前实施例中所述。另外，相对于单价CD20结合分子富含这些示例性多价CD20结合分子的示例性组合物使用本领域已知的技术制备和/或如在以前实施例中所述，使得所述组合物具有小于1∶3的单价CD20结合分子：总CD20结合分子浓度的浓度比。如在以前实施例中所述和/或使用技术人员已知的测定，试验了本实施例的示例性多价CD20结合分子及其组合物。
表9.示例性的CD20结合结构域
尽管已经通过举例说明的方式描述了本发明的一些实施方案，显而易见，可以利用许多修改、变化和改编以及利用在本领域技术人员范围内的众多等同或替代方案实施本发明，而不背离本发明的精神或超出权利要求的范围。
所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文，达到如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物、专利或专利申请通过引用整体并入的程度。专利申请公开WO2005/092917、WO 2007/033497、US 2013/196928、WO 2014/164680、WO 2014/164693、WO2015/113005、WO 2015/113007、WO 2015/138435、WO 2015/138452、US 2015/0259428和WO2015/191764各自通过引用整体并入本文。美国专利申请系列号US 14/965,882的公开内容通过引用整体并入本文。美国临时专利申请61/777,130、62/112,314和62/249,193的公开内容各自通过引用整体并入本文。关于在本文中引用的氨基酸和核苷酸序列的来自GenBank(国家生物技术信息中心，U.S.)的所有可电子获得的生物序列信息的完整公开内容各自通过引用整体并入本文。

Claims (46)

1.一种多价CD20结合分子，其包含
a)两个或更多个CD20结合区域，每个能够特异性地结合CD20的细胞外部分，和
b)一个或多个志贺毒素效应物区域。
2.根据权利要求1所述的多价CD20结合分子，其中将所述分子施用给与CD20物理偶联的细胞，所述CD20具有被所述分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，导致以下两种或多种：
i)使所述分子内化进所述细胞内部，任选地在5小时、4小时、3小时、2小时、1小时或30分钟中在约37摄氏度；
ii)将所述分子的志贺毒素效应物区域亚细胞按路线发送至细胞的胞质溶胶；
iii)破坏所述细胞的核糖体功能；和
iv)杀死所述细胞。
3.根据权利要求1所述的多价CD20结合分子，其中将所述分子施用给在细胞表面表达CD20的细胞，所述CD20具有被所述分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，所述分子能够造成所述表达CD20的细胞的死亡。
4.根据权利要求3所述的多价CD20结合分子，其中将所述分子施用给其成员为CD20阳性的第一细胞群体和其成员不是CD20阳性的第二细胞群体，所述分子对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性效应是相对于所述第二细胞群体的成员的至少3倍大。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的多价CD20结合分子，所述多价CD20结合分子包含两个或更多个组分，每个组分包含
a)至少一个CD20结合区域，其能够特异性地结合CD20的细胞外部分，和
b)志贺毒素效应物区域；且
其中所述分子不包含免疫球蛋白Fc区。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的多价CD20结合分子，所述多价CD20结合分子包含含有免疫球蛋白型结合区域的CD20结合区域。
7.根据权利要求6所述的多价CD20结合分子，所述多价CD20结合分子包含含有选自以下的多肽的免疫球蛋白型结合区域：
单结构域抗体片段，单链可变片段，抗体可变片段，互补决定区3片段，受限的FR3-CDR3-FR4多肽，Fd片段，抗原结合片段，犰狳重复多肽，纤连蛋白来源的第10个纤连蛋白III型结构域，生腱蛋白III型结构域，锚蛋白重复基序结构域，低密度脂蛋白受体来源的A-结构域，脂质运载蛋白，Kunitz结构域，蛋白-A-来源的Z结构域，γ-B结晶-来源的结构域，泛蛋白-来源的结构域，Sac7d-来源的多肽，Fyn-来源的SH2结构域，小蛋白，C-型凝集素-样结构域支架，经工程改造的抗体模拟物，和保留结合功能性的前述任一种的任何遗传上操作的相应物。
8.根据权利要求7所述的多价CD20结合分子，所述多价CD20结合分子包含含有选自以下的多肽或基本上由其组成的志贺毒素效应物区域：
a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸75-251；
b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-241；
c)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-251；和
d)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸1-261。
9.根据权利要求7所述的多价CD20结合分子，所述多价CD20结合分子包含两个或更多个通过一种或多种非共价相互作用结合的蛋白组分。
10.根据权利要求7所述的多价CD20结合分子，所述多价CD20结合分子包含两个或更多个通过一种或多种共价相互作用结合的蛋白组分且其任选地包含为二硫键的共价相互作用。
11.根据权利要求7所述的多价CD20结合分子，其中所述免疫球蛋白型结合区域包含选自以下的一个或多个多肽：
a)重链可变(VH)结构域多肽，其包含
i)HCDR1，其包含如在SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：23、SEQID NO：29或SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；
ii)HCDR2，其包含如在SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：24、SEQID NO：30或SEQ ID NO：36中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；和/或
iii)HCDR3，其包含如在SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；和/或
b)轻链可变(VL)结构域多肽，其包含
i)LCDR1，其包含如在SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQID NO：32或SEQ ID NO：38中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；
ii)LCDR2，其包含如在SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27、SEQID NO：33或SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成；和/或
iii)LCDR3，其包含如在SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：40中所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成。
12.根据权利要求11所述的多价CD20结合分子，所述多价CD20结合分子包含在SEQ IDNO：47-304中的任一个中所示的蛋白，所述蛋白任选地进一步包含氨基端甲硫氨酸残基。
13.根据权利要求12所述的多价CD20结合分子，所述多价CD20结合分子包含两种蛋白或基本上由两种蛋白组成，每种蛋白选自在SEQ ID NO：47-304中所示的蛋白中的任一种，其任选地进一步包含氨基端甲硫氨酸残基。
14.根据权利要求13所述的多价CD20结合分子，其中
a)所述两种蛋白中的每一种选自在SEQ ID NO：47-175中所示的多肽中的任一种；
b)所述多价CD20结合分子包含在所述两种蛋白之间的半胱氨酸二硫键；且
c)所述半胱氨酸二硫键涉及所述两种蛋白中的每一种中位于氨基酸242、482、483、484、490、491、492、493、494、495、499、500、501、502、503、504、505、510、511、512、513或521处的半胱氨酸残基。
15.根据权利要求1-14中的任一项所述的多价CD20结合分子，其中所述志贺毒素效应物区域包含相对于志贺毒素家族的成员的天然存在的A亚基的突变，所述突变改变所述志贺毒素效应物区域的酶活性，所述突变选自至少一个氨基酸残基缺失或置换。
16.根据权利要求1-15中的任一项所述的多价CD20结合分子，
所述多价CD20结合分子进一步包含一个或多个单价CD20结合分子组分，所述单价CD20结合分子组分包含仅一个CD20结合区域，所述CD20结合区域能够特异性地结合CD20的细胞外部分；且
其中将所述多价CD20结合分子施用给表达CD20的CD20阳性细胞群体，所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，
所述多价CD20结合分子表现出的对CD20阳性细胞群体的细胞毒性效应比在相同条件下将等同量、质量或摩尔浓度的所述多价CD20结合分子的任一种单价CD20结合分子组分施用给相同CD20阳性细胞群体引起的细胞毒性效应大1.33、1.5、1.75、2、3、5、7.5、10倍，或大于所述单价CD20结合分子组分和所述多价CD20结合分子之间的CD20结合价的倍数变化。
17.根据权利要求15所述的多价CD20结合分子，其中所述突变减少或消除所述志贺毒素效应物区域的细胞毒性。
18.根据权利要求1-16中的任一项所述的多价CD20结合分子，所述多价CD20结合分子进一步包含额外外源物质；且
其中将所述多价CD20结合分子施用给一个或多个在细胞表面表达CD20的细胞，所述CD20具有被所述多价CD20结合分子的两个或更多个CD20结合区域结合的细胞外部分，
所述多价CD20结合分子内化进所述一个或多个细胞中并将所述额外外源物质在5小时、4小时、3小时、2小时、1小时或30分钟中在约37摄氏度递送进所述细胞的内部。
19.根据权利要求18所述的多价CD20结合分子，其中所述外源物质选自细胞毒性剂、检测促进剂、肽、蛋白和核酸。
20.一种组合物，其包含根据权利要求1-19中的任一项所述的多价CD20结合分子，其中所述组合物包含小于1∶3的单价CD20结合分子浓度：总CD20结合分子浓度的比率，其中每个单价CD20结合分子
包含仅一个CD20结合区域，其能够特异性地结合CD20的细胞外部分，和
包含志贺毒素效应物区域多肽。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述组合物包含小于1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10或1∶11的单价CD20结合分子浓度：总CD20结合分子浓度的比率。
22.根据权利要求20-21所述的组合物，所述组合物进一步包含小于1∶4、1∶7、1∶11、1∶21、1∶41、1∶71、1∶111或1∶161的相对大价CD20结合分子浓度：总CD20结合分子浓度的比率；
其中每个相对大价CD20结合分子
包含三个或更多个能够特异性地结合CD20的细胞外部分的CD20结合区域和
包含一个或多个志贺毒素效应物多肽。
23.根据权利要求20-21中的任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含大于1∶2、2∶3、3∶4、4∶5、5∶6、7∶8、8∶9、9∶10、10∶11、11∶12、12∶13、13∶14或14∶15的二价CD20结合分子浓度：总CD20结合分子浓度的比率；
其中每个二价CD20结合分子
a)包含仅两个能够特异性地结合CD20的细胞外部分的CD20结合区域，和
b)包含一个或多个志贺毒素效应物多肽。
24.根据权利要求20-23中的任一项所述的组合物，其中将所述组合物施用给其成员为CD20阳性的第一细胞群体和其成员不是CD20阳性的第二细胞群体，所述组合物对所述第一细胞群体的成员的细胞毒性效应是相对于所述第二细胞群体的成员的至少3倍大。
25.一种药物组合物，其包含
根据权利要求1-19中的任一项所述的多价CD20结合分子和/或根据权利要求20-24所述的组合物，和
至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
26.一种诊断组合物，其包含
根据权利要求1-19中的任一项所述的多价CD20结合分子和/或根据权利要求20-24所述的组合物，和
检测促进剂。
27.一种多核苷酸，其能够编码根据权利要求1-19中的任一项所述的多价CD20结合分子、或其互补物、或前述任一种的片段。
28.一种表达载体，其包含根据权利要求27所述的多核苷酸。
29.一种宿主细胞，其包含根据权利要求27-28所述的多核苷酸或表达载体中的任一种。
30.一种杀死细胞的方法，所述方法包括下述步骤：使所述细胞与根据权利要求1-19中的任一项所述的多价CD20结合分子、根据权利要求20-24中的任一项所述的组合物和/或根据权利要求25所述的药物组合物接触。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述接触在体外进行。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述接触在体内进行。
33.一种诱导受试者中被多价CD20结合分子结合的、细胞表面定位的CD20的细胞内化的方法，所述方法包括下述步骤：
给所述受试者施用根据权利要求1-19中的任一项所述的多价CD20结合分子、根据权利要求20-24中的任一项所述的组合物、根据权利要求25所述的药物组合物和/或根据权利要求26所述的诊断组合物。
34.一种将外源物质递送进表达CD20的细胞中的方法，所述方法包括下述步骤：使所述细胞与根据权利要求1-19中的任一项所述的多价CD20结合分子、根据权利要求20-24中的任一项所述的组合物、根据权利要求25所述的药物组合物和/或根据权利要求26所述的诊断组合物接触。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述接触在体外进行。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述接触在体内进行。
37.一种治疗患者中的疾病、病症或病患的方法，所述方法包括下述步骤：给有此需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1-19中的任一项所述的多价CD20结合分子、根据权利要求20-24中的任一项所述的组合物和/或根据权利要求25所述的药物组合物；任选地其中所述疾病、病症或病患选自癌症、肿瘤和免疫病症。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述疾病、病症或病患选自：
血液学癌症、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、急性髓性白血病、急性非淋巴细胞白血病、B-细胞慢性淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、B-细胞非霍奇金淋巴瘤、B-细胞前体急性成淋巴细胞性白血病、B-细胞幼淋巴细胞白血病、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、弥漫性大B细胞性淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、毛细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、成免疫细胞的大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、结节性淋巴细胞优势的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞赘瘤、浆细胞性骨髓瘤、前体B-成淋巴细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、T-细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T-细胞淋巴瘤、T-细胞幼淋巴细胞白血病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、淀粉样变性、强直性脊柱炎、哮喘、克罗恩病、糖尿病、移植物排斥、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、格雷夫斯眼病、桥本甲状腺炎、溶血性尿毒症综合征、HIV相关的疾病、红斑狼疮、多发性硬化、视神经脊髓炎谱群障碍、N-甲基D-天冬氨酸酯受体脑炎、眼球阵挛肌阵挛综合征、阵发性夜间血红蛋白尿、结节性多动脉炎、多关节炎、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、巩膜炎、硬皮病、脓毒性休克、舍格伦综合征、溃疡性结肠炎和血管炎。
39.用于治疗或预防癌症、肿瘤或免疫病症的根据权利要求1-29中的任一项所述的组合物。
40.根据权利要求1-29中的任一项所述的组合物在药物制备中的用途，所述药物用于治疗或预防癌症、肿瘤或免疫病症。
41.一种生产多价CD20结合分子的方法，所述方法包括以下步骤
使用壳多糖结合相互作用纯化多价CD20结合分子或所述多价CD20结合分子的蛋白组分。
42.一种检测细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
使所述细胞与根据权利要求26所述的诊断组合物接触，和
检测所述诊断组合物的存在。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述检测在体外进行。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述检测在体内进行。
45.根据权利要求1-29中的任一项所述的组合物在疾病、病症或病患的诊断、预后或表征中的用途。
46.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-29中的任一项所述的组合物和额外试剂和/或药物递送装置。
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