CN113272019A

CN113272019A - 肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰体

Info

Publication number: CN113272019A
Application number: CN202080009047.8A
Authority: CN
Inventors: 芹泽崇; 森胜之; 浅野智美; 佐藤干也
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2019-01-28
Filing date: 2020-01-28
Publication date: 2021-08-17
Also published as: JPWO2020158691A1; EP3919128A1; US20220220176A1; BR112021012472A2; EP3919128A4; WO2020158691A1; CA3124682A1

Abstract

本发明的目的在于，提供减少肝趋向性、能够在肝脏组织之外的靶标疾病组织中选择性表达生理活性的肝细胞生长因子或其活性片段的变体。本发明提供肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰体，其在肝细胞生长因子或其活性片段的末端经由蛋白酶敏感性肽而键合有聚乙二醇。

Description

肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰体

技术领域

本发明涉及肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰体。

背景技术

肝细胞生长因子是具有多种多样的药理作用的生长因子，除了当初发现的肝细胞生长作用之外，还已知具有抗细胞凋亡作用、血管新生作用、血管扩张作用、抗脏器纤维化作用、抗上皮间质转化作用等，尝试了针对多种多样的疾病的临床应用。

然而，肝细胞生长因子的生物体内半衰期短至30分钟左右，因此暗示为了使其药理作用持续，需要频繁给药大量的肝细胞生长因子(非专利文献1)。另一方面，肝细胞生长因子具有肝趋向性，因此报道了在大量给药的情况下，作为其副作用而诱发因肝细胞生长而导致的肝肥大(非专利文献2)。

作为肝细胞生长因子的天然型剪切变体的活性片段，非专利文献3中报道了包含N结构域和Kringle 1的NK1，非专利文献4中报道了包含N结构域以及Kringle 1和Kringle 2的NK2。此外，非专利文献5中，作为通过重组技术制作的活性片段，报道了包含N结构域以及Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3和Kringle 4的NK4，报道了这些活性片段在体外和体内，对肝细胞生长因子受体的受体型酪氨酸激酶、即c-Met具有激动剂活性或者拮抗剂活性。此外，NK1具有肝趋向性，报道了在体内诱发肝肥大(非专利文献3和6)。

迄今，针对肝细胞生长因子与其活性片段之一的NK4，报道了以生物体内半衰期的延长效果作为主要目的的聚乙二醇修饰体(专利文献1和2)。聚乙二醇是生物体适应性高的聚合物性高分子，作为以蛋白质的生物体内半衰期延长、免疫原性降低为目的的修饰剂而被广泛利用。

将蛋白质用聚乙二醇化学修饰的情况下，已知根据其修饰位置，该蛋白质的生理活性降低或消失。例如，专利文献1中报道了将肝细胞生长因子用多个聚乙二醇无规地直接化学修饰得到的修饰体能够实现肝细胞生长因子的生物体内半衰期的延长效果，但另一方面其生理活性降低30%以上。

此外，非专利文献7中报道了，为了试验性地控制源自药物的毒性的目的，将源自绿脓杆菌的外毒素A经由针对源自鼻病毒的3C蛋白酶的蛋白酶敏感性肽而用聚乙二醇进行了化学修饰的前药。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开1996/28475号

专利文献2：日本特开2010-174034号公报

非专利文献

非专利文献1：Liu K.X.等人，The American Journal of Physiology，1998年，第275卷，p.E835-E842

非专利文献2：Sakata H.等人，Cell Growth & Differentiation，1996年，第7卷，p.1513-1523

非专利文献3：Jakubczak J.L.等人，Molecular and Cellular Biology，1998年，第18卷，第3号，p.1275-1283

非专利文献4：Otsuka T.等人，Molecular and Cellular Biology、2000年，第20卷，第6号，p.2055-2065

非专利文献5：Date K.等人，FEBS Letters，1997年，第420卷，第1号，p.1-6

非专利文献6：Ross J.等人，Gastroenterology、2012年，第142卷，p.897-906

非专利文献7：Stefan N.等人，Bioconjugate Chemistry，2014年，第25卷，p.2144-2156。

发明内容

发明要解决的课题

然而，非专利文献7中，对于作为源自绿脓杆菌的毒素蛋白质的外毒素A的前药，并未实施在体内和离体的功能验证。此外，非专利文献7中公开的外毒素A的前药为了抑制外毒素A的生理活性，在外毒素A的末端和序列中间的2个部位经由蛋白酶敏感性肽进行了聚乙二醇化学修饰，但一般而言，蛋白质的序列中间的肽添加、利用聚乙二醇的化学修饰的制造难度高，利用蛋白酶剪切后也在上述蛋白质的结构中间残留源自蛋白酶敏感性肽的不需要的氨基酸序列，因此在维持上述蛋白质原本具有的生理活性的观点方面具有不确定性。因此，非专利文献7中记载的技术被认为缺乏通用性，无法容易地应用于其它蛋白质。

应予说明，非专利文献7中完全没有公开或暗示肝细胞生长因子或其活性片段的前药，也完全没有公开或暗示能够应用于以减少源自肝细胞生长因子或其活性片段的肝趋向性为目的的前药设计中的生物体内蛋白酶。

因此，要求创造减少源自肝细胞生长因子或其活性片段的肝趋向性，能够在除了肝脏组织之外的靶标疾病组织中选择性表达肝细胞生长因子或其活性片段的生理活性的肝细胞生长因子或其活性片段的变体。

因此，本发明的目的在于，提供解决上述课题的肝细胞生长因子或其活性片段的变体。

用于解决课题的手段

本发明人等为了解决上述课题而反复深入研究，结果发现，通过将肝细胞生长因子或其活性片段经由蛋白酶敏感性肽用聚乙二醇进行化学修饰，能够减少源自肝细胞生长因子或其活性片段的肝趋向性，并通过在靶标疾病组织中剪切蛋白酶敏感性肽，由此能够选择性表达肝细胞生长因子或其活性片段的生理活性，从而完成了本发明。

即，本发明包括以下的(1)~(7)。

(1) 肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰体，其在肝细胞生长因子或其活性片段的末端经由蛋白酶敏感性肽而键合有聚乙二醇。

(2) 根据(1)所述的聚乙二醇修饰体，其中，上述蛋白酶敏感性肽为ADAM17敏感性肽或凝血酶敏感性肽。

(3) 根据(1)所述的聚乙二醇修饰体，其中，上述蛋白酶敏感性肽为序列表的SEQID NO: 8~20中任一项所示的氨基酸序列。

(4) 根据(1)~(3)中任一项所述的聚乙二醇修饰体，其中，上述聚乙二醇的数均分子量为20000~100000。

(5) 根据(1)~(4)中任一项所述的聚乙二醇修饰体，其中，前述肝细胞生长因子的活性片段为NK1。

(6) 根据(1)~(5)中任一项所述的聚乙二醇修饰体，其中，前述肝细胞生长因子的活性片段为序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。

(7) 药物，其含有(1)~(6)中任一项所述的聚乙二醇修饰体作为有效成分。

发明的效果

本发明的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰体能够减少肝细胞生长因子或其活性片段原本具有的肝趋向性，且在肾脏等靶标疾病组织中选择性表达肝细胞生长因子或其活性片段的生理活性，发挥其药理作用。

附图说明

图1是示出肾病模型小鼠和正常小鼠的肾脏组织和肝脏组织中的ADAM17蛋白质的酶活性的表达量的图。

图2是示出肾病模型小鼠和正常小鼠的肾脏组织和肝脏组织中的ADAM17蛋白质的表达量的图。(a)示出对ADAM17蛋白质的蛋白免疫印迹图像，(b)是将其带强度进行数值化而得的图。

图3是示出利用蛋白酶处理从前药化人NK1释放活性体、即人NK1的图。

图4是示出蛋白酶敏感性肽添加人NK1的因前药化而导致的人NK1的HGF活性减弱的图。

图5是示出从组织选择性的前药化人NK1释放活性体、即人NK1的图。

图6是示出前药化人NK1在体内的组织选择性的生理活性的图。

图7是示出基于聚乙二醇修饰部位差异的前药化人NK1的活性控制的比较的图。

具体实施方式

＜肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰体＞

本发明所涉及的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰体(以下也称为HGF或其活性片段的PEG修饰体)在1分子的肝细胞生长因子(HEPATOCYTE GROWTH FACTOR，以下也称为HGF)或其活性片段的末端(氨基末端、羧基末端)经由蛋白酶敏感性肽而共价键合有聚乙二醇(以下也称为PEG)。

作为本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体的实施方式之一，可以举出在HGF或其活性片段的末端(氨基末端或羧基末端)经由蛋白酶敏感性肽而共价键合有1分子或多个分子的PEG的物质。此时，上述HGF或其活性片段的末端与上述蛋白酶敏感性肽的键合方式没有特别限制，两者可以直接键合，也可以任意经由间隔区序列而键合。该蛋白酶敏感性肽与上述PEG的键合方式没有特别限制，可以在该蛋白酶敏感性肽上直接键合该PEG，也可以在该蛋白酶敏感性肽上经由人工添加的氨基酸等而与该PEG键合，进一步也可以在该蛋白酶敏感性肽与人工添加的氨基酸等之间，包含纯化用的蛋白酶敏感性肽、纯化用的标签序列。例如，可以举出在蛋白酶敏感性肽的羧基末端共价键合有HGF或其活性片段的末端、在该蛋白酶敏感性肽的氨基末端共价键合有PEG的物质；在蛋白酶敏感性肽的氨基末端共价键合有HGF或其活性片段的末端、在该蛋白酶敏感性肽的羧基末端共价键合有PEG的物质，优选为在蛋白酶敏感性肽的羧基末端共价键合有HGF或其活性片段的末端、在该蛋白酶敏感性肽的氨基末端共价键合有PEG的物质。

HGF或其活性片段的氨基末端承担对控制HGF或其活性片段的生理活性而言重要的HGF或其活性片段的二聚体化和肝趋向性的功能，因此为了减少HGF或其活性片段具有的生理活性和肝趋向性，优选为在HGF或其活性片段的氨基末端经由蛋白酶敏感性肽而共价键合有1分子PEG的物质，更优选为在HGF或其活性片段的氨基末端共价键合有蛋白酶敏感性肽的羧基末端、还在该蛋白酶敏感性肽的氨基末端共价键合有1分子PEG的物质，进一步优选为在HGF或其活性片段的氨基末端共价键合有ADAM17敏感性肽或凝血酶敏感性肽的羧基末端、还在该ADAM17敏感性肽或该凝血酶敏感性肽的氨基末端共价键合有1分子PEG的物质，进一步优选为在作为HGF的活性片段之一的NK1的氨基末端共价键合有ADAM17敏感性肽或凝血酶敏感性肽的羧基末端、还在该ADAM17敏感性肽或该凝血酶敏感性肽的氨基末端共价键合有1分子的数均分子量20000~100000的PEG的物质，最优选为在NK1的氨基末端共价键合有ADAM17敏感性肽或凝血酶敏感性肽的羧基末端、还在该ADAM17敏感性肽或该凝血酶敏感性肽的氨基末端共价键合有1分子的4分支型数均分子量70000~90000的PEG的物质。应予说明，为了控制利用蛋白酶的剪切效率，还能够在HGF或其活性片段与蛋白酶敏感性肽之间添加任意的间隔区序列。

作为本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体的另外的实施方式之一，可以举出在HGF或其活性片段的序列中间经由蛋白酶敏感性肽而共价键合有1分子的PEG的物质。

＜HGF和其活性片段＞

HGF从氨基末端侧起包含N结构域、Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和SPH结构域，N结构域、Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3和Kringle 4构成α链，SPH结构域构成β链。HGF在表达时作为单链的pro-HGF而被生物合成，但在分泌时去除分泌信号序列后，在细胞外从起始甲硫氨酸起第494位的精氨酸残基与第495位的缬氨酸残基之间，受到利用蛋白酶的加工，形成α链与β链通过二硫键而键合的异源二聚链，成为活性型(MiyazawaK.等人，The Journal of Biological Chemistry，1996年，第271卷，第7号，p.3615-3618)。本说明书中HGF是指具有生理活性的活性型的HGF。

HGF具有的肝细胞生长作用、抗细胞凋亡作用、血管新生作用、血管扩张作用、抗脏器纤维化作用、抗上皮间质转化作用等多种多样的药理作用已知通过HGF与作为HGF受体的受体型酪氨酸激酶的c-Met结合而诱导。通过HGF与c-Met结合，c-Met的细胞内侧的多个酪氨酸残基被磷酸化，通过在磷酸化的酪氨酸残基上结合信号分子，由此信号通路被激活。此时，作为特别重要的磷酸化部位，已知Y1234/1235。

人HGF的情况下，作为包含728个氨基酸残基(包括分泌信号序列(从起始甲硫氨酸起31个氨基酸残基))(GenBank收录号：M29145)的分泌蛋白质而被生物合成，分泌时，成为去除分泌信号序列的包含697个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO: 1)。

上述HGF不仅包括具有与天然存在的HGF(以下也称为天然型HGF)的氨基酸序列相同的氨基酸序列的物质，还包括具有在天然型HGF的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、替代或添加(或插入)的氨基酸序列、且具有作为HGF的生理活性的HGF的氨基酸突变体，进一步还包括改变了天然型HGF的糖链部分的HGF和不具有糖链部分的HGF。作为HGF的氨基酸突变体，优选为与天然型HGF的氨基酸序列具有90%以上的序列一致性的突变体，更优选为具有95%以上的序列一致性的突变体，进一步优选为具有98%以上的序列一致性的突变体。作为HGF的氨基酸突变体，可以举出例如Kringle 1内的5氨基酸残基缺失的HGF(天然存在的天然型突变体，以下也称为缺失型HGF)(Kinosaki M.等人，FEBS Letters、第434卷，1998年，p.165-170)，据报道其在某种细胞种中与人HGF(SEQ ID NO: 1)相比比活性更高。

保守的氨基酸替代一般而言是指在化学性质、电性质(或极性·疏水性)或结构性质类似的氨基酸间的替代。这样的替代中，能够抑制包含天然型HGF的多肽的立体结构(构象)的显著变化，因此该多肽能够将其活性保持而不显著损害，此外有时还能够形成与天然型相比更高的活性。这样的氨基酸替代的具体例包括酸性氨基酸间的替代(例如天冬氨酸(D)和谷氨酸(E))、碱性氨基酸间的替代(例如组氨酸(H)、赖氨酸(K)和精氨酸(R))、芳族氨基酸间的替代(例如苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W))、亲水性氨基酸间的替代(例如半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)组氨酸(H)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T))、疏水性氨基酸间的替代(例如丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、正亮氨酸(Nle)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y))等。

上述HGF还包括基于天然型HGF的氨基酸序列或碱基序列，通过基因重组技术而制作的重组型HGF。

本说明书中使用的“序列一致性”是指表示能够使用BLAST、FASTA等算法而确定的2个序列间的一致性，一般而言，将2个序列以包含空缺或不含空缺的方式，以达到最大的一致度的方式排列时，可以作为一致的氨基酸数相对于(包括空缺的)总氨基酸数的百分数(%)而算出(Altschul S.等人，Journal of Molecular Biology，1990年，第215卷，第3号p.403-410； Altschul S.等人，Nucleic Acids Research，1997年，第25卷，第17号p.3389-3402)。

本说明书中使用的“多个”是指2~10的整数、即2、3、4、5、6、7、8、9或10。

HGF的活性片段是指包括HGF的结构中的一部分，与c-Met结合，发挥作为HGF的生理活性(激动剂活性)的蛋白质或对c-Met作为拮抗剂而发挥作用(发挥拮抗剂活性)的蛋白质。

作为上述HGF的活性片段，可以举出例如HGF的天然型剪切变体、即NK1或NK2或通过重组技术而制作的NK4。NK1包含HGF的氨基末端侧的N结构域和Kringle 1，NK2包含HGF的氨基末端侧的N结构域、Kringle 1和Kringle 2。它们据报道各自在生物体内，对c-Met作为激动剂或拮抗剂而发挥作用(Jakubczak J.L.等人，Molecular and Cellular Biology、第18卷，第3号，1998年，p.1275-1283； Otsuka T.等人，Molecular and Cellular Biology、第20卷，第6号，2000年，p.2055-2065)。此外，NK1据报道具有肝趋向性，在体内诱发肝肥大(Jakubczak J.L.等人，Molecular and Cellular Biology，1998年，第18卷，第3号，p.1275-1283；Ross J.等人，Gastroenterology、2012年，第142卷，p.897-906)。NK4包含HGF的氨基末端侧的N结构域、Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3和Kringle 4，据报道对c-Met作为拮抗剂而发挥作用(Date K.等人，FEBS Letters、第420卷，第1号，1997年，p.1-6)。

上述HGF的活性片段不仅包括与源自天然型HGF的氨基酸序列具有相同氨基酸序列的物质，还包括具有源自天然型HGF的氨基酸序列的氨基酸序列中1个或多个氨基酸缺失、替代或添加的氨基酸序列、且发挥作为HGF的生理活性(激动剂活性)或对c-Met的拮抗剂活性的突变体，进一步还包括改变了源自天然型HGF的糖链部分、或不具有源自天然型HGF的糖链部分的突变体。作为HGF的活性片段的突变体，优选为与源自天然型HGF的氨基酸序列具有90%以上的序列一致性的突变体，更优选为具有95%以上的序列一致性的突变体，进一步优选为具有98%以上的序列一致性的突变体。例如，作为NK1高活性型突变体，可以举出1K1(Lietha D.等人，The EMBO Journal、2001年，第20卷，第20号，p.5543-5555)、M2.2(Jones D.S. 2nd.等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America、2011年，第108卷，第32号，p.13035-13040)。

本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体中包含的HGF或其活性片段优选为天然型HGF(包括缺失型HGF等突变体)、NK1(包括突变体)、NK2(包括突变体)或NK4(包括突变体)，更优选为NK1(包括突变体)或NK2(包括突变体)，进一步优选为NK1(包括突变体)，最优选为包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的人NK1。应予说明，SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列中，不包括源自人HGF的分泌信号序列(MWVTKLLPALLLQHVLLHLLLLPIAIPYAEG：SEQ IDNO: 3)。

此外，上述HGF或其活性片段包括源自哺乳动物的氨基酸序列，优选为源自人、猫或狗的氨基酸序列，更优选为源自人的氨基酸序列。

HGF或其活性片段可以例如使用公知的基因重组技术，设计编码HGF或其活性片段的核酸序列(DNA)，并瞬时或稳定地导入细胞中进行表达而获取。

应予说明，在HGF或其活性片段与蛋白酶敏感性肽之间，可以使用公知的基因重组技术，添加1~20个氨基酸来作为间隔区序列。在HGF或其活性片段与蛋白酶敏感性肽之间添加了间隔区序列的HGF或其活性片段可以通过例如使用公知的基因重组技术，与编码HGF或其活性片段的核酸序列(DNA)连续地添加编码任意选择的间隔区序列的核酸序列(DNA)，进一步连续地添加编码蛋白酶敏感性肽的核酸序列(DNA)，并瞬时或稳定地导入细胞中进行表达而获取。作为上述间隔区序列中能够使用的氨基酸，可以举出例如天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、正亮氨酸(Nle)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)和色氨酸(W)。所使用的间隔区序列考虑蛋白酶敏感性肽的剪切效率、利用PEG修饰的HGF或其活性片段的活性控制的效率而适当选择。

＜蛋白酶敏感性肽＞

本发明中使用的蛋白酶敏感性肽意指被在除了肝脏组织之外的靶标疾病组织中确认到表达，同时在肝脏组织中的表达相对低的蛋白酶剪切的肽。

与蛋白酶敏感性肽对应的蛋白酶根据成为对象的靶标疾病组织，所要求的酶活性的相对差异发生变化，因此需要通过蛋白免疫印迹、免疫组织染色等方法来评价肝脏组织与靶标疾病组织的相对酶活性差异而选择适当的蛋白酶。例如，作为其一个方式，在靶标疾病组织为肾脏组织的情况下，需要在肾脏组织中的酶活性相对于在肝脏组织中的酶活性的相对差异为3倍以上的蛋白酶，优选为10倍以上的蛋白酶，更优选为100倍以上的蛋白酶。

本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体中，通过选择上述那样的蛋白酶敏感性肽，上述PEG修饰体在肝脏组织中，通过用PEG进行化学修饰，HGF或其活性片段的活性减弱，形成肝趋向性减少的状态，因此能够期待源自肝脏组织中的HGF或其活性片段的副作用减少，另一方面，在靶标疾病组织中，通过这些蛋白酶敏感性肽所对应的蛋白酶进行剪切而使PEG游离，因此能够期待HGF或其活性片段的释放和其生理活性的表达。应予说明，通过对应蛋白酶而剪切的蛋白酶敏感性肽的片段可以残留在HGF或其活性片段中。

作为在除了肝脏组织之外的靶标疾病组织中确认到表达的蛋白酶，可以举出例如据报道在肾疾病患者的肾脏中表达的ADAM17(MelenhorstW.B.等人，American Journal ofPhysiology、2009年，第297卷，第3号，p.781-790)、Hepatocyte growth factor activator(HGFA)、其上游因子的凝血酶(David C.J.H.等人，American Journal of Physiology、2001年，第159卷，第4号，p1383-1393)或基质金属蛋白酶(Junwei Y.等人，The Journal ofClinical Investigation、2002年，第110卷，p.1525-1538)等。

ADAM17在细胞内作为无活性型的前体而合成后，通过弗林蛋白酶而剪切形成成熟体，显示出剪切各种各样蛋白质的活性(Aldo B.等人，Journal of BiologocalChemistry、2003年，第278卷，p.25933-25939；Belen S.J.等人，Journal of BiologocalChemistry、2007年，第282卷，p.8325-8331)。本说明书中没有特别记载的情况下，ADAM17表示ADAM17成熟体。

本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体中包含的蛋白酶敏感性肽可以使用据报道利用对应的蛋白酶而剪切的现有的生物体内源性肽、使用基因重组技术而制作的人工肽。蛋白酶敏感性肽考虑稳定性、靶标组织中的剪切效率和物种交叉性而选择。ADAM17和凝血酶由本发明人等发现在肝脏组织中的表达与在除了肝脏组织之外的靶标疾病组织相比相对低，因此蛋白酶敏感性肽优选为ADAM17敏感性肽或凝血酶敏感性肽。在此，ADAM17敏感性肽是指通过ADAM17而剪切的肽，凝血酶敏感性肽是指通过凝血酶而剪切的肽。

ADAM17敏感性肽之中，作为生物体内源性肽的例子，可以举出源自TNF-alpha的物质(SPLAQAVRSSSR、SEQ ID NO: 8)或源自L-选择素的物质(QETNRSFSK、SEQ ID NO: 10)等。作为人工肽的例子，可以举出人工ADAM-17可剪切序列(PRAAAVKSP、SEQ ID NO: 9)(CaesuC.l.等人，Biochemical Journal、2009年，第424卷，p.79-88)等。作为ADAM17敏感性肽，优选为SEQ ID NO: 8~16所示的氨基酸序列的肽，更优选为SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列的肽。

凝血酶敏感性肽之中，作为生物体内源性肽的例子，可以举出源自凝血酶原的物质(FNPRTFGS、SEQ ID NO: 19)或源自HGFA的物质(LRPRIIGG、SEQ ID NO: 20)等。作为人工肽的例子，可以举出人工凝血酶可剪切序列(TFLTPRGVRLG、SEQ ID NO: 17和TFPPRSFLG、SEQ ID NO: 18)(Maike G.等人，PLoS ONE、2012年，第7卷p.E31756-31771；Bo C.等人，TheJournal of Neuroscience、2012年，第32卷，22号p.7622-7631)等。作为凝血酶敏感性肽，优选为SEQ ID NO: 17~20所示的氨基酸序列的肽，更优选为SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列的肽。

蛋白酶敏感性肽可以使用1种或多种。通过组合使用对同一蛋白酶具有不同剪切活性的蛋白酶敏感性肽、针对不同蛋白酶的蛋白酶敏感性肽，能够将多个部位用PEG进行化学修饰、控制剪切活性。

蛋白酶敏感性肽例如使用公知的基因重组技术，设计与编码HGF或其活性片段的核酸序列(DNA)连续地编码蛋白酶敏感性肽序列的核酸序列(DNA)，并瞬时或稳定地导入细胞中进行表达，由此能够作为添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段而获取。

上述蛋白酶敏感性肽可以为了纯化等目的而添加有标签序列等人工序列。作为标签序列，可以举出例如6×His标签、HAT标签、c-Myc标签、FLAG标签、DYKDDDDK标签、Strep标签、HA标签、GST标签和MBP标签等。进一步，在添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段的纯化后，为了去除这些标签序列，除了该蛋白酶敏感性肽之外，可以进一步将用于纯化的蛋白酶敏感性肽、用于纯化的间隔区序列等序列任选插入至该蛋白酶敏感性肽与标签序列之间。在该情况下，通过纯化和标签序列的去除而得到的添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段中，可以包含用于纯化的蛋白酶剪切肽、用于纯化的间隔区序列等序列的剪切片段。

上述蛋白酶敏感性肽为了PEG修饰等目的，可以插入有半胱氨酸等天然型氨基酸、叠氮化苯丙氨酸等非天然型氨基酸。向蛋白酶敏感性肽中插入上述氨基酸可以通过例如使用公知的基因重组技术，设计与编码蛋白酶敏感性肽序列的核酸序列(DNA)连续地添加的编码氨基酸的核酸序列(DNA)，并瞬时或稳定地导入细胞中进行表达，从而实施。以PEG修饰等为目的的氨基酸的插入部位优选为蛋白酶敏感性肽的末端(氨基末端或羧基末端)。

应予说明，上述蛋白酶敏感性肽可以在蛋白酶敏感性肽与以纯化等为目的的标签序列等人工序列或为了PEG修饰等目的而插入的氨基酸之间，使用公知的基因重组技术，作为间隔区序列而添加有1~20个氨基酸。在蛋白酶敏感性肽与以纯化等为目的标签序列等人工序列或为了PEG修饰等目的而插入的氨基酸之间添加有间隔区序列的蛋白酶敏感性肽可以通过例如使用公知的基因重组技术，与编码蛋白酶敏感性肽的核酸序列(DNA)连续地添加任意选择的编码间隔区序列的核酸序列(DNA)，进一步连续地插入以纯化等为目的的标签序列等人工序列或以PEG修饰等为目的的氨基酸，并瞬时或稳定地导入细胞中进行表达，由此获取。作为上述间隔区序列中能够使用的氨基酸，可以举出例如天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、正亮氨酸(Nle)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)和色氨酸(W)。此时，任选添加的间隔区序列优选被添加至蛋白酶敏感性肽的末端，更优选在添加于HGF或其活性片段的氨基末端的蛋白酶敏感性肽的氨基末端添加间隔区序列的羧基末端，在该间隔区序列的氨基末端添加以纯化等为目的的标签序列等人工序列或为PEG修饰等目的而插入的氨基酸。上述间隔区序列考虑到蛋白酶敏感性肽的剪切效率、利用PEG修饰的HGF或其活性片段的活性控制的效率而适当选择。

＜PEG＞

PEG是包含水溶性聚(环氧乙烷)的生物体适应性高的聚合物性高分子，通过将蛋白质用PEG进行化学修饰，已知会对该蛋白质附加物理稳定性、热稳定性、对蛋白质分解酶的抵抗性、溶解性提高、生物体内的分布容积降低、血中滞留性提高等临床有用性(Inada等人，Journal of Bioact and Compatible Polymers、第5卷，1990年，p.343； Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems、第9卷，1992年，p.249；Katre、Advanced Drug Delivery Systems、第10卷，1993年，p.91)。

为了制作本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体而使用的PEG可以使用本技术领域中已知的物质。典型而言，包含重复单元结构“-(CH₂CH₂O)_n-”，末端基团或PEG整体的结构可以如后述变化。例如，根据有无末端的氧原子的替代，可以包括“-CH₂CH₂-O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-”和“-(OCH₂CH₂)_nO-”。为了制作本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体而使用的PEG的末端被封端，作为其具体例，可以举出PEG的一个末端被具有反应性的官能团(例如马来酰亚胺基)封端的物质。此外，PEG的另一个末端可以被封端，为了提高亲水性，可以接受例如羟基的导入等修饰。使用具有分支结构的PEG的情况下，至少一个末端被上述马来酰亚胺基等具有反应性的官能团封端即可，其它的支链的各末端可以接受修饰。本发明中，为了将添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段用PEG进行化学修饰，可以使用PEG末端用与添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段示出共价键合反应性那样的官能团进行了活化的PEG。

本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体中包含的PEG的结构没有特别限制，可以为直链结构或分支结构，在减少HGF或其活性片段具有的肝趋向性方面，优选具有分支结构。作为具有分支结构的PEG，可以举出例如2分支型的PEG、3分支型的PEG或4分支型的PEG，分支数也包括其以上的数，其中优选为4分支型的PEG。更具体而言，可以举出从至官能团的连接基团部分的末端起2分支、3分支或4分支的结构；从至官能团的连接基团部分的末端起分支的PEG链起进一步PEG链分支的结构；从至官能团的连接基团部分的末端和连接基团部分的中间起PEG链分支的结构，分支的PEG链各自的数均分子量可以相同或不同。其中，优选为从至官能团的连接基团部分起PEG链2分支、从各自分支的PEG链起进一步PEG链2分支的结构，最优选从至官能团的连接基团部分起PEG链2分支、从各自分支的PEG链起进一步PEG链2分支的具有总计4条相同数均分子量的PEG链的结构。作为最优选的结构的PEG，可以举出例如油化产业株式会社的SUNBRIGHT GL4-800MA(日油株式会社)。PEG的结构所涉及的优选的方式与PEG的数均分子量所涉及的优选的方式可以任意组合。例如，可以举出4分支型、数均分子量为20000~100000的PEG、从至官能团的连接基团部分起PEG链2分支、从各自分支的PEG链起进一步PEG链2分支的具有总计4条相同数均分子量的PEG链的结构、数均分子量为70000~90000的PEG。

PEG为市售品，或可以按照公知的方法或以其为准的方法，通过环氧乙烷的开环聚合合成(Sandler and Karo、Polymer Synthesis、Academic Press、New York、第3卷，p.138-161)。

本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体中包含的PEG的数均分子量优选为20000~100000，更优选为40000~100000，为了减弱HGF活性，进一步优选为60000~100000，最优选为70000~90000。应予说明，利用PEG的化学修饰的蛋白质等的生物体内半衰期的延长效果已知与PEG的数均分子量相关(Sundqvist T.等人，Computers and BiomedicalResearch，1988年，第21卷，第2号，p.110-116)，一般而言，如果数均分子量为20000以上，则能够期待生物体内半衰期的充分延长效果。

为了将添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段用PEG进行化学修饰，需要将PEG的末端活化。作为末端活化的PEG的例子，可以举出用N-羟基丁二酰亚胺酯、硝基苯磺酸酯、马来酰亚胺、邻吡啶基二硫化物、乙烯基砜、碘乙酰胺、羧酸、叠氮化物、膦或胺结构将末端活化的PEG，它们可以是市售品、或按照公知的方法合成。例如，作为通过各种反应性官能团活化的PEG，可以举出油化产业株式会社的SUNBRIGHT(注册商标、日油株式会社)系列。本说明书中，以示出与添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段的共价键合反应性的方式在PEG末端添加的反应性官能团简称为“官能团”，在末端具有这些反应性官能团的PEG记载为“通过官能团活化的PEG”。官能团根据修饰部位而适当选择，例如对于氨基而言，作为官能团，可以通过使用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)酯基而选择性修饰。此外，在半胱氨酸残基的侧链上存在的硫醇基作为官能团，可以使用马来酰亚胺基来选择性修饰。并且，对于在谷氨酸的侧链和羧基末端存在的羧基，可以使用氨基等而修饰。此外，对于叠氮化苯丙氨酸等非天然型氨基酸中包含的叠氮化物基，可以通过使用三烯丙基膦而选择性修饰。这些情况下，用PEG进行化学修饰的添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段、即本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体中，可以包含通过PEG与蛋白酶敏感性肽的共价键合反应而产生的官能团，例如在半胱氨酸中包含的硫醇基与马来酰亚胺基的共价键合反应的情况下，包含丁二酰亚胺基。

上述HGF或其活性片段的优选的方式、蛋白酶敏感性肽的优选的方式、PEG的优选的方式可以任意组合。

＜制造方法＞

本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体如前所述，在HGF或其活性片段的末端(氨基末端、羧基末端)经由蛋白酶敏感性肽而共价键合有PEG。作为其制造方法，可以举出例如使添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段与PEG共价键合的方法。

以下举出添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段的制造方法的一例。HGF或其活性片段与蛋白酶敏感性肽可以在并未分别制备的情形下作为一个分子的蛋白质而表达，例如添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段可以通过使用后述的基因重组技术，设计与编码HGF或其活性片段的核酸序列(DNA)连续地编码蛋白酶敏感性肽序列的核酸序列(DNA)，并瞬时或稳定地导入细胞中进行表达，从而获取。应予说明，以包含任选的间隔区序列的核酸序列(DNA)在HGF或其活性片段与蛋白酶敏感性肽之间、或在蛋白酶敏感性肽与以纯化等为目的的标签序列等人工序列或为PEG修饰等目的而插入的氨基酸之间连续地添加的方式进行设计，由此也能够添加间隔区序列。

该添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段的制造中，优选使用例如通过采用基因重组技术而以添加有蛋白酶敏感性肽的状态表达从而得到的添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段。此时，蛋白酶敏感性肽优选与HGF或其活性片段的氨基末端直接结合，优选蛋白酶敏感性肽的羧基末端与HGF或其活性片段的氨基末端直接结合。

添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段的纯化或浓缩可以使用公知的方法而实施，例如，可以通过离子交换、凝胶过滤、使用疏水性载体或亲和性载体的色谱等方法、或它们的组合，去除未反应的HGF或其活性片段、官能团被活化的PEG、或副产物，对添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段进行纯化或浓缩。

HGF或其活性片段还可以使用从组织提取、使用基因重组技术的蛋白质合成、使用表达HGF或其活性片段的重组细胞(或表达HGF的天然细胞)的生物学制造等公知的方法而得到。此外，作为HGF或其活性片段，还可以使用市售的HGF或其活性片段。

HGF或其活性片段已知能够使用原核生物细胞或真核生物细胞而表达，例如如果为NK1，则可以使用公知的基因重组技术而将编码作为HGF的活性片段之一的NK1的核酸序列(DNA)瞬时或稳定地导入细胞中，由此表达NK1，从而获取。

针对基因重组技术，可以按照例如Molecular Cloning、2nd ed.、Cold Springharbor Laboratory(1989)中记载的方法进行。上述技术的一例说明如下。

准备编码HGF或其活性片段的DNA。该DNA可以通过从由人组织、细胞制作的cDNA文库中选择而提取，并施加PCR法等DNA扩增法而得到。或者，该DNA可以使用例如利用亚磷酰胺法的DNA合成机而化学合成。

将上述DNA并入适当的载体中，制作表达载体。这样的载体包含为了表达(根据需要分泌)该DNA所需要的的调控序列等元件。元件的具体例包含翻译起始密码子和终止密码子、启动子、增强子、终止子、核糖体结合部位(或Shine-Dalgarno序列)、选择标志序列、信号序列等，在载体中插入必要的元件。

作为启动子，根据宿主细胞而选择适合的启动子，例如适合于作为原核生物的埃希菌属(Escherichia)细菌的细胞的启动子例如为trp启动子、lac启动子、recA启动子、λP_L启动子等，适合于芽孢杆菌属(Bacillus)细菌的细胞的启动子例如为SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。适合于酵母细胞的启动子例如为PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、AOX启动子等。适合于植物细胞的启动子例如为花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子等。适合于昆虫细胞的启动子例如为P10启动子、多角体蛋白启动子等。适合于哺乳动物细胞的启动子例如为劳氏肉瘤病毒、多瘤病毒、水痘病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒(SMV)、猿猴病毒40(SV40)、牛痘病毒等病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子等。

作为选择标志，例如为HIS3基因、LEU2基因、TRP1基因、URA3基因、二氢叶酸还原酶基因(甲氨蝶呤(MTX)耐性)、氨苄西林耐性基因、新霉素耐性基因、卡那霉素耐性基因等。

作为表达载体，选择适合于宿主细胞的载体，例如质粒、噬菌体、黏粒、病毒载体、人工染色体(例如BAC、YAC等)等是通常使用的载体。针对原核生物用载体，为来自大肠杆菌的质粒、例如pCR系质粒、pBR系质粒、pUC系质粒等、来自枯草菌的质粒、例如pUB110、pTP5、pC194等。针对酵母用载体，为来自酵母质粒、例如pSH系质粒等。针对植物细胞用载体，为双载体等。针对哺乳类细胞用载体，为pBK-CMV、pcDNA3.1、pZeoSV(インビトロゲン公司、ストラジーン公司)等市售载体、病毒载体(例如腺病毒、腺伴随病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、仙台病毒、牛痘病毒、SV40等)。

作为宿主细胞，可以举出例如大肠杆菌、枯草菌等原核生物细胞、以及酵母、植物细胞、动物细胞(例如哺乳类细胞、昆虫细胞等)等真核生物细胞。在将上述表达载体在宿主细胞中转化或转染时，可以使用例如电穿孔法、显微注射法、细胞融合法、DEAE葡聚糖法、磷酸钙法、粒子枪法等公知的手段。

作为使添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段与PEG键合的方法，可以举出例如使上述添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段与通过官能团活化的PEG共价键合的方法，换言之将上述添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段用通过官能团活化的PEG进行化学修饰的方法。

将上述添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段用PEG进行化学修饰中，可以使用该蛋白酶敏感性肽中包含的氨基酸、或在该蛋白酶敏感性肽中人工导入的半胱氨酸、非天然氨基酸(例如叠氮化苯丙氨酸)中包含的氨基、硫醇基、羧基或叠氮化物基等。上述添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段的利用PEG的化学修饰中，可以使用公知的基因重组技术(美国专利第4917888号和国际公开第1987/00056号，国际公开第1999/55377号，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、第14卷，2004年，p.5743-5745)。例如，在添加于HGF或其活性片段的氨基末端或羧基末端的蛋白酶敏感性肽内人工插入半胱氨酸的情况下，在该半胱氨酸残基的侧链上存在的硫醇基不形成分子内和分子间二硫键，因此能够对该硫醇基进行与作为官能团而具有马来酰亚胺基的PEG的部位选择性化学修饰。此外，添加有蛋白酶敏感性肽的HGF或其活性片段中，作为在该蛋白酶敏感性肽的末端插入非天然型氨基酸的方法，报道了利用密码子改变的叠氮化苯丙氨酸和叠氮化物-Z-赖氨酸等的导入方法(日本特开2009-207490号公报)，对这些非天然型氨基酸中包含的叠氮化物基，也能够进行与作为官能团而具有三烯丙基膦的PEG的部位选择性化学修饰。此外，还可以将该蛋白酶敏感性肽使用公知的生物素连接酶表达系统(Avidity)，在细胞内进行生物素标记，利用与亲和素的相互作用，用作用PEG进行化学修饰的部位。

其中，优选为将对官能团示出选择性反应性的氨基酸(天然型、非天然型)在添加于HGF或其活性片段的末端(氨基末端、羧基末端)的蛋白酶敏感性肽的末端进行人工插入的方法。对官能团示出选择性反应性的氨基酸(天然型、非天然型)的插入可以使用前述的基因重组技术而实施。特别地，在制作本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体时，更优选人工插入半胱氨酸残基、叠氮化苯丙氨酸残基或叠氮化物-Z-赖氨酸残基，进一步优选人工插入半胱氨酸残基。在该情况下，优选使用通过马来酰亚胺基而活化的PEG。

本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体的纯化或浓缩可以在经由蛋白酶敏感性肽而用PEG进行化学修饰后，使用公知的方法而实施。例如，通过离子交换、凝胶过滤、使用疏水性载体或亲和性载体的色谱等方法、或它们的组合，去除未反应的HGF或其活性片段、官能团被活化的PEG、或副产物，能够将HGF或其活性片段的PEG修饰体纯化或浓缩。

＜药物＞

本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体不仅可以期待利用PEG修饰的生物体内半衰期的延长效果，还可以通过在表达特定的蛋白酶的靶标疾病组织中剪切上述PEG修饰体中包含的蛋白酶敏感性肽，表现出HGF或其活性片段原本具有的生理活性，因此能够用作对肝脏的副作用减少的药物(例如肾纤维化等脏器纤维化的治疗药或预防药)的有效成分。

上述HGF或其活性片段的PEG修饰体的生理活性可以使用培养细胞而简便地测定。例如，可以将作为天然型HGF的药理作用的c-Met磷酸化诱导作用、细胞生长作用、细胞游走作用和抗细胞凋亡作用等作为指标(Rubin J.S.等人，The Journal of BiologicalChemistry、2001年，第276卷，35号，p.32977-32983；Lietha D.等人，The EMBO Journal、2001年，第20卷，第20号，p.5543-5555；LiuY.等人，American Journal of Physiology，1999年，第277卷，第4号，p.624-633)。

此外，从上述HGF或其活性片段的PEG修饰体释放作为活性体的HGF或其活性片段的行为，例如，可以以利用SDS电泳的PEG修饰体与活性体的分子量变化作为指标而简便地测定。

此外，上述HGF或其活性片段的PEG修饰体的生物体内半衰期可以例如通过测定向模型动物进行静脉内给药、腹腔内给药、皮下给药或皮内给药时的血药浓度而算出。特别地，通过将上述HGF或其活性片段的PEG修饰体进行放射线标记，可以简便地测定。

含有上述HGF或其活性片段的PEG修饰体作为有效成分的药物可以用于治疗能够利用HGF或其活性片段的药理作用的疾病(急性炎性疾病、慢性炎性疾病、急性缺血性疾病或慢性缺血性疾病等)。作为具体的疾病，可以用于治疗例如肌肉萎缩性侧索硬化症、脏器纤维化、糖尿病、脊髄损伤、腹膜粘连、移植治疗、创伤治癒或神经性疼痛等。

含有上述HGF或其活性片段的PEG修饰体作为有效成分的药物中，例如蛋白酶敏感性肽为ADAM17敏感性肽的情况下，与存在HGF或其活性片段的副作用的担忧的肝脏相比，能够用作在ADAM17的表达量高的脏器(例如肾脏)中发病的疾病(例如肾纤维化)的治疗剂或预防剂。此外，在正常人中，与肝脏相比，即使是ADAM17的表达量同等或更低的脏器，如果因病变而导致ADAM17的表达量上升，只要是与肝脏相比其表达量变高的脏器所涉及的疾病，则上述含有HGF或其活性片段的PEG修饰体作为有效成分的药物也能够用作该疾病的治疗剂。

上述药物能够用作对哺乳动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、狗、猫、猴、牛、羊或人)、特别是对人有用的治疗药。在将上述药物用作对人有用的治疗药的情况下，上述HGF或其活性片段优选基于源自人的HGF的氨基酸序列。

作为上述药物的给药方式，可以将作为有效成分的上述HGF或其活性片段的PEG修饰体直接或者配合药物可接受的载体而口服或非口服地给药。优选通过皮下、肌肉内或静脉内注射给药。

作为上述药物的用于口服给药的剂型，可以举出例如片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂或混悬剂，它们可以通过公知的方法制造，含有制剂领域中通常使用的载体或赋形剂和根据需要的添加剂。作为片剂用的载体和赋形剂，可以举出例如乳糖、甘露糖、蔗糖、淀粉或硬脂酸镁。作为添加剂，可以举出粘合剂、崩解剂、保存剂、延迟释放剂、着色剂、风味剂、稳定剂、溶解剂、增稠剂、乳化剂等。

作为上述药物的用于非口服给药的剂型，可以举出例如注射剂、滴眼剂、软膏剂、湿布剂、栓剂、经鼻吸收剂、经肺吸收剂、经皮吸收剂或局部缓释剂，它们可以通过公知的方法制造。溶液制剂可以例如将作为有效成分的上述HGF或其活性片段的PEG修饰体在用于注射剂的无菌的水溶液中溶解或提取液中悬浮和乳化，以包埋在脂质体中的状态制备。固体制剂可以例如向作为有效成分的上述HGF或其活性片段的PEG修饰体中添加甘露醇、海藻糖、山梨糖醇、乳糖或葡萄糖等作为赋形剂，制备为冷冻干燥物。进一步，还可以将其粉体化使用。此外，还可以将这些粉体与聚乳酸、葡糖酸等混合而固体化使用。凝胶化剂例如可以将作为有效成分的上述HGF或其活性片段的PEG修饰体在丙三醇、PEG、甲基纤维素、羧基甲基纤维素、透明质酸或硫酸软骨素等增稠剂或多糖中溶解而制备。此外，根据需要，可以向制剂中添加上述添加剂。

上述药物根据患者的年龄、体重、给药对象疾病、症状、给药方式、给药路径、PEG的分子量等而适当确定，一般而言可以以0.001mg~100mg/kg/次、优选为0.01mg~10mg/kg/次、在1次/月~1次/日、优选为1次/月~1次/周的范围内给药。

上述药物为了补充或增强其治疗或预防效果、或者减少给药量，可以与其它药剂适量配合或组合使用。

作为另外的一个方式，本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体利用HGF或其活性片段的形态形成诱导作用，可以用作包含HGF或其活性片段的PEG修饰体的细胞的分化促进诱导剂。作为上述细胞，可以举出例如上皮系细胞、神经干细胞。

实施例

以下，针对本发明所涉及的HGF或其活性片段的PEG修饰体，通过实施例具体说明，但本发明不因这些例子而受到限定。

(实施例1)蛋白酶敏感性肽添加人NK1的表达：

通过人工合成制作(ファスマック公司)编码下述人NK1的DNA，并插入作为表达载体的冷休克启动子/pColdIV(タカラバイオ)中，所述人NK1是在去除了分泌信号序列的人NK1的氨基末端，将蛋白酶敏感性肽从其羧基末端起添加(作为ADAM17敏感性肽为SEQ IDNO: 9、作为凝血酶敏感性肽为SEQ ID NO: 17)，并在蛋白酶敏感性肽的氨基末端按顺序添加6×His标签和半胱氨酸残基(即，除了蛋白酶敏感性肽之外，还添加CHHHHHH(SEQ ID NO:4))而成的人NK1。将所制作的表达用质粒基因导入至作为宿主的大肠杆菌SHuffle T7Express(New England Biolabs)中。

通过同样的方法，也基因导入编码下述人NK1的DNA，所述人NK1是在去除了分泌信号序列的人NK1的羧基末端，将蛋白酶敏感性肽从其氨基末端添加(作为ADAM17敏感性肽为SEQ ID NO: 9)，在蛋白酶敏感性肽的羧基末端按顺序添加半胱氨酸残基和6×His标签(即，除了蛋白酶敏感性肽之外，还添加HHHHHHC(SEQ ID NO: 5))。以下，将除了蛋白酶敏感性肽(即、ADAM17敏感性肽或凝血酶敏感性肽)之外，还以SEQ ID NO: 4或5所示的顺序添加了6×His标签和半胱氨酸残基的人NK1统称为蛋白酶敏感性肽添加人NK1。

将上述大肠杆菌在含硫酸卡那霉素或羧苄西林的LB琼脂培养基中涂布，37℃下培养18~22小时，进行第1阶段选择培养。将所得菌落在含硫酸卡那霉素或羧苄西林的LB培养基中植菌，培养，进行第2阶段选择培养。将该培养液作为种培养液。

将种培养液在含有硫酸卡那霉素或羧苄西林、0.8%葡萄糖、0.7%丙三醇、2%细菌用胰蛋白胨、1%酪蛋白氨基酸、1%酵母提取物、100mmol/L磷酸钾、10mmol/L MgSO₄和0.5%NaCl的培养液中培养。培养中，使用玻璃烧瓶或微型发酵罐。确认培养液的浊度上升至适当的值后，在15℃以下施加冷休克。在冷休克的同时，向培养液中添加IPTG。从冷休克起1.5~3小时后结束培养，回收培养液，通过离心分离，得到表达蛋白酶敏感性肽添加人NK1的大肠杆菌沉渣。

(实施例2)蛋白酶敏感性肽添加人NK1的纯化：

从实施例1中得到的大肠杆菌沉渣，通过下述方法纯化蛋白酶敏感性肽添加人NK1。

将实施例1中获取的表达蛋白酶敏感性肽添加人NK1的大肠杆菌沉渣在50mmol/LTris-HCl、5mmol/L EDTA、150mmol/L NaCl、10mmol/L CaCl₂、10mmol/L MgCl₂中悬浮，使用高压型台式匀浆器(Niro Soavi)破碎后，通过离心分离将破碎液净化。

使进行了离心净化的大肠杆菌破碎液通过预先用PBS(-)平衡化的肝素载体(HiTrapHeparin；GEヘルスケア)，由此在肝素载体上结合蛋白酶敏感性肽添加人NK1。接着，将PBS(-)中包含的NaCl浓度在150mmol/L~2000mmol/L的浓度范围内变化的缓冲液按照NaCl浓度的升序通过，得到各洗脱级分。将各洗脱级分进行SDS电泳，确认蛋白酶敏感性肽添加人NK1洗脱级分。

接着，使在肝素树脂纯化中得到的蛋白酶敏感性肽添加人NK1洗脱级分通过预先用含300mmol/L NaCl的PBS(-)平衡化的镍载体(cOmplete(注册商标、ロシュ·ダイアグノスティックス株式会社) His-Tag Purification Resin；Roche)，由此在树脂上结合蛋白酶敏感性肽添加人NK1。接着，将向含500mM NaCl的PBS(-)中添加咪唑(0mmol/L~500mmol/L的浓度范围)而得到的缓冲液按照咪唑浓度的升序通过，得到各洗脱级分。将各洗脱级分进行SDS电泳，确认蛋白酶敏感性肽添加人NK1洗脱级分。所得蛋白酶敏感性肽添加人NK1洗脱级分使用离心式超滤设备(Amicon Ultra-15、MWCO=10000；メルクミリポア)浓缩，得到蛋白酶敏感性肽添加人NK1。

(实施例3)前药化人NK1的合成：

在1分子的蛋白酶敏感性肽添加人NK1的氨基末端的半胱氨酸残基或羧基末端的半胱氨酸残基上经由蛋白酶敏感性肽而共价键合有1分子的PEG的人NK1(以下也称为前药化人NK1)通过下述方法合成。

将通过实施例2得到的蛋白酶敏感性肽添加人NK1进行溶剂替代为含300mmol/LNaCl、2mmol/L EDTA的100mmol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)，以摩尔比达到相对于蛋白酶敏感性肽添加人NK1为40倍的方式，添加通过官能团活化的PEG。在25℃下孵育过夜，由此使蛋白酶敏感性肽添加人NK1与PEG共价键合，合成前药化人NK1。作为上述通过官能团活化的PEG，使用SUNBRIGHT GL2-400MA(2分支型、数均分子量40000、油化产业)、SUNBRIGHT ME-400MA(直链型、数均分子量40000、油化产业)和SUNBRIGHT GL4-800MA(4分支型、数均分子量80000、油化产业)。将ADAM17敏感性肽(SEQ ID NO: 9)添加于氨基末端的人NK1通过上述3种PEG进行化学修饰(以下，作为总称，记作ADAM17剪切型前药化人NK1，一并还记载修饰中使用的PEG的结构和数均分子量)。将ADAM17敏感性肽(SEQ ID NO: 9)添加于羧基末端的人NK1通过4分支型、数均分子量80000的PEG进行化学修饰。将凝血酶敏感性肽(SEQ ID NO:17)添加于氨基末端的人NK1通过2分支型、数均分子量40000的PEG进行化学修饰(以下称为凝血酶剪切型前药化人NK1)。

接着，将包含前药化人NK1的反应液用不含NaCl的PBS(-)稀释10倍后，使之通过离子交换载体(SP-Sepharose6 Fast Flow；GEヘルスケア)，从该溶液中去除未反应的官能团被活化的PEG。将吸附在离子交换载体中的前药化人NK1用含1.0mol/L NaCl的PBS(-)洗脱后，使之通过肝素载体(Heparin-Sepharose Fast Flow；GEヘルスケア)，回收通过原液，使用离心式超滤设备(Amicon Ultra-4、MWCO=30000；メルクミリポア)浓缩，得到作为目标蛋白质的前药化人NK1。

(实施例4)前药化人NK1的纯度和蛋白酶敏感性肽添加人NK1的混入率的测定：

前药化人NK1的纯度和未用PEG进行化学修饰的前体蛋白酶敏感性肽添加人NK1的混入率通过使用高效液相色谱的反相色谱测定。

在高效液相色谱(LC-10AD系统；岛津制作所)上连接反相柱(Intrada WP-RP；Imtakt)，注入实施例3中获取的ADAM17剪切型前药化人NK1(3种)。从含0.1%三氟乙酸的蒸馏水(乙腈0%)起，使乙腈比率随时间经过增加至100%，在280nm的波长下检测峰。相对于作为主峰的前药化人NK1，将相对保留时间0.65分钟附近的峰记作蛋白酶敏感性肽添加人NK1，算出前药化人NK1的纯度和蛋白酶敏感性序列添加人NK1的混入率。

其结果是，使用2分支型、数均分子量40000的PEG进行化学修饰的ADAM17剪切型前药化人NK1的纯度为98.9%(蛋白酶敏感性肽添加人NK1的混入率1.1%)。使用直链型、数均分子量40000的PEG进行化学修饰的ADAM17剪切型前药化人NK1的纯度为97.3%(蛋白酶敏感性肽添加人NK1的混入率2.7%)。使用4分支型、数均分子量80000的PEG进行化学修饰的ADAM17剪切型前药化人NK1的纯度为97.9%(蛋白酶敏感性肽添加人NK1的混入率2.1%)。因此，前药化人NK1确认到全部能够以高纯度获得。

(实施例5)肾病模型小鼠组织中的ADAM17的活性表达量的测定：

使用ADAM17活性测定试剂盒(SENSOLYTER520 TACE；ANASPEC)，测定肾病模型小鼠组织中的ADAM17的活性表达量。测定在各条件下以2例进行。

作为肾病模型小鼠，制作单侧尿管结扎模型小鼠(以下称为UUO小鼠)。将ICR系统的雄性小鼠(日本チャールスリバー)的尿管用丝纱结扎。将切开部位缝合，饲养1、7、10和14天后，摘除小鼠的肾脏和肝脏。作为未处置的小鼠(以下称为正常小鼠)，摘除饲养0天和14天后的小鼠的肾脏和肝脏。将在SENSOLYTER520 TACE(Anaspec)随附的组分C中添加0.1%Triton-X100而得到的溶剂添加至组织片，使用手持微型匀浆器(ヒストコロン)将组织破碎。破碎的组织在4℃下或在冰上静置15分钟，以4℃、2000×g进行15分钟离心分离，得到上清液。

使用Protein Assay(Bio-Rad)试剂测定离心上清液的总蛋白质量。

通过测定485nm下激发时的535nm的荧光而检测离心上清液中的ADAM17活性，算出相对于蛋白质量1μg的ADAM17活性。

结果示于图1。纵轴表示各例的相对于蛋白质量1μg的ADAM17活性。横轴的“Day0”、“Day1”、“Day7”、“Day10”和“Day14”各自表示饲养0、1、7、10、14天的小鼠的组织。“正常”表示正常小鼠，“UUO”表示UUO小鼠。

UUO小鼠和正常小鼠均在肾脏组织中示出超过肝脏组织的ADAM17活性。此外，随着尿管结扎后的天数经过，ADAM17的活性增加，因此表明在肾病进展的肾脏组织中，与肝脏组织和正常的肾脏组织相比，ADAM17活性增加。因此，表明在HGF或其活性片段的前药化中，作为其活性控制中使用的靶标分子，ADAM17是有用的。

(实施例6)肾病模型小鼠组织中的ADAM17蛋白质的表达量的测定：

通过蛋白免疫印迹法评价肾病模型小鼠组织中的ADAM17蛋白质的表达量。评价在各条件下以2例进行。

从通过与实施例5相同的方法制作的UUO小鼠和正常小鼠中，该UUO小鼠在尿管结扎的7和14天后，该正常小鼠在实施UUO小鼠的尿管结扎之日(即0天饲养)，摘除肾脏和肝脏，将在SENSOLYTE(注册商标、Anaspec)520 TACE(Anaspec)随附的组分C中添加0.1%Triton-X100而得到的溶剂添加至组织片，使用手持微型匀浆器(ヒストコロン)将组织破碎。破碎的组织在4℃下或在冰上静置15分钟，以4℃、2000×g进行15分钟离心分离，得到上清液。

使用所得上清液，进行蛋白免疫印迹。ADAM17前体和ADAM17成熟体的检测中，作为一抗使用抗-ADAM17抗体-活化位点(abcam)，作为二抗使用抗-Rab IgG-HRP(CST)，GAPDH的检测中，作为一抗使用人/小鼠/大鼠GAPDH/G3PH抗体(R & D Systems)，作为二抗使用驴抗山羊IgG-HRP(Santa Cruz)。

分析使用ChemiDoc(注册商标、バイオ·ラッドラボラトリーズ) XRS+系统(Bio-RadRAD)拍摄的图像，算出ADAM17前体或ADAM17成熟体的带强度除以GAPDH的带强度而得到的值，作为组织中的ADAM17蛋白质的表达量的指标。

结果示于图2。(a)中示出各例的蛋白免疫印迹图像，(b)中示出根据由各例的带强度算出的组织中的ADAM17蛋白质的表达量所算出的平均值。图中的“Day0”、“Day7”和“Day14”各自表示饲养0、7和14天的小鼠。“正常”表示正常小鼠，“UUO”表示UUO小鼠。(b)的纵轴表示组织中的ADAM17蛋白质的表达量。

肾脏组织中，尿管结扎后随时间经过确认到ADAM17前体蛋白质的表达量的减少和表示ADAM17活性的ADAM17成熟体蛋白质的表达量的增加。

根据这些结果，可知在肾病进展的肾脏组织中，与肝脏组织、正常的肾脏组织相比，ADAM17成熟体蛋白质的表达量增加。

根据以上，表明在HGF或其活性片段的前药化中，作为用于其活性控制的靶标分子，ADAM17是有用的。

(实施例7)前药化人NK1的利用蛋白酶处理的活性体释放的评价：

通过SDS电泳评价将前药化人NK1通过蛋白酶处理而释放的人NK1(活性体)量。

将实施例3中获取的、前药化人NK1(ADAM17剪切型前药化人NK1(3种)和凝血酶剪切型前药化人NK1(1种))使用SENSOLYTE 520 TACE(Anaspec)随附的组分C稀释10倍。ADAM17剪切型前药化人NK1中，以反应摩尔比达到前药化人NK1：ADAM17=5：1的方式添加ADAM17(TACE,His Tag,人重组；Calbiochem)。凝血酶剪切型前药化人NK1中，以反应摩尔比达到前药化人NK1：凝血酶=1：10的方式添加凝血酶(来自人血清的凝血酶；Sigma)。作为实验的对照，针对不添加对应的蛋白酶的前药化人NK1也同样进行以下的操作。在37℃下孵育1小时后，将反应液进行TCA沉淀，进行SDS电泳，确认通过CBB染色而得到带位置。

结果示于图3。图中的“-”表示未添加蛋白酶的样品，“+”表示添加蛋白酶的样品。此外，“凝血酶剪切型”表示凝血酶剪切型前药化人NK1，“ADAM17剪切型”表示ADAM17剪切型前药化人NK1。此外，分子量表示数均分子量。

表明通过将前药化人NK1各自用对应的蛋白酶(ADAM17或凝血酶)处理，各前药化人NK1中包含的蛋白酶敏感性肽被剪切，作为活性体的人NK1被释放。

(实施例8)因将NK1通过PEG进行化学修饰而导致的活性减弱的评价：

将ADAM17剪切型前药化人NK1的HGF活性的减弱的程度以在人肺上皮细胞株A549的细胞表面存在的HGF受体的磷酸化诱导量作为指标，通过细胞内ELISA法来评价。

将A549细胞悬浮在含10%FCS的MEM培养基(ナカライテスク)中，在成像用96孔板(ベクトン·ディッキンソン)中以1.5×10⁴/孔的密度接种，培养一昼夜。细胞达到70%汇合程度后，将培养基交换为不含血清的MEM培养基(ナカライテスク)，培养16小时以上，由此制成血清饥饿状态。向处于血清饥饿状态的细胞，添加在实施例7中进行了ADAM17处理的前药化人NK1或未进行ADAM17处理的前药化人NK1，在37℃下反应10分钟。本实施例中，作为前药化人NK1，使用实施例3中获取的利用氨基末端修饰的ADAM17剪切型前药化NK1(3种)。

将细胞通过含4%甲醛的PBS(-)固定，接着，通过含0.3%Triton-X和0.6%过氧化氢的PBS(-)将细胞膜进行透化处理后，通过10%BSA将细胞进行封闭处理。向封闭处理后的细胞，添加作为一抗的抗-pYcMet(CST)、作为二抗的抗-Rab IgG-HRP(CST)而反应后，添加1×QuantaRed增强化学荧光HRP底物(サーモフィッシャーサイエンティフィック)。在室温下孵育后，使用读板仪(Envision；パーキンエルマー)测定波长590nm下的荧光强度(RFU)，记作HGF受体磷酸化诱导量。

根据所得HGF受体磷酸化诱导量，使用Prism4(GraphPad、4参数近似)算出未进行ADAM17处理的样品的浓度反应曲线的EC50。接着，作为利用PEG修饰的HGF活性减弱的程度，算出未进行ADAM17处理的样品的EC50(nM)除以与未进行ADAM17处理的样品的EC50值达到相同信号强度的进行了ADAM17处理的样品的浓度(nM)而得到的值(活性变动值(以下记作y))。

接着，使用ChemiDoc XRS+系统(Bio-Rad)分析实施例7中得到的CBB染色图像，根据带强度，按照下述式(1)算出进行了ADAM17处理的前药化人NK1的剪切效率(以下记作w)。此外，使用实施例4中得到的前药化NK1的纯度(%、以下记作v)，通过下述式(2)~(5)，各自定义蛋白酶敏感性肽添加人NK1(即因纯化不良而未添加ADAM17的样品中包含的前体)的HGF活性(以下记作preNK1)、前药化人NK1的HGF活性(以下记作Pro)、通过添加了ADAM17的样品中包含的ADAM17而剪切的前药化人NK1的HGF活性(以下记作Pro·cut)、和未通过ADAM17剪切的(即剪切残余)前药化人NK1的HGF活性(以下记作Pro·noncut)。此时，将蛋白酶敏感性肽添加人NK1的活性记作100时的前药化NK1的相对活性(%)表示为x(代数)。

前药化人NK1的剪切效率(%、w)=100-(添加了ADAM17的样品的前药化人NK1的带强度/未添加ADAM17的样品的前药化人NK1的带强度)×100 ···式(1)

未添加ADAM17的样品中包含的蛋白酶敏感性肽添加人NK1的活性(preNK1)=(100-v)/100×1 ···式(2)

未添加ADAM17的样品中包含的前药化人NK1的活性(Pro)=(v/100)×(x/100)···式(3)

添加了ADAM17的样品中包含的经剪切的前药化人NK1的活性(Pro·cut)=(v/100)×(w/100)×1 ···式(4)

添加了ADAM17的样品中包含的未剪切的前药化人NK1的活性(Pro·noncut)=(v/100)×(100-w)/100×(x/100) ···式(5)

在此，前述活性变动值(y)使用通过式(1)~(5)定义的式，可以如式(6)那样表述。

活性变动值(y)=(preNK1+Pro·cut+Pro·noncut)/(preNK1+Pro) ···式(6)

针对代数x解出式(6)，由此得到以下的式(7)。式(7)中代入v、w和y的实测值，由此算出前药化NK1的相对活性(%)x。

x={10⁴×(100-v)+10²×v×w-10⁴×y×(100-v)}/{v×(10²×y)-v×(100-w)}···式(7)

结果示于图4。纵轴示出表示HGF受体磷酸化诱导量的荧光强度(RFU)，横轴示出前药化人NK1的处理浓度(nmol/L)。图中的“ADAM17-”表示未进行ADAM17处理的前药化人NK1的样品，“ADAM17+”表示进行了ADAM17处理的前药化人NK1的样品。此外，“ADAM17剪切型”表示ADAM17剪切型前药化人NK1。此外，分子量表示数均分子量。

所有使用PEG进行化学修饰的ADAM17剪切型前药化人NK1中，在未进行ADAM17处理的前药化人NK1(ADAM17-)中与进行了ADAM17处理的前药化人NK1(ADAM17+)相比活性均低，表明通过用PEG进行化学修饰，HGF活性减弱。此外，与未用PEG进行化学修饰的蛋白酶敏感性肽添加人NK1相比，使用2分支型、数均分子量40000的PEG进行化学修饰的ADAM17剪切型前药化人NK1的HGF活性减弱80.1%，使用直链型、数均分子量40000的PEG进行化学修饰的ADAM17剪切型前药化NK1的HGF活性减弱70.7%，使用4分支型、数均分子量80000的PEG进行化学修饰的ADAM17剪切型前药化NK1的HGF活性减弱97.1%。3种PEG之中，使用4分支型、数均分子量80000的PEG进行化学修饰的前药化人NK1的HGF活性最为减弱，其HGF活性为通过ADAM17处理而释放的人NK1的30分之1。

(实施例9)组织选择性的活性体从前药化人NK1的释放的评价：

使前药化人NK1暴露于组织破碎液，通过SDS电泳评价所释放的人NK1(活性体)量。本实施例中，使用实施例3中获取的使用4分支型、数均分子量80000的PEG进行修饰的氨基末端修饰ADAM17剪切型前药化人NK1。评价在各条件下以2例或3例进行。

使用C57BL/6J系统的雄性小鼠(日本チャールスリバー)，通过与实施例5相同的方法制作UUO小鼠。尿管结扎，饲养16天后，各自摘除UUO小鼠和正常小鼠的肾脏和肝脏。

向摘除的小鼠的肾脏和肝脏中，各自添加pH7的含有50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L CaCl₂和0.05%Brij35的缓冲液，通过与实施例6相同的方法，得到组织破碎液的上清液。使用Protein Assay(Bio-Rad)，测定组织破碎液的上清液中的蛋白质量。

向各个组织破碎液的上清液中，添加ADAM17剪切型前药化人NK1，在37℃下孵育30分钟。

使用所孵育的试样，进行蛋白免疫印迹。作为一抗，使用HGFα(B-3)小鼠单克隆IgG(Santa Cruz)，作为二抗，使用过氧化物酶缀合AffiniPure驴抗-小鼠 IgG(Jackson)。应予说明，前药化NK1的带无法通过该方法检测，因此检测从前药化人NK1中包含的蛋白酶敏感性肽添加人NK1(即因纯化不良而混入的前体)和ADAM17剪切型前药化人NK1释放的人NK1的带，作为评价的指标。

各例的蛋白免疫印迹图像示于图5。与肾破碎液混合的ADAM17剪切型前药化人NK1的样品中，检测到作为活性体的人NK1的带，其带强度与前药化人NK1中包含的蛋白酶敏感性肽添加人NK1(即因纯化不良而混入的前体)相比更强，因此表明是从前药化人NK1释放的活性体。此外，ADAM17活性高的UUO肾破碎液中，人NK1的带强度更强，因此表明更多的人NK1被释放。与此相对地，与肝破碎液混合的ADAM17剪切型前药化人NK1中，未检测到作为活性体的人NK1的带。因此表明ADAM17剪切型前药化人NK1肾脏组织选择性地释放作为活性体的人NK1。

根据以上，ADAM17剪切型前药化人NK1在肝脏组织中HGF活性减少，在ADAM17高表达的肾脏组织中显示超过肝脏组织的HGF活性，表明能够期待在肾脏组织中的药效，同时能够减少在肝脏组织中的副作用。

(实施例10)前药化人NK1的体内的活性测定：

体内的ADAM17剪切型前药化人NK1的组织选择性的c-Met的磷酸化诱导量通过使用给药了ADAM17剪切型前药化人NK1或蛋白酶(ADAM17)敏感性肽添加人NK1的小鼠的组织破碎液的蛋白免疫印迹法来评价。本实施例中，使用实施例3中获取的使用2分支型、数均分子量40000的PEG进行化学修饰的氨基末端修饰ADAM17剪切型前药化人NK1、和实施例2中获取的蛋白酶(ADAM17)敏感性肽添加人NK1。

通过与实施例5相同的方法制作UUO小鼠，从尿管结扎起14天后，将蛋白酶(ADAM17)敏感性肽添加人NK1(PEG未修饰)或PEG为2分支型、数均分子量40000的前药化人NK1以400μg/kg的剂量从尾静脉给药。作为实验的对照，针对给药了前药化人NK1的溶剂(含0.3mol/L NaCl的PBS(-))的正常小鼠和UUO小鼠，也同样进行以下的操作。从给药起0.18小时后，从小鼠摘除肾脏和肝脏。

将小鼠的肾脏和肝脏使用台式型多样本细胞破碎装置(シェイクマスターネオ；バイオメディカルサイエンス)各自破碎，加入添加了磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液，在冰上静置2小时后，通过离心分离得到上清液，通过与实施例8相同的方法，测定蛋白质量。

使用上清液，进行蛋白免疫印迹。在总c-Met的检测中，作为一抗。使用抗-总cMet(CST)，作为二抗，使用抗-Ms IgG-HRP(Jackson)，磷酸化c-Met的检测中，作为一抗，使用抗-pYcMet(CST)，作为二抗，使用抗-Rab IgG-HRP(CST)。

分析使用ChemiDoc XRS+系统(Bio-RadRAD)拍摄的图像，算出磷酸化c-Met的带强度除以总c-Met的带强度得到的值。根据算出的值，算出UUO小鼠溶剂给药组的肾脏中的值记作1时的相对值，作为HGF受体磷酸化诱导量，记作评价的指标。

结果示于图6。纵轴示出HGF受体磷酸化诱导量的值。横轴的“正常+溶剂”示出对正常小鼠的溶剂给药组，“UUO+溶剂”示出对UUO小鼠的溶剂给药组，“UUO+蛋白酶敏感性肽添加人NK1”示出对UUO小鼠的蛋白酶敏感性肽添加人NK1给药组，“UUO+前药化人NK1”示出对UUO小鼠的前药化人NK1给药组。

UUO小鼠的肾脏组织中，蛋白酶敏感性肽添加人NK1给药组和前药化人NK1给药组的HGF受体磷酸化诱导量同等，与此相对地，肝脏组织中，前药化人NK1的HGF受体磷酸化诱导量与蛋白酶敏感性肽添加人NK1相比减弱69%。因此，前药化人NK1在生物体内靶标疾病组织(即，作为ADAM17高表达组织的肾脏)选择性地发挥生理活性，表明蛋白酶敏感性肽添加人NK1原本具有的肝趋向性减少。

(实施例11)基于PEG修饰部位差异的前药化人NK1的活性控制的比较：

以在人肺上皮细胞株A549的细胞表面存在的HGF受体的磷酸化诱导量作为指标，通过细胞内ELISA法评价由于对实施例2中获取的在氨基末端添加有ADAM17敏感性肽的蛋白酶敏感性肽添加人NK1进行PEG修饰的位置差异而导致的对HGF活性控制的影响。本实施例中，使用实施例3中获取的将人NK1的氨基末端经由ADAM17敏感性肽(SEQ ID NO: 9)而利用2分支型、数均分子量40000的PEG进行化学修饰的ADAM17剪切型前药化人NK1(以下、氨基末端修饰前药化人NK1)；以及实施例3中获取的将人NK1的羧基末端经由ADAM17敏感性肽(SEQ ID NO: 9)而利用2分支型、数均分子量40000的PEG进行化学修饰的ADAM17剪切型前药化人NK1(以下称为羧基末端修饰前药化人NK1)。

将A549细胞悬浮于含10%FCS的MEM培养基(ナカライテスク)中，在成像用96孔板(ベクトン·ディッキンソン)中以1.5×10⁴/孔的密度接种，培养一昼夜。细胞达到70%汇合程度后，将培养基交换为不含血清的MEM培养基(ナカライテスク)，培养16小时以上，由此制成血清饥饿状态。向处于血清饥饿状态的细胞中，添加前药化人NK1或蛋白酶敏感性肽添加人NK1，在37℃下反应10分钟。

根据所得HGF受体磷酸化诱导量，对于人NK1的氨基末端或羧基末端添加有蛋白酶敏感性肽和PEG的前药化人NK1各自，算出以未进行PEG修饰的蛋白酶敏感性肽添加人NK1的值记作100时的相对值。

结果示于图7。纵轴表示HGF受体磷酸化诱导量的值，表示以利用蛋白酶敏感性肽添加人NK1进行处置时的值记作100时的相对值。图例的“氨基末端修饰”表示在人NK1的氨基末端添加有蛋白酶敏感性肽和PEG的样品，“羧基末端修饰”表示在人NK1的羧基末端添加有蛋白酶敏感性肽和PEG的样品。

对于前药化人NK1的HGF受体磷酸化诱导量(相对值)，氨基末端修饰前药化人NK1为41，与此相对地，羧基末端修饰前药化人NK1为58，氨基末端修饰前药化人NK1与羧基末端修饰前药化人NK1相比，因利用PEG的化学修饰而导致活性进一步减弱。因此表明本发明的HGF或其活性片段的PEG修饰体在HGF或其活性片段的氨基末端进行修饰的情况能够进一步减弱其活性

工业实用性

本发明的肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰体能够靶标疾病组织选择性地释放肝细胞生长因子或其活性片段，因此能够用作在靶标疾病组织中显示高活性、另一方面源自肝细胞生长因子或其活性片段的在肝脏组织中的副作用减少的药物。

序列表独立文本

SEQ ID NO: 1：不含分泌信号序列的人HGF的氨基酸序列

SEQ ID NO: 2：不含分泌信号序列的人NK1的氨基酸序列

SEQ ID NO: 3：源自人HGF的分泌信号序列

SEQ ID NO: 4：在人NK1的氨基末端添加的半胱氨酸残基和6×His标签的氨基酸序列

SEQ ID NO: 5：在人NK1的羧基末端添加的6×His标签和半胱氨酸残基的氨基酸序列

SEQ ID NO: 6：人HGF基因的碱基序列

SEQ ID NO: 7：人HGF的氨基酸序列

SEQ ID NO: 8~16：ADAM17敏感性肽的氨基酸序列

SEQ ID NO: 17~20：凝血酶敏感性肽的氨基酸序列。

序列表

<110> TORAY INDUSTRIES, INC.

<120> 肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰体

<130> 19317WO01

<160> 20

<170> PatentIn 3.5 版本

<210> 1

<211> 697

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 不具有分泌信号序列的人HGF氨基酸序列

<400> 1

Gln Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys

1 5 10 15

Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys

20 25 30

Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly

35 40 45

Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln

50 55 60

Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu

65 70 75 80

Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn

85 90 95

Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr

100 105 110

Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu

115 120 125

His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn

130 135 140

Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr

145 150 155 160

Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser

165 170 175

Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met

180 185 190

Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr

195 200 205

Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe

210 215 220

Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys

225 230 235 240

Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr

245 250 255

Cys Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr

260 265 270

Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr

275 280 285

Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His

290 295 300

Glu His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu

305 310 315 320

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr

325 330 335

Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys

340 345 350

Asp Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr

355 360 365

Met Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp

370 375 380

Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp

385 390 395 400

Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala

405 410 415

His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr

420 425 430

Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn

435 440 445

Leu Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val

450 455 460

Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu

465 470 475 480

Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser

485 490 495

Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp

500 505 510

Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu

515 520 525

Lys Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu

530 535 540

Gly Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp

545 550 555 560

Asp Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro

565 570 575

Glu Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile

580 585 590

Asn Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn

595 600 605

Glu Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser

610 615 620

Glu Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly

625 630 635 640

Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val

645 650 655

Leu Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro

660 665 670

Gly Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile

675 680 685

Ile Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser

690 695

<210> 2

<211> 179

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 不具有分泌信号序列的人NK1氨基酸序列

<400> 2

Gln Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys

1 5 10 15

Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys

20 25 30

Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly

35 40 45

Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln

50 55 60

Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu

65 70 75 80

Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn

85 90 95

Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr

100 105 110

Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu

115 120 125

His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn

130 135 140

Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr

145 150 155 160

Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser

165 170 175

Glu Val Glu

<210> 3

<211> 31

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 源自人HGF的分泌信号序列

<400> 3

Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu

1 5 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly

20 25 30

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 在人NK1蛋白的氨基末端添加的半胱氨酸残基和6×His标签的氨基酸序列

<400> 4

Cys His His His His His His

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 在人NK1蛋白的羧基末端添加的6×His标签和半胱氨酸残基的氨基酸序列

<400> 5

His His His His His His Cys

1 5

<210> 6

<211> 2576

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (102)..(2288)

<400> 6

gggctcagag ccgactggct cttttaggca ctgactccga acaggattct ttcacccagg 60

catctcctcc agagggatcc gccagcccgt ccagcagcac c atg tgg gtg acc aaa 116

Met Trp Val Thr Lys

1 5

ctc ctg cca gcc ctg ctg ctg cag cat gtc ctc ctg cat ctc ctc ctg 164

Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu Leu His Leu Leu Leu

10 15 20

ctc ccc atc gcc atc ccc tat gca gag gga caa agg aaa aga aga aat 212

Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln Arg Lys Arg Arg Asn

25 30 35

aca att cat gaa ttc aaa aaa tca gca aag act acc cta atc aaa ata 260

Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr Thr Leu Ile Lys Ile

40 45 50

gat cca gca ctg aag ata aaa acc aaa aaa gtg aat act gca gac caa 308

Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val Asn Thr Ala Asp Gln

55 60 65

tgt gct aat aga tgt act agg aat aaa gga ctt cca ttc act tgc aag 356

Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu Pro Phe Thr Cys Lys

70 75 80 85

gct ttt gtt ttt gat aaa gca aga aaa caa tgc ctc tgg ttc ccc ttc 404

Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys Leu Trp Phe Pro Phe

90 95 100

aat agc atg tca agt gga gtg aaa aaa gaa ttt ggc cat gaa ttt gac 452

Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe Gly His Glu Phe Asp

105 110 115

ctc tat gaa aac aaa gac tac att aga aac tgc atc att ggt aaa gga 500

Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly

120 125 130

cgc agc tac aag gga aca gta tct atc act aag agt ggc atc aaa tgt 548

Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys

135 140 145

cag ccc tgg agt tcc atg ata cca cac gaa cac agc ttt ttg cct tcg 596

Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His Ser Phe Leu Pro Ser

150 155 160 165

agc tat cgg ggt aaa gac cta cag gaa aac tac tgt cga aat cct cga 644

Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg

170 175 180

ggg gaa gaa ggg gga ccc tgg tgt ttc aca agc aat cca gag gta cgc 692

Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg

185 190 195

tac gaa gtc tgt gac att cct cag tgt tca gaa gtt gaa tgc atg acc 740

Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr

200 205 210

tgc aat ggg gag agt tat cga ggt ctc atg gat cat aca gaa tca ggc 788

Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly

215 220 225

aag att tgt cag cgc tgg gat cat cag aca cca cac cgg cac aaa ttc 836

Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe

230 235 240 245

ttg cct gaa aga tat ccc gac aag ggc ttt gat gat aat tat tgc cgc 884

Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg

250 255 260

aat ccc gat ggc cag ccg agg cca tgg tgc tat act ctt gac cct cac 932

Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His

265 270 275

acc cgc tgg gag tac tgt gca att aaa aca tgc gct gac aat act atg 980

Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met

280 285 290

aat gac act gat gtt cct ttg gaa aca act gaa tgc atc caa ggt caa 1028

Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln

295 300 305

gga gaa ggc tac agg ggc act gtc aat acc att tgg aat gga att cca 1076

Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro

310 315 320 325

tgt cag cgt tgg gat tct cag tat cct cac gag cat gac atg act cct 1124

Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro

330 335 340

gaa aat ttc aag tgc aag gac cta cga gaa aat tac tgc cga aat cca 1172

Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro

345 350 355

gat ggg tct gaa tca ccc tgg tgt ttt acc act gat cca aac atc cga 1220

Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg

360 365 370

gtt ggc tac tgc tcc caa att cca aac tgt gat atg tca cat gga caa 1268

Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln

375 380 385

gat tgt tat cgt ggg aat ggc aaa aat tat atg ggc aac tta tcc caa 1316

Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln

390 395 400 405

aca aga tct gga cta aca tgt tca atg tgg gac aag aac atg gaa gac 1364

Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp

410 415 420

tta cat cgt cat atc ttc tgg gaa cca gat gca agt aag ctg aat gag 1412

Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu

425 430 435

aat tac tgc cga aat cca gat gat gat gct cat gga ccc tgg tgc tac 1460

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr

440 445 450

acg gga aat cca ctc att cct tgg gat tat tgc cct att tct cgt tgt 1508

Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys

455 460 465

gaa ggt gat acc aca cct aca ata gtc aat tta gac cat ccc gta ata 1556

Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile

470 475 480 485

tct tgt gcc aaa acg aaa caa ttg cga gtt gta aat ggg att cca aca 1604

Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr

490 495 500

cga aca aac ata gga tgg atg gtt agt ttg aga tac aga aat aaa cat 1652

Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His

505 510 515

atc tgc gga gga tca ttg ata aag gag agt tgg gtt ctt act gca cga 1700

Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg

520 525 530

cag tgt ttc cct tct cga gac ttg aaa gat tat gaa gct tgg ctt gga 1748

Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly

535 540 545

att cat gat gtc cac gga aga gga gat gag aaa tgc aaa cag gtt ctc 1796

Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu

550 555 560 565

aat gtt tcc cag ctg gta tat ggc cct gaa gga tca gat ctg gtt tta 1844

Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu

570 575 580

atg aag ctt gcc agg cct gct gtc ctg gat gat ttt gtt agt acg att 1892

Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile

585 590 595

gat tta cct aat tat gga tgc aca att cct gaa aag acc agt tgc agt 1940

Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser

600 605 610

gtt tat ggc tgg ggc tac act gga ttg atc aac tat gat ggc cta tta 1988

Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu

615 620 625

cga gtg gca cat ctc tat ata atg gga aat gag aaa tgc agc cag cat 2036

Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His

630 635 640 645

cat cga ggg aag gtg act ctg aat gag tct gaa ata tgt gct ggg gct 2084

His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala

650 655 660

gaa aag att gga tca gga cca tgt gag ggg gat tat ggt ggc cca ctt 2132

Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu

665 670 675

gtt tgt gag caa cat aaa atg aga atg gtt ctt ggt gtc att gtt cct 2180

Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro

680 685 690

ggt cgt gga tgt gcc att cca aat cgt cct ggt att ttt gtc cga gta 2228

Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val

695 700 705

gca tat tat gca aaa tgg ata cac aaa att att tta aca tat aag gta 2276

Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val

710 715 720 725

cca cag tca tag ctgaagtaag tgtgtctgaa gcacccacca atacaactgt 2328

Pro Gln Ser

cttttacatg aagatttcag agaatgtgga atttaaaatg tcacttacaa caatcctaag 2388

acaactactg gagagtcatg tttgttgaaa ttctcattaa tgtttatggg tgttttctgt 2448

tgttttgttt gtcagtgtta ttttgtcaat gttgaagtga attaaggtac atgcaagtgt 2508

aataacatat ctcctgaaga tacttgaatg gattaaaaaa acacacaggt atatttgctg 2568

gatgataa 2576

<210> 7

<211> 728

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu

1 5 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln

20 25 30

Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr

35 40 45

Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val

50 55 60

Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu

65 70 75 80

Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys

85 90 95

Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe

100 105 110

Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys

115 120 125

Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys

130 135 140

Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His

145 150 155 160

Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr

165 170 175

Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser

180 185 190

Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu

195 200 205

Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp

210 215 220

His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro

225 230 235 240

His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp

245 250 255

Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr

260 265 270

Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys

275 280 285

Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu

290 295 300

Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile

305 310 315 320

Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu

325 330 335

His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn

340 345 350

Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr

355 360 365

Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp

370 375 380

Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met

385 390 395 400

Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp

405 410 415

Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala

420 425 430

Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His

435 440 445

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys

450 455 460

Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu

465 470 475 480

Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val

485 490 495

Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg

500 505 510

Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp

515 520 525

Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr

530 535 540

Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys

545 550 555 560

Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly

565 570 575

Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp

580 585 590

Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu

595 600 605

Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn

610 615 620

Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu

625 630 635 640

Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu

645 650 655

Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp

660 665 670

Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu

675 680 685

Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly

690 695 700

Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile

705 710 715 720

Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工的 ADAM-17可剪切序列

<400> 9

Pro Arg Ala Ala Ala Val Lys Ser Pro

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Gln Glu Thr Asn Arg Ser Phe Ser Lys

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Pro Arg Val Ala Gln Val Ser Ile Thr

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Pro Val Ala Ala Ala Val Val Ser His

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Ala Asp Leu Leu Ala Val Val Ala Ala

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> SEQ No.9的变体序列1

<400> 14

Pro Arg Ala Ala Ala Leu Lys Ser Pro

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> SEQ No.9的变体序列2

<400> 15

Pro Arg Ala Ala Ala Tyr Lys Ser Pro

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> SEQ No.9的变体序列3

<400> 16

Pro Arg Ala Ala Ala Ala Lys Ser Pro

1 5

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工的凝血酶可剪切序列

<400> 17

Thr Phe Leu Thr Pro Arg Gly Val Arg Leu Gly

1 5 10

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 人工的凝血酶可剪切序列

<400> 18

Thr Phe Pro Pro Arg Ser Phe Leu Gly

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 源自人凝血酶原的凝血酶可剪切序列

<400> 19

Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 源自人HGFA的凝血酶可剪切序列

<400> 20

Leu Arg Pro Arg Ile Ile Gly Gly

1 5

Claims

1.肝细胞生长因子或其活性片段的聚乙二醇修饰体，其在肝细胞生长因子或其活性片段的末端经由蛋白酶敏感性肽键合有聚乙二醇。

2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰体，其中，前述蛋白酶敏感性肽为ADAM17敏感性肽或凝血酶敏感性肽。

3.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰体，其中，前述蛋白酶敏感性肽为序列表的SEQID NO：8~20的任一项所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1~3中任一项所述的聚乙二醇修饰体，其中，前述聚乙二醇的数均分子量为20000~100000。

5.根据权利要求1~4中任一项所述的聚乙二醇修饰体，其中，前述肝细胞生长因子的活性片段为NK1。

6.根据权利要求1~5中任一项所述的聚乙二醇修饰体，其中，前述肝细胞生长因子的活性片段为序列表的SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。

7.药物，其含有权利要求1~6中任一项所述的聚乙二醇修饰体作为有效成分。