ES2877356T3 - Epítopo de MHC de clase I que suministra polipéptidos - Google Patents

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Abstract

Polipéptido desinmunizado derivado de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental, en el que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental comprende o consiste en: (i) los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2, o SEQ ID NO: 3; (ii) los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; (iii) los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; o (iv) los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3; en el que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental es capaz de enrutarse a un compartimento de citosol de una célula en el que está presente; en el que el polipéptido desinmunizado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con: (i) los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; (ii) los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; (iii) los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; o (iv) los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; en el que el polipéptido desinmunizado comprende un epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado en dicho polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental; en el que el epítopo de células T CD8+ integrado, heterólogo, reemplaza un número equivalente de residuos de aminoácidos en el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental, de modo que el polipéptido desinmunizado que comprende el epítopo CD8+ integrado, heterólogo, tiene el mismo número total de aminoácidos que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental en ausencia del epítopo de células T CD8+ integrado, heterólogo; en el que el epítopo de células T CD8+ integrado heterólogo altera un epítopo de células B endógenas y/o un epítopo de células T CD4+ del polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental, tal como lo demuestra la antigenicidad o inmunogenicidad reducida de las células B y/o la antigenicidad o inmunogenicidad reducida de células T CD4+ del polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga que comprende el epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado, en comparación con el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental en ausencia del epítopo de células T CD8+ integrado heterólogo; y en el que dicho epítopo de células B endógenas está posicionado en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consiste en: las regiones del epítopo de células B: 1-15 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 3-14 de SEQ ID NO: 3; 26-37 de SEQ ID NO: 3; 27-37 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 39-48 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 42-48 de SEQ ID NO: 3; 53-66 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; 94-115 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; 141-153 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 140-156 de SEQ ID NO: 3; 179-190 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 179-191 de SEQ ID NO: 3; 204 de SEQ ID NO: 3; 205 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 210-218 de SEQ ID NO: 3; 240-260 de SEQ ID NO: 3; 243-257 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y 254-268 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:

Description

DESCRIPCIÓN
Epítopo de MHC de clase I que suministra polipéptidos
CAMPO DE LA PRESENTE INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere en general a procedimientos de modificación de polipéptidos para introducir la capacidad del polipéptido para suministrar un epítopo de células T heterólogo para la presentación de MHC de clase I por una célula de cordado, tal como se define en las reivindicaciones. Más específicamente, la presente invención se refiere a procedimientos para modificar polipéptidos que comprenden funciones efectoras de suministro de proteasomas en polipéptidos heterólogos que suministran epítopo de células T que difieren en sus propiedades inmunogénicas de sus moléculas parentales por la adición de uno o más péptidos epítopos de células T que pueden ser reconocidos por una molécula de MHC de clase I y ser presentados en la superficie celular por el sistema de MHC de clase I de una célula de cordado, tal como se define en las reivindicaciones. Ciertos procedimientos de la presente invención se refieren a procedimientos para modificar polipéptidos para reducir la antigenicidad y/o inmunogenicidad mediante la introducción de uno o más epítopos de células T, tal como se define en las reivindicaciones. En otro aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos desinmunizados y moléculas de reconocimiento celular que comprenden polipéptidos desinmunizados, tal como se define en las reivindicaciones. Las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención pueden usarse para numerosas aplicaciones, tales como, por ejemplo, el diagnóstico y tratamiento de una variedad de enfermedades, trastornos y afecciones, tales como, por ejemplo, cánceres, tumores, otras anomalías del crecimiento, trastornos inmunes e infecciones microbianas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
[0002] Los sistemas inmunológicoss de los cordados, tales como anfibios, aves, peces, mamíferos, reptiles, y tiburones, rastrean constantemente los entornos extracelulares e intracelulares para moléculas exógenas en un intento de identificar la presencia de moléculas extrañas, células patógenos particularmente mortales. El sistemade complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, del inglés Major Histo-Compatibility) funciona en los cordados como parte del sistema inmunológico adaptativo (Janeway's Immunobiology (Murphy K, ed., Garland Science, 8th ed., 2011)). Dentro de un cordado, los antígenos extracelulares son presentados por el sistema MHC de clase II, mientras que los antígenos intracelulares pueden ser presentados por el sistema MHC de clase I.
[0003] En general, la administración de péptidos, polipéptidos, o proteínas exógenos a una célula da como resultado que estas moléculas no entran en la célula debido a la barrera física de la membrana plasmática. Además, estas moléculas a menudo se degradan en moléculas más pequeñas mediante actividades enzimáticas extracelulares en las superficies de las células y/o en el medio extracelular. Los polipéptidos y proteínas que se internalizan desde el entorno extracelular por endocitosis habitualmente se degradan por proteólisis lisosomal como parte de una vía endocitótica que involucra endosomas tempranos, endosomas tardíos y lisosomas. Los polipéptidos y proteínas que se internalizan desde el entorno extracelular por fagocitosis habitualmente se degradan por una vía similar que termina en fagolisosomas.
[0004] La vía de MHC de clase II presenta péptidos antigénicos derivan de moléculas en el espacio extracelular, habitualmente después de la fagocitosis y procesamiento por las células presentadoras de antígeno especializadas; estas células pueden ser células presentadoras de antígenos profesionales u otras células presentadoras de antígenos, tales como, por ejemplo, células dendríticas (DC), fagocitos mononucleares (MNPC), determinadas células endoteliales y linfocitos B (células B). Estas células presentadoras de antígenos muestran ciertos péptidos que forman complejos con moléculas MHC de clase II en su superficie celular para el reconocimiento por linfocitos T (células T) positivos de CD4 (CD4+). Por otro lado, el sistema de MHC de clase I funciona en la mayoría de las células en un cordado para presentar péptidos antigénicos de un espacio intracelular, habitualmente el citosol, para su reconocimiento por células T CD8+.
[0005] El sistema de MHC de clase I juega un papel esencial en el sistema inmunológico al proporcionar presentación antigénica de antígenos intracelulares (Cellular and Molecular Immunology (Abbas A, ed., Saunders, 8th ed., 2014)). Se cree que este proceso es una parte importante del sistema inmunológico adaptativo que evolucionó en cordados principalmente para proteger contra células neoplásicas e infecciones microbianas que involucran patógenos intracelulares; sin embargo, este proceso también puede eliminar determinadas células dañadas. La presentación de un péptido antigénico complejado con una molécula de MHC de clase I sensibiliza a las células presentadoras a la destrucción dirigida por células T citotóxicas (CTL) mediante lisis, apoptosis inducida y/o necrosis. La presentación de epítopos de péptidos específicos complejados con moléculas de MHC de clase I desempeña un papel importante en la estimulación y el mantenimiento de las respuestas inmunitarias a los cánceres, tumores y patógenos intracelulares.
[0006] El sistema de clase I MHC funciona continuamente para procesar y mostrar en la superficie celular diversos epítopos intracelulares, tanto propios como no propios (extraño) y antígenos peptídicos o de lípidos. La presentación del MHC de clase I de antígenos extraños de patógenos intracelulares o células transformadas señalan las células T efectoras CD8+ para montar respuestas inmunitarias protectoras de las células T. Además, el sistema de MHC de clase I funciona continuamente para presentar epítopos de péptidos propios con el fin de establecer y mantener la tolerancia inmunológica.
[0007] La presentación de epítopos de péptidos por el sistema de MHC de clase I implica cinco etapas principales: 1) generación de péptidos citoplasmáticos, 2) transporte de péptidos al lumen del retículo endoplásmico (RE), 3) formación de complejos estables de moléculas de MHC de clase I unidas a ciertos péptidos, 4) presentación de esos complejos péptido-MHC de clase I estables (complejos de péptido-MHC de clase I) en la superficie celular, y 5) reconocimiento de ciertos complejos de péptido-MHC de clase I antigénicos presentados por células T CD8+ específicas, incluidos CTL específicos.
[0008] El reconocimiento de un complejo de antígeno-MHC de clase I presentado por una célula T CD8+ conduce a la activación de células T CD8+, la expansión clonal, y la diferenciación en células efectoras CD8+, incluyendo los CTL que reconocen células de destrucción que presentan complejos de epítopo específico-MHC de clase I. Esto conduce a la creación de una población de células efectoras CD8+ específicas, algunas de las cuales pueden viajar por todo el cuerpo para buscar y destruir células que presentan un complejo de epítopo espcífico-MHC de clase I.
[0009] El sistema de MHC de clase I se inicia con un péptido citosólico. La existencia de péptidos en el citosol puede tener lugar de múltiples maneras. En general, los péptidos presentados por moléculas de MHC de clase I se derivan de la degradación proteasomal de proteínas y polipéptidos intracelulares. La ruta del MHC de clase I puede comenzar con transportadores asociados con las proteínas de procesamiento de antígenos (TAP) asociadas con la membrana del RE. Las TAP translocan péptidos del citosol al lumen del RE, donde a continuación pueden asociarse con moléculas de MHC de clase I vacías. Las TAP translocan péptidos que más habitualmente tienen tamaños de alrededor de 8-12 residuos de aminoácidos pero que también incluyen 6-40 residuos de aminoácidos (Koopmann J et al., Eur J Immunol 26: 1720-8 (1996)).
[0010] La ruta de MHC de clase I también se puede iniciar en el lumen del RE por una ruta que implica el transporte de una proteína, polipéptido o péptido en el citosol para su procesamiento y, a continuación, reentrada en el RE a través de la translocación mediada por TAP.
[0011] Los péptidos transportados desde el citosol al lumen del RE por TAP están disponibles entonces para unirse por diferentes moléculas de MHC de clase I. En el lumen del RE, una máquina de carga de péptidos multicomponente, que involucra TAP, ayuda a ensamblar complejos estables de péptido-molécula de MHC clase I y además procesa los péptidos en algunos casos, especialmente por escisión en péptidos de tamaño óptimo en un proceso llamado “trimming” (véase Mayerhofer P, Tampé R, J Mol Biol pii S0022-2835 (2014)). En el RE, diferentes moléculas de MHC de clase I se unen estrechamente utilizando dominios de unión a antígenos de tipo inmunoglobulina altamente específicos a solo aquellos péptidos específicos por los que la molécula de MHC de clase I tiene una afinidad más fuerte. A continuación, el complejo de péptido-MHC de clase I se transporta a través de la ruta secretora a la membrana plasmática para la presentación al medio extracelular y reconocimiento por células T CD8+.
[0012] El reconocimiento por una célula T CD8+ de un complejo epítopo-MHC de clase I inicia respuestas inmunes protectoras que finalmente terminan en la muerte de la célula presentadora debido a la actividad citotóxica de uno o más CTL. Los CTL expresan diferentes receptores de células T (TCR) con diferentes especificidades. Los alelos del MHC son muy variables y la diversidad conferida por estos polimorfismos puede influir en el reconocimiento por las células T de dos formas: afectando a la unión de antígenos peptídicos y afectando a las regiones de contacto entre la molécula del MHC y los TCR. En respuesta al reconocimiento del complejo antígeno-molécula de MHC de clase I por un CTL a través de su TCR de superficie celular particular, el CTL destruirá la célula presentadora del complejo antígeno-MHC de clase I principalmente a través de actividades citolíticas mediadas por la liberación de perforina y/o granzima en la célula presentadora. Además, el CTL liberará citocinas inmunoestimuladoras, tales como, por ejemplo, interferón gamma (IFN-gamma), factor de necrosis tumoral alfa (TNF), proteína 1 beta inflamatoria de macrófagos (MIP-1beta) e interleucinas, tales como IL-17, IL-4 e IL-22. Además, los CTL activados pueden matar indiscriminadamente la célula presentadora del complejo de epítopo-MHC de clase I proximal que las activó independientemente del repertorio del complejo de péptido-MHC de clase I presente de la célula proximal (Wiedemann A et al., Proc Natl Acad Sci USA 103: 10985-90 (2006)). Estas respuestas inmunes inducidas por el complejo epítopo-MHC de clase I podrían posiblemente ser aprovechadas por agentes terapéuticos para destruir ciertos tipos de células dentro de un paciente, así como para sensibilizar el sistema inmunológico a otras células proximales.
[0013] La ruta de presentación de MHC de clase I podría ser explotada por varios agentes terapéuticos con el fin de inducir respuestas inmunes deseadas; sin embargo, existen varias barreras para desarrollar dicha tecnología, que incluyen, por ejemplo, el suministro a través de la membrana plasmática celular; escapar de la vía endocitótica y destrucción en el lisosoma; y en general evitar el secuestro, modificación y/o destrucción de polipéptidos extraños por la célula diana (Sahay G et al., J Control Release 145: 182-195 (2010); Fuchs H et al., Antibodies 2: 209-35 (2013)).
[0014] Además, la eficacia de los agentes terapéuticos que comprenden polipéptidos, por ejemplo, productos biológicos y biofarmacéuticos basados en polipéptidos, a menudo se ve limitada por respuestas inmunes indeseables generadas en los receptores en respuesta a los agentes terapéuticos. Prácticamente todos los agentes terapéuticos basados en polipéptidos inducen cierto nivel de respuesta inmune después de la administración a un sujeto mamífero. Los diferentes niveles de respuesta inmunitaria incluyen la producción de anticuerpos de inmunoglobulinaM de bajo nivel, baja afinidad y transitorios contra anticuerpos de inmunoglobulina-G de alto nivel y alta afinidad. La inmunogenicidad de un agente terapéutico puede causar respuestas inmunes no deseadas en los receptores que reducen la eficacia terapéutica, alteran adversamente la farmacocinética y/o dan lugar a reacciones de hipersensibilidad, anafilaxia, reacciones anafilactoides o reacciones a la infusión, entre otras consecuencias (ver Buttel I et al., Biologicals 39: 100-9 (2011)).
[0015] Por ejemplo, un agente terapéutico basado en polipéptido puede causar que un receptor cree anticuerpos contra los sitios antigénicos en los agentes terapéuticos (a veces llamados anticuerpos neutralizantes o anticuerpos anti­ fármaco). Las respuestas inmunitarias que generan anticuerpos que reconocen un agente terapéutico pueden dar como resultado una resistencia inmunológica al efecto o efectos del agente terapéutico. Además, las reacciones cruzadas entre anticuerpos anti-agentes terapéuticos con factores endógenos pueden dar lugar a resultados clínicos no deseados.
[0016] Los agentes terapéuticos basados en polipéptidos con secuencias polipeptídicas derivadas de especies lejanamente relacionadas con el receptor, tal como cuando el receptor es un mamífero y las secuencias polipeptídicas derivan de una planta o microorganismo, tienden a ser atacados agresivamente por el sistema inmunológico del receptor (ver, Sauerborn M et al., Trends Pharmacol Sci 31: 53-9 (2010), para revisión). Los sistemas inmunitarios de los vertebrados se han adaptado para reconocer secuencias de polipéptidos extraños con sistemas inmunitarios tanto innatos como adaptativos. De este modo, la administración de un polipéptido a un vertebrado de la misma especie de vertebrado puede reconocerse como no propio y provocar una respuesta inmune, tal como, por ejemplo, administrando a un ser humano un polipéptido que comprende una unión recombinante de dos secuencias polipeptídicas humanas heterólogas.
[0017] Por lo tanto, en el diseño de agentes terapéuticos que contienen polipéptidos a menudo es deseable intentar tratar de minimizar la inmunogenicidad del agente terapéutico para prevenir y/o reducir la aparición de respuestas inmunes no deseadas en sujetos sometidos a tratamiento terapéutico. En particular, las regiones polipeptídicas en agentes terapéuticos que probablemente produzcan antigenicidad y/o inmunogenicidad de células B y/o células T están dirigidas para su eliminación, supresión y minimización.
[0018] Los epítopos de células B y de células T pueden predecirse en una secuencia de polipéptido dado in silico usando software (véase, Bryson C et al, BioDrugs 24: 1-8. (2010), para revisión). Por ejemplo, el software llamado EpiMatrix (EpiVax, Inc., Providence, RI, EE. UU.) se utilizó con éxito para predecir la inmunogenicidad de las células T en proteínas recombinantes (De Groot A et al., Dev Biol (Basel) 122: 171-94 (2005)); Koren E et al., Clin Immunol 124: 26-32 (2007)).
[0019] Se han descrito muchos enfoques, tales como la eliminación de epítopos antigénicos y/o inmunogénicos por truncamiento o mutación, para reducir la inmunogenicidad de los agentes terapéuticos que contienen polipéptidos (Tangri S et al., J Immunol 174: 3187-96 (2005); Mazor R et al., Proc Natl Acad Sci USA 109: E3597-603 (2012); Yumura K et al., Protein Sci 22: 213-21 (2012)). Los polipéptidos extraños pueden ser reconocidos con una especificidad exquisita por el sistema inmune adaptativo a través de epítopos inmunes presentes a menudo en un pequeño número de sitios discretos en la superficie del polipéptido. Sin embargo, la afinidad de unión a anticuerpos puede estar dominada por interacciones con un pequeño número de aminoácidos específicos dentro de un epítopo. Por tanto, las modificaciones de los aminoácidos cruciales en un polipéptido que alteran un epítopo inmunogénico pueden reducir la inmunogenicidad (Laroche Y et al., Blood 96: 1425-32 (2000)). Las modificaciones que alteran el reconocimiento de epítopos incluyen deleciones de aminoácidos, sustituciones y enmascaramiento de epítopos con conjugados no inmunogénicos. Noakes et al., FEBS Letters: Vol 453, No. 1-2, 95-99 (1999) describe la explotación del transporte retrógrado de la toxina 1 similar a Shiga para la liberación de antígenos exógenos en la vía de presentación del MHC de Clase I. Shaw et al., Infection and Immunity: Vol 74, No. 2, 1001-1008 (2006) describen la estimulación de células T CD8+ después de la administración de antígenos mediada por toxina de la difteria en células dendríticas. Johnson et al., FEMS Microbiology letters: Vol 146, No. 1, 91-96 (1997) describe la construcción de un vector epítopo usando la subunidad B de la toxina de la difteria.
[0020] Para el desarrollo de agentes terapéuticos basados en polipéptidos, es deseable evitar la inducción DE respuestas inmunes mediada por células B y la producción de anticuerpos neutralizantes en Pacientes, ya que reduce la eficacia de la terapia, cambia el perfil de dosis-efecto, y lImita el número de dosis que puede recibir un paciente (véase Lui W et al., Proc Natl Acad Sci USA 109: 11782-7 (2012)).
[0021] Por lo tanto, sería deseable tener procedimientos de creación de nuevos polipéptidos que suministran epítopos de células T que pueden suministrar uno o más epítopos de células T a la vía de presentación de MHC de clase I de una célula. También sería deseable tener polipéptidos que, en condiciones fisiológicas, puedan suministrar un epítopo de células T al interior de una célula diana para iniciar respuestas inmunes mediadas por células T deseables, pero que no induzcan respuestas inmunitarias indeseables mientras se encuentran en espacios extracelulares, tales como, por ejemplo, la creación de anticuerpos inhibidores. Por tanto, sería deseable tener polipéptidos que suministren epítopos de células T en los que se añadan uno o más epítopos de células T CD8+ y se eliminen uno o más epítopos de células B y/o células T CD4+.
[0022] También sería deseable tener moléculas de suministro de epítopo de células T CD8+ dirigidas a células para el suministro dirigido de citotoxicidad a tipos de células específicos, por ejemplo, células infectadas o malignas. Además, sería deseable tener moléculas de suministro de epítopo de células T CD8+ dirigidas a células que exhiban una inmunogenicidad de células B reducida. Una vez que el péptido o péptidos inmunogénicos de células T suministrados por la molécula de reconocimiento celular se presentan en la superficie de una célula diana, el epítopo de células T puede señalar la destrucción de la célula presentadora activando el propio sistema inmunológico del receptor para reclutar células T CD8+. Además, las células T CD8+ activadas por el complejo epítopo de células T-MHC de clase I de la célula diana pueden estimular una respuesta inmune más amplia y alterar el microambiente (por ejemplo, mediante la liberación de citocinas en un tumor o locus de tejido infectado), de manera que otras células inmunes (por ejemplo, células T efectoras) se pueden reclutar al área local.
[0023] Además, sería deseable tener procedimientos de creación de nuevos polipéptidos que suministran epítopos de células T que se derivan de toxinas conservando determinadas funciones efectoras biológicas del polipéptido de la toxina parental, tales como la promoción de la internalización celular, la dirección de enrutamiento subcelular y/o actividad enzimática de la toxina. Además, es deseable tener procedimientos de ingeniería de polipéptidos derivados de toxinas reemplazando un epítopo de células B por un epítopo de células T como un medio tanto para reducir la probabilidad de que el polipéptido produzca una respuesta inmune indeseable y para aumentar la probabilidad de inducir una respuesta de células T deseable dirigida a aquellas células diana que internalizan la molécula que comprende el polipéptido de la toxina.
CARACTERÍSTICAS DE LA PRESENTE INVENCIÓN
[0024] La presente divulgación proporciona varias realizaciones de polipéptidos que suministran epítopos de células T (que se hace referencia en el presente documento como "células T CD8+ hiperinmunizadas"), que como componentes de determinadas moléculas de reconocimiento celular tienen la capacidad de suministrar un epítopo de células T para la presentación por una célula diana nucleada dentro de un cordado. La presente invención también proporciona polipéptidos hiperinmunizados de células T CD8+ desinmunizadas que tienen un potencial antigénico y/o inmunogénico reducido en mamíferos con respecto a un epítopo de células B y/o células T CD4+ (denominado aquí como "células B y/o células T CD4+ desinmunizadas"), tal como se define en las reivindicaciones. La presente invención también proporciona una molécula de reconocimiento celular, tal como se define en las reivindicaciones, para la liberación dirigida de citotoxicidad a tipos celulares específicos, por ejemplo, células infectadas o malignas en un cordato.
[0025] Además, la presente invención proporciona un procedimiento para crear una molécula de suministro de epítopo de células T CD8+ capaz de suministrar de forma intracelular un epítopo de células T CD8+ desde un compartimento endosómico temprano hasta una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente la molécula, tal como se define en las reivindicaciones. La presente invención también proporciona procedimientos para reducir la inmunogenicidad de células B y/o células T CD4+ de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o polipéptido efector de la toxina de la difteria, tal como se define en las reivindicaciones, mientras se aumenta la probabilidad de inmunogenicidad de células T CD8+. La presente invención también proporciona un procedimiento para aumentar la inmunogenicidad de células T CD8+ de un polipéptido parental capaz de suministrar intracelularmente un epítopo de células T CD8+ desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente el polipéptido, en el que el polipéptido parental comprende un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o un polipéptido efector de la toxina de la difteria, tal como se define en las reivindicaciones. La divulgación proporciona ciertos polipéptidos producidos mediante el uso de los procedimientos de la presente invención que retienen las funciones efectoras de la toxina, tales como, por ejemplo, actividad enzimática y citotoxicidad.
[0026] Los polipéptidos de la presente invención son hiperinmunizados y desinmunizados de células T CD8+, tal como se define en las reivindicaciones. Los polipéptidos desinmunizados de la presente invención pueden ser desinmunizados de epítopo de células B o desinmunizados de células T CD4+ o ambos, tal como se define en las reivindicaciones. Los polipéptidos desinmunizados de células T de la presente divulgación pueden ser desinmunizados de células T CD4+ o desinmunizados de células T CD8+ o ambos. Los polipéptidos de la presente invención comprenden uno o más epítopos de células T CD8+ heterólogos integrados, tal como se define en las reivindicaciones.
[0027] En determinadas realizaciones, un polipéptido de la presente divulgación comprende un epítopo de células T heterólogo integrado o insertado, en el que el polipéptido es capaz de suministro intracelular del epítopo de células T de un compartimento endosomal temprano a un proteasoma de una célula en en el que está presente el polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende además un polipéptido derivado de toxina capaz de enrutarse a un compartimento subcelular de una célula en el que está presente el polipéptido derivado de toxina seleccionado del grupo que consiste en: citosol, retículo endoplásmico y lisosoma. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende un epítopo de células T heterólogo que está integrado o insertado en un polipéptido derivado de toxina.
[0028] En determinadas realizaciones, un polipéptido de la presente divulgación comprende un polipéptido derivado de toxina que comprende un polipéptido efector de toxina capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina se deriva de una toxina seleccionada del grupo que consiste en: toxina ABx, toxina proteica inactivante de ribosomas, abrina, toxina de ántrax, Aspfl, bouganina, briodina, toxina de cholix, claudina, toxina de la difteria, gelonina, enterotoxina termolábil, mitogilina, toxina pertussis, proteína antiviral de phytolacca americana, pulchelina, exotoxina A de Pseudomonas, restrictocina, ricina, saporina, sarcina, toxina Shiga y citotoxina subtilasa.
[0029] En determinadas realizaciones, el polipéptido desinmunizado de la presente invención se deriva de un polipéptido efector de toxina parental que comprende o consiste en los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, o los aminoácidos 2 a 389 de SEQ ID NO: 45, tal como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido desinmunizado de la presente invención se deriva de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental que comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ. ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido desinmunizado se deriva de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental que comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 . En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido desinmunizado se deriva de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental que comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
[0030] El polipéptido desinmunizado de la presente invención comprende un epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado, en el que el polipéptido es capaz de suministrar intracelularmente el epítopo de células T a una molécula de MHC de clase I desde un compartimento endosómico temprano de una célula en la que el polipéptido está presente, tal como se define en las reivindicaciones. El polipéptido se deriva de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental o un polipéptido efector de la toxina de la difteria parental, tal como se define en las reivindicaciones, que es capaz de dirigirse a un compartimento del citosol de una célula en la que está presente el polipéptido, tal como se define en las reivindicaciones. El polipéptido de la presente invención comprende el epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado en el polipéptido derivado de la toxina, tal como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente invención es capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina además del suministro intracelular de un epítopo de células T CD8+ desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente el polipéptido, tal como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de toxina derivado de una toxina seleccionada del grupo que consiste en: toxina ABx, toxina proteica inactivante de ribosomas, abrina, toxina de ántrax, Aspfl, bouganina, briodina, toxina de cholix, claudina, toxina de la difteria, gelonina, enterotoxina termolábil, mitogilina, toxina pertussis, proteína antiviral de phytolacca americana, pulchelina, exotoxina A de Pseudomonas, restrictocina, ricina, saporina, sarcina, toxina Shiga y citotoxina subtilasa. En determinadas realizaciones, el polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, o al menos 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 2 a 389 de SEQ ID NO: 45, tal como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, tal como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, tal como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, tal como se define en las reivindicaciones.
[0031] En determinadas realizaciones, un polipéptido de la presente divulgación comprende un epítopo de células T CD8+ heterólogo, en el que el polipéptido es capaz de suministrar de forma intracelular el epítopo de células T para su presentación por una molécula de MHC de clase I en la superficie de una célula en la que el está presente el polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende un polipéptido derivado de toxina capaz de enrutarse a un compartimento subcelular de una célula en la que está presente el polipéptido derivado de toxina seleccionado del grupo que consiste en: citosol, retículo endoplásmico y lisosoma. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el epítopo de células T CD8+ heterólogo en el polipéptido derivado de la toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido derivado de toxina que comprende un polipéptido efector de toxina capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de toxina derivado de una toxina seleccionada del grupo que consiste en: toxina ABx, toxina proteica inactivante de ribosomas, abrina, toxina de ántrax, Aspfl, bouganina, briodina, toxina de cholix, claudina, toxina de la difteria, gelonina, enterotoxina termolábil, mitogilina, toxina pertussis, proteína antiviral de phytolacca americana, pulchelina, exotoxina A de Pseudomonas, restrictocina, ricina, saporina, sarcina, toxina Shiga y citotoxina subtilasa. En determinadas realizaciones, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de toxina derivado de los aminoácidos 75 a 251 de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, 0 SEQ ID NO: 3, o los aminoácidos 2 a 389 de SEQ ID NO: 45. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de la toxina Shiga derivado de los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina Shiga se deriva de los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID n O: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina Shiga se deriva de los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
[0032] En determinadas realizaciones, un polipéptido de la presente divulgación comprende un polipéptido efector de suministro al proteasoma asociado con un epítopo de células T CD8+ heterólogo, y capaz de suministro intracelular del epítopo de células T para la presentación por una molécula de MHC de clase I en la superficie de un célula en la que está presente el polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende un polipéptido efector de la toxina Shiga, en el que el epítopo de células T CD8+ heterólogo no se fusiona directamente al extremo amino del polipéptido efector de la toxina Shiga. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende además un segundo epítopo de células T integrado o insertado en un epítopo de células B. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende además un polipéptido derivado de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende además el polipéptido derivado de toxina que comprende un polipéptido efector de toxina que comprende el polipéptido efector que suministra al proteasoma y el segundo epítopo de células T. En determinadas realizaciones adicionales, un polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido derivado de toxina que comprende un polipéptido efector de toxina capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de toxina derivado de una toxina seleccionada del grupo que consiste en: toxina ABx, toxina proteica inactivante de ribosomas, abrina, toxina de ántrax, Aspfl, bouganina, briodina, toxina de cholix, claudina, toxina de la difteria, gelonina, enterotoxina termolábil, mitogilina, toxina pertussis, proteína antiviral de phytolacca americana, pulchelina, exotoxina A de Pseudomonas, restrictocina, ricina, saporina, sarcina, toxina Shiga y citotoxina subtilasa. En determinadas realizaciones, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de toxina derivado de los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o s Eq ID NO: 3, o los aminoácidos 2 a 389 de SEQ ID NO: 45. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de la toxina Shiga derivado de los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina Shiga se deriva de los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o Se Q iD NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina Shiga se deriva de los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
[0033] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, hay un procedimiento para aumentar la inmunogenicidad de células T CD8+ de un polipéptido capaz de enrutamiento intracelular a un compartimento subcelular de una célula en la que está presente el polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: citosol, retículo endoplásmico y lisosoma; comprendiendo el procedimiento la etapa de: integrar o insertar un epítopo de células T CD8+ heterólogo en el polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales, el procedimiento descrito comprende la etapa de integración o inserción en la que la integración o inserción en un epítopo de células B endógenas, un epítopo de células T CD4+ endógenas y/o un dominio catalítico del polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, el polipéptido del procedimiento se deriva de una toxina. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento, el polipéptido comprende un polipéptido efector de toxina capaz de suministrar intracelularmente un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a un proteasoma de una célula en la que está presente el polipéptido efector de toxina, y el procedimiento comprende integrar o insertar el epítopo de células T heterólogo en el polipéptido efector de la toxina. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, la etapa de integración o inserción da como resultado un polipéptido efector de toxina capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina además del suministro intracelular de un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina.
[0034] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, hay un procedimiento para aumentar la inmunogenicidad de células T CD8+ de un polipéptido capaz de suministro intracelular de un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a un proteasoma de una célula en la que está presente el polipéptido, comprendiendo el procedimiento la etapa de: integrar o insertar un epítopo de células T CD8+ heterólogo en el polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, el polipéptido del procedimiento se deriva de una toxina. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, el polipéptido comprende un polipéptido efector de toxina capaz de suministrar intracelularmente un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a un proteasoma de una célula en la que está presente el polipéptido efector de toxina y el procedimiento comprende integrar o insertar el epítopo de células T heterólogo en el polipéptido efector de toxina. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, la etapa de integración o inserción da como resultado un polipéptido efector de toxina capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina además del suministro intracelular de un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a un MHC de clase I molécula de una célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina.
[0035] La presente invención proporciona un procedimiento para aumentar la inmunogenicidad de células T CD8+ de un polipéptido parental capaz de suministrar intracelular un epítopo de células T CD8+ desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente el polipéptido, la procedimiento que comprende la etapa de: integrar un epítopo de células T CD8+ heterólogo en el polipéptido, como se define en las reivindicaciones. El polipéptido parental del procedimiento comprende un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o un polipéptido efector de la toxina de la difteria, como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito en el presente documento, el polipéptido comprende un polipéptido efector de toxina capaz de suministrar intracelular un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a un proteasoma de una célula en la que está presente el polipéptido efector de toxina. y el procedimiento comprende integrar o insertar el epítopo de células T heterólogo en el polipéptido efector de toxina. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento, la etapa de inclusión da como resultado un polipéptido efector de toxina capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina además de la entrega intracelular del epítopo de células T CD8+ integrado desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina, como se define en las reivindicaciones.
[0036] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, hay un procedimiento para crear una molécula de administración de epítopo de células T capaz de administrar un epítopo de células T intracelular desde un compartimento endosómico temprano al citosol, retículo endoplásmico y/o lisosoma de un célula en la que está presente la molécula, el procedimiento comprende el paso de: asociar un epítopo de células T heterólogo con un polipéptido capaz de dirigirse a un compartimento subcelular de una célula en la que está presente el polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: citosol, retículo endoplásmico y lisosoma. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, la asociación consiste en integrar o insertar el epítopo de células T heterólogo en un epítopo de células B endógenas, un epítopo de células T CD4+ endógenas y/o un dominio catalítico de la molécula. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, el polipéptido del procedimiento se deriva de una toxina. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento, el polipéptido comprende un polipéptido efector de toxina capaz de administrar un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano al citosol, retículo endoplásmico y/o lisosoma de una célula en la que el polipéptido efector de toxina está presente, y el procedimiento comprende integrar o insertar el epítopo de células T heterólogo en el polipéptido efector de la toxina. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, la etapa de integración o inserción da como resultado un polipéptido efector de toxina capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina además de la liberación intracelular de un epítopo de células T desde un compartimiento endosómico temprano al citosol, retículo endoplásmico y/o lisosoma de una célula en la está presente el polipéptido efector de la toxina.
[0037] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación hay un procedimiento para crear una molécula de administración de epítopo de células T CD8+ capaz de administrar un epítopo de células T intracelular desde un compartimento endosómico temprano a un proteasoma de una célula en la que la molécula de administración presente, el procedimiento que comprende el paso de: integrar o insertar un epítopo de células T CD8+ heterólogo en un proteasoma que libera polipéptido efector capaz de administrar un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a un proteasoma de una célula en la que está presente el polipéptido efector de liberación. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, la asociación consiste en integrar o insertar el epítopo de células T heterólogo en un epítopo de células B endógenas, un epítopo de células T CD4+ endógenas, y/o un dominio catalítico de la molécula. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento, el polipéptido del procedimiento se deriva de una toxina. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, el polipéptido comprende un polipéptido efector de toxina capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina además de la administración intracelular de un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a un proteasoma de una célula en la que el está presente el polipéptido efector de la toxina.
[0038] La presente invención proporciona un procedimiento para crear una molécula de administración de epítopo de células T CD8+ capaz de administrar un epítopo de células T CD8+ desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente la molécula de administración, la procedimiento que comprende el paso de: integrar un epítopo de células T CD8+ heterólogo en un proteasoma que libera polipéptido efector capaz de administrar un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que se encuentra la molécula de administración presente, como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento, el epítopo de células T heterólogo está integrado en un epítopo de células B endógenas, un epítopo de células T CD4+ endógenas y/o un dominio catalítico de la molécula. En el procedimiento de la presente invención, el polipéptido efector que libera proteasoma comprende un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o un polipéptido efector de la toxina de la difteria, y el procedimiento comprende integrar el epítopo de células T heterólogo en el polipéptido efector de la toxina, como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento, el polipéptido efector de toxina resultante del procedimiento es capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina además del suministro intracelular de un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de un célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina.
[0039] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, hay un procedimiento para crear una molécula de administración de epítopo de células T CD8+ capaz, cuando está presente en una célula, de administrar un epítopo de células T para su presentación mediante una molécula de MHC de clase I, comprendiendo el procedimiento el paso de: integración o inserción de un epítopo de células T CD8+ heterólogo en un polipéptido efector de liberación de proteasoma capaz de liberación intracelular de un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a un proteasoma de una célula en la que está presente el polipéptido efector de liberación de proteasoma. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, la asociación consiste en integrar o insertar el epítopo de células T heterólogo en un epítopo de células B endógenas, un epítopo de células T CD4+ endógenas y/o un dominio catalítico de la molécula. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, el polipéptido del procedimiento se deriva de una toxina. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento, el polipéptido comprende un polipéptido efectorde toxina que comprende el polipéptido efector que administra el proteasoma, y el procedimiento comprende integrar o insertar el epítopo de células T heterólogo en el polipéptido efector de toxina. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, el polipéptido efector de toxina resultante del es capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina además del suministro intracelular de un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a una molécula MHC de clase I de un célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina.
[0040] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, hay un procedimiento para crear una molécula de administración de epítopo de células T CD8+ capaz, cuando está presente en una célula, de administrar un epítopo de células T para su presentación mediante una molécula de MHC de clase I, comprendiendo el procedimiento el paso de: integrar o insertar un epítopo de células T CD8+ heterólogo en un proteasoma que libera polipéptido efector capaz de administrar intracelularmente un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a una molécula del MHC de clase I de una célula en la que está el polipéptido efector que libera proteasoma regalo. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, la asociación consiste en integrar o insertar el epítopo de células T heterólogo en un epítopo de células B endógenas, un epítopo de células T CD4+ endógenas y/o un dominio catalítico de la molécula. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, el polipéptido del procedimiento se deriva de una toxina. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, el polipéptido comprende un polipéptido efector de toxina que comprende el polipéptido efector que libera proteasoma, y el procedimiento comprende integrar o insertar el epítopo de células T heterólogo en el polipéptido efector de toxina. En determinadas realizaciones adicionales del procedimiento descrito, el polipéptido efector de toxina resultante del es capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina además del suministro intracelular de un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a una molécula MHC de clase I de un célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina.
[0041] El polipéptido desinmunizado de la presente invención comprende un epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado que altera un epítopo de células B endógenas y/o un epítopo de células T CD4+, como se define en las reivindicaciones. El polipéptido de la presente invención se deriva de un polipéptido efector de toxina parental, como se define en las reivindicaciones, y el epítopo de células T CD8+ heterólogo está integrado en el polipéptido efector de toxina parental, como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente invención es capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina además de la liberación intracelular de un epítopo de células T CD8+ desde un compartimiento endosómico temprano a una molécula de MHC Clase I de una célula en la que el polipéptido está presente, como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de toxina derivado de una toxina seleccionada del grupo que consiste en: toxina ABx, toxina proteica inactivante de ribosoma, abrina, toxina del ántrax, Aspfl, bouganina, briodina, toxina cholix, claudina, toxina de la difteria, gelonina , enterotoxina termolábil, mitogilina, toxina pertussis, proteína antiviral de phytolacca americana, pulchellin, exotoxina A de Pseudomonas, restrictocina, ricina, saporina, sarcina, toxina Shiga y citotoxina subtilasa. En determinadas realizaciones adicionales de la divulgación, el polipéptido efector de la toxina es un polipéptido efector de la toxina de la difteria que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de las subunidades A y B de al menos un miembro de la familia de la toxina de la difteria. en el que el polipéptido efector de la toxina de la difteria comprende una ruptura de al menos un epítopo de células B y/o una región del epítopo de células T CD4+ de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consiste en: 3-10 de SEQ ID NO : 39, 33­ 43 de SEQ ID NO: 39, 71-77 de SEQ ID NO: 39, 125-131 de SEQ ID NO: 39, 138-146 de SEQ ID NO: 39, 165-175 de SEQ ID NO : 39 y 185-191 de SEQ ID NO: 39; y en el que el polipéptido efector de la toxina de la difteria es capaz de dirigirse a un compartimento citosol de una célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina de la difteria. En un aspecto de la presente invención, el polipéptido de la presente invención se deriva de un polipéptido efector de la toxina de la difteria parental que comprende o consiste en los aminoácidos 2 a 389 de SEQ ID NO: 45. En otro aspecto de la presente invención, el polipéptido deriva de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental que comprende una secuencia de aminoácidos de una subunidad A de al menos un miembro de la familia de la toxina Shiga, como se define en las reivindicaciones, en el que el polipéptido comprende un CD8+ T heterólogo integrado -epítopo de células que altera al menos un epítopo de células B y/o una región del epítopo de células T CD4+ de la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de la toxina Shiga seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consta de: las regiones del epítopo de células B 1-15 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 3-14 de SEQ ID NO: 3; 26-37 de SEQ ID NO: 3; 27-37 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 39-48 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 42-48 de SEQ ID NO: 3; 53-66 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; 94-115 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; 141-153 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 140-156 de SEQ ID NO: 3; 179-190 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 179-191 de SEQ ID NO: 3; 204 de SEQ ID NO: 3; 205 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y 210-218 de SEQ ID NO: 3; 240-260 de SEQ ID NO: 3; 243-257 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y 254-268 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y las regiones 4-33 del epítopo de células T CD4+ de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 34-78 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 77-103 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 128-168 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 160-183 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y 236-258 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y en el que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental es capaz de dirigirse a un compartimento citosol de una célula en la que está presente. En determinadas realizaciones, el polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
[0042] En determinadas realizaciones, un polipéptido de la presente divulgación comprende un epítopo de células T CD8+ heterólogo que altera un epítopo de células B endógenas y/o un epítopo de células T CD4+ endógenas, en el que el polipéptido es capaz de suministrar intracelularmente las células T CD8+. epítopo de un compartimento endosómico temprano a un proteasoma de una célula en la que está presente el polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende un polipéptido derivado de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el epítopo de células T CD8+ heterólogo está en el polipéptido derivado de la toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido derivado de toxina de la presente invención comprende un polipéptido efector de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el epítopo de células T CD8+ heterólogo en el polipéptido efector de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de toxina es capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de toxina derivado de una toxina seleccionada del grupo que consiste en: toxina ABx, toxina proteica inactivante de ribosomas, abrina, toxina de ántrax, Aspfl, bouganina, briodina, toxina de cholix, claudina. , toxina de la difteria, gelonina, enterotoxina termolábil, mitogilina, toxina pertussis, proteína antiviral de phytolacca americana, pulchellina, exotoxina A de Pseudomonas, restrictocina, ricina, saporina, sarcina, toxina Shiga y citotoxina subtilasa. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina es un polipéptido efector de la toxina de la difteria que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de las subunidades A y B de al menos un miembro de la familia de la toxina de la difteria, en el que el polipéptido efector de la toxina de la difteria comprende una ruptura de al menos un epítopo de células B y/o una región del epítopo de células T CD4+ de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consiste en: 3-10 de SEQ ID NO : 39, 33-43 de SEQ ID NO: 39, 71-77 de SEQ ID NO: 39, 125­ 131 de SEQ ID NO: 39, 138-146 de SEQ ID NO: 39, 165-175 de SEQ ID NO : 39 y 185-191 de SEQ ID NO: 39; y en el que el polipéptido efector de la toxina de la difteria es capaz de dirigirse a un compartimento citosol de una célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina de la difteria. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de la toxina de la difteria derivado de los aminoácidos 2 a 389 de la SEQ ID NO: 45. En cierta realización adicional, el polipéptido efector de la toxina es un polipéptido efector de la toxina Shiga que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una subunidad A de al menos un miembro de la familia de la toxina Shiga, donde el polipéptido efector de la toxina Shiga comprende una ruptura de al menos un epítopo de células B y/o región de epítopo de células T CD4+ de la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de la toxina Shiga seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consiste en: las regiones de epítopo de células B 1-15 de Se Q ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 3-14 de SEQ ID NO: 3; 26­ 37 de SEQ ID NO: 3; 27-37 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 39-48 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 42-48 de SEQ ID NO: 3; 53-66 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; 94-115 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; 141-153 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 140-156 de SEQ ID NO: 3; 179-190 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 179-191 de SEQ ID NO: 3; 204 de SEQ ID NO: 3; 205 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y 210-218 de SEQ ID NO: 3; 240-260 de SEQ ID NO: 3; 243-257 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 254-268 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 262-278 de SEQ ID NO: 3; 281-297 de SEQ ID NO: 3; y 285-293 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y las regiones 4-33 del epítopo de células T CD4+ de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 34-78 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 77-103 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 128-168 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 160-183 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 236-258 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y 274-293 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y en el que el polipéptido efector de la toxina Shiga es capaz de dirigirse a un compartimento citosol de una célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina Shiga. En determinadas formas de realización, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de la toxina Shiga derivado de los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de la toxina Shiga derivado de los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina Shiga se deriva de los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina Shiga se deriva de los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de la toxina Shiga derivado de los aminoácidos 1 a 241 de Se Q ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID No : 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina Shiga se deriva de los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina Shiga se deriva de los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
[0043] El polipéptido desinmunizado de la presente invención comprende un epítopo de células T CD8+ heterólogo que altera un epítopo de células B endógenas y/o un epítopo de células T CD4+ como se define en las reivindicaciones, en el que el polipéptido es capaz de administración intracelular de CD8+ Epítopo de células T a una molécula de MHC de clase I de un compartimento endosómico temprano de una célula en la que está presente el polipéptido. El polipéptido de la presente invención se deriva de un polipéptido efector de toxina parental, como se define en las reivindicaciones, y el epítopo de células T CD8+ heterólogo está integrado en el polipéptido efector de toxina parental, como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido desinmunizado de la presente invención es capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina además del suministro intracelular de un epítopo de células T CD8+ desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que se encuentra el polipéptido presente, como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de toxina derivado de una toxina seleccionada del grupo que consiste en: toxina ABx, toxina proteica inactivante de ribosomas, abrina, toxina de ántrax, Aspfl, bouganina, briodina, toxina de cholix, claudina. , toxina de la difteria, gelonina, enterotoxina termolábil, mitogilina, toxina pertussis, proteína antiviral de phytolacca americana, pulchellina, exotoxina A de Pseudomonas, restrictocina, ricina, saporina, sarcina, toxina Shiga y citotoxina subtilasa. En determinadas realizaciones adicionales de la divulgación, el polipéptido efector de la toxina es un polipéptido efector de la toxina de la difteria que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de las subunidades A y B de al menos un miembro de la familia de la toxina de la difteria, donde el polipéptido efector de la toxina de la difteria comprende una ruptura de al menos un epítopo de células B y/o una región del epítopo de células T CD4+ de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consta de: 3-10 de SEQ ID NO: 39, 33-43 de SEQ ID NO: 39, 71-77 de SEQ ID NO: 39, 125-131 de SEQ ID NO: 39, 138-146 de SEQ ID NO: 39, 165-175 de SEQ ID NO: 39 y 185-191 de SEQ ID NO: 39; y en el que el polipéptido efector de la toxina de la difteria es capaz de dirigirse a un compartimento citosol de una célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina de la difteria. En un aspecto de la presente invención, el polipéptido de la presente invención se deriva de un polipéptido efector de la toxina de la difteria parental que comprende o consiste en los aminoácidos 2 a 389 de SEQ ID NO: 45, como se define en las reivindicaciones. En otro aspecto de la presente invención, el polipéptido se deriva de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una subunidad A de al menos un miembro de la familia de la toxina Shiga, como se define en las reivindicaciones, donde el polipéptido comprende un epítopo de células T CD8+ integrado y heterólogo que altera al menos un epítopo de células B y/o una región del epítopo de células T CD4+ de la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de la toxina Shiga seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consiste en: Regiones de epítopo de células B 1-15 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 3-14 de SEQ ID NO: 3; 26-37 de SEQ ID NO: 3; 27-37 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 39-48 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 42-48 de SEQ ID NO: 3; 53-66 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; 94-115 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; 141-153 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 140-156 de SEQ ID NO: 3; 179-190 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 179-191 de SEQ ID NO: 3; 204 de SEQ ID NO: 3; 205 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y 210-218 de SEQ ID NO: 3; 240-260 de SEQ ID NO: 3; 243-257 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y 254-268 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y las regiones 4­ 33 del epítopo de células T CD4+ de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 34-78 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 77-103 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 128-168 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 160-183 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y 236-258 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y en el que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental es capaz de dirigirse a un compartimento citosol de una célula en la que está presente. En determinadas realizaciones, el polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3
[0044] En determinadas realizaciones, un polipéptido desinmunizado de la presente divulgación comprende un epítopo de células T CD8+ heterólogo que altera un epítopo de células B endógenas y/o un epítopo de células T CD4+, en el que el polipéptido es capaz de administrar intracelularmente CD 8+ Epítopo de células T para la presentación por una molécula de MHC de clase I en la superficie de una célula en la que está presente el polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende un polipéptido derivado de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el epítopo de células T CD8+ heterólogo está en el polipéptido derivado de la toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido derivado de toxina de la presente divulgación comprende un polipéptido efector de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el epítopo de células T CD8+ heterólogo en el polipéptido efector de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de toxina es capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de toxina derivado de una toxina seleccionada del grupo que consiste en: toxina ABx, toxina proteica inactivante de ribosomas, abrina, toxina de ántrax, Aspfl, bouganina, briodina, toxina de cholix, claudina. , toxina de la difteria, gelonina, enterotoxina termolábil, mitogilina, toxina pertussis, proteína antiviral de phytolacca americana, pulchellina, exotoxina A de Pseudomonas, restrictocina, ricina, saporina, sarcina, toxina Shiga y citotoxina subtilasa. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina es un polipéptido efector de la toxina de la difteria que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de las subunidades A y B de al menos un miembro de la familia de la toxina de la difteria, donde el polipéptido efector de la toxina de la difteria comprende una ruptura de al menos un epítopo de células B y/o región del epítopo de células T CD4+ de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consta de: 3-10 de SEQ ID NO: 39, 33-43 de SEQ ID NO: 39, 71-77 de SEQ ID NO: 39, 125-131 de SEQ ID NO: 39, 138-146 de SEQ ID NO: 39, 165-175 de SEQ ID NO: 39 y 185-191 de SEQ ID NO: 39; y en el que el polipéptido efector de la toxina de la difteria es capaz de dirigirse a un compartimento citosol de una célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina de la difteria. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de la toxina de la difteria derivado de los aminoácidos 2 a 389 de SEQ ID NO: 45. En cierta realización adicional, el polipéptido efector de la toxina es un polipéptido efector de la toxina Shiga que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una subunidad A de al menos un miembro de la familia de la toxina Shiga, donde el polipéptido efector de la toxina Shiga comprende una ruptura de al menos una B -epítopo celular y/o región del epítopo de células T CD4+ de la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de la toxina Shiga seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consiste en: las regiones 1­ 15 del epítopo de células B de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 3-14 de SEQ ID NO: 3; 26-37 de SEQ ID NO: 3; 27­ 37 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 39-48 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 42-48 de SEQ ID NO: 3; 53-66 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3; 94-115 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; 141-153 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 140-156 de SEQ ID NO: 3; 179-190 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 179-191 de SEQ ID NO: 3; 204 de SEQ ID NO: 3; 205 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y 210-218 de SEQ ID NO: 3; 240-260 de SEQ ID NO: 3; 243-257 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 254-268 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 262-278 de SEQ ID NO: 3; 281-297 de SEQ ID NO: 3; y 285-293 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y las regiones 4-33 del epítopo de células T CD4+ de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 34-78 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 77-103 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 128-168 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 160-183 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 236­ 258 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y 274-293 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y en el que el polipéptido efector de la toxina Shiga es capaz de dirigirse a un compartimento citosol de una célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina Shiga. En determinadas realizaciones, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de la toxina Shiga derivado de los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de la toxina Shiga derivado de los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina Shiga se deriva de los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina Shiga se deriva de los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
[0045] En determinadas realizaciones, un polipéptido desinmunizado de la presente divulgación comprende un polipéptido efector que administra proteasoma que comprende un primer epítopo de células T heterólogo que altera un epítopo de células B endógeno y/o un epítopo de células T CD4+, en el que el polipéptido efector que administra proteasoma es unido a un segundo epítopo de células T CD8+; y el polipéptido es capaz de suministrar intracelularmente el segundo epítopo de células T CD8+ para su presentación mediante una molécula de MHC de clase I en la superficie de una célula en la que está presente el polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende un polipéptido derivado de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el epítopo de células T CD8+ heterólogo está en el polipéptido derivado de la toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido derivado de toxina de la presente divulgación comprende un polipéptido efector de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el epítopo de células T CD8+ heterólogo en el polipéptido efector de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de toxina es capaz de exhibir una o más funciones efectoras de toxina. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de toxina derivado de una toxina seleccionada del grupo que consiste en: toxina ABx, toxina proteica inactivante de ribosomas, abrina, toxina de ántrax, Aspfl, bouganina, briodina, toxina de cholix, claudina. , toxina de la difteria, gelonina, enterotoxina termolábil, mitogilina, toxina pertussis, proteína antiviral de phytolacca americana, pulchellina, exotoxina A de Pseudomonas, restrictocina, ricina, saporina, sarcina, toxina Shiga y citotoxina subtilasa. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina es un polipéptido efector de la toxina de la difteria que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de las subunidades A y B de al menos un miembro de la familia de la toxina de la difteria, donde el polipéptido efector de la toxina de la difteria comprende una ruptura de al menos un epítopo de células B y/o una región del epítopo de células T CD4+ de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consta de: 3-10 de SEQ ID NO: 39, 33-43 de SEQ ID NO: 39 , 71-77 de SEQ ID NO: 39, 125-131 de SEQ ID NO: 39, 138-146 de SEQ ID NO: 39, 165-175 de SEQ ID NO: 39 y 185-191 de SEQ ID NO: 39; y en el que el polipéptido efector de la toxina de la difteria es capaz de dirigirse a un compartimento citosol de una célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina de la difteria. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de la toxina de la difteria derivado de los aminoácidos 2 a 389 de SEQ ID NO: 45. En cierta realización adicional, el polipéptido efector de la toxina es un polipéptido efector de la toxina Shiga que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una subunidad A de al menos un miembro de la familia de la toxina Shiga, donde el polipéptido efector de la toxina Shiga comprende una ruptura de al menos una B -epítopo celular y/o región del epítopo de células T CD4+ de la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de la toxina Shiga seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consiste en: las regiones 1-15 del epítopo de células B de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 3-14 de SEQ ID NO: 3; 26-37 de SEQ ID NO: 3; 27-37 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 39-48 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 42-48 de SEQ ID NO: 3; 53-66 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3; 94-115 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; 141-153 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 140-156 de SEQ ID NO: 3; 179-190 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 179-191 de SEQ ID NO: 3; 204 de SEQ ID NO: 3; 205 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y 210-218 de SEQ ID NO: 3; 240-260 de SEQ ID NO: 3; 243-257 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 254-268 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 262-278 de SEQ ID NO: 3; 281-297 de SEQ ID NO: 3; y 285-293 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y las regiones 4-33 del epítopo de células T CD4+ de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 34-78 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 77-103 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 128-168 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 160-183 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 236-258 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y 274-293 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y en el que el polipéptido efector de la toxina Shiga es capaz de dirigirse a un compartimento citosol de una célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina Shiga. En determinadas realizaciones, el polipéptido de la presente divulgación comprende el polipéptido efector de la toxina Shiga derivado de los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID n O: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente invención comprende el polipéptido efector de la toxina Shiga derivado de los aminoácidos 1 a 241 de SEQ iD NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID No : 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina Shiga se deriva de los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3. En determinadas realizaciones adicionales, el polipéptido efector de la toxina Shiga se deriva de los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID n O: 3.
[0046] La presente invención proporciona un procedimiento para reducir la inmunogenicidad de las células B en un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o un polipéptido efector de la toxina de la difteria que tiene un epítopo de células B, comprendiendo el procedimiento la etapa de: integrar un epítopo de células T CD8+ heterólogo en el El polipéptido efector de la subunidad de la toxina Shiga A o el polipéptido efector de la toxina de la difteria que tiene un epítopo de células B, como se define en las reivindicaciones, de manera que uno o más residuos de aminoácidos del epítopo de células T CD8+ integrado, heterólogo, altera el epítopo B- epítopo celular en el polipéptido efector de toxina, como se indica en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más sustituciones de aminoácidos en el epítopo de células B. En determinadas realizaciones adicionales de la divulgación, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más inserciones de aminoácidos en el epítopo de células B.
[0047] En determinadas realizaciones del procedimiento de la presente invención para reducir la inmunogenicidad de las células B en un polipéptido, el procedimiento comprende el paso inicial de: identificación de un epítopo de células B en un polipéptido efector A subunidad toxina Shiga o diphetheria polipéptido toxina efector para la rotura con uno o más residuos de aminoácidos de un epítopo de células T CD8+ integrado en el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria, como se indica en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más sustituciones de aminoácidos en el epítopo de células B. En determinadas realizaciones adicionales de la divulgación, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más inserciones de aminoácidos en el epítopo de células B.
[0048] El procedimiento de la presente invención para reducir la inmunogenicidad de las células B en un polipéptido aumenta simultáneamente la inmunogenicidad de células T CD8+ del polipéptido mediante la incorporación de un epítopo de células T CD8+ heterólogo en el polipéptido efector de subunidad A de toxina Shiga o polipéptido de toxina de la difteria que tiene un epítopo de células B. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más sustituciones de aminoácidos en el epítopo de células B. En determinadas realizaciones adicionales de la divulgación, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más inserciones de aminoácidos en el epítopo de células B.
[0049] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación es un procedimiento para reducir la inmunogenicidad de las células B en un polipéptido al mismo tiempo que aumentar la inmunogenicidad de las células T CD8+ del polipéptido, comprendiendo el procedimiento las etapas de: identificar un epítopo de células T CD4+ en un polipéptido; y alterar el epítopo de células T CD4+ identificado con uno o más residuos de aminoácidos en un epítopo de células T CD8+ añadido al polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más sustituciones de aminoácidos en el epítopo de células B. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más inserciones de aminoácidos en el epítopo de células B.
[0050] La presente invención también proporciona un procedimiento para reducir la inmunogenicidad de las células T CD4+ en un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o un polipéptido efector de la toxina de la difteria que tiene un epítopo de células T CD4+, el procedimiento comprende la etapa de: integrar una célula T CD8+ heteróloga epítopo en el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o polipéptido efector de la toxina de la difteria que tiene un epítopo de células T CD4+, como se define en las reivindicaciones, de manera que uno o más residuos de aminoácidos del epítopo de células T CD8+ integrado, heterólogo altera el epítopo de células T CD4+ en el polipéptido efector de toxina, como se indica en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más sustituciones de aminoácidos en el epítopo de células T CD4+. En determinadas realizaciones adicionales de la divulgación, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más inserciones de aminoácidos en el epítopo de células T CD4+.
[0051] En determinadas realizaciones del procedimiento de la presente invención para reducir la inmunogenicidad de células T CD4+ en un polipéptido, el procedimiento comprende el paso inicial de: identificar un epítopo de células T CD4+ en un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o polipéptido efector de la toxina de la difteria para rotura con uno o más residuos de aminoácidos de un epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado en el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria, como se indica en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más sustituciones de aminoácidos en el epítopo de células T CD4+. En determinadas realizaciones adicionales de la divulgación, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más inserciones de aminoácidos en el epítopo de células T CD4+.
[0052] El procedimiento de la presente invención para reducir la inmunogenicidad de células T CD4+ en un polipéptido aumenta simultáneamente CD8+ inmunogenicidad de células T del polipéptido, mediante la incorporación de un epítopo de células T CD8+ heteróloga en la toxina Shiga polipéptido efector A Subunidad o toxina de la difteria polipéptido efector que tiene un epítopo de células T CD4+. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más sustituciones de aminoácidos en el epítopo de células T CD4+. En determinadas realizaciones adicionales de la divulgación, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más inserciones de aminoácidos en el epítopo de células T CD4+.
[0053] En determinadas realizaciones del procedimiento de la presente invención para reducir la inmunogenicidad de las células T CD4+ en un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o un polipéptido efector de la toxina de la difteria (que aumenta simultáneamente la inmunogenicidad de las células T CD8+ del polipéptido), el procedimiento comprende la etapa inicial de: identificar un epítopo de células T CD4+ en el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o polipéptido efector de la toxina de la difteria para la alteración con uno o más residuos de aminoácidos de un epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado en el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o polipéptido efector de la toxina de la difteria, tal como se indica en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más sustituciones de aminoácidos en el epítopo de células T CD4+. En determinadas realizaciones adicionales de la divulgación, la etapa de alteración comprende además la etapa o etapas de realizar una o más inserciones de aminoácidos en el epítopo de células T CD4+.
[0054] Determinadas realizaciones de los polipéptidos de la presente divulgación proporcionan un polipéptido producido por cualquiera de los procedimientos de la presente invención.
[0055] En determinadas realizaciones, el polipéptido de la presente divulgación comprende o consiste esencialmente en cualquiera de las SEQ ID NOs: 11-43 o 46-48.
[0056] La presente invención proporciona además una molécula dirige a una célula que comprende un resto o agente dirige a una célula, y cualquier polipéptido de la presente invención, como se indica en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, la molécula de reconocimiento celular comprende además una región de unión que comprende uno o más polipéptidos y que es capaz de unirse específicamente al menos a una biomolécula diana extracelular. En determinadas realizaciones adicionales, la región de unión comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: una región determinante complementaria 3 (CDR3) polipéptido de FR3-CDR3-FR4 (FR3-CDR3-FR4) restringido, fragmento de anticuerpo de dominio único (sdAb) , nanocuerpo, dominio de anticuerpo de cadena pesada derivado de un camélido (V HFragmento H), dominio de anticuerpo de cadena pesada derivado de un pez cartilaginoso, receptores de nuevos antígenos de inmunoglobulina (IgNAR), fragmento V nar , fragmento variable monocatenario (scFv), fragmento variable de anticuerpo (Fv), fragmento de unión a antígeno (Fab) , fragmento, pequeño immunopharmaceutical modular (SMIP) dominio Fd, fibronectina derivados de 10 °dominio de fibronectina tipo III (10Fn3) (p. ej., monocuerpo), dominio de tenascina tipo III (p. ej., TNfn3), dominio de motivo de repetición de anquirina (ARD), dominio A derivado del receptor de lipoproteínas de baja densidad (dominio A de LDLR o LDLR-A ), lipocalina (anticalina), dominio Kunitz, dominio Z derivado de proteína A, dominio derivado de cristalina gamma-B (afilina), dominio derivado de ubiquitina, polipéptido derivado de Sac7d, dominio SH2 derivado de Fyn (affitina), miniproteína, Andamio de dominio de tipo lectina de tipo C, imitador de anticuerpo modificado por ingeniería genética y cualquier homólogo manipulado genéticamente de cualquiera de los anteriores que conserve la funcionalidad de unión. En determinadas realizaciones adicionales de la molécula de reconocimiento celular de la presente invención, mediante la administración de la molécula de reconocimiento celular a una célula acoplada físicamente con una biomolécula diana extracelular de la región de unión, la molécula que se dirige a las células es capaz de causar la muerte de la célula. En determinadas realizaciones adicionales de la molécula de reconocimiento celular de la presente invención, mediante la administración de la molécula de reconocimiento celular a una primera población de células cuyos miembros están acoplados físicamente a biomoléculas diana extracelulares de la región de unión, y una segunda población de células cuyos miembros no están acoplados físicamente a ninguna biomolécula diana extracelular de dicha región de unión, el efecto citotóxico de la molécula de reconocimiento celular sobre los miembros de dicha primera población de células en relación con los miembros de dicha segunda población de células es al menos 3 veces mayor. En determinadas realizaciones adicionales de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, aspartil (asparaginil) beta-hidroxilasa humana, EphA2, HER3/ErbB-3, MUC1, antígeno asociado a tirosinasa, HPV-E7, antígeno del virus de Epstein-Barr, Bcr-Abl, antígeno de alfa-fetoproteína, 17-A1, antígeno de tumor de vejiga CD38, CD15, CD23, CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305, C3AR, FceRIa, galectina-9, mrp-14, Siglec-8, Siglec-10, CD49d, CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD123, TLR4, IgE, CD107a, CD203c, CD14, CD68, CD80, CD86, CD115, F4/80, ILT-3, galectina-3, CD11a-c, GITRL, MHC Clase II, CD284- TLR4, CD107-Mac3, CD195-CCR5, HLA-DR, CD16/32, CD282-TLR2, CD11c y cualquier fragmento inmunogénico de cualquiera de los anteriores. En determinadas realizaciones adicionales de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, la molécula de reconocimiento celular comprende además un motivo de señal de retención/recuperación del retículo endoplásmico carboxi-terminal de un miembro de la familia KDEL. En determinadas realizaciones adicionales, el motivo de señal de retención/recuperación del retículo endoplásmico carboxi-terminal seleccionado del grupo que consiste en: KDEL (SEQ ID NO: 61), HDEF (SEQ ID NO: 62), HDEL (SEQ ID NO: 63), RDEF (SEQ ID NO: 64), RDEL (SEQ ID NO: 65), WDEL (SEQ ID NO: 66), YDEL (SEQ ID NO: 67), HEEF (SEQ ID NO: 68), HEEL (SEQ ID NO: : 69), QUILLA (SEQ ID NO: 70), CARRETE (SEQ ID NO: 71), KAEL (SEQ ID NO: 72), KCEL (SEQ ID NO: 73), KFEL (SEQ ID NO: 74), KGEL (SEQ ID NO: 75), KHEL (SEQ ID NO: 76), KLEL (SEQ ID NO: 77), KNEL (SEQ ID NO: 78), KQEL (SEQ ID NO: 79), KREL (SEQ ID NO: 80), KSEL (SEQ ID NO: 81), KVEL (SEQ ID NO: 82), KWEL (SEQ ID NO: 83), KYEL (SEQ ID NO: 84), KEDL (SEQ ID NO: 85), KIEL ( SEQ ID NO: 86), DKEL (SEQ ID NO:87), FDEL (SEQ ID NO:88), KDEF (SEQ ID NO:89), KKEL (SEQ ID NO:90), HADL (SEQ ID NO:91), HAEL (SEQ ID NO:92), HIEL (SEQ ID NO:93), HNEL (SEQ ID NO:94), HTEL (SEQ ID NO:95), KTEL (SEQ ID NO:96), HVEL (SEQ ID NO:97), NDEL (SEQ ID NO:98), QDEL (SEQ ID NO:99), REDL (SEQ ID NO:100), RNEL (SEQ ID NO:101), RTDL (SEQ ID NO:102), RTEL (SEQ ID NO: 103), SDEL (SEQ ID NO: 104), TDEL (SEQ ID NO: 105), and SKEL (SEQ ID NO:106).
[0057] En determinadas realizaciones de la presente invención, tras la administración de la molécula de reconocimiento celular de la presente invención a una célula acoplada físicamente con una biomolécula diana extracelular del resto de reconocimiento celular de la proteína citotóxica, la proteína citotóxica es capaz de causar la muerte de la célula.
[0058] En determinadas realizaciones de la presente invención, tras la administración de la molécula de reconocimiento celular de la presente invención a dos poblaciones diferentes de tipos de células con respecto a la presencia de una biomolécula diana extracelular, la molécula de reconocimiento celular es capaz de causar muerte celular a los tipos de células acopladas físicamente con una biomolécula diana extracelular del resto de reconocimiento celular o la región de unión del agente a un CD50 al menos tres veces o menos que el CD50 a tipos de células que no están acopladas físicamente con una biomolécula diana extracelular del resto de reconocimiento celular de la molécula de reconocimiento celular.
[0059] En determinadas realizaciones, la molécula de reconocimiento celular de la presente invención comprende o consiste esencialmente en un polipéptido de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 49­ 60.
[0060] En determinadas realizaciones adicionales, los polipéptidos de la presente invención comprenden una mutación que reduce o elimina la actividad catalítica de un polipéptido derivado de toxina pero retiene al menos otra función efectora de toxina. En determinadas realizaciones, la molécula de direccionamiento celular de la presente invención comprende además un polipéptido efector de toxina, derivado de un polipéptido efector de toxina con actividad enzimática, que comprende una mutación relativa a una toxina de origen natural que cambia la actividad enzimática del polipéptido efector de toxina. . En determinadas realizaciones adicionales, la mutación se selecciona de al menos una deleción, inserción o sustitución de un residuo de aminoácido que reduce o elimina la citotoxicidad del polipéptido efector de la toxina. En determinadas formas de realización, las moléculas de direccionamiento celular de la presente invención comprenden una región efectora de la toxina de la difteria que además comprende una mutación relativa a una subunidad A de origen natural de un miembro de la familia de la toxina de la difteria que cambia la actividad enzimática de la región efectora de la toxina de la difteria, la mutación seleccionada entre al menos una deleción o sustitución de un residuo de aminoácido, tal como, por ejemplo, H21A, Y27A, W50A, Y54A, Y65A, E148A y W153A. En determinadas realizaciones, las moléculas de la presente invención que se dirigen a células comprenden una región efectora de la toxina Shiga que además comprende una mutación relativa a una subunidad A de origen natural de un miembro de la familia de la toxina Shiga que cambia la actividad enzimática de la región efectora de la toxina Shiga. la mutación seleccionada de al menos una deleción o sustitución de un residuo de aminoácido, tal como, por ejemplo, A231E, R75A, Y77S, Y114S,
[0061] La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido y/o molécula de reconocimiento celular de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, y al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable; y la divulgación proporciona el uso de dicho polipéptido, molécula de reconocimiento celular o una composición que comprende el polipéptido o molécula de reconocimiento celular mencionados anteriormente en procedimientos de la divulgación, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Determinadas realizaciones de la presente invención son composiciones farmacéuticas que comprenden cualquier polipéptido de la presente invención y/o cualquier molécula de reconocimiento celular de la presente invención; y al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.
[0062] La presente divulgación proporciona polinucleótidos capaces de codificar un polipéptido que comprende un polipéptido o molécula o proteína específica de células descritos en este documento, así como vectores de expresión que comprenden un polinucleótido de la divulgación y células huésped que comprenden un vector de expresión de la divulgación. Las células huésped que comprenden un vector de expresión pueden usarse, por ejemplo, en procedimientos para producir un polipéptido y/o proteína de la presente invención, o un componente polipeptídico o fragmento del mismo, mediante expresión recombinante.
[0063] Adicionalmente, la presente divulgación proporciona procedimientos para destruir selectivamente una célula o células que comprende la etapa de poner en contacto una célula o células con una molécula de reconocimiento celular de la presente invención o una composición farmacéutica que comprende dicha proteína de la presente invención. En determinadas realizaciones, la etapa de poner en contacto la célula o células se produce in vitro. En algunas otras realizaciones, la etapa de poner en contacto la célula o células se produce in vivo.
[0064] La presente invención proporciona además un polipéptido de la presente invención, una molécula de reconocimiento celular de la presente invención o una composición farmacéutica de la presente invención, para su uso como medicamento, tal como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones, el polipéptido, la molécula de reconocimiento celular o la composición farmacéutica de la presente invención se utilizan para tratar o prevenir cáncer, un tumor, un trastorno inmunológico o una infección microbiana, tal como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones, el cáncer a tratar se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de hueso, cáncer de mama, cáncer del sistema nervioso central/periférico, cáncer gastrointestinal, cáncer de células germinales, cáncer glandular, cáncer de cabeza-cuello, cáncer hematológico, cáncer del tracto urinario-riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón/pleura, cáncer de próstata, sarcoma, cáncer de piel y cáncer de útero. En determinadas realizaciones, el trastorno inmunitario a tratar es un trastorno inmunitario asociado con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: amiloidosis, espondilitis anquilosante, asma, enfermedad de Crohn, diabetes, rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huésped, tiroiditis de Hashimoto, síndrome urémico hemolítico, enfermedad relacionada con el VIH, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, poliarteritis, psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, escleroderma, choque séptico, síndrome de Sjogren, colitis ulcerosa y vasculitis.
[0065] Entre determinadas realizaciones de la presente divulgación es una composición que comprende un polipéptido de la presente invención, un polipéptido y/o molécula específica de células que comprende el polipéptido antes mencionado, o una composición que comprende cualquiera de los anteriores, para el tratamiento o prevención de una cáncer, tumor, trastorno inmunológico o infección microbiana. Entre determinadas realizaciones de la presente divulgación se encuentra el uso de una composición de materia de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un cáncer, tumor, trastorno inmunológico o infección microbiana.
[0066] Determinadas realizaciones de las moléculas de direccionamiento celular de la presente divulgación pueden usarse para administrar uno o más materiales exógenos adicionales en una célula acoplada físicamente con una biomolécula diana extracelular de la proteína de la presente divulgación. Además, la presente divulgación proporciona un procedimiento para administrar material exógeno al interior de una (s) célula (s) que comprende poner en contacto la (s) célula (s), ya sea in vitro o in vivo, con una molécula dirigida a la célula, una composición farmacéutica y/o una composición de diagnóstico de la presente invención. La presente divulgación proporciona además un procedimiento para administrar material exógeno al interior de una (s) célula (s) en un paciente que lo necesita, comprendiendo el procedimiento el paso de administrar al paciente una molécula de reconocimiento celular de la presente invención,
[0067] La presente invención también proporciona el uso de un polipéptido de la presente invención, una molécula dirige a una célula de la presente invención, una composición farmacéutica de la presente invención o una composición de diagnóstico de la presente invención en el vitro diagnóstico, pronóstico, o caracterización en de una enfermedad, trastorno o afección, según se define en las reivindicaciones.
[0068] La presente invención proporciona una composición de diagnóstico que comprende una molécula dirige a una célula de la presente invención, y un agente promotor de detección, tal como se define en las reivindicaciones, para la recogida de información, tales como información útil para el diagnóstico de un tipo de célula, tejido, órgano, enfermedad, trastorno, afección o paciente.
[0069] Entre determinadas realizaciones de la presente divulgación es el procedimiento de detección de una célula utilizando una molécula dirige a una célula y/o la composición de diagnóstico de la presente invención comprende las etapas de poner en contacto una célula con dicha molécula dirige a una célula y/o composición de diagnóstico y detectar la presencia de dicha molécula de direccionamiento celular y/o composición de diagnóstico. En determinadas formas de realización de la divulgación, la etapa de poner en contacto la (s) célula (s) se produce in vitro. En determinadas formas de realización de la divulgación, la etapa de poner en contacto la (s) célula (s) se produce in vivo. En determinadas realizaciones de la divulgación, la etapa de detectar la (s) célula (s) ocurre in vitro. En determinadas realizaciones de la divulgación, el paso de detectar la (s) célula (s) se produce in vivo.
[0070] Por ejemplo, una composición de diagnóstico de la presente invención puede usarse para detectar una célula in vivo administrando a un sujeto mamífero una composición que comprende una proteína de la presente invención que comprende un agente promotor de la detección y luego detectando la presencia de la proteína de la presente invención, ya sea in vitro o in vivo. La información recopilada puede referirse a la presencia de una célula acoplada físicamente con una diana extracelular de la región de unión de la molécula de reconocimiento celular de la presente invención y puede ser útil en el diagnóstico, pronóstico, caracterización y/o tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección. Ciertos compuestos (por ejemplo, polipéptidos y moléculas de reconocimiento celular) de la presente invención, composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas y composiciones de diagnóstico) de la presente invención, y procedimientos de la divulgación se pueden usar para determinar si un paciente pertenece a un grupo que responde a una composición farmacéutica de la invención.
[0071] En determinadas realizaciones de la divulgación, los polipéptidos de la presente invención y las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención se pueden utilizar como un inmunógeno o como un componente de un inmunógeno para la inmunización y/o vacunación de un cordado.
[0072] En determinadas realizaciones, la molécula de reconocimiento celular o la composición farmacéutica de la presente invención son para la administración "sembrando" un locus de tejido dentro de un cordado, como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, el locus tisular comprende tejido maligno, tejido enfermo, tejido inflamado, masa tumoral, crecimiento canceroso, tumor, tejido infectado o masa celular anormal, como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, el epítopo de células T heterólogo de la molécula de reconocimiento celular se selecciona del grupo que consiste en: péptidos no presentados de forma nativa por las células diana de la molécula de reconocimiento celular en los complejos MHC de clase I, péptidos no presentes de forma nativa en cualquier proteína expresada por la célula diana, péptidos no presentes de forma nativa dentro del proteoma de la célula diana, péptidos no presentes de forma nativa en el microambiente extracelular del sitio a sembrar y péptidos no presentes de forma nativa en la masa turmoral o sitio de tejido infectado a reconocer, tal como se define en las reivindicaciones
[0073] La presente invención también proporciona un kit que comprende una composición de materia de la presente invención, y un reactivo adicional y/o dispositivo de administración farmacéutica, tal como se define en las reivindicaciones; y opcionalmente puede comprender instrucciones de uso.
[0074] Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con respecto a la siguiente descripción, reivindicaciones adjuntas y las figuras adjuntas. Los elementos de la presente invención mencionados anteriormente pueden combinarse de forma individual o eliminarse libremente para realizar otras realizaciones de la presente invención, dentro del alcance de las reivindicaciones, sin ninguna declaración que objete dicha combinación o eliminación en lo sucesivo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0075]
La Figura 1 muestra la disposición general de polipéptidos efectores que presentan epítopo de células T de ejemplo, que incluyen variantes desinmunizadas de células B/células T CD4+, y moléculas de reconocimiento celular que comprenden las mismas.
La Figura 2 muestra que la integración de epítopos de células T en regiones de epítopos de células B de un polipéptido efector de toxina no altera significativamente la actividad catalítica. Dos polipéptidos derivados de la toxina de la difteria de ejemplo que comprenden un epítopo de células T integrado en una región del epítopo de células B mostraron niveles de inactivación de ribosomas comparables a los de una toxina de la difteria de tipo salvaje.
La Figura 3 muestra la integración o inserción de epítopos de células T en un epítopo o epítopos alterados de la región del epítopo de células B reconocidos por varios anticuerpos anti-SLT-1A mediante análisis de transferencia Western. La Figura 4 muestra la integración de epítopos de células T en diversas regiones de epítopos de células B alterados epítopo (s) reconocidos por diversos anticuerpos anti-SLT-1A mediante análisis de transferencia Western. La Figura 5 muestra superposiciones de los resultados del análisis de citometría de flujo de conjuntos de células que reciben diferentes tratamientos: sin tratar, tratadas con una proteína de la presente invención dirigida a células de ejemplo, tratadas con epítopo-péptido exógeno y PLE, y tratadas con epítopo-péptido exógeno solo. Las células tratadas con tres ejemplos de proteínas dirigidas a células de la presente invención, cada una de las cuales comprende un polipéptido efector de toxina Shiga desinmunizado que comprende un epítopo de células T integrado que altera una región de epítopo de células B, mostraron el epítopo-péptido integrado complejado con moléculas MHC sus superficies celulares.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0076] La presente invención se describe más completamente en lo sucesivo usando realizaciones ilustrativas, no limitantes, y las referencias a las figuras adjuntas. La presente invención puede, sin embargo, realizarse de muchas formas diferentes y no debe interpretarse como limitada a las realizaciones expuestas a continuación. Más bien, estas realizaciones se proporcionan para que esta descripción sea exhaustiva y transmita el alcance de la invención a los expertos en la materia.
[0077] A fin de que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, ciertos términos se definen a continuación. Se pueden encontrar definiciones adicionales dentro de la descripción detallada de la presente invención.
[0078] Tal como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, los términos "un", "una" y "el/la" incluyen tanto los referentes singular y plural, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
[0079] Tal como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, el término "y/o" cuando se refiere a dos especies, A y B, significa al menos uno de A y B. Tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, el término "y/o" cuando hace referencia a más de dos especies, tales como A, B, y C, significa al menos uno de A, B, o C, o al menos uno de cualquier combinación de A, B, o C (con cada especie en posibilidad singular o múltiple).
[0080] A lo largo de esta memoria descriptiva, la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" se entenderán que implican la inclusión de un número entero (o componentes) o grupo de números enteros (o componentes) indicados, pero no la exclusión de cualquier otro número entero (o componentes) o grupo de números enteros (o componentes).
[0081] En toda esta memoria descriptiva, el término "que incluye" se usa para significar "que incluye, pero no limitado a". "Que incluye" y "que incluye, pero no limitado a" se utilizan indistintamente.
[0082] El término "residuo de aminoácido" o "aminoácido" incluye la referencia a un aminoácido que se incorpora en una proteína, polipéptido o péptido. El término "polipéptido" incluye cualquier polímero de aminoácidos o residuos de aminoácidos. El término "secuencia de polipéptido" se refiere a una serie de aminoácidos o residuos de aminoácidos que comprenden físicamente un polipéptido. Una "proteína" es una macromolécula que comprende uno o más polipéptidos o “cadenas” de polipéptido. Un "péptido" es un pequeño polipéptido de tamaño de menos de un total de 15-20 residuos de aminoácidos. El término "secuencia de aminoácidos" se refiere a una serie de aminoácidos o residuos de aminoácidos que comprenden físicamente un péptido o polipéptido dependiendo de la longitud. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de polipéptidos y proteínas descritas en este documento se escriben de izquierda a derecha representando su orden de un extremo amino terminal a un extremo carboxi terminal.
[0083] Los términos "aminoácido", "residuo de aminoácido", "secuencia de aminoácidos", o “secuencias de polipéptidos” incluyen aminoácidos de origen natural y, a menos que se limite de otro modo, también incluyen análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de una manera similar a los aminoácidos de origen natural, tales como selenocisteína, pirrolisina, N-formilmetionina, gamma-carboxiglutamato, hidroxiprolinahipusina, ácido piroglutámico y selenometionina. Los aminoácidos referidos en este documento por designaciones taquigráficas se indican en la Tabla A:
Tabla A: Nomenclatura de aminoácidos
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[0084] La frase "sustitución conservativa" con respecto a un polipéptido, se refiere a un cambio en la composición de aminoácidos del polipéptido que no altera sustancialmente la función y la estructura del polipéptido general (véase Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (WH Freeman and Company, Nueva York (2a ed., 1992)).
[0085] Tal como se utiliza aquí, el término "expresado", "expresar", o "expresa" se refiere a la traducción de un polinucleótido o ácido nucleico en un polipéptido o proteína. El polipéptido o las proteínas expresados pueden permanecer intracelulares, convertirse en un componente de la membrana de la superficie celular o secretarse en un espacio extracelular.
[0086] Como se usa en este documento, el símbolo "a" es la abreviatura de una región capaz de unirse a la biomolécula que sigue al símbolo de unión de tipo inmunoglobulina. El símbolo "a" se usa para referirse a la característica funcional de una región de unión de tipo inmunoglobulina basada en su capacidad de unión a la biomolécula que sigue al símbolo.
[0087] El símbolo "::" significa las regiones de polipéptidos antes y después de que están vinculados físicamente juntos para formar un polipéptido continuo.
[0088] Para los propósitos de la presente invención, la frase "derivado de" significa que la región polipéptido comprende aminoácidos secuencias de ácido encontraron originalmente en una proteína y que ahora puede comprender adiciones, deleciones, truncamientos, u otras alteraciones relativas a la secuencia original tal que la función y la estructura generales se conservan sustancialmente.
[0089] Para los propósitos de la presente invención, el término significa "efectoras" que proporcionan una actividad biológica, tales como citotoxicidad, la señalización biológica, catálisis enzimática, enrutamiento subcelular, y/o intermolecular de unión que resulta en el reclutamiento o más de los factores (s) y/o efectos alostéricos.
[0090] Como se usa en este documento, los términos "subunidades" y "cadena" con respecto a las toxinas multiméricas, tales como, por ejemplo, las toxinas ABX, se utilizan indistintamente.
[0091] Para los propósitos de la presente invención, la frase "de células T CD8+ hiper-inmunizados" significa que la molécula, cuando está presente en el interior de una célula nucleada, cordados dentro de un cordado de estar, tiene un mayor potencial antigénico y/o inmunogénico con respecto a CD8+ Antigenicidad o inmunogenicidad de células T. habitualmente, las moléculas inmunizadas con células T CD8+ son capaces de internalización celular en un compartimento endosómico temprano de una célula cordada nucleada debido a una característica o características inherentes o como un componente de una molécula dirigida a la célula.
[0092] Para los propósitos de la presente invención, la frase "de células B y/o de células T CD4+ de-inmunizado" significa que la molécula tiene un reducido antigénico y/o potencial inmunogénico tras la administración a un mamífero con respecto a cualquiera de las células B antigenicidad o inmunogenicidad y/o antigenicidad o inmunogenicidad de células T CD4+.
[0093] Para los propósitos de la presente invención, el término "efector de liberación de proteasoma" significa una molécula que proporciona la actividad biológica de localización dentro de una célula en un compartimento subcelular que es competente para dar como resultado la degradación proteasomal de la molécula efectora de liberación de proteasoma. Generalmente, este proteasoma que libera actividad biológica se puede determinar a partir de la ubicación subcelular inicial de la molécula efectora que libera proteasoma en un compartimento endosómico temprano; sin embargo, también se puede determinar antes, por ejemplo, a partir de una ubicación de inicio extracelular que implica el paso al interior de una célula ya través de un compartimento endosómico de la célula, tal como, por ejemplo, después de la entrada endocitótica en esa célula. Alternativamente, La actividad biológica efectora que administra el proteasoma puede, en determinadas realizaciones, no implicar el paso a través de cualquier compartimento endosómico de una célula antes de que el polipéptido efector que administra el proteasoma se internalice y alcance un compartimento competente para dar como resultado su degradación proteasómica. El experto en la materia puede ensayar la capacidad de una molécula dada para proporcionar funciones efectoras de liberación de proteasomas utilizando técnicas conocidas en la técnica.
[0094] El término "heterólogo" con respecto a epítopo de células T o de células T componente péptido epítopo de un polipéptido de la presente invención se refiere a una secuencia de epítopo o péptido que no ocurrió inicialmente en el polipéptido para ser modificado, pero que se ha añadido al polipéptido utilizando un procedimiento de la presente invención, ya sea añadido mediante los procesos de integración, fusión, inserción y/o sustitución de aminoácidos como se describe en el presente documento, o por cualquier otro medio de ingeniería. El resultado es un polipéptido modificado que comprende un epítopo de células T extraño al polipéptido no modificado original, es decir, el epítopo de células T no estaba presente en el polipéptido original.
[0095] El término "endógeno" con respecto a un epítopo de células B o un epítopo de células T CD4+ en un polipéptido se refiere a un epítopo ya presente en el polipéptido antes de ser modificado mediante un procedimiento de la presente invención.
[0096] Tal como se usa en este documento, los términos "alterado", "alteración", o "alterar", con respecto a una región de polipéptido o característica dentro de un polipéptido se refiere a una alteración de al menos un aminoácido dentro de la región o que compone la característica . Las alteraciones de aminoácidos incluyen diversas mutaciones, tales como, por ejemplo, una deleción, inversión, inserción o sustitución que alteran la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Las alteraciones de aminoácidos también incluyen cambios químicos, tales como, por ejemplo, la alteración de uno o más átomos en un grupo funcional de aminoácido o la adición de uno o más átomos a un grupo funcional de aminoácido.
[0097] La frase "en asociación con" o "asociado con" con respecto a un epítopo de células T o componente del péptido de epítopo de células T de un polipéptido de la presente invención significa que el epítopo de células T y polipéptido están unidos físicamente, ya sea mediante enlaces covalentes o no covalentes, tales como, por ejemplo, integrados o insertados dentro del polipéptido, fusionado al polipéptido y/o conjugado químicamente con el polipéptido.
[0098] El término "asociar" con respecto a la presente invención reivindicada significa el acto de hacer que dos moléculas se asocien entre sí o estén en asociación unos con otros.
[0099] El término "integrado" y variantes gramaticales del mismo, con respecto a un epítopo de células T o componente del péptido de epítopo de células T de un polipéptido de la presente invención, se refiere al reemplazo interno de uno o más aminoácidos dentro de una región polipeptídica con diferentes aminoácidos para generar una nueva secuencia polipeptídica que comparta el mismo número total de residuos de aminoácidos. Por tanto, el término integrado no incluye ninguna fusión terminal externa de ningún componente de aminoácido, péptido o polipéptido adicional al polipéptido de partida ni ninguna inserción interna adicional de ningún residuo de aminoácido adicional, sino solo sustituciones de aminoácidos existentes. El reemplazo interno se puede lograr simplemente mediante la sustitución de residuos de aminoácidos o mediante una serie de sustituciones, deleciones, inserciones y/o inversiones. Si se usa una inserción de uno o más aminoácidos, entonces el número equivalente de aminoácidos proximales debe eliminarse junto a la inserción para dar como resultado un epítopo de células T integrado. Esto contrasta con el uso del término "insertado" con respecto a los epítopos de células T en los polipéptidos de la presente invención que, en cambio, se refiere a un polipéptido con una longitud aumentada equivalente a la longitud del epítopo de células T insertado. Las inserciones incluyen las anteriores incluso si se eliminan otras regiones del polipéptido no próximas a la inserción para luego disminuir la longitud total del polipéptido final.
[0100] El término "fusionado" y variantes gramaticales del mismo, con respecto a un epítopo de células T o componente del péptido de epítopo de células T de un polipéptido de la presente invención se refiere a la adición externa de cuatro, cinco, seis, o más aminoácidos al extremo amino terminal o al extremo carboxi terminal de un polipéptido para generar un nuevo polipéptido que tiene un mayor número de residuos de aminoácidos que el original. Los epítopos de células T fusionados incluyen la adición de cuatro, cinco, seis o más aminoácidos al extremo amino o al extremo carboxi incluso si se eliminan otras regiones del polipéptido para luego disminuir la longitud total del polipéptido final siempre que el nuevo polipéptido conserve una función efectora del polipéptido original, tal como, por ejemplo, el proteasoma que administra la función efectora.
[0101] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polipéptido efector de toxina" significa un polipéptido que comprende una región efectora derivada de toxina que es suficiente para proporcionar una o más actividades biológicas presentes en la toxina de la que deriva el polipéptido.
[0102] Como se usa en el presente documento, el término "suministro de epítopo de células T" significa que una molécula proporciona la actividad biológica de localizar dentro de una célula en un compartimento subcelular que es competente para dar como resultado la degradación proteasomal de una región polipeptídica portadora del epítopo de células T. Generalmente, este proteasoma que libera actividad biológica se puede determinar a partir de la ubicación subcelular inicial de la molécula que libera el epítopo de células T en un compartimento endosómico temprano; sin embargo, también se puede determinar antes, por ejemplo, a partir de una ubicación de inicio extracelular que implica el paso al interior de una célula ya través de un compartimento endosómico de la célula, tal como, por ejemplo, después de la entrada endocitótica en esa célula. Alternativamente, La actividad de entrega del epítopo de células T puede, en determinadas realizaciones, no implicar el paso a través de cualquier compartimento endosómico de una célula antes de que la molécula de entrega del epítopo de células T se internalice y alcance un compartimento competente para administrar un epítopo de células T al proteasoma para su degradación en un -Péptido del epítopo celular. La función de suministro de epítopo de células T eficaz puede ensayarse observando la presentación de MHC del epítopo de células T liberado en una superficie celular de una célula en la que se ha internalizado la molécula de suministro de epítopo de células T.
[0103] Como se usa en el presente documento, una función o actividad efectora de la toxina pueden incluir, entre otras cosas, la promoción de la internalización celular, la promoción de endosoma escape, dirigiendo encaminamiento intracelular a un compartimento subcelular, funciones catalíticas, la unión del sustrato, la inducción de la apoptosis de las células, causando la citostasis, y citotoxicidad.
[0104] Tal como se utilizada en el presente documento, la retención de una función efectora de polipéptido derivado de toxina se refiere a un nivel de actividad funcional efectora de toxina, medida por un ensayo cuantitativo apropiado con reproducibilidad, comparable a un control de polipéptido de tipo salvaje (WT). Por ejemplo, se pueden usar varios ensayos conocidos por el experto para medir la actividad enzimática y/o el enrutamiento intracelular de un polipéptido efector de toxina. La función enzimática de la toxina efectora del polipéptido de un polipéptido de la presente invención se conserva si su actividad enzimática es comparable a la de un polipéptido de tipo salvaje (WT) en el mismo ensayo en las mismas condiciones.
[0105] El término "citotoxicidad selectiva" con respecto a la actividad citotóxica de una proteína citotóxica se refiere a los niveles relativos de citotoxicidad entre una población de células reconocidas y una población de células espectadoras no reconocidas, que se puede expresar como una relación de la concentración citotóxica semimáxima (CD50) para un tipo de célula reconocida sobre la CD50 para un tipo de célula no reconocida para mostrar preferencia de destrucción celular del tipo de célula reconocida.
Introducción
[0106] La presente invención proporciona procedimientos de generación de polipéptidos que son capaces de suministrar péptidos de epítopos de células T al sistema de MHC de clase I de una célula diana para la presentación en la superficie celular, tal como se define en las reivindicaciones. La presente invención también proporciona un epítopo de células T de ejemplo que suministra polipéptidos, tal como se define en las reivindicaciones, que son capaces de suministrar epítopos de células T heterólogos al sistema de MHC de clase I de una célula diana para la presentación en la superficie celular. Los polipéptidos de la presente invención, por ejemplo, polipéptidos que suministran epítopo de células T y polipéptidos hiperinmunizados de células T CD8+, pueden utilizarse como componentes de diversas moléculas y composiciones, por ejemplo, agentes terapéuticos citotóxicos, agentes de administración terapéuticos y moléculas de diagnóstico.
[0107] Además, la presente invención proporciona procedimientos para generar variantes de polipéptidos mediante la reducción simultánea de la probabilidad de antigenicidad y/o inmunogenicidad de células B, a la vez que se proporciona en una posición superpuesta dentro del polipéptido un epítopo de células T heterólogo para aumentar la probabilidad de inmunogenicidad de células T a través de la presentación de MHC de clase I, tal como se define en las reivindicaciones. La presente invención también proporciona un epítopo de células B desinmunizado de ejemplo, polipéptidos epítopo de células T que libera polipéptidos, que son capaces de administrar epítopos de células T heterólogos al sistema MHC de clase I de una célula diana para la presentación en la superficie celular, como se define en la reclamación (es. Los polipéptidos de la presente invención, por ejemplo, polipéptidos que liberan epítopo de células T desinmunizadas de células B/células T CD4+, pueden utilizarse como componentes de diversas moléculas y composiciones, por ejemplo,
I. La estructura general de un polipéptido hiperinmunizado de células T CD8+
[0108] La presente invención implica la ingeniería de polipéptidos que comprenden varias regiones polipeptídicas efectoras de suministro al proteasoma para comprender uno o más epítopos de células T heterólogos, tal como se define en las reivindicaciones; y donde tras el suministro del polipéptido a un compartimento endosómico temprano de una célula eucariota, el polipéptido es capaz de localizarse dentro de la célula en un compartimento subcelular suficiente para suministrar el uno o más epítopos de células T heterólogos al proteasoma para su degradación y entrada en el sistema de MHC de clase I de la célula. Los polipéptidos de la presente invención se derivan de varios polipéptidos efectores de suministro a proteasomas derivados de toxinas proteicas naturales, tal como se define en las reivindicaciones.
A. Polipéptidos diseñados para comprender uno o más epítopos de células T heterólogos y un polipéptido efector de suministro a proteasoma
[0109] La presente invención contempla el uso de varios polipéptidos efectores de la subunidad A de la toxina Shiga y polipéptidos efectores de la toxina de la difteria como punto de partida para la modificación en un polipéptido de la presente invención a través de la integración de uno o más epítopos de células T CD8+ heterólogos, tal como se define en las reivindicaciones. Estos polipéptidos de origen deben exhibir, o predecirse, para exhibir una capacidad efectora de suministro a proteasoma.
[0110] La fuente predominante de epítopos peptídicos que entran en la ruta del MHC de clase I son los péptidos que resultan de la degradación proteasómica de moléculas citosólicas. Sin embargo, las moléculas localizadas en ER, como las glicoproteínas virales y las glicoproteínas de células transformadas, también pueden ser mostradas por el sistema MHC de clase I por una ruta diferente. Aunque esta ruta alternativa a la presentación del MHC de clase I comienza en el RE, el polipéptido o la fuente de proteína del péptido se transporta al citosol para el procesamiento proteolítico por el proteasoma antes de ser transportado por los TAP al lumen del RE para la carga del péptido en la clase MHC. Yo moléculas. El mecanismo exacto subyacente a esta ruta alternativa no está claro, pero podría involucrar un sistema de vigilancia del tipo de degradación asociada a ER (ERAD) para detectar proteínas mal plegadas, "productos ribosómicos defectuosos", y estructuras que imitan a las mencionadas. Este sistema de tipo ERAD transporta ciertos polipéptidos y proteínas a los proteasomas en el citosol para su degradación, lo que puede resultar en la producción de péptidos antigénicos citosólicos. Además, la investigación sobre el enrutamiento intracelular de diversas toxinas sugiere que alcanzar el citosol o el retículo endoplásmico es suficiente para la liberación de un epítopo de células T en la ruta del MHC de clase I.
[0111] Por lo tanto, los polipéptidos y proteínas conocidos o descubiertos para localizar y/o dirigir su propio transporte intracelular al citosol y/o al retículo endoplásmico representan una clase de moléculas que se predice que comprenden una o más regiones polipeptídicas efectoras de liberación de proteasoma que exhiben una función de liberación de proteasoma (s). Determinadas proteínas y polipéptidos, tales como, por ejemplo, determinadas toxinas, exhiben la capacidad de escapar de los compartimentos endosomales al citosol, evitando así la degradación lisosómica. Por tanto, los polipéptidos y proteínas que se sabe o se descubre que escapan de los compartimentos endosomales y alcanzan el citosol se incluyen en la clase de moléculas mencionadas anteriormente.
[0112] Además, determinadas moléculas son capaces de alcanzar el proteasoma de una célula después de ser localizadas en un lisosoma. Por ejemplo, las proteínas extrañas introducidas directamente en el citosol de una célula, tal como la listeriolisina y otras proteínas secretadas por Listeria monocytogenes, pueden entrar en la vía del MHC de clase I y presentarse en complejos de MHC de clase I para su reconocimiento por las células T efectoras (Villanueva M et al., J Immunol 155: 5227 - 33 (1995)). Además, la proteólisis lisosómica, incluida la proteólisis del fagolisosoma, puede producir péptidos antigénicos que se traslocan al citosol y entran en la vía del MHC de clase I para la presentación en la superficie celular en un proceso llamado presentación cruzada, que puede haber evolucionado a partir de un sistema ERAD canónico (Gagnon E et al., Cell 110: 119 - 31 (2002)). Por lo tanto, ciertos polipéptidos y proteínas conocidos o descubiertos por localizarse en lisosomas pueden ser fuentes adecuadas para polipéptidos con regiones efectoras de suministro al proteasoma que muestran función o funciones de suministro a proteasoma.
[0113] La capacidad de una molécula proteica para enrutar intracelularmente al citosol, ER, y/o compartimentos lisosomales de una célula desde la posición inicial de un compartimento endosomal temprano puede ser determinada por el experto en la materia usando ensayos conocidos en la técnica. A continuación, el experto en la materia puede mapear y aislar las regiones polipeptídicas efectoras de suministro a proteasoma de un polipéptido o proteína fuente, tal como, por ejemplo, una toxina, utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica.
1. Polipéptidos efectores de suministro a proteasomas derivados de toxinas
[0114] La presente invención contempla el uso de diversos polipéptidos derivados de toxinas como regiones efectoras de suministro a proteasoma, tal como se define en las reivindicaciones. Muchas toxinas representan fuentes óptimas de polipéptidos efectores que suminsitran a proteasoma debido a la gran cantidad de conocimientos sobre sus comportamientos de enrutamiento intracelular.
[0115] Muchas toxinas proteicas de origen natural tienen estructuras altamente evolucionadas optimizadas para dirigir el enrutamiento intracelular en células huésped de vertebrados, incluso a través de escape endosomal y las vías de transporte retrógrado.
[0116] Numerosas toxinas exhiben propiedades de escape de endosoma, habitualmente a través de la formación de poros (Mandal M et al, Biochim Biophys Acta 1563: 7-17 (2002)). Por ejemplo, la toxina de la difteria y las proteínas que inactivan el ribosoma de la planta tipo II, tales como la ricina, pueden escapar de los endosomas (Murphy S et al., Biochim Biophys Acta 1824: 34-43 (2006); Slominska-Wojewodzka M, Sandvig K, Antibodies 2: 236-269 (2013); Walsh M et al., Virulence 4: 774-84 (2013)). El escape de los compartimentos endosomales, incluidos los lisosomas, puede medirse directamente y cuantificarse utilizando ensayos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, utilizando ensayos informadores con peroxidasa de rábano picante, albúmina de suero bovino, fluoróforos como Alexa 488 y polipéptidos derivados de toxinas (véase, por ejemplo, Bartz R et al., Biochem J 435: 475-87 (2011); Gilabert-Oriol R et al., Toxins 6: 1644-66 (2014)).
[0117] Muchas toxinas dirigen su propio encaminamiento intracelular en células huésped de vertebrados. Por ejemplo, las vías de intoxicación de muchas toxinas pueden describirse como un proceso de varios pasos que implica 1 ) internalización celular de la toxina en las células huésped, 2 ) enrutamiento intracelular de la toxina a través de uno o más compartimentos subcelulares y 3) subsiguiente localización de una porción catalítica de la toxina en el citosol donde los sustratos del factor huésped se modifican enzimáticamente. Por ejemplo, este proceso describe la vía de intoxicación de los factores letales del ántrax, las toxinas del cólera, las toxinas de la difteria, las toxinas de la tos ferina, las exotoxinas de Pseudomonas y las proteínas que inactivan los ribosomas de tipo II, como la ricina y las toxinas Shiga.
[0118] Del mismo modo, las toxinas recombinantes, estructuras de toxinas modificadas, y polipéptidos de ingeniería derivados de toxinas pueden preservar estas mismas propiedades. Por ejemplo, los polipéptidos recombinantes diseñados derivados de la toxina de la difteria (DT), la toxina del factor letal del ántrax (LF) y la exotoxina A (PE) de Pseudomonas se han utilizado como vehículos de administración para mover polipéptidos desde un espacio extracelular al citosol. Cualquier toxina proteica con la capacidad intrínseca de encaminarse intracelularmente desde un compartimento endosómico temprano al citosol o al RE representa una fuente para un polipéptido efector de liberación de proteasoma que puede explotarse para los propósitos de la presente invención, tal como un componente de partida para modificación. o como fuente para mapear una región efectora de liberación de proteasoma más pequeña en la misma.
[0119] Para muchas toxinas que se dirigen a células eucariotas, la toxicidad es el resultado de un mecanismo enzimático que implica un sustrato o sustratos en el citosol (véase la Tabla I). Estas toxinas han desarrollado estructuras de toxinas con la capacidad de suministrar regiones polipeptídicas enzimáticamente activas de sus holotoxinas al citosol. Las regiones enzimáticas de las toxinas Shiga y diftérica pueden usarse como componentes de partida para crear los polipéptidos de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones.
Tabla I.Fuentes de toxina proteica de ejemplo de polipéptidos efectores que suministran proteasoma
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[0120] Las toxinas en dos superfamilias toxina, con miembros superpuestos, son muy susceptibles para su uso en la presente invención: toxinas ABX y ribotoxins.
[0121] Las toxinas ABX son capaces de entrar en las células eucariotas y enrutarse al citosol para atacar sus dianas moleculares. De manera similar, las ribotoxinas pueden entrar en las células eucariotas y enrutarse al citosol para inactivar los ribosomas. Los miembros de las superfamilias tanto de la toxina Abx como de la ribotoxina son fuentes apropiadas para identificar polipéptidos derivados de toxinas y polipéptidos efectores de suministro de proteasomas para su uso en la presente invención.
[0122] Las toxinas ABX, que también se conocen como toxinas binarias, se encuentran en bacterias, hongos, y plantas. Las toxinas ABx forman una superfamilia de toxinas que comparten la organización estructural de dos o más cadenas polipeptídicas con funciones distintas, denominadas subunidades A y B. La x representa el número de subunidades B en las holotoxinas de los miembros de la familia ABx, tales como, por ejemplo, AB1 para la toxina de la difteria y AB5 para la toxina Shiga. La superfamilia de toxinas AB5 se compone de 4 familias principales: toxinas cholix (Ct o Ctx), toxinas pertussis (Ptx), toxinas Shiga (Stx) y citotoxinas subtilasa (SubAB). Los mecanismos citotóxicos de las toxinas AB5 implican el enrutamiento subcelular de sus subunidades A dentro de una célula huésped eucariota e intoxicada hacia el citosol o el RE, donde las subunidades A catalíticas actúan sobre sus sustratos enzimáticos que representan diversas proteínas de la célula huésped (ver Tabla I).
[0123] Las toxinas de la difteria alteran la síntesis de proteínas a través de la ADP-ribosilación catalítica del factor de elongación eucariota-2 (EF2). Las toxinas diftéricas consisten en una subunidad A catalítica y una subunidad B, que contiene un dominio efector de translocación de bicapa de fosfolípidos y un dominio de unión de reconocimiento celular. Durante el proceso de intoxicación por toxina de la difteria, las toxinas diftéricas pueden enrutar intracelularmente sus dominios catalíticos al citosol de una célula eucariota, quizás a través del escape endosómico (Murphy J, Toxins (Basel) 3: 294-308 (2011)). Este mecanismo de escape endosómico puede ser compartido con otras toxinas, tales como, por ejemplo, factores letales de antrax y edema, y la capacidad general de escape del endosoma es exhibida por muchas toxinas diversas, incluidas, por ejemplo, determinadas toxinas de C. difficile, gelonina, listeriolisina, PE, ricina y saporina (véase, por ejemplo, Varkouhi A et al., J Control Release 151: 220 - 8 (2010); Murphy J, Toxins (Basilea) 3: 294-308 (2011)).
[0124] En particular, las toxinas que desactivan ribosomas en el citosol son útiles para la identificación de polipéptidos efectores de suministro de proteasoma para su uso en la presente invención. Estas toxinas comprenden regiones polipeptídicas que proporcionan simultáneamente una función o funciones efectoras de reconocimiento del citosol y función o funciones efectoras de la toxina ribotóxica citotóxica.
[0125] Con respecto a la presente invención reivindicada, la frase "polipéptido efector de toxina ribotóxica" se refiere a un polipéptido derivado de proteínas, incluidas las ribotoxinas naturales y las ribotoxinas sintéticas, que es capaz de efectuar la inactivación de los ribosomas in vitro, la inhibición de la síntesis de proteínas in vitro y/o en vivo, citotoxicidad y/o citostasis. Habitualmente, los polipéptidos efectores de toxinas ribotóxicas se derivan de toxinas proteicas naturales o estructuras similares a toxinas que se alteran o manipulan mediante la intervención humana. Sin embargo, otros polipéptidos, tales como, por ejemplo, dominios enzimáticos de origen natural que no están presentes de forma nativa en una toxina o polipéptido sintético, están dentro del alcance de ese término, tal como se usa en este documento (véase, por ejemplo, Newton D et al., Blood 97: 528-35 ( 2001); De Lorenzo C et al., FEBS Lett 581: 296­ 300 (2007); De Lorenzo C, D'Alessio G, Curr Pharm Biotechnol 9: 210 - 4 (2008); Menzel C et al., Blood 111: 3830-7 (2008)). Por tanto, los polipéptidos efectores de toxinas ribotóxicas pueden derivarse de construcciones de proteínas sintéticas o manipuladas con ribotoxicidad aumentada o disminuida, y/o proteínas de origen natural que se han alterado de otro modo para que tengan una característica no nativa.
[0126] Los polipéptidos efectores de toxinas ribotóxicas pueden derivarse de dominios ribotóxicos de proteínas de diversos filos, tales como, por ejemplo, algas, bacterias, hongos, plantas y animales. Por ejemplo, los polipéptidos derivados de varias ribotoxinas se han unido o fusionado a dominios de inmunoglobulina o ligandos de receptores mediante conjugación química o ingeniería de proteínas recombinantes con la esperanza de crear agentes terapéuticos citotóxicos específicos del tipo de célula (Pastan I et al., Annu Rev Biochem 61: 331-54 (1992); Foss F et al., Curr Top Microbiol Immunol 234: 63-81 (1998); Olsnes S, Toxicon 44: 361-70 (2004); Pastan I, et al., Nat Rev Cancer 6 : 559-65 (2006); Lacadena J et al., FEMS Microbiol Rev 31: 212-37 (2007); de Virgilio M et al., Toxins 2: 2699-737 (2011); Walsh M, Virulence 4: 774 -84 (2013); Weidle U et al., Cancer Genomics Proteomics 11: 25-38 (2014)).
[0127] Los polipéptidos efectores de la toxina ribotóxica pueden derivarse de los dominios catalíticos de miembros de la superfamilia de proteínas inactivadoras de ribosomas (RIP) de ribotoxinas proteicas (de Virgilio M et al., Toxins 2: 2699-737 (2011); Lapadula W et al., PLoS ONE 8: e72825 (2013); Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013)). Las RIP son proteínas ribotóxicas expresadas en algas, bacterias, hongos y plantas que a menudo son potentes inhibidores de la síntesis de proteínas eucariotas y procariotas a concentraciones subestequiométricas (véase Stirpe, F, Biochem J 202: 279-80 (1982)). Varias RIP se consideran fuentes prometedoras de secuencias de polipéptidos efectoras de toxinas para su uso en agentes terapéuticos para el tratamiento de cánceres (véase Pastan I, et al., Nat Rev Cancer 6: 559­ 65 (2006); Fracasso G et al., Ribosome-inactivating protein-containing conjugates for therapeutic use, Toxic Plant Proteins 18, págs. 225-63 (Eds. Lord J, Hartley, M. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2010); de Virgilio M et al., Toxins 2: 2699-737 (2011); Puri M et al., Drug Discov Today 17: 774-83 (2012); Walsh M, Virulence 4: 774 -84 (2013)).
[0128] Las ribotoxinas más habitualmente utilizadas en polipéptidos citotóxicos recombinantes incluyen la toxina de la difteria, exotoxina A de Pseudomonas, ricina, a-sarcina, saporina y gelonina (ver Shapira A, Benhar I, Toxins 2: 2519-83 (2010); Yu C et al., Cancer Res 69: 8987-95 (2009); Fuenmayor J, Montaño R, Cancer 3: 3370-93 (2011); Weldon, FEBS J 278: 4683-700 (2011); Carreras-Sangrá N et al., Protein Eng Des Sel 25: 425-35 (2012); Lyu M et al., Methods Enzymol 502: 167-214 (2012); Antignani, Toxins 5: 1486-502 (2013); Lin H et al., Anticancer Agents Med Chem 13: 1259-66 (2013); Polito L et al., Toxins 5: 1698-722 (2013); Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013)). Estas ribotoxinas generalmente se clasifican como proteínas inactivadoras de ribosomas (RIP) y comparten un mecanismo citotóxico general de inactivación de los ribosomas eucariotas al atacar el bucle sarcina-ricina (SRL) o proteínas necesarias para la función del ribosoma que se unen a SRL.
[0129] La estructura de SRL está altamente conservada entre los tres grupos filogenéticos, Archea, Bacteria y Eukarya, de modo que tanto los ribosomas procarióticas como eucarióticas comparten una estructura ribosómica de SRL (Gutell R et al., Nucleic Acids Res 21: 3055-74 (1993); Szewczak A, Moore P, J Mol Biol 247: 81-98 (1995); Glück A, Wool I, J Mol Biol 256: 838-48 (1996); Seggerson K, Moore P, RNA 4: 1203-15 (1998) ; Correll C et al., J Mol Biol 292: 275­ 87 (1999)). El SRL de varias especies de diversos filos se puede superponer sobre un mapa de densidad electrónica de estructura cristalina con alta precisión (Ban N et al., Science 11: 905-20 (2000); Gabashvili I et al., Cell 100: 537­ 49 (2000)). El SRL es la secuencia ribosómica conservada universalmente más grande que forma una estructura secundaria conservada vital para la función de translocación del ribosoma a través de la cooperación de factores de elongación, tales como EF-Tu, EF-G, EF1 y EF2 (Voorhees R et al., Science 330: 835-8 (2010); Shi X et al., J Mol Biol 419: 125-38 (2012); Chen K et al., PLoS One 8: e66446 (2013)). El SRL (bucle de sarcina-ricina) recibió su nombre por ser la diana compartida de la sarcina de ribotoxina fúngica y la ricina de RIP de tipo II de la planta.
[0130] La superfamilia de RIP incluye RIP, ribotoxinas fúngicas y ribotoxinas bacterianas que interfieren con las funciones de translocación de los ribosomas (ver Tabla B; Brigotti M et al., Biochem J 257: 723-7 (1989)). La mayoría de las RIP, tales como abrina, gelonina, ricina y saporina, depurinan de forma irreversible una adenina específica en el bucle de sarcina/ricina conservada universalmente (SRL) de los ARNr grandes de los ribosomas (por ejemplo, A4324 en animales, A3027 en hongos y A2660 en procariotas) . La mayoría de las ribotoxinas fúngicas, como la a-sarcina, escinden irreversiblemente un enlace específico en el SRL (por ejemplo, el enlace entre G4325 y A4326 en animales, G3028 y A3029 en hongos y G2661 y A2662 en procariotas) para inhibir catalíticamente la síntesis de proteínas al dañar los ribosomas ( Martinez-Ruiz A et al., Toxicon 37: 1549-63 (1999); Lacadena J et al., FEMS Microbiol Rev 31: 212-37 (2007); Tan Q et al., J Biotechnol 139: 156-62 (2009)). Las ribotoxinas de proteínas bacterianas Ct, DT y PE se clasifican en la superfamilia de RIP porque pueden inhibir la síntesis de proteínas al dañar catalíticamente la función del ribosoma e inducir la apoptosis de manera eficiente con solo unas pocas moléculas de toxina.
[0131] Las RIP se definen por una característica común, la capacidad de inhibir la traducción in vitro dañando el ribosoma a través de la actividad N-glicosidasa del ARN ribosómico (ARNr). Por el 2013, se habían descrito más de cien RIP (Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013)). La mayoría de las RIP depurinan un residuo de adenina específico en el bucle de sarcina/ricina (SRL) universalmente conservado del ARNr grande de los ribosomas eucariotas y procariotas. El mayor número de RIP se ha encontrado en las siguientes familias: Caryophyllaceae, Sambucaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Phytolaccaceae y Poaceae.
[0132] Los miembros de la familia de RIP se clasifican en al menos tres clases basadas en sus estructuras. Las RIP de tipo I, por ejemplo, gelonina, lufinas, PAP, saporinas y tricosantinas, son proteínas monoméricas que comprenden un dominio enzimático y carecen de un dominio de reconocimiento asociado. Las RIP de tipo II, por ejemplo, abrina, ricina, toxinas Shiga, son proteínas heteroméricas de múltiples subunidades con una subunidad A enzimática y una subunidad o subunidades B de reconocimiento típicas de las toxinas binarias ABx (Ho M, et al., Proc Natl Acad Sci USA 106: 20276 - 81 (2009)). Las RIP de tipo III, por ejemplo, RIP JIP60 de cebada y RIP b-32 de maíz, se sintetizan como proenzimas que requieren un procesamiento proteolítico extenso para su activación (Peumans W et al., FASEB J 15: 1493-1506 (2001); Mak A et al., Nucleic Acids Res 35: 6259-67 (2007)).
[0133] Aunque existe una baja homología de secuencia (<50% de identidad) entre los miembros de la familia de RIP, sus dominios catalíticos comparten estructuras terciarias conservadas que son superponibles de manera que los residuos clave implicados en la despurinación de los ribosomas son identificables (de Virgilio M et al., Toxins 2: 2699­ 737 (2011); Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013)). Por ejemplo, los dominios catalíticos de ricina y toxina Shiga se pueden superponer usando datos cristalográficos a pesar del 18% de identidad de secuencia de sus subunidades de cadena A (Fraser M et al., Nat Struct Biol 1: 59-64 (1994)).
[0134] Muchas enzimas y regiones efectoras de polipéptido se han utilizado para crear componentes citotóxicos de inmunotoxinas, tales como, por ejemplo, gelonina, saporina, proteína antiviral de fitolaca (PAP), briodina, bouganina, momordina, diantina, momorcochina, tricoquirina, lufina, restrictocina, mitogilina, alfa-sarcina, Onconase®, ribonucleasa pancreática, Bax, neurotoxina derivada de eosinófilos y angiogenina. En particular, se han generado inmunotoxinas potentemente citotóxicas usando polipéptidos derivados de las RIP: ricina, gelonina, saporina, momordina y pA p (Pasqualucci L et al., Haematologica 80: 546-56 (1995)).
[0135] Durante sus respectivos procesos de intoxicación, toxinas de cólera, ricinas y toxinas Shiga se enrutan subcelularmente al ER donde sus dominios catalíticos a continuación se liberan y translocan al citosol. Estas toxinas pueden aprovechar la maquinaria de proteína desplegada de la célula huésped y el sistema ERAD para señalar a la célula huésped para exportar sus dominios catalíticos al citosol (ver Spooner R, Lord J, Curr Top Microbiol Immunol 357: 190-40 (2012)).
[0136] La capacidad de una molécula determinada para enrutar intracelularmente a compartimentos específicos subcelulares puede ensayarse por el experto en la materia usando técnicas conocidas en la técnica. Esto incluye técnicas comunes en la técnica que pueden localizar una molécula de interés en cualquiera de los siguientes compartimentos subcelulares: citosol, ER y lisosoma.
[0137] Con respecto a la presente invención reivindicada, la frase "polipéptido efector de toxina dirigida al citosol" se refiere a un polipéptido derivado de proteínas, que incluyen ribotoxinas naturales y ribotoxinas sintéticas, que son capaces de enrutarse intracelularmente al citosol después de la internalización celular. Habitualmente, las regiones efectoras de la toxina de reconocimiento citosólico se derivan de toxinas proteicas naturales o estructuras similares a toxinas que se alteran o manipulan mediante la intervención humana; sin embargo, otros polipéptidos, tales como, por ejemplo, polipéptidos diseñados por ordenador, están dentro del alcance del término tal como se utiliza en el presente documento (véase, por ejemplo, Newton D et al., Blood 97: 528-35 (2001); De Lorenzo C et al., FEBS Lett 581: 296­ 300 (2007); De Lorenzo C, D'Alessio G, Curr Pharm Biotechnol 9: 210-4 (2008); Menzel C et al., Blood 111: 3830-7 (2008)). Por lo tanto, las regiones efectoras de la toxina de reconocimiento citosólico pueden derivarse de construcciones de proteínas sintéticas o manipuladas con ribotoxicidad aumentada o disminuida, y/o proteínas de origen natural que se han alterado de otro modo para tener una característica no nativa. La capacidad de una molécula dada para proporcionar la función o funciones efectoras de la toxina dirigida al citosol puede ensayarse por un experto en la materia utilizando técnicas conocidas en la técnica.
[0138] Las regiones efectoras de toxina de reconocimiento citosólico de la presente divulgación se pueden derivar de polipéptidos efectore de toxinas ribotóxica y a menudo se solapan o comprenden completamente un polipéptido efector de toxina ribotóxica.
2. Polipéptidos efectores de liberación de proteasomas derivados de otras regiones polipeptídicas o materiales no proteináceos
[0139] Existen numerosas moléculas proteináceas, distintas de moléculas derivadas de toxina, que tienen la capacidad intrínseca para localizarse dentro de una célula y/o dirigir su propio enrutamiento intracelular, al citosol, ER, o cualquier otro compartimento subcelular adecuados para el suministro a un proteasoma. Cualquiera de estos polipéptidos puede usarse directamente o derivatizarse en polipéptidos efectores de suministro de proteasomas para usar en la presente divulgación siempre que se conserve la función efectora de localización subcelular intrínseca.
[0140] Por ejemplo, se sabe que numerosas moléculas pueden escapar de los compartimentos endosomales después de ser endocitosadas en una célula, incluidas numerosas proteínas y polipéptidos naturales, a través de numerosos mecanismos, incluida la formación de poros, la fusión de bicapas lipídicas y los efectos de la esponja de protones (ver, por ejemplo, Varkouhi A et al., J Control Release 151: 220 - 8 (2010)). Los ejemplos no limitantes de moléculas no derivadas de toxinas con funciones de escape endosómico incluyen: agentes virales como hemaglutinina HA2; polipéptidos y péptidos derivados de vertebrados como péptidos derivados de calcitonina humana, proteína priónica bovina y péptido de flecha dulce; péptidos biomiméticos sintéticos; y polímeros con capacidad para alterar el endosoma (véase, por ejemplo, Varkouhi A et al., J Control Release 151: 220-8 (2010)). Escape de los compartimentos endosomales, incluidos los lisosomas,
[0141] Otros ejemplos son moléculas que se localizan en los diferentes compartimentos intracelulares específicos. La mayoría de los polipéptidos que comprenden un motivo de señal de retención/recuperación endoplásmica (por ejemplo, KDEL (SEQ ID NO: 61)) se pueden localizar en el RE de una célula eucariota de diferentes compartimentos dentro de la célula.
[0142] La capacidad de un polipéptido para enrutar intracelularmente al citosol, ER, y/o compartimentos lisosomales de una célula desde la posición inicial de un compartimento endosomal temprano puede ser determinada por el experto en la materia usando ensayos conocidos en la técnica. A continuación, el experto en la materia puede mapear y aislar las regiones polipeptídicas efectoras de suministro de proteasoma de un polipéptido o proteína origen, tal como, por ejemplo, una toxina, utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica.
3. Polipéptidos diseñados para comprender uno o más epítopos de células T heterólogos y un polipéptido efector de suministro de proteasoma
[0143] Una vez que se obtiene un polipéptido efector de suministro de proteasoma, que pueden ser diseñado en un polipéptido desinmunizado de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones. Uno o más epítopos de células T CD8+ se integran en un polipéptido efector de toxina que se enruta al citosol, con el fin de crear polipéptidos de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, que partiendo de un compartimento endosómico temprano son capaces de administrar un epítopo de células T al proteasoma para la entrada en la vía de MHC de clase I y la posterior presentación del MHC de clase I.
[0144] La capacidad de una molécula determinada para suministrar epítopos de células T al proteasoma para la entrada en la vía de MHC de clase I de una célula se puede ensayar por el experto en la materia utilizando los procedimientos descritos en este documento y/o técnicas conocidas en la técnica (véanse los ejemplos más abajo). De manera similar, el experto en la materia puede analizar la capacidad de una molécula determinada para administrar un epítopo de células T desde un compartimento de endosoma temprano a un proteasoma usando los procedimientos descritos en el presente documento y/o técnicas conocidas en la técnica.
[0145] La capacidad de una molécula determinada para suministrar un epítopo de células T desde un compartimiento de endosoma temprano a una molécula de MHC de clase I para la presentación en la superficie de una célula se puede ensayar por el experto en la materia utilizando los procedimientos descritos en este documento y/o técnicas conocidas en la técnica (ver Ejemplos más abajo). De manera similar, el experto en la materia puede analizar la capacidad de una molécula determinada para suminsitrar un epítopo de células T desde un compartimento de endosoma temprano a una molécula de MHC de clase I utilizando los procedimientos descritos en este documento y/o técnicas conocidas en la técnica.
[0146] Los polipéptidos efectores de suministro de proteasoma modificados usando los procedimientos de la presente invención no se requiere que sean capaces de inducir o promover la internalización celular, ya sea antes o después de la modificación por los procedimientos de la presente invención. Con el fin de producir moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, los polipéptidos de la presente invención se pueden unir, usando técnicas estándar conocidas en la técnica, con otros componentes conocidos por el experto en la materia con el fin de proporcionar un reconocimiento celular y/o función(es) de internalización celular, según sea necesario.
B. Epítopos de células T heterólogos
[0147] Los polipéptidos y moléculas de reconocimiento celular de la presente invención cada uno comprender o más integrados, epítopos de células T CD8+ heterólogas. Un epítopo de células T es una estructura molecular que está compuesta por un antígeno y puede estar representada por un péptido o una secuencia lineal de aminoácidos. Un epítopo de células T heterólogo es un epítopo que aún no está presente en el polipéptido fuente o polipéptido efector de liberación del proteasoma de partida que se modifica para crear un polipéptido desinmunizado de la presente invención, como se define en las reivindicaciones.
[0148] La presente divulgación proporciona para el péptido epítopo de células T heterólogo a incorporar en el polipéptido fuente a través de numerosos procedimientos conocidos para el experto, incluyendo, por ejemplo, los procesos de creación de una o más sustituciones de aminoácidos dentro del polipéptido de origen, fusionar uno o más aminoácidos al polipéptido fuente, insertar uno o más aminoácidos en el polipéptido fuente, unir un péptido al polipéptido fuente y/o una combinación de los procesos mencionados anteriormente. El resultado es una variante modificada del polipéptido fuente que comprende uno o más epítopos de células T heterólogos.
[0149] Aunque cualquier epítopo de células T se contempla como siendo utilizado como un epítopo de células T heterólogo de la presente divulgación, ciertos epítopos pueden seleccionarse en base a propiedades deseables. Un objetivo es crear polipéptidos hiperinmunizados de células T CD8+, lo que significa que el epítopo de células T heterólogo es altamente inmunogénico y puede provocar respuestas inmunes robustas in vivo cuando se muestra en forma de complejo con una molécula de MHC de clase I en la superficie de una célula. Los polipéptidos de la presente invención comprenden uno o más epítopos de células T CD8+ heterólogos integrados, como se define en las reivindicaciones.
[0150] Los epítopos de células T pueden derivarse de varias fuentes, incluidos componentes peptídicos de proteínas y péptidos derivados de proteínas ya conocidas o que se ha demostrado que son capaces de provocar una respuesta inmune en mamíferos. Los epítopos de células T pueden crearse o derivarse de diversas proteínas de origen natural. Los epítopos de células T pueden derivarse de diversas proteínas naturales extrañas a los mamíferos, tales como, por ejemplo, proteínas de microorganismos. En particular, los microorganismos infecciosos pueden contener numerosas proteínas con propiedades antigénicas y/o inmunogénicas conocidas o subregiones o epítopos. Los epítopos de células T pueden derivarse de proteínas humanas mutadas y/o proteínas humanas expresadas de forma aberrante por células humanas malignas.
[0151] Los epítopos de células T pueden elegirse o derivarse de una serie de moléculas fuente ya conocidas por ser capaces de provocar una respuesta inmune en mamíferos, incluidos péptidos, componentes peptídicos de proteínas y péptidos derivados de proteínas. Por ejemplo, las proteínas de patógenos intracelulares con huéspedes mamíferos son fuentes de epítopos de células T. Existen numerosos patógenos intracelulares, como virus, bacterias, hongos y eucariotas unicelulares, con proteínas o péptidos antigénicos bien estudiados. Los epítopos de células T pueden seleccionarse o identificarse a partir de virus humanos u otros patógenos intracelulares, tales como, por ejemplo, bacterias como micobacterias, hongos como toxoplasmas y protistas como tripanosomas.
[0152] Por ejemplo, existen muchos componentes peptídicos virales inmunogénicos conocidos de proteínas virales de virus humanos. Se han asignado numerosos epítopos de células T humanas a péptidos dentro de proteínas de virus de influenza A, como péptidos en las proteínas HA glicoproteínas FE17, S139/1, CH65, C05, hemaglutina 1 (HA1), hemaglutinina 2 (HA2), proteína no estructural 1 y 2 (NS1 y NS 2), proteína de matriz 1 y 2 (M1 y M2), nucleoproteína (NP), neuraminidasa (NA)), y se ha demostrado que muchos de estos péptidos provocan respuestas inmunitarias humanas, como al usar ensayo ex vivo (véase, por ejemplo, Assarsson E et al, J Virol 82: 12241-51 (2008); Alexander J et al., Hum Immunol 71: 468-74 (2010); Wang M et al., PLoS One 5: e10533 (2010); Wu J et al., Clin Infect Dis 51: 1184-91 (2010); Tan P et al., Human Vaccin 7: 402-9 (2011); Grant E et al., Immunol Cell Biol 91: 184-94 (2013); Terajima M et al., Virol J 10: 244 (2013)). De manera similar, se han mapeado numerosos epítopos de células T humanas en componentes peptídicos de proteínas de citomegalovirus humanos (HCMV), como péptidos en las proteínas pp65 (Ul83), UL128-131, inmediato-temprano 1 (IE-1; UL123), Se ha demostrado que la glicoproteína B, las proteínas del tegumento y muchos de estos péptidos provocan respuestas inmunitarias humanas, como mediante el uso de ensayos ex vivo (Schoppel K et al., J Infect Dis 175: 533-44 (1997); Elkington R et al. , J Virol 77: 5226-40 (2003); Gibson L et al., J Immunol 172: 2256-64 (2004); Ryckman B et al., J Virol 82: 60-70 (2008); Sacre K et al. ., J Virol 82: 10143 -52 (2008)).
[0153] Mientras que cualquier epítopo de células T se puede utilizar en las composiciones y procedimientos de la presente invención, ciertos epítopos de células T puede ser preferido en base a sus características conocidas y/o determinados empíricamente.
[0154] En muchas especies, el gen MHC codifica múltiples variantes moleculares de MHC-I. Debido a que los polimorfismos de la proteína MHC de clase I pueden afectar el reconocimiento del complejo antígeno-MHC de clase I por las células T CD8+, se pueden elegir epítopos de células T heterólogos basándose en el conocimiento sobre ciertos polimorfismos de MHC de clase I y/o la capacidad de determinadas clases de antígeno-MHC I complejos para ser reconocidos por células T de diferentes genotipos.
[0155] Hay péptido-epítopos bien definidos que se sabe que son inmunogénicos, restringidos por MHC de clase I y/o emparejados con una variante o variantes específicas del antígeno leucocitario humano (HLA). Para aplicaciones en seres humanos o que implican células diana humanas, el experto en la materia puede seleccionar o identificar epítopos restringidos a HLA de clase I utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica. La capacidad de los péptidos para unirse a moléculas de MHC de clase I humanas puede usarse para predecir el potencial inmunogénico de los supuestos epítopos de células T. La capacidad de los péptidos para unirse a moléculas de MHC de clase I humanas puede puntuarse utilizando herramientas de software. Los epítopos de células T pueden elegirse para su uso como un componente de epítopo de células T heterólogo de la presente invención basándose en la selectividad peptídica de las variantes de HLA codificadas por los alelos más prevalentes en determinadas poblaciones humanas. Por ejemplo, la población humana es polimórfica para la cadena alfa de las moléculas del MHC de clase I, y los alelos variables están codificados por los genes HLA. Ciertos epítopos de células T pueden ser presentados de manera más eficiente por una molécula de HLA específica, tal como, por ejemplo, las variantes de HLA que ocurren habitualmente codificadas por los grupos de alelos HlA-A HLA-A2 y HLA-A3.
[0156] Al elegir epítopos de células T para su uso como un componente heterólogo de epítopo de células T CD8+ de la presente invención, se pueden considera múltiples factores en el proceso de selección de epítopo por las moléculas de MHC de clase I que pueden influir en la generación de epítopos y el transporte a moléculas de MHC de clase I receptoras, tales como, por ejemplo, la especificidad del epítopo de los siguientes factores en la célula diana: proteasoma, ERAAP/ERAP1, tapasina y TAP (véase, por ejemplo, Akram A, Inman R, Clin Immunol 143: 99-115 (2012)).
[0157] Al elegir epítopos de células T para su uso como un componente heterólogo de epítopo de células T CD8+ de la presente invención, los péptidos de epítopos pueden seleccionarse para que mejor coincidan con las moléculas de MHC de clase I presentes en las poblaciones de tipo celular o de células a reconocer. Diferentes moléculas de MHC de clase I exhiben unión preferencial a secuencias de péptidos particulares, y los complejos de variantes de péptido-MHC de clase I particulares son reconocidos específicamente por los TCR de las células T efectoras. El experto en la materia puede utilizar el conocimiento sobre las especificidades de las moléculas de MHC de clase I y las especificidades de TCR para optimizar la selección de epítopos de células T heterólogos usados en la presente invención.
[0158] Además, múltiples epítopos de células T inmunogénicas para la presentación de MHC de clase I pueden estar integrados en el mismo componente o componentes polipeptídicos para uso en el suministro dirigido de una pluralidad de epítopos de células T simultáneamente.
C. Polipéptidos efectores de suministro de proteasomas que comprenden uno o más epítopos de células T heterólogos integrados o insertados para alterar una región del epítopo de células B endógenas y/o células T CD4+
[0159] A pesar del atractivo de usar polipéptidos efectores de suministro de proteasomas como componentes de agentes terapéuticos, muchos polipéptidos son inmunogénicos en espacios extracelulares cuando se administran a vertebrados. La inmunogenicidad no deseada en agentes terapéuticos de proteínas ha dado como resultado una eficacia reducida, una farmacocinética impredecible y respuestas inmunes indeseables que limitan las dosis y las administraciones repetidas. En los esfuerzos por desinmunizar agentes terapéuticos, un desafío principal es silenciar o alterar los epítopos inmunogénicos dentro de un dominio efector de polipéptido, por ejemplo, su dominio de direccionamiento citosólico, mientras se retiene la función o funciones efectoras de polipéptido deseadas, tales como, por ejemplo, el suministro de proteasoma. Además, es un desafío significativo alterar los epítopos inmunes mediante la sustitución de aminoácidos en una estructura polipeptídica mientras se conserva su función y al mismo tiempo se agregan uno o más epítopos de células T que no serán reconocidos por el sistema inmunológico hasta después de la internalización celular, procesamiento y presentación en la superficie de la célula por una célula diana. Resolver este desafío permite la creación de polipéptidos que exhiben la inmunogenicidad deseada de células T CD8+ al mismo tiempo que reducen la inmunogenicidad no deseada de células B y células T CD4+, a las que se hace referencia en el presente documento como moléculas "células T CD8+ hiperinmunizadas y/o células B/CD4+ T desinmunizadas" o moléculas “suministradoras de epítopo de células T y/o células B/células T CD4+ desinmunizadas".
II. La estructura general de moléculas de reconocimiento celular que comprenden polipéptidos hiperinmunizados de células T CD8+ que suministran epítopos de células T de la presente invención
[0160] Los polipéptidos de la presente invención pueden acoplarse a numerosos otros polipéptidos, agentes, y restos para crear moléculas de reconocimiento celular, tal como se define en las reivindicaciones, tales como, por ejemplo, proteínas de reconocimiento celular citotóxicas. Los polipéptidos y proteínas citotóxicos se pueden construir utilizando el epítopo de células T que comprende polipéptidos efectores de suministro de proteasoma de la presente invención y la adición de componentes dirigidos a células, tales como, por ejemplo, una región de unión capaz de exhibir una unión de alta afinidad a una biomolécula diana extracelular físicamente acoplada a la superficie de un tipo o tipos de células específicos. Además, los polipéptidos desinmunizados de epítopo de células B de la presente invención, tóxicos o no tóxicos, pueden usarse como componentes de numerosas moléculas útiles para la administración a mamíferos.
A. Moléculas de reconocimiento celular que comprenden un polipéptido efector de proteasoma que comprende un epítopo de células T heterólogos
[0161] La presente invención incluye una molécula de reconocimiento celular, que comprende 1) un grupo o agente de reconocimiento celular, tal como una región de unión y 2) un polipéptido desinmunizado de la presente invención que comprende un epítopo de célula T heterólogo, tal como se define en las reivindicaciones.
Grupos de reconocimiento celular
[0162] Determinadas moléculas de reconocimiento celular de la presente invención comprenden un polipéptido desinmunizado de la presente invención unido a un resto de reconocimiento celular que comprende una región de unión capaz de unirse específicamente a una biomolécula diana extracelular. En determinadas realizaciones, las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención comprenden un único polipéptido o proteína de manera que el polipéptido y la región de unión de reconocimiento celular se fusionan para formar una cadena polipeptídica continua o una proteína de fusión de reconocimiento celular.
[0163] Los grupos de reconocimiento celular de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención pueden comprender estructuras moleculares, que cuando se unen a un polipéptido de la presente invención, son cada una capaz de llevar la molécula de reconocimiento celular a las proximidades de células específicas basado en las interacciones moleculares en las superficies de esas células específicas. Los restos de reconocimiento celular pueden incluir ligandos y polipéptidos que se unen a las dianas de la superficie celular.
[0164] Un tipo de resto dirige a una célula es una región de unión proteico. Las regiones de unión de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención comprenden uno o más polipéptidos capaces de unirse selectiva y específicamente a una biomolécula diana extracelular. Las regiones de unión pueden comprender uno o más restos polipeptídicos, tales como ligandos, ya sean ligandos sintéticos o naturales y derivados de los mismos, dominios derivados de inmunoglobulina, armazones modificados por ingeniería sintética como alternativas a los dominios de inmunoglobulina y similares. El uso de regiones de unión proteináceas en moléculas que se dirigen a células de la presente invención permite la creación de moléculas que se dirigen a células que son proteínas de cadena única que se dirigen a células.
[0165] Existen numerosas regiones de unión conocidos en la técnica que son útiles para la orientación polipéptidos a tipos de células específicas a través de sus características de unión, tales como ligandos, anticuerpos monoclonales, derivados de anticuerpos por ingeniería genética, y alternativas de ingeniería a los anticuerpos.
[0166] Según un aspecto específico, pero no limitante, la región de unión de la molécula de reconocimiento celular de la presente invención comprende un ligando natural o derivado del mismo que retiene la funcionalidad de unión a una biomolécula diana extracelular, habitualmente un receptor de superficie celular. Por ejemplo, se pueden usar diversas citocinas, factores de crecimiento y hormonas conocidas en la técnica para dirigir las moléculas de la presente invención dirigidas a las células hacia la superficie celular de tipos celulares específicos que expresan un receptor de citocina afín, un receptor del factor de crecimiento o receptor de hormona. Ciertos ejemplos no limitantes de ligandos incluyen (los nombres alternativos se indican entre paréntesis) factores de activación de células B (BAFF, APRIL), factores estimulantes de colonias (CSF), factores de crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factores de crecimiento de tipo insulina (IGF), interferones, interleucinas (tales como IL-2, IL-6 e IL-32), factores de crecimientos de nervios (NGF), factores de crecimiento derivados de plaqueta, factores de crecimiento transformantes (TGF) y factores de necorsis tumoral (TNF).
[0167] De acuerdo con determinadas otras realizaciones, la región de unión comprende un ligando sintético capaz de unirse a un biomolécula diana extracelular. Un ejemplo no limitante son los antagonistas del antígeno 4 de linfocito T citotóxico (CTLA-4).
[0168] De acuerdo con un aspecto específico, pero no limitativo, la región de unión puede comprender una región de unión de tipo inmunoglobulina. El término "región de unión de tipo inmunoglobulina", tal como se usa en este documento, se refiere a una región polipeptídica capaz de unirse a una o más biomoléculas diana, tales como un antígeno o epítopo. Las regiones de unión pueden definirse funcionalmente por su capacidad para unirse a moléculas diana. Las regiones de unión de tipo inmunoglobulina se derivan habitualmente de anticuerpos o estructuras similares a anticuerpos; sin embargo, se contemplan armazones alternativos de otras fuentes dentro del alcance del término.
[0169] Las proteínas de inmunoglobulina (Ig) tienen un dominio estructural conocido como dominio Ig. Los dominios de Ig varían en longitud desde aproximadamente 70-110 residuos de aminoácidos y poseen un pliegue de Ig característico, en el que típicamente de 7 a 9 hebras beta antiparalelas se disponen en dos láminas beta que forman una estructura tipo sándwich. El pliegue de Ig se estabiliza mediante interacciones de aminoácidos hidrófobos en las superficies internas del sándwich y enlaces disulfuro altamente conservados entre los residuos de cisteína en las hebras. Los dominios de Ig pueden ser variables (IgV o V-set), constantes (IgC o C-set) o intermedios (IgI o I-set). Algunos dominios de Ig pueden estar asociados con una región determinante de complementariedad (CDR) que es importante para la especificidad de la unión de los anticuerpos a sus epítopos. Los dominios similares a Ig también se encuentran en proteínas que no son inmunoglobulinas y se clasifican sobre esa base como miembros de la superfamilia de proteínas Ig. El Comité de Nomenclatura Genética de HUGO (HGNC) proporciona una lista de miembros de la familia que contiene el dominio similar a Ig.
[0170] Una región de unión de tipo inmunoglobulina puede ser una secuencia polipeptídica de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en el que la secuencia de aminoácidos se ha variado de la de un anticuerpo nativo o un dominio similar a Ig de una proteína no inmunoglobulina, por ejemplo mediante ingeniería molecular o selección mediante cribado de bibliotecas. Debido a la relevancia de las técnicas de ADN recombinante y el cribado de bibliotecas in vitro en la generación de regiones de unión de tipo inmunoglobulina, los anticuerpos pueden rediseñarse para obtener las características deseadas, tales como tamaño más pequeño, entrada celular u otras mejoras terapéuticas. Las posibles variaciones son muchas y pueden ir desde el cambio de un solo aminoácido hasta el rediseño completo de, por ejemplo, una región variable. Típicamente, los cambios en la región variable se realizarán a efectos de mejorar las características de unión a antígen, mejorar la estabilidad de la región variable o reducir el potencial para las respuestas inmunogénicas.
[0171] Existen numerosas regiones de unión de tipo inmunoglobulina contempladas como componentes de la molécula de reconocimiento celular de la presente invención. En determinadas realizaciones, la región de unión de tipo inmunoglobulina se deriva de una región de unión de inmunoglobulina, tal como un paratopo de anticuerpo capaz de unirse a una biomolécula diana extracelular. En determinadas otras realizaciones, la región de unión de tipo inmunoglobulina comprende un polipéptido modificado no derivado de ningún dominio de inmunoglobulina, pero que funciona como una región de unión de inmunoglobulina proporcionando una unión de alta afinidad a una biomolécula diana extracelular. Este polipéptido diseñado puede incluir opcionalmente armazones polipeptídicos que comprenden o consisten esencialmente en regiones determinantes complementarias de inmunoglobulinas, tal como se describe en el presente documento.
[0172] También hay numerosas regiones de unión de la técnica anterior que son útiles para dirigir polipéptidos a tipos de células específicas a través de su características de unión de alta afinidad. En determinadas realizaciones, la región de unión se selecciona del grupo que incluye dominios de anticuerpos de dominio único (sdAbs), nanocuerpos, dominios de anticuerpos de cadena pesada derivados de camélidos (fragmentos VhH), nanocuerpos bivalentes, dominios de anticuerpos de cadena pesada derivados de peces cartilaginosos, nuevos receptores de antígenos de inmunoglobulina (IgNAR), fragmentos Vnar, fragmentos variables monocatenarios (scFv), fragmentos scFv multimerizantes (diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos), fragmentos de scFv en tándem biespecíficos, fragmentos variables de anticuerpos (Fv) estabilizados con disulfuro, fragmentos de unión a antígeno (Fab) estabilizados con disulfuro que consisten en dominios Vl, Vh, Ci_y Ch1, fragmentos F(ab')2 divalentes, fragmentos Fd que consisten en los dominios de cadena pesada y Ch1, minicuerpos Fv-Ch3 de cadena sencilla, minicuerpos biespecíficos, fragmentos de dominio Ch2 dimérico (Ch2D), dominios de unión al antígeno de Fc (Fcabs), fragmentos aislados de la región determinante complementaria 3 (CDR3), región marco restringida 3, CDR3, polipéptidos de la región marco 4 (FR3-CDR3-FR4), dominios inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y cualquier homólogo manipulado genéticamente de los anteriores que conserven su paratopo y función de unión (ver Saerens D et al., Curr. Opin. Pharmacol 8: 600-8 (2008); Dimitrov D, MAbs 1: 26-8 (2009); Weiner L, Cell 148: 1081-4 (2012); Ahmad Z et al., Clin Dev Immunol 2012: 980250 (2012)).
[0173] De acuerdo con determinadas otras realizaciones, la región de unión incluye la ingeniería, andamios alternativa a dominios de inmunoglobulina que presentan características funcionales similares, tales como de alta afinidad y unión de biomoléculas diana específico, y permite la ingeniería de características mejoradas, tales como mayor estabilidad o inmunogenicidad reducida. Para determinadas realizaciones de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, la región de unión se selecciona entre el grupo que incluye la ingeniería, fibronectina derivados, 10 °dominio de fibronectina tipo III (10Fn3) (monocuerpos, AdNectins ™ o AdNexins ™); dominio de tenascina tipo III derivado de tenascina, diseñado (Centryns ™); polipéptido que contiene un motivo repetido de anquirina diseñado (DARPins ™); dominio A (LDLR-A) diseñado, derivado del receptor de lipoproteínas de baja densidad (Avimers ™); lipocalina (anticalinas); dominio Kunitz derivado del inhibidor de proteasa, diseñado por ingeniería genética; dominio Z derivado de Proteína A, manipulado (Affibodies ™); andamio derivado de cristalina gamma-B diseñado o andamio derivado de ubiquitina diseñado (Affilins); Polipéptidos derivados de Sac7d (Nanoffitins® o affitins); dominio SH2 derivado de Fyn diseñado por ingeniería (Fynomers®); miniproteínas; Armazones de dominio de tipo lectina de tipo C; imitadores de anticuerpos modificados genéticamente; y cualquier contraparte manipulada genéticamente de lo anterior que conserve su funcionalidad de unión (Worn A, Plückthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001); Xu L et al., Chem Biol 9: 933 -42 (2002); Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455 -62 (2004); Binz H et al., Nat Biotechnol 23: 1257 - 68 (2005); Hey T et al., Trends Biotechnol 23: 514-522 (2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126 -36 (2005); Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653 -8 (2006); Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007); Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010); Zoller F et al., Molecules 16: 2467 - 85 (2011)). Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010); Zoller F et al., Molecules 16: 2467 - 85 (2011)). Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010); Zoller F et al., Molecules 16: 2467 -85 (2011)).
[0174] Cualquiera de las regiones de unión anteriores puede ser utilizada como un componente de la molécula de reconocimiento celular de la presente invención siempre que el componente de región de unión tenga una constante de disociación de 10'5 a 10'12 moles por litro, preferiblemente menos de 200 nanomolar (nM), hacia una biomolécula diana extracelular.
[0175] Determinadas moléculas de reconocimiento celular de la presente invención comprenden un polipéptido de la presente invención unido a una región de unión específica de biomolécula diana extracelular que comprende uno o más polipéptidos capaces de unirse de manera selectiva y específica a una biomolécula diana extracelular. Las biomoléculas diana extracelulares pueden seleccionarse basándose en numerosos criterios.
Biomoléculas diana extracelulares de los grupos de reconocimiento celular
[0176] Determinadas regiones de unión de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención comprenden una región polipéptido capaz de unirse específicamente a una biomolécula diana extracelular, preferiblemente que está físicamente acoplada a la superficie de un tipo de célula de interés, tal como una célula de cáncer, célula tumoral, célula plasmática, célula infectada o célula huésped que alberga un patógeno intracelular.
[0177] El término "biomolécula diana" se refiere a una molécula biológica, habitualmente una proteína o una proteína modificada por modificaciones post-traduccionales, tales como glicosilación, que es capaz de ser unida por una región de unión para dirigir una proteína a un tipo de célula específica o ubicación dentro de un organismo. Las biomoléculas diana extracelulares pueden incluir varios epítopos, incluidos polipéptidos no modificados, polipéptidos modificados mediante la adición de grupos funcionales bioquímicos y glicolípidos (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU.
5.091.178; EP 2431743). Es deseable que una biomolécula diana extracelular se internalice de forma endógena o se fuerce fácilmente a internalizar tras la interacción con una molécula de reconocimiento celular de la presente invención.
[0178] Para los propósitos de la presente invención, el término "extracelular" con respecto a la modificación de una biomolécula diana se refiere a una biomolécula que tiene al menos una parte de su estructura expuesta al medio extracelular. Las biomoléculas diana extracelulares incluyen componentes de la membrana celular, proteínas transmembrana, biomoléculas ancladas a la membrana celular, biomoléculas unidas a la superficie celular y biomoléculas secretadas.
[0179] Con respecto a la presente invención, la frase "acoplada físicamente" cuando se usa para describir una biomolécula diana significa interacciones intermoleculares covalentes y/o no covalentes que acoplan la biomolécula diana, o una porción de la misma, al exterior de una célula, tal como como una pluralidad de interacciones no covalentes entre la biomolécula diana y la célula donde la energía de cada interacción individual es del orden de aproximadamente 1-5 kilocalorías (por ejemplo, enlaces electrostáticos, enlaces de hidrógeno, interacciones de Van der Walls, fuerzas hidrofóbicas, etc. ). Todas las proteínas integrales de la membrana se pueden encontrar acopladas físicamente a la membrana celular, así como también las proteínas de la membrana periférica. Por ejemplo, una biomolécula diana extracelular podría comprender una región de extensión transmembrana, un ancla de lípidos, un ancla de glicolípidos y/o estar asociada de forma no covalente (por ejemplo, a través de interacciones hidrofóbicas no específicas y/o interacciones de unión a lípidos) con un factor que comprende cualquiera de los anteriores.
[0180] Las regiones de unión de las moléculas dirigidas a células de la presente invención pueden ser diseñadas o seleccionadas en base a numerosos criterios, tales como la expresión específica de tipo celular de sus biomoléculas diana y/o la localización física de sus biomoléculas diana con respecto a tipos de células específicos. Por ejemplo, determinadas proteínas citotóxicas de la presente invención comprenden dominios de unión capaces de unirse a dianas de la superficie celular que se expresan exclusivamente por un solo tipo de célula a la superficie celular.
[0181] Las células de vertebrados todas nucleadas se cree que son capaces de presentar epítopos de péptidos intracelulares utilizando el sistema de MHC de clase I. Por tanto, las biomoléculas diana extracelulares de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención pueden, en principio, reconocer cualquier célula de vertebrado nucleada para el suministro de epítopos de células T en la ruta de presentación del MHC de clase I.
[0182] Las biomoléculas diana extracelulares de la región de unión de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención puede incluir biomarcadores sobreproporcionalmente o exclusivamente presentes en las células cancerosas, células inmunes y las células infectadas con patógenos intracelulares, tales como virus, bacterias, hongos, priones o protozoos.
[0183] El experto en la materia, utilizando técnicas conocidas en la técnica, puede unir los polipéptidos desinmunizados de la presente invención a varias otras moléculas para dirigir biomoléculas diana extracelulares específicas acopladas físicamente a las células y promover la internalización de células dianas. Por ejemplo, un polipéptido de la presente invención puede unirse a una molécula de reconocimiento del receptor de la superficie celular que se somete a endocitosis más fácilmente, tal como, por ejemplo, mediante endocitosis mediada por receptor, o a una molécula que promueve la internalización celular a través de mecanismos en la superficie celular, tales como, por ejemplo, promover el ensamblaje de fosas recubiertas de clatrina, la deformación de la capa de fosfolípidos y/o la invaginación tubular. La capacidad de un grupo de reconocimiento celular para facilitar la internalización celular después de la unión a la diana puede determinarse usando ensayos conocidos por el experto en la materia.
Motivo de la señal de retención/recuperación del retículo endoplásmico de un miembro de la familia KDEL
[0184] Para los propósitos de la presente invención, la frase "motivo señal de retención/recuperación del retículo endoplasmático", motivo señal de tipo KDEL, o motivo señal se refiere a cualquier miembro de la familia KDEL capaz de funcionar dentro de una célula eucariota para promover la localización subcelular de una proteína al retículo endoplasmático a través de receptores de KDEL.
[0185] La secuencia lisina-asparagina-glutamato-leucina carboxi-terminal (KDEL (SEQ ID NO: 61)) es un motivo de señal de retención y recuperación del retículo endoplásmico canónico para proteínas solubles en células eucariotas y es reconocida por los receptores de KDEL (ver Capitani M, Sallese M, FEBS Lett 583: 3863-71 (2009), para revisión). La familia KDEL de motivos de señal incluye muchos motivos similares a KDEL ("KDEL" descrito como SEQ ID NO: 61), tales como HDEL (SEQ ID NO: 63), RDEL (SEQ ID NO: 65), WDEL (SEQ ID NO: : 66), YDEL (SEQ ID NO: 67), HEEL (SEQ ID NO: 69), QUILLA (SEQ ID NO: 70), CARRETE (SEQ ID NO: 71), KFEL (SEQ ID NO: 74), KIEL (SEQ ID NO: 86), DKEL (SEQ ID NO: 87), KKEL (SEQ ID NO: 90), HNEL (SEQ ID NO: 94), HTEL (SEQ ID NO: 95), KTEL (SEQ ID NO: 96) y HVEL (SEQ ID NO: 97), todos los cuales se encuentran en los extremos carboxilo de proteínas que se sabe que residen en el lumen del retículo endoplásmico de múltiples reinos filogenéticos (Munro S, Pelham H, Cell 48: 899-907 (1987); Raykhel I et al. al., J Cell Biol 179: 1193 - 204 (2007)). La familia de motivos de señal KDEL incluye al menos 46 variantes de polipéptidos que se muestran usando construcciones sintéticas (Raykhel, J Cell Biol 179: 1193-204 (2007)). Motivos de señal de KDEL adicionales incluyen ALEDEL (SEQ ID NO: 107), HAEDEL (SEQ ID NO: 108), HLEDEL (SEQ ID NO: 109), KLEDEL (SEQ ID NO: 110), IRSDEL (SEQ ID NO: 111), ERSTEL (SEQ ID NO: 112) y RPSTEL (SEQ ID NO: 113) (Alanen H et al., J Mol Biol 409: 291-7 (2011)). Un motivo de consenso generalizado que representa la mayoría de los motivos de señal de KDEL se ha descrito como [KRHQSA] -[DENQ] -EL (Hulo N et al., Nucleic Acids Res 34: D227-30 (2006)).
[0186] Las proteínas que contienen motivos señal de la familia KDEL están unidos por los receptores KDEL distribuidos por todo el complejo de Golgi y transportados al retículo endoplásmico por un mecanismo dependiente de microtúbulos para su liberación en el lumen del retículo endoplásmico (Griffiths G et al, J Cell Biol 127: 1557-74 (1994); Miesenbock G, Rothman J, J Cell Biol 129: 309-19 (1995)). Los receptores KDEL se ciclan dinámicamente entre el retículo endo­ plasmático y complejo de Golgi (Jackson M et al, EMBO J 9: 3153-62 (1990); Schütze M et al, EMBO J. 13: 1696-1705 (1994)).
[0187] Para los propósitos de la presente invención, los miembros de la familia KDEL incluyen motivos señal sintéticos capaces de funcionar dentro de una célula eucariota para promover la localización subcelular de una proteína al retículo endoplasmático a través de receptores KDEL. En otras palabras, algunos miembros de la familia KDEL podrían no estar presentes en la naturaleza o aún no se han observado en la naturaleza, pero se han construido o se pueden construir y verificar empíricamente usando procedimientos conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Raykhel I et al, J Cell Biol. 179: 1193-204 (2007).
[0188] Como un componente de determinadas realizaciones de los polipéptidos y moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, el motivo de señal de tipo KDEL se encuentra físicamente, orientados, o dispuesto dentro del polipéptido o proteína de reconocimiento celular, de tal manera que está en un extremo carboxilo.
[0189] Para los fines de la presente invención, el orden o la orientación específica no es fijo para el polipéptido desinmunizado y la región de unión de reconocimiento celular en relación el uno al otro o la totalidad de los extremos N-terminal y C-terminal de la proteína de fusión de reconocimiento celular completa (ver, por ejemplo, la Figura 1).
[0190] La estructura general de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención es modular, en que varios, diversa de células de metas de regiones de unión puede ser utilizado con diversos CD8 hiper-inmunizados de células T+ y/o de células B T/CD4+ -polipéptidos desinmunizados de células para proporcionar un direccionamiento diverso de diversas biomoléculas diana extracelulares y, por tanto, direccionamiento de citotoxicidad, citostasis y/o suministro de material exógeno a varios tipos de células diversos. Los polipéptidos hiperinmunizados de células T CD8+ y desinmunizados de células B/CD4+ que no dan como resultado la presentación del epítopo de células T y/o no son citotóxicos debido a un enrutamiento subcelular inadecuado, pueden seguir siendo útiles como componentes de células diana moléculas para suministrar materiales exógenos a las células, tales como, por ejemplo, un epítopo o antígeno de células T.
III. Enlazadores que conectan componentes polipeptídicos de la presente invención y/o sus subcomponentes
[0191] El resto de reconocimiento celular Individual, polipéptido, y componentes/o proteína de la presente invención, por ejemplo la célula de metas de regiones de unión y polipéptidos-de inmunizado, puede ser adecuadamente unidos entre sí mediante uno o más enlazadores bien conocidos en la art y/o descrito en este documento. Subcomponentes polipeptídicos individuales de las regiones de unión, por ejemplo, regiones variables de cadena pesada (Vh), regiones variables de cadena ligera (V l), Las regiones CDR y/o ABR, pueden enlazarse adecuadamente entre sí mediante uno o más enlazadores bien conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento (véase, por ejemplo, Weisser N, Hall J, Biotechnol Adv 27: 502-20 (2009 ); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)). Los componentes proteicos de la presente invención, por ejemplo, regiones de unión de múltiples cadenas, pueden unirse adecuadamente entre sí o con otros componentes polipeptídicos de la presente invención mediante uno o más enlazadores bien conocidos en la técnica. Los componentes peptídicos descritos en el presente documento, por ejemplo, motivos de señal de retención/recuperación del retículo endoplásmico de la familia KDEL, pueden unirse adecuadamente a otro componente de la presente invención mediante uno o más enlazadores, tales como un enlazador proteico, que son bien conocidos en la técnica.
[0192] Los conectores adecuados son generalmente aquellos que permiten cada componente polipéptido de la presente invención a veces con una estructura tridimensional muy similar a los componentes polipeptídicos producidos individualmente sin cualquier enlazador u otro componente. Los enlazadores adecuados incluyen aminoácidos individuales, péptidos, polipéptidos y enlazadores que carecen de cualquiera de los mencionados anteriormente, tales como varias cadenas de carbono no proteínicas, ya sean ramificadas o cíclicas (véase, por ejemplo, Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)).
[0193] Los conectores adecuados pueden ser uno proteináceo y comprender o más aminoácidos, péptidos, y/o polipéptidos. Los enlazadores proteináceos son adecuados tanto para proteínas de fusión recombinantes como para conjugados unidos químicamente. Un enlazador proteico tiene típicamente de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos, tales como, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 o de aproximadamente 6 a aproximadamente 25 residuos de aminoácidos. La longitud del enlazador seleccionado dependerá de una variedad de factores, tales como, por ejemplo, la propiedad o propiedades deseadas para las que se selecciona el enlazador (véase, por ejemplo, Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)).
[0194] Los enlazadores adecuados pueden ser no proteicos, tales como, por ejemplo, enlazadores químicos (véase, por ejemplo, Dosio F et al., Toxins 3: 848-83 (2011); Feld J et al., Oncotarget 4: 397-412 (2013)). Se pueden usar varios enlazadores no proteináceos conocidos en la técnica para enlazar restos que se dirigen a células a los componentes de polipéptido de células T CD8+ hiperinmunizadas y/o células B/CD4+ desinmunizadas, tales como enlazadores habitualmente usados para conjugar polipéptidos derivados de inmunoglobulina con polipéptidos heterólogos. Por ejemplo, las regiones polipeptídicas se pueden unir usando las cadenas laterales funcionales de sus restos de aminoácidos y restos de carbohidrato tales como, por ejemplo, un grupo carboxi, amina, sulfhidrilo, ácido carboxílico, carbonilo, hidroxilo y/o anillo cíclico. Por ejemplo, se pueden usar enlaces disulfuro y enlaces tioéter para unir dos o más polipéptidos (véase, por ejemplo, Fitzgerald D et al., Bioconjugate Chem 1: 264 - 8 (1990); Pasqualucci L et al., Haematologica 80: 546-56 (1995)). Además, los residuos de aminoácidos no naturales se pueden utilizar con otras cadenas laterales funcionales, como los grupos cetona (véase, por ejemplo, Sun S et al., Chembiochem 18 de julio (2014); Tian F et al., Proc Natl Acad Sci USA 111 : 1766-71 (2014)). Los ejemplos de enlazadores químicos no proteináceos incluyen, entre otros, N-succinimidil (4-yodoacetil) -aminobenzoato, S-(N-succinimidil) tioacetato (SATA), N-succinimidil-oxicarbonil-cu-metil-a- (2 -piridilditio) tolueno (SMPT), N-succinimidil 4- (2-piridilditio) -pentanoato (SPP), succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexano carboxilato (SMCC o MCC), sulfosuccinimidil (4-yodoacetil) -aminobenzoato -succinimidil-oxicarbonil-a- (2-piridilditio) tolueno, sulfosuccinimidil-6- (a-metil-a- (piridilditiol) -toluamido) hexanoato, 8618 - 23 (1996); Doronina S et al., Nat Biotechnol 21: 778-84 (2003); Feld J et al., Oncotarget 4: 397-412 (2013)).
[0195] Los conectores adecuados, si proteínico o no proteínico, puede incluir, por ejemplo, proteasa, redox ambiental potencial sensible, pH escindible sensible sensible, ácido, fotoescindible, y/o calor enlazadores sensibles (véase, por ejemplo Dosio F et al., Toxinas 3: 848-83 (2011); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013); Feld J et al., Oncotarget 4: 397-412 (2013)).
[0196] Pueden elegirse enlazadores proteináceos para su incorporación en moléculas de dirección de células de fusión recombinantes de la presente invención. Para las proteínas de la presente invención dirigidas a células de fusión recombinantes, los enlazadores comprenden típicamente de 2 a 50 residuos de aminoácidos, preferiblemente de 5 a 30 residuos de aminoácidos (Argos P, J Mol Biol 211: 943-58 (1990); Williamson M, Biochem J 297: 240-60 (1994); George R, Heringa J, Protein Eng 15: 871-9 (2002); Kreitman R, Aa PS J 8: E532-51 (2006)). habitualmente, los enlazadores proteináceos comprenden una mayoría de residuos de aminoácidos con residuos polares, no cargados y/o cargados, como, por ejemplo, treonina, prolina, glutamina, glicina y alanina (véase, por ejemplo, Huston J et al. Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988); Pastan I et al., Annu Rev Med 58: 221-37 (2007); Li J et al., Cell Immunol 118: 85-99 (1989); Cumber A et al. Bioconj Chem 3: 397 - 401 (1992); Friedman P et al., Cancer Res 53: 334-9 (1993) ; Whitlow M et al., Protein Engineering 6: 989 - 95 (1993); Siegall C et al., J Immunol 152: 2377 - 84 (1994) ; Newton et al. Biochemistry 35: 545 - 53 (1996);
Ladurner et al. J Mol Biol 273: 330 -7 (1997); Kreitman R et al., Leuk Lymphoma 52: 82-6 (2011); US 4.894.443). Los ejemplos no limitantes de enlazadores proteináceos incluyen alanina-serina-glicina-glicina-prolina-glutamato (ASGGPE (SEQ ID NO: 114)), valina-metionina (VM), alanina-metionina (AM), AM (G 2 a 4). S) x AM donde G es glicina, S es serina yx es un número entero de 1 a 10 (SEQ ID NO: 115).
[0197] Los enlazadores proteináceos pueden seleccionarse basándose en las propiedades deseadas. Los enlazadores proteináceos pueden ser elegidos por el experto en la materia teniendo en cuenta características específicas, tales como optimizar uno o más del plegamiento, estabilidad, expresión, solubilidad, propiedades farmacocinéticas, propiedades farmacodinámicas y/o la actividad de los dominios fusionados de la molécula de fusión en el contexto de una construcción de fusión en comparación con la actividad del mismo dominio por sí mismo. Por ejemplo, los enlazadores proteináceos pueden seleccionarse basándose en la flexibilidad, rigidez y/o escisión (véase, por ejemplo, Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)). El trabajador capacitado puede utilizar bases de datos y herramientas de software de diseño de enlazadores al elegir enlazadores. Se pueden elegir ciertos enlazadores para optimizar la expresión (véase, por ejemplo, Turner D et al., J Immunol Methods 205: 43-54 (1997)). Se pueden elegir ciertos enlazadores para promover interacciones intermoleculares entre polipéptidos o proteínas idénticos para formar homomultímeros o diferentes polipéptidos o proteínas para formar heteromultímeros. Por ejemplo, se pueden seleccionar enlazadores proteináceos que permitan interacciones no covalentes deseadas entre los componentes polipeptídicos de las proteínas de la presente invención que se dirigen a las células, tales como, por ejemplo, interacciones relacionadas con los dímeros de formación y otros multímeros de orden superior (véase, por ejemplo, el documento US 4.946.778).
[0198] Los enlazadores proteicos flexibles son a menudo mayor que 12 residuos de aminoácidos de largo y rico en residuos, no polar de aminoácidos pequeños, residuos de aminoácidos polares, y/o residuos de aminoácidos hidrófilos, tales como, por ejemplo, glycines, serinas, y treoninas (véase, por ejemplo, Bird R et al., Science 242: 423-6 (1988); Friedman P et al., Cancer Res 53: 334-9 (1993); Siegall C et al., J Immunol 152: 2377-84 (1994)). Pueden elegirse enlazadores proteicos flexibles para aumentar la separación espacial entre componentes y/o para permitir interacciones intramoleculares entre componentes. Por ejemplo, el experto en la materia conoce varios enlazadores "GS" y se componen de múltiples glicinas y/o una o más serinas, a veces en unidades repetidas, tales como, por ejemplo, (GxS)n (SEQ ID NO: 116 ), (Sx G) n (SEQ ID NO: 117), (GGGGS) n (SEQ ID NO: 118) y (G) n (SEQ ID NO: 119). en el que x es de 1 a 6 yn es de 1 a 30 (véase, por ejemplo, WO 96/06641). Ejemplos no limitantes de enlazadores proteicos flexibles incluyen GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO: 120), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO: 121), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO: 122), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 123), EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO: 124), SRSSG (SEQ ID NO: 125) y SGSSC (SEQ ID NO: 126).
[0199] Los enlazadores proteicos rígidos son a menudo estructuras rígidas alfa-helicoidales y rica en residuos de prolina y/o uno o más prolinas colocados estratégicamente (ver Chen X et al, Adv Drug Deliv Rev. 65: 1357-1369 (2013)). Pueden elegirse enlazadores rígidos para evitar interacciones intramoleculares entre componentes enlazados.
[0200] Se pueden elegir enlazadores adecuados para permitir la separación in vivo de componentes, como, por ejemplo, debido a la escisión y/o inestabilidad específica del entorno (ver Dosio F et al., Toxins 3: 848-83 (2011); Chen X et al. al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357 - 69 (2013)). Los enlazadores proteináceos escindibles in vivo son capaces de desvincularse mediante procesamiento proteolítico y/o entornos reductores a menudo en un sitio específico dentro de un organismo o dentro de un cierto tipo de célula (véase, por ejemplo, Doronina S et al., Bioconjug Chem 17: 144­ 24 (2006) ; Erickson H et al., Cancer Res 66: 4426-33 (2006)). Los enlazadores proteicos escindibles in vivo a menudo comprenden motivos sensibles a proteasas y/o enlaces disulfuro formados por uno o más pares de cisteína (véase, por ejemplo, Pietersz G et al., Cancer Res 48: 4469-76 (1998); The J et al., J Immunol Methods 110: 101-9 (1998); ver Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)). Los enlazadores proteináceos escindibles in vivo pueden diseñarse para que sean sensibles a las proteasas que existen solo en determinadas ubicaciones de un organismo, compartimentos dentro de una célula y/o se vuelven activos solo en determinadas condiciones fisiológicas o patológicas (tales como, por ejemplo, proteasas con niveles anormalmente altos niveles, proteasas sobreexpresadas en ciertos sitios de enfermedad y proteasas expresadas específicamente por un microorganismo patógeno). Por ejemplo, existen enlazadores proteicos conocidos en la técnica que son escindidos por proteasas presentes solo intracelularmente, proteasas presentes solo dentro de tipos celulares específicos y proteasas presentes solo en condiciones patológicas como cáncer o inflamación, tales como, por ejemplo, motivo RxxR y AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM ( SEQ ID NO: 127).
[0201] En determinadas realizaciones de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, un enlazador puede ser utilizado que comprende uno o más de la proteasa sitios sensibles a proporcionar para la escisión por una proteasa presente dentro de una célula diana. En determinadas realizaciones de las moléculas de la presente invención que se dirigen a células, puede usarse un enlazador que no se pueda escindir para reducir la toxicidad no deseada después de la administración a un organismo vertebrado.
[0202] Los conectores adecuados pueden incluir, por ejemplo, sensible a la proteasa redox, ambiental potencial sensible, pH escindible sensible, ácido, fotoescindible, y/o calor enlazadores sensibles, si proteínico o no proteínico (ver Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)).
[0203] enlazadores escindibles adecuados pueden incluir enlazadores que comprenden grupos escindibles que son conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, Zarling D et al, J Immunol 124:. 913-20 (1980); Jung S, Moroi M, Biochem Biophys Acta 761: 152 - 62 (1983); Bouizar Z et al., Eur J Biochem 155: 141 - 7 (1986); Park L et al., J Biol Chem 261: 205-10 (1986); Browning J, Ribolini A, J Immunol 143: 1859 - 67 (1989); Joshi S, Burrows R, J Biol Chem 265: 14518-25 (1990)).
[0204] Los enlazadores adecuados pueden incluir enlazadores sensibles al pH. Por ejemplo, se pueden elegir ciertos enlazadores adecuados por su inestabilidad en entornos de pH más bajo para proporcionar disociación dentro de un compartimento subcelular de una célula diana. Por ejemplo, los enlazadores que comprenden uno o más grupos tritilo, grupos tritilo derivatizados, grupos bismaleimideotoxipropano, grupos dihidrazida del ácido adípico y/o grupos transferrina lábiles al ácido, pueden proporcionar la liberación de componentes de las moléculas de la presente invención dirigidas a células, por ejemplo, un componente polipeptídico, en entornos con intervalos de pH específicos (véase, por ejemplo, Welhoner H et al., J Biol chem 266: 4309-14 (1991); Fattom A et al., Infect Immun 60: 584-9 (1992)). Se pueden elegir ciertos enlazadores que se escinden en rangos de pH correspondientes a las diferencias fisiológicas de pH entre tejidos, tales como, por ejemplo,
[0205] Los enlazadores fotoescindibles son enlazadores que se escinden tras la exposición a radiación electromagnética de ciertos rangos de longitud de onda, tales como luz en el rango visible (véase, por ejemplo, Goldmacher V et al., Bioconj Chem 3: 104-7 (1992)). Pueden usarse enlazadores fotoescindibles para liberar un componente de una molécula de la presente invención dirigida a células, por ejemplo, un componente polipeptídico, tras la exposición a la luz de determinadas longitudes de onda. Los ejemplos no limitantes de enlazadores fotoescindibles incluyen un grupo nitrobencilo como grupo protector fotoescindible para cisteína, reticulantes de cloruro de nitrobenciloxicarbonilo, copolímero de hidroxipropilmetacrilamida, copolímero de glicina, copolímero de fluoresceína y copolímero de metilrodamina, Pept Symp Symp, Proc. 16th, Brunfeldt K, ed., 105-110 (1981); Senter et al., Photochem Photobiol 42: 231-7 (1985); Yen et al., Makromol Chem 190: 6982 (1989); Goldmacher V et al., Bioconj Chem 3: 104 - 7 (1992)). Los enlazadores fotoescindibles pueden tener usos particulares para enlazar componentes para formar moléculas de la presente invención dirigidas a células diseñadas para tratar enfermedades, trastornos y afecciones que pueden exponerse a la luz utilizando fibra óptica.
[0206] En determinadas realizaciones de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, una región de unión dirige a una célula está unido a un polipéptido de-inmunizado usando cualquier número de medios conocidos para el experto, incluyendo tanto enlaces covalentes y no covalentes (Ver por ejemplo, Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013); Behrens C, Liu B, MAbs 6: 46-53 (2014).
[0207] En determinadas realizaciones de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, la molécula comprende una región de unión que es un scFv con un conector que conecta una variable de cadena pesada (V h ) de dominio y una variable de cadena ligera (V l ) dominio . Existen numerosos enlazadores conocidos en la técnica adecuados para este propósito, tales como, por ejemplo, el de 15 residuos (Gly4Ser) 3péptido (SEQ ID NO: 128). Los enlazadores scFv adecuados que se pueden utilizar para formar estructuras multivalentes no covalentes incluyen GGS, GGGS (SEQ ID NO: 129), GGGGS (SEQ ID NO: 130), GGGGSGGG (SEQ ID NO: 131), GGSGGGG (SEQ ID NO: 132), GSTSGGGSGGGSGGGGSS (SEQ ID NO: 133) y GSTSGSGKPGSSEGSTKG (SEQ ID NO: 134) (Plückthun A, Pack P, Immunotechnology 3: 83-105 (1997); Atwell J et al., Protein Eng 12: 597- 604 (1999); Wu A et al., Protein Eng 14: 1025-33 (2001); Yazaki P et al., J Immunol Methods 253: 195-208 (2001); Carmichael J et al., J Mol Biol 326 : 341-51 (2003); Arndt M et al., FEBS Lett 578: 257-61 (2004); Bie C et al., World J Hepatol 2: 185-91 (2010)).
[0208] Los procedimientos adecuados para la vinculación de los componentes de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención pueden ser mediante cualquier procedimiento actualmente conocido en la técnica para llevar a cabo tales, siempre que la fijación no impide sustancialmente la capacidad de unión de la de célula el resto de direccionamiento, la internalización celular del componente polipeptídico desinmunizado y/o, cuando sea apropiado, la función o funciones efectoras de toxina deseadas medidas mediante un ensayo apropiado, incluidos los ensayos descritos en el presente documento.
[0209] Para los propósitos de las moléculas de direccionamiento celular de la presente invención, el orden u orientación específicos no se fija para la región de unión al direccionamiento celular y la región polipeptídica desinmunizada en relación entre sí o con la molécula de direccionamiento celular completa (ver p. Ej. Figura 1). Los componentes de los polipéptidos y las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención pueden disponerse en cualquier orden siempre que no se eliminen las actividades deseadas del resto de reconocimiento celular y el polipéptido desinmunizado. En determinadas realizaciones de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, el resto de reconocimiento celular, el polipéptido desinmunizado y/o el motivo de señal de retención/recuperación del retículo endoplásmico pueden unirse directamente entre sí y/o unirse adecuadamente entre sí. a través de una o más secuencias de polipéptidos intervinientes,
IV. Ejemplos de variaciones estructurales específicas de epítopos de células T que suministran polipéptidos hiperinmunizados de células T CD8+ y proteínas de fusión dirigidas a células que comprenden los mismos
[0210] Se puede crear un polipéptido hiperinmunizado de células T con la capacidad de administrar un epítopo de células T para la presentación de MHC de clase I por una célula diana, en principio, añadiendo un epítopo de células T a cualquier polipéptido efector de liberación de proteasoma. Se puede crear una subvariante desinmunizada de células B/células T CD4+ del polipéptido hiperinmunizado de células T de la presente divulgación reemplazando uno o más residuos de aminoácidos en cualquier célula B y/o células T CD4+. región del epítopo celular dentro de un proteasoma que libera polipéptido efector con un epítopo de células T heterólogo superpuesto. En principio, se puede crear una molécula de reconocimiento celular con la capacidad de administrar un epítopo de células T CD8+ para la presentación de MHC de clase I por una célula diana, by linking any CD8+ T-cell hyper-immunized and/or B-cell/CD4+ T-cell de-immunised polypeptide of the invention to a cell-targeting moiety as long as the resulting molecule has a cellular internalization capability provided by at least the polypeptide of the invention, the cell-targeting moiety, or the structural combination of them together.
[0211] Puede crearse un polipéptido hiperinmunizado de células T CD8+ con la capacidad de administrar un epítopo de células T CD8+ para la presentación de MHC de clase I por una célula diana usando un polipéptido efector de liberación de proteasoma derivado de toxina. De manera similar, se puede crear un polipéptido desinmunizado de la presente invención reemplazando uno o más residuos de aminoácidos en cualquier región del epítopo de células B en un polipéptido efector que libera proteasoma derivado de toxina con un epítopo de células T CD8+ heterólogo superpuesto.
[0212] Ciertos polipéptidos de células T hiperinmunizados y de células B/CD4+ desinmunizados de células T de la presente divulgación comprenden una rotura de al menos una región del epítopo de células B putativa mediante la adición de un epítopo de células T heterólogo con el fin de reducir el potencial antigénico y/o inmunogénico de los polipéptidos después de la administración a un mamífero. Los términos "alterado" o "alteración" o "alteración" como se usan en este documento con respecto a una región de epítopo de células B se refieren a la eliminación de al menos un aminoácido en una región de epítopo de células B, inversión de dos o más aminoácidos donde al menos uno de los aminoácidos invertidos está en una región de epítopo de célula B, inserción de al menos un aminoácido en una región de epítopo de célula B, o mutación de al menos un aminoácido en una región de epítopo de célula B. Una alteración de la región del epítopo de células B por mutación incluye sustituciones de aminoácidos con aminoácidos no estándar y/o aminoácidos no naturales. El número de residuos de aminoácidos en la región afectada por la alteración es preferiblemente dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más y así sucesivamente hasta 8, 9, 10, 11, 12 o más residuos de aminoácidos.
[0213] Determinadas regiones de epítopos de células B y las interrupciones se indican en el presente documento por referencia a específica posiciones de aminoácidos de la toxina Shiga nativa A subunidades o una toxina de la difteria prototípica A Subunidad proporciona en el listado de secuencias, tomando nota de que la toxina de origen natural A subunidades pueden comprender precursor formas que contienen secuencias señal de aproximadamente 22 aminoácidos en sus terminales amino que se eliminan para producir subunidades de toxina A maduras y son reconocibles por el experto en la materia.
[0214] Ciertos polipéptidos de células T hiperinmunizados y células B/CD4+ desinmunizados de células T de la presente divulgación comprenden una ruptura de al menos una región del epítopo de células T CD4+ putativo mediante la adición de un epítopo de células T heterólogo en orden para reducir el potencial antigénico y/o inmunogénico de células T CD4+ de los polipéptidos después de la administración a un mamífero. Los términos "alterado" o "alteración" o "alteración" como se usan en este documento con respecto a una región del epítopo de células T CD4+ se refieren a la eliminación de al menos un aminoácido en una región del epítopo de células T CD4+, inversión de dos o más aminoácidos en los que al menos uno de los aminoácidos invertidos está en un epítopo de células T CD4+, inserción de al menos un aminoácido en una región del epítopo de células T CD4+ o mutación de al menos un aminoácido en una célula T CD4+ región del epítopo. Una alteración de la región del epítopo de células T CD4+ por mutación incluye sustituciones de aminoácidos con aminoácidos no estándar y/o aminoácidos no naturales. El número de residuos de aminoácidos en la región afectada por la ruptura es preferiblemente dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más y así sucesivamente hasta 8, 9, 10, 11, 12 o más residuos de aminoácidos.
[0215] regiones de epítopo Certain CD4+ de células T y trastornos se indican en el presente documento por referencia a específica posiciones de aminoácidos de la toxina Shiga nativa A subunidades o una toxina de la difteria prototípica A Subunidad proporciona en el listado de secuencias, tomando nota de que la toxina de origen natural A subunidades pueden comprender formas precursoras que contienen secuencias señal de aproximadamente 22 aminoácidos en sus terminales amino que se eliminan para producir subunidades de toxina A maduras y son reconocibles por el experto en la materia.
1. Derivado de la toxina Shiga, presentación del epítopo de células T CD8+ y polipéptidos desinmunizados de células B/células T CD4+
[0216] El Shiga familia de toxinas de toxinas proteicas se compone de varias toxinas de origen natural que son estructuralmente y funcionalmente relacionados, por ejemplo, toxina Shiga, toxina similar a Shiga 1, y similar a Shiga toxina 2 (Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105 - 16 (2010)). Los miembros de la familia de toxinas Shiga comparten la misma estructura general y mecanismo de acción (Engedal, N et al., Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)). Por ejemplo, Stx, SLT-1 y SLT-2 muestran una actividad enzimática indistinguible en sistemas libres de células (Head S et al., J Biol Chem 266: 3617-21 (1991); Tesh V et al., Infect Immun 61: 3392 -402 (1993); Brigotti M et al., Toxicon 35: 1431-1437 (1997)).
[0217] La familia de toxinas Shiga comprende la verdadera toxina Shiga (Stx) aislada de S. dysenteriae serotipo 1, variantes de toxina 1 similar a Shiga (SLT1 o Stx1 o SLT-1 o Slt-I) aisladas de serotipos de E. coli enterohemorrágica y Shiga- como variantes de la toxina 2 (SLT2 o Stx2 o SLT-2) aisladas de serotipos de E. coli enterohemorrágica. SLT1 se diferencia en un solo residuo de Stx, y ambos se han denominado verocitotoxinas o verotoxinas (VT) (O'Brien, Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)). Aunque las variantes de SLT1 y SLT2 son solo un 53-60% similares entre sí a nivel de secuencia de aminoácidos, comparten mecanismos de actividad enzimática y citotoxicidad comunes a los miembros de la familia de toxinas Shiga (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105- 16 (2010)). Se han descrito más de 39 toxinas Shiga diferentes, como los subtipos definidos Stxla, Stxlc, Stx1d y Stx2a-g (Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)). Los miembros de la familia de la toxina Shiga no están naturalmente restringidos a ninguna especie bacteriana porque los genes que codifican la toxina Shiga pueden diseminarse entre especies bacterianas a través de la transferencia horizontal de genes (Strauch E et al., Infect Immun 69: 7588-95 (2001); Zhaxybayeva O , Doolittle W, Curr Biol 21: R242-6 (2011)). Como ejemplo de transferencia entre especies, se descubrió una toxina Shiga en una cepa de A. haemolyticus aislada de un paciente (Grotiuz G et al., J Clin Microbiol 44: 3838-41 (2006)). Una vez que un polinucleótido que codifica la toxina Shiga ingresa a una nueva subespecie o especie, the Shiga toxin amino acid sequence is presumed to be capable of developing slight sequence variations due to genetic drift and/or selective pressure while still maintaining a mechanism of cytotoxicity common to members of the Shiga toxin family (see Scheutz, J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)).
[0218] Para los propósitos de la presente invención, la frase "toxina Shiga región efectora" se refiere a una región polipeptídica derivada de una toxina Shiga una subunidad de un miembro de la familia de toxinas Shiga que es capaz de exhibir al menos una función de la toxina Shiga. Las funciones de la toxina Shiga incluyen, por ejemplo, la entrada celular, la deformación de la membrana lipídica, la dirección del enrutamiento subcelular, la inactivación catalítica de los ribosomas, la realización de citotoxicidad y la realización de efectos citostáticos.
[0219] Para los fines de la presente invención, una función efectora de la toxina Shiga es una actividad biológica conferida por una región polipeptídica derivada de una subunidad A de la toxina Shiga. Los ejemplos no limitantes de funciones efectoras de la toxina Shiga incluyen internalización celular, enrutamiento subcelular, actividad catalítica y citotoxicidad. Los ejemplos no limitantes de actividades catalíticas de la toxina Shiga incluyen inactivación de ribosomas, inhibición de la síntesis de proteínas, actividad N-glicosidasa, actividad polinucleótido: adenosina glicosidasa, actividad ARNasa y actividad ADNasa. Los RIP pueden depurinar ácidos nucleicos, polinucleósidos, polinucleótidos, rRNA, ssDNA, dsDNA, mRNA (y polyA) y ácidos nucleicos virales (Barbieri L et al., Biochem J 286: 1­ 4 (1992); Barbieri L et al., Nature 372: 624 (1994); Ling J et al., FEBS Lett 345: 143-6 (1994); Barbieri L et al., Biochem J 319: 507-13 (1996); Roncuzzi L, Gasperi-Campani A, FEBS Lett 392: 16-20 (1996); Stirpe F et al., FEBS Lett 382: 309-12 (1996); Barbieri L et al., Nucleic Acids Res 25: 518 - 22 (1997); Wang P, Tumer N, Nucleic Acids Res 27: 1900 - 5 (1999); Barbieri L et al., Biochim Biophys Acta 1480: 258-66 (2000); Barbieri L et al., J Biochem 128: 883 - 9 (2000); Bagga S et al., J Biol Chem 278: 4813-20 (2003); Picard D et al., J Biol Chem 280: 20069 - 75 (2005)). Algunos RIP muestran actividad antiviral y actividad superóxido dismutasa (Erice A et al., Antimicrob Agents Chemother 37: 835-8 (1993); Au T et al., FEBS Lett 471: 169-72 (2000); Parikh B, Tumer N, Mini Rev Med Chem 4: 523-43 (2004); Sharma N et al., Plant Physiol 134: 171-81 (2004)). Se han observado actividades catalíticas de la toxina Shiga tanto in vitro como in vivo. Los ensayos de actividad efectora de la toxina Shiga pueden medir varias actividades, tales como, por ejemplo, actividad inhibidora de la síntesis de proteínas, actividad de depurinación, inhibición del crecimiento celular, citotoxicidad, actividad de relajación de ADN superenrollado y/o actividad de nucleasa.
[0220] Como se usa en el presente documento, la retención de la función de la toxina Shiga efector se refiere a un nivel de actividad funcional de la toxina Shiga, como se mide por un ensayo cuantitativo apropiado con reproducibilidad comparable a un control polipéptido efector toxina Shiga de tipo salvaje. Para la inhibición de ribosomas, Shiga toxina función efectora está exhibiendo una C I50 de 10000 pM o menos. Para la citotoxicidad en un ensayo de destrucción de células diana positiva, la función efectora de la toxina Shiga exhibe un CD 50 de 1000 nM o menos, dependiendo del tipo de célula y su expresión de la biomolécula diana extracelular apropiada.
[0221] Como se usa en el presente documento, la retención de la función de la toxina Shiga efector "significativa" se refiere a un nivel de actividad funcional de la toxina Shiga, como se mide por un ensayo cuantitativo apropiado con reproducibilidad comparable a un control polipéptido efector toxina Shiga de tipo salvaje. Para la inhibición in vitro ribosoma, importante función de la toxina Shiga efector está exhibiendo una CI 50 de 300 pM o menos dependiendo de la fuente de los ribosomas (por ejemplo, bacterias, arqueas, o eucariota (algas, hongos, plantas o animales)). Esta es una inhibición significativamente mayor en comparación con el IC 50aproximado.de 100.000 pM para el doble mutante SLT-1A 1-251 catalíticamente inactivo (Y77S, E167D). Para la citotoxicidad en un ensayo de destrucción de células diana positiva en cultivo celular de laboratorio, la función efectora significativa de la toxina Shiga exhibe un CD 50 de 100, 50 o 30 nM o menos, dependiendo de la línea celular y su expresión de la biomolécula diana extracelular apropiada. Esto es significativamente mayor citotoxicidad para la línea celular diana apropiada en comparación con el componente SLT-1A solo, sin una región de unión dirige a una célula, que tiene un CD 50 de 100-10.000 nM, dependiendo de la línea celular.
[0222] Para algunas muestras, los valores exactos, ya sea para IC 50 o CD 50 podría ser imposible de obtener debido a la incapacidad para recoger los puntos de datos requeridos para una curva de ajuste preciso. Los valores inexactos de IC 50 y/o CD 50 no deben considerarse al determinar la actividad significativa de la función efectora de la toxina Shiga. Los datos insuficientes para ajustar con precisión una curva como se describe en el análisis de los datos de los ensayos de función efectora de la toxina Shiga de ejemplo, tales como, por ejemplo, los ensayos descritos en los Ejemplos, no deben considerarse representativos de la función efectora de la toxina Shiga real. Por ejemplo, teóricamente ni un IC 50 ni un CD 50 puede determinarse si no se produce una inhibición de ribosoma superior al 50% o muerte celular, respectivamente, en una serie de concentraciones para una muestra determinada.
[0223] La incapacidad para detectar actividad en la función efectora de la toxina Shiga puede deberse a una expresión inadecuada, plegamiento de polipéptidos y/o estabilidad de polipéptidos en lugar de una falta de entrada celular, enriam iento subcelular y/o actividad enzimática. Los ensayos para las funciones efectoras de la toxina Shiga pueden no requerir mucho polipéptido de la presente invención para medir cantidades significativas de actividad de la función efectora de la toxina Shiga. En la medida en que se determine empíricamente una causa subyacente de una función efectora baja o nula para relacionarse con la expresión o estabilidad de la proteína, un experto en la técnica puede compensar dichos factores utilizando la química de las proteínas y las técnicas de ingeniería molecular conocidas en la técnica, de manera que se pueda restaurar y medir una actividad efectora funcional de la toxina Shiga. Como ejemplos, la expresión inadecuada basada en células puede compensarse utilizando diferentes secuencias de control de la expresión; El plegamiento y/o la estabilidad inadecuados del polipéptido pueden beneficiarse de la estabilización de secuencias terminales o mutaciones compensatorias en regiones no efectoras que estabilizan la estructura tridimensional de la proteína, etc. Los polipéptidos efectores de toxina Shiga inmunizados y/o células B/CD4+ desinmunizados de células T pueden analizarse para cualquier nivel de esas funciones efectoras de la toxina Shiga, tales como un ser dentro de 1000 veces o 100 veces o menos de la actividad de un polipéptido efector de la toxina Shiga de tipo salvaje o que exhibe una actividad de 3 a 30 veces o más en comparación con un polipéptido efector de la toxina Shiga de desactivación funcional.
[0224] suficiente enrutamiento subcelular puede ser simplemente deducir mediante la observación de citotoxicidad en los ensayos de citotoxicidad, tal como, por ejemplo, ensayos de citotoxicidad basado en la presentación de epítopos de células T o sobre la base de una función de toxina efector que implica un citosólica y/o sustrato diana ER.
[0225] Cabe señalar que incluso si la citotoxicidad de un polipéptido efector de la toxina Shiga se reduce en relación con el tipo salvaje, en la práctica, las aplicaciones que usan células T CD8+ atenuadas hiperinmunizadas y/o células B/células T CD4+ desinmunizadas Los polipéptidos efectores de la toxina Shiga pueden ser igual o más efectivos que los que usan polipéptidos efectores de la toxina Shiga de tipo salvaje porque la antigenicidad y/o inmunogenicidad reducidas podrían compensar la citotoxicidad reducida, como, por ejemplo, permitiendo dosis más altas, administraciones más repetidas o administración crónicas. Los polipéptidos efectores de la toxina Shiga de tipo salvaje son muy potentes, pudiendo matar con una sola molécula que alcanza el citosol o quizás 40 moléculas que se internalizan. CD8+ T-cell hyper-immunized and/or B-cell/CD4+ T-cell de-immunised Shiga toxin effector polypeptides with even considerably reduced Shiga toxin effector functions, such as, e.g., subcellular routing or cytotoxicity, as compared to wild-type Shiga toxin effector polypeptides may still be potent enough for applications based on targeted cell killing and/or specific cell detection.
[0226] Determinadas realizaciones de la presente invención proporcionan un polipéptido desinmunizado que se deriva de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental, como se define en las reivindicaciones, y comprende un epítopo de células T CD8+ integrado, heterólogo que altera al menos un B endógeno. -región del epítopo celular del polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental, como se define en las reivindicaciones (véanse, por ejemplo, las Tablas 2, 3 y 4). En determinadas realizaciones, un polipéptido desinmunizado de la presente invención puede comprender o consistir esencialmente en la subunidad A de toxina Shiga de longitud completa (por ejemplo, SLT-1A (SEQ ID NO: 1), StxA (SEQ ID NO: 2) o SLT- 2A (SEQ ID NO: 3)) que comprende al menos una alteración de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consiste en: las regiones de epítopo de células B 1-15 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO : 2; 3-14 de SEQ ID NO: 3; 26-37 de SEQ ID NO: 3; 27-37 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 39-48 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 42-48 de SEQ ID NO: 3; 53-66 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; 94-115 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; 141-153 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 140-156 de SEQ ID NO: 3; 179-190 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 179-191 de SEQ ID NO: 3; 204 de SEQ ID NO: 3; 205 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y 210-218 de SEQ ID NO: 3; 240-260 de SEQ ID NO: 3; 243-257 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y 254-268 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y las regiones 4-33 del epítopo de células T CD4+ de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 34-78 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 77-103 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 128-168 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, 160-183 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y 236-258 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
[0227] Determinadas realizaciones de la presente invención proporcionan polipéptidos derivados de un parental una subunidad de un miembro de la Shiga toxina de la familia, tal como se define en las reivindicaciones, y que comprende una, epítopo embebido heterólogo, de células T CD8+ que alteran al menos una forma nativa colocada en la región del epítopo de células T CD4+ de la subunidad A de la toxina Shiga parental, como se define en la reivindicación (véanse, por ejemplo, las Tablas 2, 3 y 4). En determinadas realizaciones, un polipéptido desinmunizado de la presente invención puede comprender o consistir esencialmente en la subunidad A de toxina Shiga de longitud completa (por ejemplo, SLT-1A (SEQ ID NO: 1), StxA (SEQ ID NO: 2) o SLT- 2A (SEQ ID NO: 3)) que comprende al menos una alteración de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consta de: 4-33, 34-78, 77-103, 128-168, 160-183 y 236-258.
[0228] En determinadas realizaciones, un polipéptido de la presente invención puede comprender o consistir en una subunidad A de toxina Shiga truncada, como se define en las reivindicaciones. Los truncamientos de las subunidades de la toxina A de Shiga pueden dar como resultado la eliminación de regiones del epítopo de células B completas sin afectar la actividad catalítica y la citotoxicidad del efector de la toxina. El fragmento más pequeño de la subunidad A de la toxina Shiga que exhibe una actividad enzimática significativa es un polipéptido compuesto por los residuos 75­ 247 de StxA (Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60 (1994)). Truncar el término carboxi de SLT-1A, StxA o SLT-2A a los aminoácidos 1-251 elimina dos regiones del epítopo de células B predichas, dos epítopos de células T CD4 positivas (CD4+) predichas y una célula B discontinua predicha epítopo. Truncar el término amino de SLT-1A, StxA, o SLT-2A a 75-293 elimina al menos tres regiones de epítopo de células B predichas y tres epítopos de células T CD4+ predichas. Truncar ambos terminales amino y carboxi de SLT-1A, StxA o SLT-2A a 75-251 elimina al menos cinco regiones de epítopo de células B predichas, cuatro epítopos de células T CD4+ putativos y un epítopo de células B discontinuo predicho.
[0229] En determinadas realizaciones, un polipéptido efector de la toxina Shiga de la presente invención puede comprender o consistir esencialmente en una Subunidad A de la toxina Shiga de longitud completa o truncada con al menos una mutación, por ejemplo, deleción, inserción, inversión o sustitución, en un B- región del epítopo de células T CD4+ y/o células. En determinadas realizaciones adicionales, los polipéptidos comprenden una alteración que comprende una deleción de al menos un aminoácido dentro de la región del epítopo de células B y/o células T CD4+. En determinadas realizaciones adicionales, los polipéptidos comprenden una ruptura que comprende una inserción de al menos un aminoácido dentro de la región del epítopo de células B y/o células T CD4+. En determinadas realizaciones adicionales, los polipéptidos comprenden una ruptura que comprende una inversión de aminoácidos, en el que al menos un aminoácido invertido está dentro de la región del epítopo de células B y/o células T CD4+. En determinadas realizaciones adicionales, los polipéptidos comprenden una alteración que comprende una mutación, tal como una sustitución de aminoácidos por un aminoácido no estándar o un aminoácido con una cadena lateral modificada químicamente. En los Ejemplos se proporcionan numerosos ejemplos de sustituciones de aminoácidos.
[0230] En otras realizaciones, el polipéptido desinmunizado de la presente invención comprende o consiste esencialmente en una subunidad A de toxina de Shiga truncada que es más corta que una subunidad A de toxina A de Shiga de longitud completa en la que al menos un aminoácido se altera en una región del epítopo de células B y/o células T CD4+ posicionadas proporcionada en los Ejemplos (véanse las Tablas 2, 3 y/o 4).
[0231] Los polipéptidos efectores de toxina Shiga hiperinmunizados de células T CD8+ y/o células B/células T CD4+ desinmunizados de la divulgación pueden ser más pequeños que la subunidad A de longitud completa, tal como, por ejemplo, que consiste en la región polipeptídica de posición de aminoácidos 77 a 239 (SLT-1A (SEQ ID NO: 1) o StxA (SEQ ID NO: 2)) o el equivalente en otras subunidades A de miembros de la familia de toxinas Shiga (por ejemplo, 77 a 238 de (SEQ ID NUMERO 3)). Por ejemplo, en determinadas realizaciones de la presente invención, el polipéptido desinmunizado se deriva de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental que comprende o consiste en: (i) los aminoácidos 75 a 251 de la SEQ ID NO: 1, (ii) ) aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, (iii) aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, o (iv) aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1 en la que al menos un aminoácido se altera en una región del epítopo de célula B y/o célula T CD4+ endógena proporcionada en los Ejemplos (Tablas 2, 3 y/o 4), como se define en las reivindicaciones. De manera similar, el polipéptido desinmunizado de la presente invención puede derivarse de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental que comprende o consiste en los aminoácidos 75 a 251 de la SEQ ID NO: 2, 1 a 241 de la SEQ ID NO: 2, 1 a 251 de SEQ ID NO: 2, o los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 2 en los que al menos un aminoácido se altera en al menos una región de epítopo de células B endógenas y/o células T CD4+ proporcionada en los Ejemplos ( Tablas 2, 3 y/o 4), como se define en las reivindicaciones. Además, el polipéptido desinmunizado de la presente invención puede derivarse de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga que comprende o consiste en los aminoácidos 75 a 251 de la SEQ ID NO: 3,
[0232] Determinadas realizaciones de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención comprenden cada una un polipéptido efector de toxina Shiga desinmunizado que retiene una función efectora de toxina Shiga pero que pueden modificarse por ingeniería genética de una molécula parental citotóxico a un polipéptido con citotoxicidad disminuida o anulada para funciones no citotóxicas, por ejemplo, realizar citostasis, suministro de materiales exógenos y/o detección de tipos de células, mediante la mutación de uno o más residuos clave para la actividad enzimática.
[0233] El polipéptido de la presente invención se deriva de un polipéptido efector de la Subunidad A de la toxina Shiga parental, tal como se define en las reivindicaciones. Para determinadas realizaciones, los polipéptidos de la presente divulgación comprenden o consisten esencialmente en uno de los polipéptidos de SEQ ID NO: 11-43.
[0234] Para determinadas realizaciones, las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención son proteínas citotóxicas que comprenden polipéptidos efectores de la toxina Shiga. Para determinadas realizaciones, las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención comprenden o consisten esencialmente en uno de los polipéptidos de SEQ ID NO: 49-54.
2. Polipéptidos hiperinmunizados de células T CD8+ y/o desinmunizados de células B/células T CD4+ derivados de la toxina de la difteria
[0235] Para los propósitos de la presente invención, la frase "región efectora de la toxina de la difteria" se refiere a una región polipeptídica derivada de una toxina de la difteria de un miembro de la familia de toxina de la difteria que es capaz de exhibir al menos una función de la toxina de la difteria. Las funciones de la toxina de la difteria incluyen, por ejemplo, la entrada de células, el escape del endosoma, la dirección del enrutamiento subcelular, la inactivación catalítica de los ribosomas, la realización de citotoxicidad y la realización de efectos citostáticos.
[0236] Para los propósitos de la presente invención, una función efectora de la toxina de la difteria es una actividad biológica conferida por una región polipeptídica derivada de una toxina de la difteria. Los ejemplos no limitantes de funciones efectoras de la toxina de la difteria incluyen internalización celular, enrutamiento subcelular, actividad catalítica y citotoxicidad. Los ejemplos no limitantes de actividades catalíticas de la toxina de la difteria incluyen inactivación de ribosomas, inhibición de la síntesis de proteínas y ribosilación de ADP. Se han observado actividades catalíticas de la toxina de la difteria tanto in vitro como in vivo. Los ensayos para la actividad efectora de la toxina de la difteria pueden medir diversas actividades, tales como, por ejemplo, actividad inhibidora de la síntesis de proteínas, ribosilación de ADP, inhibición del crecimiento celular y/o citotoxicidad. El enrutamiento subcelular suficiente puede deducirse simplemente observando la citotoxicidad en los ensayos de citotoxicidad, tales como, por ejemplo, ensayos de citotoxicidad basados en la presentación de epítopo de células T o basados en la función efectora de la toxina que implica un sustrato diana en el citosol y/o ER.
[0237] Cabe señalar que incluso si una actividad de la toxina efector de un polipéptido de toxina efector difteria se reduce en relación con el de tipo salvaje, en la práctica, las aplicaciones que utilizan atenuada de células T CD8+ hiper-inmunizados y/o de células B/T CD4+ Los polipéptidos efectores de toxina de la difteria desinmunizados en células pueden ser igual o más eficaces que los que utilizan polipéptidos efectores de toxina de la difteria con niveles de actividad de tipo salvaje porque la antigenicidad y/o inmunogenicidad reducidas podrían compensar la citotoxicidad reducida, tal como, por ejemplo, permitiendo dosis más altas, administraciones más repetidas o administración crónica. Los polipéptidos efectores de la toxina de la difteria que exhiben solo la actividad efectora del enrutamiento subcelular son apropiados para su uso en aplicaciones basadas en la administración de epítopos de células T CD8+ de células diana.
[0238] La presente invención proporciona un polipéptido desinmunizado derivado de un polipéptido efector de la toxina de la difteria parental, como se define en las reivindicaciones, y que comprende un epítopo de células T CD8+ integrado y heterólogo que altera al menos una célula B endógena y/o CD4+ T -región del epítopo celular del polipéptido efector de la toxina de la difteria parental, como se define en las reivindicaciones (véase, por ejemplo, la Tabla 5). El polipéptido desinmunizado de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 2-389 de SEQ ID NO: 45. La región del epítopo de células B endógenas del polipéptido efector de la toxina de la difteria parental que puede romperse en el polipéptido de la presente invención se coloca en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consisten en las regiones del epítopo de células B: 3-10 de SEQ ID NO: 44, 15-31 de SEQ ID NO: 44, 32-54 de SEQ ID NO: 44; 33-43 de SEQ ID NO: 44, 71-77 de SEQ ID NO: 44, 93-113 de SEQ ID NO: 44, 125-131 de SEQ ID NO: 44, 138-146 de SEQ ID NO: 44, 141-167 de SEQ ID NO: 44, 165-175 de SEQ ID NO: 44, 182-201 de SEQ ID NO: 45, 185-191 de SEQ ID NO: 44 y 225-238 de SEQ ID NO: 45 .
[0239] Opcionalmente, el polipéptido de la presente invención puede comprender una o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones, deleciones, inserciones o inversiones) en comparación con el de tipo salvaje siempre que al menos un amino ácido se altera en al menos una posicionados de forma nativa B- región del epítopo de células T CD4+ y/o células T proporcionada en los Ejemplos (ver Tabla 5). En determinadas realizaciones de la presente invención, los polipéptidos desinmunizados tienen suficiente identidad de secuencia con una subunidad A de la toxina de la difteria de origen natural para retener la citotoxicidad después de la entrada en una célula, ya sea mediante procedimientos bien conocidos de transformación, transfección, infección o inducción de la célula huésped o por internalización mediada por una región de unión dirigida a células unida con el polipéptido efector de la toxina de la difteria.
[0240] Los residuos más críticos para la actividad enzimática y/o citotoxicidad en las subunidades A de la toxina de la difteria se han mapeado en las siguientes posiciones de residuos: histidina-21, tirosina-27, glicina-52, triptófano-50, tirosina-54, tirosina-65 , glutamato-148 y triptófano-153 (Tweten R et al., J Biol Chem 260: 10392-4 (1985); Wilson B et al., J Biol Chem 269: 23296-301 (1994); Bell C, Eisenberg D, Biochemistry 36: 481-8 (1997); Cummings M et al., Proteins 31: 282-98 (1998); Keyvani K et al., Life Sci 64: 1719-24 (1999); Dolan K et al. , Biochemistry 39: 8266-75 (2000); Zdanovskaia M et al., Res Micrbiol 151: 557-62 (2000); Kahn K, Bruice T, JAm Chem Soc 123: 11960-9 (2001); Malito E et al. ., Proc Natl Acad Sci USA 109: 5229 - 34 (2012)). La capacidad de una molécula citotóxica dirigida a células de la presente invención para causar muerte celular, por ejemplo, su citotoxicidad, se puede medir utilizando cualquiera o más de un conjunto de ensayos conocidos en la técnica.
[0241] Entre determinadas realizaciones de la presente invención, los polipéptidos comprenden la CD8+ de células T hiperinmunizados y de células B/células T CD4+ de-inmunizado efector toxina de la difteria que comprende o que consiste esencialmente en los aminoácidos 2-389 de SEQ ID NO: 45 en el que al menos un aminoácido se altera en las regiones del epítopo de células B y/o del epítopo de células T CD4+ situadas de forma nativa proporcionadas en los Ejemplos (Tabla 5), como se define en las reivindicaciones.
[0242] El polipéptido de la presente invención se deriva de un polipéptido efector toxina de la difteria parental, como se define en las almejas. Para determinadas realizaciones, los polipéptidos de la presente invención comprenden o consisten esencialmente en uno de los polipéptidos de SEQ ID NO: 46-48.
[0243] Para determinadas realizaciones, las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención son proteínas citotóxicas que comprenden polipéptidos efectoras toxina de la difteria. Para determinadas realizaciones, las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención comprenden o consisten esencialmente en uno de los polipéptidos de SEQ ID NO: 55-60.
[0244] Para determinadas realizaciones, el polipéptido de la presente divulgación comprende o consiste esencialmente en uno cualquiera de los polipéptidos de las SEQ ID NOs: 11-43 o 46-48.
[0245] Las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención comprenden cada uno al menos un de­ inmunizado polipéptido unido a un resto dirigido a las células que pueden unirse específicamente a al menos una biomolécula diana extracelular en asociación física con una célula, tal como una biomolécula diana expresado en la superficie de una celda. Esta estructura general es modular en el sentido de que cualquier número de restos que se dirigen a las células puede unirse a los polipéptidos desinmunizados de la presente invención.
[0246] Está dentro del alcance de la presente invención, como se define en las reivindicaciones, para utilizar fragmentos, variantes, y/o derivados de los polipéptidos y moléculas de reconocimiento celular de la presente invención que contienen un sitio de unión funcional a cualquier parte extracelular de una biomolécula diana, e incluso más preferiblemente capaz de unirse a una biomolécula diana con alta afinidad (por ejemplo, como se muestra por K d ). Cualquier resto que se dirija a las células que se una a una parte extracelular de una biomolécula diana con una constante de disociación (K d ) de 10'5 a 10'12 moles/litro, preferiblemente menos de 200 nM, puede sustituirse para su uso en la fabricación de diana celular. moléculas de la presente invención y procedimientos de la presente invención.
VI. Variaciones en la secuencia de polipéptidos de los polipéptidos hiperinmunizados de células T y/o desinmunizados de células B/células T CD4+ de la presente invención y moléculas de reconocimiento celular que comprenden las mismas
[0247] El experto en la materia reconocerá que se pueden realizar variaciones en polipéptidos desinmunizados y moléculas de direccionamiento celular de la presente invención dentro del alcance de las reivindicaciones, y polinucleótidos de la divulgación que codifican cualquiera de los primeros, sin disminuir sus actividades biológicas, por ejemplo, manteniendo la estructura y función generales de la región efectora de la toxina junto con una o más alteraciones de epítopos que reducen el potencial antigénico y/o inmunogénico. Por ejemplo, algunas modificaciones pueden facilitar la expresión, purificación y/o propiedades farmacocinéticas y/o inmunogenicidad. Tales modificaciones son bien conocidas por el experto en la materia e incluyen, por ejemplo, una metionina añadida en el extremo amino para proporcionar un sitio de iniciación, aminoácidos adicionales colocados en cualquier extremo para crear sitios de restricción situados convenientemente o codones de terminación, y etiquetas de afinidad bioquímica fusionadas a cualquier extremo para proporcionar una detección y/o purificación convenientes.
[0248] También se contempla en el presente documento la inclusión de residuos de aminoácidos adicionales en los extremos amino y/o carboxi, tales como secuencias para etiquetas de epítopo u otros restos. Los residuos de aminoácidos adicionales se pueden usar para diversos fines que incluyen, por ejemplo, facilitar la clonación, facilitar la expresión, la modificación postraduccional, facilitar la síntesis, la purificación, facilitar la detección y la administración. Ejemplos no limitantes de etiquetas y restos de epítopos son dominios de proteínas de unión a quitina, sitios de escisión de enteropeptidasa, sitios de escisión de factor Xa, etiquetas FIAsH, etiquetas FLAG, proteínas fluorescentes verdes (GFP), partes de glutatión-S-transferasa, etiquetas HA, proteína de unión a maltosa dominios, etiquetas myc, etiquetas de polihistidina, etiquetas ReAsH, etiquetas de estreptococos, etiquetas de estreptococos II, sitios de proteasa TEV, dominios de tiorredoxina, sitio de escisión de trombina y etiquetas de epítopo V5.
[0249] En algunas de las realizaciones anteriores, la secuencia polipeptídica de los polipéptidos desinmunizados y/o proteínas de reconocimiento celular de la presente invención se varía mediante una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos introducidas en la región o regiones polipeptídicas, como se define en las reivindicaciones. , siempre que al menos un aminoácido se interrumpa en al menos una región del epítopo de células B posicionada de forma nativa proporcionada en el presente documento. Como se usa en este documento, el término "sustitución conservadora" indica que uno o más aminoácidos se reemplazan por otro residuo de aminoácido biológicamente similar. Los ejemplos incluyen la sustitución de residuos de aminoácidos con características similares, por ejemplo, aminoácidos pequeños, aminoácidos ácidos, aminoácidos polares, aminoácidos básicos, aminoácidos hidrófobos y aminoácidos aromáticos (véase, por ejemplo, la Tabla C, infra). Un ejemplo de una sustitución conservadora con un residuo que normalmente no se encuentra en péptidos y proteínas endógenos de mamíferos es la sustitución conservadora de un residuo de arginina o lisina con, por ejemplo, ornitina, canavanina, aminoetilcisteína u otro aminoácido básico. Para más información sobre sustituciones fenotípicamente silenciosas en péptidos y proteínas, véase, por ejemplo, Bowie J et al., Science 247: 1306-10 (1990).
TABLA C. Ejemplos de sustituciones conservativas de aminoácidos
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[0250] En el esquema de sustitución conservadora en la Tabla C, las sustituciones conservativas de ejemplo de aminoácidos se agrupan por propiedades fisicoquímicas - I: neutral, hidrófilo; II: ácidos y amidas; III: básico; IV: hidrofóbico; V: aminoácidos aromáticos voluminosos, VI hidrófilos sin carga, VII alifáticos sin carga, VIII no polares sin carga, IX asociados con cicloalquenilo, X hidrófobos, XI polares, XII pequeños, XIII que permiten el giro y XIV flexibles. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen las siguientes: 1) S puede sustituirse por C; 2) M o L pueden sustituirse por F; 3) Y puede sustituirse por M; 4) Q o E pueden sustituirse por K; 5) N o Q pueden sustituirse por H; y 6) H puede sustituirse por N.
[0251] Las sustituciones conservativas de aminoácidos adicionales incluyen lo siguiente: 1) S puede ser sustituido por C; 2) M o L pueden sustituirse por F; 3) Y puede sustituirse por M; 4) Q o E pueden sustituirse por K; 5) N o Q pueden sustituirse por H; y 6) H puede sustituirse por N.
[0252] En determinadas realizaciones, tal como se define en las reivindicaciones, los polipéptidos y/o moléculas de reconocimiento celular (por ejemplo, proteínas dirigida por células) de la presente invención de-inmunizaron puede comprender fragmentos funcionales o variantes de una región de polipéptido de la presente invención que tener, como máximo, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoácidos.
[0253] Las variantes de los polipéptidos desinmunizados y/o proteínas dirigidas a células de la presente invención están dentro del alcance de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones como resultado de cambiar un polipéptido de la proteína diana celular de la presente invención alterando una o más aminoácidos o eliminar o insertar uno o más aminoácidos, como dentro de la región de unión o la región polipeptídica desinmunizada, para lograr las propiedades deseadas, como citotoxicidad modificada, efectos citostáticos modificados, inmunogenicidad modificada y/o suero modificado media vida. Un polipéptido desinmunizado y/o una proteína dirigida a células de la presente invención pueden estar además con o sin una secuencia señal. tal como dentro de la región de unión o la región polipeptídica desinmunizada, con el fin de lograr las propiedades deseadas, tales como citotoxicidad modificada, efectos citostáticos modificados, inmunogenicidad modificada y/o semivida sérica modificada. Un polipéptido desinmunizado y/o una proteína dirigida a células de la presente invención pueden estar además con o sin una secuencia señal. tal como dentro de la región de unión o la región polipeptídica desinmunizada, con el fin de lograr las propiedades deseadas, tales como citotoxicidad modificada, efectos citostáticos modificados, inmunogenicidad modificada y/o semivida sérica modificada. Un polipéptido desinmunizado y/o una proteína dirigida a células de la presente invención pueden estar además con o sin una secuencia señal.
[0254] En consecuencia, en determinadas realizaciones, los polipéptidos de la presente invención comprenden o consisten esencialmente en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o 99,7% de identidad de secuencia global con una toxina natural, como, por ejemplo, la subunidad A de la toxina Shiga, como SLT-1A (SEQ ID NO: 1), StxA (SEQ ID NO: 2) y/o SLT -2A (SEQ ID NO: 3), o un dominio catalítico de toxina de la difteria (SEQ ID NO: 44), como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones, los polipéptidos desinmunizados de la presente invención comprenden o consisten esencialmente en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%. , 99,5% o 99,7% de identidad de secuencia global con una toxina natural, como se define en las reivindicaciones,
[0255] En determinadas realizaciones de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, uno o más residuos de aminoácidos pueden mutarse, insertarse o suprimirse con el fin de aumentar la actividad enzimática de la región de polipéptido desinmunizado. Por ejemplo, la mutación de la posición del residuo alanina-231 en StxlA a glutamato aumentó su actividad enzimática in vitro (Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)).
[0256] En determinadas realizaciones de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, uno o más residuos de aminoácidos pueden mutarse o suprimirse con el fin de reducir o eliminar la actividad catalítica y/o citotóxica de la región de polipéptido desinmunizado. Por ejemplo, la actividad catalítica y/o citotóxica de las subunidades A de los miembros de la familia de la toxina Shiga o la familia de la toxina de la difteria puede disminuirse o eliminarse mediante mutación o truncamiento.
[0257] En determinadas realizaciones de la presente divulgación, la región efectora de ribotoxina se ha alterado de modo que ya no soporta la desactivación catalítica de un ribosoma in vitro. Sin embargo, también se prevén dentro del alcance de la presente divulgación otros medios para modificar una región efectora ribotóxica para reducir o eliminar la ribotoxicidad. Por ejemplo, determinadas mutaciones pueden hacer que una región efectora ribotóxica no pueda unirse a su sustrato de ribosoma a pesar de mantener la capacidad catalítica observable mediante un ensayo in vitro, mientras que otras mutaciones pueden hacer que una región ribotóxica no pueda reconocer una secuencia de ácido ribonucleico específica dentro del ribosoma a pesar de mantener la capacidad catalítica hacia los ácidos nucleicos desnudos in vitro (véase, por ejemplo, Alford S et al., BMC Biochem 10: 9 (2009); Alvarez-García E et al., Biochim Biophys Act 1814: 1377-82 (2011); Wong Y et al., PLoS One 7: e49608 (2012)).
[0258] En DT, hay varios residuos de aminoácidos que se sabe que son importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, histidina-21, tirosina-27, glicina-52, triptófano-50, tirosina-54, tirosina-65, glutamato-148, y triptófano-153 (Tweten R et al., J Biol Chem 260: 10392-4 (1985); Wilson B et al., J Biol Chem 269: 23296-301 (1994); Bell C, Eisenberg D, Biochemistry 36: 481-8 (1997); Cummings M et al., Proteins 31: 282-98 (1998); Keyvani K et al., Life Sci 64: 1719-24 (1999); Dolan K et al., Biochemistry 39: 8266 -75 (2000); Zdanovskaia M et al., Res Micrbiol 151: 557-62 (2000); Kahn K, Bruice T, J Am Chem Soc 123: 11960-9 (2001); Malito E et al., Proc Natl Acad Sci USA 109: 5229 - 34 (2012)). El glutamato-581 en la toxina cholix se conserva con el glutamato-148 en DT (J0rgensen R et al., EMBO Rep 9: 802-9 (2008)), y por lo tanto, se predice que las mutaciones de glutamato-581 en la toxina de cholix reducen la actividad enzimática de la toxina cholix.
[0259] En PE, hay varios residuos de aminoácidos que se sabe que son importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, triptófano-417, histidina-426, histidina-440, glicina-441, arginina-485, triptófano-458, triptófano-466, tirosina-470, tirosina-481, glutamato-546, arginina-551, glutamato-553 y triptófano-558 (Douglas C, Collier R, J Bacteriol 169: 4967-71 (1987); Wilson B, Colliver R, Curr Top Microbiol Immunol 175: 27-41 (1992)); Beattie B et al., Biochemistry 35: 15134-42 (1996); Roberts T, Merrill A, Biochem J 367: 601 - 8 (2002); Yates S et al., Biochem J 385: 667 - 75 (2005); J0rgensen R et al., EMBO Rep 9: 802-9 (2008)). El glutamato-574 y el glutamato-581 en la toxina cholix se conservan con glutamato-546 y glutamato-553 en PE, respectivamente, (J0rgensen R et al., EMBO Rep 9: 802-9 (2008)), y por lo tanto, se predice que las mutaciones de glutamato-574 y glutamato-581 en toxina cholix reducen la actividad enzimática de la toxina cholix.
[0260] Debido a que los dominios catalíticos de toxina cholix, DT, PE, y otras enzimas relacionadas son superponibles (J0rgensen R, et al, J Biol Chem 283: 10671-8 (2008)), los residuos de aminoácidos necesarios para la actividad catalítica pueden predecirse en secuencias polipeptídicas relacionadas mediante procedimientos de alineación de secuencias conocidos por el experto en la materia.
[0261] Varios miembros de la familia RIP han sido bien estudiados con respecto a los residuos catalíticos. Por ejemplo, la mayoría de los miembros de la familia RIP comparten cinco residuos de aminoácidos clave para la catálisis, como por ejemplo, dos tirosinas cerca del término amino del dominio catalítico, un glutamato y arginina cerca del centro del dominio catalítico y un triptófano cerca del término carboxi del dominio catalítico (Lebeda F, Olson M, Int J Biol Macromol 24: 19-26 (1999); Mlsna D et al., Protein Sci 2: 429-35 (1993); de Virgilio M et al., Toxins 2 : 2699-737 (2011); Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013))). Debido a que los dominios catalíticos de los miembros de la familia RIP son superponibles, los residuos de aminoácidos requeridos para la actividad catalítica pueden predecirse en miembros nuevos y/o no estudiados de la familia RIP mediante procedimientos de alineación de secuencias conocidos por el experto (ver p. Ej. Husain J et al., FEBS Lett 342: 154 - 8 (1994); Ren J et al., Estructura 2: 7 - 16 (1994); Lebeda F, Olson M, Int J Biol Macromol 24: 19 - 26 (1999); Ma Q et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56: 185 - 6 (2000) ; Savino C et al., FEBS Lett 470: 239 - 43 (2000); Robertus J, Monzingo A, Mini Rev Med Chem 4: 477 - 86 (2004) ; Mishra V et al., J Biol Chem 280: 20712-21 (2005); Zhou C et al., Bioinformatics 21: 3089-96 (2005); Lubelli C et al., Anal Biochem 355: 102 - 9 (2006); Touloupakis E et al., FEBS J 273: 2684-92 (2006); Hou X et al., BMC Struct Biol 7:29 (2007); Meyer A et al., Biochem Biophys Res Commun 364: 195-200 (2007); Ruggiero A et al., Protein Pept Lett 14: 97-100 (2007); Wang T et al., Amino Acids 34: 239-43 (2008)). Ma Q et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56: 185 - 6 (2000); Savino C et al., FEBS Lett 470: 239 - 43 (2000); Robertus J, Monzingo A, Mini Rev Med Chem 4: 477 - 86 (2004); Mishra V et al., J Biol Chem 280: 20712-21 (2005); Zhou C et al., Bioinformatics 21: 3089-96 (2005) ; Lubelli C et al., Anal Biochem 355: 102 - 9 (2006); Touloupakis E et al., FEBS J 273: 2684-92 (2006); Hou X et al., b Mc Struct Biol 7:29 (2007); Meyer A et al., Biochem Biophys Res Commun 364: 195-200 (2007); Ruggiero A et al., Protein Pept Lett 14: 97-100 (2007); Wang T et al., Amino Acids 34: 239-43 (2008)).
[0262] En la subunidad A de la abrina, hay varios residuos de aminoácidos importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, tirosina-74, tirosina-113, glutamato 164, arginina-167 y triptófano-198 (Hung C et al., Eur J Biochem 219: 83-7 (1994); Chen J et al., Protein Eng 10: 827-33 (1997); Xie L et al., Eur J Biochem 268: 5723-33 (2001) ).
[0263] En charibdina, hay varios residuos de aminoácidos importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, valina-79, tirosina-117, glutamato-167 y la arginina-170 (Touloupakis E et al, FEBS J. 273: 2684 -92 (2006)).
[0264] En la subunidad A de cinnamomina, hay varios residuos de aminoácidos importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, tirosina-75, tirosina-115, glutamato 167, arginina-170, y triptófano-201 (Hung C et al., Eur J Biochem 219: 83-7 (1994); Chen J et al., Protein Eng 10: 827 - 33 (1997)).
[0265] En la luffaculina, hay varios residuos de aminoácidos importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, tirosina-70, glutamato-85, tirosina-110, glutamato-159, y la arginina-162 (Hou X et al., BMC Struct Biol 7:29 (2007)).
[0266] En luffinas, hay varios residuos de aminoácidos importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, tirosina-71, glutamato-86, tirosina-111, glutamato-160, y la arginina-163 (Ma Q et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56: 185-6 (2000)).
[0267] En RIP de maíz, hay varios residuos de aminoácidos importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, tirosina-79, tirosina-115, glutamato 167, arginina-170, y triptófano-201 (Robertus J, Monzingo A, Mini Rev Med Chem 4: 477-86 (2004); Yang Y et al., J Mol Biol 395: 897-907 (2009)).
[0268] En PD-Ls, hay varios residuos de aminoácidos importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, tirosina-72, tirosina-122, glutamato-175, arginina-178 y triptófano-207 en PDL-1 (Ruggiero A et al., Biopolymers 91: 1135-42 (2009)).
[0269] En la subunidad A de la RIP de muérdago, hay varios residuos de aminoácidos importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, tirosina-66, fenilalanina-75, tirosina-110, glutamato 159, arginina-162, glutamato 166, arginina-169 y triptófano-193 (Langer M et al., Biochem Biophys Res Commun 264: 944-8 (1999); Mishra V et al., Act Crystallogr D Biol Crystallogr 60: 2295-2304 (2004); Mishra V et al., J Biol Chem 280: 20712-21 (2005); Wacker R et al., J Pept Sci 11: 289-302 (2005)).
[0270] En la proteína antiviral de phytolacca americana (PAP), hay varios residuos de aminoácidos importantes para la actividad catalítica, talescomo, por ejemplo, lisina-48, tirosina-49, arginina-67, arginina-68, asparagina-69, asparagina-70. , tirosina-72, fenilalanina-90, asparagina-91, aspartato-92, arginina-122, tirosina-123, glutamato-176, arginina-179, triptófano-208 y lisina-210 (Rajamohan F et al., J Biol Chem 275: 3382-90 (2000); Rajamohan F et al., Biochemistry 40: 9104-14 (2001)).
[0271] En la cadena A de ricina, hay varios residuos de aminoácidos que se sabe que son importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, arginina-48, tirosina-80, asparagina-122, tirosina-123, glutamato-177, arginina-180, serina-203, asparagina-209, triptófano-211, glicina-212, arginina-213, serina-215 e isoleucina-252 (Frankel A et al., Mol Cell Biol 9: 415-20 (1989); Schlossman D et al. al., Mol Cell Biol 9: 5012-21 (1989); Gould J et al., Mol Gen Genet 230: 91-90 (1991); Ready M et al., Proteins 10: 270-8 (1991); Rutenber E et al., Proteins 10: 240-50 (1991); Monzingo A, Robertus, J, J Mol Biol 227: 1136-45 (1992); Day P et al., Biochemistry 35: 11098-103 (1996); Marsden C et al., Eur J Biochem 27: 153-62 (2004); Pang Y et al., PLoS One 6: e17883 (2011)). En ricina, existen varios residuos de aminoácidos que cuando se eliminan se sabe que afectan a la actividad catalítica de ricina, tales como, por ejemplo, N24, F25, A28, V29, Y81, V82, V83, G84, E146, E147, A148, I149, S168, F169, 1170, 1171, C172, I173, Q174, M175, I176, S177, E178, A179, A180, R181, F182, Q183, Y184, D202, P203, 1206, T207, N210, S211, W212, y G213 (Munishkin A, Wool I, J Biol Chem 270: 30581-7 (1995); Berrondo M, Gray J, Proteins 79: 2844-60 (2011)).
[0272] En las saporinas, hay varios residuos de aminoácidos que se sabe que son importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, tirosina-16, tirosina-72, tirosina-120, glutamato 176, arginina-179, y triptófano-208 ( Bagga S et al., J Biol Chem 278: 4813-20 (2003); Zarovni N et al., Canc Gene Ther 14: 165-73 (2007); Lombardi A et al., FASEB J 24: 253-65 ( 2010)). Además, se puede incluir un péptido señal para reducir la actividad catalítica (Marshall R et al., Plant J 65: 218-29 (2011)).
[0273] En las tricosantinas, hay varios residuos de aminoácidos que se sabe que son importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, tirosina-70, tirosina-111, glutamato 160, arginina-163, lisina-173, arginina-174, lisina -177 y triptófano-192 (Wong etal., Eur J Biochem 221: 787-91 (1994); Li et al., Protein Eng 12: 999-1004 (1999); Yan et al., Toxicon 37: 961 -72 (1999); Ding et al., Protein Eng 16: 351-6 (2003); Guo Q et al., Protein Eng 16: 391-6 (2003); Chan D et al., Nucleic Acid Res 35: 1660-72 (2007)).
[0274] Las ribotoxinas fúngicas se dirigen enzimáticamente a la misma estructura ribosómica SRL universalmente conservada que los miembros de la familia RIP y la mayoría de las ribotoxinas fúngicas comparten una secuencia de dominio catalítico de tipo ARNasa T1 y una estructura secundaria (Lacadena J et al., FEMS Microbiol Rev 31: 212-37 (2007) ). La mayoría de las ribotoxinas fúngicas y las enzimas relacionadas comparten tres residuos de aminoácidos altamente conservados para catálisis, dos residuos de histidina y un residuo de glutamato (por ejemplo, histidina-40, glutamato-58 e histidina-92 en ARNasa T1). Un motivo DSKKP (SEQ ID NO: 135) está presente a menudo en ribotoxinas fúngicas para unirse específicamente a SRL (Kao R, Davies J, J Biol Chem 274: 12576-82 (1999)). Debido a que los dominios catalíticos de ribotoxina fúngica son superponibles, se puedne predecir los residuos de aminoácidos requeridos para la actividad catalítica en ribotoxinas fúngicas no estudiadas y/o nuevas usando uno o más métodos de alineación de secuencias conocidos por el experto.
[0275] Para Aspf1, una deleción interna de 16 residuos de aminoácidos (posiciones 7-22) alteró severamente su actividad ribonucleolítica y la citotoxicidad (Garcia-Ortega L et al, FEBS J. 272: 2536-44 (2005)).
[0276] En mitogilina, hay varios residuos de aminoácidos que se sabe que son importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, asparagina-7, histidina-49, glutamato 95, lisina-111, arginina-120 e histidina-136 (Kao R et al., Mol Microbiol 29: 1019 - 27 (1998); Kao R, Davies J, FEBS Lett 466: 87 - 90 (2000)).
[0277] En la restrictocina, hay varios residuos de aminoácidos que se sabe que son importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, tirosina-47, histidina-49, glutamato 95, lisina-110, lisina-111, lisina-113, arginina -120 e histidina-136 (Nayak S, Batra J, Biochemistry 36: 13693-9 (1997); Nayak S et al., Biochemistry 40: 9115-24 (2001); Plantinga M et al., Biochemistry 50: 3004 -13 (2011)).
[0278] En a-sarcina, hay varios residuos de aminoácidos que se sabe que son importantes para la actividad catalítica, tales como, por ejemplo, triptófano-48, histidina-49, histidina-50, triptófano-51, asparagina-54, isoleucina-69 , glutamato-95, glutamato-96, lisina-11, lisina-112, lisina-114, arginina-121, histidina-136, histidina-137, lisina-145 (Lacadena J et al., Biochem J 309: 581-6 (1995); Lacadena J et al., Proteins 37: 474-84 (1999); Martinez-Ruiz A et al., Toxicon 37: 1549-63 (1999); de Antonio C et al., Proteins 41: 350- 61 (2000); Masip M et al., Eur J Biochem 268: 6190­ 6 (2001)).
[0279] La citotoxicidad de las subunidades A de los miembros de la familia de la toxina Shiga puede alterarse, reducirse o eliminarse por mutación o truncamiento. Se ha demostrado que las posiciones marcadas como tirosina-77, glutamato-167, arginina-170, tirosina-114 y triptófano-203 son importantes para la actividad catalítica de Stx, Stx1 y Stx2 (Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al., Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993); Ohmura M et al. , Microb Pathog 15: 169-76 (1993); Cao C et al., Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994); Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)). La mutación tanto del glutamato-167 como de la arginina-170 eliminó la actividad enzimática de Slt-I A1 en un ensayo de inactivación de ribosomas sin células (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). En otro enfoque que utiliza la expresión de novo de Slt-I A1 en el retículo endoplásmico, la mutación de glutamato-167 y arginina-170 eliminó la citotoxicidad del fragmento de Slt-I A1 en ese nivel de expresión (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Un análisis de truncamiento demostró que un fragmento de StxA de los residuos 75 a 268 aún conserva una actividad enzimática significativa in vitro (Haddad, J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)). Un fragmento truncado de Slt-I A1 que contiene los residuos 1-239 mostró una actividad enzimática significativa in vitro y citotoxicidad por expresión de novo en el citosol (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). La expresión de un fragmento de Slt-I A1 truncado en los residuos 1-239 en el retículo endoplásmico no fue citotóxica porque no pudo retrotranslocarse al citosol (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).
[0280] Los residuos más críticos para la actividad enzimática y/o citotoxicidad en las subunidades A de la toxina de Shiga se asignaron a las siguientes posiciones de residuos: aspargina-75, tirosina-77, tirosina-114, glutamato-167, arginina-170, arginina-176 y triptófano-203 entre otros (Di, Toxicon 57: 535-39 (2011)). En particular, una construcción doble mutante de Stx2A que contenía mutaciones de glutamato-E167-a-lisina y arginina-176-a-lisina se inactivó completamente; mientras que muchas mutaciones únicas en Stx1 y Stx2 mostraron una reducción de 10 veces en la citotoxicidad. Además, el truncamiento de StxlA a 1-239 o 1-240 redujo su citotoxicidad y, de manera similar, el truncamiento de Stx2A a un residuo hidrófobo conservado redujo su citotoxicidad. Los residuos más críticos para la unión a ribosomas eucariotas y/o la inhibición de ribosomas eucariotas en la subunidad A de toxina Shiga se han mapeado en las siguientes posiciones de residuos arginina-172, arginina-176, arginina-179, arginina-188, tirosina-189, valina-191, y leucina-233, entre otros (McCluskey A et al., PLoS One 7: e31191 (2012).
[0281] Los truncamientos de la subunidad A de la toxina 1 similar a Shiga son catalíticamente activos, capaces de inactivar enzimáticamente los ribosomas in vitro y citotóxicos cuando se expresan dentro de una célula (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). El fragmento más pequeño de la subunidad A de la toxina Shiga que exhibe una actividad enzimática completa es un polipéptido compuesto por los residuos 1-239 de SltIA (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Aunque el fragmento más pequeño de la subunidad A de la toxina Shiga que se informó que retiene una actividad catalítica sustancial fueron los residuos 75-247 de StxA (A1-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60 (1994)), un truncamiento de StxA expresado de novo dentro de una célula eucariota requiere solo hasta el residuo 240 para alcanzar el citosol y ejercer la inactivación catalítica de los ribosomas (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).
[0282] En determinadas realizaciones de los polipéptidos desinmunizados y/o moléculas de reconocimiento celular de la presente invención derivados de SLT-1A (SEQ ID NO: 1) o StxA (SEQ ID NO: 2), estos cambios incluyen la sustitución de la asparagina en la posición 75, tirosina en la posición 77, tirosina en la posición 114, glutamato en la posición 167, arginina en la posición 170, arginina en la posición 176 y/o sustitución del triptófano en la posición 203. Los expertos conocerán ejemplos de tales sustituciones basadas en la técnica anterior, tales como asparagina en la posición 75 por alanina, tirosina en la posición 77 por serina, sustitución de la tirosina en la posición 114 por serina, sustitución del glutamato en la posición 167 por glutamato, sustitución de la arginina en la posición 170 por alanina, sustitución de la arginina en la posición 176 por lisina y / o sustitución del triptófano en la posición 203 por alanina. Otras mutaciones que mejoran o reducen la actividad enzimática y/o la citotoxicidad de la toxina Shiga están dentro del alcance de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, y pueden determinarse usando técnicas y ensayos bien conocidos descritos en este documento.
[0283] Los polipéptidos desinmunizados y/o moléculas de reconocimiento celular de la presente invención opcionalmente se pueden conjugar a uno o más agentes adicionales, que pueden incluir agentes terapéuticos y/o de diagnóstico conocidos en la técnica, incluyendo agentes, tales como los descritos en el presente documento.
V. Funciones generales de los polipéptidos desinmunizados de la presente invención y moléculas de reconocimiento celular que comprenden los mismos
[0284] La presente invención proporciona diversos polipéptidos desinmunizados que pueden ser utilizados como componentes de varias composiciones de la materia, tales como moléculas de reconocimiento celular y composiciones de diagnóstico, tal como se define en las reivindicaciones. En particular, los polipéptidos desinmunizados tienen usos como componentes de diversos agentes terapéuticos de proteínas, tales como, por ejemplo, inmunotoxinas y fusiones ligando-toxina, para la destrucción dirigida de tipos de células específicos para el tratamiento de una variedad de enfermedades, incluidos cánceres, trastornos inmunitarios, e infecciones microbianas.
[0285] Cualquier polipéptido de la divulgación hiperinmunizado de células T CD8+ puede diseñarse en una molécula terapéutica dirigida a células potencialmente útil con la adición de un resto dirigido a células que se dirige a la internalización celular a un tipo o tipos celulares específicos dentro de un cordado, tal como, por ejemplo, un anfibio, pájaro, pez, mamífero, reptil o tiburón. De manera similar, cualquier polipéptido desinmunizado con epítopo de células B de la presente invención puede diseñarse en una molécula de reconocimiento celular terapéutica potencialmente útil con la adición de un resto de reconocimiento celular que se dirige a la internalización celular a un tipo o tipos celulares específicos. dentro de un cordado. La presente invención proporciona varias moléculas citotóxicas dirigidas a células que comprenden un polipéptido desinmunizado asociado funcionalmente con regiones de unión para efectuar la reconocimiento celular de manera que las moléculas citotóxicas dirigidas a células administran selectivamente epítopos de células T, matan, inhiben el crecimiento de, suministran material exógeno y/o detectar tipos de células específicos. Este sistema es modular, en el sentido de que puede usarse cualquier número de diversas regiones de unión para dirigirse a diversos tipos de células cuando se combinan con el polipéptido desinmunizado de la presente invención.
[0286] La presentación de un péptido epítopo inmunogénico de las células T por el MHC de clase I objetivos complejos de la célula que presenta por matar por citólisis mediada por CTL. Mediante la ingeniería genética de péptidos de m Hc de clase I en proteasomas que liberan componentes de polipéptidos efectores de agentes terapéuticos de internalización de células diana, la entrega dirigida y la presentación de antígenos inmunoestimuladores pueden lograrse aprovechando las vías endógenas de MHC de clase I de las células diana de vertebrados. La presentación por células diana de antígenos no propios inmunoestimuladores, tales como, por ejemplo, epítopos-péptidos virales conocidos con alta inmunogenicidad, puede indicar a otras células inmunes que destruyan las células diana y recluten más células inmunes al sitio de la célula diana dentro un organismo.
[0287] Por tanto, las moléculas ya citotóxicas, tales como, por ejemplo, agentes terapéuticos potenciales que comprenden regiones efectoras de toxinas citotóxicas, pueden modificarse mediante procedimientos de la presente invención en moléculas más citotóxicas y/o para tener un mecanismo de citotoxicidad adicional que opere a través de células T efectoras. Estos múltiples mecanismos citotóxicos pueden complementarse entre sí (por ejemplo, proporcionando tanto la muerte directa de las células diana como la muerte indirecta (mediada por CTL), y se respaldan mutuamente (por ejemplo, proporcionando un mecanismo de muerte celular en ausencia del otro), y/o proteger contra el desarrollo de resistencia terapéutica (limitando la resistencia a la situación menos probable de que la célula maligna o infectada evolucione para bloquear dos mecanismos diferentes de destrucción celular simultáneamente).
[0288] Además, las moléculas citotóxicas parentales que dependen de la toxina y/o regiones enzimáticas para la citotoxicidad pueden diseñarse para que sean citotóxicas solo a través del suministro y presentación citosólica de epítopo de células T insertando un epítopo de células T e inactivando la actividad enzimática de la molécula parental, ya sea con el epítopo de células T integrado o independientemente por otros medios tales como mutación o truncamiento. Este enfoque elimina un mecanismo citotóxico mientras agrega otro y agrega la capacidad de inmunoestimulación al área local. Además, las moléculas citotóxicas parentales que dependen de la toxina y/o regiones enzimáticas para la citotoxicidad pueden diseñarse para que sean citotóxicas solo a través del suministro y presentación citosólica de epítopo de células T insertando un epítopo de células T en el dominio enzimático de la molécula parental de manera que la actividad enzimática se reduce o elimina por los cambios de secuencia que crean el epítopo de células T heterólogo. Esto permite la modificación en un solo paso de moléculas enzimáticamente citotóxicas, que tienen la capacidad de internalizarse en las células y dirigirse al citosol, en moléculas citotóxicas enzimáticamente inactivas que dependen del suministro a proteasoma de epítopo de células T y presentación para la citotoxicidad e inmunoestimulación local.
A. Suministro de epítopos de células T para presentación de MHC de Clase I en una superficie celular
[0289] Una función de ciertos polipéptidos y moléculas de reconocimiento celular de la presente invención es el suministro de uno o más epítopos de células T para la presentación de MHC de clase I por una célula. El suministro de péptidos de epítopo de células T exógenos al sistema de MHC de clase I de una célula diana se puede usar para inducir a la célula diana a presentar el péptido del epítopo de células T en asociación con moléculas de MHC de clase I en la superficie celular, lo que posteriormente conduce a la activación de células T efectoras CD8+ para atacar la célula diana.
[0290] Determinadas realizaciones de los polipéptidos y moléculas de reconocimiento celular de la presente invención son capaces de suministrar uno o más epítopos de células T al proteasoma de una célula diana. A continuación, el epítopo de células T suministrado se procesa proteolíticamente y se presenta mediante la vía del MHC de clase I en la superficie exterior de la célula diana.
[0291] Las aplicaciones de estas funciones que presentan los epítopos de células T de los polipéptidos y moléculas de reconocimiento celular de la presente invención son enormes. Cada célula nucleada en un organismo de mamífero puede ser capaz de presentar en la vía MHC de clase I péptidos de epítopo de células T inmunogénicos en sus superficies externas de células complejadas con moléculas de MHC de clase I. Además, la sensibilidad del reconocimiento del epítopo de células T es tan exquisita que solo se requieren unos pocos complejos de péptidos MHC-I; incluso la presentación de un solo complejo puede ser suficiente para el reconocimiento por parte de una célula T efectora (Sykulev Y et al., Immunity 4: 565 - 71 (1996)).
[0292] Para que un epítopo de células T heterólogo se presente en una superficie de la célula diana, el polipéptido que suministra el epítopo-epítopo de célula T heterólogo debe ser degradado por un proteasoma en la célula diana de tal manera que un fragmento de péptido que comprende el epítopo de la célula T se crea y se transporta al lumen del RE para cargarlo en una molécula del MHC de clase I.
[0293] Además, el polipéptido debe llegar primero al interior de una célula diana y después entrar en contacto con un proteasoma en la célula diana. Para suministrar un polipéptido de la presente invención al interior de una célula diana, las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención deben ser capaces de internalizar en la célula diana. Una vez que el polipéptido de la presente invención se internaliza como un componente de una molécula de reconocimiento celular, el polipéptido residirá típicamente en un compartimento endosómico temprano, tal como, por ejemplo, una vesícula endocitótica. A continuación, el polipéptido tiene que alcanzar el proteasoma de una célula diana con al menos un epítopo de células T heterólogo intacto.
[0294] Estas funciones pueden ser detectados y monitorizados por una variedad de procedimientos estándar conocidos en la técnica para el experto. Por ejemplo, la capacidad de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención para administrar un péptido epítopo de células T e impulsar la presentación del péptido epítopo por el sistema MHC de clase I de células diana puede investigarse usando varios ensayos in vitro e in vivo. incluyendo, por ejemplo, la detección/visualización directa de complejos de péptido/MHC de clase I, la medición de las afinidades de unión del péptido del epítopo de células T heterólogo a las moléculas de MHC de clase I y/o la medición de las consecuencias funcionales del complejo de péptido de epítopo de MHC de clase I presentación en las células diana mediante el seguimiento de las respuestas CTL.
[0295] Ciertos ensayos para controlar esta función de los polipéptidos y moléculas de la presente invención implican la detección directa de un complejo antígeno péptido/MHC de clase I específico in vitro o ex vivo. Los procedimientos habituales para la visualización y cuantificación directa de complejos péptido-MHC de clase I implican varios reactivos de inmunodetección conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, se pueden desarrollar anticuerpos monoclonales específicos para reconocer un complejo de antígeno péptido/MHC/Clase I particular (Porgador A et al, Immunity 6: 715-26 (1997)). De manera similar, los receptores de células T multiméricos solubles, como los reactivos TCR-STAR (Altor, Mirmar, FL, EE. UU.) Se pueden usar para visualizar directamente o cuantificar complejos específicos de MHC I/antígeno (Zhu X et al., J Immunol 176: 3223-32 (2006)). Estos receptores de células T multiméricos, mAbs específicos o solubles, se pueden usar con varios procedimientos de detección, incluyendo, por ejemplo, inmunohistoquímica, citometría de flujo e inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA).
[0296] Un procedimiento alternativo para la identificación directa y cuantificación de complejos MHC I/péptido implica análisis de espectrometría de masas, tales como, por ejemplo, el ensayo de Presentación de Antígenos ProPresent (ProImmune, Inc., Sarasota, FL, US) en el que los complejos de péptido-clase MCH I se extraen de las superficies de las células, a continuación, los péptidos se purifican e identifican mediante secuenciación con espectrometría de masas (Falk K et al., Nature 351: 290-6 (1991)).
[0297] Ciertos ensayos para controlar el suministro de epítopos de células T y la función de presentación del MHC de clase I de los polipéptidos y moléculas de la presente invención implican procedimientos computacionales y/o experimentales para controlar el MHC de clase I y la unión y estabilidad de péptidos. Hay varios programas de software disponibles para que los utilice el trabajador capacitado para predecir las respuestas de unión de los péptidos de epítopo a los alelos del MHC de clase I, como, por ejemplo, The Immune Epitope Database and Analysis Resource (IEDB) Analysis Resource MHC-I binding prediction Consensus tool Kim Y et al., Nucleic Acid Res 40: w 525-30 (2012). Se han aplicado de forma rutinaria varios ensayos experimentales, como, por ejemplo, ensayos de unión a la superficie celular y/o ensayos de resonancia de plasmón superficial para cuantificar y/o comparar la cinética de unión (Miles K et al., Mol Immunol 48: 728-32 (2011)). Además, other MHC-peptide binding assays based on a measure of the ability of a peptide to stabilize the ternary MHC-peptide complex for a given MHC Class I allele, as a comparison to known controls, have been developed (e.g., MHC-peptide binding assay from Prolmmmune, Inc.).
[0298] Alternativamente, las mediciones de la consecuencia de la presentación del complejo antígeno péptido/MHC de clase I en la superficie celular se pueden realizar controlando la respuesta de las células T citotóxicas (CTL) al complejo específico. Estas mediciones incluyen el etiquetado directo de los CTL con reactivos tetrámeros o pentámeros de clase I de MHC. Los tetrameros o pentámeros se unen directamente a los receptores de células T de una especificidad particular, determinada por la combinación de péptidos y alelos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC). Además, la cuantificación de las citocinas liberadas, como el interferón gamma o las interleucinas, mediante ELISA o inmunospot ligado a enzimas (ELIspot) se analiza habitualmente para identificar respuestas CTL específicas. La capacidad citotóxica de CTL se puede medir mediante varios ensayos, incluido el ensayo clásico de liberación de cromo 51 (Cr) o ensayos alternativos de citotoxicidad no radiactiva (p. ej., kits no radiactivos CytoTox96® y kits CellTox ™ CellTiter-GLO® disponibles en Promega Corp., Madison, WI, Ee . UU.), Granzyme B ELISpot , Ensayos de caspasa o ensayos de citometría de flujo de translocación LAMP-1. Para monitorear específicamente la muerte de las células diana, el éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) se puede usar para etiquetar fácil y rápidamente una población celular de interés para la investigación in vitro o in vivo para monitorear la muerte de células diana marcadas con CSFE específicas de epítopo (Durward M et al., J Vis Exp 45 pii 2250 (2010)).
[0299] Las respuestas in vivo a la presentación de MHC de clase I pueden seguirse mediante la administración de un agente promotor de antígeno/MHC de clase I (por ejemplo, un péptido, una proteína o una vacuna de virus inactivado/atenuado) seguido de una estimulación con un agente activo (por ejemplo, un virus) y monitorización de las respuestas a ese agente, típicamente en comparación con los controles no vacunados. Las muestras ex vivo se pueden controlar para determinar la actividad de CTL con procedimientos similares a los descritos anteriormente (por ejemplo, ensayos de citotoxicidad de CTL y cuantificación de la liberación de citocinas).
[0300] Las moléculas de HLA-A, HLA-B y/o HLA-C se aíslan de las células intoxicadas después de la lisis usando afinidad inmune (por ejemplo, una purificación "pulldown" de anticuerpo anti-MHC) y los péptidos asociados (es decir, los péptidos presentados por las moléculas de MHC aisladas) se recuperan de los complejos purificados. Los péptidos recuperados se analizan mediante secuenciación con espectrometría de masas. Los datos de espectrometría de masas se comparan con una biblioteca de base de datos de proteínas que consiste en la secuencia del péptido exógeno (no propio) (epítopo X de células T) y el índice internacional de proteínas para humanos (que representan péptidos "propios" o no inmunogénicos). Los péptidos se clasifican por significancia de acuerdo con una base de datos de probabilidad Se enumeran todas las secuencias de péptidos antigénicos (no propios) detectados. Los datos se verifican mediante la búsqueda en una base de datos de señuelos codificados para reducir los falsos aciertos (véase, por ejemplo, Ma B, Johnson R, Mol Cell Proteomics 11: 0111.014902 (2012)). Los resultados demostrarán que los péptidos del epítopo X de las células T se presentan en complejos MHC en la superficie de las células diana intoxicadas.
[0301] El conjunto de complejos de péptido-antígeno-MHC presentados pueden variar entre las células debido a las moléculas de HLA específicas de antígeno expresadas. Las células T pueden reconocer entonces complejos péptidoantígeno-MHC específicos que se expresan en la superficie de una célula utilizando diferentes moléculas de TCR con diferentes especificidades de antígeno.
[0302] Debido a que múltiples epítopos de células T pueden ser administrados por una molécula de reconocimiento celular de la presente invención, tal como, por ejemplo, integrando dos o más epítopos de células T diferentes en un único polipéptido efector de liberación de proteasoma, una molécula de la La presente invención puede ser eficaz en cordados de la misma especie con diferentes variantes de clase de MHC, tales como, por ejemplo, en seres humanos con diferentes alelos HLA. Esto puede permitir la combinación simultánea de diferentes epítopos de células T con diferente eficacia en diferentes subpoblaciones de sujetos en función de la diversidad y polimorfismos de proteínas del complejo MHC (véase, por ejemplo, Yuhki N et al., J Hered 98: 390-9 (2007)). . Por ejemplo, las proteínas del complejo MHC humano, las proteínas HLA, varían entre los humanos en función de la ascendencia genética, por ejemplo, africana (subsahariana), amerindia, caucásica, mongoloide, de Nueva Guinea y australiana,
[0303] Las características de la activación de respuestas de células T se desean de ciertos anti-cáncer, anti-neoplásico, anti-tumor, y/o fármacos biológicos anti-microbianos para estimular el propio sistema inmune del paciente hacia las células diana. La activación de una respuesta robusta y fuerte de células T también es una característica deseada de muchas vacunas (Aly HA, J Immunol Methods 382: 1-23 (2012)). La presentación de un epítopo de células T por una célula diana dentro de un organismo puede conducir a la activación de respuestas inmunes robustas a una célula diana y/o su localización general dentro de un organismo. Por tanto, la administración dirigida de un epítopo de células T para la presentación puede utilizarse para diseñar la activación de las respuestas de las células T durante un régimen terapéutico.
B. Muerte celular a través de citotoxicidad dirigida y/o reclutamiento de CTL
[0304] Las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención que comprenden polipéptidos desinmunizados de la presente invención pueden proporcionar: 1) suministro de epítopo de células T específico del tipo de células para la presentación de MHC de clase I y 2) potente citotoxicidad. Además, las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención también proporcionan desinmunización, lo que reduce la probabilidad de determinadas respuestas inmunes cuando se administran a un mamífero.
[0305] En determinadas realizaciones de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, al entrar en contacto una célula acoplada físicamente con una biomolécula diana extracelular del grupo de reconocimiento celular (por ejemplo, una región de unión dirigida a células), la molécula de reconocimiento celular de la presente invención es capaz de provocar la muerte de la célula. El mecanismo de muerte celular puede ser directo, por ejemplo, a través de la actividad enzimática de una región efectora de toxina, o indirecto a través de citólisis mediada por CTL, y puede ser en condiciones variadas de células diana, tales como una célula diana manipulada ex vivo, una célula diana cultivada in vitro, una célula diana dentro de una muestra de tejido cultivada in vitro, o una célula diana in vivo.
1. Muerte celular indirecta a través del suministro de epítopos de células T y presentación de MHC de clase I
[0306] Los polipéptidos de la presente invención, con o sin desinmunización del epítopo de células B, pueden usarse como componentes de moléculas de reconocimiento celular para la muerte celular indirecta. Determinadas realizaciones de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención son citotóxicas porque comprenden un polipéptido presentador de epítopo de células T CD8+ de la presente invención que suministra uno o más epítopos de células T a la vía de presentación del MHC de clase I de una célula diana tras la internalización de la diana de la molécula de reconocimiento celular.
[0307] En determinadas realizaciones de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, al entrar en contacto una célula acoplada físicamente con una biomolécula diana extracelular del grupo de reconocimiento celular (por ejemplo, una región de unión dirigida a célula), la molécula de reconocimiento celular de la presente invención es capaz de provocar indirectamente la muerte de la célula, tal como, por ejemplo, mediante la presentación de uno o más epítopos de células T por la célula diana y el posterior reclutamiento de CTL.
2. Muerte celular directa a través de la citotoxicidad de la toxina dirigida a las células
[0308] Los polipéptidos desinmunizados de la presente invención se pueden usar como componentes de moléculas de reconocimiento celular para la muerte celular directa.
[0309] Debido a que muchas toxinas de origen natural están adaptados para destruir las células eucariotas, las proteínas citotóxicas diseñados usando, proteasoma regiones efectoras la entrega de la toxina derivada, puede mostrar actividad de las células-kill potente. En particular, las regiones efectoras que liberan proteasomas también pueden comprender polipéptidos efectores de toxinas ribotóxicas. Sin embargo, se contemplan otras regiones efectoras de toxina para su uso en las moléculas de reconocimiento celular de la divulgación, tales como, por ejemplo, polipéptidos de toxinas que no inactivan catalíticamente los ribosomas sino que son citotóxicos debido a otros mecanismos. Por ejemplo, las toxinas de Cholix, las enterotoxinas termolábiles y las proteínas G heterotriméricas de las toxinas de la tos ferina al atacar la subunidad Gsalpha.
[0310] Las subunidades A de muchos miembros de la superfamilia de toxina ABx comprenden dominios enzimáticos capaces de matar a una célula eucariota, una vez en el citosol de la célula. El reemplazo de un epítopo de células B por un epítopo de células T dentro de múltiples polipéptidos derivados de la toxina ABx que comprenden dominios enzimáticos de la toxina no alteró significativamente su actividad enzimática. Por tanto, los polipéptidos desinmunizados de la presente invención pueden proporcionar potencialmente dos mecanismos de destrucción celular.
[0311] Determinadas realizaciones de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención son citotóxicos debido a que comprenden un polipéptido desinmunizado de la presente invención que comprende un componente de toxina activa.
[0312] En determinadas realizaciones de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, al entrar en contacto una célula acoplada físicamente con una biomolécula diana extracelular del grupo de reconocimiento celular (por ejemplo una región de unión dirigida a célula), la molécula de reconocimiento celular de la presente invención es capaz de provocar directamente la muerte de la célula, tal como, por ejemplo, mediante la actividad enzimática de una región efectora de toxina.
C. La desinmunización mejora las aplicaciones que involucran la administración a mamíferos
[0313] Los polipéptidos y moléculas de reconocimiento celular de la presente invención tienen una utilidad mejorada para la administración a especies de mamíferos, ya sea como un agente terapéutico y/o de diagnóstico debido a la reducida probabilidad de producir respuestas inmunes no deseadas en los mamíferos, mientras se aumenta la probabilidad de producir respuestas inmunes deseables en mamíferos.
[0314] Ciertos polipéptidos desinmunizados de la presente invención pueden variar en sus perfiles de antigenicidad cuando se administran a varios mamíferos, pero se espera que tengan una antigenicidad y/o inmunogenicidad reducida de células B y/o células T CD4+. En determinadas realizaciones, las funciones biológicas deseadas del polipéptido de la toxina original a partir del cual se derivó el polipéptido desinmunizado se conservan en los polipéptidos de la presente invención después de alterar que el epítopo(s) de células B y añadir el epítopo de células T CD8+. Además, los epítopos de células B a menudo coinciden o se superponen con epítopos de células T CD4+ maduras, por lo que la alteración de un epítopo de células B a menudo altera simultáneamente un epítopo de células T CD4+.
D. Citotoxicidad selectiva entre tipos de células
[0315] Determinadas moléculas de reconocimiento celular de la presente invención tienen usos en la matanza selectiva de células diana específicas en presencia de no directo, espectador células. Al dirigir el suministro de epítopos de células T inmunogénicas a la vía del MHC de clase I de las células diana, la presentación posterior de epítopos de células T y la citólisis de células diana mediada por CTL inducida por las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención se puede restringir a matando preferentemente tipos de células seleccionados en presencia de células no seleccionadas. Además, la destrucción de células diana por la potente actividad citotóxica de diversas regiones efectoras de toxina puede restringirse para destruir preferentemente células diana con la administración simultánea de un epítopo inmunogénico de células T y un polipéptido efector de toxina citotóxica.
[0316] En determinadas realizaciones, tras la administración de la molécula de reconocimiento celular de la presente invención a una mezcla de tipos de células, la molécula de reconocimiento celular es capaz de matar selectivamente aquellas células que están acopladas físicamente con una biomolécula diana extracelular en comparación con los tipos de células no físicamente. junto con una biomolécula diana extracelular. Debido a que muchas toxinas están adaptadas para destruir células eucariotas, tales como, por ejemplo, miembros de las familias ABx y ribotoxinas, las proteínas citotóxicas diseñadas usando regiones efectoras de toxinas pueden mostrar una potente actividad citotóxica. Al dirigir la liberación de regiones efectoras de toxinas enzimáticamente activas a tipos de células específicos utilizando regiones de unión de alta afinidad,
[0317] En determinadas realizaciones, la molécula citotóxica dirigida a células de la presente invención es capaz de provocar de forma selectiva o preferencial la muerte de un tipo de célula específico dentro de una mezcla de dos o más tipos de células diferentes. Esto permite la actividad citotóxica dirigida a tipos de células específicos con una alta preferencial, como un efecto citotóxico triple, sobre los tipos de células "espectadoras" que no expresan la biomolécula diana. Alternativamente, la expresión de la biomolécula diana de la región de unión puede ser no exclusiva de un tipo de célula si la biomolécula diana se expresa en cantidades suficientemente bajas y/o acoplada físicamente en cantidades bajas con tipos de células que no van a ser diana. Esto permite la destrucción de células específicas de tipos celulares específicos con una preferencia alta, como un efecto citotóxico triple, sobre el "espectador".
[0318] En determinadas realizaciones adicionales, tras la administración de la molécula dirige a una célula citotóxica para dos poblaciones diferentes de tipos de células, la molécula dirige a una célula citotóxica es capaz de causar la muerte celular tal como se define por la concentración media máxima citotóxico (CD 50) en una población de células diana, cuyos miembros expresan una biomolécula diana extracelular de la región de unión de la proteína citotóxica, a una dosis al menos tres veces menor que la dosis de CD 50 de la misma proteína citotóxica a una población de células cuyos miembros no no expresa una biomolécula diana extracelular de la región de unión de la proteína citotóxica.
[0319] En determinadas realizaciones, la actividad citotóxica hacia poblaciones de tipos de células acopladas físicamente con una biomolécula diana extracelular es al menos 3 veces mayor que la actividad citotóxica hacia poblaciones de tipos de células no acopladas físicamente con ninguna biomolécula diana extracelular de la región de unión. Según la presente invención, la citotoxicidad selectiva puede cuantificarse en términos de la relación (a/b) de (a) citotoxicidad hacia una población de células de un tipo celular específico acoplado físicamente con una biomolécula diana de la región de unión a (b) citotoxicidad hacia una población de células de un tipo celular no acoplado físicamente con una biomolécula diana de la región de unión. En determinadas realizaciones, la relación de citotoxicidad es indicativa de citotoxicidad selectiva que es al menos 3 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30-fold, 40-fold, 50-fold, 75-fold, 100-fold, 250-fold, 500-fold, 750-fold, or 1000-fold higher for populations of cells or cell types physically coupled with a target biomolecule of the binding region compared to populations of cells or cell types not physically coupled with a target biomolecule of the binding region.
[0320] Esta función de destrucción celular preferencial permite a una célula diana ser destruida por ciertas moléculas de reconocimiento celular citotóxicas de la presente invención bajo condiciones variadas y en presencia de células espectadoras no dianas, tales como mezclas manipuladas ex vivo de tipos de células, tejidos cultivados in vitro con mezclas de tipos de células, o in vivo en presencia de múltiples tipos de células (por ejemplo, in situ o en una ubicación nativa dentro de un organismo multicelular).
E. Suministro de material exógeno adicional al interior de las células diana
[0321] Además de las aplicaciones citotóxicas y citostáticas, las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención pueden usarse opcionalmente para funciones de recopilación de información y diagnóstico. Además, se pueden usar variantes no tóxicas de las moléculas citotóxicas de reconocimiento celular de la presente invención, u opcionalmente variantes tóxicas, para administrar materiales exógenos adicionales y/o marcar el interior de las células acopladas físicamente con una biomolécula diana extracelular de la proteína citotóxica. Varios tipos de células y/o poblaciones de células que expresan biomoléculas diana en al menos una superficie celular pueden ser dirigidas por las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención para recibir materiales exógenos. Los componentes funcionales de la presente invención son modulares, en que varias regiones efectoras de toxina y materiales exógenos adicionales se pueden unir a varias regiones de unión para proporcionar diversas aplicaciones, tales como obtención de imágenes in vivo no invasivas de células tumorales.
[0322] Debido a que las moléculas que se dirigen a las células de la presente invención, incluidas las formas no tóxicas de las mismas, son capaces de entrar en las células acopladas físicamente con una biomolécula diana extracelular reconocida por la región de unión de la molécula que se dirige a las células, determinadas realizaciones de las moléculas que se dirigen a las células de la presente invención pueden ser utilizado para entregar materiales exógenos adicionales en el interior de tipos de células objetivo. En un sentido, la molécula de reconocimiento celular completa de la presente invención es un material exógeno que entrará en la célula; por tanto, los materiales exógenos "adicionales" son materiales heterólogos unidos pero distintos de la propia molécula de reconocimiento celular central.
[0323] "Material exógeno adicional", tal como se usa en este documento, se refiere a una o más moléculas, a menudo no presentes generalmente dentro de una célula diana nativa, donde las proteínas de la presente invención pueden usarse para transportar específicamente dicho material al interior de una célula. Los ejemplos no limitantes de materiales exógenos adicionales son péptidos, polipéptidos, proteínas, polinucleótidos, agentes quimioterapéuticos de molécula pequeña y agentes promotores de la detección.
[0324] En determinadas realizaciones, el material exógeno adicional comprende una proteína o polipéptido que comprende una enzima. En otras determinadas realizaciones, el material exógeno adicional es un ácido nucleico, tal como, por ejemplo, un ácido ribonucleico que funciona como un pequeño ARN inhibidor (ARNip) o microARN (miARN). En determinadas realizaciones, el material exógeno adicional es un antígeno, tal como antígenos derivados de proteínas bacterianas, proteínas virales, proteínas mutadas en cáncer, proteínas expresadas de forma aberrante en cáncer o regiones determinantes de complementariedad de células T. Por ejemplo, los materiales exógenos incluyen antígenos, tales como los característicos de las células presentadoras de antígenos infectadas por bacterias, y regiones determinantes de complementariedad de células T capaces de funcionar como antígenos exógenos. Ejemplos adicionales de materiales exógenos incluyen polipéptidos y proteínas más grandes que un péptido antigénico, tales como enzimas. Los materiales exógenos que comprenden polipéptidos o proteínas pueden comprender opcionalmente uno o más antígenos, conocidos o desconocidos para el experto en la materia.
F. Recopilación de información para funciones de diagnóstico
[0325] Determinadas moléculas de reconocimiento celular de la presente invención tienen usos en la detección in vitro y/o in vivo de células específicas, tipos de células y/o poblaciones de células. En determinadas realizaciones, las proteínas descritas en el presente documento se utilizan tanto para diagnóstico como para tratamiento, o solo para diagnóstico. Cuando se usa la misma proteína citotóxica tanto para el diagnóstico como para el tratamiento, la variante de proteína citotóxica que incorpora un agente promotor de la detección para el diagnóstico puede volverse no tóxica mediante la inactivación catalítica de una región efectora de la toxina mediante una o más sustituciones de aminoácidos, incluidas las sustituciones de ejemplo descritas en el presente documento. . Las formas no tóxicas de las moléculas citotóxicas dirigidas a células de la presente invención que se conjugan con agentes promotores de la detección pueden usarse opcionalmente para funciones de diagnóstico.
[0326] La capacidad de los agentes de detección de la promoción de conjugados conocidos en la técnica a diversas moléculas de reconocimiento celular de la presente invención proporciona composiciones útiles para la detección de cáncer, tumor, inmune, y las células infectadas. Estas realizaciones de diagnóstico de las moléculas de direccionamiento celular de la presente invención pueden usarse para la recopilación de información mediante diversas técnicas de formación de imágenes y ensayos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las realizaciones de diagnóstico de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención se pueden usar para la recopilación de información a través de la formación de imágenes de orgánulos intracelulares (por ejemplo, endocitóticos, Golgi, retículo endoplásmico y compartimentos citosólicos) de células cancerosas individuales, células inmunes o células infectadas en un paciente o una muestra de biopsia.
[0327] Varios tipos de información pueden ser recogidos utilizando las realizaciones de diagnóstico de las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención ya sea para usos de diagnóstico u otros usos. Esta información puede ser útil, por ejemplo, para diagnosticar tipos de células neoplásicas, determinar las susceptibilidades terapéuticas de la enfermedad de un paciente, analizar la progresión de las terapias antineoplásicas a lo largo del tiempo, analizar la progresión de las terapias inmunomoduladoras a lo largo del tiempo, analizar la progresión de las terapias antimicrobianas a lo largo del tiempo. tiempo, evaluar la presencia de células infectadas en los materiales de trasplante, evaluar la presencia de tipos de células no deseadas en los materiales de trasplante y/o evaluar la presencia de células tumorales residuales después de la escisión quirúrgica de una masa tumoral.
[0328] Por ejemplo, las subpoblaciones de pacientes podrían determinarse utilizando la información recopilada utilizando las variantes de diagnóstico de las moléculas de la presente invención dirigidas a las células, y luego los pacientes individuales podrían clasificarse en subpoblaciones basándose en sus características únicas reveladas utilizando esas realizaciones de diagnóstico. Por ejemplo, la eficacia de terapias o fármacos específicos podría ser un tipo de criterio utilizado para definir una subpoblación de pacientes. Por ejemplo, se puede usar una variante de diagnóstico no tóxica de una molécula de la presente invención que se dirige a células citotóxicas en particular para diferenciar qué pacientes están en una clase o subpoblación de pacientes que se predice que responderán positivamente a una variante citotóxica de la misma molécula de reconocimiento celular de la presente invención. En consecuencia, los procedimientos asociados para la identificación de pacientes, estratificación de pacientes,
VII. Producción, fabricación y purificación de polipéptidos desinmunizados de la presente invención y las moléculas de reconocimiento celular que comprenden los mismos
[0329] Los polipéptidos desinmunizados y las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención pueden producirse usando técnicas de ingeniería bioquímica bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos y las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención pueden fabricarse mediante procedimientos sintéticos estándar, mediante el uso de sistemas de expresión recombinantes o mediante cualquier otro procedimiento adecuado. Por tanto, los polipéptidos y las moléculas que se dirigen a células de la presente invención pueden sintetizarse de varias formas, que incluyen, por ejemplo, procedimientos que comprenden: (1 ) sintetizar un polipéptido o componente polipeptídico de una proteína usando metodología estándar en fase sólida o en fase líquida, ya sea por etapas o por ensamblaje de fragmentos, y aislar y purificar el producto del compuesto peptídico final; (2 ) expresar un polinucleótido que codifica un polipéptido o componente polipeptídico de una proteína de la presente invención dirigida a células en una célula huésped y recuperar el producto de expresión de la célula huésped o cultivo de células huésped; o (3) expresión in vitro libre de células de un polinucleótido que codifica un polipéptido o componente polipeptídico de una proteína de la presente invención dirigida a células y recuperar el producto de expresión; o mediante cualquier combinación de los procedimientos de (1), (2) o (3) para obtener fragmentos del componente peptídico, uniendo posteriormente (por ejemplo, ligando) los fragmentos para obtener el componente peptídico y recuperando el componente peptídico.
[0330] Puede ser preferible sintetizar un polipéptido desinmunizado o un componente de proteína o polipeptídico de una molécula de reconocimiento celular de la presente invención por medio de síntesis de péptidos en fase sólida o en fase líquida. Los polipéptidos y las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención pueden fabricarse adecuadamente mediante procedimientos sintéticos estándar. Por tanto, los péptidos pueden sintetizarse mediante, por ejemplo, procedimientos que comprenden sintetizar el péptido mediante metodología estándar en fase sólida o en fase líquida, por etapas o por ensamblaje de fragmentos, y aislar y purificar el producto peptídico final. En este contexto, se puede hacer referencia al documento WO 1998/11125 o, entre otros, Fields G et al., Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis (Synthetic Peptides, Grant G, ed., Oxford University Press, Reino Unido, 2do. ed., 2002) y los ejemplos de síntesis que contiene.
[0331] Los polipéptidos desinmunizados y las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención pueden prepararse (producirse y purificarse) usando técnicas recombinantes bien conocidas en la técnica. En general, los procedimientos para preparar polipéptidos cultivando células hospedadoras transformadas o transfectadas con un vector que comprende el polinucleótido codificante y recuperando el polipéptido del cultivo celular se describen en, por ejemplo, Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Estados Unidos, 1989); Dieffenbach C et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, EE. UU., 1995). Puede usarse cualquier célula huésped adecuada para producir un polipéptido y/o una molécula de reconocimiento celular de la presente invención. Las células huésped pueden ser células transfectadas de forma estable o transitoria, transformadas, transducidos o infectados con uno o más vectores de expresión que dirigen la expresión de un polipéptido de la presente invención. Además, se puede producir un polipéptido desinmunizado y/o una molécula de reconocimiento celular de la presente invención modificando el polinucleótido que codifica un polipéptido o molécula de reconocimiento celular de la presente invención que da como resultado la alteración de uno o más aminoácidos o la eliminación o inserción de uno. o más aminoácidos para lograr las propiedades deseadas, tales como citotoxicidad modificada, efectos citostáticos modificados y/o semivida sérica modificada.
[0332] Hay una amplia variedad de sistemas de expresión que pueden ser seleccionados para producir un polipéptido o molécula de reconocimiento celular de la presente invención. Por ejemplo, los organismos hospedadores para la expresión de moléculas de reconocimiento celular de la presente invención incluyen procariotas, tales como E. coli y B. subtilis, células eucariotas, tales como levaduras y hongos filamentosos (como S. cerevisiae, P. pastoris, A. awamori y K. lactis), algas (como C. reinhardtii), líneas celulares de insectos, células de mamíferos (como células CHO), líneas celulares vegetales y organismos eucariotas, tales como plantas transgénicas (como A. thaliana y N. benthamiana).
[0333] Por consiguiente, la presente divulgación también proporciona procedimientos para producir un polipéptido hiperinmunizado de células T CD8+ y/o desimunizado de células B/células T CD4+ y/o proteína dirigida a células de la divulgación de acuerdo con los procedimientos mencionados anteriormente y usando un polinucleótido que codifica parte o todo un polipéptido de la divulgación o un componente polipeptídico de una proteína de la divulgación dirigida a células, un vector de expresión que comprende al menos un polinucleótido de la divulgación capaz de codificar parte o la totalidad de un polipéptido de la presente invención cuando se introduce en una célula huésped, y/o una célula huésped que comprende un polinucleótido o vector de expresión de la divulgación.
[0334] Cuando un polipéptido o proteína se expresa usando técnicas recombinantes en una célula huésped o sistema libre de células, es ventajoso separar (o purificar) el polipéptido o proteína deseado de otros componentes, como los factores de la célula huésped, para obtener preparaciones que son de alta pureza o son sustancialmente homogéneos. La purificación se puede lograr mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como técnicas de centrifugación, técnicas de extracción, técnicas cromatográficas y de fraccionamiento (por ejemplo, separación por tamaños mediante filtración en gel, separación de carga por columna de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía en sílice o resinas de intercambio catiónico como DEAE y similares, cromatografía y cromatografía de proteína A sefarosa para eliminar contaminantes) y técnicas de precipitación (p. ej. precipitación con etanol o precipitación con sulfato de amonio). Puede usarse cualquier número de técnicas de purificación bioquímica para aumentar la pureza de un polipéptido desinmunizado y/o molécula de direccionamiento celular de la presente invención. En determinadas realizaciones, los polipéptidos y moléculas de la presente invención dirigidas a células pueden purificarse opcionalmente en formas homo-multiméricas (es decir, un complejo proteico de dos o más polipéptidos idénticos o moléculas de reconocimiento celular de la presente invención).
[0335] En los ejemplos siguientes se describen ejemplos no limitantes de procedimientos para producir un polipéptido o molécula de reconocimiento celular de la presente invención, así como aspectos específicos pero no limitantes de la producción de moléculas de reconocimiento celular de ejemplo de la presente invención. .
VIII. Composiciones farmacéuticas y de diagnóstico que comprenden un polipéptido desinmunizado de la presente invención o una molécula de reconocimiento celular que comprende el mismo
[0336] La presente invención proporciona polipéptidos y proteínas solos o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, en una composición farmacéutica, para uso como medicamento, tal como se define en las reivindicaciones, tal como en el tratamiento o profilaxis de afecciones, enfermedades, trastornos, o síntomas descritos con más detalle a continuación (por ejemplo, cánceres, tumores, trastornos inmunitarios e infecciones microbianas). La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un polipéptido o molécula de reconocimiento celular de la presente invención, junto con al menos un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender formas homomultiméricas y/o heteromultiméricas de los polipéptidos o moléculas de reconocimiento celular de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas serán útiles en procedimientos para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad, afección, trastorno o síntoma que se describen con más detalle a continuación. Se prevé que cada una de tales enfermedades, afecciones, trastornos o síntomas sea una realización separada con respecto a los usos de una composición farmacéutica según la presente invención. La presente invención proporciona además una composición farmacéutica, tal como se define en las reivindicaciones, para su uso como medicamento, tal como se indica en las reivindicaciones.
[0337] Tal como se usa en este documento, los términos "paciente" y "sujeto" se utilizan indistintamente para referirse a cualquier organismo, habitualmente vertebrados, tales como seres humanos y animales, que presenta síntomas, signos y/o indicaciones de al menos una enfermedad, trastorno o afección. Estos términos incluyen mamíferos, tales como los ejemplos no limitativos de primates, animales de ganado (por ejemplo, ganado, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etc.), animales de compañía (por ejemplo, gatos, perros, etc.) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, conejos, ratas, etc.).
[0338] Tal como se usa en el presente documento, "tratar", "tratar" o "tratamiento" y variantes gramaticales de los mismos se refieren a un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Los términos pueden referirse a ralentizar el inicio o la velocidad de desarrollo de una afección, trastorno o enfermedad, reducir o aliviar los síntomas asociados con ella, generar una regresión completa o parcial de la afección, o alguna combinación de cualquiera de los anteriores. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, reducción o alivio de síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estabilización (por ejemplo, no empeoramiento) del estado de la enfermedad, retraso o enlentecimiento de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable." también puede significar prolongar la supervivencia en relación con el tiempo de supervivencia esperado si no recibe tratamiento. Por tanto, un sujeto (por ejemplo, un ser humano) que necesita tratamiento puede ser un sujeto que ya padece la enfermedad o trastorno en cuestión. Los términos "tratar', "tratar" o "tratamiento" incluyen la inhibición o reducción de un aumento en la gravedad de un estado patológico o síntomas en relación con la ausencia de tratamiento, y no necesariamente implican el cese completo de la enfermedad relevante. trastorno o condición. Con respecto a los tumores y/o cánceres, el tratamiento incluye la reducción de la carga tumoral general y/o el tamaño del tumor individual.
[0339] Como se usa en el presente documento, los términos "prevenir", "prevenir", "prevención" y variantes gramaticales de los mismos se refieren a un enfoque para prevenir el desarrollo o alterar la patología de una afección, enfermedad o trastorno. Por consiguiente, "prevención" puede referirse a medidas profilácticas o preventivas. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, prevención o ralentización de síntomas, progresión o desarrollo de una enfermedad, ya sea detectable o indetectable. Por tanto, un sujeto (por ejemplo, un ser humano) que necesita prevención puede ser un sujeto que aún no padece la enfermedad o trastorno en cuestión. El término "prevención" incluye ralentizar el inicio de la enfermedad en relación con la ausencia de tratamiento, y no necesariamente implica la prevención permanente de la enfermedad, trastorno o afección relevante. Por tanto, "prevenir" o "prevención" de una afección puede, en ciertos contextos, referirse a reducir el riesgo de desarrollar la afección, o prevenir o retrasar el desarrollo de los síntomas asociados con la afección.
[0340] Como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad o dosis de una composición (por ejemplo, una composición o agente terapéutico) que produce al menos un efecto terapéutico deseado en un sujeto, como prevenir o tratar una diana. condición o aliviar de manera beneficiosa un síntoma asociado con la condición. La cantidad terapéuticamente eficaz más deseable es una cantidad que producirá una eficacia deseada de un tratamiento particular seleccionado por un experto en la técnica para un sujeto dado que lo necesite. Esta cantidad variará dependiendo de una variedad de factores comprendidos por el experto, que incluyen, pero no se limitan a, las características del compuesto terapéutico (que incluyen actividad, farmacocinética, farmacodinámica y biodisponibilidad), la condición fisiológica del sujeto (incluida la edad, el sexo, el tipo de enfermedad, el estadio de la enfermedad, la condición física general, la capacidad de respuesta a una dosis determinada y el tipo de medicación), la naturaleza del portador o portadores farmacéuticamente aceptables en la formulación y la vía de administración. Un experto en la técnica clínica y farmacológica podrá determinar una cantidad terapéuticamente eficaz a través de la experimentación de rutina, es decir, controlando la respuesta de un sujeto a la administración de un compuesto y ajustando la dosis en consecuencia (ver, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, EE. u U., 19a ed., 1995)).
[0341] Las composiciones de diagnóstico de la presente invención comprenden una molécula de reconocimiento celular de la presente invención y uno o más agentes promotores de detección. Varios agentes promotores de la detección son conocidos en la técnica, tales como isótopos, colorantes, agentes colorimétricos, agentes potenciadores de contraste, agentes fluorescentes, agentes bioluminiscentes y agentes magnéticos. Estos agentes pueden ser incorporados en la molécula de reconocimiento celular de la presente invención en cualquier posición. La incorporación del agente puede ser a través de un residuo o residuos de aminoácidos de la proteína de la invención o a través de algún tipo de unión conocido en la técnica, incluyendo a través de enlazadores y/o quelantes. La incorporación del agente es de tal manera que permite la detección de la presencia de la composición de diagnóstico en una pantalla, ensayo, procedimiento de diagnóstico y/o técnica de imagen
[0342] Cuando se produce o fabrica una composición de diagnóstico de la presente invención, una molécula dirigida a la célula de la invención puede unirse directa o indirectamente a uno o más agentes promotores de la detección. Hay numerosos agentes promotores de la detección conocidos para el experto que pueden unirse operativamente a las moléculas de reocnocimiento celular de la presente invención para los procedimientos de recopilación de información, tales como para aplicaciones de diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades, trastornos o afecciones de un organismo (véase, por ejemplo Cai W et al, J Nucl Med 48: 304-10 (2007); Nayak T, Brechbiel M, Bioconjug Chem. 20: 825-41 (2009); Paudyal P et al, Oncol Rep. 22: 115-9 (2009 ); Qiao J et al, PLoS ONE 6: e18103 (2011); Sano K et al, Breast Cancer Res. 14:. R61 (2012)). Por ejemplo, los agentes promotores de la detección incluyen agentes de contraste que mejoran la imagen, tales como colorantes fluorescentes (por ejemplo Alexa680, verde de indocianina y Cy5.5), isóto­ pos y radionúclidos, tales como 11C, 13N, 15O, 18F, 32P, 51Mn, 52mMn, 52Fe, 55Co, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 72As, 73Se, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 86Y, 90Y, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 110In, 111In, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154Gd, 155Gd, 156Gd, 157Gd, 158Gd, 177Lu, 186Re, 188Re, y 223R, iones paramagnéticos, tales como cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) o erbio (III), metales, tales como lantano (III), oro (III), plomo (II) y bismuto (III), agentes que mejoran el contraste por ultrasonidos, tales como liposomas, agentes radiopacos, tales como compuestos de bario, galio y talio. Los agentes promotores de la detección pueden incorporarse directa o indirectamente usando un grupo funcional intermediario, tales como quelantes como 2-bencil DTPA, PAMAM, NOTA, DOTA, TETA, análogos de los mismos, y equivalentes funcionales de cualquiera de los anteriores (ver Leyton J et al., Clin Cancer Res 14: 7488­ 96 (2008)).
[0343] Existen numerosas técnicas estándar conocidas para el experto para la incorporación, adhesión y/o conjugación de diversos agentes promotores de la detección a proteínas, especialmente a inmunoglobulinas y dominios derivados de inmunoglobulina (Wu A, Methods 65: 139-47 (2014)). De manera similar, hay numerosas estratategias de imágenes conocidas para el experto, tales como las técnicas de obtención de imágenes in vivo no invasivas comúnmente usadas en el campo médico, por ejemplo: formación de imágenes por tomografía computarizada (TC), formación de imágenes ópticas (incluyendo obtención de imágenes de forma directa, fluorescente y bioluminiscente), obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión de positrones (PET), ultrasonidos con tomografía computarizada por emisión de un solo fotón (SPECT) de ultrasonidos, y obtención de imágenes por tomografía computarizada con rayos X (ver Kaur S et al, Cancer Lett. 315: 97-111 (2012), para una revisión).
IX. Producción o fabricación de una composición farmacéutica y/o de diagnóstico que comprende un polipéptido desinmunizado o una molécula de reconocimiento celular de la presente invención
[0344] Las sales o solvatos de cualquiera de los polipéptidos y moléculas de reconocimiento celular de la presente invención farmacéuticamente aceptables están igualmente dentro del alcance de la presente divulgación.
[0345] El término "solvato" en el contexto de la presente divulgación se refiere a un complejo de estequiometría definida formado entre un soluto (en este caso, un compuesto polipéptido o sal farmacéuticamente aceptable de la misma de acuerdo con la invención) y un disolvente. El disolvente en esta conexión puede, por ejemplo, ser agua, etanol u otra especie orgánica farmacéuticamente aceptable, típicamente de peso molecular pequeño, tal como, pero no limitado a, ácido acético o ácido láctico. Cuando el disolvente en cuestión es agua, un solvato de este tipo se conoce normalmente como un hidrato.
[0346] Los polipéptidos y moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, o sales de las mismas, se pueden formular como composiciones farmacéuticas preparadas para almacenamiento o administración, que típicamente comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido o molécula de reconocimiento celular de la presente invención, o una sal del mismo, en un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar. Los portadores farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. (A. Gennaro, ed., 1985)). Tal como se usa en este documento, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos y agentes que retrasan la absorción, y similares, fisiológicamente aceptables, es decir, compatibles. Los portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen los usados en formulaciones adecuadas para administración oral, rectal, nasal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, y transdérmica). Ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. En ciertas realizaciones, el portadores adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo mediante inyección o infusión). Dependiendo de la ruta de administración seleccionada, la proteína u otro componente farmacéutico pueden recubrirse en un material destinado a proteger el compuesto de la acción del pH bajo y otras condiciones de inactivación natural en las que la proteína activa se puede encontrar cuando se administra a un paciente por una vía de administración particular.
[0347] Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de la farmacia. En dicha forma, la composición se divide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación envasada, conteniendo el envase cantidades discretas de las preparaciones, por ejemplo, comprimidos envasados, cápsulas y polvos en viales o ampollas. La forma de dosificación unitaria puede ser también una cápsula, píldora o el propio comprimido, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estas formas envasadas. Puede proporcionarse en forma inyectable de dosis única, por ejemplo en forma de una pluma. Las composiciones se pueden formular mediante cualquier vía y medios de administración adecuados. Los modos de administración subcutáneos o transdérmicos pueden ser particularmente adecuados para las proteínas terapéuticas descritas en este documento.
[0348] Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto mediante procedimientos de esterilización como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También pueden ser deseables agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser provocada por la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
[0349] Una composición farmacéutica de la presente invención también incluye opcionalmente un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los antioxidantes farmacéuticamente aceptables de ejemplo son antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.
[0350] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o una combinación de diferentes polipéptidos y/o moléculas de reconocimiento celular de la divulgación, o un éster, sal o amida de cualquiera de los anteriores, y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
[0351] Las composiciones terapéuticas son típicamente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, alcohol, tal como etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), o cualquier mezcla adecuada. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de agentes tensioactivos de acuerdo con la química de la formulación bien conocida en la técnica. En ciertas realizaciones, pueden ser deseables en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede provocarse mediante la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
[0352] Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación intradérmica o subcutánea incluyen típicamente uno o más de: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes de ajuste de la tonicidad, tales como, por ejemplo, cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio, o tampones con citrato, fosfato, acetato y similares. Dichas preparaciones se pueden encerrar en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis fabricados de vidrio o plástico.
[0353] Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación de un polipéptido o molécula de reconocimiento de la presente invención en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes descritos anteriormente, según se requiera, seguido de microfiltración con esterilización. Las dispersiones se pueden preparar mediante la incorporación de un compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión y los otros ingredientes, tales como los descritos anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del principio activo además de cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada estéril de los mismos.
[0354] Cuando se diseña una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido o molécula de reconocimiento celular de la presente invención para ser administrada mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, el agente de unión estará en forma de una solución acuosa libre de pirógenos parenteralmente aceptable. Los procedimientos para preparar soluciones de proteína parenteralmente aceptables, teniendo en consideración un pH, isotonicidad, estabilidad, y similares apropiados están dentro de la experiencia en la técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea contiene, además de agentes de unión, un vehículo isotónico, tal como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro sódico, inyección de Ringer con lactato, u otro vehículo conocido en la técnica. Una composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes, u otros aditivos bien conocidos por los expertos en la técnica.
[0355] Tal como se describe en otra parte en el presente documento, un polipéptido o molécula de reconocimiento celular de la presente invención se pueden preparar con portadores que protegerán la composición contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de liberación microencapsulada. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos procedimientos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (Robinson J, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, US, 1978)).
[0356] En ciertas realizaciones, la composición de la presente invención puede formularse para asegurar una distribución deseada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica excluye muchos compuestos grandes y/o hidrófilos. Para direccionar un compuesto o composición terapéutica de la invención a una localización particular in vivo, se puede formular, por ejemplo, en liposomas que pueden comprender uno o más restos que se transportan selectivamente en células u órganos específicos, mejorando así la administración dirigida de fármacos. Los restos de direccionamiento de ejemplo incluyen folato o biotina; manósidos; anticuerpos; receptor de la proteína A surfactante; p120 catenina y similares.
[0357] Las composiciones farmacéuticas incluyen formulaciones parenterales diseñadas para ser utilizadas como implantes o sistemas de partículas. Los ejemplos de implantes son formulaciones de depósito compuestas de componentes poliméricos o hidrófobos, tales como emulsiones, resinas de intercambio iónico y soluciones de sales solubles. Ejemplos de sistemas de partículas son dendrímeros, liposomas, microesferas, micropartículas, nanocápsulas, nanopartículas, nanovaras, nanoesferas, micelas poliméricas y nanotubos (véase, por ejemplo Honda M et al, Int J Nanomedicine. 8: 495-503 (2013); Sharma A et al, Biomed Res Int 2013:. 960 821 (2013); Ramishetti S, Huang L, Ther Deliv 3: 1429-1445 (2012)). Las formulaciones de liberación controlada se pueden preparar utilizando polímeros sensibles a iones, tales como, por ejemplo, liposomas, polaxámero 407 e hidroxiapatita.
X. Polinucleótidos, vectores de expresión y células huésped
[0358] Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos y las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, o porciones funcionales de los mismos, también se incluyen dentro del alcance de la presente divulgación. El término "polinucleótido" es equivalente al término "ácido nucleico", cada uno de los cuales incluye uno o más de: polímeros de ácidos desoxirribonucleicos (ADN), polímeros de ácidos ribonucleicos (ARN), análogos de estos ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. y derivados, fragmentos y homólogos de los mismos. El polinucleótido de la presente divulgación puede ser de cadena sencilla, doble o triple. Dichos polinucleótidos se describen específicamente para incluir todos los polinucleótidos capaces de codificar una proteína de ejemplo, por ejemplo, teniendo en cuenta la oscilación que se sabe que se tolera en la tercera posición de los codones de ARN, aunque codifica el mismo aminoácido que un codón de ARN diferente (véase Stothard O, Biotechniques 28: 1102-4 (2000)).
[0359] En un aspecto, la divulgación proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido de células T CD8+ hiperinmunizado y/o células B/CD4+ desinmunizadas de células T y/o una proteína dirigida a células de la divulgación, o un fragmento o derivado del mismo. . Los polinucleótidos pueden incluir, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más, idéntico a un polipéptido que comprende una de las secuencias de aminoácidos de la proteína. La divulgación también incluye polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas con un polinucleótido que codifica polipéptido de células T CD8+ hiperinmunizado y/o células B/CD4+ desinmunizado de células T y/o proteína de reconocimiento celular de la divulgación. , o un fragmento o derivado del mismo, o el antisentido o complemento de cualquiera de tales secuencias.
[0360] Los derivados o análogos de las moléculas (por ejemplo, polipéptidos hiperinmunizados de células T CD8+ y/o células B/células T CD4+ desinmunizadas y/o proteínas dirigidas a células que comprenden las mismas) de la presente divulgación incluyen, entre otros , moléculas de polinucleótidos (o polipéptidos) que tienen regiones que son sustancialmente homólogas a los polinucleótidos, polipéptidos hiperinmunizados de células T CD8+ y/o células B/células T CD4+ desinmunizadas, o proteínas dirigidas a células de la presente divulgación, por ejemplo, por al menos aproximadamente 45%, 50%, 70%, 80%, 95%, 98% o incluso 99% de identidad (con una identidad preferida de 80-99%) sobre una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos del mismo tamaño o en comparación con una secuencia alineada en la que la alineación se realiza mediante un programa informático de homología conocido en la técnica. Un programa de ejemplo es el programa GAP (Paquete de análisis de secuencia de Wisconsin, Versión 8 para UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI, EE. UU.) Utilizando la configuración predeterminada, que utiliza el algoritmo de Smith T, Waterman M, Adv. Apl. Matemáticas. 2: 482 - 9 (1981). También se incluyen en la divulgación polinucleótidos capaces de hibridar con el complemento de una secuencia que codifica las proteínas de la presente invención dirigidas a células en condiciones estrictas (véase, por ejemplo, Ausubel F et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York , NY, EE. UU., 1993)) y a continuación. Las condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Ny , EE.UU., Ch. Sec. 6.3.1-6.3.6 (1989)). Adv. Apl. Matemáticas. 2: 482 - 9 (1981). También se incluyen en la divulgación polinucleótidos capaces de hibridar con el complemento de una secuencia que codifica las proteínas de la presente invención dirigidas a células en condiciones estrictas (véase, por ejemplo, Ausubel F et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, NY, EE. UU., 1993)) y a continuación. Las condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY, EE.UU., Ch. Sec. 6.3.1-6.3.6 (1989)).
[0361] La presente divulgación proporciona además vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento. Los polinucleótidos capaces de codificar los polipéptidos hiperinmunizados de células T CD8+ y/o desinmunizados de células B/células T CD4+ y/o proteínas dirigidas a células de la divulgación pueden insertarse en vectores conocidos, incluidos plásmidos bacterianos, virales vectores y vectores de fagos, utilizando material y procedimientos bien conocidos en la técnica para producir vectores de expresión. Dichos vectores de expresión incluirán los polinucleótidos necesarios para apoyar la producción de polipéptidos hiperinmunizados de células T CD8+ y/o desinmunizados de células B/células T CD4+ y/o proteínas dirigidas a células contemplados de la divulgación dentro de cualquier célula huésped de elección o sistemas de expresión libres de células (por ejemplo, pTxb1 y pIVEX2.3). Los polinucleótidos específicos que comprenden vectores de expresión para usar con tipos específicos de células huésped o sistemas de expresión libres de células son conocidos para un experto en la materia, se pueden udeterminar utilizando experimentación de rutina o se pueden adquirir.
[0362] El término "vector de expresión", como se usa en este documento, se refiere a un polinucleótido, lineal o circular, que comprende una o más unidades de expresión. El término "unidad de expresión" denota un segmento polinucleotídico que codifica un polipéptido de interés y capaz de proporcionar expresión del segmento de ácido nucleico en una célula huésped. Una unidad de expresión comprende típicamente un promotor de la transcripción, un marco de lectura abierto que codifica el polipéptido de interés y un terminador de la transcripción, todos en configuración operable. Un vector de expresión contiene una o más unidades de expresión. Por tanto, en el contexto de la presente divulgación, un vector de expresión que codifica un polipéptido y/o proteína de células T CD8+ hiperinmunizadas y/o células B/células T CD4+ desinmunizadas que comprende una única cadena polipeptídica (p. Ej.El dominio l y una segunda cadena que comprende un dominio V h unido a una región efectora de toxina) incluye al menos dos unidades de expresión, una para cada una de las dos cadenas polipeptídicas de la proteína. Para la expresión de proteínas de la presente invención dirigidas a células multicatenarias, una unidad de expresión para cada cadena polipeptídica también puede estar contenida por separado en diferentes vectores de expresión (p. Ej., La expresión puede lograrse con una única célula huésped en la que los vectores de expresión para cada cadena polipeptídica tienen introducido).
[0363] Los vectores de expresión capaces de dirigir la expresión transitoria o estable de polipéptidos y proteínas son bien conocidos en la técnica. Los vectores de expresión generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal o péptido heterólogo, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción, cada uno de los cuales es bien conocido en la técnica. Se conocen en la técnica secuencias de control reguladoras opcionales, secuencias de integración y marcadores útiles que pueden emplearse.
[0364] El término "célula huésped" se refiere a una célula que puede apoyar la replicación o expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procariotas, tales como E. coli o células eucariotas (por ejemplo, células de levadura, insectos, anfibios, aves o mamíferos). La creación y el aislamiento de líneas de células hospedadoras que comprenden un polinucleótido de la divulgación o que pueden producir un polipéptido y/o una proteína de la presente invención dirigida a células pueden lograrse usando técnicas estándar conocidas en la técnica.
[0365] Los polipéptidos y/o proteínas hiperinmunizados de células T CD8+ y/o células B/células T CD4+ desinmunizados dentro del alcance de la presente divulgación pueden ser variantes o derivados de los polipéptidos y proteínas descritos en este documento que son producido modificando el polinucleótido que codifica un polipéptido y/o proteína alterando uno o más aminoácidos o eliminando o insertando uno o más aminoácidos que pueden hacerlo más adecuado para lograr las propiedades deseadas, tales como una expresión más óptima por parte de una célula huésped.
XI. Equipos y dispositivos de suministro
[0366] En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a un dispositivo que comprende una o más composiciones de materia de la presente invención, tal como una composición farmacéutica, para el suministro a un sujeto en necesidad del mismo. Por tanto, se puede usar un dispositivo de suministro que comprende uno o más compuestos de la presente invención para administrar a un paciente una composición de materia de la presente invención mediante varios procedimientos de administración, que incluyen: inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal; administracion oral; administración transdérmica; administración pulmonar o transmucosa; administración mediante implante, bomba osmótica, cartucho o microbomba; o por otros medios reconocidos por una persona experta en la técnica.
[0367] También dentro del alcance de la presente invención está un kit que comprende al menos una composición de materia de la presente invención, y que comprende además un reactivo y/o dispositivo de administración farmacéutica adicional, tal como se define en las reivindicaciones. Opcionalmente, el kit puede comprender además el envase e instrucciones de uso. Los kits pueden ser útiles para la administración de fármacos y/o la recopilación de información de diagnóstico. Un kit de la presente invención puede comprender opcionalmente al menos un reactivo adicional (por ejemplo, patrones, marcadores y similares). Los kits suelen incluir una etiqueta que indica el uso previsto del contenido del kit. El kit puede comprender además reactivos y otras herramientas para detectar un tipo de célula (por ejemplo, célula tumoral) en una muestra o en un sujeto, o para el diagnóstico si un paciente pertenece a un grupo que responde a una estrategia terapéutica que utiliza la composición o procedimiento relacionado de la invención, tal como se describe en el presente documento.
XII. Procedimientos para generar polipéptidos desinmunizados de la presente invención
[0368] La presente divulgación proporciona procedimientos de creación de polipéptidos hiperinmunizados de células T y/o desinmunizados de células B/células T CD4+ de la presente divulgación mediante la modificación de polipéptidos ya capaces de enrutamiento intracelular a un citosol, ER, o lisosoma de una célula desde un compartimento endosómico de la célula; comprendiendo el procedimiento la etapa de añadir un epítopo de células T heterólogo al polipéptido. En ciertos procedimientos adicionales de la presente divulgación, el epítopo de células T heterólogo se integra o inserta dentro de un polipéptido capaz de enrutarse intracelularmente a un citosol, ER o lisosoma de una célula desde un compartimento endosómico de la célula.
[0369] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, se crea un polipéptido hiperinmunizado de células T CD8+ y/o desinmunizado de células B/células T CD4+ de la presente invención mediante la modificación de un polipéptido ya capaz de enrutamiento intracelular a un citosol, ER o lisosoma de una célula desde un compartimento endosómico de la célula; comprendiendo el procedimiento la etapa de añadir un epítopo de células T heterólogo al polipéptido. En ciertos procedimientos adicionales de la presente divulgación, el epítopo de células T heterólogo se integra o inserta dentro de un polipéptido capaz de enrutarse intracelularmente a un citosol, ER o lisosoma de una célula desde un compartimento endosómico de la célula.
[0370] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, se crea en un polipéptido hiperinmunizado de células T de la presente divulgación un polipéptido ya capaz de enrutarse intracelularmente a un citosol, ER o lisosoma de una célula desde un compartimento endosómico de la célula; comprendiendo el procedimiento la etapa de añadir un epítopo de células T heterólogo al polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales de los procedimientos de la presente divulgación, se crea en un polipéptido de células T CD8+ hiperinmunizado de la presente invención un polipéptido ya capaz de enrutarse intracelularmente a un citosol, ER o lisosoma de una célula desde un compartimento endosómico de la célula; comprendiendo el procedimiento la etapa de añadir un epítopo de células T heterólogo al polipéptido. En ciertos procedimientos adicionales de la presente divulgación, el epítopo de células T heterólogo se integra o inserta dentro de un polipéptido capaz enrutar intracelularmente al citosol, ER o lisosoma de una célula desde un compartimento endosómico a la célula.
[0371] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, se crea un polipéptido capaz de suministrar un epítopo de células T para la presentación por una molécula de MHC de clase I; comprendiendo el procedimiento la etapa de añadir un epítopo de células T heterólogo a un polipéptido capaz de suministrar intracelularmente el epítopo de células T desde un compartimento endosómico de una célula a un proteasoma de la célula. En ciertos procedimientos adicionales de la presente divulgación, el epítopo de células T heterólogo se integra o inserta dentro de un polipéptido capaz de enrutarse intracelularmente a un citosol, ER o lisosoma de una célula desde un compartimento endosómico de la célula.
[0372] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, se crea un polipéptido hiperinmunizado de células T y/o desinmunizado de células B/células T CD4+; comprendiendo el procedimiento la etapa de insertar o integrar un epítopo de células T heterólogo en una región del epítopo de células B endógenas de un polipéptido ya capaz de enrutarse intracelularmente a un citosol, ER o lisosoma de una célula desde un compartimento endosómico de la célula.
[0373] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, se crea un polipéptido hiperinmunizado de células T CD8+ y desinmunizado de células B/células T CD4+ de la presente divulgación; comprendiendo el procedimiento la etapa de integrar o insertar un epítopo de células T heterólogo en una región del epítopo de células B endógenas de un polipéptido ya capaz de enrutarse intracelularmente a un citosol, ER o lisosoma de una célula desde un compartimento endosómico de la célula.
[0374] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, un polipéptido ya capaz de encaminarse intracelularmente a un citosol, ER o lisosoma de una célula desde un compartimento endosómico de la célula se crea en una célula T hiperinmunizada y/o B polipéptido desinmunizado de células/células T CD4+ de la presente divulgación; comprendiendo el procedimiento la etapa de integrar o insertar un epítopo de células T heterólogo en una región del epítopo de células B endógenas del polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales de los procedimientos de la presente divulgación, un polipéptido ya capaz de encaminarse intracelularmente a un citosol, ER o lisosoma de una célula desde un compartimento endosómico de la célula se crea en un polipéptido hiperinmunizado de células T CD8+ de la presente divulgación; el procedimiento comprende la etapa de incluir o insertar un epítopo de células T heterólogo en una región de epítopo de células B endógenas del polipéptido.
[0375] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, se crea un polipéptido desinmunizado capaz de suministrar un epítopo de células T para la presentación por una molécula de MHC de clase I; comprendiendo el procedimiento la etapa de integrar o insertar un epítopo de células T heterólogo en una región de epítopo de células B endógenas de un polipéptido capaz de suministrar intracelularmente el epítopo de células T desde un compartimento endosómico de una célula a un proteasoma de la célula.
[0376] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, se crea un polipéptido desinmunizado que tiene inmunogenicidad de células B reducida cuando se administra a un cordado. La presente invención proporciona un procedimiento para reducir la inmunogenicidad de las células B en un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o un polipéptido efector de la toxina de la difteria que tiene un epítopo de células B, comprendiendo el procedimiento la etapa de integrar un epítopo de células T CD8+ heterólogo en la Shiga. El polipéptido efector de la subunidad de la toxina A o el polipéptido efector de la toxina de la difteria que tiene un epítopo de células B, de manera que uno o más residuos de aminoácidos del epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado altera el epítopo de células B en el polipéptido efector de la toxina, como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la creación de una o más sustituciones de aminoácidos en la región del epítopo de las células B. En determinadas realizaciones adicionales de la divulgación, la etapa de alteración comprende además crear una o más inserciones de aminoácidos en la región del epítopo de células B.
[0377] Determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación son procedimientos para reducir la inmunogenicidad de las células B en un polipéptido al mismo tiempo que se aumenta la inmunogenicidad de las células T CD8+ después de la administración a un cordado, comprendiendo los procedimientos la etapa de alterar una región epítopo de células B dentro de un polipéptido con uno o más residuos de aminoácidos comprendidos por un epítopo de células T CD8+ heterólogo añadido al polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además crear una o más sustituciones de aminoácidos en la región del epítopo de células B. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la creación de una o más inserciones de aminoácidos en la región del epítopo de células B.
[0378] Determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación son procedimientos para reducir la inmunogenicidad de las células B en un polipéptido al mismo tiempo aumentar+ T-célula CD8 inmunogenicidad después de la administración a un cordado, comprendiendo los procedimientos las etapas de: 1) identificar un B-epítopo celular en un polipéptido; y 2) romper el epítopo de células B identificado con uno o más residuos de aminoácidos comprendidos por un epítopo de células T CD8+ heterólogo añadido al polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la creación de una o más sustituciones de aminoácidos en la región del epítopo de células B. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la creación de una o más inserciones de aminoácidos en la región del epítopo de células B.
[0379] Determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente invención son procedimientos para reducir la inmunogenicidad de las células B en un polipéptido, tal como se define en las reivindicaciones, que comprende la etapa inicial de: 1) la identificación de un epítopo de células B en el polipéptido efector de la subunida A de la toxina Shiga o polipéptido efector de la toxina de la difteria para la alteración con uno o más residuos de aminoácidos de un epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado en el polipéptido, tal como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la creación de una o más sustituciones de aminoácidos en la región del epítopo de células B. En determinadas realizaciones adicionales de la divulgación, la etapa de alteración comprende además crear una o más inserciones de aminoácidos en la región del epítopo de células B.
[0380] En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, se crea un polipéptido desinmunizado de células T CD4+ que tiene inmunogenicidad de células T CD4+ reducida cuando se administra a un cordado. La presente invención proporciona un procedimiento para reducir la inmunogenicidad de células T CD4+ en un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o polipéptido efector de la toxina de la difteria que tiene un epítopo de células T CD4+, el procedimiento comprende la etapa de integrar un epítopo de células T CD8+ heterólogo en el polipéptido efector de la subunidad de la toxina Shiga A o el polipéptido efector de la toxina de la difteria que tiene un epítopo de células T CD4+ de manera que uno o más residuos de aminoácidos del epítopo de células T CD8+ integrado, heterólogo, altera el epítopo de células T CD4+ en el polipéptido efector de toxina, como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la creación de una o más sustituciones de aminoácidos en la región del epítopo de las células B. En determinadas realizaciones adicionales de la divulgación, la etapa de alteración comprende además crear una o más inserciones de aminoácidos en la región del epítopo de células T CD4+.
[0381] Determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación son procedimientos para reducir la inmunogenicidad de células T CD4+ en un polipéptido al mismo tiempo que aumentan la inmunogenicidad de células T CD8+ después de la administración a un cordado, comprendiendo los procedimientos la etapa de alterar la región del epítopo de una célula T CD4+ dentro de un polipéptido con uno o más residuos de aminoácidos comprendidos por un epítopo de células T CD8+ heterólogo añadido al polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además crear una o más sustituciones de aminoácidos en la región del epítopo de células T CD4+. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además crear una o más inserciones de aminoácidos en la región del epítopo de células T CD4+.
[0382] Determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente invención son procedimientos para reducir la inmunogenicidad de células T CD4+ en un polipéptido como se define en las reivindicaciones que comprende la etapa inicial de: 1) la identificación de un epítopo de células T CD4+ en el polipéptido para la alteración con uno o más residuos de aminoácidos de un epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado en el polipéptido, como se indica en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la creación de una o más sustituciones de aminoácidos en la región del epítopo de células T CD4+. En determinadas realizaciones adicionales de la divulgación, la etapa de alteración comprende además crear una o más inserciones de aminoácidos en la región del epítopo de células T CD4+.
[0383] Determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación son procedimientos para reducir la inmunogenicidad de células T CD4+ en un polipéptido al mismo tiempo aumentar+ T-célula CD8 inmunogenicidad después de la administración a un cordado, comprendiendo los procedimientos las etapas de: 1) identificar un CD4+ Epítopo de células T en un polipéptido; y 2) romper el epítopo de células T CD4+ identificado con uno o más residuos de aminoácidos comprendidos por un epítopo de células T CD8+ heterólogo añadido al polipéptido. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además la creación de una o más sustituciones de aminoácidos en la región del epítopo de células T CD4+. En determinadas realizaciones adicionales, la etapa de alteración comprende además crear una o más inserciones de aminoácidos en la región del epítopo de células T CD4+.
XIII. Procedimientos para usar un polipéptido desinmunizado de la presente invención, molécula de reconocimiento celular que comprende el mismo, o una composición farmacéutica y/o de diagnóstico del mismo
[0384] Generalmente, es un objeto de la presente invención proporcionar agentes farmacológicamente activos, así como composiciones que los comprenden, que puedan usarse en la prevención y/o tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones, tales como ciertos cánceres, tumores, crecimiento anomalías, trastornos inmunitarios u otras afecciones patológicas mencionadas en el presente documento. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona procedimientos de uso de polipéptidos, moléculas de reconocimiento celular y composiciones farmacéuticas de la presente invención para la administración de epítopos de células T a la vía de presentación del MHC de clase I de las células diana, destrucción selectiva de células, para la administración. materiales exógenos adicionales en células objetivo, para etiquetar el interior de las células objetivo, para recopilar información de diagnóstico y para tratar enfermedades, trastornos y afecciones, tal como se describe en el presente documento.
[0385] Las moléculas ya citotóxicas, tales como, por ejemplo, agentes terapéuticos potenciales que comprenden polipéptidos de la región de la toxina citotóxica, pueden modificarse por ingeniería genética para que sean más citotóxicas y/o tengan citotoxicidades de respaldo redundantes que operan a través de mecanismos completamente diferentes. Estos múltiples mecanismos citotóxicos pueden complementarse entre sí (por ejemplo, proporcionando dos mecanismos de destrucción celular, directos e indirectos, así como mecanismos de inmunoestimulación en el área local), y se respaldan mutuamente de forma redundante (por ejemplo, proporcionando destrucción celular directa en ausencia del otro), y/o proteger contra la resistencia desarrollada (limitando la resistencia a la situación menos probable de la célula maligna o infectada bloqueando dos mecanismos diferentes simultáneamente).
[0386] Además, las moléculas citotóxicas parentales que dependen de las regiones efectoras y/o enzimáticas de la toxina para la citotoxicidad pueden modificarse mediante la mutación de la molécula parental para que sea enzimáticamente inactiva pero para que sea citotóxica a través de la entrega del epítopo de células T al sistema MHC de clase I de una célula diana. y presentación posterior a la superficie de la célula diana. Este enfoque elimina un mecanismo citotóxico mientras agrega otro y agrega la capacidad de inmunoestimulación al área local de la célula diana mediante la presentación del epítopo de la célula T. Además, las moléculas citotóxicas parentales que dependen de las regiones enzimáticas para la citotoxicidad pueden diseñarse para que sean citotóxicas solo a través de la entrega de epítopos de células T al sistema MHC de clase I mediante la inclusión de un epítopo de células T en el dominio enzimático de la molécula parental de manera que la enzima la actividad se reduce o se elimina. Esto permite la modificación en un solo paso de moléculas enzimáticamente citotóxicas, que una vez en un compartimento endosómico tienen la capacidad de encaminarse hacia el citosol y/o ER, en moléculas citotóxicas enzimáticamente inactivas que dependen de la entrega del epítopo de células T al MHC. sistema de clase I de una célula diana y posterior presentación en la superficie de la célula diana para citotoxicidad. Cualquiera de los polipéptidos de la presente invención se puede diseñar en moléculas citotóxicas dirigidas a células con potencial como agentes terapéuticos mediante la unión de una variedad de regiones de unión dirigidas a células que se dirigen a tipos celulares específicos dentro de una mezcla de dos o más tipos de células. , como, por ejemplo, dentro de un organismo.
[0387] En particular, es un objeto de la presente invención proporcionar agentes tales farmacológicamente activas, composiciones y/o procedimientos que tienen determinadas ventajas en comparación con los agentes, composiciones y/o procedimientos que se conocen actualmente en la técnica. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona procedimientos de uso de polipéptidos y proteínas caracterizados por secuencias de polipéptidos y composiciones farmacéuticas de los mismos. Por ejemplo, cualquiera de las secuencias de polipéptidos en SEQ ID NO: 1-60 puede utilizarse específicamente como un componente de las moléculas de reconocimiento celular utilizadas en los siguientes procedimientos.
[0388] La presente divulgación proporciona procedimientos para destruir una célula que comprenden la etapa de poner en contacto la célula, ya sea in vitro o in vivo, con un polipéptido, proteína o composición farmacéutica de la presente invención. Los polipéptidos, proteínas y composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden usarse para destruir un tipo de célula específico al poner en contacto una célula o células con una de las composiciones de materia reivindicadas. En determinadas realizaciones, un polipéptido citotóxico, una proteína o una composición farmacéutica de la presente invención puede usarse para destruir tipos de células específicos en una mezcla de diferentes tipos de células, tales como mezclas que comprenden células cancerosas, células infectadas y/o células hematológicas. En determinadas realizaciones, un polipéptido citotóxico, proteína, o la composición farmacéutica de la presente invención puede usarse para destruir células cancerosas en una mezcla de diferentes tipos de células. En determinadas realizaciones, se puede utilizar un polipéptido, proteína o composición farmacéutica citotóxica de la presente invención para destruir tipos de células específicos en una mezcla de diferentes tipos de células, tales como tejidos previos al trasplante. En determinadas realizaciones, se puede usar un polipéptido, proteína o composición farmacéutica de la presente invención para destruir tipos de células específicos en una mezcla de tipos de células, como material tisular de preadministración con fines terapéuticos. En determinadas realizaciones, se puede utilizar un polipéptido, proteína o composición farmacéutica de la presente invención para destruir selectivamente células infectadas por virus o microorganismos, o de otro modo matar selectivamente las células que expresan una biomolécula diana extracelular particular, tal como una biomolécula de la superficie celular. Los polipéptidos, proteínas y composiciones farmacéuticas de la presente invención tienen aplicaciones variadas, que incluyen, por ejemplo, usos para agotar tipos de células no deseadas de tejidos in vitro o in vivo, usos para modular respuestas inmunitarias para tratar la enfermedad de injerto contra huésped, usos como agentes antivirales, usos como agentes antiparasitarios y usos en la purga de tejidos de trasplante de tipos celulares no deseados.
[0389] En determinadas realizaciones, un polipéptido citotóxico, proteínas, o composición farmacéutica de la presente invención, solo o en combinación con otros compuestos o composiciones farmacéuticas, pueden mostrar actividad de las células-kill potente cuando se administra a una población de células, in vitro o in vivo en un sujeto tal como en un paciente que necesita tratamiento. Al dirigirse a la administración de regiones de toxinas enzimáticamente activas y epítopos de células T utilizando regiones de unión de alta afinidad a tipos de células específicas, esta potente actividad de destrucción de células se puede restringir para destruir específica y selectivamente ciertos tipos de células dentro de un organismo, como ciertos tipos de cáncer células, células neoplásicas, células malignas, células tumorales no malignas o células infectadas.
[0390] La presente divulgación proporciona un procedimiento para destruir una célula en un paciente en necesidad del mismo, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar al paciente al menos un polipéptido o proteína citotóxicos de la presente invención, o una composición farmacéutica del mismo.
[0391] Determinadas realizaciones del polipéptido citotóxico, proteína o composiciones farmacéuticas de los mismos pueden usarse para destruir una célula cancerosa en un paciente mediante el reconocimiento de una biomolécula extracelular que se encuentra acoplada físicamente con una célula cancerosa o tumoral. Los términos "célula cancerosa" o "célula cancerosa" se refieren a diversas células neoplásicas que crecen y se dividen de una manera anormalmente acelerada y serán claras para los expertos. El término "célula tumoral" incluye tanto células malignas como no malignas. Generalmente, los cánceres y/o tumores se pueden definir como enfermedades, trastornos o afecciones que son susceptibles de tratamiento y/o prevención. Los cánceres y tumores (malignos o no malignos) que se componen de células cancerosas y/o células tumorales que pueden beneficiarse de los procedimientos y composiciones de la presente invención serán claros para el experto en la materia. Las células neoplásicas a menudo se asocian con uno o más de los siguientes: crecimiento no regulado, falta de diferenciación, invasión tisular local, angiogénesis y metástasis.
[0392] Determinadas realizaciones del polipéptido citotóxico o molécula dirigida a células de la presente invención, o composiciones farmacéuticas de los mismos, puede ser utilizado para destruir una célula inmune (ya sea sana o maligna) en un paciente mediante el reconocimimento de una biomolécula extracelular que se encuentra acoplada físicamente con una célula inmunitaria.
[0393] Determinadas realizaciones del polipéptido citotóxico o molécula de reconocimiento celular de la presente invención, o composiciones farmacéuticas de los mismos, se pueden utilizar para destruir una célula infectada en un paciente mediante el reconocimiento de una biomolécula extracelular que se encuentra acoplada físicamente con una célula infectada.
[0394] Está dentro del alcance de la presente divulgación utilizar la molécula de reconocimiento celular de la presente invención o composición farmacéutica del mismo para los fines de purga poblaciones de células del paciente (por ejemplo, médula ósea) de células malignas, neoplásicas, o en cualquier caso de células T y/o células B no deseadas y, a continuación, reinfundir el material empobrecido de células T y/o células B en el paciente (véase, por ejemplo, van Heeckeren W et al., Br J Haematol 132: 42-55 (2006); (véase, por ejemplo, Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42 (2012)).
[0395] Está dentro del alcance de la presente divulgación utilizar la molécula de reconocimiento celular de la presente invención o composición farmacéutica de la misma para los fines de agotamiento ex vivo de las células T y/o células B a partir de poblaciones de células aisladas extraídas de un paciente. En un ejemplo no limitante, la molécula de reconocimiento celular de la divulgación se puede usar en un procedimiento para la profilaxis del rechazo de trasplantes de órganos y/o tejidos en el que el órgano o tejido del donante se perfunde antes del trasplante con una molécula citotóxica dirigida a células de la presente invención o una composición farmacéutica de la misma para purgar el órgano de células T y/o células B del donante (véase, por ejemplo, Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42 (2012)).
[0396] También está dentro del alcance de la presente divulgación utilizar la molécula de reconocimiento celular de la presente invención o composición farmacéutica del mismo para los fines de agotamiento de células T y/o células B a partir de una población de células de donantes como profilaxis contra enfermedad de injerto contra huésped e inducción de tolerancia en un paciente que se somete a un trasplante de médula ósea o de células madre (véase, por ejemplo, van Heeckeren W et al., Br J Haematol 132: 42-55 (2006); (véase, por ejemplo, Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42 (2012)).
[0397] Determinadas realizaciones del polipéptido citotóxico o molécula de reconocimiento celular de la presente invención, o composiciones farmacéuticas de los mismos, se pueden utilizar para destruir una célula infectada en un paciente mediante el reconocimiento de una biomolécula extracelular que se encuentra acoplada físicamente con una célula infectada.
[0398] Determinadas realizaciones de las moléculas de reconocimiento celular de la presente divulgación, o composiciones farmacéuticas de las mismas, pueden usarse para "sembrar" un locus dentro de un organismo con células presentadoras de péptido-epítopo de células T no propias para activar el sistema inmunológico para vigilar el lugar. En determinadas realizaciones adicionales de este procedimiento de "siembra" de la presente divulgación, el locus es una masa tumoral o un sitio de tejido infectado. En realizaciones preferidas de este procedimiento de "siembra" de la presente divulgación, el péptido-epítopo de células T no propio se selecciona del grupo que consiste en: péptidos no presentados ya por las células diana de la molécula de reconocimiento celular, péptidos no presentes dentro de cualquier proteína expresada por la célula diana, péptidos no presentes dentro del proteoma de la célula diana,
[0399] Este procedimiento de "siembra" funciona para marcar una o más células diana dentro de un cordado con uno o más epítopos de células T presentados de MHC de clase I para el reconocimiento por células T efectoras y la activación de respuestas inmunes aguas abajo. Al explotar las funciones de internalización celular, enrutamiento intracelular y entrega del epítopo de células T de las moléculas de la presente invención dirigidas a células, las células diana que muestran el epítopo de células T administradas se aprovechan para inducir el reconocimiento de la célula diana presentadora por parte del huésped T -células e inducción de respuestas inmunes adicionales, incluida la muerte de células diana por CTL. Este procedimiento de "siembra" de usar una molécula de reconocimiento celular de la presente invención puede proporcionar un efecto de vacunación temporal induciendo respuestas inmunes adaptativas para atacar las células dentro del microambiente sembrado, como, por ejemplo, una masa tumoral o un sitio de tejido infectado, ya sea que presente un epítopo (s) de células T administrado por una molécula de reconocimiento celular o no. Este procedimiento de "siembra" también puede inducir la ruptura de la inmunotolerancia a una población de células diana, una masa tumoral y/o un sitio de tejido infectado dentro de un organismo.
[0400] Además, la presente invención proporciona un polipéptido, molécula de reconocimiento celular o composición farmacéutica de la presente invención para su uso como medicamento (por ejemplo, para tratar una enfermedad, trastorno o afección en un paciente usando una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos uno de los citotóxicos). polipéptido o molécula de reconocimiento celular de la presente invención, o una composición farmacéutica del mismo), como se define en las reivindicaciones. Las enfermedades, los trastornos y las afecciones contempladas que pueden tratarse incluyen cánceres, tumores, trastornos inmunitarios e infecciones microbianas. La administración de una "dosis terapéuticamente eficaz" de un compuesto de la presente invención puede dar como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad, o una prevención de la discapacidad o incapacidad debido a la afección de la enfermedad.
[0401] La cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención dependerá de la vía de administración, el tipo de mamífero que se esté tratando y las características físicas del paciente específico en consideración. Estos factores y su relación con la determinación de esta cantidad son bien conocidos por los médicos expertos en la técnica. Esta cantidad y el procedimiento de administración se pueden adaptar para lograr una eficacia óptima y pueden depender de factores tales como el peso, la dieta, la medicación concurrente y otros factores, bien conocidos por los expertos en la técnica médica. Los tamaños de dosis y el régimen de dosificación más apropiados para uso humano pueden guiarse por los resultados obtenidos por la presente invención y pueden confirmarse en ensayos clínicos diseñados apropiadamente. Se puede determinar un protocolo de dosificación y tratamiento eficaz por medios convencionales, comenzando con una dosis baja en animales de laboratorio y luego aumentando la dosis mientras se controlan los efectos, y también variando sistemáticamente el régimen de dosificación. Un médico puede tener en cuenta numerosos factores al determinar una dosis óptima para un sujeto dado. El experto en la materia conoce tales consideraciones.
[0402] Una vía de administración aceptable puede referirse a cualquier vía de administración conocida en la técnica, incluyendo, pero no limitado a aerosol, enteral, nasal, oftálmica, oral, parenteral, rectal, vaginal, o transdérmica (por ejemplo, la administración tópica de una crema, gel o pomada, o mediante un parche transdérmico). La "administración parenteral" se asocia típicamente con la inyección en o en comunicación con el sitio de acción previsto, incluyendo infraorbital, infusión, intraarterial, intracapsular, intracardíaca, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapulmonar, intraespinal, intraesternal, intratecal, intrauterina, intravenosa, subaracnoidea administración subcapsular, subcutánea, transmucosa o transtraqueal.
[0403] Para la administración de una composición farmacéutica de la presente invención, el intervalo de dosis será generalmente de aproximadamente 0,0001 a 100 miligramos por kilogramo (mg/kg), y más, por lo general de 0,01 a 5 mg/kg, del cuerpo huésped peso. Las dosis de ejemplo pueden ser 0,25 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1 a 10 mg/kg. Un régimen de tratamiento de ejemplo es una administración una o dos veces al día, o una administración una o dos veces por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada dos o tres meses o una vez cada tres a 6 meses. Las dosis pueden ser seleccionadas y reajustadas por el profesional sanitario especializado según se requiera para maximizar el beneficio terapéutico para un paciente en particular.
[0404] Las composiciones farmacéuticas de la presente invención típicamente serán administrados al mismo paciente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser, por ejemplo, de 2 a 5 días, semanales, mensuales, cada dos o tres meses, cada seis meses o anualmente. Los intervalos entre administraciones también pueden ser irregulares, basándose en la regulación de los niveles sanguíneos u otros marcadores en el sujeto o paciente. Los regímenes de dosificación para un compuesto de la presente invención incluyen la administración intravenosa de 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal con el compuesto administrado cada dos a cuatro semanas para seis dosis, luego cada tres meses a 3 mg/kg de peso corporal o 1 mg/kg de peso corporal.
[0405] Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse mediante una o más vías de administración, usando uno o más de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración de polipéptidos, proteínas y composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, por ejemplo, vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenteral, por ejemplo mediante inyección o infusión. En otras realizaciones, un polipéptido, proteína o composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.
[0406] Los polipéptidos terapéuticos, proteínas, o composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar con una o más de una variedad de dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización, una composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja. En la técnica se encuentran ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención, que incluyen, por ejemplo, bombas de microinfusión implantables para administración de velocidad controlada; dispositivos para administrar a través de la piel; bombas de infusión para la administración a una velocidad de infusión precisa; dispositivos de infusión implantables de flujo variable para la administración continua de fármacos; y sistemas de administración de fármacos osmóticos. Estos y otros implantes, sistemas de administración y módulos de este tipo son conocidos por los expertos en la técnica.
[0407] Un polipéptido, proteína o composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. Una terapia de combinación puede incluir una molécula citotóxica dirigida a células de la presente invención o una composición farmacéutica de la misma combinada con al menos otro agente terapéutico seleccionado en base al paciente, enfermedad o afección particular que se va a tratar. Ejemplos de otros de tales agentes incluyen, entre otros, un agente citotóxico, anticanceroso o quimioterapéutico, un agente antiinflamatorio o antiproliferativo, un agente antimicrobiano o antivírico, factores de crecimiento, citocinas, un analgésico, una molécula pequeña terapéuticamente activa o polipéptido, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo clásico o un fragmento del mismo, o una molécula de ácido nucleico que modula una o más rutas de señalización, y agentes terapéuticos de modulación similar que pueden complementar o, en cualquier caso, son ventajosos en régimen de tratamiento terapéutico o profiláctico.
[0408] El tratamiento de un paciente con un polipéptido, proteína o composición farmacéutica de la presente invención conduce preferiblemente a la muerte celular de las células diana y/o la inhibición del crecimiento de las células diana. Como tales, las moléculas citotóxicas dirigidas a células de la presente invención, y las composiciones farmacéuticas que las comprenden, serán útiles en procedimientos para tratar una variedad de trastornos patológicos en los que matar o agotar las células diana puede ser beneficioso, tales como, entre otros, el cáncer. , tumores, otras anomalías del crecimiento, trastornos inmunitarios y células infectadas. La presente divulgación proporciona procedimientos para suprimir la proliferación celular y tratar trastornos celulares, que incluyen neoplasias, células B hiperactivas y células T hiperactivas.
[0409] En determinadas realizaciones, polipéptidos, proteínas, y las composiciones farmacéuticas de la presente invención puede usarse para tratar o prevenir cánceres, tumores (malignos y no malignos), trastornos del sistema inmune, y las infecciones microbianas. En un aspecto adicional, el procedimiento ex vivo anterior se puede combinar con el procedimiento in vivo anterior para proporcionar procedimientos de tratamiento o prevención del rechazo en receptores de trasplante de médula ósea y para lograr tolerancia inmunológica.
[0410] En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona procedimientos para tratar tumores malignos o neoplasmas y otros cánceres de células sanguíneas asociadas en un sujeto mamífero, como un ser humano, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína citotóxica o composición farmacéutica de la presente invención.
[0411] Los polipéptidos citotóxicos, células de metas de moléculas, y composiciones farmacéuticas de la presente invención han variado aplicaciones, incluyendo, por ejemplo, usos en la eliminación de células T no deseadas, usos en la modulación de respuestas inmunes a enfermedad delicia del injerto contra el huésped, usos como agentes antivirales, usos como agentes antimicrobianos y usos en la purga de tejidos de trasplante de tipos de células no deseadas. Los polipéptidos, proteínas y composiciones farmacéuticas de la presente invención son habitualmente agentes antineoplásicos, lo que significa que son capaces de tratar y/o prevenir el desarrollo, maduración o diseminación de células neoplásicas o malignas inhibiendo el crecimiento y/o causando la muerte de células cancerosas o tumorales.
[0412] En determinadas realizaciones de la descripción, un polipéptido, proteína o composición farmacéutica de la presente invención se usa para tratar un B-por células, por células de plasma o el anticuerpo de la enfermedad o trastorno mediado, tal como por ejemplo leucemia, linfoma , mieloma, enfermedades relacionadas con el virus de la inmunodeficiencia humana, amiloidosis, síndrome urémico hemolítico, poliarteritis, choque séptico, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, colitis ulcerosa, psoriasis, asma, síndrome de Sjogren, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de injerto, diabetes, vasculitis, esclerodermia y lupus eritematoso sistémico.
[0413] En otro aspecto, determinadas realizaciones de los polipéptidos, proteínas y composiciones farmacéuticas de la presente invención son agentes antimicrobianos, lo que significa que son capaces de tratar y/o prevenir la adquisición, el desarrollo o las consecuencias de infecciones microbiológicas patógenas, tales como causada por virus, bacterias, hongos, priones o protozoos.
[0414] Está dentro del alcance de la presente divulgación para proporcionar una profilaxis o el tratamiento de enfermedades o afecciones mediadas por células T o células B mediante la administración de la proteína citotóxica o la presente invención, o una composición farmacéutica del mismo, a un paciente para el propósito de matar las células T o las células B en el paciente. Este uso es compatible con la preparación o acondicionamiento de un paciente para trasplante de médula ósea, trasplante de células madre, trasplante de tejido o trasplante de órganos, independientemente de la fuente del material trasplantado, por ejemplo, fuentes humanas o no humanas.
[0415] Está dentro del alcance de la presente divulgación proporcionar un receptor de médula ósea para la profilaxis o tratamiento de la enfermedad de huésped contra injerto a través de las células T de huésped-destrucción de células específicas que utilizan un polipéptido citotóxico, proteína o composición farmacéutica de la presente invención.
[0416] Los polipéptidos, proteínas y composiciones farmacéuticas citotóxicas de la presente invención se pueden utilizar para tratar el cáncer que comprende administrar a un paciente, que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido, proteína o composición farmacéutica citotóxica de la presente invención, tal como se define. en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, el cáncer que se está tratando se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de hueso (como mieloma múltiple o sarcoma de Ewing), cáncer de mama, cáncer del sistema nervioso central/periférico (como cáncer de cerebro, neurofibromatosis o glioblastoma), cáncer gastrointestinal (como cáncer de estómago o cáncer colorrectal), cáncer de células germinales (como cáncer de ovario y cáncer testicular, cáncer glandular (como cáncer de páncreas, cáncer de paratiroides, cancer (such as multiple myeloma or Ewing's sarcoma), breast cancer, central/peripheral nervous system cancer (such as brain cancer, neurofibromatosis, or glioblastoma), gastrointestinal cancer (such as stomach cancer or colorectal cancer), germ cell cancer (such as ovarian cancers and testicular cancers, glandular cancer (such as pancreatic cancer, parathyroid cancer, pheochromocytoma, salivary gland cancer, or thyroid cancer), head-neck cancer (such as nasopharyngeal cancer, oral cancer, or pharyngeal cancer), hematological cancers (such as leukemia, lymphoma, or myeloma), kidney-urinary tract cancer (such as renal cancer and bladder cancer), liver cancer, lung/pleura cancer (such as mesothelioma, small cell lung carcinoma, or non-small cell lung carcinoma), prostate cancer, sarcoma (such as angiosarcoma, fibrosarcoma, Kaposi's sarcoma, or synovial sarcoma), skin cancer (such as basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, or melanoma), and uterine cancer.
[0417] Los polipéptidos, proteínas y composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden utilizar para tratar un trastorno inmunológico que comprende administrar a un paciente, que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína citotóxica o una composición farmacéutica de la presente invención, como se define en las reclamaciones. En determinadas realizaciones de los procedimientos de la presente divulgación, el trastorno inmunológico está relacionado con una inflamación asociada con una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: amiloidosis, espondilitis anquilosante, asma, enfermedad de Crohn, diabetes, rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huésped, tiroiditis de Hashimoto, síndrome urémico hemolítico, enfermedad relacionada con el VIH, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, poliarteritis, psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, escleroderma, choque séptico, síndrome de Sjogren, colitis ulcerosa y vasculitis.
[0418] Entre determinadas realizaciones de la presente invención es el uso del polipéptido o molécula dirige a una célula de la presente invención como un componente de una composición farmacéutica o medicamento para el tratamiento o la prevención de un cáncer, tumor, trastorno inmune, y/o microbiana infección, como se define en las reclamaciones. Por ejemplo, los trastornos inmunitarios que se presentan en la piel de un paciente pueden tratarse con tal medicamento en un esfuerzo por reducir la inflamación. En otro ejemplo, los tumores de piel pueden tratarse con tal medicamento en un esfuerzo por reducir el tamaño del tumor o eliminarlo por completo.
[0419] Ciertos polipéptidos citotóxicos, proteínas y composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden usarse en aplicaciones de neurocirugía molecular tales como inmunolesiones y rastreo neuronal (ver, Wiley R, Lappi D, Adv Drug Deliv Rev 55: 1043-54 (2003), para revisión). Por ejemplo, el dominio de direccionamiento puede seleccionarse o derivarse de varios ligandos, tales como neurotransmisores y neuropéptidos, que se dirigen a tipos de células neuronales específicos uniendo receptores de superficie neuronal, tales como un receptor acoplado a proteína G específico de circuito neuronal. De manera similar, el dominio de direccionamiento puede seleccionarse o derivarse de anticuerpos que se unen a receptores de superficie neuronal. Debido a que determinadas toxinas dirigen de manera robusta su propio transporte axonal retrógrado, ciertos citotóxicos, Las moléculas de reconocimiento celular de la presente invención se pueden usar para destruir una neurona (s) que expresa la diana extracelular en un sitio de inyección de proteína citotóxica distante del cuerpo celular (ver Llewellyn-Smith I et al., J Neurosci Methods 103: 83 -90 (2000)). Estos polipéptidos y proteínas citotóxicos dirigidos específicos del tipo de células neuronales tienen usos en la investigación de la neurociencia, como para dilucidar los mecanismos de las sensaciones (ver, por ejemplo, Mishra S, Hoon M, Science 340: 968-71 (2013), y crear sistemas modelo de enfermedades neurodegenerativas, como el Parkinson y el Alzheimer (véase, por ejemplo, Hamlin A et al., PLoS One e53472 (2013)).
[0420] Entre determinadas realizaciones de la presente divulgación es un procedimiento de uso de un polipéptido, proteína, composición farmacéutica y/o composición de diagnóstico de la presente invención a la etiqueta o detectar los interiores de las células neoplásicas y/o tipos de células inmunes. En base a la capacidad de ciertos polipéptidos, proteínas y composiciones farmacéuticas de la presente invención para entrar en tipos celulares específicos y en ruta dentro de las células mediante transporte intracelular retrógrado, los compartimentos interiores de tipos celulares específicos se marcan para su detección. Esto se puede realizar en células in situ dentro de un paciente o en células y tejidos extraídos de un organismo, por ejemplo, material de biopsia.
[0421] Entre determinadas formas de realización de la presente divulgación se encuentra un procedimiento de uso de un polipéptido, proteína, composición farmacéutica y/o composición de diagnóstico de la presente invención para detectar la presencia de un tipo de célula con el fin de recopilar información sobre enfermedades, afecciones y/o trastornos. El procedimiento comprende poner en contacto una célula con una cantidad suficiente para el diagnóstico de una molécula citotóxica para detectar la molécula citotóxica mediante un ensayo o técnica de diagnóstico. La frase "cantidad suficiente para el diagnóstico" se refiere a una cantidad que proporciona una detección adecuada y una medición precisa para fines de recopilación de información mediante el ensayo o técnica de diagnóstico particular utilizada. Generalmente, la cantidad suficiente para el diagnóstico para el uso diagnóstico in vivo del organismo completo será una dosis no acumulativa de entre 0°C. De 1 mg a 100 mg de la molécula de reconocimiento celular unida al agente promotor de la detección de la presente invención por kg de sujeto por sujeto. Normalmente, la cantidad de polipéptido o molécula de reconocimiento celular de la presente invención utilizada en estos procedimientos de recopilación de información será lo más baja posible siempre que sea todavía una cantidad suficiente para el diagnóstico. Por ejemplo, para la detección in vivo en un organismo, la cantidad de polipéptido, proteína o composición farmacéutica de la presente invención administrada a un sujeto será tan baja como sea posible.
[0422] El direccionamiento específico de tipo celular de polipéptidos y moléculas de direccionamiento celular de la presente invención combinados con agentes promotores de la detección proporciona una manera de detectar y visualizar células acopladas físicamente con una biomolécula diana extracelular de una región de unión de la molécula de la presente invención. La formación de imágenes de células usando los polipéptidos o moléculas de direccionamiento celular de la presente invención puede realizarse in vitro o in vivo mediante cualquier técnica adecuada conocida en la técnica. La información de diagnóstico se puede recopilar usando varios procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen la formación de imágenes de todo el cuerpo de un organismo o el uso de muestras ex vivo tomadas de un organismo. El término "muestra" utilizado en este documento se refiere a cualquier número de cosas, pero sin limitarse a, fluidos tales como sangre, orina, suero, linfa, saliva, secreciones anales, secreciones vaginales y semen. y tejidos obtenidos mediante procedimientos de biopsia. Por ejemplo, se pueden utilizar varios agentes promotores de la detección para la formación de imágenes de tumores in vivo no invasivos mediante técnicas como la formación de imágenes por resonancia magnética (IRM), procedimientos ópticos (como las imágenes directas, fluorescentes y bioluminiscentes), la tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), ultrasonido, tomografía computarizada de rayos X y combinaciones de los anteriores (ver, Kaur S et al., Cancer Lett 315: 97-111 (2012), para revisión).
[0423] Entre ciertas realizaciones de la presente divulgación está un procedimiento de uso de un polipéptido, proteína o composición farmacéutica de la presente invención como una composición de diagnóstico para marcar o detectar los interiores de cáncer, tumor, y/o tipos de células inmunes (ver por ejemplo, Koyama Y et al., Clin Cancer Res 13: 2936-45 (2007); Ogawa M et al., Cancer Res 69: 1268-72 (2009); Yang L et al., Small 5: 235-43 ( 2009)). En base a la capacidad de ciertos polipéptidos, proteínas y composiciones farmacéuticas de la presente invención para entrar en tipos de células específicas y enrutarse dentro de las células mediante transporte intracelular retrógrado, los compartimentos interiores de tipos de células específicss se marcan para su detección. Esto se puede realizar en células in situ dentro de un paciente o en células y tejidos extraídos de un organismo, por ejemplo, material de biopsia.
[0424] Las composiciones de diagnóstico de la presente invención se pueden usar para caracterizar una enfermedad, trastorno, o afección como potencialmente tratable mediante una composición farmacéutica relacionada de la presente invención. Determinadas composiciones de materia de la presente invención pueden usarse para determinar si un paciente pertenece a un grupo que responde a una estrategia terapéutica que hace uso de un compuesto, composición o procedimiento relacionado de la presente invención, tal como se describe en este documento, o es adecuado para usar un dispositivo de administración de la presente invención.
[0425] Las composiciones de diagnóstico de la presente invención se pueden usar después de detectar una enfermedad, por ejemplo un cáncer, con el fin de caracterizarla mejor, tal como para monitorizar metástasis distantes, la heterogeneidad, y la etapa de progresión del cáncer. La evaluación fenotípica del trastorno de la enfermedad o la infección puede ayudar en el pronóstico y la predicción durante la toma de decisiones terapéuticas. En la reaparición de la enfermedad, se pueden usar ciertos procedimientos de la presente invención para determinar si es un problema local o sistémico.
[0426] Las composiciones de diagnóstico de la presente invención se pueden usar para evaluar las respuestas a a un agente o agentes terapéuticos independientemente del tipo de agente terapéutico, por ejemplo, molécula pequeña, fármaco biológico, o terapia basada en células. Por ejemplo, determinadas realizaciones de los diagnósticos de la presente invención pueden usarse para medir cambios en el tamaño del tumor, cambios en las poblaciones de células positivas al antígeno, incluido el número y distribución, o monitorear un marcador diferente al antígeno dirigido por una terapia que ya se está administrando a un paciente. (Véase Smith-Jones P et al., Nat. Biotechnol 22: 701-6 (2004); Evans M et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108: 9578-82 (2011)).
[0427] Determinadas realizaciones del procedimiento usado para detectar la presencia de un tipo de célula pueden usarse para recopilar información sobre enfermedades, trastornos y afecciones, tales como, por ejemplo, cáncer de hueso (tal como mieloma múltiple o sarcoma de Ewing), cáncer de mama, cáncer central/cáncer del sistema nervioso periférico (como cáncer de cerebro, neurofibromatosis o glioblastoma), cáncer gastrointestinal (como cáncer de estómago o cáncer colorrectal), cáncer de células germinales (como cáncer de ovario y cáncer testicular, cáncer glandular (como cáncer de páncreas, cáncer de paratiroides) , feocromocitoma, cáncer de glándulas salivales o cáncer de tiroides), cáncer de cabeza y cuello (como cáncer de nasofaringe, cáncer oral o cáncer de faringe), cánceres hematológicos (como leucemia, linfoma o mieloma), cáncer de riñón-tracto urinario (como como cáncer de riñón y cáncer de vejiga), cáncer de hígado,cáncer de pulmón/pleura (como mesotelioma, carcinoma de pulmón de células pequeñas o carcinoma de pulmón de células no pequeñas), cáncer de próstata, sarcoma (como angiosarcoma, fibrosarcoma, sarcoma de Kaposi o sarcoma sinovial), cáncer de piel (como carcinoma de células basales , carcinoma de células escamosas o melanoma), cáncer de útero, SIDA, amiloidosis, espondilitis anquilosante, asma, autismo, cardiogénesis, enfermedad de Crohn, diabetes, eritematoso, gastritis, rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, síndrome urémico hemolítico, enfermedad relacionada con el VIH, lupus eritematoso, trastornos linfoproliferativos, esclerosis múltiple, miastenia grave, neuroinflamación, poliarteritis, psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, esclerodermia, choque séptico, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso sistémicocolitis ulcerosa, vasculitis, proliferación celular, inflamación, activación de leucocitos, adhesión de leucocitos, quimiotaxis de leucocitos, maduración de leucocitos, migración de leucocitos, diferenciación neuronal, leucemia linfoblástica aguda (LLA), T leucemia/linfoma linfocítico agudo (LLA), leucemia mieloide aguda leucemia mieloide (AML), leucemia linfocítica crónica de células B (CLL-B), linfoma prolinfocítico de células B, linfoma de Burkitt (BL), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mielógena crónica (CML-BP), leucemia mieloide crónica ( LMC), linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas (HCL), linfoma de Hodgkin (LH), linfoma intravascular de células B grandes, granulomatosis linfomatoide, linfoma linfoplasmocítico, linfoma MALT, linfoma de células del manto, mieloma múltiple (MM ), leucemia de células asesinas naturales,linfoma nodal de células B marginales, linfoma no Hodgkin (LNH), leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma, linfoma de derrame primario, leucemia pro-linfocítica, leucemia promielocítica, linfoma de linfocitos pequeños, linfoma esplénico de zona marginal, linfoma de células T (TCL), enfermedad de cadenas pesadas, gammapatía monoclonal, enfermedad por depósito de inmunoglobulina monoclonal, síndromes mielodesplásicos (MDS), mieloma múltiple latente y macroglobulinemia de Waldenstrom.y macroglobulinemia de Waldenstrom.y macroglobulinemia de Waldenstrom.
[0428] En determinadas realizaciones, los polipéptidos y moléculas de reconocimiento celular de la presente invención, o composiciones farmacéuticas de los mismos, se utilizan tanto para el diagnóstico como el tratamiento, o para el diagnóstico solo. En algunas situaciones, sería deseable determinar o verificar la (s) variante (s) de HLA y/o los alelos de HLA expresados en el sujeto y/o tejido enfermo del sujeto, tal como, por ejemplo, un paciente que necesita tratamiento, antes de seleccionar un polipéptido o molécula de reconocimiento celular de la presente invención para tratamiento.
[0429] La presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos, de 1) polipéptidos hiperinmunizados de células T CD8+ y/o desinmunizados de células B/células T CD4+, 2 ) polipéptidos derivados de toxinas que presentan epítopo de células T CD8+, y 3) proteínas dirigidas a células selectivamente citotóxicas que comprenden los polipéptidos mencionados anteriormente y que pueden dirigirse específicamente a ciertos tipos de células.
EJEMPLOS
[0430] Los siguientes ejemplos demuestran determinadas realizaciones de la presente invención. Sin embargo, debe entenderse que estos ejemplos tienen únicamente fines ilustrativos y no pretenden, ni deben interpretarse, que sean totalmente definitivos en cuanto a las condiciones y alcance de esta invención, que es como se define en las reivindicaciones. Los experimentos en los siguientes ejemplos se llevaron a cabo usando técnicas estándar, que son bien conocidas y rutinarias para los expertos en la técnica, excepto donde se describa lo contrario en detalle.
[0431] La presentación de un péptido epítopo inmunogénico de las células T por el sistema de MHC de clase I reconoce la célula presentadora para destruir por lisis mediada por CTL y también provoca la estimulación inmune en el microambiente local. Mediante la ingeniería genética de secuencias de epítopos inmunogénicos dentro de componentes de polipéptidos efectores de toxinas de agentes terapéuticos de internalización de células diana, se puede lograr la administración y presentación dirigidas de antígenos inmunoestimuladores. La presentación de antígenos inmunoestimuladores no propios, tales como, por ejemplo, antígenos virales conocidos con alta inmunogenicidad, por células diana señala a otras células inmunes para destruir las células diana así como para reclutar más células inmunes en el área.
[0432] En los ejemplos, los epítopos de células T fueron integrados o insertados en los polipéptidos efectores de la toxina Shiga y polipéptidos efectoras toxina de la difteria, que pueden servir como componentes de moléculas de internalización de células diana, mediante el diseño de regiones internas a uno comprender o más epítopos de células T. Por tanto, no hay fusión terminal de un resto de aminoácido, péptido o componente polipeptídico adicional con el polipéptido de partida.
[0433] En los ejemplos, la mayoría de los epítopos de células T fueron integrados en componentes polipeptídicos efectores de toxina de las moléculas de la internalización de células diana mediante ingeniería con múltiples sustituciones de aminoácidos, pero sin cambiar el número total de residuos de aminoácidos en los polipéptidos efectores de toxina de ejemplo en comparación con el polipéptido efector de la toxina parental. Por lo tanto, para todos los polipéptidos efectores de la toxina de la difteria y la mayoría de los polipéptidos efectores de la toxina Shiga probados en los Ejemplos, no hubo inserción de aminoácidos adicionales, sino solo sustituciones de los aminoácidos existentes que dieron como resultado el mantenimiento de la longitud original del polipéptido parental.
[0434] Se crearon nuevos polipéptidos efectores derivados de toxinas, que pueden funcionar como componentes de moléculas de reconocimiento celular (tales como, por ejemplo, inmunotoxinas y fusiones ligando-toxina), que pueden promover la internalización celular, el enrutamiento subcelular al citosol y el suministro del epítopo de células T al citosol para su presentación por la vía de clase MHC I a la superficie de la célula diana para señalizar a los CTL.
[0435] Ciertos polipéptidos efectores de toxina derivados novedosos fueron también el documento DE-inmunizaron mediante la incorporación o la inserción de un epítopo de células T en una región epítopo de células B usando uno o más procedimientos descritos en este documento. Para desinmunizar simultáneamente y proporcionar la presentación del epítopo de células T en la superficie de la célula diana dentro de la misma región polipeptídica de toxina, las regiones del epítopo de células B predichas se alteraron reemplazándolas con epítopos de células T conocidos que se predice que se unirán a la clase MHC Yo moléculas. Se analizaron secuencias de aminoácidos de polipéptidos derivados de toxinas para predecir epítopos de células B antigénicos y/o inmunogénicos in silico. Se ensayaron experimentalmente varios polipéptidos derivados de toxina embebidos en epítopos de células T para determinar la retención de las funciones efectoras de la toxina.
[0436] Se ensayó la conservación de las funciones efectoras de toxina de polipéptidos efectores de toxina que presentan epítopo de células T de ejemplo de la presente invención y se comparó con polipéptidos efectores de toxina que comprenden secuencias de polipéptidos de toxina de tipo salvaje, denominadas en el presente documento como "tipo salvaje" o "WT" que no comprendían ninguna modificación o mutación interna en la región efectora de la toxina.
[0437] Los siguientes ejemplos de polipéptidos derivados de la toxina Shiga que presentan epítopo de células T CD8+ de ejemplo demuestran procedimientos para proporcionar simultáneamente para el suministro de epítopo de células T para la presentación de MHC de clase I al tiempo que conserva una o más funciones efectoras de toxina Shiga. Además, los siguientes ejemplos de polipéptidos de la presente invención que presentan epítopo de células T CD8+ de ejemplo y/o polipéptidos derivados de toxina Shiga desinmunizados de células B/células T CD4+ de la presente invención demuestran procedimientos para proporcionar simultáneamente 1) suministro de epítopos de células T para la presentación de MHC de clase I, 2) conservar una o más funciones efectoras de la toxina y 3) desinmunización de la región efectora de la toxina.
[0438] Las moléculas de reconocimiento celular de ejemplo de la presente invención se unieron a biomoléculas diana expresadas por tipos de células diana y entraron en las células diana. Las proteínas de reconocimiento celular de ejemplo internalizadas de la presente invención enrutaron eficazmente sus regiones efectoras de toxina desinmunizadas al citosol y suinistraron eficazmente epítopos de células T inmunogénicas a la vía del MHC de clase I de las células diana dando como resultado la presentación del péptido del epítopo de células T en la superficie de las regiones de las células diana.
Ejemplo 1. Integración o inserción de epítopos de células T dentro de componentes polipeptídicos de moléculas de reconocimiento celular
[0439] En este ejemplo, las secuencias de epítopos de células T se seleccionaron de proteínas virales humanas y se integraron o insertaron en los polipéptidos efectores de la toxina Shiga. En algunas variantes, el epítopo de células T se integró o insertó en regiones del epítopo de células B con el fin de alterar los epítopos de células B de origen natural. En otras variantes, el epítopo de células T está integrado en regiones que no se prevé que contengan ningún epítopo de células B y, por tanto, no se prevé que estas modificaciones alteren ningún epítopo de células B dominante. En algunas de las variantes anteriores, el epítopo de células T está integrado en regiones que se prevé que alteren la actividad catalítica.
A. Selección de péptidos de epítopos de células T para integración o inserción
[0440] En este ejemplo, se seleccionaron péptidos epítopos de células T conocidos para integrar e insertar en regiones efectoras de la toxina Shiga que tienen la capacidad intrínseca para enrutar intracelularmente al citosol. Por ejemplo, existen muchas proteínas virales inmunogénicas conocidas y componentes peptídicos de proteínas virales de virus humanos, tales como los virus de la gripe A humana y los virus CMV humanos. Se eligieron péptidos virales inmunogénicos que son capaces de unirse a moléculas de MHC de clase I humanas y/o provocar respuestas mediadas por CTL humanos.
[0441] Se puntuaron siete péptidos que se predice que son epítopos de células T (SEQ ID NO: 4-10) por la capacidad de unirse a variantes de antígeno leucocitario humano (HLA) de clase I del MHC humano habitual codificadas por los alelos más prevalentes en poblaciones humanas utilizando la herramienta de consenso de predicción de unión de MHC-I y los parámetros recomendados del recurso de análisis de la base de datos de epítopos inmunes (IEDB) (Kim Y et al., Nucleic Acids Res 40: W252-30 (2012)). El análisis de predicción IEDB Mh C-I de unión predijo la "An N afinidad" - un estimado de la afinidad de unión entre el péptido de entrada y la variante de HLA humano seleccionado donde IC 50 valores de menos de 50 nanomolar (nM) se consideran de alta afinidad, IC 50 valores entre 50 y 500 nM se consideran afinidad intermedia, y IC 50los valores entre 500 y 5000 nM se consideran de baja afinidad. El análisis de predicción de la unión de IEDB MHC-I indicó los mejores aglutinantes por los rangos de percentiles más bajos. La Tabla 1 muestra el rango percentil de predicción de la unión de IEDB MHC-I y la afinidad de unión predicha de los siete epítopos-péptidos de células T ensayados (SEQ ID NO: 4-10) que se unen a las variantes de HLA humanas seleccionadas.
Tabla 1. Predicciones para varios epítopos de células T derivados de proteínas virales que se unen a varios complejos de MHC de clase I humanos
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[0442] Los resultados de los análisis de predicción de unión a MHC-I IEDB muestran que se predijo que algunos péptidos se unen con alta afinidad a múltiples moléculas de MHC de clase I humana, mientras que se predijo que otros péptidos se unen con afinidades más moderada a las moléculas de MHC de clase I humanas analizadas.
B. Identificación de regiones de epítopos de células B en toxinas y polipéptidos efectores de toxinas
[0443] Los polipéptidos derivados de toxina con características de enrutamiento subcelular intrínseco adecuadas para el suministro a proteasoma fueron elegidos para desinmunización con el fin de reducir la posibilidad de respuestas inmunes indeseables después de la administración a cordado, tales como, por ejemplo, la producción de anticuerpos anti-toxina. Se analizaron secuencias de aminoácidos de toxinas y polipéptidos derivados de toxinas para predecir los epítopos de células B antigénicos y/o inmunogénicos in silico.
[0444] Se analizaron los polipéptidos efectores derivados de una toxina Shiga y una toxina de la difteria para los epítopos de células B.
Polipéptidos efectores derivados de la toxina Shiga
[0445] En primer lugar, se identificaron regiones de epítopo de células B dentro de las subunidades A de toxina Shiga. Se utilizaron procedimientos informáticos para predecir epítopos de células B antigénicos y/o inmunogénicos en las secuencias de subunidades A de toxina Shiga con el potencial de provocar respuestas por sistemas inmunitarios de mamíferos después de la administración.
[0446] Se predijeron epítopos de células B lineales en las subunidades A toxinas Shiga utilizando la secuencia de polipéptido y datos estructurales 3D de la cadena A de toxina similar a Shiga (PDB ID: 1DM0_A) y el sistema REVEAL® proporcionado por ProImmune Inc. (Sarasota, FL, EE.UU.). En paralelo, se predijeron los epítopos de células B dentro de las secuencias de aminoácidos de la subunidad A de toxinas Shiga utilizando el servidor web BcePred (Saha S, Raghava G, Lecture Notes in Comput Sci 3239: 197-204 (2004)), la predicción de epítopos lineales BepiPred (Larsen J et al., Immunome Res 2: 2 (2006)), la predicción de epítopos de anticuerpo ElliPro (Haste Andersen P et al, Protein Sci 15: 2558-67 (2006); Ponomarenko J, Bourne P, BMC Struct Biol 7: 64 (2007)) y/o el servidor Epitopia (Rubinstein N et al., BMC Bioinformatics 10: 287 (2009)). La predicción del servidor Epitopia se utilizó para identificar epítopos de células B inmunogénicos como cualquier tramo de residuos de aminoácidos lineales que comprende una mayoría de residuos predichos en la escala de inmunnogenicidad de Epitopia como “elevado” (puntuaciónd de 4 o 5). Los diversos procedimientos informáticos revelaron predicciones similares para las regiones de epítopo de células B en tres subunidades A de toxina Shiga prototípicas (Tablas 2-4).
Tabla 2. Predicciones de epítopos de células B para la subunidad A nativa madura de la toxina sim ilar a Shiga 1 (SEQ ID NO 1)
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Tabla 3. Predicciones de epítopos de células B para la subunidad A nativa madura de la toxina Shiga (SEQ ID
NO 2)
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Tabla 4. Predicciones de epítopos de células B para la subunidad A nativa madura de la toxina sim ilar a Shiga 2 (SEQ ID NO 3)
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[0447] Además de los polipéptidos efectores de la toxina derivados de toxina Shiga, que son capaces de inducir la intemalización celular y dirigir su propio enrutamiento subcelular al citosol, pueden elegirse regiones efectoras de enrutamiento citosólico de otras proteínas como una fuente de polipéptidos para modificar en una polipéptido de la presente divulgación, tal como, por ejemplo, de otras toxinas ABx y/o RIP.
Polipéptidos efectores derivados de la toxina de la difteria
[0448] Se han usado toxinas diftéricas para diseñar inmunotoxinas y moléculas de fusión ligando-toxina en las que el componente derivado de la difteria puede proporcionar internalización celular y funciones efectoras de enrutamiento citosólico. Se utilizó un procedimiento informático para predecir regiones de epítopo de células B antigénicas y/o inmunogénicas en la subunidad A de la toxina de la difteria con el potencial para provocar respuestas en sistemas inmunes de mamíferos. Las regiones del epítopo de células B se predijeron en la subunidad A de la toxina de la difteria (SEQ ID NO: 44) usando el servidor web BcePred (Saha S, Raghava G, Lecture Notes en Comput Sci 3239: 197-204 (2004)). Este procedimiento informático reveló siete supuestas regiones del epítopo de células B en la subunidad A prototípica de la toxina de la difteria (Tabla 5). Además, se dice que la base de datos de epítopos inmunitarios (IEDB) seleccionada por los Institutos Nacionales de Alergias y Enfermedades Infecciosas de EE. UU. (NIAID) proporciona todos los epítopos de células B y células T de toxinas diftéricas caracterizados experimentalmente. Actualmente, el IEDB proporciona 7 epítopos con al menos una medición positiva con respecto a los epítopos peptídicos relacionados con la subunidad A de la toxina de la difteria y el polipéptido efector de la toxina de la difteria de SEQ ID NO: 45 usado en los Ejemplos (ver Tabla 5 y región 182-201 y 225- 238 de SEQ ID NO: 45).
Tabla 5. Predicciones del epítopo de células B para la subunidad A nativa madura de la toxina de la difteria SE ID NO: 44
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C. Identificación de regiones de epítopos de células T CD4+ en toxinas y polipéptidos efectores de toxinas
[0449] Se analizó la subunidad A de la toxina Shiga para detectar la presencia de cualquier epítopo de células T CD4+. Se predijeron los epítopos de células T para la subunidad A madura de la toxina 1 similar a Shiga (SEQ ID NO: 1) mediante el ensayo de células T del sistema de inmunogenicidad (IS) REVEAL ™ realizado por ProImmune Inc. (Sarasota, FL, EE. UU.). Este ensayo usa múltiples secuencias de péptidos superpuestas de la proteína en cuestión para probar la provocación de cualquier respuesta inmune por células T CD4+ de muestras de células de donantes sanas sin células T CD8+. Se identificaron siete regiones de epítopo de células T usando este ensayo en los siguientes grupos de residuos de aminoácidos posicionados de forma nativa: región del epítopo de células T CD4+ # 1: 4-33, región del epítopo de células T CD4+ # 2: 34-78, CD4+ Región del epítopo de células T # 3: 77-103, región del epítopo de células T c D4+ # 4: 128-168, región del epítopo de células T c D4+ # 5: 160-183, región del epítopo de células T CD4+ # 6: 236-258, y región del epítopo de células T CD4+ # 7: 274-293
[0450] La toxina de la difteria subunidad A y una de tipo salvaje (WT), polipéptido toxina efector difteria utilizado como un polipéptido parental para la generación de los polipéptidos efectores toxina de la difteria en los ejemplos, se investigaron en IEDB de NIAD para epítopes de células T. Actualmente, el IEDB proporciona más de 25 epítopos peptídicos con al menos una medición positiva con respecto al inmunogénico de células T relacionado con la subunidad A de la toxina de la difteria y los polipéptidos efectores de la toxina de la difteria en los Ejemplos. Había varias regiones del epítopo de células T identificadas por el IEDB en las toxinas de la difteria, como, por ejemplo, las siguientes regiones correspondientes a péptidos inmunogénicos superpuestos en el polipéptido de SEQ ID NO: 45 en las posiciones de los residuos de aminoácidos: 2-21, 22- 41, 32-71, 72-91, 82-221,212-231,232-251 y 251-301.
D. Generación de polipéptidos efectores de toxinas con epítopos de células T integrados o insertados que alteran las regiones del epítopo de células B endógenas y/o regiones del epítopo de células T CD4+ endógenas
[0451] Los polipéptidos efectores de toxina derivados de de ejemplo de la presente invención se crearon utilizando tanto una toxina Shiga y una toxina de la difteria.
Polipéptidos efectores derivados de la toxina Shiga
[0452] Se produjo un ácido nucleico que codifica una proteína citotóxica que comprende una región efectora de la toxina Shiga y una región de unión de tipo inmunoglobulina para el direccionamiento celular usando técnicas conocidas en la técnica. La región efectora de la toxina Shiga en la proteína citotóxica parental de este ejemplo comprendía los aminoácidos 1-251 de SEQ ID NO: 1.
[0453] Usando técnicas estándar conocidas en la técnica, se diseñaron una serie de mutaciones en el ácido nucleico que codifica la proteína citotóxica parental y se produjeron variantes de la proteína citotóxica que comprendían múltiples sustituciones de aminoácidos en comparación con la proteína citotóxica parental. Las mutaciones se seleccionaron para alterar al menos una región de epítopo de células B predicha descrita en la Tabla 2 mediante la inclusión de al menos un péptido de epítopo de células T descrito en la Tabla 1. Para la mayoría de los polipéptidos de ejemplo descritos en los Ejemplos, la secuencia de aminoácidos para cada epítopo de células T se incrustó manipulando las secuencias de ácido nucleico que codifican la región de interés de manera que el número total de residuos de aminoácidos codificados en las variantes permaneció sin cambios del número total de residuos de aminoácidos en la proteína citotóxica parental. Se generaron diez polinucleótidos diferentes, cada uno de los cuales codificaba una proteína citotóxica dirigida a la célula de ejemplo diferente que comprende un componente polipeptídico efector de la toxina Shiga de ejemplo diferente. Estos polinucleótidos de ejemplo se utilizaron para producir diez proteínas citotóxicas dirigidas a células de ejemplo utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica. En ciertos experimentos, la secuencia codificante de longitud completa de la proteína citotóxica de este ejemplo comenzó o terminó con un polinucleótido que codifica un Strep-tag® II para facilitar la detección y purificación. Las proteínas se purificaron usando procedimientos conocidos por el experto en la materia. Estos polinucleótidos de ejemplo se utilizaron para producir diez proteínas citotóxicas dirigidas a células de ejemplo utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica. En ciertos experimentos, la secuencia codificante de longitud completa de la proteína citotóxica de este ejemplo comenzó o terminó con un polinucleótido que codifica un Strep-tag® II para facilitar la detección y purificación. Las proteínas se purificaron usando procedimientos conocidos por el experto en la materia. Estos polinucleótidos de ejemplo se utilizaron para producir diez proteínas citotóxicas dirigidas a células de ejemplo utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica. En ciertos experimentos, la secuencia codificante de longitud completa de la proteína citotóxica de este ejemplo comenzó o terminó con un polinucleótido que codifica un Strep-tag® II para facilitar la detección y purificación. Las proteínas se purificaron usando procedimientos conocidos por el experto en la materia.
[0454] Se derivaron once proteínas citotóxicas de la proteína citotóxica parental, cada una de las cuales comprende un polipéptido efector de la toxina Shiga de ejemplo (seleccionado de SEQ ID NO: 11-21) y una alteración de al menos una de las regiones del epítopo de células B predichas en la Tabla 2 usando uno de los epítopos de células T descritos en la Tabla 1. La modificación exacta del polipéptido efector de la toxina Shiga parental para cada una de las once proteínas citotóxicas se muestra en la Tabla 6. La Tabla 6 enumera la secuencia de cada epítopo de células T integrado, la posición nativa en la subunidad A de la toxina Shiga de la modificación, y el tramo interrumpido de aminoácidos en la región del epítopo de la célula B.
Tabla 6. Ejemplos de polipéptidos efectores de toxina Shiga con epítopos de células T integrados o
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[0455] Las primeras nueve proteínas citotóxicas comprendían cada una un polipéptido efector de la toxina Shiga que comprende un epítopo de células T integrado (ver Tabla 6), es decir, sin ningún cambio en el número total de residuos de aminoácidos en el componente del polipéptido efector de la toxina Shiga de la proteína citotóxica parental . Cada una de las primeras nueve modificaciones enumeradas en la Tabla 6 ejemplifica un epítopo de células T integrado que altera una región del epítopo de células B. Como estas nueve modificaciones son reemplazos exactos, la secuencia del epítopo de células T y la secuencia de la región del epítopo de células B interrumpidas son idénticas en longitud y coinciden uno por uno con cada aminoácido enumerado en orden desde el extremo amino al extremo carboxi. El décimo polipéptido efector de la toxina Shiga en la Tabla 6, 53-61-F2, comprende tanto un reemplazo parcial como una inserción de un aminoácido en la posición 61 que desplaza los restos de aminoácidos de tipo salvaje (WT) carboxiterminales restantes en una posición. El undécimo polipéptido efector de la toxina Shiga en la Tabla 6 es una inserción completa de todo el epítopo de células T entre los residuos de aminoácidos 245 y 246 colocados de forma nativa. Esta inserción se encuentra dentro de la región del epítopo de células B # 9 colocada de forma nativa en los aminoácidos 243-259 de SLT-1A.
[0456] El análisis computacional in silico predijo que al menos un epítopo de células B presente en la toxina Shiga de tipo salvaje se eliminó para ocho de las variantes del polipéptido efector de la toxina Shiga con el epítopo de células T integrado o insertado, y no se predijo que nuevos epítopos de células B se generarían integrando o insertando un epítopo de células T en cualquiera de los polipéptidos efectores de la toxina Shiga de ejemplo en la Tabla 6 (véase también el Ejemplo 3, más adelante).
[0457] Además, los polipéptidos efectores de la toxina Shiga representados por SEQ ID NOs: 11-17 y 19-21 comprenden cada uno una alteración de un epítopo o epítopos de células T CD4+ endógenos predichos.
Polipéptidos efectores derivados de la toxina de la difteria
[0458] De forma similar a las descripciones anteriores de la modificación de polipéptidos derivados de la toxina Shiga, los epítopos de células T se integraron en polipéptidos derivados de la toxina de la difteria con función efectora de liberación a proteasoma para crear polipéptidos efectores de toxina de la difteria con el epítopo de células T de ejemplo de la presente invención integrado. Los epítopos de células T se seleccionaron de un péptido en la Tabla 1 y se incluyeron para alterar al menos una región del epítopo de células B predicha descrita en la Tabla 5.
[0459] Todos los polipéptidos derivados de toxina de la difteria de este ejemplo comprendían el dominio catalítico de la subunidad A de la toxina de la difteria con el dominio de translocación de la subunidad B de la toxina de la difteria, un motivo de escisión por furina entre la subunidad A y la subunidad B derivada, regiones de polipéptido efector de toxina, y un enlace disulfuro predicho entre cisteínas en las regiones polipeptídicas efectoras de toxina derivadas de las subunidades A y B. Por tanto, los polipéptidos derivados de la toxina de la difteria en este ejemplo comprenden tanto una región efectora de liberación a proteasoma como un polipéptido efector de toxina ribotóxica. Las secuencias de polipéptidos de polipéptidos efectores de toxina de la difteria, con epítopo de células T integrado, de la presente invención, se proporcionan como SEQ ID NO: 46, 47 y 48.
[0460] Usando técnicas estándar, se hicieron una serie de mutaciones en el polipéptido efector de toxina de la difteria para poder insertar un epítopo de células T en una posición que se solapa con una región de epítopo de células B predicha (véase la Tabla 5). La Tabla 7 muestra ejemplos de polipéptidos efectores de toxina de la difteria con epítopo de células T integrado al denotar la posición del epítopo de células T integrado en base a la secuencia del polipéptido de toxina de la difteria nativa en SEQ ID NO: 44, el nombre del epítopo de células T, la secuencia del péptido del epítopo de células T, la región del epítopo de la célula B predicha alterada y la secuencia de aminoácidos reemplazada en la secuencia del polipéptido de la toxina de la difteria nativa.
Tabla 7. Ejemplos de polipéptidos efectores de toxina de la difteria con epítopos de células T integrados en _____________ ____________________ regiones del epítopo de células B_________________________________ Posición Epítopo de Epítopo de Región de Región de Predicción de epítopo de (posiciones células T células T epítopo de epítopo de células B nativas) integrado células B células B epítopo | neoepítopo
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______ _____
[0461] Se analizaron las variantes de polipéptido efector de toxina de la difteria con epítopo de células T integrado (SEQ ID NOs: 46, 47, y 48) para cualquier cambio en los epítopos de células B predichos, tal como se describió anteriormente. En las tres variantes del polipéptido efector de la toxina de la difteria con el epítopo de células T integrado, se eliminó el epítopo de células B predicho en la secuencia de aminoácidos de la toxina de la difteria de tipo salvaje y no se predijeron nuevos epítopos de células B (Tabla 7).
[0462] Tres variantes de polipéptido efector de toxina de la difteria integradas en epítopo de células T (SEQ ID NO: 46, 47 y 48), y el polipéptido efector de toxina de la difteria parental que comprende solo secuencias de aminoácidos de toxina de tipo salvaje (SEQ ID NO: 45), se diseñaron cada una con una metionina amino-terminal y una etiqueta de polihistidina carboxi-terminal (etiqueta 6xHis (SEQ ID NO: 146)) para facilitar la expresión y purificación. Las variantes del polipéptido efector de la toxina de la difteria incluidas en el epítopo de células T de ejemplo de la presente invención y el polipéptido efector de la toxina de la difteria parental que comprende solo secuencias de aminoácidos de la toxina de tipo salvaje se produjeron mediante un sistema de expresión bacteriano conocido en la técnica y se purificaron en condiciones conocidas en la técnica, tal como, por ejemplo, cromatografía en resina de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA).
E. Generación de polipéptidos efectores de la toxina Shiga con epítopos de células T integrados que no alteran ninguna región del epítopo de células B
[0463] Reconociendo todas las predicciones de la región del epítopo de células B de todos los procedimientos descritos en los Ejemplos (Tabla 2), se identificaron las regiones de SLT-1A que no se predijo que contuvieran ningún epítopo de células B. Las secuencias de péptidos de epítopos de células T de la Tabla 1 están integradas en aquellas regiones identificadas que carecen de epítopos de células B reemplazando los aminoácidos nativos por sustituciones para crear tres polipéptidos efectores de toxina Shiga de ejemplo diferentes de la presente invención, tal como se muestra en la Tabla 8. La Tabla 8 muestra las regiones identificadas en la secuencia del polipéptido SLT-1A nativo maduro y las secuencias del epítopo de células T de reemplazo construidas en los polipéptidos efectores de la toxina Shiga (ver SEQ ID NO: 22-39).
Tabla 8. Epítopos de células T integrados fuera de las regiones del epítopo de células B en polipéptidos efectores de toxina Shi a
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[0464] Las secuencias de polipéptidos efectores de la toxina Shiga comprenden, como reemplazos exactos, los epítopos de células T integrados en la Tabla 8 se analizaron utilizando el programa BcePred. Ninguno de los reemplazos exactos del epítopo de células T integrados en la Tabla 8 alteró ninguna de las seis regiones del epítopo predichas por ese programa. Una de las secuencias de reemplazo de epítopo de células T integradas en la Tabla 8, variante 75-83-F3, dio como resultado la predicción de un nuevo epítopo de células B. La integración de epítopos de células T cerca de las regiones (66-74) y/o (157-165) puede interferir con la función efectora de la toxina Shiga de la actividad catalítica debido a su proximidad a al menos un aminoácido que se sabe que es necesario para la actividad catalítica de SLT-1A (por ejemplo, Y77 y E167).
[0465] Además, los polipéptidos efectores de la toxina Shiga representados por SEQ ID NOs: 22-39 todos comprenden una alteración de un epítopo o epítopos endógenos de células T CD4+ predichos a excepción de los polipéptidos con epítopos de células T heterólogos integrados en la posición 221-229, que están representadas por las SEQ ID NO: 26, 32 y 38.
F. Generación de polipéptidos efectores de toxinas con epítopos de células T integrados que alteran la función catalítica de la toxina
[0466] Los residuos más críticos para la actividad enzimática de las subunidades A de la toxina Shiga incluyen tirosina-77 (y 77) y glutamato-167 (E167) (Di, Toxicon 57: 535-39 (2011)). Las secuencias de péptidos del epítopo de células T de la Tabla 1 se integran en polipéptidos efectores de la toxina Shiga de manera que se mute Y77 o E167 para reducir o eliminar la actividad enzimática de la toxina Shiga. En la Tabla 9 se muestran seis ejemplos de polipéptidos efectores de toxina Shiga diferentes que comprenden un epítopo de células T heterólogo que altera un residuo de aminoácido catalítico. La Tabla 9 muestra la posición de los epítopos de células T integrados en la secuencia de polipéptido SLT-1A nativa madura, las secuencias de epítopo de células T de reemplazo que están integradas, las secuencias reemplazadas en la secuencia de polipéptido SLT-1A nativa madura, y una alteración del residuo catalítico resultante (ver también SEQ ID NO: 23, 29, 40, 41,42, y 43)
Tabla 9. Epítopos de células T integrados en polipéptidos efectores de toxina Shiga para desactivar la función catalítica de la toxina Shi a
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[0467] Todos los polipéptidos efectores de la toxina Shiga representados por SEQ ID NOs: 23, 29, 40, 42, y 43 comprende alteraciones de un epítopo o epítopos de células T CD4+ endógenos predichos. Además, entre los ejemplos de polipéptidos efectores de la toxina Shiga con epítopos de células T integrados que no alteran ninguna región del epítopo de células B mostrados en la Tabla 8, al menos ocho de ellos alteran un residuo de aminoácido catalítico de la región efectora de la toxina Shiga (ver SEQ ID NO: 23, 25, 29, 31 35 y 37).
[0468] Además de la integración y la inserción en un sitio único, múltiples epítopos de células T inmunogénicas para la presentación de MHC de clase I están integrados y/o insertados dentro de los mismos polipéptidos de la toxina derivada de Shiga o polipéptidos de la toxina derivada de la difteria para uso en el objetivo suministro de una pluralidad de epítopos de células T simultáneamente, tal como, por ejemplo, alterar una región de epítopo de células B con un primer epítopo de células T integrado e alterar una función catalítica de toxina con un segundo epítopo de células T integrado. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que un solo epítopo de células T integrado puede alterar simultáneamente tanto una región del epítopo de células B como una función catalítica de toxina.
Ejemplo 2. Ensayo de polipéptidos efectores derivados de toxinas para la retención de la función efectora de toxinas ribotóxicas
[0469] Se ensayaron polipéptidos efectores derivados de toxina de ejemplo de la presente invención para determinar la retención de la función efectora de la toxina ribotóxica.
Retención de ribotoxicidad de los polipéptidos efectores derivados de la toxina Shiga
[0470] La retención de la actividad enzimática del polipéptido efector de la toxina Shiga parental después de integrar o insertar uno o más epítopos de células T se determinó usando un ensayo de inhibición de ribosomas. Los resultados de este ensayo en este ejemplo se basaron en realizar el ensayo con cada polipéptido efector de la toxina Shiga como componente de una proteína citotóxica. Se midieron las citotoxicidades específicas de diferentes proteínas citotóxicas que comprenden diferentes polipéptidos efectores de la toxina Shiga usando un ensayo de toxicidad basado en células de cultivo de tejidos. Las actividades enzimáticas y citotóxicas de las proteínas citotóxicas dirigidas a células de ejemplo se compararon con el polipéptido efector de la toxina Shiga parental solo (sin región de unión a la reconocimiento celular) y una proteína citotóxica "WT" que comprende el mismo dominio de reconocimiento celular (por ejemplo, la región de unión que comprende una región de unión de tipo inmunoglobulina capaz de unirse a una biomolécila diana extracelular con alta afinidad), pero con una región efectora de toxina Shiga de tipo salavaje (WT).
[0471] Las capacidades de inactivación de ribosomas de proteínas citotóxicas que comprenden epítopos de células T integrados o insertados se determinaron utilizando un ensayo de traducción de proteínas in vitro sin células utilizando el kit TNT® Quick Coupled Transcription/Translation (L1170 Promega Madison, WI, EE. El kit incluye Luciferase T7 Control DNA (L4821 Promega Madison, WI, EE. UU.) Y TNT® Quick Master Mix. La reacción de actividad ribosómica se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se preparó una serie de diluciones de 10 veces de la proteína a ensayar, que comprendía una región polipeptídica efectora de la toxina Shiga mutada o una región WT, en un tampón apropiado y se crearon una serie de componentes idénticos de la mezcla de reacción TNT para cada dilución. Cada muestra de la serie de diluciones se combinó con cada una de las mezclas de reacción de TNT junto con el ADN de control de luciferasa T7. Las muestras de prueba se incubaron durante 1,5 horas a 30 grados Celsius (° C). Después de la incubación, se añadió reactivo de ensayo de luciferasa (E1483 Promega, Madison, WI, EE. UU.) A todas las muestras de prueba y se midió la cantidad de traducción de la proteína luciferasa mediante luminiscencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel de inhibición de la traducción se determinó mediante análisis de regresión no lineal de concentraciones transformadas logarítmicamente de proteína total frente a unidades de luminiscencia relativa. Utilizando software estadístico (GraphPad Prism, San Diego, CA, EE. UU.), La concentración inhibitoria media máxima (IC50) se calculó el valor para cada muestra utilizando la función del software Prism de log (inhibidor) frente a respuesta (tres parámetros) [Y = Inferior+ ((Superior-Inferior)/(1+ 10 A (X-LogIC 50))) ] bajo el epígrafe dosis-respuesta-inhibición. Los IC 50 valores se calcularon para cada proteína de inmunizado-que comprende una alteración Shiga región polipéptido reemplazo epítopo de células B/toxina efector y una proteína de control que comprende un Shiga toxina región efector de tipo salvaje (WT).
[0472] Las regiones de polipéptidos de la toxina Shiga efectoras de ejemplo mostraron inhibición ribosoma comparable a un Shiga toxina polipéptido efector de tipo salvaje (WT) como se indica en la Tabla 10. Como se informó en la Tabla 10, cualquier construcción que comprende un polipéptido de la toxina Shiga efector que exhibió una CI50 dentro de 10 veces la construcción de control positivo que comprende una región efectora de la toxina Shiga de tipo salvaje se consideró que presenta una actividad de inhibición del ribosoma comparable a la de tipo salvaje.
Tabla 10. Retención de la(s) función(es) de la toxina Shiga: Actividad catalítica in vitro y citotoxicidad in viv
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[0473] La retención de la citotoxicidad por polipéptidos toxina efectoras de ejemplo Shiga después de células T epítopo Inclusión/inserción se determinó mediante un ensayo de células-kill en el contexto del polipéptido de la toxina Shiga efector como un componente de una proteína citotóxica. Los niveles de citotoxicidad de proteínas que comprenden polipéptidos efectores de toxina Shiga, que comprenden un epítopo de células T integrado o insertado, se determinaron usando células que expresan diana extracelulares en comparación con células que no expresan una biomolécula diana de la región de unión de la proteína citotóxica. Las células se sembraron (2 x 103 células por pocillo para células adherentes, sembraron el día antes de la adición de proteínas o 7,5 x 103células por pocillo para las células en suspensión, sembradas el mismo día que la adición de proteína) en 20 pl de medio de cultivo celular en placas de 384 pocillos. Se preparó una serie de diluciones de 10 veces de cada proteína que comprendía una región polipeptídica efectora de la toxina Shiga mutada a ensayar en un tampón apropiado, y luego se añadieron a las células 5 pl de las diluciones o control del tampón. Se utilizaron pocillos de control que contenían solo medio para la corrección de la línea de base. Las muestras de células se incubaron con las proteínas o simplemente tampón durante 3 días a 37 ° C y en una atmósfera de dióxido de carbono (CO2) al 5% . La supervivencia celular total o el porcentaje de viabilidad se determinó usando una lectura luminiscente usando el Ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (G7573 Promega Madison, WI, EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante.
[0474] El porcentaje de viabilidad de los pocillos experimentales se calculó usando la siguiente ecuación: (Test RLU -medio de medios RLU)/(Promedio de células RLU - medio de medios RLU) * 100. concentración polipéptido Log frente a porcentaje de viabilidad se representó en Prism (GraphPad Prism , San Diego, CA, EE.UU.) y log (inhibidor) versus análisis de respuesta (3 parámetros) se utilizó para determinar la concentración citotóxica media-máxima (CD 50) de valor para las proteínas ensayadas. El CD 50 se calculó para cada proteína que comprende un polipéptido de toxina efector de ejemplo Shiga en la Tabla 10, proteína citotóxica-control positivo que comprende una Shiga región toxina efector de tipo salvaje, y la de tipo salvaje SLT-1 A Subunidad solo (dominio no focalización) - ambos se consideraron controles positivos para WT.
[0475] La proteína que comprende los polipéptidos de la toxina Shiga efectoras de ejemplo exhibido citotoxicidades específicas de células comparables a una de tipo salvaje (WT) Shiga toxina polipéptido efector como se indica en la Tabla 10. Como se informó en la Tabla 10 con respecto a la específica citotoxicidad, "comparable a WT "significa una proteína que comprende un polipéptido efector de la toxina Shiga, que comprende un epítopo de células T integrado o insertado, exhibió un CD 50 para una población de células diana positivas dentro de 10 veces de una proteína que comprende una región efectora de la toxina Shiga de tipo salvaje (WT) y/o menos de 50 veces la subunidad SLT-1A sola.
[0476] Además, las mismas construcciones de proteínas comprenden polipéptidos efectores de toxina Shiga de ejemplo exhibieron citotoxicidad específica a células que expresan dianas biomoleculares en comparación con células negativas de diana biomolecular (es decir, células que no expresaban, en una superficie celular, la diana biomolecular de la región de unión de reconocimiento celular de la construcción proteica). Por tanto, todas las proteínas que comprenden los polipéptidos efectores de la toxina Shiga de ejemplo en la Tabla 10 eran proteínas citotóxicas que exhibían funciones efectoras de la toxina Shiga comparables a las de tipo salvaje (WT), y cada proteína citotóxica comprendía una alteración en una o más regiones del epítopo de células B predichas.
Retención de ribotoxicidad de los polipéptidos efectores derivados de la toxina de la difteria
[0477] Se comparó la actividad catalítica de polipéptidos efectores de toxina de la difteria, con epítopo de células T integrado, de ejemplo, con polipéptidos efectores de toxina de la difteria que comprenden solo secuencias de aminoácidos de tipo salvaje, denominadas en el presente documento como "tipo salvaje" o "WT". Ambas variantes del polipéptido efector de la toxina de la difteria con epítopo de células T integrado retuvieron la actividad de inactivación del ribosoma.
[0478] La retención de la actividad enzimática de las variantes del polipéptido efector de la toxina de la difteria con epítopos de células T integrados en el contexto de una molécula de reconocimiento celular se probó usando un ensayo de inhibición del ribosoma y un polipéptido efector de la toxina de la difteria de tipo salvaje (WT) como control positivo. Las capacidades de inactivación de ribosomas de estos polipéptidos efectores de toxinas se determinaron usando un ensayo de traducción de proteínas in vitro sin células usando el kit TNT® Quick Coupled Transcription/Translation (L1170 Promega Madison, WI, EE. UU.) Como se describió anteriormente a menos que se indique lo contrario. En primer lugar, los polipéptidos efectores de la toxina de la difteria se escindieron in vitro con furina (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.) en condiciones estándar. Luego, las proteínas escindidas se diluyeron en tampón para hacer una serie de diluciones para cada muestra.
[0479] La IC50 se calculó, como se describió anteriormente, para los polipéptidos efectores de toxina de la difteria. La Figura 2 y la Tabla 11 muestran los resultados de este ensayo in vitro para la retención de la función efectora de la toxina ribotóxica de la difteria mediante polipéptidos efectores de la toxina de la difteria, con células T integradas, de ejemplo. La actividad de los polipéptidos efectores de toxina de la difteria con células T integradas era comparable a la del control positivo de tipo salvaje (WT) porque los valores de IC50 estaban dentro de diez veces del control de polipéptido efector de la toxina de la difteria de tipo salvaje (Figura 2; Tabla 11).
Tabla 11. Retención de la actividad catalítica por epítopo de células T de ejemplo integrado en polipéptidos efectores de la toxina de la difteria
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Ejemplo 3. Ensayo de los efectos de desinmunización de la alteración de las regiones del epítopo de células B y las regiones del epítopo de células T CD4+ en el epítopo de células T integrado en polipéptidos efectores de toxina
[0480] La alteración de las regiones de epítopo de células B en polipéptidos efectores de toxina Shiga utilizando epítopos de células T integrados o insertados se ensayó para la desinmunización mediante la investigación de niveles de antigenicidad y/o inmunogenicidad en comparación con los polipéptidos efectores de toxina Shiga de tipo salvaje (WT) que comprenden solo secuencias de aminoácidos de tipo salvaje.
Prueba de desinmunización mediante análisis Western
[0481] Para analizar la desinmunización, los niveles de antigenicidad o inmunogenicidad de los polipéptidos efectores de toxina Shiga se ensayaron tanto en silico como por transferencia Western utilizando anticuerpos preformados que reconocen polipéptidos efectores de la toxina Shiga de tipo salvaje.
[0482] Se comprobó cada polipéptido efector de la toxina Shiga descrito en la Tabla 6 (SEQ ID NO: 11-21) para determinar la alteración de los epítopos de células B pronosticados utilizando el servidor web BcePred utilizando los siguientes parámetros: lectura de flexibilidad con los ajustes predeterminados de hidrofilicidad 2 , accesibilidad 2, superficie expuesta 2.4, propensión antigénica 1.8, flexibilidad 1.9, vueltas 1.9, polaridad 2.3 y 1.9 combinados (Saha S, Raghava G, Lecture Notes in Comput Sci 3239: 197-204 (2004)). Tres regiones de epítopo inmunogénico predichas identificadas en la subunidad SLT-1 A de tipo salvaje por otros programas (ver Tabla 2) no fueron predichas por el enfoque de flexibilidad de BcePred con la configuración predeterminada y, por lo tanto, no pudieron analizarse.
[0483] La integración o inserción de epítopo de células T en los siguientes ejemplos de polipéptidos efectores de toxina Shiga SEQ ID NOs: 11-21 resultó en la eliminación del epítopo de células B predicho destinado para la alteración y sin la introducción de ningún epítopo de novo (neoepítopos) (Tabla 12). Ninguno de los polipéptidos efectores de toxina Shiga de ejemplo probados dio como resultado la generación de ningún epítopo de células B predicho de novo utilizando el enfoque de flexibilidad BcePred con los ajustes predeterminados (Tabla 12). Ninguna región de epítopo de células B no predicha por el enfoque de flexibilidad BcePred con la configuración predeterminada se indicó con "no identificada" y el resultado después de la integración o inserción del epítopo de células T se indicó con "N/A" para indicar "no aplicable".
Tabla 12. Análisis de la alteración de la región del epítopo de células B por epítopos de células T integrados o insertados
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[0484] Los niveles de antigenicidad relativos de los polipéptidos efectores de toxina Shiga se ensayaron para desinmunización por transferencia Western utilizando anticuerpos preformados, anticuerpos policlonales y monoclonales, que reconocen los polipéptidos efectores de toxina Shiga de tipo salvaje (WT) que comprenden los aminoácidos 1-251 de SEQ ID NO: 1.
[0485] La transferencia de Western se realizó en proteínas citotóxicas que comprenden un polipéptido efector de toxina Shiga que comprende solo una secuencia de toxina Shiga de tipo salvaje (WT) o una de varias secuencias de toxina Shiga modificadas que comprenden una alteración de la región del epítopo de células B mediante el reemplazo con un epítopo de células T. (SEC ID N°: 11-19). Estas proteínas citotóxicas se cargaron en cantidades iguales para replicar, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 4-20%, geles de poliacrilamida (Lonza, Basel, CH) y se sometieron a electroforesis en condiciones desnaturalizantes. Los geles resultantes se analizaron mediante tinción de Coomassie o se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilo (PVDF) utilizando el sistema iBlot® (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las membranas resultantes se sondaron en condiciones estándar usando los siguientes anticuerpos: a-NWSHPQFEK policlonal de conejo (SEQ ID NO: 156) (A00626, Genscript, Piscataway, NJ, EE. UU.) que reconoce el polipéptido NWSHPQFEK (Se Q ID NO: 156) también conocido como Streptag® II, a-Stx monoclonal de ratón (mAb1 o anti-SLT-1A mAb1) (b Ei NR-867 BEI Resources, Manassas, VA, EE. UU.; reactivo cruzado con la toxina Shiga y las subunidades A de la toxina 1 A similar a Shiga), anticuerpo policlonal de conejo a-SLT-1A (pAb1 o anti-SLT -1A pAb1) (Harlan Laboratories, Inc. Indianapolis, IN, EE. UU., Producción de anticuerpos personalizados contra los aminoácidos 1-251 de SLT-1A) y anticuerpo policlonal de conejo a-SLT-1A (pAb2 o anti-SLT-1A pAb2 ) (Genscript, Piscataway, NJ, EE.UU., producción de anticuerpos personalizados), que se generó contra los péptidos RGIDPEEGRFNN (SEQ ID NO: 157) y HGQDSVRVGR (Se Q ID NO: 158). La secuencia de péptidos RGIDpEEGRFNN (SEQ ID NO: 157) se encuentra en los aminoácidos 55-66 en SLT-1A y StxA,
[0486] unida a la membrana anticuerpos se detectaron usando condiciones estándar y, cuando sea apropiado, utilizando peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios (de cabra anti-conejo-HRP anti-ratón o de cabra-HRP, Thermo Scientific, Rockford, IL, EE. UU.). Las Figuras 3-4 muestran imágenes de transferencias Western con los carriles de los geles y/o membranas numerados y las leyendas de las figuras indican con la misma numeración respectiva qué polipéptido efector de la toxina Shiga era un componente de la muestra de proteína citotóxica cargada en cada carril. Para cada gel, la tinción de Coomassie y/o la señal de transferencia Western anti-streptag II sirven como controles de carga de proteína citotóxica total. Todos los polipéptidos efectores de la toxina Shiga modificados tenían reconocimiento reducido o abolido por uno o más anticuerpos que pueden reconocer SLT-1A de tipo salvaje, lo que indica una antigenicidad reducida y una desinmunización satisfactoria. El resultado de los análisis de transferencia Western que se muestran en las Figuras 3 y 4 se resumen en la Tabla 13.
Tabla 13. Análisis de alteración de epítopos por Western : Los polipéptidos efectores de toxina Shiga de ejemplo
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Prueba de desinmunización de células T CD4+
[0487] Se analizan las alteraciones en las regiones del epítopo de células T CD4+ predichas para determinar las reducciones en la inmunogenicidad de las células T CD4+ usando ensayos de proliferación de células T CD4+ humanas en presencia de polipéptidos administrados exógenamente y ensayos de estimulación de células T dendríticas CD4+ humanas en el presencia de monocitos humanos tratados con polipéptidos administrados.
[0488] Los ensayos de proliferación de células T conocidos por los expertos se utilizan para probar la eficacia de la desinmunización del epítopo de células T CD4+ en polipéptidos efectores de toxina de ejemplo que comprenden epítopos de células T integrados o insertados en epítopos de células T CD4+ predichos. El ensayo de proliferación de células T de este ejemplo implica el etiquetado de células T CD4+ y luego medir los cambios en la proliferación utilizando procedimientos de citometría de flujo en respuesta a la administración de diferentes péptidos derivados de un polipéptido desinmunizado utilizando los procedimientos de integración o inserción. un epítopo de células T CD8+ heterólogo (por ejemplo, SEQ ID NO: 11-43) o un polipéptido de referencia que no tiene ningún epítopo de células T heterólogo asociado.
[0489] Una serie de péptidos solapantes derivados de un polipéptido se sintetizó y se ensayó en el ensayo de proliferación de células T CD4+ CFSE (ProImmune Inc., Sarasota, FL, US). Se cultivan células mononucleares (PBMC) de sangre periférica (PBMC) empobrecidas en células T CD8+ humanas marcadas con CFSE con 5 pM de cada péptido de interés durante siete días en seis pocillos replicados. Cada placa de ensayo incluye un conjunto de pocillos de control sin tratar. El ensayo también incorpora controles de antígeno de referencia, que comprenden péptidos sintéticos para antígenos conocidos de MHC de clase II.
[0490] Las PBMC empobrecidas en células T CD8+ que proliferan en respuesta a un péptido administrado mostrarán una reducción en la intensidad de fluorescencia de CFSE medida directamente por citometría de flujo. Para un análisis de células T ingenuo, el porcentaje de estimulación por encima del fondo se determina para cada muestra estimulada, mediante la comparación con los resultados de una muestra no estimulada, por ejemplo, clasificando con respecto a la señal fluorescente, como negativa, tenue o alta. Los recuentos de la población dim de células T CD4+ CFSE en cada muestra se expresan como una proporción de la población total de células T CD4+. Los valores replicados se utilizan para calcular el porcentaje de estimulación por encima del fondo (proporción de células dim CFSE de células T CD4+ con estimulación antigénica, menos proporción de células dim CFSE de células T CD4+ sin estimulación antigénica). La media y el error estándar de la media se calculan a partir de los valores replicados. Un resultado se considera "positivo" si el porcentaje de estimulación por encima del fondo es superior al 0,5% y también superior al doble del error estándar por encima del fondo. Para permitir la comparación de péptidos, se calcula un índice de respuesta. Este índice se basa en multiplicar la magnitud de la respuesta (porcentaje de estimulación por encima del fondo) para cada péptido por el número de donantes que responden (porcentaje de antigenicidad) para cada péptido.
Determinación de la inmunogenicidad relativa de células T CD4+
[0491] El CD4+ inmunogenicidad de células T relativa de de ejemplo, polipéptidos de longitud completa se determina utilizando la siguiente de células dendríticas (DC) ensayo de proliferación de células T. Este ensayo de células T de DC mide las respuestas de las células T CD4+ a polipéptidos o proteínas administrados de forma exógena. El ensayo de células T DC se realiza utilizando el servicio de ensayo DC-T de ProImmune para determinar los niveles relativos de inmunogenicidad impulsada por células T CD4+ entre polipéptidos, proteínas y moléculas de reconocimiento celular en comparación con los polipéptidos, proteínas o células parentales iniciales. -moléculas dirigidas que carecen de la adición de cualquier epítopo de células T heterólogo. El ensayo de células T de DC de este ejemplo implica analizar células dendríticas humanas para la presentación de antígenos de péptidos derivados del polipéptido, proteína o muestras de moléculas de reconocimiento celular administradas.
[0492] En resumen, se utilizan tejidos de donantes humanos sanos para aislar muestras tipificadas basándose en la tipificación de tejidos de MHC de clase II de alta resolución. Se utiliza una cohorte de 20, 40 o 50 donantes. Primero, los monocitos obtenidos de PBMC de donantes humanos se cultivan en un medio definido para generar células dendríticas inmaduras. Luego, las células dendríticas inmaduras se estimulan con un antígeno de control bien definido y se inducen a un fenotipo más maduro mediante cultivo adicional en un medio definido. A continuación, las PBMC de donantes con depleción de células T CD8+ de la misma muestra de donante humano se marcan con CFSE. Las PBMC empobrecidas en células T CD8+ marcadas con CFSE se cultivan luego con las células dendríticas cebadas con antígeno durante siete días para permitir la estimulación de las células dendríticas CD4+, después de lo cual se analizan ocho réplicas de cada muestra. Como controles negativos, cada serie de cultivo de células dendríticas también incluye un conjunto de células dendríticas no tratadas. Para un control positivo, el ensayo incorpora dos antígenos de referencia bien definidos, cada uno de los cuales comprende una proteína de longitud completa.
[0493] Para evaluar la inmunogenicidad basada en células dendríticas, se analiza la frecuencia de las respuestas de las células del donante en toda la cohorte de estudio. Las respuestas positivas en el ensayo se consideran indicativas de una posible respuesta de células T CD4+ in vivo. Una respuesta positiva, medida como un porcentaje de estimulación por encima del nivel de fondo, se define como porcentajes superiores al 0,5 por ciento (%) en 2 o más muestras de donantes independientes. La fuerza de las respuestas positivas de las células del donante se determina tomando el porcentaje medio de estimulación por encima del fondo obtenido entre los donantes aceptados para cada muestra. Un índice de respuesta se calcula multiplicando el valor de la fuerza de respuesta por la frecuencia de respuesta de los donantes para determinar los niveles de inmunogenicidad de células T CD4+ para cada muestra. Además, un índice de respuesta,
Prueba de desinmunización mediante inmunogenicidad relativa in vivo
[0494] Los niveles de inmunogenicidad relativa de los polipéptidos efectores de la toxina Shiga se prueban para la desinmunización utilizando modelos de mamíferos del sistema inmunológico humano. A los ratones se les administran por vía intravenosa proteínas o polipéptidos citotóxicos que comprenden formas de tipo salvaje (WT) o desinmunizadas del componente del polipéptido efector de la toxina Shiga 3 veces por semana durante dos semanas o más. Se toman muestras de sangre de los ratones inyectados y se analizan mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para determinar la reactividad con las proteínas citotóxicas y/o el polipéptido efector de la toxina Shiga. Se producirán respuestas inmunogénicas reducidas en ratones inyectados con el polipéptido efector de la toxina Shiga desinmunizado, o composiciones que comprenden el mismo, en comparación con los ratones inyectados solo con la forma natural del polipéptido efector de la toxina Shiga, o la composición que comprende el mismo.
[0495] Además, los polipéptidos efectores de toxina de la difteria (por ejemplo, SEQ ID NOS: 46-48) se prueban para desinmunización usando los procedimientos de este ejemplo para verificar la alteración de una o más regiones de epítopos de células B en cada polipéptido efector de toxina de difteria que comprenden un epítopo de células T integrado o insertado.
Ejemplo 4. Ensayo de intemalización celular, enrutamiento subcelular y presentación de un epítopo de células T integrado en las superficies de células diana mediante polipéptidos efectores de toxina Shiga de ejemplo de la presente invención
[0496] En este ejemplo, la capacidad de las proteínas de ejemplo dirigido por células de la presente invención, que comprenden cada uno un polipéptido de toxina efector de ejemplo Shiga de la presente invención, para entregar los epítopos de células T a la vía de MHC de clase I de las células diana para la presentación a se investigó la superficie de la célula diana. Además, las proteínas dirigidas a células que comprenden polipéptidos efectores de la toxina de la difteria de la presente invención (por ejemplo, SEQ ID NO: 46-48) se prueban usando los procedimientos de este ejemplo para verificar su capacidad para administrar epítopos de células T integrados a la presentación de MHC de clase I sistema.
[0497] El uso de técnicas estándar conocidas en la técnica, se hicieron varias proteínas dirigida por células de ejemplo de la presente invención donde cada una comprende una región de células de tipo de segmentación y un polipéptido de la toxina Shiga efector de la presente invención (véase, por ejemplo WO2014164680 y WO2014164693). Una proteína dirigida a células de la presente invención comprende tanto un polipéptido efector de toxina Shiga de la presente invención como una región de unión dirigida a células capaz de exhibir una unión de alta afinidad a una biomolécula diana extracelular acoplada físicamente a la superficie de un tipo de célula específico (s). Las proteínas dirigidas a células de la presente invención son capaces de dirigirse selectivamente a células que expresan la biomolécula diana de su región de unión dirigida a células e internalizarlas en estas células diana.
[0498] Se usó un procedimiento de citometría de flujo para demostrar el suministro y la presentación extracelular de un epítopo de células T (insertado o integrado en una región efectora de la toxina Shiga) en complejo con moléculas de MHC de clase I en las superficies de las células diana. Este procedimiento de citometría de flujo utiliza reactivos multímeros del receptor de células T humanas solubles (TCR) (Soluble T-Cell Antigen Receptor STAR ™ Multimer, Altor Bioscience Corp., Miramar, FL, EE. UU.), Cada uno con una unión de alta afinidad a un epítopo diferente. complejo HLA humano.
[0499] Cada reactivo multímero STAR ™ TCR se deriva de un receptor de células T específico y permite la detección de un complejo péptido-MHC específico en función de la capacidad del TCR elegido para reconocer un péptido específico presentado en el contexto de una molécula de MHC de clase I en particular. Estos multímeros de TCR están compuestos de TCR humanos recombinantes que han sido biotinilados y multimerizados con estreptavidina. Los multímeros de TCR están marcados con ficoeritrina (PE). Estos reactivos multímeros de TCR permiten la detección de complejos péptido-MHC Clase I específicos presentados en las superficies de células humanas porque cada tipo de multímero de TCR soluble reconoce y se une de manera estable a un complejo péptido-MHC específico en condiciones variadas (Zhu X et al., J Immunol 176: 3223 - 32 (2006)).
[0500] El reactivo multímero TCR CMV-pp65-PE STAR ™ (Altor Bioscience Corp., Miramar, FL, EEUU) se utilizó en este Ejemplo. La presentación de la vía MHC de clase I del péptido CMV C2 (NLVPMVATV (SEQ ID NO: 10)) por células humanas que expresan el HLA-A2 puede detectarse con el reactivo multímero TCR CMV-pp65-PE STAR ™ que exhibe un reconocimiento de alta afinidad del Epítopo-péptido de CMV-pp65 (residuos 495-503, NLVPMVATV (SEQ ID NO: 10)) complejado con HLA-A2 humano y que está marcado con PE.
[0501] Las células diana usadas en este ejemplo se inmortalizaron células de cáncer humano disponibles de la ATCC (Manassas VA, US). Usando procedimientos de citometría de flujo estándar conocidos en la técnica, se confirmó que las células diana expresan en sus superficies celulares tanto la molécula HLA-A2 MHC-Clase I como la biomolécula diana extracelular de la fracción de las proteínas que se dirigen a las células usadas en este Ejemplo.
[0502] Las células diana se trataron con las proteínas de la presente invención dirigidas a células de ejemplo, cada una de las cuales comprende diferentes polipéptidos efectores de la toxina Shiga que comprenden un epítopo de células T integrado en una región del epítopo de células B predicha. Una de cada una de las proteínas de la presente invención dirigidas a células de ejemplo probadas en este Ejemplo comprendía uno de los siguientes polipéptidos efectores de la toxina Shiga: 43-51-C2 (SEQ ID NO: 13), 53-61-C2 (SEQ ID NO: 17) y 104-112-C2 (SEQ ID NO: 18). Se trataron conjuntos de células diana mediante la administración exógena de las diferentes proteínas de la presente invención dirigidas a células de ejemplo a concentraciones similares a las utilizadas por otros teniendo en cuenta las sensibilidades específicas del tipo celular a las toxinas Shiga (véase, por ejemplo, Noakes K et al., FEBS Lett 453: 95 - 9 (1999)). A continuación, las células tratadas se incubaron durante seis horas en condiciones estándar, incluso a 37 ° C y una atmósfera con 5% de dióxido de carbono, para permitir la intoxicación mediada por una región efectora de la toxina Shiga. Luego, las células se lavaron con medio de cultivo celular, se resuspendieron en medio de cultivo celular fresco y se incubaron durante 20 horas antes de teñirlas con el reactivo multímero TCR CMV-pp65-PE STAR ™.
[0503] Como controles, se trataron conjuntos de células diana en tres condiciones: 1) sin ningún tratamiento ("sin tratar"), lo que significa que no se agregaron moléculas exógenas, 2) con péptido CMV C2 administrado exógenamente (CMV-pp65, aa 495-503: secuencia NLVPMVATV (SEQ ID NO: 10), sintetizado por BioSynthesis, Lewisville, TX, US), y 3) con péptido CMV C2 administrado exógenamente (NLVPMVATV (SEQ ID No : 10), como arriba) combinado con un Peptide Loading Enhancer ("PLE”, Altor Biosicence Corp., Miramar, FL). El péptido C2 combinado con el tratamiento con PLE permitió la carga de péptidos exógenos y sirvió como control positivo. Las células que muestran el haplotipo de MHC de clase I apropiado pueden verse obligadas a cargar el péptido apropiado aplicado exógenamente desde un espacio extracelular (es decir, en ausencia de internalización celular del péptido aplicado) o en presencia de PLE, que es una mezcla de microglobulina B2 y otros componentes.
[0504] Después de los tratamientos, todos los conjuntos de células se lavaron y se incubaron con el reactivo multímero TCR CMV-pp65-PE STAR durante una hora en hielo. Las células se lavaron y se midió la fluorescencia de las muestras mediante citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo Accuri™ C6 (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.) para detectar la presencia y cuantificar cualquier multímero TCR CMV-pp65-PE STAR™ unido a células en la población (a veces denominado en el presente documento como "tinción").
[0505] Los resultados del análisis de citometría de flujo de los conjuntos de células tratadas de manera diferente se muestran en la Figura 5 y la Tabla 14. El control sin tratar se usó para identificar las poblaciones de células positivas y negativas empleando una puerta que da como resultado menos del 1% de células de el control sin tratar en la puerta "positiva" (que representa la señal de fondo). Luego se aplicó la misma puerta a las otras muestras para caracterizar la población positiva para cada muestra. En la Figura 5, los histogramas de citometría de flujo se dan con los recuentos (número de células) en el eje Y y las unidades fluorescentes relativas (RFU) en el eje X (escala logarítmica). La línea gris en todos los histogramas muestra el perfil de las células no tratadas y la línea negra muestra el perfil de las células tratadas según el tratamiento indicado. En la Tabla 14, Se proporciona el porcentaje de células en un conjunto de tratamiento que se tiñeron positivamente para el complejo C2-epítopo-péptido-HLA-A2. Las células positivas en este ensayo fueron células que se unieron al reactivo TCR-CMV-pp65-PE STAR y se contaron en la puerta positiva descrita anteriormente. La Tabla 14 también muestra para cada conjunto la intensidad fluorescente media indexada correspondiente ("iMFI", la fluorescencia de la población positiva multiplicada por el porcentaje positivo) en RFU.
Tabla 14. Resultados de citometría de flu jo para proteínas dirigidas a células de ejemplo de la presente invención : complejos péptido-epítopo C2-MHC de clase I detectados en las superficies de células diana intoxicadas
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[0506] Las células administradas con que comprende proteína exógena 43-51-C2, 53-61-C2, y 104-112-C2 mostraron una señal positiva para la superficie celular, complejos de C2-péptido-HLA-A2 en 7,6%, 4,5% y el 6,7% de las células de su población, respectivamente. Por el contrario, las poblaciones de células que fueron "no tratadas" y tratadas con "péptido C2 solamente" contenían menos del 1% de células positivas (0,96 y 0,95 por ciento, respectivamente). Debido a la eficiencia del procesamiento y la cinética, que no se midieron, es posible que el porcentaje de complejo C2-péptido-HLA-A2 presentado detectado en un solo punto de tiempo en una muestra de tratamiento de "proteína dirigida a células" no refleje con precisión la presentación máxima posible mediante estas proteínas de la presente invención dirigidas a células de ejemplo.
[0507] La población de "péptido C2 y PLE" de control positivo contenía un 36,7% de células positivas; sin embargo, el péptido solo se puede cargar en la superficie desde un espacio extracelular ("exógenamente") y en presencia de PLE, tal como se muestra al comparar con los resultados del "péptido C2 solo" que tenía un nivel de tinción de base similar (0,95 %) al del control sin tratar.
[0508] La detección del epítopo C2 de células T integrado exógenamente administrado complejado con moléculas de MHC de clase I humanas (epítopo-péptido C2/HLA-A2) en la superficie celular de células diana intoxicadas demostró que las proteínas dirigidas a células que comprenden las regiones efectoras de la toxina Shiga de ejemplo 43-51-C2, 53-61-C2 o 104-112-C2 fueron capaces de entrar en las células diana, realizar un enrutamiento subcelular suficiente y suministrar suficiente epítopo de células T integrado a la vía del MHC de clase I para presentación de superficie en la superficie de la célula diana.
Ejemplo 5. Ensayo de citó lis is mediada por células T citotóxicas de células diana intoxicadas y otras respuestas inmunitarias desencadenadas por la presentación de MHC de Clase I de epítopos de células T suministrados por proteínas de la presente invención
[0509] En este ejemplo, se utilizan ensayos estándar conocidos en la técnica para investigar las consecuencias funcionales de presentación de MHC de clase I de células diana de epítopos de células T suminsitrados por proteínas dirigidas de células de ejemplo de la presente invención. Las consecuencias funcionales a investigar incluyen la activación de CTL, la muerte de células diana mediada por CTL y la liberación de citocinas CTL por CTL.
[0510] Se utiliza un ensayo de citotoxicidad basado en CTL para evaluar las consecuencias de la presentación de epítopos. El ensayo incluye células T y células diana cultivadas en tejido. Las células diana se intoxican como se describe en el Ejemplo 4. Brevemente, las células diana se incuban durante seis horas en condiciones estándar con diferentes proteínas administradas exógenamente, donde determinadas proteínas comprenden un polipéptido efector de toxina Shiga de la presente invención o un polipéptido efector de toxina de la difteria de la presente invención. A continuación, se añaden CTL a las células diana intoxicadas y se incuban para permitir que las células T reconozcan y se unan a cualquier célula diana que presente complejos epítopo-péptido/MHC de clase I. Luego, se investigan determinadas consecuencias funcionales utilizando procedimientos estándar conocidos por el trabajador experto, incluida la unión de CTL a las células diana, la muerte de las células diana mediante citólisis mediada por CTL, y la liberación de citosinas, tales como citocinas, tales como interferón gamma o interleucinas mediante ELISA o ELIspot.
[0511] La activación de CTLs por las células diana que presentan el epítopo péptido clase/MHC I complejos se cuantifica usando ensayos de respuesta de CTL disponibles comercialmente, por ejemplo CytoTox96® ensayos no radiactivos (Promega, Madison, WI, EE.UU.), ensayos de granzima B ELISpot (Mabtech, Inc., Cincinnati, OH, EE. UU.), Ensayos de actividad de caspasa y ensayos de citometría de flujo de translocación LAMP-1. Para monitorear específicamente la destrucción de células diana mediada por CTL, se usa éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) para las células diana para investigación in vitro e in vivo como se describe en la técnica (ver, por ejemplo, Durward M et al., J Vis Exp 45 pii 2250 (2010)).
Ejemplo 6. Una proteína citotóxica que comprende un polipéptido efector de toxina Shiga hiperinmunizado de células T y células B/CD4+ desinmunizadas de células T y una región de unión específica a CD20 (aCD20 fusionada con SLT-1A)
[0512] En este ejemplo, una región efectora de toxina Shiga hiperinmunizada de células T y células B/CD4+ desinmunizadas de células T se deriva de la subunidad A de la toxina 1 similar a Shiga (SLT-1A) como se describió anteriormente. Un antígeno aCD20 de la región de unión de tipo inmunoglobulina se deriva de un dominio de tipo inmunoglobulina que reconoce CD20 humano (véase, por ejemplo, Haisma et al., Blood 92: 184-90 (1999); Geng S et al., Cell Mol Immunol 3: 439 -43 (2006); Olafesn T et al., Protein Eng Des Sel 23: 243-9 (2010)), que comprende una región de unión de tipo inmunoglobulina capaz de unirse a una parte extracelular de CD20. CD20 se expresa en múltiples tipos de células cancerosas, tales como, por ejemplo, células de linfoma de células B, células de leucemia de células pilosas, células de leucemia linfocítica crónica de células B y células de melanoma. Además, CD20 es un objetivo atractivo para la terapéutica para tratar determinadas enfermedades autoinmunes, trastornos,
Construcción, producción y purificación de la proteína citotóxica SLT-1A::aCD20
[0513] El tipo inmunoglobulina región de unión aCD20 y Shiga toxina región efectora (tales como, por ejemplo, SEQ ID NOs: 11-43) están unidos entre sí. Por ejemplo, una proteína de fusión se produce expresando un polinucleótido que codifica la proteína de unión al antígeno aCD20 SLT-1A::aCD20 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 49, 50 y 51). La expresión de la proteína citotóxica SLT-1A::aCD20 se logra usando sistemas de traducción de proteínas bacterianos y/o libres de células como se describe en los ejemplos anteriores.
Determinación de las características in vitro de la proteína citotóxica SLT-1A::aCD20
[0514] Las características de unión, la unión específica máxima (B max) y las constantes de unión en equilibrio (K d ), de la proteína citotóxica de este ejemplo para las células CD20+ y células CD20- se determina por basado en la fluorescencia, citometría de flujo. Se mide que la B max para SLT-1A::aCD20 a células CD20+ es aproximadamente 50.000-200.000 MFI con una K d dentro del rango de 0,01-100 nM, mientras que no hay unión significativa a células CD20- en este ensayo.
[0515] Las capacidades de inactivación de ribosomas de la SLT-1A::proteína citotóxica aCD20 se determina en una, in vitro la traducción de proteínas libre de células como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores. El efecto inhibidor de la proteína citotóxica de este ejemplo sobre la síntesis de proteínas libres de células es significativo. El IC 50 de SLT-1A::aCD20 en la síntesis de proteínas en este ensayo libre de células es de aproximadamente 0,1-100 pM.
Determinación de la citotoxicidad de la proteína citotóxica SLT-1A::aCD20 mediante un ensayo de eliminación de células CD20+
[0516] Las características de citotoxicidad de SLT-1A::aCD20 se determinan por el ensayo general de célula-kill como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores utilizando células CD20+. Además, las características de citotoxicidad selectiva de SLT-1A::aCD20 se determinan mediante el mismo ensayo general de destrucción de células usando células CD20- como comparación con las células CD20+. El CD 50 de la proteína citotóxica de este ejemplo es aproximadamente 0,01-100 nM para las células CD20+, dependiendo de la línea celular. El CD 50de la proteína citotóxica es aproximadamente 10-10000 veces mayor (menos citotóxica) para las células que no expresan CD20 en una superficie celular en comparación con las células que expresan CD20 en una superficie celular. Además, la citotoxicidad de SLT-1A::aCD20 se investiga tanto para la citotoxicidad directa como indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL.
Determinación de los efectos in vivo de la proteína citotóxica SLT-1A::aCD20 utilizando modelos animales
[0517] Los modelos animales se utilizan para determinar los efectos in vivo de la proteína citotóxica SLT-1A::aCD20 sobre las células neoplásicas. Se utilizan diversas cepas de ratones para probar el efecto de la proteína citotóxica después de la administración intravenosa sobre tumores de xenoinjerto en ratones resultantes de la inyección en esos ratones de células neoplásicas humanas que expresan CD20 en sus superficies celulares. La muerte celular se investiga para determinar tanto la citotoxicidad directa como la citotoxicidad indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL.
Ejemplo 7. Una proteína citotóxica que comprende un polipéptido efector de toxina Shiga hiperinmunizada de células T y células B/CD4+ desinmunizadas de células T y una región de unión específica para HER2 ("aHER2-V h H fusionado con SLT-1A" )
[0518] En este ejemplo, la región efectora de la toxina Shiga hiperinmunizada de linfocitos T CD8+ y linfocitos B/linfocitos T CD4+ desinmunizados se deriva de la subunidad A de la toxina 1 similar a Shiga (SLT-1A) como se describe sobre. La región de unión de tipo inmunoglobulina es aHER2 V h H derivada de una región variable de dominio único de la proteína 5F7 del anticuerpo de camélido (V h H), como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2011/0059090.
Construcción, producción y purificación de la proteína citotóxica "aHER2-V h H fusionada con SLT-1A"
[0519] La región de tipo inmunoglobulina de unión y Shiga toxina región efector están unidos entre sí para formar una proteína fusionada (véase, por ejemplo, SEQ ID NOs: 52, 53, y 54). En este ejemplo, un polinucleótido que codifica la región variable aHER2-V h H derivada de la proteína 5F7 puede clonarse en marco con un polinucleótido que codifica un enlazador conocido en la técnica y en marco con un polinucleótido que codifica la región efectora de la toxina Shiga que comprende aminoácidos de SEC ID N°: 11-43. Las variantes de proteínas citotóxicas "aHER2-V h H fusionadas con SLT-1A" se crean de manera que la región de unión se localiza opcionalmente adyacente al extremo amino de la región efectora de la toxina Shiga y opcionalmente comprende un motivo de señal del retículo endoplásmico carboxi-terminal de la familia KDEL. Expresión de "aHER2-VLa h H fusionada con variantes de proteínas citotóxicas SLT-1A "se logra utilizando sistemas de traducción de proteínas bacterianos y/o libres de células como se describe en los ejemplos anteriores.
Determinación de las características in vitro de la proteína citotóxica "aHEP2-V h H fusionada con SLT-1A"
[0520] Las características de unión de la proteína citotóxica de este ejemplo para células HER2+ y HER2 células se determina mediante un basado en la fluorescencia, citometría de flujo. El B max para "aHER2-V h H fusionado con variantes SLT-1A" a células HER2+ se mide en aproximadamente 50,000-200,000 MFI con un K d dentro del rango de 0.01-100 nM, mientras que no hay unión significativa a HER2 - células en este ensayo.
[0521] Las capacidades ribosoma inactivación de la "aHER2-V h H fusionan con SLT-1A" proteínas citotóxicas se determinan en una, in vitro la traducción de proteínas libre de células como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores. El efecto inhibidor de la proteína citotóxica de este ejemplo sobre la síntesis de proteínas libres de células es significativo. El IC 50 de "aHER2-V h H fusionado con SLT-1A" variantes en la síntesis de proteínas en este ensayo libre de células es de aproximadamente 0,1-100 pM.
Determinación de la citotoxicidad de la proteína citotóxica "aHER2-V h H fusionada con SLT-1A" mediante un ensayo de destrucción celular de HER2+
[0522] Las características de citotoxicidad de "aHER2-V h H fusionado con SLT-1A" variantes se determinan por el ensayo general de célula-kill como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores utilizando células HER2+. Además, las características de citotoxicidad selectiva de "aHER2-V h H fusionado con SLT-1A" se determinan mediante el mismo ensayo general de destrucción de células usando células HER2- como comparación con las células HER2+. El CD 50 de la proteína citotóxica de este ejemplo es aproximadamente 0,01-100 nM para las células HER2+, dependiendo de la línea celular. El CD 50de la proteína citotóxica es aproximadamente 10-10000 veces mayor (menos citotóxica) para las células que no expresan HER2 en una superficie celular en comparación con las células que expresan HER2 en una superficie celular. Además, la citotoxicidad de aHER2-V h H fusionado con SLT-1A se investiga tanto para citotoxicidad directa como indirecta mediante la entrega y presentación de epítopos de células T que conducen a citotoxicidad mediada por CTL.
Determinación de los efectos in vivo de la proteína citotóxica aHER2-V h H fusionada con SLT-1A utilizando modelos animales
[0523] Los modelos animales se utilizan para determinar los efectos in vivo de la proteína citotóxica aHER2-V h H fusionado con SLT-1A en células neoplásicas. Se usan diversas cepas de ratones para probar el efecto de la proteína citotóxica después de la administración intravenosa sobre tumores de xenoinjerto en ratones que resultan de la inyección en esos ratones de células neoplásicas humanas que expresan HER2 en sus superficies celulares. La muerte celular se investiga para determinar tanto la citotoxicidad directa como la citotoxicidad indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL.
Ejemplo 8. Una proteína citotóxica que comprende un polipéptido efector de toxina Shiga hiperinmunizado de células T y células B/CD4+ desinmunizadas de células T y una región de unión derivada del anticuerpo aEpstein-Barr-antígeno
[0524] En este ejemplo, la región efectora de la toxina Shiga hiperinmunizada de células T CD8+ y células B/CD4+ desinmunizadas de células T es un polipéptido efector de toxina Shiga desinmunizado derivado de la subunidad A de la toxina 1 similar a Shiga (SLT -1A) como se describe anteriormente. Una región de unión de tipo inmunoglobulina aEpstein-Barr-antígeno se deriva de un anticuerpo monoclonal contra un antígeno de Epstein Barr (Fang C et al., J Immunol Methods 287: 21-30 (2004)), que comprende una región de unión de tipo inmunoglobulina capaz de unirse a una célula humana infectada por el virus de Epstein-Barr o una célula transformada que expresa un antígeno de Epstein-Barr. El antígeno de Epstein-Barr se expresa en múltiples tipos de células, como las células infectadas por un virus de Epstein-Barr y las células cancerosas (por ejemplo, linfoma y células cancerosas nasofaríngeas). Además, la infección de Epstein-Barr se asocia con otras enfermedades, por ejemplo, esclerosis múltiple.
Construcción, producción y purificación de la proteína citotóxica SLT-1A::aEpsteinBarr::KDEL
[0525] El tipo inmunoglobulina de antígeno aEpstein Barr-región de unión y Shiga toxina región efector están unidos entre sí, y una KDEL carboxi-terminal (SEQ ID NO: 61) se añade para formar una proteína. Por ejemplo, una proteína de fusión se produce expresando un polinucleótido que codifica la proteína de unión al antígeno aEpstein-Barr SLT-1A::aEpsteinBarr::KDEL. La expresión de la proteína citotóxica SLT-1A::aEpsteinBarr::KDEL se logra usando sistemas de traducción de proteínas bacterianos y/o libres de células como se describe en los ejemplos anteriores.
Determinación de las características in vitro de la proteína citotóxica SLT-1A::aEpsteinBarr::KDEL
[0526] Las características de unión de la proteína citotóxica de este ejemplo para células positivas de Epstein-Barr antígeno y células negativas de antígeno de Epstein-Barr se determina por basado en la fluorescencia, citometría de flujo. La B max para SLT-1A::aEpsteinBarr::KDEL a células positivas al antígeno de Epstein-Barr se mide en aproximadamente 50,000-200,000 MFI con una K d dentro del rango de 0.01-100 nM, mientras que no hay unión significativa a Epstein -Células negativas al antígeno Bar en este ensayo.
[0527] Las capacidades de inactivación de ribosomas de la-1A SLT::aEpsteinBarr::KDEL proteína citotóxica se determina en una, in vitro la traducción de proteínas libre de células como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores. El efecto inhibidor de la proteína citotóxica de este ejemplo sobre la síntesis de proteínas libres de células es significativo. El IC 50 de SLT-1A::aEpsteinBarr::KDEL en la síntesis de proteínas en este ensayo libre de células es de aproximadamente 0,1-100 pM.
Determinación de la citotoxicidad de la proteína citotóxica SLT-1A::aEpsteinBarr::KDEL mediante un ensayo de destrucción celular
[0528] Las características de citotoxicidad de SLT-1A::aEpsteinBarr::KDEL se determinan por el ensayo general de célula-kill como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores utilizando células positivas Epstein-Barr antígeno. Además, las características de citotoxicidad selectiva de SLT-1A::aEpsteinBarr::KDEL se determinan mediante el mismo ensayo general de destrucción celular utilizando células negativas al antígeno Epstein-Barr como comparación con las células positivas al antígeno Epstein-Barr. El CD 50 de la proteína citotóxica de este ejemplo es aproximadamente 0,01-100 nM para las células positivas al antígeno de Epstein-Barr, dependiendo de la línea celular. El CD 50de la proteína citotóxica es aproximadamente 10-10 000 veces mayor (menos citotóxica) para las células que no expresan el antígeno de Epstein-Barr en una superficie celular en comparación con las células que expresan el antígeno de Epstein-Barr en una superficie celular. Además, se investiga la citotoxicidad de SLT-1A::aEpsteinBarr::KDEL para determinar la citotoxicidad directa y la citotoxicidad indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL.
Determinación de los efectos in vivo de la proteína citotóxica SLT-1A::aEpsteinBarr::KDEL utilizando modelos animales
[0529] Los modelos animales se utilizan para determinar los efectos in vivo de la proteína citotóxica SLT-1A::aEpsteinBarr::KDEL en células neoplásicas. Se utilizan diversas cepas de ratones para ensayar el efecto de la proteína citotóxica después de la administración intravenosa sobre tumores de xenoinjerto en ratones resultantes de la inyección en esos ratones de células neoplásicas humanas que expresan antígenos de Epstein-Barr en sus superficies celulares. La muerte celular se investiga para determinar tanto la citotoxicidad directa como la citotoxicidad indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL.
Ejemplo 9. Una proteína citotóxica que comprende un polipéptido efector de toxina Shiga hiperinmunizado de células T y células B/CD4+ desinmunizadas de células T y una región de unión derivada del anticuerpo aLeishmania-antígeno
[0530] En este ejemplo, la región toxina efector Shiga es una célula T CD8+ hiper-inmunizados y de células B/células T CD4+ de-inmunizado Shiga polipéptido toxina efector deriva de la subunidad A de la toxina similar a Shiga 1 (SLT -1A) como se describe anteriormente. Un antígeno de aLeishmania de la región de unión de tipo inmunoglobulina se deriva de un anticuerpo generado, usando técnicas conocidas en la técnica, contra un antígeno de Leishmania de la superficie celular presente en células humanas que albergan un protozoo tripanosomátido intracelular (ver Silveira T et al., Int J Parasitol 31: 1451-8 (2001); Kenner J et al., J Cutan Pathol 26: 130-6 (1999); Berman J y Dwyer, Clin Exp Immunol 44: 342-348 (1981)).
Construcción, producción y purificación de la proteína citotóxica SLT-1A::aLeishmania::KDEL
[0531] El tipo inmunoglobulina región de unión a-Leishmania-antígeno y Shiga toxina región efector están unidos entre sí, y una KDEL carboxi-terminal (SEQ ID NO: 61) se añade para formar una proteína. Por ejemplo, una proteína de fusión se produce expresando un polinucleótido que codifica la proteína de unión al antígeno de Leishmania SLT-1A::aLeishmania::KDEL. La expresión de la proteína citotóxica SLT-1A::aLeishmania::KDEL se logra usando sistemas de traducción de proteínas bacterianos y/o libres de células como se describe en los ejemplos anteriores.
Determinación de las características in vitro de la proteína citotóxica SLT-1A::aLeishmania::KDEL
[0532] Las características de unión de la proteína citotóxica de este ejemplo para células positivas de Leishmania antígeno y células negativas de antígeno de Leishmania se determina por basado en la fluorescencia, citometría de flujo. La B max para SLT-1A::aLeishmania::KDEL a células positivas al antígeno de Leishmania se mide en aproximadamente 50,000-200,000 MFI con una K d dentro del rango de 0.01-100 nM, mientras que no hay unión significativa al antígeno de Leishmania negativo. células en este ensayo.
[0533] Las capacidades de inactivación de ribosomas de la SLT-1A::proteína citotóxica aLeishmania::KDEL se determina en una, in vitro la traducción de proteínas libre de células como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores. El efecto inhibidor de la proteína citotóxica de este ejemplo sobre la síntesis de proteínas libres de células es significativo. El IC 50 de SLT-1A::aLeishmania::KDEL en la síntesis de proteínas en este ensayo libre de células es de aproximadamente 0,1-100 pM.
Determinación de la citotoxicidad de la proteína citotóxica SLT-1A::aLeishmania::KDEL mediante un ensayo de destrucción celular
[0534] Las características de citotoxicidad de SLT-1A::aLeishmania::KDEL se determinan por el ensayo general de célula-kill como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores utilizando células positivas antígeno de Leishmania. Además, las características de citotoxicidad selectiva de SLT-1A::aLeishmania::KDEL se determinan mediante el mismo ensayo general de destrucción de células utilizando células negativas al antígeno Leishmania como comparación con las células positivas al antígeno Leishmania. El CD 50 de la proteína citotóxica de este ejemplo es aproximadamente 0,01-100 nM para las células positivas al antígeno de Leishmania, dependiendo de la línea celular. El CD 50de la proteína citotóxica es aproximadamente 10-10 000 veces mayor (menos citotóxica) para las células que no expresan el antígeno de Leishmania en una superficie celular en comparación con las células que expresan el antígeno de Leishmania en una superficie celular. Además, se investiga la citotoxicidad de SLT-1A::aLeishmania::KDEL para determinar la citotoxicidad directa y la citotoxicidad indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL.
Ejemplo 10. Una proteína citotóxica que comprende un polipéptido efector de toxina Shiga hiperinmunizada de células T y células B/CD4+ desinmunizadas de células T y una región de unión derivada de un receptor de neurotensina a de región de unión de tipo inmunoglobulina
[0535] En este ejemplo, la región toxina efector Shiga es una célula T CD8+ hiper-inmunizados y de células B/células T CD4+ de-inmunizado Shiga polipéptido toxina efector deriva de la subunidad A de la toxina similar a Shiga 1 (SLT -1A) como se describe anteriormente. Un receptor de neurotensina a de región de unión de tipo inmunoglobulina se deriva de DARPin ™ (Acceso a GenBank: 2P2C_R) o un anticuerpo monoclonal (Ovigne J et al., Neuropeptides 32: 247-56 (1998)) que se une al receptor de neurotensina humano. El receptor de neurotensina es expresado por varias células cancerosas, como cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, melanoma y células de cáncer de páncreas.
Construcción, producción y purificación de la proteína citotóxica SLT-1A::aNeurotensinR::KDEL
[0536] El tipo inmunoglobulina región de unión región toxina efector aNeurotensinR y Shiga están unidos entre sí, y una KDEL carboxi-terminal (SEQ ID NO: 61) se añade para formar una proteína. Por ejemplo, una proteína de fusión se produce expresando un polinucleótido que codifica la proteína de unión al receptor de neurotensina SLT-1A::aNeurotensinR::KDEL. La expresión de la proteína citotóxica SLT-1A::aNeurotensinR::KDEL se logra usando sistemas de traducción de proteínas bacterianos y/o libres de células como se describe en los ejemplos anteriores.
Determinación de las características in vitro de la proteína citotóxica SLT-1A::aNeurotensinR::KDEL
[0537] Las características de unión de la proteína citotóxica de este ejemplo para células positivas de receptor de neurotensina y células negativas de receptor de neurotensina se determina por basado en la fluorescencia, citometría de flujo. La B max para SLT-1A::aNeurotensinR::KDEL a las células positivas al receptor de neurotensina se mide en aproximadamente 50,000-200,000 MFI con una K d dentro del rango de 0.01-100 nM, mientras que no hay unión significativa al receptor de neurotensina negativo. células en este ensayo.
[0538] Las capacidades de inactivación de ribosomas de la-1A SLT::aNeurotensinR::KDEL proteína citotóxica se determina en una, in vitro la traducción de proteínas libre de células como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores. El efecto inhibidor de la proteína citotóxica de este ejemplo sobre la síntesis de proteínas libres de células es significativo. El IC 50 de SLT-1A::aNeurotensinR::KDEL en la síntesis de proteínas en este ensayo libre de células es de aproximadamente 0,1-100 pM.
Determinación de la citotoxicidad de la proteína citotóxica SLT-1A::aNeurotensinR::KDEL mediante un ensayo de destrucción celular
[0539] Las características de citotoxicidad de SLT-1A::aNeurotensinR::KDEL se determinan por el ensayo general de célula-kill como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores utilizando células positivas de receptor de neurotensina. Además, las características de citotoxicidad selectiva de SLT-1A::aNeurotensinR::KDEL se determinan mediante el mismo ensayo general de destrucción de células utilizando células negativas al receptor de neurotensina como comparación con las células positivas al receptor de neurotensina. El CD 50 de la proteína citotóxica de este ejemplo es aproximadamente 0,01-100 nM para las células positivas al receptor de neurotensina, dependiendo de la línea celular. El CD 50de la proteína citotóxica es aproximadamente 10-10 000 veces mayor (menos citotóxica) para las células que no expresan el receptor de neurotensina en una superficie celular en comparación con las células que expresan el receptor de neurotensina en una superficie celular. Además, la citotoxicidad de SLT-1A::aNeurotensinR::KDEL se investiga tanto para citotoxicidad directa como indirecta mediante la entrega y presentación de epítopos de células T que conducen a citotoxicidad mediada por CTL.
Determinación de los efectos in vivo de la proteína citotóxica SLT-1A::aNeurotensinR::KDEL utilizando modelos animales
[0540] Los modelos animales se utilizan para determinar los efectos in vivo de la proteína citotóxica SLT-1A::aNeurotensinR::KDEL en células neoplásicas. Se utilizan diversas cepas de ratones para ensayar el efecto de la proteína citotóxica después de la administración intravenosa sobre tumores de xenoinjerto en ratones resultantes de la inyección en esos ratones de células neoplásicas humanas que expresan receptores de neurotensina en sus superficies celulares. La muerte celular se investiga para determinar tanto la citotoxicidad directa como la citotoxicidad indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL.
Ejemplo 11. Una proteína citotóxica que comprende un polipéptido efector de toxina Shiga hiperinmunizado de células T y células B/CD4+ desinmunizadas de células T y una región de unión derivada de una región de unión de tipo inmunoglobulina aEGFR
[0541] En este ejemplo, la región toxina efector Shiga es de células T CD8+ hiper-inmunizados y de células B/células T CD4+ de-inmunizado Shiga polipéptido toxina efector deriva de la subunidad A de la toxina similar a Shiga 1 (SLT-1A). La región de unión aEGFR se deriva de AdNectin ™ (Acceso a GenBank: 3QWQ_B), Affibody ™ (Acceso a GenBank: 2KZI_A; patente de EE.UU. 8.598.113), o un anticuerpo, todos los cuales se unen a uno o más receptores del factor de crecimiento epidérmico humano. La expresión de los receptores del factor de crecimiento epidérmico está asociada con células cancerosas humanas, tales como, por ejemplo, células cancerosas de pulmón, células cancerosas de mama y células cancerosas de colon.
Construcción, producción y purificación de la proteína citotóxica SLT-1A::aEGFR::KDEL
[0542] El tipo inmunoglobulina región de unión región toxina efector aEGFR y Shiga están unidos entre sí, y una KDEL carboxi-terminal (SEQ ID NO: 61) se añade para formar una proteína. Por ejemplo, una proteína de fusión se produce expresando un polinucleótido que codifica la proteína de unión a EGFR SLT-1A::aEGFR::KDEL. La expresión de la proteína citotóxica SLT-1A::aEGFR::KDEL se logra usando sistemas de traducción de proteínas bacterianos y/o libres de células como se describe en los ejemplos anteriores.
Determinación de las características in vitro de la proteína citotóxica SLT-1A::aEGFR::KDEL
[0543] Las características de unión de la proteína citotóxica de este ejemplo para las células EGFR+ y EGFR células se determina por basado en la fluorescencia, citometría de flujo. La B max para SLT-1A::aEGFR::KDEL a células EGFR+ se mide en aproximadamente 50,000-200,000 MFI con una K d dentro del rango de 0.01-100 nM, mientras que no hay unión significativa a células EGFR- en este ensayo.
[0544] Las capacidades de inactivación de ribosomas de la-1A SLT::aEGFR::KDEL proteína citotóxica se determina en una, in vitro la traducción de proteínas libre de células como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores. El efecto inhibidor de la proteína citotóxica de este ejemplo sobre la síntesis de proteínas libres de células es significativo. El IC 50 de SLT-1A::aEGFR::KDEL en la síntesis de proteínas en este ensayo libre de células es de aproximadamente 0,1-100 pM.
Determinación de la citotoxicidad de la proteína citotóxica SLT-1A::aEGFR::KDEL mediante un ensayo de destrucción celular
[0545] Las características de citotoxicidad de SLT-1A::aEGFR::KDEL se determinan por el ensayo general de célulakill como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores utilizando células EGFR+. Además, las características de citotoxicidad selectiva de SLT-1A::aEGFR::KDEL se determinan mediante el mismo ensayo general de destrucción de células utilizando células EGFR- como comparación con las células positivas al antígeno de Leishmania. El CD 50 de la proteína citotóxica de este ejemplo es aproximadamente 0,01-100 nM para células EGFR+ dependiendo de la línea celular. El CD 50de la proteína citotóxica es aproximadamente 10-10 000 veces mayor (menos citotóxica) para las células que no expresan EGFR en una superficie celular en comparación con las células que expresan EGFR en una superficie celular. Además, se investiga la citotoxicidad de SLT-1A::aEGFR::KDEL para determinar tanto la citotoxicidad directa como la indirecta mediante la entrega y presentación de epítopos de células T que conducen a la citotoxicidad mediada por CTL.
Determinación de los efectos in vivo de la proteína citotóxica SLT-1A::aEGFR::KDEL utilizando modelos animales
[0546] Los modelos animales se utilizan para determinar los efectos in vivo de la proteína citotóxica SLT-1A::aEGFR::KDEL en células neoplásicas. Se utilizan diversas cepas de ratones para ensayar el efecto de la proteína citotóxica después de la administración intravenosa sobre tumores de xenoinjerto en ratones resultantes de la inyección en esos ratones de células neoplásicas humanas que expresan EGFR (s) en sus superficies celulares. La muerte celular se investiga para determinar tanto la citotoxicidad directa como la citotoxicidad indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL.
Ejemplo 12. Una proteína citotóxica que comprende un polipéptido efector de toxina Shiga hiperinmunizado de células T y células B/CD4+ desinmunizadas de células T y una región de unión derivada del anticuerpo aCCR5
[0547] En este ejemplo, la región toxina efector Shiga es una célula T CD8+ hiper-inmunizados y de células B/células T CD4+ de-inmunizado Shiga polipéptido toxina efector deriva de la subunidad A de la toxina similar a Shiga 1 (SLT -1A). Una región de unión de tipo inmunoglobulina aCCR5 se deriva de un anticuerpo monoclonal contra CCR5 humano (CD195) (Bernstone L et al., Hybridoma 31: 7-19 (2012)). CCR5 se expresa predominantemente en células T, macrófagos, células dendríticas y microglía. Además, CCR5 desempeña un papel en la patogenia y la propagación del virus de inmunodeficiencia humana (VIH).
Construcción, producción y purificación de la proteína citotóxica SLT-1A::aCCR5::KDEL
[0548] El tipo inmunoglobulina región de unión región toxina efector aCCR5 y Shiga están unidos entre sí, y una KDEL carboxi-terminal (SEQ ID NO: 61) se añade para formar una proteína. Por ejemplo, una proteína de fusión se produce expresando un polinucleótido que codifica la proteína de unión a aCCR5 SLT-1A::aCCR5::KDEL. La expresión de la proteína citotóxica SLT-1A::aCCR5::KDEL se logra usando sistemas de traducción de proteínas bacterianos y/o libres de células como se describe en los ejemplos anteriores.
Determinación de las características in vitro de la proteína citotóxica SLT-1A::aCCR5
[0549] Las características de unión de la proteína citotóxica de este ejemplo para las células CCR5+ y CCR5 células se determina por basado en la fluorescencia, citometría de flujo. La B max para SLT-1A::aCCR5::KDEL a células positivas CCR5+ se mide en aproximadamente 50,000-200,000 MFI con un K d dentro del rango de 0.01-100 nM, mientras que no hay unión significativa a las células CCR5- en este ensayo.
[0550] Las capacidades de inactivación de ribosomas de la SLT-1A::proteína citotóxica aCCR5::KDEL se determina en una, in vitro la traducción de proteínas libre de células como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores. El efecto inhibidor de la proteína citotóxica de este ejemplo sobre la síntesis de proteínas libres de células es significativo. El IC 50 de SLT-1A::aCCR5::KDEL en la síntesis de proteínas en este ensayo libre de células es de aproximadamente 0,1-100 pM.
Determinación de la citotoxicidad de la proteína citotóxica SLT-1A::aCCR5::KDEL mediante un ensayo de destrucción celular
[0551] Las características de citotoxicidad de SLT-1A::aCCR5::KDEL se determinan por el ensayo general de célulakill como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores utilizando células CCR5+. Además, las características de citotoxicidad selectiva de SLT-1A::aCCR5::KDEL se determinan mediante el mismo ensayo general de destrucción de células utilizando células CCR5- como comparación con las células CCR5+. El CD 50 de la proteína citotóxica de este ejemplo es aproximadamente 0,01-100 nM para las células CCR5+, dependiendo de la línea celular. El CD 50de la proteína citotóxica es aproximadamente 10-10000 veces mayor (menos citotóxica) para las células que no expresan CCR5 en una superficie celular en comparación con las células que expresan CCR5 en una superficie celular. Además, se investiga la citotoxicidad de SLT-1A::aCCR5::KDEL para determinar tanto la citotoxicidad directa como la indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL.
Determinación de los efectos in vivo de la proteína citotóxica SLT-1A::aCCR5::KDEL utilizando modelos animales
[0552] Se utilizan modelos animales para determinar los efectos in vivo de la proteína citotóxica SLT-1A::aCCR5::KDEL en células T agotadoras de materiales de donantes (véase Tsirigotis P et al., Immunotherapy 4: 407-24 (2012)). Se utilizan primates no humanos para determinar los efectos in vivo de SLT-1A::aCCR5. La enfermedad de injerto contra huésped se analiza en macacos rhesus después de un trasplante de riñón cuando los órganos donados se tratan previamente con SLT-1A::aCCR5::KDEL (véase Weaver T et al., Nat Med 15: 746-9 (2009)). Se observa una depleción in vivo de linfocitos T de sangre periférica en primates cynomolgus después de la administración parenteral de diferentes dosis de SLT-1A::aCCR5::KDEL. La muerte celular se investiga para determinar tanto la citotoxicidad directa como la citotoxicidad indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL. El uso de SLT-1A::aCCR5 :: La muerte celular se investiga para determinar tanto la citotoxicidad directa como la citotoxicidad indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL.
Ejemplo 13. Una proteína citotóxica que comprende un polipéptido efector de toxina Shiga hiperinmunizado de células T y células B/CD4+ desinmunizadas de células T y una región de unión derivada de un dom inio de inm unoglobulina anti-Env
[0553] En este ejemplo, la región efectora de la toxina Shiga es un polipéptido efector de toxina Shiga de células T CD8+ hiperinmunizado y desinmunizado de células T CD4+ derivado de la subunidad A de la toxina Shiga (StxA). Una región de unión de tipo inmunoglobulina aEnv se deriva de anticuerpos existentes que se unen a la glicoproteína de la envoltura del VIH (Env), como GP41, GP120, GP140 o GP160 (véase, por ejemplo, Chen W et al., J Mol Bio 382: 779-89 (2008). ); Chen W et al., Expert Opin Biol Ther 13: 657-71 (2013); van den Kerkhof T et al., Retrovirology 10: 102 (2013)) o de anticuerpos generados usando técnicas estándar (ver Prabakaran et al. , Front Microbiol 3: 277 (2012)). Las Env son proteínas de la superficie del VIH que también se muestran en las superficies celulares de las células infectadas por el VIH durante la replicación del VIH. Aunque las Env se expresan en células infectadas predominantemente en compartimentos endosomales, Podrían estar presentes cantidades suficientes de Envs en la superficie de una célula para ser el objetivo de una proteína de la presente invención, altamente potente, citotóxica y dirigida a células. Además, las proteínas citotóxicas que se dirigen a Env pueden unirse a los viriones del VIH y entrar en las células recién infectadas durante la fusión de los viriones con una célula huésped.
[0554] Debido a que las pantallas de VIH una alta tasa de mutación, es preferible utilizar un dominio de inmunoglobulina que se une una parte constreñida funcional de un Env, tales como se muestra mediante la neutralización en términos generales anticuerpos que se unen Env a partir de múltiples cepas del VIH (van den Kerkhof T et al., Retrovirology 10: 102 (2013)). Debido a que se cree que las Env presentes en la superficie de una célula infectada presentan epítopos estéricamente restringidos (Chen W et al., J Virol 88: 1125-39 (2014)), es preferible usar menos de 100 kD e idealmente menores de 25 kD , como dominios sdAbs o V h H.
Construcción, producción y purificación de la proteína citotóxica SLT-1A::aEnv::KDEL
[0555] La región de unión de tipo inmunoglobulina región toxina efector aEnv y Shiga están unidos entre sí, y se añade un KDEL carboxi-terminal para formar una proteína citotóxica. Por ejemplo, una proteína de fusión se produce expresando un polinucleótido que codifica la proteína de unión a aEnv SLT-1A::aEnv::KDEL. La expresión de la proteína citotóxica SLT-1A::aEnv::KDEL se logra usando sistemas de traducción de proteínas bacterianos y/o libres de células como se describe en los ejemplos anteriores.
Determinación de las características in vitro de la proteína citotóxica SLT-1A::aEnv::KDEL
[0556] Las características de unión de la proteína citotóxica de este ejemplo para las células Env+ y células env se determina por el ensayo basado en la fluorescencia, citometría de flujo. La B max para SLT-1A::aEnv::KDEL a las células positivas de Env+ se mide en aproximadamente 50,000-200,000 MFI con una K d dentro del rango de 0.01­ 100 nM, mientras que no hay unión significativa a las celdas Env- en este ensayo.
[0557] Las capacidades de inactivación de ribosomas de la SLT-1A::proteína citotóxica aEnv::KDEL se determina en una, in vitro la traducción de proteínas libre de células como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores. El efecto inhibidor de la proteína citotóxica de este ejemplo sobre la síntesis de proteínas libres de células es significativo. El IC 50 de SLT-1A::aEnv::KDEL en la síntesis de proteínas en este ensayo libre de células es de aproximadamente 0,1-100 pM.
Determinación de la citotoxicidad de la proteína citotóxica SLT-1A::aEnv::KDEL mediante un ensayo de destrucción celular
[0558] Las características de citotoxicidad de SLT-1A::aEnv::KDEL se determinan por el ensayo general de célula-kill como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores utilizando células+ Env. Además, las características de citotoxicidad selectiva de SLT-1A::aEnv::KDEL se determinan mediante el mismo ensayo general de destrucción de células utilizando células Env- como comparación con las células Env+. El CD 50 de la proteína citotóxica de este ejemplo es aproximadamente 0,01-100 nM para las células Env+, dependiendo de la línea celular y/o la cepa de VIH utilizada para infectar las células para hacerlas Env+. El CD 50de la proteína citotóxica es aproximadamente 10-10000 veces mayor (menos citotóxica) para las células que no expresan Env en una superficie celular en comparación con las células que expresan Env en una superficie celular. Además, se investiga la citotoxicidad de SLT-1A::aEnv::KDEL para determinar tanto la citotoxicidad directa como la indirecta mediante la entrega y presentación de epítopos de células T que conducen a la citotoxicidad mediada por CTL.
Determinación de los efectos in vivo de la proteína citotóxica SLT-1A::aEnv::KDEL utilizando modelos animales
[0559] El uso de SLT-1A::aEnv::KDEL para inhibir la infección por VIH se prueba mediante la administración de SLT-1A::aEnv::KDEL al virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV) infectado primates no humanos (ver Sellier P et al ., PLoS One 5: e10570 (2010)). La muerte celular se investiga para determinar tanto la citotoxicidad directa como la citotoxicidad indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL.
Ejemplo 14. Una proteína citotóxica que comprende un polipéptido efector de toxina Shiga hiperinmunizado de células T y células B/CD4+ desinmunizadas de células T y una región de unión derivada del anticuerpo aUL18
[0560] En este ejemplo, la región toxina efector Shiga es una célula T CD8+ hiper-inmunizados y de células B/células T CD4+ de-inmunizado Shiga polipéptido toxina efector deriva de la subunidad A de la toxina similar a Shiga 1 (SLT -1A). Una región de unión de tipo inmunoglobulina aUL18 se deriva de un anticuerpo generado, usando técnicas conocidas en la técnica, para la proteína UL18 del citomegalovirus de la superficie celular, que está presente en células humanas infectadas con citomegalovirus (Yang Z, Bjorkman P, Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 105: 10095-100 (2008)). La infección por citomegalovirus humano está asociada con varios cánceres y trastornos inflamatorios.
Construcción, producción y purificación de la proteína citotóxica SLT-1A::aUL18::KDEL
[0561] La región de unión de tipo inmunoglobulina aUL18 y la región efectora de la toxina Shiga se unen entre sí y se añade un KDEL carboxi-terminal (SEQ ID NO: 61) para formar una proteína. Por ejemplo, una proteína de fusión se produce expresando un polinucleótido que codifica la proteína de unión a aUL18 SLT-1A::aUL18::KDEL. La expresión de la proteína citotóxica SLT-1A::aUL18::KDEL se logra usando sistemas de traducción de proteínas bacterianos y/o libres de células como se describe en los ejemplos anteriores.
Determinación de las características in vitro de la proteína citotóxica SLT-1A::aUL18::KDEL
[0562] Las características de unión de la proteína citotóxica de este ejemplo para células positivas proteína de citomegalovirus UL18 y UL18 células negativas de proteína de citomegalovirus se determina por basado en la fluorescencia, citometría de flujo. La B max para SLT-1A::aUL18::KDEL a las células positivas de la proteína del citomegalovirus UL18 se mide en aproximadamente 50,000-200,000 MFI con una K d dentro del rango de 0.01-100 nM, mientras que no hay unión significativa a la proteína del citomegalovirus Células UL18 negativas en este ensayo.
[0563] Las capacidades de inactivación de ribosomas de la-1A SLT::aUL18::KDEL proteína citotóxica se determina en una, in vitro la traducción de proteínas libre de células como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores. El efecto inhibidor de la proteína citotóxica de este ejemplo sobre la síntesis de proteínas libres de células es significativo. El IC 50 de SLT-1A::aUL18::KDEL en la síntesis de proteínas en este ensayo libre de células es de aproximadamente 0,1-100 pM.
Determinación de la citotoxicidad de la proteína citotóxica SLT-1A::aUL18::KDEL mediante un ensayo de destrucción celular
[0564] Las características de citotoxicidad de SLT-1A::aUL18::KDEL se determinan mediante el ensayo de destrucción celular general como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores usando células positivas para la proteína UL18 del citomegalovirus. Además, las características de citotoxicidad selectiva de SLT-1A::aUL18::KDEL se determinan mediante el mismo ensayo general de destrucción de células utilizando células negativas para la proteína del citomegalovirus UL18 como comparación con las células positivas para la proteína del citomegalovirus UL18. El CD 50 de la proteína citotóxica de este ejemplo es aproximadamente 0,01-100 nM para las células positivas a la proteína del citomegalovirus UL18 dependiendo de la línea celular. El CD 50de la proteína citotóxica es aproximadamente 10-10 000 veces mayor (menos citotóxica) para las células que no expresan la proteína UL18 del citomegalovirus en una superficie celular en comparación con las células que expresan la proteína UL18 del citomegalovirus en una superficie celular. Además, se investiga la citotoxicidad de SLT-1A::aUL18::KDEL para determinar la citotoxicidad directa y la citotoxicidad indirecta mediante la entrega y presentación de epítopos de células T que conducen a la citotoxicidad mediada por CTL.
Ejemplo 15. Una proteína citotóxica que comprende un polipéptido efector de toxina de la difteria hiperinmunizada de células T y células B/CD4+ desinmunizadas de células T y una región de unión específica a CD20 (aCD20 fusionada con toxina de la difteria)
[0565] En este ejemplo, una región efectora de la toxina de la difteria hiperinmunizada de células T CD8+ y células B/células T CD4+ desinmunizadas se deriva de la subunidad A de la toxina de la difteria 1 como se describió anteriormente. Un antígeno aCD20 de la región de unión de tipo inmunoglobulina se deriva de un dominio de tipo inmunoglobulina que reconoce CD20 humano (véase, por ejemplo, Haisma et al., Blood 92: 184-90 (1999); Geng S et al., Cell Mol Immunol 3: 439 -43 (2006); Olafesn T et al., Protein Eng Des Sel 23: 243-9 (2010)), que comprende una región de unión de tipo inmunoglobulina capaz de unirse a una parte extracelular de CD20. CD20 se expresa en múltiples tipos de células cancerosas, tales como, por ejemplo, células de linfoma de células B, células de leucemia de células pilosas, células de leucemia linfocítica crónica de células B y células de melanoma. Además, CD20 es un objetivo atractivo para la terapéutica para tratar determinadas enfermedades autoinmunes, trastornos,
Construcción, producción y purificación de la toxina de la difteria de proteínas citotóx¡cas::aCD20
[0566] La región de unión de tipo inmunoglobulina aCD20 y la región efectora de la toxina de la difteria (tal como, por ejemplo, SEQ ID NO: 46, 47 y 48) están unidas entre sí. Por ejemplo, una proteína de fusión se produce expresando un polinucleótido que codifica la proteína de unión al antígeno aCD20, la toxina de la difteria: aCD20 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 55, 56 y 57). La expresión de la toxina de la difteria de SLT::proteína citotóxica aCD20 se logra usando sistemas de traducción de proteínas bacterianos y/o libres de células como se describe en los ejemplos anteriores.
Determinación de las características in vitro de la toxina de la difteria de proteínas c¡totóx¡cas::aCD20
[0567] Las características de unión de la proteína citotóxica de este ejemplo para las células CD20+ y CD20-células se determina por, ensayo de citometría de flujo basada en la fluorescencia como se describe en las patentes anteriores. La B max para la toxina de la dilteria::células aCD20 a CD20+ se mide en aproximadamente 50.000-200.000 MFI con una K d dentro del intervalo de 0,01-100 nM, mientras que no hay unión significativa a las células CD20- en este ensayo.
[0568] Las capacidades de inactivación de ribosomas de la toxina de la difteria::proteína citotóxica aCD20 se determina en una, in vitro la traducción de proteínas libre de células como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores. El efecto inhibidor de la proteína citotóxica de este ejemplo sobre la síntesis de proteínas libres de células es significativo. El IC 50 de la toxina de la difteria::aCD20 en la síntesis de proteínas en este ensayo libre de células es de aproximadamente 0,1-100 pM.
Determinación de la citotoxicidad de la toxina de la difteria de proteínas c¡totóx¡cas::aCD20 mediante un ensayo de eliminación de células CD20+
[0569] Las características de citotoxicidad de la toxina de la difteria::aCD20 se determinan por el ensayo general de célula-kill como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores utilizando células CD20+. Además, las características de citotoxicidad selectiva de la toxina de la difteria::aCD20 se determinan mediante el mismo ensayo general de destrucción de células utilizando células CD20- como comparación con las células CD20+. El CD 50 de la proteína citotóxica de este ejemplo es aproximadamente 0,01-100 nM para las células CD20+, dependiendo de la línea celular. El CD 50de la proteína citotóxica es aproximadamente 10-10 000 veces mayor (menos citotóxica) para las células que no expresan CD20 en una superficie celular en comparación con las células que expresan CD20 en una superficie celular. Además, la citotoxicidad de la toxina de la difteria::aCD20 se investiga tanto para la citotoxicidad directa como indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL.
Determinación de los efectos in vivo de la toxina de la difteria de proteínas c¡totóx¡cas::aCD20 utilizando modelos animales
[0570] Los modelos animales se utilizan para determinar los efectos in vivo de la toxina de la difteria proteína citotóxica::aCD20 sobre las células neoplásicas. Se utilizan diversas cepas de ratones para probar el efecto de la proteína citotóxica después de la administración intravenosa sobre tumores de xenoinjerto en ratones resultantes de la inyección en esos ratones de células neoplásicas humanas que expresan CD20 en sus superficies celulares. La muerte celular se investiga para determinar tanto la citotoxicidad directa como la citotoxicidad indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL.
Ejemplo 16. Una proteína citotóxica que comprende un polipéptido efector de toxina de la difteria hiperinmunizada de células T y células B/CD4+ desinmunizadas de toxina de la difteria y una región de unión específica a HER2 ("aHER2-V h H fusionado con toxina de la difteria")
[0571] En este ejemplo, el inmunizados hiper CD8+ de células T y de células B/células T CD4+ difteria región de­ inmunizado toxina efector se deriva de la subunidad A de la toxina de la difteria como se describió anteriormente. La región de unión de tipo inmunoglobulina es aHER2 V h H derivada de una región variable de dominio único de la proteína 5F7 del anticuerpo de camélido (V h H), como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2011/0059090.
Construcción, producción y purificación de la proteína citotóxica "aHER2-V h H fusionada con toxina de la difteria"
[0572] La región y la difteria región toxina efector de unión de tipo inmunoglobulina están unidos entre sí para formar una proteína fusionada (véase, por ejemplo, SEQ ID NOs: 58, 59, y 60). En este ejemplo, un polinucleótido que codifica la región variable aHER2-V h H derivada de la proteína 5F7 puede clonarse en marco con un polinucleótido que codifica un enlazador conocido en la técnica y en marco con un polinucleótido que codifica la región efectora de la toxina de la difteria que comprende aminoácidos de SEC ID N°: 46, 47 o 48. Variantes de "aHER2-V hH fusionada con las proteínas citotóxicas de la toxina de la difteria se crean de manera que la región de unión está ubicada opcionalmente adyacente al extremo amino de la región efectora de la toxina de la difteria y comprende opcionalmente un motivo de señal del retículo endoplásmico carboxi-terminal de la familia KDEL. Expresión de " aHER2-V h H fusionada con variantes de proteína citotóxica de toxina de la difteria se logra usando sistemas de traducción de proteínas bacterianos y/o libres de células como se describe en los ejemplos anteriores.
Determinación de las características in vitro de las proteínas citotóxicas "aHER2-V h H fusionadas con toxina de la difteria"
[0573] Las características de unión de la proteína citotóxica de este ejemplo para células HER2+ y HER2 células se determina por, ensayo de citometría de flujo basada en la fluorescencia como se describe en las patentes anteriores. La B max para "aHER2-V h H fusionada con toxina de la difteria" a las células HER2+ se mide en aproximadamente 50,000-200,000 MFI con una K d dentro del rango de 0.01-100 nM, mientras que no hay unión significativa a las células HER2- en este ensayo.
[0574] Las capacidades ribosoma inactivación de la "aHER2-V h H fusionan con toxina de la difteria" proteínas citotóxicas se determina en una, in vitro la traducción de proteínas libre de células como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores. El efecto inhibidor de la proteína citotóxica de este ejemplo sobre la síntesis de proteínas libres de células es significativo. El IC 50 de "aHER2-V h H fusionado con toxina de la difteria" en la síntesis de proteínas en este ensayo libre de células es de aproximadamente 0,1-100 pM.
Determinación de la citotoxicidad de la proteína citotóxica "aHER2-V h H fusionada con toxina de la difteria" mediante un ensayo de destrucción celular HER2+
[0575] Las características de citotoxicidad de "aHER2-V h H fusionan con toxina de la difteria" se determina por el ensayo general de célula-kill como se describe anteriormente en los ejemplos anteriores utilizando células HER2+. Además, las características de citotoxicidad selectiva de "aHER2-V h H fusionado con toxina de la difteria" se determinan mediante el mismo ensayo general de destrucción de células usando células HER2- como comparación con las células HER2+. El CD 50 de la proteína citotóxica de este ejemplo es aproximadamente 0,01-100 nM para las células HER2+, dependiendo de la línea celular. El CD 50de la proteína citotóxica es aproximadamente 10-10 000 veces mayor (menos citotóxica) para las células que no expresan HER2 en una superficie celular en comparación con las células que expresan HER2 en una superficie celular. Además, se investiga la citotoxicidad de "aHER2-V h H fusionado con toxina de la difteria" tanto para citotoxicidad directa como indirecta mediante la entrega y presentación de epítopos de células T que conducen a citotoxicidad mediada por CTL.
Determinación de los efectos in vivo de la proteína citotóxica "aHER2-V h H fusionada con toxina de la difteria" utilizando modelos animales
[0576] Los modelos animales se utilizan para determinar los efectos in vivo de la proteína citotóxica "aHER2-V h H fusionado con toxina de la difteria" en células neoplásicas. Se usan diversas cepas de ratones para probar el efecto de la proteína citotóxica después de la administración intravenosa sobre tumores de xenoinjerto en ratones que resultan de la inyección en esos ratones de células neoplásicas humanas que expresan HER2 en sus superficies celulares. La muerte celular se investiga para determinar tanto la citotoxicidad directa como la citotoxicidad indirecta mediante la entrega y presentación del epítopo de células T que conduce a la citotoxicidad mediada por CTL.
Ejemplo 17. Células T hiperinmunizadas y/o células B/CD4+ Células T desinmunizadas Proteínas citotóxicas derivadas de la toxina Shiga dirigidas a varios tipos de células
[0577] En este ejemplo, la región efectora de la toxina Shiga comprende polipéptido efector de la toxina Shiga hiperinmunizado de células T y/o células B/CD4+ desinmunizado de células T derivado de la subunidad A de la toxina 1 similar a Shiga (SLT-1A) , Toxina Shiga (StxA) y/o toxina 2 similar a Shiga (SLT-2A) con una cualquiera o más de las regiones de epítopo de células B mencionadas anteriormente interrumpidas mediante uno o más epítopos de células T integrados o insertados. Una región de unión se deriva del dominio de inmunoglobulina de la molécula elegida de la columna 1 de la Tabla 15 y que se une a la biomolécula diana extracelular indicada en la columna 2 de la Tabla 15. Las proteínas citotóxicas de ejemplo de este ejemplo se crean opcionalmente con un KDEL carboxi-terminal. -tipo de motivo de señal y/o agente (s) promotores de la detección usando reactivos y técnicas conocidas en la técnica. Las proteínas citotóxicas de ejemplo de este ejemplo se prueban como se describe en los ejemplos anteriores usando células que expresan las biomoléculas diana extracelulares apropiadas. Las proteínas de ejemplo de este ejemplo pueden usarse, por ejemplo, para diagnosticar y tratar enfermedades, afecciones y/o trastornos indicados en la columna 3 de la Tabla 15.
Tabla 15. Diversas regiones de unión para el reconocimiento celular de proteínas citotóxicas
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Claims (35)

REIVINDICACIONES
1. Polipéptido desinmunizado derivado de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental, en el que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental comprende o consiste en:
(i) los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2, o SEQ ID NO: 3;
(ii) los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3;
(iii) los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; o
(iv) los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3;
en el que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental es capaz de enrutarse a un compartimento de citosol de una célula en el que está presente;
en el que el polipéptido desinmunizado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con:
(i) los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3;
(ii) los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3;
(iii) los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; o
(iv) los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3;
en el que el polipéptido desinmunizado comprende un epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado en dicho polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental; en el que el epítopo de células T CD8+ integrado, heterólogo, reemplaza un número equivalente de residuos de aminoácidos en el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental, de modo que el polipéptido desinmunizado que comprende el epítopo CD8+ integrado, heterólogo, tiene el mismo número total de aminoácidos que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental en ausencia del epítopo de células T CD8+ integrado, heterólogo;
en el que el epítopo de células T CD8+ integrado heterólogo altera un epítopo de células B endógenas y/o un epítopo de células T CD4+ del polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental, tal como lo demuestra la antigenicidad o inmunogenicidad reducida de las células B y/o la antigenicidad o inmunogenicidad reducida de células T CD4+ del polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga que comprende el epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado, en comparación con el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga parental en ausencia del epítopo de células T CD8+ integrado heterólogo;
y en el que dicho epítopo de células B endógenas está posicionado en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consiste en:
las regiones del epítopo de células B: 1-15 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 3-14 de SEQ ID NO: 3; 26-37 de SEQ ID NO: 3; 27-37 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 39-48 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 42-48 de SEQ ID NO: 53-66 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; 94-115 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO 141-153 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 140-156 de SEQ ID NO: 3; 179-190 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO 179-191 de SEQ ID NO: 3; 204 de SEQ ID NO: 3; 205 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 210-218 de SEQ ID NO 240-260 de SEQ ID NO: 3; 243-257 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y 254-268 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO
y/o
en el que dicho epítopo de células T CD4+ endógenas está posicionado en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consiste en las regiones del epítopo de células T CD4+: 4-33 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 34-78 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 77-103 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 128-168 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; 160-183 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2; y 236­ 258 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2;
y en el que el polipéptido desinmunizado que comprende el epítopo CD8+ heterólogo integrado es capaz de suministrar de forma intracelular el epítopo de células T CD8+ integrado, heterólogo desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente el polipéptido.
2. Polipéptido desinmunizado derivado de un polipéptido efector de la toxina de la difteria parental, en el que el polipéptido efector de la toxina de la difteria parental comprende o consiste en los aminoácidos 2 a 389 de SEQ ID NO: 45; en el que el polipéptido efector de la toxina de la difteria parental es capaz de enrutarse a un compartimento de citosol de una célula en la que está presente;
en el que el polipéptido desinmunizado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 2 a 389 de SEQ ID NO: 45;
en el que el polipéptido desinmunizado comprende un epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado en dicho polipéptido efector de la toxina de la difteria parental; en el que el epítopo de células T CD8+ integrado, heterólogo, reemplaza un número equivalente de residuos de aminoácidos en el polipéptido efector de la toxina de la difteria parental, de modo que el polipéptido desinmunizado que comprende el epítopo CD8+ integrado, heterólogo, tiene el mismo número total de aminoácidos que el polipéptido efector de la toxina de la difteria parental en ausencia del epítopo de células T CD8+ integrado, heterólogo;
en el que el epítopo de células T CD8+ integrado heterólogo altera un epítopo de células B endógenas y/o un epítopo de células T CD4+ del polipéptido efector de la toxina de la difteria parental, tal como lo demuestra la antigenicidad o inmunogenicidad reducida de células B y/o la antigenicidad o inmunogenicidad reducida de células T CD4+ del polipéptido efector de la toxina de la difteria que comprende el epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado, en comparación con el polipéptido efector de la toxina de la difteria parental en ausencia del epítopo de células T CD8+ integrado, heterólogo;
y en el que dicho epítopo de células B endógenas está posicionado en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consiste en las regiones del epítopo de células B: 3-10 de SEQ ID NO: 44; 15-31 de SEQ ID NO: 44; 32-54 de SEQ ID NO: 44; 33-43 de SEQ ID NO: 44; 71-77 de SEQ ID NO: 44; 93-113 de SEQ ID NO: 44; 125-131 de SEQ ID NO: 44; 138-146 de SEQ ID NO: 44; 141-167 de SEQ ID NO: 44; 165-175 de SEQ ID NO: 44; 182-201 de SEQ ID NO: 45; 185-191 de SEQ ID NO: 44; y 225-238 de SEQ ID NO: 45;
y/o en el que dicho epítopo de células T CD4+ endógenas está posicionado en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de aminoácidos posicionados de forma nativa que consiste en las regiones del epítopo de células T CD4+: 2-21 de SEQ ID NO: 45; 22-41 de SEQ ID NO: 45; 32-71 de SEQ ID NO: 45; 72-91 de SEQ ID NO: 45; 82-221 de SEQ ID NO: 45; 212-231 de SEQ ID NO: 45; 232-251 de SEQ ID NO: 45; y 251-301 de SEQ ID NO: 45; y en el que el polipéptido desinmunizado que comprende el epítopo CD8+ heterólogo integrado es capaz de suministrar de forma intracelular el epítopo de células T CD8+ integrado heterólogo desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente el polipéptido.
3. Polipéptido desinmunizado, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido desinmunizado que comprende el epítopo CD8+ heterólogo integrado es capaz de mostrar una o más funciones efectoras de toxina además del suministro intracelular de un epítopo de células T CD8+ desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente el polipéptido.
4. Molécula de reconocimiento celular que comprende un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un grupo o agente de reconocimiento celular.
5. Composición farmacéutica que comprende
un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una molécula de reconocimiento celular, según la reivindicación 4; y
al menos un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.
6. Polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, una molécula de reconocimiento celular, según la reivindicación 4, o una composición farmacéutica según la reivindicación 5, para uso como medicamento.
7. Polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, una molécula de reconocimiento celular, según la reivindicación 4, o una composición farmacéutica, según la reivindicación 5, para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, un tumor, un trastorno inmunológico o una infección microbiana.
8. Molécula de reconocimiento celular, según la reivindicación 4 o una composición farmacéutica, según la reivindicación 5, para su uso, según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en la que dicha molécula de reconocimiento celular o composición farmacéutica es para la administración mediante "sembrado" de un locus tisular dentro un cordado;
opcionalmente, en el que el locus del tejido comprende tejido maligno, tejido enfermo, tejido inflamado, masa tumoral, crecimiento canceroso, tumor, tejido infectado o masa celular anormal,
y/u, opcionalmente, en el que el epítopo de células T heterólogo de la molécula de reconocimiento celular se selecciona del grupo que consiste en: péptido no presentado de forma nativa por las células diana de la molécula de reconocimiento celular en complejos MHC de clase I, secuencia de péptido no presente de forma nativa dentro de cualquier proteína expresada por una célula diana, secuencia de péptido no presente de forma nativa dentro del proteoma de una célula diana, péptido no presente de forma nativa en un microambiente extracelular del sitio a sembrar y péptido no presente de forma nativa en una masa tumoral o tejido infectado del locus del tejido.
9. Composición de diagnóstico que comprende:
una molécula de reconocimiento celular, según la reivindicación 4; y
un agente promotor de la detección.
10. Uso de un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, una molécula de reconocimiento celular, según la reivindicación 4, una composición farmacéutica, según la reivindicación 5, o una composición de diagnóstico, según la reivindicación 9, en el diagnóstico in vitro, pronóstico o caracterización de una enfermedad, trastorno o afección.
11. Polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, una molécula de reconocimiento celular, según la reivindicación 4, una composición farmacéutica, según la reivindicación 5, o una composición de diagnóstico, según la reivindicación 9, para uso en el diagnóstico in vivo, pronóstico o caracterización de una enfermedad, trastorno o afección.
12. Kit que comprende:
(i) un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3;
(ii) una molécula de reconocimiento celular según la reivindicación 4;
(iii) una composición farmacéutica según la reivindicación 5;
(iv) una composición de diagnóstico según la reivindicación 9;
(v) un polinucleótido que codifica un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una molécula de reconocimiento celular según la reivindicación 4, o un complemento del mismo,
(vi) un vector de expresión que codifica un polinucleótido según (v); y/o
(vii) una célula huésped que comprende un polinucleótido según (v) o un vector de expresión según (vi);
y que comprende además un reactivo adicional y/o dispositivo de administración farmacéutica.
13. Procedimiento para aumentar la inmunogenicidad de células T CD8+ de un polipéptido parental capaz de suministrar de forma intracelular un epítopo de células T CD8+ desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente el polipéptido,
en el que el el polipéptido parental comprende un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o un polipéptido efector de la toxina de la difteria;
comprendiendo el procedimiento la etapa de:
integrar un epítopo de células T CD8+ heterólogo en el polipéptido efector de la toxina;
en el que la etapa de integración implica reemplazar un número equivalente de residuos de aminoácidos en el polipéptido efector de la toxina con el epítopo de células T CD8+ heterólogo, de modo que el polipéptido resultante que comprende el epítopo de células T CD8+ integrado heterólogo tiene el mismo número total de aminoácidos que el polipéptido efector de toxina en ausencia del epítopo de células T CD8+ integrado heterólogo; y
en el que el polipéptido resultante que comprende el epítopo de células T CD8+ integrado heterólogo, es capaz de suministrar de forma intracelular el epítopo de células T CD8+ integrado desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente el polipéptido que comprende el epítopo de células T CD8+ heterólogo.
14. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que el polipéptido parental comprende un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con:
(i) los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 , o SEQ ID NO: 3;
(ii) los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3;
(iii) los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; o
(iv) los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
15. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que el polipéptido parental comprende un polipéptido efector de la toxina de la difteria que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 2 a 389 de la SEQ ID NO: 45.
16. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en el que la etapa de integración da lugar a un polipéptido efector de toxina capaz de mostrar una o más funciones efectoras de toxina además del suministro intracelular del epítopo de células T CD8+ integrado desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina.
17. Procedimiento, según la reivindicación 16, en el que una o más funciones efectoras de toxina se seleccionan entre actividad enzimática y citotoxicidad.
18. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en el que la etapa de integrar el epítopo de células T CD8+ heterólogo en el polipéptido efector de la toxina altera un epítopo de células B endógenas, un epítopo de células T CD4+ endógenas, y/o un dominio catalítico del polipéptido efector de toxina.
19. Procedimiento para crear una molécula de suministro de epítopo de células T CD8+ capaz de suministrar un epítopo de células T CD8+ desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente la molécula de suministro,
comprendiendo el procedimiento la etapa de:
integrar un epítopo de células T CD8+ heterólogo en un polipéptido efector que suministra un proteasoma capaz de suministrar de forma intracelular un epítopo de células T desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente la molécula de suministro;
en el que el polipéptido efector que suministra un proteasoma comprende un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o un polipéptido efector de la toxina de la difteria;
en el que la etapa de integración implica reemplazar un número equivalente de residuos de aminoácidos en el polipéptido efector de la toxina con el epítopo de células T CD8+ heterólogo, de modo que la molécula de suministro del epítopo de células T CD8+ resultante que comprende el epítopo de las células T CD8+ heterólogo integrado tiene el mismo número total de aminoácidos que el polipéptido efector que suministra un proteasoma en ausencia del epítopo de células T CD8+ integrado, heterólogo;
y en el que la molécula de suministro del epítopo de células T CD8+ resultante es capaz de suministrar de forma intracelular el epítopo de células T CD8+ integrado desde un compartimento endosómico temprano a una molécula de MHC de clase I de una célula en la que está presente la molécula de suministro del epítopo de células T CD8+.
20. Procedimiento, según la reivindicación 19, en el que el polipéptido efector que suministra un proteasoma comprende un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con:
(i) los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2, o SEQ ID NO: 3;
(ii) los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3;
(iii) los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; o
(iv) los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
21. Procedimiento, según la reivindicación 19, en el que el polipéptido efector que suministra un proteasoma comprende un polipéptido efector de la toxina de la difteria que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 2 a 389 de SEQ ID NO: 45.
22. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 19-21, en el que la etapa de integración da como resultado una molécula de suministro de epítopo de células T CD8+ que comprende un polipéptido efector de toxina capaz de mostrar una o más funciones efectoras de toxina además del suministro intracelular del epítopo de células T CD8+ de un compartimento endosómico temprano a una molécula MHC de clase I de una célula en la que está presente el polipéptido efector de la toxina.
23. Procedimiento, según la reivindicación 22, en el que una o más funciones efectoras de toxina se seleccionan entre actividad enzimática y citotoxicidad.
24. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 19-23, en el que la etapa de integrar el epítopo de células T CD8+ en el polipéptido efector de toxina altera un epítopo de células B endógenas, un epítopo de células T CD4+ endógenas y/o un dominio catalítico del polipéptido efector de la toxina.
25. Procedimiento para reducir la inmunogenicidad de las células B de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o polipéptido efector de la toxina de la difteria que tiene un epítopo de células B,
comprendiendo el procedimiento la etapa de:
integrar un epítopo de células T CD8+ heterólogo en el polipéptido efector de subunidad A de la toxina Shiga o polipéptido efector de toxina de la difteria que tiene un epítopo de células B, de manera que uno o más residuos de aminoácidos del epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado alteran el epítopo de células B en el polipéptido efector de toxina;
en el que la etapa de integración implica reemplazar un número equivalente de residuos de aminoácidos en el polipéptido efector de la toxina con el epítopo de células T CD8+ heterólogo, de modo que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria desinmunizados resultantes que comprenden el epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado tiene el mismo número total de aminoácidos que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria en ausencia del epítopo de células T CD8+ integrado heterólogo;
y en el que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria desinmunizados que comprenden el epítopo de células T CD8+ integrado heterólogo es capaz de suministrar intracelularmente el epítopo de células T CD8+ integrado desde un compartimento endosómico temprano a una clase de MHC I molécula de una célula en la que está presente el polipéptido desinmunizado.
26. Procedimiento, según la reivindicación 25, en el que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con:
(i) los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO 3;
(ii) los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3;
(iii) los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; o
(iv) los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
27. Procedimiento, según la reivindicación 25, en el que el polipéptido efector de la toxina de la difteria tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 2 a 389 de la SEQ ID NO: 45.
28. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en el que el procedimiento implica una etapa inicial de: identificar un epítopo de células B en el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria para la alteración con uno o más residuos de aminoácidos de un epítopo de células T CD8+ integrado en el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria.
29. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 25-28, en el que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina A de Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria tiene un epítopo de células B, y en el que la etapa de alteración del epítopo de las células B comprende realizar una o más sustituciones de aminoácidos en el epítopo de células B.
30. Procedimiento para reducir la inmunogenicidad de células T CD4+ de un polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o polipéptido efector de la toxina de la difteria que tiene un epítopo de células T CD4+, comprendiendo el procedimiento comprende la etapa de:
integrar un epítopo de células T CD8+ heterólogo en el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria que tiene un epítopo de células T CD4+, de manera que uno o más residuos de aminoácidos del epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado altera el epítopo de células T CD4+ en el polipéptido efector de toxina;
en el que la etapa de integración implica reemplazar un número equivalente de residuos de aminoácidos en el polipéptido efector de la toxina con el epítopo de células T CD8+, de modo que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria desinmunizados resultantes que comprenden el epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado tiene el mismo número total de aminoácidos que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria en ausencia del epítopo de células T CD8+ integrado heterólogo;
y en el que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria desinmunizados que comprenden el epítopo de células T CD8+ integrado heterólogo es capaz de suministrar intracelularmente el epítopo de células T CD8+ integrado desde un compartimento endosómico temprano a una clase de MHC I molécula de una célula en la que está presente el polipéptido desinmunizado.
31. Procedimiento, según la reivindicación 30, en el que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con:
(i) los aminoácidos 75 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO 3;
(ii) los aminoácidos 1 a 241 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3;
(iii) los aminoácidos 1 a 251 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3; o
(iv) los aminoácidos 1 a 261 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
32. Procedimiento, según la reivindicación 30, en el que el polipéptido efector de la toxina de la difteria tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con los aminoácidos 2 a 389 de la SEQ ID NO: 45.
33. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 30-32, en el que el procedimiento comprende una etapa inicial de:
identificar un epítopo de células T CD4+ en el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria para la alteración con uno o más residuos de aminoácido de un epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado en el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria.
34. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 30-33, en el que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria tiene un epítopo de células T CD4+, y en el que la etapa de alteración del epítopo de células T CD4+ comprende realizar una o más sustituciones de aminoácidos en el epítopo de células T CD4+.
35. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 25-34, en el que el polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o el polipéptido efector de la toxina de la difteria desinmunizados que comprenden el epítopo de células T CD8+ heterólogo integrado es capaz de mostrar una función del polipéptido efector de la subunidad A de la toxina Shiga o función del polipéptido efector de la toxina efectora de la toxina de la difteria seleccionada entre actividad enzimática y citotoxicidad.
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