JP2021129598A - Mhcクラスiエピトープ送達ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
)系は、脊索動物において適応免疫系の一部として機能する(Janeway's Immunobiology
(Murphy K, ed., Garland Science, 8thed.,2011))。脊索動物体内で、細胞外抗原は
MHCクラスII系によって提示されるが、細胞内抗原はMHCクラスI系によって提示されうる。
Bリンパ球(B細胞)などでありうる。これらの抗原提示細胞は、CD4陽性(CD4+,CD4 positive)Tリンパ球(T細胞)による認識のためにMHCクラスII分子と複合体を形成した特定のペプチドを該細胞表面に提示する。その一方で、MHCクラスI系は、脊索動物のほとんどの細胞において機能して、CD8+T細胞による認識のために細胞内空間、一般にサイトゾル、から抗原性ペプチドを提示する。
と考えられているが、特定の損傷細胞はこのプロセスによって同様に除去されうる。MHCクラスI分子と複合体を形成した抗原ペプチドの提示は、溶解、アポトーシスの誘導、及び/又は壊死によって提示細胞を細胞毒性T細胞(CTL,cytotoxic T-cell)による標的化殺滅に対して感作させる。MHCクラスI分子と複合体を形成した特異的ペプチドエピトープの提示は、がん、腫瘍及び細胞内病原体に対する免疫応答の刺激及び維持に大きな役割を果たす。
ドの輸送、3)特定のペプチドと結合しているMHCクラスI分子の安定した複合体形成、4)細胞表面でのそれらの安定したペプチド−MHCクラスI分子複合体(ペプチド−MHCクラスI複合体)の提示、及び5)特異的CD8+T細胞(特異的CTLを含む)による提示された特定の抗原性ペプチド−MHCクラスI複合体の認識。
は、高特異的免疫グロブリン型の抗原結合ドメインを用いて、MHCクラスI分子が強い親和性を有する特異的ペプチドのみと堅く結合する。その後、ペプチド−MHCクラスI
複合体は、細胞外環境への提示及びCD8+T細胞による認識のために分泌経路によって細胞膜に輸送される。
する。MHC対立遺伝子は高可変性であり、これらの多型によって付与される多様性は、二通りで、すなわち、ペプチド抗原の結合に影響を及ぼすことによって、及びMHC分子とTCR間の接触領域に影響を及ぼすことによって、T細胞による認識に影響を及ぼすことができる。その特定の細胞表面TCRを介したCTLによる抗原−MHCクラスI分子複合体認識に応じて、CTLは、主として提示細胞へのパーフォリン及び/又はグランザイム送達によって媒介される細胞溶解活性によって、抗原−MHCクラスI複合体提示細胞を殺滅することになる。加えて、CTLは、免疫賦活性サイトカイン、例えば、インターフェロンガンマ(IFN−ガンマ,interferon gamma)、腫瘍壊死因子(TNF,tumor necrosisfactor)アルファ、マクロファージ炎症性タンパク質−1ベータ(MIP−1ベータ,macrophageinflammatory protein-1 beta)、並びにインターロイキン、例えば
IL−17、IL−4及びIL−22などを放出することになる。さらに、活性化されたCTLは、それらを活性化したエピトープ−MHCクラスI複合体の提示細胞の近位を、その近位細胞の存在するペプチド−MHCクラスI複合体レパートリーにかかわらず、無差別に殺滅することができる(Wiedemann A et al., Proc Natl Acad SciUSA103: 10985-90 (2006))。これらのエピトープ−MHCクラスI複合体誘導免疫応答を、患者体
内の特定の細胞タイプを殺滅するための並びに他の近位細胞に対して免疫系を感作するための治療薬に利用することができるだろうと考えられた。
を参照されたい)。
系治療薬は、レシピエントの免疫系による攻撃標的にされる傾向がある(総説については、Sauerborn M etal.,Trends Pharmacol Sci 31: 53-9 (2010)を参照されたい)。脊椎
動物免疫系は、自然免疫系と適応免疫系の両方で外来性ポリペプチド配列を認識することに適応している。したがって、例えば2つの異種ヒトポリペプチド配列の組換え接合部を含むポリペプチドのヒトへの投与などの、同じ脊椎動物種からの脊椎動物へのポリペプチドの投与は、非自己として認識され、免疫応答を惹起しうる。
と呼ばれるソフトウェアをうまく利用して、組換えタンパク質におけるT細胞免疫原性を予測した(De GrootAet al., Dev Biol (Basel) 122: 171-94 (2005)、Koren E et al.,
Clin Immunol 124:26-32 (2007))。
の感染又は悪性細胞、への細胞毒性の標的化送達のための細胞標的化、CD8+T細胞エピトープ送達分子の様々な実施形態も提供する。
ソーム区画からプロテアソームにT細胞エピトープを細胞内送達することができ、方法が、ポリペプチドに異種CD8+T細胞エピトープを組み込む又は挿入するステップを含む方法がある。方法の特定のさらなる実施形態において、方法のポリペプチドは毒素に由来する。方法の特定のさらなる実施形態において、ポリペプチドは、毒素エフェクターポリペプチドを含み、毒素エフェクターポリペプチドは、毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の初期エンドソームからプロテアソームにT細胞エピトープを細胞内送達することができ、方法は、毒素エフェクターポリペプチドに異種T細胞エピトープを組み込む又は挿入するステップを含む。方法の特定のさらなる実施形態では、組み込む又は挿入するステップの結果として毒素エフェクターポリペプチドが得られ、毒素エフェクターポリペプチドは、毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の初期エンドソーム区画からMHCクラスI分子へのT細胞エピトープの細胞内送達に加えて、1又は2以上の毒素エフェクター機能を示すことができる。
方法が、プロテアソーム送達エフェクターポリペプチドに異種CD8+T細胞エピトープを組み込む又は挿入するステップであって、プロテアソーム送達エフェクターポリペプチドは、プロテアソーム送達エフェクターポリペプチドが存在する細胞の初期エンドソーム区画からプロテアソームにT細胞エピトープを細胞内送達することができる、ステップを含む方法がある。方法の特定のさらなる実施形態において、会合は、分子の内因性B細胞エピトープ、内因性CD4+T細胞エピトープ及び/又は触媒ドメインへの異種T細胞エピトープの組み込み及び挿入からなる。方法の特定のさらなる実施形態において、方法のポリペプチドは、毒素に由来する。方法の特定のさらなる実施形態において、ポリペプチドは、毒素エフェクターポリペプチドを含み、毒素エフェクターポリペプチドは、毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の初期エンドソーム区画からプロテアソームへのT細胞エピトープの細胞内送達に加えて、1又は2以上の毒素エフェクター機能を示すことができる。
分子を生成する方法であって、方法が、プロテアソーム送達エフェクターポリペプチドに異種CD8+T細胞エピトープ送達分子を組み込む又は挿入するステップを含み、プロテアソーム送達エフェクターポリペプチドは、プロテアソーム送達エフェクターポリペプチドが存在する細胞の初期エンドソーム区画からMHCクラスI分子にT細胞エピトープを細胞内送達することができる、方法がある。方法の特定のさらなる実施形態において、会合は、分子の内因性B細胞エピトープ、内因性CD4+T細胞エピトープ及び/又は触媒ドメインへの異種T細胞エピトープの組み込み及び挿入からなる。方法の特定のさらなる実施形態において、方法のポリペプチドは、毒素に由来する。方法の特定のさらなる実施形態において、ポリペプチドは、プロテアソーム送達エフェクターポリペプチドを含む毒素エフェクターポリペプチドを含み、方法は、毒素エフェクターポリペプチドに異種T細胞エピトープを組み込む又は挿入するステップを含む。方法の特定のさらなる実施形態において、__の結果として得られる毒素エフェクターポリペプチドは、その毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞の初期エンドソーム区画からMHCクラスI分子へのT細胞エピトープの細胞内送達に加えて、1又は2以上の毒素エフェクター機能を示すことができる。
〜218、配列番号3の240〜260、配列番号1又は配列番号2の243〜257、配列番号1又は配列番号2の254〜268、配列番号3の262〜278、配列番号3の281〜297及び配列番号1又は配列番号2の285〜293のB細胞エピトープ領域と、配列番号1又は配列番号2の4〜33、配列番号1又は配列番号2の34〜78、配列番号1又は配列番号2の77〜103、配列番号1又は配列番号2の128〜168、配列番号1又は配列番号2の160〜183、配列番号1又は配列番号2の236〜258及び配列番号1又は配列番号2の274〜293のCD4+T細胞エピトープ領域とからなる天然位置のアミノ酸の群から選択される志賀毒素Aサブユニットアミノ酸配列の少なくとも1つのB細胞エピトープ及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域の破壊を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞のサイトゾル区画に経路指定することができる。特定のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸75〜251に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。特定のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜241に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜251に由来する。特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜261に由来する。
列番号3の3〜14、配列番号3の26〜37、配列番号1又は配列番号2の27〜37、配列番号1又は配列番号2の39〜48、配列番号3の42〜48、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の53〜66、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の94〜115、配列番号1又は配列番号2の141〜153、配列番号3の140〜156、配列番号1又は配列番号2の179〜190、配列番号3の179〜191、配列番号3の204、配列番号1又は配列番号2の205及び配列番号3の210〜218、配列番号3の240〜260、配列番号1又は配列番号2の243〜257、配列番号1又は配列番号2の254〜268、配列番号3の262〜278、配列番号3の281〜297及び配列番号1又は配列番号2の285〜293のB細胞エピトープ領域と、配列番号1又は配列番号2の4〜33、配列番号1又は配列番号2の34〜78、配列番号1又は配列番号2の77〜103、配列番号1又は配列番号2の128〜168、配列番号1又は配列番号2の160〜183、配列番号1又は配列番号2の236〜258及び配列番号1又は配列番号2の274〜293のCD4+T細胞エピトープ領域とからなる天然位置のアミノ酸の群から選択される志賀毒素Aサブユニットアミノ酸配列の少なくとも1つのB細胞エピトープ及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域の破壊を含み、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドは、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞のサイトゾル区画に経路指定することができる。特定のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸75〜251に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。特定のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜241に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜251に由来する。特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜261に由来する。
できる。特定のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号45のアミノ酸2〜389に由来するジフテリア毒素エフェクターポリペプチドを含む。特定のさらなる実施形態において、毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素ファミリーの少なくとも1つのメンバーのAサブユニットに由来するアミノ酸配列を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドであり、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号1又は配列番号2の1〜15、配列番号3の3〜14、配列番号3の26〜37、配列番号1又は配列番号2の27〜37、配列番号1又は配列番号2の39〜48、配列番号3の42〜48、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の53〜66、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の94〜115、配列番号1又は配列番号2の141〜153、配列番号3の140〜156、配列番号1又は配列番号2の179〜190、配列番号3の179〜191、配列番号3の204、配列番号1又は配列番号2の205及び配列番号3の210〜218、配列番号3の240〜260、配列番号1又は配列番号2の243〜257、配列番号1又は配列番号2の254〜268、配列番号3の262〜278、配列番号3の281〜297及び配列番号1又は配列番号2の285〜293のB細胞エピトープ領域と、配列番号1又は配列番号2の4〜33、配列番号1又は配列番号2の34〜78、配列番号1又は配列番号2の77〜103、配列番号1又は配列番号2の128〜168、配列番号1又は配列番号2の160〜183、配列番号1又は配列番号2の236〜258及び配列番号1又は配列番号2の274〜293のCD4+T細胞エピトープ領域とからなる天然位置のアミノ酸の群から選択される志賀毒素Aサブユニットアミノ酸配列の少なくとも1つのB細胞エピトープ及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域の破壊を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞のサイトゾル区画に経路指定することができる。特定のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸75〜251に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。特定のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜241に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜251に由来する。特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜261に由来する。
プチドは、配列番号39の3〜10、配列番号39の33〜43、配列番号39の71〜77、配列番号39の125〜131、配列番号39の138〜146、配列番号39の165〜175、及び配列番号39の185〜191からなる天然位置のアミノ酸の群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つのB細胞エピトープ及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域の破壊を含み、ジフテリア毒素エフェクターポリペプチドは、ジフテリア毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞のサイトゾル区画に経路指定することができる。特定のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号45のアミノ酸2〜389に由来するジフテリア毒素エフェクターポリペプチドを含む。特定のさらなる実施形態において、毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素ファミリーの少なくとも1つのメンバーのAサブユニットに由来するアミノ酸配列を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドであり、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号1又は配列番号2の1〜15、配列番号3の3〜14、配列番号3の26〜37、配列番号1又は配列番号2の27〜37、配列番号1又は配列番号2の39〜48、配列番号3の42〜48、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の53〜66、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の94〜115、配列番号1又は配列番号2の141〜153、配列番号3の140〜156、配列番号1又は配列番号2の179〜190、配列番号3の179〜191、配列番号3の204、配列番号1又は配列番号2の205及び配列番号3の210〜218、配列番号3の240〜260、配列番号1又は配列番号2の243〜257、配列番号1又は配列番号2の254〜268、配列番号3の262〜278、配列番号3の281〜297及び配列番号1又は配列番号2の285〜293のB細胞エピトープ領域と、配列番号1又は配列番号2の4〜33、配列番号1又は配列番号2の34〜78、配列番号1又は配列番号2の77〜103、配列番号1又は配列番号2の128〜168、配列番号1又は配列番号2の160〜183、配列番号1又は配列番号2の236〜258及び配列番号1又は配列番号2の274〜293のCD4+T細胞エピトープ領域とからなる天然位置のアミノ酸の群から選択される志賀毒素Aサブユニットアミノ酸配列の少なくとも1つのB細胞エピトープ及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域の破壊を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞のサイトゾル区画に経路指定することができる。特定のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸75〜251に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。特定のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜241に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜251に由来する。特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜261に由来する。
性化タンパク質毒素、アブリン、炭疽毒素、Aspf1、ブーゲニン、ブリオジン、コリックス毒素、クローディン、ジフテリア毒素、ゲロニン、易熱性エンテロトキシン、ミトギリン、百日咳毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、プルケリン、緑膿菌外毒素A、レストリクトシン、リシン、サポリン、サルシン、志賀毒素、及びスブチラーゼ細胞毒からなる群から選択される毒素に由来する毒素エフェクターポリペプチドを含む。特定のさらなる実施形態において、毒素エフェクターポリペプチドは、ジフテリア毒素ファミリーの少なくとも1つのメンバーのA及びBサブユニットに由来するアミノ酸配列を含むジフテリア毒素エフェクターポリペプチドであり、ジフテリア毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号39の3〜10、配列番号39の33〜43、配列番号39の71〜77、配列番号39の125〜131、配列番号39の138〜146、配列番号39の165〜175、及び配列番号39の185〜191からなる天然位置のアミノ酸の群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも1つのB細胞エピトープ及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域の破壊を含み、ジフテリア毒素エフェクターポリペプチドは、ジフテリア毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞のサイトゾル区画に経路指定することができる。特定のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号45のアミノ酸2〜389に由来するジフテリア毒素エフェクターポリペプチドを含む。特定のさらなる実施形態において、毒素エフェクターポリペプチドは、志賀毒素ファミリーの少なくとも1つのメンバーのAサブユニットに由来するアミノ酸配列を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドであり、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号1又は配列番号2の1〜15、配列番号3の3〜14、配列番号3の26〜37、配列番号1又は配列番号2の27〜37、配列番号1又は配列番号2の39〜48、配列番号3の42〜48、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の53〜66、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の94〜115、配列番号1又は配列番号2の141〜153、配列番号3の140〜156、配列番号1又は配列番号2の179〜190、配列番号3の179〜191、配列番号3の204、配列番号1又は配列番号2の205及び配列番号3の210〜218、配列番号3の240〜260、配列番号1又は配列番号2の243〜257、配列番号1又は配列番号2の254〜268、配列番号3の262〜278、配列番号3の281〜297及び配列番号1又は配列番号2の285〜293のB細胞エピトープ領域と、配列番号1又は配列番号2の4〜33、配列番号1又は配列番号2の34〜78、配列番号1又は配列番号2の77〜103、配列番号1又は配列番号2の128〜168、配列番号1又は配列番号2の160〜183、配列番号1又は配列番号2の236〜258及び配列番号1又は配列番号2の274〜293のCD4+T細胞エピトープ領域とからなる天然位置のアミノ酸の群から選択される志賀毒素Aサブユニットアミノ酸配列の少なくとも1つのB細胞エピトープ及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域の破壊を含み、志賀毒素エフェクターポリペプチドには、志賀毒素エフェクターポリペプチドが存在する細胞のサイトゾル区画に経路指定することができる。特定のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸75〜251に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。特定のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜241に由来する志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜251に由来する。特定のさらなる実施形態において、志賀毒素エフェクターポリペプチドは、配列番号1、配列番号2又は配列番号3のアミノ酸1〜261に由来する。
、B細胞エピトープへの1つ又は2つ以上のアミノ酸挿入を行うステップをさらに含む。
、破壊するステップは、CD4+T細胞エピトープへの1つ又は2つ以上のアミノ酸挿入を行うステップをさらに含む。
)(例えばモノボディ)、テネイシンIII型ドメイン(例えばTNfn3)、アンキリン
反復モチーフドメイン(ARD,ankyrin repeat motif domain)、低密度リポタンパク
質受容体由来Aドメイン(LDLRのAドメイン又はLDLR−A,low-density-lipoprotein-receptor-derivedA-domain)、リポカリン(アンチカリン)、Kunitzドメイン、
プロテインA由来Zドメイン、ガンマ−B結晶由来ドメイン(アフィリン)、ユビキチン由来ドメイン、Sac7d由来ポリペプチド、Fyn由来SH2ドメイン(アフィチン)、ミニタンパク質、C型レクチン様ドメイン足場、工学的に操作された抗体模倣物、及び結合機能性を保持する前述のもののいずれかの遺伝子操作された任意の対応物からなる群から選択されるポリペプチドを含む。本発明の細胞標的化分子の特定のさらなる実施形態では、細胞標的化分子を結合領域の細胞外標的生体分子と物理的に結合されている細胞に投与すると、細胞標的化分子は細胞を死滅させることができる。本発明の細胞標的化分子の特定のさらなる実施形態では、細胞標的化分子を、メンバーが結合領域の細胞外標的生体合分子と物理的に結合されている第1の細胞集団、及びメンバーが前記結合領域のいかなる細胞外標的生体分子とも物理的に結合されていない第2の細胞集団に投与すると、前記第2の細胞集団のメンバーと比較して前記第1の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果は少なくとも3倍大きい。本発明の細胞標的化分子の特定のさらな
る実施形態において、結合領域は、CD20、CD22、CD40、CD79、CD25、CD30、HER2/neu/ErbB2、EGFR、EpCAM、EphB2、前立腺特異的膜抗原、Cripto、エンドグリン、線維芽細胞活性化タンパク質、Lewis−
Y、CD19、CD21、CS1/SLAMF7、CD33、CD52、EpCAM、CEA、gpA33、ムチン、TAG−72、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドGD2、ガングリオシドGD3、ガングリオシドGM2、ガングリオシドLewis−Y2、VEGFR、アルファVベータ3、アルファ5ベータ1、ErbB1/EGF
R、Erb3、c−MET、IGF1R、EphA3、TRAIL−R1、TRAIL−R2、RANKL、FAP、テネイシン、CD64、メソセリン、BRCA1、MART−1/メランA、gp100、チロシナーゼ、TRP−1、TRP−2、MAGE−1、MAGE−3、GAGE−1/2、BAGE、RAGE、NY−ESO−1、CDK−4、ベータ−カテニン、MUM−1、カスパーゼ−8、KIAA0205、HPVE6、SART−1、PRAME、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパルチル(アスパラギニル)ベータ−ヒドロキシラーゼ、EphA2、HER3/ErbB−3、MUC1、MART−1/メランA、gp100、チロシナーゼ関連抗原、HPV−E7、エプスタイン・バーウイルス抗原、Bcr−Abl、アルファ−フェトプロテイン抗原、17−A1、膀胱腫瘍抗原、CD38、CD15、CD23、CD52、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244、CD294、CD305、C3AR、FceRIa、ガレクチン−9、mrp−14、siglec−8、siglec−10、CD49d、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD123、CD193、TLR4、FceRIa、IgE、CD107a、CD203c、CD14、CD15、CD33、CD64、CD68、CD80、CD86、CD105、CD115、F4/80、ILT−3、ガレクチン−3、CD11a−c、GITRL、MHCクラスII、CD284−TLR4、CD107−Mac3、CD195−CCR5、HLA−DR、CD16/32、CD282−TLR2、CD11c、CD123、及び前述のもののいずれかの任意の免疫原性断片からなる群から選択される細胞外標的生体分子と結合することができる。本発明の細胞標的化分子の特定のさらなる実施形態において、細胞標的化分子は、KDELファミリーのメンバーのカルボキシ末端小胞体保留/回収シグナルモチーフをさらに含む。特定のさらなる実施形態では、KDEL、HDEF、HDEL、RDEF、RDEL、WDEL、YDEL、HEEF、HEEL、KEEL、REEL、KAEL、KCEL、KFEL、KGEL、KHEL、KLEL、KNEL、KQEL、KREL、KSEL、KVEL、KWEL、KYEL、KEDL、KIEL、DKEL、FDEL、KDEF、KKEL、HADL、HAEL、HIEL、HNEL、HTEL、KTEL、HVEL、NDEL、QDEL、REDL、RNEL、RTDL、RTEL、SDEL、TDEL及びSKELからなる群から選択される、カルボキシ末端小胞体保留/回収シグナルモチーフ。
る免疫障害は、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、喘息、クローン病、糖尿病、移植片拒絶、移植片対宿主病、橋本甲状腺炎、溶血性尿毒症症候群、HIV関連疾患、エリテマトーデス、多発性硬化症、多発動脈炎、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎及び血管炎からなる群から選択される疾患に関連した免疫障害である。
よい。
細に説明する。しかし、本発明は多くの異なる形態で実施されることがあり、本発明を、下に示す実施形態に限定されるとみなすべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が行き届いたものになるように、また本発明の範囲を当業者に知らせるために提供するものである。
つの(an)」及び「その(the)」は、文脈による別段の明白な指図がない限り、単数及
び複数両方の指示対象を含む。
は「含むこと(comprising)」などの語尾変化形は、述べられている整数(若しくは成分)又は整数(若しくは成分)群の包含を暗示するが、他のいかなる整数(若しくは成分)又は整数(若しくは成分)群の除外も暗示しないと解されるものとする。
などの、その細胞のエンドソーム区画の通過を含む活性を、例えば細胞外開始位置から、判定することもできる。あるいは、T細胞エピトープ送達活性は、特定の実施形態では、T細胞エピトープ送達分子が内在化して、T細胞エピトープペプチドへの分解のためにT細胞エピトープをプロテアソームに送達するのに的確な区画に達する前に、細胞のいかなるエンドソーム区画の通過も伴わないことがある。有効なT細胞エピトープ送達機能は、T細胞エピトープ送達分子が内在化された細胞の細胞に表面における送達されたT細胞エピトープのMHC提示を観察することによってアッセイすることができる。
本発明は、細胞表面提示のために標的細胞のMHCクラスI系にT細胞エピトープペプチドを送達することができるポリペプチド及び細胞標的化分子を産生する方法を提供する。本発明は、細胞表面提示のために標的細胞のMHCクラスI系に異種T細胞エピトープペプチドを送達することができる、本発明の方法を用いて製造された、例示的T細胞エピトープポリペプチドも提供する。本発明の方法を用いて生成されるポリペプチド、例えばT細胞エピトープ送達ポリペプチド及びCD8+T細胞高度免疫化されたポリペプチドは、様々な分子及び組成物、例えば、細胞毒性治療薬、治療送達剤及び診断分子の成分として利用されうる。
本発明は、様々なプロテアソーム送達エフェクターポリペプチド領域を含むポリペプチ
ドを、1つ又は2つ以上の異種T細胞エピトープを含むように工学的に操作することを含み、この場合、ポリペプチドを真核細胞の初期エンドソーム区画に送達すると、ポリペプチドは、分解及び細胞のMHCクラスI系への侵入のための1つ又は2つ以上の異種T細胞エピトープのプロテアソームへの送達に十分な細胞内の細胞内区画に局在することができる。プロテアソーム送達エフェクターポリペプチドは、いかなる源から得られるものであってもよいが、特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、天然に存在するタンパク質毒素に由来する様々なプロテアソーム送達エフェクターポリペプチドに由来する。
本発明は、1つ又は2つ以上の異種T細胞エピトープの組み込み、融合及び/又は挿入による本発明のポリペプチドへの修飾の出発点として様々なポリペプチドを使用することを企図している。これらのソースポリペプチドは、プロテアソーム送達エフェクター能力を示すべきである、又は示すと予測されるものであるべきである。
プチド及びタンパク質をサイトゾル中のプロテアソームに輸送し、その結果、サイトゾル抗原性ペプチドを産生することができる。加えて、様々な毒素の細胞内経路指定に関する研究は、サイトゾル又は小胞体いずれかへ到達するだけでMHCクラスI経路にT細胞エピトープが送達されることを示唆している。
示のためにMHCクラスI経路に侵入する(Gagnon E et al., Cell 110: 119-31(2002))。したがって、リソソームに局在するこが既知である又は発見された特定のポリペプチド及びタンパク質は、プロテアソーム送達機能を示すプロテアソーム送達エフェクター領域を有するポリペプチドの好適な源でありうる。
本発明は、毒素に由来する様々なポリペプチドをプロテアソーム送達エフェクター領域として使用することを企図している。多くの毒素は、それらの細胞内経路指定挙動についての豊富な知識のため、プロテアソーム送達エフェクターポリペプチドの最適な源となる。
びリシンのような植物II型リボソーム不活性化タンパク質は、エンドソームから逃避することができる(Murphy S et al., Biochim Biophys Acta 1824: 34-43 (2006)、Slominska-Wojewodzka M, Sandvig K, Antibodies 2: 236-269 (2013)、Walsh M et al., Virulence 4: 774-84 (2013))。リソソームを含む、エンドソーム区画からの逃避は、当技術分
野において公知のアッセイを用いて、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ウシ血清アルブミン、Alexa488のようなフルオロフォア、及び毒素由来ポリペプチドを用
いるレポーターアッセイを用いて、直接測定し、定量することができる(例えば、Bartz R et al., BiochemJ435: 475-87 (2011)、Gilabert-Oriol R et al., Toxins 6: 1644-66 (2014)を参照されたい。
外毒素(PE,Pseudomonas exotoxin)Aに由来する工学的に操作された組換えポリペプチドは、細胞外空間からサイトゾルにポリペプチドを移動させるための送達媒体として使用されている。初期エンドソーム区画からサイトゾル又はERいずれかに細胞内経路を指定する固有の能力を有するいずれのタンパク質毒素も、本発明の目的に活用されうる、例えば、修飾のための出発成分として活用されることもあり、又はプロテアソーム送達エフェクターポリペプチド内のより小さいプロテアソーム送達エフェクター領域をマッピング
するための源として活用されることもある、プロテアソーム送達エフェクターポリペプチドの源となる。
撃することができる。同様に、リボ毒は、真核細胞に侵入し、サイトゾルに経路指定して、リボソームを不活性化することができる。Abx毒素及びリボ毒スーパーファミリーのメンバーは、本発明において使用するための毒素由来ポリペプチド及びプロテアソーム送達エフェクターポリペプチドを同定するための適切な源である。
胞毒メカニズムは、中毒にかかっている真核生物宿主細胞における毒素のAサブユニットのサイトゾル又はERのいずれかへの細胞内経路指定を含み、サイトゾル又はERにおいて、触媒Aサブユニットは、様々な宿主細胞タンパク質に相当する該サブユニットの酵素基質に対して作用する(表Iを参照されたい)。
DPリボシル化によってタンパク質合成を中断させる。ジフテリア毒素は、触媒Aサブユニットと、リン脂質二重層移行エフェクタードメイン及び細胞標的化結合ドメインを含有するBサブユニットとからなる。その中毒過程で、ジフテリア毒素は、おそらくエンドソーム逃避によって、該毒素の触媒ドメインの真核細胞のサイトゾルへの細胞内経路を指定することができる(Murphy J, Toxins (Basel) 3: 294-308 (2011))。このエンドソーム逃避メカニズムは、例えば炭疽菌致死因子及び浮腫因子などの他の毒素と共有されることがあり、一般的なエンドソーム逃避能力は、例えば特定のクロストリジウム・ディフィシル(C. difficile)毒素、ゲロニン、リステリオリジン、PE、リシン及びサポリンを含む、多くの多様な毒素によって示される(例えば、Varkouhi A et al.,J Control Release 151: 220-8 (2010)、Murphy J, Toxins(Basel) 3: 294-308 (2011)を参照されたい)。
ターポリペプチドは、リボ毒性が増加若しくは減少した合成若しくは工学的に操作されたタンパク質構造、及び/又は非ネイティブ特性を有するように別様に改変された天然に存在するタンパク質に由来することもある。
et al., Toxins 2: 2699-737 (2011)、Walsh M, Virulence4:774-84 (2013)、Weidle U et al., Cancer Genomics Proteomics 11: 25-38 (2014))。
触媒ドメインに由来することもある(de Virgilio M et al., Toxins2:2699-737 (2011)、Lapadula W et al., PLoS ONE 8: e72825 (2013)、Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013))。RIPは、藻類、細菌、真菌及び植物において発現されるリボ毒性タンパク質で
あり、準化学量論的濃度で真核生物及び原核生物タンパク質合成の強力な阻害剤であることが多い(Stirpe, F, BiochemJ 202: 279-80 (1982)を参照されたい)。様々なRIP
が、がん治療用の治療薬に使用するための有望な毒素エフェクターポリペプチド配列源と考えられている(Pastan I, et al., Nat Rev Cancer6:559-65 (2006)、Fracasso G et
al., Ribosome-inactivating protein-containing conjugates for therapeutic use,Toxic Plant Proteins 18, pp. 225-63 (Eds.Lord J,Hartley, M. Berlin,Heidelberg: Springer-Verlag, 2010)、deVirgilio M et al., Toxins 2: 2699-737 (2011)、Puri M et al., Drug Discov Today 17: 774-83 (2012)、WalshM, Virulence 4: 774-84 (2013)を参
照されたい)。
at al., Methods Enzymol 502: 167-214(2012)、Antignani, Toxins5: 1486-502
(2013)、Lin H et al., Anticancer Agents Med Chem13:1259-66 (2013)、Polito L et al., Toxins 5: 1698-722 (2013)、WalshM, Virulence 4: 774-84 (2013)を参照され
たい。これらのリボ毒は、一般に、リボソーム不活性化タンパク質(RIP)として分類され、サルシン−リシンループ(SRL,sarcin-ricin loop)、又はSRLと結合する
リボソーム機能に必要なタンパク質を攻撃することによって、真核生物リボソームを不活性化する一般細胞毒性メカニズムを共有する。
Moore P, J Mol Biol 247: 81-98 (1995)、Gluck A, Wool I,JMol Biol 256: 838-48 (1996)、Seggerson K, Moore P, RNA 4: 1203-15 (1998)、Correll C et al., J Mol Biol292:275-87 (1999))。多様な門からの様々な種のSRLを結晶構造電子密度マップに非
常に精密に重ね合わせることができる(Ban N et al., Science 11: 905-20(2000)、Gabashvili I et al., Cell 100: 537-49(2000))。SRLは、EF−Tu、EF−G、
EF1及びEF2などの伸長因子の共同作用によるリボソーム移行機能に不可欠である保存された二次構造を形成する、より大きい普遍的に保存されたリボソーム配列である(Voorhees R et al., Science 330: 835-8 (2010)、Shi X et al., J Mol Biol 419: 125-38
(2012)、Chen K et al., PLoSOne8: e66446 (2013))。SRL(サルシン−リシンル
ープ)は、真菌リボ毒サルシン及び植物II型RIPリシンの共有標的であることにちなんで名付けられた。
機能を触媒的に損傷させることによってタンパク質合成を阻害することができ、ほんの少数の毒素分子で有効にアポトーシスを誘導することができるので、RIPスーパーファミリーに分類される。
よってリボソームを損傷させることによってインビトロで移行を阻害する能力という1つの共通の特徴によって定義される。2013年までに、100を超えるRIPが記載されていた(Walsh M, Virulence 4: 774-84 (2013))。大部分のRIPは、真核生物リボソ
ームと原核動物リボソーム両方の大きいrRNAの普遍的に保存されたサルシン/リシンループ(SRL)内の特異的アデニンを脱プリン化する。より多数のRIPが次の科で見つかっている:ナデシコ科、ニワトコ科、ウリ科、トウダイグサ科、ヤマゴボウ科及びイネ科。
(2009))。III型RIP、例えば、オオムギJIP60 RIP及びトウモロコシb−3
2 RIPは、活性化のために大規模なタンパク質プロセッシングを必要とする酵素前駆体として合成される(Peumans W et al.,FASEBJ 15: 1493-1506 (2001)、Mak A et al.,
Nucleic Acids Res 35: 6259-67 (2007))。
Struct Biol 1: 59-64 (1994))。
ァ−サルシン、Onconase(登録商標)、膵臓リボヌクレアーゼ、Bax、好酸球由来ニューロトキシン、及びアンジオゲニンなどの、免疫毒素の細胞毒性成分を生成するために使用されている。特に、細胞毒性の強い免疫毒素は、次のRIPに由来するポリペプチドを使用して産生されている:リシン、ゲロニン、サポリン、モモルジン及びPAP(Pasqualucci L etal., Haematologica 80: 546-56(1995))。
されたい)。
Curr Pharm Biotechnol9:210-4 (2008)、Menzel C et al., Blood 111: 3830-7(2008)
を参照されたい)。したがって、サイトゾル標的化毒素エフェクター領域は、リボ毒性
が増加若しくは減少した合成若しくは工学的に操作されたタンパク質構造、及び/又は非ネイティブ特性を有するように別様に改変された天然に存在するタンパク質に由来することがある。当業者は、当技術分野において公知の技法を用いて、サイトゾル標的化毒素エフェクター機能をもたらす所与の分子の能力をアッセイすることができる。
毒素由来分子以外のタンパク質性分子であって、サイトゾル、ER、若しくはプロテアソームへの送達に好適な任意の他の細胞内区画内に局在する、又はサイトゾル、ER若しくは区画へのそれら独自の細胞内経路指定を指示する、固有の能力を有するタンパク質性分子が、非常に多数ある。これらのポリペプチドのいずれかを直接使用してもよいし、又は本発明において使用するためのプロテアソーム送達エフェクターポリペプチドに誘導体化してもよいが、だたし、固有の細胞内局在エフェクター機能が保存されることを条件とする。
は公知である(例えば、Varkouhi A et al., J Control Release 151: 220-8 (2010)を参照されたい)。エンドソーム逃避機能を有する非毒度由来分子の非限定的な例は、ウイルス剤、例えばヘマグルチニンHA2;脊椎動物由来ポリペプチド及びペプチド、例えばヒトカルシトニン由来ペプチド、ウシプリオンタンパク質及びスイートアローペプチド;合成生物模倣型ペプチド;並びにエンドソーム破壊能力を有するポリマーを含む(例えば、Varkouhi A et al.,J Control Release 151: 220-8 (2010)を参照されたい)。リソソー
ムを含む、エンドソーム区画からの逃避は、当技術分野において公知のアッセイを用いて、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ウシ血清アルブミン、Alexa 488のよ
うなフルオロフォア、及び毒素由来ポリペプチドを用いるレポーターアッセイを用いて、直接測定し、定量することができる(例えば、Bartz R et al., Biochem J 435: 475-87 (2011)、Gilabert-Oriol R et al., Toxins6:1644-66 (2014)を参照されたい)。
プロテアソーム送達エフェクターポリペプチドが得られたら、本発明の方法を使用してそのポリペプチドを工学的に操作して、本発明のT細胞高度免疫化された及び/又はB細胞/CD4+T細胞脱免疫化されたポリペプチドにすることができる。初期エンドソーム区画から出発してMHCクラスI経路への侵入及びその後のMHCクラスI提示のためにプロテアソームにT細胞エピトープを送達することができる本発明のポリペプチドを生成するために、本発明の方法を用いて、1つ又は2つ以上のT細胞エピトープを任意のプロテアソーム送達エフェクターポリペプチド、例えばサイトゾルへの経路を指定する毒素エフェクターポリペプチドなど(リボ毒性毒素エフェクターポリペプチドを含むこともある)に組み込む、融合する、又は挿入する。
できる必要もない。本発明の細胞標的化分子を製造するために、当技術分野において公知の標準的技法を用いて、必要に応じて細胞標的化及び/又は細胞内在化機能をもたらすための当業者に公知の他の成分と本発明のポリペプチドを連結させてもよい。
本発明のポリペプチド及び細胞標的化分子は、各々、1つ又は2つ以上の異種T細胞エピトープを含む。T細胞エピトープは、抗原が有する分子構造であり、ペプチド及び直鎖状アミノ酸配列及び__によって表すことができる。異種T細胞エピトープは、本発明のT細胞高度免疫化された及び/又はB細胞/CD4+T細胞脱免疫化されたポリペプチドを生成するために本発明の方法を使用して修飾される出発プロテアソーム送達エフェクターポリペプチドであるソースポリペプチドにはまだ存在しないエピトープである。
、CH65、C05、ヘマグルチニン1(HA1,hemagglutin 1)ヘマグルチニン2(
HA2,hemagglutinin 2)、非構造タンパク質1及び2(NS1及びNS2,nonstructural protein 1及び2)、基質タンパク質1及び2(M1及びM2,matrix protein 1及
び2)、核タンパク質(NP,nucleoprotein)、ノイラミニダーゼ(NA,neuraminidase))中のペプチドにマッピングされており、これらのペプチドの多くは、エクスビボア
ッセイを用いることなどによって、ヒト免疫応答を惹起することが証明されている(例えば、Assarsson E et al, J Virol 82: 12241-51 (2008)、AlexanderJ et al., Hum Immunol 71:468-74 (2010)、Wang M et al., PLoSOne 5: e10533 (2010)、Wu J etal.,Clin
Infect Dis 51: 1184-91 (2010)、Tan P et al.,Human Vaccin 7: 402-9 (2011)、GrantE et al.,Immunol Cell Biol 91: 184-94 (2013)、Terajima M et al., Virol J 10: 244 (2013)を参照されたい)。同様に、非常に多くのT細胞エピトープは、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV,human cytomegalovirus)からのタンパク質のペプチド成分
、例えば、タンパク質(pp65(UL83)、UL128−131、最初期1(IE−1,immediate-early1;UL123)、糖タンパク質B、テグメントタンパク質)中の
ペプチド、にマッピングされており、これらのペプチドの多くは、エクスビボアッセイを使用することなどによってヒト免疫応答を惹起することが証明されている(Schoppel K et al.,J Infect Dis 175: 533-44 (1997)、Elkington R et al, J Virol 77: 5226-40(2003)、Gibson Let al., J Immunol 172: 2256-64 (2004)、Ryckman B et al.,J Virol
82: 60-70 (2008)、Sacre K et al., J Virol82: 10143-52 (2008))。
に定義されたペプチド−エピトープがある。ヒトにおける利用又はヒト標的細胞を伴う利用のために、当業者は、当技術分野において公知の技法を用いて、HLAクラスI限定エピトープを選択又は同定することができる。ヒトMHCクラスI分子と結合するペプチドの能力を用いて、推定T細胞エピトープの免疫原性を予測することができる。ヒトMHCクラスI分子と結合するペプチドの能力を、ソフトウェアツールを用いて点数化することができる。特定のヒト集団においてより高頻度に見られる対立遺伝子によってコードされているHLAバリアントのペプチド選択性に基づいてT細胞エピトープを本発明の異種T細胞エピトープ成分としての使用に選択してもよい。例えば、ヒト集団は、MHCクラスI分子のアルファ鎖について多型性であり、可変対立遺伝子がHLA遺伝子によってコードされている。特定のT細胞エピトープは、例えばHLA−A対立遺伝子群、HLA−A2及びHLA−A3、によってコードされている普通に存在するHLA変異体などの、特異的HLA分子によって、より効率よく提示されることがある。
Inman R, Clin Immunol 143: 99-115 (2012)を参照されたい)。
治療薬の成分としてプロテアソーム送達エフェクターポリペプチドを使用することの魅力にもかかわらず、多くのポリペプチドは、脊椎動物に投与されたとき細胞外空間において免疫原性である。タンパク質療法において望ましくない免疫原性は、有効性の低下、予測不能な薬物動態、並びに投薬量及び反復投与を制限する望ましくない免疫応答をもたらした。治療薬を脱免疫化しようと努力する上で、1つの主な難題は、例えばプロテアソーム送達などの所望のポリペプチドエフェクター機能を維持しながら、ポリペプチドエフェクタードメイン、例えばそのサイトゾル標的化ドメイン、内の免疫原性エピトープをサイレンシング又は破壊することである。加えて、ポリペプチドの機能を保存しながらポリペプチド構造内の免疫エピトープをアミノ酸置換によって破壊し、同時に、標的細胞による細胞内在化、プロセッシング及び細胞表面提示後まで免疫系によって認識されない1つ又は2つ以上T細胞エピトープを付加することは、かなりの難題である。この難題を解決することによって、望ましいCD8+T細胞免疫原性を示し、その上、望ましくないB細胞及びCD4+T細胞免疫原性を低減させるポリペプチド(本明細書では「CD8+高度免疫化された及び/若しくはB細胞/CD4+T細胞脱免疫化された」分子、又は「T細胞エピトープ送達及び/若しくはB細胞/CD4+T細胞脱免疫化された」分子と言う)の生成が可能になる。
本発明のポリペプチドを非常に多くの他のポリペプチド、薬剤及び部分と結合させて、例えば本発明の細胞毒性、細胞標的化タンパク質などの、細胞標的化分子を生成することができる。本発明のプロテアソーム送達エフェクターポリペプチドを含むT細胞エピトープを使用し、例えば、特異的細胞タイプの表面と物理的に結合されている細胞外標的生体分子との高親和性結合を示すことができる結合領域などの、細胞標的化成分の付加を用いて、細胞毒性ポリペプチド及びタンパク質を構築することができる。加えて、毒性であるか非毒性であるかにかかわらず本発明のB細胞エピトープ脱免疫化されたポリペプチドを哺乳動物への投与に有用な非常に多くの分子の成分として使用することができる。
本発明は、1)細胞標的化結合領域と、2)異種T細胞エピトープを含む本発明のプロテアソーム送達エフェクターポリペプチドとを各々が含む、細胞標的化分子を含む。
本発明の特定の分子は、細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域を含む細胞標的化部分に連結された本発明のT細胞高度免疫化されたプロテアソーム送達エフェクターポリペプチドを含む。特定の実施形態において、本発明の分子は、T細胞高度免疫化されたプロテアソーム送達エフェクターポリペプチド及び細胞標的化結合領域が互いに融合されて連続ポリペプチド鎖又は細胞標的化融合タンパク質を形成するために、単一のポリペプチド又はタンパク質を含む。
管内皮増殖因子(VEGF,vascular endothelial growth factor)、インスリン様増殖因子(IGF,insulin-like growth factor)、インターフェロン、インターロイキン(例えばIL−2、IL−6及びIL−23)、神経成長因子(NGF,nerve growth factor)、血小板由来増殖因子(TGF,plateletderived growth factor)、及び腫瘍壊
死因子(TNF,tumor necrosis factor)を含む。
の源からの代替足場がこの用語の範囲内で考えられる。
のリストを提供している。
合機能を保持する前述のものの任意の遺伝子操作された対応物を含む群から選択される(Saerens D et al.,Curr.Opin.Pharmacol8: 600-8 (2008)、Dimitrov D, MAbs1:26-8 (2009)、Weiner L, Cell 148: 1081-4 (2012)、Ahmad Z et al., Clin Dev Immunol 2012: 980250 (2012)を参照されたい)。
ィ、AdNectins(商標)、又はAdNexins(商標))、工学的に操作された、テネイシン由
来、テネイシンIII型ドメイン(Centryns(商標))、工学的に操作された、アンキリン
反復モチーフ含有ポリペプチド(DARPins(商標))、工学的に操作された、低密度リポ
タンパク質受容体由来、Aドメイン(LDLR−A)(Avimers(商標))、リポカリン
(アンチカリン)、工学的に操作された、プロテアーゼ阻害剤由来、Kunitzドメイン、工学的に操作された、プロテインA由来、Zドメイン(Affibodies(商標))、工学的に操作された、ガンマ−B結晶由来足場又は工学的に操作された、ユビキチン由来足場(アフィリン)、Sac7d由来ポリペプチド(Nanoffitins(登録商標)又はアフィチン)、
工学的に操作された、Fyn由来、SH2ドメイン(Fynomers(登録商標))、ミニタンパク質、C型レクチン様ドメイン足場、工学的に操作された抗体模倣体、及びその結合機能性を保持する前述のものの任意の遺伝子操作された対応物を含む群から選択される(Worn A, Pluckthun A, J Mol Biol305:989-1010 (2001)、Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42(2002)、Wikman M et al.,Protein EngDes Sel 17:455-62 (2004)、Binz H et al.,
Nat Biotechnol 23: 1257-68(2005)、Hey T et al., Trends Biotechnol23 :514-522 (2005)、Holliger P, HudsonP, Nat Biotechnol 23: 1126-36(2005)、Gill D, Damle N, CurrOpin Biotech 17: 653-8(2006)、KoideA, Koide S, Methods Mol Biol 352:
95-109 (2007)、Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010)、ZollerF et al., Molecules 16: 2467-85(2011))。
本発明の細胞標的化分子の特定の結合領域は、細胞外標的生体分子と特異的に結合することができる、好ましくは、がん細胞、腫瘍細胞、形質細胞、感染細胞、又は細胞内病原体を内部に持つ宿主細胞などの、目的の細胞タイプの表面に物理的に結合されている、ポリペプチド領域を含む。
発明の細胞標的化分子に内因的に内在化される、又は本発明の細胞標的化分子との相互作用によって容易に内在化させられることが望ましい。
本発明では、句「小胞体保留/回収シグナルモチーフ」、KDEL型シグナルモチーフ、又はシグナルモチーフは、真核生物細胞内でKDEL受容体による小胞体へのタンパク質の細胞内局在を促進するように機能することができるKDELファミリーの任意のメンバーを指す。
れた少なくとも46のポリペプチドバリアントを含む(Raykhel, J CellBiol 179: 1193-204 (2007))。さらなるKDELシグナルモチーフは、ALEDEL、HAEDEL、
HLEDEL、KLEDEL、IRSDEL、ERSTEL、及びRPSTELを含む(Alanen H et al., J Mol Biol 409:291-7(2011))。KDELシグナルモチーフを表す
一般化コンセンサスモチーフは、[KRHQSA]−[DENQ]−E−Lと記載されている(Hulo N et al., Nucleic Acids Res34:D227-30 (2006))。
たって分布しているKDEL受容体によって結合され、小胞体の内腔への放出のために微小管依存性メカニズムによって小胞体に輸送される(Griffiths G et al., J Cell Biol 127: 1557-74 (1994)、Miesenbock G,Rothman J, J Cell Biol 129: 309-19 (1995))。
KDEL受容体は、Golgi複合体と小胞体間で動的に循環する(JacksonM et al., EMBO J. 9: 3153-62 (1990)、Schutze M et al.,EMBO J. 13: 1696-1705 (1994))。
。
本発明の個々の細胞標的化部分、ポリペプチド、及び/又はタンパク質成分、例えば、細胞標的化結合領域並びにCD8+T細胞高度免疫化された及び/又はB細胞/CD4+T細胞脱免疫化されたポリペプチドを、当技術分野において周知の及び/又は本書に記載する1つ又は2つ以上のリンカーによって安定的に互いに連結させることができる。結合領域の個々のポリペプチド小成分、例えば、重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)、CDR、及び/又はABR領域を、当技術分野において周知の及び/又は本書に記載する1つ又は2つ以上のリンカーによって安定的に互いに連結させることができる(例えば、Weisser N, Hall J, Biotechnol Adv27:502-20 (2009)、Chen X et al., Adv Drug
Deliv Rev 65: 1357-69 (2013))。本発明のタンパク質成分、例えば、多鎖結合領域は
、当技術分野において周知の1つ又は2つ以上のリンカーによって互いに又は本発明の他のポリペプチド成分と安定的に連結させることができる。本発明のペプチド成分、例えば、KDELファミリー小胞体保留/回収シグナルモチーフは、当技術分野において周知の1つ又は2つ以上のリンカー、例えばタンパク質性リンカー、によって本発明の別の成分に安定的に連結させることができる。
4: 397-412 (2013)を参照されたい)。免疫グロブリン由来ポリペプチドを異種ポリペプ
チドに結合させるために一般に使用されるリンカーなどの、当技術分野において公知の様々な非タンパク質性リンカーを使用して、細胞標的化部分を、CD8+T細胞高度免疫化された及び/又はB細胞/CD4+T細胞脱免疫化されたポリペプチド成分に連結させることができる。例えば、ポリペプチドリンカーは、それらのアミノ酸残基及び炭水化物部分の官能性側鎖、例えば、カルボキシ、アミノ、アミン、スルフヒドリル、カルボン酸、カルボニル、ヒドロキシル及び/又は環式環基などを用いて連結させることができる。例えば、ジスルフィド結合及びチオエーテル結合を用いて、2つ又は3つ以上のポリペプチドを連結させてもよい(例えば、Fitzgerald D et al., Bioconjugate Chem 1: 264-8 (1990)、Pasqualucci L etal., Haematologica 80: 546-56(1995)を参照されたい)。加
えて、非天然アミノ酸残基を他の官能性側鎖、例えばケトン基と併用してもよい(例えば、Sun S et al., Chembiochem Jul 18(2014)、Tian F etal., ProcNatl Acad Sci USA
111: 1766-71 (2014)を参照されたい)。非タンパク質性化学的リンカーの例は、N−ス
クシンイミジル(4−ヨードアセチル)−アミノベンゾエート、S−(N−スクシンイミジル)チオアセテート(SATA,S-(N-succinimidyl)thioacetate)、N-スクシンイミ
ジル−オキシカルボニル−cu−メチル−a−(2−ピリジルジチオ)トルエン(SMP
T,N-succinimidyl-oxycarbonyl-cu-methyl-a-(2-pyridyldithio) toluene)、N-スク
シンイミジル4−(2−ピリジルジチオ)−ペンタノアート(SPP,N-succinimidyl4-(2-pyridyldithio)-pentanoate)、スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シ
クロヘキサンカルボキシレート(SMCC又はMCC,succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylate)、スルホスクシンイミジル(4−ヨードアセチル)−ア
ミノベンゾエート、4−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−(2−ピリジルジチオ)トルエン、スルホスクシンイミジル−6−(α−メチル−α−(ピリジルジチオール)−トルアミド)ヘキサノエート、N−スクシンイミジル−3−(−2−ピリジルジチオ)−プロピオネート(SPDP,N-succinimidyl-3-(-2-pyridyldithio)-proprionate)
、スクシンイミジル6(3(−(−2−ピリジルジチオ)−プロピオンアミド)ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル 6(3(−(−2−ピリジルジチオ)−プロピオンア
ミド)ヘキサノエート、マレイミドカプロイル(MC,maleimidocaproyl)、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−P−アミノベンジルオキシカルボニル(MC−vc−PAB,maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxycarbonyl)、3−マレ
イミド安息香酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBC,3-maleimidobenzoic acidN-hydroxysuccinimide ester)、アルファ−アルキル誘導体、スルホNHS−ATM
BA(スルホスクシンイミジルN−[3−(アセチルチオ)−3−メチルブチリル−ベータ−アラニン])、スルホジクロロフェノール、2−イミノチオラン、3−(2−ピリジルジチオ)−プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、及びS−(2−チオピリジル)−L−システインを含むが、これらに限定されない(例えば、Thorpe P et al., Eur J Biochem 147:197-206(1985)、Thorpe P et al., Cancer Res 47: 5924-31(1987)、Thorpe P et al., Cancer Res 48: 6396-403 (1988)、Grossbard M etal., Blood 79: 576-85 (1992)、LuiC et al., Proc Natl Acad Sci USA 93: 8618-23 (1996)、Doronina S et al.,Nat Biotechnol 21: 778-84 (2003)、Feld Jet al., Oncotarget 4: 397-412 (2013)を参照されたい)。
4: 397-412 (2013)を参照されたい)。
ンパク質性リンカーは、例えばトレオニン、プロリン、グルタミン、グリシン及びアラニンなどの、極性、非荷電及び/又は荷電残基を有するアミノ酸残基の大部分を含む(例えば、Huston J et al.Proc Natl Acad Sci U.S.A.85: 5879-83 (1988)、Pastan I et al.,Annu Rev Med 58: 221-37 (2007)、Li Jet al., Cell Immunol 118: 85-99 (1989)、CumberA et al.BioconjChem 3: 397-401 (1992)、Friedman P et al., Cancer Res53: 334-9 (1993)、Whitlow M et al., Protein Engineering6: 989-95 (1993)、Siegall C et al.,J Immunol 152: 2377-84 (1994)、Newton et al.Biochemistry 35: 545-53(1996)、Ladurner et al.J Mol Biol 273: 330-7 (1997)、Kreitman R et al.,Leuk Lymphoma
52: 82-6 (2011)、米国特許第4,894,443号明細書を参照されたい)。タンパク
質性リンカーの非限定的な例は、アラニン−セリン−グリシン−グリシン−プロリン−グルタメート(ASGGPE)、バリン−メチオニン(VM)、アラニン−メチオニン(AM)、AM(G2−4S)xAM(この場合、Gはグリシンであり、Sはセリンであり、xは1〜10の整数である)を含む。
ース及びリンカー設計ソフトウェアツールを利用することができる。特定のリンカーが、発現を最適化するために選択されることもある(例えば、Turner D et al., J Immunl Methods205:43-54 (1997)を参照されたい)。ホモ多量体を形成するために同一のポリペ
プチド若しくはタンパク質間の又はヘテロ多量体を形成するために異なるポリペプチド若しくはタンパク質間の分子間相互作用を促進するために、特定のリンカーが選択されることもある。例えば、本発明の細胞標的化タンパク質のポリペプチド成分間の所望の非共有結合性相互作用、例えば、二量体及び他のより高次の多量体の形成に関連した相互作用などを可能にする、タンパク質性リンカーを選択されることもある(例えば、米国特許第4,946,778号明細書を参照されたい)。
空間的離隔を増すように選択されることもあり、及び/又は成分間の分子間相互作用を可能にするように選択されることもある。例えば、様々な「GS」リンカーが当業者に公知であり、複数のグリシン及び/又は1つ若しくは2つ以上のセリンで構成され、例えば(GxS)n、(SxG)n、(GGGGS)n及び(G)n(この場合、xは1〜6であり、nは1〜30である)などの反復単位で構成されることもある(例えば、国際公開第96/06641号パンフレットを参照されたい)。可動性タンパク質性リンカーの非限定的な例は、GKSSGSGSESKS、GSTSGSGKSSEGKG、GSTSGSGKSSEGSGSTKG、GSTSGSGKSSEGKG、GSTSGSGKPGSGEGSTKG、EGKSSGSGSESKEF、SRSSG、及びSGSSCを含む。
性リンカーは、連結された成分間の分子間相互作用を防止するために選択されることがある。
(2013)を参照されたい)。インビボ切断性タンパク質性リンカーは、タンパク質プロセ
ッシングによって結合解除することができる、及び/又は環境を、多くの場合、生物体内の若しくは特定の細胞タイプの内部の特異的部位の環境を、削減することができる(例えば、Doronina S et al.,Bioconjug Chem 17: 144-24 (2006)、EricksonH et al., Cancer Res 66: 4426-33 (2006)を参照されたい)。インビボ切断性タンパク質性リンカーは
、1つ又は2つ以上のシステイン対によって形成されるプロテアーゼ感受性モチーフ及び/又はジスルフィド結合を含むことが多い(例えば、Pietersz G et al.,Cancer Res 48:
4469-76 (1998)、The J et al., J ImmunolMethods110: 101-9 (1998)を参照された
い;Chen X et al., Adv Drug DelivRev65: 1357-69 (2013)を参照されたい)。インビ
ボ切断性タンパク質性リンカーは、生物体内の特定の位置、細胞内の区画、のみに存在する及び/又は特定の生理若しくは病的条件下でのみ活性になるプロテアーゼ(例えば、異常に高レベルのプロテアーゼ、特定の疾患部位で過剰発現されるプロテアーゼ、及び病原性微生物によって特異的に発現されるプロテアーゼなど)に対して感受性であるように設計することができる。例えば、細胞内のみに存在するプロテアーゼ、特異的細胞タイプ内にのみ存在するプロテアーゼ、及びがん若しくは炎症のような病的条件下でのみ存在するプロテアーゼ、例えば、R−x−x−Rモチーフ及びAMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAMなどによって切断されるタンパク質性リンカーは、当技術分野において公知である。
J Biochem 155: 141-7 (1986)、ParkL etal., J Biol Chem 261: 205-10 (1986)、Browning J, Ribolini A, J Immunol 143:1859-67 (1989)、Joshi S, Burrows R, J Biol Chem 265:14518-25 (1990)などの、当技術分野において公知である切断性基を含むリン
カーを含みうる。
、組織間の生理的pH差に対応するpH範囲で切断する特定のリンカーを選択してもよい(例えば、米国特許第5,612,474号明細書を参照されたい)。
の成分、例えばポリペプチド成分、を特定の波長の光への曝露に基づいて放出させることができる。光切断性リンカーの非限定的な例は、システインの光切断性保護基のようなニトロベンジル基、ニトロベンジルオキシカルボニルクロリド架橋剤、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体、グリシン共重合体、フルオレセイン共重合体及びメチルローダミン共重合体を含む(Hazum E et al., Pept Proc Eur Pept Symp, 16th, Brunfeldt K,ed.,105-110 (1981)、Senter et al., Photochem Photobiol42: 231-7(1985)、Yen et
al., MakromolChem 190: 69-82 (1989)、Goldmacher V etal., Bioconj Chem 3: 10
4-7 (1992))。光切断性リンカーは、ファイバーオプティクスを使用して光に曝露することができる疾患、障害及び状態を治療するために設計された本発明の細胞標的化分子を形成するための連結成分に、特に使用されうる。
標的細胞によってMHCクラスI提示のためのT細胞エピトープを送達する能力を有するT細胞の高度免疫化されたポリペプチドは、原則的に、エフェクターポリペプチドを送達するいずれかのプロテアソームにT細胞エピトープを付加することによって作製することができる。本発明のT細胞の高度免疫化されたポリペプチドのB細胞/CD4+T細胞の脱免疫化されたサブバリアントは、エフェクターポリペプチドを送達するプロテアソーム内のいずれかのB細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域における1又は2以上
のアミノ酸残基を、重複する異種T細胞エピトープで置き換えることによって作製することができる。標的細胞によってMHCクラスI提示のためのCD8+T細胞エピトープを送達する能力を有する細胞標的化分子は、原則的に、結果得られた分子が、少なくとも本発明のポリペプチド、細胞標的化部分、又はそれらが一緒になった構造的な組合せによってもたらされる細胞の内在化能力を有する限りは、いずれかの本発明のCD8+T細胞の高度免疫化された及び/又はB細胞/CD4+T細胞の脱免疫化されたポリペプチドを細胞標的化部分に連結することによって作製することができる。
上、6又は7以上、7又は8以上等、8、9、10、11、12まで、又はそれより多くのアミノ酸残基である。
タンパク質毒素の志賀毒素ファミリーは、構造的及び機能的に関連する様々な天然に存在する毒素、例えば、志賀毒素、志賀毒素様毒素1、及び志賀毒素様毒素2で構成される(Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010))。志賀毒素ファミリー
のメンバーは、同じ全体構造及び作用機序を共有する(Engedal, N et al., Microbial Biotech 4: 32-46 (2011))。例えば、Stx、SLT−1及びSLT−2は、無細胞系において区別できない酵素活性を示す(Head S et al., J Biol Chem 266: 3617-21 (1991)、Tesh V et al.,Infect Immun 61: 3392-402(1993)、Brigotti M et al.,Toxicon 35:1431-1437 (1997))。
た志賀毒素様毒素1バリアント(SLT1又はStx1又はSLT−1又はSlt−I)、及び腸管出血性大腸菌の血清型から単離した志賀毒素様毒素2バリアント(SLT2又はStx2又はSLT−2)を包含する。SLT1は、1つのみの残基でStxと異なっており、どちらもベロ細胞毒素又はベロ毒素(VT)と称されてきた(O’Brien, Curr TopMicrobiol Immunol 180: 65-94 (1992))。SLT1及びSLT2バリアントは、アミ
ノ酸配列レベルで約53〜60%しか互いに類似していないが、これらは、志賀毒素ファミリーのメンバーに共通の酵素活性及び細胞毒性のメカニズムを有する(Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010))。39種を超える様々な志賀毒素、例えば定義されたサブタイプであるStx1a、Stx1c、Stx1d、及びStx2a−gが説明されている(Scheutz F et al.,J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012))。志賀毒素をコー
ドする遺伝子は、遺伝子水平伝播を介して細菌種間で広がっている可能性があるため、志賀毒素ファミリーのメンバーは本来、いかなる細菌種にも限定されない(Strauch E et al., Infect Immun 69:7588-95(2001)、Zhaxybayeva O, Doolittle W, Curr Biol 21:R242-6(2011))。種間伝播の一例として、志賀毒素は、患者から単離したA.ヘモリチカス(A. haemolyticus)の株で発見された(Grotiuz G et al., J Clin Microbiol44:3838-41 (2006))。志賀毒素をコードするポリヌクレオチドが新しい亜種又は種に侵入すると
、志賀毒素のアミノ酸配列は、志賀毒素ファミリーのメンバーに共通の細胞毒性メカニズムをなお維持しながら遺伝的浮動及び/又は選択圧力によりわずかな配列バリエーションを発生させることが可能になると推測される(Scheutz, J ClinMicrobiol 50: 2951-63 (2012)を参照)。
FEBS Lett 345: 143-6 (1994)、BarbieriL et al., Biochem J 319: 507-13 (1996)、Roncuzzi L, Gasperi-Campani A, FEBS Lett 392: 16-20 (1996)、Stirpe F et al.,FEBS Lett 382: 309-12 (1996)、BarbieriL et al., NucleicAcids Res 25: 518-22 (1997)、Wang P, TumerN, Nucleic Acids Res 27:1900-5 (1999)、Barbieri L et al.,BiochimBiophys Acta 1480:258-66 (2000)、Barbieri L et al., J Biochem128: 883-9 (2000)、Bagga S et al., JBiol Chem 278: 4813-20 (2003)、PicardD et al., J Biol Chem 280: 20069-75 (2005))。いくつかのRIPは、抗ウイルス活性及びスーパーオキシドジスム
ターゼ活性を示す(Erice A et al., Antimicrob Agents Chemother 37:835-8 (1993)、Au T et al., FEBS Lett 471: 169-72 (2000)、ParikhB, Tumer N, Mini Rev Med Chem 4: 523-43 (2004)、Sharma N et al., Plant Physiol 134:171-81(2004))。
志賀毒素の触媒活性は、インビトロとインビボの両方で観察されている。志賀毒素のエフェクター活性に関するアッセイは、例えば、タンパク質合成阻害活性、脱プリン活性、細胞成長の阻害、細胞毒性、スーパーコイルDNAの弛緩活性、及び/又はヌクレアーゼ活性などの様々な活性を測定することができる。
示的な志賀毒素のエフェクター機能アッセイからのデータの分析で説明されるように、曲線を正確に適合するのに不十分なデータは、実際の志賀毒素のエフェクター機能の代表値として検討されるべきではない。例えば、理論上、所与のサンプルについて一連の濃度でそれぞれ50%より大きいリボソーム阻害又は細胞死が起こらない場合、IC50もCD50も決定することはできない。
、ポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、本発明のCD8+T細胞の高度免疫化された及びB細胞/CD4+T細胞の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプ
チドは、配列番号1又は配列番号2の1〜15;配列番号3の3〜14;配列番号3の26〜37;配列番号1又は配列番号2の27〜37;配列番号1又は配列番号2の39〜48;配列番号3の42〜48;配列番号1、配列番号2又は配列番号3の53〜66;配列番号1、配列番号2又は配列番号3の94〜115;配列番号1又は配列番号2の141〜153;配列番号3の140〜156;配列番号1又は配列番号2の179〜190;配列番号3の179〜191;配列番号3の204;配列番号1又は配列番号2の205;及び配列番号3の210〜218;配列番号3の240〜260;配列番号1又は配列番号2の243〜257;配列番号1又は配列番号2の254〜268;配列番号3の262〜278;配列番号3の281〜297;及び配列番号1又は配列番号2の285〜293のB細胞エピトープ領域、並びに配列番号1又は配列番号2の4〜33、配列番号1又は配列番号2の34〜78、配列番号1又は配列番号2の77〜103、配列番号1又は配列番号2の128〜168、配列番号1又は配列番号2の160〜183、配列番号1又は配列番号2の236〜258、及び配列番号1又は配列番号2の274〜293のCD4+T細胞エピトープ領域からなる天然位置のアミノ酸の群から選択されるアミノ酸配列;又は保存された志賀毒素エフェクターポリペプチド及び/若しくは非ネイティブの志賀毒素エフェクターポリペプチド配列における等価な位置の少なくとも1つの破壊を含む、全長の志賀毒素のAサブユニット(例えばSLT−1A(配列番号1)、StxA(配列番号2)、又はSLT−2A(配列番号3))を含むか又はそれから本質的になっていてもよい。
1へのトランケーションは、2つの予測されたB細胞エピトープ領域、2つの予測されたCD4陽性(CD4+)T細胞エピトープ、及び予測された不連続のB細胞エピトープを除去する。SLT−1A、StxA、又はSLT−2Aのアミノ末端の75〜293へのトランケーションは、少なくとも3つの予測されたB細胞エピトープ領域及び3つの予測されたCD4+T細胞エピトープを除去する。SLT−1A、StxA、又はSLT−2Aのアミノ及びカルボキシ末端の両方の75〜251へのトランケーションは、少なくとも5つの予測されたB細胞エピトープ領域、4つの推定上のCD4+T細胞エピトープ、及び1つの予測された不連続のB細胞エピトープを欠失させる。
B細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域中に少なくとも1つの変異、例えば欠失、挿入、逆位、又は置換を有する全長又はトランケートされた志賀毒素のAサブユニットを含むか又はそれから本質的になっていてもよい。特定のさらなる実施形態において、ポリペプチドは、B細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域内に少なくとも1つのアミノ酸の欠失を含む破壊を含む。特定のさらなる実施形態において、ポリペプチドは、B細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域内に少なくとも1つのアミノ酸の挿入を含む破壊を含む。特定のさらなる実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸の逆位を含む破壊を含み、ここで少なくとも1つの逆転したアミノ酸は、B細胞及び/又はCD4+T細胞エピトープ領域内である。特定のさらなる実施形態において、ポリペプチドは、非標準アミノ酸又は化学的に改変された側鎖を有するアミノ酸へのアミノ酸置換などの変異を含む破壊を含む。実施例に、極めて多くのアミノ酸置換の例を示す。
本発明の目的に関して、成句「ジフテリア毒素エフェクター領域」は、少なくとも1つのジフテリア毒素の機能を示すことが可能な、ジフテリア毒素ファミリーのメンバーのジフテリア毒素に由来するポリペプチド領域を指す。ジフテリア毒素の機能としては、例えば、細胞への侵入、エンドソーム脱出、細胞内経路を方向付けること、リボソームを触媒的に不活性化すること、細胞毒性を達成すること、及び細胞増殖抑制作用を達成することが挙げられる。
〜389のポリペプチドを含むか又はそれから本質的になっていてもよい。
、Keyvani K et al., Life Sci 64: 1719-24 (1999)、DolanK et al., Biochemistry
39: 8266-75 (2000)、Zdanovskaia M et al., Res Micrbiol 151: 557-62 (2000)、Kahn
K, Bruice T, J Am Chem Soc 123: 11960-9 (2001)、Malito E et al.,Proc Natl Acad
Sci USA 109: 5229-34 (2012))。本発明の細胞毒性細胞標的化分子の細胞死を引き起こ
す能力、例えばその細胞毒性は、当業界において周知の多数のアッセイのいずれか1又は2以上を使用して測定され得る。
ジュール式構造である。
熟練した作業者であれば、例えば、抗原性及び/又は免疫原性を示す可能性を低下させる1又は2以上のエピトープ破壊と共に毒素エフェクター領域の全体の構造及び機能を維持することによって、本発明のT細胞の高度免疫化された及び/又はB細胞/CD4+T細胞の脱免疫化されたポリペプチド及び細胞標的化分子、並びに前者のいずれかをコードするポリヌクレオチドに、それらの生物活性を低減させることなくバリエーションをもたらすことができることを理解していると予想される。例えば、いくつかの改変が、発現、精製、並びに/又は薬物動態学的特性及び/若しくは免疫原性を容易にする可能性がある。このような改変は熟練した作業者に周知であり、例えば、開始部位を提供するためのアミノ末端に付加されたメチオニン、都合よく配置された制限部位若しくは終止コドンを作製するためのいずれかの末端に配置された追加のアミノ酸、並びに便利な検出及び/若しくは精製のために提供されるいずれかの末端に融合した生化学的な親和性タグが挙げられる。
グ、マルトース結合タンパク質ドメイン、mycタグ、ポリヒスチジンタグ、ReAsHタグ、strep−タグ、strep−タグII、TEVプロテアーゼ部位、チオレドキシンドメイン、トロンビン切断部位、及びV5エピトープタグである。
1306-10 (1990)を参照されたい。
V:芳香族、嵩高なアミノ酸、VI:親水性で非荷電性、VII:脂肪族で非荷電性、VIII:
非極性で非荷電性、IX:シクロアルケニル結合、X:疎水性、XI:極性、XII:小さい、XIII:ターン許容性、及びXIV:フレキシブルにグループ分けされる。例えば、保存的アミノ酸置換としては、以下:1)Sは、Cで置換されていてもよい;2)M又はLは、Fで置換されていてもよい;3)Yは、Mで置換されていてもよい;4)Q又はEは、Kで置換されていてもよい;5)N又はQは、Hで置換されていてもよい;及び6)Hは、Nで置換されていてもよいことが挙げられる。
ペプチド又はタンパク質が、単独で並びに/又は治療及び/若しくは診断用組成物の成分としてT細胞エピトープ送達機能を保持する限りは、本明細書で列挙されたポリペプチド配列と比較して、最大で、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1つのアミノ酸置換を有する本発明のポリペプチド領域の機能的なフラグメント又はバリアントを含んでいてもよい。本発明のCD8+T細胞の高度免疫化された及び/又はB細胞/CD4+T細胞の脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチド及び/又は細胞標的化タンパク質のバリアントは、変化した細胞毒性、変化した細胞増殖抑制作用、変化した免疫原性、及び/又は変化した血清中半減期などの所望の特性を達成するために、例えば結合領域又はCD8+T細胞の高度免疫化された及び/若しくはB細胞/CD4+T細胞の脱免疫化されたポリペプチド領域内で、1又は2以上のアミノ酸を変更すること又は1又は2以上のアミノ酸を欠失させるか若しくは挿入することによって、本発明の細胞標的化タンパク質のポリペプチドを変化させる結果として本発明の範囲内である。本発明のB細胞エピトープの脱免疫化された及びCD8+T細胞の高度免疫化されたポリペプチド及び/又は細胞標的化タンパク質はさらに、シグナル配列を伴っていてもよいし、又はそうでなくてもよい。
変異は、インビトロで裸の核酸に対する触媒能力を維持しつつも、リボトキシンの領域がリボソーム内の特異的なリボ核酸配列を標的化できないようにすることができる(例えばAlford S etal., BMC Biochem10: 9 (2009)、Alvarez-Garcia E et al., Biochim Biophys Act 1814: 1377-82(2011)、WongY et al., PLoS One 7: e49608 (2012)を参照)。
毒素(cholix toxin)におけるグルタミン酸−581は、DTにおいてグルタミン酸−148と共に保存されており(Jorgensen R et al., EMBO Rep 9: 802-9 (2008))、したがって、コリックス毒素におけるグルタミン酸−581の変異は、コリックス毒素の酵素活性を低下させると予測される。
27-41 (1992))、Beattie B et al., Biochemistry35:15134-42 (1996)、Roberts T, Merrill A, Biochem J 367: 601-8 (2002)、YatesSet al., Biochem J 385: 667-75 (2005)、Jorgensen R et al., EMBO Rep 9: 802-9 (2008))。コリックス毒素におけるグルタ
ミン酸−574及びグルタミン酸−581は、それぞれPEにおいてグルタミン酸−546及びグルタミン酸−553と共に保存されており(Jorgensen R et al., EMBO Rep 9: 802-9 (2008))、したがってコリックス毒素におけるグルタミン酸−574及び/又はグルタミン酸−581の変異は、コリックス毒素の酵素活性を低下させると予測される。
活性に必要なアミノ酸残基は、熟練した作業者に公知の配列アライメント方法によって、関連するポリペプチド配列で予測が可能である。
(2011)、Walsh M, Virulence 4: 774-84(2013)))。RIPファミリーのメンバー
の触媒ドメインは重ね合わせることが可能であるため、触媒活性に必要なアミノ酸残基は、熟練した作業者に公知の配列アライメント方法によって、RIPファミリーの自然に生じた及び/又は新しいメンバーで予測が可能である(例えばHusain J et al., FEBS Lett342: 154-8 (1994)、RenJ et al., Structure 2: 7-16(1994)、Lebeda F, Olson M, Int
J Biol Macromol 24: 19-26(1999)、Ma Q et al., Acta CrystallogrD Biol Crystallog
r 56: 185-6 (2000)、Savino C et al., FEBS Lett 470:239-43 (2000)、Robertus
J, Monzingo A, Mini Rev Med Chem 4: 477-86 (2004)、Mishra V et al., J Biol Chem 280: 20712-21 (2005)、Zhou C et al., Bioinformatics 21: 3089-96 (2005)、Lubelli C et al.,Anal Biochem 355: 102-9(2006)、Touloupakis E etal., FEBS J 273: 2684-92 (2006)、Hou X et al., BMCStruct Biol 7: 29 (2007)、Meyer A et al., Biochem Biophys Res Commun 364: 195-200(2007)、RuggieroA et al., Protein Pept Lett 14:
97-100 (2007)、Wang T et al., Amino Acids 34:239-43(2008)を参照)。
268: 5723-33 (2001))。
ルタミン酸−167、及びアルギニン−170などの触媒活性にとって重要な数種のアミノ酸残基がある(Touloupakis E et al., FEBS J273:2684-92 (2006))。
(2004)、Mishra V et al., J Biol Chem 280: 20712-21(2005)、Wacker R et al., J
Pept Sci 11: 289-302 (2005))。
ンにおいて、例えば、N24、F25、A28、V29、Y81、V82、V83、G84、E146、E147、A148、I149、S168、F169、I170、I171、C172、I173、Q174、M175、I176、S177、E178、A179、A180、R181、F182、Q183、Y184、D202、P203、I206、T207、N210、S211、W212、及びG213などの欠失している場合にリシンの触媒活性を損なうことが公知の数種のアミノ酸残基がある(Munishkin A,
Wool I, J Biol Chem 270: 30581-7 (1995)、Berrondo M, Gray J, Proteins79:2844-60
(2011))。
、シグナルペプチドが包含される場合もある(Marshall R et al., Plant J65:218-29 (2011))。
Protein Eng 16: 351-6 (2003)、GuoQ et al.,Protein Eng 16: 391-6 (2003)、ChanD et al., Nucleic Acid Res 35: 1660-72 (2007))。
触媒作用に関する3つの高度に保存されたアミノ酸残基、2つのヒスチジン残基及びグルタミン酸残基(RNAアーゼT1において、例えばヒスチジン−40、グルタミン酸−5
8、及びヒスチジン−92)を共有する。DSKKPモチーフは、SRLとの特異的な結合のために真菌性リボトキシンに存在することが多い(Kao R, Davies J, J Biol Chem274: 12576-82 (1999))。真菌性リボトキシンの触媒ドメインは重ね合わせることが可能
であるため、触媒活性に必要なアミノ酸残基は、熟練した作業者に公知の1又は2以上の配列アライメント方法を使用して、自然に生じた及び/又は新しい真菌性リボトキシンで予測が可能である。
al., FEBS J 272: 2536-44 (2005))。
)。無細胞リボソーム不活性化アッセイにおいて、グルタミン酸−167とアルギニン−170の両方を変異させると、Slt−I A1の酵素活性が消去された(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。小胞体でSlt−I A1のデノボ発現を使用する別のアプローチにおいて、グルタミン酸−167とアルギニン−170の両方を変異させると、Slt−I A1フラグメントの細胞毒性がその発現レベルで消去された(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。トランケーション分析から、残基75から268までのStxAのフラグメントが、インビトロで有意な酵素活性をなお保持していることが実証された(Haddad, J Bacteriol 175: 4970-8 (1993))。残基1〜239
を含有するSlt−I A1のトランケートされたフラグメントは、インビトロにおいて有意な酵素活性及びサイトゾルにおいてデノボ発現による細胞毒性を示した(LaPointe,
J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。小胞体中の残基1〜239にトランケートされたSlt−I A1フラグメントの発現は、サイトゾルにレトロ転移(retrotranslocate)することができないことから、細胞毒性ではなかった(LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005))。
タミン酸−E167からリシン、及びアルギニン−176からリシンの変異を含有するStx2Aの二重ミュータントコンストラクトは完全に不活性化され、それに対して、Stx1及びStx2における多くの単一の変異は細胞毒性の10分の1の低下を示した。さらに、Stx1Aの1〜239又は1〜240へのトランケーションは、その細胞毒性を低下させ、同様に、Stx2Aの保存された疎水性残基へのトランケーションは、その細胞毒性を低下させた。志賀毒素のAサブユニットにおける真核性リボソーム及び/又は真核性リボソーム阻害の結合にとって最も重要な残基は、なかでも以下の残基位置、アルギニン−172、アルギニン−176、アルギニン−179、アルギニン−188、チロシン−189、バリン−191、及びロイシン−233にマッピングされている(McCluskey A et al., PLoS One 7:e31191(2012))。
達してリボソームを触媒的に不活性化させるのに、わずか240残基しか必要としない(LaPointe, JBiol Chem 280: 23310-18 (2005))。
本発明は、細胞を標的化する細胞毒性分子及び診断用組成物などの様々な物質の組成物の成分として使用することができる、様々なCD8+T細胞の高度免疫化された及び/又はB細胞/CD4+T細胞の脱免疫化されたポリペプチドを説明する。特定には、CD8+T細胞の高度免疫化された及び/又はB細胞/CD4+T細胞の脱免疫化されたポリペプチドは、がん、免疫障害、及び微生物感染を含む様々な疾患を治療するための特異的な細胞型の標的化された殺滅のための、例えば免疫毒素及びリガンド−毒素融合体などの様々なタンパク質治療剤の成分としての用途を有する。
、それと同時に別の細胞毒性メカニズムを追加し、局所領域への免疫刺激能力を追加する。さらに、細胞毒性に関して毒素及び/又は酵素領域を頼る親の細胞毒性分子は、異種T細胞エピトープを作製する配列変化によって酵素活性が低下されるか又は消去されるように親分子の酵素ドメインにT細胞エピトープを組み込むことにより、T細胞エピトープのサイトゾルへの送達及び提示のみを介して、細胞毒性になるように加工してもよい。これは、細胞に内在化させてサイトゾルに経路決定する能力を有する酵素的に細胞毒性の分子を、細胞毒性及び局所的な免疫刺激に関するT細胞エピトープのプロテアソーム送達及び提示を頼る酵素的に不活性な細胞毒性分子に一段階で改変することを可能にする。
本発明の特定のCD8+T細胞の高度免疫化されたポリペプチド及び細胞標的化分子の1つの機能は、細胞による1又は2以上のMHCクラスI提示のためのT細胞エピトープの送達である。標的細胞のMHCクラスI系への外因性T細胞エピトープペプチドの送達は、細胞表面上のMHCクラスI分子と関連してT細胞エピトープペプチドを提示するように標的細胞を誘導するのに使用することができ、その後それによってCD8+エフェクターT細胞の活性化が引き起こされて標的細胞が攻撃される。
分子への結合親和性の測定、及び/又はCTL応答をモニターすることによる標的細胞上でのMHCクラスI−エピトープペプチド複合体提示の機能的な結果の測定などを使用して調査することができる。
体のT細胞受容体、例えばTCR-STAR試薬(Altor社、Mirmar、FL、U.S.)は、特異的なM
HC I/抗原複合体を直接可視化又は定量化するのに使用することができる(Zhu X etal., J Immunol 176: 3223-32 (2006))。これらの特異的なmAb又は可溶性で多量体
のT細胞受容体は、例えば免疫組織化学、フローサイトメトリー、及び酵素結合免疫測定法(ELISA,enzyme-linkedimmuno assay)などの様々な検出方法と共に使用され得
る。
資源MHC−I結合予測統一ツール(Kim Y et al., Nucleic Acid Res40:W525-30 (2012)などがある。数種の実験的アッセイが慣習的に適用されており、例えば結合速度を定
量化及び/又は比較するための細胞表面結合アッセイ及び/又は表面プラズモン共鳴アッセイなどがある(Miles Ket al., Mol Immunol 48: 728-32 (2011))。加えて、公知の
対照と比較した、所与のMHCクラスI対立遺伝子に関する三次元のMHC−ペプチド複合体を安定化させるペプチドの能力の測定に基づく他のMHC−ペプチド結合アッセイも開発されている(例えば、ProImmmune, Inc.社製のMHC-ペプチド結合アッセイ)。
)非放射性キット及びCellTox(商標)CellTiter-GLO(登録商標)キット)、グランザイムB ELISpot、カスパーゼアッセイ又はLAMP−1トランスロケーションフロ
ーサイトメトリーアッセイなどの多数のアッセイを使用して測定することができる。標的細胞の殺滅を特異的にモニターするために、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE,Carboxyfluoresceindiacetate succinimidyl ester
)が、エピトープ特異的なCSFE標識標的細胞の殺滅をモニターするためのインビトロ又はインビボでの調査にとって所望の細胞集団を容易且つ迅速に標識するのに使用することができる(Durward M et al., J Vis Exp 45 pii2250(2010))。
毒化ウイルスワクチン)を投与し、続いて活性薬剤(例えばウイルス)で負荷を与え、その物質に対する応答を、典型的にはワクチン非接種の対照と比較してモニターすることができる。エクスビボのサンプルは、CTL活性に関して、これまでに説明した方法(例えばCTL細胞毒性アッセイ及びサイトカイン放出の定量化)に類似した方法でモニターすることができる。
素を受けた標的細胞の表面上でMHC複合体において提示されることを実証することになる。
徴である(Aly HA, J Immunol Methods 382: 1-23 (2012))。生物内での標的細胞によるT細胞エピトープの提示は、標的細胞及び/又はその生物内の一般的な場所に対するロバストな免疫応答の活性化をもたらすことができる。したがって、提示のためのT細胞エピトープの標的化された送達は、治療レジメン中にT細胞応答の活性化を操作するために利用される可能性がある。
本発明のCD8+T細胞の高度免疫化された及び/又はB細胞/CD4+T細胞の脱免疫化されたポリペプチドを含む本発明の細胞標的化分子は、以下の両方:1)MHCクラスI提示のための細胞型特異的なT細胞エピトープの送達及び2)有力な細胞毒性を提供することができる。加えて、本発明の細胞標的化分子の特定の実施形態はまた、哺乳動物に投与した場合に特定の免疫応答が起こる可能性を低下させる脱免疫化も提供する。
本発明の、B細胞エピトープの脱免疫化がなされた又はなされていないT細胞エピトープを送達するCD8+T細胞の高度免疫化されたポリペプチドは、間接的な細胞殺滅のための細胞標的化分子の成分として使用することができる。本発明の細胞標的化分子の特定の実施形態は、細胞標的化分子の標的内在化の際に標的細胞のMHCクラスI提示経路に1又は2以上のT細胞エピトープを送達する本発明のポリペプチドを提示するCD8+T細胞エピトープを含むことから、それらは細胞毒性である。
本発明のT細胞エピトープを送達するCD8+T細胞の高度免疫化された及び/又はB細胞/CD4+T細胞の脱免疫化されたポリペプチドは、直接の細胞殺滅のための細胞標的化分子の成分として使用することができる。
本発明のポリペプチド及び細胞標的化分子は、哺乳動物において望ましくない免疫応答が生じる可能性を低下させながら哺乳動物において望ましい免疫応答が生じる可能性を増加させるために、治療剤及び/又は診断剤のいずれかとしての哺乳動物種への投与に関する改善された有用性を有する。
本発明の特定の細胞標的化分子は、非標的化バイスタンダー細胞の存在下における特異的な標的細胞の選択的な殺滅において用途を有する。標的細胞のMHCクラスI経路への免疫原性T細胞エピトープの送達を標的化することによって、それに続く本発明の細胞標的化分子により誘導されたT細胞エピトープの提示及び標的細胞のCTL媒介細胞崩壊を、非標的化細胞の存在下で選択された細胞型を優先的に殺滅することに限定することができる。加えて、様々な毒素エフェクター領域の有力な細胞毒性活性による標的細胞の殺滅は、免疫原性T細胞エピトープと細胞毒性の毒素エフェクターポリペプチドの同時送達により標的細胞を優先的に殺滅することに限定することができる。
この有力な細胞殺滅活性を、標的化が望ましい細胞型と選ばれた結合領域の標的生体分子との物理的な関連によってそのような細胞型のみを殺滅することに限定することができる。
細胞毒性及び細胞増殖抑制性の適用に加えて、本発明の細胞標的化分子は、情報収集及び診断機能のために使用されてもよい。さらに、本発明の細胞毒性細胞標的化分子の非毒性バリアント、又は毒性バリアントは、細胞毒性タンパク質の細胞外標的生体分子と物理的に組み合わされた細胞に追加の外因性物質を送達すること、及び/又はそのような細胞の内部を標識することに使用されてもよい。少なくとも1つの細胞表面に標的生体分子を発現する様々な種類の細胞及び/又は細胞集団は、外因性物質を受け取るために本発明の細胞標的化分子によって標的化されてもよい。本発明の機能的な成分は、モジュール式構造であり、それにおいて、様々な毒素エフェクター領域及び追加の外因性物質が、腫瘍細
胞の非侵襲的なインビボでのイメージングなどの多様な適用を提供するために様々な結合領域に連結されていてもよい。
本発明の特定の細胞標的化分子は、インビトロ及び/又はインビボにおける特異的な細胞、細胞型、及び/又は細胞集団の検出において用途を有する。特定の実施形態において、本明細書で説明されるタンパク質は、診断と治療の両方、又は診断単独に使用される。診断と治療の両方に同じ細胞毒性タンパク質が使用される場合、診断のための検出促進剤を取り入れている細胞毒性タンパク質バリアントは、本明細書で説明される例示的な置換などの1又は2以上のアミノ酸置換を介した毒素エフェクター領域の触媒による不活性化によって非毒性にされてもよい。検出促進剤にコンジュゲートされる本発明の細胞毒性細胞標的化分子の非毒性形態は、診断機能に、例えば同じ又は関連する結合領域を含む治療レジメンと共に使用されるコンパニオン診断に使用されてもよい。
サイトゾル区画)のイメージングを介した情報収集に使用される可能性がある。
脱免疫化されたポリペプチド及びそれを含む細胞標的化分子の産生、製造、及び精製
本発明のCD8+T細胞の高度免疫化された及び/又はB細胞/CD4+T細胞の脱免疫化されたポリペプチド及び細胞標的化分子は、当業者に周知の生化学工学の技術を使用して産生され得る。例えば、本発明のポリペプチド及び細胞標的化分子は、標準的な合成方法、組換え発現系の使用、又は他のあらゆる好適な方法によって製造され得る。したがって、本発明のポリペプチド及び細胞標的化タンパク質は、多数の方法で合成することが可能であり、このような方法としては、例えば、(1)標準的な固相又は液相の手法を使用して、段階的に又はフラグメントのアセンブリのいずれかによってタンパク質のポリペプチド又はポリペプチド成分を合成するステップと、最終的なペプチド化合物生成物を単離し精製するステップとを含む方法;(2)宿主細胞中の本発明の細胞標的化タンパク質のポリペプチド又はポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを発現させるステップと、宿主細胞又は宿主細胞培養から発現生成物を回収するステップとを含む方法;又は(3)インビトロで本発明の細胞標的化タンパク質のポリペプチド又はポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを無細胞発現させるステップと、発現生成物を回収するステップとを含む方法;又は(1)、(2)又は(3)の方法のあらゆる組合せによって、ペプチド成分のフラグメントを得て、その後フラグメントを合体させ(例えばライゲートして)ペプチド成分を得て、ペプチド成分を回収する方法が挙げられる。
Peptides, Grant G, ed., OxfordUniversity Press, U.K.,2nd ed., 2002)及びそこ
に記載された合成の実施例を参照してもよい。
ナミドリムシ(C. reinhardtii)など)、昆虫細胞株、哺乳動物細胞(CHO細胞など)、植物細胞株、並びに真核生物、例えばトランスジェニック植物(シロイスナズナ(A. thaliana)及びベンサミアナタバコ(N. benthamiana)など)が挙げられる。
の脱免疫化されたポリペプチド並びに/又は細胞標的化分子の純度を増加させるために、相当数の生化学精製技術を使用することができる。特定の実施形態において、本発明のポリペプチド及び細胞標的化分子は、ホモ多量体の形態(すなわち2又は3以上の本発明の同一なポリペプチド又は細胞標的化分子のタンパク質複合体)で精製されてもよい。
本発明は、以下のさらなる詳細で説明される状態、疾患、障害、又は症状(例えばがん、悪性腫瘍、非悪性腫瘍、成長異常、免疫障害、及び微生物感染)の治療又は防止のための医薬組成物において、単独で、又は1又は2以上の追加の治療剤と組み合わせて使用するためのポリペプチド及びタンパク質を提供する。本発明はさらに、本発明に従って、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、賦形剤、又は媒体と共に、本発明のポリペプチド若しくは細胞標的化分子、又はそれらの薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明のポリペプチド又は細胞標的化分子のホモ多量体及び/又はヘテロ多量体の形態を含んでいてもよい。医薬組成物は、以下のさらなる詳細で説明される疾患、状態、障害、又は症状を治療、緩和又は予防する方法において有用であると予想される。このような疾患、状態、障害、又は症状はそれぞれ、本発明に係る医薬組成物の使用に対して別の実施形態であると想定される。本発明は、さらに、以下でより詳細に説明されるように、少なくとも1つの本発明に係る治療方法で使用するための医薬組成物を提供する。
らの文法上の変化形は、状態、疾患、若しくは障害の発症を予防する、又はその病状を変更するためのアプローチを指す。したがって、「予防」は、防止的又は予防的措置を指す場合もある。本発明の目的に関して、有益な又は所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、検出可能か又は検出不可能かにかかわらず、疾患の症状、進行又は発症の予防又は減速が挙げられる。したがって予防が必要な対象(例えばヒト)は、まだ問題の疾患又は障害に罹っていない対象であり得る。用語「予防」は、治療しない場合と比較して疾患の発病を減速させることを包含し、関連する疾患、障害又は状態の永続的な予防を暗に示すことを必ずしも意味するわけではない。したがって状態を「予防すること」又は状態の「予防」は、特定の状況において、状態を発症する危険を低下させること、又は状態に関連する症状の発症を予防若しくは遅延することを指す場合がある。
22: 115-9 (2009)、Qiao J et al., PLoSONE 6: e18103 (2011)、Sano K et al., Breast Cancer Res14: R61 (2012)を参照)。例えば、検出促進剤としては、画像を強調す
る造影剤、例えば蛍光色素(例えばAlexa680、インドシアニングリーン、及びCy5.5)、同位体及び放射性核種、例えば11C、13N、15O、18F、32P、51Mn、52mMn、52Fe、55Co、62Cu、64Cu,67Cu、67Ga、68Ga、72As、73Se、75Br、76Br、82mRb、83Sr、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、110In、111In、120I、123I、124I、125I、131I、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、177Lu、186Re、188Re、及び223R;常磁性イオ
ン、例えばクロム(III)、マンガン(II)、鉄(III)、鉄(II)、コバルト(II)、ニッケル(II)、銅(II)、ネオジム(III)、サマリウム(III)、イッテルビウム(III)、ガドリニウム(III)、バナジウム(II)、テルビウム(III)、ジスプロシウム(III)、ホルミウム(III)又はエルビウム(III);金属、例えばランタン(III)、金(III)、鉛(II)、及びビスマス(III);超音波コントラスト増強剤、例えばリポソーム;放射線不透物質、例えばバリウム、ガリウム、及びタリウム化合物が挙げられる。検出促進剤は、中間官能基、例えば2−ベンジルDTPA、PAMAM、NOTA、DOTA、TETA、それらの類似体、及び前述のもののいずれかの機能的な均等物のようなキレート化剤を使用することによって直接的又は間接的に取り込まれていてもよい(Leyton J et al.,Clin Cancer Res 14: 7488-96(2008)を参照)。
様に、医療分野で一般的に使用される非侵襲的なインビボでのイメージング技術などの熟練した作業者に公知の極めて多くのイメージングアプローチがあり、例えば、コンピューター断層撮影イメージング(CTスキャニング)、光学的イメージング(直接の、蛍光による、及び生物発光によるイメージングなど)、磁気共鳴映像法(MRI,magnetic resonance imaging)、ポジトロンエミッショントモグラフィー(PET,positron emission tomography)、単光子放射型コンピューター断層撮影法(SPECT,single-photon emission computed tomography)、超音波、及びX線コンピューター断層撮影イメージングである(総論については、Kaur S et al., Cancer Lett 315: 97-111 (2012)を参照)
。
本発明のポリペプチド及び細胞標的化分子のいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物も、同様に本発明の範囲内である。
ては、本明細書で使用される場合、ありとあらゆる生理学的に許容できる、すなわち適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に許容される担体又は希釈剤としては、経口、直腸、経鼻又は非経口(皮下、筋肉内、静脈内、皮内、及び経皮など)投与に好適な製剤で使用されるものが挙げられる。例示的な薬学的に許容される担体としては、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる。本発明の医薬組成物で採用される可能性がある好適な水性及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール(例え
ばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、及びそれらの好適な混合物、植物油、例えばオリーブ油、並びに注射可能な有機エステル、例えばエチルオレエートが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液のケースで求められる粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。特定の実施形態において、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与(例えば注射又は点滴による)に好適である。選択された投与経路に応じて、タンパク質又は他の医薬成分は、特定の投与経路によって患者に投与されたときに活性タンパク質が遭遇する可能性がある低いpH及び他の天然の不活性化条件の作用から化合物を保護することを意図した材料でコーティングされていてもよい。
しい可能性がある。注射用組成物の持続吸収は、組成物中に、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンなどの吸収を遅延させる物質を包含させることによって達成することができる。
本発明のポリペプチド及びタンパク質のほかにも、本発明のポリペプチド及び細胞標的化分子、又はそれらの機能的な部分をコードするポリヌクレオチドも、本発明の範囲内に包含される。用語「ポリヌクレオチド」は、用語「核酸」と同等であり、そのそれぞれが、デオキシリボ核酸(DNA,deoxyribonucleic acid)のポリマー、リボ核酸(RNA
,ribonucleic acid)のポリマー、ヌクレオチド類似体を使用して生成されたこれらのDNA又はRNAの類似体、並びにそれらの誘導体、フラグメント及びホモログの1又は2以上を包含する。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であり得る。このようなポリヌクレオチドは、例えば、RNAコドンの第三の位置で許容されるが異なるRNAコドンとして同じアミノ酸をコードすることが公知のゆらぎを考慮に入れて、例示的なタンパク質をコードすることが可能な全てのポリヌクレオチドを包含するように具体的に開示されている(Stothard P,Biotechniques 28: 1102-4 (2000)を参照)。
ゴリズムを使用するデフォルト設定を使用した、GAPプログラム(Wisconsin SequenceAnalysis Package、UNIX用バージョン8、Genetics Computer Group、University ResearchPark、Madison、WI、U.S.)である。また、ストリンジェントな条件下で本発明
の細胞標的化タンパク質をコードする配列の相補物にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドも包含される(例えばAusubel F et al.,Current Protocols in Molecula
r Biology (John Wiley& Sons, New York, NY, U.S.,1993)、及び以下を参照)。ス
トリンジェントな条件は当業者公知であり、例えば、Current Protocols in MolecularBiology (John Wiley &Sons, NY, U.S., Ch. Sec.6.3.1-6.3.6 (1989))で見出すこと
ができる。
特定の実施形態において、本発明は、1又は2以上の本発明の物質の組成物、例えばそれを必要とする対象に送達するための医薬組成物を含むデバイスに関する。したがって、1又は2以上の本発明の化合物を含む送達デバイスを使用して、静脈内、皮下、筋肉内又は腹膜内注射;経口投与;経皮投与;肺内又は経粘膜投与;インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ又はマイクロポンプによる投与;又は当業者によって認識される他の手段による投与などの様々な送達方法によって本発明の物質の組成物を患者に投与することができる。
されたポリペプチドを生成する方法
本発明は、細胞のエンドソーム区画から細胞のサイトゾル、ER、又はリソソームへの細胞内の経路決定がすでに可能なポリペプチドを改変することによって、本発明のT細胞の高度免疫化された及び/又はB細胞/CD4+T細胞の脱免疫化されたポリペプチドを作製する方法であって、異種T細胞エピトープをポリペプチドに付加するステップを含む方法を提供する。本発明の特定のさらなる方法において、異種T細胞エピトープは、細胞のエンドソーム区画から細胞のサイトゾル、ER、又はリソソームへの細胞内の経路決定が可能なポリペプチド内に組み込まれるか又は挿入される。
テップを含む。本発明の特定のさらなる方法において、異種T細胞エピトープは、細胞のエンドソーム区画から細胞のサイトゾル、ER、又はリソソームへの細胞内の経路決定が可能なポリペプチド内に組み込まれるか又は挿入される。
方法であって、1)ポリペプチド中のCD4+T細胞エピトープを同定するステップ;及び2)ポリペプチドに付加された異種CD8+T細胞エピトープに含まれる1又は2以上のアミノ酸残基で同定されたCD4+T細胞エピトープを破壊するステップを含む方法である。特定のさらなる実施形態において、破壊するステップは、CD4+T細胞エピトープ領域中に1又は2以上のアミノ酸置換を作製することをさらに含む。特定のさらなる実施形態において、破壊するステップは、CD4+T細胞エピトープ領域中に1又は2以上のアミノ酸挿入を作製することをさらに含む。
一般的に、本発明の目的は、特定のがん、腫瘍、成長異常、免疫障害、又は本明細書で述べられるさらなる病的状態などの疾患、障害、及び状態の予防及び/又は治療において使用することができる薬理活性薬剤、加えてそれを含む組成物を提供することである。したがって、本発明は、標的細胞のMHCクラスI提示経路にT細胞エピトープを送達するために、標的化された細胞の殺滅のために、標的化された細胞に追加の外因性物質を送達するために、標的化された細胞の内部を標識するために、診断の情報を収集するために、及び本明細書で説明されるような疾患、障害、及び状態を治療するために、本発明のポリペプチド、細胞標的化分子、及び医薬組成物を使用する方法を提供する。
T細胞エピトープのMHCクラスI系への送達とそれに続く細胞毒性のための標的細胞表面での提示を頼る酵素的に不活性な細胞毒性分子に一段階で改変することを可能にする。本発明のポリペプチドのいずれも、例えば生物内などの2又は3以上の細胞型の混合物内の特異的な細胞型を標的化する様々な細胞を標的化する結合領域を連結することによって、治療剤としての可能性を有する細胞を標的化する細胞毒性分子に加工することができる。
して、がん又は腫瘍細胞と物理的に組み合わされていることが見出された細胞外生体分子を標的化することによって、患者におけるがん細胞を殺滅することができる。用語「がん細胞」又は「癌細胞」は、異常に速い速度の様式で成長し分裂する様々な新生細胞を指し、当業者には明らかであると予想される。用語「腫瘍細胞」は、悪性及び非悪性細胞の両方を包含する。一般的に、がん及び/又は腫瘍は、治療及び/又は予防を受けることが可能な疾患、障害、又は状態と定義することができる。本発明の方法及び組成物によって利益を得る可能性があるがん細胞及び/又は腫瘍細胞で構成されるがん及び腫瘍(悪性又は良性のどちらも)は、当業者には明らかであると予想される。新生細胞は、以下:制御不能な成長、分化の欠如、局所的な組織浸潤、血管新生、及び転移の1又は2以上を伴うことが多い。
方法の好ましい実施形態において、非自己のT細胞エピトープペプチドは、細胞標的化分子の標的細胞によってまだ提示されていないペプチド、標的細胞によって発現されるいずれのタンパク質内でも提示されていないペプチド、標的細胞のプロテオーム内で提示されていないペプチド、接種しようとする部位の細胞外の微環境中で提示されていないペプチド、及び標的化しようとする腫瘤又は感染組織の部位中で提示されていないペプチドからなる群より選択される。
、約0.0001〜100ミリグラム/キログラム(mg/kg)及びそれより多く、通常は0.01〜5mg/kgであると予想される。例示的な投薬量は、体重1kg当たり0.25mg、体重1kg当たり1mg、体重1kg当たり3mg、体重1kg当たり5mg若しくは体重1kg当たり10mg、又は1〜10mg/kgの範囲内であり得る。例示的な治療計画は、1日1回若しくは2回の投与、又は週1回若しくは2回の投与、2週毎に1回、3週毎に1回、4週毎に1回、月1回、2若しくは3ヶ月毎に1回、又は3〜6ヶ月毎に1回である。投薬量は、特定の患者ごとに治療的有用性を最大化するために必要に応じて、熟練した健康管理の専門家によって選択及び再調整が可能である。
、標的細胞の殺滅又は枯渇が有益であり得る様々な病理学的障害、例えば、とりわけ、がん、腫瘍、他の成長異常、免疫障害、及び感染細胞を治療するための方法において有用であると予想される。本発明は、細胞増殖を抑制し、新形成、過剰に活性なB細胞、及び過剰に活性なT細胞などの細胞の障害を治療するための方法を提供する。
おいて、治療されるがんは、骨がん(例えば多発性骨髄腫又はユーイング肉腫)、乳がん、中枢/末梢神経系のがん(例えば脳がん、神経線維腫症、又は膠芽腫)、消化器がん(例えば胃がん又は結腸直腸がん)、生殖細胞がん(例えば卵巣がん及び睾丸がん)、腺がん(例えば膵臓がん、副甲状腺がん、褐色細胞腫、唾液腺がん、又は甲状腺がん)、頭頸部がん(例えば鼻咽頭がん、口腔がん、又は咽頭がん)、血液がん(例えば白血病、リンパ腫、又は骨髄腫)、腎臓から尿道のがん(例えば腎臓がん及び膀胱がん)、肝臓がん、肺/胸膜がん(例えば中皮腫、小細胞肺癌、又は非小細胞肺癌)、前立腺がん、肉腫(例えば血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、又は滑膜肉腫)、皮膚がん(例えば基底細胞癌、扁平上皮癌、又は黒色腫)、及び子宮がんからなる群より選択される。
できる(総論については、Wiley R, Lappi D,Adv Drug Deliv Rev 55: 1043-54(2003)
を参照)。例えば、標的化ドメインは、様々なリガンド、例えば神経回路に特異的なGタンパク質共役受容体などのニューロン表面の受容体と結合することによって特異的な神経細胞型を標的化する神経伝達物質及び神経ペプチドから選択又は誘導されてもよい。同様に、標的化ドメインは、ニューロン表面の受容体と結合する抗体から選択又は誘導されてもよい。特定の毒素がそれら自身の逆行性軸索輸送をロバストに指示することから、本発明の特定の細胞毒性細胞標的化分子を使用して、細胞体から遠位の細胞毒性タンパク質注射部位で細胞外標的を発現するニューロンを殺滅することができる(Llewellyn-Smith I et al., J NeurosciMethods103: 83-90 (2000)を参照)。これらの神経細胞型特異的な
標的化細胞毒性ポリペプチド及びタンパク質は、例えば感覚のメカニズムを解明するための神経科学の調査(例えばMishraS, Hoon M, Science 340: 968-71(2013)を参照)、及
びパーキンソン及びアルツハイマーなどの神経変性疾患のモデル系を作製すること(例えばHamlinA et al., PLoSOne e53472 (2013)を参照)において用途を有する。
型の存在を検出するために、本発明のポリペプチド、タンパク質、医薬組成物、及び/又は診断用組成物を使用する方法である。本方法は、細胞を診断に十分な量の細胞毒性分子と接触させて、アッセイ又は診断技術によって細胞毒性分子を検出するステップを含む。成句「診断に十分な量」は、利用される特定のアッセイ又は診断技術によって情報収集目的で十分な検出及び正確な測定がもたらされる量を指す。一般的に、インビボでの診断での使用における生物全体にとって診断に十分な量は、対象1kg当たり0.1mg〜100mgの非累積用量の、検出促進剤が連結された本発明の細胞標的化分子と予想される。典型的には、これらの情報収集方法で使用される本発明のポリペプチド又は細胞標的化分子の量は、なお診断に十分な量であるという条件で、可能な限り低いと予想される。例えば、生物におけるインビボでの検出の場合、対象に投与される本発明のポリペプチド、タンパク質、又は医薬組成物の量は、実行可能なレベルで可能な限り低いと予想される。
、Ogawa M et al., Cancer Res 69: 1268-72 (2009)、Yang L et al., Small 5: 235-43 (2009)を参照)。本発明の特定のポリペプチド、タンパク質、及び医薬組成物の、逆行性細胞内輸送を介して細胞内の特異的な細胞型及び経路に侵入する能力に基づいて、特異的な細胞型の内部区画が、検出のために標識される。これは、患者内のインサイチュの細胞に、又は生物から取り出された細胞及び組織、例えば生検材料に行うことができる。
胞ベースの療法に関係なく、治療剤に対する応答を評価するのに使用することができる。例えば、本発明の診断の特定の実施形態は、腫瘍サイズの変化、数及び分布などの抗原陽性細胞集団の変化を測定すること、又はすでに患者に施された療法によって標的化された抗原とは異なるマーカーをモニターすることに使用することができる(Smith-Jones P etal., Nat. Biotechnol 22: 701-6 (2004)、Evans Met al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108: 9578-82 (2011)を参照)。
ットリンパ腫(BL,Burkitt's lymphoma)、慢性リンパ球性白血病(CLL,chronic lymphocytic leukemia)、慢性骨髄性白血病(CML−BP,chronic myelogenous leukemia)、慢性骨髄性白血病(CML,chronicmyeloidleukemia)、びまん性大細胞型B
細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病(HCL,hairy cell leukemia)
、ホジキンリンパ腫(HL,Hodgkin's Lymphoma)、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、リンパ形質細胞性リンパ腫、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫(MM,multiple myeloma)、ナチュラルキラー細胞白血病、節性辺縁帯B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫(NHL,Non-Hodgkin's lymphoma)、プラズマ細胞性白血病、形質細胞腫、原発性滲出液リンパ腫、前リンパ球性白血病、前骨髄球性白血病、小リンパ球性リンパ腫、脾性辺縁帯リンパ腫、T細胞リンパ腫(TCL,T-cell lymphoma)、重鎖病、単クローン性免疫グロブリン血症、単クローン性免疫グロブリン沈
着症、骨髄異形成症候群(MDS,myelodusplastic syndrome)、くすぶり型多発性骨髄腫、及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症などの疾患、障害、及び状態に関する情報を収集するのに使用することができる。
的化することが可能な、選択的に細胞毒性の細胞標的化タンパク質の非限定的な実施例によって、本発明をさらに例示する。
[実施例]
ター領域にいかなる内部改変又は変異も起こらなかった。
本実施例において、T細胞エピトープ配列はヒトウイルスタンパク質から選択され、志賀毒素エフェクターポリペプチドに組み込まれ又は挿入された。いくつかのバリアントにおいて、T細胞エピトープは、天然由来のB細胞エピトープを破壊するためにB細胞エピトープ領域に組み込まれ又は挿入された。他のバリアントにおいて、T細胞エピトープは、いかなるB細胞エピトープも含まれることが予測されない領域に組み込まれ、従って、これらの改変がいかなる主なB細胞エピトープも破壊することは予測されない。いくつかの上記のバリアントにおいて、T細胞エピトープは触媒活性を破壊することが予測される領域に組み込まれる。
本実施例において、既知のT細胞エピトープペプチドが、細胞質ゾルに細胞内に届ける固有の能力を有する志賀毒素エフェクター領域に組み込む又は挿入するために選択された。例えば、多くの既知の免疫原性ウイルスタンパク質、並びにヒトインフルエンザAウイルス及びヒトCMVウイルスなどのヒトウイルスのウイルスタンパク質のペプチド成分がある。ヒトMHCクラスI分子と結合及び/又はヒトCTL介在応答を誘発することができる免疫原性ウイルスペプチドが選択された。
C−I結合予測コンセンサスツール及び推奨されるパラメーター(Kim Y et al., AcidsRes40: W252-30 (2012))を用いて、ヒト個体群により多く見られる対立遺伝子にコード
される共通のヒトMHCクラスIヒト白血病抗原(HLA、human leukocyte antigen)
バリアントに結合する能力について、T細胞エピトープ(配列番号4〜10)と予測される7つのペプチドを評価した。IEDB MHC−I結合予測分析は「ANN親和性」を予測した。「ANN親和性」は入力されたペプチドと選択されたヒトHLAバリアント間での推定される結合親和性であり、50ナノモル(nM)未満であるIC50値が高親和性とみなされ、50〜500nMのIC50値が中程度の親和性とみなされ、500〜5000nMのIC50値が低親和性とみなされる。IEDB MHC−I結合予測分析では、最も低いパーセンタイル順位が、最も良いバインダーであることを示した。表1は、選択されたヒトHLAバリアントに結合する、7つの被検T細胞エピトープペプチド(配列番号4〜10)の、IEDB MHC−I結合予測パーセンタイル順位及び予測される結合親和性を示す。
れたことを示す。
プロテアソーム送達に適する固有の細胞内ルーティング特性を有する毒素由来ポリペプチドは、例えば抗毒素抗体の産生などの、脊索動物への投与後の望ましくない免疫応答の可能性を下げるために、脱免疫化のために選択された。毒素及び毒素由来ポリペプチドのアミノ酸配列を分析し、抗原性及び/又は免疫原性B細胞エピトープをコンピューターで
予測した。
初めに、志賀毒素Aサブユニット内のB細胞エピトープ領域を同定した。計算法を利用して、投与後の哺乳類の免疫システムによる応答を誘発する可能性がある志賀毒素Aサブユニット配列中の抗原性及び/又は免疫原性B細胞エピトープを予測した。
賀毒素のAサブユニット内の直鎖状B細胞エピトープを予測した。同時に、BcePredウェ
ブサーバー(Saha S, Raghava G, Lecture Notes in ComputSci3239: 197-204 (2004)
)、Bepipred直鎖状エピトープ予測(Larsen J et al., Immunome Res 2: 2 (2006))、ElliPro抗体エピトープ予測(HasteAndersen P etal., Protein Sci 15: 2558-67 (2006)、Ponomarenko J, Bourne P, BMC StructBiol7: 64 (2007))、及び/又はEpitopiaサーバー(Rubinstein N et al., BMC Bioinformatics 10: 287 (2009))を用いて、志賀毒素のAサブユニットのアミノ酸配列内のB細胞エピトープを予測した。Epitopiaサーバー予測を使って、免疫原性B細胞エピトープを同定し、Epitopiaの免疫原性スケールで多数の残基を含む直鎖状アミノ酸残基の範囲を「高」(4又は5のスコア)とした。様々な計算法によって、3つの典型的な志賀毒素Aサブユニットで、B細胞エピトープ領域についての同様の予測が明らかになった(表2〜4)。
ドの改変のためのポリペプチド源として選択することができる。
ジフテリア毒素は、抗毒素及びリガンド毒素融合分子を設計するために用いられており、ジフテリア由来成分は細胞内在化及び細胞質ゾルルーティングエフェクター機能を提供することができる。計算法を利用して、哺乳類の免疫システムによる応答を誘発する可能性があるジフテリア毒素Aサブユニット中の抗原性及び/又は免疫原性B細胞エピトープを予測した。BcePredウェブサーバー(Saha S, Raghava G, Lecture Notes in Comput Sci 3239: 197-204 (2004))を使って、ジフテリア毒素のAサブユニット(配列番号44)中のB細胞エピトープ領域を予測した。この計算法で、典型的なジフテリア毒素Aサブユニット中に7つの推定されるB細胞エピトープ領域があることが明らかになった(表5)。さらに、米国立アレルギー感染病調査所(NIAID、National Institutes of Allergy and Infectious Diseases of the U.S.)が管理する免疫エピトープデーターベース(IEDB)は、全ての実験で特徴づけられたジフテリア毒素のB細胞及びT細胞エピトープを提供すると言われている。現在、IEDBは、本実施例で使用されるジフテリア毒素Aサブユニット及びジフテリア毒素エフェクターポリペプチド配列番号44に関連するペプチドエピトープに関する少なくとも1つの陽性測定を有する7つのエピトープを提供する(表5、並びに配列番号44の領域182〜201及び225〜238を参照されたい)。
志賀毒素AサブユニットにいかなるCD4+T細胞エピトープが存在するか分析した。T細胞エピトープを、ProImmune社(Sarasota, FL, U.S.)によるREVEAL(商標)免疫原
性システム(IS、immunogenicity System)T細胞アッセイによって、志賀様毒素1の
成熟Aサブユニット(配列番号1)について予測した。このアッセイは、対象タンパク質の複数の重複するペプチド配列を使って、CD8+T細胞が枯渇された健康なドナーの細胞試料のCD4+T細胞による免疫応答の誘発について試験した。以下の天然に配置されるアミノ酸残基群で同定された7つのT細胞エピトープ領域をこのアッセイで使用した:
CD4+T細胞エピトープ領域#1:4〜33、CD4+T細胞エピトープ領域#2:34〜78、CD4+T細胞エピトープ領域#3:77〜103、CD4+T細胞エピトープ領域#4:128〜168、CD4+T細胞エピトープ領域#5:160〜183、CD4+T細胞エピトープ領域#6:236〜258、及びCD4+T細胞エピトープ領域#7:274〜293。
本発明の例示的毒素由来エフェクターポリペプチドは、志賀毒素及びジフテリア毒素を用いて作製した。
志賀毒素エフェクター領域、及び細胞標的化のための免疫グロブリン型結合領域を含む細胞毒性タンパク質をコードする核酸は、当技術分野で既知の技術を用いて産生した。本実施例の元の細胞毒性タンパク質中の志賀毒素エフェクター領域は配列番号1のアミノ酸1〜251を含んでいた。
チドで開始又は終止し、検出及び精製を容易にした。タンパク質は当業者に既知の方法を用いて精製した。
エピトープの配列、改変がある志賀毒素Aサブユニットの天然の位置、及びB細胞エピトープ領域の破壊されたアミノ酸の範囲が列挙されている。
照されたい)。
上記改変と同様に、志賀毒素由来ポリペプチド、T細胞エピトープはプロテアソーム送達エフェクター機能を有するジフテリア毒素由来ポリペプチドに組み込まれ、本発明のT細胞エピトープが組み込まれた、例示的ジフテリア毒素エフェクターポリペプチドが作製された。T細胞エピトープは表1のペプチドから選択され、表5に記載される少なくとも1つの予測されるB細胞エピトープ領域を破壊するために組み込まれた。
本実施例に記載の全ての方法からの全てのB細胞エピトープ領域予測からみて(表2)、いかなるB細胞エピトープも含むことが予測されなかったSLT−1Aの領域を同定した。表1からのT細胞エピトープペプチド配列は、表8に示される本発明の3つの異なる例示的志賀毒素エフェクターポリペプチドを作製するために、天然アミノ酸を置換してB細胞エピトープが欠損していると同定された領域に組み込まれる。表8は、成熟かつ天然SLT−1Aポリペプチド配列の同定された領域及びT細胞エピトープ配列の置換は、志賀毒素エフェクターポリペプチドに構築されたことを示している(配列番号22〜39を参照されたい)。
組み込まれたT細胞エピトープのいずれも、そのプログラムによって予測された6つのエピトープ領域を破壊しなかった。表8の組み込まれたT細胞エピトープ置換配列の1つである、バリアント75−83−F3は、新しいB細胞エピトープの予測をもたらした。領域(66〜74)及び/又は(157〜165)の近くに組み込まれているT細胞エピトープは、SLT−1A触媒活性に必要であると知られている少なくとも1つのアミノ酸(例えば、Y77及びE167)に近接していることより、志賀毒素エフェクター機能である触媒活性を妨げることができる。
志賀毒素Aサブユニットの酵素活性に最も重要な残基としてチロシン77(Y77)及
びグルタミン酸167(E167)を含む(Di, Toxicon 57: 535-39 (2011))。表1の
T細胞エピトープペプチド配列は、志賀毒素エフェクターポリペプチドに組み込まれ、Y77又はE167の一方が志賀毒素酵素活性を減らす又は削除するために変異される。触媒アミノ酸残基を破壊する異種T細胞エピトープを含む、6つの異なる本発明の例示的志賀毒素エフェクターポリペプチドが表9に示される。表9は、成熟かつ天然SLT−1Aポリペプチド配列の組み込まれたT細胞エピトープの位置、組み込まれた置換T細胞エピトープ配列、成熟かつ天然SLT−1Aポリペプチド配列の置換された配列、及び生じた触媒残基の破壊(配列番号23、29、40、41、42、及び43も参照されたい)を示す。
本発明の例示的毒素由来エフェクターポリペプチドを、リボ毒素エフェクター機能の保持について試験した。
1又は2以上のT細胞エピトープを組み込み又は挿入後、元の志賀毒素エフェクターポリペプチドの酵素活性の保持は、リボソーム阻害アッセイを用いて決定した。本実施例において、このアッセイの結果は細胞毒性タンパク質の成分としての各志賀毒素エフェクターポリペプチドでのアッセイの実施を基にした。異なる志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む異なる細胞毒性タンパク質の特異的な細胞毒性は、組織培養細胞に基づく毒性試験を用いて測定した。本発明の例示的細胞毒性、細胞標的化タンパク質の酵素及び細胞毒性活性は、元の志賀毒素エフェクターポリペプチドのみ(細胞標的化結合領域なし)、及び野生型志賀毒素エフェクター領域を含む同じ細胞標的化ドメイン(例えば、細胞外標的生体分子と高親和性で結合することができる免疫グロブリン型結合領域を含む結合領域)を含む「WT」細胞毒性タンパク質と比較した。
訳アッセイを用いて決定した。このキットには、Luciferase T7 Control DNA(L4821 Promega社、Madison、WI、U.S.)及びTNT(登録商標)Quick Master Mixが含まれる。リボソーム活性反応は製造業者の説明書に従って調製した。変異した志賀毒素エフェクターポリペプチド領域又はWT領域の一方を含む、被検タンパク質の10倍希釈系列は適切な緩衝液中で調製し、同一のTNT反応混合物成分系列を各希釈液について作製した。希釈系列中
の各試料は、Luciferase T7 Control DNAと共に各TNT反応混合物と合わせた。被験試料を30℃で1.5時間インキュベートした。インキュベーション後、Luciferase Assay試薬(E1483 Promega社、Madison、WI、U.S.)を全ての被験試料に添加し、ルシフェラーゼタンパク質翻訳量を製造業者の説明書に従って発光により測定した。翻訳阻害のレベルを、相対発光単位に対する総タンパク質の対数変換された濃度の非線形回帰分析により決定した。統計ソフトウェア(GraphPad Prism社、San Diego、CA、U.S.)を用いて、見出し用
量応答阻害の下でlog(阻害剤)対応答(3つのパラメータ)のPrismソフトウェア関
数[Y=最低値+((最高値−最低値)/(1+10^(X−LogIC50)))]を用いて最大半量阻害濃度(IC50)値を各試料について計算した。B細胞エピトープ置換/破壊志賀毒素エフェクターポリペプチド領域を含む脱免疫化タンパク質及び野生型志賀毒素エフェクター領域を含む対照タンパク質それぞれのIC50値を計算した。
計算した。
例示的T細胞エピトープが組み込まれたジフテリア毒素エフェクターポリペプチドの触媒活性を、本明細書で「野生型」又は「WT」と呼ばれる、野生型アミノ酸配列のみを含むジフテリア毒素エフェクターポリペプチドと比較した。T細胞エピトープが組み込まれたジフテリア毒素エフェクターポリペプチドバリアントは共に、リボソームの不活性化活性を保持していた。
キット(L1170 Promega社、Madison、WI、U.S.)を用いた無細胞のインビトロでのタンパク質翻訳アッセイを用いて決定した。初めに、ジフテリア毒素エフェクターポリペプチドを標準的な条件下で、フリン(New England Biolabs社、Ipswich、MA、U.S.)を用いて、インビトロで切断した。そして切断したタンパク質を緩衝液で希釈し、各試料の希釈系列を作製した。各希釈系列は上記のように、Luciferase T7 Control DNAと共にTNT反応混合物と組み合わせ、リボソームの不活性化活性について試験した。
組み込まれた又は挿入されたT細胞エピトープを用いた、志賀毒素エフェクターポリペプチド中のB細胞エピトープ領域の破壊を、野生型アミノ酸配列のみを含む野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドと比較した抗原性及び/又は免疫原性のレベルを調査することによって、脱免疫化について試験した。
脱免疫化を分析するために、志賀毒素エフェクターポリペプチドの抗原性又は免疫原性のレベルを、コンピューター及び野生型志賀毒素エフェクターポリペプチドを認識する予め形成された抗体を用いたウェスタンブロッティングで試験した。
壊について確認した:親水性の初期設定と共に読み出された柔軟性2、接近可能性2、露出面2.4、抗原性傾向1.8、柔軟性1.9、回転1.9、極性2.3、及び結合1.9(Saha S, Raghava G,Lecture Notes in Comput Sci3239: 197-204 (2004))。他の
プログラムによって野生型SLT−1Aサブユニット内で同定された3つの予測された免疫原性エピトープ領域(表2を参照されたい)は、初期設定でのBcePred柔軟性アプロー
チによって予測されず、分析できなかった。
しなかった(表12)。初期設定でのBcePred柔軟性アプローチで予測されなかったいか
なるB細胞エピトープ領域も「同定されなかった」と示され、T細胞エピトープの組み込み又は挿入後の結果は、「該当なし(not applicable)」を意味する「N/A」で示した。
登録商標)(Life Technologies社、Carlsbad、CA、U.S.)システムを用いてポリビニル
ジフルオライド(PVDF、polyvinyl difluoride)膜に転写した。得られた膜は以下の抗体を用いた標準的な条件下でプローブした:Streptag(登録商標)IIとして既知の、ポリペプチドNWSHPQFEKを認識するウサギポリクローナルα−NWSHPQFEK(A00626, Genscrip
t社、Piscataway、NJ、U.S.)、マウスモノクローナルα−Stx(mAb1又は抗SL
T−1A mAb1)(BEI NR-867 BEI Resources社、Manassas、VA、U.S.:志賀毒素及び志賀様毒素1Aサブユニットと交差反応性を有する)、ウサギポリクローナル抗体α−SLT−1A(pAb1又は抗SLT−1A pAb1)(Harlan Laboratories社、Indianapolis、IN、U.S.、SLT−1Aアミノ酸1〜251に対する注文によって産生され
た抗体)、及びペプチドRGIDPEEGRFNN及びHGQDSVRVGRに対するウサギポリクローナル抗体α−SLT−1A(pAb2又は抗SLT−1A pAb2)(Genscript社、Piscataway、NJ、U.S.、注文によって産生された抗体)。ペプチド配列RGIDPEEGRFNNはSLT−1
A及びStxAのアミノ酸55〜66に位置して予測されたB細胞エピトープにわたり、ペプチド配列HGQDSVRVGRはSLT−1A及びStxAの214〜223に位置して予測されたB細胞エピトープにわたる。
ウスHRP、ThermoScientific社、Rockford、IL、U.S.)を用いた。図3〜4は、ゲル
及び/又は膜のレーンに番号が付けられたウェスタンブロットの画像と、同じそれぞれの番号についての図の説明が示され、志賀毒素エフェクターポリペプチドは各レーンにロードされた細胞毒性タンパク質試料の成分だった。各ゲルに対し、クマシー染色及び/又は抗streptag IIウェスタンブロットシグナルは総細胞毒性タンパク質ロード対照とする。
全ての改変された志賀毒素エフェクターポリペプチドは、野生型SLT−1Aを認識することができる1又は2以上の抗体による認識が減少又は破壊され、抗原性が減少し、脱免疫化が成功したことを示している。図3及び4に示されるウェスタンブロット分析の結果は表13で要約する。
CD4+T細胞エピトープ領域で予測される破壊を、体外から投与されたポリペプチドの存在下でのヒトCD4+T細胞増殖アッセイ、及び投与されたポリペプチドで処理されたヒト単球存在下でのヒトCD4+樹状T細胞刺激アッセイを用いて、CD4+T細胞免疫原性の減少について試験する。
本発明の例示的全長ポリペプチドの相対CD4+T細胞免疫原性を以下の樹状細胞(DC、dendriticcell)T細胞増殖アッセイを用いて決定する。このDC T細胞アッセイ
は、体外から投与されたポリペプチド又はタンパク質に応答するCD4+T細胞を測定する。DC T細胞アッセイはProImmune社のDC T細胞アッセイサービスを用いて行い
、ポリペプチド、タンパク質、及び本発明の細胞標的化分子間のCD4+T細胞誘導免疫原性の相対レベルを、いかなる異種T細胞エピトープも付加されていない出発原料である元のポリペプチド、タンパク質、又は細胞標的化分子と比較することによって決定する。本実施例のDC T細胞アッセイは、投与されたポリペプチド、タンパク質、又は細胞標的化分子試料に由来するペプチドの抗原提示についてヒト樹状細胞を試験することを含む。
HCクラスII組織分類を基に分類される試料を単離する。20、40又は50名のドナーのコホートを使用する。最初に、ヒトドナーPBMCから得られた単球を規定の培地で培養し、未成熟樹状細胞を生成する。そして、未成熟樹状細胞を特定の対照抗原で刺激し、規定の培地でさらに培養することによって成熟表現型を誘導する。次に、同じヒトドナー試料のCD8+T細胞を枯渇させたドナーのPBMCをCFSEで標識する。CFSEで標識された、CD8+T細胞を枯渇させたPBMCを、抗原に感作された樹状細胞と共に7日間培養し、CD4+樹状細胞を刺激し、各試料の8つの複製を試験する。陰性対象として、各樹状細胞培養系列には、未処理樹状細胞のセットを含む。陽性対照として、このアッセイには、全長タンパク質を含む2つの特定の参照抗原が組み込まれている。
合を考慮して決定する。応答項目を、各試料のCD4+T細胞免疫原性レベルを決定するため、応答強度の値に応答するドナーの数を乗じて計算する。さらに、相対CD4+T細胞免疫原性を表す応答項目を、予測されたCD4+T細胞エピトープ領域に組み込まれたCD8+T細胞エピトープを含む2つの試料、及び同じ予測されたCD4+T細胞領域でいかなる破壊もない、第2のバリアントの結果を比較することによって、破壊がヒトドナー細胞のCD4+T細胞応答を減少するかを決定する。
志賀毒素エフェクターポリペプチドの相対免疫原性レベルを、ヒト免疫システムの哺乳類モデルを用いて、脱免疫化について試験する。マウスに細胞毒性タンパク質、又は野生型若しくは脱免疫化型の志賀毒素エフェクターポリペプチド成分を含むポリペプチドを週に3回、2週間以上静脈内投与する。注射されたマウスから血液試料を回収し、細胞毒性タンパク質及び/又は志賀毒素エフェクターポリペプチドの反応性について酵素結合免疫吸着検査法(ELISA、enzyme-linked immunosorbent assay)で試験した。減少した
免疫原性応答が、野生型志賀毒素エフェクターポリペプチド又はそのポリペプチドを含む組成物のみを注射したマウスと比較して、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチド又はそのポリペプチドを含む組成物を注射したマウスで誘発され得る。比較的減少した免疫原性応答は、哺乳類に投与後の減少した免疫原性の可能性及び哺乳類の免疫システムの応答に関し、脱免疫化志賀毒素エフェクターポリペプチドは脱免疫化されることを示し得る。
本実施例において、標的細胞の表面への提示のための、標的細胞のMHCクラスI経路のT細胞エピトープの送達のための、本発明の例示的志賀毒素エフェクターポリペプチドをそれぞれ含む、本発明の例示的細胞標的化タンパク質の能力を調査した。さらに、本発明のジフテリア毒素エフェクターポリペプチドを含む細胞標的化タンパク質(例えば、配列番号46〜48)を、本実施例の方法を用いて、MHCクラスI提示系への組み込まれたT細胞エピトープを送達する能力を検証するために試験した。
torBioscience社、Miramar、FL、U.S.)を利用する。
れらのTCR多量体試薬は、各可溶性TCR多量体タイプは多様な条件下で特異的なペプチドとMHCとの複合体を認識し安定して結合するので、ヒト細胞の表面に提示される特異的なペプチドとMHCクラスIとの複合体を検出することができる(Zhu X et al., J Immunol 176: 3223-32 (2006))。これらのTCR多量体試薬は細胞の表面に存在するペ
プチドとMHCクラスIとの複合体の、フローサイトメトリーによる同定及び定量を可能にする。
胞によるCMV C2ペプチド(NLVPMVATV)のMHCクラスI経路提示は、TCR C
MV−pp65−PE STAR(商標)多量体試薬で検出することができ、ヒトHLA−A2と複合体を形成するCMV−pp65エピトープペプチド(残基495〜503、NLVPMVATV)を高親和性で認識し、PEで標識する。
ん細胞で不死化した。当技術分野で既知の標準フローサイトメトリー法を使用して、HLA−A2 MHCクラスI分子及び本実施例において用いられる細胞外標的生体分子のタンパク質の両方が細胞表面で発現されるか標的細胞を確かめた。
した細胞は、37℃で5%二酸化炭素の雰囲気下での標準的な条件で6時間インキュベートし、志賀毒素エフェクター領域の媒介による中毒化を引き起こした。そして細胞を細胞培養液で洗浄し、新しい細胞培養液に再懸濁し、TCR CMV−pp65−PE STAR(商標)多量体試薬での染色前に20時間インキュベートした。
C2ペプチド(CMV−pp65、アミノ酸495〜503:配列NLVPMVATV、BioSynthesis社、Lewisville、TX、U.S.によって合成された)で処理、及び3)体外から投与さ
れたPeptide Loading Enhancer(「PLE」、 Altor Biosicence社、Miramar、FL)と組み合わせたCMV C2ペプチド(上記のNLVPMVATV)で処理。PLEと組み合わせたC
2ペプチド処理は、外因性ペプチドローディングを可能にし、陽性対照とした。適切なMHCクラスIハプロタイプを提示する細胞は、細胞外空間(すなわち、適用されるペプチドの細胞内在化の非存在下)から又はPLEの存在下での適切な細胞外からの適用されるペプチドのロードを強制的に行うことができ、B2−ミクログロブリン及び他の成分との混合物である。
メトリーによって測定し、集団中の細胞に結合したTCR CMV−pp65−PE STAR(商標)多量体の存在を検出し、定量した(ときどき本明細書において「染色(staining)」と呼ばれる)。
れぞれ0.96及び0.95パーセント)。測定されなかった処理効率及び動態によって、「細胞標的化タンパク質」処理試料中の一点で検出されたC2ペプチドとHLA−A2との複合体の存在割合は、これらの本発明の例示的細胞標的化タンパク質によって、正確に最大提示可能性に影響を与えない可能性がある。
、PLEの存在下では、「C2ペプチドのみ」と比較すると、未処理対照と同様のバックグラウンド染色レベル(0.95%)であった。
本実施例において、当技術分野で既知の標準アッセイを用いて、本発明の例示的細胞標的化タンパク質によって送達されたT細胞エピトープのMHCクラスI提示による機能結果を調査する。調査する機能結果には、CTL活性化、CTL介在標的細胞殺滅、及びCTLによるCTLサイトカイン放出が含まれる。
ンビボでの調査を行う。
クターポリペプチド、並びにCD20に特異的な結合領域を含む細胞毒性タンパク質(SLT−1Aと融合したαCD20)
本実施例において、T細胞が高度免疫化された及びB細胞/CD4+T細胞が脱免疫化された志賀毒素エフェクター領域は、上記のように、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来する。免疫グロブリン型結合領域αCD20抗原は、ヒトCD20を認識する免疫グロブリン型ドメインに由来し(例えば、Haisma et al.,Blood 92: 184-90
(1999)、Geng S et al., Cell Mol Immunol 3: 439-43 (2006)、Olafesn T et al.,Protein Eng Des Sel 23:243-9 (2010)を参照されたい)、CD20の細胞外部分に結合する
ことができる免疫グロブリン型結合領域を含む。CD20は、例えば、B細胞リンパ腫細胞、有毛細胞白血病細胞、B細胞慢性リンパ球性白血病細胞、及びメラノーマ細胞などの複数のがん細胞型で発現する。さらに、CD20はいくつかの自己免疫疾患、障害、及び過活動B細胞を含む状態を治療するための治療学への魅力的な標的である。
免疫グロブリン型結合領域αCD20及び志賀毒素エフェクター領域(例えば、配列番号11〜43など)を共に連結した。例えば、融合タンパク質は、αCD20抗原結合タンパク質SLT−1A::αCD20をコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される(例えば、配列番号49、50、及び51を参照されたい)。細胞毒性タンパク質SLT−1A::αCD20の発現を、前記の実施例において上記のように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
CD20+細胞及びCD20−細胞に対する、本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性、最大特異的結合(Bmax)及び平衡結合定数(KD)は、蛍光に基づくフローサイトメトリーにより決定する。CD20+細胞へのSLT−1A::αCD20のBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはCD20−細胞への有意な結合はない。
SLT−1A::αCD20の細胞毒性特性を、CD20+細胞を用いて前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、SLT−1A::αCD20の選択的細胞毒性特性を、CD20+細胞と比較してCD20−細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞株に応じて、CD20+細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞表面上にCD20を発現する細胞と比較して細胞表面上にCD20を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。さらに、SLT−1A::αCD20の細胞毒性を、T細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性タンパク質SLT−1A::αCD
20のインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にCD20を発現するヒト新生物細胞のマウスへの注射から得られるマウスにおける異種移植腫瘍に対する静脈内投与後の細胞毒性タンパク質の効果を試験する。細胞殺滅をT細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
本実施例において、CD8+T細胞が高度免疫化された及びB細胞/CD4+T細胞が脱免疫化された志賀毒素エフェクター領域は、上記のように、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来する。免疫グロブリン型結合領域は、米国特許出願第2011/0059090号に記載される、ラクダ抗体の単ドメイン可変領域(VHH)であるタンパク質5F7に由来するαHER2 VHHである。
免疫グロブリン型結合領域及び志賀毒素エフェクター領域(例えば、配列番号11〜43など)は共に連結して、融合タンパク質を形成した(例えば、配列番号52、53、及び54を参照されたい)。本実施例において、タンパク質5F7に由来するαHER2−VHH可変領域をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で既知のリンカーをコードするポリヌクレオチドを有するフレーム、及び配列番号11〜43のアミノ酸を含む志賀毒素エフェクター領域をコードするポリヌクレオチドを有するフレームにクローニングすることができる。細胞毒性タンパク質「SLT−1Aと融合したαHER2−VHH」のバリアントは、結合領域を志賀毒素エフェクター領域のアミノ末端の隣に配置していてもよく、カルボキシ末端にKDELファミリーの小胞体シグナルモチーフを含んでいてもよいように作製した。細胞毒性タンパク質バリアント「SLT−1Aと融合したαHER2−VHH」の発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
HER2+細胞及びHER2−細胞に対する、本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性は、蛍光に基づくフローサイトメトリーにより決定する。HER2+細胞への「SLT−1Aと融合したαHER2−VHH」のBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはHER2−細胞への有意な結合はない。
「SLT−1Aと融合したαHER2−VHH」バリアントの細胞毒性特性を、HER2+細胞を用いて前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、「SLT−1Aと融合したαHER2−VHH」の選択的細胞毒性特
性を、HER2+細胞と比較してHER2−細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞株に応じて、HER2+細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞表面上にHER2を発現する細胞と比較して細胞表面上にHER2を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。さらに、「SLT−1Aと融合したαHER2−VHH」の細胞毒性を、T細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性タンパク質SLT−1Aと融合したαHER2−VHHのインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にHER2を発現するヒト新生物細胞のマウスへの注射から得られるマウスにおける異種移植腫瘍に対する静脈内投与後の細胞毒性タンパク質の効果を試験する。細胞殺滅をT細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
本実施例において、CD8+T細胞が高度免疫化された及びB細胞/CD4+T細胞が脱免疫化された志賀毒素エフェクター領域は、上記のように、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来する。免疫グロブリン型結合領域αエプスタイン・バー抗原は、エプスタイン・バー抗原に対するモノクローナル抗体(Fang C et al., J Immunol Methods 287: 21-30 (2004))に由来し、エプスタイン・バーウイルスに感染したヒト細胞又はエプスタイン・バー抗原を発現する形質転換細胞に結合することができる免疫グロブリン型結合領域を含む。エプスタイン・バー抗原は、エプスタイン・バーウイルスに感染した細胞やがん細胞(例えば、リンパ腫及び上咽頭がん細胞)などの複数の細胞型で発現する。さらに、エプスタイン・バー感染は、他の疾患、例えば、多発性硬化症を伴う。
免疫グロブリン型結合領域αエプスタイン・バー抗原及び志賀毒素エフェクター領域を共に連結し、カルボキシ末端にKDELを付加し、タンパク質を形成する。例えば、融合タンパク質は、αエプスタイン・バー抗原結合タンパク質SLT−1A::αエプスタイン・バー::KDELをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性タンパク質SLT−1A::αエプスタイン・バー::KDELの発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
エプスタイン・バー抗原陽性細胞及びエプスタイン・バー抗原陰性細胞に対する、本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性は、蛍光に基づくフローサイトメトリーにより決定する。エプスタイン・バー抗原陽性細胞へのSLT−1A::αエプスタイン・バー::KDELのBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはエプスタイン・バー抗原陰性細胞への有意な結合はない。
SLT−1A::αエプスタイン・バー::KDELの細胞毒性特性を、エプスタイン・バー抗原陽性細胞を用いて、前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、SLT−1A::αエプスタイン・バー::KDELの選択的細胞毒性特性を、エプスタイン・バー抗原陽性細胞と比較してエプスタイン・バー抗原陰性細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞株に応じて、エプスタイン・バー抗原陽性細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞表面上にエプスタイン・バー抗原を発現する細胞と比較して細胞表面上にエプスタイン・バー抗原を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。さらに、SLT−1A::αエプスタイン・バー::KDELの細胞毒性を、T細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性タンパク質SLT−1A::αエプスタイン・バー::KDELのインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にエプスタイン・バー抗原を発現するヒト新生物細胞のマウスへの注射から得られるマウスにおける異種移植腫瘍に対する静脈内投与後の細胞毒性タンパク質の効果を試験する。細胞殺滅をT細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
本実施例において、志賀毒素エフェクター領域は、上記のように、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来する、CD8+T細胞が高度免疫化された及びB細胞/CD4+T細胞が脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドである。免疫グロブリン型結合領域αリーシュマニア抗原は、当技術分野で既知の技術を用いて生成された、細胞内トリパノソーマ原虫を保有するヒト細胞に存在する細胞表面のリーシュマニア抗原への抗体に由来する(Silveira T et al., Int J Parasitol31:1451-8 (2001)、Kenner J et al., J CutanPathol26: 130-6 (1999)、BermanJ and Dwyer, Clin Exp Immunol 44: 342-348 (1981)を参照されたい)。
免疫グロブリン型結合領域αリーシュマニア抗原及び志賀毒素エフェクター領域を共に連結し、カルボキシ末端にKDELを付加し、タンパク質を形成する。例えば、融合タンパク質は、リーシュマニア抗原結合タンパク質SLT−1A::αリーシュマニア::KDELをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性タンパク質SLT−1A::αリーシュマニア::KDELの発現を、前記の実施例におい
て記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
リーシュマニア抗原陽性細胞及びリーシュマニア抗原陰性細胞に対する、本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性は、蛍光に基づくフローサイトメトリーにより決定する。リーシュマニア抗原陽性細胞へのSLT−1A::αリーシュマニア::KDELのBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはリーシュマニア抗原陰性細胞への有意な結合はない。
SLT−1A::αリーシュマニア::KDELの細胞毒性特性を、リーシュマニア抗原陽性細胞を用いて前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、SLT−1A::αリーシュマニア::KDELの選択的細胞毒性特性を、リーシュマニア抗原陽性細胞と比較してリーシュマニア抗原陰性細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞株に応じて、リーシュマニア抗原陽性細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞表面上にリーシュマニア抗原を発現する細胞と比較して細胞表面上にリーシュマニア抗原を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。さらに、SLT−1A::αリーシュマニア::KDELの細胞毒性を、T細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
本実施例において、志賀毒素エフェクター領域は、上記のように、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来する、CD8+T細胞が高度免疫化された及びB細胞/CD4+T細胞が脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドである。免疫グロブリン型結合領域αニューロテンシン受容体は、DARPin(商標)(GenBank受託番号:2
P2C_R)又はヒトニューロテンシン受容体と結合するモノクローナル抗体(Ovigne Jet al., Neuropeptides 32: 247-56 (1998))に由来する。ニューロテンシン受容体は、
乳がん、結腸がん、肺がん、メラノーマ、及び膵臓がん細胞など様々ながん細胞で発現する。
免疫グロブリン型結合領域αニューロテンシンR及び志賀毒素エフェクター領域を共に連結した、カルボキシ末端にKDELを付加し、タンパク質を形成する。例えば、融合タンパク質は、ニューロテンシン受容体結合タンパク質SLT−1A::αニューロテンシンR::KDELをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。
細胞毒性タンパク質SLT−1A::αニューロテンシンR::KDELの発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成した。
ニューロテンシン受容体陽性細胞及びニューロテンシン受容体陰性細胞に対する、本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性は、蛍光に基づくフローサイトメトリーにより決定する。ニューロテンシン受容体陽性細胞へのSLT−1A::αニューロテンシンR::KDELのBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはニューロテンシン受容体陰性細胞への有意な結合はない。
SLT−1A::αニューロテンシンR::KDELの細胞毒性特性を、ニューロテンシン受容体陽性細胞を用いて、前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、SLT−1A::αニューロテンシンR::KDELの選択的細胞毒性特性を、ニューロテンシン受容体陽性細胞と比較してニューロテンシン受容体陰性細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞株に応じて、ニューロテンシン受容体陽性細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞表面上にニューロテンシン受容体を発現する細胞と比較して細胞表面上にニューロテンシン受容体を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。さらに、SLT−1A::αニューロテンシンR::KDELの細胞毒性を、T細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性タンパク質SLT−1A::αニューロテンシンR::KDELのインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にニューロテンシン受容体を発現するヒト新生物細胞のマウスへの注射から得られるマウスにおける異種移植腫瘍に対する静脈内投与後の細胞毒性タンパク質の効果を試験する。細胞殺滅をT細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
本実施例において、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来する、CD8+T細胞が高度免疫化された及びB細胞/CD4+T細胞が脱免疫化された志賀毒素エフェクター領域である。結合領域αEGFRは、AdNectin
(商標)(GenBank受託番号:3QWQ_B)、Affibody(商標)(GenBank受託番号:2KZI_A;米国特許第8,598,113号明細書)、又は、その全てが1又は2以上のヒト上皮増殖因子受容体に結合する抗体に由来する。上皮増殖因子受容体の発現は、例えば、肺がん細胞、乳がん細胞、及び結腸がん細胞などのヒトがん細胞と関連がある。
免疫グロブリン型結合領域αEGFR及び志賀毒素エフェクター領域を共に連結し、カルボキシ末端にKDELを付加し、タンパク質を形成する。例えば、融合タンパク質は、EGFR結合タンパク質SLT−1A::αEGFR::KDELをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性タンパク質SLT−1A::αEGFR::KDELの発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
EGFR+細胞及びEGFR−細胞に対する、本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性は、蛍光に基づくフローサイトメトリーにより決定する。EGFR+細胞へのSLT−1A::αEGFR::KDELのBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはEGFR−細胞への有意な結合はない。
SLT−1A::αEGFR::KDELの細胞毒性特性を、EGFR+細胞を用いて、前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、SLT−1A::αEGFR::KDELの選択的細胞毒性特性を、リーシュマニア抗原陽性細胞と比較してEGFR−細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞株に応じて、EGFR+細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞表面上にEGFRを発現する細胞と比較して細胞表面上にEGFRを発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。さらに、SLT−1A::αEGFR::KDELの細胞毒性を、T細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性タンパク質SLT−1A::αEGFR::KDELのインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にEGFRを発現するヒト新生物細胞のマウスへの注射から得られるマウスにおける異種移植腫瘍に対する静脈内投与後の細胞毒性タンパク質の効果を試験する。細胞殺滅をT細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
本実施例において、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来する、CD8+T細胞が高度免疫化された及びB細胞/CD4+T細胞が脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドである。免疫グロブリン型結合領域αCCR5は、ヒトCCR5(CD195)に対するモノクローナル抗体(Bernstone L etal., Hybridoma 31: 7-19 (2012))に由来する。CCR5は主に、T細胞、マクロ
ファージ、樹状細胞、及びミクログリアで発現する。さらに、CCR5はヒト免疫不全ウイルス(HIV、humanimmunodeficiency virus)の発症及び蔓延に影響を与える。
免疫グロブリン型結合領域αCCR5及び志賀毒素エフェクター領域を共に連結し、カルボキシ末端にKDELを付加し、タンパク質を形成する。例えば、融合タンパク質は、αCCR5結合タンパク質SLT−1A::αCCR5::KDELをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性タンパク質SLT−1A::αCCR5::KDELの発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
CCR5+細胞及びCCR5−細胞に対する、本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性は、蛍光に基づくフローサイトメトリーにより決定する。CCR5+陽性細胞へのSLT−1A::αCCR5::KDELのBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはCCR5−細胞への有意な結合はない。
SLT−1A::αCCR5::KDELの細胞毒性特性を、CCR5+細胞を用いて前記の実施例において上記ように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、SLT−1A::αCCR5::KDELの選択的細胞毒性特性を、CCR5+細胞と比較してCCR5−細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞株に応じて、CCR5+細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞表面上にCCR5を発現する細胞と比較して細胞表面上にCCR5を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。さらに、SLT−1A::αCCR5::KDELの細胞毒性を、T細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
動物モデルを用いて、ドナー材料のT細胞を枯渇し(Tsirigotis P et al., Immunotherapy 4: 407-24 (2012)を参照されたい)、細胞毒性タンパク質SLT−1A::αCC
R5::KDELのインビボでの効果を決定する。非ヒト霊長類を用いて、SLT−1A
::αCCR5のインビボでの効果を決定する。ドナー臓器をSLT−1A::αCCR5::KDELで前処理したとき(Weaver T et al., Nat Med 15: 746-9 (2009)を参照
されたい)、腎臓移植後のアカゲザルの移植片対宿主病について分析する。異なる用量のSLT−1A::αCCR5::KDELの非経口投与後、霊長類カニクイザルの末梢血Tリンパ球のインビボでの枯渇を観察する。細胞殺滅をT細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。SLT−1A::αCCR5::KDELを使用したHIV感染の阻害は、サル免疫不全ウイルス(SIV、simian immunodeficiency virus)にさらされたときに循環す
るT細胞を大きく枯渇させるために、非ヒト霊長類に急性用量のSLT−1A::αCCR5::KDELを与えることによって試験する(Sellier P et al., PLoS One 5: e10570(2010)を参照されたい)。
本実施例において、志賀毒素エフェクター領域は、志賀毒素のAサブユニット(StxA)に由来する、CD8+T細胞が高度免疫化された及びB細胞/CD4+T細胞が脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドである。免疫グロブリン型結合領域αEnvは、GP41、GP120、GP140、又はGP160(例えば、Chen W et al., JMol Bio 382: 779-89 (2008)、Chen W et al., Expert Opin Biol Ther 13: 657-71 (2013)、van denKerkhof T et al., Retrovirology 10: 102 (2013)を参照されたい)など
のHIVエンベロープ糖タンパク質(Env)に結合する既存の抗体、又は標準的な技術を用いて生成された抗体(Prabakaran et al., Front Microbiol3:277 (2012)を参照さ
れたい)に由来する。EnvはHIV複製中のHIV感染細胞の細胞表面に提示される、HIV表面タンパク質である。Envは、主に感染細胞のエンドソーム区画に発現するが、本発明の強力な細胞毒性を有する細胞標的化タンパク質によって、十分な量のEnvが標的とされる細胞表面に存在させることができる。さらに、Env標的細胞毒性タンパク質は、HIVビリオンと結合でき、ビリオンと宿主細胞が融合する間に、感染細胞に新たに進入することができる。
的束縛部分に結合する免疫グロブリンドメインを使用することが好ましい。感染細胞の表面に存在するEnvは立体的に制限されたエピトープを提示するとされているので(ChenW et al., J Virol 88: 1125-39 (2014))、sdAb又はVHHドメインなどの100
kDより小さい、理想的には25kDより小さいものを使用することが好ましい。
免疫グロブリン型結合領域αEnv及び志賀毒素エフェクター領域を共に連結し、カルボキシ末端にKDELを付加し、細胞毒性タンパク質を形成する。例えば、融合タンパク質は、αEnv結合タンパク質SLT−1A::αEnv::KDELをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性タンパク質SLT−1A::αEnv::KDELの発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
Env+細胞及びEnv−細胞に対する、本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性は、蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。Env+陽性細胞へのSLT−1A::αEnv::KDELのBmaxは約50,000〜200,000MF
I、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはEnv−細胞への有意な結合はない。
SLT−1A::αEnv::KDELの細胞毒性特性を、Env+細胞を用いて前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、SLT−1A::αEnv::KDELの選択的細胞毒性特性を、Env+細胞と比較してEnv−細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞株及び/又は細胞に感染して、細胞をEnv+にするのに使用されるHIV株に応じて、Env+細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞表面上にEnvを発現する細胞と比較して細胞表面上にEnvを発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。さらに、SLT−1A::αEnv::KDELの細胞毒性を、T細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
SLT−1A::αEnv::KDELを使用したHIV感染の阻害は、サル免疫不全ウイルス(SIV)に感染した非ヒト霊長類(Sellier P et al., PLoS One 5: e10570(2010)を参照されたい)に、SLT−1A::αEnv::KDELを投与することによ
って試験する。細胞殺滅をT細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
本実施例において、志賀毒素エフェクター領域は、志賀様毒素1のAサブユニット(SLT−1A)に由来する、CD8+T細胞が高度免疫化された及びB細胞/CD4+T細胞が脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドである。免疫グロブリン型結合領域αUL18は、当技術分野で既知の技術を用いて、細胞表面サイトメガロウイルスタンパク質UL18に生成され、サイトメガロウイルスに感染したヒト細胞に存在する(YangZ, Bjorkman P,Proc Natl Acad Sci USA 105: 10095-100(2008))。ヒトサイトメガロウイルス感染は、様々ながん及び炎症性障害を伴う。
免疫グロブリン型結合領域αUL18及び志賀毒素エフェクター領域を共に連結し、カルボキシ末端にKDELを付加し、タンパク質を形成する。例えば、融合タンパク質は、αUL18結合タンパク質SLT−1A::αUL18::KDELをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって産生される。細胞毒性タンパク質SLT−1A::αUL18::KDELの発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成する。
サイトメガロウイルスUL18陽性細胞及びサイトメガロウイルスUL18陰性細胞に対する、本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性は、蛍光に基づくフローサイトメトリーにより決定する。サイトメガロウイルスタンパク質UL18陽性細胞へのSLT−1A::αUL18::KDELのBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはサイトメガロウイルスタンパク質UL18陰性細胞への有意な結合はない。
SLT−1A::αUL18::KDELの細胞毒性特性を、サイトメガロウイルスタンパク質UL18陽性細胞を用いて、前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、SLT−1A::αUL18::KDELの選択的細胞毒性特性を、サイトメガロウイルスタンパク質UL18陽性細胞と比較してサイトメガロウイルスタンパク質UL18陰性細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞株に応じて、サイトメガロウイルスタンパク質UL18陽性細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞表面上にサイトメガロウイルスタンパク質UL18を発現する細胞と比較して細胞表面上にサイトメガロウイルスタンパク質UL18を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。さらに、SLT−1A::αUL18::KDELの細胞毒性を、T細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
本実施例において、CD8+T細胞が高度免疫化された及びB細胞/CD4+T細胞が脱免疫化されたジフテリア毒素エフェクター領域は、上記のように、ジフテリア毒素1のAサブユニットに由来する。免疫グロブリン型結合領域αCD20抗原は、ヒトCD20を認識する免疫グロブリン型ドメインに由来し(例えば、Haisma et al.,Blood 92: 184-90 (1999)、Geng S et al., Cell Mol Immunol 3:439-43 (2006)、Olafesn T et al.,Protein EngDes Sel 23:243-9 (2010)を参照されたい)、CD20の細胞外部分に結合す
ることができる免疫グロブリン型結合領域を含む。CD20は、例えば、B細胞リンパ腫細胞、有毛細胞白血病細胞、B細胞慢性リンパ球性白血病細胞、及びメラノーマ細胞などの複数のがん細胞型で発現する。さらに、CD20はいくつかの自己免疫疾患、障害、及び過活動B細胞を含む状態を治療するための治療学への魅力的な標的である。
免疫グロブリン型結合領域αCD20及びジフテリア毒素エフェクター領域(例えば、配列番号46、47、及び48など)を共に連結した。例えば、融合タンパク質は、αCD20抗原結合タンパク質ジフテリア毒素::αCD20をコードするポリヌクレオチド
を発現させることによって産生される(例えば、配列番号55、56、及び57を参照されたい)。細胞毒性タンパク質SLTジフテリア毒素::αCD20の発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成した。
CD20+細胞及びCD20−細胞に対する、本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性は、前記の特許に記載のように、蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。CD20+細胞へのジフテリア毒素::αCD20のBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはCD20−細胞への有意な結合はない。
ジフテリア毒素::αCD20の細胞毒性特性を、CD20+細胞を用いて前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、ジフテリア毒素::αCD20の選択的細胞毒性特性を、CD20+細胞と比較してCD20−細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞株に応じて、CD20+細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞表面上にCD20を発現する細胞と比較して細胞表面上にCD20を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。さらに、ジフテリア毒素::αCD20の細胞毒性を、T細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性タンパク質ジフテリア毒素::αCD20のインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にCD20を発現するヒト新生物細胞のマウスへの注射から得られるマウスにおける異種移植腫瘍に対する静脈内投与後の細胞毒性タンパク質の効果を試験する。細胞殺滅をT細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
本実施例において、CD8+T細胞が高度免疫化された及びB細胞/CD4+T細胞が脱免疫化されたジフテリア毒素エフェクター領域は、上記のように、ジフテリア毒素のAサブユニットに由来する。免疫グロブリン型結合領域は、米国特許出願第2011/0059090号に記載されるように、ラクダ抗体の単ドメイン可変領域(VHH)であるタンパク質に由来するαHER2 VHHである。
免疫グロブリン型結合領域及びジフテリア毒素エフェクター領域を共に連結し、融合タンパク質を形成した(例えば、配列番号58、59、60など)。本実施例において、タンパク質5F7に由来するαHER2−VHH可変領域をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で既知のリンカーをコードするポリヌクレオチドを有するフレーム、及び配列番号46、47、又は48のアミノ酸を含むジフテリア毒素エフェクター領域をコードするポリヌクレオチドを有するフレームにクローニングすることができる。細胞毒性タンパク質「ジフテリア毒素と融合したαHER2−VHH」のバリアントは、結合領域をジフテリア毒素エフェクター領域のアミノ末端の隣に位置していてもよく、カルボキシ末端にKDELファミリーの小胞体シグナルモチーフを含んでいてもよいように作製した。細胞毒性タンパク質「ジフテリア毒素と融合したαHER2−VHH」の発現を、前記の実施例において記載したように、細菌及び/又は無細胞のいずれかのタンパク質翻訳系を用いて達成した。
HER2+細胞及びHER2−細胞に対する、本実施例の細胞毒性タンパク質の結合特性は、前記の特許に記載のように、蛍光に基づくフローサイトメトリーアッセイにより決定する。HER2+細胞への「ジフテリア毒素と融合したαHER2−VHH」のBmaxは約50,000〜200,000MFI、KDは0.01〜100nMである一方、このアッセイにおいてはHER2−細胞への有意な結合はない。
「ジフテリア毒素と融合したαHER2−VHH」の細胞毒性特性を、HER2+細胞を用いて前記の実施例において上記のように、一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。さらに、「ジフテリア毒素と融合したαHER2−VHH」の選択的細胞毒性特性を、HER2+細胞と比較してHER2−細胞を用いる同じ一般的な細胞殺滅アッセイにより決定する。本実施例の細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞株に応じて、HER2+細胞について約0.01〜100nMである。細胞毒性タンパク質のCD50は、細胞表面上にHER2を発現する細胞と比較して細胞表面上にHER2を発現しない細胞について約10〜10,000倍高い(細胞毒性が低い)。さらに、「ジフテリア毒素と融合したαHER2−VHH」の細胞毒性を、T細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
動物モデルを用いて、新生物細胞に対する細胞毒性タンパク質「ジフテリア毒素と融合したαHER2−VHH」のインビボでの効果を決定する。様々なマウス株を用いて、細胞表面上にHER2を発現するヒト新生物細胞のマウスへの注射から得られるマウスにおける異種移植腫瘍に対する静脈内投与後の細胞毒性タンパク質の効果を試験する。細胞殺滅をT細胞エピトープの送達による直接細胞毒性及び間接細胞毒性の両方、並びにCTL介在細胞毒性を導く提示について調査する。
本実施例において、志賀毒素エフェクター領域は、1又は2以上の組み込まれた又は挿入されたT細胞エピトープを介して、1又は2以上の上記B細胞エピトープ領域が破壊された、志賀様毒素1、志賀毒素、及び/又は志賀様毒素2のAサブユニット(SLT−1A、StxA、SLT−2A)に由来する、T細胞が高度免疫化された及び/又はB細胞/CD4+T細胞が脱免疫化された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む。結合領域は表15の第1列から選択される分子の免疫グロブリンドメインに由来し、表15の第2列に示される細胞外標的生体分子と結合する。本実施例の例示的細胞毒性タンパク質は、カルボキシ末端にKDEL型シグナルモチーフを有し及び/又は当技術分野で既知の試薬及び技術を用いて作製していてもよい。本実施例の例示的細胞毒性タンパク質は、前記の実施例において記載したように、適切な細胞外標的生体分子を発現する細胞を用いて試験される。本実施例の例示的タンパク質は、例えば、表15の第3列に示される疾患、状態、及び/又は障害を診断及び治療するために用いることができる。
物学的配列情報の完全な開示は、その全体が参照により組み込まれる。
Claims (13)
- 配列番号1のアミノ酸1〜251に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドであって、
前記アミノ酸配列が、少なくとも4つの内因性B細胞エピトープ領域を含み、かつ
配列番号1のアミノ酸残基の位置53〜61に組み込まれ、かつV54I、R55L、I57F、P59F、E60T及びE61Lに変異した残基を有する、異種CD8+T細胞エピトープ
をさらに含み、
前記内因性B細胞エピトープ領域は、野生型志賀毒素Aサブユニットにおいて配列番号1の39〜48;配列番号1の94〜115、配列番号1の179〜190;及び配列番号1の243〜251のアミノ酸残基内に天然に配置され、かつ
前記アミノ酸配列は、配列番号1の75位に対応するアミノ酸残基にアスパラギン、配列番号1の77位に対応するアミノ酸残基にチロシン、配列番号1の114位に対応するアミノ酸残基にチロシン、配列番号1の167位に対応するアミノ酸残基にグルタミン酸、配列番号1の170位に対応するアミノ酸残基にアルギニン、配列番号1の176位に対応するアミノ酸残基にアルギニン、及び配列番号1の203位に対応するアミノ酸残基にトリプトファンを含む、
前記志賀毒素エフェクターポリペプチド。 - アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸1〜251に対して少なくとも95%の同一性を有する、請求項1に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- アミノ酸配列が、配列番号16に対して少なくとも95%の同一性を有する、請求項1に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
- i)細胞の細胞表面に物理的に結合される細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域、及び
ii)請求項1〜3のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド、
を含む、細胞標的化分子。 - 結合領域が、志賀毒素エフェクターポリペプチドのカルボキシ末端に融合し、単一の連続ポリペプチドを形成する、請求項4に記載の細胞標的化分子。
- 結合領域が、免疫ブロブリン型結合領域を含む、請求項4又は5に記載の細胞標的化分子。
- 免疫グロブリン型結合領域が、
シングルドメイン抗体断片、一本鎖可変断片、抗体可変断片、相補性決定領域3断片、拘束FR3−CDR3−FR4ポリペプチド、Fd断片、抗原結合断片、フィブロネクチンから得られる第10フィブロネクチンIII型ドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリン反復モチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Aドメイン、リポカリン、Kunitzドメイン、プロテインA由来Zドメイン、ガンマ−B結晶由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Sac7d由来ポリペプチド、Fyn由来SH2ドメイン、ミニタンパク質、C型レクチン様ドメイン足場、ラクダ化動物に由来する重鎖抗体ドメイン(VHH断片)、軟骨魚類に由来する重鎖抗体ドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体(IgNAR)、VNAR断片、多量体化scFv断片(ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ)、二価ナノボディ、二重特異性タンデムscFv断片、又は二重特異性ミノボディ、
から選択されるポリペプチドを含む、請求項6に記載の細胞標的化分子。 - リンカーペプチド(GxS)n(式中、xは1〜6であり、nは1〜30である)を含む、請求項4〜7のいずれかに記載の細胞標的化分子。
- xが4であり、かつnが1である、請求項8に記載の細胞標的化分子。
- 請求項4〜9のいずれかに記載の細胞標的化分子と、薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む、医薬組成物。
- 請求項4〜9のいずれかに記載の細胞標的化分子をコードするポリヌクレオチド、又はその相補物。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチド又は請求項12に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
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