CN101622352A - 选择和产生修饰的毒素、含有修饰的毒素的缀合物的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了选择和鉴定修饰的毒素及其缀合物的方法。所述方法选择对于表达毒素的宿主细胞显示降低的毒性的毒素。本发明还提供了提高毒素例如修饰的毒素或其缀合物的生产的方法。特别地，在所述方法中所述毒素或其缀合物在存在抑制分子时生产。本发明还提供了修饰的毒素及其缀合物。这种缀合物可以用于治疗多种与参与免疫或炎性反应的细胞的增殖、迁移和生理学活性相关的疾病或病症。

Description

选择和产生修饰的毒素、含有修饰的毒素的缀合物的方法及其应用

优先权要求和相关申请

要求Hongesheng Su，Philip J.Coggins，John R.McDonald and Laura M.McIntosh于2007年8月22日提交的题为“METHODS OF SELECTING ANDPRODUCING MODIFIED TOXINS，CONJUGATES CONTAININGMODIFIED TOXINS，AND USES THEREOF”的美国临时申请系列号No.60/965,977和Hongesheng Su，Philip J.Coggins，John R.McDonald and LauraM.McIntosh于2006年12月29日提交的题为“METHODS OF SELECTINGAND PRODUCING MODIFIED TOXINS，CONJUGATES CONTAININGMODIFIED TOXINS，AND USES THEREOF”的美国临时申请系列号No.60/878,166的优先权。

本申请还涉及1999年7月22日申请的美国申请系列号No.09/360,242，现为美国专利号7,157,418，题为“METHODS AND COMPOSITIONS FORTREATING SECONDARY TIS SUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMA-TORY CONDITIONS AND DISORDERS”，其根据35 U.S.C.§120要求了题为“METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARYTISSUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMATORY CONDITIONS ANDDISORDERS”、Osprey Pharmaceuticals Limited，McDONALD，John R.andCOGGINS，Philip J.于1999年7月21日提交的国际PCT申请PCT/CA99/00659的继续部分申请的优先权以及根据35 U.S.C.§119(e)要求了John R.McDonald和Philip J.Coggins于1998年7月22日提交的、题为“METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARYTISSUE DAMAGE”的美国临时申请系列号No.60/155,186的优先权。

本申请还涉及1999年12月02日申请的美国申请系列号No.09/453,851，现为美国专利号7,166,702，授予John R.McDonald和Philip J.Coggins，名称为“CYTOTOXIC CONJUGATES COMPRISING A Chemokinereceptor TARGETING AGENT”，其是美国申请系列号09/360,242的divisional，现为美国专利号7,157,418。本申请还涉及2001年2月22日申请的美国申请系列号No.09/792,793，现为美国专利号7,192,736，名称为“NUCLEIC ACID MOLECULES ENCODING CYTOTOXIC CONJUGATESTHAT CONTAIN A Chemokine receptor TARGETING AGENT”，其是美国申请系列号No.09/360,242和美国申请系列号No.09/453,851的分案申请。

本申请还涉及2003年2月24日申请的美国申请系列号No.10/375,209，现已放弃，名称为“METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATINGSECONDARY TISSUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMATORYCONDITIONS AND DISORDERS”，其是美国申请系列号No.09/792,793、美国申请系列号No.09/453,851和美国申请系列号No.09/360,242的继续申请。

本申请还涉及2006年2月24日申请的美国申请系列号No.11/361,977，名称为“METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING SECONDARYTIS SUE DAMAGE AND OTHER INFLAMMATORY CONDITIONS ANDDISORDERS”，其是美国申请系列号No.10/375,209、美国申请系列号No.09/792,793、美国申请系列号No.09/453,851和美国申请系列号No.09/360,242的继续申请。

当允许时，上述每个申请和专利以全文并入本文做参考。

发明领域

本发明提供了选择和鉴别具有降低的毒性的修饰的毒素的方法。本发明还提供了具有降低的毒性的修饰的毒素，以及含有这种修饰的毒素的缀合物。本发明还提供了产生这种修饰的毒素或者其缀合物的方法。所述缀合物用于与参与炎性反应的细胞的增殖、迁移和生理学活性相关的疾病的治疗方法中。

背景

炎性反应由免疫防御细胞及相关的组织居留细胞(residential cell)介导，所述细胞聚集在组织损伤或创伤部位以清除机体不需要的外源性物质(例如微生物)和内源性物质(例如癌细胞克隆)、清除细胞碎片以及参与组织和伤口愈合。不幸地，由于例如白细胞的不适当激活可引起继发组织损害，因此参与这些修复(炎症)过程的分子机制导致一些炎症和免疫调节疾病的发病机制和持久的病理学。

参与继发组织损害的分子机制以及细胞和化学介质在大多数人体炎性疾病中是相似的(如果不相同的话)。因此，已经开发了通过靶向这些分子机制和/或其它共同介质的多种治疗剂治疗这种炎症和免疫调节疾病。例如，已经开发了靶向在细胞水平发生的与这种炎症和免疫调节疾病的病理生理学过程相关的特定单一生物化学事件的治疗剂(例如兴奋性氨基酸或者活性氧的细胞毒性作用)。这种治疗剂包括类固醇，例如但不限于甲基强的松龙及其合成的2 1氨基类固醇(lazaroid)衍生物(例如trisilazad)，其发挥氧自由基清除剂的作用。类固醇的有益副作用被使人衰弱的副作用阻碍，由此长期类固醇治疗不是可行的临床选择。

本发明也已经开发了通过靶向在病理生理学过程中诱导和/或涉及的特定炎症介质(即细胞因子、生长因子或其受体)以治疗炎性疾病的治疗剂。这种治疗剂包括(infliximab，肿瘤坏死因子(TNF)-α的中和抗体)、

(etanercept，可溶的TNFα受体)以及多种生长因子的中和抗体，所述生长因子包括碱性成纤维细胞和血管内皮生长因子(McDonald et al.(2001)IDrugs，4：427-442)。虽然这种治疗剂是特异性的，但是它们均针对疾病病理学中涉及的单一成分。因此，由于炎性反应的代偿性质以及参与所述病理过程的其它炎性细胞因子和生长因子的存在，这种治疗剂典型仅提供部分或暂时的益处。

本领域已经开发了这样的治疗剂，其提供了通过靶向疾病的细胞介质而治疗炎性疾病及具有免疫调节成分的其它病症的更全面的途径。这种靶向细胞的治疗剂包括含有毒素部分且能通过多种机制进入一或多种细胞中导致所述细胞被消除的那些治疗剂。这种分子的例子是在美国专利申请系列号No.09/360,242、09/453,851和09/792,793以及美国专利No.7,166,702、7,157,418和7,192,736中描述的那些分子。这种缀合物可以被设计为特异性且可预测地靶向与疾病病理学相关的细胞类型，并因此可用于疾病治疗。融合蛋白缀合物在宿主细胞中产生。然而，所述缀合物中的毒素部分限制这些分子的有效产生。虽然已知并且可利用这种分子，但是仍需要有效地大量生产以广泛传播和应用。因此，本发明的目的是提供更有效地产生毒素和含有所述毒素的缀合物的方法。

发明概述

本发明提供了产生治疗分子的方法，以及修饰的毒素缀合物靶向与炎症或免疫调节疾病或病症的病理学相关的细胞介质的应用。特别地，本发明提供了修饰的毒素多肽、含有所述修饰的毒素多肽的缀合物以及产生和制备修饰的毒素多肽的方法。所述修饰的毒素多肽(和/或含有其的缀合物)在表达其的宿主细胞中呈现降低的毒性，与未如此修饰的毒素多肽相比允许以较高水平表达。所述修饰在多肽的一级氨基酸序列中发生。

本发明提供了修饰的核糖体失活蛋白(RIP)或者其活性部分或片段的选择或鉴别方法，其是依靠在宿主细胞中的表达而被鉴别。特别地，所述方法选择与在本文所述选择方法中使用的起始RIP蛋白相比对于宿主细胞具有降低的毒性的RIP。在实践本发明提供的方法中，将编码RIP或其活性部分的核酸导入宿主细胞中，使该细胞生长，分离生长的细胞，并且从生长的细胞中分离表达RIP的细胞。可以进行本发明提供的方法，由此所述细胞在不含有选择性调节剂例如腺嘌呤类似物如4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(4-aminopyrazolo[3，4-d]pyrimidine，4-APP)的培养基中生长。本发明提供的方法可进一步包括扩增表达RIP的细胞的步骤。在一个实例中，鉴别、分离或者纯化在分离的细胞中表达的RIP。RIP可以通过其序列或者其分子量鉴别。在一些情况中，可以通过测序鉴别RIP。本发明还提供了通过所述方法产生的RIP。

在所述方法的一些实例中，使具有编码RIP的核酸的细胞在存在选择性调节剂的条件下生长。所述选择性调节剂可以是RIP抑制剂，例如腺嘌呤类似物。所述腺嘌呤类似物可以是4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(4-APP)。在使用选择性调节剂如RIP抑制剂、例如腺嘌呤类似物如4-APP中，选择对于宿主细胞无毒性的浓度。在一些方面中，选择抑制RIP对于宿主细胞毒性的浓度。在一个实例中，与不存在RIP抑制剂、腺嘌呤类似物或者4-APP的情况相比，所述毒性的抑制足以增加表达的RIP的量。例如，RIP的毒性被抑制0.1％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或者100％。在所述RIP抑制剂是4-APP的情况中，本发明方法中使用的抑制剂的浓度是大约或者是0.1mM至大约或者是5.0mM。对于其它抑制剂，合适的浓度可以根据经验或者参考4-APP确定。在一些实例中，4-APP的浓度在大约或者是在0.1至2、3或4mM之间，或者是0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9或1mM。在其它实例中，4-APP的浓度是大约或者是0.5mM。

因此本发明提供了选择毒性降低的毒素的方法以及生产毒性降低的毒素的方法。所述选择方法鉴别了具有降低的毒性的毒素。这种毒素通常当编码其的核酸被导入细菌中以进行表达时不被表达，但是一般在低水平表达。所述选择方法寻找表达的毒素，然后扩增表达具有降低的毒性的毒素的细胞以允许表达。本发明还提供了生产方法，其是通过在存在抑制剂的条件下生长所述细胞而选择突变体的另一种方式，所述抑制剂例如是4-APP，典型是低剂量的4-APP，其进一步抑制高水平毒性，并且导致毒素产生以及突变体保留良好的毒性，但是不是象野生型那样高。

因此，所述选择方法使得可以鉴别具有降低毒性的毒素。这种修饰的毒素可以高于野生型的水平产生。在生产方法中，野生型或者修饰的毒素可以在存在4-APP(通常是高于在选择方法中使用的浓度)的条件下表达，以使得毒素毒性降低。如果在选择方法中鉴别的修饰的毒素已经是毒性低于野生型，则4-APP的存在进一步限制毒性，由此与野生型或在不存在4-APP条件下的突变体相比可以产生更多毒素，或者可以使用较低浓度的4-APP。在所有情况中，均保留足够的毒性以使得在方法中利用其细胞毒性。所述毒素是如此毒性的，以致于即使大幅度降低其毒性例如降低至1％毒性，其在本文所述方法中仍具有足够毒性。

一方面，本发明提供的方法中宿主细胞是真核细胞。另一方面，本文所述方法中使用的宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌(E.coli)。

在本发明提供的方法中，由导入的核酸分子编码的RIP可以是I型RIP或者其活性片段。例如，本文所述方法中使用的RIP包括但不限于香石竹毒蛋白30、香石竹毒蛋白32、剪秋罗苷(lychnin)、肥皂草毒蛋白-1、肥皂草毒蛋白-2、肥皂草毒蛋白-3、肥皂草毒蛋白-4、肥皂草毒蛋白-5、肥皂草毒蛋白-6、肥皂草毒蛋白-7、肥皂草毒蛋白-8、肥皂草毒蛋白-9、PAP、PAP II、PAP-R、PAP-S、PAP-C、mapalmin、商陆毒蛋白、异株泻根毒蛋白-L、异株泻根毒蛋白、异株泻根毒蛋白II、棒麦角素(clavin)、大肠菌素-1、大肠菌素-2、软瓜蛋白-A、软瓜蛋白-B、软瓜蛋白-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、α-kirilowin、β-kirilowin、多花白树毒蛋白、苦瓜毒蛋白、苦瓜毒蛋白-II、苦瓜毒蛋白-Ic、紫茉莉属(Mirabilis)抗病毒蛋白(MAP)、MAP-30、α-苦瓜子蛋白、β-苦瓜子蛋白、天花粉蛋白、TAP-29、trichokirin、大麦RIPI、大麦RIP II、小麦毒蛋白、亚麻RIP、玉米RIP 3、玉米RIP 9、玉米RIPX、asparin-1或者asparin 2。

在本发明提供的方法的其它实例中，由导入的核酸分子编码的RIP是II型RIP、其催化亚基或者其活性片段。例如，本发明方法中使用的RIP包括但不限于志贺毒素(Stx)、志贺样毒素II(Stx2)、塑莲根毒蛋白I、蓖麻毒蛋白、黑杆菌素-CIP-29、相思豆毒蛋白、vircumin、塑莲根毒蛋白II、ebulitin-α、ebulitin-β、ebulitin-γ或者porrectin。一方面，导入的核酸编码RIP亚基A或者其活性片段。另一方面，导入的核酸编码RIP志贺毒素的亚基A1(SA1)。所述SA1可以是截短的。例如，所述SA1可以在N末端或C末端缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或者12个连续氨基酸而被截短。在另一个实例中，所述SA1可以通过用另一个氨基酸如Ser置换Cys而被修饰。在本发明方法中被导入宿主细胞中的核酸的例子是编码具有SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示氨基酸序列的SA1的核酸分子。例如，所述SA1可以由含有其序列如SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25所示的碱基的核酸分子编码。

在本发明提供的方法中，由导入的核酸分子编码的RIP可以与配体缀合形成配体-毒素缀合物。缀合物中的RIP与配体可以通过共价键或离子键直接连接。例如，RIP与配体可以通过接头如肽、多肽或者氨基酸连接。接头的例子是Ala-Met接头。典型地，所述配体-毒素缀合物是融合蛋白。

配体-毒素缀合物中的配体可以是趋化因子受体靶向物质、非趋化因子细胞因子、激素、生长因子、细胞表面受体特异性抗体、TNF超家族配体以及模式识别受体(PRR)配体。在一个实例中，所述配体是生长因子如VEGF。在另一个实例中，所述配体是趋化因子受体靶向物质如趋化因子或者趋化因子的片段、或者特异性结合趋化因子受体的抗体或者抗体片段，其中所述片段结合趋化因子受体。在所述配体是抗体的情况中，其可以是单克隆抗体或者其抗原特异性片段。单克隆抗体的例子是特异于抗原的那些抗体，所述抗原包括但不限于(DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR6、CXCR7、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1以及XCR1。

在另一实例中，所述配体是趋化因子。本发明方法中使用的配体-毒素缀合物中的趋化因子的例子包括但不限于单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、嗜酸性粒细胞趋化蛋白1(Eotaxin-1)、Eotaxin-2、Eotaxin-3、基质衍生因子-1β、SDF-1α、SDF-2、巨噬细胞抑制蛋白1α(MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、调节活化正常T细胞表达和分泌的(Regulated on Activatin，Normal T Cell Expressed and Secreted，RANTES)蛋白、白细胞介素-8(IL-8)、生长调节蛋白α(GRO-α)、干扰素可诱导蛋白10(IP-10)、巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)、粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)、上皮来源的中性粒细胞激活蛋白78(ENA-78)、血小板碱性蛋白(PBP)、γ干扰素诱导的单核因子(MIG)、血小板因子4(PF-4)、hemofiltrate CC趋化因子1(HCC-1)、胸腺和激活调节趋化因子(TARC)、淋巴细胞趋化因子、lungkine、C10、肝表达趋化因子(LEC)、exodus-2(SLC)、胸腺表达趋化因子(TECK)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、单C基序1-β(SCM-1β)、干扰素诱导的T细胞α化学引诱物(I-TAC)、胸肾表达趋化因子(BRAK)、CXXXC趋化因子及B细胞吸引趋化因子1(BCA-1)，以及其等位基因变体或物种变体。在一个实例中，所述趋化因子是MCP-1、Eotaxin-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α和BCA-1以及其等位基因变体或物种变体中的任一种。在另一个实例中，所述趋化因子是MCP-1。编码配体毒素缀合物的核酸的例子是编码具有SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：40所示氨基酸残基序列的配体-毒素缀合物的核酸分子。这种核酸分子例如是具有SEQ ID NO：37或SEQID NO：39所示序列的那些分子。

在本发明方法的一个方面中，鉴别的RIP与由导入的核酸分子编码的RIP相比含有突变。在本发明提供的方法中，评估鉴别的RIP的毒性。毒性可以通过包括但不限于如下的测定法评估：蛋白质合成测定、脱嘌呤测定以及细胞生长/存活性测定。典型地，鉴别的RIP与由导入的核酸分子编码的RIP相比保留毒性。鉴别的RIP保留0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多毒性。

本发明的方法中还提供了产生鉴别的RIP的额外步骤。这种方法包括将编码鉴别的RIP或者其活性片段的核酸分子导入宿主细胞中，在存在RIP抑制剂的条件下保温该细胞，其中选择RIP抑制剂的量以降低RIP多肽的毒性；使所述细胞在一定条件下生长，从而产生所述RIP或者其活性片段。可以对RIP进行纯化，由此表达或纯化或者表达及纯化的RIP的量通常高于在不存在RIP抑制剂的条件下的结果。

本发明提供的方法也可包括制备含有鉴别的RIP的缀合物的进一步步骤。在本发明提供的方法中，所述方法还包括合成鉴别的RIP或者含有鉴别的RIP的缀合物。

本发明还提供了增加核糖体失活蛋白(RIP)或者其活性片段的产生的方法。这种方法可以有效地产生RIP或者含有RIP的缀合物例如为这种缀合物用作治疗剂提供可行来源。在本发明的生产方法中，编码RIP或者其活性片段的核酸被导入宿主细胞中。将所述细胞在存在RIP抑制剂的条件下保温，由此选择RIP抑制剂的量以降低RIP的毒性。在本发明的增加生产的方法中，使所述细胞在产生RIP或其活性片段的条件下生长。一方面，所述生产方法包括纯化RIP的步骤。典型地，表达的或纯化的或者表达及纯化的RIP的量均高于在不存在RIP抑制剂的条件下的结果。

在本发明提供的生产方法中，由导入的核酸分子编码的RIP可以是I型RIP或者其活性片段。例如，本发明方法中使用的RIP包括但不限于香石竹毒蛋白30、香石竹毒蛋白32、剪秋罗苷、肥皂草毒蛋白-1、肥皂草毒蛋白-2、肥皂草毒蛋白-3、肥皂草毒蛋白-4、肥皂草毒蛋白-5、肥皂草毒蛋白-6、肥皂草毒蛋白-7、肥皂草毒蛋白-8、肥皂草毒蛋白-9、PAP、PAP II、PAP-R、PAP-S、PAP-C、mapalmin、商陆毒蛋白、异株泻根毒蛋白-L、异株泻根毒蛋白、异株泻根毒蛋白II、棒麦角素、大肠菌素-1、大肠菌素-2、软瓜蛋白-A、软瓜蛋白-B、软瓜蛋白-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、α-kirilowin、β-kirilowin、多花白树毒蛋白、苦瓜毒蛋白、苦瓜毒蛋白-II、苦瓜毒蛋白-Ic、紫茉莉属抗病毒蛋白(MAP)、MAP-30、α-苦瓜子蛋白、β-苦瓜子蛋白、天花粉蛋白、TAP-29、trichokirin、大麦RIP I、大麦RIP II、小麦毒蛋白、亚麻RIP、玉米RIP 3、玉米RIP 9、玉米RIP X、asparin-1或者asparin 2。

在本发明生产方法的其它实例中，由导入的核酸分子编码的RIP是II型RIP、其催化亚基或者活性片段。例如，本发明方法中使用的RIP包括但不限于志贺毒素(Stx)、志贺样毒素II(Stx2)、塑莲根毒蛋白I、蓖麻毒蛋白、黑杆菌素-CIP-29、相思豆毒蛋白、vircumin、塑莲根毒蛋白II、ebulitin-α、ebulitin-β、ebultin-γ或者porrectin。一方面，导入的核酸编码RIP亚基A或者其活性片段。另一方面，导入的核酸编码RIP志贺毒素的亚基A1(SA1)。所述SA1可以是截短的。例如，所述SA1可以在N末端或者C末端缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或者12个连续氨基酸而被截短。

一方面，由导入的核酸编码的RIP例如SA1被修饰。在一个实例中，所述SA1可以通过用另一氨基酸如Ser置换Cys而被修饰。在另一个实例中，所述SA1通过参考具有SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的SA1中的氨基酸位置置换位置38或者位置219之一或者这两个位置而被修饰。例如，所述氨基酸置换可以相应于L38R和/或V219A。在一个实例中，所述氨基酸置换相应于V219A。在本发明提供的方法中导入宿主细胞中的核酸的例子是编码具有SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28所示氨基酸序列的SA1的核酸分子。例如，所述SA1可以由含有其序列为SEQ ID NO：27或SEQ IDNO：29所示的核苷酸的核酸分子编码。

在本发明提供的生产方法中，所述RIP抑制剂是腺嘌呤类似物。例如，所述腺嘌呤类似物是4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(4-APP)。通常地，在本发明的生产方法中，选择RIP抑制剂、腺嘌呤类似物或4-APP的浓度以使得RIP的毒性有效降低了或者大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％。在RIP抑制剂是4-APP的情况中，本发明方法中使用的浓度是大约1mM或者是1mM至大约40.0mM或者40.0mM。在一个实例中，4-APP的浓度在大约或者2.0mM、3.0mM、4.0mM、5.0mM、6.0mM、7.0mM、8.0mM、9.0mM、10.0mM、15.0mM或者20.0mM之间。

在本发明提供的生产方法的一方面中，生产是在真核宿主细胞中进行。另一方面，生产是在原核宿主细胞例如大肠杆菌中进行。

在本发明提供的生产方法中，可以使用诱导剂，由此在经诱导剂诱导后RIP多肽表达。所述诱导剂可以是IPTG。本发明的生产方法中使用的RIP抑制剂可以在加入诱导剂之前、期间和/或之后加入。

在一些方面中，本发明的生产方法用于增加含有RIP的缀合物的产生。在这种方法中，编码RIP的核酸分子包括编码配体的核苷酸序列，从而所述分子编码配体-毒素缀合物。缀合物中的RIP和配体可以通过共价键或者离子键直接连接。例如，RIP和配体可以通过接头如肽、多肽或者氨基酸连接。接头的例子是Ala-Met接头，所述Met在连接的多肽中可以作为起始密码子。典型地，所述配体-毒素缀合物是融合蛋白。

本发明提供了缀合物，其含有一或多种受体靶向物质(receptor targetingagent)，例如与一或多种被靶向物质(targeted agent)直接或者通过接头靶向连接的趋化因子-受体。特别地，本发明提供的缀合物含有如下成分：(受体靶向物质)_n，(L)_q以及(被靶向物质)_m，其中至少一种受体靶向物质例如受体配体或者受体特异性抗体或者所述配体或抗体的有效部分与至少一种被靶向物质直接连接或者通过一或多个接头(L)连接。L指接头。所述缀合物的元件之间的任何合适关联均包含在内，只要所得缀合物与被靶向受体相互作用，由此导致关联的被靶向物质内化即可。在本发明提供的缀合物中，所述被靶向物质是修饰的毒素例如修饰的RIP或者其毒性片段。所述毒素或其片段是在其一级氨基酸序列中被修饰，由此与其未修饰形式相比对于表达生产的宿主细胞的毒性更低。所述毒素或缀合物是通过本发明提供的方法修饰的。

变量n和m是1或大于1的整数，q是0或者任何整数。选择变量n、q和m，由此所得缀合物与被靶向受体相互作用而且被靶向物质由被靶向细胞内化。典型地，n在1-3之间；q是0或更大，根据连接的靶向物质和被靶向物质的数目和/或接头的功能确定，q通常在1-4之间；m是1或者更大，通常是1或2。当缀合物中存在一个以上的被靶向物质时，所述被靶向物质可以相同或不同。相似地，当缀合物中存在一个以上的受体靶向物质时，其可以相同或不同。

本发明提供的缀合物可以作为融合蛋白而产生，可以是化学偶联的或者包括融合蛋白部分和化学连接部分或者其任意组合。对于本发明而言，受体靶向物质是与受体特异性相互作用的任何物质，典型是多肽，例如激活白细胞上的趋化因子受体，而且在与受体相互作用时使得连接的或者另外关联的被靶向物质如毒素内化，即由被靶向细胞内化。

配体-毒素缀合物中的配体可以是趋化因子受体靶向物质、非趋化因子细胞因子、激素、生长因子、细胞表面受体特异性抗体、TNF超家族配体以及模式识别受体(PRR)配体。在一个实例中，所述配体是生长因子如VEGF。在另一个实例中，所述配体是趋化因子受体靶向物质例如趋化因子或者趋化因子的片段，或者特异性结合趋化因子受体的抗体或者抗体的片段，其中所述片段结合趋化因子受体。在所述配体是抗体的情况中，其可以是单克隆抗体或者其抗原特异性片段。举例的单克隆抗体是特异于选择的抗原的那些抗体，所述抗原包括但不限于(DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1以及XCR1。

在另一实例中，所述配体是趋化因子。本发明方法中使用的配体-毒素缀合物中趋化因子的例子包括但不限于单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、嗜酸性粒细胞趋化蛋白1(Eotaxin-1)、Eotaxin-2、Eotaxin-3、基质衍生因子-1β、SDF-1α、SDF-2、巨噬细胞抑制蛋白1α(MIP-1α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、调节活化正常T细胞表达和分泌的(RANTES)蛋白、白细胞介素-8(IL-8)、生长调节蛋白α(GRO-α)、干扰素可诱导蛋白10(IP-10)、巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)、粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)、上皮来源的中性粒细胞激活蛋白78(ENA-78)、血小板碱性蛋白(PBP)、γ干扰素诱导的单核因子(MIG)、血小板因子4(PF-4)、hemofiltrate CC趋化因子1(HCC-1)、胸腺活化调节趋化因子(TARC)、淋巴细胞趋化因子、lungkine、C10、肝表达趋化因子(LEC)、exodus-2(SLC)、胸腺表达趋化因子(TECK)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、单C基序1-β(SCM-1β)、干扰素可诱导T细胞α化学引诱物(I-TAC)、胸肾表达趋化因子(BRAK)、CXXXC趋化因子和B细胞吸引趋化因子1(BCA-1)以及其等位基因变体或物种变体。在一个实例中，所述趋化因子是任意的MCP-1、Eotaxin-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α和BCA-1以及其等位基因变体或物种变体。在另一个实例中，所述趋化因子是MCP-1。

所述配体-毒素缀合物中的毒素部分可以是志贺毒素，其催化活性片段或者其活性片段。例如，本发明方法中产生的配体-毒素缀合物中的毒素部分可以是SA1。所述配体-毒素缀合物中的毒素部分如SA1可以是修饰的毒素。编码本发明方法中产生的配体-毒素缀合物的核酸的例子是编码具有任何SEQ ID NO：42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64或67所示氨基酸残基序列的配体-毒素缀合物的核酸分子。这种核酸分子例如是具有任何SEQ ID NO：41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65或66所示序列的那些分子。

本发明提供了修饰的毒素，特别是修饰的RIP，其与起始材料RIP(包括野生型和变体RIP)相比呈现降低的毒性。这种修饰的RIP毒素或其缀合物包括在本发明方法中鉴别的任何毒素或其缀合物。

本发明提供的修饰的毒素例如是修饰的志贺毒素多肽或者其活性片段，其在志贺毒素、其等位基因变体或物种变体、其催化活性部分或者其活性片段中具有一或多个氨基酸修饰，由此所述修饰赋予降低的毒性。在一个实例中，所述一或多个氨基酸修饰是参考具有SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的志贺毒素A1亚基(SA1)中氨基酸位置在相应于位置38和/或219之一或这两个位置的置换。本发明提供的修饰的志贺毒素与具有SEQ IDNO：22所示氨基酸序列的多肽具有至少大约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列相同性并且包括在相应于氨基酸位置38和/或219的基因座的修饰。在位置38和/或219的修饰是相应于L38R和/或V219A的那些修饰。修饰的志贺毒素包括亚基A。例如，修饰的志贺毒素可以仅包括志贺毒素的SA1或者其活性片段。所述SA1可以是截短的。例如，截短的SA1可以通过在N末端或C末端缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或者12个连续氨基酸而被截短。修饰的志贺毒素的例子是具有SEQ ID NO：26或28所示氨基酸序列的那些毒素或者其等位基因变体或物种变体。

本发明还提供了含有被靶向物质的缀合物，所述被靶向物质是修饰的核糖体失活蛋白(RIP)，例如在本发明方法中鉴别的任何修饰的RIP。本发明还提供了含有被靶向物质的缀合物，所述被靶向物质是修饰的志贺毒素或者其活性片段，例如上述任何修饰的志贺毒素。所述缀合物还含有靶向物质或其部分，其促进所述缀合物与细胞表面受体的结合，导致所述被靶向物质由携带所述受体的细胞内化。

这些缀合物是具有如下成分的那些缀合物：(靶向物质)_n、(L)_q和(被靶向物质)_m，其中L是连接靶向物质与被靶向物质的接头，所述靶向物质是选择性结合细胞表面受体的任何成分，m和n单独地是至少1，q是0或者大于0，只要所得缀合物结合被靶向的受体、被内化并且输送被靶向物质即可。典型地，所得缀合物结合与靶向物质相互作用并使其内化的受体，从而被靶向物质被携带受体的细胞内化。在所述缀合物含有多个被靶向物质的情况中，所述被靶向物质是相同或不同的。典型地，被靶向物质是所有修饰形式的RIP毒素。另外，当所述缀合物含有多个靶向物质时，所述靶向物质是相同或不同的。在一个实例中，m和n单独地是1-6。在另一个实例中q是1，n是2以及m是1。

在本发明提供的缀合物中，靶向物质包括受体靶向物质，例如但不限于趋化因子受体靶向物质、非趋化因子细胞因子、激素、生长因子、细胞表面受体特异性抗体、TNF超家族配体以及模式识别受体(PRR)配体。在一个实例中，所述配体是生长因子如VEGF。在另一个实例中，所述配体是趋化因子受体靶向物质如趋化因子或者趋化因子的片段或者特异性结合趋化因子受体的抗体或者抗体的片段，其中所述片段结合趋化因子受体。在配体是抗体的情况中，其可以是单克隆抗体或者其抗原特异性片段。举例的单克隆抗体是特异于抗原的那些抗体，所述抗原包括但不限于(DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR6、CXCR7、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1和XCR1。

在另一实例中，所述配体是趋化因子。本发明提供的配体-毒素缀合物中的趋化因子的例子包括但不限于单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、嗜酸性粒细胞趋化蛋白1(Eotaxin-1)、Eotaxin-2、Eotaxin-3、基质衍生因子-1β、SDF-1α、SDF-2、巨噬细胞抑制蛋白1α(MIP-1 α)、MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3、MIP-3β、MIP-3α、MIP-4、MIP-5、调节活化正常T细胞表达和分泌的(RANTES)蛋白、白细胞介素-8(IL-8)、生长调节蛋白α(GRO-α)、干扰素可诱导的蛋白10(IP-10)、巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)、粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)、上皮来源的中性粒细胞活化蛋白78(ENA-78)、血小板碱性蛋白(PBP)、γ干扰素诱导的单核因子(MIG)、血小板因子4(PF-4)、hemofiltrate CC趋化因子1(HCC-1)、胸腺活化调节趋化因子(TARC)、淋巴细胞趋化因子、lungkine、C10、肝表达趋化因子(LEC)、exodus-2(SLC)、胸腺表达趋化因子(TECK)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、单C基序1-β(SCM-1β)、干扰素可诱导的T细胞α化学引诱物(I-TAC)、胸肾表达趋化因子(BRAK)、CXXXC趋化因子和B细胞吸引趋化因子1(BCA-1)以及其等位基因变体或物种变体。在一个实例中，所述趋化因子是任意的MCP-1、Eotaxin-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α和BCA-1以及其等位基因变体或物种变体。在另一个实例中，所述趋化因子是MCP-1。

本发明提供的缀合物中的靶向物质特异性结合一或多种免疫效应细胞或者与免疫或炎性反应相关的其它细胞上的一或多种细胞表面受体。在一个实例中，所述免疫效应细胞是白细胞。在另一个实例中，与免疫或炎性反应相关的其它细胞是组织居留细胞(TRC)。由本发明提供的缀合物靶向的细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、天然杀伤(NK)细胞以及嗜中性粒细胞。巨噬细胞包括组织巨噬细胞例如尘细胞、小胶质细胞和kupfer细胞。树突细胞包括不成熟树突细胞、成熟树突细胞和朗格汉斯细胞。T细胞包括CD4+(如Th1、Th2或Th17细胞)和CD8+T细胞。TRC包括系膜细胞、神经胶质细胞、内皮细胞、上皮细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞和滑膜细胞(synoviocyte)。由所述缀合物靶向的细胞可以被活化。例如，细胞活化可诱导由所述缀合物靶向的一或多种细胞表面受体的表达。

本发明提供的缀合物例如是靶向结合一或多种趋化因子的细胞表面受体的那些缀合物。这种趋化因子受体包括但不限于CXCR1、CXCR2、CXCR3A、CXCR3B、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCR1、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、XCR1和CX3CR-1。缀合物与趋化因子受体的结合促进缀合物由携带受体的细胞内化。

在本发明提供的缀合物中，所述靶向物质与被靶向物质或者其活性片段通过共价键或者离子键连接。例如，缀合物中修饰的RIP与配体可以通过共价键或者离子键直接连接。在一些情况中，RIP与配体通过接头连接，所述接头例如是肽、多肽、氨基酸或者化学接头。接头的例子是Ala-Met接头。接头的例子还包括但不限于N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸盐/酯、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸盐/酯、4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯、磺基琥珀酰亚胺基-6-(α-甲基-α-(吡啶基二硫醇)-甲苯甲酰胺基)己酸盐/酯、N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)-丙酸盐/酯、琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基)己酸盐/酯、磺基琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基)己酸盐/酯、3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰肼、Ellman’s试剂、二氯三嗪酸(dichlorotriazinic acid)和S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸。

本发明提供了具有SEQ ID NO：44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64或67任一所示氨基酸序列的缀合物。

本发明还提供了含有本发明提供的任何修饰的毒素缀合物例如具有修饰的SA1的任一毒素缀合物的药物组合物。所述药物组合物含有药物可接受的赋形剂且可以根据任何适当施用途径而配制，所述施用途径包括但不限于全身性、口服、经鼻、经肺、局部(local)以及表面(topical)施用。本发明还提供了试剂盒，其含有所述任何药物组合物、施用所述组合物的装置以及任选地含有施用说明书。

本发明还提供了编码本发明提供的任一缀合物的核酸分子。本发明还提供了含有所述核酸分子的质粒以及含有所述核酸分子或质粒的细胞。

本发明还提供了使毒素靶向细胞的方法。这种方法包括例如给对象样品施用所述缀合物。施用的缀合物含有修饰的毒素如本发明提供的任一种以及细胞表面受体靶向物质如配体。靶向的细胞表达所述靶向物质的细胞表面受体。

本发明提供了一种治疗患有免疫或者炎性疾病或失调的对象的方法。在所述治疗方法中，将含有本发明提供的任一缀合物的药物组合物给予对象，由此所述组合物抑制继发组织损害引起的炎性细胞的增殖、迁移或者生理学活性。

本发明还提供了通过施用缀合物如本发明提供的任一缀合物抑制动物或对象的疾病或失调或者治疗患有疾病或失调的动物或对象的方法，所述疾病或失调例如是与炎性反应和/或继发组织损害相关的免疫或炎症病症，所述炎性反应和/或继发组织损害与一或多种细胞的活化、增殖和迁移相关。在所述方法中，所述缀合物结合在一或多种细胞上表达的一或多种细胞表面受体，导致被靶向物质在携带所述受体的细胞中内化，从而抑制一或多种细胞的活化、增殖或迁移。在一个实例中，治疗对象是哺乳动物。在另一个实例中，治疗对象是人。

在所述方法中，所述一或多种细胞可以是免疫效应细胞或者与免疫或炎症病症相关的其它细胞。在一个实例中，所述免疫效应细胞是白细胞。在另一个实例中，与免疫或炎症病症相关的其它细胞是组织居留细胞(TRC)。所述细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、天然杀伤(NK)细胞以及嗜中性粒细胞。巨噬细胞包括组织巨噬细胞，如尘细胞、小胶质细胞或者kupffer细胞。树突细胞包括不成熟树突细胞、成熟树突细胞或者朗格汉斯细胞。T细胞包括CD4+(如Th1、Th2或者Th17细胞)和CD8+T细胞。TRC包括系膜细胞、神经胶质细胞、上皮细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞以及滑膜细胞。在一些情况中，所述一或多种细胞被活化，由此例如在细胞上表达的细胞表面受体上调。

在抑制疾病或失调的方法的一个方面中，所述缀合物抑制参与疾病或失调的一或多种细胞的活化、增殖或迁移，所述疾病或失调例如但不限于CNS损伤、CNS炎性疾病、神经变性疾病、心脏病、炎性眼病、炎性皮肤病、炎性肠病、炎性关节病、炎性肾病、炎性肺病、炎性鼻病、炎性全身疾病、肥胖症及相关疾病中的炎症、炎性甲状腺疾病、与细菌或病毒感染相关的炎性反应、癌症以及血管发生介导的疾病。

在一个实例中，CNS炎性疾病和/或神经变性疾病包括但不限于闭合性头部损伤、脑白质病、脉络丛脑膜炎、脑膜炎、肾上腺脑白质营养不良、爱滋病痴呆复合征、阿尔茨海默病、唐氏综合征、慢性疲劳综合征、脑炎、脑脊髓炎、海绵样脑病、多发性硬化、帕金森氏病和脊髓损伤/创伤(SCI)。在另一个实例中，所述心脏病是动脉粥样硬化。炎性眼病包括但不限于增生性糖尿病视网膜病变、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜炎、巩膜炎、巩膜虹膜炎、脉络膜炎和葡萄膜炎。炎性皮肤病包括但不限于银屑病、湿疹和皮炎。炎性肠病可包括但不限于慢性结肠炎、克罗恩病(Crohn′s disease)以及溃疡性结肠炎。炎性关节疾病包括但不限于幼年类风湿性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎以及脊椎关节病变如强直性脊柱炎、Reiter’s综合征、反应性关节炎、银屑病关节炎、脊柱炎、未分化脊椎关节病变以及Behcet’s综合征。炎性肾病包括但不限于肾小球肾炎、IgA肾病以及狼疮肾炎。炎性肺病包括但不限于急性呼吸窘迫综合征、嗜酸性细胞肺病、慢性嗜酸性细胞肺炎、急性嗜酸性细胞肺炎、支气管收缩、支气管肺发育不良、支气管肺泡嗜酸粒细胞增多、过敏性支气管肺曲霉病、肺炎和纤维化肺病。炎性鼻病包括但不限于息肉病、鼻窦炎和鼻炎。炎性甲状腺病包括但不限于甲状腺炎。癌症包括但不限于神经胶质瘤、粥样斑癌(atheromascarcinomas)、腺癌、肉芽肿、成胶质细胞瘤、肉芽肿病、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤、结节病、小神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌和头颈癌。

一方面，选择的疾病或失调是肾病、脊髓损伤或者迟发型超敏性疾病或失调。

在本发明的治疗或抑制疾病或失调的方法中，缀合物的靶向物质包括但不限于MCP-1、Eotaxin-1、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α和BCA-1以及其等位基因变体或物种变体，所述被靶向物质是修饰的志贺毒素。在一个实例中，靶向物质是MCP-1。缀合物的例子包括但不限于LPM1c、LPM1d、LPM2、LPM3、LPM4、LPM5、LPM6、LPM7、LPM8、LPM9、LPM10和LPM11。这种缀合物具有SEQ IDNO：42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64或者67分别所示任一氨基酸序列。

例如，所述疾病可以是多发性硬化(MS)。对于这种实施方案，被靶向的细胞是表达在MS中被上调的受体的那些细胞。例如，被靶向的细胞包括表达受体的那些细胞，所述受体选自例如一或多种如下受体，例如一种或者至少两种如下受体：CCL1-8、CXCL8-13、CCR1-3，5，6以及CXCR1-3，4。治疗MS的缀合物含有靶向物质，例如足以结合并内化所连接的(直接或间接连接)物质的趋化因子或者其片段，其结合这种受体并由其内化。因此，例如所述缀合物可含有足以结合受体并由受体内化的趋化因子或其片段；所述趋化因子例如选自I-309、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MCP-3、MCP-2、IL-8、MIG、IP-10、I-TAC、SDF-1α、SDF-1β、BCA-1、Eotaxin、MCP-4、MCP-5、C10、LEC和MIP-1b2。这种缀合物的例子是LPM1d。

在本发明方法的一个实例中，所述缀合物的靶向物质含有PF-4或者其等位基因变体或物种变体，所述疾病或病症是血管发生介导的疾病。在另一个实例中，所述缀合物的靶向物质是VEGF或者其等位基因变体或物种变体，所述疾病或病症是血管发生介导的疾病。

详细描述

概述

A.定义

B.核糖体失活蛋白(RIP)，其选择、表达与产生

C.核糖体失活蛋白(RIP)及作用方法

1.举例的RIP

志贺毒素

2.RIP毒素抑制剂

4-APP及其它腺嘌呤类似物

D.选择修饰的毒素或者其缀合物的方法

1.候选RIP蛋白或其缀合物

2.RIP或其缀合物导入宿主细胞中

a.转染

b.转化

c.电穿孔

3.表达、选择及鉴别

4.活性评估

a.蛋白质合成测定

b.脱嘌呤测定

c.细胞生长/存活/存活性测定

E.举例的修饰的毒素

修饰的SA1毒素

E.靶向物质及其缀合物

1.靶向物质

a.趋化因子

i.配体

ii.趋化因子受体

iii.趋化因子/趋化因子受体细胞谱(Cellular Profile)

iv.举例的趋化因子靶向物质

b.非趋化因子细胞因子

c.抗体配体成分

d.其它靶向物质以及受体靶

生长因子

2.接头部分

a.举例的接头

i.异双官能交联剂

ii.酸可裂解的、光可裂解的以及热敏感的接头

iii.进行化学缀合的其它接头

iv.肽接头

3.举例的白细胞群调节剂(LPM)缀合物

G.修饰的RIP毒素及其缀合物的制备

1.产生及克隆毒素多肽或者含有毒素多肽的缀合物的方法

2.含有融合蛋白的缀合物的产生以及表达系统

a.为进行表达的质粒及宿主细胞

i.细菌细胞表达系统

ii.昆虫细胞表达系统

iii.酵母细胞表达系统

iv.植物细胞表达系统

v.哺乳动物细胞表达系统

b.纯化

3.化学缀合物的产生

H.增加RIP多肽或者其缀合物的产生的方法

增加蛋白质产生的其它方法

I.测量毒素或者其缀合物的活性的体外和体内测定法

1.体外活性测定法

a.基于细胞的毒性测定法

b.受体结合测定与内化

c.趋化性测定

2.检测缀合物的体内动物模型

a.脊髓损伤(SCI)

b.外伤性脑损伤及卒中

c.阿尔茨海默病

d.多发性硬化

e.关节炎及自身免疫疾病

f.炎性肺病

g.基因治疗后的炎症

h.血管发生

i.肿瘤生长

j.人免疫缺陷病毒(HIV)

k.肾病

l.超敏性

J.含有毒素及其缀合物的组合物的配制与施用

K.使用毒素或其缀合物治疗疾病和失调的方法

1.免疫宿主防御系统与炎症

a.内环境稳态炎症(Homeostatic inflammation)

b.病理性炎症

2.候选治疗剂及其限制

3.配体-毒素缀合物(即LPM)

治疗选择的疾病或失调的配体-毒素缀合物的选择

白细胞群调节剂的选择与设计

4.举例的疾病

a.癌症

b.肾病

c.脊髓损伤(SCI)

d.超敏性

e.HIV感染和AIDS以及其它病原体感染

f.炎性关节疾病以及自身免疫疾病

g.肺病

h.由继发组织损害引起的其它疾病

5.组合治疗

L.实施例

A.定义

除非特别定义，本文中使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域技术人员通常了解的相同含义。除非特别定义，本文的所有专利、专利申请、公布的申请以及出版物、Genbank序列、数据库、网站及其它公布的材料均以其全部内容并入作参考。在术语具有多个定义的情况中，以此章节所述含义为准。当参考URL或其他这种标识或地址时，应理解这种标识可能改变以及互联网上特定信息可能变化，但是可以通过搜索互联网发现等价信息。对其的参考证明这种信息的可获得性和公开传播。

如本文所用，毒素(也称作细胞毒素)是指如多肽或药物这样的分子，当其被细胞内化时通过例如抑制细胞生长和/或增殖而抑制细胞功能。毒素可抑制细胞的增殖或者对细胞有毒性。当由细胞内化时干扰或有害地改变细胞代谢或者以任何方式抑制细胞生长或增殖的任何分子均包含在这个术语的范围内，包括但不限于其毒性作用是当转运至细胞中而介导的那些分子以及其毒性作用是在细胞表面介导的那些分子。本领域已知多种细胞毒素，包括抑制蛋白质合成的那些毒素以及抑制为细胞生长或存活所需的某些基因表达的那些毒素。毒素包括导致细胞死亡的那些毒素以及抑制细胞生长、增殖和/或分化或者另外有害地改变细胞代谢的那些毒素。例如，毒素包括但不限于核糖体失活蛋白(RIP)。当由细胞内化时，RIP改变细胞中的代谢或者基因表达，调节或改变蛋白质合成，抑制增殖，杀死细胞或者另外有害地影响细胞。对于本发明目的而言，毒素例如RIP蛋白如本发明提供的修饰的RIP蛋白是被靶向物质。当在标准条件下或者正常条件下培养表达毒素的细胞时，所述毒素以任意方式抑制宿主细胞生长和增殖或者干扰或有害地改变宿主细胞的细胞代谢。

如本文所用，在宿主细胞标准条件下生长是指在此条件下这种细胞正常生长以表达编码的蛋白质或者重组蛋白。

如本文所用，核糖体失活蛋白(RIP)是指在植物和细菌中表达的一类蛋白质，其是真核细胞和原核细胞蛋白质合成的强力抑制剂。RIP在输入细胞核中时还降解细胞DNA。RIP是N-糖苷酶或者多核苷酸：腺苷糖苷酶，且能失活核糖体和非核糖体核酸底物。

如本文所用，提及的RIP多肽是指呈现N-糖苷酶活性并且失活核糖体的任何多肽。这些多肽包括分离自天然来源的多肽以及例如通过重组方法、化学合成方法或者任何方法合成产生的那些多肽。它们还包括变体、野生型、物种和等位基因变体。举例的RIP包括但不限于任何I型或II型RIP，包括但不限于志贺毒素，包括志贺毒素1(Stx1)、Stx2、肥皂草毒蛋白6、大麦RIP I、大麦RIP II、多花白树毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、苦瓜毒蛋白I、苦瓜毒蛋白II、异株泻根毒蛋白I、异株泻根毒蛋白II、Pap-S、软瓜蛋白、天花粉蛋白、棒麦角素、相思豆毒蛋白-a、玉米RIP3、玉米RIP9、玉米RIP X、小麦毒蛋白、MAP、香石竹毒蛋白30、黑杆菌素b、黑杆菌素I、Ebulin、这些毒素的细胞毒性活性片段以及本领域技术人员已知的其它RIP。RIP多肽还包含RIP多肽的变体及其它修饰形式如突变蛋白。典型地，变体和修饰形式具有N-糖苷酶活性。变体包括例如等位基因变体和物种变体以及具有氨基酸残基插入或缺失的那些。举例的RIP蛋白的序列是包含具有SEQ ID NO：1、5、89-111任一所示氨基酸序列的氨基酸残基的任何序列以及其等位基因和/或物种变体及其具有至少40、50、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或更高的序列相同性、特别保留N-糖苷酶活性的类似物和修饰形式。举例的RIP变体包括本领域已知的或者本发明提供的任何变体，例如具有SEQ ID NO：3、6-21、162-169所示任一或多个氨基酸变化的RIP蛋白。

如本文所用，RIP多肽的“功能活性”或“活性”是指可评估的RIP多肽呈现的任何活性。这种活性可以在体外和/或在体内检测，包括但不限于N-糖苷酶活性和/或多核苷酸：腺苷糖苷酶活性，包括RNAase和DNAase活性。其它活性包括但不限于超氧化物歧化酶活性、磷脂酶活性、几丁质酶活性以及抗病毒活性。确定RIP多肽、其修饰形式或者其缀合物的活性的测定法为本领域技术人员所已知。例如，可以通过测定蛋白质合成、脱嘌呤作用和/或细胞生长/存活性评估活性。此外，所述多核苷酸：腺苷糖苷酶活性可以例如通过从用RIP多肽处理的细胞中纯化DNA以及通过用溴化乙锭染色观测加以评估。举例的评估RIP多肽如修饰的SA1多肽或者其缀合物的活性的测定法在此陈述或者在实施例2和实施例5中描述。

如本文所用，毒素的活性片段(与活性部分可互换使用)是指具有活性如毒性活性或者催化活性的片段。因此，所述片段是指毒素如RIP的催化活性片段以及保留毒素活性的片段。在提供修饰的毒素如修饰的志贺毒素的情况中，所述活性片段包括修饰。

如本文所用，变体毒素多肽如变体RIP统指如本文所述进行修饰以降低毒性之前的RIP。变体毒素是指与野生型不同的任何形式多肽，包括等位基因和/或物种变体、由剪接变体编码的多肽、和/或修饰形式、特别是在一级结构改变的变体。变体包括与野生型蛋白质相比含有氨基酸缺失、置换或者添加的那些变体。例如，SA1变体包括含有氨基酸突变的那些变体或者与相应于SEQ ID NO：5所示成熟A结构域的第1-251位氨基酸的野生型SA1相比是截短的那些变体以及其等位基因变体或物种变体。举例的截短是分别由SEQ ID NO：22和24所示的变体1和变体2。

如本文所用，物种变体是指不同物种中多肽的变体，包括不同细菌种如埃希氏菌属(Escherichia)和志贺氏菌属(Shigella)。

如本文所用，等位基因变体是指相同物种成员之中蛋白质变化。

如本文所用，未修饰的RIP多肽是指选择用于修饰的起始蛋白质。所述起始靶多肽可以是天然发生的、野生型多肽。此外，所述起始靶多肽可以预先改变或突变，由此其与天然野生型同种型不同，但是在此相对于随后本发明产生的修饰的蛋白质而称作起始未修饰的靶蛋白。因此，已知经修饰而与未修饰的参考蛋白相比具有希望的特定活性或性质的增加或降低的蛋白质可以用作起始未修饰的靶蛋白。对于本发明而言，未修饰的RIP多肽包括单独的RIP多肽、或者其活性片段、或者含有RIP多肽或其活性片段的缀合物。

如本文所用，“修饰的”或者“突变的”RIP多肽是指与参考起始蛋白或者未修饰的多肽如野生型多肽或者特定物种的其它起始RIP多肽包括其等位基因变体及其它变体相比在一级序列中具有一或多个修饰的多肽。所述修饰或突变改变毒性(即改变细胞中代谢或基因表达、调节或改变蛋白质合成、抑制增殖、杀死细胞或者另外有害地影响细胞的能力)。因此，修饰的或突变的RIP含有突变，包括任何RIP中氨基酸残基的插入和缺失，从而与起始RIP相比毒性降低。所述一或多个突变包括一或多个氨基酸置换(取代)、插入、缺失以及这些突变的组合。修饰的RIP多肽可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、1 8、19、20或更多个修饰的位置。通常，这些突变改变了RIP多肽的毒性和/或一或多种其它活性。这种修饰包括在本发明选择方法中鉴别的那些修饰。除了含有改变多肽毒性的修饰之外，修饰的RIP多肽也可含有其它修饰。修饰的RIP多肽与野生型或者起始未修饰的RIP多肽的氨基酸相应序列典型具有60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性。

如本文所用，志贺毒素是指最初分离自细菌、特别是志贺氏菌属及其它相关菌属的成员如痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)的RIP多肽。志贺毒素是多亚基蛋白，由一个A亚基和五个B亚基组成，所述A亚基裂解为A1和A2形成活性志贺毒素A1(SA1)部分。所述B亚基与A2部分连接，是志贺毒素进入细胞所必需的(Sandvig and van Deurs，EMBO J.，19：5943-50，2000)。在本发明提供的缀合物中，B亚基被进入细胞的靶向物质置换。因此，所述缀合物包括毒素亚基，特别是亚基A，更特别是其催化活性片段(SA1)或者活性片段。举例的志贺毒素A亚基的前体序列如SEQ ID NO：1所示，成熟序列如SEQ ID NO：5所示。所述催化活性A1片段(SA1)相应于SEQ ID NO：5所示序列的第1-251位氨基酸，A2片段相应于SEQ ID NO：5所示序列的第252-293位氨基酸。

志贺毒素也呈现等位基因和物种变化。举例的志贺毒素包括由志贺氏菌属物种以及等位基因和物种变体产生的那些毒素，例如但不限于在痢疾志贺氏菌、大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、嗜水气单胞菌(Aeromononas hydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromononas caviae)以及阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)中产生的那些毒素。举例的各种志贺毒素A链的前体或成熟形式的序列如SEQ ID NO：1、3、5和7-21所示。志贺毒素A链的其它变体如SEQ ID NO：6所示。

如本文所用，RIP多肽的“酶活性亚基”或者“催化活性亚基”或“活性亚基”是指多肽的介导毒性活性的部分。所述毒性活性可以是所述多肽的任何性质或活性，例如通过N-糖苷酶活性对rRNA的抑制活性或者对于DNA、mRNA或者病毒DNA或病毒RNA的脱嘌呤作用。例如，对于志贺毒素而言，所述活性部分是A1亚基(SA1)，其通过A亚基裂解为A1和A2片段而被激活。因此，志贺毒素A链的活性部分是A1亚基，也称作SA1。

志贺毒素以及任何RIP的活性部分为本领域所已知或者可以使用体外或体内活性测定法评估活性而根据经验加以鉴别(见例如Stirpe et al.，Bio/Technology 10：405-12，1992，及Sandvig and Van Deurs，Physiol.Rev.76：949-66，1996；Stirpe and Battelli，Cell Mol Life Sci.，63：1850-66，2006)。举例的RIP的A亚基在本文表3中描述，或者为本领域所已知或者可以由本领域技术人员鉴别。

如本文所用，RIP毒素的“活性部分”或者“活性片段”是指含有显示毒性活性的至少最低限度氨基酸残基的多肽。典型地，活性部分含有提供毒性活性所需的RIP多肽的连续氨基酸，如A亚基或者A1亚基的最低限度部分。活性片段和最低限度氨基酸残基可以根据经验确定，通过产生并检测RIP多肽A亚基或者A1亚基的N末端或C末端或者这两端的截短情况以确定显示活性的那些残基。活性可以通过本文描述的或者本领域已知的多种测定法评估，包括但不限于蛋白质合成测定、脱嘌呤测定或者细胞生长/存活性测定。活性可以是任何百分比的全长多肽活性(更多或更低)，包括但不限于与全长多肽相比1％的活性、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更高的活性。

典型地，RIP毒素的活性片段是截短的片段，其中缺少在多肽A链的N末端或C末端的大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或者15个氨基酸。举例的催化活性SA1亚基的活性片段或者志贺毒素的活性片段如SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示。

如本文所用，毒性是指分子包括肽、蛋白质、化合物或者其它分子改变细胞中代谢或基因表达、调节或改变蛋白质合成、抑制增殖、杀死细胞或者另外有害地影响细胞的能力。对于本发明，就RIP而言，毒性是指RIP或其亚基或者其片段在由细胞内化时改变细胞中代谢或基因表达、调节或改变蛋白质合成、抑制增殖、杀死细胞或者另外有害地影响细胞的能力。例如，RIP多肽或者其缀合物通过包括但不限于其N-糖苷酶活性和/或多核苷酸：腺苷糖苷酶活性等多种活性而呈现细胞毒性。

如本文所用，N-糖苷酶活性是指裂解核苷酸N-糖苷键的多肽酶。RIP多肽通过从核糖体rRNA中除去特定的腺嘌呤残基而呈现糖苷酶活性。这种活性导致蛋白质合成的抑制及随后通过阻止延伸因子与核糖体的结合而导致细胞死亡。

如本文所用，相应残基是指在对比位置(aligned loci)存在的残基。通过本领域技术人员已知的任何方法对相关多肽或者变体多肽进行对比。这种方法典型使匹配最大化，包括如使用人工对比或者使用可利用的多种序列对比程序(例如BLASTP)及本领域技术人员已知的其它方法。通过对多肽序列进行对比，本领域技术人员根据指导使用保守和相同的氨基酸残基可以鉴别相应的残基。例如，本领域技术人员意识到SEQ ID NO：5所示成熟志贺毒素A链的提及的位置与SEQ ID NO：1所示前体志贺毒素A链相比有22个氨基酸残基不同，这是由于存在信号序列所致。因此，在SEQ ID NO：1的第23位的氨基酸“相应于”SEQ ID NO：5的第一个氨基酸残基。此外，本领域技术人员也可以应用保守氨基酸残基根据指导发现在人和非人序列之间和之中的相应氨基酸残基。相应位置也可以基于结构对比，例如通过使用计算机模拟的蛋白质结构对比而进行。在其它情况中，可以鉴别相应区域。本领域技术人员也可以应用保守氨基酸残基根据指导发现在人和非人序列之间和之中的相应氨基酸残基。

如本文所用，“一级序列”是指多肽中的氨基酸残基序列。

如本文所用，术语“同源性”和“相同性”可互换使用，但蛋白质同源性可包括保守氨基酸改变。通常为了鉴别相应位置，对氨基酸序列进行对比以获得最高级别的匹配(见例如Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing： Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987以及Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；Carilloet al.(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。

如本文所用，“序列相同性”是指在测试多肽与参考多肽或多核苷酸的对比中相同氨基酸(或者核苷酸碱基)的数目。同源多肽是指预定数目的相同或同源氨基酸残基。同源性包括保守氨基酸取代以及相同残基。序列相同性可以通过标准对比算法程序确定，使用每个供应商确定的默认缺口罚分。同源核酸分子是指预定数目的相同或同源核苷酸。同源性包括不改变编码的氨基酸的取代(即沉默取代)以及相同残基。基本上同源的核酸分子典型在中等严格或者高度严格条件下在感兴趣的核酸全长或者在全长核酸分子的至少大约70％、80％或90％的长度杂交。本发明还包含含有简并密码子代替杂交核酸分子或者具有指定序列相同性的分子中的密码子的核酸分子。为了确定蛋白质同源性，可以对保守氨基酸以及相同氨基酸进行对比，在这种情况中，相同性百分比和同源性百分比有变化。任两个核酸分子是否具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或者99％“相同”的核苷酸序列(或者任两个多肽是否具有这样的氨基酸序列)可以通过使用已知计算机算法如“FAST A”程序使用例如默认参数进行确定，如Pearson etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)所述(其它程序包括GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(I)：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.，et al.，J.Molec.Biol.215：403(1990)；Guide to Huge Computers，Martin J.Bishop，ed.，Academic Press，San Diego(1994)，以及Carillo et al.SIAM J Applied Math 48：1073(1988))。例如，美国国家生物技术信息中心数据库的BLAST可用于确定相同性。其它可商购或者可公开获得的程序包括DNAStar“MegAlign”程序(Madison，WI)以及Universityof Wisconsin Genetics Computer Group(UWG)“Gap”程序(Madison WI))。蛋白质和/或核酸分子的同源性或者相同性百分比可以例如通过使用由Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482(1981))修正的GAP程序(例如Needleman et al.J.Mol.Biol.48：443(1970)所述)对比序列信息而确定。简而言之，GAP程序定义相似性是相似的对比符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列较短序列中符号总数。GAP程序的默认参数可包括：(1)一元对比真值表(相同值为1，不同值为0)以及Gribskov et al.Nucl.Acids Res.14：6745(1986)的加权对比真值表，如Schwartz and Dayhoff，eds.，Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358(1979)所述；(2)每个缺口罚分3.0以及每个缺口中每个符号额外0.10罚分；及(3)末端缺口没有罚分。

如本文所用，术语“相同性”表示测试多肽与参考多肽或多核苷酸之间的对比。在一个非限制性实例中，“至少90％相同”是指与参考多肽的相同性百分比为90-100％。在90％或更高水平的相同性表示这样的事实，即为了举例说明而假定对比长度为100个氨基酸的测试与参考多核苷酸，则测试多肽中不超过10％(即100个中的10个)的氨基酸与参考多肽的氨基酸不同。在测试与参考多核苷酸之间可以进行相似的对比。这种差异可以以随机分布于氨基酸序列全长的点突变表示，或者它们聚集在不同长度直至最大允许长度的一或多个位置，例如10/100氨基酸差异(大约90％相同性)。差异定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。在高于大约85-90％的同源性或相同性水平，结果应与程序和缺口参数设置无关；这种高水平相同性可易于评估，通常不依赖于软件。

如本文所用，也应理解术语“基本上相同”或者“相似”根据相关领域技术人员的理解而有所不同，但是技术人员可以进行评估。

如本文所用，“选择方法”是指其中基于特定属性、性质或活性鉴别蛋白质的任何方法。对于本发明而言，在本发明所述选择方法中鉴别的RIP多肽或者其活性片段包括与未修饰的或者起始蛋白质相比展示降低的毒性的那些多肽。

如本文所用，通过重组方法产生是指使用重组DNA方法表达重组多肽。这种方法为本领域技术人员所熟知，典型包括表达克隆的DNA编码的蛋白质的分子生物学方法。

如本文所用，“增加的产量”是指与不存在RIP抑制剂的条件相比在存在RIP抑制剂的条件下产生的RIP的量，如mg/l或者绝对量。

如本文所用，就细胞而言“分离的”是指细胞、细胞集落或者细胞群与其它细胞集落或者细胞群分开。分离可以通过分离细胞的任何方法实现，例如铺板条件、纯化技术如使用磁珠，特别的细胞特性如粒度或者其它相似技术。例如，分离可以通过将细胞培养物如细菌细胞培养物的样品在使每个存活细胞生长并形成细胞集落的条件下铺板或涂布于营养琼脂表面上而实现。可以优化铺板条件，例如稀释细胞培养物，由此以离散的集落检测单细胞集落。可以单独地挑取或者选择细胞或者细胞集落作为单细胞。

如本文所用，就核酸分子或多肽或者其它生物分子而言“分离的”是指核酸或者多肽已经与获得所述多肽或核酸或细胞的遗传环境分开。其也可以意味着从天然状态中改变。例如，如该术语在本文所用，在活的动物中天然存在的多核苷酸或者多肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料分开的相同多核苷酸或者多肽是“分离的”。因此，在重组宿主细胞中产生的和/或包含于其中的多肽或多核苷酸被认为是分离的。也认为“分离的多肽”或者“分离的多核苷酸”是已经从重组宿主细胞或者从天然来源部分或者基本上纯化的多肽或多核苷酸。例如，重组产生的化合物可以通过如Smith et al.，Gene，67：31-40(1988)所述一步法基本上纯化。术语“分离的”与“纯化的”可以互换使用。

因此，“分离的”是指所述核酸不含在生物体天然存在的基因组中(如果有的话)位于编码感兴趣的核酸的基因两侧的那些基因的编码序列。分离的DNA可以是单链或者双链的且可以是基因组DNA、cDNA、重组杂交DNA或者合成DNA。其与起始DNA序列可以相同或者由于缺失、添加或者取代一或多个核苷酸而与起始序列不同。

如本文所用，从生物细胞或者宿主中制成的“纯化”制备物是指含有指定DNA或者蛋白质的细胞提取物、包括感兴趣的DNA或蛋白质的粗提物的至少纯度。例如，在蛋白质的情况中，纯化的制备物可以通过一种技术或者一系列制备或生物化学技术获得，这些制备物中可以存在不同纯度的感兴趣的DNA或蛋白质。所述技术方法包括但不限于硫酸铵分级分离、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、密度梯度离心以及电泳。

如本文所用，“基本上纯的”或者“分离的”DNA或者蛋白质制备物是指这样的制备物，其基本上没有在天然状态与所述DNA或蛋白质通常相关联的天然存在的材料并且通常含有5％或更低的其它污染物。

如本文所用，含有感兴趣的DNA或蛋白质的细胞提取物是指得自表达所述蛋白质或者含有感兴趣的DNA的细胞的均质制备物或者无细胞制备物。术语“细胞提取物”意在包括细胞培养基，尤其是已经从中除去细胞的耗竭培养基(spent culture medium)。

如本文所用，“选择剂”是指细胞或细胞群对其敏感或易感的任何因子，根据敏感性可用于鉴别呈现对所述选择剂抗性的细胞或者对于所述选择剂对于细胞的作用有抗性的细胞。典型地，选择剂与表达系统组合使用以选择赋予宿主细胞对于特异选择剂的抗性的表达的多肽。举例的选择剂是抗生素。

如本文所用，“选择调节剂”或“调节选择的物质”是指选择方法中使用的任何因子或物质，其改善或者增加选择特定属性、性质或活性如重组多肽的属性、性质或活性的能力。对于本发明而言，调节选择的物质可用于选择方法中以改善呈现改变的毒性的RIP多肽或者其活性片段的选择。举例的选择调节剂是RIP抑制剂。例如，RIP抑制剂如腺嘌呤类似物降低或者减弱RIP对于宿主细胞的毒性，从而使得RIP在宿主细胞中表达。所选择的选择调节剂、其浓度以及保温时间是可以影响选择调节剂增强针对属性、性质或活性进行选择的能力的因素。选择调节剂因此与选择剂不同。

如本文所用，“诱导剂”是指用于引起重组蛋白在宿主细胞中表达的任何因子。可以用作诱导剂的因子包括但不限于温度改变或者施用小分子、肽或者多肽。诱导剂的选择依赖于用于重组蛋白质表达的宿主细胞以及用于表达蛋白质的特定启动子。本领域技术人员熟知各种各样的诱导剂。例如，在pET表达系统中，基因表达所需的T7 RNA聚合酶在IPTG-可诱导的T7启动子的控制下。蛋白质表达在用含有克隆的基因的pET载体转化的宿主细胞、特别是大肠杆菌BL21(DE3)细胞中不发生，直至通过IPTG诱导才表达。

如本文所用，RIP抑制剂是抑制RIP多肽活性的任何化合物，例如肽、多肽、寡核苷酸或者其它分子或条件。典型地，RIP抑制剂包括抑制RIP多肽的N-糖苷酶活性的任何抑制剂。因此，RIP抑制剂是降低RIP多肽活性的任何物质、多肽或者其它分子。这种物质为本领域所已知，包括降低RIP多肽活性的任何物质。举例的RIP抑制剂是4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(4-APP)。

如本文所用，当用于描述RIP抑制剂时“有效抑制RIP多肽的毒性”是指在存在所述抑制剂的条件下，RIP多肽无活性或者保留很少的活性或者当在存在RIP抑制剂的条件下保温时其活性降低。例如，毒性被抑制的RIP多肽与在不存在RIP抑制剂的条件下RIP多肽的毒性活性相比毒性呈现50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的降低。

如本文所用，“保留毒性活性”是指RIP多肽或者其活性部分呈现RIP多肽活性，这个活性与野生型、起始或者参考形式的RIP多肽活性相比典型降低。对于本发明而言，如果其足以呈现对核糖体、DNA、mRNA、tRNA或者靶宿主细胞的毒性活性则认为活性得以保留。例如，如果RIP多肽或者其活性部分与野生型、起始或者参考RIP多肽相比显示至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高的活性，则认为其保留活性。RIP或者其它毒素可以显示活性显著降低，甚至低于其原始活性的1％，只要含有这种RIP的缀合物对于治疗是有效的。

如本文所用，缀合物是指本发明提供的分子，其包括与一或多个被靶向物质直接或者间接连接的一或多个靶向部分，所述被靶向物质是修饰的RIP毒素。这些缀合物在本文也被称作配体-毒素缀合物，包括例如白细胞群调节剂(LPM)。这种缀合物包括融合蛋白、通过化学缀合产生的那些缀合物以及通过任何其它方法产生的那些缀合物，由此至少一种修饰的毒素与靶向物质直接或间接连接，在与细胞表面受体结合时毒素被靶向的细胞内化。

如本文所用，白细胞群调节剂(LPM)是配体-毒素缀合物，其中靶向物质是多肽部分，其足以使得所述缀合物靶向在细胞上表达的一或多种趋化因子受体，从而导致其连接的或者其它方式关联的被靶向物质内化。通常，所述LPM的多肽部分是趋化因子配体、其片段或者等位基因或物种或剪接变体，其使得所述缀合物靶向一或多种趋化因子受体。典型地，通过细胞表面表达的趋化因子受体，这种缀合物靶向一种或一种以上的白细胞。

如本文所用，融合蛋白是指含有至少两种多肽成分如靶向部分(即趋化因子)和被靶向物质毒素以及任选含有肽或多肽接头的多肽。这种蛋白质可通过在宿主细胞中表达编码所述缀合物的核酸而产生。

如本文所用，被靶向物质是通过如本文所述连接靶向部分而内化、且在内化时以一些方式改变或影响细胞代谢、生长、活性、存活性或者细胞的其它性质或者特性的任何物质。本文所述被靶向物质是修饰的毒素。本发明提供的被靶向物质的例子是SA1或者其活性片段，包括修饰的SA1多肽。

如本文所用，靶向被靶向物质是指通过将所述物质与靶向部分连接而使其靶向表达所选择的受体的细胞。在与受体结合时，所述被靶向物质或者与受体结合部分连接的被靶向物质由所述细胞内化。

如本文所用，“免疫细胞”或者“免疫效应细胞”是指作为免疫系统的一部分帮助机体防御感染性疾病和外来异物的任何细胞。这种细胞包括在血液、淋巴系统以及在其它机体组织中发现的那些细胞。这些细胞包括但不限于白细胞及其它组织居留细胞如kupffer细胞、小胶质细胞、尘细胞或者其它组织相关免疫细胞。

如本文所用，白细胞是指在机体的宿主免疫防御系统中起作用的白细胞。白细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、天然杀伤细胞、粒细胞(嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜中性粒细胞)和淋巴细胞(B和T淋巴细胞)。

如本文所用，组织居留细胞(TRC)是指居留在或者特异于特定组织或器官的特化细胞。许多组织居留细胞在机体免疫防御中起作用，特别是对于特定组织。这种TRC包括肝kupffer细胞、脑小胶质细胞和肺的尘细胞。

如本文所用，就免疫细胞或白细胞而言活化的细胞是指受刺激时与未受刺激的细胞相比呈现改变的基因表达谱(profile)的细胞。典型地，这种细胞分泌或者产生或者上调可溶的或者细胞表面结合的肽或多肽介质的表达，所述介质例如是炎症或者其它免疫介质，例如细胞因子、趋化因子或者其它化学信使蛋白或者其受体，其表达或者产生与刺激之前相比更强。

如本文所用，靶向物质是指任何细胞结合配体多肽或者其一部分，其通过结合细胞表面受体结合靶细胞及随后由细胞内化。靶向物质是促进被靶向部分内化的任何物质。因此，靶向物质是结合内吞细胞表面受体的任何物质。靶向部分可包括结合任何细胞受体或细胞配体的任何多肽或者其一部分，只要所述多肽在结合细胞表面分子之后由所述细胞内化即可。例如，靶向部分包括但不限于抗体、生长因子、细胞因子、趋化因子等。举例的靶向物质是靶向趋化因子受体的那些物质。

如本文所用，趋化因子受体是与天然发生的蛋白质的趋化因子家族成员特异性相互作用并将其转运至携带这种受体的细胞中的受体。这些包括但不限于CXC趋化因子结合的受体(CXCR1-7，包括CXCR3A和CXCR3B)以及CC趋化因子结合的受体(CCR1-10，包括CCR2A和CCR2B)以及任何趋化因子特异性结合并促进连接的被靶向物质内化的任何其它受体。

如本文所用，趋化因子受体靶向物质是指特异性结合细胞上的趋化因子受体并且导致连接的或者另外关联的被靶向物质内化的任何分子或配体。趋化因子受体结合部分包括但不限于能结合趋化因子被靶向的细胞表面蛋白、且能促进含有配体的融合蛋白由细胞内化的任何多肽。这种多肽包括趋化因子、抗体或者其片段，只要所述多肽结合一或多种趋化因子受体且导致任何连接的被靶向物质内化即可。有效结合一或多种趋化因子受体并且使得连接的被靶向物质内化的多肽如趋化因子或抗体的片段或部分的鉴别可以根据经验进行，通过使用本文所述或者本领域技术人员已知的任何测定法检测例如通过测试与胞毒剂连接的片段并且寻找细胞死亡进行鉴别。因此，趋化因子受体靶向物质包括经鉴定并称作趋化因子的所有肽，包括但不限于本文所述类别及其截短形式和部分，其足以使得连接的被靶向物质靶向全长趋化因子特异性结合的细胞表面受体或者蛋白质并且促进或者使得由其上存在所述受体或蛋白质的细胞内化。

如本文所用，术语“细胞因子”是指这样的多肽，包括白细胞介素、趋化因子、淋巴因子、单核因子、集落刺激因子、生长因子、脂肪因子(adipokine)和受体相关蛋白及其功能片段。对于本发明而言，非趋化因子细胞因子是指所有细胞因子、更特别是经典细胞因子且不包括趋化因子，其具有其它(经典)细胞因子通常不具备的化学引诱及其它活性。然而，由本领域技术人员识别并且在下文论述的趋化因子是一类独特的多肽。

如本文所用，趋化因子是指由细胞分泌的促进附近细胞运动或者趋化性的小蛋白质家族。一些趋化因子被认为是促炎的且可以在免疫应答期间被诱导，而其它趋化因子被认为是稳态的。典型地，趋化因子通过结合一或多种趋化因子受体而发挥其化学引诱功能及其它功能。趋化因子包括分离自天然来源的蛋白质以及通过重组方式或者通过化学合成法合成产生的那些。举例的趋化胞因子(在SEQ ID NO：112-161中示出)包括但不限于MCP-1、Eotaxin、SDF-1β、GRO-α、MIP-1β、IL-8、IP-10、MCP-3、MIP-3α、MDC、MIP-1α、BCA-1、GCP-2、ENA-78、PBP、MIG、PF-4、PF-4var1、SDF-2、MCP-2、MCP-4、MIP-4、MIP-3β、MIP-2α、MIP-2β、MIP-5、HCC-1、RANTES、Eotaxin-2、TARC、I-309、淋巴细胞趋化因子、Lungkine、C10、MIP-1γ、MCP-5、LEC、Exodus-2、MIP-3、TECK、Eotaxin-3、CTACK、MEC、SCM-1β、I-TAC、BRAK、SR-PSOX、CXXXC趋化因子、LD78-β、MIP-1b2及本领域技术人员已知的其它趋化因子。提及趋化因子典型包括这种趋化因子的单体形式。趋化因子还包括二聚体或者其它多聚体形式。

趋化因子包含趋化因子的变体或突变蛋白，所述变体或突变蛋白具有使得连接的被靶向物质靶向携带趋化因子-受体的细胞的能力。本发明也包含在用于所述缀合物中作为靶向物质的趋化因子突变蛋白。这种突变蛋白可具有保守氨基酸改变，例如下表1中示出的那些。除非通过置换简并密码子修饰，否则编码这种突变蛋白的核酸在至少低严格条件下与DNA杂交，通常在高严格条件下与编码野生型蛋白质的DNA杂交。所述蛋白质的突变蛋白和修饰物也包括但不限于较少的等位基因或者物种变异以及残基的插入或缺失。举例的趋化因子变体在SEQ ID NO：170-191中示出。合适的保守和非保守氨基酸取代为本领域技术人员所已知，通常可以不用改变所得分子的活性而产生。本领域技术人员意识到在多肽的非必需区域中的单氨基酸取代通常不明显改变活性(见例如Watson et al.Molecular Biologyof the Gene，4th Edition，1987，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。可以根据如下所示产生这种取代：

表1

也可允许其它取代且可以根据经验或者已知的保守或非保守取代确定。所述多肽的任何这种修饰均可以通过本领域技术人员已知的任何方式实现。

如本文所用，趋化因子的一部分是指趋化因子的片段或一段(piece)，其单独或者与另一片段或者趋化因子单体形成二聚体足以结合趋化因子受体以使得连接的被靶向物质内化。本领域技术人员已知鉴别趋化因子和趋化因子活性、特别是趋化活性的各种体外测定法(见例如Walz et al.(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.149：755鉴别嗜中性粒细胞的趋化性，Larsen et al.(1989)Science 243：1464；以及Carr et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：3652测定淋巴细胞的趋化性；也见国际PCT申请No.WO99/33990，其描述了鉴别趋化因子的多种测定法以及例示方法)。这些测定法可用于鉴别趋化因子、修饰的趋化因子以及其活性片段。如本文所述的以及本领域技术人员已知的结合测定法可用于鉴别特异性识别趋化因子受体的部分，细胞毒性测定法可用于鉴别也使得连接或者关联的被靶向物质内化的那些部分。

如本文所用，编码趋化因子肽或者多肽的核酸是指本文所述的编码这种肽的任何核酸片段，本领域技术人员已知的任何这种核酸片段，编码结合趋化因子受体并从而被内化的趋化因子并可以使用任何前述核酸片段作为探针从人细胞文库中分离的任何核酸片段或者编码任何已知的趋化因子肽的任何核酸片段，包括SEQ ID NO：112-161、170-191所示那些片段以及可以通过简并密码子取代从任何前述核酸片段中产生的任何DNA片段。应理解一旦本领域技术人员可获得肽如趋化因子肽的完整的氨基酸序列及编码这种肽的一个核酸片段，则可常规取代简并密码子并且产生编码这种肽的任何可能的核酸片段。通常也可以基于氨基酸序列合成编码这种肽的核酸。

如本文所用，接头是连接靶向物质(即趋化因子多肽)与被靶向物质的肽或其它分子。如果所述物质是多肽或者肽，则接头可以通过被靶向物质的N末端或者C末端或者每一端典型大约20个氨基酸内的附近内部残基结合。典型地，在被靶向物质是趋化因子的情况中，连接是在C末端。本发明所用接头可以仅连接所述缀合物的成分以增加所述缀合物的胞内可利用性、血清稳定性、特异性和可溶性或者提供所述缀合物增加的挠性或者减少位阻。例如，被靶向物质的特异性或者胞内可利用性可以通过包含接头而赋予，所述接头是某些蛋白酶如在肿瘤细胞中以高于在正常细胞中的水平存在的蛋白酶的底物。

如本文所用，肽和/或多肽是指聚合物或者称作多肽，其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或者D-光学异构体，优选L-异构体。此外，也包括非天然的氨基酸如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。通常遇到的非基因编码的氨基酸也可以用于本发明提供的配体-毒素嵌合物中，但优选可编码的氨基酸。

如本文所用，在本文所述各个氨基酸序列中存在的“氨基酸”是根据其熟知的三字母或者单字母缩写形式识别的(见表1)。在各个DNA片段中存在的核苷酸以本领域常用的标准单字母名称命名。

如本文所用，“氨基酸”是含有氨基基团和羧基基团的有机化合物。多肽含有两或多个氨基酸。对于本发明而言，氨基酸包括二十种天然发生的氨基酸、非天然氨基酸以及氨基酸类似物(例如其中α-碳具有侧链的氨基酸)。

如本文所用，“氨基酸残基”是指多肽在其肽键位置发生化学消化(水解)而形成的氨基酸。本文所述氨基酸残基通常是“L”异构体形式。“D”异构体形式的残基可以由任何L-氨基酸残基取代，只要所述多肽保留希望的功能性质即可。NH2是指在多肽的氨基末端存在的游离氨基基团。COOH是指在多肽的羧基末端存在的游离羧基基团。与J.Biol.Chem.，243：3552-59(1969)以及采用的37 C.F.R.§§.1.821-1.822所述的标准多肽命名法一致，氨基酸残基缩写在表2中示出。

表2：对应表

在本文由化学式表示的所有氨基酸残基序列从左至右方向是从氨基末端至羧基末端的常规方向。此外，短语“氨基酸残基”广泛地包括对应表(表2)中列出的氨基酸以及修饰的、非天然的和不寻常的氨基酸，例如37 C.F.R.§§1.821-1.822中提及的且并入本文作参考的那些氨基酸。此外，应注意在氨基酸残基序列的起始或末端的破折号表示与另外的一或多个氨基酸残基的序列或者与氨基末端基团如NH₂或者与羧基末端基团如COOH的肽键。

如本文所用，“天然发生的氨基酸”指在多肽中存在的20种L-氨基酸。

如本文所用，术语“非天然氨基酸”指具有与天然氨基酸相似的结构、但是为了模拟天然氨基酸的结构和反应性而在结构上进行修饰的有机化合物。非天然发生的氨基酸因此包括例如除了所述20种天然发生的氨基酸之外的氨基酸或者氨基酸类似物，包括但不限于氨基酸的D-isostereomer。举例的非天然氨基酸是为本领域技术人员所已知的那些。

如本文所用，载体或质粒是指用于将异源DNA导入细胞以使得所述异源DNA表达或者克隆的异源DNA复制的独立元件。这种载体和质粒的选择和应用为本领域技术人员所熟知。

如本文所用，表达是指核酸被转录为mRNA以及翻译成肽、多肽或者蛋白质的过程。如果核酸衍生自基因组DNA，如果选择合适的真核宿主细胞或生物体，则表达可包括mRNA的剪接。

如本文所用，表达载体包括能表达与调节序列如启动子区可操纵地连接的DNA片段的载体，所述调节序列能使得这种DNA片段表达。因此，表达载体是指重组DNA或者RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或者其它载体，在导入合适的宿主细胞时导致克隆的DNA表达。合适的表达载体为本领域技术人员所熟知，包括能在真核细胞和/或原核细胞中复制的那些以及保持为附加体或者可以整合进宿主细胞基因组中的那些。

如本文所用，术语“编码表达多肽的核苷酸序列”是指当被转录及随后翻译所得mRNA时产生所述多肽的序列。

如本文所用，术语“表达控制序列”是指这样的核酸序列，其调节与其可操纵地连接的核酸序列的表达。当表达控制序列控制并调节核酸序列的转录以及合适时核酸序列的翻译时，认为所述表达控制序列与核酸序列是可操纵地连接的。因此，表达控制序列可包括合适的启动子、增强子、转录终止子、在蛋白质编码基因前面的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号及蛋白质编码基因的正确读框以允许mRNA的正确翻译的维持以及终止密码子。此外，可以包含编码荧光指示多肽如绿色或蓝色荧光蛋白的DNA序列以选择阳性克隆(即表达希望的多肽的那些宿主细胞)。

如本文所用，“宿主细胞”是指这样的细胞，载体可以在其中增殖以及其核酸被表达。该术语还包括对象宿主细胞的任何后代。应理解所有后代与亲代细胞可以不相同，因为在复制期间可能发生突变。当使用术语“宿主细胞”时包含这种后代。

如本文所用，分泌信号是指前体蛋白质内的肽区域，其指导前体蛋白从宿主细胞质分泌至周质空间或者胞外生长培养基中。这种信号可以位于前体蛋白的氨基末端或者羧基末端。优选的分泌信号与氨基末端连接并且与其连接的蛋白质可以是异源的。典型地，信号序列在转运期间通过细胞分泌途径被裂解。裂解不是精确定位所必需或者需要的，只要分泌的蛋白质保留其希望活性即可。

如本文所用，转染是指DNA或RNA由宿主细胞摄取。转化是指以一定方式进行的这个过程，由此DNA可以作为宿主染色体外元件或者作为宿主染色体DNA的一部分而复制。完成转染和转化的方法和手段为本领域技术人员所熟知(见例如Wigler et al.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA76：1373-1376；Cohen et al.(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2110)。

如本文所用，术语“功能片段”是指这样的多肽，其具有可以通过指定功能测定法鉴别且与细胞或者细胞机制或细胞活性中特定的生物学、形态学或者表型改变相关的活性。

如本文所用，活性是指多肽在体外和/或在体内呈现的任何活性。

如本文所用，生物学活性是指在体内施用化合物如本发明提供的缀合物、组合物或者其它混合物时产生的所述化合物的体内活性或者生理学应答。因此，生物学活性包含这种化合物、组合物和混合物的治疗作用和药物活性。然而，这种生物学活性可以参考在如指定测定法中测量的体外活性而定义。因此，例如趋化因子单体、二聚体或其片段或者趋化因子单体和片段的其它组合的生物学活性是指所述趋化因子结合具有趋化因子受体的细胞并且使连接的物质内化的能力。这种活性典型在体外评估，通过将趋化因子(二聚体、单体或片段)与细胞毒性物质如修饰的志贺毒素A1亚基连接，将具有趋化因子受体的细胞如白细胞与所述缀合物接触并且评估细胞增殖或者生长情况而进行。这种体外活性应推广到体内活性。本文提及和描述了许多动物模型。

如本文所用，术语生物学活性的或者提及由靶向物质组成的缀合物如含有趋化因子和被靶向物质如修饰的志贺毒素A1亚基的缀合物的生物学活性是指这种多肽通过在体内或体外失活核糖体而酶促抑制蛋白质合成的能力或者在含有毒素的多肽由细胞内化时抑制细胞生长或者杀死细胞的能力。这种生物学活性或者细胞毒性活性可以通过本领域技术人员已知的任何方法测定，包括但不限于测量蛋白质合成的体外测定法和测量检测化合物对于细胞增殖或者对于蛋白质合成的作用而评估细胞毒性的体内测定法。然而，特别优选在被靶向细胞中评估细胞毒性的测定法。

如本文所用，与被靶向受体特异性结合是指与所述受体以足够亲和性结合以实现内化。典型地，所述结合亲和性(Ka)是10⁷l/mol、10⁸l/mol或更高。

如本文所用，与受体结合是指配体特异性识别以及特异性结合或者可检测地结合(如通过标准体外测定法测定)这种受体的能力。例如，结合测量趋化因子缀合物、趋化因子单体或者其它趋化因子受体靶向物质识别已知表达这种趋化因子受体的细胞上的趋化因子受体的能力。这种细胞包括细胞系或者各种原代白细胞亚型，例如但不限于小胶质细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、天然杀伤细胞、B细胞、肥大细胞、树突细胞和T细胞，或者其它组织居留细胞，或者这种细胞的活性形式，使用充分描述的配体-受体结合测定、趋化性测定、组织病理学分析、流式细胞术以及聚焦显微镜分析以及本领域技术人员已知和/或本发明举例说明的其它测定法。

如本文所用，培养是指在有益于其生长的培养基中细胞以及其所有传代培养物的增殖。术语“传代培养物”是指从另一培养细胞(原始培养物(source culture))生长的细胞培养物或者原始培养物的任何传代培养物，不考虑在感兴趣的传代培养物与原始培养物之间进行传代培养的次数。术语“培养”是指这种培养物增殖的过程。

如本文所用，组合物是指两或多种产物或化合物(例如制剂、调节剂、调节物等)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊、水溶液、非水溶液配制品或者其任一组合。

如本文所用，组合是指两或多个物品的任何联合。

如本文所用，化合物治疗特定疾病的有效量是足以改善或者以一些方式减轻疾病相关症状的量。这种量可以以单剂量施用或者可以根据治疗方案施用，从而达到有效治疗。所述量可以治愈疾病，但是典型地被施用以改善疾病症状。可能需要重复施用以达到所需的症状改善。

如本文所用，所述缀合物的药物可接受的盐、酯或者其它衍生物包括可以由本领域技术人员利用已知用于这种衍生化和产生可以给动物或人施用而基本上无毒性作用且是药物学活性的或者是前体药物的化合物的方法容易地制备的任何盐、酯或衍生物。

如本文所用，治疗是指病症、失调或者疾病的症状得以改善或者另外有益地改变的任何方式。治疗也包含本发明所述组合物的任何药物学应用。

如本文所用，通过施用特定药物组合物而使得特定疾病的症状改善是指归因于施用所述组合物或者与之相关的任何症状减轻，无论是持久还是暂时、永久或短暂减轻。

如本文所用，术语“对象”是指动物，包括哺乳动物如人。

如本文所用，患者是指人对象。

如本文所用，术语“抗体”包括能结合表位决定簇的完整分子以及其功能片段如Fab、F(ab′)2和Fv。这些功能性抗体片段保留一些选择性结合其各自抗原或者受体的能力，如下文定义：

(1)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可以通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体产生完整轻链和一条重链的一部分而产生；

(2)Fab′，可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体及随后还原以产生完整轻链和重链一部分而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab′片段；

(3)F(ab′)2，可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体及随后不还原而获得的抗体片段；F(ab′)2是两个Fab′片段通过两个二硫键连接在一起的二聚体；

(4)Fv，定义为遗传工程化的片段，含有以两个链表达的轻链可变区和重链可变区；

(5)单链抗体(SCA)，遗传工程化的分子，含有轻链可变区和重链可变区，通过合适的多肽接头连接，作为经遗传融合的单链分子。

产生这些片段的方法为本领域所已知(见例如并入本文作参考的Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York，1988所述)。

如本文所用，术语“表位”是指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇含有化学活性的表面分子基团如氨基酸或者碳水化合物侧链且通常具有特异的三维结构特性以及特异的电荷特性。

如本文所用，除非特别明确指出，则单数形式“一个”和“所述”包括复数。因此，例如对于化合物而言，“包含一个胞外结构域”包括具有一或多个胞外结构域的化合物。

如本文所用，范围和量可以以“大约”的特定值或范围表示。“大约”也包括精确值。因此，“大约5个碱基”是指“大约5个碱基”以及“5个碱基”。

如本文所用，“任选”是指随后描述的事件或者情况发生或不发生，该描述包括其中所述事件或情况发生的情况以及不发生的情况。例如，任选取代的基团是指该基团未被取代或者被取代。

如本文所用，除非特别指出，关于任何保护基团、氨基酸及其它化合物的缩写是根据其通用法、公认缩写或者根据IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature(1972)Biochem.，11：942-944所述而定。

B.核糖体失活蛋白(RIP)，其选择、表达和产生

本发明提供了选择、鉴别、纯化和/或分离具有降低毒性的核糖体失活蛋白(RIP)毒素的方法，所得的修饰的RIP以及表达RIP和修饰的RIP及其缀合物的方法。毒性被降低至足以增加蛋白质的表达，但是RIP仍保留足够的活性以发挥治疗作用(抑制或杀死细胞)。由于RIP是如此毒性的，因此活性降低10-、100-、1000-倍或更多基本上不影响所述毒素在缀合物中作为毒素抑制或杀死细胞或者影响细胞代谢的应用。

本发明提供的方法应用RIP抑制剂如4-氨基吡唑并[3，4-d]-嘧啶(4-APP)调节RIP毒素的选择以及增加其高产量生产。本发明还提供了含有全部或足以发挥毒性活性的修饰的RIP的部分的配体-毒素缀合物，例如本发明提供的任一种。选择的修饰的RIP以及含有修饰的RIP的缀合物对于宿主细胞的毒性降低，导致表达后蛋白质产物的产量增加。增加的产量与固有毒性降低和/或用4-APP对活性的抑制相关，如下文描述。

RIP是这样的毒素，其通过对真核细胞和原核细胞核糖体RNA(rRNA)的脱嘌呤作用导致蛋白质合成抑制，从而促进细胞毒性和死亡。通常，RIP包括蓖麻毒蛋白和志贺毒素对于真核细胞核糖体具有毒性活性。然而，一些RIP可以攻击真核细胞和原核细胞核糖体。这些包括例如志贺毒素，其对于大肠杆菌细胞具有毒性(Skinner and Jackson，Microb.Pathol.，24：117-22，1998；Suh et al.(1998)Biochemistry 37：9394-8)。因此，RIP的表达以及因此其高产量蛋白质产生通常受到RIP对于用于重组蛋白质表达的原核宿主细胞或真核宿主细胞或者这二者的细胞毒性作用的制约。

鉴于RIP对于真核细胞具有一般毒性，RIP或者含RIP的缀合物典型在大肠杆菌中产生。例如，一些含有RIP的融合蛋白先前已经在大肠杆菌中表达。这些融合蛋白包括例如与作为毒性部分的肥皂草毒蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白或者志贺毒素的融合蛋白。通常获得相对低水平的表达。在一些情况中，这是由于释放足量的毒素以干扰细胞生存力的渗漏启动子系统所致。已经应用了优化表达的策略。

通常，诱导系统用于抑制表达，直至宿主细胞已经充分生长。这使得紧密控制的方式可以使得转化的细胞在毒素诱导开始杀死宿主培养物之前充分生长，从而限制RIP毒素的过量产生。例如，一种生产毒素或者其缀合物的标准方法是在通过异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之后、在T7晚期启动子控制下在转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达而进行。在这个系统中，RIP或其缀合物的表达已经使用BL21(DE3)pLysS细菌细胞进一步优化，其在无诱导情况中强力抑制从pET载体中的表达(Joshi et al.(2005)，Prot.Exp.Purif.，39：189-198)。在这两个系统中，所得蛋白质以与包涵体相关形式保持在胞内且在纯化时需要变性和复性程序(Barth et al.(2000)AppEnviron.Microbiol，66：1572-1579)。也可以使用其它诱导系统。例如，紫茉莉属抗病毒蛋白(MAP)基因已经在温度调节的启动子控制下表达，从而MAP基因的表达通过在\88-10992对数期通过使培养温度从30℃升高至42℃而诱导。通常即使使用这种可诱导系统，RIP对于宿主细胞也可以是毒性的。在一些情况中，不能获得转化体或者转化体生长非常不好，这表示所述可诱导系统是渗漏的和/或所述产物的毒素部分是造成杀死宿主细胞的因素。

也已经应用了其它策略增加活性蛋白质的表达和/或产量。在一个实例中，可以设计表达载体以实现蛋白质产物从宿主胞质溶胶中即时分泌以降低对于宿主细胞核糖体的毒性作用。例如，对于大肠杆菌分泌蛋白质而言，需要一个信号序列。OmpA是大肠杆菌中的主要外膜蛋白，其由大肠杆菌细胞大量产生和分泌(Habuka et al.(1990)J.Biol.Chem.，265：10988-10992)。因此，MAP蛋白的分泌和产生已经通过使大肠杆菌OmpA的信号序列与编码MAP的序列可操纵地连接而实现。在其它情况中，RIP或者含有RIP的缀合物已经通过使用其它细菌表达系统表达，所述系统例如是指导毒素周质表达的系统。与细菌细胞质相反，细菌周质是非还原环境，使得一些蛋白质的天然构象所需的二硫键形成。尽管这种策略对于需要二硫键形成的那些蛋白质是有益的，但是蛋白质在周质环境中的不可溶性可以影响蛋白质产量并从而在表达和纯化期间需要使用相容的溶质(Barth et al.(2000)App Environ.Microbiol，66：1572-1579)。RIP或者含有RIP的缀合物也可以在酵母巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中表达，但这需要重新设计并构建合成基因以优化在酵母中的异源表达(Gurkan et al.(2005)MicrobialCell Factories，4：33)。

尽管上述每种策略的组合根据所用的RIP或者宿主细胞有时或者在某种程度上是有效的，但是在许多情况中宿主细胞对于RIP的毒性作用持续易感。在这种情况中，应用其它策略尝试从宿主细胞中表达和产生毒素，但是这种策略具有其局限性。例如，Fabrini et al.(FASEB J.14：391-398(2000))提议使用抗RIP抗体在真核细胞中作为中和剂以保护宿主核糖体免于失活同时使得大多数合成的多肽以生物活性形式分泌。尽管中和抗肥皂草毒蛋白(SAP)抗体已经用于SAP缀合物的产生中，但是这种策略需要抗RIP抗体片段在宿主细胞中组成型和稳定表达。

因此，本发明提供了产生RIP或者含有RIP的配体-毒素缀合物的方法，通过利用N-糖苷酶机制克服这些限制，RIP通过这个机制介导其对于原核和真核宿主细胞的毒性作用。腺嘌呤及其一些类似物能抑制RIP活性，如通过体外核糖体失活、包括例如4-氨基吡唑并[3，4-d]-嘧啶(4-APP)的抑制作用测量(Brigotti et al.(2000)Nucleic Acids Res.，28：2383-8；Brigotti et al.(2000)Life Sci.，68：331-6)。本文认为腺嘌呤类似物(例如4-APP)的应用可用于选择细胞表达克隆例如细菌克隆以及大规模表达毒素和配体-毒素缀合物分子包括例如白细胞群调节剂(LPM)。

本发明提供的方法被设计为：1)选择修饰的RIP毒素，所述修饰的RIP毒素呈现对于宿主细胞降低的毒性同时保留足够的毒性活性，这种选择可以在存在腺嘌呤类似物的条件下调节；2)在宿主细胞中在存在一或多种腺嘌呤类似物的条件下表达选择的修饰的RIP毒素或者含有修饰的RIP毒素的缀合物。这种方法可以鉴别选择的修饰的RIP毒素，可以对其进行检测以鉴别保留了对于靶宿主细胞核糖体足够毒性活性的那些毒素。此外，本发明提供了使得可以在存在一或多种RIP抑制剂如4-APP的条件下大规模表达和产生RIP毒素以及含有RIP毒素的缀合物的方法。

因此，所述方法使得可以鉴别修饰的RIP毒素，其可用于设计含有修饰的RIP毒素的配体-毒素缀合物，修饰的RIP毒素对于宿主表达细菌菌株呈现降低的细胞毒性并从而提供了产生更大数的用于临床前和临床研究的产物的可行表达策略。所述修饰的配体-毒素缀合物治疗疾病和失调的适宜性可以使用评估活性或者生物学活性的体外和体内测定法评估，所述疾病和失调例如是与促进炎性反应包括继发组织损害的细胞的增殖、迁移和/或生理学活性相关的炎性疾病。

C.核糖体失活蛋白(RIP)及作用方法

核糖体失活蛋白(RIP)是一类在植物、真菌和细菌中表达的蛋白质，其通过保守机制是真核细胞和原核细胞蛋白质合成的强力抑制剂。RIP是N-糖苷酶或多核苷酸：腺苷糖苷酶且能失活核糖体和非核糖体核酸底物。RIP被分为两类。I型RIP(也称作holo-RIP；即天花粉蛋白和软瓜蛋白)具有核糖体失活活性的～30kDa的单多肽链。II型RIP(也称作chimero-RIP；即蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白以及细菌毒素如志贺毒素)含有通过二硫键连接的两条多肽链或者种类，以A(通常为单亚基)和B(单个或多个亚基)表示。II型RIP的B链是进入细胞所需的，但是也可以由导致进入细胞的多肽取代。也有不属于I型和II型家族的其它RIP实例。这些RIP被称作双链I型RIP，其仅含有一个A链，但是需要蛋白酶解，以及III型RIP蛋白，其是在结构和功能上与大麦RIP JIP60相关的蛋白质(Peumans et al.(2001)The FASEBJournal，15：1493)。

II型RIP的B链结合细胞表面上含有半乳糖的受体，使得A链进入细胞质中，在此其失活核糖体。典型地，II型RIP是作为含有A链和B链的前多肽原(prepropolypeptide)合成的。在所述前多肽原靶向内质网(ER)之后，信号序列被裂解产生多肽原。在ER中，蛋白质经历两个链之间形成二硫键以及N-糖基化发生。所述多肽原通过高尔基体被转运至蛋白体中，在此其被蛋白体内的内肽酶蛋白酶解。内肽酶将多肽原裂解为A链和B链或者通过单二硫键保持连接的链。以这种方式对RIP的处理保证了在合成和转运期间避免毒素使其自身宿主细胞核糖体中毒如通过渗漏进细胞溶胶中。

RIP的毒性活性需要催化亚基内化进宿主细胞的细胞溶胶。II型RIP进入细胞是通过B-亚基促进的，I型RIP与II型RIP相比其毒性活性效力较低，I型RIP不被造血性组织居留性和内在的组织细胞特异性识别。为毒素内化而存在的各种细胞进入机制包括但不限于网格蛋白依赖性和网格蛋白非依赖性胞吞作用、胞膜窖非依赖性胞吞作用以及大胞饮。此外，在进入细胞时，毒素通过不同机制转运至细胞溶胶中(Sandvig et al.(2005)GeneTherapy，12：865-872)。一旦进入细胞溶胶内部，RIP催化核糖体的脱嘌呤作用，从而破坏蛋白质合成。

I型RIP和II型RIP的A链与这些毒素的酶活性相关，通过从真核细胞和原核细胞核糖体的28S rRNA中除去特定腺嘌呤而抑制蛋白质合成。通常，II型RIP被认为仅对于真核细胞核糖体是活性的，而I型RIP对于真核细胞和原核细胞核糖体均具有活性。一些II型RIP例如志贺毒素(STX)也抑制原核细胞核糖体(Skinner et al.(1998)，Microbial Pathogenesis，24：117-122)。

无论是单链(I型)还是双链(II型，通过A链介导)的RIP的毒性活性均由蛋白质的N-糖苷酶活性介导。这种酶活性导致在主要rRNA的普遍保守的GAGA四核苷酸环中精确位置的一个腺嘌呤(在大鼠肝28S rRNA的情况中是A₄₃₂₄，在大肠杆菌rRNA中是A₂₆₆₀)从腺苷中去除，所述环也被称作α-帚曲霉素/蓖麻毒蛋白环(见例如Endo et al.(1987)J.Biol.Chem.，262：8128；Barbieri et al.(1993)Biochim.Biophys.Acta.，1154：237；Sandvig etal.(2001)Toxicon，39：1629-1635；Ippoliti et al.(2004)The Italian JournalofBiochemistry，53：92；Stirpe and Battelli，Cell Mol Life Sci.，63：1850-66，2006)。腺嘌呤碱基的除去导致核糖体不能结合延伸因子2，从而终止RNA翻译。GAGA序列存在于原核细胞和真核细胞核糖体中。

RIP毒素的酶活性是通过催化链与核糖体蛋白的相互作用而介导。与腺嘌呤的相互作用发生在毒素蛋白的活性位点裂口(cleft)处。毒素之间底物结合的差异可以是由于活性位点裂口处氨基酸差异所致。例如，尽管X-射线晶体学数据示出Stx与蓖麻毒蛋白的A-亚基之间的活性位点裂口是相似的，但是在这些蛋白质的活性位点中有至少7个不变的残基(Brigotti etal.(2000)Nucleic Acids Research，28：2383-2388)。此外，毒素在真核细胞与原核细胞之间的底物特异性中的差异也被认为是RIP与不同核糖体蛋白相互作用的能力不同所致。例如，大鼠肝脏蛋白质L9和L10e是蓖麻毒蛋白A链的结合靶位，而核糖体蛋白L3是美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)的结合因子。L3是高度保守的核糖体蛋白，其解释了PAP对于不同物种的核糖体的广泛特异性(Peuman et al.(2001)The FASEB Journal，15：1493-1496)。腺嘌呤的除去导致rNRA的构象变化并且阻止延伸因子2的结合。因此，脱嘌呤的核糖体不能延伸新生的肽链。

除了失活核糖体以及抑制蛋白质合成之外，RIP由于其与除了rRNA之外的其它底物的相互作用而还具有其它功能。RIP可以使DNA、mRNA和病毒多核苷酸脱嘌呤(Ippoliti et al.(2004)The Italian Journal ofBiochemistry，53：92；Parikh et al.(2004)Mini-Reviews in Medicinal Chemistry，4：523-543)。因此，除了N-糖苷酶活性之外，已经证实由于RIP使含有腺嘌呤的多核苷酸、单链DNA、双链DNA和mRNA去腺苷酸的能力而具有多核苷酸：腺苷糖苷酶活性。例如，据报道RIP降解超螺旋DNA(见例如Liet al.(1991)Nucleic Acid Res.，22：6309；Ling et al.(1994)FEBS Lett.，345：143；Roncuzzi et al.(1996)FEBS Lett.，392：16)以及片段基因组DNA(Bagga et al.(2003)J Biol.Chem.，278：4813-4820)。此外，一些RIP从核糖体中释放一个以上的腺嘌呤残基(Barbieri et al.(1992)Biochem.J.，286：1)，作用于除了核糖体RNA之外的RNA(包括病毒RNA)或者也作用于poly(A)以及DNA(Barbieri et al.(1994)Nature，372：624；Stirpe et al.(1996)FEBS Lett.，382：309；Picard et al.(2005)J Biol.Chem.，280：20069-20075)。再者，一些RIP已经示出抑制HIV-1整合酶的3’-末端加工和链转移活性，随之抑制病毒基因组插入宿主细胞基因组中(Au et al.，FEBS Lett，471：169-72，2000)。因此，病毒增殖被抑制。因此，除了或者代替蛋白质合成抑制作用之外，一些RIP通过失活核糖体而呈现抗病毒活性(Parikh et al.(2004)Mini-Reviews in Medicinal Chemistry，4：523-543；Erice et al.(1993)Antimicrobial Agents and Chemotherapy，37：835-838)。因此，许多(如果不是全部的话)RIP具有N-糖苷酶活性、RNase活性、DNase活性及其它活性例如但不限于超氧化物歧化酶活性、磷脂酶活性、壳多糖酶活性以及抗病毒活性的一或多种(Park et al.(2004)Planta，219：1093-1096；Bagga et al.(2003)J Biol.Chem.，278：4813-4820；Parikh et al.(2004)Mini-Reviews in MedicinalChemistry，4：523-543；Au et al.，FEBS Lett，471：169-72，2000)。

1.举例的RIP

用于本发明提供的方法中选择具有降低活性的修饰的毒素的举例性毒素可以是通过使rRNA脱嘌呤的N-糖苷酶活性而呈现细胞毒性的任何毒素，所述修饰的毒素如用以改良毒素或者其缀合物的生产或者用于在配体-毒素缀合物的产生中。这种毒素为本领域技术人员所已知，典型包括毒素的RIP家族。例如，已经提出超过400种RIP，对其中50种I型RIP和15种II型RIP已经测序和/或克隆(Peumans et al.(2001)The FASEB Journal，15：1493)。举例的I型RIP包括但不限于香石竹毒蛋白30、香石竹毒蛋白32、剪秋罗苷、肥皂草毒蛋白-1、肥皂草毒蛋白-2、肥皂草毒蛋白-3、肥皂草毒蛋白-4、肥皂草毒蛋白-5、肥皂草毒蛋白-6、肥皂草毒蛋白-7、肥皂草毒蛋白-8、肥皂草毒蛋白-9、PAP、PAP II、PAP-R、PAP-S、PAP-C、mapalmin、商陆毒蛋白、异株泻根毒蛋白-L、异株泻根毒蛋白、大肠菌素-1、大肠菌素-2、软瓜蛋白-A、软瓜蛋白-B、软瓜蛋白-S、19K-PSI、15K-PSI、9K-PSI、α-kirilowin、β-kirilowin、多花白树毒蛋白、苦瓜毒蛋白、苦瓜毒蛋白-II、苦瓜毒蛋白-Ic、MAP-30、α-苦瓜子蛋白、β-苦瓜子蛋白、天花粉蛋白、TAP-29、trichokirin、大麦RIP、小麦毒蛋白、亚麻RIP、玉米RIP、asparin-1和asparin 2。举例的II型RIP包括但不限于塑莲根毒蛋白I、蓖麻毒蛋白、志贺毒素、黑杆菌素-CIP-29、相思豆毒蛋白、vircumin、塑莲根毒蛋白II、ebulitin-α、ebulitin-β、ebultin-γ和porrectin。通常A链或者其活性片段足以发挥II型RIP的酶活性。

对于各种RIP毒素多肽的论述不意味着限制本发明提供的实施方案的范围。应理解本领域技术人员已知的或者随后鉴别的任何RIP多肽均包含在本发明提供的方法中。本领域技术人员熟知RIP毒素的鉴别和功能鉴定法。举例的RIP毒素多肽及其相应的SEQ ID NO示于表3中。

表3：举例的RIP毒素

RIP毒素	异名	UniProtNO：	信号序列	酶亚基(即A链)	SEQIDNO：
						志贺毒素A-链(Stx)	StxA；StxI；Stx1；志贺样毒素I亚基A；SLT-A；SLT-I；SLT-1；Vero细胞毒素1亚基A；VT1	P10149	1-22	23-315	1
志贺样毒素II亚基A(Stx2)	StxA2；Stx2A；Vero细胞毒素2亚基A；VT2；SLT-IIA；SLT2	P09385	1-22	23-319	3
						肥皂草毒蛋白6	SAP-6；SO-6	P20656	1-24	25-277	89
大麦RIPI	蛋白质合成抑制剂I；RIP30	P22244		1-280	90
						大麦RIPII	蛋白质合成抑制剂II；RIP30A	P04399		1-280	91
多花白树毒蛋白	GEL	P33186	1-26	47-297	92
						蓖麻毒蛋白A		P02879	1-35	36-302	93
苦瓜毒蛋白I	α-苦瓜子蛋白；α-MMC	P16094	1-23	24-269	94
						苦瓜毒蛋白II		P29339	1-23	24-286	95

RIP毒素	异名	UniProtNO：	信号序列	酶亚基(即A链)	SEQIDNO：
						异株泻根毒蛋白I	BD1	P33185	1-23	24-270	96
异株泻根毒蛋白II	BD2	P98184	1-21	22-282	97
						Pap-S	美洲商陆抗病毒蛋白S	P23339		1-261	98
软瓜蛋白	软瓜蛋白-α	Q00465	1-19	20-277	99
						天花粉蛋白	α-天花粉蛋白；α-TCS	P09989	1-23	24-270	100
棒麦角素		P49074	1-27	28-177	101
						相思豆毒蛋白-a		P11140		1-251	102
玉米RIP 3	CRIP3	P25891		1-300	103
						玉米RIP 9	CRIP9	P25892		1-304	104
玉米RIP X		P28522	1-16	17-161	105
						小麦毒蛋白	Trig7；小麦RIP	Q07810		1-275	106
MAP		P21326	1-28	29-278	107
						香石竹毒蛋白30	DAP-30	P24476	1-23	24-293	108
黑杆菌素b	凝集素V；SNAV	P33183	1-25	26-297	109
						黑杆菌素I		Q8GT32	1-25	26-274	110
Ebulin	Ebu1	Q9AVR2	1-25	26-298	111

志贺毒素

志贺毒素(STX)是RIP蛋白家族，其由细菌产生。志贺毒素被分为三个不同类别。志贺毒素(Stx)由痢疾志贺氏菌产生，是含有32-kDa酶A亚基(StxA)的II型RIP蛋白，所述A亚基与5个7.7kDa B亚基(StxB)的环非共价缔合。Stx与志贺样毒素1(Stx1，也称作Vero细胞毒素、SLT1或VT1)的氨基酸序列相同，由大肠杆菌产生。Stx和Stx1的A-链前体的长度为315个氨基酸(如SEQ ID NO：1所示)，含有相应于SEQ ID NO：1第1-22位氨基酸的长度为22个氨基酸的信号序列。成熟Stx/Stx1A链长度为293个氨基酸，相应于SEQ ID NO：1第23-315位氨基酸，如SEQ ID NO：5所示。第三个Stx是志贺样毒素2(Stx2，也称作Vero细胞毒素2、SLT2或VT2)，其与Stx和Stx1相比呈现序列差异。Stx2的A-链前体长度为319个氨基酸(如SEQ ID NO：3所示)，含有相应于SEQ ID NO：3第1-22位氨基酸的长度为22个氨基酸的信号序列。成熟Stx2A链长度为297个氨基酸，相应于SEQID NO：3的第23-319位氨基酸。Stx/Stx1和Stx2的B亚基长度为89个氨基酸(分别如SEQ ID NO：2和4所示)。据报道志贺样毒素也在弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌和阴沟肠杆菌中产生(Sandvig et al.(2001)Toxicon，39：1629-1635)。

Stx的A链(StxA)具有酶活性A片段，其含有在SEQ ID NO：5所示序列的C242与C261(分别相应于SEQ ID NO：1所示序列的C264和C283)之间形成的内部二硫键。SEQ ID NO：5中的序列²⁴⁸Arg-Val-Ala-Arg²⁵¹位于两个半胱氨酸之间的环中，由胰蛋白酶或者由细胞蛋白酶弗林蛋白酶识别。弗林蛋白酶在反面高尔基网络(trans golgi network，TGN)和内体中发现，在其翻译后加工期间很可能裂解StxA。胰蛋白酶或者弗林蛋白酶在SEQ IDNO：5所示序列中Arg²⁵¹的COOH-末端侧裂解StxA，使A链分成A1和A2片段(Sandvig et al.(2001)Toxicon，39：1629-1635；Garred et al.(1995)J Bio1.Chem.，270：10817-10821)。因此，Stx的裂解的A1片段(SA1)相应于SEQ IDNO：5的第1-251位氨基酸，Stx的A2片段(SA2)相应于第252-293位氨基酸。

弗林蛋白酶裂解激活A片段(SA1)。所述A1结构域由于C242和C261之间的二硫键而保持与A2/B亚基缔合，直至通过ER转运，在ER所述二硫键被还原并且使得A1片段反易位(retrotranslocate)至细胞溶胶(LaPointeet al.(2005)J Biol.Chem.，280：23310-8)。Stx的A1片段的活性与完整Stx蛋白的活性相比高6-400倍(Suh et al.(1998)Biochemistry，37：9394-9398)。正是如此，SA1含有RIP酶活性且通过60S核糖体亚基的28S RNA的脱嘌呤作用而抑制蛋白质合成。A1链的前239个氨基酸代表StxA1 RIP结构域的最小催化活性区域(LaPointe et al.(2005)J Biol.Chem.，280：23310-8)。保留催化活性的截短的SA1包括例如SEQ ID NO：22所示以及由SEQ ID NO：23所示核苷酸序列编码的变体1 SA1序列，以及如SEQ ID NO：24所示以及由SEQ ID NO：25所示核苷酸序列编码的变体2序列。

与其它RIP一样，Stx的活性SA1亚基攻击真核细胞核糖体；然而，其对于细菌核糖体也具有活性。例如，许多研究小组已经报道在存在SA1的条件下大肠杆菌细胞生长降低(见例如Skinner et al.(1998)MicrobialPathogenesis，24：117-122；Suh et al.(1998)Biochemistry，37：9394-9398)。SA1对于原核细胞的毒性活性需要毒素在细胞质中表达，如由于不存在其天然信号序列所致；在SA1通过其信号序列输送至周质之后，在细胞中观测到无Stx-介导的毒性。SA1对于原核细胞的毒性活性与其对于真核细胞的毒性活性相当。其它RIP也靶向原核细胞，包括例如植物RIP PAP和MAP，但是在大多数情况中这种植物RIP针对真核细胞核糖体的毒性活性的效力高大约100倍(Suh et al.(1998)Biochemistry，37：9394-9398)。相反，其它RIP如RTA(蓖麻毒蛋白的酶亚基)显示出对于原核细胞无毒性。

2.RIP毒素抑制剂

本领域已知并且可以鉴别失活毒性RIP的抑制剂。对于这种抑制剂的研究提供了关于毒素活性位点的结构的认知。此外，由于多种原因而关注于鉴别和开发RIP抑制剂，包括但不限于诊断目的、中毒的解毒剂或者在由RIP表达菌引起的感染中作为预防和治疗剂(Brigotti et al.(2000)LifeSciences，68：331-336；美国专利申请No.6,562,969)。一些RIP抑制剂靶向RIP毒素的保守N-糖苷酶活性。这种RIP毒素抑制剂包括RIP特异性寡核苷酸抑制剂，例如RNA适体(见例如Hesselberth et al.(2000)J.Biol.Chem.，275：4937-4942；Hirao et al.(2000)J.Biol.Chem.，275：4943-4948)、RIP-特异性抗体和/或腺嘌呤异构体包括例如腺嘌呤、4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(4-APP)及其他类似异构体(Pallanca et al.(1998)Biochimica et BiophysicaActa，1384：277-284；Brigotti et al.(2000)Nucleic Acids Research，28：2383-2388；Brigotti et al.(2000)Life Sci.，68：331-6；美国专利申请No.6,562,969)。

4-APP及其它腺嘌呤类似物

腺嘌呤是RIP毒素的天然底物中的碱基(即GAGA环序列中的第一个腺嘌呤碱基)。因此，腺嘌呤及其类似物通过作为RNA N-糖苷酶活性抑制剂而抑制RIP毒性活性(Pallanca et al.(1998)Biochimica et Biophysica Acta，1384：277-284；Brigotti et al.(2000)Nucleic Acids Research，28：2383-2388；Brigotti et al.(2000)Life Sci.，68：331-6)。典型地，腺嘌呤类似物包括任何稠合二环化合物，其中一个环是6-氨基嘧啶，另一个环是5元杂环，其含有至少两个相邻的碳原子，包括但不限于吡咯、吡唑、咪唑、三唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、呋喃以及噻吩。典型地，环的融合以任一附着模式发生在6-氨基嘧啶的第4位与第5位的碳原子之间以及所述5元环的任两个相邻碳原子之间。这包括例如5元环是咪唑构型的腺嘌呤本身。腺嘌呤的结构如下：

腺嘌呤

此外，这种类似物还包括所述5元环的氮原子从咪唑至吡唑构型的任何重排，包括例如4-APP和间型霉素碱基，其仅在6-氨基嘧啶与所述5元吡唑环的附着模式方面不同(见例如Brigotti et al.(2000)Life Sci.，68：331-6)。另外，本发明提供的抑制剂包括间型霉素A碱基的核糖核苷与脱氧核糖核苷类似物，例如间型霉素A碱基的核糖核苷5’一磷酸-、5’二磷酸-、5’三磷酸-和3’一磷酸类似物以及间型霉素A的脱氧核糖核苷酸5’一磷酸-、5’二磷酸-、5’三磷酸和3’一磷酸类似物或者任何其它相似或已知化合物，如随后鉴别的化合物(见例如美国专利申请No.6,562,969)。4-APP和间型霉素A碱基的结构如下所示：

4-氨基吡唑并[3，4-d]-嘧啶    间型霉素A碱基

(4-APP)

尽管RIP毒素的保守的N-糖苷酶活性，腺嘌呤及腺嘌呤类似物如4-APP呈现出保护核糖体免于RIP失活的不同能力(Pallanca et al.(1998)Biochimica et Biophysica Acta，1384：277-284；Brigotti et al.(2000)NucleicAcids Research，28：2383-2388；Brigotti et al.(2000)Life Sci.，68：331-6)。例如，4-APP是Stx、苦瓜毒蛋白及其它植物RIP的强抑制剂，但是对于蓖麻毒蛋白呈现几乎没有的抑制作用。此外，4-APP对于Stx较腺嘌呤呈现更高的抑制活性，然而，4-APP和腺嘌呤对于RIP毒素苦瓜毒蛋白表现出相似的抑制活性。同样，腺嘌呤保护核糖体免于被蓖麻毒蛋白失活，而4-APP对于蓖麻毒蛋白的毒性活性表现出几乎没有的抑制作用。因此，RIP毒素在被各种腺嘌呤异构体抑制的能力方面有所不同，表示RIP毒素未共有共同的活性位点结合裂口。腺嘌呤异构体对于RIP活性的抑制活性为本领域已知(Pallanca et al.(1998)Biochimica et Biophysica Acta，1384：277-284；Brigotti et al.(2000)Nucleic Acids Research，28：2383-2388；Brigotti et al.(2000)Life Sci.，68：331-6)，或者可以由本领域技术人员如通过在存在所述抑制剂的条件下确定RNA N-糖苷酶活性(即RIP活性)而确定。

正如下文所详细描述，RIP抑制剂如腺嘌呤及其类似物包括例如4-APP可用于选择修饰形式的RIP的方法中并且也可以用于改良RIP毒素或者其缀合物的产生的方法中，例如本发明提供的或者通过本发明提供的选择方法鉴别的任何修饰的RIP毒素。

D.选择修饰的毒素或者其缀合物的方法

本发明提供了选择修饰的RIP毒素的方法，所述修饰的RIP毒素表现为对于宿主表达细胞的细胞毒性降低。在本发明的方法中，发现由于RIP对于特定宿主细胞的毒性，RIP通常在细胞培养物中低水平表达，甚至在其对于所有或者基本上所有细胞均具有毒性的条件下也低水平表达。典型地，RIP被表达因为需要规定量以呈现对于细胞的毒性，因此一些细胞可以对于RIP以及如本发明示出的RIP突变体的毒性影响具有抗性。结果，在含有编码RIP的核酸的细胞培养物中，RIP被表达但是相对低水平表达。

因此，设计方法以在起始RIP毒素未产生或者低水平产生的条件下选择和鉴别那些由宿主细胞产生的RIP毒素。为了进行本发明提供的方法，将编码未修饰的或者起始形式的RIP毒素的核酸导入宿主细胞中，使该宿主细胞生长，分离生长的细胞并且鉴别在所述细胞中表达的RIP毒素并检测其活性例如N-糖苷酶活性和/或其它RIP活性，包括但不限于RNase活性、DNase活性、超氧化物歧化酶活性和磷脂酶活性。在一些实例中，在存在选择调节剂如RIP抑制剂的条件下另外进行选择。

通常，这种修饰的RIP毒素与起始RIP蛋白相比是被修饰的，由于进行修饰，因此所述RIP毒素与起始RIP毒素相比具有改变的活性，例如改变的毒性活性或者其它活性。通常，修饰的RIP多肽的毒性被降低。在一些实例中，在本发明的选择方法中鉴别的修饰的RIP多肽呈现出无毒性活性。然而典型地，修饰的RIP毒素或者其缀合物与野生型毒素或者其缀合物相比保留0.5％、1％、1.5％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或者100％的毒性活性。由于保留的细胞毒性活性，因此含有这种修饰的毒素的缀合物可以被设计为靶向特定细胞，从而在所述缀合物内化时导致杀死被靶向的细胞。例如，如下文详细描述，含有修饰的RIP毒素的缀合物通过靶向参与疾病过程的一或多种细胞或者细胞群而可用于治疗各种疾病或失调的方法中。这种修饰的毒素也可用于表达和产生RIP毒素或者其缀合物的方法中，从而使得可以高产量产生蛋白质。

1.候选RIP蛋白或者其缀合物

通常，由于许多RIP蛋白通过细胞核糖体抑制蛋白质合成而呈现出对于原核细胞和/或真核细胞的毒性活性，因此在一些或所有宿主细胞系统中不能高水平表达。本发明提供了降低RIP毒性的方法，因此其可以较高水平表达，但是仍呈现出足够的毒性以治疗性用于应用RIP的缀合物中。所述缀合物包括在美国专利No.7,166,702、7,157,418和7,192,736中所述的缀合物以及细胞因子如生长因子包括FGF、VEGF、EGF等的缀合物。

在本发明提供的方法中，产生在宿主细胞中呈现降低毒性的RIP毒素或者其缀合物。这种修饰的RIP毒素或者其缀合物因此对于细胞的毒性降低。对经修饰而显示活性降低的RIP蛋白或者其缀合物的选择使得这种毒素可以由宿主细胞表达并且改良产量。因此，这种方法使得RIP毒素或者其缀合物可以有效及高效产生，从而用于其被设计用来治疗疾病或失调的方法中。

通过本发明提供的选择方法修饰的RIP蛋白可以是任何RIP蛋白或者含有RIP蛋白或者其活性部分的任何多肽，其在标准或者正常生长条件下由于其对于宿主细胞核糖体的毒性活性而在宿主细胞中不被表达或者低水平表达。所述蛋白质被修饰，然后在相同条件下以较高水平表达。用于选择的候选RIP蛋白包括野生型RIP蛋白或者野生型RIP蛋白的变体形式，或者其呈现毒性活性的活性部分，包括未由本发明的方法选择的RIP蛋白的等位基因变体或者物种变体以及同种型。

这种RIP蛋白包括上表3所示任何蛋白质，如具有SEQ ID NO：5、89-111所示氨基酸序列的任何蛋白质，特别是这种RIP蛋白的A链的活性部分，如志贺毒素的A1链(即SA1)或者其任何活性片段。例如，本发明提供的方法中使用的起始蛋白质可以是其A链或者A1链被截短但是仍呈现催化活性的任何蛋白质。本发明提供的方法中的起始蛋白质还包括包含变体形式RIP蛋白的任何多肽，所述变体如其等位基因变体或物种变体。举例的RIP蛋白的变体如SEQ ID NO：6、9-21或者162-169任一所示。本发明还提供了含有与靶向物质连接的这种蛋白质的缀合物。

本发明提供的方法中的起始蛋白质还包括含有与另一多肽部分直接或者间接连接的如上述任何这种RIP毒素或者这种RIP毒素的活性部分的缀合物。例如，这种缀合物包括配体-毒素缀合物，包括其中RIP毒素与趋化因子、细胞因子、抗体、生长因子或者能结合细胞表面受体的其它这种配体蛋白直接或者间接连接的那些缀合物。典型地，这种缀合物由编码融合蛋白的核酸分子编码。

在本发明提供的方法中用作起始蛋白质的RIP蛋白的例子包括SA1，例如具有相应于SEQ ID NO：5的第1-25 1位氨基酸的氨基酸序列或者其截短形式如分别具有SEQ ID NO：22(即变体1 SA1)或者SEQ ID NO：24(即变体2 SA1)所示氨基酸序列的SA1或者其等位基因变体或物种变体。举例的这种缀合物是含有上述任何SA1部分的任何缀合物，其中所述SA1部分与配体或者其它细胞受体结合分子直接或者间接连接。例如，这种缀合物包括趋化因子缀合物(即白细胞群调节剂)如美国专利No.7,166,702、7,157,418和7,192,736所述。这些包括例如具有与SA1连接的MCP-1趋化因子的缀合物。举例的与变体1 SA1 RIP蛋白连接的MCP-1-SA1缀合物(即LPM1a)的序列如SEQ ID NO：38所示，由SEQ ID NO：37所示核苷酸序列编码。另一举例的与变体2 SA1 RIP蛋白连接的MCP-1-SA1缀合物(即LPM1b)的序列如SEQ ID NO：40所示，由SEQ ID NO：39所示核苷酸序列编码。

2.RIP或者其缀合物导入宿主细胞中

编码希望的起始RIP蛋白或者其缀合物的核酸被导入任何希望的宿主细胞中。典型地，在本发明选择方法中选择的宿主细胞是对于起始RIP蛋白或者其缀合物的毒性作用易感的宿主细胞，由此在所述RIP在宿主细胞中表达时该宿主细胞的蛋白质合成被废除或者明显削弱。在本发明的选择方法中使用的宿主细胞包括任何原核细胞，包括但不限于任何细菌细胞如大肠杆菌。宿主细胞还包括任何真核细胞，包括但不限于酵母如巴斯德毕赤氏酵母、爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)以及哺乳动物细胞例如Vero、Hep2、Chang、A549、COS-1以及HeLa细胞。在决定用于本发明选择方法中的适当宿主细胞中，RIP蛋白或者其缀合物对于宿主细胞中重组蛋白质表达的影响可以通过下文所述或者本领域技术人员已知的各种方法确定。评估对于蛋白质合成的影响的测定法包括例如脱嘌呤测定法(即腺嘌呤的释放)、无细胞蛋白质合成测定法如兔网织红细胞裂解物或者麦胚裂解物蛋白质合成测定法或者细胞生长/生存力测定法。例如，通过使用这种测定法，获知SA1对于真核细胞和原核细胞核糖体呈现显著的毒性活性(Suh et al.(1998)Biochemistry，37：9394)。因此，在一个实例中，在真核细胞中选择修饰形式的SA1或者其活性形式。在另一个实例中，在细菌细胞如大肠杆菌中选择修饰形式的SA1或者其活性部分。各种大肠杆菌宿主菌株均可利用，包括但不限于BL21(DE3)或者BL21(DE3)pLysS细胞。

编码用于本发明方法中的起始RIP蛋白或者其缀合物的核酸分子可以通过本领域已知的任何方法产生或分离，包括分离自天然来源、通过标准重组DNA技术如通过标准克隆方法从细胞、组织和生物体中产生以及通过其它重组方法和包括in silico步骤的方法、合成方法以及本领域技术人员已知的任何方法产生。这种核酸分子可包括额外的序列如限制酶序列、接头、标记或者其它这种序列。举例的核酸分子包括编码RIP蛋白、其活性形式或者其变体的任何核酸分子，如编码SEQ ID NO：1、3、5、7-22、24、89-111或者162-169所示任何多肽的任何核酸分子或者编码含有这种RIP蛋白的缀合物的任何核酸分子。举例的核酸序列包括例如SA1的变体1和变体2形式的序列，分别如SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25所示。其它举例的核酸序列包括编码缀合物的序列，所述缀合物例如是与SA1变体连接的趋化因子如MCP-1的缀合物。例如，编码LPM1a或LPM1b缀合物的核酸序列可以用于本发明提供的方法中，包括分别如SEQ ID NO：37和39所示序列。

典型地，用于导入宿主细胞中具有修饰的RIP蛋白或者其缀合物的选择和表达的序列的核酸分子是表达载体形式，包括具有与编码用于多肽表达的核酸序列可操纵地连接的表达控制序列的那些表达载体。这种表达载体在下文详细描述。适当的载体可以根据宿主细胞和/或任何希望的转录/翻译元件包括例如组成型和可诱导启动子、转录增强子元件、转录终止子等选择。在一个实例中，可诱导表达系统用于本发明方法中，使得宿主细胞在毒素表达之前最佳生长。举例性的在大肠杆菌中的可诱导系统是pET载体，如PET9c质粒，其在T7晚期启动子的控制下并且需要IPTG诱导。在其它实例中，可以选择用于表达导入其中的编码核酸的宿主细胞，其自身也携带优化毒素表达的进一步成分。例如，在宿主细胞是大肠杆菌的情况中，可以使用细胞系BL21(DE3)pLysS，其与渗漏型亲代宿主细胞BL21(DE3)相比在无诱导的条件下强力抑制从T7启动子(如在pET载体中)的表达。

编码RIP蛋白、其活性形式或者其缀合物的核酸分子可以通过本领域技术人员已知的任何方法导入宿主细胞中。这种方法根据选择的宿主细胞选择，包括但不限于转染、转化、电穿孔及任何其他合适方法。在一些情况中，DNA也可以通过使用病毒载体转导而被导入细胞中。典型地，当将DNA导入细菌细胞中时，使用转化或电穿孔方法。

a.转染

可以使用转染将核酸导入真核细胞或者原核细胞中。转染可以通过各种方法实现，但是典型包括打开瞬时“孔”以使得DNA进入细胞，然后在宿主细胞中瞬时表达。通过转染导入DNA的方法的例子包括但不限于磷酸钙方法、脂转染以及基因枪方法。例如，脂转染方法中，DNA被包含在脂质体中或者通过使用脂质-阳离子试剂，其随后能与细胞膜融合而将DNA释放进细胞中。举例的阳离子脂质包括但不限于Lipofectin(LifeTechnologies，Inc.，Burlington，Ont.)(阳离子脂质N-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(N-[1-(2，3-dioleyloxy)propyl]-N，N，N-trimethylammonium chloride，DOTMA)与二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine，DOPE)的1∶1(w/w)配制品)；LipofectAMINE(Life Technologies，Burlington，Ont.，见美国专利No.5,334,761)(聚阳离子脂质2，3-二油烯氧基-N-[2(精胺-羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯(2，3-dioleyloxy-N-[2(spermine-carboxamido)ethyl]-N，N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoroacetate，DOSPA)与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的3∶1(w/w)配制品)；LipofectAMINE PLUS(LifeTechnologies，Burlington，Ont.，见美国专利No.5,334,761和5,736,392；也见美国专利No.6,051,429)(LipofectAmine and Plus reagent)；LipofectAMINE2000(Life Technologies，Burlington，Ont.；也见国际PCT申请No.WO00/27795)(阳离子脂质)；Effectene(Qiagen，Inc.，Mississauga，Ontario)(非脂质体脂质配制品)；Metafectene(Biontex，Munich，Germany)(聚阳离子脂质)；Eu-fectins(Promega Biosciences，Inc.，San Luis Obispo，CA)(乙醇阳离子脂质编号1-12：C₅₂H₁₀₆N₆O₄4CF₃CO₂H、C₈₈H₁₇₈N₈O₄S₂.4CF₃CO₂H、C₄₀H₈₄NO₃P.CF₃CO₂H、C₅₀H₁₀₃N₇O₃.4CF₃CO₂H、C₅₅H₁₁₆N₈O₂.6CF₃CO₂H、C₄₉H₁₀₂N₆O₃.4CF₃CO₂H、C₄₄H₈₉N₅O₃.2CF₃CO₂H、C₁₀₀H₂₀₆N₁₂O₄S₂.8CF₃CO₂H、C₁₆₂H₃₃₀N₂₂O₉.13CF₃CO₂H、C₄₃H₈₈N₄O₂.2CF₃CO₂H、C₄₃H₈₈N₄O₃.2CF₃CO₂H，C₄₁H₇₈NO₈P)；Cytofectene(Bio-Rad，Hercules，CA)(阳离子脂质与中性脂质的混合物)；GenePORTER(Gene Therapy Systems Inc.，San Diego，CA)(中性脂质(Dope)与阳离子脂质的配制品)以及FuGENE 6(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)(基于非脂质体试剂的多成分脂质)。

b.转化

转化与转染的区别在于导入的DNA掺入细胞基因组中以表达遗传物质。典型地，用于稳定转化的表达载体具有可选择标记例如抗生素抗性使得可以选择和维持转化的细胞。转化需要DNA转移进细胞中，这在天然感受态细胞或者使之成为感受态的细胞中完成以吸收DNA穿过细胞膜或者膜。氯化钙是用于使得细胞如大肠杆菌细胞成为更加感受态的一种方法。在细菌细胞经热休克之后，其被诱导吸收所述DNA。转化非限于细菌，也可以在酵母、植物和哺乳动物细胞包括胚胎干细胞中进行。转化方法为本领域所熟知(见例如Mello et al.(1995)Methods Cell Biol.，48：451-82).

c.电穿孔

电穿孔通过使用脉冲旋转电场暂时打开细胞外膜中的孔。用于在体外和体内电穿孔的方法和设备为本领域所熟知(见例如美国专利No.6,027,488、5,993,434、5,944,710、5,507,724、5,501,662、5,389,069、5,318,515所述)。可以使用标准方案。

3.表达、选择与鉴别

DNA分子导入宿主细胞中导致基因产物扩增，从而使得多个基因拷贝表达。由于本发明的选择方法中使用的起始RIP毒素或者其缀合物通常对于选择的宿主细胞是毒性的，因此起始蛋白质的扩增与表达例如由于细胞死亡而典型地不发生。因此，本发明提供的方法使用起始蛋白质的正常毒性作为选择方法选择呈现出对于宿主细胞更低毒性、从而被表达的那些修饰形式的蛋白质。典型地，这种表达的蛋白质在其一级序列中通过一或多个氨基酸突变而被修饰，使得所述蛋白质毒性降低。在一些情况中，表达的蛋白质与起始蛋白质相比通过氨基酸序列的截短而被修饰，使得蛋白质毒性降低。在大多数宿主细胞表达系统中，编码修饰的RIP毒素的基因可以通过生长转化体、从所述转化体中分离重组DNA分子以及当需要时从分离的重组DNA中取出插入的基因而大量获得。

在一些实例中，在本发明的选择方法中加入另一或者另外的物质以调节选择从而优化修饰的RIP毒素或者其缀合物的回收。这种选择调节剂典型是降低RIP毒素或者其缀合物的毒性活性的任何调节剂。例如，任何RIP抑制剂均可用于调节选择。本领域技术人员已知的或者随后鉴别的可以失活RIP毒素的任何RIP毒素抑制剂均可用于本发明提供的方法中。典型地，这种RIP毒素抑制剂是通过靶向例如RIP毒素的保守的N-糖苷酶活性而抑制毒性活性的任何抑制剂。可以选择靶向任一或多种其它RIP活性的其它RIP毒素抑制剂，所述活性包括但不限于RNase活性、DNase活性以及超氧化物歧化酶和磷脂酶活性。对于本发明而言，任何RIP抑制剂如腺嘌呤或者其任何类似物均可用于本发明的方法中，只要所述抑制剂对于起始形式的RIP毒素具有抑制活性即可，所述起始形式RIP毒素例如是野生型RIP毒素或者其活性片段。例如，4-APP可用于本发明方法中以选择修饰的RIP，所述修饰的RIP包括但不限于修饰的SA1、肥皂草毒蛋白、苦瓜毒蛋白或者异株泻根毒蛋白(Brigotti et al.(2000)Life Sciences，68：331-336)。典型地，4-APP用于本发明的方法中以选择修饰的SA1。本发明还包含其它抑制剂也可用于选择修饰的SA1。

所述选择方法中使用的RIP抑制剂的量可以基于其对于RIP蛋白或者其缀合物的毒性活性的已知作用而根据经验加以确定。重要的是本发明方法中使用的RIP抑制剂自身对于特定宿主细胞是无毒性的，其毒性是已知的或者可以由本领域技术人员根据选择的宿主细胞进行确定。此外，为了保证RIP抑制剂有效地调节修饰的RIP毒素或者其缀合物的选择，选择这样的RIP抑制剂浓度，由此其抑制起始蛋白质的毒性活性。典型地，选择这样的RIP抑制剂浓度，由此所述起始RIP蛋白在存在RIP抑制剂的条件下保留一些活性，从而允许选择方法中RIP抑制剂在一定程度上的选择性压力或调节。通常，选择这样的RIP抑制剂浓度，其使得RIP毒素或者其缀合物的毒性活性被抑制至少或者大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或者90％，但是低于100％毒性活性。本领域技术人员已知的各种测定法均可用于检测不同浓度的RIP抑制剂对于宿主细胞或者RIP蛋白活性的影响。

典型地，在本发明的选择方法中，加入RIP抑制剂例如如下浓度的4-APP以调节选择：大约或者是0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM.0.5mM.0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、5.0mM、6.0mM.7.0mM、8.0mM、9.0mM、10.0mM或者更高，只要所述抑制剂自身对于选择的宿主细胞无毒性即可。应理解选择的RIP抑制剂的浓度可以根据选择的宿主细胞或者用于重组表达的条件而不同。例如，在大肠杆菌细胞表达系统中用于本发明选择方法中选择的4-APP的浓度的例子是或者大约是0.2-0.8mM、通常0.5mM抑制剂。

所述RIP抑制剂可以在用起始蛋白RIP毒素或者其缀合物处理宿主细胞之前、期间或者之后加入。在一些实例中，将RIP抑制剂加入液体培养物或者培养基中例如加入细胞培养基中。在其它实例中，将RIP抑制剂加入能固化的培养基如固体琼脂中。例如，RIP抑制剂如4-APP可以加入luria肉汤(LB)琼脂中以产生含有所述RIP抑制剂的琼脂平板。RIP抑制剂可以单独用作选择性调节剂或者可以在存在其它选择性调节剂或者选择剂例如但不限于其它RIP抑制剂或者赋予抗生素抗性的抗生素的条件下使用。

选择的从宿主细胞转化体中表达的修饰毒素可以被扩增以促进选择的修饰的RIP毒素或者其缀合物的鉴别。这种方法包括一般的重组DNA技术且为本领域技术人员所已知。可以分离含有修饰的毒素DNA的宿主细胞转化体的载体以使得选择的蛋白质纯化。例如，在用如上述RIP起始蛋白转化大肠杆菌宿主细胞之后，细胞转化体生长为单独克隆，其可以通过单独挑选菌落并使其生长以使用本领域技术人员已知的方法进行质粒纯化而分离，且如果需要可以例如使用Midi质粒纯化试剂盒(Qiagen)进行大量制备。纯化的质粒可以用于DNA测序以鉴别修饰的毒素的序列或者可用于转染进任何细胞中以进一步表达和产生，例如但不限于转染进原核细胞或者真核细胞表达系统中。在一些实例中，可以进行一步或者两步PCR以扩增选择的序列，其可以被亚克隆进选择的表达载体中。可以设计PCR引物以促进亚克隆，例如包括加入限制酶位点。

在选择的毒素在任何希望的细胞表达系统中进一步表达和产生之后，含有RIP毒素多肽或者其缀合物的条件培养基可以在活性测定中检测或者可用于进一步纯化。典型地，选择的修饰的RIP毒素或者其缀合物的进一步表达和产生在存在RIP抑制剂的条件下进行。这种方法在章节G中针对改良的RIP毒素或者其缀合物的产生中详细描述。

4.活性评估

对在本发明提供的方法中选择的修饰的RIP毒素或者其缀合物可以进行检测以确定在选择之后其是否保留对于宿主细胞核糖体的毒性活性。典型地，选择这种修饰的毒素是因为其与起始RIP蛋白或者其缀合物相比毒性活性降低。然而，选择的修饰的毒素通常保留起始毒素蛋白的一些活性。本发明提供的修饰的RIP毒素或者其缀合物与参考或起始毒素或者其缀合物相比保留0.5％、1％、1.5％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或者更高的毒性活性。举例的测定法可以是检测RIP多肽活性的任何测定法，包括例如评估N-糖苷酶活性、DNAase活性、RNAase活性或者其它活性的测定法。本领域技术人员已知的任何方法均可用于评估RIP蛋白或者其缀合物的毒性活性，典型包括测定RIP蛋白的N-糖苷酶活性作用的测定。举例的评估任何RIP毒素或者其缀合物、包括这种毒素的修饰形式的毒性活性的测定在下文描述。

a.蛋白质合成测定

通过使用蛋白质合成测定法测量RIP毒素或者其缀合物如任何修饰的RIP包括例如在本发明提供的选择方法中鉴别的任何修饰的毒素的活性以确定所述毒素对于翻译的作用。这种测定法是本领域技术人员常用且已知的。举例的这种测定法是兔网织红细胞裂解物测定。典型地，所述兔网织红细胞裂解物含有或者补加有效转录和翻译需要的成分如镁和钾离子以及NTP。还加入模板RNA，其是合成的蛋白质的来源。这种测定法允许可被检测的通过兔核糖体进行的偶联的蛋白质体外转录和翻译。在一种方法中，可以通过掺入放射性进行检测，所述放射性如[³H]Leu、[³⁵S]Met或者[³⁵S]Met-Cys，其被掺入合成的蛋白质中且可以在用三氯乙酸沉淀后测量(TCA；Baas et al.(1992)The Plant Cell，4：225-234；Zhao et al.(2005)Journalof Microbiology，54：1023-1030)。在另一种方法中，荧光素酶DNA可以用作模板，随后通过使用光度计进行检测。举例的兔网织红细胞裂解物系统是由Promega销售的那些系统，包括例如Coupled Reticulocyte LysateSystems。这种测定法在实施例2中描述。对所述测定法可以修改以适合使用其它翻译系统包括小麦或玉米网织网织红细胞裂解物或者可以修改为适合翻译反应，所述翻译反应含有完整细胞裂解物或者从各种上清级分中重新构建的裂解物以及纯化的核糖体或者多核糖体(Baas et al.(1992)ThePlant Cell，4：225-234)。在一些方法中，对所述测定可以进行修改以适合评估对于在完整细胞中蛋白质合成的作用，在此通过腺病毒表达的荧光素酶可便于进行蛋白质合成的检测(Zhao et al.(2005)Journal of Microbiology，54：1023-1030)。此外，可以进行动力学分析和剂量应答曲线分析以确定所述毒素的相对活性，通过提供二分之一最大应答(RIC50)必需的毒素浓度确定。

b.脱嘌呤作用测定

可以在脱嘌呤作用测定中确定RIP毒素或者其缀合物的活性，所述毒素例如是任何修饰的RIP包括例如在本发明提供的选择方法中鉴别的任何修饰的毒素。RIP-介导的RNA的大核糖体亚基的脱嘌呤增加了糖-磷酸主链在脱嘌呤位点对于水解的易感性(Tumer et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.，94：3866-3871)。在用苯胺处理之后，通过小片段的释放而可以观测到水解。因此，核糖体可以在存在或者不存在增加浓度的毒素，提取的并用苯胺处理的RNA的条件下处理并且通过凝胶电泳分析。片段可以通过用溴化乙啶染色而进行观测(Tumer et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.，94：3866-3871；Hartley et al.(1991)FEBS，290：1：65-68)。脱嘌呤的百分比可以通过扫描RNA凝胶照片的底片而确定(见例如Taylor et al.(1994)The Plant Journal，5：827-835)。

c.细胞生长/存活/生存力测定

通过直接评估对于细胞生长的作用可以确定RIP毒素或者其缀合物的活性，所述毒素如任何修饰的RIP包括例如在本发明提供的选择方法中鉴别的任何修饰的毒素。在这种测定中，可以在任何原核细胞或者真核细胞中导入编码毒素的DNA例如以合适的表达载体形式导入。或者，可以直接给任何原核细胞或者真核细胞施用RIP多肽或者其缀合物例如配体-毒素缀合物。可以检测任何细胞，包括但不限于任何原代细胞如直接得自对象即得自血液、血清或者其它组织来源的细胞。这种细胞包括任何白细胞亚型或者其活化的白细胞。细胞系也可以用于测定中以评估RIP多肽或者其缀合物的毒性。举例的细胞系是THP-1、U251或HT-29细胞。

细胞生长可以通过测定细胞增殖、细胞生存力或者细胞存活而监测。可以随时间监测生长以及在存在或者不存在增加浓度的毒素的条件下监测。例如，细胞生长可以通过如下方式进行监测：在Coulter计数器中计数细胞；测量细胞相对时间的光密度(Suh et al.(1998)Biochemistry，37：9394-9398)，使用DNA染料如MTT，其由肝细胞还原形成可被测量的不溶的紫色甲

(formazan)晶体(Arora et al.(1999)Cancer Research，59：183-188；McDonald et al.(2001)IDrugs，4：427-442)，或者通过使用染料如锥虫蓝监测，锥虫蓝是从活细胞排出而死细胞不排出的染料(McDonald et al.(2001)IDrugs，4：427-442)。在另一实例中，细胞生存力可以通过测量释放进入培养基中的ATP的量而评估。举例的这种测定是如在实施例5中描述的CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay Kit(Promega，Madison WI)。在ATP反应混合物(由厂商提供的CellTiter-

试剂)裂解细胞时，ATP推动萤光素氧化，产生发光信号，该信号与孔中ATP的浓度成比例。这与培养基中存活细胞数目成正比。

E.举例的修饰的毒素

本发明提供了修饰的RIP毒素多肽或者其缀合物，其与野生型RIP多肽相比呈现出降低的毒性活性。例如，修饰的RIP多肽或者其缀合物与参考或者起始形式毒素或者其缀合物相比呈现0.5％、1％、1.5％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或者更高的毒性活性。由于毒性降低，这种修饰的RIP毒素多肽由宿主细胞表达并且可以从中纯化、分离和/或鉴别。所述修饰的毒素或者其缀合物呈现出对于真核细胞或者原核细胞的毒性降低。通常，所述修饰的RIP毒素或者其缀合物呈现出对细菌细胞如大肠杆菌的毒性降低，从而允许毒素来源可以用于在大肠杆菌中的生产方法中。

典型地，这种修饰的RIP毒素多肽或者其缀合物保留起始或者野生型蛋白质(即未修饰多肽)的一或多种活性。例如，修饰的RIP毒素多肽或者其缀合物与未修饰的或者野生型RIP多肽或者其缀合物相比保留至少或大约0.5％、1％、1.5％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高的一或多种RIP活性。RIP多肽的活性包括但不限于任一或多种N-糖苷酶活性，多核苷酸：腺苷糖苷酶活性，包括RNAase活性和DNAase活性，超氧化物歧化酶活性，磷脂酶活性，壳多糖酶活性以及抗病毒活性。活性可以在体外或者在体内评估并且可以与起始RIP多肽的活性进行比较。

在一些实例中，这种修饰的RIP多肽在本发明的选择方法中鉴别，根据与宿主细胞不表达或者低水平表达的起始RIP多肽或者含有RIP多肽的多肽缀合物相比宿主细胞对其的表达情况加以鉴别。如上所述，这种修饰的RIP毒素多肽根据如下方式鉴别：导入编码起始或者野生型RIP多肽的核酸例如编码表3所示RIP多肽的任何核酸或者其活性片段，随后选择和鉴别表达的RIP多肽。在一些实例中，本发明提供的修饰的RIP毒素多肽是根据毒素从宿主细胞中的表达而鉴别的，所述宿主细胞中导入了编码起始RIP毒素或者其活性部分的核酸。在其它实例中，本发明提供的修饰的RIP毒素多肽是根据RIP毒素缀合物多肽(即配体-毒素缀合物)从宿主细胞中的表达而鉴别的，所述宿主细胞中导入了编码含有RIP毒素或者其活性部分的多肽的起始缀合物。典型地，这种缀合物是融合蛋白，从而使得编码融合蛋白的核酸分子导入细胞中。

使用本文所述方法，可以鉴别表达的RIP多肽中的特定修饰，例如通过对多肽测序进行鉴别。典型地，在本发明方法中鉴别的修饰包括改变未修饰的多肽的一级序列的任何修饰，包括但不限于任一或多个氨基酸置换、氨基酸缺失和/或氨基酸截短。例如，修饰包括一级序列中的任一或多个氨基酸突变或者一级序列的截短或者这些修饰的任意组合。因此，可以鉴别RIP多肽或者其活性片段中的氨基酸残基修饰，其由于所述多肽一级序列的改变而使得细胞毒性降低。

在本发明的选择方法中鉴别的表达的RIP多肽中的修饰可以在任何靶蛋白的相应位置产生，例如任何相关多肽如但不限于表达的RIP多肽的任何等位基因、物种、截短或者其它变体形式。这种修饰可以通过本领域技术人员已知的标准重组DNA技术产生。本领域已知的在靶蛋白中产生任一或多个氨基酸突变的任何方法均可以使用。所述方法包括对编码核酸分子进行的标准定点诱变(使用例如得自Stratagene的QuikChange试剂盒)或者固相多肽合成方法。

此外，在本发明的方法中鉴别的或者基于在本发明方法中鉴别的修饰而产生的任何修饰的RIP多肽可以用于产生融合蛋白或者缀合物。例如，可以产生这样的配体-毒素缀合物，其具有修饰的毒素部分作为被靶向物质(见下文章节F)，与靶向细胞表面受体的任何部分直接或者间接连接以使其内化。这种缀合物可以通过常规重组DNA技术产生。例如可以使用常规亚克隆希望的缀合物成分的限制酶和克隆方法产生缀合物。产生的具有在本发明选择方法中鉴别的修饰的任何修饰的多肽包括任何缀合物均保留毒性活性。这种修饰的多肽通常保留或者显示任一或多种RIP活性。可以对所述缀合物的毒性活性及其它活性进行检测。

在修饰的RIP多肽或者其缀合物中也可以包含在或不在多肽一级序列中的其它修饰，例如但不限于加入碳水化合物部分、加入聚乙二醇(PEG)部分、加入Fc结构域等。例如，可以产生这种额外的修饰以增加蛋白质的稳定性或半衰期。

修饰的SA1毒素

举例的本发明提供的RIP毒素是修饰形式的SA1，包括其任何活性形式的修饰，例如其任何截短形式，只要截短的多肽呈现RIP活性即可，以及其等位基因变体或物种变体。例如，修饰的SA1多肽可包括在如SEQ IDNO：22或SEQ ID NO：24所示SA1截短变体或者其任何等位基因变体或物种变体中的任一或多个修饰。修饰的SA1毒素与选择方法中使用的起始SA1毒素相比可以是截短的或者可以表达氨基酸突变。典型地，这种修饰的毒素与起始SA1多肽相比保留一或多种活性。因此，这种修饰的SA1多肽可用于改良SA1多肽生产的方法中和/或可用于融合蛋白中以产生含有修饰的SA1多肽的缀合物蛋白。

修饰的SA1多肽可以在本发明的选择方法中鉴别。在一个实例中，修饰的SA1多肽可以在导入编码SA1多肽或者其活性片段的核酸之后鉴别。例如，修饰的SA1多肽的选择可以在导入编码SEQ ID NO：22所示变体1SA1多肽的核酸之后实现。在另一实例中，修饰的SA1多肽的选择可以在导入编码变体2 SA1多肽的核酸之后实现。变体2 SA1是与SEQ ID NO：22所示变体1 SA1相比缺少5个C末端氨基酸(CHHHA)以避免半胱氨酸诱导的二聚体化的一种SA1形式。变体2 SA1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：24，由SEQ ID NO：25所示核酸序列编码。

在一些情况中，修饰的SA1多肽的选择可以在导入编码含有SA1多肽部分的缀合物的核酸之后实现。所述缀合物可包括任何配体-毒素缀合物或者其它缀合物，只要所述缀合物含有SA1多肽或者其活性片段即可。例如，美国专利No.7,166,702、7,157,418和7,192,736中描述的趋化因子缀合物可用作起始蛋白以鉴别修饰形式的变体1 SA1多肽(如SEQ ID NO：22所示，由SEQ ID NO：23所示核酸序列编码)。在一个实例中，LPM1a多肽用作起始蛋白，其是与变体1 SA1多肽间接连接的趋化因子MCP-1的缀合物。LPM1a缀合物如SEQ ID NO：38所示，由SEQ ID NO：37所示核酸序列编码。在另一实例中，含有与SA1的变体2形式连接的趋化因子MCP-1的缀合物可用作起始未修饰蛋白，在本文也称作LPM1b。LPM1b缀合物如SEQID NO：40所示，由SEQ ID NO：39所示的核酸序列编码。

本发明提供了修饰的SA1毒素，其含有在第38位的氨基酸突变，相应于SEQ ID NO：22所示变体SA1多肽的第38位。例如，氨基酸修饰可相应于位置L38。举例的在本发明提供的方法中鉴别的SA1中氨基酸突变相应于如SEQ ID NO：22所示变体SA1多肽中的L38R修饰。在一些实例中，相应的L38R突变在其它SA1变体形式中鉴别或产生，包括在等位基因变体或物种变体中产生。例如，相应的L38R突变可以在SEQ ID NO：24所示SA1的变体2序列中产生。举例的具有L38R氨基酸突变的SA1毒素如SEQID NO：26所示，由SEQ ID NO：27所示氨基酸序列编码。这种修饰的SA1在本文也称作突变变体1(也称作变体3)。突变变体1 SA1多肽可用于产生进一步的毒素缀合物，其可用于例如对其设计缀合物的疾病或失调的治疗方法中。此外，突变变体1 SA1多肽可用于改良SA1或者其缀合物的生产的方法中。

在另一实例中，本发明提供了修饰的SA1毒素，其含有在219位的氨基酸突变，相应于SEQ ID NO：22所示变体SA1多肽的第219位。例如，氨基酸修饰可相应于位置V219。在本发明提供的方法中鉴别的SA1中举例的氨基酸突变相应于如SEQ ID NO：22所示变体SA1多肽中的V219A修饰。在一些实例中，相应V219A突变在其它SA1变体形式中鉴别或产生，包括在等位基因变体或物种变体中产生。例如，相应V219A突变可以在SEQ IDNO：24所示SA1的变体2序列中产生。举例的具有V219A氨基酸突变的修饰的SA1多肽如SEQ ID NO：28所示，由SEQ ID NO：29所示氨基酸序列编码。这种修饰的SA1在本文也称作突变变体2(也称作变体4)。所述突变变体2 SA1多肽可用于产生进一步的毒素缀合物，其可用于例如治疗对其设计所述缀合物的疾病或失调的方法中。此外，突变变体2 SA1多肽可用于改良SA1或者其缀合物的生产的方法中。

此外，可以组合在本发明的选择方法中在修饰的RIP多肽中鉴别的任何突变。例如可以产生这样的修饰的SA1多肽或者其缀合物，其具有相应于SEQ ID NO：22所示变体SA1中的位置的L38和V219修饰。这种修饰可以在任何SA1多肽如SEQ ID NO：22或24分别示出的SA1多肽、其任何等位基因变体或物种变体或者在本领域技术人员已知的任何其它SA1变体的相应位置产生。再者，在本发明的选择方法中在修饰的RIP多肽中鉴别的任何突变可以与本领域技术人员已知的或者随后鉴别的RIP多肽中的任何其它突变组合。典型地，RIP多肽或者其缀合物中任何这种组合突变体与野生型或者起始形式RIP多肽相比均呈现对于宿主细胞的毒性降低，但是与参考或者起始形式毒素或者其缀合物相比仍保留0.5％、1％、1.5％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或者更高的毒性活性。

F.靶向物质及其缀合物

本发明提供了含有RIP毒素或者其活性片段的缀合物，所述RIP毒素或者其活性片段与一或多种部分或物质如任何化学物、多肽或者肽部分或者其一部分直接或者间接连接。典型地，用于本发明提供的缀合物中的毒素是含有任何RIP毒素变体包括任何修饰的RIP毒素变体的那些毒素。这种修饰的毒素包括本发明提供的或者使用本发明的选择方法鉴别的任何修饰的RIP毒素例如修饰的SA1毒素或者其等位基因变体或片段。这种修饰的SA1包括在本发明的选择方法中鉴别的突变变体1 SA1(即变体3)或者突变变体2 SA1(即变体4)。

典型地，修饰的RIP毒素与靶向物质直接或者间接连接，所述靶向物质包括通过选择性结合细胞表面受体而使得所述缀合物靶向一或多种细胞类型的任何物质(即在此称作配体-毒素缀合物)。因此，可以使用结合细胞表面受体并且由细胞内化的任何多肽或分子。这种靶向物质包括但不限于生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体以及激素或者其等位基因变体、突变蛋白或者其片段，只要所述靶向物质通过细胞表面受体内化即可。此外，本发明提供的缀合物可任选包含其它成分，例如但不限于其它序列或部分以便于克隆、表达、翻译后修饰、纯化、检测和施用。这些包括例如限制酶序列、翻译起始或终止密码子序列、His标记或者其它这种成分。例如，可以在编码核酸序列中加入起始甲硫氨酸密码子或者Kozak序列以允许或者增强成熟多肽或者多肽片段的翻译。再者，如上文章节D所述，编码含有与靶物质(target agent)如SA1亚基或者其活性部分连接的靶向物质的配体-毒素缀合物的任何核酸分子均可用于筛选被靶向物质的变体如上文及实施例中描述的修饰的SA1。

1.靶向物质

通常，本发明提供的修饰的RIP毒素缀合物含有靶向物质，其使得所述缀合物靶向参与各种疾病病理学过程的细胞或者细胞群上的受体。根据疾病或失调的不同，这种细胞是活化的细胞，其决定疾病以及疾病过程，或者是旁观细胞(bystander cell)，其支持疾病过程。因此，靶向这些受体以及表达这些受体的细胞允许适应于特定疾病以及疾病进程的治疗。因此，本发明提供的缀合物可以在各种疾病的治疗中用作治疗剂。

例如，本发明提供的缀合物包括配体-毒素，其含有结合参与免疫应答的特殊细胞类型上的受体的靶向部分，所述细胞类型包括参与炎性疾病的各种白细胞亚型。例如，作为本发明提供的缀合物的成分，靶向部分可包括配体，所述配体靶向在免疫系统细胞例如白细胞系的任何细胞或者其它组织居留细胞包括参与疾病过程的活化细胞上表达的一或多种细胞表面受体。可以由所述缀合物靶向的举例的细胞类型包括但不限于白细胞，包括但不限于单核细胞，巨噬细胞包括组织巨噬细胞如脑的小胶质细胞、肝的kupfer细胞或者肺尘细胞，B细胞，T细胞包括Th1和Th2细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，树突细胞包括不成熟和成熟的树突细胞以及朗格汉斯细胞，肥大细胞，天然杀伤细胞和嗜中性粒细胞。可以被靶向的其它细胞类型的例子包括血小板、星形胶质细胞、内皮细胞、神经元、上皮细胞和脂肪细胞。

a.趋化因子

本发明提供了缀合物，在所述配体-毒素缀合物中使用的靶向物质选自趋化因子家族。为了评估趋化因子作为靶向物质在本发明的缀合物中的应用，对于趋化因子配体及其受体的功能和相互作用的了解是有益的。下文的论述提供了这种背景。

趋化因子是四十种或更多种小蛋白质的家族，典型由细胞分泌并且刺激附近表达关联趋化因子受体(cognate chemokine receptor)的应答细胞、典型为白细胞的活化和/或迁移(趋化性)。趋化因子在一起靶向全部白细胞亚型；单个的每一种趋化因子则靶向部分白细胞亚型。尽管一些趋化因子是组成型的并且参与稳态免疫应答，但是许多趋化因子被称作炎性趋化因子并且应答细菌感染、病毒及其它刺激剂而从广泛的细胞中诱导。

趋化因子具有许多种生物学活性。它们最初是通过其刺激白细胞迁移和活化的能力而被分离。趋化因子与粘附分子结合，募集白细胞亚类至炎症和组织损伤的特定部位。例如，趋化因子主要是作为化学引诱剂通过刺激在多种白细胞上表达的趋化因子受体而起作用，所述白细胞包括在先天性免疫中的那些细胞，从而从血液中募集单核细胞、嗜中性粒细胞及其它效应细胞至感染或损害部位，以及在获得性免疫中的那些细胞，包括募集淋巴细胞至免疫反应部位。通常，趋化因子和趋化因子受体表达在疾病中上调，趋化因子以自分泌或者旁分泌方式起作用(Glabinski et al.(1995)Int.J.Dev.Neurosci.，13：153-65；Furie and Randolph(1995)Am.J.Pathol.，146：1287-301；Benveniste E.N.(1997)J.Mol.Med.，75：165-73；Schall et al.(1994)Current Biol.，6：865-73；Taub et al.(1994)Ther.Immunol.，1：229-46；Baggliolini et al.(1994)Adv.Immunol.，55：97-179；以及Haelensetal.(1996)Immunobiol.，195：499-521；Taub，Cytokine Growth Factor Res.，7：355-76，1996；Dong et al.，Eur.J.Dermatol.，13：224-30，2003；Pastore etal.，Eur.J.Dermatol.，14：203-8，2004：Charo and Ransohoff，N Eng J Med.，354：610-21，2006)。

趋化因子还诱导细胞活化，包括但不限于小胶质细胞和巨噬细胞。因此，据信趋化因子诱导活性氧、降解酶以及炎症和毒性细胞因子从各种白细胞群中产生和释放。此外，趋化因子已经示出调节造血祖细胞增殖，而且一些CXC趋化因子可以调节血管发生。趋化因子在包含炎性组织破坏的许多疾病中也起作用，如成人呼吸窘迫综合征、心肌梗塞、类风湿性关节炎以及动脉粥样硬化。

趋化因子最初是例如根据其功能或来源而命名。在本文中使用的是针对给定配体的最常用的名称。近来采用系统命名法，其使用趋化因子组名，随后是数字。例如配体单核细胞化学引诱蛋白(MCP)-1和白细胞介素(IL)-8被系统命名法分别称作CCL2和CXCL8。其受体被分别称作CCR2和CXCR1/2(表x和7；Bacon，et al.，J.Interferon Cytokine Res.，22：1067-8，2002；Murphy，Pharmacol.Rev，54：227-9，2002；Murphy et al.，Pharmacol.Rev.，52：145-76，2000)。趋化因子和趋化因子受体在本文中可交替使用常用名和系统命名法名称。给出一个名称，本领域技术人员已知或者可以确定相应名称。

i.配体

如上所述，趋化因子是小的(大约6-14 kDa)、可诱导和分泌的、化学引诱细胞因子的超家族，其主要作用于白细胞亚型。趋化因子配体在其一级结构中具有15-50％的相同性，但是其共有的高度保守的三维结构与受体结合和活化相关。该超家族基于其一级序列中4个保守半胱氨酸残基的位置(或者存在)而被分成4个亚家族。其中三组含有这四个半胱氨酸，另一组不含有半胱氨酸。通过前两个半胱氨酸的排列定义组。如果前两个半胱氨酸由一个氨基酸隔开，则其是CXC家族(也称作α)成员；如果所述半胱氨酸是相邻的，则其被分类为CC家族(也称作β)；如果所述半胱氨酸由三个氨基酸隔开，则称之为CX₃C，它们是第三组的成员(也称作δ)。第四组趋化因子C或γ，其含有相应于其它组中第一个和第三个半胱氨酸的两个半胱氨酸。

结构分析证实大多数趋化因子作为单体起作用，而且受体结合所需的两个区域位于成熟多肽的柔性N末端的前35个氨基酸内(Clark-Lewis et al.(1995)J Leukocyte Biol.，57：703-11；Beall et al.(1996)Biochem.J.313：633-40；以及Steitz et al.(1998)FEBS Lett 430：158-64)。趋化因子二聚体可以形成，其形成在趋化因子之间有所不同。二聚体的形成典型在溶液中高浓度发生(Baggiolini et al.(2001)J Int.Med.，250：91-104)。然而，二聚体在稀释时解离而且单体组成生物学活性分子。

一般而言，α趋化因子成员优先作用于嗜中性粒细胞和T-淋巴细胞，β趋化因子作用于单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和T-淋巴细胞。此外，α和β趋化因子亚家族的一些成员作用于树突细胞，该细胞是在由不成熟的吞噬细胞活化和成熟后呈现强力抗原呈递性质的迁移细胞，据认为其参与许多炎性疾病的病理生理学(例如Xu et al.，J.Leukoc.Biol.，60：365-71，1996；Sozzani et al.，J.Immunol.，159：1993-2000，1997；Hashimoto et al.，JDermatol Sci.，44：93-9，2006；van Rijt et al.，J Exp Med，201：981-91，2005)。已经报道了称作CXXXC趋化因子的第四种人CX3C-型趋化因子(Bazan etal.，Nature，385：640-4，1997；Imai et al.，Cell，91：521-30，1997；Mackay，Curr.Biol.7：R384-6，1997)。与其它趋化因子不同，CXXXC趋化因子以膜和可溶形式存在。该可溶形式是单核细胞和T-细胞的化学引诱物。这种趋化因子的细胞表面受体被称作CX3CR1。应注意衍生自不同物种的趋化因子的化学性质和生理效应可略为不同(Baggliolini et al.，Adv.Immunol.，55：97-179，1994；and Haelens et al.，Immunobiol.，195：499-521，1996)。

表4示出了举例的趋化因子，包括其异名，以及举例的SEQ ID NO。此外表4示出了参照各自SEQ ID NO中位置的信号序列和编码成熟细胞因子的氨基酸位置。注意氨基酸位置的描述只是举例说明，而非限制本发明提供的实施方案的范围。应理解多肽及其描述是基于与相似多肽的同源分析及序列对比而在理论上推导的。因此，精确的位置可以变化，每个多肽非必需相同。趋化因子的等位基因变体或者物种变体也已知。举例的趋化因子的举例的等位基因变体如SEQ ID NO：170-191任一所示。

表4：举例的趋化因子配体

趋化因子	异名	UniProtNO：	信号序列	成熟趋化因子	SEQIDNO：
						MCP-1(单核细胞化学引诱蛋白-1)	CCL2；小的可诱导的细胞因子A2；MCAF；单核细胞分泌蛋白JE；HC11；SCYA2	P13500	1-23	24-99	112
Eotaxin(嗜酸性粒细胞趋化蛋白)	CCL11；小的可诱导的细胞因子A11；SCYA11	P51671	1-23	24-97	113
						SDF-1β(基质衍生因子1)	CXCL12；前B细胞生长刺激因子(PBSH)；hIRH	P48061	1-21	22-93	114
GRO-α(生长调节蛋白α)	CXCL1；黑素瘤生长刺活化性(MGSA)；嗜中性粒细胞活化蛋白3(NAP-3)；SCYB1	P09341	1-34	35-107	115
						MIP-1β(巨噬细胞炎症蛋白1-β)	CCL4；小的可诱导的细胞因子A4；T-细胞活化蛋白2；ACT-2；PAT744；H400；SIS-γ；淋巴细胞活化基因1蛋白(LAG-1)；HC21；G-26T-淋巴细胞分泌蛋白；SCYA4	P13236	1-23	24-92	116
IL-8(白细胞介素-8)	CXCL8；单核细胞衍生嗜中性粒细胞趋化因子(MDNCF)；T-细胞趋化因子；嗜中性粒细胞活化蛋白1(NAP-1)；蛋白3-10C；粒细胞趋化蛋白1(GCP-1)；单核细胞衍生嗜中性粒细胞活化肽(MONAP)；Emoctakin	P10145	1-20	21-99	117
						IP-10(干扰素可诱导蛋白-10)	CXCL10；小的可诱导的细胞因子B10；10kDa干扰素-γ-诱导蛋白；γ-IP10；SCYB10	P02778	1-21	22-98	118
MCP-3(单核细胞趋化蛋白3)	CCL7；小的可诱导的细胞因子A7；NC28；SCYA7	P80098	1-23	24-99	119

趋化因子	异名	UniProtNO：	信号序列	成熟趋化因子	SEQIDNO：
						MIP-3α(巨噬细胞炎症蛋白3α)	CCL20；小的可诱导的细胞因子A20；肝和活化调节趋化因子肝和活化调节的趋化因子(LARC)；β趋化因子exodus-1；SCYA20	P78556	1-26	27-96	120
MDC(巨噬细胞来源的趋化因子)	CCL22；小的可诱导的细胞因子A22；刺激的T细胞趋化蛋白1(STCP-1)；SCYA22	O00626	1-24	25-93	121
						MIP-1α(巨噬细胞炎症蛋白1-α)	CCL3；小的可诱导的细胞因子A3；扁桃体淋巴细胞LD78α蛋白；G0/G1开关调节蛋白19-1(G0S19-1蛋白)；SIS-β；PAT 464.1；SCYA3	P10147	1-23	24-92	122
BCA-1(B细胞吸引趋化因子1)	CXCL13；小的可诱导的细胞因子B13；B淋巴细胞化学引诱物；CXC趋化因子BLC；ANGIE；SCYB13	O43927	1-22	23-109	123
						GCP-2(粒细胞趋化蛋白2)	CXCL6；小的可诱导的细胞因子B6；趋化因子α3(CKA-3)；SCYB6	P80162	1-37	38-114	124
ENA-78(上皮来源的嗜中性粒细胞活化蛋白78)	CXCL5；小的可诱导的细胞因子B5；SCYB5	P42830	1-36	37-114	125
						PBP (血小板碱性蛋白)	CXCL7；小的可诱导的细胞因子B7；粒细胞衍生生长因子(LDGF)；巨噬细胞衍生生长因子(MDGF)；结缔组织活化肽e III(CTAP-III)；低亲和性血小板因子IV(LA-PF4)；TC-2；β-血小板球蛋白；嗜中性粒细胞活化肽2(NAP-2)；SCYB7	P02775	1-34	35-128	126
MIG(γ干扰素诱导的单核因子)	CXCL9；小的可诱导的细胞因子B9；SCYB9	Q07325	1-22	23-125	127
						PF-4(血小板因子4)	CXCL4；制瘤素A；Ironplact；SCYB4	P02776	1-31	32-101	128

趋化因子	异名	UniProtNO：	信号序列	成熟趋化因子	SEQIDNO：
						PF-4var1(血小板因子4变体)	CXCL4L1；PF4alt；PF4V1；SCYB4V1	P10720	1-30	31-104	129
SDF-2(基质衍生因子2)		Q99470	1-18	19-211	130
						MCP-2(单核细胞趋化蛋白2)	CCL8；小的可诱导的细胞因子A8；HC14；SCYA10；SCYA8	P80075	1-23	24-99	131
MCP-4(单核细胞趋化蛋白4)	CCL13；小的可诱导的细胞因子A13；CK-β-10；NCC-1；SCYA13	Q99616	1-16	17-98	132
						MIP-4(巨噬细胞炎症蛋白4)	CCL18；小的可诱导的细胞因子A18；肺和活化调节的趋化因子(PARC)；巨噬细胞替代活化相关CC趋化因子1(AMAC-1)；树突细胞趋化因子1(DC-CK1)	P55774	1-20	21-89	133
MIP-3β(巨噬细胞炎症蛋白3-β)	CCL19；小的可诱导的细胞因子A19；EBI1-配体趋化因子(ELC)；β趋化因子exodus-3；CK β-11；SCYA19	Q99731	1-21	22-98	134
						MIP-2α(巨噬细胞炎症蛋白2-α)	CXCL2；生长调节蛋白β(GRO-β)；GRO2；GROB；SCYB2	P19875	1-34	35-107	135
MIP-2β(巨噬细胞炎症蛋白2-β)	CXCL3；生长调节蛋白γ(GRO-γ)；GRO3；GROG；SCYB3	P19876	1-34	35-107	136
						MIP-5(巨噬细胞炎症蛋白5)	CCL15；小的可诱导的细胞因子A15；趋化因子CC-2；HCC-2；NCC-3；MIP-1δ；Leukotactin；LKN-1；Mrp-2b；SCYA 15	Q16663	1-21	22-113	137
HCC-1(HemofiltrateCC趋化因子1)	CCL14；小的可诱导的细胞因子A14；趋化因子CC-1/CC-3；HCC-1/HCC-3；NCC-2；SCYA14	Q16627	1-19	20-93	138
						RANTES(调节活化正常T细胞表达和分泌的)	CCL5；小的可诱导的细胞因子A5；SIS-δ；T细胞特异性蛋白P228	P13501	1-23	24-91	139

趋化因子	异名	UniProtNO：	信号序列	成熟趋化因子	SEQIDNO：
							(TCP228)；SCYA5
Eotaxin-2(嗜酸性粒细胞趋化蛋白2)	CCL24；小的可诱导的细胞因子A24；骨髓祖细胞抑制因子2(MPIF-2)；CK-β-6；SCYA24)	O00175	1-26	27-119	140
						TARC (胸腺和活化调节的趋化因子)	CCL17；小的可诱导的细胞因子A17；SCYA17	Q92583	1-23	24-94	141
T淋巴细胞分泌的蛋白1-309	CCL1；小的可诱导的细胞因子A1；SCYA1	P22362	1-23	24-96	142
						淋巴细胞趋化因子	XCL1；小的可诱导的细胞因子C1；细胞因子SCM-1；ATAC；Lymphotaxin；SCM-1-α；XC趋化因子配体1；SCYC1	P47992	1-21	22-114	143
Lungkine	CXCL15；小的可诱导的细胞因子B15；SCYB15	Q9WVL17	1-25	26-167	144
						C10	CCL6；小的可诱导的细胞因子A6；SCYA6	P27784	1-21	22-116	145
MIP-1γ(巨噬细胞炎症蛋白1-γ)	CCL9；CCL10；小的可诱导的细胞因子A9；巨噬细胞炎症蛋白-相关蛋白2(MRP-2)；CCF18；SCYA9；SCYA10	P51670	1-21	22-122	146
						MCP-5(单核细胞趋化蛋白5)	CCL12；小的可诱导的细胞因子A 12；MCP-1-相关的趋化因子；SCYA12	Q62401	1-22	23-104	147
LEC (肝表达的趋化因子)	CCL16；小的可诱导的细胞因子A16；IL-10-可诱导的趋化因子；Monotactin-1(MTN-1)；HCC-4；NCC-4；淋巴细胞和单核细胞化学引诱物(LMC)；LCC-1；ILINCK；SCYA16	O15467	1-23	24-120	148

趋化因子	异名	UniProtNO；	信号序列	成熟趋化因子	SEQIDNO：
						Exodus-2	CCL21；小的可诱导趋化因子A21；6Ckine；二级淋巴-组织趋化因子(SLC)；SCYA21	O00585	1-23	24-134	149
MIP-3(巨噬细胞炎症蛋白3)	CCL23；小的可诱导的细胞因子A23；骨髓祖细胞抑制因子1(MPIF1)；CK-β-8；CKB-8；SCYA23	P55773	1-21	22-120	150
						TECK(胸腺表达的趋化因子)	CCL25；小的可诱导的细胞因子A25；SCYA25	O15444	1-23	24-150	151
Eotaxin-3	CCL26；小的可诱导的细胞因子A26；巨噬细胞炎症蛋白4-α(MIP-4-α)；胸腺基质趋化因子-1(TSC-1)；IMAC；SCYA26	Q9Y258	1-23	24-94	152
						CTACK(皮肤T-细胞引诱性趋化因子)	CCL27；小的可诱导的细胞因子A27；ILC；IL-11R-α-locus趋化因子；Skinkine；ESkine；SCYA27	Q9Y4X3	1-24	25-112	153
MEC(粘膜相关上皮趋化因子)	CCL28；小的可诱导的细胞因子A28；CCK1；SCYA28	Q9NRJ3	1-19	20-127	154
						SCM-1β(单一C基序-1β)	XCL2；XC趋化因子配体2；SCM-1b；SCYC2	Q9UBD3	1-21	22-114	155
I-TAC (干扰素可诱导的T细胞α化学引诱物)	CXCL11；小的可诱导的细胞因子B11；干扰素-γ-可诱导的蛋白9(IP-9)；H174；β-R1；SCYB9B；SCYB11	O14625	1-21	22-94	156
						BRAK (胸-肾表达的趋化因子)	CXCL14；小的可诱导的细胞因子B14；Bolekine；NJAC；SCYB14	O95715	1-22	23-99	157
SR-PSOX(磷脂酰丝氨酸和氧化的低密度脂蛋白的清除剂受体)	CXCL16；小的可诱导的细胞因子B16；SCYB16	Q9H2A7	1-29	30-254	158
						CXXXC趋化因子	CX3CL1；小的可诱导的细胞因子D1；Neurotactin；CX3C膜锚定的趋化因子；FKN；SCYD1	O35188	1-24	25-395	159

趋化因子	异名	UniProtNO：	信号序列	成熟趋化因子	SEQIDNO：
						LD78-β	CCL3L1；小的可诱导的细胞因子A3-like1；扁桃体淋巴细胞LD78β蛋白；G0/G1开关调节蛋白19-2(G0S19-2蛋白)；PAT464.2；SCYA3L1	P16619	1-23	24-93	160
MIP-1b2(巨噬细胞炎症蛋白-1b2)	CCL4L1；CC趋化因子配体4L1	Q8NHW4	1-23	24-92	161

ii.趋化因子受体

趋化因子通过G-蛋白偶联七次跨膜视紫红质样细胞表面受体介导其活性。典型地，CXC趋化因子结合七种CXC-受体(CXCR1、2、3A、3B、4、5、6)中的一或多种，而CC趋化因子结合十一种CC-受体(CCR1、2A、2B、3-10)中的一或多种。其它趋化因子受体包括XCR1，CX3CR，D6，CKX-CKR和Duffy(也称作趋化因子Duffy抗原受体或者DARC)。DARC、D6和CKX-CKR是清除剂趋化因子受体，其可以结合所有四组的趋化因子配体(Hansell et al.，Biochem Soc Trans.，34：1009-13，2006；Locati et al.，CytokineGrowth Factor Rev.，16：679-86，2005)。举例的趋化因子受体包括但不限于趋化因子Duffy抗原受体(DARC)、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR-6、CXCR-7、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1、XCR1、D6及其它趋化因子受体。

趋化因子与其靶细胞的受体结合是复杂且不断研究进展的领域。通常，受体以重叠和复合方式结合各种配体。炎症细胞典型表达一些趋化因子受体，而且一种以上的趋化因子可以结合一种受体。例如，β趋化因子受体CCR3不仅结合MCP-3、MCP-4和RANTES，而且还结合三种其它CC趋化因子，Eotaxin、Eotaxin-2和Eotaxin-3(He et al.，Nature，385：645-49，1997；Jose et al.，J.Exp.Med.，179：881-7，1994；Jose et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，205：788-94，1994；Ponath et al.，J.Clin.Invest.，97：604-12，1996；Daugherty et al.，J.Exp.Med.183：2349-54，1996；and Forssman et al.，J.Exp.Med.，185：2171-6，1997)。Eotaxin、Eotaxin-2和-3是CCR3-特异性的(Ponathet al.，J.Clin.Invest.，97：604-12，1996；Daugherty et al.，J.Exp.Med.183：2349-54，1996；and Forssman et al.，J.Exp.Med.，185：2171-6，1997；Kitaura etal.，JBiol Chem.，274：27975-80，1999)。另一例子是α-趋化因子CXCR4(融合素)HIV共同受体。已经鉴别了特异性结合这种受体的趋化因子基质衍生因子(SDF)的一些异构体，包括SDF-1α、SDF-1β和SDF-2，其存在于炎症细胞的各种亚类中且是高度强力的MNP细胞引诱物(Ueda et al.，J.Biol.Chem.，272：24966-70，1997；Yi et al.，J.Virol.，72：772-7，1998；Shirozu et al.，Genomics，28：495-500.1995；Shirozu et al.，Genomics，37：273-80，1996；Bleulet al.，J.Exp.Med.，184：1101-9，1996；Tanabe et al.，J.Immunol.159：905-11，1997；以及Hamada et al.，Gene，176：211-4，1996；Yu et al.，Gene 374：174-9，2006)。

在一些实例中，趋化因子与特异性受体的结合受到特定氨基酸基序存在与否的影响，所述基序例如是三肽ELR基序(Glu-Leu-Arg)。CXC-受体结合受到这种基序的影响。ELR阳性趋化因子通常结合CXCR2受体，是生成血管的且优先靶向嗜中性粒细胞。相反，ELR阴性趋化因子结合CXCR3和5，是抗血管发生的且优先靶向T-淋巴细胞、NK细胞、不成熟的树突细胞(IDC)以及活化的内皮细胞。ELR阴性趋化因子SDF-1β(CXCR4)以及一些CC趋化因子包括MCP-1(CCR2)也是血管发生的(Strieter et al.(2005)Cytokine Growth Factor Res.，16：593-609；Salcedo et al.(2000)Blood 96：34-40)。趋化因子还结合细胞表面肝素和粘多糖，以被认为维持促进为白细胞活化以及从循环转运(外渗)至发炎组织中所需梯度的方式结合(Schall etal.，Current Biol.，6：865-73，1994；Tanaka et al.，Immunology Today，14：111-15，1993；Neel et al.，Cytokine Growth Factor Rev.，16：637-58，2005；Johnson et al.，Biochem.Soc.Trans.，32：366-77，2004)。

表5示出了对于举例的趋化因子及其受体的趋化因子/趋化因子对抗特异性。务必注意某些趋化因子已经示出以拮抗形式结合不同的趋化因子受体。表5中的数据与人有关。在趋化因子受体特异性之间可以存在物种差异，而且所述趋化因子对于不同受体可具有不同亲和性。因此，可以制备物种特异性以及受体特异性缀合物。在物种成员中在受体中也存在等位基因差异，且如果需要，可以制备等位基因特异性缀合物。此外，不同物种表达人趋化因子同系物。例如，TCA-3是人I-309的鼠同系物(I.Goya et al.(1998)J.Immunol.，160：1975-81)。

表5：举例的趋化因子配体-受体特异性

趋化因子配体	趋化因子受体
		MCP-1(单核细胞化学引诱物蛋白-1)	CCR2；D6
Eotaxin(嗜酸性粒细胞趋化蛋白)	CCR3；CCR5
		SDF-1β(基质衍生因子1)	CCR4，CXCR7
GRO-α(生长调节蛋白α)	CXCR2；CXCR1；Duffy
		MIP-1β(巨噬细胞炎症蛋白1-β)	CCR5；D6
IL-8(白细胞介素-8)	CXCR1；CXCR2；Duffy
		IP-10(干扰素可诱导蛋白-10)	CXCR3A；CXCR3B
MCP-3(单核细胞趋化蛋白3)	CCR1；CCR2；CCR3
		MIP-3α(巨噬细胞炎症蛋白3α)	CCR6
MDC(巨噬细胞来源的趋化因子)	CCR4
		MIP-1α(巨噬细胞炎症蛋白1-α)	CCR1；CCR5
BCA-1(B细胞吸引趋化因子1)	CXCR5
		GCP-2(粒细胞趋化蛋白2)	CXCR1；CXCR2
ENA-78(上皮来源嗜中性粒细胞活化蛋白78)	CXCR2
		MIG(γ干扰素诱导的单核因子)	CXCR3A；CXCR3B
SDF-2(基质衍生因子2)	未知
		MCP-2(单核细胞趋化蛋白2)	CCR1；CCR2；CCR3；CCR5；D6
MCP-4(单核细胞趋化蛋白4)	CCR1；CCR2；CCR3；D6
		MIP-4(巨噬细胞炎症蛋白4)	未知
MIP-3β(巨噬细胞炎症蛋白3-β)	CCR7；CCR11
		MIP-2α(巨噬细胞炎症蛋白2-α)	CXCR2
MIP-2β(巨噬细胞炎症蛋白2-β)	CXCR2
		MIP-5(巨噬细胞炎症蛋白5)	CCR1；CCR3；D6
HCC-1(Hemofiltrate CC趋化因子1)	CCR1；CCR5；D6
		RANTES(调节调节正常T细胞表达和分泌)	CCR1；CCR3；CCR5；Duffy；D6
Eotaxin-2(嗜酸性粒细胞趋化蛋白2)	CCR3
		TARC(胸腺和活化调节趋化因子)	CCR4
T淋巴细胞分泌蛋白I-309	CCR8；Duffy
		淋巴细胞趋化因子	XCR1
Lungkine	未知
		C10	CCR1
MIP-1γ(巨噬细胞炎症蛋白1-γ)	CCR1
		MCP-5(单核细胞趋化蛋白5)	CCR2；CCR3
LEC(肝表达趋化因子)	CCR1；CCR2；CCR5；CCR8
		Exodus-2	CCR7；CCR11
MIP-3(巨噬细胞炎症蛋白3)	CCR1
		TECK(胸腺表达趋化因子)	CCR9；CCR11
Eotaxin-3	CCR3
		CTACK(皮肤T细胞引诱趋化因子)	CCR10

趋化因子配体	趋化因子受体
		MEC(粘膜相关上皮趋化因子)	CCR10
SCM-1β(单一C基序-1β)	XCR1
		I-TAC(干扰素可诱导的T细胞α化学引诱物)	CXCR3A；CXCR3B
BRAK(胸和肾表达的趋化因子)	未知
		SR-PSOX(磷脂酰丝氨酸和氧化的低密度脂蛋白的清除剂受体)	CXCR6
CXXXC趋化因子	CX3CR1
		LD78-β	CCR5；D6
MIP-1b2(巨噬细胞炎症蛋白-1b2)	CCR5

iii.趋化因子/趋化因子受体细胞谱(Profile)

每种趋化因子受体均具有独特的白细胞特异性，但是各种趋化因子受体-白细胞特异性可以显著重叠(见例如表6)。例如，特异于相同趋化因子和相同功能的不同受体亚型可以在相同细胞上共表达。此外，作用于相同细胞上单独受体的不同趋化因子配体可诱导相同细胞应答。此外，不同的趋化因子配体可结合共有受体并诱导对于靶细胞的不同细胞应答。大多数趋化因子结合在白细胞特别是活化的白细胞上表达的受体，但是一些趋化因子受体可以在其它细胞类型上表达，例如多种组织居留细胞如红细胞、血小板、星形胶质细胞、内皮细胞、神经元、上皮细胞、脂肪细胞以及脑的小胶质细胞。表6包括非详尽的趋化因子受体的举例列表，只是示出了举例的白细胞亚型及已知在各种疾病和非疾病情况中表达每种趋化因子受体的其它细胞类型。

表6：举例的趋化因子受体-白细胞特异性

趋化因子受体	白细胞亚型
		CCR1	NK细胞；T细胞；IDC；MNP；TAM；嗜碱性粒细胞；嗜酸性粒细胞；PMN；血小板
CCR2	NK细胞；B细胞；T细胞；IDC；MNP；嗜碱性粒细胞；PMN
		CCR3	T细胞；Th2；MDC；嗜碱性粒细胞；嗜酸性粒细胞；血小板；MaC
CCR4	胸腺细胞；NK细胞；T细胞；Th2；IDC；MDC；MNP；嗜碱性粒细胞；血小板
		CCR5	胸腺细胞；NK细胞；B细胞；T细胞；Th1；IDC；MDC；MNP；GC；TAM；脂肪细胞
CCR6	B细胞；T细胞；IDC
		CCR7	B细胞；T细胞；MDC
CCR8	胸腺细胞；B细胞；T细胞；Th2；IDC；MDC；MNP
		CCR9	胸腺细胞；T细胞；MDC；MNP

趋化因子受体	白细胞亚型
		CCR10	T细胞
CXCR1	MNP；PMN；MaC；Astrocyte
		CXCR2	MNP；嗜酸性粒细胞；PMN；MaC
CXCP3A	NK细胞；B细胞；T细胞；Th1；MaC
		CXCR3B	NK细胞；B细胞；T细胞
CXCR4	胸腺细胞；B细胞；T细胞；IDC；MDC；MNP；GC；PMN；血小板；脂肪细胞；星形胶质细胞
		CXCR5	B细胞；T细胞；星形胶质细胞
CXCR6	NK细胞；T细胞
		XCR1	NK细胞；T细胞
CX3CR1	NK细胞；T细胞；MNP；PMN；星形胶质细胞

注：NK＝天然杀伤细胞；Th1＝1型辅助T细胞；Th2＝2型辅助T细胞；IDC＝不成熟的树突细胞；MDC＝成熟树突细胞；MNP＝单核吞噬细胞(单核细胞、巨噬细胞和小胶质细胞)；GC＝巨细胞(多核融合巨噬细胞)；TAM＝肿瘤相关巨噬细胞；PMN＝多单核嗜中性粒细胞；MaC＝肥大细胞。注意：上表只是举例非详尽地列出表达特定趋化因子受体的细胞类型。

每种细胞类型均具有趋化因子受体谱，其类似于指纹或者“chemoprint”，其依赖于特殊的细胞类型、功能类型、组织类型、疾病状态和疾病类型、细胞类型的发育状态、细胞受体的活化状态以及胞外环境，包括周围细胞类型和分子。例如，单核细胞谱系细胞趋向于与CXCR4和CCR1-3和5受体相关；嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞与CCR1-3和CXCR3和4相关；PMN与CXCR1、2和CCR1相关；B细胞与CCR1-7和CXCR3-5相关；Th1细胞与CXCR3和CCR5相关；以及Th2细胞与CCR2、3、4和8相关(例如Baggiolini，J.Intern.Med.，250：91-104，2001)。

通常，靶细胞的受体亚型的结合亲和性、特异性以及差异分布决定了特定趋化因子对产生炎症过程的贡献。在一个环境(setting)中确定的特定趋化因子的生物学谱也许在另一个中不正确，特别是如果在损伤或疾病期间靶细胞的比率和活化状态改变的情况中。因此如果需要，则特定趋化因子的生物学谱可以基于实际情况而确定。例如，单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)的作用与MCP-1相似，但是前者结合更广泛的细胞和受体。除了在不同细胞上不同受体的表达之外，在细胞表面上表达的受体数目可以变化。例如，CCR1和CCR2以每个单核细胞和淋巴细胞3000个受体的比率表达，而在嗜酸性粒细胞上有大约50000个CCR3受体(Borish and Steinke，J AllergyClin Immunol.，111：S460-75，2003)。这种差异可能与迁移方向和应答时间相关。例如，T细胞上高密度的CXCR4与由HIV诱导的较快死亡相关，较高密度的受体包括CCR2和CCR4与变应性哮喘患者中肺泡T细胞的募集相关(Kallinich et al.(2005)Clin.Exp.Allergy 35，26-33；Lelievre et al.(2004)AIDS Res.Hum.Retroviruses 20：1230-43)。

同样地，趋化因子受体谱在损伤或疾病期间通常改变。趋化因子配体/受体轴(ligand/receptor axes)被分类为组成型/稳态、可诱导的/炎性或者这二者(见例如表7)。因此，炎症趋化因子配体及其受体非必需表达直至发生疾病或损伤。例如，静止细胞一旦活化将迅速改变并上调受体表达(例如Ghirnikar，et al.(2000)Neurosci.Res.59：63-73：Henneken et al.(2005)Arthritis Res.Ther.7：R1001-13；Klitgaard et al.(2004)Acta.Ophthalmol.Scand.82：179-83；McDonald et al.(2001)IDrugs 4：427-42所述)。chemoprint的性质也依赖于环境中的炎症和非炎症介质的类型和丰度(例如Porcherayet al.(2006)Virology 349：112-20；Stout and Suttles(2004)J.Leukoc.Biol.76：509-13；Sozzani(2005)Cytokine Growth Factor Res.16：581-92；Mantovannietal.，Trends Immunol.，25：677-86，2004；Ben-Baruch，Cancer Metastasis Rev.，2006，提前出版)。表7示出在稳态和炎性条件下趋化因子/受体轴作为功能结果的举例表达谱。

表7：配体和受体的趋化因子超家族成员

表7只是举例说明，不同趋化因子/受体对的表达依赖于许多因素，例如但不限于疾病的阶段或者严重性。例如，某些白细胞亚型可以不存在直至临床病症已经达到特定阶段。同样，受体表达也可以改变。例如，在大鼠脊髓挫伤之前未检测到趋化因子。CCR2、CCR3、CCR5、CCR10和CXCR4的表达从损伤后第1天至损伤后第14天以时间依赖性方式差异上调(Ghirnikar，et al.(2000)Neurosci.Res.，59：63-73)。

某些配体/受体轴在特定疾病中起显著作用。例如，MCP-1/CCR2轴在许多疾病中起重要作用，所述疾病包括但不限于关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、再狭窄、多发性硬化、脊髓损伤(SCI)、癌症以及一些类别的慢性肾病(CKD)。在另一实例中，SDF-1β/CXCR4与关节炎及许多癌症相关，所述癌症包括卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌和脑癌。在另一实例中，MIG、IP-10、I-TAC/CXCR3A轴与器官移植排斥反应、1型糖尿病、增生性肾小球肾炎(GN)以及多发性硬化相关。在另一实例中，Eotaxin、Eotaxin-2和Eotaxin-3/CCR3在哮喘、嗜酸性粒细胞肺炎、食管炎和炎性皮肤病中是重要的轴。

在大多数情况中，多个趋化因子配体和趋化因子受体在特定疾病状态中表达(例如Mantovani(1999)Immunol.Today 20：254-7；Borish and Steinke(2003)J.Allergy Clin.Immunol.，111：S460-75；Charo and Ransohoff，N Engl JMed.，354：610-21，2006)。例如，在实验性多发性硬化(MS)的自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型中，T细胞可表达CCR5、CCR2和CXCR3(Matsui et al.(2002)J.Neuroimmunol.，128：16-22)。在另一实例中，在体外血脑屏障(BBB)迁移(transmigration)研究中，MCP-1/CCR2轴对于表达CCR2的MNP和T细胞的CNS渗出是重要的，尽管T细胞可表达CCR2、CCR5和CXCR3(Mahadet al.(2006)Brain 129：212-23；Callahan et al.(2004)J.Neuroimmunol.，153：150-7)。因此，当研究特殊的疾病或者损伤时，在选择所述毒素缀合物的靶向物质中可以建立任何特定配体/受体轴的空间、时间、生物学以及临床谱。

更为复杂的是，在病理学情况中，免疫细胞和起作用的组织居留细胞(TRC)可经历深入的表型变化并且可以表达与特殊细胞类型通常不相关的趋化因子受体。例如，尽管CXC趋化因子优选PMN，但是在血管炎败血病的大鼠模型和败血病小鼠模型中发生由CC趋化因子MCP-1和MIP-1α所致的深入的PMN化学引诱(Johnston et al.(1999)J.Clin.Invest.103：1269-76；Speyer et al.(2004)Am.J.Pathol.165：2187-96)。受体改变也出现在涉及MNP、T淋巴细胞和MaC的疾病中。它们可以被诱导在特殊炎症微环境中表达CXCR1和CXCR2(Smith et al.(2005)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.289：H1976-84；Lippert et al.(2004)Exp.Dermatol.13：520-5)。嗜酸性粒细胞通常表达功能性CCR2，即MCP-1关联受体(Dunzendorfer(2001)J.Allergy Clin.Immunol.108：581-7)。

iv.举例的趋化因子靶向物质

本发明提供的配体-毒素缀合物中使用的趋化因子配体典型是对于在一或多种免疫效应细胞上表达的至少一种趋化因子受体、典型是对于一种以上的趋化因子受体具有特异性的任何趋化因子，所述免疫效应细胞包括白细胞或者参与免疫调节或者炎症过程如促进继发组织损害的病理学炎症的其它起作用的效应细胞。这种受体通常是G-蛋白偶联7次跨膜结构域视紫红质样受体超家族成员，包括但不限于本领域已知的一或多种受体如趋化因子Duffy抗原受体(DARC)、D6、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR-6、CXCR-7、CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR10、CX3CR-1、XCR1及其它趋化因子受体。在一些实例中，选择用作本发明提供的缀合物中的靶向物质的趋化因子可以结合特异性受体，而在其它实例中，选择的趋化因子可以结合一种以上的受体。此外，用作缀合物中的靶向物质的选择的趋化因子与其它趋化因子可以呈现重叠和差异受体特异性(见例如表5)。

这种趋化因子配体包括上表4所示任何配体，包括任何α和β趋化因子以及趋化因子的其它相似亚组。更特别地，目前优选用作配体-毒素缀合物中蛋白质样配体部分的趋化因子包括但不限于本领域已知的α-趋化因子如IL-8；粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)；生长相关的致癌基因-α(GRO-α)、GRO-β和GRO-γ；上皮细胞来源的嗜中性粒细胞活化肽-78(ENA-78)；结缔组织活化肽III(CTAP III；嗜中性粒细胞活化肽-2(NAP-2)；干扰素-γ诱导的单核因子(MIG)；干扰素可诱导蛋白10(IP-10，其具有强化学引诱物作用，但是对于嗜中性粒细胞和T细胞不是唯一的)；基质细胞衍生因子SDF-1α、SDF-1β和SDF-2；本领域已知的β-趋化因子如单核细胞趋化蛋白MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4和MCP-5；巨噬细胞炎症蛋白MIP-1α、 MIP-1β、MIP-1γ、MIP-2、MIP-2α、MIP-2β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4和MIP-5；巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)；人趋化因子1(HCC-1)；RANTES；Eotaxin1；Eotaxin 2；Eotaxin-3；TARC；SCYA17和I-309；树突细胞趋化因子-1(DC-CK-1)；γ-趋化因子，淋巴细胞趋化因子；可溶形式的CX3C趋化因子CXXXC趋化因子(其是化学引诱物，但是对于单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和T细胞不是唯一的)；本领域技术人员已知的任何其它趋化因子；以及设计为结合趋化因子受体的任何合成或修饰的蛋白质。趋化因子可以使用常规方法分离自天然来源或者使用编码趋化因子的核酸表达。生物学活性的趋化因子已经在大肠杆菌中重组表达(例如可商购自R&D Systems，Minneapolis，MN的那些趋化因子)。

举例的其它趋化因子靶向物质包括结合和/或活化一或多种免疫细胞的任何趋化因子，所述免疫细胞如任何继发组织损害促进细胞，例如酰化的LDL清除剂受体1和2以及LDL、极低密度脂蛋白-1(VLDL-1)、VLDL-2、糖蛋白330/巨蛋白、脂蛋白受体相关蛋白(LRP)、α-2-巨球蛋白、sorLA-1的受体。至今仍未命名的特别有益的受体相关蛋白的分子量为大约39000道尔顿，其结合并调节蛋白质如低密度脂蛋白(LDL)-受体家族成员的活性。

本领域已知其它趋化因子，并且可以鉴别这种趋化因子及其特异性受体，在需要时生产并用于产生如本文所述的缀合物。如下文详述，可应用所得缀合物的疾病可以通过特异性和表达受体的细胞群确定，也可以使用本领域技术人员已知的、包括本文举例的、描述的和/或参考的那些体外和体内模型根据经验加以确定。

b.非趋化因子细胞因子

包括经典细胞因子的缀合物也可以用于本发明的缀合物中以及用于产生本发明提供的缀合物的方法中，所述经典细胞因子是非趋化因子细胞因子，其结合参与继发组织损害的细胞类型包括也表达趋化因子受体的任何细胞上的特异性细胞因子受体。包括这种经典细胞因子的缀合物已经用于治疗，例如通过靶向肿瘤细胞而治疗癌症。在本发明中，细胞因子根据其结合携带趋化因子-受体的细胞的能力而选择，所述细胞如浸润肿瘤的白细胞以及与不希望的炎症反应相关的其它细胞。

尽管趋化因子表面上分类为细胞因子，但是它们是独特类别的蛋白质。其被分类为细胞因子更因历史导致而非根据实际情况。当发现新的蛋白质时，例如以其表观活性或者其细胞来源而命名。因此，早期的细胞因子被认为是激素或者被称作生长因子。由于细胞因子共有激素和生长因子的许多性质，因此其区别依旧不清。例如，在综述文章中(见例如Wells et al.(1996)Ann Rev Biochem 65：609-34)短语“造血激素/细胞因子”用于描述细胞因子(涉及各种集落刺激因子的生物学活性相似性)。一些细胞因子活性最初分离自淋巴细胞和单核细胞，分别被称作淋巴因子和单核因子。当认识到这些分子呈现广谱活性且衍生自多种细胞类型时，创造术语“细胞因子”。

经典细胞因子(12-40 kDa蛋白质)包括干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素(因为其活性包括在白细胞之间的通讯而命名)、造血生长因子、生长激素、睫状神经营养因子等。这些细胞因子通过结构同源的I类细胞因子受体而调节许多不同类型细胞的增殖与分化。I类受体典型由两个多肽链组成，即配体特异性亚基和β信号转导亚基。这类受体基于相同亚基和第三个亚基的用途而可以再分。干扰素通过结构不同的一系列(α、β和γ)II类受体起作用。现在显现出不同TNF受体的家族。

细胞因子受体通常通过JAK/STAT胞内信号途径发出信号，但是也可以通过其它信号级联发出信号。值得注意的是，结合这些受体的细胞因子如白细胞介素无一结合任何结构不同的趋化因子受体(如上述)且无趋化因子配体结合任何上述细胞因子受体。

因此，非趋化因子细胞因子意在包括经典的细胞因子。可以作为配体部分使缀合物靶向细胞例如也具有趋化因子受体的细胞上的受体的非趋化因子细胞因子包括但不限于内皮单核细胞活化多肽II(EMAP-II)、集落刺激因子(CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF)、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、白细胞介素1(IL-1)、IL-1a、IL-1b、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素18(IL-18)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素ω(IFNω)、干扰素τ(IFNτ)、干扰素γ诱导因子I(IGIF)、Flt-3配体、促红细胞生成素(EPO)、肿瘤坏死因子(TNF)、增殖诱导配体(APRIL)、CD40配体、CD30配体、CD27配体、fas配体、4-1BB配体、LIGHT、HVEM、TWEAK、GITRL、TNF-相关凋亡诱导配体(TRAIL)、TNF-相关活化诱导细胞因子(TRANCE)、TNF和凋亡配体相关白细胞表达的配体1(TALL-1)，其结合参与炎症反应的细胞如继发组织损害促进细胞上的细胞因子受体家族。

举例的由本发明提供的任何非趋化因子细胞因子靶向的细胞因子受体包括但不限于促红细胞生成素家族受体(例如IL-2至IL-7以及GM-CSF的受体)、干扰素家族受体(例如IFNα、IFNβ和IFNγ的受体)以及肿瘤坏死因子家族受体(例如TNFα、淋巴毒素、Fas配体、LIGHT、BTLA、CD40配体、4-1BB配体、OX-40配体的受体以及其它受体包括但不限于任何TNF受体(TNFR)例如但不限于TNFR1、TNFR2、LtβR、Fas、CD40、CD27、D30、4-1BB、OX40、DR3、DR5和HVEM)。

c.抗体配体部分

所述配体-毒素缀合物中的靶向物质也可以是抗体，特别是单克隆抗体或者其功能片段，其特异于在参与炎症反应的细胞表面上表达的受体，特别是趋化因子受体、细胞因子受体及在表达趋化因子受体的细胞上表达的其它受体。优选特异于趋化因子受体例如CCR-1、CCR-2A、CCR-2B、CCR-3、CCR-4、CCR-5、CCR-6、CCR-7、CCR-8、CCR-9、CCR-10、CXCR-1、CXCR-2、CXCR-3A、CXCR3B、CXCR-4、CXCR-5、CXCR-6、DARC、XCR1、CX3CR-1及其它这种受体的单克隆抗体。

在一些情况中，所述抗体可以特异于非趋化因子细胞因子受体，例如如下任一或多种细胞因子的受体：EMAPII、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13。含有这些抗体的缀合物可用于靶向表达被靶向的细胞因子受体的细胞。这种细胞包括参与继发组织损害的细胞。被靶向的细胞也可表达一或多种趋化因子受体。

可用于所述缀合物中的单克隆抗体的非限制性例子包括但不限于MAC-1、MAC-3、ED-1、ED-2、ED-3以及如下抗原的单克隆抗体：CD5、14、1 5、19、22、34、35、54和68；OX4、6、7、19和42；Ber-H2、BR96、Fib75、EMB-11、HLA-DR、LN-1和蓖麻凝集素-1。

抗体片段可以通过抗体的蛋白酶解或者通过在大肠杆菌中表达编码所述片段的DNA而制备。抗体片段可以通过常规方法用胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶消化完整的抗体而获得。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶裂解抗体而产生，提供以F(ab′)2表示的5S片段。这个片段可以被进一步裂解，使用硫醇还原剂及任选得自二硫键裂解的巯基基团的阻断基团，产生3.5SFab′单价片段。或者，使用胃蛋白酶裂解直接产生两个单价Fab′片段和一个Fc片段(见例如美国专利No.4,036,945和4,331,647以及其中包含的参考文献所述，其参考文献也以其全部内容并入本文做参考；也见Porter，R.R.，(1959)Biochem.J.，73：119-126所述)。也可以使用其它裂解抗体的方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，进一步裂解片段或者其它酶、化学或者遗传技术，只要所述片段结合由完整抗体识别的抗原即可。

Fv片段含有VH与VL链的缔合。这种缔合可以是非共价的，如Inbaret al.(1972)Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.69：2659-62所述。或者，可变链可以通过分子间二硫键连接或者通过化学物如戊二醛交联而连接。典型地，Fv片段含有通过肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)是通过构建编码由寡核苷酸连接的VH和VL结构域的核酸分子而制备。将所得构建体插入表达载体中，将该载体导入宿主细胞如大肠杆菌中。重组宿主细胞用连接两个V结构域的接头肽合成单一多肽链。产生sFv的方法见例如Whitlow and Filpula(1991)Methods，2：97-105；Bird et al.(1988)Science 242：423-426；Pack et al.(1993)Bio/Technology 11：1271-77以及Ladner et al.，美国专利No.4,946,778所述。

另一形式的抗体片段是编码单一互补性决定区域(CDR)的肽。CDR肽(最小识别单位)可以通过构建编码感兴趣的抗体的CDR的基因而获得。例如通过使用聚合酶链反应从抗体产生细胞的RNA中合成可变区而制备这种基因(见例如Larrick et al.(1991)Methods，2：106-10；以及Orlandi et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：3833-3837)。

结合继发组织损害促进细胞上的趋化因子受体或者非趋化因子细胞因子受体的抗体可以通过使用完整多肽或者含有感兴趣小肽的生物学功能片段作为免疫抗原而制备。如果需要，用于免疫动物的多肽或者肽(例如衍生自翻译的cDNA或者化学合成的)可以与载体蛋白缀合。与所述肽化学偶联的常用的载体包括但不限于匙孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)以及破伤风类毒素。偶联的肽随后用于免疫动物(例如小鼠、大鼠或者兔)。

单克隆抗体的制备为本领域所熟知(见例如Kohler et al.(1975)Nature256：495-7；Harlow et al.，in：Antibodies：a Laboratory Manual，(Cold SpringHarbor Pub.，1988)。简而言之，单克隆抗体可以通过如下程序获得：用含有抗原的组合物注射小鼠，通过去除血清样品检验抗体的存在，去除脾以获得B淋巴细胞，将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤，克隆该杂交瘤，选择产生所述抗原的抗体的阳性克隆，从杂交瘤培养物中分离抗体。单克隆抗体可以通过各种充分确立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化。这种分离技术包括蛋白质-A琼脂糖亲和性层析、大小排阻层析以及离子交换层析，这些技术为本领域技术人员所熟知(见例如Pharmacia MonoclonalAntibody Purification Handbook(例如Cat.#18-1037-46))。

抗体也可以衍生自类人灵长类动物抗体。这种在狒狒中产生可用于治疗的抗体的方法为本领域技术人员所已知(见例如Goldenberg et al.(1991)公布的国际PCT申请No.WO 91/11465以及Losman et al.(1990)Int.J.Cancer，46：310-314)。可用于治疗的抗体可衍生自“人源化”单克隆抗体。本领域已知这种方法和抗体。例如，人源化单克隆抗体通过如下方式产生：将来自小鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区的小鼠互补性决定区域转移至人可变结构域中，然后用人残基取代小鼠对应物的构架区。衍生自人源化单克隆抗体的抗体成分的使用避免了与小鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。克隆小鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术在例如Orlandi et al.(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：3833-7中描述，所述文献以其全部内容并入本文做参考。产生人源化单克隆抗体的技术在例如Jones et al.(1986)Nature 321：522-5；Riechmann et al.(1988)Nature 332：323-7；Verhoeyen et al.(1988)Science 239：1534-6；Carter et al.(1992)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA89：4285-9；Sandhu(1992)Crit.Rev.Biotech.12：437-62；and Singer et al.(1993)J.Immunol.1 50：2844-67)中描述。

抗独特型技术可用于产生模拟表位的单克隆抗体。例如，第一种单克隆抗体产生的抗独特型单克隆抗体在高变区中具有结合结构域，其是由第一种单克隆抗体结合的表位的“影像(image)”。

d.其它靶向物质和受体靶

本发明提供的缀合物可含有使该缀合物靶向细胞表面受体的任何靶向物质。除了上文提及的靶向物质包括趋化因子、细胞因子和抗体之外，这种靶向物质还包括例如但不限于生长因子、激素及其它配体或者其等位基因变体、突变蛋白或其片段，只要所述靶向物质通过其结合的细胞表面受体内化即可。这种靶向物质可用于通过使用本发明提供的方法产生配体-毒素缀合物。此外，这种靶向物质可用于构建配体-毒素缀合物，其含有与修饰的毒素或者毒素变体包括本发明提供的修饰的SA1变体直接或者间接连接的靶向物质。

举例的靶向物质包括但不限于转化生长因子β(TGF-β)、利什曼延伸起始因子(Leishmania elongation initiating factor，LEIF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、双调蛋白、神经调节蛋白-1、神经调节蛋白-2、神经调节蛋白-3或者神经调节蛋白-4、生长因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、神经生长因子(NGF)、胎盘生长因子(P1GF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、betacellulin(BTC)、中期因子、抑制素、内皮生长因子、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、神经营养蛋白-2(NT-2)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、神经营养蛋白-5(NT-5)、胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、多营养因子、干细胞因子(SCF)、制瘤素M、感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)、白血病抑制因子(LIF)、Müllerian-抑制物质(MIS)、心肌营养蛋白-1、血小板生成素、血管生成素、激活蛋白、骨形态发生蛋白(BMP)、APM1、生长激素(GH)、瘦蛋白以及促乳素或者其等位基因变体、突变蛋白或者片段。所述靶向物质还包括病原识别受体(PRR)，其参与病原体的吞噬作用或者胞吞作用。例如，其它举例的靶向物质包括靶向如下受体的分子：甘露糖受体(MR)、Dectin-1以及胶原凝集素或者胶原凝集素样蛋白质的受体，包括但不限于表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白D、甘露糖结合凝集素(MBL)或者补体蛋白1q(C1q)的受体。优选的靶向物质是当与受体结合时由细胞内化的多肽。

使用这种靶向物质产生的配体-毒素缀合物可用于治疗具有病理学涉及细胞成分的任何疾病或失调。优选的这种疾病或失调是具有病理性细胞成分的任何疾病或失调，所述细胞成分表达可以被靶向的一或多种细胞表面受体。这种疾病或失调也包含其它疾病和失调，特别是血管发生疾病，包括但不限于癌症以及视网膜病变如眼或糖尿病视网膜病变，例如通过靶向参与血管发生的内皮细胞进行。

生长因子

结合参与炎症和/或继发组织损害的细胞上胞吞细胞表面受体的生长因子也可用作本发明提供的缀合物的靶向物质且可以用于本发明提供的方法中。这种生长因子也可以用作靶向物质以靶向参与血管发生疾病的细胞，所述疾病包括癌症及其它疾病如眼病或者各种慢性炎症，通过将配体-毒素缀合物靶向内皮细胞进行。生长因子如例如血管内皮生长因子(VEGF)或者其任何修饰形式包括具有氨基酸取代、缺失、插入或者添加的那些形式可以用于使毒素部分靶向特异细胞类型，只要其保留结合受体并被内化的能力即可(见例如美国专利申请No.2004/0166565和US20010031485)。因此，这种生长因子可用于构建配体-毒素缀合物，其含有与修饰的毒素或者毒素变体包括本发明提供的修饰的志贺毒素A1变体直接或者间接连接的生长因子。被靶向的细胞类型可包括例如参与血管发生的内皮细胞，血管发生是通常与肿瘤生长和慢性炎症状态相关的新血管生长的过程。

血管发生是紧密控制的新血管生长过程(见例如Folkman&Shing(1992)JBiol.Chem.，267：1093 1-4；Hanahan(1997)Science，277：48-50综述)。在正常环境下，血管发生仅在胚胎发育、伤口愈合和黄体发育期间发生。血管发生在大量病变中出现，如在实体瘤和转移生长、多种眼病、慢性炎症以及缺血性损伤中发生(见Folkman(1995)Nat.Med.，1：27-3 1综述)。因此，生长中的内皮细胞是一些主要病变的治疗的独特靶位。

VEGF是分泌的二聚体糖蛋白家族，其是血管发生的阳性调节物(例如Cross and Claesson-Welsh，Trends Pharmacol Sci.，22：201-7，2001所述)。举例的VEGF蛋白包括但不限于VEGF-A(UniProt NO：P15692)、VEGF-B(UniProtNO：P49765)、VEGF-C(UniProt NO：P49767)、VEGF-D(UniProt NO：O43915)以及PGF(胎盘生长因子，VEGF相关蛋白；UniProt NO：Q53XY6)及其剪接变体、等位基因变体或者物种变体。举例的VEGF-A前体多肽示于SEQ IDNO：204-210，包括相应于SEQ ID NO：204-206第1-26位氨基酸的一个26个氨基酸的信号肽，而且由于可变剪接的结果，成熟多肽的长度不同。例如，成熟VEGF-A多肽的长度可以是206、189、183、165、148、145或者121个氨基酸。VEGF-B前体多肽示于SEQ ID NO：211和212，包括相应于SEQ ID NO：211和212的第1-21位氨基酸的一个21个氨基酸信号肽，并且成熟多肽的长度为186和167个氨基酸，分别相应于SEQ ID NO：211的第22-207位氨基酸和SEQ ID NO：212的第22-188位氨基酸。VEGF-C的前体多肽示于SEQ ID NO：213，包括相应于SEQ ID NO：213第1-31位氨基酸的一个31个氨基酸信号肽、相应于SEQ ID NO：213第32-111和228-419位氨基酸的两个前肽序列，并且成熟的116个氨基酸多肽相应于SEQ IDNO：213的第112-227位氨基酸。VEGF-D的前体多肽示于SEQ ID NO：214，包括相应于SEQ ID NO：214的第1-21位氨基酸的一个21个氨基酸信号肽、相应于SEQ ID NO：214第22-88和206-354位氨基酸的两个前肽序列，并且成熟的117个氨基酸多肽相应于SEQ ID NO：214的第89-205位氨基酸。PGF的前体多肽示于SEQ ID NO：215。

VEGF对于内皮细胞的作用通过酪氨酸激酶受体VEGFR-1(flt-1)、VEGFR-2(KDR/flk-1)和VEGFR-1-相关受体介导。这些受体优先在内皮细胞上表达。所述受体是单一跨膜蛋白酪氨酸激酶，属于免疫球蛋白超家族，并且在胞外结构域中含有7个Ig样环，且与血小板衍生生长因子受体具有同源性。结合这些受体的VEGF诱导受体二聚体化，随后二聚体中SH2和SH3结构域酪氨酸磷酸化。然后KDR/flk-1-VEGF复合物通过受体介导的胞吞作用而内化。由于其可以被表达其受体的细胞内化，因此任何VEGF如本文所述均可以作为缀合物中的靶向物质，所述缀合物含有修饰的RIP多肽如修饰的SA1多肽或者其活性片段。

2.接头部分

在制备本发明提供的缀合物中，RIP毒素例如本发明提供的修饰的SA1毒素与靶向物质直接或者间接连接。例如，本发明提供的缀合物包含如下成分：(靶向物质)_n、(L)_q和(被靶向物质)_m，其中L是连接靶向物质与毒素的接头；靶向物质是结合在细胞表面上表达的受体并且由其内化的任何部分；m和n是单独选择的，至少为1；q是0或更大，只要所得缀合物结合被靶向的受体、内化以及输送被靶向物质即可。所述缀合物中各成分的连接可以通过本领域已知的连接两个部分的任何方法连接，只要接头部分与蛋白质配体的附着不明显妨碍所述蛋白质配体与靶细胞(即靶细胞上的受体)的结合即可或者不明显妨碍配体-毒素的内化或者代谢即可，以便降低修饰的RIP毒素对于靶细胞的毒性。所述连接可以是任何类型的链接，包括但不限于离子键和共价键，以及任何其它足够稳定的关联，从而所述被靶向物质(例如修饰的RIP毒素)将由缀合物靶向的细胞内化。

所述靶向物质如趋化因子任选与修饰的RIP毒素或者其活性片段通过一或多个接头连接。根据希望的性质选择接头部分。例如，可以选择接头部分的长度以优化配体结合的动力学和特异性，包括由于配体与靶受体的结合而诱导的任何构象变化。所述接头部分应该是足够长和柔性的以使得所述蛋白质配体部分与靶细胞受体自由地相互作用。如果接头太短或者太刚性，则在蛋白质配体部分与细胞毒素之间可以存在位阻。如果接头部分太长，则细胞毒素在生产过程中可以被蛋白酶解或者不能有效地将其毒性作用施加于靶细胞。接头如化学接头可以通过使用本领域已知的多种方法附着于纯化的配体(见Pierce Chemicals“Solutions，Cross-linking of Proteins：Basic Concepts and Strategies，”Seminar#12，Rockford，IL)。

a.举例的接头

本领域技术人员已知的任何接头均可用于本发明中。通常，不同于化学产生的缀合物中的接头的一系列接头被用于作为融合蛋白的缀合物中。适于化学连接的缀合物的接头和键包括但不限于二硫键、硫醚键、受阻二硫键以及游离反应基团如胺和硫醇基团之间的共价键。这些键是通过使用异双官能试剂产生，在所述一或两个多肽上产生反应性硫醇基团，然后一个多肽上的硫醇基团与可以附着反应性马来酰亚胺基团或者硫醇基团的另一个多肽上的反应性硫醇基团或胺基团反应。其它接头包括酸裂解接头，如bismaleimideothoxy propane、酸不稳定运铁蛋白缀合物以及脂肪酸二酰肼，其在更酸性的胞内区室中被裂解；在暴露于UV或者可见光时裂解的交联剂，以及这样的接头，如来自人IgG1恒定区的各种结构域如CH1、CH2和CH3(见Batra et al.(1993)Molecular Immunol.30：379-386)。在一些实施方案中，可以包括一些接头以利用每个接头的希望的性质。化学接头与肽接头可以通过所述接头与趋化因子受体靶向物质和修饰的RIP毒素的共价偶联而插入。下文描述的异双官能剂可用于实现这种共价偶联。肽接头也可以通过表达编码作为融合蛋白的接头与靶向物质、接头与修饰的RIP毒素或者接头、修饰的RIP毒素以及靶向物质的DNA而进行连接。预期使用柔性接头和增加所述缀合物溶解性的接头，单独使用或者与其它接头组合使用。

接头可以是适合连接修饰的RIP毒素与靶向物质的任何部分。这种部分包括但不限于肽键；氨基酸和肽键，典型含有1至大约60个氨基酸；化学接头，如异双官能可裂解交联剂。其它接头包括但不限于肽与降低修饰的RIP毒素与靶向物质之间位阻的其它部分，胞内酶底物，增加缀合物柔性的接头，增加缀合物溶解性的接头，增加缀合物的血清稳定性的接头，光裂解接头以及酸裂解接头。

i.异双官能交联剂

本领域技术人员已知用于在氨基基团与硫醇基团之间形成共价键或者将硫醇基团导入蛋白质中的许多异双官能交联剂(见例如PIERCECATALOG，ImmunoTechnology Catalog & Handbook，1992-1993，其描述了这种试剂的制备与应用并且提供了这种试剂的商业来源；也见例如Cumber etal.(1992)Bioconjugate Chem.3：397-401；Thorpe et al.(1987)Cancer Res.47：5924-5931；Gordon et al.(1987)Proc.Natl.AcadSci.84：308-312；Waldenet al.(1986)J.Mol.Cell Immunol.2：191-197；Carlsson et al.(1979)Biochem.J.173：723-737；Mahan et al.(1987)Anal.Biochem.162：163-170；Wawryznaczaketal.(1992)Br.J.Cancer 66：361-366；Fattom et al.(1992)Infection &Immun.60：584-589所述；交联剂可得自：Pierce Chemical Company，Rockford，IL；Sigma Chemical Company，St.Louis，MO.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。可用于交联的官能团包括伯胺、巯基、羰基、碳水化合物和羧酸。举例的用于异双官能交联剂中的基团包括但不限于：芳基叠氮化物、马来酰亚胺、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-酯、酰肼、PFP-酯、羟甲基膦、补骨脂素、亚氨酸酯、吡啶二硫化物、异氰酸酯以及乙烯砜。异双官能交联剂可用于在靶向物质如趋化因子和修饰的RIP毒素之间形成共价键。举例的异双官能交联剂含有两个反应基团：一个与伯胺基团反应(例如N-羟基琥珀酰亚胺)，另一个与硫醇基团反应(例如吡啶二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)。通过伯胺反应基团，所述交联剂可以与一个多肽的赖氨酸残基反应；通过硫醇反应基团，已经附着(tied up)于第一个蛋白质的交联剂与另一多肽的半胱氨酸残基(游离巯基基团)反应。举例的异双官能交联剂包括但不限于：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP；二硫化物接头)；磺基琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基二硫)丙酰胺基]己酸酯(sulfo-LC-SPDP)；琥珀酰亚胺基氧基羰基--甲基苄基硫代硫酸酯(SMBT，受阻二硫酸酯接头)；琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基二硫)丙酰胺基]己酸酯(LC-SPDP)；磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(sulfo-SMCC)；琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丁酸酯(SPDB；受阻二硫键接头)；磺基琥珀酰亚胺基2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1，3′-二硫代丙酸酯(SAED)；磺基琥珀酰亚胺基7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸酯(SAMCA)；磺基琥珀酰亚胺基6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯甲酰胺基]己酸酯(sulfo-LC-SMPT)；1，4-二-[3′-(2′-吡啶基二硫)丙酰胺基]丁烷(DPDPB)；4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基--甲基--(2-吡啶基硫代)甲苯(SMPT，受阻二硫酸酯接头)；4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-a-(2-吡啶基二硫)甲苯；磺基琥珀酰亚胺基6[-甲基--(2-吡啶基二硫)甲苯甲酰胺基]己酸酯(sulfo-LC-SMPT)；m-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)；m-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-MBS)；N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(SIAB；硫醚接头)；磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(sulfo-SIAB)；琥珀酰亚胺基4(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)；磺基琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sulfo-SMPB)；叠氮基苯甲酰肼(ABH)；3-(2-吡啶基二硫)-丙酰肼；Ellman’s试剂；二氯三嗪酸，S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸。进一步的举例的双官能连接化合物在例如美国专利No.5,349,066、5,618,528、4,569,789、4,952,394和5,137,877中论述。

ii.酸裂解、光裂解以及热敏感接头

也可以使用酸裂解、光裂解以及热敏感接头，特别是在需要裂解修饰的RIP毒素以使其更易于反应的情况中。本领域已知许多可裂解基团(见例如，Jung et al.(1983)Biochem.Biophys.Acta 761：152 162；Joshi etal.(1990)J.Biol.Chem.265：14518 14525；Zarling et al.(1980)J.Immunol.124：913920；Bouizar et al.(1986)Eur.J.Biochem.155：141 147；Park et al.(1986)J.Biol.Chem.261：205 210；Browning et al.(1989)J.Immunol.143：1859-1867)。此外，更广泛的可裂解双官能接头基团可购自如Pierce等供应商。

酸裂解接头包括但不限于bismaleimideothoxy propane；以及脂肪酸二酰肼接头(见例如Fattom etal.(1992)Infection &Immun.60：584-589)和酸不稳定运铁蛋白缀合物，其含有足够的运铁蛋白部分以进入胞内运铁蛋白循环途径(见例如et al.(1991)J.Biol.Chem.266：4309-4314)。

光裂解接头是在暴露于光时被裂解的接头(见例如Goldmacher et al.(1992)Bioconj.Chem.3：104-107)，从而在暴露于光时释放被靶向物质。在暴露于光时被裂解的光裂解接头为本领域所熟知(见例如Hazum et al.(1981)in Pept.，Proc.Eur.Pept.Symp.，16th，Brunfeldt，K(Ed)，pp.105-110，其描述了硝基苄基基团作为半胱氨酸的光裂解保护基团的应用；Yen et al.(1989)Makromol.Chem 190：69-82，其描述了水溶性光裂解共聚物，包括羟丙基甲基丙烯酰胺共聚物、甘氨酸共聚物、荧光素共聚物以及甲基罗丹明共聚物；Goldmacher et al.(1992)Bioconj.Chem.3：104-107，其描述了在暴露于近UV光(350nm)时光降解的交联剂和试剂；以及Senter et al.(1985)Photochem.Photobiol 42：231-237，其描述了产生光裂解键的硝基苄氧基羰基氯交联剂)。这种接头在可以通过使用光纤暴露于光治疗的皮肤病或者眼病中具有特殊用途。在施用所述缀合物之后，眼或皮肤或者其它机体部分可以暴露于光，使得修饰的RIP毒素从缀合物中释放。这种光裂解接头可用于诊断方案中，其中希望除去靶向物质以允许快速从动物机体内清除。

iii.用于化学缀合的其它接头

其它接头包括三苯甲基接头特别是衍生化的三苯甲基基团以产生在不同酸碱度释放治疗剂的缀合物。因此，柔性由预选择pH范围的能力提供，在此pH范围治疗剂将释放，使得可以基于需要递送治疗剂的组织之间的已知生理学差异而选择接头(见例如美国专利No.5,612,474)。例如，肿瘤组织的酸性看起来低于正常组织的酸性。

iv.肽接头

接头部分可以是肽。肽接头可以用于融合蛋白中，也可以用于化学连接的缀合物中。所述肽典型具有大约2-60个氨基酸残基，例如大约5-40个或者大约10-30个氨基酸残基。根据一些因素选择接头长度，如接头的使用目的。

蛋白质配体特异性结合一或多种靶细胞上的受体，并且由靶细胞吸收。为了便于配体-毒素缀合物进入靶细胞，目前优选所述配体-毒素缀合物的大小不大于可以由感兴趣的靶细胞吸收的大小。通常，所述配体-毒素缀合物的大小依赖于其组成。在配体毒素缀合物含有化学接头和化学毒素(即不是蛋白质的)的情况中，配体-毒素的大小通常小于当所述配体-毒素缀合物是融合蛋白时的大小。肽接头可以常规地由核酸编码并且在宿主细胞如大肠杆菌中表达时掺入融合蛋白中。

当靶向物质是蛋白质时，肽接头是有利的。例如，所述接头部分可以是柔性间隔氨基酸序列，如在单链抗体研究中已知的那些。举例的这种已知的接头部分包括但不限于GGGGS(SEQ ID NO：192)、(GGGGS)_n(SEQ.IDNO：193)、GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO：194)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ.ID NO：195)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ  ID NO：196)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO：197)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ IDNO：198)、EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO：199)、SRSSG(SEQ.ID NO：200)、SGSSC(SEQ ID NO：20 1)。具有序列AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM(SEQ ID NO：202)的白喉毒素胰蛋白酶敏感接头也是有用的。

或者，肽接头部分可以是VM或者AM(SEQ ID NO：34)或者具有如下式描述的结构：AM(G_2至4S)_xAM，其中X是从1-11的整数(SEQ ID NO：203)。另外的连接部分在例如Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883；Whitlow，M.，et al.(1993)Protein Engineering 6：989-995；Newton et al.(1996)Biochemistry 35：545-553；A.J.Cumber et al.(1992)Bioconj.Chem.3：397-401；Ladurner et al.(1997)J.Mol.Biol.273：330-337；以及美国专利No.4,894,443中描述。

其它接头包括但不限于：酶底物，如组织蛋白酶B底物、组织蛋白酶D底物、胰蛋白酶底物、凝血酶底物、枯草杆菌蛋白酶底物、因子Xa底物和肠激酶底物；增加溶解性、柔性和/或胞内可裂解性的接头包括如(gly_mser)_n和(ser_mgly)_n这样的接头，其中m是1-6、通常是1-4、典型是2-4，n是1-30、或者1-10、典型是1-4(见例如国际PCT申请No.WO 96/06641，其提供了用于缀合物中举例的接头)。在一些实施方案中，可包括一些接头以利用每个接头的希望的性质。

3.举例的白细胞群调节剂(LPM)缀合物

举例的配体-毒素缀合物包括LPM缀合物，其含有与志贺毒素A1(SA1)变体直接或者间接连接的趋化因子，所述变体如本文描述的任何SA1变体。典型地，这种缀合物含有可以结合受体的趋化因子多肽或者其一部分的成熟部分。任选地，在间接连接的情况中，编码所述缀合物的核酸分子可含有编码在所述趋化因子靶向物质多肽与SA1变体被靶向部分之间的接头多肽的序列，例如，Ala-Met接头(SEQ ID NO：34；技术上，Met是进行细菌表达的志贺毒素起始密码子)。在一些实例中，额外的核酸分子可以加入编码配体-毒素缀合物的核酸或者可以通过其它方式例如通过化学接头方式与配体-毒素缀合物连接以便于纯化、表达、克隆或检测。例如，可以在核酸分子的3’和5’末端的一端或这两端工程化加入限制酶位点以便于克隆。在一个这样的实例中，在SEQ ID NO：37和39所示核酸分子中工程化加入第1-6位的NdeI限制位点和在第967-972位的BamHI限制位点。

本发明提供的LPM缀合物是这样的缀合物，其中成熟MCP-1趋化因子多肽与作为被靶向物质的变体1志贺毒素A1(SA1)亚基直接或者间接连接。例如，如本发明提供的实施例所述，LPM1a缀合物含有与SA1亚基多肽的第23-268位残基连接的成熟MCP-1多肽(SEQ ID NO：69)，所述SA1亚基多肽含有核糖体失活(RIP)结构域(在本文称作SA1变体1；相应于SEQID NO：22所示氨基酸序列)。所述MCP-1多肽与SA1多肽通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)间接连接，产生配体：接头：毒素融合多肽。举例的编码LPM1a多肽的核酸如SEQ ID NO：37所示。编码的LPM1a多肽如SEQ IDNO：38所示。

本发明提供的LPM缀合物也是这样的缀合物，其中成熟MCP-1趋化因子多肽与作为被靶向物质的变体2志贺毒素A1(SA1)亚基直接或者间接连接。例如，如本发明提供的实施例所述，LPM1b缀合物含有与截短的志贺毒素A1亚基多肽(在本文称作SA1变体2，相应于SEQ ID NO：24所示氨基酸序列)连接的成熟MCP-1多肽(SEQ ID NO：69)。MCP-1多肽与变体2SA1多肽通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)间接连接，产生配体：接头：毒素融合多肽。举例的编码LPM1b多肽的核酸如SEQ ID NO：39所示，其中第7-966位核苷酸编码配体-毒素缀合物多肽，第964-966位核苷酸编码工程化的终止密码子。SEQ ID NO：40所示编码的LPM1b多肽是长度为320个氨基酸的多肽，含有5’起始甲硫氨酸残基(在第一个氨基酸位置)，随后是成熟MCP-1(第2-77位氨基酸)、Ala-Met接头(第78-79位氨基酸)以及SA1变体2亚基(第80-320位氨基酸)。

另一举例的本发明提供的LPM是这样的缀合物，其中成熟MCP-1趋化因子多肽与作为被靶向物质的突变体变体1(也称作变体3)志贺毒素A1(SA1)亚基直接或者间接连接，所述变体是在本发明选择方法中鉴别的修饰的SA1多肽。例如，LPM1c缀合物含有与突变体志贺毒素A1亚基多肽(在本文称作SA1变体3，相应于SEQ ID NO：26所示氨基酸序列)连接的成熟MCP-1多肽(如SEQ ID NO：69所示)。MCP-1多肽与SA1多肽变体通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)间接连接，产生配体：接头：毒素融合多肽。SA1变体3在相对于SEQ ID NO：22所示成熟野生型SA1多肽的第38位具有L至R的突变。如实施例中所述，LPM1c在筛选修饰形式的LPM1a缀合物(SEQ ID NO：38)的SA1部分中产生。举例的编码LPM1c多肽的核酸如SEQID NO：41所示。编码的LPM1c多肽如SEQ ID NO：42所示。

另一举例的本发明提供的LPM是这样的缀合物，其中成熟MCP-1趋化因子多肽与作为被靶向物质的突变体变体2(也称作变体4)志贺毒素A1(SA1)亚基直接或者间接连接，所述变体是在本发明选择方法中鉴别的修饰的SA1多肽。例如，LPM1d缀合物含有与突变体志贺毒素A1亚基多肽(在本文称作SA1变体4，相应于SEQ ID NO：28所示氨基酸序列)连接的成熟MCP-1趋化因子多肽(如SEQ ID NO：69所示)。MCP-1多肽与SA1多肽变体通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)间接连接，产生配体：接头：毒素融合多肽。SA1变体4相对于SEQ ID NO：24所示成熟截短的SA1变体2多肽在第219位具有V至A的突变。如在实施例中所述，LPM1d在筛选LPM1b缀合物(SEQ ID NO：40)的SA1部分变体中产生。举例的编码LPM1d多肽的核酸如SEQ ID NO：43所示。编码的LPM1d多肽如SEQ ID NO：44所示。

另一举例的本发明提供的LPM是这样的缀合物，其中趋化因子Eotaxin与作为被靶向物质的修饰的志贺毒素A1(SA1)亚基直接或者间接连接。例如，LPM2缀合物含有通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)与SA1变体4多肽(相应于SEQ ID NO：28所示氨基酸序列)连接的成熟Eotaxin多肽(相应于SEQ ID NO：113所示序列第24-97位氨基酸)。举例的编码LPM2的核酸分子如SEQ ID NO：45的第7-960位核苷酸所示，包括在第958-960位核苷酸的工程化终止密码子。如SEQ ID NO：46所示的编码的LPM2多肽是长度为318个氨基酸的多肽，其含有5’起始甲硫氨酸残基(在第一个氨基酸位置)，随后是成熟Eotaxin(第2-75位氨基酸)、Ala-Met接头(第76-77位氨基酸)以及SA1变体4亚基(第78-318位氨基酸)。

另一举例的本发明提供的LPM是LPM12，其是趋化因子Eotaxin与作为被靶向物质的修饰的志贺毒素A1(SA1)亚基连接的缀合物。LPM12中使用的Eotaxin多肽具有与LPM2中Eotaxin相同的氨基酸序列，然而由于合成其的方式不同(见实施例3)，其核酸序列不同。举例的编码LPM12的核酸分子如SEQ ID NO：65第7-960位核苷酸所示，包括在第958-960位的工程化终止密码子。如SEQ ID NO：46所示编码的LPM12多肽是长度为318个氨基酸的多肽，其含有5’起始甲硫氨酸残基(在第一个氨基酸位置)，随后是成熟Eotaxin(第2-75位氨基酸)、Ala-Met接头(第76-77位氨基酸)以及SA1变体4亚基(第78-318位氨基酸)。

另一举例的本发明提供的LPM是这样的缀合物，其中趋化因子SDF-1β与作为被靶向物质的修饰的志贺毒素A1(SA1)亚基直接或者间接连接。在一个实例中，修饰的SA1亚基是在本发明选择方法中鉴别的变体4 SA1多肽。例如，LPM3缀合物含有通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)与SA1变体4多肽(相应于SEQ ID NO：28所示氨基酸序列)连接的成熟SDF-1β多肽(相应于SEQ ID NO：114所示序列第22-93位氨基酸)。举例的编码LPM3的核酸分子如SEQ ID NO：47第7-954位核苷酸所示，包括在第952-954位核苷酸的工程化终止密码子。SEQ ID NO：48所示编码的LPM3多肽是长度为316个氨基酸的多肽，其含有5’起始甲硫氨酸残基(在第一个氨基酸位置)，随后是成熟SDF-1β(第2-73位氨基酸)、Ala-Met接头(第74-75位氨基酸)以及SA1变体4亚基(第76-316位氨基酸)。

另一举例的本发明提供的LPM是这样的缀合物，其中趋化因子GRO-α与作为被靶向物质的修饰的志贺毒素A1(SA1)亚基直接或者间接连接。在一个实例中，修饰的SA1亚基是在本发明选择方法中鉴别的变体4 SA1多肽。例如，LPM4缀合物含有通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)与SA1变体4多肽(相应于SEQ ID NO：28所示氨基酸序列)连接的成熟GRO-α多肽(相应于SEQ ID NO：115所示多肽第35-107位氨基酸)。举例的编码LPM4的核酸分子如SEQ ID NO：49第7-957位核苷酸所示，包括在第955-957位核苷酸的工程化终止密码子。SEQ ID NO：50所示编码的LPM4多肽是长度为3 17个氨基酸的多肽，其含有5’起始甲硫氨酸残基(在第一个氨基酸位置)，随后是成熟GRO-α(第2-74位氨基酸)、Ala-Met接头(第75-76位氨基酸)以及SA1变体4亚基(第77-3 17位氨基酸)。

另一举例的本发明提供的LPM是这样的缀合物，其中趋化因子MIP-1β与作为被靶向物质的修饰的志贺毒素A1(SA1)亚基直接或者间接连接。在一个实例中，修饰的SA1亚基是在本发明选择方法中鉴别的变体4 SA1多肽。例如，LPM5缀合物含有通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)与SA1变体4多肽(相应于SEQ ID NO：28所示氨基酸序列)连接的成熟MIP-1β多肽(相应于SEQ ID NO：116所示多肽第24-92位氨基酸)。举例的这种LPM5序列是SEQ ID NO：51所示核酸序列的第7-945位核苷酸，包括在第943-945位核苷酸的工程化终止密码子。如SEQ ID NO：52所示的编码的LPM5多肽是长度为313个氨基酸的多肽，其含有5’起始甲硫氨酸残基(在第一个氨基酸位置)，随后是成熟MIP-1β(第2-70位氨基酸)、Ala-Met接头(第71-72位氨基酸)以及SA1变体4亚基(第73-313位氨基酸)。

另一举例的本发明提供的LPM是这样的缀合物，其中趋化因子IL-8与作为被靶向物质的修饰的志贺毒素A1(SA1)亚基直接或者间接连接。在一个实例中，修饰的SA1亚基是在本发明选择方法中鉴别的变体4 SA1多肽。例如，LPM6缀合物含有通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)与SA1变体4序列(相应于SEQ ID NO：28所示氨基酸序列)连接的成熟IL-8多肽(相应于SEQ ID NO：117所示多肽第21-99位氨基酸)。举例的编码LPM6的核酸分子如SEQ ID NO：53第7-969位核苷酸所示，包括在第967-969位核苷酸的工程化终止密码子。如SEQ ID NO：54所示的编码的LPM6多肽是长度为321个氨基酸的多肽，其含有5’起始甲硫氨酸残基(在第一个氨基酸位置)，随后是成熟IL-8(第2-78位氨基酸)、Ala-Met接头(第79-80位氨基酸)以及SA1变体4亚基(第81-321位氨基酸)。

另一举例的本发明提供的LPM是这样的缀合物，其中趋化因子IP-10与作为被靶向物质的修饰的志贺毒素A1(SA1)亚基直接或者间接连接。在一个实例中，所述修饰的SA1亚基是在本发明选择方法中鉴别的变体4 SA1多肽。例如，LPM7缀合物含有通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)与SA1变体4多肽(相应于SEQ ID NO：28所示氨基酸序列)连接的成熟IP-10多肽(相应于SEQ ID NO：118所示多肽第22-98位氨基酸)。举例的编码LPM7的核酸分子如SEQ ID NO：55第7-969位核苷酸所示，包括在第967-969位的工程化终止密码子。SEQ ID NO：56所示编码的LPM7多肽是长度为321个氨基酸的多肽，其含有5’起始甲硫氨酸残基(在第一个氨基酸位置)，随后是成熟IP-10(第2-78位氨基酸)、Ala-Met接头(第79-80位氨基酸)以及SA1变体4亚基(第81-321位氨基酸)。

另一举例的本发明提供的LPM是这样的缀合物，其中趋化因子MCP-3与作为被靶向物质的修饰的志贺毒素A1(SA1)亚基直接或者间接连接。在一个实例中，所述修饰的SA1亚基是在本发明选择方法中鉴别的变体4 SA1多肽。例如，LPM8缀合物含有通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)与SA1变体4多肽(相应于SEQ ID NO：28所示氨基酸序列)连接的成熟MCP-3多肽(相应于SEQ ID NO：119所示多肽第24-99位氨基酸)。举例的编码LPM8的核酸分子如SEQ ID NO：57第7-966位核苷酸所示，其包括在第964-966位核苷酸的工程化终止密码子。SEQ ID NO：58所示编码的LPM8多肽是长度为320个氨基酸的多肽，其含有5’起始甲硫氨酸残基(在第一个氨基酸位置)，随后是成熟MCP-3(第2-77位氨基酸)、Ala-Met接头(第78-79位氨基酸)以及SA1变体4亚基(第80-320位氨基酸)。

另一举例的本发明提供的LPM是这样的缀合物，其中趋化因子MIP-3 α与作为被靶向物质的修饰的志贺毒素A1(SA1)亚基直接或者间接连接。在一个实例中，修饰的SA1亚基是在本发明选择方法中鉴别的变体4 SA1多肽。例如，LPM9缀合物含有通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)与SA1变体4多肽(相应于SEQ ID NO：28所示氨基酸序列)连接的成熟MIP-3α多肽(相应于SEQ ID NO：120所示多肽第27-96位氨基酸)。举例的编码LPM9的核酸分子如SEQ ID NO：59第7-948位核苷酸所示，其包括在第946-948位核苷酸的工程化终止密码子。SEQ ID NO：60所示编码的LPM9多肽是长度为314个氨基酸的多肽，其含有5’起始甲硫氨酸残基(在第一个氨基酸位置)，随后是成熟MIP-3α(第2-71位氨基酸)、Ala-Met接头(第72-73位氨基酸)以及SA1变体4亚基(第74-314位氨基酸)。

另一举例的本发明提供的LPM是这样的的缀合物，其中趋化因子MDC与作为被靶向物质的修饰的志贺毒素A1(SA1)亚基直接或间接连接。在一个实例中，修饰的SA1亚基是在本发明选择方法中鉴别的变体4 SA1多肽。例如，LPM10缀合物含有通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)与SA1变体4多肽(相应于SEQ ID NO：28所示氨基酸序列)连接的成熟MDC多肽(相应于SEQ ID NO：121所示多肽第25-93位氨基酸)。举例的编码LPM10的核酸分子如SEQ ID NO：61的第7-945位核苷酸所示，包括在第943-945位核苷酸的工程化终止密码子。SEQ ID NO：62所示编码的LPM10多肽是长度为313个氨基酸的多肽，其含有5’起始甲硫氨酸残基(在第一个氨基酸位置)，随后是成熟MDC(第2-70位氨基酸)、Ala-Met接头(第7 1-72位氨基酸)以及SA1变体4亚基(第73-3 13位氨基酸)。

另一举例的本发明提供的LPM是这样的缀合物，其中趋化因子MIP-1α与作为被靶向物质的修饰的志贺毒素A1(SA1)亚基直接或者间接连接。在一个实例中，所述修饰的SA1亚基是在本发明选择方法中鉴别的变体4 SA1多肽。例如，LPM11缀合物含有通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)与SA1变体4多肽(相应于SEQ ID NO：28所示氨基酸序列)连接的成熟MIP-1α多肽(相应于SEQ ID NO：122所示第24-92位氨基酸)。举例的编码LPM1 1的核酸分子如SEQ ID NO：63的第7-945位核苷酸所示，包括在第943-945位核苷酸的工程化终止密码子。如SEQ ID NO：64所示编码的LPM11多肽是长度为3 13个氨基酸的多肽，其含有5’起始甲硫氨酸残基(在第一个氨基酸位置)，随后是成熟MIP-1α(第2-70位氨基酸)、Ala-Met接头(第71-72位氨基酸)以及SA1变体4亚基(第73-3 13位氨基酸)。

另一举例的本发明提供的LPM是这样的缀合物，其中趋化因子BCA-1与作为被靶向物质的修饰的志贺毒素A1(SA1)亚基直接或者间接连接。在一个实例中，修饰的SA1亚基是在本发明选择方法中鉴别的变体4SA1多肽。例如，LPM13缀合物含有通过Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)与SA1变体4多肽(相应于SEQ ID NO：28所示氨基酸序列)连接的成熟BCA-1多肽(相应于SEQ ID NO：123所示多肽的第23-109位氨基酸)。举例的编码LPM1 3的核酸分子如SEQ ID NO：66的第7-999位核苷酸所示，包括在第997-999位的工程化终止密码子。如SEQ ID NO：67所示的编码LPM13多肽是长度为331个氨基酸的多肽，其含有5’起始甲硫氨酸残基(在第1个氨基酸位置)，随后是成熟BCA-1(第2-88位氨基酸)，Ala-Met接头(第89-90位氨基酸)以及SA1变体4亚基(第91-331位氨基酸)。

G.修饰的RIP毒素及其缀合物的制备

与被靶向物质连接的靶向部分的缀合物可以通过化学缀合、重组DNA技术或者组合重组表达与化学缀合技术而制备。本文所述方法可用于制备和使用缀合物，所述缀合物是任何靶向物质与任何被靶向物质如RIP毒素直接连接或者通过如本文所述接头连接的缀合物。所述靶向物质和被靶向物质可以以任何方向连接，而且在缀合物中可以存在一种以上的靶向物质和/或被靶向物质。特别利用含有靶向物质如趋化因子以及被靶向物质如修饰的志贺毒素A1多肽的缀合物举例说明了本发明的方法。

此外，本发明提供了表达和产生重组多肽的方法。这种方法可用于表达本发明提供的修饰的毒素或者毒素变体，单独表达或者作为与选择的靶向物质如趋化因子的缀合物融合蛋白(例如配体-RIP毒素缀合物)表达。在实例中，在被靶向物质如本发明提供的修饰的毒素和靶向物质作为单独的肽被表达的情况中，可以通过在本文别处论述的化学方式产生修饰的被靶向物质与靶向物质的缀合物。

1.产生和克隆毒素多肽或者含有毒素多肽的缀合物的方法

编码修饰的毒素或者含有修饰的毒素的缀合物包括配体-毒素缀合物的核酸可以使用本领域已知的克隆和分离核酸分子的任何可用方法克隆和分离。例如，含有靶向物质或者配体以及一或多种被靶向物质的嵌合融合蛋白的缀合物在如果已知靶向物质或者被靶向物质的核酸序列的情况中可以通过熟知的蛋白质合成技术产生或者通过编码选择的靶向物质或者被靶向物质的DNA分子的化学合成产生。或者，如果未知靶向物质或者被靶向物质的核酸序列，则可首先使用熟知的方法确定序列，所述方法例如但不限于是筛选文库，包括核酸杂交筛选、基于抗体的筛选和基于活性的筛选。在仅已知部分氨基酸序列的情况中，这种筛选方法也可用于获得编码特定蛋白质的核酸序列。

扩增核酸的方法可用于分离编码靶向物质和/或被靶向物质的核酸分子，所述方法包括例如聚合酶链反应(PCR)方法。含有核酸的材料可用作起始材料，从中可以分离编码靶向物质或者被靶向物质的核酸分子。例如，在扩增方法中可以使用DNA和mRNA制备物、细胞提取物、组织提取物、流体样品(例如血液、血清、唾液)、来自健康和/或患病对象的样品。核酸文库也可以用作起始材料的来源。可以设计引物以扩增希望的分子。例如，引物可以基于表达的序列设计，毒素或配体分子(即趋化因子)从所述表达的序列中产生。可以基于特定已知氨基酸序列的逆翻译(back-translation)设计引物。可以对通过扩增产生的核酸分子进行测序并证实其编码所述分子。

编码靶向物质或者被靶向物质的一些基因可以商购。例如，可以获得编码趋化因子或者细胞毒素的核酸分子。获得可商购基因的优势是该序列通常已经被优化以在宿主如大肠杆菌中表达。编码蛋白质、肽的多核苷酸或者感兴趣的多核苷酸可以使用核酸合成技术产生。处理DNA分子的方法不包括但不限于克隆进载体中、核酸残基的诱变以及添加或者缺失核酸残基，这些方法为本领域所熟知，可用于产生本发明提供的修饰的RIP毒素或者配体-RIP毒素缀合物。

在一个实施方案中，嵌合配体-RIP毒素作为融合蛋白产生。融合蛋白可以通过重组核酸技术产生，其中单一多肽包括靶向部分如趋化因子，与蛋白质被靶向物质如细胞毒素直接连接。或者，所述蛋白质可以间隔一段距离以保证蛋白质形成正确的二级和三级结构。合适的接头序列(1)采用柔性延伸构象，(2)不呈现产生可以与融合多肽的功能结构域相互作用的有序二级结构的倾向，以及(3)具有可促进与功能性蛋白质结构域相互作用的最小疏水性或者带电荷特性。靶向部分可位于多肽中细胞毒素部分的氨基末端。这种融合蛋白的一个例子是具有如下一般化结构：(氨基末端)靶向物质：肽接头：毒素(羧基末端)。或者，靶向部分可位于融合蛋白内细胞毒素部分的羧基末端，例如具有如下一般化结构：(氨基末端)毒素：肽接头：靶向物质(羧基末端)。

本发明还包含这样的融合蛋白，其在氨基和/或羧基末端含有额外的氨基酸序列，例如表位标记或者便于蛋白质纯化的其它部分的序列。例如，可以应用多组氨酸标记，其可以便于例如克隆、表达、翻译后修饰、纯化、检测和施用等过程。在一些情况中，在存在一种以上RIP毒素、一种以上接头或者一种以上的配体的情况中，基因可以任何顺序排列，条件是不消除靶向物质或者被靶向物质的希望的活性。

融合蛋白可以使用对希望的序列进行酶切割以及片段连接的常规技术制备。例如，希望的序列可以使用寡核苷酸合成仪合成、通过适当的限制酶消化分离自产生蛋白质的亲代细胞DNA或者通过用适当引物对基因组DNA进行PCR而得自靶来源如细胞、组织、载体或者其它靶来源。在一个实例中，毒素缀合物如本发明提供的含有修饰的毒素部分的任何配体-毒素缀合物可以通过连续多轮将DNA靶序列连接进载体中的工程化重组位点而产生。消化的产物可以被亚克隆进载体中以进一步重组处理序列例如产生与已经包含在载体中的另一核酸序列的融合体或者表达靶分子。

在一些情况中，可以利用PCR扩增获得足够数量的消化产物。也可以对PCR扩增中使用的PCR引物进行工程化以便于核酸序列的可操纵连接。例如，在引物中可以加入非模板互补5’延伸以使得可以对PCR产物进行各种扩增后处理而不明显影响扩增本身。例如，这些5’延伸包括限制位点、启动子序列、限制酶接头序列、蛋白酶裂解位点序列或者表位标记序列。在一个实例中，为了产生融合序列，可以掺入引物中的序列包括例如编码myc标记、his标记或者其它小表位标记的序列，由此扩增的PCR引物有效地含有感兴趣的核酸序列与表位标记的融合体。

在另一实例中，将限制酶位点掺入引物中可促进扩增产物亚克隆进含有相容限制位点的载体中，例如通过提供用于核酸序列连接的粘性末端进行。多个PCR扩增产物亚克隆进单个载体中可以用作可操纵地连接或者融合不同核酸序列的策略。将PCR产物亚克隆进载体中的其它方法包括平端克隆、TA克隆、不依赖于连接的克隆以及体内克隆方法。

在将含有暴露的限制酶位点的PCR产物亚克隆进载体中例如产生与感兴趣序列的融合体之前，有时需要将消化的PCR产物从保持未切割的那些序列中解离。在这种实例中，在进行PCR之前可以在引物的5’末端添加荧光标记。这使得可以鉴别消化的产物，因为已经成功消化的那些产物在被消化时已经丧失荧光标记。在一些情况中，含有限制位点的扩增的PCR产物随后被亚克隆进载体中以产生融合序列的应用可以导致在融合蛋白产物中掺入限制酶接头序列。通常这种接头序列较短，只要所述序列是可操纵地连接的则不损害多肽功能。

2.含有融合蛋白的缀合物的产生及表达系统

编码毒素或者其缀合物如本发明提供的任何配体-毒素缀合物的核酸分子可以含有所述核酸分子的载体形式提供。这种载体的一个例子是质粒。本领域技术人员可获得并已知许多表达载体，这些载体可用于表达毒素多肽包括毒素缀合物。表达载体的选择可以受宿主表达系统的选择的影响。通常，表达载体可包括转录启动子以及任选地增强子、翻译信号和转录及翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体典型具有选择标记，使得可以选择和维持转化的细胞。在一些情况中，复制起点可用于扩增载体的拷贝数。此外，许多表达载体提供邻近多克隆位点的N末端或者C末端表位标记，以便从所述载体中表达的任何所得蛋白质均具有一个表位标记，该标记符合读框地插入在多肽序列中。

融合蛋白可以使用熟知技术产生，其中用表达载体转染宿主细胞，所述表达载体含有与编码被表达的融合蛋白的核酸分子可操纵地连接的表达控制序列(Molecular Cloning A Laboratory Manual，Sambrook et al.，eds.，2ndEd.，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，1989)。将编码毒素的DNA转染进宿主细胞中表达，所述毒素通常是融合蛋白形式，其含有与修饰的毒素直接或间接连接的配体，如本发明提供的任何配体-毒素缀合物。毒素多肽包括配体-毒素缀合物可以在适于产生施用和治疗所需的需要量和需要形式的多肽的任何生物体中表达。通常，可以被工程化表达异源DNA并且具有分泌途径的任何细胞类型均是合适的。表达宿主包括原核生物体和真核生物体，如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞包括人细胞系以及转基因动物。表达宿主的蛋白质产生水平以及在表达的蛋白质上存在的翻译后修饰的类型可不同。表达宿主可以基于这些及其它因素加以选择，所述其它因素例如考虑到管理和安全性、生产成本以及纯化的需要和方法。

a.用于表达的质粒和宿主细胞

含有编码本发明提供的RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物的核酸分子的表达载体的构建以及所述核酸在转染的细胞中的表达包括使用本领域熟知的分子克隆技术。这种方法包括构建表达载体，所述载体含有与适当的转录/翻译控制信号可操纵地连接的编码多肽的核酸分子。这些方法还包括体外重组核酸(例如DNA或RNA)技术、合成技术以及体内重组/遗传重组(见例如在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook etal.，eds.，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，1989；Current Protocolsin Molecular Biology，Vols.1 and 2，Ausubel，et al.eds.，Current Protocols，1987-1994；John Wiley and Sons，Inc.，1994-1999；以及Cloning Vectors：ALaboratory Manual，VolsI-IV，Pouwels，et al.，eds.，and Supplements therein，Elsevier，N.Y.，1995-1998中描述的技术)。

用于在宿主细胞中表达感兴趣多肽的重组核酸分子通常是表达载体形式，其包含与编码所述多肽的核酸分子可操纵地连接的表达控制序列。获得稳定转移以使得外源核酸持续保持在宿主中的方法为本领域所已知。用重组核酸转化宿主细胞可以通过本领域技术人员熟知的常规技术进行。

许多宿主表达载体系统可用于表达RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物蛋白。这些包括但不限于微生物如细菌，用含有编码所述RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物的核酸分子的重组质粒DNA、噬菌体DNA或者粘粒DNA表达载体转化；酵母，用含有编码所述RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物的核酸分子的重组酵母表达载体转化；植物细胞系统，用含有编码RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物的核酸分子的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染或者用重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化；昆虫细胞，用含有编码RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物的核酸分子的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染；或者动物细胞系统，用含有编码RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物的核酸分子的重组质粒表达载体转化或者用含有编码RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物的核酸分子的重组病毒表达载体(例如DNA或RNA病毒，例如但不限于逆转录病毒、腺病毒和痘苗病毒)感染，或者稳定表达RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物的工程化的转化的动物细胞系统。

根据使用的宿主/载体系统，众多合适的转录和翻译元件包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等任一均可在表达载体中与编码RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物的核酸可操纵地连接(见例如Bitter et al.，Methods in Enzymology 153：516-544，1987)。例如，当使用细菌系统时，可以使用诱导型启动子，例如但不限于噬菌体S的P_L、P_LAC、P_TRP、P_TAC(P_TRP-LAC杂种启动子)或者T7。在另一实例中，当使用哺乳动物细胞系统时，可以使用衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或者衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如逆转录病毒长末端重复、腺病毒晚期启动子或者痘苗病毒7.5K启动子)。通过重组核酸技术或者合成技术产生的启动子也可用于提供编码RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物的插入的核酸分子的转录。

当宿主是原核细胞例如大肠杆菌时，能摄取DNA(即转化)的感受态细胞可以通过本领域熟知的方法从细胞制备。例如，可以在指数生长期之后收获细胞，随后通过CaCl₂方法处理。或者，可以使用MgCl₂或者RbCl。转化也可以在宿主细胞原生质体形成之后进行或者通过电穿孔进行。通常原核宿主用作宿主细胞。

当宿主是真核细胞时，重组核酸分子的转染方法包括磷酸钙共沉淀形成以及常规的机械程序如显微注射、电穿孔以及插入装在脂质体中的质粒。另一种核酸转移方法包括使用真核细胞病毒载体，如猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、痘苗病毒、牛乳头瘤病毒或者重组自主细小病毒载体(例如美国专利No.5,585,254所述)以瞬时感染或者转化真核细胞并表达蛋白质(Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman ed.，1982)。真核细胞也可以用编码RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物多肽的核酸以及编码可选择表型如单纯疱疹胸苷激酶基因的另一种核酸分子共转染。或者，编码RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物多肽的核酸分子与编码可选择表型的核酸分子可以存在于相同载体或者质粒上。

真核表达系统使得可以对表达的哺乳动物蛋白质进行进一步的翻译后修饰。如果希望如此，这种细胞具有对初级转录物进行翻译后加工的细胞机构。这种修饰包括但不限于糖基化、磷酸化以及法尼基化(farnesylation)。这种宿主细胞系可包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、Jurkat、HEK-293和WI38。

i.细菌细胞表达系统

在细菌系统中，根据希望的系统属性可以有利地选择许多表达载体。例如，当需要产生大量RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物蛋白时，可以选择指导易于纯化的RIP毒素变体或配体-RIP毒素变体缀合物蛋白产物高水平表达的载体。优选被工程化为含有裂解位点以助于回收表达的多肽的那些载体。使用一些可商购的载体包括pET 11a、b、c或d(Novagen，Madison，WI)可以并且已经获得极佳结果。

特别优选的转化大肠杆菌细胞的质粒包括pET表达载体(见例如美国专利No.4,952,496；得自NOVAGEN，Madison，WI；也见Novagen描述的表达系统的公开文献)。这种质粒包括pET 11c和/或pET 11a，其含有T7lac启动子、T7终止子、可诱导的大肠杆菌lac操纵基因以及lac阻抑物基因；pET 12a-c，其含有T7启动子、T7终止子以及大肠杆菌ompT分泌信号；以及pET 15b(Novagen，Madison，WI)，其含有用于His柱纯化的His-Tag^TM前导序列(Seq.ID NO.40)以及在经过柱纯化后允许裂解的凝血酶裂解位点；T7-lac启动子区和T7终止子。

编码用接头或者不用接头而与被靶向物质连接的靶向物质如趋化因子的核酸以及其它这种构建体可以插入pET载体如pET1 1c、pET-11a和pET-15b表达载体(NOVAGEN，Madison，WI)中以在细胞内或者在周质表达RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物蛋白。或者，被靶向物质或者靶向物质可以插入pET载体中并单独表达。

其它质粒包括pKK质粒，特别是pKK 223-3，其含有tac启动子(得自Pharmacia；也见Brosius et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81：6929；Ausubelet al.Current Protocols in Molecular Biology；美国专利No.5,122,463、5,173,403、5,187,153、5,204,254、5,212,058、5,212,286、5,215,907、5,220,013、5,223,483和5,229,279所述)，其含有tac启动子。质粒pKK已经通过在氨苄青霉素抗性标记基因中插入具有EcoRI粘端的卡那霉素抗性盒(购自Pharmacia；得自pUC4K(见例如Vieira et al.(1982)Gene 19：259-268；美国专利No.4,719,179)而修饰。

其它优选载体包括但不限于pP_L-λ可诱导表达载体和tac启动子载体pDR450(见例如美国专利No.5,281,525、5,262,309、5,240,831、5,231,008、5,227,469、5,227,293；得自Pharmacia P.L.Biochemicals；也见于Mott，et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：88；De Boer et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21)；以及杆状病毒载体如pBlueBac载体(也称作pJVETL及其衍生物；见例如美国专利No.5,278,050、5,244,805、5,243,041、5,242,687、5,266,3 17、4,745,051和5,169,784)，包括pBlueBac III。

其它载体包括但不限于pIN-IIIompA质粒，如pIN-IIIompA2(见例如美国专利No.4,575,013和Duffaud et al.(1987)Meth.Enzymology153：492-507)。pIN-IIIompA质粒包含符合转录读框地与衍生自大肠杆菌脂蛋白基因的功能性片段连接的异源DNA的插入位点。该质粒也包含编码大肠杆菌ompA蛋白的信号肽的DNA片段，其定位是使得希望的多肽与在其氨基末端的ompA信号肽一起表达，从而使得可以有效的跨细胞膜分泌。该质粒进一步包含编码大肠杆菌lac启动子-操纵基因的特定节段的DNA，其位于合适方向以使得希望的多肽转录表达，该质粒还包含编码相关的阻抑物分子的单独的功能性大肠杆菌lacI基因，在无lac操纵子诱导剂的条件下，其与lac启动子-操纵基因相互作用阻止转录。虽然从任一启动子的转录通常被阻抑物分子阻断，但是希望的多肽的表达在脂蛋白(lpp)启动子和lac启动子-操纵基因的控制下。阻抑物被诱导剂分子选择性失活，从而诱导希望的多肽从这两个启动子转录表达。

阻抑物蛋白可以由含有所述构建体的质粒或者含有编码阻抑物-蛋白的基因的另一质粒编码。所述阻抑物-蛋白能阻抑含有阻抑物-蛋白所结合的核苷酸序列的启动子的转录。所述启动子可以通过改变细胞的生理学条件而去阻抑。所述改变可以通过向生长培养基中加入如下分子或者通过改变生长培养基的温度而实现，所述分子抑制例如与操纵基因或者与调节蛋白或者DNA的其它区域相互作用的能力。优选的阻抑物-蛋白包括但不限于应答IPTG诱导的大肠杆菌lacI阻抑物、温度敏感性cI857阻抑物。优选大肠杆菌lacI阻抑物。

在某些实施方案中，所述构建体还包含转录终止子序列。启动子区和转录终止子独立地选自相同或者不同基因。在一些实施方案中，DNA片段在细菌细胞如大肠杆菌中复制。所述DNA片段也典型包括细菌复制起点以保证DNA片段在细菌的世代中得以维持。以这种方式，通过在细菌中复制可以产生大量DNA片段。优选的细菌复制起点包括但不限于f1-ori和colE1复制起点。

举例的细菌宿主含有编码与诱导型启动子如lacUV启动子可操纵地连接的T7 RNA聚合酶的DNA的染色体拷贝(见美国专利No.4,952,496)。这种宿主包括但不限于溶原性细菌大肠杆菌菌株HMS174(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysS、HMS174(DE3)以及BL21(DE3)。优选菌株BL21(DE3)。pLys菌株提供低水平T7溶菌酶，T7 RNA聚合酶的天然抑制剂。优选的细菌宿主是昆虫细胞草地夜蛾(Soodoptera frugiperda)(sf9细胞；见例如Luckow et al.(1988)Biotechnology 6：47-55和美国专利No.4,745,051)。

利用细菌宿主的表达系统易于按比例地小规模或者大规模生产蛋白质。大规模生产蛋白质的方法如分批发酵法可用于表达重组蛋白质如本发明提供的修饰的RIP毒素或者配体-RIP毒素缀合物。举例的分批发酵法为本领域所已知，也可见于例如本发明提供的实施例。例如，细菌宿主细胞可以在容器例如发酵罐中分批发酵生长，所述细菌宿主细胞含有携带编码本发明提供的RIP毒素或者配体-RIP毒素缀合物的核酸分子的表达载体如pET载体。典型地，这种发酵罐用于5-100升或者更多的液体培养基中的细菌生长。用于生长的液体培养基典型是标准富集培养基，其可任选含有增强细菌生长和/或表达的蛋白质产生的额外成分。例如，可以在培养中加入RIP毒素抑制剂如4-APP以增强表达RIP毒素或者配体-RIP毒素缀合物蛋白的细菌生长。如本文别处所述，4-APP的加入抑制表达的RIP毒素对于宿主细菌细胞的毒性活性，从而可以产生较高产量蛋白质。对于蛋白质表达而言，当使用可诱导载体如pET载体时，一旦培养物达到特定生长密度时，典型地在一段时间内向培养物中加入诱导剂(例如IPTG)。诱导剂的浓度以及诱导时间的长度可以根据经验确定或者使用本领域熟知的确定蛋白质表达的最佳生长条件的方法实验性确定。从细菌宿主细胞中纯化表达的蛋白质的方法为本领域所熟知，可包括例如在合适的增溶缓冲液中用匀浆器增溶，随后通过柱纯化，所述增溶缓冲液例如是强变性溶液(例如盐酸胍/尿素溶液)任选包含去污剂。举例的RIP毒素和配体-RIP毒素缀合物的纯化方法在本文实施例中提供。

ii.昆虫细胞表达系统

可用于表达RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物蛋白的另一种表达系统是昆虫系统。在一个这样的系统中，使用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)用作载体以表达外源基因。该病毒生长于草地夜蛾细胞中。编码RIP毒素变体或配体-RIP毒素变体缀合物的核酸可以被克隆进病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中并且置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)控制下。编码RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物的核酸的成功插入将导致所述多角体蛋白基因失活以及非包含体型重组病毒(即缺乏由所述多角体蛋白基因编码的蛋白质外壳的病毒)产生。然后这些重组病毒用于感染草地夜蛾细胞，其中插入的基因被表达(见例如美国专利No.4,215,051)。

对于昆虫宿主而言，杆状病毒载体如pBlueBac(也称作pJVETL及其衍生物)载体特别是pBlueBac III(见例如美国专利No.4,745,051、5,242,687、5,243,041、5,244,805、5,266,317、5,270,458、5,278,050和5,169,784以及公布的国际PCT申请WO 93/10139所述；得自Invitrogen，San Diego)也可用于表达多肽。pBlueBacIII载体是双启动子载体，可用于通过蓝/白筛选择重组体，因为这个质粒含有在昆虫可识别的ETL启动子控制下并且可由IPTG诱导的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)。导入pBlueBac III杆状病毒载体中的DNA构建体与所述多角体蛋白启动子可操纵地连接以产生表达质粒，然后将该表达质粒与野生型病毒共转染进昆虫细胞草地夜蛾中(sf9细胞；见例如Luckow et al.(1988)Biotechnology 6：47-55和美国专利No.4,745,051)。选择蓝色包含体阴性病毒噬斑，通过任何标准技术纯化噬斑并筛选编码缀合物蛋白的DNA分子的存在，所述标准技术如使用适当抗血清的western印迹或者使用适当探针的Southern印迹。然后例如通过CaPO₄转染或者脂质体转染将选择的纯化的重组病毒与野生型杆状病毒共转染进草地夜蛾细胞(sf9细胞)中，在组织培养瓶或者在悬浮培养物中生长。

iii.酵母细胞表达系统

可用于表达RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物蛋白的另一表达系统是酵母。在酵母中，可以使用含有组成型或者诱导型启动子的许多载体。这种载体为本领域所熟知(见例如Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Sambrook et al.，eds.，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，1989；Bitter，et al.(1987)Methods in Enzymol.153：516-544；Bitter et al.(1987)Methods in Enzymol.，152：673-684；Rothstein，DNA Cloning，Vol.II，Glover，D.M.，ed.，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3，1986；以及The Molecular Biology ofthe Yeast Saccharomyces，Strathern e al.，eds.，Cold Spring Harbor Press，Vols.I and II，1982所述)。可以使用组成型酵母启动子如ADH或LEU2或者诱导型启动子如GAL(见例如Rothstein，DNA Cloning，Vol.II，Glover，D.M.，ed.，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3，1986)。或者，可以使用促进外源DNA序列整合进酵母染色体中的载体。

iv.植物细胞表达系统

可用于表达RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物蛋白的另一表达系统是植物细胞系统。在使用植物表达载体的情况中，编码缀合物蛋白的DNA分子的表达可以由多种启动子驱动。例如，可以使用病毒启动子如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(见例如Brisson et al.，(1984)Nature310：511-514)或者TMV的外壳蛋白启动子(见例如Takamatsu et al.(1987)EMBO J.6：307-311)；或者，可以使用植物启动子如RuBisCO的小亚基(见例如Coruzzi et al.(1984)EMBO J.3：1671-1680和Broglie et al.(1984)Science 224：838-843)；或者热休克蛋白启动子，例如大豆hsp17.5-E或者hsp1 7.3-B(见例如Gurley，et al.(1986)Mol.Cell.Biol.6：559-565)。可以通过如下方法将这些构建体导入植物细胞中：使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、定向DNA转化、显微注射、电穿孔等。关于这些技术的综述见例如Weissbach and Weissbach(1 988)Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，pp.421-463以及Plant Molecular Biology，2d Ed.，Covet，S.N.，Ed.，Ch.7-9，Blackie，London 1988所述。

v.哺乳动物表达系统

可用于表达RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物蛋白的另一表达系统是哺乳动物细胞系统。表达构建体可以通过病毒如腺病毒或者痘苗病毒感染、定向DNA转移如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖以及通过物理手段如电穿孔和显微注射转移进哺乳动物细胞中。哺乳动物表达载体典型包含mRNA帽位点、TATA盒、翻译起始序列(Kozak共有序列)以及聚腺苷酸化元件。这种载体通常包含转录启动子-增强子例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子以及Rous肉瘤病毒(RSV)的长末端重复以进行高水平表达。这些启动子-增强子在许多细胞类型中是活性的。组织和细胞类型启动子和增强子区域也可用于表达。举例的启动子/增强子区域包括但不限于如下基因的那些区域：弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺肿瘤病毒、白蛋白、α-胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、β-球蛋白、髓鞘碱性蛋白、肌球蛋白轻链-2以及促性腺激素释放激素基因控制。选择标记可用于选择和维持具有所述表达构建体的细胞。举例的选择标记基因包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶和胸苷激酶。与细胞表面信号分子如TCR-ζ和Fc_εRI-γ的融合可指导蛋白质在细胞表面上以活性状态表达。

许多细胞系可用于哺乳动物表达，包括小鼠、大鼠、人、猴和鸡以及仓鼠细胞。举例的细胞系包括但不限于CHO、VERO、BHK、HT1080、MDCK、W138、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌型)及其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异杂交瘤细胞系、淋巴细胞、RPMI 1788细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8、EBNA-1以及HKB细胞(见例如美国专利No.5,618,698、6,777,205)。细胞系也可以适应无血清培养基，其便于分泌的蛋白质从细胞培养基中纯化(例如EBNA-1，Pham etal.，(2003)Biotechnol.Bioeng.84：332-42)。

可以对使用重组病毒或者病毒元件指导表达的哺乳动物细胞系统工程化。例如，当使用腺病毒表达载体时，编码RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物的核酸可以与腺病毒转录/翻译控制复合物连接，所述转录/翻译控制复合物例如是晚期启动子和三联前导序列。然后可以通过体外或者体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如E1或E3区)导致重组病毒在感染的宿主中可以存活并且能表达编码RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物的核酸(例如见Loganand Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：3655-3659)。或者，可以使用痘苗病毒7.5K启动子(见例如Mackett et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：7415-7419；Mackett et al.(1984)J.Virol.49：857-864，1984；以及Panicali et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：4927-4931)。特别感兴趣的是基于牛乳头状瘤病毒的载体，其具有作为染色体外元件复制的能力(Sarver，et al.，Mol.Cell.Biol.1：486-96，1981)。在这种DNA进入小鼠细胞后不久，质粒复制为大约100-200个拷贝每个细胞。插入的cDNA的转录不需要质粒整合进宿主基因组中，从而产生高水平表达。这些载体通过在质粒中包含选择标记如neo基因而可用于稳定表达。或者，可以对逆转录病毒基因组进行修饰以用作能导入并指导RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物在宿主细胞中表达的载体(Cone and Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6349-6353，1984)。高水平表达也可以通过使用诱导型启动子实现，所述诱导型启动子包括但不限于金属硫蛋白IIA启动子和热休克启动子。

对于长期高产量产生重组蛋白质而言，优选稳定表达。代替使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用由适当的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的编码RIP毒素变体或者配体-RIP毒素变体缀合物蛋白的cDNA以及选择标记转化宿主细胞。重组质粒中的选择标记赋予对选择的抗性并使得细胞将该质粒稳定整合进其染色体中，生长形成转化灶(foci)，其随之可以被克隆进细胞系中并扩展。例如，在导入外源DNA之后，可以使工程化的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换为选择培养基。可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.，Cell，11：223-32，1977)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska and Szybalski(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，48：2026-30)以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al.(1980)Cell 22：817-31)基因可分别用于tk^-、hgprt^-或aprt^-细胞中。抗代谢物抗性也可以用作选择基础：dhfr，其赋予氨甲蝶呤抗性(Wigler et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：3567-70；O′Hare et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8：1527-31，1981)；gpt，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan and Berg(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072-6；neo，其赋予氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin et al.(1981)J.Mol.Biol.150：1-14)；以及hygro，其赋予潮霉素基因抗性(Santerreet al.(1984)Gene 30：147-56)。近年来已经描述了其它可选择基因：trpB，其使得细胞可以使用吲哚代替色氨酸；hisD，其使得细胞可以使用histinol代替组氨酸(Hartman and Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8047-51)；以及ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其赋予鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸、DFMO(McConlogue and Coffino(1983)J.Biol.Chem.258：8384-8388)抗性。

b.纯化

从宿主细胞中分离和纯化表达的修饰的RIP毒素或者配体-RIP毒素缀合物的技术依赖于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌分子，蛋白质通常在除去细胞之后从培养基中纯化。对于细胞内表达，可以裂解细胞并从提取物中纯化蛋白质。当转基因生物体如转基因植物和动物用于表达时，组织或器官可用作起始材料产生裂解的细胞提取物。此外，转基因动物产生可包括在可以收集的乳汁或蛋中产生多肽，如果需要可以使用本领域标准方法进一步提取蛋白质以及进一步纯化。

在一些情况中，在纯化之前，可以获得含有分泌的融合多肽包括配体-毒素缀合物的条件培养基。所述条件培养基可以纯形式(neat form)检测。在其它实例中，所述条件培养基可以被澄清和/或浓缩。澄清可以通过离心及随后的过滤实现。浓缩可以通过本领域技术人员已知的任何方法实现，例如使用切向流膜(tangential flow membranes)或者使用搅动细胞系统滤器。各种分子量(MW)分离截断值可用于浓缩方法中。例如可以使用10000 MW分离截断值。

可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术对由原核生物或者真核生物产生的修饰的RIP毒素或者配体-RIP毒素缀合物进行纯化，所述方法包括但不限于SDS-PAGE、示差沉淀、渗滤、超滤、柱电聚焦(columnelectrofocusing)、平板电聚焦(flat-bed electrofocusing)、凝胶过滤、等速电泳、大小分级分离、硫酸铵沉淀、高效液相层析、螯合层析、吸附层析、离子交换层析(例如阳离子、阴离子)、疏水性相互作用层析以及分子排阻层析。亲和性纯化技术也可以用于改良制备物的功效和纯度。例如，在亲和性纯化中可以使用单克隆或者多克隆抗体、受体以及结合修饰的RIP毒素或者配体-RIP毒素缀合物的其它分子。也可以对表达构建体工程化以加入亲和性标记如myc表位、GST融合体或者His₆，并且分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂亲和性纯化蛋白质。纯度可以通过本领域已知的任何方法评估，包括凝胶电泳和染色以及分光光度法。

在转化之后，可以根据常规方法分离和纯化大量蛋白质。例如，可以从表达宿主中制备裂解产物，希望的蛋白质(例如配体-RIP毒素变体)可以使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和性层析或者其它纯化技术纯化。纯化的蛋白质通常是大约80％至大约90％纯的，可以是直至并包括100％纯的。纯是指没有其它蛋白质以及细胞碎片。

在一些实例中，选择的纯化方法可影响蛋白质结构并因此在纯化后需要额外的制备步骤以产生希望的重组蛋白。例如，在应用强变性条件的纯化技术之后，一些表达的蛋白质需要再折叠。再折叠蛋白质的方法为本领域所已知，可包括例如在存在低水平还原剂的条件下透析(见例如实施例4)。

3.化学缀合物的产生

为实现本发明的化学缀合，通过一或多个选择的接头或者直接连接靶向物质与被靶向物质。如果被靶向物质和靶向物质作为单独的多肽被表达则可以使用化学缀合并且如果被靶向物质不是肽或蛋白质如核酸或者非肽药物则必须使用化学缀合。可以使用本领域技术人员已知用于化学缀合选择部分的任何方法。一些方法在本文别处描述，包括但不限于使用交联剂如同-和异双官能连接化合物。

编码RIP毒素变体或者靶向物质的核酸分子也可以被修饰以便于被靶向物质如本发明提供的修饰的RIP毒素变体与靶向物质的翻译后化学缀合。例如，编码RIP毒素变体或者靶向物质的核酸分子可以与编码能够在表达后将RIP毒素与靶向物质连接的接头多肽的核酸分子融合及任选纯化RIP毒素与靶向物质。在另一实例中，编码RIP毒素变体或者靶向物质的核酸分子可以被修饰为突变特定密码子以在多肽中产生可用作多肽的化学修饰和附着位点的氨基酸如接头以进行缀合。更特别地，通过除去和/或导入含有用于接头部分的附着基团的氨基酸残基可以特异性修饰多肽以产生对于与选择的接头部分缀合更敏感的分子(见例如美国专利Publication No.20060252690)。

H.增加RIP多肽或者其缀合物产生的方法

本发明提供了通过降低RIP毒素的毒性活性以使得宿主产生增加量的毒性多肽而增加重组表达的RIP毒素或者配体-RIP毒素缀合物或者其变体的产生的方法。在这种方法中，如本发明提供的任何RIP毒素或者其缀合物可以例如在上文章节G所述在存在一或多种RIP抑制剂的条件下产生。本领域技术人员已知的或者随后鉴别的可以失活RIP毒素的任何RIP毒素抑制剂均可以用于本发明提供的方法中。如在本文别处所述，举例的RIP毒素抑制剂包括例如RIP特异性寡核苷酸抑制剂如RNA适体、RIP特异性抗体和/或腺嘌呤异构体包括例如腺嘌呤、4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(4-APP)及其它类似异构体。对于本发明提供的方法而言，这种RIP毒素抑制剂典型是通过靶向RIP毒素的保守N-糖苷酶活性而抑制毒性活性的任何抑制剂。对于本发明而言，任何RIP抑制剂如腺嘌呤或者其任何类似物均可用于本发明方法中，只要所述抑制剂对于RIP毒素或者其缀合物具有抑制活性即可。因此，RIP抑制剂如4-APP可用于本发明方法中以进行RIP毒素、配体-RIP毒素或者其变体包括但不限于修饰的SA1、肥皂草毒蛋白、苦瓜毒蛋白或者异株泻根毒蛋白的蛋白质生产。

本发明提供的改良生产的方法中使用的RIP抑制剂的选择依赖于许多因素，包括但不限于选择用于重组蛋白质表达的宿主细胞以及被表达的特异RIP多肽。RIP抑制剂对于指定RIP多肽的特异性是已知的或者可以基于评估RIP多肽毒性的常规测定法确定。关于RIP抑制剂特异性的论述在本文别处描述。例如，基于已知和检测的腺嘌呤类似物的特异性，4-APP是用于本发明表达和改良产生志贺毒素包括其SA1部分、活性片段以及缀合物的方法中的候选物。特别地，4-APP可用于本发明改良生产的方法中以增加本发明提供的任何修饰的SA1多肽或者其任何缀合物如本发明提供的任何LPM缀合物的产量。

多肽表达方法中使用的RIP抑制剂的量可以基于其对于RIP毒素、配体-RIP毒素缀合物或者其变体的毒性活性的已知作用而根据经验加以确定。重要的是本发明方法中使用的RIP抑制剂本身对于特定宿主细胞无毒性，毒性为本领域技术人员所已知或者可以根据选择的宿主细胞加以确定。因此，在本发明的表达方法中，加入大约或者是0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、5.0mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM、50mM或者更多RIP抑制剂例如4-APP，只要所述抑制剂本身对于选择的宿主细胞无毒性即可。应理解选择的RIP抑制剂的浓度可以根据选择的宿主细胞、用于重组表达的条件、与抑制剂保温的持续时间、选择的特定RIP抑制剂和/或特定的RIP毒素或者产生的配体-毒素缀合物而变化。

在一个实例中，RIP抑制剂的浓度可以通过进行剂量应答实验并且测定在每种浓度抑制剂下表达的蛋白质的量而根据经验加以确定。例如，本发明实施例4描述了举例性的这样的实验，通过在增加浓度的4-APP的存在下表达之后进行考马斯蓝染色评估各种LPM的表达谱从而确定用于各种LPM生产中的4-APP的最佳浓度。如实施例4所例证，结果示出在增加浓度的4-APP的存在下，不同LPM缀合物之间表达的多肽水平存在一些差异。为了确定用于本发明生产方法中RIP抑制剂的浓度，可以使用任何RIP多肽或者其缀合物以及任何RIP抑制剂例如4-APP进行相似实验以确定提供最大程度蛋白质表达的RIP抑制剂浓度。例如，LPM1 d在存在或在大约10mM或更高4-APP条件下最大水平表达，而LPM7在存在或大约2.0mM或更高4-APP条件下最大水平表达。通常，LPM缀合物如含有与变体4修饰的SA1部分直接或者间接连接的趋化因子配体的那些缀合物在本发明的方法中在存在或者在大约2.0mM、3.0mM、4.0mM、5.0mM、10.0mM或者20mM的4-APP条件下产生。

RIP抑制剂可以在用编码RIP毒素、配体-毒素缀合物或者其变体的核酸转化宿主细胞之前、期间或者之后加入。在使用诱导剂诱导蛋白质表达的情况中，RIP抑制剂可以在诱导剂诱导宿主细胞之前、期间和/或之后加入。例如，RIP抑制剂可以在加入诱导剂之前以单一浓度加入。在另一实例中，RIP抑制剂可以在加入诱导剂之前以单一浓度加入，并且在与诱导剂保温期间或者之后可以为培养基补充额外的RIP抑制剂。在一些情况中，根据使用的特定表达系统，加入表达系统中的RIP抑制剂的浓度在不同阶段可以变化。例如，如实施例4举例说明，在配体-毒素缀合物的最初过夜培养和生长期间，向用编码LPM的核酸转化的大肠杆菌细胞中加入的RIP抑制剂4-APP的浓度为2.0mM，然而在与诱导剂一起保温期间加入的另外的4-APP浓度高出直至10倍。如实施例4举例说明，使用的RIP抑制剂的浓度以及施用RIP抑制剂的时间可以根据使用的特定表达系统而优化。

在本发明的方法中可以使用一或多种RIP抑制剂以改良RIP毒素或者其缀合物的产生。此外，改良蛋重组白质表达和生产的其它方法如上述任何方法也可以用于本发明方法中。例如，本领域已知的已经用于增加RIP多肽或者其缀合物的表达和生产的任何方法均可以在存在或者不存在RIP抑制剂如4-APP的条件下进行。

增加蛋白质产生的其它方法

除了在蛋白质的表达和产生期间使用RIP抑制剂如4-APP增加RIP多肽或者配体-毒素缀合物的产生之外，也可以使用其它方法。改善多肽如本发明提供的任何RIP多肽或者其缀合物的表达和产生的方法包括本领域已知的任何方法。这种方法的使用依赖于用于产生多肽的表达系统(例如细菌、酵母、哺乳动物、昆虫、植物等)且可以包含一些因素的更改如表达载体的选择(例如针对调节或组成型表达)、宿主细胞的生长条件或者蛋白质诱导参数。上文提及的从宿主细胞中分离表达的多肽的纯化方法(例如宿主细胞裂解和蛋白质分离方法)也可以通过本领域已知的变化进行优化以改良产生的蛋白质的量。举例的改良生产的其它方法在下文论述。

可以通过各种方法改变宿主细胞的生长条件，所述方法包括但不限于改变pH、温度、大气含量(例如氧和二氧化碳浓度)、培养基含量包括渗透压、营养物浓度(例如葡萄糖及其它糖、矿物质和磷酸盐或者其它离子)或者存在影响宿主生长的其它分子(例如抗生素、抗病毒或抗微生物化合物、蛋白质抑制剂等)。也可以对生长条件进行修饰以降低可影响蛋白质表达的抑制剂分子如硫酸盐的产生(见例如美国专利No.6,686,180)。

诱导参数也可以改变，例如改变诱导剂的浓度(例如IPTG或者其它诱导物分子、温度、氧含量等)、诱导时间长度、诱导温度、在诱导期间宿主细胞浓度以及宿主背景对于表达水平的影响。

宿主细胞的选择可影响蛋白质生产水平。例如，在不同遗传背景中获得的细菌菌株可以影响蛋白质产生。这种差异包括但不限于蛋白酶(例如lon和ompT)、重组酶(例如recA)或者核酸内切酶(例如endA)中的突变，改良二硫键形成和蛋白质再折叠的突变(例如trxB/gor)，为进行T7启动子驱动表达的DE3溶原性细菌的存在(例如LysE或者LysS)以及影响蛋白质诱导控制的突变(例如lacZY or lacI^q)或者宿主细胞的糖利用。宿主细胞也可以含有稀有tRNA拷贝以改良编码多肽的核酸序列中稀有密码子的识别。

改变本发明提供的多肽的表达水平的另一方法是修饰编码该多肽的核酸或者改变含有编码该多肽的核酸分子的表达载体。如本文别处所述及本领域所知，许多载体可用于表达本发明提供的多肽，包括本发明提供的RIP毒素变体以及配体-RIP毒素变体。改良本发明提供的多肽的产生的方法包括选择载体，所述载体具有例如但不限于强启动子以高水平表达、可调节启动子以控制表达时间、组成型启动子以持续表达或者稳定启动子以长期表达。优选使用使得蛋白质可以高水平表达并紧密调节的载体以表达毒性蛋白质如本发明提供的RIP毒素变体以及配体RIP毒素变体。这种载体的例子为本领域所已知，包括例如在本文别处以及实施例中描述的pET载体，具有厌氧调节启动子(例如nirB)的载体以及L-鼠李糖可诱导载体，其被D-葡萄糖抑制(pET载体可商购自Novagen；Debinski et al.，(1991)Mol.Cell.Biol.11：3：1751-1753；Debinski and Pastan(1992)Cancer Res.52：5379 5385；Debinski et al.(1992)J.Clin.Invest.90：405-411；Oxer et al.(1991)Nucl.AcidsRes.19(11)2889-2892；Giacalone et al.(2006)Biotechniques 40(3)：355-363)。

编码多肽的核酸也可以被修饰以在编码多肽氨基酸的密码子中含有突变，由此在表达所述多肽的宿主中稀有的密码子被突变为在宿主中更常见的密码子，而不改变编码的氨基酸。使用特定宿主的更高使用率的密码子可通过改良多肽的翻译速率而改良多肽的产生。特定宿主如细菌宿主的密码子使用频率为本领域所已知，可用于产生编码本发明提供的多肽的优化的核酸。

I.测量毒素缀合物活性的体外和体内测定法

通常，本发明提供的配体-毒素缀合物呈现对于一或多种宿主细胞的毒性活性和/或呈现一或多种其它活性，如靶向并结合细胞表面受体的能力。正是如此，所述缀合物是候选的治疗剂。如果需要，可以使用体外和体内测定法筛选缀合物以监测或者鉴别毒素缀合物的活性并且选择呈现这种活性的缀合物。检测本发明提供的任何缀合物的体外测定法包括确定所述缀合物对于特定宿主细胞被靶向的细胞群是否显示活性的任何测定法。这种活性包括但不限于毒性测定，包括基于细胞的毒性测定、受体结合测定、细胞内化测定以及趋化性测定。而且，本领域已知各种体内动物模型或者可以设计模型以评估特定毒素在特定疾病模型中的作用。

1.体外活性测定

a.基于细胞的毒性测定

可以检测本发明提供的缀合物由于其N-糖苷酶活性而对于宿主细胞的毒性活性。检测毒性活性的测定在上文章节D中详细描述，包括但不限于评估蛋白质合成、核糖体的脱嘌呤作用以及宿主细胞的细胞生长或生存力的测定。例如，针对毒性活性测定选择的宿主细胞可以是已知表达被靶向的受体的细胞。这种细胞可包括直接得自对象即血液、血清或者其它组织来源的那些细胞或者已知表达细胞表面受体的任何细胞系。这种细胞包括活化的细胞。细胞可以在体外通过任何刺激活化和/或可以直接得自患有疾病或失调的对象，特别是特征在于活化的白细胞或其它细胞类型的任何炎性疾病或失调。举例的可以在毒性活性测定中检测的细胞类型包括但不限于任何免疫细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞(包括尘细胞、小胶质细胞、kupffer细胞)、树突细胞(包括不成熟或者成熟树突细胞或者朗格汉斯细胞)、T细胞(包括CD4阳性细胞，例如但不限于Th1和/或Th2细胞，或者CD8阳性细胞)、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞以及内皮细胞或者其活化形式。可以检测对于配体毒素缀合物的毒性的其它细胞包括例如癌细胞或者癌细胞系，如U251、HT-29或者THP-1细胞。如上所述，细胞的存活(或者死亡)可以例如通过如下能力确定：释放ATP进入培养基的能力、细胞还原活性染料MTT的能力和/或排除染料台盼蓝的能力。

b.受体结合测定及内化

配体-毒素缀合物如任何趋化因子毒素缀合物例如本发明提供的含有修饰的SA1部分的任何LPM均可以被设计为靶向一或多种被靶向宿主细胞上的细胞表面受体。结合这种细胞表面受体的毒素缀合物可以通过评估毒素缀合物与细胞的结合而直接评估。在一些实例中，可以确定毒素缀合物与单核细胞、巨噬细胞(包括尘细胞、小胶质细胞)、T细胞(包括Th1和Th2细胞)、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、kupffer细胞、肥大细胞、天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和内皮细胞的结合。如果需要，在进行结合实验之前首先可以用任何已知活化剂活化细胞以诱导受体的表达，如通常在各种疾病和失调中观测到的炎症和病变中出现的。检测的细胞可以是直接分离自供体或者在诱导适当细胞表型的条件下长期培养的任何合适供体衍生的细胞系或者原代细胞。在一些实例中，可以用关联非缀合配体进行竞争测定以评估与配体相比毒素缀合物的活性。例如，如果检测毒素缀合物LPM1d(含有与修饰的SA1缀合的趋化因子MCP-1)，在竞争测定中可以单独使用MCP-1。

在一个实例中，毒素缀合物结合已知表达特定细胞表面受体的宿主细胞的能力可以通过用任何已知的可检测物质标记所述缀合物进行评估，所述可检测物质例如但不限于是荧光部分、放射性部分或者标记多肽(即Flag、His标记、myc标记)。例如，毒素缀合物可以用荧光部分如异硫氰酸荧光素(FITC)标记。可以向任何希望的细胞类型中加入增加浓度的FITC-标记的毒素缀合物并在4℃保温指定时间，例如30分钟或者1小时。在洗涤细胞以除去任何未结合的毒素缀合物后，可以通过流式细胞术测量细胞结合荧光。在一些情况中，毒素缀合物的结合亲和性可以通过在流式细胞术中通过毒素缀合物的浓度除以配体的浓度等于平均荧光值通过对比配体与配体毒素缀合物的结合亲和性而确定(见例如Thompson et al.(2001)ProteinEngineering，14：1035-1041)。此外，如果需要，可以通过对比在4℃和37℃的荧光评估毒素缀合物由细胞内化的能力。可以调整保温时间以保证毒素缀合物在37℃保温期间对细胞无毒性。评估结合和内化的其它方法为本领域技术人员所已知，包括但不限于使用放射性、基于细胞的ELISA以及其它这种测定。

c.趋化性测定

可以使用常规趋化性测定法检测毒性缀合物、特别是任一或多种趋化因子毒素缀合物如本发明提供的含有修饰的SA1部分的任何LPM缀合物的调节细胞趋化性的能力。这种测定与趋化因子结合关联趋化因子受体的能力相关。在这种测定中，白细胞包括活化的白细胞的迁移可以由趋化因子诱导并通过使用常规Boyden室设置计数迁移穿过滤膜的细胞而进行测量(见例如McDonald et al.(2001)IDrugs，4：427-442)。例如，可以将任何希望的细胞铺板于改良的Boyden室上部孔中，所述细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞(包括尘细胞、小胶质细胞)、T细胞(包括Th1和Th2细胞)、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、kupffer细胞、肥大细胞、天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和内皮细胞。这种细胞可以是直接分离自供体或者在诱导适当细胞表型的条件下长期培养的任何合适供体的细胞系或者原代细胞。Boyden室的下部室典型地含有含配体趋化因子的培养基。在一些情况中，某些细胞在无任何特异外界刺激的条件下是组成型活性的并且可以迁移。这种细胞包括例如THP-1细胞。因此，如果THP-1细胞用于趋化性测定中，不需要外源趋化因子，而且可以对比所述趋化因子缀合物对于通过迁移而在底部室中存在的活性细胞和上部室中剩余的非活性细胞的作用(McDonald et al.(2001)IDrugs，4：427-442)。Boyden室的上部孔或者底部孔或者这二者可以用各种浓度的趋化因子毒素缀合物处理。在保温30分钟、1小时、2小时、5小时、10小时、15小时、24小时或者更长时间之后，可以确定室的每个孔中(或者滤膜上存在的)的细胞数目。可以确定趋化因子毒素缀合物对于每个室中细胞的作用并且与不含毒素缀合物的对照孔对比。在一或这两个室中不存在细胞和/或在底部室中不存在迁移活性细胞表示趋化因子毒素缀合物具有抗靶细胞群活性。

2.检测缀合物的体内动物模型

本发明提供的缀合物如与修饰的SA1或者其活性部分缀合的任何多肽包括例如本发明提供的含有修饰的SA1部分的任何LPM缀合物可用于治疗趋化因子和/或受体参与或者与之相关的疾病。本文描述了针对特定疾病的特定缀合物。如果需要，本领域技术人员可以在熟知模型中检测缀合物以证实或者鉴别用于特定指征的缀合物。疾病的动物模型为本领域所熟知。这种模型包括炎性疾病的任何动物模型，特别是涉及活化的白细胞或者在某疾病状态表达趋化因子受体的细胞的疾病在本发明中用配体-毒素缀合物治疗。测定所述毒素缀合物在这种动物模型中的活性可证实活性和/或鉴别适于治疗本发明涵盖的特定疾病或失调的那些毒素缀合物。

本发明提供的配体-毒素缀合物包括含有修饰的SA1部分的任何LPM缀合物也可以在已经使用过其它缀合物的疾病模型如小鼠异种移植模型中检测以鉴别抗肿瘤活性(见例如Beitz et al.(1992)Cancer Research52：227-230；Houghton et al.(1982)Cancer Res.42：535-539；Bogden et al.(1981)Cancer(Philadelphia)48：10-20；Hoogenhout et al.(1983)Int.J.Radiat.Oncol.，Biol.Phys.9：871-879；Stastny et al.(1993)Cancer Res.53：5740-5744)。

选择治疗哺乳动物的候选物的动物模型为本领域所熟知并且有许多公认的模型。另外，活化的免疫细胞在这些疾病状态中的作用已经证实。举例的这种疾病和病症的模型包括但不限于下文论述的那些。

a.脊髓损伤(SCI)

检测并证实本发明的缀合物治疗SCI的活性的模型为本领域技术人员所已知。举例的提供并使用可用于检测配体-毒素缀合物如含有修饰的SA1部分的LPM缀合物的SCI动物模型的参考文献包括但不限于如下阐述的那些文献。

Bennett et al.(1999)，Spasticity in rats with sacral spinal cord injury，J.Neurotrauma 16：69-84，提供了肌痉挛大鼠模型，该模型是最低限度破坏性的，不妨碍膀胱、肠或者后肢运动功能。在S2骶椎水平做脊髓横断，因此仅影响尾部肌肉系统。在脊髓横断后，尾部肌肉失活2周。在此最初阶段之后，在尾部出现张力过高、反射亢进和阵挛，并且随着时间而更明显。在警觉大鼠中评估这些改变，因为尾部易于接近且易于操作。尾部的肌肉伸展或者皮肤刺激产生肌痉挛并且肌张力明显增加，这通过受力和肌电图记录测量。当尾部不受限制时，自发或者反射诱导的屈肌和伸肌痉挛使尾部卷曲。在痉挛期间的运动通常在尾部末端引发阵挛。尾部毛和皮肤对于轻触极端超反射(hyperreflexive)，在接触时迅速缩回，并且有时阵挛可通过在尾部表面上重复接触而产生。在spinalization之前和之后测量节段尾部肌反射例如Hoffman反射(H-反射)，在横断2周后显著增加。这些结果表明骶椎横断大鼠在尾部肌产生痉挛状态症状，与在人脊髓损伤的肢体肌组织中见到的那些有相似特征，因此提供了研究这种病症的方便制备物。

Taoka et al.(1998)，Spinal cord injury in the rat，Prog Neurobiol56：341-58，提供了关于大鼠创伤引起的脊髓损伤的病理学机制综述以进一步开发新的治疗策略。由于创伤引起的脊髓损伤是最初的物理损害及随后的包括各种病理化学事件导致组织破坏的渐进性损伤的结果；后者因此是药物治疗的靶位。近年来，已经揭示活化的嗜中性粒细胞参与大鼠脊髓损伤的后期过程。活化的嗜中性粒细胞通过释放炎症介质如嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和氧自由基而损害内皮细胞。活化的嗜中性粒细胞与内皮细胞的粘附在内皮细胞损伤中也可起作用。这种内皮细胞损伤随之可诱导微循环障碍，引起脊髓缺血。抑制嗜中性粒细胞活化的一些治疗剂减轻在大鼠脊髓损伤模型中观测到的运动障碍。目前只有甲基强的松龙(MPS)和GM1神经节苷脂这两种药物可用于临床治疗急性脊髓损伤，它们在这个大鼠模型中不抑制嗜中性粒细胞活化。总之，这些观测结果产生这样的可能性，即抑制嗜中性粒细胞活化的其它药剂与MPS或GM1神经节苷脂联合应用在治疗人创伤性脊髓损伤中可具有协同作用。

Carlson et al.(1 998)，Acute inflammatory response in spinal cordfollowing impact injury，Exp Neurol 151：77-88，检查了大鼠T10脊髓挫伤(10g重量，50mm打击)后第4、6、24和48小时嗜中性粒细胞和巨噬细胞/小胶质细胞的嘴-尾分布。嗜中性粒细胞主要位于坏死区，根据髓过氧物酶活性(MPO)测定在24小时达到峰值。MPO活性的最锐利峰位于距损伤4mm嘴尾之间。巨噬细胞/小胶质细胞利用ED1和OX-42的抗体观测。具有吞噬细胞形态的许多细胞在24小时呈现，在48小时达到较高数目。这些细胞主要位于灰质和背索白质内。细胞数目在距损伤6mm嘴尾逐渐减少。OX-42染色也显示钝性过程的活性小胶质细胞，特别是在远离损伤处。巨噬细胞/小胶质细胞的数目与每种水平的组织损害量显著相关。

Expression of pro-inflammatory cytokine and chemokine mRNA uponexperimental spinal cord injury in mouse：an in situ hybridization study，Bartholdi et al.(1997)Eur JNeurosci 9：1422-38，描述了在小鼠实验性脊髓损伤模型中促炎和化学引诱物细胞因子的表达模式研究。原位杂交揭示促炎细胞因子TNFα和IL-1以及趋化因子

和

的转录物在损伤后的头一个小时内上调。在这个早期阶段，促炎细胞因子的表达受限于损伤区域周围的细胞，可能是居留CNS细胞。虽然TNFα在非常窄的时间窗内表达，但是IL-1可以在第二阶段在大约6小时迁移进脊髓中的多形核粒细胞亚类中检测到。趋化因子

和

的信使在损伤后大约24小时以一般化方式在全部脊髓灰质中表达并且在损伤后4天再次受限于损伤部位的细胞浸润。数据表明居留CNS细胞、最可能是小胶质细胞而不是周围炎症细胞是细胞因子和趋化因子mRNA的主要来源。观测到的限定的细胞因子模式表明在CNS损伤时的炎症事件被紧密控制。促炎细胞因子和趋化因子信使的极早期表达可以代表炎症细胞募集的重要元件。

Morphometric analysis of blood vessels in chronic experimental spinalcord injury：hypervascularity and recovery of function，Blight et al.(1991)，JNeurol Sci 106：158-74，提供了豚鼠脊髓损伤模型，其基于先前已经描述的压缩至设定厚度。在11只麻醉的成年豚鼠中进行较低胸髓压缩性损伤，使用连续行为测试以及在2-3个月对损害进行形态测量监测结果。这个报道描述了脊髓的血管分布变化，其基于光学显微镜分析穿过损伤中心的1微米塑性横向切片。这些损伤中的平均血管密度是在正常未损伤脊髓的相同区域中发现的大约2倍，白质的过度血管分布从损伤中心向头和尾延伸至少4个脊髓节段。毛细管直径分布显著转变为环绕大多数毛细管和毛细管前和后血管的更大值和大的血管周围空隙。过度血管分布的程度与损伤的整体严重程度无关，但是在损害后第一天至第8周之间可见的在白质外层400微米中的血管密度与损伤以下继发神经功能丧失之间存在显著正相关。这些数据表明损害处过度血管分布与脊髓损伤的继发病理学机制可能是炎症反应相关，其相对不依赖于最初的机械损伤，而是与功能的丧失和恢复更密切相关。

Increased levels of the excitotoxin quinolinic acid in spinal cord followingcontusion injury，Blight et al.(1993)，Brain Res 632：314-6，揭示了炎症吞噬细胞的产物是在脊髓损伤之后继发病变的潜在导致者(contributor)，并且介绍了这样的研究，即量化在短暂压缩性损伤之后5天的成年豚鼠的较低胸髓中神经毒素以及活化的巨噬细胞的产物喹啉酸(QUIN)的水平。在损伤部位(T13)，组织QUIN水平升高(＞10倍)伴随吲哚胺-2，3二氧酶的活性(＞2倍)和L-犬尿氨酸浓度(＞2.5倍)成比例增加。相反，在与对照组对比检查的两个未损伤的区域中无明显变化，这两个区域即颈髓(C2)和躯体感觉皮质。

Forbes et al.(1994)，Inhibition of neutrophil adhesion does not preventischemic spinal cord injury，Ann Thorac Surg 58：1064-8，依赖于动物模型揭示截瘫可以在由于最初脊髓缺血或者再灌注期间损伤所致的短暂主动脉血流阻断后发生。在缺血/再灌注动物模型中有迹象表明再灌注损伤可以部分由嗜中性粒细胞调节。在兔脊髓缺血/再灌注模型中评估了嗜中性粒细胞粘附阻断性小鼠单克隆抗体(MAb 60.3)的效力。脊髓缺血通过对肾下主动脉进行球囊导管闭塞而实现。神经学评估分级为正常、部分神经学缺陷或者完全截瘫。使用躯体感觉诱发电位进行电生理学监测以确定血流阻断的最佳时间长度。将动物随机通过静脉内注射2mg/kg的Mab 60.3(8只)或者盐水溶液(9只)处理，研究人员不知道用何物处理。组间平均血流阻断时间无差异(对照组32.7+/-3.6分钟，MAb组32.4+/-6.0分钟)。5只(55％)经盐水处理的动物和4只(50％)经MAb 60.3-处理的动物成为截瘫。最初轻截瘫的动物在24小时内均进展为弛缓性截瘫。这项研究推断在短暂主动脉血流阻断之后的脊髓损伤不依赖于嗜中性粒细胞的CD11/CD18糖蛋白复合物。这种背景中的损伤可以在缺血期间发生并因此也许不依赖于嗜中性粒细胞或者再灌注。

Liu et al.(1997)，Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cordinjury，J Neurosci 17：5395-406，检查了进行轻度至中等程度创伤性损害的大鼠脊髓。在施加轻度重物下降打击(10gm重量下降6.25mm)之后的几分钟内，直接受力区域中的神经元示出丧失细胞质Nissl物质。在接下来的7天，这个损伤区域扩展并空化。最初注意到末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)-介导性三磷酸脱氧尿苷-生物素切口末端标记(TUNEL)-阳性神经元在损伤后4-24小时限于整个损伤区域，在损伤后8小时达到最大程度存在。TUNEL-阳性神经胶质细胞在4小时至14天的整个研究阶段均存在，在损伤后24小时在损害区域内最大程度存在。损伤7天后，第二波TUNEL-阳性神经胶质细胞在损害周围的白质中注意到并且扩展到距离损害中心至少几毫米的区域。凋亡机制通过电子显微镜以及通过用Hoechst 33342染料进行核染色及通过检查从损害部位制备的DNA而证实。此外，在用12.5mm重物下降打击之后立即开始的重复腹膜内注射环己酰亚胺使得在4周后评估的脊髓损害的组织学迹象和运动功能障碍显著减轻。该数据支持了这样的假说，即依赖于活性蛋白质合成的凋亡导致神经元和神经胶质细胞死亡并且导致通过大鼠脊髓的轻度至中等程度创伤诱导的神经学功能障碍。

举例的LPM缀合物在脊髓损伤模型中的结果在实施例8中阐述，其示出了LPM1d在脊髓损伤模型中的结果。其它LPM如本发明提供的含有与修饰的SA1缀合的趋化因子的任何LPM也可以在相似测定中检测。这些结果表明LPM可用作候选治疗剂治疗脊髓损伤。

b.神经变性疾病，包括创伤性脑损伤和卒中

检测和证实本发明的缀合物治疗神经变性疾病如创伤性脑损伤和卒中的活性的模型为本领域技术人员所已知。本文提供了提供并应用神经变性疾病如创伤性脑损伤和卒中的动物模型的举例的参考文献。这种模型可用于证实或鉴别配体-毒素缀合物如含有修饰的SA1部分的LPM缀合物，所述参考文献包括但不限于如下引用的参考文献。

Ghirnikar et al.(1996)，Chemokine expression in rat stab wound braininjury，J Neurosci Res 46：727-33，描述了成年哺乳动物中枢神经系统(CNS)的创伤性损伤导致反应性星形胶质化以及造血细胞迁移进入受损的神经组织。趋化因子被认为是在损伤后发生的炎症改变的介质。MCP-1表达已经在大鼠脑创伤中证实(Berman et al.(1996)J Immunol 156：3017-3023)。使用机械性损伤的戳伤模型研究两种其它趋化因子RANTES和MIP-1β在大鼠脑中的表达。戳伤特征在于广泛的神经胶质增生以及造血细胞浸润。免疫组织化学染色表明在损伤的脑中存在RANTES和MIP-1β。RANTES和MIP-1β均在坏死组织中广泛表达并且可以在早如损伤后(dpi)第1天检测到。双重标记研究揭示MIP-1β而非RANTES在损伤部位附近由反应性星形胶质细胞表达。此外，在损伤部位的巨噬细胞上也检测到MIP-1β染色。最初的趋化因子表达与损伤CNS中炎症细胞的出现密切相关，表示RANTES和MIP-1β可在创伤性脑损伤的炎症事件中起作用。这项研究也证实在大鼠CNS损伤后反应性星形胶质细胞中的MIP-1β表达。

Wang et al.(1998)，Prolonged expression of interferon-inducibleprotein-10 in ischemic cortex after permanent occlusion of the middle cerebralartery in rat，J Neurochem 71：1194-204，研究了IP-10在局灶性卒中中的作用，并通过Northern分析研究了在大鼠大脑中动脉闭塞后IP-10 mRNA的时间表达。在局灶性卒中之后IP-10mRNA表达证实一种独特的两相谱，在大脑中动脉血流阻断后3小时显著增加(与对照组相比增加4.9倍；p＜0.01)，在6小时达到峰值(14.5倍；p 0.001)，在缺血性损伤10-15天后出现第二波(在第10天和第15天分别增加7.2和9.3倍；p 0.001)。原位杂交证实在局灶性卒中后诱导的IP-10 mRNA表达并表明其空间分布。免疫组织化学研究证实IP-10肽在缺血区神经元(3-12小时)和星形胶质细胞(6小时至15天)中的表达。研究证实IP-10对于C6神经胶质细胞的剂量依赖性趋化作用以及增强的大鼠小脑颗粒神经元附着。数据表明缺血诱导IP-10，其在局灶性卒中之后的延长的白细胞募集、星形胶质细胞迁移/活化以及神经元附着/萌发中起作用。

Galasso et al.(1998)，Excitotoxic brain injury stimulates expression of thechemokine receptor CCR5 in neonatal rats，Am J Pathol 153：1631-40，评估了在出生后7天大鼠中经海马内注射NMDA对于CCR5表达的影响。逆转录聚合酶链反应表明在损伤后24小时海马CCR5 mRNA表达增加，原位杂交分析证实CCR5 mRNA在受损的海马及邻近区域中表达。Western印迹分析证实损伤后32小时的海马组织提取物中CCR5蛋白增多。互补免疫细胞化学研究鉴别浸润小胶质细胞/单核细胞和受损神经元是主要的CCR5-免疫反应性细胞。这些结果提供了急性兴奋性毒性损伤调节CCR5表达的证据。

Vannucci et al.(1999)，Rat model of perinatal hypoxic-ischemic braindamage，JNeurosci Res 55：158-63，使用早产大鼠模型研究围产期缺氧缺血性脑损害的发病机制和处理。这个模型需要结扎一条颈总动脉，之后形成全身缺氧。这种损伤产生限于闭塞颈动脉同侧大脑半球的永久缺氧-缺血脑损害。这个模型用于鉴别预防或最小化缺氧缺血性脑损害的治疗方案的研究中。

c.神经变性疾病-阿尔茨海默病(AD)

检测并证实本发明的缀合物治疗神经变性疾病如AD的活性的模型为本领域技术人员所已知。本文提供了举例的动物模型。这些模型可用于证实或鉴别用于治疗神经变性疾病如阿尔茨海默病的缀合物，其可用于检测配体-毒素缀合物如含有修饰的SA1部分的LPM缀合物，包括但不限于如下引用的参考文献。

Hauss-Wegrzyniak et al.(1998)，Chronic neuroinflammation in ratsreproduces components of the neurobiology of Alzheimer′s disease，Brain Res780：294-303，描述了炎症过程在阿尔茨海默病相关的变性改变和认知损害的发病机制中起作用并且描述了使用来自革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖(LPS)在年幼大鼠脑内产生慢性整体炎症。向第四脑室中持续灌注LPS(0.25μg/h)4周产生(1)遍及脑分布的胶质纤维酸性蛋白质-阳性活化的星形胶质细胞和OX-6-阳性反应性小胶质细胞数目增加，最多的增加出现在颞叶，特别是海马；(2)基底前脑区和海马中白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α以及β-淀粉样前体蛋白mRNA水平的诱导；(3)海马CA3锥体神经元的变性以及(4)通过对T-迷宫的自发变换行为降低而确定的空间记忆的显著损害。

本领域技术人员已知并可利用许多其它阿尔茨海默病模型，包括被遗传工程化表达参与阿尔茨海默病早期发作的家族中Aβ产生的人基因突变形式的啮齿动物。

d.多发性硬化

多发性硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)的炎性疾病，特征在于局部区域脱髓鞘。对于髓磷脂抗原的免疫应答导致疾病过程。MS是异种慢性自身免疫疾病，特征在于明显的炎症、少突胶质细胞髓磷脂鞘丧失、神经变性、神经胶质增生以及轴突丧失(见例如Bruck，W.& Stadelmann，C.Neurol Sci24 Suppl 5，S265-7 (2003)；Bruck，W.& Stadelmann，C.，Curr Opin Neurol 18，22 1-4(2005)；Fox，E.J.，Neurology 63，S3-7(2004)；Fox，R.J.&Ransohoff，R.M，Trends Immunol 25，632-6(2004)；Hendriks，J.J.，Teunissen，C.E.，deVries，H.E.& Dijkstra，C.D.Brain Res Brain Res Rev 48，185-95(2005)；Prat，A.&Antel，J.，Curr Opin Neurol 18，225-30(2005)；Liu，L.，Callahan，M.K.，Huang，D.&Ransohoff，R.M.，Curr Top Dev Biol 68，149-81(2005)；Mahad，D.et al.，Ernst Schering Res Found Workshop，59-68(2004))。这种疾病在北美影响大约400000人，全世界2百50万(见例如Cross，A.H.&Stark，J.L.，Immunol Res 32，85-98(2005)；Hafler，D.A.，J Clin Invest 113，788-94(2004)；Sindern，E.，Front Biosci 9，457-63(2004)；以及Steinman，L.，Neuron 24，511-4(1999))。这种疾病通常在20-40岁发作，但是也有非典型MS形式，包括早期(18岁以下)和晚期(50岁以上)病例，呈现不同的预后和诊断难题(见例如Krupp，L.B. & Macallister，W.S.，Curr Treat Options Neurol 7，191-199(2005)；Martinelli，V.，Rodegher，M.，Moiola，L.& Comi，G.，Neurol Sci 25Suppl 4，S350-5(2004)；Stadelmann，C.& Bruck，W.，Neurol Sci 25 Suppl 4，S319-22(2004)；Stadelmann，C.et al.，Brain 128，979-87(2005))。

大约85％的一般病例是以受损的感觉形态再发作-再缓解事件开始，包括受损的视力、暂时失明以及运动协调性。这可以为继发进展性疾病所代替。另一形式的MS称作原发进展性MS。再发作持续发生直至出现神经变性阶段(见例如Bruck，W.& Stadelmann，C.，Neurol Sci 24 Suppl 5，S265-7(2003)；Bruck，W.& Stadelmann，C.，Curr Opin Neurol 18，221-4(2005)；Fox，E.J.，Neurology 63，S3-7(2004)；Fox，R.J.&Ransohoff，R.M.，Trends Immunol25，632-6(2004)；Steinman，L.，Curr Opin Immunol 13，597-600(2001)；以及Zaffaroni，M.，Neurol Sci 24 Suppl 5，S279-82(2003))。MS的病因学包含免疫、遗传以及环境因素(例如病毒、细菌)(见例如Zaffaroni，M.，Neurol Sci24 Suppl 5，S279-82(2003))。

MS的病理标志是遍及CNS包括脊髓的白质斑块或者损害(见例如Bruck，W.& Stadelmann，C.，Neurol Sci 24 Suppl 5，S265-7(2003)；Mahad，D.et al.，Ernst Schering Res Found Workshop，59-68(2004)；Fawcett，J.W.& Asher，R.A.，Brain Res Bull 49，377-91(1999)；以及Zhang，Y.et al.，J Clin Immunol25，254-64(2005))。慢性活动型病变中最多的白细胞群是活化的CCR2⁺/CCR3⁺/CCR5⁺/CXCR3⁺巨噬细胞。其它细胞包括具有相似受体表达谱的B细胞、T细胞以及小胶质细胞。这些受体的关联配体在星形胶质细胞和参与的白细胞群周围的损害区中产生(见例如Banisor，I.，Leist，T.P.&Kalman，B.，J Neuroinflammation 2，7(2005)；Cartier，L.，Hartley，O.，Dubois-Dauphin，M.& Krause，K.H.，Brain Res Brain Res Rev 48，16-42(2005)；Galimberti，D.，Bresolin，N.&Scarpini，E.，Expert Rev Neurother 4，439-53(2004)；以及Putheti，P.et al.，Eur J Neurol 10，529-35(2003))。一旦在CNS中，白细胞群通过有害物质包括活性氧和氮、MMP、白三烯、自身抗体的产生以及促炎细胞因子和趋化因子的释放导致免疫损害。继之导致轴突损害、损害形成以及少突胶质细胞和神经元细胞死亡。

1)EAE模型

在EAE模型中，在小鼠中诱导脱髓鞘病。活化的单核细胞、巨噬细胞小胶质细胞及T细胞造成组织损害。尽管本例中的模型是急性的(类似于慢性进行性MS，与复发-缓解相反)，但是其实质上是在恶化之前存在这些白细胞组上CCR2(例如对LPM1d的受体，LPM1d多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：44所示)的上调，CNS及疾病的浸润。因此所述模型证实治疗可用于所有类型的MS。提供并使用多发性硬化动物模型(该模型可用于测试配体-毒素缀合物，例如含有修饰的SA1部分的LPM缀合物)的举例性参考文献包括但不限于Liu et al.(1998)，Nat Med 4：78-83，其描述了使用啮齿类模型，实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)用于研究MS。本文中提供的缀合物在EAE模型中的有效性数据见实施例10。

2)MS中涉及的白细胞

在许多研究中巨噬细胞和小胶质细胞在人类MS病理学及在EAE模型中是关键的。DC、MaC和B细胞也起作用(Cross，A.H.& Stark，J.L.，Immunol Res 32，85-98(2005)；Zhang，Y.et al.，J Clin Immunol 25，254-64(2005)；Mouzaki，A.，Tselios，T.，Papathanassopoulos，P.，Matsoukas，I.&Chatzantoni，K.，Curr Neurovasc Res 1，325-40(2004)；Heppner，F.L.et al.，Nat Med 11，146-52(2005)；Huitinga，I.et al.，Clin Exp Immunol 100，344-51(1995)；Polfliet，M.M.et al.，J Neuroimmunol 122，1-8(2002)；Behi，M.E.et al.，Immunol Lett 96，11-26(2005)；Theoharides，T.C.& Cochrane，D.E.，JNeuroimmunol 146，1-12(2004)；Chavarria，A.& Alcocer-Varela，J.，Autoimmun Rev 3，251-60(2004)；Kouwenhoven，M.et al.，J Neuroimmunol126，161-71(2002)；Greter，M.et al.，Nat Med 11，328-34(2005))。小胶质细胞在EAE发作之前被活化并增殖(见例如Ponomare v，E.D.，Shriver，L.P.，Maresz，K.&Dittel，B.N.，J Neurosci Res 81，374-89(2005))。小胶质细胞和巨噬细胞失活及T细胞和MNP细胞耗竭改善了EAE严重性(见例如Heppner，F.L.et al.，Nat Med 11，146-52(2005)；Huitinga，I.et al.，Clin ExpImmunol 100，344-51(1995)；Polfliet，M.M.et al.，J Neuroimmunol 122，1-8(2002)；Rajan，A.J.，Asensio，V.C.，Campbell，I.L.& Brosnan，C.F.，J Immunol164，2120-30(2000)；Rajan，A.J.，Klein，J.D.& Brosnan，C.F.J Immunol 160，5955-62(1998)；Bauer，J.et al.，Glia 15，437-46(1995)；Kotter，M.R.，Zhao，C.，van Rooijen，N.& Franklin，R.J.，Neurobiol Dis 18，166-75(2005)；and Tran，E.H.，Hoekstra，K.，van Rooijen，N.，Dijkstra，C.D.&Owens，T.，J Immunol 161，3767-75(1998))。研究表明外周巨噬细胞对于其活化T细胞和EAE发生是关键的(见例如Polfliet，M.M.et al.，J Neuroimmunol 122，1-8(2002)；Deloire，M.S.et al.，Mult Scler 10，540-8(2004)；Imrich，H.& Harzer，K.，J NeuralTransm 108，379-95(2001)；Raivich，G.& Banati，R.，Brain Res Brain Res Rev46，261-81(2004))。在MS患者中用Rituxan(抗CD20mAb)耗竭B细胞导致显著的临床改善(参见，Stuve，O.et al.，Arch Neurol 62，1620-3(2005))。在EAE中耗竭PMN抑制疾病的效应期。MS患者中的PMN表达高水平的几种细胞表面抗原，其与疾病恶化相关(见例如McColl，S.R.etal.，JImmunol 161，6421-6(1998)；Ziaber，J.et al.，Mediators Inflamm 7，335-8(1998))。小鼠研究表明CNS PMN是T细胞应答髓磷脂和辅助抗原的强抑制剂，最近在MS男性患者中报道了一例自身免疫性中性粒细胞减少(Kozuka，T. et al.，Intern Med 42，102-4(2003)；and Zehntner，S.P.et al.，JImmunol 174，5124-31(2005))。

高度活化的小胶质细胞、血管周MNP和浸润性MNP在MS中起若干作用。除了它们通过释放有毒物质的炎性破坏作用外，它们呈递抗原给浸润T细胞以促进髓磷脂特异性T细胞应答及T细胞和巨噬细胞经趋化因子的进一步募集(见例如Deng，X.& Sriram，S.，Curr Neurol Neurosci Rep 5，239-44(2005)；Behi，M.E.et al.，Immunol Lett 96，11-26(2005)；Raivich，G.&Banati，R.，Brain Res Brain Res Rev 46，261-81(2004)；Nelson，P.T.，Soma，L.A.&Lavi，E.，Ann Med 34，491-500(2002)；Zhang，S.C.，Goetz，B.D.，Carre，J.L.&Duncan，I.D.，Glia 34，101-9(2001)；Izikson，L.，Klein，R.S.，Luster，A.D.&Weiner，H.L.，Clin Immunol 103，125-31(2002))。巨噬细胞还参与MS中的变性病理学。细胞浸润与MS损害中轴突丧失相关(见例如Hendriks，J.J.，Teunissen，C.E.，de Vries，H.E.& Dijkstra，C.D.，Brain Res Brain Res Rev 48，185-95(2005))。吞噬性MNP和小胶质细胞破坏轴突髓鞘，导致患者功能障碍(见例如Cartier，L.，Hartley，O.，Dubois-Dauphin，M.& Krause，K.H.，BrainRes Brain Res Rev 48，16-42(2005)；Raivich，G.& Banati，R.，Brain Res BrainRes Rev 46，261-81(2004)；and Smith，M.E.，van der Maesen，K.& Somera，F.P.，J Neurosci Res 54，68-78(1998))。小胶质细胞可以诱导神经元细胞死亡及抑制神经突生长以及吞噬神经元凋亡小体(见例如Munch，G. et al.，ExpBrain Res 150，1-8(2003)；and Stolzing，A.&Grune，T.，Faseb J 18，743-5(2004))。

单核细胞衍生DC、B细胞、MaC和活化的星形胶质细胞也参与MS病理学(见例如Zhang，Y.et al.，J Clin Immunol 25，254-64(2005)；Behi，M.E.et al.，Immunol Lett 96，11-26(2005)；Chavarria，A.& Alcocer-Varela，J.，Autoimmun Rev 3，251-60(2004)；Corcione，A.et al.，Autoimmun Rev 4，549-54(2005)；and Zang，Y.C.et al.，Mult Scler 10，499-506(2004))。活化的星形胶质细胞释放几种趋化因子和其他介质以吸引白细胞至炎症位点(见例如Ambrosini，E.et al.，J Neuropathol Exp Neurol 64，706-15(2005)；Andjelkovic，A.V.，Kerkovich，D.& Pachter，J.S.，J Leukoc Biol 68，545-52(2000)；Krumbholz，M.et al.，J Exp Med 201，195-200(2005))。MaC释放蛋白酶，导致血管通透性并促进纤维蛋白在损害中沉积(见例如Theoharides，T.C.&Cochrane，D.E.，J Neuroimmunol 146，1-1 2(2004)；Pedotti，R.，De Voss，J.J.，Steinman，L.& Galli，S.J.，Trends Immunol 24，479-84(2003))。DC呈递抗原促进T细胞活化及疾病进展(见例如Greter，M.et al.，Nat Med 11，328-34(2005))。异位淋巴组织在MS患者的脑膜炎症位点可见。这种患者的脑膜含有B细胞、T细胞、血浆细胞和DC细胞，其代表了维持体液自身免疫的步骤及疾病恶化(见例如Serafini，B.，Rosicarelli，B.，Magliozzi，R.，Stigliano，E.&Aloisi，F.，Brain Pathol 14，164-74(2004))。

除了MNP、T细胞、Ig和免疫复合物外，B细胞也在MS损害中发生。超过70％的活性损害含有补体和抗体(见例如Cross，A.H.&Stark，J.L.ImmunolRes 32，85-98(2005))。克隆扩增的分泌抗体的B细胞和中心母细胞(centroblast)在MS患者的CSF中发现(见例如Zhang，Y.et al.，J ClinImmunol 25，254-64(2005)；Ziemssen，T.&Ziemssen，F.，Autoimmun Rev 4，460-7(2005)；Corcione，A.et al.，Autoimmun Rev 4，549-54(2005)；和Corcione，A.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 101，11064-9(2004))。超过90％的MS患者具有鞘内寡克隆Ig和在CSF中的增加量的抗体，其与MS恶化事件相关(见例如Cross，A.H.&Stark，J.L.，Immunol Res 32，85-98(2005))。B细胞据认为是衍生自CNS生发中心；脑为异位淋巴样结构的长期存活、增殖和形成提供了有利的微环境。B细胞产生针对髓磷脂蛋白的抗体(增加髓磷脂调理作用)，呈递抗原和共刺激分子给T细胞及增加白细胞募集。一项研究发现部分循环B细胞不是永久失活的，而是持续活化并变成自身免疫攻击的原因(见例如Gauld，S.B.，Benschop，R.J.，Merrell，K.T.&Cambier，J.C.，NatImmunol 6，1160-7(2005))。MS中的B细胞可以随着它们在CNS内分化而活化。

3)MS中的趋化因子

配体和受体的趋化因子通信系统(Chemokine-messaging system)在EAE和MS病理学中起重要作用。该系统使这些自身免疫疾病中的一系列白细胞亚型的运输、CNS浸润及异常炎性功能谐调起来。在多发性硬化损害中已鉴别了许多趋化因子及其受体，包括CCL-1-8，CXCL8-13，CCR1-3，5和CXCR1-3，4(参见例如Banisor，I.，Leist，T.P.&Kalman，B.，JNeuroinflammation 2，7(2005)；Cartier，L.，Hartley，O.，Dubois-Dauphin，M.&Krause，K.H.，Brain Res Brain Res Rev 48，16-42(2005)；Galimberti，D.，Bresolin，N.&Scarpini，E.，Expert Rev Neurother 4，439-53(2004)；Putheti，P.et al.，Eur J Neurol 10，529-35(2003)；和Raivich，G.& Banati，R.，Brain ResBrain Res Rev 46，261-81(2004))。例如，CCR1，2，5和6及CXCR3在CD3+T细胞上发生，CCR1，2，3和5及CXCR3在MS损害中的泡沫状巨噬细胞和活化的小胶质细胞上发生(见例如Banisor，I.，Leist，T.P.& Kalman，B.，JNeuroinflammation 2，7(2005)；Cartier，L.，Hartley，O.，Dubois-Dauphin，M.&Krause，K.H.，Brain Res Brain Res Rev 48，16-42(2005)；Galimberti，D.，Bresolin，N.&Scarpini，E.，Expert Rev Neurother 4，439-53(2004)；Putheti，P.et al.，Eur J Neurol 10，529-35(2003)；Raivich，G.&Banati，R.，Brain ResBrain Res Rev 46，261-81(2004)；Malamud，V.et al.，J Neuroimmunol 138，115-22(2003)；Pedotti，R.，De Voss，J.J.，Steinman，L.& Galli，S.J.，TrendsImmunol 24，479-84(2003)；Serafini，B.，Rosicarelli，B.，Magliozzi，R.，Stigliano，E.& Aloisi，F.，Brain Pathol 14，164-74(2004)；Corcione，A.et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 101，11064-9(2004)；Gauld，S.B.，Benschop，R.J.，Merrell，K.T.&Cambier，J.C.，Nat Immunol 6，1160-7(2005)；Bartosik-Psujek，H.&Stelmasiak，Z.，Eur J Neurol 1 2，49-54(2005))。

星形胶质细胞衍生CCL2和CXCL10在EAE研究中证实。这些趋化因子引发进一步的神经免疫应答并有助于从外周募集白细胞(见例如Galimberti，D.，Bresolin，N.&Scarpini，E.，Expert Rev Neurother 4，439-53(2004)；Huang，D.et al.，Immunol Rev 177，52-67(2000)；Jee，Y.，Yoon，W.K.，Okura，Y.，Tanuma，N.&Matsumoto，Y.，J Neuroimmunol 128，49-57(2002))。CCL2/CCR2和CXCL9/10/11/CXCR3是治疗性介入的靶，因为它们分布在若干特异性病理白细胞类型上并且在MS和EAE研究中经常检测到。趋化因子轴CCL2/CCR2在MNP和T细胞跨内皮迁移进CNS中起作用并参与血脑屏障(BBB)损害和崩溃(见例如Chavarria，A.&Alcocer-Varela，J Autoimmun Rev3，251-60(2004)；Mahad，D.et al.，Brain(2005)；Dzenko，K.A.，Andjelkovic，A.V.，Kuziel，W.A.&Pachter，J.S.，.J Neurosci 21，9214-23(2001)；Dzenko，K.A.，Song，L.，Ge，S.，Kuziel，W.A.&Pachter，J.S.，Microvasc Res(2005)；Stamatovic，S.M.et al.，J Cereb Blood Flow Metab 25，593-606(2005)；Minagar，A.&Alexander，J.S.，Mult Scler 9，540-9(2003))。CCL2通过经CCR2改变内皮细胞间的紧密连接而增加BBB通透性(Stamatovic，S.M.et al.，JCereb Blood Flow Metab 25，593-606(2005))。进入的MNP通过分泌CCL2也改变通透性，然后迁移进CNS。MNP-和T-细胞衍生MMP也与BBB的损坏和崩溃相关并帮助细胞游走(见例如Abraham，M.，Shapiro，S.，Karni，A.，Weiner，H.L.&Miller，A.，J Neuroimmunol 163，157-64(2005)；Avolio，C.et al.，JNeuroimmunol 1 36，46-53(2003)；Karabudak，R.et al.，J Neurol 251，279-83(2004)；Uccelli，A.，Pedemonte，E.，Narciso，E.&Mancardi，G.，Neurol Sci 24Suppl 5，S271-4(2003)；Brundula，V.，Rewcastle，N.B.，Metz，L.M.，Bernard，C.C.&Yong，V.W.，Brain 125，1297-308(2002)；Sellebjerg，F.&Sorensen，T.L.，Brain Res Bull 6 1，347-55(2003)；Vos，C.M.，van Haastert，E.S.，de Groot，C.J.，van der Valk，P.& de Vries，H.E.，J Neuroimmunol 138，106-14(2003))。CXCR3⁺标记T细胞运输至BBB，但是是CCR2在这些细胞上的表达使得血细胞渗出(见Mahad，D.et al.，Brain(2005)；Callahan，M.K.et al.，JNeuroimmunol 153，150-7(2004)，其描述了在跨越BBB后T细胞和单核细胞上CCR2的下调)。CCL2/CCR2趋化因子对参与BBB通透性并且观察到在CNS薄壁组织和损害内几种白细胞类型上CCL2/CCR2轴的显著增加(Mahad，D.J.&Ransohoff，R.M.，Semin Immunol 15，23-32(2003)。此外，CCL2/CCR2轴在MS脑损害，患者的血液和CSF中注意到(见Banisor，I.，Leist，T.P.& Kalman，B.，.J Neuroinflammation 2，7(2005)；Cartier，L.，Hartley，O.，Dubois-Dauphin，M.& Krause，K.H.，Brain Res Brain Res Rev 48，16-42(2005)；Putheti，P.et al.，Eur J Neurol 10，529-35(2003)；和Mahad，D.J.&Ransohoff，R.M.，Semin Immunol 15，23-32(2003)))。受体表达随时间变化，因为chemoprints是时空性的并且根据占优势的微环境而改变(Karpus，W.J.&Ransohoff，R.M.J Immunol 161，2667-71(1998))。随着单核细胞跨过BBB，它们在成熟分化为巨噬细胞时下调然后重新表达CCR2。这在用尸检MS生物活检研究中证实，其显示在对照CNS组织中由小胶质细胞表达的低水平CCR2、CCR3和CCR5。在慢性活性MS损害中，CCR2，CCR3和CCR5在泡沫状巨噬细胞和活化的小胶质细胞上发生。CCR2和CCR5也存在于大量的浸润淋巴细胞上，CCR3阳性淋巴细胞数量较少(见例如Simpson，J.et al.，JNeuroimmunol 108，192-200(2000))。类似地，CXCR3和CCR5在Th1细胞(促炎细胞因子产生细胞)上优势表达并且在MS复发过程中在外周血中显著上调。受体水平随着患者好转而降低(Mahad，D.J.，Lawry，J.，Howell，S.J.&Woodroofe，M.N.，Mult Scler 9，189-98(2003))。CXCL10表达在来自MS患者的CSF中上调并且与CNS组织切片中的脱髓鞘空间相关，与其受体CXCR3的表达紧密相关(见例如Sorensen，T.L.et al.，J Neuroimmunol 127，59-68(2002))。CCL2/CCR2参与自身免疫性脱髓鞘的进一步证据来自EAE研究。发现CCL2在CNS中高表达，抗CCL2治疗阻断小鼠中基本复发。用CCR2^-/-小鼠的研究表明CCL2/CCR2对于EAE发生是重要的(Fife，B.T.，Huffnagle，G.B.，Kuziel，W.A.&Karpus，W.J.，J Exp Med 192，899-905(2000)；Izikson，L.，Klein，R.S.，Charo，I.F.，Weiner，H.L.&Luster，A.D.，J Exp Med 192，1075-80(2000))。CCL2 DNA疫苗保护动物免于发生EAE，并且CCL2和CCR2的上调与疾病复发期紧密相关(Jee，Y.，Yoon，W.K.，Okura，Y.，Tanuma，N.&Matsumoto，Y.，J Neuroimmunol 128，49-57(2002)；Youssef，S.et al.，JImmunol 161，3870-9(1998))。CCL2被示出当在小鼠中长期表达时导致脑病，显示趋化因子可诱导损害形成(Huang，D.et al.，Faseb J 19，761-72(2005))。

CXCL9/10/11趋化因子及其关联CXCR3受体也在EAE和MS中起作用(见例如Liu，L.，Callahan，M.K.，Huang，D.&Ransohoff，R.M.，Curr Top DevBiol 68，149-81(2005)；Cartier，L.，Hartley，O.，Dubois-Dauphin，M.&Krause，K.H.，Brain Res Brain Res Rev 48，1 6-42(2005)；Sorensen，T.L.et al.，JNeuroimmunol 127，59-68(2002)；Mahad，D.J.，Lawry，J.，Howell，S.J.&Woodroofe，M.N.，Mult Scler 9，189-98(2003)；and Lazzeri，E.& Romagnani，P.，Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord 5，109-118(2005)。在MS中，炎症平衡有利于Th1细胞(促炎细胞因子产生细胞)，其与CXC3和CCR5表达相关，与Th2细胞环境(抗炎细胞因子产生细胞)相反，并且特征性表达CCR3，4和8(见例如Mouzaki，A.，Tselios，T.，Papathanassopoulos，P.，Matsoukas，I.&Chatzantoni，K.，Curr Neurovasc Res 1，325-40(2004)；Teleshova，N.et al.，J Neurol 249，723-9(2002)；以及Misu，T.et al.，JNeuroimmunol 114，207-12(2001))。表达CXCR3和CCR5的T细胞在MS CSF中与血液相比被显著富集。CCR5⁺/CCR3^-细胞在CSF中不存在，表明CCR5单独不负责T细胞运输至CSF(见例如Kivisakk，P.et al.，Clin Exp Immunol129，510-8(2002)；and Sorensen，T.L.et al.，.J Clin Invest 103，807-15(1999))。在炎症模型中，抗CXCR3治疗减轻了Th1细胞向发炎组织的迁移，证实CXCR3是运输所需受体(见例如Xie，J.H.et al.，J Leukoc Biol 73，771-80(2003)；and Sindem，E.，Patzold，T.，Ossege，L.M.，Gisevius，A.&Malin，J.P.，JNeuroimmunol 131，186-90(2002))。在活性MS损害中，CXCL9和CXCL10由巨噬细胞和由围绕损害的星形胶质细胞表达。CXCR3在损害内的T细胞和星形胶质细胞上表达。Th1细胞衍生IFN-γ刺激细胞表达化学引诱物以持续T细胞募集到CNS(Simpson，J.et al.，J Neuroimmunol 108，192-200(2000))。CXCR3及关联配体在几个EAE模型中进行了研究。这一轴在特异性EAE模型和啮齿类物种中起作用。在一个研究中，CXCL10-null小鼠显示如对照组的表达、严重性和组织病理学。该研究总结出CXCL10不是运输所需的，但是确实确定了与对照相比外周中疾病易感性阈值降低(Klein，R.S.etal.，J Immunol 172，5 50-9(2004)；Oppenheim，J.J.et al.，J Leukoc Biol 77，854-61(2005))。CXCR3还在至少一部分上述白细胞群中表达(Sorensen，T.L.et al.，J Clin Invest 103，807-15(1999)；Oppenheim，J.J.et al.，J Leukoc Biol 77，854-61(2005)；Kuipers，H.F.et al.Glia(2005)；Foley，J.F.et al.，J Immunol 174，4892-900(2005))。例如，患者在活性MS中与对照相比在CSF和血液中B细胞上具有更高的CXCR3和CCR5表达(Sorensen，T.L.，Roed，H.& Sellebjerg，F.，J Neuroimmunol 122，125-31(2002))。小鼠和人类星形胶质细胞和小胶质细胞表达受体并在体外应答关联配体而经历趋化现象(见例如Biber，K.et al.，Neuroscience 112，487-97(2002))。因此，这些受体可以被合适选择的本文提供的缀合物靶向，所述选择是选择靶向一或多种这些受体(参见本文的表、实施例和描述)。

4)MS中的治疗剂

甲基强的松龙、干扰素和Copaxone减慢复发缓解型疾病的进展。包括novantrone、硫唑嘌呤、氨甲喋呤好和环磷酰胺在内的免疫抑制药物被用于原发和继发进行性MS(表5)。没有药物(除了不走运的Campath之外)确定地修饰疾病进程(见例如Galimberti，D.，Bresolin，N.&Scarpini，E.，Expert Rev Neurother 4，439-53(2004)；和Leary，S.M.&Thompson，A.J.，CNSDrugs 19，369-76(2005))。白细胞耗竭研究和良好的病理学及由Campath白细胞耗竭诱导的缓解(尽管毒性)与趋化因子介导的白细胞减量预示很好(见例如Coles，A.J.et al.，Ann Neurol 46，296-304(1999)；Moreau，T.et al.，Lancet 344，298-301(1994))。趋化因子通信系统可以作为针对MS的坚实的治疗靶。因为在MS中活跃的许多白细胞亚型表达CCR2和/或CXCR3，靶向这些受体的缀合物如LPM7或LPM1d和本文举例的其它缀合物可用于治疗MS。可以使用靶向CCL1-8，CXCL8-13，CCR1-3，5，6和CXCR1-3，4任一或其二种或多种组合的其它缀合物。

e.关节炎及自身免疫疾病

本领域技术人员已知用于测试和证实本文缀合物治疗自身免疫疾病如上述关节炎、狼疮和MS的活性的模型。提供和使用关节炎和自身免疫疾病动物模型的举例性参考文献包括但不限于下述参考文献，所述模型可以用于测试配体-毒素缀合物，如含有修饰的SA1部分的LPM缀合物。

Barnes et al.(1998)，Polyclonal antibody directed against human RANTESameliorates disease in the Lewis rat adjuvant-induced arthritis model，J ClinInvest 101：2910-9，描述了佐剂诱导关节炎(AIA)是类风湿性关节炎众多动物模型之一，该疾病特征在于T淋巴细胞和巨噬细胞细胞浸润。Barnes etal.鉴定了这一疾病模型有关趋化因子表达的发展，并表明增加水平的两种趋化因子RANTES(一种T淋巴细胞和单核细胞化学引诱物)和KC(人GRO-α的小鼠同系物)(嗜中性粒细胞的化学引诱物)在全血和关节中被发现。另一种T淋巴细胞和单核细胞化学引诱物MIP-1α的水平在疾病整个过程中在全血中未改变，在关节中仅轻微升高。RANTES表达在疾病中有重要作用，因为针对RANTES的多克隆抗体大大改善了诱导出AIA的动物中的症状并且发现其与用非甾体抗炎药吲哚美辛的治疗一样有效。针对MIP-1α或KC的多克隆抗体是无效的。

Weinberg，A.D.(1998)，Antibodies to OX-40(CD134)can identify andeliminate autoreactive T cells：implications for human autoimmune disease，MolMed Today 4：76-83，描述了自身抗原特异性CD4+T细胞已作为病因细胞类型牵涉进：多发性硬化、类风湿性关节炎、自身免疫葡萄膜炎、糖尿病、炎症性肠病和移植物抗宿主疾病。Weinberg还描述了使用实验性诱导的自身免疫疾病开发有效的疗法，所述疗法缺失自身免疫组织破坏位点的自体反应性T细胞。

Schrier et al.(1998)，Role of chemokines and cytokines in a reactivationmodel of arthritis in rats induced by injection with streptococcal cell walls，JLeukoc Biol 63：359-63，提供了对趋化因子在关节炎动物模型中作用的研究。关节内注射链球菌细胞壁(SCW)抗原随后静脉内攻击在雌性Lewis大鼠中产生T细胞介导的单关节关节炎。最初研究表明这一对静脉内SCW抗原的再活化应答依赖于白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的存在以及早期肿胀是嗜嗜中性粒细胞依赖性的。嗜中性粒细胞耗竭或用抗P-选择蛋白或MIP-2抗体被动免疫降低了踝部浮肿和嗜嗜中性粒细胞流入。但是在最初几天后，关节炎应答主要由单个核细胞介导。关节组织显示MCP-1mRNA的上调，其可以部分由抗IL-4抑制；用针对IL-4或MCP-1的抗体治疗大鼠显著抑制踝部浮肿的发展及炎症的组织病理学迹象。针对干扰素-γ或IL-10的抗体无作用。用抗MCP-1治疗还抑制标记的T细胞流入踝关节。这些数据表明SCW诱导的雌性Lewis大鼠中的关节炎的晚期单个核细胞依赖期需要上调MCP-1的细胞因子，其随后可以促进单个核细胞募集和溢出到关节中。

Oppenheimer-Marks et al.(1998)，Interleukin 15 is produced byendothelial cells and increases the transendothelial migration of T cells in vitroand in the SCID mouse-human rheumatoid arthritis model in vivo，J Clin Invest101：1261-72，检查了内皮细胞(EC)产生IL-15的能力及IL-15影响T细胞跨内皮迁移的能力。人类脐静脉内皮细胞表达IL-15 mRNA及蛋白质。内皮衍生IL-15增强了T细胞的跨内皮迁移，这由针对IL-15的阻断性单克隆抗体抑制这一过程证明。IL-15通过激活整联蛋白粘附分子LFA-1(CD11a/CD18)的结合能力而增强T细胞跨内皮迁移并也增加T细胞运动性。此外，IL-15诱导早期活化分子CD69的表达。IL-15在调节体内T细胞迁移中的重要性通过其增强移植到免疫缺陷SCID小鼠中的类风湿性关节炎滑膜组织中的过继转移人类T细胞的积累的能力而记录。这些结果证实EC产生IL-15，其在刺激T细胞外渗到炎症组织中起作用。

Kasama et al.(1995)，Interleukin-10 expression and chemokine regulationduring the evolution of murine type II collagen-induced arthritis J Clin Invest95：2868-76，研究了特异性趋化因子MIP-1α和MIP-2和白介素10(IL-10)在II型胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)演化过程中的表达和贡献。可检测水平的MIP-1α和MIP-2的趋化细胞因子蛋白在初次II型胶原蛋白攻击后第32天和36天之间首次观察到，而IL-10增加在第36和44天之间发现。用针对MIP-1α或MIP-2的抗体被动免疫的CIA小鼠证实关节炎发作延迟及关节炎严重性降低。接受中和抗IL-10抗体的CIA小鼠证实发作加速及关节炎严重性增加。抗IL-10治疗增加了MIP-1α和MIP-2的表达以及增加了髓过氧化物酶(MPO)活性及发炎关节中的白细胞浸润。这些数据表明MIP-1α和MIP-2在起始和维持中起作用，而IL-10似乎在实验性关节炎发展过程中起调节作用。

Keffer et al.(1991)，Transgenic mice expressing human tumor necrosisfactor：a predictive genetic model of arthritis，Embo J 10：4025-31，提供了转基因小鼠品系，其携带及表达野生型和3’修饰的人肿瘤坏死因子(hTNF-α，恶液质素)转基因，显示正确的内毒素应答性和巨噬细胞特异性hTNF基因表达可以在转基因小鼠中建立并且提供了hTNF基因的3’区域可参与巨噬细胞特异性转录的证据。携带3’修饰的hTNF转基因的转基因小鼠显示去调节的表达模式并产生慢性炎性多关节炎。Keffer et al.显示预计发生关节炎的转基因小鼠代表一种遗传模型，通过这一模型可以进一步研究人类中这一疾病的发病机制和治疗。

Sakai et al.(1998)，Potential withdrawal of rheumatoid synovium by theinduction of apoptosis using a novel in vivo model of rheumatoid arthritis，Arthritis Rheum 41：1251-7，研究了Fas介导的凋亡是否具有作为类风湿性关节炎(RA)治疗策略的潜力，其使用RA模型，其中人类RA组织被移植到SCID小鼠中。新鲜的类风湿滑膜组织包括关节软骨被皮下移植到SCID小鼠背中。移植后6周，抗Fas单克隆抗体被腹膜内注射。在移植的滑膜中抗Fas单克隆抗体导致的时间相关的凋亡变化通过缺口末端标记组织化学评估。注射后36小时，在移植的滑膜中观察到弥漫的凋亡变化。注射后4周，类风湿滑膜组织消失。

Smith et al.(1999)，Diacerhein treatment reduces the severity ofosteoarthritis in the canine cruciate-deficiency model of osteoarthritis，ArthritisRheum 42：545-54，描述了骨关节炎(OA)犬模型。OA在20只成年杂种狗中通过横切左膝的前交叉韧带而诱导。该模型用于测试对OA的治疗。

f.炎性肺病

用于测试和证实本文的缀合物治疗炎性肺病的活性的模型是本领域技术人员已知的。提供和使用炎性肺病动物模型的举例性参考文献包括但不限于下述参考文献，所述模型可以用于测试配体-毒素缀合物，如含有修饰的SA1部分的LPM缀合物。

Kumagai et al.(1999)，Inhibition of Matrix Metalloproteinases PreventsAllergen-Induced Airway Inflammation in a Murine Model of Asthma，JImmunol 162：4212-4219，研究了MMP在支气管哮喘发病机制中的作用，其使用过敏性哮喘的小鼠模型。使用这一模型，报道了在用OVA敏化的小鼠中在Ag吸入后在支气管肺泡灌洗液中MMP-2和MMP-9释放增加，其伴随淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润。给气道施用金属蛋白酶-2组织抑制剂抑制了Ag诱导的淋巴细胞和嗜酸性粒细胞对气道壁和内腔的浸润，降低了Ag诱导的气道超应答性，增加了外周血中嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数。对气道内腔的细胞浸润的抑制还用金属蛋白酶-1的组织抑制剂和一种合成的基质金属蛋白酶抑制剂观察到。数据表明MMP特别是MMP-2和MMP-9对于炎症细胞浸润及气道超应答性诱导(它们是支气管哮喘的病理生理特征)是关键的。

Griffiths-Johnson et al.(1997)，Animal models of asthma：role ofchemokines，Methods Enzymol 288：241-66，描述了许多趋化因子，它们通过使用(1)体外细胞培养上清和来自炎症动物模型的体内渗出物的生物分析及(2)分子生物学技术被发现。有来自动物及临床研究的引人注目的证据表明嗜酸性粒细胞是哮喘中的重要效应细胞。Griffiths-Johnson et al.鉴别了预防嗜酸性粒细胞募集到肺的两种靶：在嗜酸性粒细胞生物学的若干方面是重要的IL-5及其受体；和eotaxin及其受体CCR3。eotaxin受体在嗜酸性粒细胞上大量表达，但是在其他白细胞上不是，似乎是嗜酸性粒细胞对eotaxin和其它趋化因子如MCP-4的主要检测物。Eotaxin和CCR3敲除小鼠使得可以评估参与哮喘的介质以及测试特异性治疗形式。

Campbell et al.(1998)，Temporal role of chemokines in a murine model ofcockroach allergen-induced airway hyperreactivity and eosinophilia，J Immunol161：7047-53，提供了蟑螂过敏原诱导的气道疾病的鼠模型并评估了应答的特异机制，其类似于特应性人类哮喘。这一模型的过敏性应答包括过敏原特异性气道嗜酸性粒细胞增多和显著改变的气道生理学，其直接与炎症相关。鉴别了在这些阶段CC趋化因子的特异作用，MIP-1α是引发阶段中重要的嗜酸性粒细胞引诱物，eotaxin则是继发再攻击阶段的。这些模型使得可以评估蟑螂过敏原攻击二个阶段中涉及的介质以及测试特异治疗形式。

Piguet et al.(1989)，Tumor necrosis factor/cachectin plays a role inbleomycin-induced pneumopathy and fibrosis，JExp Med 170：655-63和Schrieret al.(1983)，The effects of the nude(nu/nu)mutation on bleomycin-inducedpulmonary fibrosis.A biochemical evaluation，Am Rev Respir Dis 127：614-617，描述了肺纤维化的小鼠模型。

Steinhauser et al.(1999)，IL-10 is a major mediator of sepsis-inducedimpairment in lung antibacterial host defense，J Immunol 162：392-399，描述了败血病诱导的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)肺炎的小鼠模型以探索与败血病相关的免疫抑制机制。CD-1小鼠用26号针穿刺(CLP)进行盲肠结扎或进行假手术，随后气管内(i.t.)施用铜绿假单胞菌或盐水。进行CLP随后24小时后i.t.施用盐水或铜绿假单胞菌的小鼠中的存活率分别是58％和10％，而进行假手术随后施用铜绿假单胞菌的动物95％存活。CLP/铜绿假单胞菌组中增加的死亡率可归因于显著受损的肺细菌清除及早期发生铜绿假单胞菌菌血症。将细菌i.t.施用CLP而非假手术的小鼠导致肺内积累嗜中性粒细胞。另外，在败血病小鼠中进行铜绿假单胞菌攻击导致朝向增加肺IL-10产生的相对移动，伴有IL-12降低趋势。在败血病小鼠即将铜绿假单胞菌攻击之前i.p.而非i.t.施用IL-10 Ab显著改善了存活率和细菌从被施用铜绿假单胞菌的败血病动物肺的清除。最后，分离自进行CLP的动物的尘细胞显示出摄取和杀死离体铜绿假单胞菌的能力显著受损，这一缺陷通过体内IL-10的中和而部分逆转。总之，这些观察表明败血病应答实质上削弱了肺对铜绿假单胞菌的先天免疫，这一作用由内源产生的IL-10介导。

g.基因治疗后的炎症

用于证实或鉴别本文的缀合物治疗炎症包括基因治疗后炎症的模型是已知的。例如，Muruve et al.(1999)，Adenoviral gene therapy leads to rapidinduction of multiple chemokines and acute neutrophil-dependent hepatic injuryin vivo，Hum Gene Ther 10：965-76，研究了复制缺陷型腺病毒诱导急性损伤和感染组织炎症的分子机制，其限制了其在人类基因治疗中的用途。为了鉴定这一应答，在静脉内施用各种腺病毒载体后在DBA/2小鼠中评估了趋化因子表达。静脉内施用adCMVbeta gal，adCMV-GFP或FG140在小鼠肝脏中快速诱导了剂量依赖方式的一致的C-X-C和C-C趋化因子表达模式。用10(10)PFU的adCMVbeta gal感染1小时后，MIP-2 mRNA的肝水平增加超过基线＞60倍。MCP-1和IP-10 mRNA水平也在用各种腺病毒载体感染后立即增加，在6小时到达峰值，分别为＞25倍和＞100倍表达。还发生了腺病毒载体对RANTES和MIP-1β mRNA的早期诱导，但是程度较低。趋化因子诱导的发生不依赖于病毒基因表达，因为补骨脂素失活的腺病毒颗粒在施用后前16小时产生相同的趋化因子基因转录模式。趋化因子表达如预期一样与嗜中性粒细胞和CD11b+细胞流入感染动物的肝中相关。在高效价，所有腺病毒载体在全身施用DBA/2小鼠后均导致显著肝坏死和凋亡。为了研究嗜中性粒细胞在这一腺病毒诱导的肝损伤中的作用，动物用中和抗MIP-2抗体预治疗或耗竭嗜中性粒细胞。MIP-2拮抗作用和嗜中性粒细胞耗竭每个及二者均产生降低的血清ALT/AST水平和腺病毒诱导的肝损伤的组织学减弱，证实这一早期损伤很大程度上是由于趋化因子产生及嗜中性粒细胞募集。这些结果澄清了对复制缺陷腺病毒载体的早期免疫应答并指出了通过干预趋化因子或嗜中性粒细胞功能预防腺病毒介导的炎症和组织损伤的策略。

h.血管发生

本文提供的缀合物可以靶向在血管发生及其中涉及的过程中上调的细胞。提供和使用血管发生动物模型的举例性参考文献包括但不限于下述参考文献，所述模型可以用于证实或鉴别配体-毒素缀合物，如含有修饰的SA1部分的LPM缀合物。

Folkman et al.(1987)，Angiogenic factors，Science 235：442-7，建立了血管发生及因子的作用及其在了解血管系统的生长调节中的重要性，所述因子例如酸性和碱性成纤维细胞生长因子、血管生成素和转化生长因子α和β。当根据靶评估时，所述因子可分为2组：直接作用于血管内皮细胞以刺激运动或有丝分裂的那些，及通过动员宿主细胞(例如巨噬细胞)以释放内皮生长因子而间接作用的那些。除了它们在经历新血管化的肿瘤中存在之外，相同的血管发生肽在许多正常组织中也发现，这些组织未发生新血管化。这表明血管发生因子的生理学表达是紧密调节的。除了由肿瘤诱导的持续血管发生之外，现在看起来以前认为不相关的各种非肿瘤性疾病可以被认为是“血管发生疾病”，因为它们以毛细血管的病理性生长占优势。

Leibovich et al.(1987)，Macrophage-induced angiogenesis is mediated bytumor necrosis factor-alpha，Nature 329：630-632，描述了巨噬细胞在创伤修复、炎症和肿瘤生长期间新血管生长诱导中是重要的并通过研究大鼠角膜和发育的鸡绒膜尿囊膜中毛细血管形成而研究了这一点。

Koch et al.(1992)，Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator ofangiogenesis，Science 258：1798-1801，描述了由单核细胞/巨噬细胞产生的血管发生因子参与特征在于持续血管发生的慢性炎症失调的发病机制。对淋巴细胞和嗜中性粒细胞是趋化性的白介素-8(IL-8)的作用被显示是当被植入大鼠角膜中时是强血管发生性的并诱导人类脐静脉内皮细胞增殖及趋化性。数据表明巨噬细胞衍生的IL-8在血管发生依赖性失调如类风湿性关节炎、肿瘤生长和创伤修复中的作用。

i.肿瘤生长

本文提供的缀合物(如生长因子-毒素缀合物，ErbB受体缀合物及其它)可以用于治疗肿瘤，如通过靶向肿瘤受体和/或参与肿瘤发生包括血管发生的细胞。参与血管发生和炎症的细胞的募集与肿瘤生长及发育相关。下述参考文献描述了这些关系以及用于鉴别针对肿瘤、血管发生和炎症应答抑制剂的治疗的动物模型是本领域技术人员已知的。这些参考文献证实用于研究抑制肿瘤生长及其相关细胞的治疗剂的动物模型的可利用性。本文提供的配体-毒素缀合物包括含有修饰的SA1部分的LPM缀合物可用于这种模型以评价对肿瘤生长的作用。

Phillips et al.(1994)，Transforming growth factor-alpha-Pseudomonasexotoxin fusion protein(TGF-alpha-PE3 8)treatment of subcutaneous andintracranial human glioma and medulloblastoma xenografts in athymic mice，CancerRes 54：1008-15，研究了表皮生长因子受体(EGFR)的差异表达，其在许多恶性神经胶质瘤和其它原发脑肿瘤中扩增或过表达，但是在正常脑中低或不可检测，用于靶向脑肿瘤治疗，该治疗使用TGF-α-假单胞菌外毒素重组毒素TGF-α-PE3 8使用携带成胶质细胞瘤或髓母细胞瘤皮下异种移植物的裸鼠进行。所述异种移植物模型可以用于研究趋化因子受体-靶向缀合物治疗炎症应答及靶向肿瘤发育中涉及的细胞。

Debinski et al.(1994)，Interleukin-4 receptors expressed on tumor cells canserve as a target for anticancer therapy using chimeric Pseudomonas exotoxin，Int J Cancer 58：744-748，报道了嵌合蛋白在人类实体肿瘤异种移植物模型中的用途，所述嵌合蛋白由人IL4(hIL4)和2种不同突变形式的强细菌毒素假单胞菌外毒素A(PE)组成。所述2种嵌合毒素命名为hIL4-PE4E和hIL4-PE38QQR，显示出特异的hIL4R依赖性和剂量依赖性抗肿瘤活性。

Husain et al.(1998)，Complete regression of established humanglioblastoma tumor xenograft by interleukin-4 toxin therapy，Cancer Res58：3649-53，显示了IL-4毒素缀合物在裸鼠中用于靶向治疗成胶质细胞瘤侧肿瘤(flank tumor)的用途。Kreitman et al.(1998)，Accumulation of arecombinant immunotoxin in a tumor in vivo：fewer than 1000 molecules percell are sufficient for complete responses，Cancer Res 58：968-975，也证实了这一模型的用途。

McDonald et al.(2001)，The therapeutic potential of chemokine-toxinfusion proteins，IDrugs 4：427-442，报道了SDF-1β-SA1(野生型SA1)在两个独立的小鼠异种移植物模型中阻止HT-29结肠癌肿瘤生长。SDF-1β-SA1还根除了新形成的肿瘤内血管，这由相对于对照肿瘤在治疗的肿瘤中缺少横截面血管证实。

LPM缀合物在肿瘤生长模型中的举例结果如实施例9所示，其示出测试LPM1d在肿瘤生长的异种移植物模型中的实验结果。其它LPM如本文提供的含有与修饰的SA1缀合的趋化因子的任一种也可以在类似的分析中测试。这些结果证实LPM可以用作候选治疗剂治疗癌症和血管发生。

j.人免疫缺陷病毒(HIV)及其它病毒

具有毒素部分的缀合物可以靶向被病毒感染的细胞，所述病毒例如但不限于HIV，甲型、乙型和/或丙型肝炎病毒和慢性感染细胞的其它病毒。作用模式可以是经过毒素对细胞代谢的作用。此外，毒素如志贺毒素和修饰的志贺毒素及本文提供的活性片段是多核苷酸腺苷糖苷酶，其使多核苷酸包括RNA和DNA包括病毒核酸脱嘌呤。因此被靶向在病毒感染细胞上表达的受体的缀合物可以治疗病毒感染。

例如，本文提供的缀合物可以用于靶向HIV感染细胞并破坏病毒核酸和/或抑制或杀死细胞。提供和使用HIV动物模型的举例性参考文献包括但不限于下述参考文献，所述模型可以用于测试配体-毒素缀合物如含有修饰的SA1部分的LPM缀合物。Westmoreland et al.(1998)，Chemokine receptorexpression on resident and inflammatory cells in the brain of macaques withsimian immunodeficiency virus encephalitis，Am J Pathol 152：659-665，描述了脑中单核细胞/巨噬细胞浸润与神经学疾病之间存在关联，以及趋化因子和趋化因子受体可在HIV神经病理发生中起作用以及描述了它们在SIV感染的恒河猴HIV脑炎模型中的表达模式。趋化因子MIP-1α，MIP-1β，RANTES和IP-10在患有SIV脑炎的猕猴脑中升高的表达已被证实，在这一研究中相应的趋化因子受体CCR3，CCR5，CXCR3和CXCR4被示出在这些相同组织的血管周浸润中表达。此外，CCR3，CCR5和CXCR4在大海马和大脑新皮层椎体细胞亚群上及在正常和脑炎脑的神经胶质细胞上检测到。数据和结果表明多种趋化因子及其受体在SIV脑炎中有助于单核细胞和淋巴细胞募集到脑中。另外，已知的HIV/SIV共受体在神经元上的表达表明一种可能的机制，由此HIV或SIV可以直接与这些细胞相互作用，破坏它们正常生理功能并有助于AIDS痴呆复合征的发病。

Tyor et al.(1993)，A model of human immunodeficiency virus encephalitisin SCID mice，Proc Natl Acad Sci USA 90：8658-62，提供了HIV相关痴呆复合征的动物模型以帮助开发疗法。接受异种移植物而不排斥的具有重症联合免疫缺陷的小鼠(SCID小鼠)用人外周血单个核细胞和HIV脑内接种。接种后1-4周，通过免疫细胞化学染色这些小鼠的脑含有人巨噬细胞(其中一些是HIV p24抗原阳性的)，偶然的多核细胞及醒目的神经胶质增生。人巨噬细胞还经常对于肿瘤坏死因子α是阳性的，偶尔对白介素1和VLA-4是阳性的。这些脑培养物对HIV是阳性的。通常人巨噬细胞不存在于对照小鼠脑中，也未有明显神经胶质增生。从脑内仅接受HIV的小鼠中未回收HIV。病理学上，这一SCID小鼠中的HIV脑炎模型类似于人类中的HIV脑炎，数据表明通过用HIV感染激活巨噬细胞导致它们在脑中积累和持续及发生神经胶质增生。这一HIV脑炎模型提供了对这一失调的发病机制和治疗的见解。

Toggas et al.(1994)，Central nervous system damage produced byexpression of the HIV-1 coat protein gp 1 20 in transgenic mice，Nature367：188-193，提供了在脑中表达gp120的转基因小鼠并使用这些小鼠研究gp120在人中观察到的神经元和神经胶质中的作用。在转基因小鼠脑中观察到的变化类似于HIV-1感染的人脑中的异常。损害的严重性与gp120表达的脑水平正相关。这些结果提供了体内证据表明gp120在HIV-1相关神经系统损害中起作用。这促进了目的在于HIV-脑相互作用的治疗策略的评估和开发。

Wykrzykowska et al.(1998)，Early regeneration of thymi c progenitors inrhesus macaques infected with simian immunodeficiency virus，J Exp Med187：1767-1778，使用AIDS的SIV/猕猴模型检查了SIV对胸腺的早期作用。

Krucker et al.(1998)Transgenic mice with cerebral expression of humanimmunodeficiency virus type-1 coat protein gp120 show divergent changes inshort-and long-term potentiation in CA1 hippocampus，Neuroscience83：691-700，研究了从脑星形胶质细胞组成型表达神经胶质原纤维酸性蛋白驱动的gp120的转基因小鼠，其显示神经元和神经胶质变化类似于人免疫缺陷病毒1型感染的人脑中的异常。

Power et al.(1998)，Neurovirulence in feline immunodeficiencyvirus-infected neonatal cats is viral strain specific and dependent on systemicimmune suppression，J Virol 72：9109-15，提供了HIV动物模型及其在免疫抑制中的作用。猫免疫缺陷病毒(FIV)是一种慢病毒，导致猫中免疫抑制和神经学疾病。为确定不同FIV毒株导致神经学疾病的程度，FIV V1CSF和Petaluma在离体测定和体内测定中进行了比较。两种病毒均以相似水平感染和在巨噬细胞及混合神经胶质细胞培养物中复制，但是在神经毒性测定中V1CSF比Petaluma诱导显著更多的神经元死亡。V1CSF感染的动物与Petaluma感染的和未感染的动物相比显示显著的神经发育延迟。额皮质的磁共振光谱研究揭示在V1CSF组中与其他组相比显著降低的N-乙酰天冬氨酸/肌酸比率。环孢菌素A治疗Petaluma感染动物导致神经发育延迟和脑中降低的N-乙酰天冬氨酸/肌酸比率。与未感染的和Petaluma感染组相比降低的CD4(+)和CD8(+)细胞计数在V1 CSF感染组中观察到。这些发现表明神经发育延迟和神经元损伤是FIV毒株特异性的，但是系统性免疫抑制也是FIV诱导的神经毒力的重要决定因素。

针对其他病毒感染的模型是已知的并可以用于证实对其他病毒的抗病毒活性。

k.肾病

本文提供的缀合物可用于治疗肾病。肾病动物模型可以用于测试配体-毒素缀合物如含有修饰的SA1的LPM缀合物。这种动物模型包括模拟良好鉴定的不同人类慢性肾病(CKD)的那些模型。综述了几种良好鉴定的CKD模型包括抗GBM疾病及其与人类疾病相关性的举例性参考文献是Durvasula and Shankland(Methods Mol Med.，86：47-66，2003)。

例如，作为人类系膜增生性肾小球肾炎模型的大鼠中的抗Thy-1诱导的肾小球肾炎已充分描述(参见Jefferson and Johnson(1999)J.Nephrol.12：297-307；Westerhuis et al.(2000)Am.J.Pathol.，156：303-10)。简而言之，大鼠用抗胸腺细胞抗体注射，所述抗体结合肾小球系膜细胞(MGC)并导致补体依赖性肾小球膜溶解。肾小球膜溶解在第2天终止，随后是MGC增殖和在大约第5-7天细胞过多到峰值。之后MGC经历凋亡直至模型本身溶解。在增殖期间MGC表型有改变，其与过量细胞基质蛋白(ECM)沉积相关，ECM是纤维化的早期指标。在开始的几分钟内存在可溶性炎症介质包括趋化因子MCP-1的上调，其与淋巴细胞最重要的巨噬细胞流入相关。巨噬细胞据认为通过产生活性氮和氧类有助于早期肾小球膜溶解。在晚期它们据认为通过产生细胞因子和生长因子包括促纤维化TGF-β而有助于MGC增殖和ECM产生。巨噬细胞数在大约2-4达到峰值之后逐渐降低。已经示出这一模型中MCP-1中和改善了巨噬细胞浸润、TGF-β产生及ECM蛋白合成。在另一研究中，用氯膦酸脂质体耗竭巨噬细胞导致小球膜基质扩张显著降低。

LPM缀合物在肾病模型中的举例性结果如实施例6所示，其示出在抗Thy-1诱导的肾小球肾炎模型中测试LPM1d的实验结果。结果显示LPM1d在许多所测试生理学参数中提供了肾保护。其它LPM如本文提供的含有与修饰的SA1缀合的趋化因子的任一种也可以在类似测定中测试。这种结果证实LPM可以用作治疗肾病的候选治疗剂。

l.超敏感性

一些举例参考文献提供并应用超敏感性动物模型，该模型可用于检测配体-毒素缀合物如含有修饰的SA1的LPM缀合物，所述参考文献包括但不限于如下引用的参考文献。最初开发小鼠迟发型超敏感性(MDTH)模型以检测接触性超敏感性。对该模型进行调试以筛选T细胞调节的免疫应答的抑制并常用作慢性炎性疾病的模型(Staite et al.，(1996)Blood 88：2973-2979)。

例如，一些模型特别是噁唑酮(OXA)-诱导的变应性接触性皮炎小鼠模型已经用于鉴别潜在的抗炎和免疫调节药物(Chapman et al.，(1986)Am.J.Dermatopathol.130-8)。当将噁唑酮溶液直接应用于小鼠耳时，小鼠经历可再生及可测量的炎症反应而被噁唑酮敏化。半抗原特异性皮肤T淋巴细胞(Th1与Th2细胞的混合物)和巨噬细胞被触发释放促炎细胞因子和趋化因子。尽管数量较少，但是也存在嗜中性粒细胞活化和浸润。其它DTH模型研究已经示出嗜中性粒细胞可通过释放细胞因子和趋化因子而间接或者直接调节T细胞募集。在几小时内，小鼠耳肿胀并且白细胞开始浸润血管外组织。耳厚度和细胞浸润在24小时达到峰值，在几天内逐渐降低至基础水平。小鼠耳的重量由于白细胞流入以及渗出物产生而增加。

举例的超敏感性模型中LPM缀合物的结果在实施例7中示出，其示出在超敏感性模型中检测LPM1c和LPM1d的实验结果。参与MDTH模型耳肿胀的大多数白细胞亚型均表达CCR2，CCR2在其它趋化因子受体中是MCP-1的被靶向受体。因此，选择含有修饰的SA1的MCP-1-SA1(LPM1)缀合物以靶向这些细胞以进行消除。该结果例证了MCP-1-SA1(LPM1)变体LPM1c和LPM1d在治疗超敏感性中是有效的，而且LPM1c和LPM1d具有与其毒性活性一致的不同效力(见例如实施例3所述)。其它LPM如本发明提供的含有与修饰的SA1缀合的趋化因子的任何LPM也可以在相似测定中检测。可以检测任何LPM缀合物，特别是已知靶向细胞表面受体如在参与超敏感性的一或多种白细胞上表达的任何细胞表面受体的任何LPM缀合物。因此，这个结果证实LPM可用作治疗超敏感性的治疗候选物。

J.含有毒素及其缀合物的组合物的配制与施用

本发明提供了用于治疗与病理生理性炎症反应相关失调的组合物，所述失调包括继发组织损害和相关疾病状态以及其它疾病。这种组合物含有治疗有效量的配体-毒素缀合物，所述缀合物含有本文所述靶向物质例如趋化因子或其活性片段以及RIP毒素。可以对本领域技术人员已知的其它缀合物进行修饰，由此毒素部分由本发明提供的毒素替代，本发明也包含含有这种缀合物的组合物。

将治疗病症或疾病的有效浓度的一或多种配体-毒素缀合物如本发明提供的LPM或者其药物可接受的衍生物与合适的药物载体或者运载体混合以进行全身、表面(topical)或者局部(local)施用。组合物包含治疗选择的失调的有效量的化合物。组合物中活性化合物的浓度依赖于该活性化合物的吸收、失活、排泄速度、给药方案、施用量以及本领域技术人员已知的其它因素而定。

适于施用所述缀合物及适于本发明提供的方法的药物载体或者运载体包括本领域技术人员已知的适于特定施用模式的任何这种载体。此外，所述化合物可以配制为组合物中唯一的药物活性成分或者可以与其它活性成分组合。

施用的治疗剂的精确量或剂量依赖于特定缀合物、施用途径以及其它这类考虑。可以在缓释运载体中施用，所述运载体例如但不限于是微球、脂质体、微粒、纳米颗粒以及胶体炭。典型地，治疗有效剂量应产生活性成分的血清浓度为大约0.1ng/ml至大约50-100μg/ml。根据选择的缀合物，所述药物组合物的剂量典型应提供每天每公斤体重大约0.01mg至大约100-2000mg缀合物。对于静脉内或者全身性治疗而言，每日剂量在大约0.05至0.5mg/kg之间应该足够。局部应用每次施用剂量应提供大约1ng直至100μg、典型大约1μg至大约10μg。应理解所述施用量是选择的缀合物、治疗指征以及可能地可以耐受的副作用的函数。可以使用每种失调的公认模型根据经验确定剂量。

所述活性成分可以一次施用或者可以分成几次间隔一定时间以较小剂量施用。应理解精确剂量与治疗持续时间是治疗的组织的函数且可以使用已知的检测方案根据经验确定或者从体内或者体外检测数据中推断。注意浓度和剂量值可以根据治疗个体的年龄而变化。进一步应理解的是对于任何特定对象而言，应该根据个体需要以及管理或监督所述组合物施用的专业人员的判断随时调整特定剂量方案，本文所述的浓度范围是举例性的。

所述化合物可以以微粉化或者其它适当形式悬浮或者可以被衍生化产生更可溶的活性产物或者产生前体药物。所得混合物的形式依赖于许多因素，包括指定的施用模式以及化合物在选择的载体或者运载体中的溶解性。有效浓度足以改善被靶向的病症并且可以根据经验加以确定。为了配制组合物，将化合物的重量级分(weight fraction)以有效浓度溶解、悬浮、分散或者其它方式混合于选择的运载体中，由此减轻或者改善被靶向的病症。

对于局部内部施用如肌内、胃肠外或者关节内施用而言，所述化合物通常被配制成基于水性介质的溶液或者悬浮液如等渗缓冲盐水或者与生物相容支持物或者用于内部施用的生物粘合剂组合。

所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳状液或者其它这种混合物，并且可以配制成水性混合物、乳液、凝胶、软膏、乳状液、乳液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫剂、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带，或者适于全身、表面或者局部施用的任何其它配制品。

适于施用本发明提供的化合物的药物和化妆品用载体或者运载体包括本领域技术人员已知的适于特定施用模式的任何这种载体。此外，所述化合物可以配制为组合物中唯一的药物活性成分或者可以与其它活性成分组合。载体中包含的活性化合物的量足以对治疗个体发挥治疗有效作用而不存在严重毒性作用。可以通过使用体外和体内系统包括本文所述动物模型检测所述化合物而根据经验确定有效浓度。

用于局部应用的溶液或者悬浮液包括如下任何成分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或者其它合成溶剂；抗微生物剂，如苯甲醇和羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸和亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸[EDTA]；缓冲液，如乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液；以及调节张力的物质如氯化钠或者葡萄糖。液体制备物可以封入安瓿、一次性注射器或者由玻璃、塑料或者其它合适材料制成的多剂量小瓶中。合适的载体可包括生理盐水或者磷酸盐缓冲盐水[PBS]，悬浮液和溶液可含有增稠剂和增溶剂，如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物。脂质体悬浮液也可以适用作药物可接受载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备。

用于本发明方法中的治疗剂可以通过本领域技术人员已知的任何途径施用，例如但不限于表面、关节内、脑池内、眼内、脑室内、鞘内、静脉内、肌内、腹膜内、皮内、气管内以及通过任两或多种途径的任意组合。

最合适的施用途径根据治疗的疾病而定，例如根据炎症病症的部位而定。施用模式包括但不限于表面、局部、关节内、脑池内、眼内、脑室内、鞘内、静脉内、肌内、气管内、腹膜内、皮内、立体定向以及其任两或多种的组合。例如，为了治疗SCI及其它CNS炎症病症，局部施用包括施用给CNS液或者脑(例如鞘内、脑室内或者脑池内)提供了这样的优势，即所述治疗剂可以以高浓度施用而无可伴随全身施用治疗剂的并发症的风险。或者，可以通过立体定向接种于脑中而施用例如用于治疗肿瘤。类似地，为了治疗炎性关节疾病，可以通过注射局部施用治疗剂到发炎的关节中(即通过关节内、静脉内或者皮下方式)。再例如，与炎性皮肤病症相关的疾病可有利地通过表面施用治疗剂进行治疗，所述治疗剂例如配制成乳液、凝胶或者软膏。为了治疗与炎性肺病相关的疾病，优选的施用治疗剂的途径可以是通过气雾剂吸入或者气管内施用。

因此，所述缀合物可以通过任何适当途径施用，例如口服、胃肠外(例如静脉内、腹膜内、肌内、皮内、通过皮下注射或者灌注或者植入)、经鼻或者通过肺、阴道、直肠、舌下或者局部途径以液体、半液体或者固体形式，并且以适于每种施用途径的形式配制。优选的施用模式根据治疗指征而定。皮肤病学和眼科学指征典型是局部治疗；而肿瘤和SCI及其它这种失调典型通过全身性、皮内、肌内、立体定向或者其它施用模式治疗。可以通过注射施用(使用例如静脉内或者皮下方式)，但是也可以通过持续灌注以缓慢或定时施用(使用例如缓释装置或者微型泵如渗透泵或者皮肤贴片)。

所述治疗剂以有效量施用。当然，治疗有效量根据疾病的严重性和对象的体重及一般状态以及施用途径而定。局部施用治疗剂典型需要低于任何全身性施用模式的剂量，但是在一些情况中，在局部施用之后治疗剂的局部浓度可高于全身性施用达到的安全浓度。

由于个体对象的症状的严重性各不相同而且每种治疗剂具有其独特的治疗特征，因此专业人员需要确定对象对于治疗的反应并因此改变剂量。在体外使用的剂量可以为原位施用药物组合物的量提供有益的指导，在一些情况中动物模型可用于确定治疗特定疾病的有效剂量。然而，对于局部施用而言，预期治疗剂的有效量通常是在每公斤体重大约0.1皮克(pg)至大约1ng的范围内。关于达到有效量的各种因素在例如Goodman And Gilman′s：The Pharmacological Bases of Therapeutics，8th ed.，Pergamon Press，1990；以及Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990；以及Mantyh et al.，(1997)Science 278：275-79中描述，包括神经元特异性配体-毒素的鞘内注射。

在本发明提供的组合物和方法的一个实施方案中，所述治疗剂在缓释输送运载体中局部施用，例如在胶体分散系统中或者在聚合物稳定晶体中包囊化。可用的胶体分散系统包括纳米胶囊、微球、珠以及基于脂质的系统，包括水包油乳状液、微团、混合微团以及脂质体。目前优选的胶体系统是脂质体或者微球。脂质体是人工膜泡，当注射或者植入时可用作缓释运载体。一些举例的脂质-聚合物缀合物和脂质体在美国专利No.5,63 1,018中揭示，所述文献以其全部内容并入本文作参考。缓释输送运载体的其它实例是生物可降解的水凝胶基质(美国专利No.5,041,292)、树状聚合物缀合物(美国专利No.5,714,166)以及多泡脂质体(

Depotech，SanDiego，CA)(U.S.Patent Nos.5,723,147 and 5,766,627)。适于包囊化治疗剂以局部注射(例如注射进皮下组织中)的一种类型的微球是聚(D，L)丙交酯微球，如D.Fletcher(1997)Anesth.Analg.84：90-94所述。

除了为创伤部位输送有效治疗剂量的治疗剂并降低全身性毒性的机会之外，局部施用还降低治疗剂暴露于降解过程例如蛋白酶解和通过抗原和免疫原性应答的免疫干预。药物与例如单甲氧基聚乙二醇的衍生化也降低上述不利之处的可能性。据报道治疗剂的聚乙二醇化增加对于蛋白酶解的抗性；延长血浆半衰期并降低抗原性和免疫原性。举例的聚乙二醇化方法由Lu and Felix(1994)Int.J.Peptide Protein Res.，43：127-138；Lu and Felix(1993)Peptide Res.，6：142-6；Felix et al.(1995)Int.J.Peptide Res.，46：253-64；Benhar et al.(1994)J.Biol.Chem.，269：13398-404；Brumeanu et al.(1995)JImmunol.，154：3088-95提供。

本发明提供的组合物进一步可含有一或多种便于输送的佐剂，例如但不限于惰性载体或者胶体分散系统。这种惰性载体的代表性及非限制性的实例可选自水、异丙醇、气态碳氟化合物、乙醇、聚乙烯比咯烷酮、丙二醇、凝胶生成材料、硬脂醇、硬脂酸、鲸蜡、去水山梨糖醇单油酸酯、甲基纤维素及其两或多种的适当组合。

本发明提供的组合物也可以根据已知方法使用合适的分散剂或者增湿剂以及悬浮剂配制为无菌可注射悬浮剂。所述无菌可注射制备物也可以是在无毒胃肠外可接受的稀释剂或者溶剂例如1，4-丁二醇中的无菌可注射溶液或者悬浮液。无菌不挥发油也常用作溶剂或者悬浮介质。为此，可以应用任何无刺激性不挥发油，包括但不限于合成的甘油一酯或甘油二酯、脂肪酸(包括油酸)、天然存在的植物油如芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油及其它油，或者合成的脂肪运载体如油酸乙酯。如果需要，可以掺入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂以及合适的成分。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或者可食用载体并且可以压缩成片剂或者封入明胶胶囊中。对于口服治疗剂，活性化合物可以掺入赋形剂并且以片剂、胶囊或者锭剂形式应用。可包含药物相容粘合剂和佐剂材料作为组合物的一部分。

片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任意如下成分或者具有相似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶和明胶；赋形剂，如淀粉和乳糖；崩解剂，例如但不限于褐藻酸和玉米淀粉；润滑剂，例如但不限于硬脂酸镁；助流剂，例如但不限于胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；以及调味剂，如薄荷油、水杨酸甲酯和果味剂。

当剂量单位形式是胶囊时，其除了含有上述类型的材料之外还可以含有液体载体如脂肪油。此外，剂量单位形式可含有修饰所述剂量单位的物理形式的各种其它材料，例如糖衣及其它肠溶剂。所述缀合物也可以作为酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafer)、口香糖等的成分施用。糖浆除了所述活性化合物之外还可含有作为甜味剂的蔗糖以及某些防腐剂、染料和色素以及调味剂。

所述活性材料也可以与不削弱希望作用的其它活性材料混合，或者与补充希望的作用的材料如治疗肿瘤的顺铂混合。

最后，所述化合物可以包装成生产成品，其含有包装材料、在所述包装材料中的一或多种本发明提供的缀合物或者组合物以及标示所述缀合物的适应症的标签。

K.使用毒素或者其缀合物治疗疾病和失调的方法

本发明提供了使用本发明提供的任一或多种配体-毒素缀合物、包括含有修饰的RIP部分如修饰的SA1的缀合物治疗疾病或失调的方法，所述配体-毒素缀合物设计为靶向所述疾病或失调。利用所述缀合物对于表达被靶向受体的细胞的受体特异性靶向，本发明提供的组合物和方法使得可以选择性地、有意地及暗中将治疗剂输送至协调应答损伤或疾病的细胞。所述缀合物靶向参与免疫调节和炎性疾病及其它创伤的病理生理学过程的细胞使得所述缀合物由受体介导内化，从而促进毒素介导的细胞毒性并消除病变细胞成分。

因此，本发明提供了使用缀合物治疗炎症或者免疫疾病和病症的方法。为了评价这种缀合物在治疗这种疾病或病症中的应用，需要了解免疫系统以及病变细胞在这种疾病恶化中的参与作用，如目前候选治疗剂限制的讨论。如下讨论提供了配体-毒素缀合物如含有修饰的毒素的缀合物的选择和在举例的疾病治疗中的应用的这种背景序言。

1.免疫宿主防御系统与炎症

免疫系统可分为先天免疫系统和获得性免疫系统两部分，其共同赋予完整的免疫监视和宿主防御系统。该系统包括一些异质白细胞群，包括但不限于单核细胞或者巨噬细胞(统称为单核吞噬细胞(MNP)、嗜中性粒细胞(多形核嗜中性粒细胞，PMN)、T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、天然杀伤(NK)细胞、树突细胞(DC)以及肥大细胞(MaC))。先天免疫系统依赖于对侵入物如微生物立即起反应的细胞，包括MNP、树突细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞。获得性免疫系统包括T细胞和B细胞，其需要通过抗原呈递细胞、主要是树突细胞激活以靶向特定的宿主侵入物。先天免疫应答和获得性免疫应答的细胞与组织居留细胞(TRC；例如上皮细胞)相呼应以维持许多器官特异性过程中的稳态平衡，所述过程包括胚胎发生、血管发生、淋巴细胞运输(lymphocyte trafficking)、伤口愈合、组织修复、细胞碎片及其它非所需物质如微生物、病毒或者癌细胞克隆的清除(例如Esche et al.，J.Invest.Dermatol.，125：615-28，2005；Chaturvedi et al.，Indian J.Med.Res.，124：23-40，2006；Bunde，J.Exp.Med.201：1031-6，2005；Krishnaswamy et al.，Methods Mol.Biol.315：13-34，2005；Martin andLeibovich，Trends Cell Biol.，15：599-607，2005；Kim，Curr.Drug TargetsImmune Endocr.Metabol.Disord.，4：343-61，2004；Moser and Willimann，Ann.Rheum.Dis.63(suppl 2)：84-9，2004；Hoebe et al.，Nat.Immunol.，5：971-4，2004；Schaerli et al.，J.Exp.Med.，199：1265-75，2004；Olson and Miller，J.Immunol.173：3916-24，2004；Middleton et al.，Blood，100：3853-60，2002；Beyer et al.，Glia 31：262-66，2000)。

a.稳态炎症

稳态炎症是一种多因子生化过程，其由活化的TRC和白细胞谱系活化细胞协调和维持，在趋化因子通信系统中起重要作用。从损伤和死亡细胞释放的可溶性因子、免疫复合物或负荷复合物的抗原如细菌脂多糖(LPS)和经补体和toll受体系统工作的病毒包膜蛋白是白细胞活化和募集的通用触发物。在应答中，白细胞经历深入的表型改变，包括上调细胞粘附分子和促炎细胞因子以及趋化因子以运输和与其它白细胞群通讯。一旦在浸润部位白细胞产生细胞毒性介质。例如，活性氧和氮、蛋白酶解酶以及类花生酸类消灭入侵微生物和真菌，主要由巨噬细胞和PMN吞噬。在伤口部位例如白细胞(特别是巨噬细胞)-衍生生长因子(GF)包括血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞GF(FGF)促进血管发生。促纤维化因子(Profibroticfactor)如转化生长因子-βTGF-β促进结疤和伤口愈合(Krishnaswamy et al.(2005)Methods Mol.Biol.315：13-34；Puneet et al．(2005)Am. J.Physiol.LungCell Mol.Physiol.288：L3-1 5；Taylor et al.(2005)Annu.Rev.Immunol.23：90 1-44；Byrne et al.(2005)J.Cell Mol.Med.9：777-94；Carroll(2004)Nat.Immunol.5：98 1-6；Iwasaki and Medzhitov(2004)Nat.Immunol.5：987-95；Martin and Leibovich(2005)Trends Cell Biol.15：599-607；Liu and Pope(2004)Rheum.Dis.Clin.North.Am.，30：19-39；Stark et al.(2005)Immunity，22：285-94；Gordon(2003)Nat.Rev.Immunol.，3：23-5；Borish and Steinke(2003)J.Allergy Clin.Immunol.，111：S460-75；Cross and Claesson-Welsh(2001)Trends Pharmacol.Sci.，22，201-7；Trautmann，et al.(2000)J.Pathol.，190：100-6)。通常，由活化的白细胞产生的这种免疫介质是保护性的，但是在某些病理学状况中其可以变得有害且延长疾病病程。

b.病理学炎症

炎性反应是由聚集在组织损伤或创伤部位的免疫防御细胞介导以除去机体的不必要外源物质(例如微生物)或者内源物质(例如癌细胞克隆)；清除细胞碎片以及参与组织和伤口愈合。不幸地，参与这些修复(炎症)过程的分子机制可以引发继发组织损害，继之导致许多炎性疾病的发病和持续病理。参与继发组织损害的分子机制及细胞和化学介质在大多数人炎性疾病中是相似的(如果不相同的话)。例如，在由于大量刺激源的活化诱导的病理学状况可以导致细胞活化，所述刺激包括但不限于病毒、细菌、寄生虫、促炎细胞因子、趋化因子、缺氧、缺血、蛋白尿(尿液中蛋白质)、渐进性糖化终极产物(AGE)、自身抗体、系统核苷酸、补体、免疫复合物、免疫球蛋白以及环境污染物如吸烟，所述细胞包括但不限于各种淋巴细胞和TRC，包括CNS神经胶质细胞、肾的系膜细胞(MC)以及许多器官的内皮细胞。所述刺激可以是疾病的引发因子，但是TRC和炎症白细胞是疾病病理学的卫士。活化的TRC和居留白细胞表达并分泌细胞因子、趋化因子和生长因子超家族的成员，促进炎症部位的白细胞活化、浸润以及增殖。由任何指定组织的TRC释放的特异性趋化因子及其它促炎分子解释了白细胞在指定疾病或创伤中的特异性白细胞浸润(Lindemans et al.(2006)Clin.Exp.Immunol.，144：409-17；Puneet et al.(2005)Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.288：L3-15；Boyle，J.J.(2005)Curr.Vasc.Pharmacol.3：63-8；Liu and Pope(2004)Rheum.Dis.Clin.North.Am.，30：19-39；Tetley(2002)Chest 121：156S-159S；de Leeuw et al.(2005)Ann.N.Y.Acad.Sci.1051：362-71；Drinda，et al.(2005)Rheumatol.Int.25：411-3；Raivich and Banati(2004)Brain Res.Brain Res.Rev.，46：261-81；Tokarska-Rodak et al.(2004)Ann.Agric.Environ.Med.11：227-31；Hou et al.(2004)J.Am.Soc.Nephrol.，15：1889-96；Hayashida et al.(2001)Arthritis Res.3：118-26；Garcia-Ramallo et al.，(2002)J.Immunol.169：6467-73；Kim et al.(2002)Blood 100：11-6；Perez de Lema(2001)J.Am.Soc.Nephrol.，12：1369-82；Barnes et al.，Eur.Respir.J.，22：672-88，2003；Luster etal.，Nat.Immunol.，6：11 82-90，2005；Charo and Ransohoff，N.Eng.J.Med.，354：610-21，2006)。

病理学炎症中采用何种炎症介质如细胞因子、趋化因子和关联受体依赖于涉及的精确白细胞亚型、涉及的组织或器官以及损伤或疾病的阶段。此外，炎症介质的释放可导致病理循环无限期延长。例如，细胞因子和趋化因子无限期延续其自我产生并且通过自分泌和旁分泌机制从白细胞中释放。它们还诱导其靶向的细胞合成和释放细胞毒性化合物。除了神经毒素之外，居留和浸润白细胞释放用于稳态目的的相同分子以介导组织损害。细胞因子和趋化因子诱导细胞粘附分子(CAM)和细胞表面抗原(包括细胞因子和趋化因子受体)在各种细胞类型包括白细胞、内皮细胞、神经胶质细胞和癌细胞上的表达。CAM和糖胺聚糖(GAG)是细胞运输(或者迁移)必需的，不仅在稳态环境中，而且在病理性炎症病症包括癌症转移中也如此。细胞表面抗原的上调有助于细胞活化，细胞活化有助于炎症介质的进一步产生。此外，炎症因子的微环境的成分影响不同细胞的表型。例如，已知嗜中性粒细胞表达CXC受体，但是在某些情况中如在败血症急性肺损伤和再灌注损伤中它们表达CC受体，包括CCR2。

相对疾病特异性白细胞亚型的过度浸润、(慢性)活化和增殖(数目增加)已经被明确证实是数百种不同临床病症、疾病和创伤的免疫病理学基础(见例如表6、表7)。组织特异性变化主要是占据主导作用的不同白细胞亚群所致，例如在CNS炎症早期阶段中的小胶质细胞；变应性肺部炎症中的嗜酸性粒细胞、Th2细胞和肥大细胞(MaC)；以及慢性肾病(CKD)中的巨噬细胞、Th1细胞和MaC。此外，白细胞衍生的可溶介质如血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子-β(TGF-β)是其它病理学过程如分别为血管发生和纤维化的调节剂。近年来的研究意识到疾病/慢性炎症过程中白细胞的绝对数目的重要性，揭示了高白细胞计数的绝经后妇女与低白细胞计数的那些妇女相比心脏病、卒中和死亡危险高40-50％(Cushman，Arch.Intern.Med.165：487-8，2005；Margolis，et al.，Arch.Intern.Med.165：500-8，2005)。尘细胞在慢性阻塞性肺病(COPD)的发病机制中起作用。COPD患者与对照组相比在气道、肺实质、支气管肺泡灌洗液及痰液中MNP数目增加直至10倍。类似地，肺气肿患者的组织和肺泡腔中MNP数目增加25倍(Tetley，Chest121：156S-159S，2002)。过继转移研究示出肾小球巨噬细胞的数目增加与巨噬细胞诱导的蛋白尿(肾损伤的标记)、肾小球细胞增生以及细胞过多相关。白细胞亚型数目与不同疾病的严重性和进展相关(例如Ikezumi，et al.，Kidney Int.，63：83-95，2003；Brightling et al.，N.Engl.J.Med.346：1699-705，2002；Panzer et al.，Transplantation 78：1341-50，2004)。下表8示出支持各种白细胞在多种疾病和失调的病理学中的作用的参考文献。表9示出举例的参与许多疾病病理学的白细胞群及其它免疫细胞或者组织居留细胞。

表8：疾病病理学中的白细胞

疾病/创伤	举例的参考文献
		关节炎	Haringman et al.，Ann.Rheum.Dis.，65：294-300，2006；Adamopoulos et al.，J.Pathol.，208：35-43，2006：Ma and Pope，Curr.Pharm.Des.，11：569-580，2005；Haringman et al.，Ann.Rheum.Dis.，63：1186-94，2004；Koch，Arthritis.Rheum.，52：710-21，2005.
癌症、血管发生&转移	Lewis and Pollard，Cancer Res.，66：605-12，2006；Kakinumama and Hwang，J Leukoc.Biol.，79：639-51，2006；Allavena et al.，Curr.Cancer Ther.Rev.，1：81-92，2005；Wang et al.，J.Transl.Med.，4：30，2006.Mantovani et al.，Semin Cancer Biol.，14：155-60，2004；Ben-Baruch，Cancer Metastasis Rev，提前出版，2006.
		心血管疾病	Hansson et al.，Annu.Rev.Pathol.Mech.Dis.1：297-329，2006，Boyle，Curr.Vasc.Pharmacol.，3；63-8，2005；Charo and Taubman，Circ.Res.，95：858-66，2004；Usui et al.，Faseb J.，16：1838-40，2002.
慢性肾病	Galkina and Ley，J.Am.Soc.Nephrol.，17：368-77，

疾病/创伤	举例的参考文献
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CNS疾病和创伤	Minami et al.，J.Pharmacol.Sci.，100：461-470，2006；Jones et al.，Curr.Pharm.Des.11：1223-36，2005；Sindern，Front.Biosci.，9：457-63，2004；Kimand de Vellis，J.Neurosci.Res.，81：302-13，2005；Offner et al.，J.Cereb.Blood Flow Metab.，26：654-65，2006；Kaul and Lipton，Neurotox.Res.，8：167-86，2005；Eugenin et al.，J.Neurosci.，26：1098-106，2006；Kaul et al.，Cell Death Differ.，12(Suppl 1)：878-92，2005.Ubogu et al.，TrendsPharmacol.Sci.，27：48-55，2006.
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疾病/创伤	举例的参考文献
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移植排斥	Hoffmann et al.，Nephrol.Dial.Transplant.，21：1373-81，2006；Nicod，Proc.Am.Thorac.Soc.，3：444-9，2006；Wyburn et al.，Transplantation 80：1641-7，2005；Perez-Simon et al.，Drugs 66：1041-57，2006；Ruster et al.，Clin.Nephrol.，61：30-9，2004；Belperio et al.，Semin.Crit.Care.Med.，24：499-530，2003.
		血管疾病	Aries etal.，IMAJ.，7：768-73，2005；Foell etal.，J.Pathol.，204：311-6，2004；Ishibashi，et al，Circ.Res.，94：1203-10，2004；Wagner et al.，Clin.Exp.Rheumatol.，21：185-92，2003；Falk and Jennette，J.Nephrol.，17(Suppl 8)：S3-9，2004.
肥胖症	Neels and Olefsky，J.Clin.Invest.，116：33-5，2006；Weisberg et al.，J.Clin.Invest.，116：115-24，2006；Fantuzzi，J.Allergy Clin.Immunol.，115：911-9，2005；Martinovic et al.，Circ.J.，69：1484-9，2005；Weisberg etal.，J.Clin.Invest.，112：1796-808，2003)

表9：人疾病中举例的白细胞类型

注：B＝B细胞；T＝T细胞；NK＝天然杀伤细胞；Th2＝2型辅助T细胞；DC＝树突细胞；MNP＝单核巨噬细胞(单核细胞、巨噬细胞和小胶质细胞)；GC＝巨细胞(多核融合巨噬细胞)；TAM＝肿瘤相关巨噬细胞；PMN＝多单核嗜中性粒细胞(polymononuclear neutrophil)；MaC＝肥大细胞。

2.候选治疗剂

针对干扰细胞活性包括例如病理性白细胞和癌细胞活性的一些方法已经并正在研究。这许多药剂频繁遇到的问题是缺乏特异性。例如，免疫抑制剂如糖皮质激素、环磷酰胺和硫唑嘌呤已经用于治疗炎性疾病，然而这些药物的非特异性免疫抑制作用存在一些缺点。首先，宿主防御受害，可导致危及生命的感染并且由于免疫监视的缺失导致恶性迹象增加。其次，针对器官毒性和代谢过程的破坏是普遍的(见例如Ingelfinger and Schwartz，N.Engl.J.Med.353：836-9，2005；Siegal and Sands，Ailment Pharmacol.Ther.，22：1-16，2005；Duncan and Wilkes，Proc.Am.Thorac.Soc.，2：449-55，2005；Perez-Simon et al.，Drugs 66：1041-57，2006)。其它方法也已经用于增加特异性并因此降低药物的副作用。例如，已经揭示了生物应答修饰剂(BRM)，包括细胞因子和趋化因子受体拮抗剂；细胞因子和趋化因子抗配体抗体；抗细胞粘附分子(CAM)，抗-GAG试剂以及干扰胞内信号转导途径的分子(例如Johnson et al.(2004)Biochem.Soc.Trans.，32：366-77；Johnson et al.(2004)J.Immunol.，173：5776-85；Eis et al.(2004)Arch.Immunol.Ther.Exp.(Warsz)52：164-72；McDonald et al.(2001)IDrugs.，4：427-42；Ribeiro andHoruk(2005)Pharmacol.Ther.107：44-58；Wong(2005)Curr.Opin.Pharmacol.5：264-71；de Boer(2005)Drug Discov.Today 10：93 105；Haringman and Tak(2004)Arthritis Res.Ther.，6：93-7；Barber et al.(2005)NatMed 11：933-5；Camps et al.(2005)Nat Med 11：936-43；Schon et al.(2003)JInvest Dermatol.，121：951-962)。

然而，由于在稳态和炎性免疫应答中使用的各种网络和级联反应的补偿性、多效性和异质性质，BRM在疾病治疗中受限。因此，限制BRM在治疗疾病中的应用的一个原因是细胞信号装置的冗余和串扰，包括疾病相关的细胞受体和可溶介质的冗余。例如，炎症相关介质例如细胞因子、趋化因子以及生长因子系统成员的大量冗余。

典型地，免疫细胞可以表达可溶配体介质的一些受体，而且每种受体可以应答一种以上的可溶配体。例如，趋化因子MIP-1α、RANTES和LEC结合CCR5，但是也分别结合CCR1、CCR1与CCR3；以及CCR1与CCR2(见表5)。因此，CCR5的拮抗剂不干扰MIP-1α、RANTES和LEC与CCR1、CCR2和/或CCR3的结合，并且持续发挥炎症效应(见例如Matsui et al.，(2002)J.Neuroimmunol.128：16-22)。在另一个实例中，在疾病中抑制趋化因子MCP-1以减少经CCR2的巨噬细胞浸润不是最佳的治疗方法，因为其它趋化因子也使用CCR2，例如MCP-3、MCP-2、MCP-5、MCP-4并且LEC和巨噬细胞表达除了CCR2之外的其它趋化因子受体(见例如表5)。例如，Fujinaka et al.(J.Am.Soc.Nephrol.，8：1174-8(1997))揭示了在治疗患者4天时，MCP-1的中和抗体降低单核细胞和巨噬细胞的数目以及减少肾小球的蛋白尿，然而在8天后，抗-MCP-1治疗不降低细胞浸润、尿蛋白排泄或者新月体形成。因此，在这个系统中，巨噬细胞不仅被MCP-1激活，而且还被导致肾小球损伤的其它因子激活。例如，除了其它CCR2配体之外，巨噬细胞还表达CCR1、CCR3、CCR5和CCR8，以及在一些情况中表达CXCR1和2，一些或者全部这些因子是与观测到的病理学相关的因子。在关节炎实验中也已经观测到抗MCP-1治疗对于临床症状或者免疫组织学改善不起作用(见例如Haringman et al.，(2006)Arthritis Rheum.，54：2387-92)。

因此，大多数候选治疗剂靶向白细胞释放或激活的一种而不是全部的生物化学介质，或者他们杀死一种特定的白细胞亚型，前提是一种细胞类型仅负责一种指定疾病，这种情况很少见。治疗疾病、失调或者创伤的一种更可取的方法是消除参与疾病病理学的细胞成分，如白细胞包括病理性白细胞和/或TRC。白细胞的数目和增加的活性与疾病的严重性以及测量的病理学参数之间存在相关性(见例如Wada et al.(1996)；Zoja et al.(1996)；andChiang et al.(1996；Nikolic-Paterson and Atkins，Nephrol Dial Transplant.，16(Suppl 5)：3-7，2001)。例如，病理性白细胞如活化的白细胞的消除使得炎症介质和毒性分子的产生得以废止，并且降低与许多疾病的恶化相关的白细胞运输。举例的这种候选治疗剂是配体-毒素缀合物，特别是靶向活化的白细胞的趋化因子-受体靶向缀合物。因此，这种缀合物是具有炎症成分或者共有潜在炎症病理学的疾病的候选治疗剂。

3.配体-毒素缀合物

本领域已经产生并且已知特异性靶向参与疾病病理学的一或一种以上细胞群的配体-毒素缀合物。这些缀合物包括趋化因子毒素缀合物，如美国专利申请系列No.09/360,242、09/453,851和09/792,793以及美国专利No.7,166,702、7,157,418和7,192,736所述。这种缀合物靶向一种、典型靶向一种以上的细胞类型，通过一或一种以上的特异性细胞表面受体识别并且被内化而导致通过毒素部分杀死细胞。使用这种毒素缀合物，已经证实白细胞及其它细胞包括病理性白细胞的特异性和明智的根除可有效治疗疾病(见例如McCarron et al.(2005)，Mol.Interv.，5：368-80；Pastan et al.(2006)，Nat.Rev.Cancer 6：559-65；Frankel et al.(2003)，Semin.Oncol.，30：545-57；Pastan(2003)，Immunol.Ther.52：338-41；Kreitman，(2006)AAPS.J..，8：E532-51；Carter(2006)，Nat.Rev.Immunol.，6：343-57；Cohen(2005)MedGenMed.，7：72；Edwards et al.(2004)N.Engl.J.Med.350：2572-81；Zeisberger et al.(2006)Br.J Cancer，95：272-81；Cross et al.，J.Neuroimmunol.Aug 10，2006，(published online)；Cailhier et al.(2005)，J.Immunol.，174：2336-42；van Roon et al.(2005)Ann.Rheum.Dis.64：865-70；Sfikakis et al.(2005)Arthritis Rheum.，52：501-13；Nikolic-Paterson and Atkins(2001)Nephrol.Dial.Transplant.，16：Suppl 5，3-7；Rajan et al.(1998)，J.Immunol.160：5955-62；Hu et al.(1997)Cell Immunol.，177：26-34；Schuh et al.(2003)Eur.J.Immunol.，33：3080-90；Taoka et al.(1997)，Neuroscience 79：1177-82；Wolff et al.，(2004)J.Vasc.Surg.，39：878-88；Duffield et al.，Am.J.Pathol.，167：1207-19，2005)。

本发明提供了含有修饰的RIP毒素多肽的配体-毒素缀合物。所述缀合物可用于治疗多种疾病和失调，含有未修饰的RIP毒素的缀合物针对所述疾病和失调而设计。如上文论证，这些修饰的配体-毒素缀合物对宿主细胞的毒性降低，从而使得可高产量产生毒素。这种修饰的配体-毒素缀合物产量增加对于其用作候选治疗剂以及作为治疗被靶向的疾病和失调的治疗剂是有益的。修饰的配体-毒素缀合物包括含有修饰的SA1的那些可用于消除细胞或者另外抑制其生长或者改变其代谢。被靶向的细胞是参与疾病或失调的病理学的那些细胞，例如参与炎症、血管发生或者癌症的细胞。

含有修饰的毒素的缀合物例如是趋化因子配体-毒素缀合物，称作白细胞群调节剂(LPM)。如下文所述，LPM被设计为根除活化的病理性(炎性)白细胞及其它细胞或者改变其代谢，通过利用在这些细胞上表达的高度调节的趋化因子受体进行。LPM的配体部分与通过关联趋化因子受体的表达得以进入细胞有关。表达适当趋化因子受体的细胞将摄取LPM分子，其包括抑制所述细胞的生长、杀死细胞或者另外改变其代谢的毒素，例如通过降解病毒核酸或者通过干扰蛋白质合成进行。随着病理性细胞被除去或者被抑制或杀死，参与疾病过程的细胞之间通讯越来越少而且促炎介质不再合成。因此，参与不同炎症或者其它疾病过程(血管发生，其中被靶向细胞是内皮细胞，如表达VEGFR的那些细胞)的多重刺激相伴随地被关闭。

本发明提供的方法使得可以产生及分离修饰的毒素如RIP或者含有这种毒素的缀合物，其对于宿主细胞毒性降低，所述毒素在宿主细胞中产生以用于缀合物中或者作为缀合物产生。因此，可以生产较高数量。由于毒素是强力的，因此其毒性降低10倍、100倍、甚至1000倍或更多并不影响其在治疗缀合物中的应用。本领域技术人员已知的或者制备的含有毒素特别是RIP毒素的任何缀合物均可以通过本发明的方法修饰或者用本发明提供的修饰的毒素置换所述毒素。已知许多这种缀合物。这些包括在美国专利No.7,166,702、7,157,418和7,192,736中描述的那些以及细胞因子缀合物如生长因子和抗体及其它多肽靶向物质的缀合物。

配体-毒素缀合物包括具有与截短形式的SA1如变体1或者变体2 SA1直接或者间接连接的配体如趋化因子或者其活性片段的那些缀合物。举例的这种缀合物是分别如SEQ ID NO：38和40所示的LPM1a和LPM1b。特别地，含有趋化因子配体与修饰的SA1连接的缀合物包括但不限于在本发明方法中鉴别的任何修饰的SA1如突变变体1 SA1(及变体3)或者突变变体2(即变体4)SA1部分或者已知或者发现呈现降低的毒性的任何其它修饰的SA1。用于本发明治疗方法中的这种LPM的例子是如SEQ ID NO：42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64或者66任一所示的任何LPM缀合物。

本发明提供的配体缀合物可以靶向任何细胞，只要所述细胞表达与所述配体-毒素缀合物相互作用的一或多种细胞表面受体从而使得所述缀合物内化即可。例如，任何表达一或多种趋化因子受体的这种细胞均可以通过趋化因子受体靶向物质与修饰的毒素的连接而被靶向。举例的缀合物是本发明提供的缀合物，包括本发明提供的任一或多种LPM分子。被靶向的细胞包括白细胞或者其它免疫细胞，特别是活化的白细胞和免疫细胞，例如但不限于单核细胞、巨噬细胞(包括尘细胞、小胶质细胞、kupffer细胞)、树突细胞(包括不成熟或成熟树突细胞和朗格汉斯细胞)、T细胞(包括CD4阳性细胞，例如但不限于Th1和/或Th2细胞，或者CD8阳性细胞)、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、天然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞。此外，还包括任何组织居留细胞(TRC)，如系膜细胞、神经胶质细胞、内皮细胞、上皮细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、星形胶质细胞和/或滑膜细胞。趋化因子在细胞上的表达可以是组成型或者可以是例如由于细胞的活化所致的诱导型的。典型地，静止白细胞或者其他功能中使用的白细胞不是如本发明提供的任何LPM的靶(McDonald et al，IDrugs，4：427-42，2001)。通常，LPM特异于可诱导趋化因子，如由于炎症或者可以成为病理性的并且恶化多种疾病或失调的表现的其它病症导致的在活化的细胞上被上调的那些趋化因子。因此，只是活化的白细胞或者具有被靶向的趋化因子受体的其它活化的TRC被消耗。

例如，在许多情况中，为了起始并持续疾病过程(例如癌症)或者炎症反应，参与的细胞被激活并且上调其各种配体的细胞表面受体的表达。由于参与创伤和疾病的受体通常被上调，因此增加了所述治疗剂被合适的细胞内化的可能性。因此，靶向在疾病过程中被上调的细胞受体增加了指定毒素缀合物治疗特定疾病或失调的特异性。

举例的所治疗的疾病或失调是具有与疾病病理学相关的免疫或者炎症细胞成分的那些，如在上表8和9中论述。这些包括例如创伤以及具有变应性、血管发生、自身免疫、炎症或者肿瘤发生成分的任何疾病。因此，本发明预期用配体-毒素缀合物如本发明提供的任何LPM缀合物靶向活化的细胞以治疗疾病或失调，所述活化的细胞例如但不限于任何活化的白细胞如任何活化的免疫效应细胞和/或任何活化的组织居留细胞或者参与疾病或失调表达一或一种以上趋化因子受体的其它细胞。

然而，治疗任何疾病或失调的毒素缀合物包括靶向参与血管发生和癌症及其它疾病的细胞的那些可以通过用本发明提供的修饰的毒素代替其毒素多肽部分而修饰或者可以通过本发明提供的方法修饰。举例的可被修饰的FDA许可的治疗剂包括例如Gemtuzumab-ozogamicin，其是由CD33的人源化单克隆抗体组成的配体-毒素融合蛋白；Denileukin diftitox，其是由人IL-2配体组成的配体-毒素融合蛋白。

治疗选择的疾病或失调的配体-毒素缀合物的选择

如上文所述及在表8和9中所例证，多种细胞类型加剧和/或导致许多疾病、失调及其它病症的病理学。在给定的疾病或失调中，可以集合参与的白细胞亚型或者其他细胞类型的谱以及表达的相关细胞表面受体的类型和分布。因此，可以设计这样的配体-毒素缀合物，其靶向特定的细胞表面受体，从而提供进入受影响的细胞的方法以及治疗该特定疾病的机制。如本文所述，这种配体-毒素缀合物通常包括修饰的RIP毒素或者其活性部分如修饰的SA1，其在进入靶宿主细胞时杀死该细胞从而作为治疗疾病的一种手段。因此，靶向宿主细胞的所选配体部分的选择是设计配体-毒素缀合物的一个基本因素。治疗疾病的特异性配体-毒素缀合物的选择需要如下步骤：1)选择要治疗的疾病；2)确定哪些细胞在这种疾病中过量存在和/或导致这种疾病；3)确定选择的细胞类型上细胞表面受体的表达谱；4)关联也可参与所述疾病的其它细胞类型上的细胞表面受体的表达；5)选择选择的细胞表面受体的配体；以及6)构建配体-毒素缀合物。

细胞因子、趋化因子、生长因子和/或其关联受体的靶向依赖于参与特定疾病或失调的确切细胞群、涉及的组织和/或损伤或疾病的阶段。例如，已经示出特异性炎症趋化因子配体/受体轴在特定疾病中表达并占优势。因此可以通过选择靶向在特定疾病和创伤中占优势的白细胞亚型上其关联受体的相关配体(即趋化因子、细胞因子、生长因子)设计针对特定疾病的药物。

表9列出了举例的疾病以及与这种疾病的病理学或者恶化相关的白细胞及其它细胞群。本领域技术人员已知或者可以鉴别导致疾病进展的细胞群，例如表9所示任一或多种细胞。通过如本发明提供的任何配体-毒素缀合物靶向参与疾病或失调的任一或多种细胞可用于治疗所述疾病或失调。用于这种治疗中的配体-毒素缀合物的选择依赖于细胞表面受体在细胞或者细胞群上的表达以及配体对于这种受体的特异性。本领域技术人员已知或者可以鉴别在特异细胞类型上表达的受体，包括考虑涉及的组织或者损伤和/或疾病的状态。例如，可以使用常规表达研究例如但不限于流式细胞计量术或者实时PCR方法确定细胞或者细胞群上的受体表达。检测的细胞可以是细胞系、培养的原代细胞或者直接得自患病患者的细胞(即得自患者的组织、血液或者其它来源的细胞)。同样，可以使用本领域技术人员已知的如本文所述的常规结合测定法评估配体-受体特异性。可以例如通过用荧光或者放射性直接标记配体以通过流式细胞计量术、荧光测定法或者放射性测定法直接测量与选择的靶细胞的结合而检测配体结合。典型地，这种结合测定法在4℃进行，但是也可以在37℃进行以确定被靶向的细胞表面受体是否介导胞吞作用及使特异配体内化。对于配体-缀合物融合体，内化是需要考虑的事项，因为毒素必须得以进入细胞的细胞质才可以发挥其毒性作用。

下文的讨论描述了配体-毒素缀合物的设计和选择，其通过基于趋化因子及其关联受体的已知表达谱选择白细胞群调节剂举例说明。本领域已知相似的策略或者该策略可用于设计其它配体-毒素缀合物。所述讨论只是举例说明。配体-毒素缀合物的设计需要疾病特异性考虑事项，包括例如疾病的阶段和严重性。本领域技术人员可以设计并且在体外毒性活性测定和体内疾病测定中检测配体-毒素缀合物，所述体外测定例如是针对特定细胞或者细胞群的毒性活性测定，体内测定例如但不限于本文描述的任何测定。

白细胞群调节剂的选择和设计

针对治疗特定疾病设计LPM需要选择适当的靶向物质如趋化因子配体。根据治疗的疾病或失调选择用于缀合物中的趋化因子。首先需要鉴别与特定疾病或病症相关的白细胞或其它细胞。如本文所论述，本领域已知(见例如表8和表9)或者可以确定各种白细胞群对于疾病的影响。第二步是选择靶向在被靶向的一或一种以上的细胞群上表达的一或一种以上趋化因子受体的特定趋化因子配体。这种趋化因子配体基于趋化因子对于受体的特异性以及趋化因子受体在不同细胞上的表达谱加以选择。白细胞亚型上趋化因子受体表达以及趋化因子配体-受体相互作用为本领域所已知(见例如表5和6)或者可以由本领域技术人员通过实验确定。

特别地，用于配体-毒素缀合物中的优选趋化因子是靶向趋化因子受体的趋化因子，所述趋化因子受体在炎症和病理学病症下被诱导，但是在免疫稳态期间不在细胞上表达。例如，表7示出了在炎症(即病理学)和稳态条件下的趋化因子受体谱。这个表只是举例说明，应理解趋化因子受体的诱导表达依赖于并受许多因素影响，所述因素例如刺激、疾病、疾病状态或者疾病的严重性以及检测的特定细胞群。本领域技术人员已知或者可以通过实验确定在各种病症或者疾病期间细胞或者细胞群上趋化因子谱表达(即chemoprint)。具有抗病理性细胞而不是其它旁观或者静止白细胞的活性的靶向物质的选择保证了导致疾病进展的活化的细胞被靶向杀死。

某些趋化因子与其它相比看起来在特定疾病状态具有更强的影响力。例如，MCP-1表达看起来调节急性实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，而MIP-1α表达与复发EAE的严重性相关。在另一个实例中，阿尔茨海默病(AD)脑样品的免疫组织化学染色示出MIP-1β表达相对于一些其它趋化因子的优势。因此，例如MIP-1α和MIP-1β分别是治疗MS和阿尔茨海默病的LPM缀合物的选择配体。配体如MCP-1、IP-10和RANTES用于治疗人MS，因为其各自的关联配体CCR2、CXCR3和CCR5在该疾病中被上调。Eotaxins1、2和3示出对于优先由嗜酸性粒细胞表达的CCR3的高度特异性。因此，Eotaxin LPM可用于嗜酸性粒细胞(变应性)疾病，包括各种肺病和皮肤病，包括哮喘、嗜酸性粒细胞增多-肌痛综合征、鼻变态反应、特应性皮炎和息肉病。在另一个实例中，PF-4是用于靶向内皮细胞且可以用于治疗血管发生或者其它血管发生相关疾病如眼病或糖尿病的趋化因子(见例如WO95/12414)。

因此，其它需要考虑的因素例如疾病的阶段、疾病的严重性以及治疗的时间和持续时间也影响趋化因子配体的选择。例如，在继发组织损害早期阶段(例如小胶质细胞和/或巨噬细胞起始炎症的情况中)需要呈现较高程度的受体特异性的特定趋化因子LPM。用非常特异性的物质除去这些细胞可以降低周围仍良性的细胞的活化潜力。当在疾病的中期或者晚期募集其它白细胞亚群时，可需要更广谱的细胞特异性。此外，适当的广谱趋化因子LPM对于那些受限的表达多种类型趋化因子受体的白细胞群施加强有力的打击。

例如，MCP-1、Eotaxin和SDF-1β是举例的趋化因子配体，其呈现受限的且非常特异性的受体结合谱。这种配体通过受限的可利用受体亚型靶向非常特异性的细胞类型。MCP-3和RANTES是举例的具有广泛细胞和受体结合谱的配体。这种趋化因子配体可以与单一或者广泛的临床病症相关。使用受体亚型靶向广泛细胞类型的配体可以在所有这些细胞或者仅某些细胞上表达。这很大程度上是特异于给定病症或多种病症共有的细胞类型的函数。

基于上述考虑可以设计LPM。例如，如果预期治疗肺病如急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或者慢性阻塞性肺病(COPD)，本领域技术人员已知(即如上表9所示)或者可以确定在这种疾病中表达的任一或多种细胞类型包括PMN、MNP、T细胞、肥大细胞、不成熟或者成熟DC和/或嗜酸性粒细胞表达例如一或多种CCR1、CCR2和CCR3。因此，选择特异于一或多种这样的趋化因子受体的配体(例如MCP1、MCP-3或者Eotaxin)是设计治疗任一或多种ALI、ARDS或者COPD的配体-毒素缀合物的第一步。第二步是了解特异的趋化因子受体在参与疾病的不同病理性白细胞亚型上的表达。预期配体-毒素缀合物可以用于治疗肺病，所述缀合物具有与如通过本发明的方法揭示的和/或如本文描述的任何修饰的RIP直接或者间接连接的配体部分MCP-1、MCP-3或者Eotaxin。这种配体-毒素缀合物包括LPM1d。

下表概括了用于治疗选择的疾病和病症的LPM设计中的一些举例的配体。

为此，根据参与疾病的病理学或恶化的主要细胞类型已经设计了许多趋化因子-配体毒素融合蛋白(即LPM)治疗疾病。治疗特定疾病的举例的LPM示于表11。

表11：举例的白细胞群调节剂的疾病应用

趋化因子配体-毒素	举例的临床应用
		MCP-1-SA1Var4(LPM1d)	肾病、CNS、肺病、心脏病和关节疾病、移植
Eotaxin-SA1 Var4(LPM2)	变应性肺病、鼻病和皮肤病，嗜酸性粒细胞胃肠炎
		SDF-1β-SA1 Var4(LPM3)	癌症、关节疾病和HIV
IP-10-SA1Var4(LPM7)	癌症、CNS、关节疾病、肾病、移植
		MCP-3-SA1 Var4(LPM8)	CNS、心脏病、关节疾病、肾病
Gro-α-SA1 Var4(LPM4)	癌症和关节疾病
		IL-8-SA1 Var4(LPM6)	癌症、肺病、肾病、关节疾病

4.举例的疾病

本领域已知并且可以制备靶向参与病理学的细胞的配体-毒素缀合物，所述细胞例如是与异常血管发生相关的那些细胞、具有潜在炎症成分的那些细胞、肿瘤细胞及其它异常细胞、病毒感染的细胞。治疗的特定疾病决定了选择的配体(靶向物质)或者其片段。任何这种缀合物均可包括本发明提供和描述的修饰的毒素(所有这种描述均并入本章节作参考)。

举例的疾病与疾病状态是与各种类型炎症免疫细胞包括白细胞及其它上皮或内皮源细胞的增殖、活化和迁移相关的那些疾病。这些事件组合在一起在损伤或者疾病部位产生极具侵略性和不友好的环境。涉及大多数器官系统的几百种疾病和病症的细胞生物学包括病理生理学炎症反应。许多这些病理生理学疾病的细胞成分在上表9中举例说明。这种疾病和失调可以用本发明提供的和/或如本发明所述生产的任何配体-毒素缀合物治疗，所述缀合物包括含有修饰的RIP如修饰的SA1部分的任何缀合物。用于本发明方法中的这种配体-毒素缀合物的例子是LPM，特别是本发明提供的已经设计并选择以治疗特定疾病的任何LPM。因此，本发明提供的方法和组合物被设计为短暂抑制或者阻抑白细胞亚型(和/或其它细胞如脂肪细胞、星形胶质细胞等)的活性并且除去炎症机制和继发损害的刺激因素的来源。

举例的病症和失调包括但不限于在上表9中示出的任何疾病，例如心血管疾病，包括卒中、动脉粥样硬化和高血压；肝病；肺病，如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性非损伤和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)；炎性关节疾病如类风湿性关节炎和骨关节炎；急性超敏感性；慢性肾病，包括糖尿病肾病和肾小球肾炎；全身性疾病，如系统性红斑狼疮和肥胖症；HIV感染及相关疾病，包括痴呆、脑炎和肾病；一些形式癌症的生长、新血管化(血管发生)和转移，包括所有器官的癌症如脑癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌；中枢神经系统疾病，包括阿尔茨海默病；唐氏综合征；多发性硬化症；脊髓损伤；海绵样脑病；炎性肠病如败血症；溃疡性结肠炎以及Crohn′s病；皮肤病，如湿疹和银屑病；眼病，包括葡萄膜炎和视网膜炎及虹膜炎，以及增生性玻璃体视网膜病变；以及移植，如移植物抗宿主病(GVHD)和移植物/器官排斥。

下文描述了白细胞及其它类型细胞在一些这些疾病的病理学中的参与。这种描述只是举例说明而不限于特定LPM缀合物毒素或者特定的配体-毒素缀合物。本领域技术人员基于已知的细胞成分可以设计并选择用于治疗任何希望疾病的配体-毒素缀合物。特定的治疗和剂量可以由本领域技术人员确定。评估治疗中需要考虑的包括：治疗的疾病、参与该疾病的细胞成分、疾病的严重性和进程、所述分子是预防性还是治疗性应用、先前的治疗、患者的临床病史以及对于治疗的反应以及主治医生的判断。

a.癌症

癌症可以被认为是炎性疾病，即使癌细胞不是血液来源的。癌细胞归因于白细胞亚型而显示许多表型，可以认为是炎症细胞。它们具有分泌蛋白酶和促炎介质(包括趋化因子)以及进行吞噬作用的能力。此外，癌细胞表达多种受体，包括细胞因子、趋化因子、生长因子(GF)受体；表达CAM以促进转移；以及经历转分化。作为后者的一个实例，结肠癌细胞经历上皮-间质转变伴随CXCR1和CXCL8表达增加，这增强了能动性和浸入性(Bates etal.(2004)Exp.Cell Res.，299：315-24)。定量检测白细胞浸润已经表明例如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和淋巴细胞组成乳腺癌中高达50％的细胞实质并且可争辩地认为是肿瘤(Elkak et al.(2005)J.Carcinog.，4：7；Leek et al.(1996)Cancer Res.56：4625-9；Murdoch et al.(2004)Blood 104：2224-34；Queen et al.(2005)Cancer Res.，65：8896-904)。MNP及募集的单核细胞分化为提供生长因子和有助于血管发生和转移的TAM这一事实证明了这个观点(见例如Ueno et al.(2000)Clin.Cancer Res.，6：3282-9；Valkovic et al.(2002)VirchowsArch.，440：583-8；及参见表8)。

b.肾病

现由许多肾病的分类方法，一些肾病被分为许多亚型。这些疾病包括但不限于急性肾炎综合征；抗肾小球基膜病；常染色体显性多囊性肾病；肾小球肾炎(GN)，抗嗜中性粒细胞胞浆抗体GN；糖尿病肾病；糖尿病肾小球硬化症；局灶节段性肾小球硬化症；Goodpasture′s综合征；HIV肾病；特发性新月体GN；特发性急进性GN；IgA肾病IgAN；IgM系膜增生性GN；狼疮性肾炎；膜增生性GN(MPGN，I，II，III)；微小病变肾病；膜性肾病；肾炎综合征；多瘤病毒肾病；链球菌感染后GN；急进性新月体GN；肾移植排斥反应；肾血管病(例如Wegener’s肉芽肿病)和肾小管间质性肾炎。少数肾病也许消退，但是大多数一般途径是迅速或者缓慢衰退为不能治愈的慢性肾病(CKD)。CKD患者最终衰退为肾衰竭及晚期肾病(ESRD)。ESRD需要患者依赖透析治疗或者移植。

白细胞和趋化因子在肾病和肾同种异体移植排斥中起关键作用。CKD中的炎症反应可以由活化的白细胞、自身抗体、免疫复合物免疫球蛋白、DNA、核小体、AGE、补体或者这些因素的组合引起。重要的引发机制是抗体介导的肾小管和肾小球损伤。抗体与不溶的肾小球抗原形成复合物和/或与循环抗原形成免疫复合物，最终沉积在肾小球系膜中。一些肾细胞和非肾细胞被激活，许多不同种类的可溶介质包括细胞因子、趋化因子和促纤维化生长因子被释放进周围环境中。一旦激活，浸润白细胞和所有内在的肾细胞包括成纤维细胞、系膜细胞(MGC)、肾小管上皮细胞(TEC)、足细胞以及肾小球壁上皮细胞(PEC)能表达这些相同的促炎介质。CKD的一般病理学包括肾盂肾炎(PN)或者肾感染、肾小球基膜(GBM)破坏以及壁基膜(PBM)破坏、白细胞浸润、新月体形成、纤维化、肾小管和肾单位破坏以及塌陷的肾小球。除非得以解决或者进行医学干预，否则这些疾病将由炎症、重复肾脏损伤、纤维化进展为ESRD。巨噬细胞/单核细胞、T细胞和MaC是参与CKD的主要白细胞。调节CKD中这些白细胞亚型的活化、迁移和增殖的一些趋化因子及其关联受体包括MIP-1α/CCR1、ENA-78/CCR5、CXXXC趋化因子/CX3CR1、MIG/IP-10/I-TAC/CXCR3和IL-8/CXCR1/2。正如动物模型和人体研究所证实，巨噬细胞/单核细胞以及MCP-1/CCR2在一些不同类型CKD中的作用是关键的，并且使得这种趋化因子/受体轴是一种引人注目的治疗干预(参见表8)。目前还没有成功治疗CKD所有症状的治疗方法而且很少没有副作用(例如Busauschina et al.，Transplant Proc.，36：229S-233S，2004；Slattery et al.，Am.J.Pathol.，167：395-407，2005；Bir etal.，J.Rheumatol.，33：185-7，2006)。因此，需要不同的治疗CKD的方法，如本发明提供的方法。

c.脊髓损伤(SCI)

脊髓损伤(SCI)的结果是最初的机械和缺血损伤破坏细胞离子平衡状态，随后迅速发生通过活化的白细胞亚型包括小胶质细胞(CNS的居留巨噬细胞)的作用、白细胞炎症介质产生以及强大的炎症级联反应而引起的继发组织损害。这些级联反应在几分钟内即可观测到并且持续几周，随后是内源性修复和再生的一段部分恢复时期。继发损害可通过如下情况检测到，神经元和少突胶质细胞的坏死性和凋亡性细胞死亡、细胞兴奋性毒性、血脑屏障/血脊髓屏障破坏、反应性神经胶质增生(导致神经胶质出现瘢痕)、新血管化、脱髓鞘、感觉和运动功能丧失以及SCI后慢性疼痛(Jones et al.(2005)Curr.Pharm.Des.，11：1223-6；Klussman and Martin-Villalba(2005)J.Mol.Med.，83：657-71；Lee et al.(2000)Neurochem.Int.，36：417-25；McTigueet al.(1998)J.Neurosci.Res.，53：368-76；Carlson et al.(1998)Exp.Neurol.，151：77-88；Bartholdi and Schwab(1997)Eur.J.Neurosci.，9：1422-38；Hainsand Waxman(2006)J.Neurosci.，26：4308-17；Abbadie，Trends Immunol.，26：529-34，2005)。是由最初的物理损伤产生的初级坏死与由白细胞和星形胶质细胞衍生的炎症介质引起的凋亡事件的组合导致SCI中继发组织损害而且该病理学机制与许多CNS创伤和疾病相似，所述创伤与疾病包括例如创伤性脑损伤；卒中；多发性硬化(MS)，阿尔茨海默病和HIV相关痴呆(参见表8)。

SCI中急性炎症损伤持续几天，但是被CNS修复机制覆盖，如部分由于分化的前体少突胶质细胞引起的轴突萌发及有限的髓鞘再形成。已经鉴别MNP(小胶质细胞和巨噬细胞)是修复促进剂。这些细菌吞噬死亡细胞和碎片并且提供有助于CNS修复的基质蛋白生长因子、神经营养因子和细胞因子。MNP在损伤和修复中的双重作用在其它白细胞介导的疾病中也显然如此，所述疾病包括实验性肾小球肾炎、肝损伤；颈动脉损伤以及MS(Duffield et al.(2005)J.Clin.Invest 115：56-65；Duffield(2003)Clin.Sci.104：27-38；Danenberg et al.(2002)Circulation 106：599-605；Raivich andBanati(2004)Brain Res.Brain Res.Rev.46：261-81)。实验性SCI研究已经证实MNP活性的短暂抑制或者后来的治疗的外渗和取消导致了增加的不受影响的组织和改善的行为结果。这部分由于MNP以及也许T细胞的修复活性所致(Jones et al.(2005)Curr.Pharm.Des.，11：1223-36；Gris et al.(2004)J.Neurosci.24：4043-5 1；Wells et al.(2003)Brain 126：1628-37)。实验性SCI早期阶段中PMN或者巨噬细胞的耗竭示出相似的阳性结果(Taoka andOkajima，Prog.Neurobiol.，56：341-58，1998；Popovich et al.(1999)Exp.Neurol.，158：351-365)。趋化因子配体和受体的差异表达参与SCI中继发组织损害的病理学，使得可以使用LPM鉴别靶受体(Glaser et al.(2004)J.Neurosci.Res.，77：701-8；Glaser et al.，(2006)J.Neurosci.Res.84：724-34；Ghirnikar et al.(2000)J.Neurosci.Res.59：63-73；McTigue et al.(1998)J.Neurosci.Res.，53：368-76；Lee et al.，Neurochem.Int.36：417-25，2000)。已知在SCI之后仅需要少数的剩余轴突(10-15％)进行显著的功能性恢复(Jones etal.(2005)Curr.Pharm.Des.，11：1223-36)。因此，急性期中减缓炎症是一种可行治疗方法。根除活化的病理性白细胞是一个途径。

d.超敏感性

超敏感性反应被分为四种(有时是重叠的)主要类型(I-IV)，所有这四种类型均可与免疫介导的组织损伤相关。I型(即发型)超敏感性在暴露于变应原之后几分钟至几小时内发生，包括B细胞产生介导肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱粒的IgE抗体。嗜酸性粒细胞也包含在内。该反应参与许多病症，包括哮喘、特应性皮炎、湿疹、结膜炎和鼻炎。II型(细胞毒性)超敏感性是由于抗体识别细胞表面上的自身或者外来抗原并且通过活化的巨噬细胞和天然杀伤T细胞介导补体依赖性细胞毒性或者抗体依赖性细胞介导的细胞毒性所致。与该反应相关的病症包括Goodpasture’s综合征(肺和肾)以及甲状腺炎。当抗体结合可沉积在组织中的自身或者外来抗原并导致补体活化和炎症(各种白细胞亚型的活化、增殖与浸润)时，III型免疫复合物介导的超敏感性产生。这是一些疾病涉及的传统病理学，所述疾病如肾小球肾炎、脉管炎、系统性红斑狼疮以及关节炎。IV型(迟发型)细胞介导的超敏感性通常在几天后发生而且不是抗体依赖性的。该反应依赖于T细胞、细胞毒性T细胞以及巨噬细胞的不同亚类，其异常破坏与自身或者外来抗原复合的自身靶细胞。嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞也参与这种类型的反应。该反应见于这样的病症，例如接触性皮炎、银屑病、炎性肠病、胰岛素依赖型糖尿病、多发性硬化症以及类风湿性关节炎。所有上述免疫反应均包含受影响组织和器官的白细胞的运输、活化和增殖(参见表8)。

接触性皮炎研究已鉴别了几种负责活化靶细胞的募集的趋化因子轴，包括但不限于IP-10/CXCR3，IL-8/CXCR2，RANTES/CCR5，MCP-1/CCR2，MIP-1α/CCR1和5。对于变应性接触性皮炎、银屑病、特应性湿疹和特应性皮炎已经鉴别了不同的chemoprints。类似地，已经鉴别了参与一些形式的皮肤T细胞淋巴瘤、黑素瘤、硬皮病和系统性硬化症的显著的趋化因子轴。这表明使用精心选择的含有相关趋化因子受体靶向物质的LPM的疗法可用于炎性皮肤病和癌症的治疗中(参见表6)。

e.HIV感染和AIDS以及其它病原体感染

CNS小胶质细胞与浸润巨噬细胞的活化与感染是HIV诱导疾病的发病机制的一个标志。人免疫缺陷病毒(HIV)通过某些受体进入细胞，传统是与特异的趋化因子共同受体相关的CD4受体。CXCR4、CCR2b、CCR3、CCR5、CCR6、CCR8、CX3CR1及其它受体可以在一起以共同受体能力起作用。例如，亲巨噬细胞的HIV-1毒株通常使用CCR5共同受体，而亲T细胞毒株通常使用CXCR4。此外，双亲性病毒可以使用CXCR4和CCR5共同受体进入细胞，而HIV病毒毒株的其它亚型使用多种其它趋化因子共同受体(见Rubbertet al.，HIV Medicine 2006，Chapter 4，Hoffman et al.，eds，Flying Publisher，Paris)。

在HIV脑炎(HIVE)患者中，CXCR-4在MNP、星形胶质细胞和胆碱能神经元亚群上表达，而CCR5主要在MNP上表达。应注意HIVE患者(儿童和成人)中大多数感染的细胞看起来是MNP而且CCR5增加的表达看起来与疾病的严重性相关。这表明MNP介导的事件是重要的，至少在HIVE晚期和严重阶段是重要的。在CNS细菌感染之后以及在缺血性脑损伤的大鼠模型中，CCR5受体也被上调。

细胞因子(例如TNF-α)和趋化因子(例如RANTES、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β)的产生增加与HIV感染相关。HIV中CNS趋化因子增加说明外周白细胞募集和细胞因子释放，其对于神经元和少突胶质细胞具有直接细胞毒性作用(至少在细胞因子TNF-α的情况中)，并且精确反映出在CNS创伤中的经历。一些细胞因子通过激活和/或增加HIV复制也导致HIV疾病的发病机制，所述细胞因子包括GM-CSF、巨噬细胞-CSF、IL-1β、IL2、IL-3、IL-6、TNF-α和TNF-β。

继发损害在HIV-1阳性无症状AIDS前期患者中发生(An et al.(1997)Arch Anat Cytol Pathol 45，94-105)。这些研究人员在50％的无症状患者以及90％显示星型胶质化患者的脑中能检测到HIV-1 DNA。这些患者还具有升高水平的免疫分子和细胞因子，包括TNF-α、IL-1、IL-4和IL-6。神经元损害通过检测凋亡神经元证实。

MNP衍生的兴奋性氨基酸的CCR5共同受体的直接神经毒性和上调参与HIV感染的病理学。在AIDS患者的HIV感染的小胶质细胞中已经检测到可诱导的一氧化氮合酶活性增加。这表明一氧化氮的产生导致神经系统的HIV感染区域中损害的形成。而且，影响CNS的HIV脑病以及前期和完全发作的AIDS的病理学看起来模拟在SCI及其它炎性疾病中观测到的继发组织损害。

也已经发现一些趋化因子和趋化因子受体也是促微生物(promicrobial)因素并且促进感染性疾病(见Pease et al.(1998)Semin Immunol 10：169-178)。病原体利用趋化因子系统。例如，细胞趋化因子受体通过胞内病原体包括HIV用以进入细胞。此外，病毒使用病毒编码的趋化因子受体促进宿主细胞增殖。病原体也暗中破坏趋化因子系统。本领域已知病毒编码的趋化因子拮抗剂和病毒编码的趋化因子清除剂(例如Murphy，Nat Immunol.，2：116-22，2001：Kotwal，Immunol Today，21：242-8，2000)。

f.炎性关节疾病和自身免疫疾病

类风湿性关节炎(RA)是一种炎性自身免疫疾病，特征在于慢性结缔组织损害和骨侵蚀。这种疾病的发病机制包括白细胞浸润进入滑膜腔、活化并且释放炎症介质，最后导致受影响的关节变形和破坏。实际的关节炎反应看起来是当MNP释放促炎细胞因子和趋化因子时起始。发现TNFα、IL-1、IL-6、GM-CSF以及趋化因子IL-8在RA患者的关节组织中富集而且其最可能的来源除了MNP之外还包括滑膜成纤维细胞。MNP、嗜中性粒细胞和T细胞的组合与滑膜成纤维细胞和滑膜细胞的参与组成了炎症级联反应。

IL-1和TNFα被认为与关节炎关节中趋化因子的产生相关。在一项研究中，这两种细胞因子浓度增加诱导分离自RA患者的人滑膜成纤维细胞中IL-8(强力的T细胞化学引诱物)和RANTES(强力的嗜中性粒细胞化学引诱物)表达(Rathanaswami et al.(1993)J Biol Chem 268，5834-9)。其它研究已经表明RA和骨关节炎患者的炎症滑膜组织含有高浓度MCP-1，以及TNFα和IL-1显著增加这种趋化因子在衍生自这些样品的培养的滑膜细胞中的mRNA表达。看起来来自MNP的趋化因子和细胞因子刺激滑膜成纤维细胞和滑膜细胞通过促进外周单核细胞、嗜中性粒细胞和T细胞的募集和渗出而在RA病理学中起作用。与其它疾病和病症一样，活化的白细胞释放许多其它组织损害介质。更特别地，白细胞衍生的活性氧和蛋白酶解酶(例如基质金属蛋白酶、组织蛋白酶和嗜中性粒细胞衍生弹性蛋白酶)参与炎性关节疾病的组织损害的起始和维持(参见表8)。

g.肺病

肺部损伤包括许多临床病症。对于本发明而言，将其统称为炎性肺病(ILD)。ILD典型是特异性损害的结果，例如全身性细菌感染(例如败血症)、创伤(例如缺血-再灌注损伤)以及抗原的吸入(例如毒素样香烟)。ILD还包括变应性肺泡炎、ARDS(急性或者成人呼吸窘迫综合征)、各种形式的哮喘、支气管炎、胶原-血管病、肺结节病、嗜酸性粒细胞肺病、肺炎以及肺纤维化。简而言之，这些疾病和病症的病理学涉及巨噬细胞、特别是位于肺泡中的那些的活化。嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和T细胞被激活并且募集至受损部位，随后释放巨噬细胞及邻近的内皮细胞和上皮细胞衍生的细胞因子和趋化因子。所述特异性细胞因子和趋化因子包括GM-CSF、TNF-α、IL-1、IL-3、IL-5、IL-8、MCP-1、MCP-3、MIP-1α、RANTES和Eotaxin。

白细胞通过释放继发组织损害的多种介质(包括蛋白酶、活性氧和生物活性脂质)以及通过表达细胞表面抗原和细胞粘附分子而应答促炎细胞因子和趋化因子。此外，看起来所述特异性白细胞群在一些ILD中比在其它疾病中发挥更显著的作用。嗜中性粒细胞和MNP在急性肺损伤如ARDS和各种肺纤维化中是导致继发损害的更主要因素；而T细胞和嗜酸性粒细胞在嗜酸性粒细胞肺病中是主要因素，所述疾病包括变应性哮喘、纤维性肺泡炎以及结节病(参见表8)。

h.由继发组织损害介导的其它疾病

与继发组织损害相关的疾病状态可以根据本发明提供的方法及使用本发明提供的缀合物以及本领域技术人员已知的治疗其它病症的某些非趋化因子细胞因子进行治疗。这些疾病状态包括但不限于CNS损伤、CNS炎性疾病、神经变性疾病、心脏病、炎性眼病、炎性肠病、炎性关节疾病、炎性肾病、炎性肺病、炎性鼻病、炎性甲状腺疾病、细胞因子调节的癌症及涉及或者与继发组织损害相关的其它疾病状态。

可以使用本发明提供的方法和缀合物治疗的举例的CNS炎性疾病和/或神经变性疾病包括但不限于卒中、闭合性头部损伤、白质脑病、脉络丛脑膜炎、脑膜炎、肾上腺脑白质营养不良、AIDS痴呆综合征、阿尔茨海默病、唐氏综合征、慢性疲劳症候群、脑炎、脑脊髓炎、海绵状脑病、多发性硬化症、帕金森氏病、脊髓损伤/创伤(SCI)以及创伤性脑损伤；可以使用本发明提供的方法治疗的心脏病包括但不限于动脉粥样硬化、新生内膜增生和再狭窄；可以使用本发明提供的方法和缀合物治疗的炎性眼病包括但不限于增生性糖尿病视网膜病变、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜炎、巩膜炎、巩膜虹膜炎、脉络膜炎以及葡萄膜炎。可以使用本发明提供的缀合物和方法治疗的举例的炎性皮肤病包括但不限于银屑病、湿疹和皮炎。

可以使用本发明提供的方法和缀合物治疗的举例的炎性肠病包括但不限于慢性结肠炎、Crohn’s病以及溃疡性结肠炎。可以使用本发明提供的方法和缀合物治疗的举例的炎性关节疾病包括但不限于幼年类风湿性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、脊椎关节病变如强直性脊柱炎、Reiter’s综合征、活动型关节炎、银屑病关节炎、脊柱炎、未分化的脊椎关节病变和Behcet’s综合征；可以使用本发明提供的方法和缀合物治疗的举例的炎性肾病包括但不限于肾小球肾炎、狼疮肾炎和IgA肾病。可以使用本发明提供的方法和缀合物治疗的举例的炎性肺病包括但不限于嗜酸性粒细胞肺病、慢性嗜酸性粒细胞肺炎、纤维化肺病、急性嗜酸性粒细胞肺炎、支气管狭窄，包括哮喘、支气管肺发育异常、支气管肺泡嗜酸粒细胞增多症、变应性支气管肺曲霉病、肺炎、急性呼吸窘迫综合征以及慢性阻塞性肺病(COPD)；可以使用本发明提供的方法和缀合物治疗的举例的炎性鼻病包括但不限于息肉病、鼻炎、鼻窦炎；可以使用本发明提供的方法和缀合物治疗的举例的炎性甲状腺疾病包括但不限于甲状腺炎；可以使用本发明提供的方法治疗的举例的细胞因子调节的癌症包括但不限于神经胶质瘤、粥样斑癌(atheromas carcinomas)、腺癌、肉芽肿、成胶质细胞瘤、肉芽肿病、淋巴瘤、白血病、黑素瘤、肺癌、骨髓瘤、肉瘤、结节病、小神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、Hodgkins病以及乳腺癌和前列腺癌。对于使用本发明提供的方法和缀合物治疗敏感的其它炎性疾病包括但不限于脉管炎、自身免疫性糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病、移植物抗宿主病(GVHD)、银屑病、系统性红斑狼疮、败血症、全身炎症反应综合征(SIRS)以及由于烧伤引起的有害炎症。

如上所述，这些失调尽管不同，但是呈现出与炎症反应相关的共同特征。可以通过给需要治疗的对象施用有效量的如本文所述的治疗剂进行治疗的脊髓损伤或者创伤是本发明包含的一个举例的失调。本发明的治疗设计为攻击这种反应的不利结果，包括白细胞的增殖和迁移。所述治疗将消除或者降低白细胞增殖和迁移，由此改善症状、减少不利事件或者可以增强其它治疗效力的其它有益结果。

5.组合治疗

所述配体-毒素缀合物如本发明提供的任何LPM可组合用于治疗指定疾病。组合治疗可以通过施用配体-毒素缀合物以及任何其它治疗剂治疗特定疾病而实现。这种治疗剂为本领域技术人员所已知。组合治疗也可以通过使用由两或多种如附着于毒素部分任一端的两种不同的趋化因子组成的分子而实现。在这种情况中，这些双重趋化因子融合体可包括来自α和β每个趋化因子家族的一个配体。

L.实施例

下述实施例仅是举例目的，不试图限制本发明的范围。

实施例1

选择修饰的志贺毒素A1(SA1)变体以构建LPM

A.克隆及表达LPM以选择SA1变体

设计了编码MCP-1/志贺毒素融合蛋白(称为LMP1a)的核酸分子以便融合蛋白以甲硫氨酸(Met)残基起始，后接成熟MCP-1的公布序列(如SEQID NO：69所示，并由SEQ ID NO：68所示核苷酸序列编码)，Ala-Met接头(SEQ ID NO：34)和含有核糖体失活(RIP)结构域的志贺-A1毒素亚基的残基23-268(本文称作变体1 SA1；相应于SEQ ID NO：22并由SEQ ID NO：23所示核酸序列编码)。为了促进该基因序列转移并置换进不同的表达载体，在基因序列的3’和5’末端掺入了限制性内切酶位点。LPM1a的序列被设计具有NdeI限制位点，其在5’末端含有甲硫氨酸起始密码子(SEQ ID NO：31)，并且还被设计为在3’末端具有终止密码子后接BamHI限制位点(SEQ IDNO：33)。编码LPM1a的核酸分子根据DNA合成服务组织(Blue HeronBiotechnology，Seattle WA)的密码子使用及二级结构优化原则而合成并供应在除去了多克隆位点的pUC质粒(pUC minus M，SEQ ID NO：86)中。LPM1a核酸分子及编码的融合蛋白的序列分别如SEQ ID No：37和38所示。

由于LMP1a融合蛋白所含的SA1的变体1序列含有相应于SEQ ID NO：22的氨基酸242的半胱氨酸残基，产生了进一步截短的SA1部分以避免在高度纯化的LMP融合蛋白之间的半胱氨酸诱导的二聚化。这一SA1部分(称为变体2)缺少相应于SEQ ID NO：22所示多肽序列的氨基酸242-246的5个C末端氨基酸(CHHHA)。变体2 SA1的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，并由SEQ ID NO：25所示核酸序列编码。产生了含有变体2 SA1部分的MCP-1融合蛋白，命名为LPM1b。如以上针对LPM1a融合蛋白所述合成并供应编码含有变体2 SA1序列的LPM1b融合蛋白(MCP-1-AM-SA1(变体2))的核酸序列。LPM1b核酸分子及编码的融合蛋白的序列分别如SEQID No：39和40所示。

得到的在pUC minus M载体中的LMP1a及LMP1b构建体用NdeI和BamHI消化以产生～1Kb NdeI/BamHI片段，该片段被克隆到T7表达载体pET9c(Novagen，SEQ ID NO：84)的相应NdeI/BamHI位点。含有LPM1 a的pET9c质粒根据厂商指导(Novagen)被转化进表达宿主菌株HMS174(DE3)pLyS(F^- recA1 hsdR(r_K12 ^-m_K12 ⁺)(DE3)pLysS(Cam^R，Rif^R)。含有LPM1b的pET9c质粒根据厂商指导(Novagen)被转化进表达宿主菌株HMS174(DE3)(F^-recA1 hsdR(r_K12 ^-m_K12 ⁺)(DE3)(Rif^R)。

B.突变体选择

LPM1a及LPM1b产生含有SA1 RIP毒素部分的融合蛋白，如上述A部分所述。SA1部分的表达对于宿主细胞是有毒的并破坏LPM融合蛋白的产生。为了选择显示较低毒性的SA1的突变体，使用含有LPM1a或LPM1b的pET9c质粒构建体在存在或不存在变化浓度的4APP(4-氨基吡唑并[3，4-d]-嘧啶)的条件下进行突变选择。在含有LPM构建体的pET9c如A部分所述转化进合适的宿主菌株中之后，在存在或不存在变化浓度的4APP的条件下在50μg/ml的LB卡那霉素(km)上选择转化的细菌。下述结果基于在不存在4APP条件下在50μg/ml的卡那霉素(km)LB上对LPM1a转化的细菌细胞的选择以及在存在0.5mM 4APP条件下在50μg/ml的卡那霉素(km)LB上对LPM1b转化的细菌细胞的选择。

1.LPM1a突变体

用含有LPM1a的pET9c质粒构建体在不存在4APP下转化HMS174(DE3)pLyS宿主细胞产生82个转化体。筛选了所有82个选择菌落的LPM1a表达及质粒完整性。用标准微量制备程序从细菌转化体中分离了质粒DNA。全长蛋白质的表达经SDS-PAGE证实。来自pET9c质粒的LPM1a插入序列被纯化后用NdeI/BamHI消化，用T7引物及T7t引物测序插入序列以证实序列。T7：5’TAA，TAC，GAC，TCA，CTA，TAG，GG 3’(SEQ IDNO：35)；T7t：5’GCT，AGT，TAT，TGC，TCA，GCG 3’(SEQ ID NO：36)。

极少数菌落表达LPM1。一些选择的菌落表达截短形式的LPM1。一个菌落表达这样的LPM1，其与SEQ ID NO：38所示的LPM1a序列相比含有在融合蛋白的SA1部分的位置11 7中的L至R的突变(相应于在SEQ IDNO：22所示变体1 SA1部分的氨基酸序列中的L38R)。这一突变体LPM1本文中称为LPM1c。LPM1c的核苷酸及氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：41和42，并可以与SEQ ID NO：37和38所示的亲代LPM1a分子相比较。SA1中的L38R突变在本文中称为突变体变体1(在本文中也称为变体3)并示于SEQ ID NO：26，并由具有SEQ ID NO：27所示序列的核酸编码。

2.LPM1b突变体

用含有LPM1b的pET9c质粒构建体在存在0.5mM 4APP下转化HMS174(DE3)宿主细胞产生10个转化体。如以上针对LPM1a突变体所述选择所有10个转化体，进行质粒DNA制备及分析。

两个选择的菌落表达这样的LPM1，其与SEQ ID NO：40所示的亲代LPM1b序列相比含有在位置298在SA1部分中的V突变为A(相应于分别示于SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24的变体1和变体2 SA1部分的氨基酸序列中的V219A)。这一突变体LPM1在本文中称为LPM1d。LPM1d的核苷酸及氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：43和44，并可以与SEQ ID NO：39和40所示的亲代LPM1b序列相比较。SA1中的该V21 9A突变在本文中称为突变体变体2(在本文中也称为变体4)并示于SEQ ID NO：28，并由具有SEQ ID NO：29所示序列的核酸编码。

实施例2

变体LPM1活性的比较

SA1中的突变对LPM1活性的影响通过在兔网织红细胞裂解物(RIP)分析中测量LPM1c(含有变体3 SA1序列)及LPM1d(含有变体4 SA1序列)的活性而评估。LPM1c和LPM1d蛋白被表达及部分纯化(见实施例4)。这些蛋白质的活性用可商购的设计用于分析萤光素酶RNA的翻译的兔网织红细胞裂解物系统(即RIP分析)(Promega，Madison，WI；包括所有试剂)测量蛋白质合成的抑制而评估。简而言之，将蛋白质样品稀释至1μg/ml并在含有1mg/ml BSA的PBS，pH7.4中以10倍步骤系列稀释。稀释的蛋白质(1 0μl)加入到5μl反应混合物(反应混合物：2μl的1mg/ml萤光素酶RNA溶液；1μl的1∶1比率的0.1mM无甲硫氨酸氨基酸混合物和无赖氨酸的氨基酸混合物；2μl的核糖核酸酶抑制剂)及35μl兔网织红细胞裂解物。样品在30℃保温1.5小时，之后通过在冰上保温样品而终止反应。用上述反应混合物1∶25稀释样品。将反应混合物(100μl)转移到96孔白色聚苯乙烯平板(Corning Corporation，NY)并向每个反应中加入100μl发光染料Bright-Glo(Promega)。平板用预热的(20-25℃)FLUOstar光度计(BMG LabTechnologies，Durham，NC)分析。平行地，使用仅反应混合物或试剂空白作为阴性对照，RIP蛋白肥皂草毒蛋白(Sigma，St.Louis，MO)用作阳性对照。肥皂草毒蛋白阳性对照持续具有8-12pM范围的相对活性(RIC₅₀)值。志贺全毒素具有9pM的报道RIC₅₀值(Skinner and Jackson(1997)J.Bacteriol.179：1368-174)。纯化的变体4 SA1亚基(SEQ ID NO：28)具有50pM的RIC₅₀值。LPM1c(SEQ ID NO：42)及LPM1d(SEQ ID NO：44)分别具有5nM和80-100pM的RIC₅₀值。基于观测的所测试突变体变体的RIP活性，如以下实施例3所述构建了含有来自LPM1d的SA1序列(其是突变体变体2(即变体4)SA1)的新LPM。

实施例3

含有SA1变体4的LPM基因的构建

构建了LPM 2-13(表12)以编码融合蛋白，所述融合蛋白由各趋化因子序列通过丙氨酸-甲硫氨酸二肽与成熟SA1志贺毒素亚基的突变体变体2(即变体4)截短版本(如SEQ ID NO：28所示)连接而成。编码LPM 2-13的序列通过下述两种不同方法插入到pET9c质粒(SEQ ID NO：84)中。每种方法均依赖于在SA1志贺毒素亚基序列的5’序列内存在的内部EcoRI限制位点(例如相应于SEQ ID NO：23所示变体1序列或SEQ ID NO：29所示变体4序列的核苷酸4-9)，产生缺少5’赖氨酸残基的SA1部分，其通过设计含有相邻于EcoRI限制位点的编码赖氨酸的趋化因子接头部分而重构。所有用于质粒操作的方案均来自Maniatis et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1982).

表12：LPM变体

LPM	趋化因子	SA1变体	SEQ ID NO(核苷酸)	SEQ ID NO(氨基酸)
					LPM1a	MCP-1	1	37	38
LPM1b	MCP-1	2	39	40
					LPM1c	MCP-1	3	41	42
LPM1d	MCP-1	4	43	44
					LPM2	Eotaxin-1	4	45	46
LPM3	SDF-1β	4	47	48
					LPM4	GRO-α	4	49	50
LPM5	MIP-1β	4	51	52
					LPM6	IL-8	4	53	54
LPM7	IP-10	4	55	56
					LPM8	MCP-3	4	57	58
LPM9	MIP-3α	4	59	60
					LPM10	MDC	4	61	62
LPM11	MIP-1α	4	63	64
					LPM12	Eotaxin-1	4	65	46
LPM13	BCA-1	4	66	67

简而言之，用于构建LPM 2-13(表12)的编码趋化因子的核酸分子的序列根据密码子使用及二级结构优化原理由DNA合成服务组织(Bio S&T，Montreal)合成并供应在pUC质粒(pUC19，SEQ ID NO：85)中。对于每种趋化因子基因，向5’末端加入含有甲硫氨酸起始密码子的NdeI限制位点(SEQID NO：31)并向3’末端加入编码氨基酸Ala-Met-Lys后接EcoRI位点的接头序列(SEQ ID NO：32)。每种趋化因子构建体的核苷酸序列见表13并如SEQID NO：72-83所示。第二个eotaxin序列由Blue Heron Biotechnology优化并供应并如SEQ ID NO：82所示。编码趋化因子的每种核酸分子用于经下述两种克隆方法之一产生LPM融合蛋白。

表13：用于LPM 2-13的趋化因子构建体的序列成分的核苷酸位置

LPM	趋化因子构建体	SEQ IDNO：	NdeI I限制位点	成熟趋化因子	接头序列	EcoRI位点
							2	Eotaxin	72	1-6	7-228	229-237	238-243
3	SDF-1β	73	1-6	7-222	223-231	232-237
							4	GRO-α	74	1-6	7-225	226-234	235-240
5	MIP-1β	75	1-6	7-213	214-222	223-228

LPM	趋化因子构建体	SEQ IDNO：	NdeI I限制位点	成熟趋化因子	接头序列	EcoRI位点
							6	IL-8	76	1-6	7-237	238-246	247-252
7	IP-10	77	1-6	7-237	238-246	247-252
							8	MCP-3	78	1-6	7-234	235-243	244-249
9	MIP-3α	79	1-6	7-216	217-225	226-231
							10	MDC	80	1-6	7-213	214-222	223-228
11	MIP-1α	81	1-6	7-213	214-222	223-228
							12	Eotaxin	82	1-6	7-228	229-237	238-243
13	BCA-1	83	1-6	7-267	268-276	277-282

A.克隆方法1

LPM 4-10，LPM12及LPM13的成分(见表13)被组装进pUC19质粒(SEQ ID NO：85)，然后亚克隆进pET9c载体。简而言之，通过用EcoRI和BamHI消化含有LPM1d的pET9c载体(见实施例1)获得含有SA1变体4基因的750bp EcoRI/BamHI DNA片段而产生SA1变体4成分。消化的片段凝胶纯化并插入到也在相应的EcoRI/BamHI位点被切割的pUC19质粒中以产生pUC19BB质粒。LPM 4-10，LPM12及LPM13的趋化因子序列成分如下产生：用NdeI和EcoRI消化如上所述的含有各趋化因子的pUC19质粒以获得针对每种趋化因子的～250bp NdeI/EcoRI DNA片段。为了产生完整的LPM序列(见表12)，消化的趋化因子片段凝胶纯化并插入已在相应的NdeI和EcoRI限制位点消化的含有SA1变体4序列的pUC19BB质粒中。含有完整的LPM基因序列的pUC19BB然后用NdeI和BamHI消化以获得～1kb片段，其被凝胶纯化并亚克隆进已用NdeI和BamHI消化的pET9c质粒(SEQ ID NO：84)中。证实质粒表达各LPM并测序证实插入序列。上表12示出了克隆的LPM变体LPM 4-10，LPM12和LPM13的各自核酸及编码的氨基酸的序列标识符。

B.克隆方法2

为产生LPM 2，3及11(见表12)，用本文所述方法直接将各自趋化因子基因插入到pET9c表达质粒(SEQ ID NO：84)中。首先，为防止在后续克隆步骤中载体的消化，从pET9c质粒除去EcoRI位点以产生载体pET9DE。简而言之，pET9c质粒用EcoRI消化并且末端用T4DNA聚合酶填充。连接质粒DNA，产生pET9DE载体并转化进DH5α大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。质粒DNA用标准微量制备程序分离自细菌转化体并用限制消化证实了pET9DE载体中EcoRI位点的缺失。

为了克隆编码LPM 2、3和11的基因，来自上述克隆方法1的含有完整LPM1d基因的序列的pUC19BB用NdeI和BamHI消化以产生1kb片段。该片段凝胶纯化并亚克隆进已用NdeI和BamHI消化的pET9DE载体以产生pET9DE-BB质粒。LPM 2、3和11的趋化因子序列成分如下产生：用NdeI和EcoRI消化如上所述的含有各趋化因子的pUC19质粒以获得针对每种趋化因子的～250bp NdeI/EcoRI DNA片段。为了产生完整的LPM序列(见表12)，消化的片段凝胶纯化并插入已在相应NdeI/EcoRI位点消化的pET9DE-BB质粒中。上表12示出了克隆的LPM变体LPM 2、3和11的各自核酸及编码的氨基酸的序列标识符。

实施例4

LPM变体的表达及纯化

A.LPM变体的表达

用pET9c/LPM质粒转化HMS174(DE3)后，通过使转化体在含有50μg/ml卡那霉素和2mM 4APP的MTB培养基(含有24g/L酵母提取物、12g/L胰胨和0.4％甘油的1xM9培养基)中于37℃生长过夜而测试RIP抑制剂4APP对不同LPM的表达的作用。在用IPTG诱导各自LMP之前，细胞在相同培养基中传代培养(1∶10稀释)并在37℃生长额外3小时。通过在存在或不存在1mM IPTG及在存在增加浓度的4APP(例如0，0.1，2，5，10，15和20mM 4APP)下在相同温度诱导额外3.5小时而诱导细胞。从细胞收获含有LPM融合蛋白的包含体(见下述方法)。在IPTG存在下诱导时，具有希望的表达谱的菌株显示～36kD表达带，呈4APP剂量应答方式。用抗SA1抗体经Western印迹验证蛋白质。抗SA1亚基的抗体在兔中针对SA1合成肽(SEQ ID NO：30)产生(Covance Research Laboratories，Denver PA)并收集血清。

表14示出LPM缀合物LPM1d，LPM8，LPM3，LPM6或LPM7的相对表达。在从细胞表达和收获LPM融合蛋白后，蛋白质在SDS-PAGE凝胶上分离并用考马斯蓝染色显示总蛋白。伴随4-APP剂量曲线的表达百分比通过上样自每种相同摇瓶发酵相同制备的样品而估计(0.1至20mM 4-APP)。任何给定的LPM的100％表达基于在给定浓度4-APP在凝胶上见到蛋白质水平不再增加。表达百分比通过目视比较指定的100％表达与具有较低表达和发酵液中较低4-APP的样品的泳道而估计。实验至少进行2次。通常，表达水平从在0.1mM 4APP极少或无可检测量的希望的蛋白质增加到在10-20mM 4APP的高水平。

B.蛋白质产生

开发了分批发酵方法用于LPM产生。携带具有选择的SA1变体的pET9c/LPM质粒的宿主细胞(HMS174(DE3))在37℃于2mM 4APP存在下在液体富集培养基中生长(5-100L于发酵罐中或400ml于2.8L摇瓶中)。蛋白质表达用1mM IPTG在10mM 4 APP存在下诱导3-6小时，离心收获细胞。均质细胞沉淀(经超声或通过匀浆器3-4次)，随后除去碎片并离心回收包含体(Ib)。Ib用若干体积的dH₂O洗2-3次。Ib在含有6M盐酸胍的缓冲液中溶解，离心，上清对8M脲透析。发酵罐或摇瓶的典型起始LPM收率估计分别为～1g/L(OD_600nm～50)和300mg/L(OD_600nm～7)。600nm的光密度(OD)是使用Ultraspec Pro分光光度计对大肠杆菌密度的测量。用0.1％(v/v)聚乙烯亚胺从IB溶液除去核酸。离心后，通过用阴离子交换树脂滤膜或柱(Q-sepharose-FF)除去额外的DNA，所述滤膜或柱结合残余DNA并使得具有高等电点的蛋白质如LPM通过。蛋白质产物经阳离子交换树脂层析(S-sepharose-FF或HP)捕获并用NaCl梯度在脲存在下洗脱。来自这个柱的流经级分含有少量的游离SA1毒素部分。收集整个NaCl梯度的蛋白质级分并经SDS-PAGE分析。然后合并含有LPM的级分。通过对25mM Tris-HCL，1M脲，0.5M L-精氨酸，1mM还原型谷胱甘肽和0.1mM氧化型谷胱甘肽pH8.0透析16-24小时进行产物的重折叠。重折叠的材料然后透析进配制缓冲液(50mM柠檬酸钠，0.05mM EDTA，和20％蔗糖)并储存在-80℃。这一材料用SDS-PAGE评估是超过80％纯的并用阳离子交换或疏水相互作用层析进一步纯化以作为配制前的精制步骤。另一种方法采用相同的初始步骤但是来自初始阴离子交换的产物通过稀释进25mM磷酸钠，1M脲，200mM L-精氨酸，20％(w/v)蔗糖，1mM还原型谷胱甘肽和0.1mM氧化型谷胱甘肽pH8.0、16-24小时而立即重折叠。重折叠的材料然后进行阳离子交换，随后疏水相互作用层析，之后透析进上述配制缓冲液中。

实施例5

基于细胞的细胞毒性测定

LPM1d和LPM12的细胞毒性在基于细胞的细胞毒性测定中测量。在此测定中，细胞在存在或不存在毒素(即含有SA1部分的LPM蛋白)时生长一段时间。细胞裂解时培养物中的ATP量作为细胞存活性的可测量指示剂。

A.细胞培养及样品添加

THP-1单核细胞根据厂商指导(ATCC，Manassas，VA)在含有补加10％FBS的RPMI培养基的完全培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生长并每周传代2次以保证细胞密度低于5x10⁵细胞/mL。离心收集细胞并用新鲜的温培养基洗涤并重悬于合适体积的培养基中以达到密度为3-4x10⁴细胞/ml以用于基于细胞的细胞毒性测定。细胞接种是将100μL等份的细胞悬液转移进96孔细胞培养板的内部60个孔中的每个中(外部孔仅填充完全培养基)。20μl的运载体(仅缓冲液)及LPM1d或LPM12蛋白质样品(浓度范围为25μg/ml至100μg/ml)一式三份加入到孔中并与细胞温和混合。然后在37℃保温细胞24小时(5％CO₂)。

B.基于细胞的细胞毒性的评估

使用CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay Kit(Promega，Madison WI)(根据厂商指导)测定细胞存活性以作为基于细胞的细胞毒性的测量。在用ATP反应混合物(由厂商以CellTiter-

Reagent供应)裂解细胞时，ATP驱动萤光素氧化产生发光信号，其与孔中ATP浓度成比例。这与培养物中存活细胞数直接成比例。将来自上述A部分的THP-1细胞板的100μL等份转移至白色平底培养板(Corning Corporation，NY)中以进行发光测量，并在添加100μL ATP反应混合物之前平衡30分钟。添加ATP反应混合物后，用涡旋机温和振荡板内容物30秒以诱导细胞裂解并在室温保温10分钟以稳定发光信号。用FLUOstar光度计(BMG Lab Technologies，Durham，NC)测量发光。对每种含LMP蛋白的运载体制备匹配的对照孔(仅缓冲液)。取三份平均值并从所有测试的条件中减去背景发光。在LPM融合蛋白存在下的ATP含量以匹配对照存在下ATP含量(设为100％)的百分比显示。LPM1d及LPM12在基于细胞的细胞毒性测定中进行了测试，结果分别见表15和16。结果显示ATP含量在增加浓度的LPM1d存在下剂量依赖性地降低，显示LPM1d对于THP-1细胞是毒性的。LPM12对于THP-1细胞也是毒性的，但是仅在33μg/ml或更高浓度并且在这些细胞上未观察到LPM12的剂量依赖性作用。LPM12(含有eotaxin趋化因子的融合蛋白)的观察到的作用可能是由于THP-1细胞上缺少eotaxin受体CCR3的表达以及在THP-1细胞上存在MCP-1受体CCR2所致，eotaxin在高浓度结合MCP-1受体CCR2(Ogilvie et al.，(2001)Blood 97：1920-1924).

表15：LPM1d对THP-1细胞的细胞毒性

LMP浓度	匹配对照(仅缓冲液)ATP含量的百分比
		0μg/ml	100％
25μg/ml	96.02％
		35μg/ml	63.52％
50μg/ml	52.23％
		75μg/ml	38.83％
100μg/ml	26.47％

表16：LPM12对THP-1细胞的细胞毒性

LMP浓度	匹配对照(仅缓冲液)ATP含量的百分比
		0μg/ml	100％
25μg/ml	127.87％
		35μg/ml	56.01％
50μg/ml	81.36％
		75μg/ml	55.22％
100μg/ml	61.88％

实施例6

LPM1d在大鼠抗胸腺细胞血清(ATS)诱导系膜增生性肾小球肾炎中的活性

下述实施例证实LPM治疗对大鼠抗胸腺细胞血清(ATS)诱导系膜增生性肾小球肾炎的进展的作用。

A.ATS注射及LPM1d治疗

评估了LPM1d治疗对大鼠ATS诱导系膜增生性肾小球肾炎的进展的作用。称重24只大鼠并置于代谢笼中24小时以收集基础尿。记录尿体积，用标准程序加工尿液并定量肌酸酐和蛋白质。麻醉大鼠，从边缘尾静脉取0.5-1.0ml血液。凝固血液，保留血清用标准程序测量血尿素氮(BUN)、肌酸酐和胆固醇。在第0天给大鼠注射20mg/100g体重的抗胸腺细胞(Thy1)IgG级分(Probotex，San Antonio，TX)并在恢复后回到笼子中。每天监测大鼠并记录体重及健康状态。大鼠分为3组，每组8只：两组每隔1天(第2、4、6及8天)分别注射50或100μg/kg的LPM1d，第3组仅注射运载体(含有0.05mM EDTA的50mM柠檬酸钠缓冲液pH6.2)作为疾病对照组，起自抗体施用后的第2天。在第4天，大鼠返回代谢笼用于收集中点尿。在接下来的那天从尾静脉获得血液以收集中点血清。在第8天大鼠再被置于代谢笼中用于终点24小时尿收集。动物在整个实验中是健康的。LPM治疗组的肾小球滤过率(通过尿肌酸酐清除而测量)通常与对照没有差别，仅在第5天和第9天在高剂量动物中观察到稍有增加。BUN和胆固醇水平在所有动物中均在正常范围。尿蛋白在研究的中点被确定(24h尿收集第4-5天)。发现低剂量和高剂量治疗大鼠的尿蛋白与对照相比分别降低34％和39％，表示LPM1d对肾功能具有保护作用。

B.组织学分析

第9天，处死所有大鼠，收集血液，加工肾以用于组织学。来自这一实验的肾皮质切成2-3mm冠状切片，在液氮中闪冻，置于福尔马林中或置于methacarn中在4℃固定过夜。

1.纤维变性过程标记的免疫组织化学染色

冷冻切片用针对纤连蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)(分别为cloneIST-9，Serotec，Harlan Bioproducts for Science，Indianapolis，IN和clone 1A4from Sigma，St.Louis MO)的抗体处理。纤连蛋白是胞外基质(ECM)沉积和合成的标记，α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是经历表型变化的细胞过多的系膜细胞的标记，其是ECM沉积的前奏。纤连蛋白和α-SMA的表达是纤维变性过程的指示。对于染色α-SMA或纤连蛋白，结果以0-4等级显示，其分别代表零、轻度、中度、高度和重度染色。表17示出用α-SMA染色冷冻切片的结果，是组中所有4只大鼠的平均(AV)评分。结果显示在增加浓度的LPM1d存在下α-SMA的表达降低。因此，在LPM1d处理的肾中系膜细胞活化降低。

表17：冷冻肾切片中α-SMA水平

治疗	AV评分组1	AV评分组2
			运载体	2.18	2.10
50μg/kg LPM1d	1.76	2.08
			100μg/kg LPM1d	1.69	1.30

表18示出了在用LPM1d治疗大鼠时冷冻肾切片的纤连蛋白染色结果。结果显示免疫组织化学染色的纤连蛋白表达降低，特别是在高浓度LPM1d(100μg/kg)时。因此，在LPM1d治疗肾中ECM沉积降低。

表18：冷冻肾切片中的纤连蛋白水平

治疗	AV评分组1	AV评分组2
			运载体	1.86	1.98
50μg/kg LPM1d	1.48	2.0
			100μg/kg LPM1d	1.49	1.43

2.肾损害的苏木精和曙红染色(H&E)

福尔马林处理的样品被加工用于肾损害的苏木精和曙红染色(H&E)评估。冷冻切片的H&E染色使得可以观察和全局评估肾损害及肾小球完整性及结构，其以0-4等级评分，从正常外观至严重损伤。结果(表19)示出在LPM1d存在下在α-Thy1治疗的大鼠肾中肾损害的存在降低。在用100μg/Kg LPM1d治疗的大鼠组中未观察到明显损害(即相当于评分为1.44)。因此，在LPM1d治疗肾中的肾损害及结构损伤降低。

表19：冷冻肾切片中肾损害的H&E染色

治疗	平均评分(n＝4)
		运载体	2.4
50μg/kg LPM1d	2.25
		100μg/kg LPM1d	1.44

3.增殖细胞的免疫组织化学染色

Methacarn处理的样品用于用ED-1抗体(Chemicon Corporation，Temecula，CA)的巨噬细胞数的免疫组织化学评估。在这一模型中，巨噬细胞数在大约第5天达到峰值。为评估ED-1阳性巨噬细胞，在第9天对来自25个肾小球的巨噬细胞(即ED-1阳性细胞)的总数进行计数。结果示于表20，作为一组中4只大鼠的每一只的计数的巨噬细胞的原始数。结果显示在LPM1d治疗的肾中存在的巨噬细胞降低。

表20：在第9天肾小球中的巨噬细胞数

治疗	每只动物的原始#
		运载体	109，100，120，110
50μg/kg LPM1d	79，71，63，90
		100μg/kg LPM1d	62，71，68，87

实施例7

LPM1c及LPM1d在小鼠迟发型超敏反应模型中的活性

下述实施例证实LPM1c及LPM1d治疗在小鼠耳中对噁唑酮的炎症应答程度的作用。

在通过施用抗原噁唑酮而诱导的小鼠迟发型超敏反应模型(MDTH)中评估了LPM蛋白对基于细胞的免疫应答的作用。评估了LPM1c及LPM1d治疗在小鼠耳中对噁唑酮的炎症应答程度的作用。56只重～20-25克的雌性Balb/c小鼠分为7个治疗组，如表21所示。通过将抗原溶液加到身体上的剃毛区而在第7天和第6天将小鼠对2％噁唑酮(Sigma，St.Louis，MO)敏化。第0天，小鼠用直接施加至双耳的2％噁唑酮攻击。在第0天和第1天，小鼠用LPM1c(100μg/kg)，LPM1d(10μg/kg或25μg/kg)，地塞米松(抗炎皮质类固醇，0.2mg/kg(Vedco Inc，St.Joseph，MO)或运载体对照治疗。

表21：MDTH治疗组

组	治疗(n＝8)
		1	未敏化，攻击+运载体
2	敏化，攻击+运载体
		3	敏化，攻击+LMP1c 100μg/kg
4	敏化，攻击+LPM1d 25μg/kg
		5	敏化，攻击+LPM1d 10μg/kg
6	敏化，攻击+地塞米松0.2mg/kg
		7	未攻击

为评估对噁唑酮的炎症应答程度及比较表21列出的治疗作用，测量了耳厚度及总重量。小鼠的双耳在攻击前、在攻击后24小时及在研究结束时(攻击后48小时)用卡尺测量。另外，在研究结束时取下耳朵并称重。

确定了以克表示的最终耳重量的平均值/-标准误差。用二尾t检验分析结果的统计学显著性，所有LPM治疗与运载体治疗的/敏化的/攻击组(表18中的组2)在耳宽度方面均是统计学显著的(^*p＜0.05)相对降低，与阳性对照地塞米松治疗组一样。计算了每组的相对于运载体治疗的/敏化的/攻击组的耳宽度降低百分比。降低百分比如下式计算：1-[(治疗组-阴性对照)/(阳性对照-阴性对照)]x 100％。结果见表22。在LPM1c(组3)和LPM1d(组4和组5)治疗组中的耳厚度测量与地塞米松(组6)治疗组中类似降低(29％)。

表22：LPM治疗对MDTH中耳重量的作用

治疗组	相对于运载体/敏化攻击的组2的耳重量降低百分比
		组1：未敏化，攻击+运载体	74％
组2：敏化，攻击+运载体	0％
		组3：敏化，攻击+LMP1c 100μg/kg	20％
组4：敏化，攻击+LPM1d 25μg/kg	29％
		组5：敏化，攻击+LPM1d 10μg/kg	22％
组6：敏化，攻击+地塞米松0.2mg/kg	28％
		组7：未攻击	100％

实施例8

LPM1d在脊髓损伤模型中的活性

A.脊髓损伤及LPM施用

设计了脊髓损伤(SCI)模型实验，其中LPM1d仅在损伤后头1-3天施用以定量巨噬细胞和嗜中性粒细胞群中的降低。简而言之，脊髓损伤如下诱导：6-8周龄CD-1成年小鼠(Charles River Laboratories，Montreal，Quebec，Canada)分别用氯胺酮-赛拉嗪混合物(85mg/kg和15mg/kg，腹膜内(I.P.))麻醉并进行中等(60kdyne)T9/10挫伤脊髓损伤(SCI)(Infinite HorizonsImpactor，Precision Systems Instrumentation，Kentucky，USA)。损伤已在啮齿类中良好鉴定并以可重复方式产生中度损害，模拟人SCI的病理学(见例如Wells et al.(2003)Brain，126：1628-37)。在损伤后小鼠在热毯上恢复并接受0.5ml盐水以补偿血液损失和脱水。每日手工压膀胱2-3次直至自发排泄恢复。所有实验根据University of Calgary Animal Care Ethics Committee进行并符合Canadian Council on Animal Care的规定。

损伤后，给小鼠施用LPM1d或运载体对照。小鼠随机分为4个治疗组，如下表23所示。

表23：在SCI模型中用LPM1d治疗

组	治疗
		I	单次推注LPM1d(100μg/kg，I.P.)SCI后2小时
II	两次注射LPM1d(100μg/kg，I.P.)SCI后2小时及24小时
		III	三次注射LPM1d(100μg/kg，I.P.)SCI后2、24及48小时
IV	运载体(I.P.)

B.收获组织及血液用于数据分析

1.新鲜组织

在小鼠被麻醉后在SCI损伤后24及48小时从每个治疗组收集新鲜组织，通过心脏穿刺收集～1ml全血进100μl肝素溶液。在血液收集后立即用冰冷的PBS灌注动物并快速分离脊髓(损伤部位中心周围2cm)并置于冰冷的PBS中。然后制备血液及脊髓样品用于流式细胞术。

2.固定的组织

在SCI损伤后5天从每个治疗组收集固定的组织。动物用致死剂量的氯胺酮-赛拉嗪麻醉，用PBS灌注，然后用4％低聚甲醛于PBS中的溶液灌注-固定。取出脊髓(T6至T13)并在4％低聚甲醛中后固定过夜，随后在30％蔗糖中冷冻保护。脊髓然后置于模块中，冷冻并在-70℃贮存直至切片。模块在横向平面以20μm厚度切片，组织切片收集在Superfrost玻片上(FisherScientific，Houston，TX)组织成5个相邻切片系列。

3.统计学分析

用SigmaStat Software(SPSS，Inc.)进行统计学分析。治疗组之间的差异用方差分析(ANOVA)及当确认时Holm-Sidak post-hoc分析检验。在不相等方差情况下，使用Kruskal-Wallis one way ANOVA on ranks。P值小于0.05的差异被认为是显著的。

C.数据分析

1.流式细胞术

来自新鲜组织的脊髓样品用小的玻璃杜恩斯匀浆器机械破坏，通过将溶液通过线网筛(Sigma-Aldrich，Canada)而获得单细胞悬液。样品然后在4℃以1100RPM(200xg)低破损离心10分钟。沉淀重悬于FBS染色缓冲液(BDBiosciences)中并离心(3000RPM 7分钟，慢刹车，4℃)。沉淀然后重悬于FBS染色缓冲液中。

脊髓细胞用针对标记的抗体染色，所述标记用于确定居留小胶质细胞群(CD45dim：CD11b)和血液衍生白细胞群(粒细胞和单核细胞；CD45high：CD11b)。为优化抗体稀释度，细胞数首先用台盼蓝染色计数，通过将细胞在台盼蓝中1∶1稀释(10μl台盼蓝加入10μl每种样品)并用血细胞计数器计数细胞数进行。样品先与Fc Block^TM(纯化的大鼠抗小鼠CD16/CD32(FcγIII/II受体；BD Biosciences；0.5mg/ml))保温以降低由于抗体结合Fc受体导致的非特异性结合。与Fc block保温大约5分钟后，向细胞样品中加入下述单克隆抗体(BD Biosciences)以评估居留小胶质细胞及血液衍生白细胞的存在：R-藻红蛋白(R-PE)-缀合大鼠抗小鼠CD11b(0.2mg/ml)，FITC抗小鼠Ly-6G和Ly-6C(Gr-1；0.5mg/ml)，FITC抗小鼠CD3分子复合物(0.5mg/ml)及多甲藻素叶绿素-a蛋白(PerCP)-缀合大鼠抗小鼠CD45(白细胞共同抗原，Ly-5；0.2mg/ml)。为控制非特异性结合及自身荧光，还用合适的同种型对照抗体(即PE标记的大鼠IgG2a，k同种型对照(0.2mg/ml)；FITC标记的大鼠IgG2b，k同种型对照(0.5mg/ml)及PerCP-缀合大鼠IgG2b同种型对照(0.2mg/ml))进行了染色。在染色保温中还包括仅细胞的样品。细胞在4℃保温30分钟。保温后，在FBS染色缓冲液中洗涤细胞样品两次并重悬于1％缓冲的福尔马林中。细胞样品在4℃储存并用BD FACScan(BDBiosciences)分析。

流式细胞术结果用WinMD12.8版软件(Scripps Research Institute，California，USA)从密度图(CD45，y-轴；CD11b，x-轴)中确定并在不同治疗组之间比较。使用WinMD12.8版软件确定了每一治疗组的CD45和CD11b染色的平均荧光。血液衍生白细胞对居留小胶质细胞的比率确定为CD45∶CD11b的平均荧光值的比率。还确定了每一治疗组的平均值的标准误差。结果见表24。结果显示SCI后24小时，SCI后2小时用LPM1d治疗的组I的小鼠显示与仅用运载体治疗的小鼠相比降低的脊髓中的血液衍生白细胞比率。分析显示在SCI后2小时接受1剂LPM1d的小鼠揭示在24小时血液衍生白细胞：小胶质细胞比率与对照相比显著(P＜0.05)降低。这代表血液衍生白细胞的30％降低，因为小胶质细胞数在组间无变化。在SCI后48小时，来自在感染后2和24小时接受2剂LPM1d的小鼠(即组II)的脊髓细胞比率显示在测试和对照比率之间无显著差异。

表24：SCI后24和48小时血液衍生白细胞比居留小胶质细胞的比率

治疗	n	平均值	SEM	时间点
					运载体	6	2.431	0.317	24hr
组I	6	1.703	0.102	24hr
					运载体	6	3.02	0.38	48hr
组II	6	3.619	0.965	48hr

2.检测小胶质细胞/巨噬细胞的免疫组织化学

在含有来自损伤后5天的脊髓的固定组织切片的玻片上进行荧光免疫组织化学。解冻玻片，在PBS中洗3次，在室温在10％正常山羊血清中阻断30分钟。为检测小胶质细胞/巨噬细胞，玻片与兔抗Iba1抗体(1∶1000；Wako Chemicals USA，Inc.)在室温保温2小时。在PBS中洗3次后，玻片与Alexa488山羊抗兔二抗(1∶1000，Molecular Probes Inc.，USA)在室温保温1小时以显现Iba-1。玻片然后在PBS中洗3次并浸没于Hoechst 33258(1μg/ml，Sigma-Aldrich，Canada)。

为定量在损害的脊髓中小胶质细胞/巨噬细胞活化/募集，用SigmaScanPro软件(SPSS，Chicago，IL)将一个重叠盒(overlay box)(1024乘1024像素)置于含有Iba-1信号的横断面脊髓切片的数字捕获共聚焦阈值图像(digitallycaptured confocal thresholded images)上。在SCI后5天用Iba-1组织染色计算由Iba-1信号占据的面积百分比以确定脊髓小胶质细胞/巨噬细胞的密度。评估了每只动物的损害部位中心的至少2个切片(每组n＝2-3只动物)。确定了平均值和平均值标准误差(SEM)Iba-1信号，结果见表25。结果显示与仅运载体的对照相比，在SCI后2小时接受单剂LPM1d的动物(组I)和在SCI后2、24及48小时接受3剂LPM1d的小鼠(组III)分别显示细胞数降低40％和60％。这是统计学显著的(在治疗组之间P＜0.05差异，Kruskal-Wallis one way ANOVA on Ranks)。在这一实验中，在2小时和24小时接受2剂LPM1d的组II中的小鼠与对照细胞相比未显示Iba-1阳性细胞百分比的显著差异。

表25：SCI后5天Iba-1(％面积)阳性小胶质细胞/巨噬细胞密度

治疗	n	平均值	SEM
				运载体	2	12.148	2.822
组I	3	7.342	0.503
				组II	2	13.465	1.337
组III	2	4.89	1.297

实施例9

LPM在异种移植模型中的活性

用已建立的肿瘤异种移植模型评估了LPM在乳腺癌中的作用。雌性无胸腺裸鼠(nu/nu)用雌激素依赖性乳腺癌细胞系MCF-7(American TypeCulture Collection(ATCC)，Manassas，VA)的2百50万个细胞(于0.2mlPBS/Matrigel中)注射并评估两种LPM分子对肿瘤生长的作用。

A.SDF-1β-SA1Var1LPM

在这个研究中，SDF-1β-SA1Var1LPM(SEQ ID NO：216)用于治疗方案。这个LPM含有与野生型SA1部分连接的成熟SDF-1β趋化因子。在MCF-7注射后第7天开始腹膜内给予100μg/kg SDF-1β-SA1Var1LPM或运载体对照并每天持续直至第21天。肿瘤继续生长直至第31天。

1.肿瘤生长

SDF-1β-SA1Var1在这一小鼠异种移植模型中延迟MCF-7乳腺癌细胞进展的作用通过测量肿瘤重量及肿瘤体积评估肿瘤生长而确定。在不存在SDF-1β-SA1Var1时，肿瘤生长从第7天(大约100mm³开始)至第31天稳定增长，在第28天达到最大肿瘤体积为大约980mm³。用剂量为100μg/kg的LPM治疗小鼠也产生肿瘤生长的稳定增长；但是肿瘤增长幅度比不存在LPM时显著降低。例如，在存在LPM时，在第28天达到最大肿瘤生长，最大肿瘤体积仅达到大约500mm³。结果显示用LPM治疗小鼠导致MCF-7肿瘤生长速率统计学显著降低。与对照相比来自测试动物的最终肿瘤重量平均降低35％，最终肿瘤体积降低41.5％(用p＜0.05二尾t-检验是显著的)。

2.炎性浸润

用显微镜检查确定SDF-1β-SA1Var1LPM对这一模型中炎性浸润的作用。在最后1剂SDF-1β-SA1Var1LPM被给予小鼠后10天(即第31天)切下肿瘤及切片，并用显微镜检查评价肿瘤周围白细胞浸润。细胞用苏木精和曙红(H&E)染色显现。结果显示与仅用运载体处理的动物相比，LPM处理的动物的组织中细胞少36％，其是统计学显著的。

3.CD-31染色

组织学检查使得可以显现肿瘤内坏死及空泡化程度。抗CD-31(山羊多克隆抗体PECAM-1(clone M-20)，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)用于显现PECAM-1，其是在单核细胞、嗜中性粒细胞、血小板和T细胞亚群的细胞表面上表达的细胞粘附分子及糖蛋白。PECAM-1还在成体及胚胎内皮细胞表面上表达。在最后1剂SDF-1β-SA1Var1LPM被给予小鼠后10天(即第31天)切下肿瘤及切片并用抗CD-31抗体染色。简而言之，将福尔马林固定的石蜡包埋肿瘤样品切片脱石蜡及水合。在第一抗体保温前使用在Target Retrieval Solution(pH 9.0，DakoCytomation，Carpenteria，CA)中的热诱导表位恢复(heat-induced-epitope retrieval)预处理。内源性过氧化物酶活性通过用3％H₂O₂保温而抑制，非特异性染色用DAKO ProteinBlock Serum-Free(DakoCytomation，Carpenteria，CA)阻断。样品与1∶800稀释的第一(抗CD-31)抗体在室温保温30分钟。组织切片然后与1∶400稀释的生物素化兔抗山羊免疫球蛋白(Vector Laboratories，Burlington，CA)在室温保温30分钟，随后添加Dako Envision+Rabbit System Labeled Polymer，HRP(DakoCytomation，Carpenteria，CA)。染色用Liquid DAB+(DakoCytomation，Carpenteria，CA)显色并用苏木精复染。一些白细胞(通过在组织学分析下循环染色显现)和内皮细胞(通过具有伸长形状的细胞的染色显现)对于CD-31染色阳性。这些结果显示在生长的肿瘤中存在血管发生。相反，在SDF-1β-SA1Var1LPM治疗的肿瘤中无CD-31染色，表示不存在巨噬细胞(无胸腺小鼠不具有T细胞)及不存在肿瘤内内皮细胞血管。

4.Ki-67染色

也使用组织学检查评估了SDF-1β-SA1Var1LPM对这一模型中的细胞增殖的作用，这是通过在最后1剂SDF-1β-SA1Var1LPM被给予小鼠后10天(即第31天)用兔多克隆抗Ki-67抗体(Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA)染色细胞而进行。这一抗原在细胞周期的所有活跃期(G1、S、G2及M期)表达，但是在静息细胞(G0期)中不存在。Ki-67抗原随着细胞进入非增殖状态快速降解，在DNA修复过程中无Ki-67表达。简而言之，福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤样品切片脱石蜡并水合。在第一抗体保温前使用在Target Retrieval Solution(pH 9.0，DakoCytomation，Carpenteria，CA)中的热诱导表位恢复预处理。内源性过氧化物酶活性通过用3％H₂O₂保温而抑制，非特异性染色用DAKO Protein Block Serum-Free(DakoCytomation，Carpenteria，CA)阻断。样品与1∶200稀释的第一(抗Ki-67)抗体在室温保温30分钟。组织切片然后与1∶400稀释的生物素化山羊抗兔免疫球蛋白(Vector Laboratories，Burlington，CA)在室温保温30分钟，随后施加Dako Envision+Rabbit System Labeled Polymer，HRP(DakoCytomation，Carpenteria，CA)。染色用Liquid DAB+(DakoCytomation，Carpenteria，CA)显色并用苏木精复染。如Ki-67染色所示在未治疗肿瘤中大量细胞在增殖。相反，SDF-1β-SA1Var1 LPM治疗的肿瘤显示很少的用抗Ki-67染色，表示肿瘤进展降低。另外，看起来许多癌细胞经历了坏死，如视野内的明显空泡证明。

B.MCP-1-SA1Var4(LPM1d)

在这个研究中，MCP-1-SA1Var4(LPM1d)用于治疗方案。腹膜内给药在第7天开始，各组接受运载体；(1)第7天1剂2mg/Kg LPM1d；(2)第7、11、15及21天2mg/Kg LPM1d或(3)从第7天至第21天每天100μg/KgLPM1d。肿瘤持续生长至第32天。包括对照的不同组之间治疗动物的体重变化百分比不超过0.5％。

在不存在LPM1d时，肿瘤生长从第7天至第32天稳定增长，在第32天达到最大肿瘤体积为大约1500mm³。用所有剂量方案的LPM治疗小鼠产生肿瘤生长的稳定增长；但是肿瘤增长幅度比不存在LPM1d时显著降低。用MCP-1-SA1Var4(LPM1d)治疗诱导了MCF-7肿瘤生长的统计学显著降低，如肿瘤体积及重量所测。所有LPM1d治疗组肿瘤生长的降低从第7天至第29天是相似的，尽管到第32天在不同LPM1d治疗组之间对重量生长的作用有一些差异。与对照相比来自组1-3的最终肿瘤重量分别降低41％、58.6％和36％(用p＜0.05二尾t-检验是显著的)。与对照相比来自组1-3的最终肿瘤体积分别降低47％、63％和40.4％(用p＜0.05二尾t-检验是显著的)。这个研究表明单次或最低重复给药足以显著降低肿瘤生长速率。

用LPM1d进行了第二个MCF-7异种移植实验。来自第一个实验的剂量方案产生相似的结果。加入了另外的剂量方案，其中在用LPM1d治疗前先使肿瘤生长至～700mm³肿瘤体积(而不是～100mm³)以测试治疗是否能影响大的生长中的肿瘤(具有更显著的血管结构)。因此，在施用LPM1d或运载体对照之前使肿瘤生长直至大约第27天。从第27天至第43天每4天动物经腹膜内注射用100μg/kg LPM1d治疗。与对照相比用LPM1d治疗在第一次注射后立即显著降低了肿瘤体积(p＜0.05)。这一趋势持续至第43天。

实施例10

实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中的LPMd活性，一种多发性硬化的动物模型

8-10周龄C57BL/6雌性小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)被分成4组(Gr1-4)。为诱导EAE，组1和2(n＝9)在第0天用100μg髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)33-55肽(Bernard et al.(1997)J Mol Med 75：77-88)在尾后面皮下注射，所述肽在100μl完全弗氏佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)中乳化。这些小鼠还在第0天和第2天腹膜内接受在200μl磷酸盐缓冲液中的300ng剂量的重配的冻干百日咳毒素(Liu et al.(1998)NatMed 4：78-83)。组1和2分别接受在缓冲液(50mM柠檬酸钠缓冲液pH 6.2，0.05mM EDTA和10％v/v甘油)中的LPM1d(500μg/kg)或仅缓冲液的6次每日注射(第3-8天)。组3和4中的对照小鼠(n＝6)分别不接受注射或接受仅500μg/kg LPM1d的6次每日(D3-8)注射。

用评分系统每日评估动物，该系统在0-15等级范围内评估疾病(Weaveret al.，2005)。疾病评分是尾部和四肢状态的总和。对于尾部，0分代表无迹象，1代表半瘫痪尾部，2分代表全瘫痪尾部。对于分别评估的前后肢，0代表无迹象，1分是弱的或改变的步态，2代表轻瘫，3分代表全瘫痪肢。因此，四肢全瘫痪的动物得分为14。死亡等于15分。结果显示对照小鼠(组3和4)未显示瘫痪。组2为用缓冲液治疗的EAE模型，其在注射后大约9天出现瘫痪并线性增长至到第14天平均临床评分大于6。治疗的EAE动物开始出现瘫痪，在第10天平均分小于大约4，其到第12天降至对照水平(接近0)并在第13天保持。

在多发性硬化的急性实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中，OPL-CCL2-LPM对疾病过程有引人注目的作用。疾病的发作和严重性分别被显著延迟和降低。在这一研究中动物在第3-8天每日用运载体或LPM治疗。对照及测试动物显示如预测的在第1 0天疾病初始发作。之后在接下来的4天中相比对照动物(显示临床严重性评分为6-10)在治疗动物中疾病的临床严重性评分返回为0(无行为疾病指示)。

平均临床严重性评分(近似到刻度上0.5)

未注射或仅运载体(无疾病)的动物记为0。

实施例11

OPL-CCL2-LPM在抗胸腺细胞血清(ATS)诱导系膜增生性肾小球肾炎模型中进行了测试。雄性大鼠用ATS在第0天注射并用运载体、50或100μg/kg重组蛋白Q2D从第2天直至第8天静脉内治疗。在ATS注射前及第5和9天收集尿和血液。在第9天处死动物。未观察到对体重的治疗相关作用或临床毒性迹象。尿蛋白水平在治疗动物中降低。肾切片的组织病理学分析揭示肾小球损害、M/M计数、纤连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的最大降低分别为40，36，38和28％。后两种蛋白分别是胞外基质合成和系膜细胞活化的标记。这些结果表明在这一肾炎模型中的显著的肾保护作用并表明所述趋化因子-配体毒素可用于治疗疾病。

由于修饰对于本领域技术人员是显而易见的，因此本发明仅有所附权利要求书的范围限定。

序列表

<110>美国奥斯普瑞医药公司

<120>选择和产生修饰的毒素、含有修饰的毒素的缀合物的方法及其应用

<130>119361-00074/609CN

<140>Unknown

<141>Filed herewith

<160>216

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>315

<212>PRT

<213>Shigella dysenteriae，Escherichia coli

<220>

<223>Shiga Toxin A-chain Precursor

<400>1

Met Lys Ile Ile Ile Phe Arg Val Leu Thr Phe Phe Phe Val Ile Phe

 1               5                  10                  15

Ser Val Asn Val Val Ala Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala

            20                  25                  30

Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr

        35                  40                  45

Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp

    50                  55                  60

Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp

65                  70                  75                  80

Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn

                85                  90                  95

Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr

            100                 105                 110

Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val

        115                 120                 125

Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly

    130                 135                 140

Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser

145                 150                 155                 160

Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val

                165                 170                 175

Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg

            180                 185                 190

Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser

        195                 200                 205

Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn

    210                 215                 220

Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser

225                 230                 235                 240

Val Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly

                245                 250                 255

Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala

            260                 265                 270

Arg Met Ala Ser Asp Glu Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg

        275                 280                 285

Val Arg Gly Ile Thr Hi s Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu

    290                 295                 300

Gly Ala Ile Leu Met Arg Arg Thr Ile Ser Ser

305                 310                 315

<210>2

<211>89

<212>PRT

<213>Shigella dysenteriae，Escherichia coli

<220>

<223>Shiga Toxin B-chain

<400>2

Met Lys Lys Thr Leu Leu Ile Ala Ala Ser Leu Ser Phe Phe Ser Ala

 1               5                  10                  15

Ser Ala Leu Ala Thr Pro Asp Cys Val Thr Gly Lys Val Glu Tyr Thr

            20                  25                  30

Lys Tyr Asn Asp Asp Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Gly Asp Lys Glu

        35                  40                  45

Leu Phe Thr Asn Arg Trp Asn Leu Gln Ser Leu Leu Leu Ser Ala Gln

    50                  55                  60

Ile Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys Thr Asn Ala Cys His Asn Gly

65                  70                  75                  80

Gly Gly Phe Ser Glu Val Ile Phe Arg

                85

<210>3

<211>319

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Shiga-like ToxinII subunit A Precursor

<400>3

Met Lys Cys Ile Leu Phe Lys Trp Val Leu Cys Leu Leu Leu Gly Phe

 1               5                  10                  15

Ser Ser Val Ser Tyr Ser Arg Glu Phe Thr Ile Asp Phe Ser Thr Gln

            20                  25                  30

Gln Ser Tyr Val Ser Ser Leu Asn Ser Ile Arg Thr Glu Ile Ser Thr

        35                  40                  45

Pro Leu Glu His Ile Ser Gln Gly Thr Thr Ser Val Ser Val Ile Asn

    50                  55                  60

His Thr Pro Pro Gly Ser Tyr Phe Ala Val Asp Ile Arg Gly Leu Asp

65                  70                  75                  80

Val Tyr Gln Ala Arg Phe Asp His Leu Arg Leu Ile Ile Glu Gln Asn

                85                  90                  95

Asn Leu Tyr Val Ala Gly Phe Val Asn Thr Ala Thr Asn Thr Phe Tyr

            100                 105                 110

Arg Phe Ser Asp Phe Thr His Ile Ser Val Pro Gly Val Thr Thr Val

        115                 120                 125

Ser Met Thr Thr Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Ala

    130                 135                 140

Leu Glu Arg Ser Gly Met Gln Ile Ser Arg Hi s Ser Leu Val Ser Ser

145                 150                 155                 160

Tyr Leu Ala Leu Met Glu Phe Ser Gly Asn Thr Met Thr Arg Asp Ala

                165                 170                 175

Ser Arg Ala Val Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg

            180                 185                 190

Phe Arg Gln Ile Gln Arg Glu Phe Arg Gln Ala Leu Ser Glu Thr Ala

        195                 200                 205

Pro Val Tyr Thr Met Thr Pro Gly Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp

    210                 215                 220

Gly Arg Ile Ser Asn Val Leu Pro Glu Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Val

225                 230                 235                 240

Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Asn Asn Ile Ser Ala Ile Leu Gly Thr

                245                 250                 255

Val Ala Val Ile Leu Asn Cys His His Gln Gly Ala Arg Ser Val Arg

            260                 265                 270

Ala Val Asn Glu Glu Ser Gln Pro Glu Cys Gln Ile Thr Gly Asp Arg

        275                 280                 285

Pro Val Ile Lys Ile Asn Asn Thr Leu Trp Glu Ser Asn Thr Ala Ala

    290                 295                 300

Ala Phe Leu Asn Arg Lys Ser Gln Phe Leu Tyr Thr Thr Gly Lys

305                 310                 315

<210>4

<211>89

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Shiga-like Toxin II subunit B Precursor

<400>4

Met Lys Lys Met Phe Met Ala Val Leu Phe Ala Leu Ala Ser Val Asn

 1               5                  10                  15

Ala Met Ala Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr

            20                  25                  30

Asn Glu Asp Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Asp Gly Lys Glu Tyr Trp

        35                  40                  45

Thr Ser Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr

    50                  55                  60

Gly Met Thr Val Thr Ile Lys Ser Ser Thr Cys Glu Ser Gly Ser Gly

65                  70                  75                  80

Phe Ala Glu Val Gln Phe Asn Asn Asp

                85

<210>5

<211>293

<212>PRT

<213>Shigella dysenteriae，Escherichia coli

<220>

<223>Shiga toxin A-chain Mature

<400>5

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys Hi s His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu

                 245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg

        275                 280                 285

Arg Thr Ile Ser Ser

    290

<210>6

<211>293

<212>PRT

<213>Shigella dysenteriae，Escherichia coli

<220>

<221>VARIANT

<222>45

<223>Xaa＝Thr or Ser

<220>

<221>VARIANT

<222>77

<223>Xaa＝Tyr，Phe or Ser

<220>

<221>VARIANT

<222>114

<223>Xaa＝Tyr，Phe or Ser

<220>

<221>VARIANT

<222>167

<223>Xaa＝Glu，Gln or Asp

<220>

<221>VARIANT

<222>170

<223>Xaa＝Arg or Leu

<220>

<221>VARIANT

<222>203

<223>Xaa＝Try，Ala or Phe

<220>

<221>VARIANT

<222>204

<223>Xaa＝Gly or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>205

<223>Xaa＝Arg or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>226

<223>Xaa＝Phe or Tyr

<220>

<221>VARIANT

<222>231

<223>Xaa＝Ala or Asp

<220>

<221>VARIANT

<222>232

<223>Xaa＝Ile or Glu

<220>

<221>VARIANT

<222>233

<223>Xaa＝Leu or Glu

<220>

<221>VARIANT

<222>234

<223>Xaa＝Gly or Glu

<220>

<221>VARIANT

<222>240

<223>Xaa＝Leu，Lys，Ala，Asn，Arg or Asp

<220>

<221>VARIANT

<222>241

<223>Xaa＝Asn or Asp

<220>

<221>VARIANT

<222>242

<223>Xaa＝Cys or Ser

<220>

<221>VARIANT

<222>253

<223>Xaa＝Ala or Gly

<220>

<221>VARIANT

<222>254

<223>Xaa＝Ser or Thr

<220>

<221>VARIANT

<222>277

<223>Xaa＝Try，Phe or Gly

<220>

<221>VARIANT

<222>278

<223>Xaa＝Asp or Lys

<220>

<221>VARIANT

<222>288

<223>Xaa＝Arg，Gly or Glu

<220>

<221>VARIANT

<222>289

<223>Xaa＝Arg，Gly or Glu

<400>6

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Xaa Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Xaa Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Xaa Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Xaa Ala Leu Xaa Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Xaa Xaa Xaa Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Xaa Gly Ser Ile Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Val Ala Leu Ile Xaa

225                 230                 235                 240

Xaa Xaa His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Xaa Xaa Asp Glu

                245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Xaa Xaa Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Xaa

        275                 280                 285

Xaa Thr Ile Ser Ser

    290

<210>7

<211>293

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Stxlc Mature

<400>7

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg Hi s Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Val Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Ile Val Pro Asn Glu

                245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Pro Val Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Ile Arg

        275                 280                 285

Arg Ala Ile Ser Ser

    290

<210>8

<211>293

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Stxld Mature

<400>8

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Lys Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Ile Met Gly Leu Glu Pro Glu Glu Glu Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Arg Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Ile Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Thr Pro Asp Glu

                245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Pro Thr Asp Gly Ser Gly Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Ile Arg

        275                 280                 285

Arg Thr Ile Ser Ser

    290

<210>9

<211>293

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Shiga toxin allelic variant

<400>9

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu

                245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Gln Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg

        275                 280                 285

Arg Thr Ile Ser Ser

    290

<210>10

<211>293

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Shiga toxin allelic variant

<400>10

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Ser Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu

                245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg

        275                 280                 285

Arg Thr Ile Ser Ser

    290

<210>11

<211>293

<212>PRT

<213>Shigella dysenteriae

<220>

<223>Shiga toxin allelic variant

<400>11

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Pro Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly ArgIle

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Ile Asn AlaIle Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu

                245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg

        275                 280                 285

Arg Thr Ile Ser Ser

    290

<210>12

<211>293

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Shiga toxin allelic variant

<400>12

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Leu Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu

                245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His

           260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg

        275                 280                 285

Arg Thr Ile Ser Ser

    290

<210>13

<211>293

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Shiga toxin allelic variant

<400>13

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln ThrIle Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Ser Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly ArgIle

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu

                245                 250                 255

Phe ProSer Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His

           260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg

        275                 280                 285

Arg Thr Ile Ser Ser

    290

<210>14

<211>293

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Shiga toxin allelic variant

<400>14

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

Hi s Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Glu Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu

                245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg

        275                 280                 285

Arg Thr Ile Ser Ser

    290

<210>15

<211>293

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Shiga toxin allelic variant

<400>15

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Arg Gly Thr Ser Leu Pro Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu

                245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg

        275                 280                 285

Arg Thr Ile Ser Ser

    290

<210>16

<211>293

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Shiga toxin allelic variant

<400>16

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu MetIle Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

Hi s Arg Gly Thr Ser Leu Pro Gln Ser Gly Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu

                245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg

        275                 280                 285

Arg Thr Ile Ser Ser

    290

<210>17

<211>293

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Shiga toxin allelic variant

<400>17

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Gln Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly ArgIle

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Val Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Ala Ser Asp Glu

                245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Pro Ala Asp Gly Arg Gly Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Met Arg

        275                 280                 285

Arg Thr Ile Ser Ser

    290

<210>18

<211>293

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Shiga toxin allelic variant

<400>18

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Gly Asn

         35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gl yIle Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Val Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Ile Val Pro Asn Glu

                245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Pro Val Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Ile Arg

        275                 280                 285

Arg Ala Ile Ser Ser

    290

<210>19

<211>293

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Shiga toxin allelic variant

<400>19

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Val Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Ile Val Pro Asn Glu

                245                 250                 255

Leu Pro Ser Met Cys Pro Val Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile LeuIle Arg

        275                 280                 285

Arg Ala Ile Ser Ser

    290

<210>20

<211>293

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Shiga toxin allelic variant

<400>20

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Gly Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Pro Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Pro

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Val Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys Pro His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Ile Val Pro Asn Glu

                245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Pro Val Asp Gly Arg Val Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Ile Arg

        275                 280                 285

Arg Ala Ile Ser Ser

    290

<210>21

<211>293

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<220>

<223>Shiga toxin allelic variant

<400>21

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Lys Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Ile Met Gly Leu Glu Pro Glu Glu Glu Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Arg Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Ile Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala Ser Arg Val Ala Arg Met Thr Pro Asp Glu

                245                 250                 255

Phe Pro Ser Met Cys Pro Thr Asp Gly Ser Gly Arg Gly Ile Thr His

            260                 265                 270

Asn Lys Ile Leu Trp Asp Ser Ser Thr Leu Gly Ala Ile Leu Ile Arg

        275                 280                 285

Arg Thr Ile Ser Ser

    290

<210>22

<211>246

<212>PRT

<213>Shigella dysenteriae

<220>

<223>SA1 Variant 1

<400>22

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala

                245

<210>23

<211>738

<212>DNA

<213>Shigella dysenteriae

<220>

<223>SA1 Variant 1

<400>23

aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc 60

cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tctcttaatg 120

atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa 180

gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc 240

ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt 300

cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt 360

gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc 420

gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt 480

tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca 540

actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc 600

ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgtacgt 660

gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg 720

aactgccacc accatgca                                               738

<210>24

<211>241

<212>PRT

<213>Shigella dysenteriae

<220>

<223>SA1 Variant 2

<400>24

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn

<210>25

<211>723

<212>DNA

<213>Shigella dysenteriae

<220>

<223>SA1 Variant 2

<400>25

aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc 60

cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tctcttaatg 120

atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa 180

gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc 240

ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt 300

cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt 360

gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc 420

gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt 480

tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca 540

actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc 600

ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgtacgt 660

gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg 720

aac                                                               723

<210>26

<211>246

<212>PRT

<213>Shigella dysenteriae

<220>

<223>SA1 Variant 3

<400>26

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln ThrIle Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Arg Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165                 170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn Cys His His His Ala

    245

<210>27

<211>738

<212>DNA

<213>Sigella dysenteriae

<220>

<223>SA1 Variant 3

<400>27

aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc 60

cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tcgcttaatg 120

atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa 180

gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc 240

ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt 300

cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt 360

gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc 420

gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt 480

tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca 540

actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc 600

ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgtacgt 660

gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg 720

aactgccacc accatgca                                                738

<210>28

<211>241

<212>PRT

<213>Shigella dysenteriae

<220>

<223>SA1 Variant 4

<400>28

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

 1               5                  10                  15

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    50                  55                  60

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

65                  70                  75                  80

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                85                  90                  95

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            100                 105                 110

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        115                 120                 125

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    130                 135                 140

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

145                 150                 155                 160

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                165             170                 175

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            180                 185                 190

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        195                 200                 205

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg Ile

    210                 215                 220

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

225                 230                 235                 240

Asn

<210>29

<211>723

<212>DNA

<213>Shigella dysenteriae

<220>

<223>SA1 Variant 4

<400>29

aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc 60

cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tctcttaatg 120

atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa 180

gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc 240

ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt 300

cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt 360

gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc 420

gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt 480

tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca 540

actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc 600

ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgcacgt 660

gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg 720

aac                                                               723

<210>30

<211>22

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：SA1Peptide for Antibody Production

<400>30

Cys Leu Phe Ala Val Asp Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu

 1               5                  10                  15

Gly Arg Phe Asn Asn Leu

            20

<210>31

<211>6

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：NdeI restriction site

<400>31

catatg                                                      6

<210>32

<211>6

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：EcoRI restriction site

<400>32

gaattc                                                      6

<210>33

<211>6

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：BamHI restriction site

<400>33

ggattc                                                     6

<210>34

<211>6

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Ala-Met linker

<400>34

gccatg                                                     6

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：T7 Primer

<400>35

taatacgact cactataggg                                      20

<210>36

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Descripti on of Artificial Sequence：T7t Primer

<400>36

gctagttatt gctcagcg                                        18

<210>37

<211>987

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein MCP-1-AM-Shiga-A1Variant 1

<220>

<223>LPM1a

<400>37

catatgcaac ctgacgcaat caacgctcct gtcacctgtt gttacaattt taccaatcgc 60

aaaatttctg tccaacgtct tgcatcttat cgccgtatta cttcctctaa atgtcctaaa 120

gaagccgtca ttttcaaaac cattgttgca aaagaaatct gtgccgaccc gaaacaaaaa 180

tgggtacaag actccatgga ccacctcgat aaacaaactc aaaccccaaa aacagccatg 240

aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc 300

cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tctcttaatg 360

atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa 420

gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc 480

ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt 540

cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt 600

gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc 660

gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt 720

tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca 780

actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc 840

ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgtacgt 900

gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg 960

aactgccacc accatgcata aggatcc                                     987

<210>38

<211>325

<212>PRT

<213>Artiificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Chemokine-toxin fusion

protein MCP-1-AM-Shiga-A1Variant 1

<220>

<223>LPM1a

<400>38

Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe

 1               5                  10                  15

Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile

            20                  25                  30

Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val  Ile Phe Lys Thr Ile Val

        35                  40                  45

Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser

    50                  55                  60

Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr Ala Met Lys

65                  70                  75                  80

Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu

                85                  90                  95

Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser

            100                 105                 110

Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu

        115                 120                 125

Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn

    130                 135                 140

Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe

145                 150                 155                 160

Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His

                165                 170                 175

Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser

            180                 185                 190

Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln

        195                 200                 205

Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His

    210                 215                 220

Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe

225                 230                 235                 240

Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly

                245                 250                 255

Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr

            260                 265                 270

Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val

        275                 280                 285

Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile Ser

    290                 295                 300

Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn

305                 310                 315                 320

Cys His His His Ala

                325

<210>39

<211>972

<212>DNA

<213>Artificial Seauence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein MCP-1-AM-Shiga-A1Variant 2

<220>

<223>LPM1b

<400>39

catatgcaac ctgacgcaat caacgctcct gtcacctgtt gttacaattt taccaatcgc 60

aaaatttctg tccaacgtct tgcatcttat cgccgtatta cttcctctaa atgtcctaaa 120

gaagccgtca ttttcaaaac cattgttgca aaagaaatct gtgccgaccc gaaacaaaaa 180

tgggtacaag actccatgga ccacctcgat aaacaaactc aaaccccaaa aacagccatg 240

aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc 300

cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tctcttaatg 360

atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa 420

gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc 480

ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt 540

cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt 600

gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc 660

gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt 720

tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca 780

actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc 840

ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgtacgt 900

gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg 960

aac taaggat cc                                                    972

<210>40

<211>320

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Chemokine-toxin fusion

protein MCP-1-AM-Shiga-A1 Variant 2

<220>

<223>LPM1b

<400>40

Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe

 1               5                  10                  15

Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile

            20                  25                  30

Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val

        35                  40                  45

Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser

    50                  55                  60

Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr Ala Met Lys

65                  70                  75                  80

Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu

                85                  90                  95

Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser

            100                 105                 110

Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu

        115                 120                 125

Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn

    130                 135                 140

Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe

145                 150                 155                 160

Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His

                165                 170                 175

Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser

            180                 185                 190

Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln

        195                 200                 205

Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His

    210                 215                 220

Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe

225                 230                 235                 240

Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly

                245                 250                 255

Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr

            260                 265                 270

Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val

        275                 280                 285

Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile Ser

    290                 295                 300

Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn

305                 310                 315                 320

<210>41

<211>987

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein MCP-1-AM-Shiga-A1Variant 3

<220>

<223>LPM1c

<400>41

catatgcaac ctgacgcaat caacgctcct gtcacctgtt gttacaattt taccaatcgc 60

aaaatttctg tccaacgtct tgcatcttat cgccgtatta cttcctctaa atgtcctaaa 120

gaagccgtca ttttcaaaac cattgttgca aaagaaatct gtgccgaccc gaaacaaaaa 180

tgggtacaag actccatgga ccacctcgat aaacaaactc aaaccccaaa aacagccatg 240

aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc 300

cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tcgcttaatg 360

atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa 420

gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc 480

ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt 540

cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt 600

gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc 660

gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt 720

tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca 780

actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc 840

ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgtacgt 900

gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg 960

aactgccacc accatgcata aggatcc                                     987

<210>42

<211>325

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Chemokine-toxin fusion

protein MCP-1-AM-Shiga-A1Variant 3

<220>

<223>LPM1c

<400>42

Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe

 1               5                  10                  15

Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile

            20                  25                  30

Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val

        35                  40                  45

Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser

    50                  55                  60

Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr Ala Met Lys

65                  70                  75                  80

Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu

                85                  90                  95

Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser

            100                 105                 110

Gly Gly Thr Ser Arg Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu

        115                 120                 125

Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn

    130                 135                 140

Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe

145                 150                 155                 160

Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His

                165                 170                 175

Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser

            180                 185                 190

Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln

        195                 200                 205

Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His

    210                 215                 220

Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe

225                 230                 235                 240

Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly

                245                 250                 255

Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr

            260                 265                 270

Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val

        275                 280                 285

Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile Ser

    290                 295                 300

Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn

305                 310                 315                 320

Cys His His His Ala

    325

<210>43

<211>972

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusionprotein MCP-1-AM-Shiga-A1 Variant 4

<220>

<223>LPM1d

<400>43

catatgcaac ctgacgcaat caacgctcct gtcacctgtt gttacaattt taccaatcgc 60

aaaatttctg tccaacgtct tgcatcttat cgccgtatta cttcctctaa atgtcctaaa 120

gaagccgtca ttttcaaaac cattgttgca aaagaaatct gtgccgaccc gaaacaaaaa 180

tgggtacaag actccatgga ccacctcgat aaacaaactc aaaccccaaa aacagccatg 240

aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc 300

cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tctcttaatg 360

atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa 420

gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc 480

ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt 540

cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt 600

gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc 660

gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt 720

tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca 780

actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc 840

ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgcacgt 900

gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg 960

aactaaggat cc                                                     972

<210>44

<211>320

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Chemokine-toxin fusion

protein MCP-1-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM1d

<400>44

Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe

 1               5                  10                  15

Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile

            20                  25                  30

Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val

        35                  40                  45

Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser

    50                  55                  60

Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr Ala Met Lys

65                  70                  75                  80

Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu

                85                  90                  95

Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser

            100                 105                 110

Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu

        115                 120                 125

Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn

    130                 135                 140

Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe

145                 150                 155                 160

Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His

                165                 170                 175

Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser

            180                 185                 190

Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln

        195                 200                 205

Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His

    210                 215                 220

Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe

225                 230                 235                 240

Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly

                245                 250                 255

Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr

            260                 265                 270

Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val

        275                 280                 285

Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Ala Arg Val Gly ArgIle Ser

    290                 295                 300

Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn

305                 310                 315                 320

<210>45

<211>966

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein Eotaxin-1-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM2

<400>45

catatgggcc ccgcatccgt tccaactaca tgttgtttta atctggcgaa ccgcaagatt 60

cctctccagc gtcttgaatc atacagacgg atcacgtctg gtaaatgccc gcaaaaggcc 120

gtgatattca aaaccaaatt ggcgaaagat atctgcgctg accctaagaa aaagtgggta 180

caggactcga tgaagtatct ggatcaaaaa agcccaaccc cgaaaccggc catgaaagaa 240

ttcacactcg acttcagcac cgcaaaaact tacgtagact ccctgaatgt aatccgctcc 300

gctatcggca ccccgttaca aactattagc tccggcggta catctctctt aatgatcgat 360

tccggtactg gcgacaattt attcgctgtg gatgtacgtg gcattgaccc agaagaaggc 420

cgtttcaata acctgcgctt aattgttgaa cgtaataacc tgtatgtaac tggcttcgta 480

aaccgtacca acaacgtctt ttaccgcttc gctgactttt ctcacgtaac ctttcccgga 540

acaactgcag taactctctc cggcgacagt tcctatacga ccctccaacg tgttgcaggt 600

atttctcgca ccggtatgca aatcaatcgt cactctctta ctacatcgta tctcgattta 660

atgtcacact ccggcacctc tttaacccag tccgtcgcac gcgcaatgtt acgttttgtt 720

actgtcacag cagaggctct tcgctttcgt cagattcaac gtggtttccg cacaactctt 780

gatgatttat ctggccgctc ttatgtaatg accgcagaag atgtagatct gaccttgaac 840

tggggccgcc tgagcagtgt gttacctgat tatcacggac aagacagtgc acgtgtaggc 900

cgtatctcct ttggttccat taacgccatt ttaggttctg ttgcacttat tctgaactaa 960

ggatcc                                                            966

<210>46

<211>318

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Chemokine-toxin fusion

protein Eotaxin-1-AM-Shiga-A1 Variant 4

<220>

<223>LPM2

<400>46

Met Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn

 1               5                  10                  15

Arg Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser

            20                  25                  30

Gly Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys

        35                  40                  45

Asp Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Lys

    50                  55                  60

Tyr Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro Ala Met Lys Glu Phe

65                  70                  75                  80

Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val

                85                  90                  95

Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser Gly Gly

            100                 105                 110

Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala

        115                 120                 125

Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu

    130                 135                 140

Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn

145                 150                 155                 160

Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr

                165                 170                 175

Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr

            180                 185                 190

Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln Ile Asn

        195                 200                 205

Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly

    210                 215                 220

Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr

225                 230                 235                 240

Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly Phe Arg

                245                 250                 255

Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu

            260                 265                 270

Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro

        275                 280                 285

Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Gly

    290                 295                 300

Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala LeuIle Leu Asn

305                 310                 315

<210>47

<211>960

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein SDF-1beta-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM3

<400>47

catatgaagc cggtgtctct gtcctaccgt tgcccatgta gatttttcga gagccatgtt 60

gcccgggcaa acgttaaaca cctaaagata ctcaataccc ctaactgtgc gttacagatc 120

gtcgcgaggc ttaaaaacaa taaccgccaa gtatgcatcg accccaagtt gaagtggatt 180

caggaatatc tggaaaaagc tctgaataaa cgattcaaaa tggccatgaa agaattcaca 240

ctcgacttca gcaccgcaaa aacttacgta gactccctga atgtaatccg ctccgctatc 300

ggcaccccgt tacaaactat tagctccggc ggtacatctc tcttaatgat cgattccggt 360

actggcgaca atttattcgc tgtggatgta cgtggcattg acccagaaga aggccgtttc 420

aataacctgc gcttaattgt tgaacgtaat aacctgtatg taactggctt cgtaaaccgt 480

accaacaacg tcttttaccg cttcgctgac ttttctcacg taacctttcc cggaacaact 540

gcagtaactc tctccggcga cagttcctat acgaccctcc aacgtgttgc aggtatttct 600

cgcaccggta tgcaaatcaa tcgtcactct cttactacat cgtatctcga tttaatgtca 660

cactccggca cctctttaac ccagtccgtc gcacgcgcaa tgttacgttt tgttactgtc 720

acagcagagg ctcttcgctt tcgtcagatt caacgtggtt tccgcacaac tcttgatgat 780

ttatctggcc gctcttatgt aatgaccgca gaagatgtag atctgacctt gaactggggc 840

cgcctgagca gtgtgttacc tgattatcac ggacaagaca gtgcacgtgt aggccgtatc 900

tcctttggtt ccattaacgc cattttaggt tctgttgcac ttattctgaa ctaaggatcc 960

<210>48

<211>316

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Chemokine-toxin fusion

protein SDF-1beta-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM3

<400>48

Met Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu

 1               5                  10                  15

Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr

            20                  25                  30

Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg

        35                  40                  45

Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu

    50                  55                  60

Lys Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met Ala Met Lys Glu Phe Thr Leu

65                  70                  75                  80

Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val Ile Arg

                85                  90                  95

Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Ser

            100                 105                 110

Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp

        115                 120                 125

Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu

    130                 135                 140

Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr

145                 150                 155                 160

Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro

                165                 170                 175

Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu

            180                 185                 190

Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln Ile Asn Arg His

        195                 200                 205

Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser

    210                 215                 220

Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr

225                 230                 235                 240

Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly Phe Arg Thr Thr

                245                 250                 255

Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val

            260                 265                 270

Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr

        275                 280                 285

His Gly Gln Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Gly Ser Ile

    290                 295                 300

Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn

305                 310                 315

<210>49

<211>963

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein GRO-alpha-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM4

<400>49

catatggcgt ccgttgctac cgagctgcgt tgtcagtgcc tgcaaactct gcagggtatc 60

cacccgaaaa acatccagag cgtaaacgtg aaatctccag gtccgcactg cgcgcagacc 120

gaagttattg ctaccctgaa aaacggccgt aaagcgtgtc tgaacccggc ctccccgatc 180

gttaagaaaa ttatcgaaaa gatgctgaac tctgacaaaa gcaatgcaat gaaagaattc 240

acactcgact tcagcaccgc aaaaacttac gtagactccc tgaatgtaat ccgctccgct 300

atcggcaccc cgttacaaac tattagctcc ggcggtacat ctctcttaat gatcgattcc 360

ggtactggcg acaatttatt cgctgtggat gtacgtggca ttgacccaga agaaggccgt 420

ttcaataacc tgcgcttaat tgttgaacgt aataacctgt atgtaactgg cttcgtaaac 480

cgtaccaaca acgtctttta ccgcttcgct gacttttctc acgtaacctt tcccggaaca 540

actgcagtaa ctctctccgg cgacagttcc tatacgaccc tccaacgtgt tgcaggtatt 600

tctcgcaccg gtatgcaaat caatcgtcac tctcttacta catcgtatct cgatttaatg 660

tcacactccg gcacctcttt aacccagtcc gtcgcacgcg caatgttacg ttttgttact 720

gtcacagcag aggctcttcg ctttcgtcag attcaacgtg gtttccgcac aactcttgat 780

gatttatctg gccgctctta tgtaatgacc gcagaagatg tagatctgac cttgaactgg 840

ggccgcctga gcagtgtgtt acctgattat cacggacaag acagtgcacg tgtaggccgt 900

atctcctttg gttccattaa cgccatttta ggttctgttg cacttattct gaactaagga 960

tcc                                                               963

<210>50

<211>317

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Art ificial Sequence：Chemokine-toxin fusion

protein GRO-alpha-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM4

<400>50

Met Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu

 1               5                  10                  15

Gln Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Lys Ser Pro

            20                  25                  30

Gly Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly

        35                  40                  45

Arg Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Ile Val Lys Lys Ile Ile

    50                  55                  60

Glu Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn Ala Met Lys Glu Phe Thr

65                  70                  75                  80

Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val Ile

                85                  90                  95

Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr

            100                 105                 110

Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val

        115                 120                 125

Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg

    130                 135                 140

Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg

145                 150                 155                 160

Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser Hi s Val Thr Phe

                165                 170                 175

Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr

            180                 185                 190

Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln Ile Asn Arg

        195                 200                 205

His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr

    210                 215                 220

Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val

225                 230                 235                 240

Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly Phe Arg Thr

                245                 250                 255

Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp

            260                 265                 270

Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp

        275                 280                 285

Tyr His Gly Gln Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn

305                 310                 315

<210>51

<211>951

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein MIP-1beta-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM5

<400>51

catatggctc cgatgggttc tgacccgccg actgcttgct gtttttctta taccgcacgt 60

aaactgccgc gtaacttcgt tgttgactac tacgagacct cctctctgtg ctctcagcca 120

gccgtagtct tccagaccaa gcgcagcaaa caggtgtgcg cggatccttc cgaaagctgg 180

gtgcaagaat atgtttacga tctggaactg aacgcgatga aagaattcac actcgacttc 240

agcaccgcaa aaacttacgt agactccctg aatgtaatcc gctccgctat cggcaccccg 300

ttacaaacta ttagctccgg cggtacatct ctcttaatga tcgattccgg tactggcgac 360

aatttattcg ctgtggatgt acgtggcatt gacccagaag aaggccgttt caataacctg 420

cgcttaattg ttgaacgtaa taacctgtat gtaactggct tcgtaaaccg taccaacaac 480

gtcttttacc gcttcgctga cttttctcac gtaacctttc ccggaacaac tgcagtaact 540

ctctccggcg acagttccta tacgaccctc caacgtgttg caggtatttc tcgcaccggt 600

atgcaaatca atcgtcactc tcttactaca tcgtatctcg atttaatgtc acactccggc 660

acctctttaa cccagtccgt cgcacgcgca atgttacgtt ttgttactgt cacagcagag 720

gctcttcgct ttcgtcagat tcaacgtggt ttccgcacaa ctcttgatga tttatctggc 780

cgctcttatg taatgaccgc agaagatgta gatctgacct tgaactgggg ccgcctgagc 840

agtgtgttac ctgattatca cggacaagac agtgcacgtg taggccgtat ctcctttggt 900

tccattaacg ccattttagg ttctgttgca cttattctga actaaggatc c          951

<210>52

<211>313

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Chemokine-toxin fusion

proteinMIP-1beta-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM5

<400>52

Met Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr

 1               5                  10                  15

Thr Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val Val Asp Tyr Tyr Glu Thr

            20                  25                  30

Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val Phe Gln Thr Lys Arg Ser

        35                  40                  45

Lys Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp Val Gln Glu Tyr Val

    50                  55                  60

Tyr Asp Leu Glu Leu Asn Ala Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser

65                  70                  75                  80

Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile

                85                  90                  95

Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met

            100                 105                 110

Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly

        115                 120                 125

Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu

    130                 135                 140

Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val

145                 150                 155                 160

Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr

                165                 170                 175

Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val

            180                 185                 190

Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr

        195                 200                 205

Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln

    210                 215                 220

Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala

225                 230                 235                 240

Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp

                245                 250                 255

Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr

            260                 265                 270

Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln

        275                 280                 285

Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile

    290                 295                 300

Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn

305                 310

<210>53

<211>975

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein IL-8-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM6

<400>53

catatggcgg tcctgccacg ttccgcgaaa gaactgcgct gccagtgcat taagacctac 60

agcaaaccgt ttcacccgaa attcatcaaa gaactgcgtg ttatcgagtc tggtccgcac 120

tgtgcaaaca ccgaaattat cgttaaactg tctgatggcc gtgaactgtg cctggacccg 180

aaagagaact gggtgcagcg tgtggtagaa aagttcctga aacgcgccga aaattccgct 240

atgaaagaat tcacactcga cttcagcacc gcaaaaactt acgtagactc cctgaatgta 300

atccgctccg ctatcggcac cccgttacaa actattagct ccggcggtac atctctctta 360

atgatcgatt ccggtactgg cgacaattta ttcgctgtgg atgtacgtgg cattgaccca 420

gaagaaggcc gtttcaataa cctgcgctta attgttgaac gtaataacct gtatgtaact 480

ggcttcgtaa accgtaccaa caacgtcttt taccgcttcg ctgacttttc tcacgtaacc 540

tttcccggaa caactgcagt aactctctcc ggcgacagtt cctatacgac cctccaacgt 600

gttgcaggta tttctcgcac cggtatgcaa atcaatcgtc actctcttac tacatcgtat 660

ctcgatttaa tgtcacactc cggcacctct ttaacccagt ccgtcgcacg cgcaatgtta 720

cgttttgtta ctgtcacagc agaggctctt cgctttcgtc agattcaacg tggtttccgc 780

acaactcttg atgatttatc tggccgctct tatgtaatga ccgcagaaga tgtagatctg 840

accttgaact ggggccgcct gagcagtgtg ttacctgatt atcacggaca agacagtgca 900

cgtgtaggcc gtatctcctt tggttccatt aacgccattt taggttctgt tgcacttatt 960

ctgaactaag gatcc                                                  975

<210>54

<211>321

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Chemokine-toxin fusion

protein IL-8-AM-Shiga-A1 Variant 4

<220>

<223>LPM6

<400>54

Met Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile

 1               5                  10                  15

Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg

            20                  25                  30

Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys

        35                  40                  45

Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val

    50                  55                  60

Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser Ala Met

65                  70                  75                  80

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

                85                  90                  95

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            100                 105                 110

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        115                 120                 125

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    130                 135                 140

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

145                 150                 155                 160

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                165                 170                 175

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            180                 185                 190

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        195                 200                 205

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    210                 215                 220

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

225                 230                 235                 240

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                245                 250                 255

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            260                 265                 270

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        275                 280                 285

Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg Ile

    290                 295                 300

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

305                 310                 315                 320

Asn

<210>55

<211>975

<212>DNA

<213>Artificial  Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein IP-10-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM7

<400>55

catatggttc cgctgtctcg caccgttcgt tgtacttgca tctctatctc taatcagccg 60

gtcaacccgc gcagcctgga aaaactggaa atcatcccgg cgtcccagtt ctgccctcgt 120

gtggaaatta tcgctaccat gaagaagaaa ggtgagaagc gttgcctgaa cccagagtct 180

aaagcaatta aaaacctgct gaaagctgta tccaaagaac ggtcgaaacg tagcccggcg 240

atgaaagaat tcacactcga cttcagcacc gcaaaaactt acgtagactc cctgaatgta 300

atccgctccg ctatcggcac cccgttacaa actattagct ccggcggtac atctctctta 360

atgatcgatt ccggtactgg cgacaattta ttcgctgtgg atgtacgtgg cattgaccca 420

gaagaaggcc gtttcaataa cctgcgctta attgttgaac gtaataacct gtatgtaact 480

ggcttcgtaa accgtaccaa caacgtcttt taccgcttcg ctgacttttc tcacgtaacc 540

tttcccggaa caactgcagt aactctctcc ggcgacagtt cctatacgac cctccaacgt 600

gttgcaggta tttctcgcac cggtatgcaa atcaatcgtc actctcttac tacatcgtat 660

ctcgatttaa tgtcacactc cggcacctct ttaacccagt ccgtcgcacg cgcaatgtta 720

cgttttgtta ctgtcacagc agaggctctt cgctttcgtc agattcaacg tggtttccgc 780

acaactcttg atgatttatc tggccgctct tatgtaatga ccgcagaaga tgtagatctg 840

accttgaact ggggccgcct gagcagtgtg ttacctgatt atcacggaca agacagtgca 900

cgtgtaggcc gtatctcctt tggttccatt aacgccattt taggttctgt tgcacttatt 960

ctgaactaag gatcc                                                   975

<210>56

<211>321

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Chemokine-toxin fusion

protein IP-10-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM7

<400>56

Met Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys Ile Ser Ile Ser

 1               5                  10                  15

Asn Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu Glu Ile Ile Pro

            20                  25                  30

Ala Ser Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala Thr Met Lys Lys

        35                  40                  45

Lys Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Ala Ile Lys Asn

    50                  55                  60

Leu Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser Lys Arg Ser Pro Ala Met

65                  70                  75                  80

Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser

                85                  90                  95

Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser

            100                 105                 110

Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn

        115                 120                 125

Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe

    130                 135                 140

Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly

145                 150                 155                 160

Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser

                165                 170                 175

His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser

            180                 185                 190

Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met

        195                 200                 205

Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser

    210                 215                 220

His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg

225                 230                 235                 240

Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg

                245                 250                 255

Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met

            260                 265                 270

Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser

        275                 280                 285

Val Leu Pro Asp Tyr Hi s Gly Gln Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg Ile

    290                 295                 300

Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu

305                 310                 315                 320

Asn

<210>57

<211>972

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein MCP-3-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM8

<400>57

catatgcagc ctgtgggtat caatacctct accacttgtt gctatcgctt tatcaacaaa 60

aagatcccga agcagcgtct cgaatcgtac cgtcgcacga cttccagcca ttgcccgcgt 120

gaggctgtta ttttcaaaac caaacttgat aaagaaattt gcgcggaccc aacccagaaa 180

tgggtacagg atttcatgaa acacttggac aaaaagactc aaaccccgaa actggccatg 240

aaagaattca cactcgactt cagcaccgca aaaacttacg tagactccct gaatgtaatc 300

cgctccgcta tcggcacccc gttacaaact attagctccg gcggtacatc tctcttaatg 360

atcgattccg gtactggcga caatttattc gctgtggatg tacgtggcat tgacccagaa 420

gaaggccgtt tcaataacct gcgcttaatt gttgaacgta ataacctgta tgtaactggc 480

ttcgtaaacc gtaccaacaa cgtcttttac cgcttcgctg acttttctca cgtaaccttt 540

cccggaacaa ctgcagtaac tctctccggc gacagttcct atacgaccct ccaacgtgtt 600

gcaggtattt ctcgcaccgg tatgcaaatc aatcgtcact ctcttactac atcgtatctc 660

gatttaatgt cacactccgg cacctcttta acccagtccg tcgcacgcgc aatgttacgt 720

tttgttactg tcacagcaga ggctcttcgc tttcgtcaga ttcaacgtgg tttccgcaca 780

actcttgatg atttatctgg ccgctcttat gtaatgaccg cagaagatgt agatctgacc 840

ttgaactggg gccgcctgag cagtgtgtta cctgattatc acggacaaga cagtgcacgt 900

gtaggccgta tctcctttgg ttccattaac gccattttag gttctgttgc acttattctg 960

aactaaggat cc                                                     972

<210>58

<211>320

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Chemokine-toxin fusion

protein MCP-3-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM8

<400>58

Met Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe

 1               5                  10                  15

Ile Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr

            20                  25                  30

Thr Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu

        35                  40                  45

Asp Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe

    50                  55                  60

Met Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu Ala Met Lys

65                  70                  75                  80

Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu

                85                  90                  95

Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser

            100                 105                 110

Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu

        115                 120                 125

Phe Ala Val Asp Val Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn

    130                 135                 140

Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe

145                 150                 155                 160

Val Asn Arg Thr Asn Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His

                165                 170                 175

Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser

            180                 185                 190

Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln

        195                 200                 205

Ile Asn Arg His Ser Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His

    210                 215                 220

Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe

225                 230                 235                 240

Val Thr Val Thr Ala Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly

                245                 250                 255

Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr

            260                 265                 270

Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val

        275                 280                 285

Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg Ile Ser

    290                 295                 300

Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn

305                 310                 315                 320

<210>59

<211>954

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein MIP-3alpha-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM9

<400>59

catatggcaa gcaactttga ttgttgtctg ggttataccg accgcattct gcatccgaaa 60

ttcattgtcg gcttcactcg tcagctggct aatgaaggtt gcgacatcaa cgccatcatc 120

ttceacacca aaaagaaact ctccgtatgc gcgaacccaa aacagacgtg ggttaaatac 180

atcgttcgtc tgctttctaa aaaggtgaag aacatggcca tgaaagaatt cacactcgac 240

ttcagcaccg caaaaactta cgtagactcc ctgaatgtaa tccgctccgc tatcggcacc 300

ccgttacaaa ctattagctc cggcggtaca tctctcttaa tgatcgattc cggtactggc 360

gacaatttat tcgctgtgga tgtacgtggc attgacccag aagaaggccg tttcaataac 420

ctgcgcttaa ttgttgaacg taataacctg tatgtaactg gcttcgtaaa ccgtaccaac 480

aacgtctttt accgcttcgc tgacttttct cacgtaacct ttcccggaac aactgcagta 540

actctctccg gcgacagttc ctatacgacc ctccaacgtg ttgcaggtat ttctcgcacc 600

ggtatgcaaa tcaatcgtca ctctcttact acatcgtatc tcgatttaat gtcacactcc 660

ggcacctctt taacccagtc cgtcgcacgc gcaatgttac gttttgttac tgtcacagca 720

gaggctcttc gctttcgtca gattcaacgt ggtttccgca caactcttga tgatttatct 780

ggccgctctt atgtaatgac cgcagaagat gtagatctga ccttgaactg gggccgcctg 840

agcagtgtgt tacctgatta tcacggacaa gacagtgcac gtgtaggccg tatctccttt 900

ggttccatta acgccatttt aggttctgtt gcacttattc tgaactaagg atcc       954

<210>60

<211>314

<212>PRT

<213>Artiificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Chemokine-toxin fusion

protein MIP-3alpha-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM9

<400>60

Met Ala Ser Asn Phe Asp Cys Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu

 1               5                  10                  15

His Pro Lys Phe Ile Val Gly Phe Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly

            20                  25                  30

Cys Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val

        35                  40                  45

Cys Ala Asn Pro Lys Gln Thr Trp Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu

    50                  55                  60

Ser Lys Lys Val Lys Asn Met Ala Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe

65                  70                  75                  80

Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala

                85                  90                  95

Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu

            100                 105                 110

Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg

        115                 120                 125

Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val

    130                 135                 140

Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn

145                 150                 155                 160

Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr

                165                 170                 175

Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg

            180                 185                 190

Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu

        195                 200                 205

Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr

    210                 215                 220

Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu

225                 230                 235                 240

Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp

                245                 250                 255

Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu

            260                 265                 270

Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly

275                 280                 285

Gln Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala

                290                 295                 300

Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn

305                 310

<210>61

<211>951

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein MDC-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM10

<400>61

catatgggtc catacggtgc gaatatggag gactccgtgt gctgtcgtga ttatgtccgt 60

tatcgtctgc ctctgcgtgt ggttaaacac ttttactgga cttctgactc ttgcccgcgc 120

ccgggcgttg ttctgctgac cttccgtgac aaagaaattt gcgctgatcc gcgcgttccg 180

tgggtaaaaa tgatcctgaa caagctgagc caggccatga aagaattcac actcgacttc 240

agcaccgcaa aaacttacgt agactccctg aatgtaatcc gctccgctat cggcaccccg 300

ttacaaacta ttagctccgg cggtacatct ctcttaatga tcgattccgg tactggcgac 360

aatttattcg ctgtggatgt acgtggcatt gacccagaag aaggccgttt caataacctg 420

cgcttaattg ttgaacgtaa taacctgtat gtaactggct tcgtaaaccg taccaacaac 480

gtcttttacc gcttcgctga cttttctcac gtaacctttc ccggaacaac tgcagtaact 540

ctctccggcg acagttccta tacgaccctc caacgtgttg caggtatttc tcgcaccggt 600

atgcaaatca atcgtcactc tcttactaca tcgtatctcg atttaatgtc acactccggc 660

acctctttaa cccagtccgt cgcacgcgca atgttacgtt ttgttactgt cacagcagag 720

gctcttcgct ttcgtcagat tcaacgtggt ttccgcacaa ctcttgatga tttatctggc 780

cgctcttatg taatgaccgc agaagatgta gatctgacct tgaactgggg ccgcctgagc 840

agtgtgttac ctgattatca cggacaagac agtgcacgtg taggccgtat ctcctttggt 900

tccattaacg ccattttagg ttctgttgca cttattctga actaaggatc c    951

<210>62

<211>313

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificia1 Sequence：Chemokine-toxin fusion

protein MDC-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM10

<400>62

Met Gly Pro Tyr Gly Ala Asn Met Glu Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp

 1               5                  10                  15

Tyr Val Arg Tyr Arg Leu Pro Leu Arg Val Val Lys His Phe Tyr Trp

            20                  25                  30

Thr Ser Asp Ser Cys Pro Arg Pro Gly Val Val Leu Leu Thr Phe Arg

        35                  40                  45

Asp Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Arg Val Pro Trp Val Lys Met Ile

    50                  55                  60

Leu Asn Lys Leu Ser Gln Ala Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser

65                  70                  75                  80

Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile

                85                  90                  95

Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met

            100                 105                 110

Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly

        115                 120                 125

Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu

    130                 135                 140

Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val

145                 150                 155                 160

Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr

                165                 170                 175

Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val

            180                 185                 190

Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr

        195                 200                 205

Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln

    210                 215                 220

Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe ValThr Val Thr Ala Glu Ala

225                 230                 235                 240

Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp

                245                 250                 255

Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr

            26 0                265                 270

Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln

        275                 280                 285

Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile

    290                 295                 300

Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn

305                 310

<210>63

<211>951

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein MIP-1alpha-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM11

<400>63

catatgtctc tggcggctga taccccgact gcatgttgct tctcttacac gtcccgccag 60

atcccacaga acttcatcgc cgattatttt gaaacctcct ctcaatgcag caaacctggt 120

gtaattttcc tgaccaagcg tagccgtcag gtctgcgctg acccgtccga ggaatgggtt 180

cagaaatacg tgtctgacct ggaactgagc gcggccatga aagaattcac actcgacttc 240

agcaccgcaa aaacttacgt agactccctg aatgtaatcc gctccgctat cggcaccccg 300

ttacaaacta ttagctccgg cggtacatct ctcttaatga tcgattccgg tactggcgac 360

aatttattcg ctgtggatgt acgtggcatt gacccagaag aaggccgttt caataacctg 420

cgcttaattg ttgaacgtaa taacctgtat gtaactggct tcgtaaaccg taccaacaac 480

gtcttttacc gcttcgctga cttttctcac gtaacctttc ccggaacaac tgcagtaact 540

ctctccggcg acagttccta tacgaccctc caacgtgttg caggtatttc tcgcaccggt 600

atgcaaatca atcgtcactc tcttactaca tcgtatctcg atttaatgtc acactccggc 660

acctctttaa cccagtccgt cgcacgcgca atgttacgtt ttgttactgt cacagcagag 720

gctcttcgct ttcgtcagat tcaacgtggt ttccgcacaa ctcttgatga tttatctggc 780

cgctcttatg taatgaccgc agaagatgta gatctgacct tgaactgggg ccgcctgagc 840

agtgtgttac ctgattatca cggacaagac agtgcacgtg taggccgtat ctcctttggt 900

tccattaacg ccattttagg ttctgttgca cttattctga actaaggatc c          951

<210>64

<211>313

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Chemokine-toxin fusion

protein MIP-1alpha-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM11

<400>64

Met Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr

 1               5                  10                  15

Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser

            20                  25                  30

Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg

        35                  40                  45

Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser

    50                  55                  60

Asp Leu Glu Leu Ser Ala Ala Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp Phe Ser

65                  70                  75                  80

Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser Ala Ile

                85                  90                  95

Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu Leu Met

            100                 105                 110

Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val Arg Gly

        115                 120                 125

Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile Val Glu

    130                 135                 140

Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn Asn Val

145                 150                 155                 160

Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly Thr Thr

                165                 170                 175

Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln Arg Val

            180                 185                 190

Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln Ile Asn Arg His Ser Leu Thr

        195                 200                 205

Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Leu Thr Gln

    210215220

Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala Glu Ala

225                 230                 235                 240

Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu Asp Asp

                245                 250                 255

Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp Leu Thr

            260                 265                 270

Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr His Gly Gln

        275                 280                 285

Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn Ala Ile

    290                 295                 300

Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn

305                 310

<210>65

<211>966

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusio nprotein Eotaxin-1-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM12

<400>65

catatgggcc ctgcctccgt tccaaccacc tgctgtttta atctcgccaa tcgtaaaatc 60

ccccttcaac gcttagaatc ttaccgtcgt attacctctg gaaaatgccc tcaaaaagcc 120

gtaatcttta aaaccaaact tgccaaagac atctgtgccg atccaaaaaa aaaatgggtt 180

caagactcaa tgaaatatct cgaccaaaaa tctccaactc ccaaacctgc catgaaagaa 240

ttcacactcg acttcagcac cgcaaaaact tacgtagact ccctgaatgt aatccgctcc 300

gctatcggca ccccgttaca aactattagc tccggcggta catctctctt aatgatcgat 360

tccggtactg gcgacaattt attcgctgtg gatgtacgtg gcattgaccc agaagaaggc 420

cgtttcaata acctgcgctt aattgttgaa cgtaataacc tgtatgtaac tggcttcgta 480

aaccgtacca acaacgtctt ttaccgcttc gctgactttt ctcacgtaac ctttcccgga 540

acaactgcag taactctctc cggcgacagt tcctatacga ccctccaacg tgttgcaggt 600

atttctcgca ccggtatgca aatcaatcgt cactctctta ctacatcgta tctcgattta 660

atgtcacact ccggcacctc tttaacccag tccgtcgcac gcgcaatgtt acgttttgtt 720

actgtcacag cagaggctct tcgctttcgt cagattcaac gtggtttccg cacaactctt 780

gatgatttat ctggccgctc ttatgtaatg accgcagaag atgtagatct gaccttgaac 840

tggggccgcc tgagcagtgt gttacctgat tatcacggac aagacagtgc acgtgtaggc 900

cgtatctcct ttggttccat taacgccatt ttaggttctg ttgcacttat tctgaactaa 960

ggatcc                                                            966

<210>66

<211>1005

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein BCA-1-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM13

<400>66

catatggttc tggaagtgta ctataccagc ctgcgctgcc gctgcgtgca agaatcctct 60

gttttcatcc ctcgtcgctt catcgaccgt atccagattc tgccgcgtgg taacggctgc 120

ccgcgtaaag aaatcatcgt gtggaaaaag aacaaatcta tcgtttgtgt agatccgcag 180

gcggagtgga ttcagcgtat gatggaagtt ctgcgcaaac gtagctcttc caccctgcca 240

gtaccggtct ttaaacgtaa aattccggcc atgaaagaat tcacactcga cttcagcacc 300

gcaaaaactt acgtagactc cctgaatgta atccgctccg ctatcggcac cccgttacaa 360

actattagct ccggcggtac atctctctta atgatcgatt ccggtactgg cgacaattta 420

ttcgctgtgg atgtacgtgg cattgaccca gaagaaggcc gtttcaataa cctgcgctta 480

attgttgaac gtaataacct gtatgtaact ggcttcgtaa accgtaccaa caacgtcttt 540

taccgcttcg ctgacttttc tcacgtaacc tttcccggaa caactgcagt aactctctcc 600

ggcgacagtt cctatacgac cctccaacgt gttgcaggta tttctcgcac cggtatgcaa 660

atcaatcgtc actctcttac tacatcgtat ctcgatttaa tgtcacactc cggcacctct 720

ttaacccagt ccgtcgcacg cgcaatgtta cgttttgtta ctgtcacagc agaggctctt 780

cgctttcgtc agattcaacg tggtttccgc acaactcttg atgatttatc tggccgctct 840

tatgtaatga ccgcagaaga tgtagatctg accttgaact ggggccgcct gagcagtgtg 900

ttacctgatt atcacggaca agacagtgea cgtgtaggcc gtatctcctt tggttccatt 960

aacgccattt taggttctgt tgcacttatt ctgaactaag gatcc                 1005

<210>67

<211>331

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Chemokine-toxin fusion

protein BCA-1-AM-Shiga-A1Variant 4

<220>

<223>LPM13

<400>67

Met Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln

 1               5                  10                  15

Glu Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile

            20                  25                  30

Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys

        35                  40                  45

Lys Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln

    50                  55                  60

Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser Ser Thr Leu Pro Val

65                  70                  75                  80

Pro Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro Ala Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp

                85                  90                  95

Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser

            100                 105                 110

Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu

        115                 120                 125

Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val

    130                 135                 140

Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg LeuIle

145                 150                 155                 160

Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn

                165                 170                 175

Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly

            180                 185                 190

Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln

        195                 200                 205

Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln Ile Asn Arg His Ser

    210                 215                 220

Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Leu

225                 230                 235                 240

Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala

                245                 250                 255

Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu

            260                 265                 270

Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp

        275                 280                 285

Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr Hi s

    290                 295                 300

Gly Gln Asp Ser Ala Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Gly SerIle Asn

305                 310                 315                 320

Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn

                325                 330

<210>68

<211>228

<212>DNA

<213>Homo sapien

<220>

<223>Mature MCP-1

<400>68

caacctgacg caatcaacgc tcctgtcacc tgttgttaca attttaccaa tcgcaaaatt 60

tctgtccaac gtcttgcatc ttatcgccgt attacttcct ctaaatgtcc taaagaagcc 120

gtcattttca aaaccattgt tgcaaaagaa atctgtgccg acccgaaaca aaaatgggta 180

caagactcca  tggaccacct cgataaacaa actcaaaccc caaaaaca             228

<210>69

<211>76

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>Mature MCP-1

<400>69

Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr

 1               5                  10                  15

Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr

            20                  25                  30

Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala

        35                  40                  45

Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met

    50                  55                  60

Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr

65                  70                  75

<210>70

<211>231

<212>DNA

<213>Homo sapien

<220>

<223>Mature MCP-1wi th N-Terminal Methionine

<400>70

atgcaacctg acgcaatcaa cgctcc tgtc acctgttgtt acaattttac caatcgcaaa 60

atttctgtcc aacgtcttgc atcttatcgc cgtattactt cctctaaatg tcctaaagaa 120

gccgtcattt tcaaaaccat tgttgcaaaa gaaatctgtg ccgacccgaa acaaaaatgg 180

gtacaagact ccatggacca cctcgataaa caaactcaaa ccccaaaaac a          231

<210>71

<211>77

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>Mature MCP-1with N-Terminal Methionine

<400>71

Met Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe

 1               5                  10                  15

Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile

            20                  25                  30

Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val

        35                  40                  45

Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser

    50                  55                  60

Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr

65                  70                  75

<210>72

<211>243

<212>DNA

<213>Homo sapien

<220>

<223>Eotaxin construct

<400>72

catatgggcc ccgcatccgt tccaactaca tgttgtttta atctggcgaa ccgcaagatt 60

cctctccagc gtcttgaatc atacagacgg atcacgtctg gtaaatgccc gcaaaaggcc 120

gtgatattca aaaccaaatt ggcgaaagat atctgcgctg accctaagaa aaagtgggta 180

caggactcga tgaagtatct ggatcaaaaa agcccaaccc cgaaaccggc catgaaagaa 240

ttc                                                               243

<210>73

<211>237

<212>DNA

<213>Homo sapien

<220>

<223>SDF-1beta construct

<400>73

catatgaagc cggtgtctct gtcctaccgt tgcccatgta gatttttcga gagccatgtt  60

gcccgggcaa acgttaaaca cctaaagata ctcaataccc ctaactgtgc gttacagatc  120

gtcgcgaggc ttaaaaacaa taaccgccaa gtatgcatcg accccaagtt gaagtggatt  180

caggaatatc tggaaaaagc tctgaataaa cgattcaaaa tggccatgaa agaattc     237

<210>74

<211>240

<212>DNA

<213>Homo sapien

<220>

<223>GRO-alpha construct

<400>74

catatggcgt ccgttgctac cgagctgcgt tgtcagtgcc tgcaaactct gcagggtatc 60

cacccgaaaa acatccagag cgtaaacgtg aaatctccag gtccgcactg cgcgcagacc 120

gaagttattg ctaccctgaa aaacggccgt aaagcgtgtc tgaacccggc ctccccgatc 180

gttaagaaaa ttatcgaaaa gatgctgaac tctgacaaaa gcaatgcaat gaaagaattc 240

<210>75

<211>228

<212>DNA

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-1beta construct

<400>75

catatggctc cgatgggttc tgacccgccg actgcttgct gtttttctta taccgcacgt 60

aaactgccgc gtaacttcgt tgttgactac tacgagacct cctctctgtg ctctcagcca 120

gccgtagtct tccagaccaa gcgcagcaaa caggtgtgcg cggatccttc cgaaagctgg 180

gtgcaagaat atgtttacga tctggaactg aacgcgatga aagaattc              228

<210>76

<211>252

<212>DNA

<213>Homo sapien

<220>

<223>IL-8 construct

<400>76

catatggcgg tcctgccacg ttccgcgaaa gaactgcgct gccagtgcat taagacctac 60

agcaaaccgt ttcacccgaa attcatcaaa gaactgcgtg ttatcgagtc tggtccgcac 120

tgtgcaaaca ccgaaattat cgttaaactg tctgatggcc gtgaactgtg cctggacccg 180

aaagagaact gggtgcagcg tgtggtagaa aagttcctga aacgcgccga aaattccgct 240

atgaaagaat tc                                                     252

<210>77

<211>252

<212>DNA

<213>Homo sapien

<220>

<223>IP-l0 construct

<400>77

catatggttc cgctgtctcg caccgttcgt tgtacttgca tctctatctc taatcagccg 60

gtcaacccgc gcagcctgga aaaactggaa atcatcccgg cgtcccagtt ctgccctcgt 120

gtggaaatta tcgctaccat gaagaagaaa ggtgagaagc gttgcctgaa cccagagtct 180

aaagcaatta aaaacctgct gaaagctgta tccaaagaac ggtcgaaacg tagcccggcg 240

atgaaagaat tc                                                     252

<210>78

<211>249

<212>DNA

<213>Homo sapien

<220>

<223>MCP-3construct

<400>78

catatgcagc ctgtgggtat caatacctct accacttgtt gctatcgctt tatcaacaaa 60

aagatcccga agcagcgtct cgaatcgtac cgtcgcacga cttccagcca ttgcccgcgt 120

gaggctgtta ttttcaaaac caaacttgat aaagaaattt gcgcggaccc aacccagaaa 180

tgggtacagg atttcatgaa acacttggac aaaaagactc aaaccccgaa actggccatg 240

aaagaattc                                                         249

<210>79

<211>231

<212>DNA

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-3alpha construct

<400>79

catatggcaa gcaactttga ttgttgtctg ggttataccg accgcattct gcatccgaaa  60

ttcattgtcg gcttcactcg tcagctggct aatgaaggtt gcgacatcaa cgccatcatc  120

ttccacacca aaaagaaact ctccgtatgc gcgaacccaa aacagacgtg ggttaaatac  180

atcgttcgtc tgctttctaa aaaggtgaag aacatggcca tgaaagaatt c           231

<210>80

<211>228

<212>DNA

<213>Homo sapien

<220>

<223>MDC construct

<400>80

catatgggtc catacggtgc gaatatggag gactccgtgt gctgtcgtga ttatgtccgt 60

tatcgtctgc ctctgcgtgt ggttaaacac ttttactgga cttctgactc ttgcccgcgc 120

ccgggcgttg ttctgctgac cttccgtgac aaagaaattt gcgctgatcc gcgcgttccg 180

tgggtaaaaa tgatcctgaa caagctgagc caggccatga aagaattc              228

<210>81

<211>228

<212>DNA

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-1alpha construct

<400>81

catatgtctc tggcggctga taccccgact gcatgttgct tctcttacac gtcccgccag 60

atcccacaga acttcatcgc cgattatttt gaaacctcct ctcaatgcag caaacctggt 120

gtaattttcc tgaccaagcg tagccgtcag gtctgcgctg acccgtccga ggaatgggtt 180

cagaaatacg tgtctgacct ggaactgagc gcggccatga aagaattc              228

<210>82

<211>243

<212>DNA

<213>Homo sapien

<220>

<223>Eotaxin construct(Blue Heron)

<400>82

catatgggcc ctgcctccgt tccaaccacc tgctgtttta atctcgccaa tcgtaaaatc 60

ccccttcaac gcttagaatc ttaccgtcgt attacctctg gaaaatgccc tcaaaaagcc 120

gtaatcttta aaaccaaact tgccaaagac atctgtgccg atccaaaaaa aaaatgggtt 180

caagactcaa tgaaatatct cgaccaaaaa tctccaactc ccaaacctgc catgaaagaa 240

ttc                                                               243

<210>83

<211>282

<212>DNA

<213>Homo sapien

<220>

<223>BCA-1construct

<400>83

catatggttc tggaagtgta ctataccagc ctgcgctgcc gctgcgtgca agaatcctct 60

gttttcatcc ctcgtcgctt catcgaccgt atccagattc tgccgcgtgg taacggctgc 120

ccgcgtaaag aaatcatcgt gtggaaaaag aacaaatcta tcgtttgtgt agatccgcag 180

gcggagtgga ttcagcgtat gatggaagtt ctgcgcaaac gtagctcttc caccctgcca 240

gtaccggtct ttaaacgtaa aattccggcc atgaaagaat tc                    282

<210>84

<211>4339

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：pET9C Vector(Novagen)

<400>84

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa 60

ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120

caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180

gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata 240

tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg 300

ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac 360

cacacccgtc ctgtggatat ccggatatag ttcctccttt cagcaaaaaa cccctcaaga 420

cccgtttaga ggccccaagg ggttatgcta gttattgctc agcggtggca gcagccaact 480

cagcttcctt tcgggctttg ttagcagccg gatccgaccc atttgctgtc caccagtcat 540

gctagccata tgtatatctc cttcttaaag ttaaacaaaa ttatttctag agggaaaccg 600

ttgtggtctc cctatagtga gtcgtattaa tttcgcggga tcgagatctc gatcctctac 660

gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc 720

gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc 780

ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat 840

gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta 900

atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc 960

agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt 1020

atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc 1080

tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc 1140

ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt 1200

atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc 1260

tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg 1320

caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc 1380

gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc 1440

gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc 1500

tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg aatggaagcc 1560

ggcggcacct cgctaacgga ttcaccactc caagaattgg agccaatcaa ttcttgcgga 1620

gaactgtgaa tgcgcaaacc aacccttggc agaacatatc catcgcgtcc gccatctcca 1680

gcagccgcac gcggcgcatc tcgggcagcg ttgggtcctg gccacgggtg cgcatgatcg 1740

tgctcctgtc gttgaggacc cggctaggct ggcggggttg ccttactggt tagcagaatg 1800

aatcaccgat acgcgagcga acgtgaagcg actgctgctg caaaacgtct gcgacctgag 1860

caacaacatg aatggtcttc ggtttccgtg tttcgtaaag tctggaaacg cggaagtcag 1920

cgccctgcac cattatgttc cggatctgca tcgcaggatg ctgctggcta ccctgtggaa 1980

cacctacatc tgtattaacg aagcgctggc attgaccctg agtgattttt ctctggtccc 2040

gccgcatcca taccgccagt tgtttaccct cacaacgttc cagtaaccgg gcatgttcat 2100

catcagtaac ccgtatcgtg agcatcctct ctcgtttcat cggtatcatt acccccatga 2160

acagaaatcc cccttacacg gaggcatcag tgaccaaaca ggaaaaaacc gcccttaaca 2220

tggcccgctt tatcagaagc cagacattaa cgcttctgga gaaactcaac gagctggacg 2280

cggatgaaca ggcagacatc tgtgaatcgc ttcacgacca cgctgatgag ctttaccgca 2340

gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga 2400

cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag 2460

cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt 2520

atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatatgcgg 2580

tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc 2640

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 2700

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 2760

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 2820

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 2880

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 2940

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 3000

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 3060

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 3120

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 3180

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 3240

tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 3300

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 3360

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 3420

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgaacaat 3480

aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata ttcaacggga 3540

aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa 3600

atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc 3660

cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga 3720

tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt 3780

tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga aaacagcatt 3840

ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt 3900

cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt 3960

tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga 4020

tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata agcttttgcc 4080

attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga 4140

cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca 4200

ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct 4260

ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct 4320

cgatgagttt ttctaagaa                                              4339

<210>85

<211>2686

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：pUC19 Vector

<400>85

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccggggat 420

cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 480

gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 540

aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 600

gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 660

agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 720

gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 780

gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 840

cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 900

aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 960

tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 1020

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 1080

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 1140

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 1200

ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 1260

gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 1320

atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 1380

aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1440

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 1500

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 1560

cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 1620

gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 1680

tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 1740

ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 1800

ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 1860

atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 1920

cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 1980

tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 2040

aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 2100

tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 2160

ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 2220

agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 2280

gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 2340

agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 2400

accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 2460

gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 2520

cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 2580

ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 2640

atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc                2686

<210>86

<211>3171

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：pUC Plasmid M(minus MCS)

<400>86

gaaagtcctc tccactgact gtagcctcca attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 60

actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 120

gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 180

atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 240

gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt 300

ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc 360

tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg 420

gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgattt 480

gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt 540

ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat 600

ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa 660

tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt 720

atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc 780

gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca 840

agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg 900

cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 960

ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 1020

atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1080

tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1140

cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1200

agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1260

taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 1320

tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 1380

catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 1440

ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 1500

ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 1560

catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 1620

aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 1680

aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 1740

taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 1800

atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 1860

gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 1920

tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 1980

ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 2040

gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 2100

agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 2160

aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 2220

agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 2280

tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 2340

atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 2400

taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 2460

gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 2520

gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 2580

aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 2640

tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 2700

gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 2760

cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 2820

ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 2880

cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 2940

ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 3000

gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 3060

gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 3120

ctatgaccat gattacgcca agctccttcc tcttccagcc cttcctcttt c          3171

<210>87

<211>5675

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：pET-11c Vector(Novagen)

<400>87

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa 60

ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120

caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180

gcgggatatc cggatatagt tcctcctttc agcaaaaaac ccctcaagac ccgtttagag 240

gccccaaggg gttatgctag ttattgctca gcggtggcag cagccaactc agcttccttt 300

cgggctttgt tagcagccgg atccgaccca tttgctgtcc accagtcatg ctagccatat 360

gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga ggggaattgt tatccgctca 420

caattcccct atagtgagtc gtattaattt cgcgggatcg agatctcgat cctctacgcc 480

ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc 540

gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc 600

gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca 660

ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg 720

caggagtcgc ataagggaga gcgtcgagat cccggacacc atcgaatggc gcaaaacctt 780

tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc 840

agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt 900

ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc 960

ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct 1020

gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat 1080

taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg 1140

cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat 1200

cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt 1260

tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca 1320

tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc 1380

gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa 1440

atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat 1500

gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct 1560

ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg 1620

cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat 1680

cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 1740

cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact 1800

ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 1860

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 1920

acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg atgcccttga 1980

gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac 2040

ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctctgggtca 2100

ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat 2160

tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg 2220

gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccgacgc gctgggctac gtcttgctgg 2280

cgttcgcgac gcgaggctgg atggccttcc ccattatgat tcttctcgct tccggcggca 2340

tcgggatgcc cgcgttgcag gccatgctgt ccaggcaggt agatgacgac catcagggac 2400

agcttcaagg atcgctcgcg gctcttacca gcctaacttc gatcactgga ccgctgatcg 2460

tcacggcgat ttatgccgcc tcggcgagca catggaacgg gttggcatgg attgtaggcg 2520

ccgccctata ccttgtctgc ctccccgcgt tgcgtcgcgg tgcatggagc cgggccacct 2580

cgacctgaat ggaagccggc ggcacctcgc taacggattc accactccaa gaattggagc 2640

caatcaattc ttgcggagaa ctgtgaatgc gcaaaccaac ccttggcaga acatatccat 2700

cgcgtccgcc atctccagca gccgcacgcg gcgcatctcg ggcagcgttg ggtcctggcc 2760

acgggtgcgc atgatcgtgc tcctgtcgtt gaggacccgg ctaggctggc ggggttgcct 2820

tactggttag cagaatgaat caccgatacg cgagcgaacg tgaagcgact gctgctgcaa 2880

aacgtctgcg acctgagcaa caacatgaat ggtcttcggt ttccgtgttt cgtaaagtct 2940

ggaaacgcgg aagtcagcgc cctgcaccat tatgttccgg atctgcatcg caggatgctg 3000

ctggctaccc tgtggaacac ctacatctgt attaacgaag cgctggcatt gaccctgagt 3060

gatttttctc tggtcccgcc gcatccatac cgccagttgt ttaccctcac aacgttccag 3120

taaccgggca tgttcatcat cagtaacccg tatcgtgagc atcctctctc gtttcatcgg 3180

tatcattacc cccatgaaca gaaatccccc ttacacggag gcatcagtga ccaaacagga 3240

aaaaaccgcc cttaacatgg cccgctttat cagaagccag acattaacgc ttctggagaa 3300

actcaacgag ctggacgcgg atgaacaggc agacatctgt gaatcgcttc acgaccacgc 3360

tgatgagctt taccgcagct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 3420

catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 3480

ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg 3540

tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga 3600

gtgcaccata tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca 3660

ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 3720

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 3780

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 3840

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 3900

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 3960

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 4020

cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 4080

ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 4140

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 4200

ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 4260

ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 4320

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 4380

gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 4440

atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 4500

ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 4560

gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 4620

tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 4680

ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 4740

taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 4800

gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 4860

gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 4920

ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 4980

aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 5040

gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 5100

cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 5160

actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 5220

caacacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 5280

gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 5340

ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 5400

caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 5460

tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 5520

gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 5580

cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 5640

ataggcgtat cacgaggccc tttcgtcttc aagaa                            5675

<210>88

<211>4338

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：pET-9d Plasmid

<400>88

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa 60

ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120

caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180

gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata 240

tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg 300

ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac 360

cacacccgtc ctgtggatat ccggatatag ttcctccttt cagcaaaaaa cccctcaaga 420

cccgtttaga ggccccaagg ggttatgcta gttattgctc agcggtggca gcagccaact 480

cagcttcctt tcgggctttg ttagcagccg gatccgaccc atttgctgtc caccagtcat 540

gctagccatg gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga gggaaaccgt 600

tgtggtctcc ctatagtgag tcgtattaat ttcgcgggat cgagatctcg atcctctacg 660

ccggacgcat cgtggccggc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg 720

ccgacatcac cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg 780

gcgtgggtat ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg 840

caccattcct tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaacct actactgggc tgcttcctaa 900

tgcaggagtc gcataaggga gagcgtcgac cgatgccctt gagagccttc aacccagtca 960

gctccttccg gtgggcgcgg ggcatgacta tcgtcgccgc acttatgact gtcttcttta 1020

tcatgcaact cgtaggacag gtgccggcag cgctctgggt cattttcggc gaggaccgct 1080

ttcgctggag cgcgacgatg atcggcctgt cgcttgcggt attcggaatc ttgcacgccc 1140

tcgctcaagc cttcgtcact ggtcccgcca ccaaacgttt cggcgagaag caggccatta 1200

tcgccggcat ggcggccgac gcgctgggct acgtcttgct ggcgttcgcg acgcgaggct 1260

ggatggcctt ccccattatg attcttctcg cttccggcgg catcgggatg cccgcgttgc 1320

aggccatgct gtccaggcag gtagatgacg accatcaggg acagcttcaa ggatcgctcg 1380

cggctcttac cagcctaact tcgatcactg gaccgctgat cgtcacggcg atttatgccg 1440

cctcggcgag cacatggaac gggttggcat ggattgtagg cgccgcccta taccttgtct 1500

gcctccccgc gttgcgtcgc ggtgcatgga gccgggccac ctcgacctga atggaagccg 1560

gcggcacctc gctaacggat tcaccactcc aagaattgga gccaatcaat tcttgcggag 1620

aactgtgaat gcgcaaacca acccttggca gaacatatcc atcgcgtccg ccatctccag 1680

cagccgcacg cggcgcatct cgggcagcgt tgggtcctgg ccacgggtgc gcatgatcgt 1740

gctcctgtcg ttgaggaccc ggctaggctg gcggggttgc cttactggtt agcagaatga 1800

atcaccgata cgcgagcgaa cgtgaagcga ctgctgctgc aaaacgtctg cgacctgagc 1860

aacaacatga atggtcttcg gtttccgtgt ttcgtaaagt ctggaaacgc ggaagtcagc 1920

gccctgcacc attatgttcc ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac 1980

acctacatct gtattaacga agcgctggca ttgaccctga gtgatttttc tctggtcccg 2040

ccgcatccat accgccagtt gtttaccctc acaacgttcc agtaaccggg catgttcatc 2100

atcagtaacc cgtatcgtga gcatcctctc tcgtttcatc ggtatcatta cccccatgaa 2160

cagaaatccc ccttacacgg aggcatcagt gaccaaacag gaaaaaaccg cccttaacat 2220

ggcccgcttt atcagaagcc agacattaac gcttctggag aaactcaacg agctggacgc 2280

ggatgaacag gcagacatct gtgaatcgct tcacgaccac gctgatgagc tttaccgcag 2340

ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 2400

ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 2460

gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta 2520

tactggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatatgcggt 2580

gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 2640

cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 2700

aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 2760

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 2820

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 2880

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 2940

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 3000

ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 3060

gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 3120

agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 3180

gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 3240

acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 3300

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 3360

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 3420

cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgaacaata 3480

aaactgtctg cttacataaa cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa 3540

acgtcttgct cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg ctgatttata tgggtataaa 3600

tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct atcgattgta tgggaagccc 3660

gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat 3720

gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt 3780

atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccgggaa aacagcattc 3840

caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc 3900

ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt 3960

cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat 4020

gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa gcttttgcca 4080

ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac 4140

gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag 4200

gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt 4260

tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc 4320

gatgagtttt tctaagaa                                               4338

<210>89

<211>299

<212>PRT

<213>Saponaria officinalis

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein Saporin-6Precursor

<400>89

Met Lys Ile Tyr Val Val Ala Thr Ile Ala Trp Ile Leu Leu Gln Phe

 1               5                  10                  15

Ser Ala Trp Thr Thr Thr Asp Ala Val Thr Ser Ile Thr Leu Asp Leu

            20                  25                  30

Val Asn Pro Thr Ala Gly Gln Tyr Ser Ser Phe Val Asp Lys Ile Arg

        35                  40                  45

Asn Asn Val Lys Asp Pro Asn Leu Lys Tyr Gly Gly Thr Asp Ile Ala

    50                  55                  60

Val Ile Gly Pro Pro Ser Lys Glu Lys Phe Leu Arg Ile Asn Phe Gln

65                  70                  75                  80

Ser Ser Arg Gly Thr Val Ser Leu Gly Leu Lys Arg Asp Asn Leu Tyr

                85                  90                  95

Val Val Ala Tyr Leu Ala Met Asp Asn Thr Asn Val Asn Arg Ala Tyr

            100                 105                 110

Tyr Phe Arg Ser Glu Ile Thr Ser Ala Glu Ser Thr Ala Leu Phe Pro

        115                 120                 125

Glu Ala Thr Thr Ala Asn Gln Lys Ala Leu Glu Tyr Thr Glu Asp Tyr

    130                 135                 140

Gln Ser Ile Glu Lys Asn Ala Gln Ile Thr Gln Gly Asp Gln Ser Arg

145                 150                 155                 160

Lys Glu Leu Gly Leu Gly Ile Asp Leu Leu Ser Thr Ser Met Glu Ala

                165                 170                 175

Val Asn Lys Lys Ala Arg Val Val Lys Asp Glu Ala Arg Phe Leu Leu

            180                 185                 190

Ile Ala Ile Gln Met Thr Ala Glu Ala Ala Arg Phe Arg Tyr Ile Gln

        195                 200                 205

Asn Leu Val Ile Lys Asn Phe Pro Asn Lys Phe Asn Ser Glu Asn Lys

    210                 215                 220

Val Ile Gln Phe Glu Val Asn Trp Lys Lys Ile Ser Thr Ala Ile Tyr

225                 230                 235                 240

Gly Asp Ala Lys Asn Gly Val Phe Asn Lys Asp Tyr Asp Phe Gly Phe

                245                 250                 255

Gly Lys Val Arg Gln Val Lys Asp Leu Gln Met Gly Leu Leu Met Tyr

            260                 265                 270

Leu Gly Lys Pro Lys Ser Ser Asn Glu Ala Asn Ser Thr Val Arg His

        275                 280                 285

Tyr Gly Pro Leu Lys Pro Thr Leu Leu Ile Thr

    290                 295

<210>90

<211>280

<212>PRT

<213>Hordeum vulgare

<220>

<223>Riboso me-inactivating protein I  (Barley)

<400>90

Ala Ala Lys Met Ala Lys Asn Val Asp Lys Pro Leu Phe Thr Ala Thr

 1               5                  10                  15

Phe Asn Val Gln Ala Ser Ser Ala Asp Tyr Ala Thr Phe Ile Ala Gly

            20                  25                  30

Ile Arg Asn Lys Leu Arg Asn Pro Ala His Phe Ser His Asn Arg Pro

        35                  40                  45

Val Leu Pro Pro Val Glu Pro Asn Val Pro Pro Ser Arg Trp Phe His

    50                  55                  60

Val Val Leu Lys Ala Ser Pro Thr Ser Ala Gly Leu Thr Leu Ala Ile

65                  70                  75                  80

Arg Ala Asp Asn Ile Tyr Leu Glu Gly Phe Lys Ser Ser Asp Gly Thr

                85                  90                  95

Trp Trp Glu Leu Thr Pro Gly Leu Ile Pro Gly Ala Thr Tyr Val Gly

            100                 105                 110

Phe Gly Gly Thr Tyr Arg Asp Leu Leu Gly Asp Thr Asp Lys Leu Thr

        115                 120                 125

Asn Val Ala Leu Gly Arg Gln Gln Leu Ala Asp Ala Val Thr Ala Leu

    130                 135                 140

His Gly Arg Thr Lys Ala Asp Lys Pro Ser Gly Pro Lys Gln Gln Gln

145                 150                 155                 160

Ala Arg Glu Ala Val Thr Thr Leu Leu Leu Met Val Asn Glu Ala Thr

                165                 170                 175

Arg Phe Gln Thr Val Ser Gly Phe Val Ala Gly Leu Leu His Pro Lys

            180                 185                 190

Ala Val Glu Lys Lys Ser Gly Lys Ile Gly Asn Glu Met Lys Ala Gln

        195                 200                 205

Val Asn Gl y Trp Gln Asp Leu Ser Ala Ala Leu Leu Lys Thr Asp Val

    210                 215                 220

Lys Pro Pro Pro Gly Lys Ser Pro Ala Lys Phe Ala Pro Ile Glu Lys

225                 230                 235                 240

Met Gly Val Arg Thr Ala Val Gln Ala Ala Asn Thr Leu Gly Ile Leu

                245                 250                 255

Leu Phe Val Glu Val Pro Gly Gly Leu Thr Val Ala Lys Ala Leu Glu

            260                 265                 270

Leu Phe His Ala Ser Gly Gly Lys

        275                 280

<210>91

<211>280

<212>PRT

<213>Hordeum vulgare

<220>

<223>Ribosome-inactivating proteinII  (Barley)

<400>91

Ala Ala Lys Met Ala Lys Asn Val Asp Lys Pro Leu Phe Thr Ala Thr

 1               5                  10                  15

Phe Asn Val Gln Ala Ser Ser Ala Asp Tyr Ala Thr Phe Ile Ala Gly

            20                  25                  30

Ile Arg Asn Lys Leu Arg Asn Pro Ala His Phe Ser His Asn Glu Pro

        35                  40                  45

Val Leu Pro Pro Val Glu Pro Asn Val Pro Pro Ser Arg Trp Phe His

    50                  55                  60

Val Val Leu Lys Ala Ser Pro Thr Ser Ala Gly Leu Thr Leu Ala Ile

65                  70                  75                  80

Arg Ala Asp Asn Ile Tyr Leu Glu Gly Phe Lys Ser Ser Asp Gly Thr

                85                  90                  95

Trp Trp Glu Leu Thr Pro Gly Leu Ile Pro Gly Ala Thr Tyr Val Gly

            100                 105                 110

Phe Gly Gly Thr Tyr Arg Asp Leu Leu Gly Asp Thr Asp Lys Leu Thr

        115                 120                 125

Asn Val Ala Leu Gly Arg Gln Gln Leu Glu Asp Ala Val Thr Ala Leu

    130                 135                 140

His Gly Arg Thr Lys Ala Asp Lys Ala Ser Gly Pro Lys Gln Gln Gln

145                 150                 155                 160

Ala Arg Glu Ala Val Thr Thr Leu Leu Leu Met Val Asn Glu Ala Thr

                165                 170                 175

Arg Phe Gln Thr Val Ser Gly Phe Val Ala Gly Leu Leu His Pro Lys

            180                 185                 190

Ala Val Glu Lys Lys Ser Gly Lys Ile Gly Asn Glu Met Lys Ala Gln

        195                 200                 205

Val Asn Gly Trp Gln Asp Leu Ser Ala Ala Leu Leu Lys Thr Asp Val

    210                 215                 220

Lys Pro Pro Pro Gly Lys Ser Pro Ala Lys Phe Thr Pro Ile Glu Lys

225                 230                 235                 240

Met Gly Val Arg Thr Ala Glu Gln Ala Ala Ala Thr Leu Gly Ile Leu

                245                 250                 255

Leu Phe Val Glu Val Pro Gly Gly Leu Thr Val Ala Lys Ala Leu Glu

            260                 265                 270

Leu Phe His Ala Ser Gly Gly Lys

        275                 280

<210>92

<211>316

<212>PRT

<213>Gelonium multiflorum

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein Gelonin Precursor

<400>92

Met Lys Gly Asn Met Lys Val Tyr Trp Ile Lys Ile Ala Val Ala Thr

 1               5                  10                  15

Trp Phe Cys Cys Thr Thr Ile Val Leu Gly Ser Thr Ala Arg Ile Phe

            20                  25                  30

Ser Leu Pro Thr Asn Asp Glu Glu Glu Thr Ser Lys Thr Leu Gly Leu

        35                  40                  45

Asp Thr Val Ser Phe Ser Thr Lys Gly Ala Thr Tyr Ile Thr Tyr Val

    50                  55                  60

Asn Phe Leu Asn Glu Leu Arg Val Lys Leu Lys Pro Glu Gly Asn Ser

65                  70                  75                  80

His Gly Ile Pro Leu Leu Arg Lys Lys Cys Asp Asp Pro Gly Lys Cys

                85                  90                  95

Phe Val Leu Val Ala Leu Ser Asn Asp Asn Gly Gln Leu Ala Glu Ile

            100                 105                 110

Ala Ile Asp Val Thr Ser Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln Val Arg Asn

        115                 120                 125

Arg Ser Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Pro Asp Ala Ala Tyr Glu Gly Leu

    130                 135                 140

Phe Lys Asn Thr Ile Lys Thr Arg Leu Hi s Phe Gly Gly Ser Tyr Pro

145                 150                 155                 160

Ser Leu Glu Gly Glu Lys Ala Tyr Arg Glu Thr Thr Asp Leu Gly Ile

                165                 170                 175

Glu Pro Leu Arg Ile Gly Ile Lys Lys Leu Asp Glu Asn Ala Ile Asp

            180                 185                 190

Asn Tyr Lys Pro Thr Glu Ile Ala Ser Ser Leu Leu Val Val Ile Gln

        195                 200                 205

Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Thr Phe Ile Glu Asn Gln Ile Arg

    210                 215                 220

Asn Asn Phe Gln Gln Arg Ile Arg Pro Ala Asn Asn Thr Ile Ser Leu

225                 230                 235                 240

Glu Asn Lys Trp Gly Lys Leu Ser Phe Gln Ile Arg Thr Ser Gly Ala

                245                 250                 255

Asn Gly Met Phe Ser Glu Ala Val Glu Leu Glu Arg Ala Asn Gly Lys

            260                 265                 270

Lys Tyr Tyr Val Thr Ala Val Asp Gln Val Lys Pro Lys Ile Ala Leu

        275                 280                 285

Leu Lys Phe Val Asp Lys Asp Pro Lys Thr Ser Leu Ala Ala Glu Leu

    290                 295                 300

Ile Ile Gln Asn Tyr Glu Ser Leu Val Gly Phe Asp

305                 310                 315

<210>93

<211>576

<212>PRT

<213>Ricinus communis

<220>

<223>Ricin Precursor

<400>93

Met Lys Pro Gly Gly Asn Thr Ile Val Ile Trp Met Tyr Ala Val Ala

 1               5                  10                  15

Thr Trp Leu Cys Phe Gly Ser Thr Ser Gly Trp Ser Phe Thr Leu Glu

            20                  25                  30

Asp Asn Asn Ile Phe Pro Lys Gln Tyr Pro Ile Ile Asn Phe Thr Thr

        35                  40                  45

Ala Gly Ala Thr Val Gln Ser Tyr Thr Asn Phe Ile Arg Ala Val Arg

    50                  55                  60

Gly Arg Leu Thr Thr Gly Ala Asp Val Arg His Glu Ile Pro Val Leu

65                  70                  75                  80

Pro Asn Arg Val Gly Leu Pro Ile Asn Gln Arg Phe Ile Leu Val Glu

                85                  90                  95

Leu Ser Asn His Ala Glu Leu Ser Val Thr Leu Ala Leu Asp Val Thr

            100                 105                 110

Asn Ala Tyr Val Val Gly Tyr Arg Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Phe Phe

        115                 120                 125

His Pro Asp Asn Gln Glu Asp Ala Glu Ala Ile Thr His Leu Phe Thr

    130                 135                 140

Asp Val Gln Asn Arg Tyr Thr Phe Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Asp Arg

145                 150                 155                 160

Leu Glu Gln Leu Ala Gly Asn Leu Arg Glu Asn Ile Glu Leu Gly Asn

                165                 170                 175

Gly Pro Leu Glu Glu Ala Ile Ser Ala Leu Tyr Tyr Tyr Ser Thr Gly

            180                 185                 190

Gly Thr Gln Leu Pro Thr Leu Ala Arg Ser Phe Ile Ile Cys Ile Gln

        195                 200                 205

Met Ile Ser Glu Ala Ala Arg Phe Gln Tyr Ile Glu Gly Glu Met Arg

    210                 215                 220

Thr Arg Ile Arg Tyr Asn Arg Arg Ser Ala Pro Asp Pro Ser Val Ile

225                 230                 235                 240

Thr Leu Glu Asn Ser Trp Gly Arg Leu Ser Thr Ala Ile Gln Glu Ser

                245                 250                 255

Asn Gln Gly Ala Phe Ala Ser Pro Ile Gln Leu Gln Arg Arg Asn Gly

            260                 265                 270

Ser Lys Phe Ser Val Tyr Asp Val Ser Ile Leu Ile Pro Ile Ile Ala

        275                 280                 285

Leu Met Val Tyr Arg Cys Ala Pro Pro Pro Ser Ser Gln Phe Ser Leu

    290                 295                 300

Leu Ile Arg Pro Val Val Pro Asn Phe Asn Ala Asp Val Cys Met Asp

305                 310                 315                 320

Pro Glu Pro Ile Val Arg Ile Val Gly Arg Asn Gly Leu Cys Val Asp

                325                 330                 335

Val Arg Asp Gly Arg Phe Hi s Asn Gly Asn Ala Ile Gln Leu Trp Pro

            340                 345                 350

Cys Lys Ser Asn Thr Asp Ala Asn Gln Leu Trp Thr Leu Lys Arg Asp

        355                 360                 365

Asn Thr Ile Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu Thr Thr Tyr Gly Tyr Ser

    370                 375                 380

Pro Gly Val Tyr Val Met Ile Tyr Asp Cys Asn Thr Ala Ala Thr Asp

385                 390                 395                 400

Ala Thr Arg Trp Gln Ile Trp Asp Asn Gly Thr Ile Ile Asn Pro Arg

                405                 410                 415

Ser Ser Leu Val Leu Ala Ala Thr Ser Gly Asn Ser Gly Thr Thr Leu

            420                 425                 430

Thr Val Gln Thr Asn Ile Tyr Ala Val Ser Gln Gly Trp Leu Pro Thr

        435                 440                 445

Asn Asn Thr Gln Pro Phe Val Thr Thr Ile Val Gly Leu Tyr Gly Leu

    450                 455                 460

Cys Leu Gln Ala Asn Ser Gly Gln Val Trp Ile Glu Asp Cys Ser Ser

465                 470                 475                 480

Glu Lys Ala Glu Gln Gln Trp Ala Leu Tyr Ala Asp Gly Ser Ile Arg

                485                 490                 495

Pro Gln Gln Asn Arg Asp Asn Cys Leu Thr Ser Asp Ser Asn Ile Arg

            500                 505                 510

Glu Thr Val Val Lys Ile Leu Ser Cys Gly Pro Ala Ser Ser Gly Gln

        515                 520                 525

Arg Trp Met Phe Lys Asn Asp Gly Thr Ile Leu Asn Leu Tyr Ser Gly

    530                 535                 540

Leu Val Leu Asp Val Arg Ala Ser Asp Pro Ser Leu Lys Gln Ile Ile

545                 550                 555                 560

Leu Tyr Pro Leu His Gly Asp Pro Asn Gln Ile Trp Leu Pro Leu Phe

                565                 570                 575

<210>94

<211>286

<212>PRT

<213>Momordica charantia

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein Momordin I Precursor

<400>94

Met Ser ArgPhe Ser Val Leu Ser Phe Leu Ile Leu Ala Ile Phe Leu

 1              5                  10                  15

Gly Gly Ser Ile Val Lys Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala

            20                  25                  30

Asp Pro Arg Ser Tyr Gly Met Phe Ile Lys Asp Leu Arg Asn Ala Leu

        35                  40                  45

Pro Phe Arg Glu Lys Val Tyr Asn Ile Pro Leu Leu Leu Pro Ser Val

    50                  55                  60

Ser Gly Ala Gly Arg Tyr Leu Leu Met His Leu Phe Asn Tyr Asp Gly

65                  70                  75                  80

Lys Thr Ile Thr Val Ala Val Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly

                85                  90                  95

Tyr Leu Ala Asp Thr Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Pro Ala Ala Glu

            100                 105                 110

Leu Ala Ser Gln Tyr Val Phe Arg Asp Ala Arg Arg Lys Ile Thr Leu

        115                 120                 125

Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gln Ile Ala Ala Gly Lys Pro

    130                 135                 140

Arg Glu Lys Ile Pro Ile Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Ser

145                 150                 155                 160

Thr Leu Leu His Tyr Asp Ser Thr Ala Ala Ala Gly Ala Leu Leu Val

                165                 170                 175

Leu Ile Gln Thr Thr Ala Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Gln

            180                 185                 190

Gln Ile Gln Glu Arg Ala Tyr Arg Asp Glu Val Pro Ser Leu Ala Thr

        195                 200                 205

Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp Ser Gly Leu Ser Lys Gln Ile Gln Leu

    210                 215                 220

Ala Gln Gly Asn Asn Gly Ile Phe Arg Thr Pro Ile Val Leu Val Asp

225                 230                 235                 240

Asn Lys Gly Asn Arg Val Gln Ile Thr Asn Val Thr Ser Lys Val Val

                245                 250                 255

Thr Ser Asn Ile Gln Leu Leu Leu Asn Thr Arg Asn Ile Ala Glu Gly

            260                 265                 270

Asp Asn Gly Asp Val Ser Thr Thr Hi s Gly Phe Ser Ser Tyr

        275                 280                 285

<210>95

<211>286

<212>PRT

<213>Momordica bal samina

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein Momordin II

Precursor

<400>95

Met Val Lys Cys Leu Leu Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ala Ile Phe Ile

 1               5                  10                  15

Gly Val Pro Thr Ala Lys Gly Asp Val Asn Phe Asp Leu Ser Thr Ala

            20                  25                  30

Thr Ala Lys Thr Tyr Thr Lys Phe Ile Glu Asp Phe Arg Ala Thr Leu

        35                  40                  45

Pro Phe Ser His Lys Val Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Tyr Ser Thr Ile

    50                  55                  60

Ser Asp Ser Arg Arg Phe Ile Leu Leu Asp Leu Thr Ser Tyr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Glu Thr Ile Ser Val Ala Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Val Val Ala

                85                  90                  95

Tyr Arg Thr Arg Asp Val Ser Tyr Phe Phe Lys Glu Ser Pro Pro Glu

            100                 105                 110

Ala Tyr Asn Ile Leu Phe Lys Gly Thr Arg Lys Ile Thr Leu Pro Tyr

        115                 120                 125

Thr Gly Asn Tyr Glu Asn Leu Gln Thr Ala Ala His Lys Ile Arg Glu

    130                 135                 140

Asn Ile Asp Leu Gly Leu Pro Ala Leu Ser Ser Ala Ile Thr Thr Leu

145                 150                 155                 160

Phe Tyr Tyr Asn Ala Gln Ser Ala Pro Ser Ala Leu Leu Val Leu Ile

                165                 170                 175

Gln Thr Thr Ala Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Arg His Val

            180                 185                 190

Ala Lys Tyr Val Ala Thr Asn Phe Lys Pro Asn Leu Ala Ile Ile Ser

        195                 200                 205

Leu Glu Asn Gln Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Phe Leu Ala Gln

    210                 215                 220

Asn Gln Gly Gly Lys Phe Arg Asn Pro Val Asp Leu Ile Lys Pro Thr

225                 230                 235                 240

Gly Glu Arg Phe Gln Val Thr Asn Val Asp Ser Asp Val Val Lys Gly

                245                 250                 255

Asn Ile Lys Leu Leu Leu Asn Ser Arg Ala Ser Thr Ala Asp Glu Asn

            260                 265                 270

Phe Ile Thr Thr Met Thr Leu Leu Gly Glu Ser Val Val Asn

        275                 280                 285

<210>96

<211>290

<212>PRT

<213>Bryonia dioica

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein Bryodin I Precursor

<400>96

Met Ile Lys Leu Leu Val Leu Trp Leu Leu Ile Leu Thr Ile Phe Leu

 1               5                  10                  15

Lys Ser Pro Thr Val Glu Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala

            20                  25                  30

Thr Thr Thr Ser Tyr Gly Val Phe Ile Lys Asn Leu Arg Glu Ala Leu

        35                  40                  45

Pro Tyr Glu Arg Lys Va1 Tyr Asn Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser Ile

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Arg Tyr Thr Leu Leu His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp

65                  70                  75                  80

Glu Thr Ile Ser Val Ala Val Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly

                85                  90                  95

Tyr Leu Ala Gly Asp Val Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr

            100                 105                 110

Glu Ala Ala Lys Phe Val Phe Lys Asp Ala Lys Lys Lys Val Thr Leu

        115                 120                 125

Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile

    130                 135                 140

Arg Glu Asn Ile Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr

145                 150                 155                 160

Thr Leu Tyr Tyr Tyr Thr Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ala Leu Leu Val

                165                 170                 175

Leu Ile Gln Ser Thr Ala Glu Ser Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln

            180                 185                 190

Gln Ile Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Thr

        195                 200                 205

Ile Ser Leu Glu Asn Asn Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile GlnIle

    210                 215                 220

Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asp

225                 230                 235                 240

Gly Asn Asn Gln Arg Val Ser Ile Thr Asn Ala Ser Ala Arg Val Val

                245                 250                 255

Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu Leu Asn Arg Asn Asn Ile Ala Ala Ile

            260                 265                 270

Gly Glu Asp Ile Ser Met Thr Leu Ile Gly Phe Glu His Gly Leu Tyr

        275                 280                 285

Gly Ile

    290

<210>97

<211>282

<212>PRT

<213>Bryonia dioica

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein Bryodin II Precursor

<400>97

Met Arg Ser Ile Gly Phe Tyr Ser Val Leu Ala Leu Tyr Val Gly Ala

 1               5                  10                  15

His Val Thr Glu Asp Val Asp Ile Asn Phe Ser Leu Ile Gly Ala Thr

            20                  25                  30

Gly Ala Thr Tyr Lys Thr Phe Ile Arg Asn Leu Arg Thr Lys Leu Thr

        35                  40                  45

Val Gly Thr Pro Arg Val Tyr Asp Ile Pro Val Leu Arg Asn Ala Ala

    50                  55                  60

Ala Gly Leu Ala Arg Phe Gln Leu Val Thr Leu Thr Asn Tyr Asn Gly

65                  70                  75                  80

Glu Ser Val Thr Val Ala Leu Asp Val Val Asn Val Tyr Val Val Ala

                85                  90                  95

Tyr Arg Ala Gly Asn Thr Ala Tyr Phe Leu Ala Asp Ala Ser Thr Glu

            100                 105                 110

Ala Asn Asn Val Leu Phe Ala Gly Ile Asn His Val Arg Leu Pro Tyr

        115                 120                 125

Gly Gly Asn Tyr Asp Gly Leu Glu Thr Ala Ala Gly Arg Ile Ser Arg

    130                 135                 140

Glu Asn Ile Glu Leu Gly Phe Ser Glu Ile Ser Ser Ala Ile Gly Asn

145                 150                 155                 160

Met Phe Arg His Asn Pro Gly Thr Ser Val Pro Arg Ala Phe Ile Val

                165                 170                 175

Ile Ile Gln Thr Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Gln

            180                 185                 190

Arg Val Ser Glu Asn Val Gly Thr Lys Phe Lys Pro Asp Pro Ala Phe

        195                 200                 205

Leu Ser Leu Gln Asn Ala Trp Gly Ser Leu Ser Glu Gln Ile Gln Ile

    210                 215                 220

Ala Gln Thr Arg Gly Gly Glu Phe Ala Arg Pro Val Glu Leu Arg Thr

225                 230                 235                 240

Val Ser Asn Thr Pro Thr Phe Val Thr Asn Val Asn Ser Pro Val Val

                245                 250                 255

Lys Gly Ile Ala Leu Leu Leu Tyr Phe Arg Val Asn Val Gly Thr Asp

            260                 265                 270

Asn Val Phe Ala Met Ser Leu Ser Thr Tyr

        275                 280

<210>98

<211>261

<212>PRT

<213>Phytolacca americana

<220>

<223>Ribosome-inactivating proteinPAP-S

<400>98

Ile Asn Thr Ile Thr Phe Asp Ala Gly Asn Ala Thr Ile Asn Lys Tyr

 1               5                  10                  15

Ala Thr Phe Met Glu Ser Leu Arg Asn Glu Ala Lys Asp Pro Ser Leu

            20                  25                  30

Lys Cys Tyr Gly Ile Pro Met Leu Pro Asn Thr Asn Ser Thr Ile Lys

        35                  40                  45

Tyr Leu Leu Val Lys Leu Gln Gly Ala Ser Leu Lys Thr Ile Thr Leu

    50                  55                  60

Met Leu Arg Arg Asn Asn Leu Tyr Val Met Gly Tyr Ser Asp Pro Tyr

65                  70                  75                  80

Asp Asn Lys Cys Arg Tyr His Ile Phe Asn Asp Ile Lys Gly Thr Glu

                85                  90                  95

Tyr Ser Asp Val Glu Asn Thr Leu Cys Pro Ser Ser Asn Pro Arg Val

            100                 105                 110

Ala Lys Pro Ile Asn Tyr Asn Gly Leu Tyr Pro Thr Leu Glu Lys Lys

        115                 120                 125

Ala Gly Val Thr Ser Arg Asn Glu Val Gln Leu Gly Ile Gln Ile Leu

    130                 135                 140

Ser Ser Asp Ile Gly Lys Ile Ser Gly Gln Gly Ser Phe Thr Glu Lys

145                 150                 155                 160

Ile Glu Ala Lys Phe Leu Leu Val Ala Ile Gln Met Val Ser Glu Ala

                165                 170                 175

Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Asn Gln Val Lys Thr Asn Phe Asn Arg

            180                 185                 190

Asp Phe Ser Pro Asn Asp Lys Val Leu Asp Leu Glu Glu Asn Trp Gly

        195                 200                 205

Lys Ile Ser Thr Ala Ile His Asn Ser Lys Asn Gly Ala Leu Pro Lys

    210                 215                 220

Pro Leu Glu Leu Lys Asn Ala Asp Gly Thr Lys Trp Ile Val Leu Arg

225                 230                 235                 240

Val Asp Glu Ile Lys Pro Asp Val Gly Leu Leu Asn Tyr Val Asn Gly

                245                 250                 255

Thr Cys Gln Ala Thr

            260

<210>99

<211>277

<212>PRT

<213>Luffa cylindrica

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein Luffin-alpha

Precursor

<400>99

Met Lys ArgPhe Thr Val Leu Ile Leu Ala Ile Phe Val Ala Ala Ser

 1              5                  10                  15

Thr Val Glu Ala Asp Val Arg Phe Ser Leu Ser Gly Ser Ser Ser Thr

            20                  25                  30

Ser Tyr Ser Lys Phe Ile Gly Asp Leu Arg Lys Ala Leu Pro Ser Asn

        35                  40                  45

Gly Thr Val Tyr Asn Ile Thr Leu Leu Leu Ser Ser Ala Ser Gly Ala

    50                  55                  60

Ser Arg Tyr Thr Leu Met Thr Leu Ser Asn Tyr Asp Gly Lys Ala Ile

65                  70                  75                  80

Thr Val Ala Val Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Leu Val

                85                  90                  95

Asn Ser Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ser Asp Ala Lys Leu Ala Ser

            100                 105                 110

Gln Tyr Val Phe Lys Gly Ser Thr Ile Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly

        115                 120                 125

Asn Tyr Glu Lys Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile Arg Glu Lys Ile

    130                 135                 140

Pro Leu Gly Phe Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe His

145                 150                 155                 160

Tyr Asp Ser Thr Ala Ala Ala Ala Ala Phe Leu Val Ile Ile Gln Thr

                165                 170                 175

Thr Ala Glu Ala Ser Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Gly Gln Ile Ile Glu

            180                 185                 190

Arg Ile Ser Lys Asn Gln Val Pro Ser Leu Ala Thr Ile Ser Leu Glu

        195                 200                 205

Asn Glu Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Leu Ala Gln Thr Asn

    210                 215                 220

Asn Gly Thr Phe Lys Thr Pro Val Val Ile Thr Asp Asp Lys Gly Gln

225                 230                 235                 240

Arg Val Glu Ile Thr Asn Val Thr Ser Lys Val Val Thr Lys Asn Ile

                245                 250                 255

Gln Leu Leu Leu Asn Tyr Lys Gln Asn Val Ala Ala Phe Asp Glu Asp

            260                 265                 270

Val Ser Ala Lys His

        275

<210>100

<211>289

<212>PRT

<213>Trichosanthes kirilowii

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein alpha-trichosanthin

Precursor

<400>100

Met lle Arg Phe Leu Val Leu Ser Leu Leu Ile Leu Thr Leu Phe Leu

 1               5                  10                  15

Thr Thr Pro Ala Val Glu Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala

            20                  25                  30

Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Val Phe Ile Ser Asn Leu Arg Lys Ala Leu

        35                  40                  45

Pro Asn Glu Arg Lys Leu Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser Leu

    50                  55                  60

Pro Gly Ser Gln Arg Tyr Ala Leu Ile His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp

65                  70                  75                  80

Glu Thr Ile Ser Val Ala Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly

                85                  90                  95

Tyr Arg Ala Gly Asp Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr

            100                 105                 110

Glu Ala Ala Lys Tyr Val Phe Lys Asp Ala Met Arg Lys Val Thr Leu

        115                 120                 125

Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile

    130                 135                 140

Arg Glu Asn Ile Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr

145                 150                 155                 160

Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val

                165                 170                 175

Leu Ile Gln Ser Thr Ser Glu Ala Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln

            180                 185                 190

Gln Ile Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile

        195                 200                 205

Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile

    210                 215                 220

Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asn

225                 230                 235                 240

Ala Gln Asn Gln Arg Val Thr Ile Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val

                245                 250                 255

Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu Leu Asn Arg Asn Asn Met Ala Ala Met

            260                 265                 270

Asp Asp Asp Val Pro Met Thr Gln Ser Phe Gly Cys Gly Ser Tyr Ala

        275                 280                 285

Ile

<210>101

<211>177

<212>PRT

<213>Aspergillus clavatus

<220>

<223>Ribonuclease Clavin Precursor

<400>101

Met Val Ala Ile Lys Asn Leu Val Leu Val Ala Leu Thr Ala Val Thr

 1               5                  10                  15

Ala Leu Ala Met Pro Ser Pro Leu Glu Glu Arg Ala Ala Thr Trp Thr

            20                  25                  30

Cys Met Asn Glu Gln Lys Asn Pro Lys Thr Asn Lys Tyr Glu Asn Lys

        35                  40                  45

Arg Leu Leu Tyr Asn Gln Asn Asn Ala Glu Ser Asn Ala His His Ala

    50                  55                  60

Pro Leu Ser Asp Gly Lys Thr Gly Ser Ser Tyr Pro His Trp Phe Thr

65                  70                  75                  80

Asn Gly Tyr Asp Gly Asp Gly Lys Ile Leu Lys Gly Arg Thr Pro Ile

                85                  90                  95

Lys Trp Gly Asn Ser Asp Cys Asp Arg Pro Pro Lys His Ser Lys Asn

            100                 105                 110

Gly Asp Gly Lys Asn Asp His Tyr Leu Leu Glu Phe Pro Thr Phe Pro

        115                 120                 125

Asp Gly His Gln Tyr Asn Phe Asp Ser Lys Lys Pro Lys Glu Asp Pro

    130                 135                 140

Gly Pro Ala Arg Val Ile Tyr Thr Tyr Pro Asn Lys Val Phe Cys Gly

145                 150                 155                 160

Ile Val Ala His Thr Arg Glu Asn Gln Gly Asp Leu Lys Leu Cys Ser

                165                 170                 175

His

<210>102

<211>528

<212>PRT

<213>Abrus precatorius

<220>

<223>Abrin-a

<400>102

Gln Asp Arg Pro Ile Lys Phe Ser Thr Glu Gly Ala Thr Ser Gln Ser

 1               5                  10                  15

Tyr Lys Gln Phe Ile Glu Ala Leu Arg Glu Arg Leu Arg Gly Gly Leu

            20                  25                  30

Ile His Asp Ile Pro Val Leu Pro Asp Pro Thr Thr Leu Gln Glu Arg

        35                  40                  45

Asn Arg Tyr Ile Thr Val Glu Leu Ser Asn Ser Asp Thr Glu Ser Ile

    50                  55                  60

Glu Val Gly Ile Asp Val Thr Asn Ala Tyr Val Val Ala Tyr Arg Ala

65                  70                  75                  80

Gly Thr Gln Ser Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Pro Ser Ser Ala Ser Asp

                85                  90                  95

Tyr Leu Phe Thr Gly Thr Asp Gln His Ser Leu Pro Phe Tyr Gly Thr

            100                 105                 110

Tyr Gly Asp Leu Glu Arg Trp Ala His Gln Ser Arg Gln Gln Ile Pro

        115                 120                 125

Leu Gly Leu Gln Ala Leu Thr His Gly Ile Ser Phe Phe Arg Ser Gly

    130                 135                 140

Gly Asn Asp Asn Glu Glu Lys Ala Arg Thr Leu Ile Val Ile Ile Gln

145                 150                 155                 160

Met Val Ala Glu Ala Ala Arg Phe Arg Tyr Ile Ser Asn Arg Val Arg

                165                 170                 175

Val Ser Ile Gln Thr Gly Thr Ala Phe Gln Pro Asp Ala Ala Met Ile

            180                 185                 190

Ser Leu Glu Asn Asn Trp Asp Asn Leu Ser Arg Gly Val Gln Glu Ser

        195                 200                 205

Val Gln Asp Thr Phe Pro Asn Gln Val Thr Leu Thr Asn Ile Arg Asn

    210                 215                 220

Glu Pro Val Ile Val Asp Ser Leu Ser His Pro Thr Val Ala Val Leu

225                 230                 235                 240

Ala Leu Met Leu Phe Val Cys Asn Pro Pro Asn Ala Asn Gln Ser Pro

                245                 250                 255

Leu Leu Ile Arg Ser Ile Val Glu Lys Ser Lys Ile Cys Ser Ser Arg

            260                 265                 270

Tyr Glu Pro Thr Val Arg Ile Gly Gly Arg Asp Gly Met Cys Val Asp

        275                 280                 285

Val Tyr Asp Asn Gly Tyr His Asn Gly Asn Arg Ile Ile Met Trp Lys

    290                 295                 300

Cys Lys Asp Arg Leu Glu Glu Asn Gln Leu Trp Thr Leu Lys Ser Asp

305                 310                 315                 320

Lys Thr Ile Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu Thr Thr Tyr Gly Tyr Ala

                325                 330                 335

Pro Gly Ser Tyr Val Met Ile Tyr Asp Cys Thr Ser Ala Val Ala Glu

            340                 345                 350

Ala Thr Tyr Trp Glu Ile Trp Asp Asn Gly Thr Ile Ile Asn Pro Lys

        355                 360                 365

Ser Ala Leu Val Leu Ser Ala Glu Ser Ser Ser Met Gly Gly Thr Leu

    370                 375                 380

Thr Val Gln Thr Asn Glu Tyr Leu Met Arg Gln Gly Trp Arg Thr Gly

385                 390                 395                 400

Asn Asn Thr Ser Pro Phe Val Thr Ser Ile Ser Gly Tyr Ser Asp Leu

                405                 410                 415

Cys Met Gln Ala Gln Gly Ser Asn Val Trp Met Ala Asp Cys Asp Ser

            420                 425                 430

Asn Lys Lys Glu Gln Gln Trp Ala Leu Tyr Thr Asp Gly Ser Ile Arg

        435                 440                 445

Ser Val Gln Asn Thr Asn Asn Cys Leu Thr Ser Lys Asp His Lys Gln

    450                 455                 460

Gly Ser Thr Ile Leu Leu Met Gly Cys Ser Asn Gly Trp Ala Ser Gln

465                 470                 475                 480

Arg Trp Val Phe Lys Asn Asp Gly Ser Ile Tyr Ser Leu Tyr Asp Asp

                485                 490                 495

Met Val Met Asp Val Lys Gly Ser Asp Pro Ser Leu Lys Gln Ile Ile

            500                 505                 510

Leu Trp Pro Tyr Thr Gly Lys Pro Asn Gln Ile Trp Leu Thr Leu Phe

        515                 520                 525

<210>103

<211>300

<212>PRT

<213>Zea mays

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein 3(Maize)Precursor

<400>103

Met Ala Glu Ile Thr Leu Glu Pro Ser Asp Leu Met Ala Gln Thr Asn

 1               5                  10                  15

Lys Arg Ile Val Pro Lys Phe Thr Glu Ile Phe Pro Val Glu Asp Ala

            20                  25                  30

Asn Tyr Pro Tyr Ser Ala Phe Ile Ala Ser Val Arg Lys Asp Val Ile

        35                  40                  45

Lys His Cys Thr Asp His Lys Gly Ile Phe Gln Pro Val Leu Pro Pro

    50                  55                  60

Glu Lys Lys Val Pro Glu Leu Trp Leu Tyr Thr Glu Leu Lys Thr Arg

65                  70                  75                  80

Thr Ser Ser Ile Thr Leu Ala Ile Arg Met Asp Asn Leu Tyr Leu Val

                85                  90                  95

Gly Phe Arg Thr Pro Gly Gly Val Trp Trp Glu Phe Gly Lys Asp Gly

            100                 105                 110

Asp Thr His Leu Leu Gly Asp Asn Pro Arg Trp Leu Gly Phe Gly Gly

        115                 120                 125

Arg Tyr Gln Asp Leu Ile Gly Asn Lys Gly Leu Glu Thr Val Thr Met

    130                 135                 140

Gly Arg Ala Glu Met Thr Arg Ala Val Asn Asp Leu Ala Lys Lys Lys

145                 150                 155                 160

Lys Met Ala Thr Leu Glu Glu Glu Glu Val Gln Met Gln Met Gln Met

                165                 170                 175

Pro Glu Ala Ala Asp Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Pro Gln Ala

            180                 185                 190

Asp Thr Lys Ser Lys Leu Val Lys Leu Val Val Met Val Cys Glu Gly

        195                 200                 205

Leu Arg Phe Asn Thr Val Ser Arg Thr Val Asp Ala Gly Phe Asn Ser

    210                 215                 220

Gln His Gly Val Thr Leu Thr Val Thr Gln Gly Lys Gln Val Gln Lys

225                 230                 235                 240

Trp Asp Arg Ile Ser Lys Ala Ala Phe Glu Trp Ala Asp His Pro Thr

                245                 250                 255

Ala Val Ile Pro Asp Met Gln Lys Leu Gly Ile Lys Asp Lys Asn Glu

            260                 265                 270

Ala Ala Arg Ile Val Ala Leu Val Lys Asn Gln Thr Thr Ala Cys Ala

        275                 280                 285

Thr Ala Ala Ser Ala Asp Asn Asp Asp Asp Glu Ala

    290                 295                 300

<210>104

<211>304

<212>PRT

<213>Zea mays

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein 9(Maize)Precursor

<400>104

Met Ala Glu Thr Asn Pro Glu Leu Ser Asp Leu Met Ala Gln Thr Asn

 1               5                  10                  15

Lys Lys Ile Val Pro Lys Phe Thr Glu Ile Phe Pro Val Glu Asp Val

            20                  25                  30

Asn Tyr Pro Tyr Ser Ala Phe Ile Ala Ser Val Arg Lys Asp Val Ile

        35                  40                  45

Lys His Cys Thr Asp His Lys Gly Ile Phe Gln Pro Val Leu Pro Pro

    50                  55                  60

Glu Lys Lys Val Pro Glu Leu Trp Phe Tyr Thr Glu Leu Lys Thr Arg

65                  70                  75                  80

Thr Ser Ser Ile Thr Leu Ala Ile Arg Met Asp Asn Leu Tyr Leu Val

                85                  90                  95

Gly Phe Arg Thr Pro Gly Gly Val Trp Trp Glu Phe Gly Lys Ala Gly

            100                 105                 110

Asp Thr His Leu Leu Gly Asp Asn Pro Arg Trp Leu Gly Phe Gly Gly

        115                 120                 125

Arg Tyr Gln Asp Leu Ile Gly Asn Lys Gly Leu Glu Thr Val Thr Met

    130                 135                 140

Gly Arg Ala Glu Met Thr Arg Ala Val Asn Asp Leu Ala Lys Lys Lys

145                 150                 155                 160

Lys Met Ala Thr Leu Glu Glu Glu Glu Val Gln Met Gln Met Gln Met

                165                 170                 175

Pro Glu Ala Ala Glu Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Pro Gln

            180                 185                 190

Ala Asp Thr Lys Ser Lys Leu Val Lys Leu Val Val Met Val Cys Glu

        195                 200                 205

Gly Leu Arg Phe Asn Thr Val Ser Arg Thr Val Asp Ala Gly Phe Asn

    210                 215                 220

Ser Gln His Gly Val Thr Leu Thr Val Thr Gln Gly Lys Gln Val Gln

225                 230                 235                 240

Lys Trp Asp Arg Ile Ser Lys Ala Ala Phe Glu Trp Ala Asp His Pro

                245                 250                 255

Thr Ala Val Ile Pro Asp Met Gln Lys Leu Gly Ile Lys Asp Lys Asn

            260                 265                 270

Glu Ala Ala Arg Ile Val Ala Leu Val Lys Asn Gln Thr Thr Ala Ala

        275                 280                 285

Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ser Ala Asp Asn Asp Asp Asp Glu Ala

    290                 295                 300

<210>105

<211>301

<212>PRT

<213>Zea mays

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein X(Maize)Precursor

<400>105

Met Ala Glu Ile Thr Leu Glu Pro Ser Asp Leu Met Ala Gln Thr Asn

 1               5                  10                  15

Lys Arg Ile Val Pro Lys Phe Thr Glu Ile Phe Pro Val Glu Asp Ala

            20                  25                  30

Asn Tyr Pro Tyr Ser Ala Phe Ile Ala Ser Val Arg Lys Asp Val Ile

        35                  40                  45

Lys His Cys Thr Asp Hi s Lys Gly Ile Phe Gln Pro Val Leu Pro Pro

    50                  55                  60

Glu Lys Lys Val Pro Glu Leu Trp Phe Tyr Thr Glu Leu Lys Thr Arg

65                  70                  75                  80

Thr Ser Ser Ile Thr Leu Ala Ile Arg Met Asp Asn Leu Tyr Leu Val

                85                  90                  95

Gly Phe Arg Thr Pro Gly Gly Val Trp Trp Glu Phe Gly Lys Asp Gly

            100                 105                 110

Asp Thr His Leu Leu Gly Asp Asn Pro Arg Trp Leu Gly Phe Gly Gly

        115                 120                 125

Arg Tyr Gln Asp Leu Ile Gly Asn Lys Gly Leu Glu Thr Val Thr Met

    130                 135                 140

Gly Arg Ala Glu Met Thr Arg Ala Val Asn Asp Leu Ala Lys Lys Lys

145                 150                 155                 160

Lys Met Ala Thr Leu Glu Glu Glu Glu Val Lys Met Gln Met Gln Met

                165                 170                 175

Pro Glu Ala Ala Asp Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Pro Gln Ala

            180                 185                 190

Asp Thr Lys Ser Lys Leu Val Lys Leu Val Val Met Val Cys Glu Gly

        195                 200                 205

Leu Arg Phe Asn Thr Val Ser Arg Thr Val Asp Ala Gly Phe Asn Ser

    210                 215                 220

Gln His Gly Val Thr Leu Thr Val Thr Gln Gly Lys Gln Val Gln Lys

225                 230                 235                 240

Trp Asp Arg Ile Ser Lys Ala Ala Phe Glu Trp Ala Asp His Pro Thr

                245                 250                 255

Ala Val Ile Pro Asp Met Gln Lys Leu Gly Ile Lys Asp Lys Asn Glu

            260                 265                 270

Ala Ala Arg Ile Val Ala Leu Val Lys Asn Gln Thr Thr Ala Ala Ala

        275                 280                 285

Ala Thr Ala Ala Ser Ala Asp Asn Asp Asp Asp Glu Ala

    290                 295                 300

<210>106

<211>275

<212>PRT

<213>Triticum aestivum

<220>

<223>Tritin Precursor

<400>106

Met Ala Lys Asn Val Asp Lys Pro Leu Phe Thr Ala Thr Phe Asn Val

 1               5                  10                  15

Gln Ala Ser Ser Ala Asp Tyr Val Thr Phe Ile Asn Gly Ile Arg Asn

            20                  25                  30

Lys Leu Arg Asn Pro Gly His Ser Ser His Asn Arg Pro Val Leu Pro

        35                  40                  45

Pro Ile Glu Pro Asn Val Pro Pro Ser Arg Trp Phe His Ile Val Leu

    50                  55                  60

Lys Thr Ser Pro Ala Ser Thr Gly Leu Thr Leu Ala Thr Arg Ala Asp

65                  70                  75                  80

Asn Leu Tyr Trp Glu Gly Phe Lys Ser Ser Asp Gly Thr Trp Trp Glu

                85                  90                  95

Leu Thr Pro Gly Leu Ile Pro Gly Ala Thr His Val Gly Phe Gly Gly

            100                 105                 110

Thr Tyr Arg Asp Leu Leu Gly Asp Thr Asp Lys Leu Thr Asn Val Ala

        115                 120                 125

Leu Gly Arg Gln Gln Met Ala Asp Ala Val Thr Ala Leu Tyr Gly Arg

    130                 135                 140

Thr Lys Ala Asp Lys Thr Ser Gly Pro Lys Gln Gln Gln Ala Arg Glu

145                 150                 155                 160

Ala Val Thr Thr Leu Leu Leu Met Val His Glu Ala Thr Arg Phe Gln

                165                 170                 175

Thr Val Ser Gly Phe Val Ala Gly Val Leu His Pro Lys Glu Lys Lys

            180                 185                 190

Ser Gly Lys Ile Gly Asn Glu Met Lys Ala Gln Val Asn Gly Trp Gln

        195                 200                 205

Asp Leu Ser Glu Ala Leu Leu Lys Thr Asp Ala Asn Ala Pro Pro Gly

    210                 215                 220

Lys Ala Pro Ala Lys Phe Thr Pro Ile Glu Lys Met Gly Val Arg Thr

225                 230                 235                 240

Ala Glu Gln Ala Ala Ala Thr Leu Gly Ile Leu Leu Phe Val Gln Val

                245                 250                 255

Pro Gly Gly Met Thr Val Ala Gln Ala Leu Glu Leu Phe His Lys Ser

            260                 265                 270

Gly Gly Lys

    275

<210>107

<211>278

<212>PRT

<213>Mirabilis jalapa

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein MAP Precursor

<400>107

Met Leu Thr Thr Thr Lys Val Phe Phe Leu Leu Leu Thr Thr Trp Ile

 1               5                  10                  15

Thr Trp Tyr Ala Ile Val Asn Pro Gln Ser Arg Ala Ala Pro Thr Leu

            20                  25                  30

Glu Thr Ile Ala Ser Leu Asp Leu Asn Asn Pro Thr Thr Tyr Leu Ser

        35                  40                  45

Phe Ile Thr Asn Ile Arg Thr Lys Val Ala Asp Lys Thr Glu Gln Cys

    50                  55                  60

Thr Ile Gln Lys Ile Ser Lys Thr Phe Thr Gln Arg Tyr Ser Tyr Ile

65                  70                  75                  80

Asp Leu Ile Val Ser Ser Thr Gln Lys Ile Thr Leu Ala Ile Asp Met

                85                  90                  95

Ala Asp Leu Tyr Val Leu Gly Tyr Ser Asp Ile Ala Asn Asn Lys Gly

            100                 105                 110

Arg Ala Phe Phe Phe Lys Asp Val Thr Glu Ala Val Ala Asn Asn Phe

        115                 120                 125

Phe Pro Gly Ala Thr Gly Thr Asn Arg Ile Lys Leu Thr Phe Thr Gly

    130                 135                 140

Ser Tyr Gly Asp Leu Glu Lys Asn Gly Gly Leu Arg Lys Asp Asn Pro

145                 150                 155                 160

Leu Gly Ile Phe Arg Leu Glu Asn Ser Ile Val Asn Ile Tyr Gly Lys

                165                 170                 175

Ala Gly Asp Val Lys Lys Gln Ala Lys Phe Phe Leu Leu Ala Ile Gln

            180                 185                 190

Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Ser Asp Lys Ile Pro

        195                 200                 205

Ser Glu Lys Tyr Glu Glu Val Thr Val Asp Glu Tyr Met Thr Ala Leu

    210                 215                 220

Glu Asn Asn Trp Ala Lys Leu Ser Thr Ala Val Tyr Asn Ser Lys Pro

225                 230                 235                 240

Ser Thr Thr Thr Ala Thr Lys Cys Gln Leu Ala Thr Ser Pro Val Thr

                245                 250                 255

Ile Ser Pro Trp Ile Phe Lys Thr Val Glu Glu Ile Lys Leu Val Met

            260                 265                 270

Gly Leu Leu Lys Ser Ser

        275

<210>108

<211>293

<212>PRT

<213>Dianthus caryophyllus

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein Dianthin 30

Precursor

<400>108

Met Lys Ile Tyr Leu Val Ala AlaIle Ala Trp Ile Leu Phe Gln Ser

 1               5                  10                  15

Ser Ser Trp Thr Thr Asp Ala Ala Thr Ala Tyr Thr Leu Asn Leu Ala

            20                  25                  30

Asn Pro Ser Ala Ser Gln Tyr Ser Ser Phe Leu Asp Gln Ile Arg Asn

        35                  40                  45

Asn Val Arg Asp Thr Ser Leu Ile Tyr Gly Gly Thr Asp Val Ala Val

    50                  55                  60

Ile Gly Ala Pro Ser Thr Thr Asp Lys Phe Leu Arg Leu Asn Phe Gln

65                  70                  75                  80

Gly Pro Arg Gly Thr Val Ser Leu Gly Leu Arg Arg Glu Asn Leu Tyr

                85                  90                  95

Val Val Ala Tyr Leu Ala Met Asp Asn Ala Asn Val Asn Arg Ala Tyr

            100                 105                 110

Tyr Phe Lys Asn Gln Ile Thr Ser Ala Glu Leu Thr Ala Leu Phe Pro

        115                 120                 125

Glu Val Val Val Ala Asn Gln Lys Gln Leu Glu Tyr Gly Glu Asp Tyr

    130                 135                 140

Gln Ala Ile Glu Lys Asn Ala Lys Ile Thr Thr Gly Asp Gln Ser Arg

145                 150                 155                 160

Lys Glu Leu Gly Leu Gly Ile Asn Leu Leu Ile Thr Met Ile Asp Gly

                165                 170                 175

Val Asn Lys Lys Val Arg Val Val Lys Asp Glu Ala Arg Phe Leu Leu

            180                 185                 190

Ile Ala Ile Gln Met Thr Ala Glu Ala Ala Arg Phe Arg Tyr Ile Gln

        195                 200                 205

Asn Leu Val Thr Lys Asn Phe Pro Asn Lys Phe Asp Ser Glu Asn Lys

    210                 215                 220

Val Ile Gln Phe Gln Val Ser Trp Ser Lys Ile Ser Thr Ala Ile Phe

225                 230                 235                 240

Gly Asp Cys Lys Asn Gly Val Phe Asn Lys Asp Tyr Asp Phe Gly Phe

                245                 250                 255

Gly Lys Val Arg Gln Ala Lys Asp Leu Gln Met Gly Leu Leu Lys Tyr

            260                 265                 270

Leu Gly Arg Pro Lys Ser Ser Ser Ile Glu Ala Asn Ser Thr Asp Asp

        275                 280                 285

Thr Ala Asp Val Leu

    290

<210>109

<211>563

<212>PRT

<213>Sambucus nigra

<220>

<223>Nigrin b Precursor

<400>109

Met ArgVal Val Ala Ala Ala Met Leu Tyr Phe Tyr Ile Val Val Leu

 1              5                  10                  15

Ala Ile Cys Ser Val Gly Ile Gln Gly Ile Asp Tyr Pro Ser Val Ser

            20                  25                  30

Phe Asn Leu Asp Gly Ala Lys Ser Ala Thr Tyr Arg Asp Phe Leu Ser

        35                  40                  45

Asn Leu Arg Lys Thr Val Ala Thr Gly Thr Tyr Glu Val Asn Gly Leu

    50                  55                  60

Pro Val Leu Arg Arg Glu Ser Glu Val Gln Val Lys Ser Arg Phe Val

65                  70                  75                  80

Leu Val Pro Leu Thr Asn Tyr Asn Gly Asn Thr Val Thr Leu Ala Val

                85                  90                  95

Asp Val Thr Asn Leu Tyr Val Val Ala Phe Ser Gly Asn Ala Asn Ser

            100                 105                 110

Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Thr Glu Val Gln Lys Ser Asn Leu Phe Val

        115                 120                 125

Gly Thr Lys Gln Asn Thr Leu Ser Phe Thr Gly Asn Tyr Asp Asn Leu

    130                 135                 140

Glu Thr Ala Ala Asn Thr Arg Arg Glu Ser Ile Glu Leu Gly Pro Ser

145                 150                 155                 160

Pro Leu Asp Gly Ala Ile Thr Ser Leu Tyr His Gly Asp Ser Val Ala

                165                 170                 175

Arg Ser Leu Leu Val Val Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe

            180                 185                 190

Arg Tyr Ile Glu Gln Glu Val Arg Arg Ser Leu Gln Gln Ala Thr Ser

        195                 200                 205

Phe Thr Pro Asn Ala Leu Met Leu Ser Met Glu Asn Asn Trp Ser Ser

    210                 215                 220

Met Ser Leu Glu Ile Gln Gln Ala Gly Asn Asn Val Ser Pro Phe Phe

225                 230                 235                 240

Gly Thr Val Gln Leu Leu Asn Tyr Asp His Thr His Arg Leu Val Asp

                245                 250                 255

Asn Phe Glu Glu Leu Tyr Lys Ile Thr Gly Ile Ala Ile Leu Leu Phe

            260                 265                 270

Arg Cys Ser Ser Pro Ser Asn Asp Asn Ala Ile Arg Met Pro Leu Asp

        275                 280                 285

Leu Ala Gly Glu Asp Asn Lys Tyr Asn Asp Gly Glu Thr Cys Thr Leu

    290                 295                 300

Arg Thr Ser Phe Thr Arg Asn Ile Val Gly Arg Asp Gly Leu Cys Val

305                 310                 315                 320

Asp Val Arg Asn Gly Tyr Asp Thr Asp Gly Thr Pro Leu Gln Leu Trp

                325                 330                 335

Pro Cys Gly Thr Gln Arg Asn Gln Arg Trp Thr Phe Asp Ser Asp Asp

            340                 345                 350

Thr Ile Arg Ser Met Gly Lys Cys Met Thr Ala Asn Gly Leu Asn Asn

        355                 360                 365

Gly Ser Asn Ile Val Ile Phe Asn Cys Ser Thr Ala Ala Glu Asn Ala

    370                 375                 380

Ile Lys Trp Glu Val Pro Ile Asp Gly Ser Ile Ile Asn Pro Ser Ser

385                 390                 395                 400

Gly Leu Val Met Thr Ala Pro Arg Ala Ala Ser Arg Thr Ile Leu Leu

                405                 410                 415

Leu Glu Asp Asn Ile Tyr Ala Ala Ser Gln Gly Trp Thr Val Thr Asn

            420                 425                 430

Asn Val Lys Pro Ile Val Ala Ser Ile Val Gly Tyr Lys Glu Met Cys

        435                 440                 445

Leu Gln Ser Asn Gly Glu Asn Asn Gly Val Trp Met Glu Asp Cys Glu

    450                 455                 460

Ala Thr Ser Leu Gln Gln Gln Trp Ala Leu Tyr Gly Asp Arg Thr Ile

465                 470                 475                 480

Arg Val Asn Ser Thr Arg Gly Leu Cys Val Thr Thr Asn Gly Tyr Asn

                485                 490                 495

Ser Lys Asp Leu Ile Ile Ile Leu Lys Cys Gln Gly Leu Pro Ser Gln

            500                 505                 510

Arg Trp Phe Phe Asn Ser Asp Gly Ala Ile Val Asn Pro Lys Ser Arg

        515                 520                 525

His Val Met Asp Val Arg Ala Ser Asn Val Ser Leu Arg Glu Ile Ile

    530                 535                 540

Ile Phe Pro Ala Thr Gly Asn Pro Asn Gln Gln Trp Val Thr Gln Val

545                 550                 555                 560

Leu Pro Ser

<210>110

<211>563

<212>PRT

<213>Sambucus nigra

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein Nigrin I Precursor

<400>110

Met Arg Val Val Ala Ala Ala Met Leu Tyr Phe Tyr Ile Val Val Leu

 1               5                  10                  15

Ala Ile Cys Ser Val Gly Ile Gln Gly Ile Asp Tyr Pro Ser Val Ser

            20                  25                  30

Phe Asn Leu Asp Gly Ala Lys Ser Ala Thr Tyr Arg Asp Phe Leu Ser

        35                  40                  45

Asn Leu Arg Lys Thr Val Ala Thr Gly Thr Tyr Glu Val Asn Gly Leu

    50                  55                  60

Pro Val Leu Arg Arg Glu Ser Glu Val Gln Val Lys Ser Arg Phe Val

65                  70                  75                  80

Leu Val Pro Leu Thr Asn Tyr Asn Gly Asn Thr Val Thr Leu Ala Val

                85                  90                  95

Asp Val Thr Asn Leu Tyr Val Val Ala Phe Ser Gly Asn Ala Asn Ser

           100                 105                 110

Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Thr Glu Val Gln Lys Ser Asn Leu Phe Val

        115                 120                 125

Gly Thr Lys Gln Asn Thr Leu Ser Phe Thr Gly Asn Tyr Asp Asn Leu

    130                 135                 140

Glu Thr Ala Ala Asn Thr Arg Arg Glu Ser Ile Glu Leu Gly Pro Ser

145                 150                 155                 160

Pro Leu Asp Gly Ala Ile Thr Ser Leu Tyr His Gly Asp Ser Val Ala

                165                 170                 175

Arg Ser Leu Leu Val Val Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe

            180                 185                 190

Arg Tyr Ile Glu Gln Glu Val Arg Arg Ser Leu Gln Gln Ala Thr Ser

        195                 200                 205

Phe Thr Pro Asn Ala Ser Met Leu Ser Met Glu Asn Asn Trp Ser Ser

    210                 215                 220

Met Ser Leu Glu Ile Gln Gln Ala Gly Asn Asn Val Ser Pro Phe Ser

225                 230                 235                 240

Gly Thr Val Gln Leu Leu Asn Tyr Asp His Thr His Arg Leu Val Asp

                245                 250                 255

Asn Phe Glu Glu Leu Tyr Lys Ile Thr Gly Ile Ala Ile Leu Leu Phe

            260                 265                 270

Arg Cys Ser Ser Pro Ser Asn Asp Asn Ala Ile Arg Met Pro Leu Asp

        275                 280                 285

Leu Ala Gly Glu Asp Asn Lys Tyr Asn Asp Gly Glu Thr Cys Thr Leu

    290                 295                 300

Arg Thr Ser Phe Thr Arg Asn Ile Val Gly Arg Asp Gly Leu Cys Val

305                 310                 315                 320

Asp Val Arg Asn Gly Tyr Asp Thr Asp Gly Thr Pro Leu Gln Leu Trp

                325                 330                 335

Pro Cys Gly Thr Gln Arg Asn Gln Arg Trp Thr Phe Asn Thr Asp Asp

            340                 345                 350

Thr Ile Arg Ser Met Gly Lys Cys Met Thr Ala Asn Gly Leu Asn Asn

        355                 360                 365

Gly Ser Asn Ile Val Ile Phe Asn Cys Ser Thr Ala Val Glu Asn Ala

    370                 375                 380

Ile Lys Trp Glu Val Pro Ile Asp Gly Ser Ile Ile Asn Pro Ser Ser

385                 390                 395                 400

Gly Arg Val Val Thr Ala Pro Ser Ala Ala Ser Arg Thr Ile Leu Leu

                405                 410                 415

Leu Glu Asp Asn Ile Tyr Ala Ala Ser Gln Gly Trp Thr Val Thr Asn

            420                 425                 430

Asn Val Lys Pro Ile Val Ala SerIle Val Gly Tyr Lys Glu Met Cys

        435                 440                 445

Leu Gln Ser Asn Gly Glu Asn Asn Gly Val Trp Met Glu Asp Cys Glu

    450                 455                 460

Ala Thr Ser Leu Gln Gln Gln Trp Ala Leu Tyr Gly Asp Arg Thr Ile

465                 470                 475                 480

Arg Val Asn Ser Thr Arg Gly Leu Cys Val Thr Thr Asn Gly Tyr Asn

                485                 490                 495

Ser Lys Asp Leu Ile Ile Ile Leu Lys Cys Gln Gly Leu Pro Ser Gln

            500                 505                 510

Arg Trp Phe Phe Asn Ser Asp Gly Ala Ile Val Asn Pro Lys Ser Arg

        515                 520                 525

Leu Val Met Asp Val Arg Ala Ser Asn Val Ser Leu Arg Glu Ile Ile

    530                 535                 540

Ile Phe Pro Ala Thr Gly Asn Pro Asn Gln Gln Trp Val Thr Gln Val

545                 550                 555                 560

Leu Pro Ser

<210>111

<211>564

<212>PRT

<213>Sambucus ebulus

<220>

<223>Ribosome-inactivating protein Ebulin 1 Precursor

<400>111

Met Arg Val Val Lys Ala Ala Met Leu Tyr Leu His Ile Val Val Leu

 1               5                  10                  15

Ala Ile Tyr Ser Val Gly Ile Gln Gly Ile Asp Tyr Pro Ser Val Ser

            20                  25                  30

Phe Asn Leu Ala Gly Ala Lys Ser Thr Thr Tyr Arg Asp Phe Leu Lys

        35                  40                  45

Asn Leu Arg Asp Arg Val Ala Thr Gly Thr Tyr Glu Val Asn Gly Leu

    50                  55                  60

Pro Val Leu Arg Arg Glu Ser Glu Val Gln Val Lys Asn Arg Phe Val

65                  70                  75                  80

Leu Val Arg Leu Thr Asn Tyr Asn Gly Asp Thr Val Thr Ser Ala Val

                85                  90                  95

Asp Val Thr Asn Leu Tyr Leu Val Ala Phe Ser Ala Asn Gly Asn Ser

            100                 105                 110

Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Thr Glu Leu Gln Lys Ser Asn Leu Phe Leu

        115                 120                 125

Gly Thr Thr Gln His Thr Leu Ser Phe Thr Gly Asn Tyr Asp Asn Leu

    130                 135                 140

Glu Thr Ala Ala Gly Thr Arg Arg Glu Ser Ile Glu Leu Gly Pro Asn

145                 150                 155                 160

Pro Leu Asp Gly Ala Ile Thr Ser Leu Trp Tyr Asp Gly Gly Val Ala

                165                 170                 175

Arg Ser Leu Leu Val Leu Ile Gln Met Val Pro Glu Ala Ala Arg Phe

            180                 185                 190

Arg Tyr Ile Glu Gln Glu Val Arg Arg Ser Leu Gln Gln Leu Thr Ser

        195                 200                 205

Phe Thr Pro Asn Ala Leu Met Leu Ser Met Glu Asn Asn Trp Ser Ser

    210                 215                 220

Met Ser Leu Glu Val Gln Leu Ser Gly Asp Asn Val Ser Pro Phe Ser

22                 5230                 235                 240

Gly Thr Val Gln Leu Gln Asn Tyr Asp His Thr Pro Arg Leu Val Asp

                245                 250                 255

Asn Phe Glu Glu Leu Tyr Lys Ile Thr Gly Ile Ala Ile Leu Leu Phe

            260                 265                 270

Arg Cys Val Ala Thr Lys Thr Thr His Asn Ala Ile Arg Met Pro His

        275                 280                 285

Val Leu Val Gly Glu Asp Asn Lys Phe Asn Asp Gly Glu Thr Cys Ala

    290                 295                 300

Ile Pro Ala Pro Phe Thr Arg Arg Ile Val Gly Arg Asp Gly Leu Cys

305                 310                 315                 320

Val Asp Val Arg Asn Gly Tyr Asp Thr Asp Gly Thr Pro Ile Gln Leu

                325                 330                 335

Trp Pro Cys Gly Thr Gln Arg Asn Gln Gln Trp Thr Phe Tyr Asn Asp

            340                 345                 350

Lys Thr Ile Arg Ser Met Gly Lys Cys Met Thr Ala Asn Gly Leu Asn

        355                 360                 365

Ser Gly Ser Tyr Ile Met Ile Thr Asp Cys Ser Thr Ala Ala Glu Asp

    370                 375                 380

Ala Thr Lys Trp Glu Val Leu Ile Asp Gly Ser Ile Ile Asn Pro Ser

385                 390                 395                 400

Ser Gly Leu Val Met Thr Ala Pro Ser Gly Ala Ser Arg Thr Thr Leu

                405                 410                 415

Leu Leu Glu Asn Asn Ile His Ala Ala Ser Gln Gly Trp Thr Val Ser

            420                 425                 430

Asn Asp Val Gln Pro Ile Ala Thr Leu Ile Val Gly Tyr Asn Glu Met

        435                 440                 445

Cys Leu Gln Ala Asn Gly Glu Asn Asn Asn Val Trp Met Glu Asp Cys

    450                 455                 460

Asp Val Thr Ser Val Gln Gln Gln Trp Ala Leu Phe Asp Asp Arg Thr

465                 470                 475                 480

Ile Arg Val Asn Asn Ser Arg Gly Leu Cys Val Thr Ser Asn Gly Tyr

                485                 490                 495

Val Ser Lys Asp Leu Ile Val Ile Arg Lys Cys Gln Gly Leu Ala Thr

            500                 505                 510

Gln Arg Trp Phe Phe Asn Ser Asp Gly Ser Val Val Asn Leu Lys Ser

        515                 520                 525

Thr Arg Val Met Asp Val Lys Glu Ser Asp Val Ser Leu Gln Glu Val

    530                 535                 540

Ile Ile Phe Pro Ala Thr Gly Asn Pro Asn Gln Gln Trp Arg Thr Gln

545                 550                 555                 560

Val Pro Gln Ile

<210>112

<211>99

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MCP-1 Precursor

<400>112

Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ile Ala Ala Thr

 1               5                  10                  15

Phe Ile Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val

            20                  25                  30

Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu

        35                  40                  45

Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val

    50                  55                  60

Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln

65                  70                  75                  80

Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr

                85                  90                  95

Pro Lys Thr

<210>113

<211>97

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>Eotaxin Precursor

<400>113

Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Trp Leu Leu Leu Ile Ala Ala Ala

 1               5                  10                  15

Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys

            20                  25                  30

Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser

        35                  40                  45

Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe

    50                  55                  60

Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp

65                  70                  75                  80

Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys

                85                  90                  95

Pro

<210>114

<211>93

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>SDF-1Precursor

<400>114

Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu

 1               5                  10                  15

Cys Leu Ser Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys

            20                  25                  30

Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys

        35                  40                  45

Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys

    50                  55                  60

Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys TrpIle Gln

65                  70                  75                  80

Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met

                85                  90

<210>115

<211>107

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>GRO-alpha Precursor

<400>115

Met Ala Arg Ala Ala Leu Ser Ala Ala Pro Ser Asn Pro Arg Leu Leu

 1               5                  10                  15

Arg Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Gly Arg Arg Ala

            20                  25                  30

Ala Gly Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr

        35                  40                  45

Leu Gln Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Lys Ser

    50                  55                  60

Pro Gly Pro Hi s Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn

65                  70                  75                  80

Gly Arg Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Ile Val Lys Lys Ile

                85                  90                  95

Ile Glu Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn

    100                 105

<210>116

<211>92

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-1-beta Precursor

<400>116

Met Lys Leu Cys Val Thr Val Leu Ser Leu Leu Met Leu Val Ala Ala

 1               5                  10                  15

Phe Cys Ser Pro Ala Leu Ser Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr

            20                  25                  30

Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val

        35                  40                  45

Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val

    50                  55                  60

Phe Gln Thr Lys Arg Ser Lys Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser

65                  70                  75                  80

Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr Asp Leu Glu Leu Asn

                85                  90

<210>117

<211>99

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>IL-8Precursor

<400>117

Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu Ile Ser

 1               5                  10                  15

Ala Ala Leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu

            20                  25                  30

Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe

        35                  40                  45

Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr

    50                  55                  60

Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro

65                  70                  75                  80

Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala

                85                  90                  95

Glu Asn Ser

<210>118

<211>98

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>IP-10Precursor

<400>118

Met Asn Gln Thr Ala Ile Leu Ile Cys Cys Leu Ile Phe Leu Thr Leu

 1               5                  10                  15

Ser Gly Ile Gln Gly Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys

            20                  25                  30

Ile Ser Ile Ser Asn Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu

        35                  40                  45

Glu Ile Ile Pro Ala Ser Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala

    50                  55                  60

Thr Met Lys Lys Lys Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys

65                  70                  75                  80

Ala Ile Lys Asn Leu Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser Lys Arg

                85                  90                  95

Ser Pro

<210>119

<211>99

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MCP-3Precursor

<400>119

Met Lys Ala Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala

 1               5                  10                  15

Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr

            20                  25                  30

Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu

        35                  40                  45

Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val

    50                  55                  60

Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln

65                  70                  75                  80

Lys Trp Val Gln Asp Phe Met Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr

                85                  90                  95

Pro Lys Leu

<210>120

<211>96

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-3-alpha Precursor

<400>120

Met Cys Cys Thr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu

 1               5                  10                  15

Leu Leu His Leu Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ala Ser Asn Phe Asp Cys

            20                  25                  30

Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu Hi s Pro Lys Phe Ile Val Gly

        35                  40                  45

Phe Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys AspIle Asn Ala Ile Ile

    50                  55                  60

Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gln Thr

65                  70                  75                  80

Trp Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asn Met

                85                  90                  95

<210>121

<211>93

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MDC Precursor

<400>121

Met Ala Arg Leu Gln Thr Ala Leu Leu Val Val Leu Val Leu Leu Ala

 1               5                  10                  15

Val Ala Leu Gln Ala Thr Glu Ala Gly Pro Tyr Gly Ala Asn Met Glu

            20                  25                  30

Asp Ser Val Cys Cys Arg Asp Tyr Val Arg Tyr Arg Leu Pro Leu Arg

        35                  40                  45

Val Val Lys His Phe Tyr Trp Thr Ser Asp Ser Cys Pro Arg Pro Gly

    50                  55                  60

Val Val Leu Leu Thr Phe Arg Asp Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Arg

65                  70                  75                  80

Val Pro Trp Val Lys Met Ile Leu Asn Lys Leu Ser Gln

                85                  90

<210>122

<211>92

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-1-alpha Precursor

<400>122

Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala

 1               5                  10                  15

Leu Cys Asn Gln Phe Ser Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala

            20                  25                  30

Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala

        35                  40                  45

Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe

    50                  55                  60

Leu Thr Lys Arg Ser Arg Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp

65                  70                  75                  80

Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Ser Ala

                85                  90

<210>123

<211>109

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>BCA-1 Precursor

<400>123

Met Lys Phe Ile Ser Thr Ser Leu Leu Leu Met Leu Leu Val Ser Ser

 1               5                  10                  15

Leu Ser Pro Val Gln Gly Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg

            20                  25                  30

Cys Arg Cys Val Gln Glu Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile

        35                  40                  45

Asp Arg Ile Gln Ile Leu Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu

    50                  55                  60

Ile Ile Val Trp Lys Lys Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln

65                  70                  75                  80

Ala Glu Trp Ile Gln Arg Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser

                85                  90                  95

Ser Thr Leu Pro Val Pro Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro

    100                 105

<210>124

<211>114

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>GCP-2Precursor

<400>124

Met Ser Leu Pro Ser Ser Arg Ala Ala Arg Val Pro Gly Pro Ser Gly

 1               5                  10                  15

Ser Leu Cys Ala Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Thr Pro Pro Gly

            20                  25                  30

Pro Leu Ala Ser Ala Gly Pro Val Ser Ala Val Leu Thr Glu Leu Arg

        35                  40                  45

Cys Thr Cys Leu Arg Val Thr Leu Arg Val Asn Pro Lys Thr Ile Gly

    50                  55                  60

Lys Leu Gln Val Phe Pro Ala Gly Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val

65                  70                  75                  80

Val Ala Ser Leu Lys Asn Gly Lys Gln Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala

                85                  90                  95

Pro Phe Leu Lys Lys Val Ile Gln Lys Ile Leu Asp Ser Gly Asn Lys

            100                 105                 110

Lys Asn

<210>125

<211>114

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>ENA-78Precursor

<400>125

Met Ser Leu Leu Ser Ser Arg Ala Ala Arg Val Pro Gly Pro Ser Ser

 1               5                  10                  15

Ser Leu Cys Ala Leu Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Thr Gln Pro Gly

            20                  25                  30

Pro Ile Ala Ser Ala Gly Pro Ala Ala Ala Val Leu Arg Glu Leu Arg

        35                  40                  45

Cys Val Cys Leu Gln Thr Thr Gln Gly Val His Pro Lys Met Ile Ser

    50                  55                  60

Asn Leu Gln Val Phe Ala Ile Gly Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val

65                  70                  75                  80

Val Ala Ser Leu Lys Asn Gly Lys Glu Ile Cys Leu Asp Pro Glu Ala

                85                  90                  95

Pro Phe Leu Lys Lys Val Ile Gln Lys Ile Leu Asp Gly Gly Asn Lys

            100                 105                 110

Glu Asn

<210>126

<211>128

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>PBP Precursor

<400>126

Met Ser Leu Arg Leu Asp Thr Thr Pro Ser Cys Asn Ser Ala Arg Pro

 1               5                  10                  15

Leu His Ala Leu Gln Val Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Thr Ala

            20                  25                  30

Leu Ala Ser Ser Thr Lys Gly Gln Thr Lys Arg Asn Leu Ala Lys Gly

        35                  40                  45

Lys Glu Glu Ser Leu Asp Ser Asp Leu Tyr Ala Glu Leu Arg Cys Met

    50                  55                  60

Cys Ile Lys Thr Thr Ser Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Leu

65                  70                  75                  80

Glu Val Ile Gly Lys Gly Thr His Cys Asn Gln Val Glu Val Ile Ala

                85                  90                  95

Thr Leu Lys Asp Gly Arg Lys Ile Cys Leu Asp Pro Asp Ala Pro Arg

            100                 105                 110

Ile Lys Lys Ile Val Gln Lys Lys Leu Ala Gly Asp Glu Ser Ala Asp

        115                 120                 125

<210>127

<211>125

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIG Precursor

<400>127

Met Ly s Lys Ser Gly Val Leu Phe Leu Leu Gly Ile Ile Leu Leu Val

 1                5                  10                  15

Leu Ile Gly Val Gln Gly Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys Ser

            20                  25                  30

Cys Ile Ser Thr Asn Gln Gly Thr Ile Hi s Leu Gln Ser Leu Lys Asp

        35                  40                  45

Leu Lys Gln Phe Ala Pro Ser Pro Ser Cys Glu Lys Ile Glu Ile Ile

    50                  55                  60

Ala Thr Leu Lys Asn Gly Val Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser Ala

65                  70                  75                  80

Asp Val Lys Glu Leu Ile Lys Lys Trp Glu Lys Gln Val Ser Gln Lys

                85                  90                  95

Lys Lys Gln Lys Asn Gly Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu Lys

            100                 105                 110

Val Arg Lys Ser Gln Arg Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr

        115                 120                 125

<210>128

<211>101

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>PF-4Precursor

<400>128

Met Ser Ser Ala Ala Gly Phe Cys Ala Ser Arg Pro Gly Leu Leu Phe

 1               5                  10                  15

Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val Val Ala Phe Ala Ser Ala Glu

            20                  25                  30

Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gln Cys Leu Cys Val Lys Thr Thr Ser

        35                  40                  45

Gln Val Arg Pro Arg His Ile Thr Ser Leu Glu Val Ile Lys Ala Gly

    50                  55                  60

Pro His Cys Pro Thr Ala Gln Leu Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg

65                  70                  75                  80

Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys

                85                  90                  95

Lys Leu Leu Glu Ser

            100

<210>129

<211>104

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>PF4Variant Precursor

<400>129

Met Ser Ser Ala Ala Arg Ser Arg Leu Thr Arg Ala Thr Arg Gln Glu

 1               5                  10                  15

Met Leu Phe Leu Ala Leu Leu Leu Leu Pro Val Val Val Ala Phe Ala

            20                  25                  30

Arg Ala Glu Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gln Cys Leu Cys Val Lys

        35                  40                  45

Thr Thr Ser Gln Val Arg Pro Arg His Ile Thr Ser Leu Glu Val Ile

    50                  55                  60

Lys Ala Gly Pro His Cys Pro Thr Ala Gln Leu Ile Ala Thr Leu Lys

65                  70                  75                  80

Asn Gly Arg Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Leu Leu Tyr Lys Lys

                85                  90                  95

Ile Ile Lys Glu His Leu Glu Ser

            100

<210>130

<211>211

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>SDF-2Precursor

<400>130

Met Ala Val Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly Gly Leu Trp Ser Ala Val

 1               5                  10                  15

Gly Ala Ser Ser Leu Gly Val Val Thr Cys Gly Ser Val Val Lys Leu

            20                  25                  30

Leu Asn Thr Arg His Asn Val Arg Leu His Ser His Asp Val Arg Tyr

        35                  40                  45

Gly Ser Ser Ser Gly Gln Gln Ser Val Thr Gly Val Thr Ser Val Asp

    50                  55                  60

Asp Ser Asn Ser Tyr Trp Arg Ile Arg Arg Lys Ser Ala Thr Val Cys

65                  70                  75                  80

Glu Arg Gly Thr Pro Ile Lys Cys Gly Gln Pro Ile Arg Leu Thr His

                85                  90                  95

Val Asn Thr Gly Arg Asn Leu His Ser His His Phe Thr Ser Pro Leu

            100                 105                 110

Ser Gly Asn Gln Glu Val Thr Ala Phe Gly Glu Glu Gly Glu Gly Asp

        115                 120                 125

Tyr Leu Asp Asp Trp Thr Val Leu Cys Asn Gly Pro Tyr Trp Val Arg

    130                 135                 140

Asp Gly Glu Val Arg Phe Lys His Ser Ser Thr Glu Val Leu Leu Ser

145                 150                 155                 160

Val Thr Gly Glu Gln Tyr Gly Arg Pro Ile Ser Gly Gln Lys Glu Val

                165                 170                 175

His Gly Met Ala Gln Pro Ser Gln Asn Asn Tyr Trp Lys Ala Met Glu

            180                 185                 190

Gly Ile Phe Met Lys Pro Ser Glu Leu Leu Lys Ala Glu Ala His His

        195                 200                 205

Ala Glu Leu

    210

<210>131

<211>99

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MCP-2Precursor

<400>131

Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Met Ala Ala Thr

 1               5                  10                  15

Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile

            20                  25                  30

Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu

        35                  40                  45

Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val

    50                  55                  60

Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu

65                  70                  75                  80

Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn

                85                  90                  95

Leu Lys Pro

<210>132

<211>98

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MCP-4Precursor

<400>132

Met Lys Val Ser Ala Val Leu Leu Cys Leu Leu Leu Met Thr Ala Ala

 1               5                  10                  15

Phe Asn Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ala Leu Asn Val Pro Ser

            20                  25                  30

Thr Cys Cys Phe Thr Phe Ser Ser Lys Lys Ile Ser Leu Gln Arg Leu

        35                  40                  45

Lys Ser Tyr Val Ile Thr Thr Ser Arg Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile

    50                  55                  60

Phe Arg Thr Lys Leu Gly Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys

65                  70                  75                  80

Trp Val Gln Asn Tyr Met Lys His Leu Gly Arg Lys Ala His Thr Leu

                85                  90                  95

Lys Thr

<210>133

<211>89

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-4Precursor

<400>133

Met Lys Gly Leu Ala Ala Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Thr Met Ala

 1               5                  10                  15

Leu Cys Ser Cys Ala Gln Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu Cys Cys Leu

            20                  25                  30

Val Tyr Thr Ser Trp Gln Ile Pro Gln Lys Phe Ile Val Asp Tyr Ser

        35                  40                  45

Glu Thr Ser Pro Gln Cys Pro Lys Pro Gly Val Ile Leu Leu Thr Lys

    50                  55                  60

Arg Gly Arg Gln Ile Cys Ala Asp Pro Asn Lys Lys Trp Val Gln Lys

65                  70                  75                  80

Tyr Ile Ser Asp Leu Lys Leu Asn Ala

                85

<210>134

<211>98

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-3-beta Precursor

<400>134

Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro

 1               5                  10                  15

Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser

            20                  25                  30

Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr

        35                  40                  45

Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr

    50                  55                  60

Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu

65                  70                  75                  80

Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg

                85                  90                  95

Ser Ser

<210>135

<211>107

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP2-alpha Precursor

<400>135

Met Ala Arg Ala Thr Leu Ser Ala Ala Pro Ser Asn Pro Arg Leu Leu

 1               5                  10                  15

Arg Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Ser Arg Arg Ala

            20                  25                  30

Ala Gly Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr

        35                  40                  45

Leu Gln Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys Val Lys Ser

    50                  55                  60

Pro Gly Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn

65                  70                  75                  80

Gly Gln Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys Ile

                85                  90                  95

Ile Glu Lys Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn

            100                 105

<210>136

<211>107

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP2-beta Precursor

<400>136

Met Ala His Ala Thr Leu Ser Ala Ala Pro Ser Asn Pro Arg Leu Leu

 1               5                  10                  15

Arg Val Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Ala Ser Arg Arg Ala

            20                  25                  30

Ala Gly Ala Ser Val Val Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr

        35                  40                  45

Leu Gln Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Arg Ser

    50                  55                  60

Pro Gly Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn

65                  70                  75                  80

Gly Lys Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Gln Lys Ile

                85                  90                  95

Ile Glu Lys Ile Leu Asn Lys Gly Ser Thr Asn

            100                 105

<210>137

<211>113

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-5Precursor

<400>137

Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Ala Val

 1               5                  10                  15

Leu Gly Ser Gln Ala Gln Phe Ile Asn Asp Ala Glu Thr Glu Leu Met

            20                  25                  30

Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Val Leu Asn Ser Phe His

        35                  40                  45

Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser Tyr Ile Ser Gln Ser Ile Pro Cys

    50                  55                  60

Ser Leu Met Lys Ser Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys Ser Lys Pro

65                  70                  75                  80

Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln Val Cys Ala Lys Pro

                85                  90                  95

Ser Gly Pro Gly Val Gln Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys Pro Tyr Ser

            100                 105                 110

Ile

<210>138

<211>93

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>HCC-1Precursor

<400>138

Met Lys Ile Ser Val Ala Ala Ile Pro Phe Phe Leu Leu Ile Thr Ile

 1               5                  10                  15

Ala Leu Gly Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr His Pro

            20                  25                  30

Ser Glu Cys Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys Ile Pro Arg Gln Arg

        35                  40                  45

Ile Met Asp Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Ile

    50                  55                  60

Val Phe Ile Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys Thr Asn Pro Ser Asp

65                  70                  75                  80

Lys Trp Val Gln Asp Tyr Ile Lys Asp Met Lys Glu Asn

                85                  90

<210>139

<211>91

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>RANTES Precursor

<400>139

Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala

 1               5                  10                  15

Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro

            20                  25                  30

Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala Hi s Ile Lys

        35                  40                  45

Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe

    50                  55                  60

Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp

65                  70                  75                  80

Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser

                85                  90

<210>140

<211>119

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>Eotaxin-2Precursor

<400>140

Met Ala Gly Leu Met Thr Ile Val Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gly Val

 1               5                  10                  15

Cys Ala His His Ile Ile Pro Thr Gly Ser Val Val Ile Pro Ser Pro

            20                  25                  30

Cys Cys Met Phe Phe Val Ser Lys Arg Ile Pro Glu Asn Arg Val Val

        35                  40                  45

Ser Tyr Gln Leu Ser Ser Arg Ser Thr Cys Leu Lys Ala Gly Val Ile

    50                  55                  60

Phe Thr Thr Lys Lys Gly Gln Gln Phe Cys Gly Asp Pro Lys Gln Glu

65                  70                  75                  80

Trp Val Gln Arg Tyr Met Lys Asn Leu Asp Ala Lys Gln Lys Lys Ala

                85                  90                  95

Ser Pro Arg Ala Arg Ala Val Ala Val Lys Gly Pro Val Gln Arg Tyr

            100                 105                 110

Pro Gly Asn Gln Thr Thr Cys

        115

<210>141

<211>94

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>TARC Precursor

<400>141

Met Ala Pro Leu Lys Met Leu Ala Leu Val Thr Leu Leu Leu Gly Ala

 1               5                  10                  15

Ser Leu Gln His Ile His Ala Ala Arg Gly Thr Asn Val Gly Arg Glu

            20                  25                  30

Cys Cys Leu Glu Tyr Phe Lys Gly Ala Ile Pro Leu Arg Lys Leu Lys

        35                  40                  45

Thr Trp Tyr Gln Thr Ser Glu Asp Cys Ser Arg Asp Ala Ile Val Phe

    50                  55                  60

Val Thr Val Gln Gly Arg Ala Ile Cys Ser Asp Pro Asn Asn Lys Arg

65                  70                  75                  80

Val Lys Asn Ala Val Lys Tyr Leu Gln Ser Leu Glu Arg Ser

                85                  90

<210>142

<211>96

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>I-309 Precursor

<400>142

Met Gln Ile Ile Thr Thr Ala Leu Val Cys Leu Leu Leu Ala Gly Met

 1               5                  10                  15

Trp Pro Glu Asp Val Asp Ser Lys Ser Met Gln Val Pro Phe Ser Arg

            20                  25                  30

Cys Cys Phe Ser Phe Ala Glu Gln Glu Ile Pro Leu Arg Ala Ile Leu

        35                  40                  45

Cys Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Ile Cys Ser Asn Glu Gly Leu Ile Phe

    50                  55                  60

Lys Leu Lys Arg Gly Lys Glu Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp

65                  70                  75                  80

Val Gln Arg His Arg Lys Met Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys

                85                  90                  95

<210>143

<211>114

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>Lymphotactin Precursor

<400>143

Met Arg Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Gly Ile Cys Ser Leu Thr Ala

 1               5                  10                  15

Tyr Ile Val Glu Gly Val Gly Ser Glu Val Ser Asp Lys Arg Thr Cys

            20                  25                  30

Val Ser Leu Thr Thr Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr

        35                  40                  45

Thr Ile Thr Glu Gly Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg

    50                  55                  60

Gly Leu Lys Val Cys Ala Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val

65                  70                  75                  80

Val Arg Ser Met Asp Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln

                85                  90                  95

Thr Lys Pro Thr Gly Thr Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu

            100                 105                 110

Thr Gly

<210>144

<211>167

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>Lungkine Precursor

<400>144

Met Ala Ala Gln Gly Trp Ser Met Leu Leu Leu Ala Val Leu Asn Leu

 1               5                  10                  15

Gly Ile Phe Val Arg Pro Cys Asp Thr Gln Glu Leu Arg Cys Leu Cys

            20                  25                  30

Ile Gln Glu His Ser Glu Phe Ile Pro Leu Lys Leu Ile Lys Asn Ile

        35                  40                  45

Met Val Ile Phe Glu Thr Ile Tyr Cys Asn Arg Lys Glu Val Ile Ala

    50                  55                  60

Val Pro Lys Asn Gly Ser Met Ile Cys Leu Asp Pro Asp Ala Pro Trp

65                  70                  75                  80

Val Lys Ala Thr Val Gly Pro Ile Thr Asn Arg Phe Leu Pro Glu Asp

                85                  90                  95

Leu Lys Gln Lys Glu Phe Pro Pro Ala Met Lys Leu Leu Tyr Ser Val

            100                 105                 110

Glu His Glu Lys Pro Leu Tyr Leu Ser Phe Gly Arg Pro Glu Asn Lys

        115                 120                 125

Arg Ile Phe Pro Phe Pro Ile Arg Glu Thr Ser Arg His Phe Ala Asp

    130                 135                 140

Leu Ala His Asn Ser Asp Arg Asn Phe Leu Arg Asp Ser Ser Glu Val

145                 150                 155                 160

Ser Leu Thr Gly Ser Asp Ala

                165

<210>145

<211>116

<212>PRT

<213>Mus musculus

<220>

<223>C10 Precursor

<400>145

Met Arg Asn Ser Lys Thr Ala Ile Ser Phe Phe Ile Leu Val Ala Val

 1               5                  10                  15

Leu Gly Ser Gln Ala Gly Leu Ile Gln Glu Met Glu Lys Glu Asp Arg

            20                  25                  30

Arg Tyr Asn Pro Pro Ile Ile His Gln Gly Phe Gln Asp Thr Ser Ser

        35                  40                  45

Asp Cys Cys Phe Ser Tyr Ala Thr Gln Ile Pro Cys Lys Arg Phe Ile

    50                  55                  60

Tyr Tyr Phe Pro Thr Ser Gly Gly Cys Ile Lys Pro Gly Ile Ile Phe

65                  70                  75                  80

Ile Ser Arg Arg Gly Thr Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Asp Arg Arg

                85                  90                  95

Val Gln Arg Cys Leu Ser Thr Leu Lys Gln Gly Pro Arg Ser Gly Asn

            100                 105                 110

Lys Val Ile Ala

        115

<210>146

<211>122

<212>PRT

<213>Mus musculus

<220>

<223>MIP-1-gamma Precursor

<400>146

Met Lys Pro Phe His Thr Ala Leu Ser Phe Leu Ile Leu Thr Thr Ala

 1               5                  10                  15

Leu Gly Ile Trp Ala Gln Ile Thr His Ala Thr Glu Thr Lys Glu Val

            20                  25                  30

Gln Ser Ser Leu Lys Ala Gln Gln Gly Leu Glu Ile Glu Met Phe His

        35                  40                  45

Met Gly Phe Gln Asp Ser Ser Asp Cys Cys Leu Ser Tyr Asn Ser Arg

    50                  55                  60

Ile Gln Cys Ser Arg Phe Ile Gly Tyr Phe Pro Thr Ser Gly Gly Cys

65                  70                  75                  80

Thr Arg Pro Gly Ile Ile Phe Ile Ser Lys Arg Gly Phe Gln Val Cys

                85                  90                  95

Ala Asn Pro Ser Asp Arg Arg Val Gln Arg Cys Ile Glu Arg Leu Glu

            100                 105                 110

Gln Asn Ser Gln Pro Arg Thr Tyr Lys Gln

        115                 120

<210>147

<211>104

<212>PRT

<213>Mus musculus

<220>

<223>MCP-5Precursor

<400>147

Met Lys Ile Ser Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ile Ala Thr Thr Ile

 1               5                  10                  15

Ser Pro Gln Val Leu Ala Gly Pro Asp Ala Val Ser Thr Pro Val Thr

            20                  25                  30

Cys Cys Tyr Asn Val Val Lys Gln Lys Ile His Val Arg Lys Leu Lys

        35                  40                  45

Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Ser Gln Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile

    50                  55                  60

Phe Arg Thr Ile Leu Asp Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys

65                  70                  75                  80

Trp Val Lys Asn Ser Ile Asn His Leu Asp Lys Thr Ser Gln Thr Phe

                85                  90                  95

Ile Leu Glu Pro Ser Cys Leu Gly

            100

<210>148

<211>120

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>LEC Precursor

<400>148

Met Lys Val Ser Glu Ala Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Ile LeuIle

 1               5                  10                  15

Ile Thr Ser Ala Ser Arg Ser Gln Pro Lys Val Pro Glu Trp Val Asn

            20                  25                  30

Thr Pro Ser Thr Cys Cys Leu Lys Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Pro Arg

        35                  40                  45

Arg Leu Val Val Gly Tyr Arg Lys Ala Leu Asn Cys His Leu Pro Ala

    50                  55                  60

Ile Ile Phe Val Thr Lys Arg Asn Arg Glu Val Cys Thr Asn Pro Asn

65                  70                  75                  80

Asp Asp Trp Val Gln Glu Tyr Ile Lys Asp Pro Asn Leu Pro Leu Leu

                85                  90                  95

Pro Thr Arg Asn Leu Ser Thr Val Lys Ile Ile Thr Ala Lys Asn Gly

            100                 105                 110

Gln Pro Gln Leu Leu Asn Ser Gln

        115                 120

<210>149

<211>134

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>Exodus-2Precursor

<400>149

Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe

 1               5                  10                  15

Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys

            20                  25                  30

Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr

        35                  40                  45

Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe

    50                  55                  60

Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu

65                  70                  75                  80

Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro

                85                  90                  95

Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr

            100                 105                 110

Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser

        115                 120                 125

Gln Thr Pro Lys Gly Pro

    130

<210>150

<211>120

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-3Precursor

<400>150

Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala

 1               5                  10                  15

Leu Gly Ser Gln Ala Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met

            20                  25                  30

Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His

        35                  40                  45

Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro Arg Ser Ile Pro

    50                  55                  60

Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys

65                  70                  75                  80

Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn

                85                  90                  95

Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp

            100                 105                 110

Thr Arg Ile Lys Thr Arg Lys Asn

        115                 120

<210>151

<211>150

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>TECK Precursor

<400>151

Met Asn Leu Trp Leu Leu Ala Cys Leu Val Ala Gly Phe Leu Gly Ala

 1               5                  10                  15

Trp Ala Pro Ala Val His Thr Gln Gly Val Phe Glu Asp Cys Cys Leu

            20                  25                  30

Ala Tyr His Tyr Pro Ile Gly Trp Ala Val Leu Arg Arg Ala Trp Thr

        35                  40                  45

Tyr Arg Ile Gln Glu Val Ser Gly Ser Cys Asn Leu Pro Ala Ala Ile

    50                  55                  60

Phe Tyr Leu Pro Lys Arg His Arg Lys Val Cys Gly Asn Pro Lys Ser

65                  70                  75                  80

Arg Glu Val Gln Arg Ala Met Lys Leu Leu Asp Ala Arg Asn Lys Val

                85                  90                  95

Phe Ala Lys Leu His His Asn Met Gln Thr Phe Gln Ala Gly Pro His

            100                 105                 110

Ala Val Lys Lys Leu Ser Ser Gly Asn Ser Lys Leu Ser Ser Ser Lys

        115                 120                 125

Phe Ser Asn Pro Ile Ser Ser Ser Lys Arg Asn Val Ser Leu Leu Ile

    130                 135                 140

Ser Ala Asn Ser Gly Leu

145                 150

<210>152

<211>94

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>Eotaxin-3Precursor

<400>152

Met Met Gly Leu Ser Leu Ala Ser Ala Val Leu Leu Ala Ser Leu Leu

 1               5                  10                  15

Ser Leu His Leu Gly Thr Ala Thr Arg Gly Ser Asp Ile Ser Lys Thr

            20                  25                  30

Cys Cys Phe Gln Tyr Ser His Lys Pro Leu Pro Trp Thr Trp Val Arg

        35                  40                  45

Ser Tyr Glu Phe Thr Ser Asn Ser Cys Ser Gln Arg Ala Val Ile Phe

    50                  55                  60

Thr Thr Lys Arg Gly Lys Lys Val Cys Thr His Pro Arg Lys Lys Trp

65                  70                  75                  80

Val Gln Lys Tyr Ile Ser Leu Leu Lys Thr Pro Lys Gln Leu

                85                  90

<210>153

<211>112

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>CTACK Precursor

<400>153

Met Lys Gly Pro Pro Thr Phe Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu

 1               5                  10                  15

Leu Ser Pro Asp Pro Thr Ala Ala Phe Leu Leu Pro Pro Ser Thr Ala

            20                  25                  30

Cys Cys Thr Gln Leu Tyr Arg Lys Pro Leu Ser Asp Lys Leu Leu Arg

        35                  40                  45

Lys Val Ile Gln Val Glu Leu Gln Glu Ala Asp Gly Asp Cys His Leu

    50                  55                  60

Gln Ala Phe Val Leu His Leu Ala Gln Arg Ser Ile Cys Ile His Pro

65                  70                  75                  80

Gln Asn Pro Ser Leu Ser Gln Trp Phe Glu His Gln Glu Arg Lys Leu

                85                  90                  95

His Gly Thr Leu Pro Lys Leu Asn Phe Gly Met Leu Arg Lys Met Gly

            100                 105                 110

<210>154

<211>127

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MEC Precursor

<400>154

Met Gln Gln Arg Gly Leu Ala Ile Val Ala Leu Ala Val Cys Ala Ala

 1               5                  10                  15

Leu His Ala Ser Glu Ala Ile Leu Pro Ile Ala Ser Ser Cys Cys Thr

            20                  25                  30

Glu Val Ser His His Ile Ser Arg Arg Leu Leu Glu Arg Val Asn Met

        35                  40                  45

Cys Arg Ile Gln Arg Ala Asp Gly Asp Cys Asp Leu Ala Ala Val Ile

    50                  55                  60

Leu His Val Lys Arg Arg Arg Ile Cys Val Ser Pro His Asn His Thr

65                  70                  75                  80

Val Lys Gln Trp Met Lys Val Gln Ala Ala Lys Lys Asn Gly Lys Gly

                85                  90                  95

Asn Val Cys His Arg Lys Lys His His Gly Lys Arg Asn Ser Asn Arg

            100                 105                 110

Ala His Gln Gly Lys His Glu Thr Tyr Gly His Lys Thr Pro Tyr

        115                 120                 125

<210>155

<211>114

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>SCM-1beta Precursor

<400>155

Met Arg Leu Leu Ile Leu Ala Leu Leu Gly Ile Cys Ser Leu Thr Ala

 1               5                  10                  15

Tyr Ile Val Glu Gly Val Gly Ser Glu Val Ser His Arg Arg Thr Cys

            20                  25                  30

Val Ser Leu Thr Thr Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr

        35                  40                  45

Thr Ile Thr Glu Gly Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg

    50                  55                  60

Gly Leu Lys Val Cys Ala Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val

65                  70                  75                  80

Val Arg Ser Met Asp Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln

                85                  90                  95

Thr Lys Pro Thr Gly Thr Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu

            100                 105                 110

Thr Gly

<210>156

<211>94

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>I-TAC Precursor

<400>156

Met Ser Val Lys Gly Met Ala Ile Ala Leu Ala Val Ile Leu Cys Ala

 1               5                  10                  15

Thr Val Val Gln Gly Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Leu Cys

            20                  25                  30

Ile Gly Pro Gly Val Lys Ala Val Lys Val Ala Asp Ile Glu Lys Ala

        35                  40                  45

Ser Ile Met Tyr Pro Ser Asn Asn Cys Asp Lys Ile Glu Val Ile Ile

    50                  55                  60

Thr Leu Lys Glu Asn Lys Gly Gln Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys

65                  70                  75                  80

Gln Ala Arg Leu Ile Ile Lys Lys Val Glu Arg Lys Asn Phe

                85                  90

<210>157

<211>99

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>BRAK Precursor

<400>157

Met Arg Leu Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Tyr

 1               5                  10                  15

Thr Ala Arg Val Asp Gly Ser Lys Cys Lys Cys Ser Arg Lys Gly Pro

            20                  25                  30

Lys Ile Arg Tyr Ser Asp Val Lys Lys Leu Glu Met Lys Pro Lys Tyr

        35                  40                  45

Pro His Cys Glu Glu Lys Met Val Ile Ile Thr Thr Lys Ser Val Ser

    50                  55                  60

Arg Tyr Arg Gly Gln Glu His Cys Leu His Pro Lys Leu Gln Ser Thr

65                  70                  75                  80

Lys Arg Phe Ile Lys Trp Tyr Asn Ala Trp Asn Glu Lys Arg Arg Val

             85                  90                  95

Tyr Glu Glu

<210>158

<211>254

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>SR-PSOX Precursor

<400>158

Met Gly Arg Asp Leu Arg Pro Gly Ser Arg Val Leu Leu Leu Leu Leu

 1               5                  10                  15

Leu Leu Leu Leu Val Tyr Leu Thr Gln Pro Gly Asn Gly Asn Glu Gly

            20                  25                  30

Ser Val Thr Gly Ser Cys Tyr Cys Gly Lys Arg Ile Ser Ser Asp Ser

        35                  40                  45

Pro Pro Ser Val Gln Phe Met Asn Arg Leu Arg Lys His Leu Arg Ala

    50                  55                  60

Tyr Hi s Arg Cys Leu Tyr Tyr Thr Arg Phe Gln Leu Leu Ser Trp Ser

65                  70                  75                  80

Val Cys Gly Gly Asn Lys Asp Pro Trp Val Gln Glu Leu Met Ser Cys

                85                  90                  95

Leu Asp Leu Lys Glu Cys Gly His Ala Tyr Ser Gly Ile Val Ala His

            100                 105                 110

Gln Lys His Leu Leu Pro Thr Ser Pro Pro Ile Ser Gln Ala Ser Glu

        115                 120                 125

Gly Ala Ser Ser Asp Ile His Thr Pro Ala Gln Met Leu Leu Ser Thr

    130                 135                 140

Leu Gln Ser Thr Gln Arg Pro Thr Leu Pro Val Gly Ser Leu Ser Ser

145                 150                 155                 160

Asp Lys Glu Leu Thr Arg Pro Asn Glu Thr Thr Ile His Thr Ala Gly

                165                 170                 175

His Ser Leu Ala Val Gly Pro Glu Ala Gly Glu Asn Gln Lys Gln Pro

            180                 185                 190

Glu Lys Asn Ala Gly Pro Thr Ala Arg Thr Ser Ala Thr Val Pro Val

        195                 200                 205

Leu Cys Leu Leu Ala Ile Ile Phe Ile Leu Thr Ala Ala Leu Ser Tyr

    210                 215                 220

Val Leu Cys Lys Arg Arg Arg Gly Gln Ser Pro Gln Ser Ser Pro Asp

225                 230                 235                 240

Leu Pro Val His Tyr Ile Pro Val Ala Pro Asp Ser Asn Thr

                245                 250

<210>159

<211>395

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>Fractalkine Precursor

<400>159

Met Ala Pro Ser Pro Leu Ala Trp Leu Leu Arg Leu Ala Ala Phe Phe

 1               5                  10                  15

His Leu Cys Thr Leu Leu Pro Gly Gln His Leu Gly Met Thr Lys Cys

            20                  25                  30

Glu Ile Met Cys Gly Lys Met Thr Ser Arg Ile Pro Val Ala Leu Leu

        35                  40                  45

Ile Arg Tyr Gln Leu Asn Gln Glu Ser Cys Gly Lys Arg Ala Ile Val

    50                  55                  60

Leu Glu Thr Thr Gln His Arg Arg Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys

65                  70                  75                  80

Trp Val Gln Asp Ala Met Lys His Leu Asp His Gln Ala Ala Ala Leu

                85                  90                  95

Thr Lys Asn Gly Gly Lys Phe Glu Lys Arg Val Asp Asn Val Thr Pro

            100                 105                 110

Gly Ile Thr Leu Ala Thr Arg Gly Leu Ser Pro Ser Ala Leu Thr Lys

        115                 120                 125

Pro Glu Ser Ala Thr Leu Glu Asp Leu Ala Leu Glu Leu Thr Thr Ile

    130                 135                 140

Ser Gln Glu Ala Arg Gly Thr Met Gly Thr Ser Gln Glu Pro Pro Ala

145                 150                 155                 160

Ala Val Thr Gly Ser Ser Leu Ser Thr Ser Glu Ala Gln Asp Ala Gly

                165                 170                 175

Leu Thr Ala Lys Pro Gln Ser Ile Gly Ser Phe Glu Ala Ala Asp Ile

            180                 185                 190

Ser Thr Thr Val Trp Pro Ser Pro Ala Val Tyr Gln Ser Gly Ser Ser

        195                 200                 205

Ser Trp Ala Glu Glu Lys Ala Thr Glu Ser Pro Ser Thr Thr Ala Pro

    210                 215                 220

Ser Pro Gln Val Ser Thr Thr Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn Val

225                 230                 235                 240

Gly Ser Glu Gly Gln Pro Pro Trp Val Gln Gly Gln Asp Leu Ser Pro

                245                 250                 255

Glu Lys Ser Leu Gly Ser Glu Glu Ile Asn Pro Val His Thr Asp Asn

            260                 265                 270

Phe Gln Glu Arg Gly Pro Gly Asn Thr Val His Pro Ser Val Ala Pro

        275                 280                 285

Ile Ser Ser Glu Glu Thr Pro Ser Pro Glu Leu Val Ala Ser Gly Ser

    290                 295                 300

Gln Ala Pro Lys Ile Glu Glu Pro Ile His Ala Thr Ala Asp Pro Gln

305                 310                 315                 320

Lys Leu Ser Val Leu Ile Thr Pro Val Pro Asp Thr Gln Ala Ala Thr

                325                 330                 335

Arg Arg Gln Ala Val Gly Leu Leu Ala Phe Leu Gly Leu Leu Phe Cys

            340                 345                 350

Leu Gly Val Ala Met Phe Ala Tyr Gln Ser Leu Gln Gly Cys Pro Arg

        355                 360                 365

Lys Met Ala Gly Glu Met Val Glu Gly Leu Arg Tyr Val Pro Arg Ser

    370                 375                 380

Cys Gly Ser Asn Ser Tyr Val Leu Val Pro Val

385                 390                 395

<210>160

<211>93

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>LD78-beta Precursor

<400>160

Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala

 1               5                  10                  15

Leu Cys Asn Gln Val Leu Ser Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr

            20                  25                  30

Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile

        35                  40                  45

Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile

    50                  55                  60

Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu

65                  70                  75                  80

Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Ser Ala

                85                  90

<210>161

<211>92

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-1b2 Precursor

<400>161

Met Lys Leu Cys Val Thr Val Leu Ser Leu Leu Val Leu Val Ala Ala

 1               5                  10                  15

Phe Cys Ser Leu Ala Leu Ser Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr

            20                  25                  30

Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val

        35                  40                  45

Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val

    50                  55                  60

Phe Gln Thr Lys Arg Gly Lys Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser

65                  70                  75                  80

Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr Asp Leu Glu Leu Asn

                85                  90

<210>162

<211>299

<212>PRT

<213>Saponaria officinalis

<220>

<223>Saporin Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>60

<223>Xaa＝Gly or Ser

<220>

<221>VARIANT

<222>72

<223>Xaa＝Glu or Asp

<220>

<221>VARIANT

<222>115

<223>Xaa＝Arg or Lys

<220>

<221>VARIANT

<222>123

<223>Xaa＝Ser or Leu

<220>

<221>VARIANT

<222>212

<223>Xaa＝Ile or Thr

<400>162

Met Lys Ile Tyr Val Val Ala Thr Ile Ala Trp Ile Leu Leu Gln Phe

 1               5                  10                  15

Ser Ala Trp Thr Thr Thr Asp Ala Val Thr Ser Ile Thr Leu Asp Leu

            20                  25                  30

Val Asn Pro Thr Ala Gly Gln Tyr Ser Ser Phe Val Asp Lys Ile Arg

        35                  40                  45

Asn Asn Val Lys Asp Pro Asn Leu Lys Tyr Gly Xaa Thr Asp Ile Ala

    50                  55                  60

Val Ile Gly Pro Pro Ser Lys Xaa Lys Phe Leu Arg Ile Asn Phe Gln

65                  70                  75                  80

Ser Ser Arg Gly Thr Val Ser Leu Gly Leu Lys Arg Asp Asn Leu Tyr

                85                  90                  95

Val Val Ala Tyr Leu Ala Met Asp Asn Thr Asn Val Asn Arg Ala Tyr

            100                 105                 110

Tyr Phe Xaa Ser Glu Ile Thr Ser Ala Glu Xaa Thr Ala Leu Phe Pro

        115                 120                 125

Glu Ala Thr Thr Ala Asn Gln Lys Ala Leu Glu Tyr Thr Glu Asp Tyr

    130                 135                 140

Gln Ser Ile Glu Lys Asn Ala Gln Ile Thr Gln Gly Asp Gln Ser Arg

145                 150                 155                 160

Lys Glu Leu Gly Leu Gly Ile Asp Leu Leu Ser Thr Ser Met Glu Ala

                165                 170                 175

Val Asn Lys Lys Ala Arg Val Val Lys Asp Glu Ala Arg Phe Leu Leu

            180                 185                 190

Ile Ala Ile Gln Met Thr Ala Glu Ala Ala Arg Phe Arg Tyr Ile Gln

        195                 200                 205

Asn Leu Val Xaa Lys Asn Phe Pro Asn Lys Phe Asn Ser Glu Asn Lys

    210                 215                 220

Val Ile Gln Phe Glu Val Asn Trp Lys Lys Ile Ser Thr Ala Ile Tyr

225                 230                 235                 240

Gly Asp Ala Lys Asn Gly Val Phe Asn Lys Asp Tyr Asp Phe Gly Phe

                245                 250                 255

Gly Lys Val Arg Gln Val Lys Asp Leu Gln Met Gly Leu Leu Met Tyr

            260                 265                 270

Leu Gly Lys Pro Lys Ser Ser Asn Glu Ala Asn Ser Thr Val Arg His

        275                 280                 285

Tyr Gly Pro Leu Lys Pro Thr Leu Leu Ile Thr

    290                 295

<210>163

<211>316

<212>PRT

<213>Gelonium multiflorum

<220>

<223>Gelonin Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>90

<223>Xaa＝Cys or Lys

<220>

<221>VARIANT

<222>93

<223>Xaa＝Pro or Asp

<400>163

Met Lys Gly Asn Met Lys Val Tyr Trp Ile Lys Ile Ala Val Ala Thr

 1               5                  10                  15

Trp Phe Cys Cys Thr Thr Ile Val Leu Gly Ser Thr Ala Arg Ile Phe

            20                  25                  30

Ser Leu Pro Thr Asn Asp Glu Glu Glu Thr Ser Lys Thr Leu Gly Leu

        35                  40                  45

Asp Thr Val Ser Phe Ser Thr Lys Gly Ala Thr Tyr Ile Thr Tyr Val

50                  55                  60

Asn Phe Leu Asn Glu Leu Arg Val Lys Leu Lys Pro Glu Gly Asn Ser

65                  70                  75                  80

His Gly Ile Pro Leu Leu Arg Lys Lys Xaa Asp Asp Xaa Gly Lys Cys

                85                  90                  95

Phe Val Leu Val Ala Leu Ser Asn Asp Asn Gly Gln Leu Ala Glu Ile

            100                 105                 110

Ala Ile Asp Val Thr Ser Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln Val Arg Asn

        115                 120                 125

Arg Ser Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Pro Asp Ala Ala Tyr Glu Gly Leu

    130                 135                 140

Phe Lys Asn Thr Ile Lys Thr Arg Leu His Phe Gly Gly Ser Tyr Pro

145                 150                 155                 160

Ser Leu Glu Gly Glu Lys Ala Tyr Arg Glu Thr Thr Asp Leu Gly Ile

                165                 170                 175

Glu Pro Leu Arg Ile Gly Ile Lys Lys Leu Asp Glu Asn Ala Ile Asp

            180                 185                 190

Asn Tyr Lys Pro Thr Glu Ile Ala Ser Ser Leu Leu Val Val Ile Gln

        195                 200                 205

Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Thr Phe Ile Glu Asn Gln Ile Arg

    210                 215                 220

Asn Asn Phe Gln Gln Arg Ile Arg Pro Ala Asn Asn Thr Ile Ser Leu

225                 230                 235                 240

Glu Asn Lys Trp Gly Lys Leu Ser Phe Gln Ile Arg Thr Ser Gly Ala

                245                 250                 255

Asn Gly Met Phe Ser Glu Ala Val Glu Leu Glu Arg Ala Asn Gly Lys

            260                 265                 270

Lys Tyr Tyr Val Thr Ala Val Asp Gln Val Lys Pro Lys Ile Ala Leu

        275                 280                 285

Leu Lys Phe Val  Asp Lys Asp Pro Lys Thr Ser Leu Ala Ala Glu Leu

    290                 295                 300

Ile Ile Gln Asn Tyr Glu Ser Leu Val Gly Phe Asp

305                 310                 315

<210>164

<211>576

<212>PRT

<213>Ricinus communis

<220>

<223>Ricin A Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>76

<223>Xaa＝Glu or Asp

<220>

<221>VARIANT

<222>83

<223>Xaa＝Arg or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>109

<223>Xaa＝Leu，Ala or Met

<220>

<221>VARIANT

<222>110

<223>Xaa＝Asp，Ala，Glu or Asn

<220>

<221>VARIANT

<222>111

<223>Xaa＝Val，Ala or Met

<220>

<221>VARIANT

<222>132

<223>Xaa＝Asn or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>551

<223>Xaa＝Ala or Arg

<400>164

Met Lys Pro Gly Gly Asn Thr Ile Val Ile Trp Met Tyr Ala Val Ala

 1               5                  10                  15

Thr Trp Leu Cys Phe Gly Ser Thr Ser Gly Trp Ser Phe Thr Leu Glu

            20                  25                  30

Asp Asn Asn Ile Phe Pro Lys Gln Tyr Pro Ile Ile Asn Phe Thr Thr

        35                  40                  45

Ala Gly Ala Thr Val Gln Ser Tyr Thr Asn Phe Ile Arg Ala Val Arg

    50                  55                  60

Gly Arg Leu Thr Thr Gly Ala Asp Val Arg His Xaa Ile Pro Val Leu

65                  70                  75                  80

Pro Asn Xaa Val Gly Leu Pro Ile Asn Gln Arg Phe Ile Leu Val Glu

                85                  90                  95

Leu Ser Asn His Ala Glu Leu Ser Val Thr Leu Ala Xaa Xaa Xaa Thr

            100                 105                 110

Asn Ala Tyr Val Val GlyTyr Arg Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Phe Phe

        115                 120                 125

His Pro Asp Xaa Gln Glu Asp Ala Glu Ala Ile Thr His Leu Phe Thr

    130                 135                 140

Asp Val Gln Asn Arg Tyr Thr Phe Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Asp Arg

145                 150                 155                 160

Leu Glu Gln Leu Ala Gly Asn Leu Arg Glu Asn Ile Glu Leu Gly Asn

                165                 170                 175

Gly Pro Leu Glu Glu Ala Ile Ser Ala Leu Tyr Tyr Tyr Ser Thr Gly

            180                 185                 190

Gly Thr Gln Leu Pro Thr Leu Ala Arg Ser Phe Ile Ile Cys Ile Gln

        195                 200                 205

Met Ile Ser Glu Ala Ala Arg Phe Gln Tyr Ile Glu Gly Glu Met Arg

    210                 215                 220

Thr Arg Ile Arg Tyr Asn Arg Arg Ser Ala Pro Asp Pro Ser Val Ile

225                 230                 235                 240

Thr Leu Glu Asn Ser Trp Gly Arg Leu Ser Thr Ala Ile Gln Glu Ser

                245                 250                 255

Asn Gln Gly Ala Phe Ala Ser Pro Ile Gln Leu Gln Arg Arg Asn Gly

            260                 265                 270

Ser Lys Phe Ser Val Tyr Asp Val Ser Ile Leu Ile Pro Ile Ile Ala

        275                 280                 285

Leu Met Val Tyr Arg Cys Ala Pro Pro Pro Ser Ser Gln Phe Ser Leu

    290                 295                 300

Leu Ile Arg Pro Val Val Pro Asn Phe Asn Ala Asp Val Cys Met Asp

305                 310                 315                 320

Pro Glu Pro Ile Val ArgIle Val Gly Arg Asn Gly Leu Cys Val Asp

                325                 330                 335

Val Arg Asp Gly Arg Phe Hi s Asn Gly Asn Ala Ile Gln Leu Trp Pro

            340                 345                 350

Cys Lys Ser Asn Thr Asp Ala Asn Gln Leu Trp Thr Leu Lys Arg Asp

        355                 360                 365

Asn Thr Ile Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu Thr Thr Tyr Gly Tyr Ser

    370                 375                 380

Pro Gly Val Tyr Val Met Ile Tyr Asp Cys Asn Thr Ala Ala Thr Asp

385                 390                 395                 400

Ala Thr Arg Trp Gln Ile Trp Asp Asn Gly Thr Ile Ile Asn Pro Arg

                405                 410                 415

Ser Ser Leu Val Leu Ala Ala Thr Ser Gly Asn Ser Gly Thr Thr Leu

            420                 425                 430

Thr Val Gln Thr Asn Ile Tyr Ala Val Ser Gln Gly Trp Leu Pro Thr

        435                 440                 445

Asn Asn Thr Gln Pro Phe Val Thr Thr Ile Val Gly Leu Tyr Gly Leu

    450                 455                 460

Cys Leu Gln Ala Asn Ser Gly Gln Val Trp Ile Glu Asp Cys Ser Ser

465                 470                 475                 480

Glu Lys Ala Glu Gln Gln Trp Ala Leu Tyr Ala Asp Gly Ser Ile Arg

                485                 490                 495

Pro Gln Gln Asn Arg Asp Asn Cys Leu Thr Ser Asp Ser Asn Ile Arg

            500                 505                 510

Glu Thr Val Val Lys Ile Leu Ser Cys Gly Pro Ala Ser Ser Gly Gln

        515                 520                 525

Arg Trp Met Phe Lys Asn Asp Gly Thr Ile Leu Asn Leu Tyr Ser Gly

    530                 535                 540

Leu Val Leu Asp Val Arg Xaa Ser Asp Pro Ser Leu Lys Gln Ile Ile

545                 550                 555                 560

Leu Tyr Pro Leu His Gly Asp Pro Asn Gln Ile Trp Leu Pro Leu Phe

           565                 570                 575

<210>165

<211>290

<212>PRT

<213>Bryonia dioica

<220>

<223>Bryodin I Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>212

<223>Xaa＝Glu or Lys

<400>165

Met Ile Lys Leu Leu Val Leu Trp Leu Leu Ile Leu Thr Ile Phe Leu

 1               5                  10                  15

Lys Ser Pro Thr Val Glu Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala

            20                  25                  30

Thr Thr Thr Ser Tyr Gly Val Phe Ile Lys Asn Leu Arg Glu Ala Leu

        35                  40                  45

Pro Tyr Glu Arg Lys Val Tyr Asn Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser Ile

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Arg Tyr Thr Leu Leu His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp

65                  70                  75                  80

Glu Thr Ile Ser Val Ala Val Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly

                85                  90                  95

Tyr Leu Ala Gly Asp Val Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr

            100                 105                 110

Glu Ala Ala Lys Phe Val Phe Lys Asp Ala Lys Lys Lys Val Thr Leu

        115                 120                 125

Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile

    130                 135                 140

Arg Glu Asn Ile Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr

145                 150                 155                 160

Thr Leu Tyr Tyr Tyr Thr Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ala Leu Leu Val

                165                 170                 175

Leu Ile Gln Ser Thr Ala Glu Ser Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln

            180                 185                 190

Gln Ile Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Thr

        195                 200                 205

Ile Ser Leu Xaa Asn Asn Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile

    210                 215                 220

Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asp

225                 230                 235                 240

Gly Asn Asn Gln Arg Val Ser Ile Thr Asn Ala Ser Ala Arg Val Val

                245                 250                 255

Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu Leu Asn Arg Asn Asn Ile Ala Ala Ile

            260                 265                 270

Gly Glu Asp Ile Ser Met Thr Leu Ile Gly Phe Glu His Gly Leu Tyr

        275                 280                 285

Gly Ile

    290

<210>166

<211>289

<212>PRT

<213>Thrichosanthes kirilowii

<220>

<223>Trichosanthin Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>87

<223>Xaa＝Ile or Leu

<220>

<221>VARIANT

<222>196

<223>Xaa＝Lys or Ser

<220>

<221>VARIANT

<222>231

<223>Xaa＝Gln or Thr

<220>

<221>VARIANT

<222>234

<223>Xaa＝Ser or Thr

<220>

<221>VARIANT

<222>247

<223>Xaa＝Thr or Met

<400>166

Met Ile Arg Phe Leu Val Leu Ser Leu Leu Ile Leu Thr Leu Phe Leu

 1               5                  10                  15

Thr Thr Pro Ala Val Glu Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala

            20                  25                  30

Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Val Phe Ile Ser Asn Leu Arg Lys Ala Leu

        35                  40                  45

Pro Asn Glu Arg Lys Leu Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser Leu

    50                  55                  60

Pro Gly Ser Gln Arg Tyr Ala Leu Ile His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp

65                  70                  75                  80

Glu Thr Ile Ser Val Ala Xaa Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly

                85                  90                  95

Tyr Arg Ala Gly Asp Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr

            100                 105                 110

Glu Ala Ala Lys Tyr Val Phe Lys Asp Ala Met Arg Lys Val Thr Leu

        115                 120                 125

Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile

    130                 135                 140

Arg Glu Asn Ile Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr

145                 150                 155                 160

Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val

                165                 170                 175

Leu Ile Gln Ser Thr Ser Glu Ala Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln

            180                 185                 190

Gln Ile Gly Xaa Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile

        195                 200                 205

Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile

    210                 215                 220

Ala Ser Thr Asn Asn Gly Xaa Phe Glu Xaa Pro Val Val Leu Ile Asn

225                 230                 235                 240

Ala Gln Asn Gln Arg Val Xaa Ile Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val

                245                 250                 255

Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu Leu Asn Arg Asn Asn Met Ala Ala Met

            260                 265                 270

Asp Asp Asp Val Pro Met Thr Gln Ser Phe Gly Cys Gly Ser Tyr Ala

        275                 280                 285

Ile

<210>167

<211>528

<212>PRT

<213>Abrus precatorius

<220>

<223>Abrin Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>1

<223>Xaa＝Gln or Glu

<220>

<221>VARIANT

<222>200

<223>Xaa＝Asn or Pro

<220>

<221>VARIANT

<222>298

<223>Xaa＝Asn or Tyr

<220>

<221>VARIANT

<222>427

<223>Xaa＝Met or Leu

<220>

<221>VARIANT

<222>467

<223>Xaa＝Thr or Pro

<220>

<221>VARIANT

<222>483

<223>Xaa＝Val  or Leu

<400>167

Xaa Asp Arg Pro Ile Lys Phe Ser Thr Glu Gly Ala Thr Ser Gln Ser

 1               5                  10                  15

Tyr Lys Gln Phe Ile Glu Ala Leu Arg Glu Arg Leu Arg Gly Gly Leu

            20                  25                  30

Ile His Asp Ile Pro Val Leu Pro Asp Pro Thr Thr Leu Gln Glu Arg

        35                  40                  45

Asn Arg Tyr Ile Thr Val Glu Leu Ser Asn Ser Asp Thr Glu Ser Ile

    50                  55                  60

Glu Val Gly Ile Asp Val Thr Asn Ala Tyr Val Val Ala Tyr Arg Ala

65                  70                  75                  80

Gly Thr Gln Ser Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Pro Ser Ser Ala Ser Asp

                85                  90                  95

Tyr Leu Phe Thr Gly Thr Asp Gln His Ser Leu Pro Phe Tyr Gly Thr

            100                 105                 110

Tyr Gly Asp Leu Glu Arg Trp Ala His Gln Ser Arg Gln Gln Ile Pro

        115                 120                 125

Leu Gly Leu Gln Ala Leu Thr His Gly Ile Ser Phe Phe Arg Ser Gly

    130                 135                 140

Gly Asn Asp Asn Glu Glu Lys Ala Arg Thr Leu Ile Val Ile Ile Gln

145                 150                 155                 160

Met Val Ala Glu Ala Ala Arg Phe Arg Tyr Ile Ser Asn Arg Val Arg

                165                 170                 175

Val SerIle Gln Thr Gly Thr Ala Phe Gln Pro Asp Ala Ala MetIle

           180                 185                 190

Ser Leu Glu Asn Asn Trp Asp Xaa Leu Ser Arg Gly Val Gln Glu Ser

        195                 200                 205

Val Gln Asp Thr Phe Pro Asn Gln Val Thr Leu Thr Asn Ile Arg Asn

    210                 215                 220

Glu Pro Val Ile Val Asp Ser Leu Ser His Pro Thr Val Ala Val Leu

225                 230                 235                 240

Ala Leu Met Leu Phe Val Cys Asn Pro Pro Asn Ala Asn Gln Ser Pro

                245                 250                 255

Leu Leu Ile Arg Ser Ile Val Glu Lys Ser Lys Ile Cys Ser Ser Arg

            260                 265                 270

Tyr Glu Pro Thr Val Arg Ile Gly Gly Arg Asp Gly Met Cys Val Asp

        275                 280                 285

Val Tyr Asp Asn Gly Tyr His Asn Gly Xaa Arg Ile Ile Met Trp Lys

    290                 295                 300

Cys Lys Asp Arg Leu Glu Glu Asn Gln Leu Trp Thr Leu Lys Ser Asp

305                 310                 315                 320

Lys Thr Ile Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu Thr Thr Tyr Gly Tyr Ala

                325                 330                 335

Pro Gly Ser Tyr Val Met Ile Tyr Asp Cys Thr Ser Ala Val Ala Glu

            340                 345                 350

Ala Thr Tyr Trp Glu Ile Trp Asp Asn Gly Thr Ile Ile Asn Pro Lys

        355                 360                 365

Ser Ala Leu Val Leu Ser Ala Glu Ser Ser Ser Met Gly Gly Thr Leu

    370                 375                 380

Thr Val Gln Thr Asn Glu Tyr Leu Met Arg Gln Gly Trp Arg Thr Gly

385                 390                 395                 400

Asn Asn Thr Ser Pro Phe Val Thr Ser Ile Ser Gly Tyr Ser Asp Leu

                405                 410                 415

Cys Met Gln Ala Gln Gly Ser Asn Val Trp Xaa Ala Asp Cys Asp Ser

            420                 425                 430

Asn Lys Lys Glu Gln Gln Trp Ala Leu Tyr Thr Asp Gly Ser Ile Arg

        435                 440                 445

Ser Val Gln Asn Thr Asn Asn Cys Leu Thr Ser Lys Asp His Lys Gln

    450                 455                 460

Gly Ser Xaa Ile Leu Leu Met Gly Cys Ser Asn Gly Trp Ala Ser Gln

465                 470                 475                 480

Arg Trp Xaa Phe Lys Asn Asp Gly Ser Ile Tyr Ser Leu Tyr Asp Asp

                485                 490                 495

Met Val Met Asp Val Lys Gly Ser Asp Pro Ser Leu Lys Gln Ile Ile

            500                 505                 510

Leu Trp Pro Tyr Thr Gly Lys Pro Asn Gln Ile Trp Leu Thr Leu Phe

        515                 520                 525

<210>168

<211>278

<212>PRT

<213>Mirabilis jalapa

<220>

<223>MAP Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>35

<223>Xaa＝Ile or Leu

<220>

<221>VARIANT

<222>58

<223>Xaa＝Ala or Val

<220>

<221>VARIANT

<222>180

<223>Xaa＝Val or Cys

<220>

<221>VARIANT

<222>218

<223>Xaa＝Asp or Gly

<400>168

Met Leu Thr Thr Thr Lys Val Phe Phe Leu Leu Leu Thr Thr Trp Ile

 1               5                  10                  15

Thr Trp Tyr Ala Ile Val Asn Pro Gln Ser Arg Ala Ala Pro Thr Leu

            20                  25                  30

Glu Thr Xaa Ala Ser Leu Asp Leu Asn Asn Pro Thr Thr Tyr Leu Ser

        35                  40                  45

Phe Ile Thr Asn Ile Arg Thr Lys Val Xaa Asp Lys Thr Glu Gln Cys

    50                  55                  60

Thr Ile Gln Lys Ile Ser Lys Thr Phe Thr Gln Arg Tyr Ser Tyr Ile

65                  70                  75                  80

Asp Leu Ile Val Ser Ser Thr Gln Lys Ile Thr Leu Ala Ile Asp Met

                85                  90                  95

Ala Asp Leu Tyr Val Leu Gly Tyr Ser Asp Ile Ala Asn Asn Lys Gly

            100                 105                 110

Arg Ala Phe Phe Phe Lys Asp Val Thr Glu Ala Val Ala Asn Asn Phe

        115                 120                 125

Phe Pro Gly Ala Thr Gly Thr Asn Arg Ile Lys Leu Thr Phe Thr Gly

    130                 135                 140

Ser Tyr Gly Asp Leu Glu Lys Asn Gly Gly Leu Arg Lys Asp Asn Pro

145                 150                 155                 160

Leu Gly Ile Phe Arg Leu Glu Asn Ser Ile Val Asn Ile Tyr Gly Lys

                165                 170                 175

Ala Gly Asp Xaa Lys Lys Gln Ala Lys Phe Phe Leu Leu Ala Ile Gln

            180                 185                 190

Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Ser Asp Lys Ile Pro

        195                 200                 205

Ser Glu Lys Tyr Glu Glu Val Thr Val Xaa Glu Tyr Met Thr Ala Leu

    210                 215                 220

Glu Asn Asn Trp Ala Lys Leu Ser Thr Ala Val Tyr Asn Ser Lys Pro

225                 230                 235                 240

Ser Thr Thr Thr Ala Thr Lys Cys Gln Leu Ala Thr Ser Pro Val Thr

                245                 250                 255

Ile Ser Pro Trp Ile Phe Lys Thr Val Glu Glu Ile Lys Leu Val Met

            260                 265                 270

Gly Leu Leu Lys Ser Ser

        275

<210>169

<211>563

<212>PRT

<213>Sambucus nigra

<220>

<223>Nigrin b Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>39

<223>Xaa＝Lys or Val

<400>169

Met Arg Val Val Ala Ala Ala Met Leu Tyr Phe Tyr Ile Val Val Leu

 1               5                  10                  15

Ala Ile Cys Ser Val Gly Ile Gln Gly Ile Asp Tyr Pro Ser Val Ser

            20                  25                  30

Phe Asn Leu Asp Gly Ala Xaa Ser Ala Thr Tyr Arg Asp Phe Leu Ser

        35                  40                  45

Asn Leu Arg Lys Thr Val Ala Thr Gly Thr Tyr Glu Val Asn Gly Leu

    50                  55                  60

Pro Val Leu Arg Arg Glu Ser Glu Val Gln Val Lys Ser Arg Phe Val

65                  70                  75                  80

Leu Val Pro Leu Thr Asn Tyr Asn Gly Asn Thr Val Thr Leu Ala Val

                85                  90                  95

Asp Val Thr Asn Leu Tyr Val Val Ala Phe Ser Gly Asn Ala Asn Ser

            100                 105                 110

Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Thr Glu Val Gln Lys Ser Asn Leu Phe Val

        115                 120                 125

Gly Thr Lys Gln Asn Thr Leu Ser Phe Thr Gly Asn Tyr Asp Asn Leu

    130                 135                 140

Glu Thr Ala Ala Asn Thr Arg Arg Glu Ser Ile Glu Leu Gly Pro Ser

145                 150                 155                 160

Pro Leu Asp Gly Ala Ile Thr Ser Leu Tyr His Gly Asp Ser Val Ala

                165                 170                 175

Arg Ser Leu Leu Val Val Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe

            180                 185                 190

Arg Tyr Ile Glu Gln Glu Val Arg Arg Ser Leu Gln Gln Ala Thr Ser

        195                 200                 205

Phe Thr Pro Asn Ala Leu Met Leu Ser Met Glu Asn Asn Trp Ser Ser

    210                 215                 220

Met Ser Leu Glu Ile Gln Gln Ala Gly Asn Asn Val Ser Pro Phe Phe

225                 230                 235                 240

Gly Thr Val Gln Leu Leu Asn Tyr Asp His Thr His Arg Leu Val Asp

                245                 250                 255

Asn Phe Glu Glu Leu Tyr Lys Ile Thr Gly Ile Ala Ile Leu Leu Phe

            260                 265                 270

Arg Cys Ser Ser Pro Ser Asn Asp Asn Ala Ile Arg Met Pro Leu Asp

        275                 280                 285

Leu Ala Gly Glu Asp Asn Lys Tyr Asn Asp Gly Glu Thr Cys Thr Leu

    290                 295                 300

Arg Thr Ser Phe Thr Arg Asn Ile Val Gly Arg Asp Gly Leu Cys Val

305                 310                 315                 320

Asp Val Arg Asn Gly Tyr Asp Thr Asp Gly Thr Pro Leu Gln Leu Trp

                325                 330                 335

Pro Cys Gly Thr Gln Arg Asn Gln Arg Trp Thr Phe Asp Ser Asp Asp

            340                 345                 350

Thr Ile Arg Ser Met Gly Lys Cys Met Thr Ala Asn Gly Leu Asn Asn

        355                 360                 365

Gly Ser Asn Ile Val Ile Phe Asn Cys Ser Thr Ala Ala Glu Asn Ala

    370                 375                 380

Ile Lys Trp Glu Val Pro Ile Asp Gly Ser Ile Ile Asn Pro Ser Ser

385                 390                 395                 400

Gly Leu Val Met Thr Ala Pro Arg Ala Ala Ser Arg Thr Ile Leu Leu

                405                 410                 415

Leu Glu Asp Asn Ile Tyr Ala Ala Ser Gln Gly Trp Thr Val Thr Asn

            420                 425                 430

Asn Val Lys ProIle Val Ala Ser Ile Val Gly Tyr Lys Glu Met Cys

        435                 440                 445

Leu Gln Ser Asn Gly Glu Asn Asn Gly Val Trp Met Glu Asp Cys Glu

    450                 455                 460

Ala Thr Ser Leu Gln Gln Gln Trp Ala Leu Tyr Gly Asp Arg Thr Ile

465                 470                 475                 480

Arg Val Asn Ser Thr Arg Gly Leu Cys Val Thr Thr Asn Gly Tyr Asn

                485                 490                 495

Ser Lys Asp Leu Ile Ile Ile Leu Lys Cys Gln Gly Leu Pro Ser Gln

            500                 505                 510

Arg Trp Phe Phe Asn Ser Asp Gly Ala Ile Val Asn Pro Lys Ser Arg

        515                 520                 525

His Val Met Asp Val Arg Ala Ser Asn Val Ser Leu Arg Glu Ile Ile

    530                 535                 540

Ile Phe Pro Ala Thr Gly Asn Pro Asn Gln Gln Trp Val Thr Gln Val

545                 550                 555                 560

Leu Pro Ser

<210>170

<211>99

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MCP-1Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>26

<223>Xaa＝Asp or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>28

<223>Xaa＝Ile or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>29

<223>Xaa＝Asn or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>31

<223>Xaa＝Pro or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>32

<223>Xaa＝Val，Ala or Glu

<220>

<221>VARIANT

<222>33

<223>Xaa＝Thr，Ala or Glu

<220>

<221>VARIANT

<222>36

<223>Xaa＝Tyr or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>47

<223>Xaa＝Arg or Phe

<220>

<221>VARIANT

<222>50

<223>Xaa＝Ser or Gln

<220>

<221>VARIANT

<222>51

<223>Xaa＝Tyr or Asp

<220>

<221>VARIANT

<222>53

<223>Xaa＝Arg or Leu

<220>

<221>VARIANT

<222>79

<223>Xaa＝Lys or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>81

<223>Xaa＝Lys or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>89

<223>Xaa＝His or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>91

<223>Xaa＝Asp or Leu

<400>170

Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ile Ala Ala Thr

 1               5                  10                  15

Phe Ile Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Xaa Ala Xaa Xaa Ala Xaa Xaa

            20                  25                  30

Xaa Cys Cys Xaa Asn Phe Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Xaa Leu

        35                  40                  45

Ala Xaa Xaa Arg Xaa Ile Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val

    50                  55                  60

Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Xaa Gln

65                  70                  75                  80

Xaa Trp Val Gln Asp Ser Met Asp Xaa Leu Xaa Lys Gln Thr Gln Thr

                85                  90                  95

Pro Lys Thr

<210>171

<211>97

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>Eotaxin Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>7

<223>Xaa＝Leu or Pro

<220>

<221>VARIANT

<222>23

<223>Xaa＝Ala or Thr

<220>

<221>VARIANT

<222>51

<223>Xaa＝Arg or Ser

<220>

<221>VARIANT

<222>79

<223>Xaa＝Lys or Arg

<400>171

Met Lys Val Ser Ala Ala Xaa Leu Trp Leu Leu Leu Ile Ala Ala Ala

 1               5                  10                  15

Phe Ser Pro Gln Gly Leu Xaa Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys

            20                  25                  30

Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser

        35                  40                  45

Tyr Arg Xaa Ile Thr Ser Gly Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe

    50                  55                  60

Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Xaa Trp

65                  70                  75                  80

Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys

                85                  90                  95

Pro

<210>172

<211>92

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-1-beta Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>6

<223>Xaa＝Thr or Cys

<220>

<221>VARIANT

<222>15

<223>Xaa＝Ala or Ser

<220>

<221>VARIANT

<222>56

<223>Xaa＝Ser or Ile

<220>

<221>VARIANT

<222>70

<223>Xaa＝Ser or Gly

<220>

<221>VARIANT

<222>80

<223>Xaa＝Ser or Thr

<400>172

Met Lys Leu Cys Val Xaa Val Leu Ser Leu Leu Met Leu Val Xaa Ala

 1               5                  10                  15

Phe Cys Ser Pro Ala Leu Ser Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr

            20                  25                  30

Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val

        35                  40                  45

Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser Xaa Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val

    50                  55                  60

Phe Gln Thr Lys Arg Xaa Lys Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Xaa

65                  70                  75                  80

Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr Asp Leu Glu Leu Asn

                85                  90

<210>173

<211>99

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>IL-8Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>53

<223>Xaa＝Arg or Leu

<400>173

Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu Ile Ser

 1               5                  10                  15

Ala Ala Leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu

            20                  25                  30

Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe

        35                  40                  45

Ile Lys Glu Leu Xaa Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr

    50                  55                  60

Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro

65                  70                  75                  80

Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala

                85                  90                  95

Glu Asn Ser

<210>174

<211>98

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>IP-10Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>93

<223>Xaa＝Arg or Met

<400>174

Met Asn Gln Thr Ala Ile Leu Ile Cys Cys Leu Ile Phe Leu Thr Leu

 1               5                  10                  15

Ser Gly Ile Gln Gly Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys

            20                  25                  30

Ile Ser Ile Ser Asn Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu

        35                  40                  45

Glu Ile Ile Pro Ala Ser Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala

    50                  55                  60

Thr Met Lys Lys Lys Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys

65                  70                  75                  80

Ala Ile Lys Asn Leu Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Xaa Ser Lys Arg

                85                  90                  95

Ser Pro

<210>175

<211>99

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MCP-3Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>30

<223>Xaa＝Thr or Lys

<400>175

Met Lys Ala Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala

 1               5                  10                  15

Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Val Gly Ile Asn Xaa Ser Thr

            20                  25                  30

Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu

        35                  40                  45

Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val

    50                  55                  60

Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln

65                  70                  75                  80

Lys Trp Val Gln Asp Phe Met Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr

                85                  90                  95

Pro Lys Leu

<210>176

<211>96

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-3-alpha Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>47

<223>Xaa＝Val or Met

<400>176

Met Cys Cys Thr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu

 1               5                  10                  15

Leu Leu His Leu Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ala Ser Asn Phe Asp Cys

            20                  25                  30

Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His Pro Lys Phe Ile Xaa Gly

        35                  40                  45

Phe Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys Asp Ile Asn Ala Ile Ile

    50                  55                  60

Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gln Thr

65                  70                  75                  80

Trp Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asn Met

                85                  90                  95

<210>177

<211>92

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-1-alpha Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>40

<223>Xaa＝Arg or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>49

<223>Xaa＝Asp or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>68

<223>Xaa＝Arg or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>70

<223>Xaa＝Arg or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>89

<223>Xaa＝Glu or Ala

<400>177

Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala

 1               5                  10                  15

Leu Cys Asn Gln Phe Ser Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala

            20                  25                  30

Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Xaa Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala

        35                  40                  45

Xaa Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe

    50                  55                  60

Leu Thr Lys Xaa Ser Xaa Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp

65                  70                  75                  80

Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Xaa Leu Ser Ala

                85                  90

<210>178

<211>101

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>PF-4Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>78

<223>Xaa＝Asn or Asp

<400>178

Met Ser Ser Ala Ala Gly Phe Cys Ala Ser Arg Pro Gly Leu Leu Phe

 1               5                  10                  15

Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val Val Ala Phe Ala Ser Ala Glu

            20                  25                  30

Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gln Cys Leu Cys Val Lys Thr Thr Ser

        35                  40                  45

Gln Val Arg Pro Arg His Ile Thr Ser Leu Glu Val Ile Lys Ala Gly

    50                  55                  60

Pro His Cys Pro Thr Ala Gln Leu Ile Ala Thr Leu Lys Xaa Gly Arg

65                  70                  75                  80

Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys

                85                  90                  95

Lys Leu Leu Glu Ser

            100

<210>179

<211>104

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>PF-4varl Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>77

<223>Xaa＝Ala or Ser

<400>179

Met Ser Ser Ala Ala Arg Ser Arg Leu Thr Arg Ala Thr Arg Gln Glu

 1               5                  10                  15

Met Leu Phe Leu Ala Leu Leu Leu Leu Pro Val Val Val Ala Phe Ala

            20                  25                  30

Arg Ala Glu Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gln Cys Leu Cys Val Lys

        35                  40                  45

Thr Thr Ser Gln Val Arg Pro Arg Hi s Ile Thr Ser Leu Glu Val Ile

    50                  55                  60

Lys Ala Gly Pro His Cys Pro Thr Ala Gln Leu Ile Xaa Thr Leu Lys

65                  70                  75                  80

Asn Gly Arg Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Leu Leu Tyr Lys Lys

                85                  90                  95

Ile Ile Lys Glu His Leu Glu Ser

                  100

<210>180

<211>211

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>SDF-2Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>51

<223>Xaa＝Ser or Gly

<220>

<221>VARIANT

<222>74

<223>Xaa＝Arg or Gly

<220>

<221>VARIANT

<222>119

<223>Xaa＝Thr or Ser

<400>180

Met AlaVal Val Pro Leu Leu Leu Leu Gly Gly Leu Trp Ser Ala Val

 1              5                  10                  15

Gly Ala Ser Ser Leu Gly Val Val Thr Cys Gly Ser Val Val Lys Leu

            20                  25                  30

Leu Asn Thr Arg His Asn Val Arg Leu His Ser His Asp Val Arg Tyr

        35                  40                  45

Gly Ser Xaa Ser Gly Gln Gln Ser Val Thr Gly Val Thr Ser Val Asp

    50                  55                  60

Asp Ser Asn Ser Tyr Trp Arg Ile Arg Xaa Lys Ser Ala Thr Val Cys

65                  70                  75                  80

Glu Arg Gly Thr Pro Ile Lys Cys Gly Gln Pro Ile Arg Leu Thr His

                85                  90                  95

Val Asn Thr Gly Arg Asn Leu His Ser His Hi s Phe Thr Ser Pro Leu

            100                 105                 110

Ser Gly Asn Gln Glu Val Xaa Ala Phe Gly Glu Glu Gly Glu Gly Asp

        115                 120                 125

Tyr Leu Asp Asp Trp Thr Val Leu Cys Asn Gly Pro Tyr Trp Val Arg

    130                 135                 140

Asp Gly Glu Val Arg Phe Lys His Ser Ser Thr Glu Val Leu Leu Ser

145                 150                 155                 160

Val Thr Gly Glu Gln Tyr Gly Arg Pro Ile Ser Gly Gln Lys Glu Val

                165                 170                 175

His Gly Met Ala Gln Pro Ser Gln Asn Asn Tyr Trp Lys Ala Met Glu

           180                 185                 190

Gly lle Phe Met Lys Pro Ser Glu Leu Leu Lys Ala Glu Ala His His

        195                 200                 205

Ala Glu Leu

    210

<210>181

<211>99

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MCP-2Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>69

<223>Xaa＝Lys or Gln

<400>181

Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Met Ala Ala Thr

 1               5                  10                  15

Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile

            20                  25                  30

Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu

        35                  40                  45

Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val

    50                  55                  60

Ile Phe Lys Thr Xaa Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu

65                  70                  75                  80

Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn

                85                  90                  95

Leu Lys Pro

<210>182

<211>113

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-5Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>14

<223>Xaa＝Val or Ile

<220>

<221>VARIANT

<222>24

<223>Xaa＝Ile or Thr

<400>182

Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Xaa Ala Val

 1               5                  10                  15

Leu Gly Ser Gln Ala Gln Phe Xaa Asn Asp Ala Glu Thr Glu Leu Met

            20                  25                  30

Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Val Leu Asn Ser Phe His

        35                  40                  45

Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser Tyr Ile Ser Gln Ser Ile Pro Cys

    50                  55                  60

Ser Leu Met Lys Ser Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys Ser Lys Pro

65                  70                  75                  80

 Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln Val Cys Ala Lys Pro

                 85                  90                  95

Ser Gly Pro Gly Val Gln Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys Pro Tyr Ser

            100                 105                 110

Ile

<210>183

<211>119

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>Eotaxin-2Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>29

<223>Xaa＝Ile or Leu

<220>

<221>VARIANT

<222>61

<223>Xaa＝Ala or Gly

<220>

<221>VARIANT

<222>73

<223>Xaa＝Phe or Ser

<400>183

Met Ala Gly Leu Met Thr Ile Val Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gly Val

 1               5                  10                  15

Cys Ala His His Ile Ile Pro Thr Gly Ser Val Val Xaa Pro Ser Pro

            20                  25                  30

Cys Cys Met Phe Phe Val Ser Lys Arg Ile Pro Glu Asn Arg Val Val

        35                  40                  45

Ser Tyr Gln Leu Ser Ser Arg Ser Thr Cys Leu Lys Xaa Gly Val Ile

    50                  55                  60

Phe Thr Thr Lys Lys Gly Gln Gln Xaa Cys Gly Asp Pro Lys Gln Glu

65                  70                  75                  80

Trp Val Gln Arg Tyr Met Lys Asn Leu Asp Ala Lys Gln Lys Lys Ala

                85                  90                  95

Ser Pro Arg Ala Arg Ala Val Ala Val Lys Gly Pro Val Gln Arg Tyr

            100                 105                 110

Pro Gly Asn Gln Thr Thr Cys

        115

<210>184

<211>116

<212>PRT

<213>Mus musculus

<220>

<223>C10Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>43

<223>Xaa＝Phe or Val

<220>

<221>VARIANT

<222>93

<223>Xaa＝Ser or Arg

<220>

<221>VARIANT

<222>111

<223>Xaa＝Gly or Arg

<400>184

Met Arg Asn Ser Lys Thr Ala Ile Ser Phe PheIle Leu Val Ala Val

 1               5                  10                  15

Leu Gly Ser Gln Ala Gly Leu Ile Gln Glu Met Glu Lys Glu Asp Arg

            20                  25                  30

Arg Tyr Asn Pro Pro Ile Ile His Gln Gly Xaa Gln Asp Thr Ser Ser

        35                  40                  45

Asp Cys Cys Phe Ser Tyr Ala Thr Gln Ile Pro Cys Lys Arg Phe Ile

    50                  55                  60

Tyr Tyr Phe Pro Thr Ser Gly Gly Cys Ile Lys Pro Gly Ile Ile Phe

6570                  75                  80

Ile Ser Arg Arg Gly Thr Gln Val Cys Ala Asp Pro Xaa Asp Arg Arg

                85                  90                  95

Val Gln Arg Cys Leu Ser Thr Leu Lys Gln Gly Pro Arg Ser Xaa Asn

            100                 105                 110

Lys Val Ile Ala

        115

<210>185

<211>122

<212>PRT

<213>Mus musculus

<220>

<223>MIP-1-gamma Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>113

<223>Xaa＝Gln or Lys

<400>185

Met Lys Pro Phe His Thr Ala Leu Ser Phe Leu Ile Leu Thr Thr Ala

 1               5                  10                  15

Leu Gly Ile Trp Ala Gln Ile Thr His Ala Thr Glu Thr Lys Glu Val

            20                  25                  30

Gln Ser Ser Leu Lys Ala Gln Gln Gly Leu Glu Ile Glu Met Phe His

        35                  40                  45

Met Gly Phe Gln Asp Ser Ser Asp Cys Cys Leu Ser Tyr Asn Ser Arg

    50                  55                  60

Ile Gln Cys Ser Arg Phe Ile Gly Tyr Phe Pro Thr Ser Gly Gly Cys

65                  70                  75                  80

Thr Arg Pro Gly Ile Ile Phe Ile Ser Lys Arg Gly Phe Gln Val Cys

                85                  90                  95

Ala Asn Pro Ser Asp Arg Arg Val Gln Arg Cys Ile Glu Arg Leu Glu

            100                 105                 110

Xaa Asn Ser Gln Pro Arg Thr Tyr Lys Gln

        115                  120

<210>186

<211>120

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>MIP-3Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>106

<223>Xaa＝Met or Val

<400>186

Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Val Thr Ala

 1               5                  10                  15

Leu Gly Ser Gln Ala Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met

            20                  25                  30

Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His

        35                  40                  45

Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro Arg Ser Ile Pro

    50                  55                  60

Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys

65                  70                  75                  80

Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn

                85                  90                  95

Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Xaa Arg Met Leu Lys Leu Asp

            100                 105                 110

Thr Arg Ile Lys Thr Arg Lys Asn

        115                 120

<210>187

<211>112

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>CTACK Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>78

<223>Xaa＝Ile or Val

<220>

<221>VARIANT

<222>96

<223>Xaa＝Leu or Phe

<400>187

Met Lys Gly Pro Pro Thr Phe Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu

 1               5                  10                  15

Leu Ser Pro Asp Pro Thr Ala Ala Phe Leu Leu Pro Pro Ser Thr Ala

            20                  25                  30

Cys Cys Thr Gln Leu Tyr Arg Lys Pro Leu Ser Asp Lys Leu Leu Arg

        35                  40                  45

Lys Val Ile Gln Val Glu Leu Gln Glu Ala Asp Gly Asp Cys His Leu

    50                  55                  60

Gln Ala Phe Val Leu His Leu Ala Gln Arg Ser Ile Cys Xaa His Pro

65                  70                  75                  80

Gln Asn Pro Ser Leu Ser Gln Trp Phe Glu His Gln Glu Arg Lys Xaa

                85                  90                  95

His Gly Thr Leu Pro Lys Leu Asn Phe Gly Met Leu Arg Lys Met Gly

            100                 105                 110

<210>188

<211>94

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>I-TAC Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>89

<223>Xaa＝Val or Ala

<400>188

Met Ser Val Lys Gly Met Ala Ile Ala Leu Ala Val Ile Leu Cys Ala

 1               5                  10                  15

Thr Val Val Gln Gly Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Leu Cys

            20                  25                  30

Ile Gly Pro Gly Val Lys Ala Val Lys Val Ala Asp Ile Glu Lys Ala

        35                  40                  45

Ser Ile Met Tyr Pro Ser Asn Asn Cys Asp Lys Ile Glu Val Ile Ile

    50                  55                  60

Thr Leu Lys Glu Asn Lys Gly Gln Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys

65                  70                  75                  80

Gln Ala Arg Leu Ile Ile Lys Lys Xaa Glu Arg Lys Asn Phe

                85                  90

<210>189

<211>254

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>SR-PSOX Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>123

<223>Xaa＝Ile or Thr

<220>

<221>VARIANT

<222>135

<223>Xaa＝His or Leu

<220>

<221>VARIANT

<222>181

<223>Xaa＝Val or Ala

<220>

<221>VARIANT

<222>222

<223>Xaa＝Leu or Pro

<400>189

Met Gly Arg Asp Leu Arg Pro Gly Ser Arg Val Leu Leu Leu Leu Leu

 1               5                  10                  15

Leu Leu Leu Leu Val Tyr Leu Thr Gln Pro Gly Asn Gly Asn Glu Gly

            20                  25                  30

Ser Val Thr Gly Ser Cys Tyr Cys Gly Lys Arg Ile Ser Ser Asp Ser

        35                  40                  45

Pro Pro Ser Val Gln Phe Met Asn Arg Leu Arg Lys His Leu Arg Ala

    50                  55                  60

Tyr His Arg Cys Leu Tyr Tyr Thr Arg Phe Gln Leu Leu Ser Trp Ser

65                  70                  75                  80

Val Cys Gly Gly Asn Lys Asp Pro Trp Val Gln Glu Leu Met Ser Cys

                85                  90                  95

Leu Asp Leu Lys Glu Cys Gly His Ala Tyr Ser Gly Ile Val Ala His

            100                 105                 110

Gln Lys His Leu Leu Pro Thr Ser Pro Pro Xaa Ser Gln Ala Ser Glu

        115                 120                 125

Gly Ala Ser Ser Asp Ile Xaa Thr Pro Ala Gln Met Leu Leu Ser Thr

    130                 135                 140

Leu Gln Ser Thr Gln Arg Pro Thr Leu Pro Val Gly Ser Leu Ser Ser

145                 150                 155                 160

Asp Lys Glu Leu Thr Arg Pro Asn Glu Thr Thr Ile His Thr Ala Gly

                165                 170                 175

His Ser Leu Ala Xaa Gly Pro Glu Ala Gly Glu Asn Gln Lys Gln Pro

            180                 185                 190

Glu Lys Asn Ala Gly Pro Thr Ala Arg Thr Ser Ala Thr Val Pro Val

        195                 200                 205

Leu Cys Leu Leu Ala Ile Ile Phe Ile Leu Thr Ala Ala Xaa Ser Tyr

    210                 215                 220

Val Leu Cys Lys Arg Arg Arg Gly Gln Ser Pro Gln Ser Ser Pro Asp

225                 230                 235                 240

Leu Pro Val His Tyr Ile Pro Val Ala Pro Asp Ser Asn Thr

                245                 250

<210>190

<211>395

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>Fractalkine Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>37

<223>Xaa＝Gly or Asp

<400>190

Met Ala Pro Ser Pro Leu Ala Trp Leu Leu Arg Leu Ala Ala Phe Phe

 1               5                  10                  15

His Leu Cys Thr Leu Leu Pro Gly Gln His Leu Gly Met Thr Lys Cys

            20                  25                  30

Glu Ile Met Cys Xaa Lys Met Thr Ser Arg Ile Pro Val Ala Leu Leu

        35                  40                  45

Ile Arg Tyr Gln Leu Asn Gln Glu Ser Cys Gly Lys Arg Ala Ile Val

    50                  55                  60

Leu Glu Thr Thr Gln His Arg Arg Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys

65                  70                  75                  80

Trp Val Gln Asp Ala Met Lys His Leu Asp His Gln Ala Ala Ala Leu

                85                  90                  95

Thr Lys Asn Gly Gly Lys Phe Glu Lys Arg Val Asp Asn Val Thr Pro

            100                 105                 110

Gly Ile Thr Leu Ala Thr Arg Gly Leu Ser Pro Ser Ala Leu Thr Lys

        115                 120                 125

Pro Glu Ser Ala Thr Leu Glu Asp Leu Ala Leu Glu Leu Thr Thr Ile

    130                 135                 140

Ser Gln Glu Ala Arg Gly Thr Met Gly Thr Ser Gln Glu Pro Pro Ala

145                 150                 155                 160

Ala Val Thr Gly Ser Ser Leu Ser Thr Ser Glu Ala Gln Asp Ala Gly

                165                 170                 175

Leu Thr Ala Lys Pro Gln Ser Ile Gly Ser Phe Glu Ala Ala Asp Ile

            180                 185                 190

Ser Thr Thr Val Trp Pro Ser Pro Ala Val Tyr Gln Ser Gly Ser Ser

        195                 200                 205

Ser Trp Ala Glu Glu Lys Ala Thr Glu Ser Pro Ser Thr Thr Ala Pro

    210                 215                 220

Ser Pro Gln Val Ser Thr Thr Ser Pro Ser Thr Pro Glu Glu Asn Val

225                 230                 235                 240

Gly Ser Glu Gly Gln Pro Pro Trp Val Gln Gly Gln Asp Leu Ser Pro

                245                 250                 255

Glu Lys Ser Leu Gly Ser Glu Glu Ile Asn Pro Val His Thr Asp Asn

            260                 265                 270

Phe Gln Glu Arg Gly Pro Gly Asn Thr Val His Pro Ser Val Ala Pro

        275                 280                 285

Ile Ser Ser Glu Glu Thr Pro Ser Pro Glu Leu Val Ala Ser Gly Ser

    290                 295                 300

Gln Ala Pro Lys Ile Glu Glu Pro Ile His Ala Thr Ala Asp Pro Gln

305                 310                 315                 320

Lys Leu Ser Val Leu Ile Thr Pro Val Pro Asp Thr Gln Ala Ala Thr

                325                 330                 335

Arg Arg Gln Ala Val Gly Leu Leu Ala Phe Leu Gly Leu Leu Phe Cys

            340                  45                 350

Leu Gly Val Ala Met Phe Ala Tyr Gln Ser Leu Gln Gly Cys Pro Arg

        355                 360                 365

Lys Met Ala Gly Glu Met Val Glu Gly Leu Arg Tyr Val Pro Arg Ser

    370                 375                 380

Cys Gly Ser Asn Ser Tyr Val Leu Val Pro Val

385                 390                 395

<210>191

<211>93

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>LD78-beta Variants

<220>

<221>VARIANT

<222>91

<223>Xaa＝Leu or Pro

<400>191

Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala

 1               5                  10                  15

Leu Cys Asn Gln Val Leu Ser Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr

            20                  25                  30

Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile

        35                  40                  45

Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile

    50                  55                  60

Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu

65                  70                  75                  80

Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Xaa Ser Ala

                85                  90

<210>192

<211>5

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Linker peptide

<400>192

Gly Gly Gly Gly Ser

 1               5

<210>193

<211>5

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Linker peptide

<220>

<221>REPEAT

<222>(1)...(5)

<400>193

Gly Gly Gly Gly Ser

 1               5

<210>194

<211>12

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Linker peptide

<400>194

Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser

 1               5                  10

<210>195

<211>14

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Linker peptide

<400>195

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly

 1               5                  10

<210>196

<211>18

<212>PRT

<213>Artiificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Linker peptide

<400>196

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Ser Gly Ser Thr

 1               5                  10                  15

Lys Gly

<210>197

<211>14

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Linker peptide

<400>197

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly

 1               5                  10

<210>198

<211>18

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Linker peptide

<400>198

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

 1               5                  10                  15

Lys Gly

<210>199

<211>14

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Linker peptide

<400>199

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Glu Phe

 1               5                  10

<210>200

<211>5

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Linker peptide

<400>200

Ser Arg Ser Ser Gly

 1               5

<210>201

<211>5

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Linker peptide

<400>201

Ser Gly Ser Ser Cys

 1               5

<210>202

<211>28

<212>PRT

<213>Corynebacterium diphtheriae

<220>

<223>Diphtheria toxin trypsin sensitive peptide linker

<400>202

Ala Met Gly Arg Ser Gly Gly Gly Cys Ala Gly Asn Arg Val Gly Ser

 1               5                  10                  15

Ser Leu Ser Cys Gly Gly Leu Asn Leu Gln Ala Met

            20                  25

<210>203

<211>6

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Linker peptide

<220>

<221>REPEAT

<222>(3)...(3)

<223>repeat unit 2-4times

<220>

<221>REPEAT

<222>(3)...(4)

<223>repeat family 1-11times

<400>203

Ala Met Gly Ser Ala Met

 1               5

<210>204

<211>232

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>VEGF-A Precursor  (splicevariant 206)

<400>204

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

 1               5                  10                  15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

            20                  25                  30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val ValLys Phe Met Asp Val Tyr Gln

        35                  40                  45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

    50                  55                  60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65                  70                  75                  80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

                85                  90                  95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

            100                 105                 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

        115                 120                 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val

    130135140

Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr

145                 150                 155                 160

Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp

                165                 170                 175

Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys

            180                 185                 190

His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn

        195                 200                 205

Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr

    210                 215                 220

Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

225                 230

<210>205

<211>215

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>VEGF-A Precursor(splice variant 189)

<400>205

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

 1               5                  10                  15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

            20                  25                  30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

        35                  40                  45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

    50                  55                  60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65                  70                  75                  80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

                85                  90                  95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met ArgIle Lys Pro His

            100                 105                 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

        115                 120                 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val

    130                 135                 140

Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr

145                 150                 155                 160

Lys Ser Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His

                165                 170                 175

Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr

            180                 185                 190

Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys

        195                 200                 205

Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

    210                 215

<210>206

<211>209

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>VEGF-A Precursor(splice variant 183)

<400>206

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

 1               5                  10                  15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

            20                  25                  30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

        35                  40                  45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

    50                  55                  60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65                  70                  75                  80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

                85                  90                  95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

            100                 105                 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

        115                 120                 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val

    130                 135                 140

Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Pro

145                 150                 155                 160

Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro

                165                 170                 175

Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala

            180                 185                 190

Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg

        195                 200                 205

Arg

<210>207

<211>191

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>VEGF-A(splice variant 165)

<400>207

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

 1               5                  10                  15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

            20                  25                  30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

        35                  40                  45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

    50                  55                  60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65                  70                  75                  80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

                85                  90                  95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

            100                 105                 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

        115                 120                 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly

    130                 135                 140

Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys Hi s Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr

145                 150                 155                 160

Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln

                165                 170                 175

Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

            180                 185                 190

<210>208

<211>174

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>VEGF-A Precursor(splice variant 148)

<400>208

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

 1               5                  10                  15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

            20                  25                  30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

        35                  40                  45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

    50                  55                  60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65                  70                  75                  80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

                85                  90                  95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

            100                 105                 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

        115                 120                 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly

    130                 135                 140

Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr

145                 150                 155                 160

Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Met

                165                 170

<210>209

<211>171

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>VEGF-A Precursor(splice variant 145)

<400>209

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

 1               5                  10                  15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

            20                  25                  30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

        35                  40                  45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

    50                  55                  60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65                  70                  75                  80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

                85                  90                  95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

            100                 105                 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

        115                 120                 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val

    130                 135                 140

Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr

145                 150                 155                 160

Lys Ser Trp Ser Val Cys Asp Lys Pro Arg Arg

                165                 170

<210>210

<211>147

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>VEGF-A Precursor  (splice variant 121)

<400>210

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

 1               5                  10                  15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

            20                  25                  30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

        35                  40                  45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

    50                  55                  60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65                  70                  75                  80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

                85                  90                  95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

            100                 105                 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

        115                 120                 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Cys Asp Lys

    130                 135                 140

Pro Arg Arg

145

<210>211

<211>207

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>VEGF-B Precursor  (splice variant 186)

<400>211

Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu

 1               5                  10                  15

Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln

            20                  25                  30

Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln

        35                  40                  45

Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val

    50                  55                  60

Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly

65                  70                  75                  80

Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln Hi s Gln

                85                  90                  95

Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly

            100                 105                 110

Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys

        115                 120                 125

Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg

    130                 135                 140

Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro

145                 150                 155                 160

Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala

                165                 170                 175

His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala

            180                 185                 190

Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala

        195                 200                 205

<210>212

<211>188

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>VEGF-B Precursor(splice variant 167)

<400>212

Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu

 1               5                  10                  15

Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln

            20                  25                  30

Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln

        35                  40                  45

Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val

    50                  55                  60

Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly

65                  70                  75                  80

Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln

                85                  90                  95

Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly

            100                 105                 110

Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys

        115                 120                 125

Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg

    130                 135                 140

Cys Thr Gln Hi s His Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg

145                 150                 155                 160

Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu

                165                 170                 175

Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg

            180                 185

<210>213

<211>419

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>VEGF-C Precursor

<400>213

Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala

 1               5                  10                  15

Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe

            20                  25                  30

Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala

        35                  40                  45

Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser

    50                  55                  60

Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met

65                  70                  75                  80

Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln

                85                  90                  95

Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala

            100                 105                 110

His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys

        115                 120                 125

Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val CysIle Asp Val Gly Lys Glu Phe

    130                 135                 140

Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr

145                 150                 155                 160

Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr

                165                 170                 175

Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu

            180                 185                 190

Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser

        195                 200                 205

Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile

    210                 215                 220

Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn

225                 230                 235                 240

Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys

                245                 250                 255

Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser

            260                 265                 270

Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu

        275                 280                 285

Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys

    290                 295                 300

Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys

305                 310                 315                 320

Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu

                325                 330                 335

Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro

            340                 345                 350

Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys

        355                 360                 365

Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His Hi s Gln Thr Cys Ser Cys Tyr

    370                 375                 380

Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser

385                 390                 395                 400

Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro

                405                 410                 415

Gln Met Ser

<210>214

<211>354

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>VEGF-D Precursor

<400>214

Met Tyr Arg Glu Trp Val Val Val Asn Val Phe Met Met Leu Tyr Val

 1               5                  10                  15

Gln Leu Val Gln Gly Ser Ser Asn Glu His Gly Pro Val Lys Arg Ser

            20                  25                  30

Ser Gln Ser Thr Leu Glu Arg Ser Glu Gln Gln Ile Arg Ala Ala Ser

        35                  40                  45

Ser Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ile Thr His Ser Glu Asp Trp Lys Leu

    50                  55                  60

Trp Arg Cys Arg Leu Arg Leu Lys Ser Phe Thr Ser Met Asp Ser Arg

65                  70                  75                  80

Ser Ala Ser His Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala Thr Phe Tyr Asp Ile

                85                  90                  95

Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg Thr Gln Cys Ser

            100                 105                 110

Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr

        115                 120                 125

Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly

    130                 135                 140

Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr

145                 150                 155                 160

Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro

                165                 170                 175

Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu

            180                 185                 190

Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr SerIle Ile Arg Arg Ser Ile Gln

        195                 200                 205

Ile Pro Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu Cys Pro Ile

    210                 215                 220

Asp Met Leu Trp Asp Ser Asn Lys Cys Lys Cys Val Leu Gln Glu Glu

225                 230                 235                 240

Asn Pro Leu Ala Gly Thr Glu Asp His Ser His Leu Gln Glu Pro Ala

                245                 250                 255

Leu Cys Gly Pro His Met Met Phe Asp Glu Asp Arg Cys Glu Cys Val

            260                 265                 270

Cys Lys Thr Pro Cys Pro Lys Asp Leu Ile Gln His Pro Lys Asn Cys

        275                 280                 285

Ser Cys Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys Gln Lys His

    290                 295                 300

Lys Leu Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg Cys Pro Phe

305                 310                 315                 320

His Thr Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys

                325                 330                 335

Arg Phe Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gln Gly Pro Hi s Ser Arg Lys

            340                 345                 350

Asn Pro

<210>215

<211>170

<212>PRT

<213>Homo sapien

<220>

<223>Placental Growth Factor Precursor

<400>215

Met Pro Val Met Arg Leu Phe Pro Cys Phe Leu Gln Leu Leu Ala Gly

 1               5                  10                  15

Leu Ala Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly

            20                  25                  30

Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly

        35                  40                  45

Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu

    50                  55                  60

Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu

65                  70                  75                  80

Leu Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro

                85                  90                  95

Val Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly

            100                 105                 110

Asp Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys

        115                 120                 125

Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Arg Arg Pro

    130                 135                 140

Lys Gly Arg Gly Lys Arg Arg Arg Glu Lys Gln Arg Pro Thr Asp Cys

145                 150                 155                 160

His Leu Cys Gly Asp Ala Val Pro Arg Arg

                165                 170

<210>216

<211>963

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Construct encoding chemokine-

toxin fusion protein SDF-1beta-AM-truncated Shiga-A1 Subunit

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(963)

<400>216

aag ccc gtc agc ctg agc tac aga tgc cca tgc cga ttc ttc gaa agc    48

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser

  1               5                  10                  15

cat gtt gcc aga gcc aac gtc aag cat ctc aaa att ctc aac act cca    96

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro

             20                  25                  30

aac tgt gcc ctt cag att gta gcc cgg ctg aag aac aac aac aga caa    144

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln

         35                  40                  45

gtg tgc att gac ccg aag cta aag tgg att cag gag tac ctg gag aaa    192

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

     50                  55                  60

gct tta aac aag agg ttc aag atg gcg atg aaa gaa ttc acc ctg gac    240

Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met Ala Met Lys Glu Phe Thr Leu Asp

 65                  70                  75                  80

ttt tcc act gca aaa act tac gtc gat agc ctg aat gtg att cgt tcc    288

Phe Ser Thr Ala Lys Thr Tyr Val Asp Ser Leu Asn Val Ile Arg Ser

                 85                  90                  95

gcg atc ggt acg ccg ctg caa acg att tcc agc ggt ggt act tcc ctc    336

Ala Ile Gly Thr Pro Leu Gln ThrIle Ser Ser Gly Gly Thr Ser Leu

            100                 105                 110

ctg atg att gat tcc ggt acg ggt gat aac ttg ttt gct gtt gat gtg    384

Leu Met Ile Asp Ser Gly Thr Gly Asp Asn Leu Phe Ala Val Asp Val

        115                 120                 125

cgc ggc att gac ccg gaa gaa ggc cgt ttt aat aat ctg cgt ctg atc    432

Arg Gly Ile Asp Pro Glu Glu Gly Arg Phe Asn Asn Leu Arg Leu Ile

    130                 135                 140

gtc gaa cgc aac aac ctg tat gtg acg ggt ttt gtg aac cgt acg aac    480

Val Glu Arg Asn Asn Leu Tyr Val Thr Gly Phe Val Asn Arg Thr Asn

145                 150                 155                 160

aac gtc ttc tat cgt ttc gct gat ttc tcc cac gta acg ttt ccg ggc    528

Asn Val Phe Tyr Arg Phe Ala Asp Phe Ser His Val Thr Phe Pro Gly

                165                 170                 175

acc act gct gtt act ctg agc ggc gat tct tct tat act acg tta cag    576

Thr Thr Ala Val Thr Leu Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Gln

            180                 185                 190

cgt gtg gct ggt atc agc cgc act ggt atg caa atc aat cgc cat tct    624

Arg Val Ala Gly Ile Ser Arg Thr Gly Met Gln Ile Asn Arg His Ser

        195                 200                 205

ctg acg acc agc tat ctg gac tta atg agc cat tct ggc acc agc ctg    672

Leu Thr Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Met Ser His Ser Gly Thr Ser Leu

    210                 215                 220

acc cag tct gtt gcc cgt gcg atg ctg cgc ttc gtg acg gtc acc gcc    720

Thr Gln Ser Val Ala Arg Ala Met Leu Arg Phe Val Thr Val Thr Ala

225                 230                 235                 240

gaa gcc ctg cgt ttc cgt caa atc caa cgc ggc ttc cgc acc act tta     768

Glu Ala Leu Arg Phe Arg Gln Ile Gln Arg Gly Phe Arg Thr Thr Leu

                245                 250                 255

gac gat ctg tct ggc cgc agc tat gtg atg act gcc gaa gat gtc gat     816

Asp Asp Leu Ser Gly Arg Ser Tyr Val Met Thr Ala Glu Asp Val Asp

            260                 265                 270

ctg acc ctg aac tgg ggt cgc ttg tct tcc gtt ctg ccg gat tat cac     864

Leu Thr Leu Asn Trp Gly Arg Leu Ser Ser Val Leu Pro Asp Tyr His

        275                 280                 285

ggt cag gat  tct gtc cgt gtt ggc cgt atc agc ttt ggc tct att aat    912

Gly Gln Asp Ser Val Arg Val Gly Arg Ile Ser Phe Gly Ser Ile Asn

    290                 295                 300

gcc atc cta ggc tcc gtc gca ctg att ctc aat tgc cac cac cac gct     960

Ala Ile Leu Gly Ser Val Ala Leu Ile Leu Asn Cys His His His Ala

305                 310                 315                 320

taa                                                                 963

Claims (211)

1.一种选择修饰的核糖体失活蛋白(RIP)或其活性片段的方法，包括：

a)将编码RIP或其活性片段的核酸分子导入宿主细胞；

b)生长所述细胞；

c)分离生长的细胞；及

d)从生长的细胞分离表达RIP或其活性片段的细胞，其中所述RIP或片段与由步骤a)导入的核酸分子编码的相比含有修饰。

2.权利要求1的方法，进一步包括：

e)鉴别或分离或纯化在所述分离的细胞中表达的修饰的RIP或其活性片段。

3.权利要求1或2的方法，其中细胞在不含有选择性调节剂的培养基中生长。

4.权利要求1的方法，其中所述细胞生长的培养基不含有腺嘌呤类似物。

5.权利要求4的方法，其中所述腺嘌呤类似物是4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(4-APP)。

6.权利要求1-5任一项的方法，进一步包括：在步骤c)或d)之后扩增表达RIP的分离的细胞。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中修饰的RIP是通过其序列或其分子量或通过测序鉴别的。

8.权利要求1或2的方法，进一步包括在选择性调节剂存在下生长步骤b)的细胞。

9.权利要求8的方法，其中选择性调节剂是RIP抑制剂。

10.权利要求9的方法，其中所述RIP抑制剂是腺嘌呤类似物。

11.权利要求10的方法，其中所述腺嘌呤类似物是4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(4-APP)。

12.权利要求9-11任一项的方法，其中所述RIP抑制剂、腺嘌呤类似物或4-APP的浓度对宿主细胞不是毒性的。

13.权利要求9-12任一项的方法，其中所述RIP抑制剂、腺嘌呤类似物或4-APP的浓度抑制或降低RIP对宿主细胞的毒性。

14.权利要求13的方法，其中与不存在多大RIP抑制剂、腺嘌呤类似物或4-APP相比，毒性的抑制或降低足以增加表达的RIP的量。

15.权利要求13或14的方法，其中所述RIP的毒性被抑制至少1％，5％，10％，15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或100％。

16.权利要求11-15任一项的方法，其中4-APP的浓度是大约或是0.1mM至大约或5.0mM。

17.权利要求11-16任一项的方法，其中4-APP的浓度在大约或是0.1至2，3或4mM，或是大约或是0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9或1mM。

18.权利要求11-17任一项的方法，其中4-APP的浓度是大约或是0.5mM。

19.权利要求1-18任一项的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。

20.权利要求1-18任一项的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。

21.权利要求20的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌(E.coli)。

22.权利要求1-21任一项的方法，其中由导入的核酸分子编码的RIP是I型RIP或其活性片段。

23.权利要求22的方法，其中所述RIP选自香石竹毒蛋白30，香石竹毒蛋白32，剪秋罗苷，肥皂草毒蛋白-1，肥皂草毒蛋白-2，肥皂草毒蛋白-3，肥皂草毒蛋白-4，肥皂草毒蛋白-5，肥皂草毒蛋白-6，肥皂草毒蛋白-7，肥皂草毒蛋白-8，肥皂草毒蛋白-9，PAP，PAP II，PAP-R，PAP-S，PAP-C，mapalmin，商陆毒蛋白，异株泻根毒蛋白-L，异株泻根毒蛋白，异株泻根毒蛋白II，棒麦角素，大肠菌素-1，大肠菌素-2，软瓜蛋白-A，软瓜蛋白-B，软瓜蛋白-S，19K-PSI，15K-PSI，9K-PSI，alpha-kirilowin，beta-kirilowin，多花白树毒蛋白，苦瓜毒蛋白，苦瓜毒蛋白-II，苦瓜毒蛋白-Ic，紫茉莉抗病毒蛋白(MAP)，MAP-30，α-苦瓜子蛋白，β-苦瓜子蛋白，天花粉蛋白，TAP-29，trichokirin，大麦RIP I，大麦RIP II，小麦毒蛋白，亚麻RIP，玉米RIP 3，玉米RIP 9，玉米RIP X，asparin-1和asparin 2。

24.权利要求1-21任一项的方法，其中由导入的核酸分子编码的所述RIP是II型RIP或其催化亚基或其活性片段。

25.权利要求24的方法，其中所述RIP选自志贺毒素(Stx)，志贺样毒素II(Stx2)，塑莲根毒蛋白I，蓖麻毒蛋白，黑杆菌素-CIP-29，相思豆毒蛋白，vircumin，塑莲根毒蛋白II，ebulitin-α，ebulitin-β，ebultin-γ和porrectin。

26.权利要求25的方法，其中所述RIP包括亚基A或其活性片段。

27.权利要求25的方法，其中所述志贺毒素包括亚基A1(SA1)或其活性片段或由亚基A1或其活性片段组成。

28.权利要求27的方法，其中所述SA1是截短的。

29.权利要求28的方法，其中所述SA1通过在C末端缺失1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个连续氨基酸而截短。

30.权利要求27-29任一项的方法，其中所述SA1进一步通过用另一氨基酸置换Cys而修饰。

31.权利要求30的方法，其中置换氨基酸是Ser。

32.权利要求27-29任一项的方法，其中所述SA1包含SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示的氨基酸残基序列。

33.权利要求27-29任一项的方法，其中所述SA1由包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25所示序列的核酸分子编码。

34.权利要求1-33任一项的方法，其中由导入的核酸分子编码的RIP与配体缀合形成配体-毒素缀合物。

35.权利要求34的方法，其中所述缀合物中的RIP和配体直接连接或经共价或离子键间接连接。

36.权利要求35的方法，其中所述RIP和配体经接头连接。

37.权利要求36的方法，其中所述接头是肽、多肽或氨基酸。

38.权利要求37的方法，其中所述接头是Ala-Met接头。

39.权利要求34的方法，其中所述配体-毒素缀合物是融合蛋白。

40.权利要求34-39任一项的方法，其中所述配体选自趋化因子受体靶向物质、非趋化因子细胞因子、激素、生长因子、细胞表面受体特异性抗体、TNF超家族配体和模式识别受体(PRR)配体。

41.权利要求40的方法，其中所述生长因子是VEGF。

42.权利要求40的方法，其中：

所述趋化因子受体靶向物质是趋化因子、趋化因子片段或特异结合趋化因子受体的抗体或抗体的片段，其中所述片段结合趋化因子受体。

43.权利要求42的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其抗原特异性片段。

44.权利要求43的方法，其中所述单克隆抗体特异结合选自(DARC)，D6，CXCR-1，CXCR-2，CXCR-3A，CXCR3B，CXCR-4，CXCR-5，CCR-1，CCR-2A，CCR-2B，CCR-3，CCR-4，CCR-5，CCR-6，CCR-7，CCR-8，CCR-9，CCR10，CX3CR-1和XCR1的抗原。

45.权利要求43的方法，其中所述单克隆抗体特异结合选自CXCR-6和CXCR-7的抗原。

46.权利要求42的方法，其中所述趋化因子受体靶向物质是趋化因子。

47.权利要求46的方法，其中所述趋化因子选自单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MCP-5，嗜酸性粒细胞趋化蛋白1(Eotaxin-1)，Eotaxin-2，Eotaxin-3，基质衍生因子-1β(SDF-1β)，SDF-1α，SDF-2，巨噬细胞抑制蛋白1α(MIP-1α)，MIP-1β，MIP-1γ，MIP-2，MIP-2α，MIP-2β，MIP-3，MIP-3β，MIP-3α，MIP-4，MIP-5，调节活化正常T细胞表达和分泌(RANTES)的蛋白，白介素-8(IL-8)，生长调节蛋白α(GRO-α)，干扰素诱导蛋白10(IP-10)，巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)，粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)，上皮来源的嗜中性粒细胞激活蛋白78(ENA-78)，血小板碱性蛋白(PBP)，γ干扰素诱导单核因子(MIG)，血小板因子4(PF-4)，hemofiltrate CC趋化因子1(HCC-1)，胸腺及激活调节趋化因子(TARC)，淋巴细胞趋化因子，lungkine，C10，肝表达趋化因子(LEC)，exodus-2(SLC)，胸腺表达趋化因子(TECK)，皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)，粘膜相关上皮趋化因子(MEC)，单C基序1-β(SCM-1β)，干扰素诱导T细胞α化学引诱物(I-TAC)，乳腺及肾表达趋化因子(BRAK)，CXXXC趋化因子和B细胞吸引趋化因子1(BCA-1)以及其等位基因变体或物种变体。

48.权利要求46或47的方法，其中所述趋化因子选自MCP-1，Eotaxin-1，SDF-1β，GRO-α，MIP-1β，IL-8，IP-10，MCP-3，MIP-3α，MDC，MIP-1α和BCA-1以及其等位基因变体或物种变体。

49.权利要求46-48任一项的方法，其中所述趋化因子是MCP-1。

50.权利要求38-49任一项的方法，其中所述配体-毒素缀合物包含SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：40所示的氨基酸残基序列。

51.权利要求38-49任一项的方法，其中所述配体-毒素缀合物由包含SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：39所示序列的核酸分子编码。

52.权利要求1-51任一项的方法，其中所鉴别的RIP与由导入的核酸分子编码的RIP相比含有突变。

53.权利要求1-52任一项的方法，进一步包括评估鉴别的RIP的毒性。

54.权利要求53的方法，其中毒性是在选自蛋白质合成测定、脱嘌呤测定及细胞生长/存活性测定的测定中评估。

55.权利要求1-54任一项的方法，其中所鉴别的RIP与由导入的核酸分子编码的RIP相比保留了毒性。

56.权利要求55的方法，其中所鉴别的RIP保留了0.5％，1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多的毒性。

57.权利要求1-56任一项的方法，进一步包括：

a)将编码所鉴别的RIP或其活性片段的核酸分子导入宿主细胞；

b)在RIP抑制剂存在下保温细胞，其中选择RIP抑制剂的量以降低所述RIP多肽的毒性；和

c)在产生所述RIP或其活性片段的条件下生长细胞。

58.权利要求57的方法，进一步包括纯化所述RIP的步骤c)，其中表达的或纯化的或者表达和纯化的RIP量大于不存在RIP抑制剂的量。

59.增加核糖体失活蛋白(RIP)或其活性片段的产生的方法，包括：

a)将包含编码RIP或其活性片段的核苷酸序列的核酸导入宿主细胞；

b)在RIP抑制剂存在下保温细胞，其中选择RIP抑制剂的量以降低所述RIP的毒性；

c)在一定条件下生长细胞，从而RIP或其活性片段以大于当在不存在RIP抑制剂生长时的量产生。

60.权利要求59的方法，进一步包括纯化RIP的步骤c)，其中表达的或纯化的或者表达和纯化的RIP的量大于不存在RIP抑制剂时的量。

61.权利要求59或60的方法，其中由导入的核酸编码的RIP是I型RIP或其活性片段。

62.权利要求61的方法，其中所述RIP选自香石竹毒蛋白30，香石竹毒蛋白32，剪秋罗苷，肥皂草毒蛋白-1，肥皂草毒蛋白-2，肥皂草毒蛋白-3，肥皂草毒蛋白-4，肥皂草毒蛋白-5，肥皂草毒蛋白-6，肥皂草毒蛋白-7，肥皂草毒蛋白-8，肥皂草毒蛋白-9，PAP，PAP II，PAP-R，PAP-S，PAP-C，mapalmin，商陆毒蛋白，异株泻根毒蛋白-L，异株泻根毒蛋白，异株泻根毒蛋白II，棒麦角素，大肠菌素-1，大肠菌素-2，软瓜蛋白-A，软瓜蛋白-B，软瓜蛋白-S，19K-PSI，15K-PSI，9K-PSI，alpha-kirilowin，beta-kirilowin，多花白树毒蛋白，苦瓜毒蛋白，苦瓜毒蛋白-II，苦瓜毒蛋白-Ic，紫茉莉抗病毒蛋白(MAP)，MAP-30，α-苦瓜子蛋白，β-苦瓜子蛋白，天花粉蛋白，TAP-29，trichokirin，大麦RIP I，大麦RIP II，小麦毒蛋白，亚麻RIP，玉米RIP 3，玉米RIP 9，玉米RIP X，asparin-1和asparin 2。

63.权利要求59或60的方法，其中由导入的核酸编码的RIP是II型RIP、其催化亚基或其活性片段。

64.权利要求63的方法，其中所述RIP选自志贺毒素(Stx)，志贺样毒素II(Stx2)，志贺样毒素I，塑莲根毒蛋白I，蓖麻毒蛋白，黑杆菌素-CIP-29，相思豆毒蛋白，vircumin，塑莲根毒蛋白II，ebulitin-α，ebulitin-β，ebultin-γ和porrectin。

65.权利要求64的方法，其中所述RIP包括亚基A或其活性片段。

66.权利要求64的方法，其中所述志贺毒素包括亚基A1(SA1)或其活性片段。

67.权利要求66的方法，其中所述SA1是截短的。

68.权利要求67的方法，其中所述SA1是通过在C末端缺失1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个连续氨基酸而截短。

69.权利要求59-65任一项的方法，其中所述RIP是修饰的。

70.权利要求66-69任一项的方法，其中所述SA1是修饰的。

71.权利要求70的方法，其中所述SA1通过置换一或多个氨基酸而修饰。

72.权利要求71的方法，其中所述SA1通过用另一氨基酸置换Cys而修饰。

73.权利要求72的方法，其中置换氨基酸是Ser。

74.权利要求71的方法，其中：

所述SA1通过置换位置38或位置219之一或两者而修饰；及

所述位置参考具有SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的SA1中的氨基酸位置。

75.权利要求74的方法，其中所述氨基酸置换相应于L38R和/或V219A。

76.权利要求75的方法，其中所述氨基酸置换相应于V219A。

77.权利要求74或75的方法，其中所述SA1具有SEQ ID NO：26或28所示氨基酸序列。

78.权利要求74或75的方法，其中所述SA1由SEQ ID NO：27或29所示核酸序列编码。

79.权利要求59-78任一项的方法，其中所述RIP抑制剂是腺嘌呤类似物。

80.权利要求79的方法，其中所述腺嘌呤类似物是4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶(4-APP)。

81.权利要求59、79或80的方法，其中所述RIP抑制剂、腺嘌呤类似物或4-APP的浓度有效降低RIP的毒性10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％或大约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。

82.权利要求80或81的方法，其中4-APP的浓度是大约或是1mM至大约或是40.0mM。

83.权利要求81-82任一项的方法，其中4-APP的浓度在大约或是2.0mM，3.0mM，4.0mM，5.0mM，6.0mM，7.0mM，8.0mM，9.0mM，10.0mM，15.0mM或20.0mM之间。

84.权利要求59-83任一项的方法，其中所述宿主细胞是真核的。

85.权利要求59-83任一项的方法，其中所述宿主细胞是原核的。

86.权利要求85的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

87.权利要求59-86任一项的方法，其中所述RIP多肽在用诱导剂诱导后表达。

88.权利要求87的方法，其中所述诱导剂是IPTG。

89.权利要求87或88的方法，其中所述RIP抑制剂在加入诱导剂之前、期间和/或之后加入。

90.权利要求59-89任一项的方法，其中编码所述RIP的核酸分子包含编码配体的核苷酸序列，其中所述分子编码配体-毒素缀合物。

91.权利要求90的方法，其中所述缀合物中的RIP和配体经共价或离子键直接连接。

92.权利要求91的方法，其中所述RIP和配体经接头连接。

93.权利要求92的方法，其中所述接头是肽、多肽或氨基酸。

94.权利要求93的方法，其中所述接头是Ala-Met接头。

95.权利要求90的方法，其中所述配体-毒素缀合物是融合蛋白。

96.权利要求90-95任一项的方法，其中所述配体-毒素缀合物中的配体选自趋化因子受体靶向物质、非趋化因子细胞因子、激素、生长因子、细胞表面受体特异性抗体、TNF超家族配体和模式识别受体(PRR)配体。

97.权利要求96的方法，其中所述生长因子是VEGF。

98.权利要求96的方法，其中所述趋化因子受体靶向物质是趋化因子或结合趋化因子受体的趋化因子片段，或特异结合趋化因子受体的抗体或结合所述受体的抗体片段。

99.权利要求98的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其抗原特异性片段。

100.权利要求99的方法，其中所述单克隆抗体特异于选自(DARC)，D6，CXCR-1，CXCR-2，CXCR-3A，CXCR3B，CXCR-4，CXCR-5，CCR-1，CCR-2A，CCR-2B，CCR-3，CCR-4，CCR-5，CCR-6，CCR-7，CCR-8，CCR-9，CCR10，CX3CR-1和XCR1的抗原。

101.权利要求99的方法，其中所述单克隆抗体特异于选自CXCR-6和CXCR-7的抗原。

102.权利要求98的方法，其中所述趋化因子受体靶向物质是趋化因子。

103.权利要求102的方法，其中所述趋化因子选自单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MCP-5，嗜酸性粒细胞趋化蛋白1(Eotaxin-1)，Eotaxin-2，Eotaxin-3，基质衍生因子-1β(SDF-1β)，SDF-1α，SDF-2，巨噬细胞抑制蛋白1α(MIP-1α)，MIP-1β，MIP-1γ，MIP-2，MIP-2α，MIP-2β，MIP-3，MIP-3β，MIP-3α，MIP-4，MIP-5，调节活化正常T细胞表达和分泌(RANTES)蛋白，白介素-8(IL-8)，生长调节蛋白α(GRO-α)，干扰素诱导蛋白10(IP-10)，巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)，粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)，上皮来源的嗜中性粒细胞激活蛋白78(ENA-78)，血小板碱性蛋白(PBP)，γ干扰素诱导单核因子(MIG)，血小板因子4(PF-4)，hemofiltrate CC趋化因子1(HCC-1)，胸腺及激活调节趋化因子(TARC)，淋巴细胞趋化因子，lungkine，C10，肝表达趋化因子(LEC)，exodus-2(SLC)，胸腺表达趋化因子(TECK)，皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)，粘膜相关上皮趋化因子(MEC)，单C基序1-β(SCM-1β)，干扰素诱导T细胞α化学引诱物(I-TAC)，乳腺及肾表达趋化因子(BRAK)，CXXXC趋化因子，B细胞吸引趋化因子1(BCA-1)以及其等位基因变体或物种变体。

104.权利要求102或103的方法，其中所述趋化因子选自MCP-1，Eotaxin-1，SDF-1β，GRO-α，MIP-1β，IL-8，IP-10，MCP-3，MIP-3α，MDC，MIP-1α和BCA-1以及其等位基因变体或物种变体。

105.权利要求102-104任一项的方法，其中所述趋化因子是MCP-1。

106.权利要求90-105任一项的方法，其中RIP是志贺毒素或其活性片段；或者是包括修饰的修饰的志贺毒素或其活性片段。

107.权利要求106的方法，其中所述志贺毒素包括A1亚基(SA1)。

108.权利要求90-107任一项的方法，其中所述配体-毒素缀合物包含SEQ ID NOS：42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64或67任一所示的氨基酸残基序列。

109.权利要求90-107任一项的方法，其中所述配体-毒素缀合物由包含SEQ ID NO：41，43，45，47，49，50，53，55，57，59，61，63，65或66任一所示序列的核酸分子编码。

110.权利要求1-58任一项的方法，进一步包括制备含有所述鉴别的RIP的缀合物。

111.权利要求110的方法，包括合成所述缀合物。

112.由权利要求1-58任一项的方法选择的修饰的核糖体失活蛋白(RIP)。

113.一种在志贺毒素、其等位基因变体或物种变体、其催化活性片段或其活性片段中包含一或多个氨基酸修饰的修饰的志贺毒素多肽或其活性片段，其中所述一或多个氨基酸修饰是在相应于位置38和/或219之一或两者的置换，所述位置参考包含SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的志贺毒素A1亚基(SA1)中的氨基酸位置。

114.权利要求113的修饰的志贺毒素，其与包含SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的多肽具有至少大约40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％序列相同性并且在相应于氨基酸位置38和/或219的位置包括修饰。

115.权利要求113或114的修饰的志贺毒素，其中所述修饰相应于L38R和/或V219A。

116.权利要求113-115任一项的修饰的志贺毒素，其中所述志贺毒素包括A亚基。

117.权利要求113-116任一项的修饰的志贺毒素多肽，其中所述志贺毒素包括志贺毒素A1链(SA1)或其活性片段。

118.权利要求117的修饰的志贺毒素，其中所述SA1是截短的。

119.权利要求118的修饰的志贺毒素，其中所述截短的SA1是通过在C末端缺失1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个连续氨基酸而截短。

120.权利要求117-119任一项的修饰的志贺毒素，其中所述SA1包含SEQ ID NOS：26或28所示的氨基酸序列或者是其等位基因变体或物种变体。

121.一种缀合物，包含：

被靶向物质，其是权利要求112的修饰的核糖体失活蛋白(RIP)或权利要求113-120任一项的修饰的志贺毒素或其活性片段；及

靶向物质或其部分，其中所述缀合物结合细胞表面受体，导致被靶向物质在携带所述受体的细胞中内化。

122.权利要求121的缀合物，包含下述组分：(靶向物质)_n，(L)_q和(被+靶向物质)_m，其中：

L是连接靶向物质与被靶向物质的接头；

靶向物质是选择性结合细胞表面受体的任何部分；

m和n是独立地选择，至少是1；及

q是0或更大，只要所得的缀合物结合被靶向的受体、被内化并输送被靶向物质即可；

所得缀合物结合受体，所述受体与靶向物质相互作用并内化靶向物质，由此被靶向物质在携带所述受体的细胞中内化；及

当缀合物含有多个被靶向物质时，所述被靶向物质相同或不同，当缀合物含有多个靶向物质时，所述靶向物质相同或不同。

123.权利要求122的缀合物，其中m和n独立地选择，是1-6。

124.权利要求122的缀合物，其中q是1，n是2及m是1。

125.权利要求121-124任一项的缀合物，其中：

靶向物质选自趋化因子受体靶向物质、非趋化因子细胞因子、激素、生长因子、细胞表面受体特异性抗体、TNF超家族配体和模式识别受体(PRR)配体。

126.权利要求125的缀合物，其中所述生长因子是VEGF。

127.权利要求125的缀合物，其中所述趋化因子受体靶向物质是趋化因子或结合趋化因子受体的趋化因子片段或特异结合趋化因子受体的抗体或特异结合趋化因子受体的抗体的片段。

128.权利要求127的缀合物，其中所述趋化因子受体靶向物质是趋化因子。

129.权利要求128的缀合物，其中所述趋化因子选自单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MCP-5，嗜酸性粒细胞趋化蛋白1(Eotaxin-1)，Eotaxin-2，Eotaxin-3，基质衍生因子-1β(SDF-1β)，SDF-1α，SDF-2，巨噬细胞抑制蛋白1α(MIP-1α)，MIP-1β，MIP-1γ，MIP-2，MIP-2α，MIP-2β，MIP-3，MIP-3β，MIP-3α，MIP-4，MIP-5，调节活化正常T细胞表达和分泌(RANTES)蛋白，白介素-8(IL-8)，生长调节蛋白α(GRO-α)，干扰素诱导蛋白10(IP-10)，巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)，粒细胞趋化蛋白2(GCP-2)，上皮来源的嗜中性粒细胞激活蛋白78(ENA-78)，血小板碱性蛋白(PBP)，γ干扰素诱导单核因子(MIG)，血小板因子4(PF-4)，hemofiltrate CC趋化因子1(HCC-1)，胸腺及激活调节趋化因子(TARC)，淋巴细胞趋化因子，lungkine，C10，肝表达趋化因子(LEC)，exodus-2(SLC)，胸腺表达趋化因子(TECK)，皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)，粘膜相关上皮趋化因子(MEC)，单C基序1-β(SCM-1β)，干扰素诱导T细胞α化学引诱物(I-TAC)，乳腺及肾表达趋化因子(BRAK)，CXXXC趋化因子，B细胞吸引趋化因子1(BCA-1)或其等位基因变体或物种变体。

130.权利要求128或129的缀合物，其中所述趋化因子选自MCP-1，Eotaxin-1，SDF-1β，GRO-α，MIP-1β，IL-8，IP-10，MCP-3，MIP-3α，MDC，MIP-1α和BCA-1或其等位基因变体或物种变体。

131.权利要求121-130任一项的缀合物，其中所述靶向物质特异结合在一或多种免疫效应细胞或与免疫或炎症应答相关的其它细胞上的一或多种细胞表面受体。

132.权利要求131的缀合物，其中所述免疫效应细胞是白细胞。

133.权利要求131或132的缀合物，其中所述细胞选自单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、天然杀伤(NK)细胞及嗜中性粒细胞。

134.权利要求133的缀合物，其中巨噬细胞是组织巨噬细胞，选自尘细胞、小胶质细胞和kupfer细胞。

135.权利要求133的缀合物，其中树突细胞选自未成熟树突细胞、成熟树突细胞及朗格汉斯细胞。

136.权利要求133的缀合物，其中T细胞选自CD4+和CD8+T细胞。

137.权利要求136的缀合物，其中CD4+T细胞是Th1或Th2细胞。

138.权利要求131的缀合物，其中：

所述一或多种细胞是与免疫或炎症病症相关的另一种细胞并且是组织居留细胞(TRC)；及

所述TRC选自系膜细胞，神经胶质细胞，内皮细胞，上皮细胞，肿瘤细胞，成纤维细胞和滑膜细胞。

139.权利要求131-138任一项的缀合物，其中所述细胞是活化的。

140.权利要求139的缀合物，其中所述活化诱导一或多种细胞表面受体的表达。

141.权利要求121-140任一项的缀合物，其中所述细胞表面受体是选自CXCR1，CXCR2，CXCR3A，CXCR3B，CXCR4，CXCR5，CXCR6，CCR1，CCR2A，CCR2B，CCR3，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR8，CCR9，XCR1和CX3CR-1的趋化因子受体，其中：

所述趋化因子与受体结合，由此所述缀合物内化进携带所述受体的细胞。

142.权利要求121-141任一项的缀合物，其中所述靶向物质和被靶向物质或其活性片段经共价或离子键直接连接。

143.权利要求141-142任一项的缀合物，其中所述靶向物质和被靶向物质经接头连接。

144.权利要求143的缀合物，其中所述接头是肽、多肽或化学接头。

145.权利要求144的缀合物，其中所述接头选自N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯，磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯，4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯，磺基琥珀酰亚胺基-6-(α-甲基-α-(吡啶基二硫醇)-甲苯甲酰胺基)己酸酯，N-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)-丙酸酯，琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基)己酸酯，磺基琥珀酰亚胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基)己酸酯，3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰肼，Ellman’s试剂，二氯三嗪酸和S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸。

146.权利要求144的缀合物，其中所述接头是肽或氨基酸。

147.权利要求146的缀合物，其中所述接头是Ala-Met接头。

148.权利要求121-147任一项的缀合物，具有SEQ ID NO：44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64或67任一的氨基酸序列。

149.一种核酸分子，包含编码权利要求121-148任一项的缀合物的核苷酸序列。

150.一种质粒，包含权利要求149的核酸分子。

151.一种宿主细胞，包含权利要求150的质粒。

152.一种药物组合物，包含在药物学可接受载体中的治疗有效浓度或治疗有效量的权利要求121-148任一项的缀合物。

153.将毒素靶向细胞的方法，包括施用一种缀合物，其中：

所述缀合物含有权利要求113-120任一项的修饰的毒素和细胞表面受体靶向物质；和

所述细胞表达被靶向的细胞表面受体。

154.一种治疗免疫或炎症疾病或失调的方法，包括施用权利要求152的组合物，其中所述组合物抑制继发组织损伤促进性炎症细胞的增殖、迁移或生理学活性。

155.一种抑制疾病或失调的方法，包括给动物施用权利要求121-148任一项的缀合物，其中：

所述疾病或失调是与炎症应答相关的免疫或炎症病症和/或与一或多种细胞的活化、增殖和迁移相关的继发组织损伤；

所述缀合物结合在一或多种细胞上表达的一或多种细胞表面受体，导致被靶向物质内化在携带所述受体的细胞中；及

所述缀合物抑制一或多种细胞的活化、增殖或迁移。

156.权利要求155的方法，其中所述一或多种细胞是免疫效应细胞或与免疫或炎症应答相关的其它细胞。

157.权利要求156的方法，其中所述免疫效应细胞是白细胞。

158.权利要求156的方法，其中所述一或多种细胞是与免疫或炎症病症相关的另一种细胞并且是组织居留细胞(TRC)。

159.权利要求156-158任一项的方法，其中所述一或多种细胞是免疫效应细胞，选自单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、天然杀伤(NK)细胞及嗜中性粒细胞。

160.权利要求159的方法，其中所述一或多种细胞是巨噬细胞，其是选自尘细胞、小胶质细胞和kupfer细胞的组织巨噬细胞。

161.权利要求159的方法，其中所述一或多种细胞是树突细胞，其选自未成熟树突细胞、成熟树突细胞和朗格汉斯细胞。

162.权利要求159的方法，其中所述一或多种细胞是T细胞，选自CD4+和CD8+T细胞。

163.权利要求162的方法，其中所述细胞是CD4+T细胞，其为Th1或Th2细胞。

164.权利要求158的方法，其中所述TRC选自系膜细胞、神经胶质细胞、上皮细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞和滑膜细胞。

165.权利要求155-164任一项的方法，其中所述一或多种细胞是活化的。

166.权利要求155-165任一项的方法，其中所述动物是哺乳动物。

167.权利要求155-165任一项的方法，其中所述动物是人。

168.权利要求155-165任一项的方法，其中所述缀合物抑制参与疾病或失调的一或多种细胞的活化、增殖或迁移，所述疾病或失调选自CNS损伤、CNS炎症疾病、神经变性疾病、心脏病、炎性眼病、炎性肠病、炎性关节病、炎性肾病、炎性皮肤病、炎性肺病、炎性鼻病、炎性全身性疾病、肥胖症及相关疾病中的炎症、炎性甲状腺疾病、与细菌或病毒感染相关的炎性应答、癌症、自身免疫疾病和血管发生介导的疾病。

169.权利要求168的方法，其中所述疾病或失调是CNS炎性疾病和/或神经变性疾病并且选自卒中、闭合性头部损伤、白质脑病、脉络丛脑膜炎、脑膜炎、肾上腺脑白质营养不良、AIDS痴呆复合征、阿尔茨海默病、唐氏综合征、慢性疲劳综合征、脑炎、脑脊髓炎、海绵样脑病、多发性硬化、帕金森氏病和脊髓损伤/创伤(SCI)。

170.权利要求168的方法，其中所述疾病或失调是心脏病和是动脉粥样硬化。

171.权利要求168的方法，其中所述疾病或失调是炎性眼病，选自增生性糖尿病视网膜病变、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜炎、巩膜炎、巩膜虹膜炎、脉络膜炎和葡萄膜炎。

172.权利要求168的方法，其中所述疾病或失调是炎性肠病，选自慢性结肠炎，Crohn’s病和溃疡性结肠炎。

173.权利要求168的方法，其中所述疾病或失调是炎性关节病，选自幼年类风湿性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎和脊椎关节病变。

174.权利要求173的方法，其中炎性关节病是脊椎关节病变，选自强直性脊柱炎、Reiter’s综合征、活动型关节炎、银屑病关节炎、脊柱炎、未分化的脊椎关节病变和Behcet’s综合征。

175.权利要求168的方法，其中所述疾病或失调是炎性肾病，其选自肾小球肾炎、IgA肾病和狼疮肾炎。

176.权利要求131的缀合物，其中所述一或多种细胞是与免疫或炎症病症相关的另一种细胞及是组织居留细胞(TRC)。

177.一种缀合物，包含直接连接或经接头连接权利要求113-120任一项的修饰的志贺毒素或其SA1亚基或其活性片段的趋化因子，所述趋化因子选自I-309，MCP-1，MIP-1α，MIP-1β，RANTES，MCP-3，MCP-2，IL-8，MIG，IP-10，I-TAC，SDF-1α，SDF-1β，BCA-1，Eotaxin，MCP-4，MCP-5，C10，LEC和MIP-1b2或其片段。

178.权利要求168的方法，其中所述疾病或失调是炎性肺病，选自急性呼吸窘迫综合征、嗜酸性细胞肺病、慢性嗜酸性细胞肺炎、急性嗜酸性细胞肺炎、支气管收缩、支气管肺发育不良、支气管肺泡嗜酸粒细胞增多、过敏性支气管肺、曲霉病、肺炎和纤维化肺病。

179.权利要求168的方法，其中所述疾病或失调是炎性鼻病，选自息肉病、鼻窦炎和鼻炎。

180.权利要求168的方法，其中所述疾病或失调是炎性甲状腺病，其是甲状腺炎。

181.权利要求168的方法，其中所述疾病或失调是癌症，选自神经胶质瘤、粥样斑癌、腺癌、肉芽肿、成胶质细胞瘤、肉芽肿病、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤、结节病、小胶质细胞瘤、脑膜瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌和头颈癌。

182.权利要求168的方法，其中所述疾病或失调选自肾病、脊髓损伤和迟发型超敏性。

183.权利要求155-175和178-182任一项的方法，其中所述缀合物的靶向物质选自MCP-1，Eotaxin-1，SDF-1β，GRO-α，MIP-1β，IL-8，IP-10，MCP-3，MIP-3α，MDC，MIP-1α和BCA-1及其等位基因变体或物种变体，被靶向物质是修饰的志贺毒素或其活性片段。

184.权利要求155-175和178-183任一项的方法，其中所述靶向物质是MCP-1。

185.权利要求155-175和178-184任一项的方法，其中所述缀合物选自LPM1c，LPM1d，LPM2，LPM3，LPM4，LPM5，LPM6，LPM7，LPM8，LPM9，LPM10和LPM11。

186.权利要求155-168任一项的方法，其中所述缀合物的靶向物质是PF-4或其等位基因变体或物种变体，所述疾病或病症是血管发生介导的疾病。

187.权利要求155-168任一项的方法，其中所述缀合物的靶向物质是VEGF或其等位基因变体或物种变体，所述疾病或病症是血管发生介导的疾病。

188.权利要求155-169任一项的方法，其中所述缀合物靶向参与MS的病因学或病理学的细胞。

189.权利要求188的方法，其中所述细胞表达选自CCL1-8，CXCL8-13，CCR1-3，5，6和CXCR1-3，4的一或多个受体。

190.权利要求188或189的方法，其中所述缀合物靶向选自CCL1-8，CXCL8-13，CCR1-3，5，6和CXCR1-3，4的至少二个受体。

191.权利要求188或189的方法，其中：

所述缀合物包含趋化因子或其足以结合和由受体内化的片段；以及

所述趋化因子选自I-309，MCP-1，MIP-1α，MIP-1β，RANTES，MCP-3，MCP-2，IL-8，MIG，IP-10，I-TAC，SDF-1α，SDF-1β，BCA-1，Eotaxin，MCP-4，MCP-5，C10，LEC和MIP-1b2。

192.权利要求188-191任一项的方法，其中所述缀合物是LPM7或LPM1d。

193.权利要求1-34任一项的方法，进一步包括纯化或分离所述RIP。

194.由权利要求69-111任一项的方法产生的修饰的RIP。

195.权利要求136的缀合物，其中CD4+T细胞是Th17细胞。

196.权利要求168的方法，其中所述疾病是炎性皮肤病，选自银屑病、湿疹和皮炎，或者是自身免疫疾病，选自移植物排斥和移植物抗宿主疾病。

197.缀合物将毒素靶向细胞的用途，其中：

所述缀合物含有权利要求113-120任一项的修饰的毒素和细胞表面受体靶向物质；及

所述细胞表达被靶向的细胞表面受体。

198.缀合物用于配制用于将毒素靶向细胞的药物的用途，其中：

所述缀合物含有权利要求113-120任一项的修饰的毒素和细胞表面受体靶向物质；及

所述细胞表达被靶向的细胞表面受体。

199.权利要求152的组合物用于治疗免疫或炎性疾病或失调的用途。

200.权利要求152的组合物用于配制用于治疗免疫或炎性疾病或失调的药物的用途。

201.权利要求121-148任一项的缀合物用于抑制疾病或失调的用途，其中所述疾病或失调是与炎症应答相关的免疫或炎性病症和/或与一或多种细胞的活化、增殖和迁移相关的继发组织损伤；

所述缀合物结合在一或多种细胞上表达的一或多种细胞表面受体，导致被靶向物质内化在携带所述受体的细胞中；

所述缀合物抑制一或多种细胞的活化、增殖或迁移。

202.权利要求121-148任一项的缀合物用于配制用于抑制疾病或失调的药物的用途，其中所述疾病或失调是与炎症应答相关的免疫或炎性病症和/或与一或多种细胞的活化、增殖和迁移相关的继发组织损伤；

所述缀合物结合在一或多种细胞上表达的一或多种细胞表面受体，导致被靶向物质内化在携带所述受体的细胞中；

所述缀合物抑制一或多种细胞的活化、增殖或迁移。

203.权利要求197-202任一项的用途，其中所述缀合物抑制参与疾病或失调的一或多种细胞的活化、增殖或迁移，所述疾病或失调选自CNS损伤、CNS炎性疾病、神经变性疾病、心脏病、炎性眼病、炎性肠病、炎性关节病、炎性肾病、炎性皮肤病、炎性肺病、炎性鼻病、炎性全身性疾病、肥胖症及相关疾病中的炎症、炎性甲状腺疾病、与细菌或病毒感染相关的炎症应答、癌症、自身免疫疾病和血管发生介导的疾病。

204.权利要求203的用途，其中所述疾病或失调是CNS炎性疾病和/或神经变性疾病，其选自卒中、闭合性头部损伤、白质脑病，脉络丛脑膜炎、脑膜炎、肾上腺脑白质营养不良、AIDS痴呆复合征、阿尔茨海默病、唐氏综合征、慢性疲劳综合征、脑炎、脑脊髓炎、海绵样脑病、多发性硬化、帕金森氏病和脊髓损伤/创伤(SCI)。

205.权利要求203的用途，其中所述疾病或失调是炎性皮肤病，选自银屑病、湿疹和皮炎，或者是自身免疫疾病，选自移植物排斥和移植物抗宿主疾病。

206.权利要求203的用途，其中所述疾病或失调是心脏病及是动脉粥样硬化。

207.权利要求203的用途，其中所述疾病或失调是炎性眼病，其选自增生性糖尿病视网膜病变、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜炎、巩膜炎、巩膜虹膜炎、脉络膜炎和葡萄膜炎。

208.权利要求203的用途，其中所述疾病或失调是炎性肠病，其选自慢性结肠炎，Crohn’s病和溃疡性结肠炎。

209.权利要求203的用途，其中所述疾病或失调是炎性关节病，其选自幼年类风湿性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎和脊椎关节病变。

210.权利要求209的用途，其中所述疾病或失调是脊椎关节病变，其选自强直性脊柱炎、Reiter’s综合征、活动型关节炎、银屑病关节炎、脊柱炎、未分化的脊椎关节病变和Behcet’s综合征。

211.权利要求203的用途，其中所述疾病或失调是炎性肾病，其选自肾小球肾炎、IgA肾病和狼疮肾炎。