KR20130010461A - Ｉｌ―２３에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질 - Google Patents

Ｉｌ―２３에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인터류킨 23 (IL-23), 구체적으로 IL-23의 p19 하위단위에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 자가면역 질환을 치료하기 위한 치료 용도에서 본 발명의 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 단백질을 포함하는 세포, 상기 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

Description

ＩＬ―２３에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질{FIBRONECTIN BASED SCAFFOLD DOMAIN PROTEINS THAT BIND IL-23}
본 발명은 인터류킨 23 (IL-23), 구체적으로 IL-23의 p19 하위단위에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 자가면역 질환을 치료하기 위한 치료 용도에서 본 발명의 단백질의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 상기 단백질을 포함하는 세포, 상기 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
IL-23은 IL-12 이종이량체성 시토카인 패밀리의 구성원이다. 이는 p40 하위단위 (IL-12에 공통됨) 및 특유한 p19 하위단위를 함유한다. IL-23은 IL-12Rβ1 및 IL-23R로 이루어지는 이종이량체성 수용체 복합체를 통해 신호를 보낸다 (Aggarwal, S et al., "Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17", J. Biol. Chem., 278: 1910-1914 (2003)). IL-23은 만성 염증성 장애, 예컨대 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선 및 크론(Crohn) 질환의 치료를 위한 잠재적인 표적이다.
피브로넥틴 기반 스캐폴드는 관심있는 임의의 화합물에 결합하도록 진화할 수 있는 단백질의 패밀리이다. 이들 단백질 (이는 일반적으로 피브로넥틴 타입 III (Fn3) 또는 Fn3-유사 도메인으로부터 유래한 스캐폴드를 이용한다)은 천연 또는 조작된 항체 (즉, 폴리클로날, 모노클로날, 또는 단일쇄 항체)의 특징적인 방식으로 기능하고, 추가로 구조적 이점을 가진다. 구체적으로, 이들 항체 모방체의 구조는 정상적으로 항체에서 구조 및 기능의 손실을 일으키는 조건 하에서도 최적 폴딩, 안정성, 및 용해도를 위해 설계되었다. 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질의 한 예는 애드넥틴(Adnectin) (애드넥서스(Adnexus), 브리스톨-마이어스 스퀴브 알앤디 컴퍼니(Bristol-Myers Squibb R&D Company)의 자회사)이다.
피브로넥틴 타입 III (Fn3) 도메인은 N-말단에서 C-말단의 순서로 베타 또는 베타-유사 가닥, A; 루프 AB; 베타 또는 베타-유사 가닥, B; 루프 BC; 베타 또는 베타-유사 가닥 C; 루프 CD; 베타 또는 베타-유사 가닥 D; 루프 DE; 베타 또는 베타-유사 가닥, E; 루프 EF; 베타 또는 베타-유사 가닥 F; 루프 FG; 및 베타 또는 베타-유사 가닥 G를 포함한다. 임의의 또는 모든 루프 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG는 표적 결합에 참여할 수 있다. BC, DE, 및 FG 루프는 이뮤노글로불린으로부터의 상보성 결정 영역 (CDR)과 구조상 및 기능상 모두 유사하다. 미국 특허 번호 7,115,396에서는 BC, DE, 및 FG 루프에 대한 변경이 고친화도 TNFα 바인더를 생성시키는 Fn3 도메인 단백질을 설명하고 있다. 미국 특허 공개 2007/0148126에서는 BC, DE, 및 FG 루프에 대한 변경이 고친화도 VEGFR2 바인더를 생성시키는 Fn3 도메인 단백질을 설명하고 있다.
자가면역 장애의 치료 목적의 처치를 위해 개선된 피브로넥틴 도메인 스캐폴드 단백질을 얻는 것이 유리할 것이다. 인터류킨 17을 생산하는 효과기 T 세포의 하위세트 (IL-17; "Th17 세포")는 고도로 전염증성이고 중증 자가면역성을 유도한다. Th17 세포는 IL-6, 종양 괴사 인자 (TNF), IL-22, IL-17A 및 IL-17F뿐만 아니라 케모킨 수용체 CCR6을 비롯하여, Th1 및 Th2 세포에 비해 뚜렷이 다른 하위세트의 시토카인 및 케모카인을 발현한다. IL-23은 활성화된 T 세포에 의한 IL-17의 생산을 촉진하고 (Aggarwal, S et al., "Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17", J. Biol. Chem., 278: 1910-1914 (2003)), IL-17-생산 CD4+ T 세포의 팽창을 유도하기 위한 핵심 시토카인이다. IL-23에 대한 노출이 Th17 세포의 병원성을 결정하는 핵심 특징으로 보인다.
발명의 개요
본원은 인간 IL-23-특이적 p19 하위단위에 대해 작용성인 애드넥틴™을 제공한다. 본 발명의 한 측면은 하나 이상의 용매 접근가능 루프가 무작위화되거나 돌연변이된 Fn3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, Fn3 도메인은 인간 피브로넥틴 타입 III 도메인의 야생형 제10 모듈 (10Fn3)로부터 유래하는 Fn3 도메인이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 10Fn3 폴리펩티드는 인간 10Fn3 도메인과 적어도 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 동일하다.
일부 실시양태에서, BC, DE, 및 FG로부터 선택된 하나 이상의 루프는 상응하는 인간 피브로넥틴 루프에 비해 길이가 연장되거나 단축될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 제10 피브로넥틴 타입 III (10Fn3) 도메인을 포함하고, 여기서 10Fn3 도메인은 루프 AB; 루프 BC; 루프 CD; 루프 DE; 루프 EF; 및 루프 FG를 포함하고; 인간 10Fn3 도메인의 상응하는 루프의 서열에 비해 변경된 아미노산 서열을 갖는, 루프 BC, DE, 및 FG로부터 선택된 적어도 하나의 루프를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 비-루프 영역에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Fn3 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 BC 루프는 서열 2-6으로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 DE 루프는 서열 7-48로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 FG 루프는 서열 49-59로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로 시작하고/하거나 끝날 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 서열 2-6에 제시된 BC 루프 서열, 서열 7-48에 제시된 하나의 DE 루프 서열 및 서열 49-59에 제시된 하나의 FG 루프 서열로부터의 하나의 루프 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 서열 2-59 중 임의의 하나에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 동일한 BC, DE 및 FG 루프 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-IL-23 애드넥틴은 서열 60-100의 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-IL-23 애드넥틴은 서열 60-100 중 임의의 하나의 위치 3-96으로부터 Fn3 도메인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-IL-23 애드넥틴은 서열 60-100 중 임의의 하나에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 항-IL-23 애드넥틴은 약동학적 (PK) 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, PK 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
한 측면에서, 본원은 자가면역 질환의 치료에서 유용한 항-IL-23 애드넥틴을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 피브로넥틴 타입 III 제10 (10Fn3) 도메인 및 항-IL-23 애드넥틴을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 10Fn3 도메인은 1 μM 이하의 Kd로 HSA에 결합한다. 특정 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 서열 103에 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 서열 104에 제시된 아미노산 서열을 갖는 BC 루프, 서열 105에 제시된 아미노산 서열을 갖는 DE 루프, 및 서열 106에 제시된 아미노산 서열을 갖는 FG 루프를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 서열 104에 제시된 아미노산 서열을 갖는 BC 루프, 서열 105에 제시된 아미노산 서열을 갖는 DE 루프, 및 서열 106에 제시된 아미노산 서열을 갖는 FG 루프 중 하나 이상을 포함한다.
한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드의 10Fn3 도메인은 또한 붉은털원숭이 혈청 알부민 (RhSA), 사이노몰거스 원숭이 혈청 알부민 (CySA), 또는 뮤린 혈청 알부민 (MuSA) 중 하나 이상에 결합한다. 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 RhSA, CySA 또는 MuSA 중 하나 이상과 교차반응하지 않는다.
특정 실시양태에서, 융합 폴리펩티드의 10Fn3 도메인은 1 μM 이하의 Kd로 HSA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 500 nM 이하의 Kd로 HSA에 결합한다. 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 적어도 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 또는 5 nM의 Kd로 HSA에 결합한다.
다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드의 10Fn3 도메인은 HSA의 도메인 I 또는 II에 결합한다. 한 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 HSA의 도메인 I 및 II 모두에 결합한다. 일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 5.5 내지 7.4의 pH 범위에서 HSA에 결합한다. 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 pH 5.5에서 200 nM 이하의 Kd로 HSA에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 5.5 내지 7.4의 pH 범위에서 적어도 500 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 또는 5 nM의 Kd로 HSA에 결합한다. 한 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 pH 5.5에서 적어도 500 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, 또는 5 nM의 Kd로 HSA에 결합한다.
일부 실시양태에서, 혈청 알부민의 존재 하에 융합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 혈청 알부민의 부재 하에 폴리펩티드의 혈청 반감기보다 적어도 5배 더 크다. 특정 실시양태에서, 혈청 알부민의 존재 하에 융합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 혈청 알부민의 부재 하에 폴리펩티드의 혈청 반감기보다 적어도 2배, 5배, 7배, 10배, 12배, 15배, 20배, 22배, 25배, 27배, 또는 30배 더 크다. 일부 실시양태에서, 혈청 알부민은 HSA, RhSA, CySA, 또는 MuSA 중 임의의 하나이다.
특정 실시양태에서, 혈청 알부민의 존재 하에 융합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 적어도 20시간이다. 특정 실시양태에서, 혈청 알부민의 존재 하에 융합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 적어도 10시간, 12시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 40시간, 50시간, 75시간, 90시간, 100시간, 110시간, 120시간, 130시간, 150시간, 170시간, 또는 200시간이다. 일부 실시양태에서, 융합 폴리펩티드의 이러한 반감기는 영장류 (예를 들어, 인간 또는 원숭이) 또는 뮤린에서 관찰된다.
임의의 상기한 측면 및 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 서열 107, 111, 115, 119, 및 123-143 중에서 선택된 서열을 포함한다.
도 1a-f는 본 발명의 항-IL23 애드넥틴의 전장 DNA 서열 정렬을 보여준다.
도 2는 실시예 2에 설명된 바와 같은 pBMS2008/ATI001044 단백질 발현 벡터를 보여준다.
도 3은 본 발명의 항-IL23 애드넥틴의 전장 아미노산 서열 정렬을 보여준다.
도 4는 실시예 4에 설명된 바와 같은 항-IL-23 애드넥틴에 의한 PBMC pSTAT3 억제로부터 대표적인 IC50 곡선을 보여준다.
도 5는 실시예 4에 설명된 바와 같은 항-IL-23 애드넥틴 및 항-p40 모노클로날 항체 (MAB1510)에 의한 IL-23-의존성 IL-17A의 억제에 대한 대표적인 IC50 곡선을 보여준다.
도 6은 공여자 228 (실시예 4에 설명된 바와 같이 시험된 4명의 공여자 중 1명)의 PBMC에 의한 IL-23-유도된 IL-17 생산의 ATI001045 억제를 보여준다.
도 7은 항-IL-23 애드넥틴에 대한 대표적인 선택성 데이터를 보여준다. 실시예 4에 설명된 바와 같은 포획된 ATI001016에 대한 10 nM IL-23 및 1 μM IL-12 결합의 결합 상 및 해리 상을 예시하는 완충제 차감된 센소그램 (sensorgram)을 보여준다.
도 8은 항-IL-23 애드넥틴이 실시예 4에 설명된 바와 같이 NK-92 세포에서 IL-12 유도된 IFN-γ 생산을 억제하지 않음을 보여준다.
도 9a는 ATI001045가 실시예 4에 설명된 바와 같이 마우스 약동학 모델에서 혈청 IL-17 수준을 억제함을 보여준다.
도 9b는 실시예 4에 설명된 바와 같이 마우스 약동학 모델에서 항-IL-23 애드넥틴의 억제 활성의 비교를 보여준다.
도 10a는 실시예 4에 설명된 바와 같이 인간 IL-23 유도된 극세포증 (acanthosis)에서 ATI000934 용량 반응을 보여준다.
도 10b는 실시예 4에 설명된 바와 같이 인간 IL-23 유도된 극세포증에서 ATI001045 용량 반응을 보여준다.
도 11은 마우스에서 생체내 HSA 반감기를 보여준다. HSA를 마우스에 20 mg/kg (도 11a) 또는 50 mg/kg (도 11b)로 주사하였다.
도 12a-d는 마우스에서 SABA1-SABA4의 반감기 결정을 보여준다.
도 13a은 HSA와 동시-주사할 때 SABA1-4의 마우스에서의 반감기 향상의 그래프 요약을 보여준다. 도 13b는 사이노몰거스 원숭이 및 마우스로부터의 데이터를 비교한다.
도 14a-b는 사이노몰거스 원숭이에서 SABA1.1 및 SABA5.1에 대한 반감기 결정을 보여준다.
도 15는 직접 결합 ELISA 검정에 의한 인간, 마우스 및 래트로부터의 알부민에 대한 SABA1.2 결합을 보여준다.
도 16은 SABA1.1 및 HSA 화학량론의 결정을 보여준다.
도 17은 HSA의 재조합 도메인 단편에 대한 SABA1.2 결합의 비아코어 (Biacore) 분석을 보여준다.
도 18은 1 mpk 및 10 mpk로 투여된 원숭이에서 SABA1.2에 대한 약동학 프로파일을 보여준다.
도 19는 1 mpk로 정맥내 또는 피하 투여된 원숭이에서 SABA1.2에 대한 약동학 프로파일을 보여준다.
발명의 상세한 설명
정의
"폴리펩티드"는 길이, 번역후 변형, 또는 기능과 상관없이 2개 이상의 아미노산의 임의의 서열을 의미한다. "폴리펩티드" "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 교환가능하게 사용된다. 폴리펩티드는 천연 아미노산 및 비-천연 아미노산, 예컨대 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,559,126에 기재된 것을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 임의의 다양한 표준 화학 방식으로 변형될 수 있다 (예를 들어, 아미노산은 보호기로 변형될 수 있거나; 카르복시-말단 아미노산은 말단 아미드기로 변경되거나; 아미노-말단 잔기는 예를 들어 친지성을 향상시키는 기로 변형될 수 있거나; 또는 폴리펩티드는 안정성 또는 생체내 반감기를 증가시키기 위해 화학적으로 글리코실화되거나 또는 다르게 변형될 수 있다). 폴리펩티드 변형은 또 다른 구조, 예컨대 시클릭 화합물 또는 다른 분자의 폴리펩티드에 대한 부착을 포함할 수 있고, 또한 하나 이상의 아미노산을 변경된 형상 (즉, R 또는 S; 또는 L 또는 D)으로 함유하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 IL-23의 p19 하위단위에 특이적으로 결합하도록 변형된 피브로넥틴의 제10 타입 III 도메인으로부터 유래된 단백질이고, 본원에서 "애드넥틴" 또는 "항-IL-23 애드넥틴"으로서 칭한다.
용어 "PK"는 "약동학"의 두문자어이고, 예를 들어 대상체에 의한 흡수, 분포, 대사, 및 제거를 비롯한 화합물의 특성을 포함한다. "PK 조정 단백질" 또는 "PK 모이어티"는 생물학적 활성 분자에 융합되거나 이 분자와 함께 투여될 때 생물학적 활성 분자의 약동학적 특성에 영향을 주는 임의의 단백질, 펩티드, 또는 모이어티를 의미한다. PK 조정 단백질 또는 PK 모이어티의 예는 PEG, 인간 혈청 알부민 (HSA) 바인더 (미국 특허 출원 공개 번호 2005/0287153 및 2007/0003549에 개시된 바와 같은), 인간 혈청 알부민, Fc 또는 Fc 단편, 및 당 (예를 들어, 시알산)을 포함한다.
본원에서 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)"는 서열을 정렬하고, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 필요한 경우 갭 (gap)을 도입한 후, 선택된 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 규정되고, 여기서 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 %를 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR?) 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내에 해당하는 다양한 방식으로 수행할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
"단리된" 폴리펩티드는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질 또는 비단백질 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 폴리펩티드의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기를 적어도 얻기에 충분한 정도까지 또는 (3) 쿠마시 블루 (Coomassie blue) 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는 폴리펩티드의 자연 환경의 적어도 한 성분도 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 (in situ) 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
아미노산 서열 또는 화합물의 "반감기"는 일반적으로 예를 들어, 서열 또는 화합물의 분해 및/또는 천연 메카니즘에 의한 서열 또는 화합물의 청소 또는 제거 (sequestration)에 의해 생체 내에서 폴리펩티드의 혈청 농도가 50% 감소하는데 소요되는 시간으로서 규정될 수 있다. 반감기는 공지된 임의의 방식으로, 예컨대 약동학적 분석에 의해 결정될 수 있다. 적합한 기법은 당업자에게 명백할 것이고, 예를 들어 일반적으로 영장류에게 적합한 용량의 본 발명의 아미노산 서열 또는 화합물을 적합하게 투여하고; 상기 영장류로부터 일정한 간격으로 혈액 샘플 또는 다른 샘플을 수거하고; 상기 혈액 샘플 내의 본 발명의 아미노산 서열 또는 화합물의 수준 또는 농도를 결정하고; 이렇게 얻어진 데이터(의 플롯)으로부터, 본 발명의 아미노산 서열 또는 화합물의 수준 또는 농도가 투여시의 초기 수준에 비해 50% 감소할 때까지의 시간을 계산하는 단계를 수반할 것이다. 예를 들어, 표준 안내서, 예컨대 문헌 [Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists], 및 [Lee, P.I.D. et al., Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach (1996)]을 참조한다. 또한 문헌 [Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker, publ. (1982)]을 참조한다.
반감기는 t1/2-알파, t1/2-베타와 같은 파라미터 및 곡선하 면적 (AUC)을 사용하여 표현될 수 있다. 본원 명세서에서, "반감기의 증가"는 이들 파라미터 중 임의의 1개, 이들 파라미터 중 임의의 2개, 또는 이들 3개의 파라미터 전부의 증가를 의미한다. "반감기의 증가"는 t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 둘 모두의 증가를 보이거나 보이지 않으면서 t1/2-베타가 증가하는 것을 의미한다.
개요
본원은 인간 IL-23-특이적 p19 하위단위에 대해 작용하는 애드넥틴을 제공한다. IL-23 특이적 길항제를 확인하기 위해, IL-23을 항-p40 mAb를 사용하여 애드넥틴의 큰 합성 라이브러리에 제시하였다. IL-23 p19 하위단위에 결합하는 애드넥틴을 T-세포주에서 인간 IL-23에 대한 결합, IL-23/IL-23R 상호작용의 경쟁, 및 IL-23 유도 신호전달의 억제에 대해 스크리닝하였다. 항-IL-23 애드넥틴을 표적 농도를 저하시키고 느린 오프-속도 (off-rate)를 갖는 항-IL-23 애드넥틴에 대해 선택함으로써 추가의 선택 압력에 적용하였다. 상기 최적화 과정으로부터, 애드넥틴의 패밀리는 유리한 생화학적 및 생물물리학적 특성을 갖는 IL-23 특이적 억제제로서 확인되었다.
피브로넥틴 기반 스캐폴드
본원의 하나의 측면은 하나 이상의 용매 접근가능 루프가 무작위로 선정되거나 또는 돌연변이된 Fn3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, Fn3 도메인은 인간 피브로넥틴 타입 III 도메인의 야생형 제10 모듈 (10Fn3)로부터 유래된 Fn3 도메인이다:
Figure pct00001
상기 10Fn3 서열에서, BC, DE 및 FG 루프를 밑줄로 표시한다.
다양한 돌연변이체 10Fn3 스캐폴드가 보고되었다. 한 측면에서, Asp 7, Glu 9, 및 Asp 23 중의 하나 이상은 또 다른 아미노산, 예를 들어, 비-음하전 아미노산 잔기 (예를 들어, Asn, Lys 등)로 교체된다. 이들 돌연변이는 야생형에 비해 중성 pH에서 돌연변이체 10Fn3의 보다 큰 안정성을 촉진하는 효과를 갖는 것으로 보고되었다 (PCT 공개 WO02/04523 참조). 유익하거나 중성인 10Fn3 스캐폴드 내의 다양한 추가의 변경이 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Batori et al., Protein Eng., 15(12):1015-1020 (Dec. 2002)]; [Koide et al., Biochemistry, 40(34):10326-10333 (Aug. 28, 2001)]를 참조한다.
변이체와 야생형 10Fn3 단백질은 모두 동일한 구조, 즉 A 내지 G로 지정된 7개의 베타-가닥 도메인 서열 및 7개의 베타-가닥 도메인 서열을 연결하는 6개의 루프 영역 (AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프, 및 FG 루프)을 특징으로 한다. N- 및 C-말단에 가장 근접하여 위치하는 베타 가닥은 용액 내에서 베타-유사 입체형태를 취할 수 있다. 서열 1에서, AB 루프는 잔기 15-16에 상응하고, BC 루프는 잔기 21-30에 상응하고, CD 루프는 잔기 39-45에 상응하고, DE 루프는 잔기 51-56에 상응하고, EF 루프는 잔기 60-66에 상응하고, FG 루프는 잔기 76-87에 상응한다 (Xu et al., Chemistry & Biology, 9:933-942 (2002)).
일부 실시양태에서, 10Fn3 폴리펩티드는 서열 1에 제시된 바와 같은 인간 10Fn3 도메인에 적어도 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 동일할 수 있다. 많은 변이성은 일반적으로 하나 이상의 루프에서 발생할 것이다. 10Fn3 폴리펩티드의 각각의 베타 또는 베타-유사 가닥은 상기 변이가 생리학적 조건에서 폴리펩티드의 안정성을 파괴하지 않는다면, 서열 1의 상응하는 베타 또는 베타-유사 가닥의 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 본질적으로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시내용은 제10 피브로넥틴 타입 III (10Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공하고, 여기서 10Fn3 도메인은 루프 AB; 루프 BC; 루프 CD; 루프 DE; 루프 EF; 및 루프 FG를 포함하고; 인간 10Fn3 도메인의 상응하는 루프의 서열에 비해 변경된 아미노산 서열을 갖는, 루프 BC, DE, 및 FG로부터 선택된 적어도 하나의 루프를 갖는다. 일부 실시양태에서, BC 및 FG 루프는 변경되고, 일부 실시양태에서, BC, DE, 및 FG 루프는 변경되고, 즉, Fn3 도메인은 비-천연 발생 루프를 포함한다. "변경된"은 주형 서열 (상응하는 인간 피브로넥틴 도메인)에 비해 하나 이상의 아미노산 서열 변경을 의미하고, 아미노산 부가, 결실, 및 치환을 포함한다. 아미노산 서열을 변경하는 것은 일반적으로 서열을 코딩하는 핵산의 의도적인, 무계획적 (blind), 또는 자연발생적인 서열 변이를 통해 달성될 수 있고, 임의의 기법, 예를 들어, PCR, 오류 빈발 (error-prone) PCR, 또는 화학적 DNA 합성에 의해 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, BC, DE, 및 FG로부터 선택된 하나 이상의 루프는 상응하는 인간 피브로넥틴 루프에 비해 길이가 연장되거나 단축될 수 있다. 일부 실시양태에서, 루프의 길이는 2-25개 아미노산만큼 연장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 루프의 길이는 1-11개 아미노산만큼 감소될 수 있다. 따라서, 항원 결합을 최적화하기 위해, 10Fn3의 루프의 길이는 항원 결합시에 가능한 최대 가요성 및 친화도를 얻도록 길이 및 서열에서 변경될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 1의 비-루프 영역에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Fn3 도메인을 포함하고, 여기서 BC, DE, 및 FG로부터 선택된 적어도 하나의 루프가 변경된다. 일부 실시양태에서, 변경된 BC 루프는 10개 이하의 아미노산 치환, 4개 이하의 아미노산 결실, 10개 이하의 아미노산 삽입, 또는 이들의 조합을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변경된 DE 루프는 6개 이하의 아미노산 치환, 4개 이하의 아미노산 결실, 13개 이하의 아미노산 삽입, 또는 이들의 조합을 갖는다. 일부 실시양태에서, FG 루프는 12개 이하의 아미노산 치환, 11개 이하의 아미노산 결실, 25개 이하의 아미노산 삽입, 또는 이들의 조합을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 BC 루프는 GHYPMHV (서열 2), GHYPLHV (서열 3), GHYPMHI (서열 4), GHYPLHI (서열 5) 및 GHYPLHL (서열 6)로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 DE 루프는 HRTH (서열 7), YYHY (서열 8), SKQH (서열 9), SNVH (서열 10), NRAH (서열 11), RKTY (서열 12), RSRY (서열 13), SRYY (서열 14), PHRY (서열 15), RSTH (서열 16), SRIY (서열 17), HQRY (서열 18), KQVY (서열 19), AHRY (서열 20), RSRH (서열 21), ARQY (서열 22), RTQY (서열 23), PRYH (서열 24), MRQH (서열 25), SRKY (서열 26), RQKY (서열 27), HAKY (서열 28), SNRY (서열 29), NTSH (서열 30), SQVY (서열 31), NRVY (서열 32), PRSH (서열 33), RTKY (서열 34), SRYH (서열 35), PRRY (서열 36), RQKY (서열 37), RYKY (서열 38), VPRH (서열 39), TPKH (서열 40), RSKY (서열 41), SRKY (서열 42), VPRY (서열 43), PRRY (서열 44), RMRH (서열 45), PPRH (서열 46), RQIY (서열 47), 및 MRQH (서열 48)로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 FG 루프는 YYNEADYSQI (서열 49), YYQEYEYRYI (서열 50), YYMEEKYAVI (서열 51), YYAQENYKEI (서열 52), YYKEANYREI (서열 53), YYAQEEYHII (서열 54), YYKEADYSQI (서열 55), YYEQVEYREI (서열 56), YYEQPIYATI (서열 57), YYEQVEYREI (서열 58) 및 YYSEELYKYI (서열 59)로 이루어진 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
10Fn3 도메인은 아미노산 변경으로 시작할 수 있다. 예를 들어, 추가의 MG 서열이 Fn3 도메인의 N-말단에 위치할 수 있다. M은 대체로 절단되어, N-말단에는 G가 존재할 것이다. 일부 실시양태에서, 서열들이 10Fn3 도메인의 C-말단에 위치할 수 있다. 예를 들어, 부위 지정 PEG화에서 시스테인 함유 링커, 예컨대 GSGC (서열 101)가 C-말단에 첨가된다. 별법으로, 천연 발생 C-말단 테일 (tail)의 PEG화는 시스테인 함유 링커 EIDKPCQ (서열 102)에 대해 Ser을 Cys으로 변경함으로써 돌연변이된다. GSGC 링커를 포함하는 본 발명의 항-IL-23 애드넥틴의 예는 ATI001014, ATI001015, ATI001016, ATI001044, ATI001045 및 ATI001047을 포함한다. ATI000934는 EIDKPCQ 링커를 포함하는 본 발명의 항-IL-23 애드넥틴의 예이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 서열 2-6에 제시된 BC 루프 서열로부터의 하나의 루프 서열, 서열 7-48에 제시된 하나의 DE 루프 서열 및 서열 49-59에 제시된 하나의 FG 루프 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 서열 2-59 중 임의의 하나에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 동일한 BC, DE 및 FG 루프 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 당업자는 서열 2-6에 제시된 BC 루프 서열이 공통 서열 모티프 GHYPX1HX2 (서열 257)를 공유하고, 여기서 X1은 M 또는 L이고, X2는 I 또는 V이고, 서열 49-59에 제시된 FG 루프 서열은 공통 서열 모티프 YYX3X3X3X3YX3X3I (서열 258)를 공유하고, 여기서 X3은 임의의 아미노산일 수 있음을 알 것이다. 따라서, 컨센서스 서열 GHYPX1HX2에 들어맞는 BC 루프 및/또는 패턴 YYX3X3X3X3YX3X3I에 들어맞는, 서열 49-59에 명시적으로 나열된 것을 넘어서는 다른 FG 루프를 갖는, IL-23에 결합하는 추가의 애드넥틴을 생성하는 것이 가능할 것이다.
일부 실시양태에서, 항-IL-23 애드넥틴은 서열 60-100 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-23 애드넥틴은 서열 60-100 중 임의의 하나의 위치 3-96으로부터의 Fn3 도메인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-23 애드넥틴은 서열 60-100 중 임의의 하나에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-23 애드넥틴은 서열 60-100 중 임의의 하나의 위치 3-96으로부터의 아미노산 서열에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-IL-23 애드넥틴은 peg화되고/되거나 his-태그를 함유할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, ATI000934는 루프 서열이 구축물 1571G06 (서열 87)의 것과 동일한 단백질을 의미하고, 단백질은 C-말단에 잔기 EIDKPCQ를 함유하고, 여기서 단백질은 peg화되고 his-태그를 함유한다. ATI001014는 루프 서열이 구축물 1571G04 (서열 86)의 것과 동일한 단백질을 의미하고, 단백질은 C-말단에 GSGC 링커를 함유하고, 여기서 단백질은 peg화되고 his-태그를 함유한다. ATI001015는 루프 서열이 구축물 1572G06 (서열 91)의 것과 동일한 단백질을 의미하고, 단백질은 C-말단에 GSGC 링커를 함유하고, 여기서 단백질은 peg화되고 his-태그를 함유한다. ATI001016은 루프 서열이 구축물 1490B03 (서열 79)의 것과 동일한 단백질을 의미하고, 단백질은 C-말단에 GSGC 링커를 함유하고, 여기서 단백질은 peg화되고 his-태그를 함유한다. ATI001044는 루프 서열이 구축물 1490B03 (서열 79)의 것과 동일한 단백질을 의미하고, 단백질은 C-말단에 GSGC 링커를 함유하지만, 여기서 단백질은 peg화되지 않고 his-태그가 존재하지 않는다. ATI001045는 루프 서열이 구축물 1490B03 (서열 79)의 것과 동일한 단백질을 의미하고, 단백질은 C-말단에 GSGC 링커를 함유하고, 여기서 단백질이 peg화되고, his-태그는 존재하지 않는다. ATI001047은 루프 서열이 구축물 1571G04 (서열 86)의 것과 동일한 단백질을 의미하고, 단백질은 C-말단에 GSGC 링커를 함유하고, 여기서 단백질이 peg화되고, his-태그는 존재하지 않는다.
피브로넥틴은 그의 인테그린-결합 모티프인 "아르기닌-글리신-아스파르트산" (RGD)을 통해 특정 종류의 인테그린에 천연적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 (RGD) 인테그린 결합 모티프가 결여된 10Fn3 도메인을 포함한다.
약동학적 모이어티
한 측면에서, 본원은 약동학적 (PK) 모이어티를 추가로 포함하는 항-IL-23 애드넥틴을 제공한다. 개선된 약동학은 인지된 치료 필요성에 따라 평가할 수 있다. 종종, 가능하게는 단백질이 투여 후에 혈청 내에서 이용가능한 상태로 유지되는 시간을 증가시킴으로써 생체이용률을 증가시키고/시키거나 투여 사이의 시간을 증가시키는 것이 바람직하다. 몇몇 경우에, 시간에 걸친 단백질의 혈청 농도의 지속성을 개선하는 (예를 들어, 투여 직후 및 다음 투여 직전에 단백질의 혈청 농도의 차이를 감소시키는) 것이 바람직하다. 항-IL-23 애드넥틴은 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 또는 인간)에서 폴리펩티드의 청소율을 비변형된 애드넥틴에 비해 3배 초과로 감소시키는 모이어티에 부착될 수 있다. 개선된 약동학의 다른 척도는 종종 알파 기 및 베타 기로 분류되는 혈청 반감기를 포함할 수 있다. 어느 한 기 또는 두 기 모두가 적절한 모이어티의 첨가에 의해 유의하게 개선될 수 있다.
혈액으로부터 단백질의 청소를 느리게 하는 경향이 있는 모이어티 (본원에서 "PK 모이어티"로서 칭함)는 폴리옥시알킬렌 모이어티, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 당 (예를 들어, 시알산), 및 관용성이 좋은 단백질 모이어티 (예를 들어, Fc, Fc 단편, 트랜스페린, 또는 혈청 알부민)를 포함한다. 애드넥틴은 미국 특허 공개 번호 2007/0048282에 기재된 바와 같이 알부민 또는 알부민의 단편 (일부) 또는 변이체에 융합될 수 있다.
일부 실시양태에서, PK 모이어티는 혈청 알부민 결합 단백질, 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0178082 및 2007/0269422에 기재된 것이다.
일부 실시양태에서, PK 모이어티는 혈청 이뮤노글로불린 결합 단백질, 예컨대 미국 특허 공개 번호 2007/0178082에 기재된 것이다.
일부 실시양태에서, 애드넥틴은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 하나 이상의 PEG 분자는 단백질 상의 상이한 위치에 부착될 수 있고, 상기 부착은 아민, 티올 또는 다른 적합한 반응성 기와의 반응에 의해 달성할 수 있다. 아민 모이어티는 예를 들어 폴리펩티드의 N-말단에서 발견되는 1급 아민 또는 아미노산, 예컨대 리신 또는 아르기닌에 존재하는 아민 기일 수 있다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 a) N-말단; b) N-말단과 가장 N-말단의 베타 가닥 또는 베타-유사 가닥 사이; c) 표적-결합 부위와 마주보는 폴리펩티드의 면 (face) 상에 위치하는 루프; d) C-말단과 가장 C-말단의 베타 가닥 또는 베타-유사 가닥 사이; 및 e) C-말단으로 이루어진 군 중에서 선택되는 폴리펩티드 상의 위치에 부착된다.
peg화는 적합한 반응성 기가 단백질 내로 도입되어 peg화가 우선적으로 일어나는 부위를 생성하는 부위-지정 peg화에 의해 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 시스테인 잔기를 목적하는 위치에 도입하여, 시스테인에 대한 부위 지정 peg화를 허용하도록 변형된다. PEG는 분자량이 매우 다양할 수 있고, 분지형이거나 선형일 수 있다.
일부 실시양태에서, 애드넥틴은 Fn3 도메인 및 PK 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fn3 도메인은 10Fn3 도메인이다. 일부 실시양태에서, PK 모이어티는 폴리펩티드의 혈청 반감기를 Fn3 도메인 단독에 비해 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 400, 600, 800, 1000% 초과로 또는 이보다 크게 증가시킨다.
일부 실시양태에서, PK 모이어티는 중합체 당이다. 일부 실시양태에서, PK 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티이다. 몇몇의 실시양태에서, PK 모이어티는 혈청 알부민 결합 단백질이다. 몇몇의 실시양태에서, PK 모이어티는 인간 혈청 알부민이다. 몇몇의 실시양태에서, PK 모이어티는 혈청 이뮤노글로불린 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, PK 모이어티는 트랜스페린이다. 몇몇의 실시양태에서, PK 모이어티는 혈청 단백질에 특이적인 또 다른 애드넥틴이다.
생물물리학적 및 생화학적 특성결정
본원은 IL-23의 p19 하위단위에 결합하는 Fn3 도메인을 포함하는 애드넥틴을 제공한다. 표 1 및 실시예 4에서 보이는 바와 같이, 표적 분자에 대한 폴리펩티드 결합은 평형 상수 (예를 들어, 해리, KD) 및 운동 상수 (예를 들어, 온-속도 상수, Kon 및 오프-속도 상수, Koff)의 측면에서 평가할 수 있다. 애드넥틴은 일반적으로 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM, 100 pM 미만의 KD로 표적 분자에 결합할 것이지만, 보다 높은 KD 값이 용인될 수 있고, 이 경우 Koff는 충분히 낮거나 또는 Kon은 충분히 높다.
본 발명의 항-IL-23 애드넥틴의 패밀리의 BC, DE 및 FG 루프 서열 및 상응하는 전장 서열 번호를 아래 표 1에 제시한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
* 친화도 결정 방법: 항-His 항체, mAb050 (알앤디 시스템즈 (RnD Systems, 미국 미네소타주))을 아세테이트 5.0 내에 20 ㎍/ml로 희석하고, 제조자의 지시에 따라 CM5 칩 표면 (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare, 미국 뉴저지주 피스카타웨이))의 유동 셀 1 및 2 상에 약 9000 RU로 고정하였다. 모든 표면 플라즈몬 실험은 25℃에서 HBS-EP (10 mM Hepes 150 mM NaCl 3 mM EDTA 0.05% 계면활성제 P20) 내에서 수행하였다. IL-23을 2분 동안 항-His mAb 포획 애드넥틴 상에 주사한 후, 10분 해리시켰다. 결합 특이성 평가는 비아코어 T100 평가 소프트웨어를 사용하여 완료하였다. 추가의 상세한 방법은 실시예 4에서 설명된다.
추가의 항-IL-23 애드넥틴 특성결정은 표 2에서 설명된다.
Figure pct00005
핵산-단백질 융합 기술
한 측면에서, 본원은 IL-23의 p19 하위단위에 결합하는 피브로넥틴 타입 III 도메인을 포함하는 애드넥틴을 제공한다. 특이적 결합 특성을 갖는 Fn3 도메인을 신속하게 제조하고 시험하는 한 방법은 브리스톨-마이어스 스퀴브 알앤디 컴퍼니의 자회사인 애드넥서스의 핵산-단백질 융합 기술이다. 상기 기술은 단백질에 대한 결합에 중요한 신규한 폴리펩티드 및 아미노산 모티프를 확인하기 위해 핵산-단백질 융합체 (RNA- 및 DNA-단백질 융합체)를 활용하는, PRO융합(PROfusion)으로 불리는 시험관내 발현 및 태깅 (tagging) 기술을 이용한다. 핵산-단백질 융합 기술은 단백질을 그를 코딩하는 유전자 정보에 공유 커플링시키는 기술이다. RNA-단백질 융합 기술 및 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질 라이브러리 스크리닝 방법의 상세한 설명에 대해서는, 그 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 소스타크 (Szostak) 등의 미국 특허 번호 6,258,558, 6,261,804, 6,214,553, 6,281,344, 6,207,446, 6,518,018, 6,818,418; 및 문헌 [Roberts et al., Proc. Natl., Acad. Sci., 94: 12297-12302 (1997)]을 참조한다.
벡터 및 폴리뉴클레오티드 실시양태
본원에 개시된 임의의 다양한 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 화학적으로 합성될 수 있다. 코돈 사용 빈도는 세포 내에서 발현을 개선하도록 선택될 수 있다. 상기 코돈 사용빈도는 선택된 세포 종류에 따라 결정될 것이다. 특정 코돈 사용빈도 패턴이 이. 콜라이 (E. coli) 및 다른 박테리아, 및 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 곤충 세포에 대해 개발되었다. 예를 들어, 문헌 [Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan. 21, 2003)]; [Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(1):96-105 (Oct. 2002)]; [Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (Oct. 2001)]; [Makrides et al., Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (Sept. 1996)]; 및 [Sharp et al., Yeast, 7(7):657-678 (Oct. 1991)]을 참조한다.
핵산 조작을 위한 일반적인 기법은 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, publ. (1989)], 또는 [Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York, publ. (1987)] 및 그의 주기적인 최신판에 기재되어 있다. 일반적으로, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 포유동물, 바이러스, 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 상기 조절 요소는 전사 프로모터, 전사를 제어하기 위한 임의적 오퍼레이터 (operator) 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 대체로 복제 기점에 의해 부여되는, 숙주 내에서 복제하는 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자가 추가로 포함된다.
본원에 기재된 단백질은 직접, 및 바람직하게는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드인 이종성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 선택된 이종성 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다.
천연 신호 서열을 인식하여 처리하지 못하는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정성 장독소 II 리더의 군으로부터 선택되는 원핵생물 신호 서열로 대체된다.
효모 분비를 위해, 천연 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, 인자 (factor) 리더 (사카로미세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로미세스 (Kluyveromyces) 알파-인자 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 미국 특허 5,631,144에 기재된 신호에 의해 대체될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다. 상기 전구체 영역을 위한 DNA는 단백질을 코딩하는 DNA에 리딩 프레임으로 결찰될 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터는 모두 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 복제가능하도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있도록 하는 것이고, 복제 기점 또는 자가 복제 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2 마이크로미터 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (SV40 기원은 단지 조기 프로모터를 함유하기 때문에 일반적으로 사용될 수 있다).
발현 및 클로닝 벡터는 또한 선택가능 마커로도 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 대표적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결함 (auxotrophic deficiency)을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 핵심 영양소를 공급하는 단백질 (예를 들어, 바실루스 (Bacillus)에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자)을 코딩한다.
발현 및 클로닝 벡터는 대체로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 본 발명의 단백질, 예를 들어, 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주에 사용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tan 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 박테리아 프로모터가 적합하다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) (S.D.) 서열을 함유할 것이다. 프로모터 서열은 진핵생물에 대해서도 알려져 있다. 실질적으로 모든 진핵생물 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 약 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시부로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역이고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 단부에는 코딩 서열의 3' 말단에 대한 폴리 A 테일의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이다. 이들 서열 모두는 진핵생물 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.
효모 숙주와 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소, 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제를 위한 프로모터를 포함한다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 전사는 그 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성이라면, 예를 들어 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 얻은 프로모터, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 열-쇼크 프로모터에 의해 제어될 수 있다.
고등 진핵생물에 의한 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 (enhancer) 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토단백질, 및 인슐린)로부터 알려져 있다. 그러나, 일반적으로, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 하류 (bp 100-270) 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 하류 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 증강 요소에 대해서는 문헌 [Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 펩티드-코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5'의 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
진핵 숙주 세포 (예를 들어, 효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 상기 서열은 일반적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 본 발명의 단백질을 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 분절을 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO 94/11026 및 여기에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
재조합 DNA는 또한 단백질을 정제하기 위해 유용할 수 있는 임의의 종류의 단백질 태그 서열을 포함할 수 있다. 단백질 태그의 예는 히스티딘 태그, FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, 또는 GST 태그를 포함하지만 그로 제한되지 않는다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주에 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 그의 관련 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, publ. (1985)]에서 찾을 수 있다.
발현 구축물은 당업자에게 명백할 바와 같이 숙주 세포에 적절한 방법을 사용하여 숙주 세포 내로 도입된다. 전기천공; 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 사용한 형질감염; 미세입자 투사법 (microprojectile bombardment); 리포펙션 (lipofection); 및 감염 (벡터가 감염성 물질인 경우)을 포함하고 이로 제한되지 않는, 핵산을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다.
적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 포유동물 세포, 또는 박테리아 세포를 포함한다. 적합한 박테리아는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 이. 콜라이 또는 바실루스 종을 포함한다. 바람직하게는 사카로미세스 속의 효모, 예컨대 에스. 세레비지아에 (S. cerevisiae)도 폴리펩티드의 생산을 위해 사용될 수 있다. 또한, 다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 재조합 단백질을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 곤충 세포에서 이종성 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템이 문헌 [Luckow et al., Bio/Technology, 6:47 (1988)]에서 검토되었다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예는 내피 세포, CO8-7 원숭이 신장 세포, CV-1, L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), 인간 배아 신장 세포, HeLa, 293, 293T, 및 BHK 세포주를 포함한다. 정제된 폴리펩티드는 재조합 단백질을 발현하기 위해 적합한 숙주/벡터 시스템을 배양함으로써 제조된다. 많은 용도를 위해, 본원에 개시된 많은 폴리펩티드의 작은 크기 때문에, 이. 콜라이에서의 발현이 바람직한 발현 방법이 된다. 이어서, 단백질은 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제된다.
단백질 생산
숙주 세포는 단백질 생산을 위해 본원에서 설명되는 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터 유도, 형질전환체 선택, 또는 목적하는 서열 코딩 유전자의 증폭에 적절한 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 본원에서 제시된 예에서, 고효율 (high-throughput) 단백질 생산 (HTPP) 및 중간-규모 생산을 위해 사용된 숙주 세포는 BL21 DE3 plysS-박테리아 균주이었다. 본 발명의 단백질을 생산하기 위해 사용된 숙주 세포는 다양한 배지, 예컨대 문헌 [Ham et al., Meth. Enzymol., 58:44 (1979)], [Barites et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 4,560,655, 5,122,469, 6,048,728, 5,672,502, 또는 미국 특허 번호 RE30,985에 기재된 것에서 배양될 수 있다. 또한, 임의의 다른 필수 보충물이 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 이전에 사용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.
본원에 개시된 단백질은 또한 세포-번역 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 상기 목적을 위해, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 mRNA를 생산하기 위해 시험관내 전사를 허용하고 이용되는 특정 세포-미함유 시스템 (진핵생물, 예컨대 포유동물 또는 효모 세포-미함유 번역 시스템 또는 원핵생물, 예컨대 박테리아 세포-미함유 번역 시스템)에서 mRNA의 세포-미함유 번역을 허용하도록 변형되어야 한다.
본 발명의 단백질은 또한 화학적 합성에 의해 (예를 들어, 문헌 [Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL, publ. (1984)]에 기재된 방법에 의해) 생산될 수 있다. 단백질에 대한 변형은 또한 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 단백질은 일반적으로 단백질 화학 분야에 알려진 단백질에 대한 단리/정제 방법에 의해 정제될 수 있다. 비-제한적인 예는 추출, 재결정화, 염석 (예를 들어, 황산암모늄 또는 황산나트륨을 사용한), 원심분리, 투석, 한외여과, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 정상 상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 겔 여과, 겔 투과 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 전기영동, 역류 분배 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 정제 후에, 폴리펩티드는 상이한 완충제 내로 교환되고/되거나 여과 및 투석을 포함하지만 그로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 다양한 방법에 의해 농축될 수 있다.
정제된 폴리펩티드는 바람직하게는 적어도 85% 순수하거나, 또는 바람직하게는 적어도 95% 순수하고, 가장 바람직하게는 적어도 98% 순수하다. 순도의 정확한 수치값과 무관하게, 폴리펩티드는 제약 제품으로서 사용하기에 충분히 순수하다.
플랫폼 (platform) 제조 공정이 항-IL-23 애드넥틴을 제조하기 위해 사용되었다. 실시예 1은 제조 공정의 예를 설명한다. 애드넥틴은 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli, 이. 콜라이)에서 생산된다. 이. 콜라이 MG1655 세포를 단백질을 봉입체 (inclusion body)로서 불용성 형태로 생산하는 발현 벡터 (pBMS2008/ATI001044)로 형질전환시킨다. 재조합 균주를 교반 탱크 발효기에서 성장시킨다. 발효 종료시에, 정제를 위해 봉입체를 수집하고, 가용화시키고, 재폴딩 (refolding)시킨다. 정제된 애드넥틴은 말레이미드 링커를 사용하여 40 kDa 분지형 메톡시PEG에 접합시킨다. 접합된 물질을 후속적으로 유리 PEG, 유리 애드넥틴 및 생성물 관련 불순물을 제거하기 위해 재정제한다. 품질 관리 시험은 벌크 (bulk) 약물 물질에 대해 수행하였다.
치료 목적의 생체내 용도
한 측면에서, 본원은 자가면역 질환, 예컨대 루푸스 (예를 들어, 홍반성 루푸스, 루푸스 신장염), 하시모토 갑상선염, 원발성 점액 수종, 그레이브스 (Graves) 질환, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 애디슨 (Addison) 질환, 당뇨병 (예를 들어, 인슐린 의존성 당뇨병, 제I형 당뇨병), 굿패스쳐 (Goodpasture) 증후군, 중증 근육무력증, 천포창, 크론 질환, 교감성 안염, 자가면역 포도막염, 다발성 경화증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판감소증, 원발성 담즙성 간경변증, 만성 활동 간염, 궤양성 대장염, 쇼그렌 (Sjoegren) 증후군, 류마티스 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염), 다발근염, 공피증, 및 혼합 결합 조직 질환의 치료에서 유용한 항-IL-23 애드넥틴을 제공한다.
본원은 또한 항-IL-23 애드넥틴을 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 항-IL-23 애드넥틴은 포유동물, 특히 인간에게 제약상 허용된다. "제약상 허용되는" 폴리펩티드는 유의한 유해한 의학적 결과 없이, 예컨대 본질적으로 내독소 비함유 또는 매우 낮은 내독소 수준으로 동물에게 투여되는 폴리펩티드를 나타낸다.
제제화 및 투여
본원은 본원에서 설명되는 항-IL-23 애드넥틴을 포함하는 제약상 허용되는 조성물을 추가로 제공하고, 여기서 조성물에는 본질적으로 내독소가 존재하지 않는다. 항-IL-23 애드넥틴을 포함하는 치료 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 설명되는 애드넥틴을 임의의 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 수용액, 동결건조된 또는 다른 건조된 제제의 형태로 보관을 위해 제조된다 (Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition (1980)). 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당체, 이당체, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트란; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(Tween), 플루로닉(PLURONIC)? 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
본원에서 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는, 상보적인 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 상기 분자들은 의도된 목적을 위해 효과적인 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
생체내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행된다.
당업자는 각각의 치료제의 투여량이 치료제의 종류에 의존적일 것임을 이해할 것이다.
치료 용도를 위해, 항-IL-23 애드넥틴은 제약상 허용되는 투여 형태로 대상체에게 투여된다. 이것은 볼루스로서 정맥 내로 또는 일정 시간에 걸친 연속 주입에 의해, 또는 피하 경로에 의해 투여될 수 있다. 적합한 제약상 허용되는 담체, 희석제, 및 부형제는 당업계에 공지되어 있고, 임상 상황에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다. 적합한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예는 (1) 둘베코 (Dulbecco) 포스페이트 완충 염수, (2) 0.9% 염수 (0.9% w/v NaCl), 및 (3) 5% (w/v) 덱스트로스를 포함한다.
본 발명의 방법은 시험관 내에서, 생체 내에서, 또는 생체 외에서 실시할 수 있다.
항-IL-23 애드넥틴, 및 하나 이상의 추가의 치료제의 투여는 동시 투여든 또는 순차적 투여든 관계없이 치료 용도에 대해 상기한 바와 같이 수행될 수 있다. 동시 투여에 적합한 제약상 허용되는 담체, 희석제, 및 부형제는 투여되는 특정 치료제의 종류에 좌우된다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
동결건조된 형태가 아니라 수성 투여 형태로 존재할 때, 단백질은 일반적으로 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 농도로 제제화될 것이지만, 이들 범위를 크게 벗어나는 농도도 허용된다. 질환의 치료를 위해, 항-IL-23 애드넥틴의 적절한 투여량은 치료할 질환의 종류, 질환의 중증도 및 경과, 애드넥틴이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 이전 요법의 경과, 환자의 임상력 및 애드넥틴에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 결정될 것이다. 단백질은 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.
혈청 알부민 결합 애드넥틴 (SABA)의 융합
특정 측면에서, 본원은 인간 혈청 알부민에 결합하는 10Fn3 도메인 (혈청 알부민 결합 애드넥틴 (10Fn3 도메인) 또는 SABA)에 융합된 항-IL23-애드넥틴을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 상기 융합 단백질은 항-IL23-애드넥틴 단독에 비해 알부민의 존재 하에 연장된 혈청 반감기를 가진다.
특정 측면에서, 본원은 융합 단백질의 t1 /2을 연장하기 위해 혈청 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민 (HSA)에 특이적으로 결합하는 10Fn3 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
특정 실시양태에서, SABA에 융합된 항-IL23-애드넥틴의 혈청 반감기는 SABA에 접합되지 않을 때의 항-IL23-애드넥틴의 혈청 반감기에 비해 증가된다. 특정 실시양태에서, SABA 융합체의 혈청 반감기는 SABA에 융합되지 않을 때의 항-IL23-애드넥틴의 혈청 반감기에 비해 적어도 20, 40, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1500, 1800, 1900, 2000, 2500, 또는 3000% 더 길다. 다른 실시양태에서, SABA 융합체의 혈청 반감기는 SABA에 융합되지 않을 때의 항-IL23-애드넥틴의 혈청 반감기보다 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 10배, 12배, 13배, 15배, 17배, 20배, 22배, 25배, 27배, 30배, 35배, 40배, 또는 50배 더 크다. 일부 실시양태에서, SABA 융합체의 혈청 반감기는 적어도 10시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 35시간, 40시간, 50시간, 60시간, 70시간, 80시간, 90시간, 100시간, 110시간, 120시간, 130시간, 135시간, 140시간, 150시간, 160시간, 또는 200시간이다.
따라서, 본원에서 설명되는 SABA 융합 분자는 항-IL23-애드넥틴과 SABA 사이의 융합을 생성함으로써 항-IL23-애드넥틴의 반감기를 증가시키는데 유용하다. 상기 융합 분자는 IL23의 생물학적 활성에 반응하는 상태의 치료를 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 IL-23의 조절이상에 의해 야기되는 질환에서 SABA 융합 분자의 사용을 고려한다.
융합체, 즉, SABA-항-IL23-애드넥틴 또는 항-IL23-애드넥틴-SABA 배열은 항-IL23-애드넥틴을 SABA 분자의 한 말단에 부착시킴으로써 생성될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 혈청 알부민 결합 10Fn3 도메인을 포함하는 항-IL-23 애드넥틴을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 예시적인 실시양태에서, 본원에서 설명되는 혈청 알부민 결합 10Fn3 단백질은 3 μM, 2.5 μM, 2 μM, 1.5 μM, 1 μM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM 또는 10 pM 미만의 KD로 HSA에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 혈청 알부민 결합 10Fn3 단백질은 5.5 내지 7.4의 pH 범위에서 25℃ 또는 37℃에서 3 μM, 2.5 μM, 2 μM, 1.5 μM, 1 μM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM 또는 10 pM 미만의 KD로 HSA에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 혈청 알부민 결합 10Fn3 단백질은 7.4 이상의 pH에서의 HSA에 대한 결합 친화도에 비해 7.4 미만의 pH에서 HSA에 보다 긴밀하게 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 HSA 결합 10Fn3 도메인을 포함하는 융합 단백질은 또한 하나 이상의 원숭이, 래트, 또는 마우스로부터의 혈청 알부민에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 혈청 알부민 결합 10Fn3 단백질은 붉은털원숭이 혈청 알부민 (RhSA) 또는 사이노몰거스 원숭이 혈청 알부민 (CySA)에 3 μM, 2.5 μM, 2 μM, 1.5 μM, 1 μM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM 또는 100 pM 미만의 KD로 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 혈청 알부민 결합 10Fn3 도메인을 포함하는 융합 단백질은 HSA의 도메인 I 및/또는 도메인 II에 결합한다. 한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 혈청 알부민 결합 10Fn3 도메인을 포함하는 융합 단백질은 HSA의 도메인 III에 결합하지 않는다.
특정 실시양태에서, 융합 단백질의 혈청 알부민 결합 10Fn3 (SABA) 부분은 야생형 10Fn3 도메인 (서열 1)에 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% 또는 85% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, BC, DE, 또는 FG 루프 중 적어도 하나는 야생형 10Fn3 도메인에 비해 변형된다. 또 다른 실시양태에서, BC, DE, 또는 FG 루프 중의 적어도 2개는 야생형 10Fn3 도메인에 비해 변형된다. 또 다른 실시양태에서, BC, DE, 및 FG 루프 3개 전부가 야생형 10Fn3 도메인에 비해 변형된다. 다른 실시양태에서, SABA는 표 3에 제시된 26개의 코어 SABA 서열 (즉, 서열 103, 107, 111, 115, 119, 및 123-143) 중의 임의의 하나 또는 표 3에 제시된 연장된 SABA 서열 (즉, 6xHIS 태그를 제외한 서열 188-215) 중의 임의의 하나에 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 코어 아미노산 잔기는 고정되고, 임의의 치환, 보존적 치환, 결실 또는 첨가는 코어 아미노산 잔기 이외의 다른 잔기에서 발생한다. 예시적인 실시양태에서, BC, DE, 및 FG 루프는 아래 표 3에 제시된 임의의 HSA 바인더 (즉, 표 3의 서열 103, 107, 111, 115, 119, 및 123-143)로부터의 BC, DE 및 FG 루프 서열을 포함하는 폴리펩티드로 교체된다.
특정 실시양태에서, SABA (예를 들어, 상기한 바와 같은 SABA 코어 서열 또는 이를 기초로 한 서열)는 N-말단 연장 서열 및/또는 C-말단 연장 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 예시적인 연장 서열은 표 3에 제시된다. 예를 들어, SABA1.1로 지정된 서열 188은 N-말단 서열 MGVSDVPRDLE (서열 144, AdNT1로서 지정됨), 및 C-말단 서열 EIDKPSQ (서열 153)을 갖는 코어 SABA 1 서열 (서열 103)을 포함한다. SABA1.1은 His6 태그를 C-말단에 추가로 포함하지만, His6 태그는 완전히 선택적인 것이고, N- 또는 C-말단 연장 서열 내의 임의의 위치에 존재할 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 표 3에 제시된 임의의 예시적인 N- 또는 C-말단 연장 서열 (서열 144-163), 및 그의 임의의 변이체는 표 3에 제공된 임의의 주어진 SABA 코어 서열을 변형시키기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 테일 서열은 SABA 융합 분자의 설계시에 필요한 다른 공지의 링커 서열 (예를 들어, 표 3의 서열 164-187)과 조합될 수 있다.
접합 링커
SABA 융합체는 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청 알부민 결합 10Fn3은 직접 또는 폴리펩티드 링커를 통해 간접적으로 항-IL23-애드넥틴에 연결될 수 있다. Fn3 연결에 적합한 링커는 별개의 도메인이 서로 독립적으로 폴딩하여 표적 분자에 대한 고친화도 결합을 허용하는 3차원 구조를 서로 형성하도록 하는 것이다.
본원의 개시내용은 글리신-세린 기반 링커, 글리신-프롤린 기반 링커, 및 아미노산 서열 PSTSTST (서열 184)을 갖는 링커를 비롯하여 상기 요건을 충족하는 많은 적합한 링커를 제공한다. 본원에서 설명되는 실시예는 폴리펩티드 링커를 통해 연결된 Fn3 도메인이 그의 표적 결합 기능을 보유함을 입증한다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신-세린 기반 링커이다. 이들 링커는 글리신 및 세린 잔기를 포함하고, 8 내지 50, 10 내지 30, 및 10 내지 20개 아미노산의 길이일 수 있다. 그 예는 아미노산 서열 (GS)7 (서열 171), G(GS)6 (서열 166), 및 G(GS)7G (서열 168)를 갖는 링커를 포함한다. 다른 링커는 글루탐산을 함유하고, 예를 들어, (GSE)5 (서열 173) 및 GGSE GGSE (서열 177)를 포함한다. 다른 예시적인 글리신-세린 링커는 (GS)4 (서열 170), (GGGGS)7 (서열 179), (GGGGS)5 (서열 180), 및 (GGGGS)3G (서열 181)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신-프롤린 기반 링커이다. 이들 링커는 글리신 및 프롤린 잔기를 포함하고, 3 내지 30, 10 내지 30, 및 3 내지 20개 아미노산의 길이일 수 있다. 그 예는 아미노산 서열 (GP)3G (서열 182) 및 (GP)5G (서열 183)를 갖는 링커를 포함한다. 다른 실시양태에서, 링커는 길이가 3 내지 30, 10 내지 30, 및 3 내지 20개 아미노산인 프롤린-알라닌 기반 링커일 수 있다. 프롤린 알라닌 기반 링커의 예는 예를 들어, (PA)3 (서열 185), (PA)6 (서열 186) 및 (PA)9 (서열 187)를 포함한다. 최적 링커 길이 및 아미노산 조성은 당업계에 공지된 방법에 의한 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있음이 고려된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 융합체는 혈액 또는 표적 조직에서 프로테아제에 의해 절단가능한 프로테아제 부위를 갖는 폴리펩티드 링커를 통해 연결된다. 상기 실시양태는 보다 우수한 전달 또는 치료 특성 또는 보다 효율적인 생산을 위해 치료 단백질을 방출하기 위해 사용될 수 있다.
추가의 링커 또는 스페이서는 Fn3 도메인과 폴리펩티드 링커 사이의 Fn3 도메인의 C-말단에 도입될 수 있다. 추가의 링커 또는 스페이서는 Fn3 도메인과 폴리펩티드 링커 사이의 Fn3 도메인의 N-말단에 도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료 모이어티는 직접 또는 중합체 링커를 통해 간접적으로 SABA에 연결될 수 있다. 중합체 링커는 하나 이상의 다음 특성을 갖는 단백질 융합체를 생성하기 위해 융합체의 각각의 성분 사이의 거리를 최적으로 변경하기 위해 사용될 수 있다: 1) 관심있는 단백질에 결합할 때 하나 이상의 단백질 도메인의 결합의 감소된 또는 증가된 입체 장애, 2) 증가된 단백질 안정성 또는 용해도, 3) 감소된 단백질 응집, 및 4) 단백질의 증가된 총 결합력 또는 친화도.
일부 실시양태에서, 치료 모이어티는 생체적합성 중합체, 예컨대 중합체 당을 통해 SABA에 연결된다. 중합체 당은 혈액 또는 표적 조직에서 효소에 의해 절단가능한 효소 절단 부위를 포함할 수 있다. 상기 실시양태는 보다 우수한 전달 또는 치료 특성 또는 보다 효율적인 생산을 위해 치료 단백질을 방출하기 위해 사용될 수 있다.
혈청 알부민-결합 애드넥틴 (SABA) 서열의 요약
본원에 언급된 많은 SABA 서열을 아래 표 3에 요약한다. 달리 명시하지 않으면, 모든 N-말단 연장부는 단일 밑줄로 표시하고, 모든 C-말단 테일/연장부는 이중 밑줄로 표시하고, 링커 서열은 박스로 표시한다. 루프 영역 BC, DE 및 FG는 각각의 코어 SABA 서열에 대해 음영으로 처리하였다.
Figure pct00006
Figure pct00007
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Figure pct00013
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Figure pct00016
실시예
실시예 1
제조 공정
발효 및 수거
생산 발효액을 멸균 기초 배지를 사용하여 제조하였다. 바이알을 해동하고, 성장 배지가 담긴 전달 용기(vessel)를 접종하기 위해 사용하였다. 접종물을 생산 발효액에 즉시 전달하였다. 배양액을 교반하면서 34℃의 온도에서 유지하고, 5-10의 OD600 (1 OD 단위는 약 1x109개 세포/mL임)에 도달하도록 성장시켰다. 공급물 배지의 첨가는 상기 OD에서 개시되었다. 발효는 OD600 = 25로 진행시켰고, 이 시점에서 배양액을 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)의 첨가에 의해 애드넥틴을 생산하도록 유도하였다. 용기의 온도는 유도시에 34℃에서 39℃로 증가되었다. 샘플을 무균 상태로 매시간 취하고, 세포 밀도에 대해 시험하였다.
9-12 hr의 유도된 발효 후에, 온도를 25℃로 감소시키고, 10 mM의 최종 농도로 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 첨가하고, 수산화나트륨의 첨가에 의해 pH를 7.8로 증가시키고, 교반을 감소시켜 수거를 위해 용기를 준비하였다. 1시간 보유 기간 후에, 발효기 내용물을 수집 용기 내로 배출하였다.
봉입체의 제조
세포를 파괴하여 그 내용물을 방출시키는 마이크로플루다이저 (MICROFLUIDIZER)?를 통해 물질을 통과시킴으로써 수거 풀 (pool)의 세포 파괴를 수행하였다. 세포 파괴에 이어, 극히 높은 원심분리력에 의해 연속 공정으로 고체 및 액체 상을 분리하기 위해 디스크 스택 (disc stack) 원심분리기를 사용하여 봉입체를 수집하였다. 이어서, 봉입체를 완충제 (20-25℃)로 2회 및 물 (20-25℃)로 2회 세척하였다. 매회 세척된 봉입체를 원심분리에 의해 수거하였다. 세척한 봉입체를 슬러리로서 회수하였다.
봉입체의 가용화 및 단백질 재폴딩
가용화 완충제를 봉입체 슬러리에 첨가한 후 실온에서 1 hr 동안 교반하였다. 이 과정 동안 OD280=20 (총 단백질)을 목표로 하였다.
단백질 재폴딩은 2단계 희석 과정을 이용하여 수행하였다. 희석 완충제를 가용화된 봉입체에 1부의 가용화된 봉입체 대 0.5부의 희석 완충제 (v/v)의 비로 첨가하였다. 제2 희석은 가용화된 봉입체를 OD280=0.7 (총 단백질)을 목표로 하여 재폴딩 완충제에 첨가함으로써 수행하였다. 희석은 실온에서 교반하면서 수행하였다. 1시간 동안 완전히 혼합한 후, 교반을 중지하고, 단백질 용액을 실온에서 밤새 유지하였다. 가용화되고 재폴딩된 애드넥틴을 0.8 ㎛-0.22 ㎛ 필터를 통해 통과시키고, A280 및 RP-HPLC에 의해 단백질 함량에 대해 시험하였다.
정제 및 PEG에 대한 접합
재폴딩되고 여과된 애드넥틴을 초기 포획을 위해 양이온 교환 (CEX1) 칼럼 상에 직접 로딩하였다. 결합된 물질을 세척 완충제로 세척하고, 50 mM 아세트산나트륨, 500 mM 염화나트륨, 1.5% 프로필렌 글리콜, pH 5.5로 용리시켰다. 용출액 풀을 순도, 정체, 농도, 및 내독소에 대해 검정하였다.
포획 크로마토그래피로부터의 용출액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 사용하여 추가로 정제하였다. CEX1 용출액을 HIC 칼럼 상에 직접 로딩하고, 세척하고, 후속적으로 50 mM 아세트산나트륨, 30% 프로필렌 글리콜, pH 5.5로 용리시켰다. 용출액 풀을 순도, 정체 및 농도에 대해 검정하였다.
이어서, 정제된 애드넥틴을 40 kDa 분지형 PEG의 말레이미드 유도체 (mPEG2-MAL)로 직접 포매팅하였다. HIC 용출액을 실온에서 교반하고, mPEG2-MAL을 첨가하였다. 실온에서 1 hr 혼합 후에, 반응 혼합물을 동일한 온도에서 밤새 인큐베이션시켰다. 이어서, PEG화 용액을 최종 CEX 칼럼 (CEX2) 상에서 처리하였다. 샘플을 단백질 함량, 순도 및 내독소 분석을 위해 취하였다.
PEG화 용액의 pH 및 전도성을 75 mM 아세트산을 사용하여 각각 4.0 및 1.0 mS/cm으로 조정한 후, 재정제를 위해 최종 양이온 교환 칼럼 (CEX2) 상에 로딩하였다. 일단 로딩된 후, 결합된 물질을 완충제로 세척하고, 후속적으로 50 mM 아세트산나트륨, 25 mM 염화나트륨, pH 5.0로 용리시켰다. 샘플을 단백질 함량, 순도 및 내독소 분석을 위해 취하였다.
CEX2 용출액을 V-스크린이 있는 30 kDa 공칭 분자량 컷오프 막이 장치된 접선 (tangential) 흐름 여과 유닛에서 15 mg/mL로 농축시켰다. 50 mM 아세트산나트륨, 25 mM 염화나트륨, pH 5.0 내의 벌크 약물 물질을 0.22 ㎛ 필터를 통해 통과시키고, -80℃에서 동결시켰다.
실시예 2
유전자, 벡터 및 숙주 세포
균주 구축에 사용하기 위해 T7 프로모터의 제어 하에 단백질을 코딩하는 플라스미드를 생성하였다. 상기 플라스미드 DNA를 사용하여 적격 이. 콜라이 K-12 MG1655 세포 (F-람다-, ilvG - rfb -50 rph -1)를 형질전환시켰다. IPTG의 첨가 시에 유전자로부터 발현의 유도를 허용하기 위해 숙주 균주를 설계하였다. 형질전환된 MG1655 균주는 카나마이신에 내성이다. 이 단백질 발현 벡터를 도 2에 제시한다. 플레이트로부터의 단일 콜로니 선택을 사용하여 발효 배양액에 접종하고, 이어서 이를 분취하여 연구용 세포 은행으로서 사용하기 위해 동결시켰다.
실시예 3
생물물리학적 및 생화학적 특성결정
본 발명의 단백질의 구조 및 품질을 몇 가지 포괄적 분석 방법에 의해 검사하였다.
MALDI-MS
질량 스펙트럼 프로파일을 MALDI에 의해 분석하였다. 샘플에 대한 MALDI 분석의 정확도를 평가하기 위해, 20개의 개별 스폿 (spot)을 각각의 샘플에 대해 스틸 플레이트 상에 놓고, 순차적으로 분석하였다. 총 20개의 스펙트럼이 생성되었다.
펩티드 맵핑 (mapping)
본 발명의 단백질 및 상응하는 비PEG화 단백질에 대해 cDNA 서열로부터 예측된 아미노산 서열 (1차 구조)의 올바른 발현을 확인하기 위해 펩티드 맵핑을 사용하였다. 완전한 서열 범위 (coverage)를 얻기 위해, 트립신 (Lys 및 Arg 잔기의 C-말단측 절단) 및 엔도프로테이나제 Glu-C (Glu 잔기의 C-말단측 절단)를 사용하여 펩티드 단편의 2개의 중첩되는 세트를 생성하였다. 또한, 잔류 N-말단 메티오닌, 디술피드-가교, 아스파라긴의 탈아미드화, 메티오닌 산화 (등)를 비롯한 공유적 번역후 변형을 결정하기 위해 펩티드 맵핑을 사용하였다. 분자량을 통해 액체 크로마토그래피 질량 분광측정법 (LC-MS)에 의해 및 충돌-유도 해리 (CID)를 통해 부분적 서열 정보를 제공하는 텐덤 질량 분광측정법 (MSMS)에 의해 펩티드를 확인하고, 특성을 결정하였다.
SDS-PAGE
비PEG화 및 PEG화 항-IL-23 애드넥틴의 분자량 밴드 형성 패턴을 가시화하기 위해 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 사용하였다. 샘플을 환원제 함유 또는 미함유 샘플 완충제 내에 제조하였다. SDS 내에서 가열한 후, 샘플 및 분자량 마커를 이미 만들어진 (pre-cast) 구배 (4-20%) 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동에 의해 분석하였다. 전기영동 후에, 겔을 고정하고, 쿠마시 블루로 염색하였다. 샘플의 밴드 형성 패턴의 동등성 (equivalence)을 육안으로 평가하였다.
크기-배제 크로마토그래피/다각도 광 산란 (SECMALS)
크기-배제 크로마토그래피 (SEC)를 단량체, 고분자량 (HMW), 및 저분자량 (LMW) 종의 정량적 분석을 위해 사용하였다. SEC 분리 후에, 분리된 종의 분자 질량을 시차 굴절계와 함께 다각도 광 산란에 의해 결정하였다.
실시예 4
시험관내 비임상 약물학
SPR에 의한 KD
결합 특성을 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 특성결정하였다. 인간 IL-23을 프로테온(ProteOn) XPR (바이오-라드) 칩 표면의 한 치수에 2 내지 4개의 수준으로 고정하고, 동일한 SPR 칩 표면의 다른 치수에 6개의 상이한 농도의 항-IL-23 애드넥틴에 노출시켰다. 이를 통해 재생 부재 하에 동역학적 결정을 수행할 수 있었다. 이중 칩을 25℃ 및 37℃에서의 동역학적 결정에 사용하였다. 동역학적 파라미터의 평가는 랭뮤어 (Langmuir) 상호작용 모델 및 프로테온 매니저(ProteOn Manager) 소프트웨어를 이용한 상수 파라미터 핏팅을 사용하여 수행하였다.
아래 표 4에 제시된 바와 같이, 이들 항-IL-23 애드넥틴에 대한 오프-속도는 25℃에서 느리다 (대략 10-5 s-1). 심지어 37℃에서, 오프-속도는 SPR 기술에 대한 검출 한계에 가까웠고, 따라서 보고된 해리 상수 측정치는 과소평가된 것일 수있다.
Figure pct00017
용액상 친화도
인간 IL-23에 대한 ATI001045의 용액 친화도는 동역학 배제 검정 (KinExA)을 사용하여 측정하였다. 한 포맷에서, hIL-23의 이중 적정을 각각의 3개의 농도에 대해 수행하였다. 상대적인 미결합 ATI001045 농도는 인간 IL-23 고체 매트릭스 상의 포획, 이어서 애드넥틴 스캐폴드를 인식하는 형광 표지된 항체를 사용한 검출에 의해 측정되었다. 기술적인 제한 때문에, 시험될 수 있는 최저 농도는 0.75 nM이었다. 따라서, 표 5에 제시된 전체적인 KD 분석이 KD에 대한 51 pM의 추정치를 제공하지만, 친화도는 95% 신뢰 구간 내에서 1 pM만큼 낮거나 또는 150 pM 만큼 높을 수 있다.
Figure pct00018
인간 IL-23에 대한 ATI001045 및 ATI001047의 용액 친화도를 또한 KinExA의 다른 포맷으로 측정하였다. 애드넥틴의 이중 적정을 각각의 3개의 (ATI001045) 또는 단일 (ATI001047) 농도의 인간 IL-23 (최저 농도에 대해 사중으로)에 대해 수행하였다. 상대적인 미결합 인간 IL-23 농도는 비-PEG화 ATI001045 고체 매트릭스 상의 포획, 이어서 hIL-23의 p40 하위단위를 인식하는 형광 표지된 항체를 사용한 검출에 의해 측정되었다. 표 6에 제시된 전체적인 KD 분석은 ATI001045에 대해 22 - 2.4 pM의 95% 신뢰 구간에서 9.4 pM의 KD 및 60.1 내지 19.4 pM의 95% 신뢰 구간에서 36.3 pM의 KD를 보여준다.
Figure pct00019
Kit225 세포에 대한 STAT3 인산화
문헌 [Parham et al., "A receptor for the heterodimeric cytokine IL-23 is composed of IL-12Rbeta1 and a novel cytokine receptor subunit, IL-23R", J. Immunol., 168(11):5699-5708 (Jun. 1, 2002)]에서는 인간 IL-2 의존적 T-세포주인 Kit225로부터 IL-23R을 클로닝하였다. 이들 세포는 FACS 분석에 의해 IL-12RB1 및 IL-23R 둘 모두의 발현에 대해 특성 결정되었고, pSTAT3의 자극에 의해 IL-23에 및 pSTAT4의 자극에 의해 IL-12에 반응하였다. Kit225 세포를 96 웰 플레이트 내로 시딩(seeding)하고, FBS 및 IL-2의 부재 하에 3 hr 동안 37℃에서 정치시켰다. 상기 인큐베이션 후에, 인간 재조합 IL-23 (또는 길항제와 함께 1시간 동안 예비-인큐베이션한 IL-23)을 적용하고, 세포를 STAT3의 인산화 (p-STAT3으로 약칭함)를 자극하기 위해 다시 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 각각의 상태를 96-웰 플레이트에서 이중으로 검정하였다. 세포를 얼음 상에 놓고 빙냉 PBS를 첨가함으로써 자극을 중지시켰다. 마지막으로, 세포를 펠릿화하고, 표준 프로토콜에 따라 용해시키고, pSTAT3 생산을 ELISA에 의해 검출하였다.
자극을 위한 IL-23의 최적 농도는 35 pM이었다. IL-23 유도 pSTAT3의 억제는 항-p40 모노클로날 항체 (mAb1510) 및 항-p19 폴리클로날 항체 (AF1716)의 적정에 의해 입증되었다. ATI001045, ATI001047, ATI001014 및 ATI001016은 항-p19 폴리클로날 항체보다 약 150배 더 강력한, 약 300 pM의 IC50의 동등한 활성을 가진 한편, ATI001015는 항-p19 폴리클로날 항체보다 약 40배 더 강력한, 약 1.2 nM의 IC50을 가졌다. 애드넥틴 ATI000934는 1 nM의 IC50으로, ATI001045의 1/3의 효능을 보인다 (표 7).
Figure pct00020
인간 PBMC에 대한 STAT3 인산화
1차 인간 세포에서 작용 메카니즘으로서 STAT3의 인산화를 평가하기 위한 목적으로 2차 세포-기반 확인 검정을 개발하였다. 건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 정상적으로 낮은 수준의 IL-23R을 발현하고 외인성 IL-23으로 자극할 때 평가가능하게 반응하지 않는 나이브 및 휴지 T-세포로 주로 이루어진다. 그러나, IL-2를 사용한 나이브 PBMC의 폴리클로날 활성화는 나이브 T-세포의 활성화 및 분화, 이어서 후속적인 IL-23R의 증가된 발현을 유발한다. 이때, 이들 활성화된 세포는, STAT 경로를 활성화하여 STAT3의 인산화를 일으키는 외인성 IL-23을 사용한 자극에 감수성이다.
상업적으로 입수가능한 항체 (AF1716 (항-p19 pAb) 및 mAb1510 (항-p40 mAb), 둘 모두 알&디 시스템즈 제품)를 IL-23 유도 STAT3 인산화의 억제에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 6개의 애드넥틴의 억제 활성을 다수의 공여자로부터의 혈액을 사용하여 10회의 별개의 실험에서 비교하였다 (표 8에 요약한다). 하위세트에 대한 예시적인 데이터는 도 4에 제시한다. 항-IL-23 애드넥틴은 STAT3 인산화의 억제시에 항-p19보다 유의하게 (>150배) 더 강력하지만, 항-p40 모노클로날 항체에 비해서는 이와 유사한 수준 내지 이보다 5배 덜 강력한 효능을 보였다.
Figure pct00021
마우스 비장세포에 의한 IL-23 유도 시토카인 생산
뮤린 Th17 세포로부터 IL-23-의존성 시토카인 분비를 억제하는 항-IL-23 애드넥틴의 능력을 평가하기 위해 1차 세포를 사용한 초기 세포 검정을 설계하였다. 분석을 위한 뮤린 Th17 세포를 분화시키기 위해, CD4+ T 세포를 자기 비드로 농축하고, 방사선 조사된 비장세포와 함께 동시 배양하고, TGF-β 및 IL-6의 존재 하에 항-CD3 및 IL-4 및 IFN-γ에 대한 중화 항체로 활성화시켰다. 배양액 내에서 6일 후에, 극성화된 Th17 세포를 수거하고, 96-웰 플레이트에 재시딩하고, 100 ng/ml 인간 IL-23 및 5 ng/ml 뮤린 IL-2로 자극하였다. IL-2의 첨가는 세포 생존력을 유지하고 IL-23에 반응하여 강력한 시토카인 생산이 가능하도록 하기 위해 필요하였지만, IL-17A 또는 IL-22 생산을 단독으로 강하게 유도하지 않았다. IL-2는 낮은 수준의 시토카인 분비를 유도하기 때문에, 각각의 샘플 세트는 IL-23의 부재 하에 생산된 시토카인의 기준선 수준을 제어하기 위해 IL-2 단독으로 자극된 세포를 포함하였다. IL-23-의존성 반응은 IL-2 및 IL-23의 조합에 의해 유도된 시토카인의 수준과 IL-2 단독에 의해 유도된 기준선 수준 사이의 차이를 계산함으로써 평가하였다. 그의 억제 잠재력을 시험하기 위해 IL-2 및 IL-23을 사용한 Th17 세포의 재자극 동안 일정 용량 범위의 애드넥틴을 첨가하였다. 일정 용량 범위의 인간 항-p40 항체 (알&디 시스템즈 MAB1510)를 IL-23 억제를 평가하기 위한 양성 대조군으로서 동등하게 시험하였다. 각각의 조건을 96-웰 플레이트의 삼중 웰에서 시험하였다. 4일 후에, 삼중 웰로부터 조건화된 배지를 모으고, 세포 잔해물을 제거하고, ELISA에 의해 IL-17A 및 IL-22 농도 모두에 대해 검정하였다.
IL-2 및 IL-23을 사용한 Th17 세포의 자극은 IL-2 단독에 의해 유도된 수준에 비해 IL-17A의 2 내지 3배 증가 및 IL-22의 적어도 5배 향상을 유도하였다. ATI000934, ATI001014, ATI001015, ATI001016, ATI001045 및 양성 대조군 항-p40 모노클로날 항체는 IL-23-의존성 IL-17A 및 IL-22 분비의 용량-의존성 감소를 매개하였다. IL-17A 및 IL-22 둘 모두의 분비 억제를 위한 IC50 값을 각각의 애드넥틴 및 항-p40 대조군에 대해 계산하고, 이들 데이터를 표 9에 요약하였다. 시험된 모든 애드넥틴은 IL-23-의존성 IL-17A 분비의 억제에 있어서 항-p40 대조군보다 2배 더 강력하고, IL-23-의존성 IL-22 생산의 억제에 있어서는 항-p40 대조군보다 2배 내지 3배 더 강력하였다.
Figure pct00022
인간 T 세포에 의한 IL-23 유도 시토카인 생산
PBMC는 정상적인 건강한 공여자로부터의 EDTA-처리한 전체 혈액의 밀도-구배 분리에 의해 얻었다. T 세포는 양 적혈구 (SRBC)로 로제팅 (rosetting)한 PBMC의 E+ 분획으로부터 제조하였다. T 세포를 항-CD3 (10 ㎍/ml의 OKT)로 1시간 동안 37℃에서 코팅하고 PBS로 세척한 96-웰 평저 플레이트 내로 100,000개 세포/웰로 플레이팅하였다. 항-CD28 (1 ㎍/ml의 9.3) 및 IL-1β (10 ng/ml) 또는 IL-1β + IL-23 (1 ng/ml)을 함유하는 RPMI-FCS 배지의 혼합물을 제조하였다. 상기 시토카인 조합은 인간 T 세포의 IL-17-분비 T 세포로의 분화를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 1 ㎍/ml의 출발 농도의 ATI001045를 IL-1β + IL-23을 함유하는 혼합물에 첨가하였다. IL-17은 듀오세트(DUOSET)? ELISA 발색 키트 (알&디 시스템즈)를 사용하여 상청액 내에서 검출되었다. ATI001045는 IL-1β 단독을 배경으로서 사용하여 2.0 ± 1.6 nM의 EC50 (n = 4명의 상이한 공여자)으로 IL-17 생산을 억제하였다. 시판 항-p40 항체 (MAB1510)는 내부 대조군으로서 사용하였고, 2.2 ± 1.4 nM의 EC50 (n = 3)으로 IL-17 생산을 억제하였다. 공여자 228로부터의 예시적인 데이터를 도 6에 제시한다.
IL-12보다 IL-23에 대한 항-IL-23 애드넥틴의 선택성
표 2에 나열된 애드넥틴 및 ATI001016을 사용하여 IL-23/IL-12에 대한 생화학적 선택성을 조사하였다. 결합 분석은 고정된 항-His 항체에 대한 항-IL-23 애드넥틴의 포획, 이어서 애드넥틴 상의 IL-23 또는 IL-12의 유동을 수반하였다. IL-23에 대한 애드넥틴의 선택성은 IL-23보다 100배 더 높은 농도의 IL-12에 대한 결합 신호를 비교함으로써 평가하였다. 도 7의 예시적인 데이터는 ATI001016이 10 nM 인간 IL-23에 대해 강한 결합 (약 40 RU)을 보이지만, 1 μM 인간 IL-12에 대해서는 검출가능한 결합이 관찰되지 않았음을 보여준다.
NK-92 세포는 IFN-γ를 분비함으로써 IL-2 의존적인 방식으로 IL-12에 반응하는 것으로 알려진 인간 천연 킬러 세포주이다. 세포를 일반적으로 IL-2를 제거하기 위해 세척하여 96-웰 플레이트 내로 시딩한 후, 25 pM 재조합 인간 IL-12 (또는 길항제와 함께 예비인큐베이션한 IL-12)로 처리하고, 추가로 20시간 동안 인큐베이션하였다. 정화된 상청액을 ELISA에 의해 IFN-γ에 대해 검정하였다.
표 2에 나열된 각각의 애드넥틴 클론의 5 μM에서 출발한 4점, 5배 연속 희석물을 제조하고, 25 pM IL-12와 함께 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, NK-92 세포에 첨가하였다. ATI001045 및 ATI001016의 5 μM에서 출발한 12점, 5배 연속 희석물을 25 pM IL-12와 함께 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, NK-92 세포에 첨가하였다. 표 2에 나열된 클론 및 ATI001045 또는 ATI001016 그 어느 것도 시험된 임의의 농도에서 IFN-γ 분비를 검출가능하게 억제하지 않았고, 이것은 이들 항-IL-23 애드넥틴이 IL-12와 NK-92 세포의 표면 상의 수용체의 상호작용을 억제하지 않음을 입증한다. 이들은 음성 대조군 및 100 nM 항-p19 폴리클로날 항체와 동등한 것으로 보인다. 양성 대조군으로서, 항-p40 모노클로날 항체 (mAb1510)는 0.07 nM의 IC50으로 IL-12 유도 IFN-γ 분비를 억제하였다 (도 8).
항-IL-23 애드넥틴은 약동학 모델에서 IL-23 유도된 IL-17을 차단한다.
암컷 C57B1/6 마우스의 복강 내로 (IP) 재조합 뮤린 IL-2 및 인간 IL-23을 다음 스케쥴에 따라 주사하였다.
Figure pct00023
모든 마우스를 시간 = 30h에서 IL-2 및 IL-23의 최종 투여 후 7 - 8시간 경과시에 안락사시켰다. 혈청을 수거하고 IL-17 및 IL-23에 대해 ELISA에 의해 검정하였다.
인간 IL-23은 마우스 수용체에 결합하고, 시토카인, 예컨대 IL-17 및 IL-22의 생산을 유도한다. IL-2 및 인간 IL-23을 복강 내로 (IP) 투여한 동물로부터의 비장세포는 항-마우스 CD3e로 생체 외에서 배양액에서 자극할 때 IL-17을 분비한다. C57B1/6 마우스를 추가로 24시간에 걸친 IL-2 + IL-23의 3회의 이중 주사 24시간 전에 IL-2로 프라이밍하는, 표 10에 설명된 치료법에 적용된 동물의 혈청 내에서 유의한 수준의 IL-17이 검출될 수 있다. 아마도, IL-2는 Th 집단을 계내에서 폴리클로날 방식으로 활성화 및 팽창시키고, IL-23 수용체의 발현을 상향-조절한다. 이것은 약물 작용 메카니즘 및 생체내 환경에서 약물 농도와 효과 사이의 관계를 조사할 수 있는 방법을 제공한다. 이 모델은 항-p40 모노클로날 항체인 mAb1510를 사용하여 입증되었다 (데이터를 제시하지 않음). 8회의 별개의 실험에서, 8회의 별개의 실험에서 IL-2 + IL-23의 초기 투여 2시간 전에 0.5, 0.15, 0.05 및 0.015 mg/kg으로 SC 투여할 때 뮤린 IL-17의 생산을 억제하는 그의 능력에 대해 5개의 항-IL-23 애드넥틴을 시험하였다. ATI001045에 대한 예시적인 용량 반응 데이터를 도 9a에 제시한다 (0.03 mg/kg의 계산된 평균 ED50). 시험된 모든 항-IL-23 애드넥틴은 혈청에서 인간 IL-23 뮤린 IL-17 생산의 용량 의존적 억제를 보였지만, 억제 정도는 애드넥틴에 따라 가변적이었다.
IL-23 유도된 피부 극세포증 모델에서 항-IL-23 애드넥틴의 활성
IL-23의 마우스의 등의 피부 또는 외이개 내로의 피부내 주사는 피부 염증 및 표피의 증식증 (극세포증)을 유발한다 (Zheng, Y., "Interleukin-22, a TH17 cytokine, mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosis", Nature, Vol. 445/8 (Feb. 2007)). 이들 연구에서, 비정상적인 피부 IL-23 노출의 후속 결과 (downstream consequence)를 조사하기 위해 재조합 인간 IL-23 (rHuIL-23)을 마우스 귀 내에 주사하였다.
6 내지 8주령 C57BL/6 암컷 마우스에 5 ㎍의 이중 사슬, 재조합 인간 IL-23을 제12일까지 격일로 우측 귀 내로 주사하였다. PBS는 대조군으로서 다른 쪽 귀 내에 주사하였다. 하나의 연구에서, ATI001045를 사용한 처리를 제1 IL-23 주사 약 2시간 전에 개시하고, 제12일까지 매주 3회 지속하였다. ATI001045를 0.1, 0.3, 1, 3 mg/kg의 용량으로 SC 투여하였다. 제2 연구에서, 비히클 또는 ATI000934-123 (1753E02)을 IL-23 투여 약 1시간 전에 1, 3, 또는 10 mg/kg으로 IP 투여하고, 그 후 제10일까지 매주 3회 투여하였다. 항-HuIL-12/IL-23 p40 항체 (알&디 mAb1510)를 10 mg/kg으로 제0 및 4일에 양성 대조군으로서 IP 투여하였다. 귀 두께 (수천 분의 1 인치 단위)는 미투토요(MITUTOYO)? (#2412F) 다이얼 캘리퍼스 (dial caliper)를 사용하여 다음 귀 주사 전에 격일로 측정하였다. 귀 두께는 각각의 동물에 대해 IL-23 주사한 귀에 대한 측정치로부터 대조군 귀의 값을 차감함으로써 계산하였다. 연구의 끝 (ATI001045의 경우 제14일 및 ATI000934의 경우 제12일)에, CO2 가스로 안락사시킨 후에, 귀를 머리털이 난 부근에서 절제하고, 포르말린 고정하고/파라핀-포매된 조직을 H&E 염색된 슬라이드 상에서 조직학적으로 조사하였다.
전체적으로, ATI000934의 1, 3, 및 10 mg/kg의 용량은 본 연구에서 IL-23-유도된 귀 비후의 유사한 수준의 억제를 제공하였다 (도 10). 모든 처리군에서의 귀 두께는 제5일부터 제12일의 연구의 끝까지 항-p40 군을 비롯한 비히클보다 유의하게 (p<0.01 ANOVA/던넷 (Dunnett)) 더 작았다. 제12일에, 말단 혈장 샘플을 마지막 투여 48시간 후에 얻고, ATI000934의 순환 수준에 대해 분석하였고, 각각 11, 18, 36 ㎍/ml로 결정되었다.
제12일의 마지막 측정 후에, 군당 10마리의 동물로부터 통상적인 조직학적 검사를 위해 부검시에 귀를 수거하였다. ATI000934를 투여한 대부분의 동물은 극세포증 및 피부 침윤물을 가졌지만, 조직학적 심도 스코어는 비히클 처리 동물에서 관찰된 것으로부터 감소하였다. 겉보기 용량 반응은 존재하지 않았다. 또한, 항-p40을 투여한 모든 동물은 극세포증 및 피부 침윤물을 가졌지만, 조직학적 심도 스코어는 비히클 처리 동물에서 관찰된 것으로부터 감소하였다.
ATI001045 (1 mg/kg 및 3 mg/kg)는 제5일부터 제14일까지 비히클 (PBS) 처리 동물에 비해 귀 두께를 용량-의존성으로 감소시켰다 (비히클에 대해 p<0.01, ANOVA/던넷, 도 10). 이와 대조적으로, 0.1 mg/kg 용량 수준은 임의의 연구일에 비히클 처리와 통계상 상이하지 않았다 (p>0.05). 0.3 mg/kg를 사용한 처리는 제5, 7, 9일에 비히클보다 통계상 더 작은 중간 정도의 감소를 제공하였다. 최종 투여 48시간 후에 수거한 혈청 샘플을 ATI001045의 순환 수준에 대해 평가하였고, 이는 각각 0.1, 0.3, 1, 3 mg/kg의 용량에 대해 0.698, 2.72, 8, 22.5 ㎍/ml로 결정되었다. 조직학 분석은 ATI001045의 투여가 귀 두께 스코어와 상호관련된 IL-23 유도된 세포 침윤물 및 극세포증의 용량 의존적 감소를 유도함을 보여주었다.
실시예 5
본원에서 사용된 물질 및 방법
고효율 단백질 생산 (HTPP)
선택된 바인더를 pET9d 벡터 내로 클로닝하고, 이. 콜라이 BL21 DE3 plysS 세포 내로 형질전환시키고, 24-웰 포맷으로 50 ㎍/mL 카나마이신을 함유하는 5 ml LB 배지 내에 접종하고, 37℃에서 밤새 성장시켰다. 밤새 배양한 배양액으로부터 200 ㎕를 흡인하고 이를 적절한 웰 내로 분배함으로써 신선한 5 ml LB 배지 (50 ㎍/mL 카나마이신) 배양액을 유도가능 발현을 위해 제조하였다. 배양액을 A600 0.6-0.9까지 37℃에서 성장시켰다. 1 mM 이소프로필-β-티오갈락토시드 (IPTG)를 사용한 유도 후에, 배양액을 6시간 동안 30℃에서 발현시키고, 10분 동안 2750 g 및 4℃에서 원심분리하여 수거하였다.
세포 펠릿 (24-웰 포맷에서)을 450 ㎕의 용해 완충제 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1x 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (Complete Protease Inhibitor Cocktail)-EDTA 프리 (free) (로슈 (Roche)), 1 mM PMSF, 10 mM CHAPS, 40 mM 이미다졸, 1 mg/ml 리소자임, 30 ㎍/ml DNAse, 2 ㎍/ml 아프로토닌, pH 8.0) 내에 재현탁시킴으로써 용해시키고, 실온에서 1-3시간 동안 진탕하였다. 용해물을 정화하고, 96-웰, 1.2 ml 포획 (catch) 플레이트가 구비된 96-웰 와트만 (Whatman) GF/D 유니필터(UNIFILTER)? 내로 전달함으로써 96-웰 포맷으로 재구성하고, 양압에 의해 여과하였다. 정화한 용해물을 평형화 완충제 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 40 mM 이미다졸, pH 8.0)로 평형화시킨 96-웰 Ni-킬레이팅 플레이트로 전달하고, 5 min 동안 인큐베이션하였다. 비결합된 물질을 양압에 의해 제거하였다. 수지를 세척 완충제 #1 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 5 mM CHAPS, 40 mM 이미다졸, pH 8.0)로 2 x 0.3 ml/웰로 세척하고, 각각의 세척액을 양압에 의해 제거하였다. 용리 전에, 각각의 웰을 50 ㎕ 용리 완충제 (PBS + 20 mM EDTA)로 세척하고, 5 min 동안 인큐베이션하고, 상기 세척액을 양압에 의해 버렸다. 추가의 100 ㎕의 용리 완충제를 각각의 웰에 적용함으로써 단백질을 용리시켰다. 실온에서 30분 인큐베이션 후에, 플레이트(들)을 5분 동안 200 g에서 원심분리하고, 용리된 단백질을 용리 전에 용리 포획 플레이트의 바닥에 첨가된 5 ㎕의 0.5 M MgCl2를 함유하는 96-웰 포획 플레이트에 수거하였다. 단백질 표준물로서 SGE를 사용하는 총 단백질 검정 (BCA)을 사용하여 용리된 단백질을 정량하였다.
불용성 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질 바인더의 중간규모 발현 및 정제
발현을 위해, 선택된 클론(들), 이어서 HIS6 태그를 pET9d 벡터 내로 클로닝하고, 이. 콜라이 BL21 DE3 plysS 세포에서 발현시켰다. 20 ml의 접종 배양액 (단일 플레이팅된 콜로니로부터 생성된)를 사용하여 50 ㎍/ml 카나마이신 및 34 ㎍/ml 클로람페니콜을 함유하는 1 리터의 LB 배지 또는 TB-철야 발현 배지 (자가 유도)를 접종하였다. LB 배지 내의 배양액을 37℃에서 A600 0.6-1.0까지 인큐베이션하고, 이때 이를 1 mM 이소프로필-β-티오갈락토시드 (IPTG)로 유도하고, 4시간 동안 30℃에서 성장시켰다. TB-철야 발현 배지에서 성장한 배양액을 37℃에서 5시간 인큐베이션하고, 이때 온도를 18℃로 낮추고, 19시간 동안 성장시켰다. 배양액을 30분 동안 10,000 g 이상 및 4℃에서 원심분리에 의해 수거하였다. 세포 펠릿을 -80℃에서 동결시켰다. 세포 펠릿을 울트라-투락스(ULTRA-TURRAX)? 균질화기 (IKA 웍스 (works))를 사용하여 얼음 상에서 25 ml의 용해 완충제 (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1x 완전 프로테아제 억제제 칵테일-EDTA 프리 (로슈), pH 7.4) 내에 재현탁시켰다. 세포 용해는 모델 M-110S 마이크로플루다이저? (마이크로플루이딕스 (Microfluidics))를 사용하는 고압 균질화 (≥18,000 psi)에 의해 달성하였다. 불용성 분획을 30분 동안 23,300 g 이상 및 4℃에서 원심분리에 의해 분리하였다. 용해물의 원심분리로부터 회수한 불용성 펠릿을 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl (pH 7.4)로 세척하였다. 펠릿을 초음파 처리하면서 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl (pH 7.4) 내의 6.0 M 구아니딘 히드로클로라이드에 재가용화시키고, 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 재가용화된 펠릿을 0.45 ㎛로 여과하고, 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl/6.0 M 구아니딘 (pH 7.4) 완충제로 평형화시킨 히스트랩(HISTRAP)? 칼럼 상으로 로딩하였다. 로딩 후에, 칼럼을 추가의 25 CV 동안 동일한 완충제로 세척하였다. 결합된 단백질을 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl/6.0 M 구안-HCl (pH 7.4) 내의 50 mM 이미다졸로 용리하였다. 정제된 단백질을 50 mM 아세트산나트륨/150 mM NaCl (pH 4.5) 또는 PBS (pH 7.2)에 대한 투석에 의해 재폴딩시켰다.
가용성 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질 바인더의 중간규모 발현 및 정제
불용성 바인더의 정제에 대한 대안으로서, 가용성 바인더의 정제를 또한 이용할 수 있다. 발현을 위해, 선택된 클론(들), 이어서 HIS6 태그를 pET9d 벡터 내로 클로닝하고, 이. 콜라이 BL21 DE3 plysS 세포에서 발현시켰다. 20 ml의 접종 배양액 (단일 플레이팅된 콜로니로부터 생성된)를 사용하여 50 ㎍/ml 카나마이신 및 34 ㎍/ml 클로람페니콜을 함유하는 1 리터의 LB 배지 또는 TB-철야 발현 배지 (자가 유도)를 접종하였다. LB 배지 내의 배양액을 37℃에서 A600 0.6-1.0까지 인큐베이션하고, 이때 이를 1 mM 이소프로필-β-티오갈락토시드 (IPTG)로 유도하고, 4시간 동안 30℃에서 성장시켰다. TB-철야 발현 배지에서 성장한 배양액을 37℃에서 5시간 인큐베이션하고, 이때 온도를 18℃로 낮추고, 19시간 동안 성장시켰다. 배양액을 30분 동안 10,000 g 이상 및 4℃에서 원심분리에 의해 수거하였다. 세포 펠릿을 -80℃에서 동결시켰다. 세포 펠릿을 울트라-투락스? 균질화기 (IKA 웍스)를 사용하여 얼음 상에서 25 ml의 용해 완충제 (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1x 완전 프로테아제 억제제 칵테일-EDTA 프리 (로슈), pH 7.4) 내에 재현탁시켰다. 세포 용해는 모델 M-110S 마이크로플루다이저? (마이크로플루이딕스)를 사용하는 고압 균질화 (≥18,000 psi)에 의해 달성하였다. 불용성 분획을 30분 동안 23,300 g 이상 및 4℃에서 원심분리에 의해 분리하였다. 상청액을 0.45 ㎛ 필터를 통해 정화하였다. 정화한 용해물을 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl (pH 7.4)로 예비-평형화시킨 히스트랩? 칼럼 (GE) 상으로 로딩하였다. 이어서 칼럼을 25배 칼럼 부피의 동일한 완충제, 이어서 20배 칼럼 부피의 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl/25 mM 이미다졸 (pH 7.4) 및 이어서 35배 칼럼 부피의 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl/40 mM 이미다졸 (pH 7.4)로 세척하였다. 15배 칼럼 부피의 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl/500 mM 이미다졸 (pH 7.4)로 단백질을 용리시키고, 분획을 A280에서의 흡광도를 기초로 하여 모으고, 1x PBS, 50 mM 트리스(Tris), 150 mM NaCl (pH 8.5) 또는 50 mM NaOAc; 150 mM NaCl (pH 4.5)에 대해 투석하였다. 0.22 ㎛에서 여과함으로써 임의의 침전물을 제거하였다.
피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질 (애드넥틴)은 다양한 크기 및 종류의 PEG로 peg화될 수 있다. peg화를 허용하기 위해서, 10FN3 단백질의 C-말단부에서 발견되는 천연 발생 잔기 EIDKPSQ는 아미노산, 대개 세린의 시스테인으로의 단일 점 돌연변이에 의해 변형될 수 있다. 단일 시스테인 잔기에서 단백질의 PEG화는 다양한 말레이미드-유도체화된 PEG 형태를 접합하고, PEG 시약을 단백질 용액과 조합하고, 인큐베이션함으로써 수행된다. 다른 방법은 EIDKPSQ 테일을 GSGC 링커로 교체하고, 유사하게 PEG화를 위해 시스테인 잔기를 사용하는 것이다. 조작된 시스테인 잔기를 함유하는 애드넥틴은 시스테인 상의 티올기와 PEG 시약의 말레이미드 관능기 사이의 마이클 (Michael)-부가 화학을 통해 PEG와 접합되었다. 간단히 설명하면, 40 kDa PEG를 약산성 내지 중성 조건 하에 몰 과량으로 단백질 용액에 첨가하였다. 반응을 실온에서 2시간 내지 밤새 진행시켰다. 이어서, 반응액을 반응하지 않은 PEG-말레이미드 및 비-PEG화 애드넥틴으로부터 PEG화 애드넥틴을 분리하기 위해 이온 교환 칼럼에 적용하였다. SE/HPLC 방법을 또한 사용할 수 있다. 정제된 PEG화 애드넥틴은 대개 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석된다.
실시예 6
후보 혈청 알부민-결합 애드넥틴 (SABA)의 스크리닝 및 선택
PRO융합으로 알려진 선택 기법 (예를 들어, 문헌 [Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(23):12297-12302 (1997)] 및 WO 2008/066752 참조)을 10Fn3의 BC, DE 및 FG 루프로 설계된 가변 영역을 갖는 DNA 라이브러리에 적용하였다. 상기 설계로부터 1013개 초과 분자의 무작위 라이브러리를 생성하고, 바람직한 결합 특성을 갖는 후보 혈청 알부민-결합 애드넥틴 (SABA)을 단리하기 위해 선택 압력을 HSA의 비오티닐화 형태에 적용하였다.
고효율 단백질 생산 (HTTP) 공정
다양한 HSA 결합 애드넥틴을 고효율 단백질 생산 공정 (HTPP)을 사용하여 정제하였다. 선택된 바인더를 HIS6 태그를 함유하는 pET9d 벡터 내로 클로닝하고, 이. 콜라이 BL21(DE3)pLysS 세포 내로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 24-웰 포맷으로 50 ㎍/mL 카나마이신을 함유하는 5 ml LB 배지 내에 접종하고, 37℃에서 밤새 성장시켰다. 밤새 배양한 배양액으로부터 200 ㎕를 흡인하고 이를 적절한 웰 내로 분배함으로써 신선한 5 ml LB 배지 (50 ㎍/mL 카나마이신) 배양액을 유도가능 발현을 위해 제조하였다. 배양액을 A600 0.6-0.9까지 37℃에서 성장시켰다. 1 mM 이소프로필-β-티오갈락토시드 (IPTG)를 사용한 유도 후에, 배양액을 추가 4시간 동안 30℃에서 성장시키고, 10분 동안 3220 x g 및 4℃에서 원심분리에 의해 수거하였다. 세포 펠릿을 -80℃에서 동결시켰다.
세포 펠릿 (24-웰 포맷에서)을 450 ㎕의 용해 완충제 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1x 완전 프로테아제 억제제 칵테일-EDTA 프리 (로슈), 1 mM PMSF, 10 mM CHAPS, 40 mM 이미다졸, 1 mg/ml 리소자임, 30 ㎍/ml DNAse, 2 ㎍/ml 아프로토닌, pH 8.0) 내에 재현탁시킴으로써 용해시키고, 실온에서 1시간 동안 진탕하였다. 용해물을 정화하고, 96-웰, 650 ㎕ 포획 플레이트가 구비된 96-웰 와트만 GF/D 유니필터? 내로 전달함으로써 96-웰 포맷으로 재구성하고, 5분 동안 200 x g에서 원심분리하였다. 정화한 용해물을 평형화 완충제 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 10 mM CHAPS, 40 mM 이미다졸, pH 8.0)로 평형화시킨 96-웰 Ni-킬레이팅 플레이트로 전달하고, 5 min 동안 인큐베이션하였다. 비결합된 물질을 제거하였다. 수지를 세척 완충제 #1 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 5 mM CHAPS, 40 mM 이미다졸, pH 8.0)로 2 x 0.3 ml/웰로 세척하였다. 이어서, 수지를 PBS로 3 x 0.3 ml/웰 세척하였다. 용리 전에, 각각의 웰을 50 ㎕ 용리 완충제 (PBS + 20 mM EDTA)로 세척하고, 5 min 동안 인큐베이션하고, 상기 세척액을 진공에 의해 버렸다. 추가의 100 ㎕의 용리 완충제를 각각의 웰에 적용함으로써 단백질을 용리시켰다. 실온에서 30분 인큐베이션 후에, 플레이트(들)을 5분 동안 200 x g에서 원심분리하고, 용리된 단백질을 Ni-플레이트의 바닥에 부착된 5 ㎕의 0.5 M MgCl2를 함유하는 96-웰 포획 플레이트에 수거하였다. 단백질 표준물로서 SGE (대조 애드넥틴)를 사용하는 BCA 단백질 검정을 사용하여 용리된 단백질을 정량하였다. SGE 애드넥틴은 인테그린 결합 도메인 (위치 78-80의 아미노산 RGD)이 SGE로 교체된 야생형 10Fn3 도메인 (서열 1)이다.
HSA, RhSA 및 MuSA 직접 결합 ELISA
HSA에 대한 직접적인 바인더의 검정을 위해, 맥시소르프(MaxiSorp) 플레이트 (넝크 인터내셔널 (Nunc International, 미국 뉴욕주 로체스터))를 PBS 내의 10 ㎍/mL HSA (시그마, 미국 미주리주 세인트루이스)로 4℃에서 밤새 코팅한 후, 카세인 차단 완충제 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific, 미국 일리노이주 록포드)) 내에서 1-3시간 동안 실온에서 차단하였다. 단일-점 스크리닝 검정을 위해, 정제된 HTPP 애드넥틴을 카세인 차단 완충제 내에 1:20으로 희석하고, 각각의 웰 내에서 1시간 동안 실온에서 HSA에 결합하도록 하였다. 용량 반응 검정을 위해, 0.1 nM 내지 1 μM 이하 범위의 농도를 사용하였다. 미결합 애드넥틴을 제거하기 위해 PBST 내에서 세척한 후, 결합된 His-태깅된 애드넥틴에 카세인 차단 완충제 내에 1:2500으로 희석된 항-His mAb-HRP 접합체 (알&디 시스템즈, 미국 미네소타주)를 1시간 동안 실온에서 첨가하였다. PBST로 세척함으로써 과량의 접합체를 제거하고, 결합된 애드넥틴을 제조자의 지시에 따라 TMB 검출 시약 (비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences))을 사용하여 검출하였다.
후보 혈청 알부민-결합 애드넥틴 (SABA)의 확인
HSA/RhSA/MuSA 결합 및 생물물리학적 기준에 대한 스크리닝의 결과로서, 4개의 특유한 혈청 알부민-결합 애드넥틴 (SABA)을 확인하고, 그의 반감기를 마우스에서 평가하도록 선택하였다. 시험관내 및 생체내 특성결정을 수행하기 위해, 4개의 SABA에 대해 중간규모 시험을 착수하였다. 표 3은 SABA 1-26으로 지정된, PRO융합으로부터 확인된 26개의 특유한 SABA 코어 서열의 서열을 제공한다. SABA4는 중간규모 시험 전에 고정된 스캐폴드 돌연변이를 보유하였다. SABA4의 스캐폴드-완전 버전은 SABA5이다. SABA4 및 SABA5는 BC, DE, 및 FG 루프에 동일한 서열을 갖는다.
실시예 7
후보 SABA의 생산 및 제제화
SABA의 중간규모 단백질 생산
선택된 SABA, 이어서 HIS6 태그를 pET9d 벡터 내로 클로닝하고, 이. 콜라이 BL21(DE3)pLysS 세포 (SABA1.1, SABA2.1, SABA3.1, 및 SABA5.1로 지정된 각각의 His-태깅된 SABA 서열에 대해서는 표 3 참조)에서 발현시켰다. 20 ml의 접종 배양액 (단일 플레이팅된 콜로니로부터 생성된)를 사용하여 50 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 1 리터의 LB 배지에 접종하였다. 배양액을 37℃에서 A600 0.6-1.0까지 인큐베이션하였다. 1 mM 이소프로필-β-티오갈락토시드 (IPTG)를 사용한 유도 후에, 배양액을 추가의 4시간 동안 30℃에서 성장시키고, 30분 동안 10,000 x g 이상 및 4℃에서 원심분리에 의해 수거하였다. 세포 펠릿을 -80℃에서 동결시켰다. 세포 펠릿을 울트라-투락스? 균질화기 (IKA 웍스)를 사용하여 얼음 상에서 25 ml의 용해 완충제 (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1x 완전 프로테아제 억제제 칵테일-EDTA 프리 (로슈), pH 7.4) 내에 재현탁시켰다. 세포 용해는 모델 M-110S 마이크로플루다이저? (마이크로플루이딕스)를 사용하는 고압 균질화 (≥18,000 psi)에 의해 달성하였다. 가용성 분획을 30분 동안 23,300 x g 및 4℃에서 원심분리에 의해 분리하였다. 상청액을 0.45 ㎛ 필터를 통해 정화하였다. 정화한 용해물을 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl (pH 7.4)로 예비-평형화시킨 히스트랩? 칼럼 (GE) 상으로 로딩하였다. 이어서, 칼럼을 25배 칼럼 부피의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl (pH 7.4), 이어서 20배 칼럼 부피의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 25 mM 이미다졸 (pH 7.4), 이어서 35배 칼럼 부피의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 40 mM 이미다졸 (pH 7.4)로 세척하였다. 단백질을 15배 칼럼 부피의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 500 mM 이미다졸 (pH 7.4)로 용리시키고, 분획을 A280에서의 흡광도를 기초로 하여 모으고, 1x PBS, 50 mM 트리스, 150 mM NaCl (pH 8.5) 또는 50 mM NaOAc; 150 mM NaCl (pH 4.5)에 대해 투석하였다. 0.22 ㎛에서 여과함으로써 임의의 침전물을 제거하였다.
중간규모 발현 및 정제를 통해, 가용성 형태로 발현되고 박테리아 시토졸의 가용성 분획으로부터 정제된 고도로 순수한 활성 애드넥틴이 수득되었다. 100 mM NaPO4, 100 mM NaSO4, 150 mM NaCl (pH 6.8) (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))의 이동 상에서 수퍼덱스(SUPERDEX)? 200 또는 수퍼덱스? 75 10/30GL 상의 SEC 분석은 주로 단량체 애드넥틴을 보여주었다.
SABA1.2의 제제
1개의 특이적 SABA, 즉 SABA1.2 (서열 180)를 예비 제제 스크린을 위해 선택하였다. SABA1.2는 10Fn3의 "코어 1" 서열 상에 (ED)5 연장부를 포함한다. SABA1.2에 대해, pH 6.0 및 5 mg/mL의 생성물 농도에서 10 mM 숙신산, 8% 소르비톨, 5% 글리신의 안정한 제제가 확인되었다. 상기 제제에서, 단백질 용융 온도는 1.25 mg/mL의 단백질 농도를 사용하여 시차 주사 열량계 (DSC)에 의해 결정할 때 75℃이었다. 이 제제는 4℃ 및 25℃에서 만족스러운 물리적 및 화학적 안정성을 제공하였고, 초기 응집체 수준은 1.2%이었다. 1개월의 안정화 후에, 응집 수준은 매우 낮았다 (4℃에서 1.6% 및 25℃에서 3.8%). 또한, 단백질은 -80℃ 내지 -20℃에서 주변 온도로 변하는 5 사이클의 동결-해동 후에 상기 제제 내에서 안정하였다. 추가로, 상기 제제에서, SABA1.2는 침전 또는 응집 증가를 보이지 않으면서 4℃ 및 주변 온도에서 적어도 20 mg/mL 단백질 농도로 가용성이었다.
실시예 8
후보 SABA의 생물물리학적 특성 결정
크기 배제 크로마토그래피
중간규모 공정으로부터 생성된 후보 SABA에 대해 표준 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 수행하였다. 중간규모 물질에 대한 SEC를 A214 nm 및 A280 nm에서의 UV 검출 및 형광 검출 (여기 = 280 nm, 방출 = 350 nm)을 사용하여 애질런트 (Agilent) 1100 또는 1200 HPLC 시스템에서 수퍼덱스? 200 10/30 또는 수퍼덱스? 75 10/30 칼럼 (지이 헬쓰케어)을 사용하여 수행하였다. 100 mM 황산나트륨, 100 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨 (pH 6.8)의 완충제를 SEC 칼럼의 적절한 유동 속도에서 사용하였다. 겔 여과 표준물 (바이오-라드 래보래토리즈, 미국 캘리포니아주 허큘레스)을 분자량 보정을 위해 사용하였다.
중간규모의 정제된 SABA에 대한 SEC의 결과는 우세하게 단량체성 애드넥틴 및 제시된 바와 같은 10 kDa 대 구상 겔 여과 표준물 (바이오라드)의 대략적인 범위의 용리를 보여주었다.
열 안정성
중간규모의 SABA에 대한 시차 주사 열량계 (DSC) 분석을 수행하여 그 각각의 Tm을 결정하였다. 온도를 3 atm 압력 하에 분당 1도의 속도로 5℃로부터 95℃로 증가시킴으로써 1 mg/ml 용액을 N-DSC II 열량계 (칼로리메트리 사이언시즈 코퍼레이션 (Calorimetry Sciences Corp))로 스캐닝하였다. 오르긴 (Orgin) 소프트웨어 (오르긴랩 코퍼레이션 (OrginLab Corp))을 사용한 최적 맞춤 (best fit)을 사용하여 적절한 완충제의 대조군 시행에 대비하여 데이터를 분석하였다. SEC 및 DSC 분석의 결과를 표 11에 요약한다.
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실시예 9
혈청 알부민에 결합하는 후보 SABA1의 특성 결정
각각의 혈청 알부민 (HSA/RhSA/MuSA)을 비아센서 (Biasensor) CM5 칩의 표면 상에 포획하고 일련의 농도의 SABA를 참조 유동 세포 및 포획된 알부민 둘 모두 상에 유동시킴으로써, HTPP 및/또는 중간규모 물질로부터 정제된 선택된 SABA 클론의 동역학을 결정하였다. 추가로, 알부민에 대한 결합은 pH 5.5 내지 pH 7.4의 다양한 pH 조건 하에서 수행하였다. HSA-결합 애드넥틴인 SABA2.1, SABA3.1, SABA4.1 (SABA5.1) & SABA1.1은 RhSA와 교차반응하지만, MuSA와는 교차반응하지 않았다. SABA2 및 SABA4 결합은 pH 감수성인 반면, 클론 SABA3은 HSA에 결합하는 pH 저항성 하한이 pH 6.0까지 감소됨을 보였다. SABA1.1은 pH 5.5까지 하향된 pH 저항성 및 친화도/동역학에 대한 생화학적 기준을 충족하였다.
도메인 맵핑을 비아코어에 의해 결정하였다. HSA 또는 단지 HSA-도메인 I & II 또는 HSA-도메인 III으로만 이루어진 구축물을 비아센서 CM5 칩의 표면 상에 포획하고 일련의 농도의 SABA를 참조 유동 세포 및 포획된 알부민 둘 모두 상에 유동시킴으로써 HTPP 및/또는 중간규모 물질로부터 정제된 선택된 SABA 클론을 결정하였다. 클론 SABA2 & SABA1은 HSA 및 HSA-도메인 I-II 구축물에 결합하지만, HSA-도메인 III 구축물에는 결합하지 않았다. 클론 SABA3 & SABA4는 HSA에 결합하지만, HSA-도메인 I-II 또는 HSA-도메인 III 구축물에는 결합하지 않았다. 그 결과를 표 12에 요약한다.
Figure pct00025
실시예 10
후보 SABA의 생체내 t1 /2의 조사
HSA-결합 애드넥틴은 MuSA와 교차반응하지 않기 때문에 마우스 내의 HSA의 반감기는 마우스에서의 HSA-결합 애드넥틴 평가를 가능하게 하는 것으로 결정되었다. HSA를 20 mg/kg (도 11a) 및 50 mg/kg 용량 (도 11b)으로 약 6주령 Ncr 암컷 누드 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사하고, 주사후 일정 시간 간격으로 채혈한 혈액 샘플 내의 HSA의 농도를 ELISA에 의해 결정하였다. 20 mg/kg 및 50 mg/kg으로 마우스 내로 주사된 HSA의 t1 /2은 각각 약 24 hr 및 약 20 hr으로 결정되었다.
마우스에서 SABA1-4의 반감기 결정
HSA 결합 클론 SABA1.1, SABA2.1, SABA3.1, 및 SABA4.1의 1리터의 이. 콜라이 성장액을 제조하고, 정제하고, 내독소를 제거하였다. 각각의 SABA 변이체를 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사하고, 주사후 일정 시간 간격으로 채혈한 혈액 샘플 내의 농도를 ELISA에 의해 결정하였다.
각각의 SABA의 약동학 프로파일을 약 6주령 Ncr 암컷 누드 마우스에서 HSA의 존재 또는 부재 하에 비교하였다. HSA를 동시-주사한 마우스는 각각의 SABA와 예비혼합된 HSA (3-4몰 과량의 HSA)를 가졌고, 그 이유는 결합하는 클론이 HSA 및 RhSA에 대해 선택적이었고, 마우스 혈청 알부민에는 결합하지 않았기 때문이다. 마우스 혈장 내에서 SABA1.1의 반감기는 0.56시간인 반면에, HSA와 동시-주사한 SABA1.1의 반감기는 5.6시간으로서, 반감기가 약 10배 증가하였다 (도 12a). 마우스 혈장 내에서 SABA2.1의 반감기는 0.24시간인 반면에, HSA와 동시-주사한 SABA2.1의 반감기는 2.8시간으로서, 반감기가 약 12배 증가하였다 (도 12b). 마우스 혈장 내의 SABA3.1의 반감기는 0.28시간인 반면에, HSA와 동시-주사한 SABA3.1의 반감기는 0.53시간으로서, 반감기가 약 2배 증가하였다 (도 12c). 마우스 혈장 내의 SABA4.1의 반감기는 0.66시간인 반면에, HSA와 동시-주사한 SABA4의 반감기는 4.6시간으로서, 반감기가 약 7배 증가하였다 (도 12d). 본 실시예의 개요를 도 13a에 제시한다.
사이노몰거스 원숭이에서 SABA1.1 및 SABA5.1의 반감기 결정
2마리의 사이노몰거스 원숭이에서 1 mg/kg (mpk) 용량 (IV)에서 약동학을 평가하기 위해서 SABA1.1 및 SABA5.1의 개념 연구의 3주 단일 용량 시험을 사이노몰거스 원숭이에서 수행하였다. 약동학은 혈장 샘플에서 애드넥틴을 검출하기 위해 개발된 정량적 ELISA-기반 검정을 사용하여 평가하였다. SABA1.1은 96-137시간 범위의 반감기를 갖는다. SABA5.1은 약 12시간의 반감기를 갖고, ELISA에서 120시간까지만 측정가능하였다. 도 14a 및 14b는 이들 클론에 대한 데이터를 요약하고, 사이노몰거스 원숭이로부터의 데이터를 비교한다.
실시예 11
혈청 알부민에 결합하는 SABA1의 특성 결정
SABA1.1 및 1.2는 HSA 및 RhSA에 결합한다.
(ED)5 연장부를 포함하는 "코어 1" 10Fn3인 SABA1.2 (서열 190)는 중성 pH 및 25℃에서 55.3 nM의 계산된 평균 Kd에 대해 8.21E+03 M-1s-1의 평균 결합 속도 상수 (ka), 및 4.43E-04 s-1의 평균 해리 속도 상수 (kd)로 인간 혈청 알부민 (HSA)에 결합하였다 (표 13). 붉은털원숭이 혈청 알부민 (RhSA)의 경우, 측정된 평균 결합 속도 상수는 6.6E+03 M-1s-1이고, 해리 속도 상수는 3.78E-03 s-1이었고, 계산된 평균 Kd는 580 nM이었다. 1 μM까지는 SABA1.2와 마우스 또는 래트 혈청 알부민 사이에서 측정가능한 상호작용을 관찰할 수 없었다 (표 13 및 도 15). 37℃에서, ka 및 kd는 2 내지 5배 증가하였고, 이것은 HSA에 대한 친화도의 약 2배 증가 및 RhSA에 대한 친화도의 1/2 감소를 야기하였다 (표 13).
Figure pct00026
추가로, SABA1과 HSA 사이의 화학량론을 결정하기 위해 열량 측정 적정을 수행하였다. 상기 연구를 위해, His6 연장부를 포함하는 "코어 1" 10Fn3인 SABA1.1 (서열 189)을 사용하였다. HSA (115 μM 단백질 용액의 주사당 10 ㎕)를 8.1 μM의 농도로 SABA1.1을 함유하는 열량측정 셀 내로 주입하였다. 실험은 PBS 완충제 (pH 7.4) 내에서 37℃에서 수행하였다. 도 16은 SABA1.1이 1:1의 화학량론으로 HSA에 결합함을 보여준다.
SABA1.2는 낮은 pH에서 HSA에 강하게 결합한다
알부민이 긴 반감기 (예를 들어, HSA의 t1 /2은 19일이다)를 갖는 것은 이들이 주로 낮은 pH 조건 하에서 엔도솜 내부에 존재하는 신생 Fc 수용체인 FcRn에 대한 결합에 의해 세포내 이입 (endocytic) 경로로부터 재순환되기 때문이다. 표 14에 제시된 바와 같이, SABA1.2는 5.5의 엔도솜 pH에서 HSA에 강하게 결합하였고, 이것은 HSA에 일단 결합되면 SABA1의 t1 /2도 또한 FcRn 재순환 메카니즘에 의해 연장됨을 시사한다.
Figure pct00027
SABA1.2는 HSA의 도메인 I 및 II에 결합하지만, 도메인 III에는 결합하지 않는다.
알부민 상의 SABA1.2 결합 부위를 재조합 HSA 단편을 사용하여 N-말단 도메인 I 또는 II에 맵핑하였고, 도메인 III에 대한 검출가능한 결합은 존재하지 않았다 (도 17). 도메인 III은 주로 FcRn과 상호작용하는 HSA의 도메인이기 때문에 SABA1.2가 FcRn에 대한 HSA 결합과 경쟁할 가능성은 작고, 이것은 다시 향상된 반감기에 대한 재순환 메카니즘을 충분히 상승시킬 가능성을 증가시킨다.
실시예 12
SABA1.2의 생체내 약물학
2개의 상이한 용량 수준에서 약동학 및 면역원성을 평가하기 위해 SABA1.2에 대한 4주의 단일 용량 예비-독성학 연구를 사이노몰거스 원숭이에서 수행하였다. 약동학 및 면역원성은 또한 정맥내 및 피하 투여 아암을 모두 포함하는 3주의 단일 용량 예비-독성학 연구로 평가하였다. 추가로, SABA1.2의 약동학을, 혈장 샘플 내에서 SABA1.2를 검출하기 위해 개발된 정량적 ELISA-기반 검정을 이용하여 사이노몰거스 원숭이에서 2개의 별개의 단일 용량 예비-독성학 연구로 평가하였다.
SABA1.2를 원숭이에게 1 mpk 및 10 mpk IV로 투여하였다. 도 18 및 아래 기재된 파라미터에 제시된 바와 같이, Cmx 및 AUC는 용량과 대략 선형 관계로 증가하였다. 약동학적 파라미터를 평가하기 위해 윈논린(WINNONLIN)? 소프트웨어를 사용하는 비-구획 분석을 수행하였다. 10 mpk에서 SABA1.2에 대한 청소율 (CL)은 0.15 ml/hr/kg이었고, 베타기 반감기 (t1 /2)는 143시간이었고, 분포 용적 (Vz)은 30 mL/kg이었고, 총 약물 노출 (AUCall)은 5,609,457 hr*nmol/L이었다 (표 15). 1 mpk에서 SABA1.2에 대한 청소율 (CL)은 0.4 ml/hr/kg이었고, 반감기 (t1 /2)는 124시간이었고, 분포 용적 (Vz)은 72 mL/kg이었고, 총 약물 노출 (AUCall)은 214,636 hr*nmol/L이었다 (표 15).
SABA1.2의 SC 또는 IV 투여 후에, 베타기 약동학 프로파일은 유사하였다 (도 19). 약동학적 파라미터를 평가하기 위해 윈논린? 소프트웨어를 사용한 비-구획 분석을 수행하였다. 1 mpk IV에서 SABA1.2에 대한 청소율 (CL)은 0.22 ml/hr/kg이었고, 베타기 반감기 (t1 /2)는 125시간이었고, 분포 용적 (Vz)은 40 mL/kg이었고, 총 약물 노출 (AUCall)은 357,993 hr*nmol/L이었다 (표 15). 1 mpk SC에서 SABA1.2에 대한 청소율 (CL)은 0.32 ml/hr/kg이었고, 베타기 반감기 (t1 /2)는 134시간이었고, 분포 용적 (Vz)은 62 mL/kg이었고, 총 약물 노출 (AUCall)은 251,339 hr*nmol/L이었다 (표 15). IV에 비해 SC의 상대적인 생체이용률 (F)은 0.7이었다.
Figure pct00028
SEQUENCE LISTING <110> Bristol-Myers Squibb Company Schneeweis, Lumelle Bush, Alex Dasgupta, Ruchira Engle, Linda <120> Fibronectin Based Scaffold Domain Proteins That Bind IL-23 <130> 11563 PCT <150> 61/305566 <151> 2010-02-18 <150> 61/330706 <151> 2010-05-03 <160> 258 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp 65 70 75 80 Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <223> BC Loop <400> 2 Gly His Tyr Pro Met His Val 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Polypeptide 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atagccctgt ccaggagttc actgtgcctg ttccgcgtta cacagctacc 180 atcagcggcc ttaaacctgg cgttgattat accatcactg tgtatgctgt cacttactac 240 gctcaggaaa actacaaaga aatcccaatt tccattaatt accgcacaga aattgacaaa 300 ccatcccagc accatcacca ccaccactga 330 <210> 253 <211> 330 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <223> 1550C05 <400> 253 atgggagttt ctgatgtgcc gcgcgacctg gaagtggttg ctgccacccc caccagcctg 60 ctgatcagct ggggtcatta cccgatgcat gttcgatatt accgcatcac ttacggcgaa 120 acaggaggca atagccctgt ccaggagttc actgtgcctc cgcgtcgtta cacagctacc 180 atcagcggcc ttaaacctgg cgttgattat accatcactg tgtatgctgt cacttactac 240 aacgaagctg actactctca gatcccaatt tccattaatt accgcacaga aattgacaaa 300 ccatcccagc accatcacca ccaccactga 330 <210> 254 <211> 330 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <223> 1550E03 <400> 254 atgggagttt ctgatgtgcc gcgcgacctg gaagtggttg ctgccacccc caccagcctg 60 ctgatcagct ggggtcatta cccgctgcat atccgatatt accgcatcac ttacggcgaa 120 acaggaggca atagccctgt ccaggagttc actgtgcctc gtatgcgtca tacagctacc 180 atcagcggcc ttaaacctgg cgttgattat accatcactg tgtatgctgt cacttactac 240 tccgaagaac tgtacaaata catcccaatt tccattaatt accgcacaga aattgacaaa 300 ccatcccagc accatcacca ccaccactga 330 <210> 255 <211> 330 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <223> 1550E06 <400> 255 atgggagttt ctgatgtgcc gcgcgacctg gaagtggttg ctgccacccc caccagcctg 60 ctgatcagct ggggtcatta cccgatgcat gttcgatatt accgcatcac ttacggcgaa 120 acaggaggca atagccctgt ccaggagttc actgtgcctc cgccgcgtca taccgctacc 180 atcagcggcc ttaaacctgg cgttgattat accatcactg tgtatgctgt cacttactac 240 gctcaggaaa actacaaaga aatcccaatt tccattaatt accgcacaga aattgacaaa 300 ccatcccagc accatcacca ccaccactga 330 <210> 256 <211> 330 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <223> 1550H05 <400> 256 atgggagttt ctgatgtgcc gcgcgacctg gaagtggttg ctgccacccc caccagcctg 60 ctgatcagct ggggtcatta cccgctgcat gttcgatatt accgcatcac ttacggcgaa 120 acaggaggca atagccctgt ccaggagttc actgtgcctc gtcagatcta cacagctacc 180 atcagcggcc ttaaacctgg cgttgattat accatcactg tgtatgctgt cacttactac 240 aacgaagctg actactctca gatcccaatt tccattaatt accgcacaga aattgacaaa 300 ccatcccagc accatcacca ccaccactga 330 <210> 257 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Polypeptide <220> <221> misc_feature <223> BC Loop common sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be M or L <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be I or V <400> 257 Gly His Tyr Pro Xaa His Xaa 1 5 <210> 258 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Polypeptide <220> <221> misc_feature <223> FG Loop common sequence motif <220> <221> misc_feature <222> (3)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 258 Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Ile 1 5 10

Claims (16)

  1. 피브로넥틴 타입 III 제10 도메인 (10Fn3)을 포함하고, 여기서 10Fn3이 인간 10Fn3 도메인의 상응하는 루프의 서열에 비해 변경된 아미노산 서열을 갖는 루프 BC, DE, 및 FG로부터 선택된 적어도 하나의 루프를 갖는 것인, IL-23의 p19 하위단위에 500 nM 미만의 KD로 결합하는 폴리펩티드.
  2. 피브로넥틴 타입 III 제10 도메인 (10Fn3)을 포함하고, 여기서 10Fn3이 인간 10Fn3 도메인의 상응하는 루프의 서열에 비해 변경된 아미노산 서열을 갖는 루프 BC, DE, 및 FG로부터 선택된 적어도 하나의 루프를 갖는 것인, IL-23의 p19 하위단위의 구조적 에피토프에 결합하는 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, BC 루프가 서열 2-6으로부터 선택된 것인 폴리펩티드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, DE 루프가 서열 7-48로부터 선택된 것인 폴리펩티드.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, FG 루프가 서열 49-59로부터 선택된 것인 폴리펩티드.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, BC, DE 또는 FG 루프 아미노산 서열이 서열 2-59 중 임의의 하나에 적어도 80% 동일한 것인 폴리펩티드.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리펩티드 아미노산 서열이 서열 60-100 중 임의의 하나에 적어도 90% 동일한 것인 폴리펩티드.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리펩티드 아미노산 서열이 서열 60-100의 아미노산 3-96에 적어도 90% 동일한 것인 폴리펩티드.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, BC 루프 서열 모티프가 서열 257에 제시된 GHYPX1HX2이고, 여기서 X1이 메티오닌 또는 류신이고, X2가 이소류신 또는 발린인 폴리펩티드.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, FG 루프 서열 모티프가 서열 258에 제시된 YYX3X3X3X3YX3X3I이고, 여기서 X3이 임의의 아미노산일 수 있는 것인 폴리펩티드.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜, 시알산, Fc, Fc 단편, 트랜스페린, 혈청 알부민, 혈청 알부민 결합 단백질 및 혈청 이뮤노글로불린 결합 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 약동학적 (PK) 모이어티를 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서, PK 모이어티가 폴리에틸렌 글리콜인 폴리펩티드.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시스테인 링커를 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  14. 제13항에 있어서, 시스테인 링커가 서열 101에 제시된 아미노산 GSGC 및 서열 102에 제시된 EIDKPCQ로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하고, 본질적으로 내독소가 존재하지 않는 제약상 허용되는 조성물.
  16. 내인성 IL-23과 Th17 세포의 반응을 방해하기에 효과적인 양으로 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 IL-23과 접촉시키는 것을 포함하는, Th17 세포의 병원성을 조절하는 방법.
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