CN108884147B - 结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基于纤连蛋白的支架分子 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3结合的包含纤连蛋白III型第十结构域(10Fn3)的多肽。还提供了在诊断和治疗应用中使用的包含与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3结合的10Fn3结构域的融合分子。还提供了磷脂酰肌醇蛋白聚糖3‑10Fn3药物缀合物。

Description

结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基于纤连蛋白的支架分子
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年9月23日提交的美国临时申请No.62/222,633的优先权，将其内容通过提述明确并入本文。在整个本说明书中引证的任何专利、专利申请、和参考文献的内容都通过提述完整并入本文。
背景
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3是属于磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的癌胚抗原，磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族是由糖基磷脂酰肌醇锚接的硫酸肝素蛋白聚糖组成的。磷脂酰肌醇蛋白聚糖调节若干生长因子的活性，这些生长因子包括Wnts、刺猬因子(Hedgehogs)、骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子(FGF)(Filmus等人，FEBS J.2013,280:2471-2476)。磷脂酰肌醇蛋白聚糖的特征是与称为硫酸肝素糖胺聚糖的多糖链的共价连接。磷脂酰肌醇蛋白聚糖参与细胞-胞外基质界面的细胞信号转导。(Sasisekharan等人，Nature Reviews|Cancer,Volume 2(2002)。迄今为止，已经鉴定了人磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的六个不同成员。细胞膜结合的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3由通过一个或多个二硫键连接的两个亚基组成。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达在发育过程中的胎肝和胎盘中，并且在正常的成人组织中被下调或沉默。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3基因的突变和缺失是引起人类中Simpson-Golabi-Behmel或Simpson畸形综合征的原因。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3表达于各种癌症，特别是肝细胞癌(“HCC”)、黑素瘤、维尔姆斯瘤和肝母细胞瘤。(Jakubovic和Jothy；Ex.Mol.Path.82:184-189(2007)；Nakatsura和Nishimura,Biodrugs 19(2):71-77(2005)。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞表面形式在HCC(>50％)和包括鳞状肺癌(约25％)的其他癌症中高度表达。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3通过刺激经典Wnt信号转导促进体外和体内肿瘤生长，其诱导转录因子β-连环蛋白的胞质积聚和核易位(Filmus，上文)。已经表明，GPC3可以与几种Wnt(Capurro等人，Cancer Res.,2005,65:6245-6254)和卷曲蛋白(Frizzleds，Wnts的信号转导受体)形成复合物(Filmus等人，Genome Biol.,2008,9:224)。
HCC是全世界癌症相关死亡的第三大原因。HCC每年导致约100万例死亡。(Nakatsura和Nishimura,Biodrugs 19(2):71-77(2005)。)导致肝硬化的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和长期大量饮酒仍然是HCC的最常见原因。由于丙型肝炎病毒感染的传播，其发病率在美国急剧增加，预期在接下来的20年增加。主要通过肝移植或肿瘤切除来治疗HCC。患者的预后取决于基础肝功能和肿瘤诊断所处的阶段这两者。(Parikh和Hyman,AmJ.Med.120(3):194-202(2007)。)需要有效的HCC治疗策略。
概述
本文中提供了多肽，其含有结合人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基于纤连蛋白的支架(FBS)，还提供了这些多肽的适合作为治疗剂和诊断剂的缀合物。
在一个方面，提供了包含特异性结合人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的FBS的多肽。在一些实施方案中，抗GPC3FBS与治疗剂或诊断剂缀合。
在另一个方面，提供了通过向受试者施用治疗有效量的包含抗GPC3FBS的多肽或抗GPC3FBS-药物缀合物来治疗人类受试者中的癌症的方法。在一些实施方案中，癌症过表达与非癌细胞相关的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3。在一些实施方案中，癌症是肝癌(例如，肝细胞癌、肝母细胞瘤)、黑素瘤、维尔姆斯瘤或肺癌(例如，鳞状肺癌)。
在另一个方面，提供了体外和体内检测GPC3的方法，包括使细胞与包含抗GPC3FBS的多肽在允许抗GPC3FBS与GPC3结合的条件下接触，以及检测包含所述抗GPC3FBS和GPC3的复合物。在一些实施方案中，抗GPC3FBS与可检测标记物(例如，FITC)连接。
还提供了包含抗GPC3FBS多肽和/或抗GPC3FBS-药物缀合物的组合物，包括药物组合物和诊断组合物。
还提供了编码抗GPC3FBS的核酸分子，以及包含这种核酸的表达载体和包含这种表达载体的宿主细胞。还提供了包含抗GPC3FBS多肽和抗GPC3FBS缀合物以及使用说明书的试剂盒。
阅读了以下详细说明和实施例后，本发明的其他特征和优点将不言自明，这些实施例不应被解释为限制性。
附图简述
图1描绘了代表性抗GPC3 Adnectin多肽的氨基酸序列。4578F03(SEQ ID NO:9)、4578H08(SEQ ID NO:18)、4578B06(SEQ ID NO:35)、4606F06(SEQ ID NO:48)、5273C01(SEQID NO:61)、5273D01(SEQ ID NO:74)、5274E01(SEQ ID NO:87)、6561A01(SEQ ID NO:87)、6077F02(SEQ ID NO:102)、6093A01(SEQ ID NO:463)。
图2A-2B是描绘DAR1和DAR2微管溶素类似物-GPC3 Adnectin药物缀合物的结构的示意图。
图3A-3D显示了抗GPC3 Adnectin与人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3阳性细胞结合的流式细胞术结果。
图4A-4B显示了抗GPC3 AdxDC DAR1和DAR2抗体与人Hep3B和H446细胞结合的流式细胞术结果。
图5A-5B显示了抗GPC3 AdxDC DAR1和DAR2抗体对Hep3B和H446细胞的细胞生长抑制。
图6A-6B显示了抗GPC3 AdxDC DAR1和DAR2抗体对Hep3B和HepG2细胞的细胞生长抑制。
图7A-7B是描绘抗GPC3 Adnectin，ADX_6077_F02到H446和HepB3细胞中的内化速率的条形图。
图8A-8F描绘了在时间点15分钟和8小时的膜和内化的AF488标记的抗GPC3Adnectin，ADX_6077_F02。
图9是描绘微管溶素类似物-抗GPC3 Adnectin药物偶联物在小鼠中的暴露状况的图表。
图10A-10B是如通过肿瘤体积缩小和体重变化百分比量度的描绘抗GPC3Adnectin药物缀合物在HepG2异种移植模型中的效果的图表。
图11A-11D是如通过肿瘤体积缩小和体重变化百分比量度的描绘DAR1和DAR2在HepG2异种移植模型(TV0＝380-480mm3 )中的效果的图表。
图12A-12B是如通过肿瘤体积缩小和体重变化百分比量度的描绘DAR2在HepG2异种移植模型(TV0＝228-350mm3)中的效果的图表。
图13A-13B是如通过肿瘤体积缩小和体重变化百分比量度的描绘DAR2在HepG2异种移植模型(TV0＝514-673mm3)中的效果的图表。
图14描绘了通过质谱法确定的人GPC3的常见胃酶解肽(SEQ ID NO:344的氨基酸1-559，其后为6X his)。
图15是通过HDX-MS确定的人GPC3上的ADX_6077_F02adnectin结合位点的图形描绘。
图16A-16B是抗GPC3DG突变体与亲本抗GPC3 Adnectin的结合动力学的图形比较。
图17显示在将不同剂量的GPC3_AdxDC DA或对照非结合性AdxDC施用于植入了Hep3B肿瘤细胞的NSG小鼠之后随着天数变化的肿瘤体积，表明GPC3_AdxDC DA在高表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞系衍生的异种移植物中是有效的。
图18显示在将不同剂量的GPC3_AdxDC DA或对照非结合性AdxDC施用于植入了H446肿瘤细胞的CB17SCID小鼠之后随着天数变化的肿瘤体积，表明GPC3_AdxDC DA延缓了低表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞系衍生的异种移植物的生长。
图19显示在向小鼠施用0.22μM/kg的3H GPC3_AdxDC之后0.17小时、1小时、5小时和168小时取得的小鼠组织的定量全身放射自显影(QWBA)，表明Hep3B肿瘤相对于正常组织的优先摄取。
图20显示在向小鼠施用0.015μM/kg的3H GPC3_AdxDC之后0.17小时、1小时、5小时和168小时取得的小鼠组织的QWBA，表明Hep3B肿瘤相对于正常组织的优先摄取。
图21显示在向小鼠施用0.22μM/kg的3H GPC3_AdxDC之后0.17小时、1小时、5小时和168小时取得的小鼠组织的QWBA，表明Hep3B肿瘤相对于非结合性对照AdxDC的更高摄取。
图22显示在向小鼠施用0.22μM/kg的3H RGE_AdxDC(对照，非GPC3结合性AdxDC)之后0.17小时、1小时、5小时和168小时取得的小鼠组织的QWBA，表明Hep3B肿瘤相对于GPC3_AdxDC的更低摄取。
图23显示向小鼠施用3H GPC3_AdxDC或非结合性AdxDC对照(“RGE_ADxDC”)之后0.17小时、1小时、5小时、24小时、48小时和168小时的不同小鼠组织中的总放射性浓度。每一组织的条形按上句中所言的顺序显示。
图24A-24B显示了通过使用10nM(图24A)或1nM(图24B)的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3-生物素的位置扫描获得的GPC3_AdxDC DG的BC环(SEQ ID NO:98的氨基酸15-21)的热图。wt BC环的序列在SEQ ID NO:1的氨基酸15-21中列出。
图25A-25B显示了通过使用10nM(图25A)或1nM(图25B)的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3-生物素的位置扫描获得的GPC3_AdxDC DA的BC环(SEQ ID NO:98的氨基酸15-21)的热图。wt BC环的序列在SEQ ID NO:1的氨基酸15-21中列出。
图26A-26B显示了通过使用10nM(图26A)或1nM(图26B)的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3-生物素的位置扫描获得的GPC3_AdxDC DG的DE环的热图。wt DE环的序列在SEQ ID NO:1的氨基酸52-55中列出。
图27A-27B显示了通过使用10nM(图27A)或1nM(图27B)的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3-生物素的位置扫描获得的GPC3_AdxDC DA的DE环的热图。wt DE环的序列在SEQ ID NO:1的氨基酸52-55中列出。
图28显示了通过使用10nM的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3-生物素的位置扫描获得的GPC3_AdxDC DG的FG环(SEQ ID NO:98的氨基酸69-79)的热图。wt FG环的序列在SEQ IDNO:1的氨基酸77-87中列出。
图29显示了通过使用1nM的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3-生物素的位置扫描获得的GPC3_AdxDC DG的FG环(SEQ ID NO:98的氨基酸69-79)的热图。wt FG环的序列在SEQ IDNO:1的氨基酸77-87中列出。
图30显示了通过使用10nM的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3-生物素的位置扫描获得的GPC3_AdxDC DA的FG环(SEQ ID NO:98的氨基酸69-79)的热图。wt FG环的序列在SEQ IDNO:1的氨基酸77-87中列出。
图31显示了通过使用1nM的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3-生物素的位置扫描获得的GPC3_AdxDC DA的FG环(SEQ ID NO:98的氨基酸69-79)的热图。wt FG环的序列在SEQ IDNO:1的氨基酸77-87中列出。
发明详述
定义
除非另有定义，本文中使用的所有的技术和科学术语具有与技术人员所通常理解的相同的含义。尽管可以在本发明的实践或测试中使用类似于或等同于本文所述的那些的任何方法和组合物，但在本文中描述了优选的方法和组合物。
术语“磷脂酰肌醇蛋白聚糖3”、“磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白聚糖3”、“GPC3”、“OTTHUMP00000062492”、“GTR2-2”、“SGB”、“DGSX”、“SDYS”、“SGBS”、“OCI-5”和“SGBS1”可互换使用，并且包括人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的变体、同种型和物种同源物。示例性人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的完整氨基酸序列的Genbank/NCBI登录号为NM_004484(SEQ ID NO:344)。
“氨基酸残基”是在肽键形成中已经失去一个水分子(来自含氮侧的H+和来自羧基侧的OH-)之后的剩余氨基酸部分。
关于“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何序列，而不论长度、翻译后修饰、或功能。多肽可包括正如在美国专利No.6,559,126中描述的那些天然氨基酸和非天然氨基酸，通过提述将该专利并入本文。也可以多种标准化学方法的任一者修饰多肽(例如，可用保护基修饰氨基酸；羧基端氨基酸可被制成为末端酰胺基团；可用基团修饰氨基端残基，例如，以便增强亲油性；或者，可以化学方式将多肽糖基化或以别的方式修饰以便增加稳定性或体内半衰期)。多肽修饰可包括另一种结构如环状化合物或其他分子与多肽的附接，并且还可包括含有处于改变构型的一个或多个氨基酸(即，R或S；或者，L或D)的多肽。
“分离的”多肽是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分为将会干扰所述多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶类、激素类、和其他蛋白性或非蛋白性溶质。在某些实施方案中，所述多肽将被纯化为：(1)正如通过洛瑞法(Lowry Method)确定的按多肽的重量计大于95％，并且最优选地按重量计大于99％，(2)到足以通过使用转杯测序仪至少获得N端残基或内部氨基酸序列的程度，或(3)达到还原或非还原条件下进行的SDS-PAGE考马斯亮蓝或优选地银染色同质性的程度。
如本文中使用的，“10Fn3结构域”或“10Fn3模块”或“10Fn3分子”是指野生型10Fn3及其生物活性变体，例如与诸如靶蛋白的靶标特异性地结合的生物活性变体。野生型人10Fn3结构域可包含在SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列。野生型人10Fn3结构域的生物活性变体包括相对于包含SEQ ID NO:1的10Fn3结构域包含至少、至多或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40或45个氨基酸改变(即，取代、添加或缺失)的10Fn3结构域。
“Adnectin”或“Adx”或“adnectin”或“adx”是指已被修饰(相对于野生型序列)为与靶标特异性地结合的人10Fn3分子。
“GPC3 Adnectin”或“抗GPC3 Adnectin”是与GPC3例如以1μM或更低的KD特异性地结合的Adnectin。
如本文中使用的10Fn3结构域(或模块或分子)的“区域”是指环(AB、BC、CD、DE、EF和FG)、β链(A、B、C、D、E、F和G)、N端(相应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-7)、或C端(相应于SEQID NO:1的氨基酸残基93-94)。
10Fn3结构域(或模块)的“北极环”是指10Fn3结构域的BC、DE和FG环的任一者。
10Fn3结构域(或模块)的“南极环”是指10Fn3结构域的AB、CD和EF环的任一者。
“支架区”是指人10Fn3结构域的任何非环区域。支架区包括A、B、C、D、E、F和Gβ链以及N端区(相应于SEQ ID NO:1的残基1-7的氨基酸)和C端区(相应于SEQ ID NO:1的残基93-94的氨基酸)。
本文中的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在序列比对和引入空位(如果需要的话，达到最大序列同一性百分比，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守取代)之后候选序列中与选定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。以本领域技术内的各种方法可实现为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对，例如，利用可公开获得的计算机软件，如BLASTSM、BLASTSM-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign软件。本领域技术人员可确定测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。
为本文的目的，如下计算给定氨基酸序列A相对于(与、或针对)给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者可表述为给定氨基酸序列A相对于(与、或针对)给定氨基酸序列B具有或包含一定的氨基酸序列同一性％)：100乘以分数X/Y，其中X为在A与B的序列比对程序(如BLASTSM、BLASTSM-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign)比对中通过该程序评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y为B中的氨基酸残基的总数。应当理解的是，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A相对于B的氨基酸序列同一性％不会等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。
如本文中使用的，术语“Adnectin结合位点”是指与特定Adnectin相互作用或结合的蛋白质(例如，GPC3)的位点或部分。Adnectin结合位点可以由通过蛋白质的三级折叠并置的连续氨基酸或非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的Adnectin结合位点在暴露于变性溶剂时通常会被保留，而由三级折叠形成的Adnectin结合位点在用变性溶剂处理时通常会丢失。
可以通过应用通常用于抗体的表位作图的标准技术，包括但不限于蛋白酶作图和突变分析，来确定本文所述的抗GPC3 Adnectin的Adnectin结合位点。
如本文中使用的，多肽中的氨基酸残基被视为“贡献于结合”靶标，条件是(1)在实验确定的复合物的三维结构的基础上发现残基的侧链或主链的任何非氢原子在结合靶标的任何原子的五个埃之内、和/或(2)针对其在野生型10Fn3(例如SEQ ID NO:1)中的等效物的残基、针对丙氨酸、或针对与讨论中的残基具有相似大小或更小的侧链的残基的突变，导致测量的针对靶标的平衡解离常数增加(例如，kon增加)。
在针对GPC3的FBS结合的背景下，如本文中可互换使用的术语“特异性地结合”、“特异性结合”、“选择性结合”、和“选择性地结合”是指对GPC3展现出亲和力、而与不同的多肽并不显著结合(例如，少于约10％结合)的FBS，正如通过本领域可得到的技术所测量，所述技术例如但不限于，斯卡查德分析和/或竞争性结合测定(例如，竞争ELISA、BIACORE测定)。在例如本文所述的FBS的结合结构域对来自一个或多个物种(例如人，啮齿动物、灵长类动物)的GPC3具有特异性但不与其他磷脂酰肌醇蛋白聚糖(例如，磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖6)交叉反应的情况下，所述术语也是适用的。
在与GPC3结合的Adnectin的背景下，如本文中使用的术语“优先结合”是指其中本文所述的Adnectin与GPC3的结合比它与不同的多肽的结合高至少约20％的情形，正如通过本领域可得到的技术所测量，所述技术例如但不限于，斯卡查德分析和/或竞争性结合测定(例如，竞争ELISA、BIACORE测定)。
在与GPC3结合的Adnectin的背景下，如本文中使用的术语“KD”意指特定的Adnectin-蛋白质(例如，GPC3)相互作用的解离平衡常数或Adnectin对于蛋白质(例如，GPC3)的亲和力，正如使用表面等离子体共振测定或细胞结合测定所测量的。如本文中使用的，“期望KD”是指对于预期目的足够的Adnectin的KD。例如，期望KD可以指在例如基于细胞的萤光素酶测定的体外测定中引出功能效应所需要的Adnectin的KD。
在与蛋白质结合的Adnectin的背景下，如本文中使用的术语“ka”意指Adnectin结合成Adnectin/蛋白复合物的结合速率常数。
在与蛋白质结合的Adnectin的背景下，如本文中使用的术语“kd”意指Adnectin从Adnectin/蛋白复合物解离的解离速率常数。
在Adnectin的背景下，如本文中使用的术语“IC50”是指Adnectin在体外或体内测定中将反应抑制到最大抑制反应的50％的水平(即，最大抑制反应和未经处理的反应之间的半程)的浓度。
如本文中使用的术语“磷脂酰肌醇蛋白聚糖活性”或“磷脂酰肌醇蛋白聚糖3”活性是指与GPC3激活细胞信号转导(例如，激活Wnt信号转导)相关的一种或多种生长调节活性或形态发生活性。例如，GPC3可以通过与Wnt和/或卷曲(Frizzeled)蛋白形成复合物来调节肿瘤细胞生长。GPC3还可以通过与FGF相互作用而激活信号转导通路和肿瘤细胞生长。GPC3活性可以使用本领域公认的方法，例如本文所述的那些方法来确定。短语“磷脂酰肌醇蛋白聚糖3活性”或“拮抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3活性”或“拮抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3”可互换使用，指的是本文中提供的抗GPC3FBS和抗GPC3药物缀合物体内或体外中和或拮抗GPC3的活性的能力。如本文中使用的关于抗GPC3FBS活性的术语“抑制”或“中和”是指基本上拮抗、阻止、预防、抑制、减慢、破坏、消除、停止、减少或逆转例如被抑制者的进展或严重程度的能力，所述被抑制者包括但不限于生物学活性或性质、疾病或病症(例如，肿瘤细胞生长)。抑制或中和优选为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。
如本文中使用的，术语“连接”是指两个或更多个分子的结合。连接可以是共价或非共价的。连接可以在多肽与化学模块或另一多肽模块之间。连接也可以是遗传的(即，重组融合)。这样的连接可以使用多种本领域公认的技术来实现，比如化学缀合和重组蛋白生产。
术语“PK”是“药代动力学”的首字母缩写，其涵盖化合物的性质，包括例如通过受试者的吸收、分布、代谢和消除。如本文中使用的，“PK调节蛋白”或“PK模块”是指当融合至生物活性分子或与生物活性分子一起施用时影响所述生物活性分子的药代动力学性质的任何蛋白质、肽或模块。PK调节蛋白或PK模块的实例包括PEG、人血清白蛋白(HSA)结合剂(如美国公开号2005/0287153和2007/0003549，PCT公开号WO 2009/083804和WO 2009/133208中公开的)、人血清白蛋白及其变体、转铁蛋白及其变体、Fc或Fc片段及其变体以及糖类(例如，唾液酸)。
多肽的血清或血浆“半衰期”可通常定义为例如，由于通过天然机制对多肽的降解和/或多肽的清除或鳌合所致的所述多肽的血清浓度在体内降低50％所花费的时间。可以本身已知的任何方式，比如通过药代动力学分析来确定半衰期。适合的技术对于本领域人员来说是清楚的，例如，可通常涉及下列步骤：向灵长动物给予适宜剂量的多肽；以规律间隔从所述灵长动物采集血液样品或其他样品；确定所述血液样品中的多肽浓度水平；并且根据由此获得的数据(的绘图)计算直到所述多肽的水平或浓度相比于在给药时的初始水平降低50％的时间。确定半衰期的方法例如可见于Kenneth等人，Chemical Stability ofPharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists(1986)；Peters等人，PharmacokineteAnalysis:A Practical Approach(1996)；和Gibaldi,M.等人，Pharmacokinetics,SecondRev.Edition,Marcel Dekker(1982)。
血清半衰期可以使用诸如t1/2-α、t1/2-β和曲线下面积(AUC)之类的参数来表示。“半衰期的增加”是指这些参数的任一者、这些参数的任何两者、或所有这三个参数的增加。在某些实施方案中，半衰期的增加是指t1/2-β和/或HL_λ_z的增加，同时具有或没有t1/2-α和/或AUC或两者的增加。
术语“可检测(的)”是指从背景信号中检出某信号的能力。术语“可检测信号”是来源于非侵入性成像技术(例如但不限于正电子发射断层摄影术(PET)之类)的信号。可检测信号能够从受试者可能产生的其他背景信号中检出并且与之区分。换言之，可检测信号和背景之间存在可测量的并且在统计学上显著的差异(例如，在统计学上显著的差异是足以在中加以区分的差异，比如在可检测信号与背景之间的约0.1％、1％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％或40％或更多的差异)。可以使用标准品和/或校准曲线来确定可检测信号和/或背景的相对强度。
包含本文所述的显像剂的组合物的“检测有效量”定义为足以使用可用于临床使用的设备产生可接受的图像的量。可以通过多于一次的注射施用本文中提供的显像剂的检测有效量。检测有效量可根据诸如个体的易感性程度、个体的年龄、性别和体重、个体的特异反应等因素而变化。成像组合物的检测有效量也可以根据所使用的仪器和方法而变化。这些因素的优化完全在本领域技术水平之内。在某些实施方案中，GPC3显像剂(例如，本文所述的那些)提供了2个或更多个(例如3个、4个、5个或更多个)区别因素(即，针对背景信号的特异性信号)。
在本文中可互换使用的术语“个体”、“受试者”和“患者”是指动物，优选哺乳动物(包括非灵长类和灵长类动物)，例如人类。
“癌症”是指以体内异常细胞的不受控制的生长为特征的广泛的各种疾病。不受调节的细胞分裂和生长(分裂并生长)导致恶性肿瘤的形成，所述恶性肿瘤侵袭邻近组织并且还可能通过淋巴系统或血流转移到身体的远处部位。
受试者的“治疗”或“疗法”是指为了逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防与疾病相关的症状的发作、进展、发展、严重或复发、并发症、病症或生化标记而对受试者进行的或施用活性剂的任何类型的干预或过程。
在抗GPC3 Adnectin的背景下，如本文中使用的“给药”或“施用”是指将本文所述的GPC3 Adnectin或基于GPC3 Adnectin的探针或标记探针(也称为“显像剂”)引入到受试者中。可以使用任何适合的给药途径，比如静脉内、口服、局部、皮下、腹膜内、动脉内、吸入、阴道、直肠、鼻腔，引入到脑脊液或滴注到身体隔室中。
如本文中使用的，术语“共同施用”等意在包括将选择的药剂施用于单个患者，并且旨在包括其中通过相同或不同施用途径或者在相同或不同的时间施用药剂的方案。
术语“治疗有效量”是指至少向受试者赋予治疗益处所必需的药剂的最小剂量，但它小于毒性剂量。
如本文中使用的，“有效量”是指至少在剂量和时间段方面有效实现期望的结果所需的量。
如本文中使用的，“足量”是指足以实现期望的结果的量。
术语“样品”可以指组织样品、细胞样品、流体样品等。样品可以取自一个受试者。组织样品可以包括毛发(包括发根)、口腔拭子、血液、唾液、精液、肌肉或来自任何内部器官。流体可以是但不限于尿、血液、腹水、胸膜液、脊髓液等。身体组织可以包括但不限于皮肤、肌肉、子宫内膜、子宫和宫颈组织。
概述
本文中提供了结合人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的新型基于纤连蛋白的支架多肽。这样的多肽可以与其他治疗剂和诊断剂偶联，并且可用于例如将治疗剂和诊断剂靶向表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞和组织(例如，过表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的癌细胞)。
I.抗GPC3的基于纤连蛋白的支架
如本文中使用的，“基于纤连蛋白的支架”或“FBS”蛋白或模块是指基于纤连蛋白III型(“Fn3”)重复并且可以被修饰为与给定靶标(例如，靶蛋白)特异性地结合的蛋白质或模块。Fn3是具有免疫球蛋白(Ig)折叠(即，Ig样β夹心结构，其组成为七个β链和六个环)结构的小的(约10kDa)结构域。纤连蛋白具有18个Fn3重复，虽然在重复之间的序列同源性较低，但它们在三级结构上都共有高度相似性。Fn3结构域还出现在除了纤连蛋白之外的多种蛋白质例如粘附分子、细胞表面分子(例如，细胞因子受体)和碳水化合物结合结构域中。关于综述参见Bork等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89(19):8990-8994(1992)；Bork等人，J.Mol.Biol.,242(4):309-320(1994)；Campbell等人，Structure,2(5):333-337(1994)；Harpez等人，J.Mol.Biol.,238(4):528-539(1994))。术语“FBS”蛋白或模块预期包括基于来自这些其他蛋白质(即，非纤连蛋白分子)的Fn3结构域的支架。
Fn3结构域小、单体性、可溶、且稳定。其缺乏二硫键，因此在还原条件下是稳定的。按照从N端到C端的顺序，Fn3结构域包含β或β样链A；环AB；β或β样链B；环BC；β或β样链C；环CD；β或β样链D；环DE；β或β样链E；环EF；β或β样链F；环FG；和β或β样链G。七个反平行β链排列成两个β片层，它们形成稳定的核心，同时产生两个由连接β或β样链的环构成的“面”。环AB、CD、和EF位于一个面上(“南极”)且环BC、DE、和FG位于相对的面上(“北极”)。
Fn3分子中的环在结构上类似于抗体的互补决定区(CDR)，并且在被改变时可能涉及Fn3分子与靶标例如靶蛋白的结合。Fn3分子的其他区域，如β或β样链以及N端或C端区在被改变时可能涉及与靶标的结合。任何或所有环AB、BC、CD、DE、EF和FG均可参与靶标结合。任何β或β样链可能涉及与靶标的结合。Fn3结构域还可通过一个或多个环以及一个或多个β或β样链与靶标结合。结合可能还需要N端或C端区。
抗GPC3FBS可基于纤连蛋白III型第十结构域，即其中一个或多个溶剂可及环被随机化或突变的人Fn3的第十模块(10Fn3)。野生型人10Fn3部分的氨基酸序列如下：
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:1)
AB、CD和EF环加下划线；BC、FG、和DE环用粗体着重标记；β链位于各个环区之间或其附近；并且N端区以斜体表示)。SEQ ID NO:1的最后两个氨基酸残基为C端区的一部分。核心10Fn3结构域以氨基酸9(“E”)开始并以氨基酸94(“T”)结尾，并且对应于86个氨基酸的多肽。核心野生型人10Fn3结构域在SEQ ID NO:2中列出。变体和野生型10Fn3蛋白两者以相同的结构为特征，即，指定为A到G的七个β链结构域序列和连接这七个β链结构域序列的六个环区(AB环、BC环、CD环、DE环、EF环、和FG环)。定位在N端和C端最近处的β链可采用β样溶液构象。在SEQ ID NO:1中，AB环对应于残基14-17，BC环对应于残基23-31，CD环对应于残基37-47，DE环对应于残基51-56，EF环对应于残基63-67，并且FG环对应于残基76-87。
因此，在某些实施方案中，抗GPC3FBS模块(例如，抗GPC3Adnectin)包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域通常由以下简并序列限定：
VSDVPRDLEVVAA(X)u LLISW(X)v YRITY(X)w FTV(X)x ATISGL(X)y YTITV YA(X)z ISINYRT(SEQ ID NO:3)，或由分别缺乏1、2、3、4、5、6或7个N端氨基酸的序列限定。
在SEQ ID NO:3中，AB环以(X)u表示，BC环以(X)v表示，CD环以(X)w表示，DE环以(X)x表示，EF环以(X)y表示，并且FG环以Xz表示。X表示任何氨基酸，在X后面的下标表示氨基酸的数目的整数。具体而言，u、v、w、x、y和z各自可独立地为选自2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7、或6-7个氨基酸的任一者。β链序列(在SEQ ID NO:3中加下划线)可以具有相对于SEQ ID NO:3中所示的相应氨基酸的在所有7个支架区上的从0到10、从0到8、从0到6、从0到5、从0到4、从0到3、从0到2、或从0到1个取代、缺失或添加的任一者。在一些实施方案中，β链序列可以具有相对于SEQ ID NO:3中所示的相应氨基酸的在所有7个支架区上的从0到10、从0到8、从0到6、从0到5、从0到4、从0到3、从0到2、或从0到1个取代(例如，保守取代)的任一者。
应当理解，为了实现对于期望靶标具有强亲和力的10Fn3结合结构域，并不是环区中的每个残基都需要修饰或改变。另外，还可以在环区中形成插入和缺失，同时仍然产生高亲和力的抗GPC3的10Fn3结合结构域。关于“改变”意指相对于模板序列(即，相应的野生型人纤连蛋白结构域)的一个或多个氨基酸序列改变并且包括氨基酸添加、缺失、取代及其组合。
在一些实施方案中，抗GPC3FBS模块包含10Fn3结构域，其中非环区包含与SEQ IDNO:1的非环区具有至少80％、85％、90％、95％、98％、或100％同一性的氨基酸序列，并且其中选自AB、BC、CD、DE、EF和FG的至少一个环被改变。
在一些实施方案中，选自AB、BC、CD、DE、EF和FG的一个或多个环相对于野生型人10Fn3中的相应环可以在长度上延长或缩短。在任何给定的多肽中，一个或多个环可以在长度上延长，一个或多个环可以在长度上缩短，或者为这两者的组合。在一些实施方案中，给定环的长度可以延长2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-25、5-20、5-15、5-10、10-25、10-20、或10-15个氨基酸。在一些实施方案中，给定环的长度可以缩短1-15、1-11、1-10、1-5、1-3、1-2、2-10、或2-5个氨基酸。具体地说，10Fn3的FG环的长度为13个残基，而在抗体重链中的相应环的长度范围为4-28个残基。因此，在一些实施方案中，可以改变10Fn3的FG环的长度以及序列，以在靶结合依赖于FG环的多肽中获得最大可能的灵活性和靶亲和力。
在某些实施方案中，抗GPC3FBS模块包含纤连蛋白III型第十(10Fn3)结构域，其中所述10Fn3结构域包含环AB、环BC、环CD、环DE、环EF、和环FG，并且其中选自环BC、DE和FG的至少一个环具有相对于人10Fn3结构域的相应环序列的改变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的抗GPC3 Adnectin包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域包含与SEQ ID NO:1或2的非环区具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中选自BC、DE和FG的至少一个环被改变。在某些实施方案中，BC和FG环被改变，在某些实施方案中，BC和DE环被改变，在某些实施方案中，DE和FG环被改变，并且在某些实施方案中，BC、DE和FG环被改变，即，10Fn3结构域包含非天然存在的环。在某些实施方案中，AB、CD和/或EF环被改变。在一些实施方案中，一个或多个规定的支架改变与一个或多个环改变相组合。
在某些实施方案中，抗GPC3的10Fn3的非配体结合序列可被改变，前提是10Fn3保留配体结合功能和/或结构稳定性。在一些实施方案中，通过一个或多个保守取代可以修饰0Fn3结构域的非环区。通过保守取代可以改变10Fn3结构域中多达5％、10％、20％或甚至30％或更多的氨基酸，而基本上不改变10Fn3的配体亲和力。在某些实施方案中，非环区，例如β链，可包含选自0-15、0-10、0-8、0-6、0-5、0-4、0-3、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、2-15、2-10、2-8、2-6、2-5、2-4、5-15、或5-10个保守氨基酸取代的任一者。在示例性实施方案中，支架修饰可将10Fn3结合剂对配体的结合亲和力降低小于100倍、50倍、25倍、10倍、5倍、或2倍。这样的变化可能改变10Fn3的体内免疫原性，并且在免疫原性降低的情况下，这样的变化可能是希望的。如本文中使用的，“保守取代”是在物理上或功能上类似于相应参考残基的残基。即，保守取代与其参考残基具有相似的大小、性状、电荷、化学特性，包括形成共价键或氢键等等的能力。示例性的保守取代包括满足在Dayhoff等人，Atlas of ProteinSequence and Structure,5:345-352(1978and Supp.)中针对可接受点突变所定义的标准的那些取代。保守取代的实例包括在下组范围内的取代：(a)缬氨酸、甘氨酸；(b)甘氨酸、丙氨酸；(c)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；(d)天冬氨酸、谷氨酸；(e)天冬酰胺、谷氨酰胺；(f)丝氨酸、苏氨酸；(g)赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸；和(h)苯丙氨酸、酪氨酸。
在一些实施方案中，Asp 7、Glu 9、和Asp 23中的一者或多者被另一个氨基酸替换，例如像非带负电荷的氨基酸残基(例如，Asn、Lys等)。已公开了在10Fn3支架中有益的或中性的多种另外的改变。参见，例如，Batori等人，Protein Eng.,15(12):1015-1020(December 2002)；Koide等人，Biochemistry,40(34):10326-10333(Aug.28,2001)。
在其他实施方案中，疏水性核心氨基酸残基(在以上SEQ ID NO:3中的粗体残基)是固定的，且任何取代、保守取代、缺失或添加发生在除了10Fn3支架中的疏水性核心氨基酸残基之外的残基处。因此，在一些实施方案中，本文中提供的多肽的疏水性核心残基相对于野生型人10Fn3结构域(例如，SEQ ID NO:1)未予修饰。
10Fn3分子可包含Fn3结构域的第10个和第11个重复之间的柔性接头，即，EIDKPSQ(SEQ ID NO:369)。在其C端具有EIDKPSQ(SEQ ID NO:369)的野生型10Fn3多肽由下列序列表示：
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT EIDKPSQ(SEQ ID NO:4)
在一些实施方案中，可以取代整合素结合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)(SEQ ID NO:1的氨基酸78-80)的一个或多个残基，从而破坏整合素结合。在一些实施方案中，本文中提供的所述多肽的FG环不含RGD整合素结合位点。在一个实施方案中，所述RGD序列被替换为极性氨基酸-中性氨基酸-酸性氨基酸序列(以N端到C端的方向)。在某些实施方案中，所述RGD序列被替换为SGE或RGE。
A.示例性抗GPC3 Adnectin
在一些实施方案中，抗GPC3FBS(例如，与人GPC3特异性地结合的Adnectin)的BC环包含在SEQ ID NO:6、19、32、45、58、71、84或99中列出的氨基酸序列，其中任选地，所述BC环相对于SEQ ID NO:6、19、32、45、58、71、84或99的BC环包含1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入。
在一些实施方案中，抗GPC3FBS的DE环包含在SEQ ID NO:7、20、33、46、59、72、85或100中列出的氨基酸序列，其中任选地，所述DE环相对于SEQ ID NO:7、20、33、46、59、72、85或100的DE环包含1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入。
在一些实施方案中，抗GPC3FBS的FG环包含在SEQ ID NO:8、21、34、47、60、73、86、101、129、156、183、210、237、264、291或318中列出的氨基酸序列，其中任选地，所述FG环相对于SEQ ID NO:8、21、34、47、60、73、86、101、129、156、183、210、237、264、291或318的FG环包含1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin(例如，与人GPC3特异性地结合的Adnectin)的BC环包含在SEQ ID NO:6、19、32、45、58、71、84或99中列出的氨基酸序列，其中任选地，所述BC环相对于SEQ ID NO:6、19、32、45、58、71、84或99的BC环包的1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入；抗GPC3Adnectin的DE环包含在SEQ ID NO:7、20、33、46、59、72、85或100中列出的氨基酸序列，其中任选地，所述DE环相对于SEQ ID NO:7、20、33、46、59、72、85或100的DE环包的1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入；并且，抗GPC3FBS的FG环包含在SEQ ID NO:8、21、34、47、60、73、86、101、129、156、183、210、237、264、291或318中列出的氨基酸序列，其中任选地，所述FG环相对于SEQ ID NO:8、21、34、47、60、73、86、101、129、156、183、210、237、264、291或318的FG环包含1、2或3个氨基酸取代、缺失或插入。
在一些实施方案中，抗GPC3FBS包含：包含在SEQ ID NO:6、19、32、45、58、71、84或99中列出氨基酸序列的BC环；包含在SEQ ID NO:7、20、33、46、59、72、85或100中列出的氨基酸序列DE环；以及包含在SEQ ID NO:8、21、34、47、60、73、86、101、129、156、183、210、237、264、291或318中列出的氨基酸序列的FG环。
在一些实施方案中，抗GPC3FBS包含分别如SEQ ID NO:6、19、32、45、58、71、84或99；7、20、33、46、59、72、85或100；和8、21、34、47、60、73、86、101、129、156、183、210、237、264、291或318中列出的BC、DE和FG环，并且在所述BC、DE和FG环中具有允许FBS维持与GPC3的结合的氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗GPC3FBS包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:6、7和8中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:6、7和8中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且FG环具有0、1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin(例如，包含人10Fn3的抗FBS模块)包含在SEQID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:6、7和8的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:19、20和21中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:19、20和21中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且FG环具有0、1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:19、20和21的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:32、33和34中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:32、33和34中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且FG环具有0、1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:32、33和34的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:45、46和47中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:45、46和47中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且FG环具有0、1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:45、46和47的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:58、59和60中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:58、59和60中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且FG环具有0、1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:58、59和60的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:71、72和73中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:71、72和73中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且FG环具有0、1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:71、72和73的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:84、85和86中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:84、85和86中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且FG环具有0、1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:84、85和86的BC、DE和FG环。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环具有与分别在SEQ ID NO:99、100和101中列出的BC、DE或FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:99、100和101中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且FG环具有0、1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:99、100和101的BC、DE和FG环。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:99、100和129中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:99、100和129的BC、DE和FG环。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:99、100和156中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:99、100和156的BC、DE和FG环。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:99、100和183中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:99、100和183的BC、DE和FG环。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:99、100和210中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:99、100和210的BC、DE和FG环。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:99、100和237中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:99、100和237的BC、DE和FG环。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:99、100和264中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:99、100和264的BC、DE和FG环。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:99、100和291中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:99、100和291的BC、DE和FG环。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环包含分别在SEQ ID NO:99、100和318中列出的氨基酸序列，其中BC环具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代，并且DE环具有0、1、2或3个氨基酸取代，比如保守氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含在SEQ ID NO:3中列出的序列，其中分别由(X)v、(X)x和(X)z表示的BC、DE和FG环包括分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:99、100和318的BC、DE和FG环。
这样的抗GPC3 Adnectin的支架区可包含相对于SEQ ID NO:3的支架氨基酸残基的从0到20、从0到15、从0到10、从0到8、从0到6、从0到5、从0到4、从0到3、从0到2、或从0到1个取代、保守取代、缺失或添加的任一者。可以进行这样的支架修饰，只要抗GPC3 Adnectin能够以期望的KD结合GPC3即可。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含与本文中公开的抗GPC3 Adnectin至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同并且具有例如SEQ ID NO:5、18、31、44、57、70、83和98中的任一者的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含与SEQ ID NO:5、9-18、22-31、35-44、48-57、61-70、74-83、87-98、102-128、130-155、157-182、184-209、211-236、238-263、265-290、292-317和319-343中的任一者至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本文所述的抗GPC3 Adnectin包含与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:6、7和8中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:19、20和21中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:32、33和34中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:45、46和47中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:58、59和60中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:71、72和73中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:84、85和86中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:99、100和101中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:99、100和129中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:99、100和129中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:99、100和156中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:99、100和183中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:99、100和210中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:99、100和237中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:99、100和264中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:99、100和291中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含分别如SEQ ID NO:99、100和318中列出的BC、DE和FG环；以及与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83或98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含选自5、18、31、44、57、70、83、98、128、155、182、209、209、236、263、290和317的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin进一步包含选自PmXn、PmCXn和PmCXn1CXn2的C端模块，其中X是任何氨基酸，并且m、n、n1和n2独立地是0或1、2、3、4、5或更大的整数。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含选自5、9-18、22-31、35-44、48-57、61-70、74-83、87-98、102-128、130-155、157-182、184-209、211-236、238-263、265-290、292-317和319-343的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含选自SEQ ID NO:98、102-128、129-155、157-182、184-209、211-236、238-263、265-290、292-317和319-343的氨基酸序列，并且任选地在C端具有一个或多个组氨酸(例如，6xHis)。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含选自SEQ ID NO:102-127的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含SEQ ID NO:114-118。在其他实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含SEQ ID NO:123-127。
本文中提供了以10-7或更低的KD与人GPC3特异性地结合的多肽，其中所述多肽包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域包含ADX_6077_A01的BC、DE和FG环，即SEQ ID NO:99、100和101。本文中提供了以10-7或更低的KD与人GPC3特异性地结合的多肽，其中所述多肽包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域具有包含SEQ ID NO:99的BC环、包含SEQ ID NO:100的DE环和包含SEQ ID NO:101的FG环。还提供了以10-7或更低的KD与人GPC3特异性地结合的多肽，其中所述多肽包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域具有包含SEQ ID NO:99的BC环、包含SEQ ID NO:100的DE环和包含SEQ ID NO:101的FG环，其中FG环中两个氨基酸残基DG中的一个被另一个氨基酸取代。还提供了以10-7或更低的KD与人GPC3特异性地结合的多肽，其中所述多肽包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域具有包含SEQ ID NO:99的BC环、包含SEQ ID NO:100的DE环和包含SEQ ID NO:101的FG环，其中FG环中DG的氨基酸残基D(即D78；相对于SEQID NO:102中的编号进行编号)被另一个氨基酸例如E、S、A和G取代。还提供了以10-7或更低的KD与人GPC3特异性地结合的多肽，其中所述多肽包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域具有包含SEQ ID NO:99的BC环、包含SEQ ID NO:100的DE环和包含SEQ ID NO:101的FG环，其中FG环中DG的氨基酸残基G(即D79)被另一个氨基酸残基例如S、A、L或V取代。还提供了以10-7或更低的KD与人GPC3特异性地结合的多肽，其中所述多肽包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域具有包含SEQ ID NO:99的BC环、包含SEQ ID NO:100的DE环和包含SEQ ID NO:101、129、156、183、210、237、264、291或318的FG环。本段中描述的任何多肽可以包含与多肽的C末端直接或间接连接的半胱氨酸残基和/或可以包含与多肽的C末端直接或间接连接的以下氨基酸残基或序列之一：P、PC、PCHHHHHH(SEQ ID NO:395)、PCPPPPPC(SEQ ID NO:416)或PCPPPPPCHHHHHH(SEQ ID NO:424)。
还提供了以10-7或更小的KD与人GPC3特异性地结合的多肽，其中所述多肽包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域包含ADX_6077_A01核心序列(即，SEQ ID NO:98)或与其至少90％、95％、97％、98％或99％相同或以1-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或添加而与其不同的氨基酸序列。还提供了以10-7或更小的KD与人GPC3特异性地结合的多肽，其中所述多肽包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域包含ADX_6077_A01核心序列(即，SEQ ID NO:98)或与其至少90％、95％、97％、98％或99％相同或以1-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或添加而与其不同的氨基酸序列，并且所述10Fn3结构域具有包含SEQ ID NO:99的BC环、包含SEQ ID NO:100的DE环和包含SEQNO:101的FG环(或在DG中的一个氨基酸与其不同)。还提供了以10-7或更小的KD与人GPC3特异性地结合的多肽，其中所述多肽包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:98或与其至少90％、95％、97％、98％或99％相同或以1-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或添加而与其不同的氨基酸序列，并且所述10Fn3结构域具有包含SEQ ID NO:99的BC环、包含SEQ ID NO:100的DE环和包含SEQ ID NO:101、129、156、183、210、237、264、291或318的FG环。还提供了以10-7或更小的KD与人GPC3特异性地结合的多肽，其中所述多肽包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域包含ADX_6077_A01核心序列(即，SEQ IDNO:98)或与其至少90％、95％、97％、98％或99％相同或以1-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或添加而与其不同的氨基酸序列，并且进一步包含与多肽的C末端直接或间接连接的半胱氨酸残基。还提供了以10-7或更小的KD与人GPC3特异性地结合的多肽，其中所述多肽包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域包含ADX_6077_A01核心序列(即，SEQ ID NO:98)或与其至少90％、95％、97％、98％或99％相同或以1-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或添加而与其不同的氨基酸序列，并且进一步包含与多肽的C末端直接或间接连接的以下氨基酸残基或序列之一：P、PC、PCHHHHHH(SEQ ID NO:395)、PCPPPPPC(SEQ ID NO:416)或PCPPPPPCHHHHHH(SEQ ID NO:424)。
本文中提供了包含ADX_6077_A01或ADX_6912_G02的氨基酸序列(具有或不具有N端甲硫氨酸)并且具有或不具有6xHis尾的多肽。
本文中还提供了10Fn3蛋白，所述10Fn3蛋白以10-7或更低的KD与人GPC3特异性地结合并且包含ADX_6077_A01的BC、DE和FG环，即SEQ ID NO:99、100和101。本文中提供了这样的10Fn3蛋白，所述10Fn3蛋白以10-7或更低的KD与人GPC3特异性地结合并且具有包含SEQ IDNO:99的BC环、包含SEQ ID NO:100的DE环和包含SEQ ID NO:101的FG环。还提供了这样的10Fn3蛋白，所述10Fn3蛋白以10-7或更低的KD与人GPC3特异性地结合并且具有包含SEQ IDNO:99的BC环、包含SEQ ID NO:100的DE环和包含SEQ ID NO:101的FG环，其中FG环中两个氨基酸残基DG中的一个被另一个氨基酸取代。还提供了这样的10Fn3蛋白，所述10Fn3蛋白以10-7或更低的KD与人GPC3特异性地结合并且具有包含SEQ ID NO:99的BC环、包含SEQ ID NO:100的DE环和包含SEQ ID NO:101的FG环，其中FG环中DG的氨基酸残基D(即D78；相对于SEQID NO:102中的编号进行编号)被另一个氨基酸例如E、S、A和G取代。还提供了这样的10Fn3蛋白，所述10Fn3蛋白以10-7或更低的KD与人GPC3特异性地结合并且具有包含SEQ ID NO:99的BC环、包含SEQ ID NO:100的DE环和包含SEQ ID NO:101的FG环，其中FG环中DG的氨基酸残基G(即D79)被另一个氨基酸残基例如S、A、L或V取代。还提供了这样的10Fn3蛋白，所述10Fn3蛋白以10-7或更低的KD与人GPC3特异性地结合并且具有包含SEQ ID NO:99的BC环、包含SEQID NO:100的DE环和包含SEQ ID NO:101、129、156、183、210、237、264、291或318的FG环。本段中描述的任何10Fn3蛋白可以包含与其C端直接或间接连接的半胱氨酸残基和/或可以包含与其C端直接或间接连接的以下氨基酸残基或序列之一：P、PC、PCHHHHHH(SEQ ID NO:395)、PCPPPPPC(SEQ ID NO:416)或PCPPPPPCHHHHHH(SEQ ID NO:424)。
还提供了这样的10Fn3蛋白，所述10Fn3蛋白以10-7或更小的KD与人GPC3特异性地结合并且包含ADX_6077_A01核心序列(即，SEQ ID NO:98)或与其至少90％、95％、97％、98％或99％相同或以1-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或添加而与其不同的氨基酸序列。还提供了这样的10Fn3蛋白，所述10Fn3蛋白以10-7或更小的KD与人GPC3特异性地结合并且包含ADX_6077_A01核心序列(即，SEQ ID NO:98)或与其至少90％、95％、97％、98％或99％相同或以1-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或添加而与其不同的氨基酸序列，并且所述10Fn3蛋白具有包含SEQ ID NO:99的BC环、包含SEQ ID NO:100的DE环和包含SEQ NO:101的FG环(或在DG中的一个氨基酸与其不同)。还提供了这样的10Fn3蛋白，所述10Fn3蛋白以10-7或更小的KD与人GPC3特异性地结合并且包含SEQ ID NO:98或与其至少90％、95％、97％、98％或99％相同或以1-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或添加而与其不同的氨基酸序列，并且所述10Fn3蛋白具有包含SEQ ID NO:99的BC环、包含SEQ ID NO:100的DE环和包含SEQ IDNO:101、129、156、183、210、237、264、291或318的FG环。还提供了这样的10Fn3蛋白，所述10Fn3蛋白以10-7或更小的KD与人GPC3特异性地结合并且包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域包含ADX_6077_A01核心序列(即，SEQ ID NO:98)或与其至少90％、95％、97％、98％或99％相同或以1-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或添加而与其不同的氨基酸序列，并且进一步包含与所述10Fn3蛋白的C端直接或间接连接的半胱氨酸残基。还提供了这样的10Fn3蛋白，所述10Fn3蛋白以10-7或更小的KD与人GPC3特异性地结合并且包含10Fn3结构域，所述10Fn3结构域包含ADX_6077_A01核心序列(即，SEQ ID NO:98)或与其至少90％、95％、97％、98％或99％相同或以1-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失或添加而与其不同的氨基酸序列，并且进一步包含与所述10Fn3蛋白的C端直接或间接连接的以下氨基酸残基或序列之一：P、PC、PCHHHHHH(SEQ ID NO:395)、PCPPPPPC(SEQ ID NO:416)或PCPPPPPCHHHHHH(SEQ ID NO:424)。
本文中提供了包含ADX_6077_A01或ADX_6912_G02的氨基酸序列(具有或不具有N端甲硫氨酸)并且具有或不具有6xHis尾的10Fn3蛋白。
还提供了药物缀合物，其包含与药物模块例如微管溶素类似物缀合的在上述段落中所述的多肽或10Fn3蛋白之一。
进一步提供了包含10Fn3结构域的10Fn3蛋白或多肽，所述10Fn3结构域在其C端包含包括一个或多个半胱氨酸的序列，其中至少一个半胱氨酸与本文所述的微管溶素类似物缀合。例如，包含10Fn3结构域的10Fn3蛋白或多肽可与包含氨基酸序列PmCn的肽连接，其中m和n独立地为1或更大的整数，并且其中一个或多个半胱氨酸与本文所述的微管溶素类似物缀合。
在某些实施方案中，本文所述的任何一种抗GPC3 Adnectin的BC、DE和/或FG环氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:5、9-18、22-31、35-44、48-57、61-70、74-83、87-98、102-128、130-155、157-182、184-209、211-236、238-263、265-290、292-317和319-343)被接枝到非10Fn3结构域蛋白支架中。例如，将一个或多个环氨基酸序列交换抗体重链或轻链或其片段的一个或多个CDR环或插入到抗体重链或轻链或其片段的一个或多个CDR环中。在其他实施方案中，其中一个或多个氨基酸环序列被交换或插入的蛋白质结构域包括但不限于，共有Fn3结构域(Centocor,US)、锚蛋白重复蛋白(Molecular Partners AG,ZurichSwitzerland)、结构域抗体(Domantis,Ltd,Cambridge,MA)、单结构域骆驼科纳米抗体(Ablynx,Belgium)、脂质运载蛋白(例如，抗运载蛋白(anticalin)；Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、Avimers(Amgen,CA)、亲和体(Affibody AG,Sweden)、泛素(例如，affilins；Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)、蛋白表位模拟物(Polyphor Ltd,Allschwil,Switzerland)、螺旋束支架(例如，阿尔法体，Complix,Belgium)、Fyn SH3结构域(Covagen AG,Switzerland)或atrimers(Anaphor,Inc.,CA)。
B.交叉竞争性抗GPC3 Adnectin
还提供了与本文所述的特定抗GPC3 Adnectin竞争(例如，交叉竞争)结合人GPC3的Adnectin。这样的竞争性Adnectin可以根据它们在标准GPC3结合测定中竞争性抑制本文所述的Adnectin与GPC3结合的能力加以鉴定。例如，可以使用标准ELISA测定，其中重组GPC3蛋白被固定在平板上，其中一种Adnectin被荧光标记，对未标记Adnectin竞争掉标记Adnectin的结合的能力进行评估。
在某些实施方案中，可进行竞争ELISA形式来确定两种抗GPC3 Adnectin是否结合GPC3上的重叠的Adnectin结合位点。在一种形式中，Adnectin#1被包被在平板上，然后将其封闭和洗涤。向这个平板添加单独的GPC3、或添加用饱和浓度的Adnectin#2预温育的GPC3。在适当温育期之后，洗涤平板并用多克隆抗GPC3抗体(比如生物素化的抗GPC3多克隆抗体)探测，然后用链霉亲和素-HRP缀合物和标准四甲基联苯胺显影程序进行检测。如果对于用或不用Adnectin#2预温育而言的OD信号相同，则这两种Adnectin彼此独立地结合，并且它们的Adnectin结合位点不重叠。然而，如果接受GPC3/Adnectin#2混合物的孔的OD信号低于仅仅接受GPC3的那些孔，则Adnectin#2的结合被确认为阻断了Adnectin#1与GPC3的结合。
或者，通过表面等离子体共振(SPR，例如，BIAcore)进行类似的实验。将Adnectin#1固定在SPR芯片表面上，随后注入单独的GPC3或用饱和浓度的Adnectin#2预温育的GPC3。如果对于GPC3/Adnectin#2混合物的结合信号与单独的GPC3相同或比之更高，则这两种Adnectin彼此独立地结合，并且它们的Adnectin结合位点不重叠。然而，如果对于GPC3/Adnectin#2混合物的结合信号低于单独的GPC3的结合信号，则Adnectin#2的结合被确认为阻断了Adnectin#1与GPC3的结合。这些实验的特征是饱和浓度的Adnectin#2的使用。如果GPC3未用Adnectin#2饱和，则以上结论不成立。可以使用类似的实验来确定任何两种GPC3结合性蛋白质是否与重叠的Adnectin结合位点结合。
在Adnectin#2被固定以及GPC3-Adnectin#1被添加至平板的情况下，也可以相反的顺序进行上文例示的两种测定。或者，可用单克隆抗体和/或可溶性受体-Fc融合蛋白替换Adnectin#1和/或#2。
在另一个实施方案中，可使用HTRF夹心测定来确定竞争。
候选竞争性抗GPC3 Adnectin可以抑制本文所述的抗GPC3 Adnectin与GPC3结合的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％，和/或它们的结合被抑制至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。可使用上文描述的方法确定竞争的％。
在一些实施方案中，与本文所述的抗GPC3 Adnectin竞争的分子不一定是Adnectin，而可以是与GPC3结合的任何类型的分子，例如但不限于抗体、小分子、肽等等。
在某些实施方案中，Adnectin与本文所述的特定抗GPC3 Adnectin结合GPC3上的相同Adnectin结合位点。可以使用标准定位技术，如蛋白酶定位、突变分析、HDX-MS、X射线结晶学和2维核磁共振来确定Adnectin是否与参考Adnectin结合相同的Adnectin结合位点(参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris编辑(1996))。
在一些实施方案中，本文中提供的抗GPC3 Adnectin与人GPC3上的不连续Adnectin结合位点结合。在一些实施方案中，抗GPC3FBS结合在包含SEQ ID NO:345的人GPC3(SEQ ID NO:344)内的例如10-20个氨基酸残基的区域。在一些实施方案中，抗GPC3Adnectin结合在包含SEQ ID NO:346的人GPC3(SEQ ID NO:344)内的例如10-20个氨基酸残基的区域。在其他实施方案中，抗GPC3FBS结合各自在人GPC3(SEQ ID NO:344)内的例如10-20个氨基酸残基的两个区域，对应地一个区域包含SEQ ID NO:345，另一个区域包含SEQ IDNO:346。
C.N端和C端修饰的抗GPC3 Adnectin
在一些实施方案中，Adnectin的N端和/或C端区的氨基酸序列可以通过相对于包含例如SEQ ID NO:1的10Fn3结构域的相应区域的氨基酸序列的缺失、取代或插入而予以修饰。
在某些实施方案中，在本文提供的多肽中，Adnectin的前1、2、3、4、5、6、7、8或9个残基的氨基酸序列，例如像SEQ ID NO:1中那样以“VSD”开始的序列，可以被修饰或缺失。在示例性实施方案中，相应于Adnectin的氨基酸1-7、8或9的、具有以“VSD开始的序列的氨基酸，例如SEQ ID NO:1中的那样，被替换为具有长度为1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3,1-2、或1个氨基酸的替代N端区。
可以添加至GPC3 Adnectin核心序列或以“VSD开始的那些序列的示例性替代N端区域包括(由单字母氨基酸代码表示)M、MG、G、MGVSDVPRD(SEQ ID NO:351)和GVSDVPRD(SEQID NO:352)。其他适合的替代N端区包括，例如，XnSDVPRDL(SEQ ID NO:353)、XnDVPRDL(SEQID NO:354)、XnVPRDL(SEQ ID NO:355)、XnPRDL(SEQ ID NO:356)、XnRDL(SEQ ID NO:357)、XnDL(SEQ ID NO:358)、或XnL，其中n＝0、1或2个氨基酸，其中当n＝1时，X是Met或Gly，并且当n＝2时，X是Met-Gly。当Met-Gly序列被添加至10Fn3结构域的N端时，M常会被剪切掉，在N端留下G。在其他实施方案中，替代的N端区包含氨基酸序列MASTSG(SEQ ID NO:359)。在某些实施方案中，N端延伸由选自下组的氨基酸序列组成：M、MG、和G。
在一些实施方案中，可将具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2、或1个氨基酸长度的替代C端区添加至GPC3 Adnectin的以“RT”结束的C端区(就像例如SEQ ID NO:1中那样)。替代C端区序列的实例包括，例如，包含、基本上为、或为EIEK(SEQ ID NO:360)、EGSGC(SEQ ID NO:361)、EIEKPCQ(SEQ ID NO:362)、EIEKPSQ(SEQ ID NO:363)、EIEKP(SEQID NO:364)、EIEKPS(SEQ ID NO:365)、EIEKPC(SEQ ID NO:366)、EIDK(SEQ ID NO:367)、EIDKPCQ(SEQ ID NO:368)或EIDKPSQ(SEQ ID NO:369)的多肽。在某些实施方案中，所述C端区由EIDKPCQ(SEQ ID NO:368)组成。在某些实施方案中，10Fn3结构域与C端延伸序列连接，所述C端延伸序列包含E和D残基并且长度可以在8和50、10和30、10和20、5和10、以及2和4个氨基酸之间。在一些实施方案中，尾部序列包括基于ED的接头，其中所述序列包含ED的串联重复。在示例性实施方案中，尾部序列包含2-10、2-7、2-5、3-10、3-7、3-5、3、4或5个ED重复。在某些实施方案中，基于ED的尾部序列还可包含另外的氨基酸残基，例如像，EI、EID、ES、EC、EGS、和EGC。这样的序列部分地基于已知的Adnectin尾部序列，如EIDKPSQ(SEQ ID NO:369)，其中残基D和K已去除。在一些实施方案中，基于ED的尾部包含在ED重复之前的E、I或EI残基。
在某些实施方案中，用已知的接头序列(例如，表13中的SEQ ID NO:426-451)将N或C端延伸序列与10Fn3结构域连接。在一些实施方案中，可以将序列置于10Fn3结构域的C端以促进药代动力学模块的附接。例如，可以将含有半胱氨酸的接头比如GSGC添加至C端，以促进半胱氨酸残基上的定点聚乙二醇化。
在某些实施方案中，可与GPC3 Adnectin的C端氨基酸RT(即，例如正如在SEQ IDNO:1中的氨基酸94)连接的替代C端模块包含氨基酸PmXn，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，m是至少为1的整数，并且n是0或至少为1的整数。在一些实施方案中，m可以是1、2、3或更大。例如，m可以是1-3或者m可以是1-2。“n”可以是0、1、2、3或更大，例如，n可以是1-3或1-2。
PmXn模块可与10Fn3模块的C端氨基酸例如它的第94个氨基酸(基于SEQ ID NO:1的氨基酸编号)直接连接。PmXn模块可经由肽键与10Fn3模块的第94个氨基酸连接。在SEQ IDNO:1末端的单个脯氨酸残基被称为“95Pro”或“Pro95”或“P95”或“95P”。
在某些实施方案中，n不是0，并且可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。例如，n可以是0-10、0-5、0-3、1-10、1-5、1-3或1-2。然而，多于10个氨基酸可以与脯氨酸连接。例如，在串联FBS模块或与另一个多肽融合的FBS模块中，FBS模块的C端氨基酸可与一个或多个脯氨酸连接，并且最后的脯氨酸与第二个FBS模块或与异源模块连接。因此，在某些实施方案中，n可以是范围为0-100、0-200、0-300、0-400、0-500或更大的整数。
在某些实施方案中，与GPC3 Adnectin的C端连接的PmXn包含半胱氨酸。例如，在脯氨酸之后的第一个氨基酸可以是半胱氨酸，并且所述半胱氨酸可以是分子中最后的氨基酸或者所述半胱氨酸可以在一个或多个氨基酸之后。半胱氨酸的存在容许诸如化学模块(例如，PEG)的异源模块与FBS模块缀合。包含半胱氨酸的示例性PmXn模块包括：PmCXn，其中C是半胱氨酸，每个X独立地是任何氨基酸，m是至少为1的整数，n是0或至少为1的整数。在一些实施方案中，m可以是1、2、3或更大。例如，m可以是1-3或者m可以是1-2。“n”可以是0、1、2、3或更大，例如，n可以是1-3或1-2。其他示例性PmXn模块包括两个半胱氨酸，例如PmCXn1CXn2，其中每个X独立地是任何氨基酸，n1和n2独立地是0或至少为1的整数。例如，n1可以是1、2、3、4或5，并且n2可以是1、2、3、4或5。示例性PmXn模块包括在表1中列出的那些。
表1：示例性PmXn模块
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在某些实施方案中，例如，PmXn模块选自PC、PPC和PCC。在另一个实施方案中，PmXn模块是PmCXn1CXn2。在某些实施方案中，PmCXn1CXn2选自PCPPPC(SEQ ID NO:415)和PCPPPPPC(SEQ ID NO:416)。
本文所述的任何C端修饰可以应用于GPC3 Adnectin。
任何PmXn模块，例如，在表1中所示的那些，其后可以是组氨酸尾，例如，6xHis标签，或其他标签。这并不排除可能被包括在PmXn中的组氨酸尾。
在某些实施方案中，基于纤连蛋白的支架蛋白包含具有替代N端区序列和替代C端区序列这两者的10Fn3结构域以及任选的6X his尾。
II.多价多肽
在某些实施方案中，蛋白质包含GPC3FBS和至少一个其他的FBS。多价FBS可以包含共价结合的2个、3个或更多个FBS。在示例性实施方案中，FBS模块是包含两个10Fn3结构域的双特异性或二聚体蛋白。
在多价蛋白中的FBS模块，例如，10Fn3结构域可以通过多肽接头加以连接。示例性的多肽接头包括具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、或1-2个氨基酸的多肽。适合的用于连接10Fn3结构域的接头为允许分开的结构域彼此独立地折叠形成容许与靶分子高亲和力结合的三维结构的那些接头。适合的接头的具体实例包括基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头、基于脯氨酸-丙氨酸的接头以及本文中描述的任何其他接头。在一些实施方案中，所述接头为基于甘氨酸-脯氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和脯氨酸残基并且长度可以在3和30、10和30、以及3和20个氨基酸之间。这样的接头的实例包括GPG、GPGPGPG(SEQ ID NO:436)和GPGPGPGPGPG(SEQ ID NO:437)。在一些实施方案中，所述接头为基于脯氨酸-丙氨酸的接头。这些接头包含脯氨酸和丙氨酸残基并且长度可以在3和30、10和30、3和20以及6和18个氨基酸之间。这样的接头的实例包括PAPAPA(SEQ ID NO:438)、PAPAPAPAPAPA(SEQ ID NO:439)和PAPAPAPAPAPAPAPAPA(SEQ ID NO:440)。在一些实施方案中，所述接头是基于甘氨酸-丝氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和丝氨酸残基并且长度可以在8和50、10和30、以及10和20个氨基酸之间。这样的接头的实例可以包含，例如，(GS)5-10(SEQ ID NO:464)、(G4S)2-5(SEQ ID NO:465)和(G4S)2G(SEQ ID NO:466)。这样的接头的实例包括SEQ ID NO:427-439。在示例性实施方案中，所述接头不含任何Asp-Lys(DK)对。
III.药代动力学模块
为了治疗目的，本文所述的抗GPC3 Adnectin可以与药代动力学(PK)模块直接或间接连接。可以根据所认为的治疗需要来评估药代动力学的改善。通常希望增加生物利用度和/或增加剂量之间的时间，这可能通过增加蛋白质在给药后在血清中保持有效的时间来实现。在一些情况下，希望改善蛋白质随时间过去的血清浓度的连续性(例如，减小给药后不久与下一次给药之前的蛋白质的血清浓度差)。抗GPC3 Adnectin可以与这样的模块附接，所述模块相对于未修饰的抗GPC3 Adnectin使哺乳动物(例如小鼠、大鼠或人)中的多肽的清除率降低超过两倍、超过三倍、超过四倍、或超过五倍。其他药代动力学改善的量度可能包括血清半衰期，其通常被分为α相和β相。通过添加适当的模块可以显著改善任一个相或两个相。例如，PK模块相对于单独的Fn3结构域可以将多肽的血清半衰期增加多于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％、400％、600％、800％、1000％或更多。
减慢蛋白质从血液中清除的模块(在本文中称为“PK模块”)包括聚氧化亚烷基模块(例如，聚乙二醇)、糖(例如，唾液酸)和良好耐受的蛋白质模块(例如，Fc和片段及其变体、转铁蛋白或血清白蛋白)。如美国公开号2007/0048282中所述，抗GPC3 Adnectin也可以与白蛋白或白蛋白的片段(部分)或变体融合，或者如本文所述可以与一种或多种血清白蛋白结合性Adnectin融合。
可用于本发明的其他PK模块包括Kontermann等人所述的那些(Current Opinionin Biotechnology 2011；22:868-76)，将其通过提述并入本文。这样的PK模块包括但不限于人血清白蛋白融合物、人血清白蛋白缀合物、人血清白蛋白结合剂(例如，Adnecti PKE、AlbudAb、ABD)、XTEN融合物、PAS融合物(即，基于脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸三个氨基酸的重组PEG模拟物)、碳水化合物缀合物(例如，羟乙基淀粉(HES))、糖基化、聚唾液酸缀合物和脂肪酸缀合物。
在一些实施方案中，本发明提供了与作为聚合糖的PK模块融合的抗GPC3Adnectin。在一些实施方案中，PK模块是聚乙二醇模块或Fc区。在一些实施方案中，PK模块是血清白蛋白结合蛋白，比如在美国公开号2007/0178082和2007/0269422中描述的那些。在一些实施方案中，PK模块是人血清白蛋白。在一些实施方案中，PK模块是转铁蛋白。
在一些实施方案中，PK模块通过多肽接头与抗GPC3 Adnectin连接。示例性的多肽接头包括具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、或1-2个氨基酸的多肽。适合的用于连接Fn3结构域的接头为允许分开的结构域彼此独立地折叠形成容许与靶分子高亲和力结合的三维结构的那些接头。在示例性实施方案中，所述接头不含任何Asp-Lys(DK)对。表14中提供了适合的接头的列表(例如，SEQ ID NO:426-451)。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin例如经由多肽接头与抗HSA Adnectin连接，所述多肽接头具有可被血液或靶组织中的蛋白酶裂解的蛋白酶位点。这样的实施方案可用于释放抗GPC3 Adnectin，以便获得更好的递送或治疗特性或更有效地生产。
可在Fn3结构域的N端或C端引入另外的接头或间隔物，使其位于Fn3结构域和多肽接头之间。
聚乙二醇
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin包含聚乙二醇(PEG)。PEG是熟知的水溶性聚合物，其可商购或者可以根据本领域熟知的方法通过乙二醇的开环聚合来制备(Sandler和Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York,第3卷，第138-161页)。术语“PEG”广泛地用于涵盖任何聚乙二醇分子，无论其PEG的大小或末端的修饰，并且可以由下式表示：X—O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH，其中n是20至2300，X是H或末端修饰，例如C1-4烷基。PEG可以含有其他化学基团，所述化学基团对于结合反应是必需的，其由分子的化学合成产生；或者，其用作分子的多个部分的最佳距离的间隔物。另外，这样的PEG可以由一条或多条连接在一起的PEG侧链组成。具有多于一条PEG链的PEG被称为多臂或分支PEG。分支PEG描述于例如欧洲公开申请No.473084A和美国专利No.5,932,462中。
免疫球蛋白Fc结构域(及片段)
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin与免疫球蛋白Fc结构域或其片段或变体融合。如本文中使用的，“功能性Fc区”是保留结合FcRn的能力的Fc结构域或其片段。在一些实施方案中，功能性Fc区与FcRn结合，但不具有效应子功能。可以通过本领域已知的标准结合测定来确定Fc区或其片段与FcRn结合的能力。在其他实施方案中，Fc区或其片段与FcRn结合并且具有天然Fc区的至少一个“效应子功能”。示例性的“效应子功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒作用(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。这种效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗GPC3 Adnectin)相结合，并且可以使用本领域中已知的用于评价这种抗体效应子功能的各种测定法进行评估。
“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中的约一个至约十个氨基酸取代，并且优选约一个至约五个氨基酸取代。本文中的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％的序列同一性，并且最优选与其具有至少约90％的序列同一性，更优选与其具有至少约95％的序列同一性。
在示例性实施方案中，Fc结构域衍生自IgG1亚类，然而，也可以使用其他亚类(例如，IgG2、IgG3和IgG4)。下面显示的是人IgG1免疫球蛋白Fc结构域的序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:463)
核心铰链序列加下划线，并且CH2和CH3区以常规文本表示。应该理解的是，C端赖氨酸是任选的。也可以使用这个序列的同种异型和突变体。正如本领域中已知，可以设计突变体以调节Fc的多种性质，例如ADCC、CDC或半衰期。
在某些实施方案中，用于抗GPC3 Adnectin融合物的Fc区包含CH1区。在某些实施方案中，用于抗GPC3 Adnectin融合物的Fc区包含CH2和CH3区。在某些实施方案中，用于抗GPC3 Adnectin融合物的Fc区包含CH2、CH3和铰链区。
在某些实施方案中，“铰链”区包含跨IgG1Fc区的SEQ ID NO:463(DKTHTCPPCPAPELLG；SEQ ID NO:464)的位置1-16的核心铰链残基。在某些实施方案中，部分地由于铰链区内的SEQ ID NO:的位置6和9的半胱氨酸残基，抗GPC3 Adnectin-Fc融合物采用多聚体结构(例如，二聚体)。
IV.载体和多核苷酸
本文中还提供了编码本文所述的抗GPC3 Andectin的核酸。正如本领域技术人员理解，由于第三碱基简并性，几乎每个氨基酸都可由编码核苷酸序列中的多于一个的三联体密码子表示。另外，微小的碱基对变化可导致所编码的氨基酸序列中的保守取代，但预期不会实质性改变基因产物的生物活性。因此，编码本文所述的蛋白质的核酸序列可以在序列上轻微被修饰而仍然还编码其对应的基因产物。编码本文所述的抗GPC3 Adnectin及其融合物的某些示例性核酸包括具有在SEQ ID NO:452-462中列出的序列的核酸。
可以化学、酶促或重组方式合成编码本文中公开的包含抗GPC3 Adnectin的各种蛋白质的任一者的核酸。可以选择密码子使用以便提高细胞中的表达。这样的密码子使用将取决于所选择的细胞类型。已经开发了专门针对大肠杆菌和其他细菌、以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞的密码子使用模式。参见，例如，Mayfield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(2):438-442(Jan.21,2003)；Sinclair等人，ProteinExpr.Purif.,26(1):96-105(Oct.2002)；Connell,N.D.,Curr.Opin.Biotechnol.,12(5):446-449(Oct.2001)；Makrides等人，Microbiol.Rev.,60(3):512-538(Sep.1996)；和Sharp等人，Yeast,7(7):657-678(Oct.1991)。
核酸操作的一般技术描述于例如Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第二版，Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，或Ausubel,F.等人，Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing andWiley-Interscience,New York(1987)及定期的更新中，将这些文献通过提述并入本文。编码多肽的DNA与适合的来源于哺乳动物、病毒、或昆虫基因的转录或翻译调控元件可操作连接。这样的调控元件包括转录启动子、任选的控制转录的操作序列、编码适合的mRNA核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译的终止的序列。另外，组入了常常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力、以及便于识别转化体的选择基因。
本文所述的蛋白质不仅可以直接地以重组方式产生，还以具有异源多肽的多肽的形式产生，所述异源多肽优选是信号序列或其他的具有在成熟蛋白或多肽的N端的特异性切割位点的多肽。优选选择的异源信号序列是被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工天然信号序列的原核宿主细胞，信号序列被例如选自下组的原核信号序列取代：碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定肠毒素II前导序列。为了酵母分泌，可将天然信号序列取代为例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母属和克鲁维酵母属α-因子前导序列)、或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌葡糖淀粉酶前导序列、或PCT公开文本No.WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列，例如单纯疱疹gD信号。这样的前体区域的DNA可以阅读框的方式连接于编码蛋白质的DNA。
表达载体和克隆载体两者都包含使所述载体能够在一个或多个选定的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这个序列是使所述载体能够独立于宿主染色体DNA而复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。这样的用于多种细菌、酵母、和病毒的序列是熟知的。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，并且各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，复制起点组分对于哺乳动物表达载体是不需要的(一般可以使用SV40起点，仅仅是因为它含有早期启动子)。
表达载体和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志物。典型的选择基因编码这样的蛋白质，所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素的抗性，(b)补足营养缺陷型缺陷，或(c)提供从复合培养基中不可得的关键养分，例如，编码杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。
适合于在酵母中使用的选择基因是trp1基因，其存在于酵母质粒YRp7中(Stinchcomb等人，Nature,282:39(1979))。trp1基因针对缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株例如No.44076或PEP4-1提供选择标志物。Jones,Genetics,85:12(1977)。此外，通过在缺乏色氨酸的情况下的生长，在酵母宿主细胞基因组中trp1损害的存在提供了检测转化的有效环境。类似地，Leu2缺陷型酵母株(/>20,622或38,626)通过已知的荷Leu2基因的质粒而得到补充。
表达载体和克隆载体常常含有被宿主生物识别并且与编码蛋白质的核酸可操作连接的启动子。适合于与原核宿主一起使用的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子例如tac启动子。然而，其他已知的细菌启动子也是适合的。用于细菌系统中的启动子还将包含Shine-Dalgarno(S.D.)序列，其与编码蛋白质的DNA可操作连接。
真核生物的启动子序列是已知的。几乎所有的真核基因都具有富AT区，它位于转录起始的位点上游大约25到30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70到80个碱基处发现的另一个序列为CNCAAT(SEQ ID NO:465)区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端为AATAAA(SEQ ID NO:466)序列，其可以是向编码序列的3′端添加多聚A尾的信号。所有这些序列都适宜地插入真核表达载体中。
适合于与酵母宿主一起使用的启动序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶的启动子。
其他酵母启动子，其为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子，是下列酶的启动子区：醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶，以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。在酵母表达中使用的适合载体和启动子进一步描述于欧洲专利公开文本No.73,657以及PCT公开文本No.WO 2011/124718和WO 2012/059486中。将酵母增强子与酵母启动子一起使用也是有利的。
在哺乳动物宿主细胞中从载体转录可以例如受到从病毒基因组中获得的启动子、来自异源哺乳动物的启动子例如启动子或免疫球蛋白启动子、热休克启动子的控制，只要这样的启动子与宿主细胞系统相容即可，所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，以及最优选地，猴病毒40(SV40)。
以SV40限制性片段的形式合宜地获得SV40病毒的早期启动子和晚期启动子，所述片段还包含SV40病毒复制起点。以HindIII E限制性片段的形式合宜地获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。在美国专利No.4,419,446中公开了利用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。在美国专利No.4,601,978中描述了对这个系统的修改。关于人β干扰素cDNA在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中的表达，还参见Reyes等人，Nature,297:598-601(1982)。或者，可使用劳斯肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
经常通过向载体中插入增强子序列来增加高等真核生物对编码蛋白质的DNA的转录。目前已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α甲胎蛋白、和胰岛素)的增强子序列。然而，通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括位于复制起点下游(late side)的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点下游(late side)的多瘤病毒增强子、以及腺病毒增强子。关于真核生物启动子活化的增强元件，还参见Yaniv,Nature,297:17-18(1982)。可在多肽编码序列5′或3′位置但优选位于启动子的5′位点将所述增强子剪接到载体中。
在真核宿主细胞(例如，酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类、或来自其他多细胞生物的有核细胞)中使用的表达载体还将含有对于终止转录和稳定化mRNA必需的序列。这样的序列通常可从真核生物或病毒DNA的5′及有时的3′非翻译区或cDNA得到。这些区域含有转录为编码多肽的mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分为牛生长激素多腺苷酸化区。参见WO 94/11026及其中所公开的表达载体。
重组DNA也可包括任何类型的可用于纯化蛋白质的蛋白质标签序列。蛋白质标签的实例包括，但不限于，组氨酸标签、标签、myc标签、HA标签、或GST标签。用于细菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞宿主的适当克隆与表达载体可见于：Cloning Vectors:ALaboratory Manual,Elsevier,New York(1985)，将其相关公开内容通过提述并入本文。
可使用适合于宿主细胞的方法将表达构建体引入宿主细胞中，这对于本领域技术人员是显而易见的。将核酸引入宿主细胞中的各种方法是本领域中已知的，包括，但不限于，电穿孔；使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质转染；微粒轰击；脂质体转染；及感染(其中载体为感染剂)。
适合的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞、或细菌细胞。适合的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，大肠杆菌或芽孢杆菌属物种。优选地，来自酵母属物种的酵母，如酿酒酵母，也可用于产生多肽。还可使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白质。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统由Luckow等人(Bio/Technology,6:47(1988))综述。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括内皮细胞、C0S-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、HeLa、293、293T、和BHK细胞系。通过培养适合的宿主/载体系统来表达重组蛋白而制备纯化的蛋白质。然后从培养基或细胞提取物中纯化FBS蛋白。
V.蛋白质产生
用本文所述的用于产生蛋白质的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在常规营养培养基中培养宿主细胞，所述营养培养基改良为适于诱导启动子、选择转化体、或扩增编码期望序列的基因。
可在各种培养基中培养用于产生蛋白质的宿主细胞。可商购的培养基，如Ham'sF10(Sigma)、最低必需培养基((MEM)，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco'sModified Eagle's Medium((DMEM)(Sigma))适合于培养宿主细胞。另外，在Ham等人，Meth.Enzymol.,58:44(1979),Barnes等人，Anal.Biochem.,102:255(1980),美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；PCT公开文本No.WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利No.RE30,985中描述的培养基的任一者可用作宿主细胞的培养基。在需要时，可对任何这些培养基补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁、和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素药物)、微量元素(定义为无机化合物，通常以在微摩尔范围内的终浓度存在)、以及葡萄糖或等效能源。还可包括适当浓度的本领域技术人员已知的任何其他必要的补充剂。诸如温度、PH值等培养条件为先前用于经选择用于表达的宿主细胞的那些条件，且对于普通技术人员而言是显而易见的。
还可使用无细胞翻译系统产生本文中公开的蛋白质。为了这样的目的，必须修饰编码蛋白质的核酸，以允许体外转录而产生mRNA并允许mRNA在所用的特定无细胞系统(真核无细胞翻译系统例如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统，原核无细胞翻译系统例如细菌无细胞翻译系统)中的无细胞翻译。
也可通过化学合成产生蛋白质(例如，通过在Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，The Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984))中描述的方法)。蛋白质的修饰也可通过化学合成产生。
本文中公开的蛋白质可通过蛋白质化学领域中通常已知的用于蛋白质的分离/纯化的方法来纯化。非限制性实例包括萃取、重结晶、盐析(例如，使用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、正相色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、凝胶渗透色谱法、亲和色谱法、电泳、逆流分布法或这些方法的任何组合。纯化后，可通过本领域已知的多种方法中的任何方法，包括但不限于，过滤和透析，将蛋白质交换到不同的缓冲液中和/或浓缩。
经纯化的蛋白质优选为至少85％纯，更优选为至少95％纯，且最优选为至少98％或99％纯。不论纯度的确切数值如何，该蛋白质的纯度足以用作医药产品。
一种在大肠杆菌中表达Adnectin的方法如下所述。将编码Adnectin的克隆克隆到PET9d载体中，在HIS6标签的上游，并转化到大肠杆菌BL21DE3plysS细胞中，在5ml含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中以24孔形式温育，在37℃培养过夜。通过吸出200μl过夜培养物制备新鲜的5ml的LB培养基(50μg/mL卡那霉素)培养物用于诱导表达，并将其分配到适当的孔中。使培养物在37℃生长直到A600为0.6-0.9。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，使培养物在30℃表达6小时，通过在2750g下在4℃离心10分钟收获培养物。
通过在450μl的裂解缓冲液(50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、1x无EDTA的全蛋白酶抑制剂混合物(CompleteTMProtease Inhibitor Cocktail-EDTA free)(Roche)、1mM PMSF、10mMCHAPS、40mM咪唑、1mg/ml溶菌酶、30μg/ml DNA酶、2μg/ml抑肽酶，pH 8.0)中重悬使细胞沉淀物(24孔形式)裂解，并在室温下振摇1-3小时。澄清裂解物并通过转移到配备有96孔1.2ml捕捉板(catch plate)的96孔Whatman GF/D Unifilter中而重排(re-rack)为96孔形式，并借助于正压过滤。将澄清的裂解物转移到已用平衡缓冲液(50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、40mM咪唑，pH8.0)平衡的96孔镍-钴螯合板中并温育5分钟。借助于正压去除未结合的材料。用洗涤缓冲液#1(50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、5mM CHAPS、40mM咪唑，pH 8.0)以0.3ml/孔洗涤树脂两次。借助于正压去除每次洗涤物。在洗脱之前，用50μl洗脱缓冲液(PBS+20mM EDTA)洗涤每个孔，温育5分钟，借助于正压弃去此次洗涤物。通过向每个孔施用另外100μl洗脱缓冲液来洗脱蛋白质。在室温下温育30分钟后，将板在200g下离心5分钟并将洗脱的蛋白质收集在96孔捕捉板中，所述捕捉板含有在洗脱前添加在洗脱捕捉板底部的5μl 0.5M MgCl2。使用总蛋白质测定，利用野生型10Fn3结构域作为蛋白质标准品来定量洗脱的蛋白质。
不溶性Adnectin的中等规模表达和纯化方法如下所述。将编码Adnectin的核酸连同HIS6标签克隆到pET9d(EMD Bioscience,San Diego,CA)载体中并在大肠杆菌HMS174细胞中表达。使用20ml接种培养物(从单个平板接种的菌落产生)接种1升含有50μg/ml羧苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基。使培养物在37℃生长直到A600为0.6-1.0。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之后，使培养物在30℃生长4小时，通过在>10,000g下在4℃离心30分钟收获培养物。在-80℃下冷冻细胞沉淀。使用均质器(IKAworks)将细胞沉淀重悬于在冰上的25ml裂解缓冲液(20mM NaH2P04、0.5M NaCl、lx无EDTA的全蛋白酶抑制剂混合物(Complete Protease Inhibitor Cocktail-EDTA free)(Roche)、ImM PMSF，pH 7.4)中。通过使用M-l 10S型/>(Microfluidics)进行高压均质化(>18,000psi)实现细胞裂解。通过在4℃下以23,300g离心30分钟来分离不溶部分。用20mM磷酸钠/500mM NaCl(pH 7.4)洗涤从裂解物的离心回收的不溶性沉淀。用超声处理将所述沉淀再溶解于在20mM磷酸钠/500mM NaCl(pH 7.4)中的6.0M盐酸胍中，随后在37度下温育1-2小时。将再溶解的沉淀过滤至0.45μm并上样到用20mM磷酸钠/500M NaCl/6.0M胍(pH7.4)缓冲液平衡的Histrap柱上。在上样之后，用另外25个CV的相同缓冲液洗涤柱。用20mM磷酸钠/500mM NaCl/6.0M胍-HCl(pH 7.4)中的50mM咪唑洗脱结合的蛋白质。通过针对50mM乙酸钠/150mM NaCl(pH 4.5)进行透析使纯化的蛋白质再折叠。
可溶性Adnectin的中等规模表达和纯化方法如下所述。将编码Adnectin的核酸连同HIS6标签克隆到pET9d(EMD Bioscience,San Diego,CA)载体中并在大肠杆菌HMS174细胞中表达。使用20ml接种培养物(从单个平板接种的菌落产生)接种1升含有50μg/ml羧苄青霉素和34μg/ml氯霉素的LB培养基。使培养物在37℃生长直到A600为0.6-1.0。在用1mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之后，使培养物在30℃生长4小时，通过在>10,000g下在4℃离心30分钟收获培养物。在-80℃下冷冻细胞沉淀。使用均质器(IKAworks)将细胞沉淀重悬于在冰上的25ml裂解缓冲液(20mM NaH2P02、0.5M NaCl、lx无EDTA的全蛋白酶抑制剂混合物(Complete Protease Inhibitor Cocktail-EDTA free)(Roche)、ImM PMSF，pH 7.4)中。通过使用M-1 10S型/>(Microfluidics)进行高压均质化(>18,000psi)实现细胞裂解。通过在4℃下以23,300g离心30分钟来分离可溶部分。经由0.45μm过滤器使上清液澄清。将澄清的裂解物上样到用20mM磷酸钠/500M NaCl(pH7.4)预平衡的Histrap柱(GE)上。然后用25个柱体积的相同缓冲液、之后20个柱体积的20mM磷酸钠/500mM NaCl/25mM咪唑(pH7.4)及随后35个柱体积的20mM磷酸钠/500M NaCl/40mM咪唑(pH 7.4)洗涤柱。用15个柱体积的20mM磷酸钠/500mM NaCl/500mM咪唑(pH 7.4)洗脱蛋白质，根据A280下的吸光度合并各部分并针对l x PBS、50mM Tris、150mM NaCl(pH 8.5)或50mM NaOAc、150mM NaCl(pH 4.5)进行透析。通过在0.22μm过滤去除任何沉淀。
VI.生物物理学和生物化学表征
可以以平衡常数(例如，解离，KD)方面和在动力学常数(例如，结合速率常数kon和解离速率常数koff为标准来评估本文所述的抗GPC3 Adnectin的结合。Adnectin通常以上小于1μM、500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pM、或100pM的KD与靶分子结合，不过在koff足够低或kon足够高的情况下，更高的KD值也是可以容忍的。
结合亲和力的体外测定法
用于确定抗GPC3 Adnectin的结合亲和力的示例性测定法包括但不限于溶液相法，如动力排除测定(KinExA)(Blake等人，JBC 1996；271:27677-85；Drake等人，AnalBiochem 2004；328:35-43)、采用Biacore系统(Uppsala,Sweden)的表面等离子体共振(SPR)(Welford等人，Opt.Quant.Elect 1991；23:1；Morton和Myszka,Methods inEnzymology 1998；295:268)和均相时间分辨荧光(HTRF)测定(Newton等人，J BiomolScreen 2008；13:674-82；Patel等人，Assay Drug Dev Technol 2008；6:55-68)。
在某些实施方案中，可在Biacore系统中实时监测生物分子的相互作用，Biacore系统利用SPR来检测玻璃支持物上的薄金膜的表面上的光由于离开该表面高达300nm的折射率变化所致的共振角变化。Biacore分析生成结合速率常数、解离速率常数、平衡解离常数、和亲和常数。通过使用Biacore表面等离子体共振系统(Biacore,Inc.)评估结合速率常数和解离速率常数获得结合亲和力。生物传感器芯片由于靶标的共价偶联而活化。然后将靶标稀释并注射到芯片上，获得以固定材料的反应单位表示的信号。由于以共振单位(RU)表示的信号与固定材料的质量成比例，这代表在基质上的固定靶标密度的范围。在全局分析中同时拟合结合数据和解离数据，以解析1:1双分子相互作用的净速率表达，从而产生kon、koff和Rmax(饱和时的最大反应)的最佳拟合值。从SPR测量值计算关于结合的平衡解离常数KD，表示为koff/kon。
在一些实施方案中，本文所述的抗GPC3 Adnectin在实施例2中描述的SPR亲和力测定中显示出1μM或更低、500nM或更低、400nM或更低、300nM或更低、200nM或更低、150nM或更低、100nM或更低、90nM或更低、80nM或更低、70nM或更低、60nM或更低、50nM或更低、40nM或更低、30nM或更低、20nM或更低、15nM或更低、10nM或更低、5nM或更低、或1nM或更低的KD。
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin基本上不与近缘的蛋白结合，例如，抗GPC3Adnectin基本上不与磷脂酰肌醇蛋白聚糖1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4或磷脂酰肌醇蛋白聚糖6结合。
应当理解，本文中上述测定是示例性的，并且可以使用本领域已知的用于确定蛋白质之间的结合亲和力的任何方法(例如，荧光共振能量转移(FRET)、酶联免疫吸附测定、和竞争性结合测定(例如，放射免疫测定)来评估在本文所述的抗GPC3 Adnectin之间的结合亲和力。
结合的细胞测定法
在一些实施方案中，抗GPC3 Adnectin及其缀合物被内化到表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞中。评价多肽内化的标准测定法是本领域已知的，包括例如HumZap内化测定法。为了评估与肿瘤细胞例如Hep-3b或Hep-G2(ATCC保藏号分别为HB-8064和HB-8065)的结合，可以从公众可获得的来源例如美国典型培养物保藏中心获得细胞，并将其用于诸如流式细胞术分析的标准测定中。
VII.药物缀合物
还提供了包含与治疗剂或药物模块缀合的FBS结构域的多肽，例如Adnectin。在Adnectin-药物缀合物(AdxDC)中，FBS模块(例如，抗GPC3 Adnectin)与药物模块缀合，其中Adnectin作为靶向剂用于将AdxDC导向至表达GPC3的靶细胞，比如癌细胞。一旦药物在靶细胞内部或在其附近释放，药物起到治疗剂的作用。关于对与例如在癌症治疗中的抗体一起使用的药物缀合物的作用机制和用途的综述，参见Schrama等人，Nature Rev.Drug Disc.,5:147(2006)。
用于药物缀合物的适合的药物模块包括细胞毒素或放射性毒素。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害(例如，杀伤)的任何药剂，包括抗代谢药、烷化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌合剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素、和抗有丝分裂剂。
适合的药剂包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二轻基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂还包括例如，抗代谢药(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥(Thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(以前的道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(以前的放线菌素D)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。可以与本发明的抗GPC3 Adnectin缀合的治疗性细胞毒素的其他优选实例包括倍癌霉素、卡奇霉素、美登素和奥里斯他汀及其衍生物。
Adnectin药物缀合物可用于修饰给定的生物反应，并且药物模块并非解释为局限于经典的化学治疗剂。例如，药物模块可以是具有期望的生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可以包括例如酶促活性毒素或其活性片段，比如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；诸如肿瘤坏死因子或干扰素-γ的蛋白质；或生物反应调节剂，例如像淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
可以使用本领域可用的接头技术将抗GPC3 Adnectin与治疗剂缀合。已经用于将细胞毒素与Adnectin缀合的接头类型的实例包括但不限于腙类、硫醚类、酯类、二硫化物类和含肽接头。可以选择这样的接头，例如其对溶酶体区室内低pH的切割是敏感的或者对蛋白酶(比如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶，比如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D))的切割是敏感的。细胞毒素的实例描述于例如美国专利No.6,989,452、7,087,600和7,129,261以及PCT申请号PCT/US02/17210、PCT/US2005/017804、PCT/US06/37793、PCT/US06/060050、PCT/US2006/060711、WO/2006/110476以及美国专利申请No.60/891,028中，将所有这些专利通过提述完整并入本文。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnecin和治疗剂优选地经由可裂解的接头缀合，所述接头例如肽基、二硫键或腙接头。更优选地，接头为肽基接头，其包含Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQ ID NO:467)、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser、或Glu。可以根据在美国专利No.7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公开号WO 02/096910；WO 07/038658；WO 07/051081；WO07/059404；WO 08/083312；和WO 08/103693；美国专利公开号2006/0024317；2006/0004081；和2006/0247295中描述的类似方法来制备FBS-DC；将这些公开内容通过提述并入本文。
例如，利用马来酰亚胺化学，可使接头自身与抗GPC3 Adnectin上的PmXn模块的半胱氨酸连接(例如，共价连接)，其中至少一个X是半胱氨酸。例如，接头可与抗GPC3Adnectin-PmXn共价连接，其中至少一个X是半胱氨酸。例如，接头可与抗GPC3 Adnectin--PmCn连接，其中P是脯氨酸，C是半胱氨酸，m和n是至少为1的整数，例如1-3。可以利用马来酰亚胺化学如本领域已知进行与半胱氨酸的连接(例如，Imperiali,B.等人，ProteinEngineering:Nucleic Acids and Molecular Biology,Vol.22,pp.65-96,Gross,H.J.,ed.(2009))。为了将接头与抗GPC3FBS上的半胱氨酸附接，所述接头例如可以包含马来酰亚胺基模块，于是所述模块与半胱氨酸反应而形成共价键。在某些实施方案中，优化半胱氨酸周围的氨基酸，以促进化学反应。例如，相对于以一段带正电荷的氨基酸围绕半胱氨酸，通过使带负电荷的氨基酸围绕半胱氨酸可以使反应更快(EP 1074563)。药物模块与抗GPC3Adnectin上的半胱氨酸的连接是位点特异性的连接。
关于癌症治疗，该药物优选地是引起靶向的癌细胞死亡的细胞毒性药物。可以在抗GPC3 FBS-DC中使用的细胞毒性药物包括例如下列类型的化合物及其类似物和衍生物：
a)烯二炔类，如卡奇霉素(参见，例如，Lee等人，J.Am.Chem.Soc.1987,109,3464和3466)和uncialamycin(参见，例如，Davies等人，WO 2007/038868 A2(2007)；Chowdari等人，US 8,709,431 B2(2012)；以及Nicolaou等人，WO 2015/023879 A1(2015))；
b)微管溶素类(参见，例如，Domling等人，US 7,778,814 B2(2010)；Cheng等人，US8,394,922 B2(2013)；以及Cong等人，US 8,980,824 B2(2015))；
c)DNA烷化剂类，比如CC-1065的类似物和倍癌霉素(参见，例如，Boger,US 6,5458,530 B1(2003)；Sufi等人，US 8,461,117 B2(2013)；以及Zhang等人，US 8,852,599B2(2014))；
d)埃坡霉素类(参见，例如，Vite等人，US 2007/0275904 A1(2007)和US RE42930E(2011))；
e)奥里斯他汀类(参见，例如，Senter等人，US 6,844,869 B2(2005)和Doronina等人，US 7,498,298 B2(2009))；
f)吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)二聚体类(参见，例如，Howard等人，US 2013/0059800 A1(2013)；US 2013/0028919 A1(2013)；以及WO 2013/041606 A1(2013))；和
g)美登木素生物碱类，如DM1和DM4(参见，例如，Chari等人，US 5,208,020(1993)和Amphlett等人，US 7,374,762 B2(2008))。
除了公开药物模块本身之外，前述药物模块参考文献还公开了适用于缀合它们的可用于制造药物-接头化合物的接头。与药物-接头化合物的制备有关的特别有关的公开可见于Chowdari等人，US 8,709,431 B2(2012)；Cheng等人，US 8,394,922 B2(2013)；Cong等人，US 8,980,824 B2(2015)；Sufi等人，US 8,461,117 B2(2013)；以及Zhang等人，US 8,852,599。
优选地，所述药物模块是DNA烷化剂、微管溶素、奥里斯他汀、吡咯并苯并二氮杂卓、烯二炔或美登木素生物碱化合物，比如：
/>
在上述前五种药物的情况下，实现缀合的官能团是胺(-NH2)基团，并且在最后两种药物的情况下，所述官能团是甲胺(-NHMe)基团。
为了将药物与adnectin缀合，需要接头基团。药物与接头结合形成药物-接头化合物，然后与adnectin缀合。药物-接头化合物可以由式(I)表示
其中
D是药物；
T是自消基团；
t是0或1；
AAa和AAb各自独立地选自下组：丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
p是1、2、3或4；
q是2、3、4、5、6、7、8、9或10；
r是1、2、3、4或5；并且
s是0或1。
在式II中，-AAa-[AAb]p-代表其长度由p的值决定的多肽(如果p为1则为二肽，如果p为3则为四肽，等)。AAa位于多肽的羧基末端，并且其羧基与药物D的胺氮(或自消基团T，如果存在的话)形成肽(酰胺)键。相反，最后一个AAb位于多肽的氨基末端，并且其α-氨基与
形成肽键，
这取决于s分别是1还是0。优选的多肽-AAa-[AAb]p-是Val-Cit、Val-Lys、Lys-Val-Ala、Asp-Val-Ala、Val-Ala、Lys-Val-Cit、Ala-Val-Cit、Val-Gly、Val-Gln和Asp-Val-Cit,以常规的N至C方向书写，正如H2N-Val-Cit-CO2H)。更优选地，所述多肽是Val-Cit、Val-Lys或Val-Ala。优选地，多肽-AAa-[AAb]p-可被靶(癌)细胞内发现的酶切割，所述酶例如组织蛋白酶，特别是组织蛋白酶B。
如果下标s为1，则药物-接头(I)含有聚(乙二醇)(PEG)基团，其可以有利地改善药物-接头(I)的溶解性，促进与adnectin的缀合——这是在水性介质中进行的步骤。而且，PEG基团可以用作adnectin和肽-AAa-[AAb]p-之间的间隔物，使得adnectin的体积在空间上不干扰肽切割酶的作用。
正如下标t等于0或1指示的，自消基团T的存在是可任选的。自消基团是这样的一个基团，其使得切割AAa或AAb(视情况而定)引发反应序列，导致自消基团自身与药物D脱离并释放后者以发挥其治疗功能。当存在时，自消基团T优选为对氨基苄基氧羰基(PABC)基团，其结构如下所示，其中星号(*)表示与药物D的胺氮键合的PABC的末端，波浪线表示与多肽-AAa-[AAb]p-键合的末端。
如Feng在US 7,375,078 B2(2008)中所公开的，可以使用的另一自消基团是取代的噻唑。
式(I)中的马来酰亚胺基团充当反应性官能团，用于通过由adnectin上的巯基的迈克尔加成反应而与adnectin附接，如下所示：
或者，可以使adnectin的赖氨酸残基侧链中的ε-氨基与2-亚氨基硫杂环戊烷反应以引入游离巯基(-SH)。巯基可以与药物-接头(I)中的马来酰亚胺基团反应以实现缀合：
通过这后一种方法的缀合有时被称为“随机缀合”，因为被亚氨基硫杂环戊烷修饰的赖氨酸残基的数目和位置难于预测。
在某些实施方案中，FBS药物缀合物例如AdxDC中的治疗剂是微管溶素或微管溶素类似物。微管溶素属于一组天然存在的抗有丝分裂多肽和缩酚酸肽，包括拟茎点霉毒素、多拉司他汀和念珠藻素(Hamel等人，Curr.Med.Chem.-Anti-Cancer Agents,2002,2:19-53)。微管溶素防止微管蛋白装配成微管，从而使受累细胞滞留在G2/M期并发生凋亡(Khalil等人，ChemBioChem 2006,7:678-683)。
除了天然存在的微管溶素之外，适用于本文中提供的FBS支架药物缀合物(例如,AdxDC)的具有有效细胞毒活性的合成微管溶素类似物已经描述于例如美国专利8,394,922和8,980,824中(通过提述将其并入本文)。
在一些实施方案中，AdxDC中的治疗剂是合成的微管溶素类似物并且具有由式(II)表示的结构：
为了将药物模块(例如，具有式II)与FBS支架(例如抗GPC3FBS支架)缀合，使用具有式(III)所示结构的接头模块：
这个接头模块包含缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit，以常规N至C方向记载)二肽，其被设计成在AdxDC到达靶癌细胞并且被内化之后被细胞内酶组织蛋白酶B切割，从而释放治疗剂以发挥其细胞毒作用(Dubowchik等人，Biorg.Med.Chem Lett.,1998,8:3341-3346；Dubowchik等人，Biorg.Med.Chem Lett.,1998,8:3347-3352；Dubowchik等人，Bioconjugate Chem.,2002,13:855-869)。
药物(II)和接头(III)偶联以产生具有由式(IV)表示的结构的药物-接头化合物，然后与adnectin缀合。药物-接头(IV)的制备描述于Cheng等人的US 8,394,922 B2(2013)(参见例如图20b和实施例22)中，将其公开内容并入本文。本领域技术人员将会理解，在药物-接头(IV)的情况下，不存在任选的自消基团或PEG基团，但是如果需要的话可以掺入这些基团。
在AdxDC缀合物的制备中，制备了具有由式(IV)表示的结构的治疗剂-接头化合物，然后与FBS支架缀合。
在一些实施方案中，FBS-药物缀合物具有由式(V)表示的结构。
/>
其中m是1、2、3、4或更大。在某些实施方案中，m是1。在其他实施方案中，m是2。
在一个实施方案中，抗GPC3 Adnectin(Adx)的C端半胱氨酸残基的侧链中的巯基与化合物(V)中的马来酰亚胺基团反应以实现缀合：
在另一个实施方案中，位于抗GPC3 Adnectin(Adx)C端的两个半胱氨酸的巯基与化合物(IV)中的马来酰亚胺基团反应，以实现每Adnectin两个药物分子的缀合(例如DAR2，图2)。
在一些实施方案中，缀合物中的抗GPC3Adx具有如上在部分IA中所述的氨基酸序列，其已被修饰为含有包含半胱氨酸的C端尾。In在一些实施方案中，抗GPC3Adx包含选自SEQ ID NO:5、9-10、18、22-23、31、35-36、44、48-49、57、61-62、70、74-75、83、87-88、98、102-105、128、130-132、155、157-159、180、184-186、20-,211-213、236、238-240、263、265-267、290、292-294、317和319-321的核心氨基酸序列，其被修饰为含有包含半胱氨酸的C端模块。
在一些实施方案中，抗GPC3Adx已被修饰为含有由本文中定义的PmCXn或PmCXn1CXn2组成的C端模块。在某些实施方案中，C端模块由PC、PCC或本文所述的任何一个C端序列组成，例如在SEQ ID NO:409-423中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，C端模块由PC或PCPPPPPC(SEQ ID NO:416)组成。
在某些实施方案中，修饰的抗GPC3 Adx包含由PmCXn组成的C端模块，并且选自SEQID NO:11-14、24-27、37-40、50-53、63-66、76-79、89-93、106-118、133-145、160-172、187-199、214-226、241-253、268-280、295-307和322-334。
在某些实施方案中，修饰的抗GPC3 Adx包含由PmCXn1CXn2组成的C端模块，并且选自SEQ ID NO:15-17、28-30、41-43、54-57、67-70、80-83、94-97、119-127、146-154、173-181、200-208、227-235、254-262、281-289、308-316和335-343。
在特定的实施方案中，用于药物缀合物中的抗GPC3 Adx为SEQ ID NO:114-118；123-127；141-145；150-154；168-172；177-181；195-199；204-208；222-226；231-235；249-253；258-262；276-280；285-289；303-307；312-316；330-334；和339-343中的任一者。
本文所述的抗GPC3 Adnectin还可以与放射性同位素缀合以产生细胞毒性放射性药物。可以与抗体缀合用于诊断或治疗的放射性同位素的实例包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。本领域中建立了制备放射性缀合物的方法。
VIII.药物组合物
还提供了包含本文所述的抗GPC3 Adnectin和缀合物的药学上可接受的组合物，其中所述组合物基本上不含内毒素和/或无热原。
本领域熟知的用于制备制剂的方法见于例如"Remington:The Science andPractice of Pharmacy"(20th ed.,ed.A.R.Gennaro A R.,2000,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.)。用于肠胃外给药的制剂可例如含有赋形剂、无菌水、盐水、聚亚烷基二醇(如聚乙二醇)、植物来源的油类、或氢化萘。生物相容性、生物可降解丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。纳米颗粒制剂(例如生物可降解纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、脂质体)可用于控制化合物的生物分布。其他潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统、和脂质体。制剂中化合物的浓度视许多因素而变化，包括要给予的药物的剂量和给药途径。
通过将所描述的具有期望纯度的蛋白质与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合而制备用于储存的包含蛋白质的治疗制剂(Osol,A.编辑，Remington'sPharmaceutical Sciences，第16版(1980))，其呈水溶液、冻干或其他干燥制剂的形式。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在采用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的，并且包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(比如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，比如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，比如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，比如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，比如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖类、二糖类、和其他碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖、或葡聚糖；螯合剂，比如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，比如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如吐温、或聚乙二醇(PEG)。
可以任选地以药学上可接受的盐形式给予多肽，所述盐比如在制药工业中常用的无毒酸加成盐或金属络合物。酸加成盐的实例包括有机酸，比如乙酸、乳酸、扑酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸、或三氟乙酸等；聚合酸，比如鞣酸、羧甲基纤维素等；以及无机酸，比如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等。金属络合物包括锌、铁等。在一个实例中，在乙酸钠存在下配制多肽以增加热稳定性。
在被治疗的特殊适应症需要时，本文中的制剂还可含有多于一种的活性化合物，优选地，所述活性化合物具有彼此无不良影响的互补活性。这样的分子以对预期目的有效的量适当地组合存在。
还可例如通过凝聚技术或通过界面聚合将蛋白质包埋在制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。这样的技术公开于Osol,A.编辑，Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(1980)中。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这通过无菌过滤膜容易实现。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适合实例包括含有本文中描述的蛋白质的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形物品的形式，例如薄膜、或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸-γ-乙基酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的注射微球)、和聚-D-(-)-3-羟丁酸。虽然诸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够使分子释放持续100天以上，但某些水凝胶释放蛋白质持续较短的时期。当封装的蛋白质在体内长时间保留时，它们可能由于暴露于37℃的湿气而变性或凝集，导致生物活性的丧失和可能的免疫原性变化。可以根据所涉及的机制针对稳定化设计合理的策略。例如，如果发现凝集机制为通过巯基二硫键转换的分子间S--S键形成，可通过修饰巯基残基、冻干酸性溶液、控制含湿量、使用适当的添加剂、和开发特定的聚合物基质组成而实现稳定化。
为了治疗应用，以药学上可接受的剂型向受试者给予蛋白质。所述蛋白质可以推注的方式或通过在一定时段中以连续方式静脉内给予，通过肌内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、或吸入途径给予。还可以通过瘤内、肿瘤周围、病灶内、或病灶周围途径给予蛋白质，以发挥局部以及全身性疗效。适合的药学上可接受的载体、稀释剂、和赋形剂是熟知的，并且在临床情况允许时可由本领域的技术人员确定。适合的载体、稀释剂和/或赋形剂包括：(1)杜尔贝科(Dulbecco)磷酸盐缓冲盐水，pH约7.4，含有1mg/ml到25mg/ml的人血清白蛋白，(2)0.9％盐水(0.9％w/v NaCl)、和(3)5％(w/v)右旋糖。本发明的方法可以在体外、体内、或离体实施。
蛋白质、和一种或多种另外的治疗剂的给药，无论是联合给药还是依次给药，可如上文针对治疗应用的描述来进行。技术人员将了解，用于联合给药的适合的药学上可接受的载体、稀释剂、和赋形剂取决于联合给药的具体治疗剂的身份(identity)。
当以除了冻干剂型之外的含水剂型存在时，一般将蛋白质配制为约0.1mg/ml到100mg/ml的浓度，不过也允许这些范围之外的广泛变化。对于疾病的治疗，适当的蛋白质剂量将取决于有待治疗的疾病的类型、疾病的严重性和病程、所述蛋白质是为预防目的还是治疗目的而给予、先前治疗的过程、患者的临床病史和对融合物的反应、以及主治医师的判定。适当地以一次或经过一系列治疗向患者给予蛋白质。
治疗有效剂量指产生给药目的治疗效果的剂量。确切的剂量将取决于待治疗的疾患，且可由本领域技术人员使用已知技术来确定。优选的剂量范围可以从约10mg/平方米至约2000mg/平方米，更优选从约50mg/平方米至约1000mg/平方米。在一些实施方案中，以每天约0.01μg/kg至约50mg/kg，每天0.01mg/kg至约30mg/kg，或每天0.1mg/kg至约20mg/kg给予抗GPC3 Adnectin或抗GPC3 AdxDC。
可每天(例如，每天一次、两次、三次、或四次)或以更低频率(例如，每隔天一次、每周一次或两次、每两周一次、每三周一次或每月一次)给予抗GPC3 Adnectin或抗GPC3AdxDC。另外，如本领域中已知，可能需要针对年龄以及体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用、和疾病严重程度进行调整，且可由本领域技术人员使用常规实验来确定。
IX.治疗方法
本文所述的抗GPC3 Adnectin及其药物缀合物适用于治疗具有表达GPC3(例如相对于健康组织而言高水平的GPC3)的肿瘤细胞的癌症。在一些实施方案中，癌症选自肝癌(例如，肝细胞癌(HCC)或肝母细胞瘤)、黑素瘤、肉瘤、肺癌(例如，鳞状肺癌)和维尔姆斯瘤。另外，本文所述的GPC3 Adnectin适用于治疗难治性或复发性恶性肿瘤。
如本文中使用的，术语“受试者”旨在包括人或非人类的动物。优选的受试者包括具有由GPC3活性介导的疾患或表达高水平GPC3的不良细胞的人类患者。当抗GPC3Adnectin或其药物缀合物与另一种药剂一起给予时，可以以任一顺序或同时给予这两者。
例如，抗GPC3 Adnectin、多特异性或双特异性分子及其药物缀合物可用于在体内或体外引发一种或多种以下生物活性：抑制表达GPC3的细胞的生长和/或杀死表达GPC3的细胞；在人效应细胞存在下介导表达GPC3的细胞的吞噬作用或ADCC，或者可能例如通过阻断GPC3配体与GPC3结合而调节GPC3活性。
在某些实施方案中，本文所述的抗GPC3 Adnectin或抗GPC3 AdxDC与免疫原性药剂例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、抗原呈递细胞如携带肿瘤相关抗原的树突细胞、以及用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞的制剂组合(He等人，2004)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，比如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MARTI和/或酪氨酸酶的肽，或经转染的表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。GPC3阻断还可以与标准癌症治疗(包括化疗治疗方案、放疗、手术、激素剥夺和血管生成抑制剂)以及另一种免疫治疗剂(例如，抗PD-1、抗CTLA-4和抗LAG-3 Adnectin或抗体)组合。
本文中提供了联合治疗方法，其中抗GPC3 Adnectin和/或抗GPC3 AdxDC与一种或多种另外的药剂(例如，小分子药物、抗体或其抗原结合部分)一起给予(同时地或连续地)，所述另外的药剂在刺激免疫应答中有效，从而增强、刺激或上调受试者中的免疫应答。
通常，例如本文所述的抗GPC3 Adnectin或/或抗GPC3 AdxDC可以与肿瘤免疫药剂组合，所述肿瘤免疫药剂例如在免疫细胞如T细胞上的(i)刺激(例如，共刺激)分子(例如，受体或配体)的激动剂和/或(ii)抑制性信号或分子(例如，受体或配体)的拮抗剂，这两者都导致免疫应答，如抗原特异性T细胞应答的放大。在某些方面，肿瘤免疫药剂是在参与先天免疫的细胞，例如NK细胞上的(i)刺激(包括共刺激)分子(例如，受体或配体)的激动剂或(ii)抑制(包括共抑制)分子(例如，受体或配体)的拮抗剂，并且其中肿瘤免疫药剂增强先天免疫。这样的肿瘤免疫药剂通常被称为免疫检查点调节剂，例如免疫检查点抑制剂或免疫检查点刺激剂。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin或/或抗GPC3 AdxDC与靶向作为免疫球蛋白超家族(IgSF)成员的刺激或抑制分子的药剂一起给药。例如，例如本文所述的抗GPC3Adnectin和/或抗GPC3 AdxDC可以与靶向IgSF家族成员的药剂一起给予受试者以增加免疫应答。例如，抗GPC3 Adnectin和/或抗GPC3 AdxDC可以与靶向(或特异性结合)膜结合配体B7家族成员的药剂一起施用，所述B7家族包括B7-1、B7-2、B7(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)以及B7-H6或与B7家族成员特异性结合的共刺激或共抑制受体。
抗GPC3 Adnectin和/或抗GPC3 AdxDC也可以与靶向分子(配体或受体)的TNF和TNFR家族成员的药剂一起施用，所述分子例如CD40和CD40L、OX-40、GITR、GITRL、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDA1、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY和NGFR(参见，例如Tansey(2009)Drug Discovery Today 00:1)。
可以通过施用一种或多种下列药剂来刺激T细胞应答：
(1)抑制T细胞活化的蛋白质的拮抗剂(抑制剂或阻断剂)(例如，免疫检查点抑制剂)，所述蛋白质例如如上所述的CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2和LAG-3，以及任何以下蛋白质：TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1和TIM-4；和/或
(2)刺激T细胞活化的蛋白质的激动剂，所述蛋白质例如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、DR3和CD28H。
调节上述蛋白质之一并可与抗GPC3 Adnectin和/或抗GPC3 AdxDC组合的示例性药剂(例如，本文所述用于治疗癌症的那些)包括：YervoyTM(伊匹单抗)或曲美木单抗(针对CTLA-4)、加利昔单抗(针对B7.1)、BMS-936558(针对PD-1)、MK-3475(针对PD-1)、AMP224(针对B7DC)、BMS-936559(针对B7-H1)、MPDL3280A(针对B7-H1)、MEDI-570(针对ICOS)、AMG557(针对B7H2)、MGA271(针对B7H3)、IMP321(针对LAG-3)、BMS-663513(针对CD137)、PF-05082566(针对CD137)、CDX-1127(针对CD27)、抗OX40抗体(Providence HealthServices)、huMAbOX40L(针对OX40L)、阿塞西普(针对TACI)、CP-870893(针对CD40)、鲁卡木单抗(针对CD40)、达西珠单抗(针对CD40)、莫罗单抗-CD3(针对CD3)、伊匹单抗(针对CTLA-4)和/或MK4166。
抗GPC3 Adnectin或抗GPC3 AdxDC也可与皮地利珠单抗(CT-011)一起施用，不过其对PD-1结合的特异性受到质疑。
可以与抗GPC3 Adnectin或抗GPC3 AdxDC组合用于治疗癌症的其他分子包括NK细胞上的抑制性受体的拮抗剂或NK细胞上的活化受体的激动剂。例如，抗GITR激动剂抗体可以与KIR的拮抗剂(例如，立鲁单抗)组合。
T细胞活化还受到可溶性细胞因子的调节，并且抗GPC3 Adnectin或抗GPC3 AdxDC可以与抑制T细胞活化的细胞因子的拮抗剂或刺激T细胞活化的细胞因子的激动剂一起施用于例如患有癌症的受试者。
在某些实施方案中，抗GPC3 Adnectin或抗GPC3 AdxDC可以与下列各项组合：(i)抑制T细胞活化的IgSF家族或B7家族或TNF家族的蛋白质的拮抗剂(或抑制剂或阻断剂)或抑制T细胞活化的细胞因子(例如，IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF；“免疫抑制细胞因子”)的拮抗剂和/或(ii)IgSF家族、B7家族或TNF的刺激性受体的激动剂，或刺激T细胞活化的细胞因子的激动剂，用于刺激免疫应答，例如用于治疗诸如癌症的增殖性疾病。
用于联合治疗的其他药剂包括抑制或耗竭巨噬细胞或单核细胞的药剂，包括但不限于CSF-1R拮抗剂，比如CSF-1R拮抗剂抗体，包括RG7155(WO11/70024、WO11/107553、WO11/131407、WO13/87699、WO13/119716、WO13/132044)或FPA-008(WO11/140249；WO13169264；WO14/036357)。
抗GPC3 Adnectin或抗GPC3 AdxDC也可以与抑制TGF-β信号转导的药剂一起施用。
可以与抗GPC3 Adnectin和/或抗GPC3 AdxDC组合的另外的药剂包括增强肿瘤抗原呈递的药剂，例如树突细胞疫苗、分泌GM-CSF的细胞疫苗、CpG寡核苷酸和咪喹莫特，或增强肿瘤细胞的免疫原性的治疗(例如，蒽环类)。
可与抗GPC3 Adnectin或抗GPC3AdxDC组合的其他治疗还包括耗竭或阻断Treg细胞的治疗，例如与CD25特异性地结合的药剂。
另一种可与抗GPC3 Adnectin或抗GPC3 AdxDC组合的治疗是抑制代谢酶比如吲哚胺双加氧酶(IDO)、双加氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶的治疗。
另一类可与抗GPC3 Adnectin或/或抗GPC3 AdxDC一起使用的药剂包括抑制腺苷形成或抑制腺苷A2A受体的药剂。
可以与用于治疗癌症的抗GPC3 Adnectin或抗GPC3 AdxDC组合的其他治疗包括逆转/预防T细胞无能或耗竭的治疗和在肿瘤部位触发先天免疫激活和/或炎症的治疗。
抗GPC3 Adnectin或抗GPC3 AdxDC可以与多于一种的肿瘤免疫药剂组合，并且可以例如与靶向免疫途径的多种成分的组合方法相结合，所述组合方法例如以下一种或多种：增强肿瘤抗原呈递的治疗(例如，树突细胞疫苗，分泌GM-CSF的细胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特)；例如通过抑制CTLA-4和/或PD1/PD-L1/PD-L2途径和/或耗竭或阻断Treg或其他免疫抑制性细胞来抑制负性免疫调节的治疗；刺激正性免疫调节的治疗，例如用刺激CD-137、OX-40和/或GITR途径和/或刺激T细胞效应子功能的激动剂；全身性地增加抗肿瘤T细胞的频率的治疗；耗竭或抑制Treg(比如肿瘤中的Treg)的治疗，例如使用CD25拮抗剂(例如，达利珠单抗)或通过离体抗CD25珠耗竭；影响肿瘤中的抑制性髓样细胞功能的治疗；增强肿瘤细胞的免疫原性的治疗(例如，蒽环类)；过继性T细胞或NK细胞转移，所述细胞包括遗传修饰的细胞，例如经嵌合抗原受体修饰的细胞(CAR-T疗法)；抑制代谢酶如吲哚胺双加氧酶(IDO)、双加氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶的治疗；逆转/防止T细胞无能或耗竭的治疗；在肿瘤部位触发先天免疫激活和/或炎症的治疗；免疫刺激性细胞因子的施用；或免疫抑制性细胞因子的阻断。
本文所述的抗GPC3 Adnectin和/或抗GPC3 AdxDC可以与一种或多种下列药剂一起使用：连接正性共刺激受体的激动剂；通过抑制性受体减弱信号转导的阻断剂、拮抗剂和一种或多种全身性地增加抗肿瘤T细胞的频率的药剂；克服肿瘤微环境中不同免疫抑制途径的药剂(例如，阻断抑制性受体接合(例如，PD-L1/PD-1相互作用))；耗竭或抑制Treg(例如，使用抗CD25单克隆抗体(例如，达利珠单抗)或通过离体抗CD25珠耗竭)，抑制代谢酶比如IDO；或逆转/预防T细胞无能或衰竭)以及在肿瘤部位触发先天免疫激活和/或炎症的药剂。
本文中提供了本文所述的任何抗GPC3 Adnectin在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途。本公开提供了本文所述的任何抗GPC3Adnectin的医学用途，其对应于采用本文所述的抗GPC3 Adnectin的治疗方法的所有实施方案。
XI.可检测标记物
本文所述的抗GPC3 Adnectin还可用于各种诊断和成像应用。在某些实施方案中，用体内可检测的模块标记抗GPC3 Adnectin，并且如此标记的Adnectin可用作例如用于全身成像的体内成像剂。例如，在一个实施方案中，用于检测受试者中的GPC3阳性肿瘤的方法包括：向受试者给予与可检测标记物连接的抗GPC3 Adnectin，并且在适当的时间后检测受试者中的所述标记物。
可以使用抗GPC3 Adnectin成像剂来诊断与GPC3的水平增加相关的疾患或疾病，例如癌症，其中肿瘤选择性地过表达GPC3。以相似的方式，可以使用抗GPC3 Adnectin来监测受试者(例如，正在接受治疗以降低GPC3水平和/或GPC3阳性细胞(例如，肿瘤细胞)的受试者)中的GPC3水平。抗GPC3Adnectin的使用可以加以或没有进一步的修饰，并且可以通过共价或非共价附接可检测模块加以标记。
可检测标记可以是当前在体外诊断学领域中使用的任何不同类型，包括颗粒标记物，包括金属溶胶，如胶体金；同位素，如I125或Tc99，例如与N2S2、N3S或N4类型的肽螯合剂一起提供；发色团，包括荧光标志物、生物素、发光标志物、磷光标志物等，还有将给定底物转化为可检测标志物的酶标记物，以及通过后续扩增例如聚合酶链反应显示的多核苷酸标签。然后可通过亲和素或链霉亲和素结合来检测生物素化的抗GPC3FBS。适合的酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等等。例如，标记物可以是酶(碱性磷酸酶)，其可通过测定在转化1,2二氧杂环丁烷底物，如金刚烷基甲氧基磷氧酰苯基二氧杂环丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5′-氯)三环{3.3.1.1 3,7}癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠(CSPD)，还有CDP和或本领域技术人员熟知的其他发光底物，例如适合的镧系元素铽(III)和铕(III)的螯合物之后化学发光的存在或形成而加以检测。
可以使用的可检测模块包括放射性物质，比如：放射性重金属，如铁螯合物，钆或锰的放射性螯合物，氧、氮、铁、碳或镓的正电子发射体，18F、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、124I、86Y、89Zr、66Ga、67Ga、68Ga、44Sc、47Sc、11C、111In、114mIn、114In、125I、124I、131I、123I、131I、123I、32Cl、33Cl、34Cl、74Br、75Br、76Br、77Br、78Br、89Zr、186Re、188Re、86Y、90Y、177Lu、99Tc、212Bi、213Bi、212Pb、225Ac、或153Sm。
通过选定的标记物确定检测手段。在标记物是微粒且以适当水平累积的情况下，利用肉眼或使用仪器，如分光光度计、发光计、荧光计等等可获得标记物或其反应产物的外观，一切都遵循标准实践。
可根据本领域中已知的方法将可检测模块与半胱氨酸连接。当可检测模块是放射性物质，例如本文中进一步描述的那些放射性物质时，通过与半胱氨酸反应的螯合剂将可检测模块与FBS连接，所述螯合剂例如含有马来酰亚胺的螯合剂，比如马来酰亚胺-NODAGA或马来酰亚胺-DBCO。马来酰亚胺-NODAGA或马来酰亚胺-DBCO可与FBS的C端上的半胱氨酸反应(例如，通过PmXn模块，其中至少一个X是半胱氨酸)，以分别产生FBS-NODAGA或FBS-DBCO。可以使用下列螯合剂的任一者，条件是它包含或可被修饰为包含与半胱氨酸反应的反应模块：DFO、DOTA及其衍生物(CB-DO2A、3p-C-DEPA、TCMC、Oxo-DO3A)、TE2A、CB-TE2A、CB-TE1A1P、CB-TE2P、MM-TE2A、DM-TE2A、diamsar及衍生物、NODASA、NODAGA、NOTA、NETA、TACN-TM、DTPA、1B4M-DTPA、CHX-A”-DTPA、TRAP(PRP9)、NOPO、AAZTA及衍生物(DATA)、H2dedpa、H4octapa、H2azapa、H5decapa、H6phospa、HBED、SHBED、BPCA、CP256、PCTA、HEHA、PEPA、EDTA、TETA、和基于TRITA的螯合剂、以及其接近的类似物和衍生物。
在某些实施方案中，FBS用PET示踪剂加以标记并用作体内成像剂。例如，FBS可用PET示踪剂64Cu加以标记。利用诸如马来酰亚胺-NODAGA的螯合剂，64Cu可与具有C端半胱氨酸的FBS连接。
为了合成本文所述的基于抗GPC3 Adnectin的成像剂，也可以使用本领域公认的用放射性核素比如64Cu和18F标记多肽的其他方法。参见，例如US2014/0271467；Gill等人，Nature Protocols 2011；6:1718-25；Berndt等人，Nuclear Medicine and Biology 2007；34:5-15，Inkster等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 2013；23:3920-6，将这些文献的内容通过提述完整并入本文。
在某些实施方案中，GPC3成像剂包含PEG分子(例如，5KDa PEG、6KDa PEG、7KDaPEG、8KDa PEG、9KDa PEG或10KDa PEG)，从而以小增量增加成像剂的血液PK而增强成像对比度或增加基于抗GPC3 Adnectin的成像剂的亲合力。
XI.GPC3的检测
体内检测方法
在某些实施方案中，可以使用标记的抗GPC3 Adnectin将GPC3阳性细胞或组织(例如，表达GPC3的肿瘤)成像。例如，将标记的抗GPC3 Adnectin以足以使标记的Adnectin摄入感兴趣的组织(例如，表达GPC3的肿瘤)的量施用于受试者。然后使用诸如PET的成像系统使受试者成像，成像的时间量适合于所使用的具体放射性核素。然后通过成像系统检测标记的抗GPC3 Adnectin结合的表达GPC3的细胞或组织，例如表达GPC3的肿瘤。
用GPC3成像剂的PET成像可用于定性或定量检测GPC3。GPC3成像剂可以用作生物标志物，并且受试者中GPC3阳性信号的存在或不存在例如可以指示：受试者将对给定的治疗(例如，癌症治疗)有反应，或者受试者对治疗正在作出反应或无反应。
在某些实施方案中，可以对疾病(例如，肿瘤)的随时间或治疗而变化的进展或消退成像。例如，可以监测在经历癌症治疗(例如，化学疗法，放射疗法)的受试者中的肿瘤的大小，并且基于标记的抗GPC3 Adnectin的检测，可以实时监测肿瘤消退的程度。
导致成像剂(例如，18F-Adnectin成像剂，64Cu-Adnectin成像剂)摄入感兴趣的细胞或组织(例如，肿瘤)的有效量可取决于各种因素，包括例如，宿主的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；所采用的特异性探针的排泄率；治疗的持续时间；与所采用的特定组合物联合或同时使用的其他药物的存在；和其他因素。
在某些实施方案中，在给予标记的抗GPC3 Adnectin之前、期间和之后实现表达GPC3的组织的成像。
在某些实施方案中，本文所述的抗GPC3 Adnectin可用于肺、心脏、肾脏、肝脏和皮肤以及其他器官、或与表达GPC3的这些器官相关的肿瘤的PET成像。
在某些实施方案中，抗GPC3显像剂提供至少50％、75％、2、3、4、5或更高的对比度。实施例显示所使用的所有抗GPC3 Adnectin均提供2或更高的PET对比度，并且Adnectin的亲和力并不重要。
当与短半衰期放射性核素(例如，18F)一起用于成像(例如，PET)时，放射性标记的抗GPC3 Adnectin优选静脉内施用。其他的给药途径也适是合的，取决于所使用的放射性核素的半衰期。
在某些实施方案中，通过向受试者施用本文中公开的抗GPC3显像剂并检测所述显像剂，本文所述的抗GPC3显像剂用于检测受试者中的GPC3阳性细胞，检测到的显像剂限定了GPC3阳性细胞在受试者中的位置。在某些实施方案中，通过正电子发射断层摄影术检测显像剂。
在某些实施方案中，通过向受试者施用本文中公开的抗GPC3显像剂并检测所述显像剂，本文所述的抗GPC3显像剂用于检测受试者中的表达GPC3的肿瘤，检测到的显像剂限定了所述肿瘤在受试者中的位置。在某些实施方案中，通过正电子发射断层摄影术检测显像剂。
在某些实施方案中，通过将显像剂施用于受试者并通过正电子发射断层摄影术将所述显像剂的分布进行体内成像而获得本文所述的抗GPC3显像剂的图像。
因此，本文中提供了获得表达GPC3的组织或细胞的定量图像的方法，所述方法包括使细胞或组织与本文所述的抗GPC3成像剂接触，并使用正电子发射断层摄影术检测或定量表达GPC3的组织。
本文中还提供了检测表达GPC3的肿瘤的方法，其包括向患有表达GPC3的肿瘤的受试者施用显像有效量的本文所述的抗GPC3显像剂，并使用正电子发射断层摄影术检测所述显像剂在肿瘤中的放射性发射，其中在肿瘤中检测到放射性发射。
本文中还提供了诊断受试者中表达GPC3的肿瘤的存在的方法，所述方法包括：
●向需要它的受试者施用本文所述的抗GPC3显像剂；和
●获得受试者的至少一部分的放射图像以检测所述显像剂的存在或不存在；
●其中在背景之上显像剂的存在和位置指示疾病的存在和位置。
本文中还提供了监测针对受试者中的表达GPC3的肿瘤的抗肿瘤治疗的进展的方法，所述方法包括：
●在第一时间点向有需要的受试者给予本文所述的抗GPC3显像剂并获得受试者的至少一部分的图像以确定肿瘤的大小；
●向受试者施用抗肿瘤治疗；
●在一个或多个随后的时间点向受试者施用所述显像剂，并且获得在每个时间点的受试者的至少一部分的图像；
●其中在每个时间点的肿瘤的尺寸和位置指示疾病的进展。
体外检测方法
除了体内检测GPC3之外，可以使用诸如本文所述的那些抗PDL1 Adnectin来检测样品中的靶分子。方法可包括使所述样品与本文所述的抗GPC3 Adnectin接触，其中所述接触是在允许抗GPC3 Adnectin-靶标复合物形成的条件下进行的；和检测所述复合物，由此检测所述样品中的所述靶标。可使用任何本领域公认的技术进行检测，例如放射线照相术、免疫测定法、荧光检测、质谱法、或表面等离子体共振。样品可来自人或其他哺乳动物。出于诊断目的，适当的物质是包括用于全身成像的放射性同位素的可检测标记，以及用于样品测试的放射性同位素、酶、荧光标记物和其他适合的抗体标签。
可检测标记可以是当前在体外诊断学领域中使用的任何不同类型，包括颗粒标记物，包括金属溶胶，如胶体金；同位素，如I125或Tc99，例如与N2S2、N3S或N4类型的肽螯合剂一起提供；发色团，包括荧光标志物、生物素、发光标志物、磷光标志物等，还有将给定底物转化为可检测标志物的酶标记物，以及通过后续扩增例如聚合酶链反应显示的多核苷酸标签。然后可通过亲和素或链霉亲和素结合来检测生物素化的FBS。适合的酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等等。例如，标记物可以是酶(碱性磷酸酶)，其可通过测定在转化1,2二氧杂环丁烷底物，如金刚烷基甲氧基磷氧酰苯基二氧杂环丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环{3.3.1.1 3,7}癸烷}-4-基)苯基磷酸二钠(CSPD)，还有CDP和或本领域技术人员熟知的其他发光底物，例如适合的镧系元素铽(III)和铕(III)的螯合物之后化学发光的存在或形成而加以检测。其他标记物包括在上述成像部分中列出的标记物。通过选定的标记物确定检测手段。在标记物是微粒且以适当水平累积的情况下，利用肉眼或使用仪器，如分光光度计、发光计、荧光计等等可获得标记物或其反应产物的外观，一切都遵循标准实践。
XII.试剂盒和制品
可以将本文所述的抗GPC3 Adnectin及其药物缀合物提供在试剂盒中，所述试剂盒为预定量的试剂与用于本文所述的治疗或诊断方法的说明书的包装组合。
例如，在某些实施方案中，提供了含有用于治疗或预防本文所述的疾患或病症或用于本文所述的检测方法的材料的制品。所述制品包括容器和标签。适合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、试管等。可以由各种材料如玻璃或塑料形成容器。所述容器可以容纳用于体内成像的本文所述的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。所述组合物中的活性剂是本文所述的抗GPC3 Adnectin或抗GPC3 AdxDC。所述制品可以进一步包括第二容器，所述第二容器包含药学上可接受的缓冲剂，比如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括立足于商业和用户立场所需的其他物品，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装说明书。
示例性实施方案
1.一种含有包含BC、DE和FG环的基于纤连蛋白的支架(FBS)的多肽，其中所述环的一个或多个相对于野生型FBS结构域的相应环被改变，并且其中所述多肽以1μM或更低的KD与人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)特异性地结合。
2.实施方案1的多肽，其中所述FBS是纤连蛋白III型(Fn3)结构域。
3.实施方案2的多肽，其中所述Fn3结构域是人纤连蛋白III型第十(10Fn3)结构域。
4.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述BC环包含选自下组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:6、19、32、45、58、71、84或99；并且
(b)BC环相对于SEQ ID NO:6、19、32、45、58、71、84或99的BC环具有1、2或3个氨基酸取代、插入或缺失。
5.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述DE环包含选自下组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:7、20、33、46、59、72、85或100；并且
(b)DE环相对于SEQ ID NO:7、20、33、46、59、72、85或100的DE环具有1、2或3个氨基酸取代、插入或缺失。
6.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述FG环包含选自下组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:8、21、34、47、60、73、86、101、129、156、183、210、237、264、291或318；并且
(b)FG环相对于SEQ ID NO:8、21、34、47、60、73、86、101、129、156、183、210、237、264、291或318的FG环具有1、2或3个氨基酸取代、插入或缺失。
7.前述实施方案中任一项的多肽，其中对应地所述BC环包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、19、32、45、58、71、84或99；所述DE环包含选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO:7、20、33、46、59、72、85和100；并且所述FG环包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、21、34、47、60、73、86、101、129、156、183、210、237、264、291和318，并且其中任选地，所述BC、DE和/或FG环包含1、2或3个氨基酸取代。
8.前述实施方案中任一项的多肽，其中：
(a)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:6、7和8；
(b)所述BC、DE和FG环中的至少一者相对于SEQ ID NO:6、7和8的对应BC、DE和FG环包含1、2或3个氨基酸取代；
(c)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:19、20和21；
(d)所述BC、DE和FG环中的至少一者相对于SEQ ID NO:19、20和22的对应BC、DE和FG环包含1、2或3个氨基酸取代；
(e)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:32、33和34；
(f)所述BC、DE和FG环中的至少一者相对于SEQ ID NO:32、33和34的对应BC、DE和FG环包含1、2或3个氨基酸取代；
(g)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:45、46和47；
(h)所述BC、DE和FG环中的至少一者相对于SEQ ID NO:45、46和47的对应BC、DE和FG环包含1、2或3个氨基酸取代；
(i)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:58、59和60；
(j)所述BC、DE和FG环中的至少一者相对于SEQ ID NO:58、59和60的对应BC、DE和FG环包含1、2或3个氨基酸取代；
(k)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:71、72和73；
(l)所述BC、DE和FG环中的至少一者相对于SEQ ID NO:71、72和73的对应BC、DE和FG环包含1、2或3个氨基酸取代；
(m)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:84、85和86；
(n)所述BC、DE和FG环中的至少一者相对于SEQ ID NO:84、85和86的对应BC、DE和FG环包含1、2或3个氨基酸取代；
(o)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:99、100和101；
(p)所述BC、DE和FG环中的至少一者相对于SEQ ID NO:99、100和101的对应BC、DE和FG环包含1、2或3个氨基酸取代。
9.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述FBS包含在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列，其中BC、DE和FG环分别由(X)v、(X)x和(X)z表示，并且
(a)包含与分别在SEQ ID NO:6、7和8中列出的BC、DE和FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(b)包含分别具有SEQ ID NO:6、7和8的氨基酸序列的BC、DE和FG环；
(c)包含与分别在SEQ ID NO:19、20和21中列出的BC、DE和FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(d)包含分别具有SEQ ID NO:19、20和21的氨基酸序列的BC、DE和FG环；
(e)包含与分别在SEQ ID NO:32、33和34中列出的BC、DE和FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(f)包含具有SEQ ID NO:32、33和34的氨基酸序列的BC、DE和FG环；
(g)包含与分别在SEQ ID NO:45、46和47中列出的BC、DE和FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(h)包含具有SEQ ID NO:45、46和47的氨基酸序列的BC、DE和FG环；
(i)包含与分别在SEQ ID NO:58、59和60中列出的BC、DE和FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(j)包含具有SEQ ID NO:58、59和60的氨基酸序列的BC、DE和FG环；
(k)包含与分别在SEQ ID NO:71、72和73中列出的BC、DE和FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(l)包含具有SEQ ID NO:71、72和73的氨基酸序列的BC、DE和FG环；
(m)包含与分别在SEQ ID NO:84、85和86中列出的BC、DE和FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(n)包含具有SEQ ID NO:84、85和86的氨基酸序列的BC、DE和FG环；
(o)包含与分别在SEQ ID NO:99、100和101中列出的BC、DE和FG环序列至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；
(p)包含具有SEQ ID NO:99、100和101的氨基酸序列的BC、DE和FG环；
(q)包含具有SEQ ID NO:99、100和129的氨基酸序列的BC、DE和FG环；
(r)包含具有SEQ ID NO:99、100和156的氨基酸序列的BC、DE和FG环；
(s)包含具有SEQ ID NO:99、100和183的氨基酸序列的BC、DE和FG环；
(t)包含具有SEQ ID NO:99、100和210的氨基酸序列的BC、DE和FG环；
(u)包含具有SEQ ID NO:99、100和237的氨基酸序列的BC、DE和FG环；
(v)包含具有SEQ ID NO:99、100和264的氨基酸序列的BC、DE和FG环；
(w)包含具有SEQ ID NO:99、100和264的氨基酸序列的BC、DE和FG环；或
(x)包含具有SEQ ID NO:99、100和318的氨基酸序列的BC、DE和FG环。
10.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述FBS包含与SEQ ID NO:3、5、18、31、44、57、70、83和98的非BC、DE和FG环区至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
11.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述FBS包含与SEQ ID NO:5、18、31、44、57、70、83和98中的任一者至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
12.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述FBS包含与SEQ ID NO:5、9-18、22-31、35-44、48-57、61-70、74-83、87-98、102-128、130-155、157-182、184-209、211-236、238-263、265-290、292-317或319-343中任一者的氨基酸序列至少90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
13.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述FBS包含与SEQ ID NO:98、102-128、129-155、157-182、184-209、211-236、238-263、265-290、292-317和319-343的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
14.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述FBS包含选自SEQ ID NO:5、18、31、44、57、70、83、98、128、155、182、209、209、236、263、290和317的氨基酸序列。
15.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述FBS包含选自SEQ ID NO:5、9-18、22-31、35-44、48-57、61-70、74-83、87-98、102-128、130-155、157-182、184-209、211-236、238-263、265-290、292-317和319-343的氨基酸序列。
16.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述FBS包含选自SEQ ID NO:98、102-128、129-155、157-182、184-209、211-236、238-263、265-290、292-317和319-343的氨基酸序列。
17.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述FBS与包含氨基酸序列SEQ ID NO:98的FBS竞争结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖3。
18.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述FBS与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3内的包含HQVSFF(SEQ ID NO:209)的10-20个氨基酸残基的区域结合。
19.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述FBS与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3内的包含EQLLQSASM(SEQ ID NO:210)的10-20个氨基酸残基的区域结合。
20.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述FBS与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3内的包含HQVSFF(SEQ ID NO:209)和EQLLQSASM(SEQ ID NO:210)的不连续Adnectin位点结合。
21.前述实施方案中任一项的多肽，进一步包括异源蛋白。
22.前述实施方案中任一项的多肽，进一步包含一个或多个选自下组的药代动力学(PK)模块：聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、转铁蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白结合性蛋白和血清免疫球蛋白结合性蛋白。
23.前述实施方案中任一项的多肽，其中所述FBS的C端与由氨基酸序列PmXn组成的模块连接，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，m是至少为1的整数，并且n是0或至少为1的整数。
24.实施方案23的多肽，其中m是1或2，并且n是1-10的整数。
25.实施方案23或24的多肽，其中所述模块包含半胱氨酸。
26.实施方案25的多肽，其中所述模块由氨基酸序列PmCXn组成，其中C是半胱氨酸，每个X独立地是任何氨基酸。
27.实施方案25的多肽，其中所述模块由氨基酸序列PmCXn1CXn2组成，其中每个X独立地是任何氨基酸，n1和n2独立地是0或至少为1的整数。
28.实施方案28的多肽，其中n1和n2独立地是1-5的整数。
29.实施方案23的多肽，其中所述模块选自下组：PI、PC、PID、PIE、PIDK(SEQ IDNO:382)、PIEK(SEQ ID NO:383)、PIDKP(SEQ ID NO:384)、PIEKP(SEQ ID NO:385)、PIDKPS(SEQ ID NO:386),PIEKPS(SEQ ID NO:387)、PIDKPC(SEQ ID NO:388)、PIEKPC(SEQ ID NO:389)、PIDKPSQ(SEQ ID NO:390)、PIEKPSQ(SEQ ID NO:391)、PIDKPCQ(SEQ ID NO:392)、PIEKPCQ(SEQ ID NO:393)、PHHHHHH(SEQ ID NO:394)和PCHHHHHH(SEQ ID NO:395)。
30.实施方案26的多肽，其中所述模块是PC或PPC。
31.实施方案27的多肽，其中所述模块选自下组：PCGC(SEQ ID NO:412)、PCPC(SEQID NO:413)、PCGSGC(SEQ ID NO:414)、PCPPPC(SEQ ID NO:415)、PCPPPPPC(SEQ ID NO:416)、PCGSGSGC(SEQ ID NO:417)、PCHHHHHC(SEQ ID NO:418)、PCCHHHHHH(SEQ ID NO:419)、PCGCHHHHHH(SEQ ID NO:420)、PCPCHHHHHH(SEQ ID NO:421)、PCGSGCHHHHHH(SEQ IDNO:422)、PCPPPCHHHHHH(SEQ ID NO:423)、PCPPPPPHHHHHH(SEQ ID NO:424)和PCGSGSGCHHHHHH(SEQ ID NO:425)。
32.实施方案31的多肽，其中所述模块是PCPPPPPC(SEQ ID NO:416)。
33.实施方案25-32中任一项的多肽，其中C端模块中的半胱氨酸与异源模块缀合。
34.实施方案33的多肽，其中所述异源模块为可检测模块。
35.实施方案33的多肽，其中所述异源模块是药物模块，并且所述FBS和药物模块形成FBS-药物缀合物。
36.一种包含实施方案1-31中任一项的FBS模块的FBS-药物缀合物，其中所述药物模块通过接头与FBS模块缀合。
37.实施方案36的FBS-药物缀合物，其中所述接头是腙、硫醚、酯、二硫键或含肽接头。
38.实施方案37的FBS-药物缀合物，其中所述接头是肽基接头。
39.实施方案38的FBS-药物缀合物，其中所述肽基接头是Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQ ID NO:467)、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser、或Glu。
40.实施方案36-39中任一项的FBS-药物缀合物，其中所述药物模块是细胞毒性药物。
41.实施方案40的FBS-药物缀合物，其中所述细胞毒性药物选自下组：
(a)烯二炔类，比如卡奇霉素和uncialamycin；
(b)微管溶素；
(c)DNA烷化剂类，比如CC-1065的类似物和倍癌霉素；
(d)埃坡霉素类；
(e)奥里斯他汀；
(f)吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)二聚体类；
(g)美登木素生物碱类，比如DM1和DM4
及其类似物和衍生物。
42.实施方案41的FBS-药物缀合物，其中所述药物模块是：
/>
/>
43.实施方案36-41中任一项的FBS-药物缀合物，其中所述药物模块是具有式(II)的结构的合成微管溶素类似物：
44.实施方案36-43中任一项的FBS-药物缀合物，其中所述FBS和药物模块用具有式(III)的结构的接头模块缀合：
45.实施方案44的FBS-药物缀合物，其中所述药物-模块-接头具有式(IV)的结构：
其中马来酰亚胺基团与FBS的半胱氨酸的巯基反应，由此在药物-模块-接头和FBS之间形成硫醚键。
46.实施方案36-45中任一项的FBS-药物缀合物，其中所述FBS模块含有包含半胱氨酸的C端模块。
47.实施方案46的FBS-药物缀合物，其中所述C端模块由氨基酸序列PmCXn组成，其中C是半胱氨酸，每个X独立地是任何氨基酸，m是至少为1的整数，并且n是0或至少为1的整数。
48.实施方案47的FBS-药物缀合物，其中m是1或2，并且n是1-10的整数。
49.实施方案46的FBS-药物缀合物，其中所述模块由氨基酸序列PmCXn1CXn2组成，其中每个X独立地是任何氨基酸，n1和n2独立地是0或至少为1的整数。
50.实施方案49的FBS-药物缀合物，其中n1和n2独立地是1-5的整数。
51.实施方案47的FBS-药物缀合物，其中所述C端模块是PC或PPC。
52.实施方案49的FBS-药物缀合物，其中所述模块选自下组：PCGC(SEQ ID NO:412)、PCPC(SEQ ID NO:413)、PCGSGC(SEQ ID NO:414)、PCPPPC(SEQ ID NO:415)、PCPPPPPC(SEQ ID NO:416)、PCGSGSGC(SEQ ID NO:417)、PCHHHHHC(SEQ ID NO:418)、PCCHHHHHH(SEQID NO:419)、PCGCHHHHHH(SEQ ID NO:420)、PCPCHHHHHH(SEQ ID NO:421)、PCGSGCHHHHHH(SEQ ID NO:422)、PCPPPCHHHHHH(SEQ ID NO:423)、PCPPPPPHHHHHH(SEQ ID NO:424)和PCGSGSGCHHHHHH(SEQ ID NO:425)。
53.实施方案52的FBS-药物缀合物，其中所述模块是PCPPPPPC(SEQ ID NO:16)。
54.一种具有由式(I)表示的结构的FBS-药物缀合物，
其中m是1、2、3或4，并且Adx是与人GPC3以1μM或更低的KD特异性地结合的Adnectin，并且其中与“Adx”连接的硫原子是Adnectin的半胱氨酸的巯基的硫原子。
55.实施方案54的FBS-药物缀合物，其中Adx是人10Fn3结构域，其中，
(a)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:6、7和8；
(b)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:19、20和21；
(c)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:32、33和34；
(d)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:45、46和47；
(e)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:58、59和60；
(f)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:71、72和73；
(g)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:84、85和86；
(h)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:99、100和101；
(i)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:99、100和129；
(j)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:99、100和156；
(k)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:99、100和183；
(l)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:99、100和210；
(m)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:99、100和237；
(n)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:99、100和264；
(o)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:99、100和264；或
(p)所述BC、DE和FG环分别包含SEQ ID NO:99、100和318。
并且，10Fn3结构域包含由氨基酸序列PmCXn或PmCXn1CXn2组成的C端模块，其中每个X独立地是任何氨基酸，n1和n2独立地是0或至少为1的整数。
56.实施方案55的FBS-药物缀合物，其中所述C端模块是PC或PPC、PCGC(SEQ IDNO:412)、PCPC(SEQ ID NO:413)、PCGSGC(SEQ ID NO:414)、PCPPPC(SEQ ID NO:415)、PCPPPPPC(SEQ ID NO:416)、PCGSGSGC(SEQ ID NO:417)、PCHHHHHC(SEQ ID NO:418)、PCCHHHHHH(SEQ ID NO:419)、PCGCHHHHHH(SEQ ID NO:420)、PCPCHHHHHH(SEQ ID NO:421)、PCGSGCHHHHHH(SEQ ID NO:422)、PCPPPCHHHHHH(SEQ ID NO:423)、PCPPPPPHHHHHH(SEQ IDNO:424)或PCGSGSGCHHHHHH(SEQ ID NO:425)。
57.实施方案52的FBS-药物缀合物，其中所述模块是PC或PCPPPPPC(SEQ ID NO:16)。
58.实施方案54的FBS-药物缀合物，其中Adx包含选自SEQ ID NO:12-17、24-30、38-43、51-56、64-69、77-82、90-97、110-127、137-154、164-181、191-208、218-235、245-262、272-289、299-316和326-343的氨基酸序列。
59.实施方案54的FBS-药物缀合物，其中Adx包含选自SEQ ID NO:110-127、137-154、164-181、191-208、218-235、245-262、272-289、299-316和326-343的氨基酸序列。
60.实施方案54的FBS-缀合物，其中Adx包含选自SEQ ID NO:110-127的氨基酸序列。
61.一种包含实施方案1-35中任一项的多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。
62.一种包含实施方案36-60中任一项的FBS-药物缀合物的药物组合物。
63.实施方案61或62的组合物，其中所述组合物基本上不含内毒素。
64.一种编码实施方案1-35中任一项的多肽的分离的核酸分子。
65.一种包含编码权利要求1-35中任一项的多肽的核苷酸序列的表达载体。
66.一种包含编码实施方案1-35中任一项的多肽的核酸的细胞。
67.一种产生实施方案1-35中任一项的多肽的方法，所述方法包括在适合于表达所述多肽的条件下培养权利要求66的细胞，并纯化所述多肽。
68.一种减轻或抑制受试者中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3疾病或疾患的方法，其包括给所述受试者施用有效量的实施方案61或62的药物组合物。
69.实施方案68的方法，其中所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖3疾病或疾患是癌症。
70.实施方案69的方法，其中所述癌症是肝细胞癌、黑素瘤、维尔姆斯瘤、肝母细胞瘤、卵巢癌或鳞状肺癌。
71.一种包含实施方案1-62中任一项的多肽、FBS-药物缀合物或药物组合物以及使用说明书的试剂盒。
72.一种检测或测量样品中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的方法，其包括将样品与实施方案1-35中任一项的多肽接触，并检测或测量FBS与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的结合。
73.一种具有由式(I)表示的结构的FBS-药物缀合物，
其中m是1并且Adx是包含SEQ ID NO:110-117和272-289中任一者的氨基酸序列的Adnectin；并且其中与“Adx”连接的硫原子是Adnectin的C端半胱氨酸的巯基的硫原子。
74.一种具有由式(I)表示的结构的FBS-药物缀合物，
其中m是2并且Adx是包含SEQ ID NO:119-126和281-288的氨基酸序列的Adnectin；并且其中与“Adx”连接的硫原子是Adnectin的两个C端半胱氨酸中的每一个的巯基的硫原子。
75.一种具有由式(VI)表示的结构的FBS-药物缀合物，
其中与半胱氨酸连接的硫原子是半胱氨酸的巯基的硫原子。
76.一种具有由式(VII)表示的结构的FBS-药物缀合物，
/>
其中与半胱氨酸连接的硫原子是半胱氨酸的巯基的硫原子。
参考文献
在本申请各处引证的所有附图和所有参考文献、Genbank序列、网站、专利和公开的专利申请的内容通过提述明确地并入本文，其程度如同全部或部分地在本文件中写入一样。特别地将PCT/US2015/021466的内容通过提述并入本文。
现在通过参考以下实施例来描述本发明，这些实施例仅是说明性的，并不旨在限制本发明。虽然已经参照具体实施方案详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对其进行各种改变和修改。
实施例
实施例1：抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3结合性Adnectin的选择、表达和纯化
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)结合性的Adnectin是从用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白筛选的Adnectin文库中分离出来的，或者从所述文库中鉴定出克隆后，通过PROfusion亲和力成熟而得到。关于RNA-蛋白质技术和基于纤连蛋白的支架蛋白文库筛选方法的详细描述参见Szostak等人，美国专利No.6,258,558；6,261,804；6,214,553；6,281,344；6,207,446；6,518,018；PCT公开文本号WO 00/34784；WO 01/64942；WO 02/032925；和Roberts等人，Proc Natl.Acad.Sci.,94:12297-12302(1997)，通过提述将其并入本文。
以下提供了具有良好结合和生物物理特性的7种adnectin的氨基酸和核苷酸序列：
ADX_4578_F03
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWHPPHPNIVSYHIYYGETGGNSPVQEFTVEGSKSTAKISGLKPGVDYTITVYAVAPEIEKYYQIWINYRTEGSGS*(SEQ ID NO:10)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACTTGGAAGTGGTTGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCTCTTGGCATCCGCCGCATCCGAACATCGTTTCTTACCATATCTACTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGGAAGGTTCTAAATCTACTGCTAAAATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTACGCTGTTGCTCCGGAAATCGAAAAATACTACCAGATTTGGATTAATTACCGCACAGAAGGCAGCGGTTCCTAA(SEQ ID NO:452)
ADX_4578_H08
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSGYDYGDSYYRITYGETGGNSPVQEFTVPDGSNTATISGLKPGVDYTITVYAVEAYGKGYTRYTPISINYRTEIDKPSQ*(SEQ ID NO:23)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGTCTGGTTACGACTACGGTGACTCTTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGACGGTTCTAACACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGAAGCTTACGGTAAAGGTTACACTCGTTACACTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGTAA(SEQ ID NO:452)
ADX_4578_B06
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWFPDRYVYYITYGETGGNSPVQEFTVEGHKQTAYISGLKPGVDYTITVYAIYYYPDDFQGYPQPISINYRTEGSGS*(SEQ ID NO:36)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACTTGGAAGTGGTTGCCGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCTCTTGGTTCCCGGACCGTTACGTTTACTACATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGGAAGGTCATAAACAGACTGCTTACATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTACGCTATCTACTACTACCCGGACGACTTCCAGGGTTACCCGCAGCCGATTTCTATTAATTACCGCACAGAAGGCAGCGGTTCCTAA(SEQ ID NO:454)
ADX_4606_F06
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWNSGHSGQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPRYGYTATISGLKPGVDYTITVYAVAHSEASAPISINYRTEIDKPSQ*(SEQID NO:49)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGAACTCTGGTCATTCTGGTCAGTATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTCGTTACGGTTACACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCGCTCATTCTGAAGCTTCTGCTCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGTAA(SEQ ID NO:455)
ADX_5273_C01
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSDPYEEERYYRITYGETGGNSPVQEFTVPAFHTTATISGLKPGVDYTITVYAVTYKHKYAYYYPPISINYRTEIDKPSQ*(SEQ ID NO:62)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGTCTGACCCGTACGAAGAAGAACGATATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGCTTTCCATACTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTTACAAACATAAATACGCTTACTACTACCCGCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGTAA(SEQ ID NO:456)
ADX_5273_D01
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEPSYKDDRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPSFHQTATISGLKPGVDYTITVYAVTYEPDEYYFYYPISINYRTEIDKPSQ*(SEQ ID NO:75)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGGAACCGTCTTACAAAGACGACCGATATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTTCTTTCCATCAGACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTTACGAACCGGACGAATACTACTTCTACTACCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGTAA(SEQ ID NO:457)
ADX_5274_
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSGDYHPHRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGEHETATISGLKPGVDYTITVYAVTYDGEKADKYPPISINYRTEIDKPSQ*(SEQ ID NO:88)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGTCTGGTGACTACCATCCGCATCGATATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGTGAACATGAAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTTACGACGGTGAAAAAGCTGACAAATACCCGCCAATTTCCATTAATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGTAA(SEQ ID NO:458)
使用GPC3阳性CHO细胞系和HepG2人肿瘤细胞系，通过使用重组GPC3和流式细胞术的ELISA确定7种GPC3结合性Adnectin的结合特征。对于流式细胞术实验，用乙二胺四乙酸(Versene)处理CHO-K1或CHO-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3细胞或HepG2肿瘤细胞系并重悬于FACS缓冲液(PBS 2.5％FBS)中。将稀释在FACS缓冲液中的Adnectin与细胞一起在4℃温育1小时。在FACS缓冲液中洗涤1次后，将细胞与2μg/ml的抗His抗体一起温育，并在4℃温育1小时。在FACS缓冲液中洗涤2次后，将细胞重悬于FIX缓冲液(PBS中的2.5％甲醛)中。用BBBiosciences FACS Canto进行分析。
ELISA实验的结果显示在表3中，并且示例性流式细胞术的结果显示在图3A-D中。表2还提供了通过尺寸排阻色谱法(SEC)确定的Adnectin的聚集评分。这些Adnectin都没有显著聚集。
表2：人GPC3结合性Adnectin的ELISA和SEC评分
/>
通过包含C端半胱氨酸和6xHis尾来修饰ADX_5274_E01的C端，以产生AdnectinADX_6561_A01：
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSGDYHPHRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGEHETATISGLKPGVDYTITVYAVTYDGEKADKYPPISINYRTPCHHHHHH(SEQ ID NO:94)
通过在环BC、DE或FG中编码氨基酸残基的每个核苷酸位置引入一小部分取代，将编码ADX_6561_A01的核酸多样化。然后将得到的与ADX_6561_A01相关的Adnectin序列的文库通过PROfusion(mRNA展示)体外选择在高严格条件下与人GPC3的结合。在选择完成之后，将富集的克隆进行测序，表示为HTPP形式，并进一步分析。
所述选择鉴定出Adnectin ADX_6077_F02以高亲和力与人GPC3结合。ADX_6077_F02的氨基酸序列和编码它的核苷酸序列如下：
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSDDYHAHRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGEHVTATISGLKPGVDYTITVYAVTYDGEKAATDWSISINYRTPCHHHHHH(SEQ ID NO:118；BC、DE和FG环以粗体显示)
ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAGCCTGCTGATCAGCTGGTCTGATGACTACCATGCGCATCGATATTACCGCATCACTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGTGAACATGTGACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTTACGACGGTGAAAAGGCTGCCACAGATTGGTCAATTTCCATTAATTACCGCACACCGTGCCACCATCACCACCACCACTGA(SEQ ID NO:459)
测试了抗GPC3 Adnectin与其他磷脂酰肌醇蛋白聚糖分子的结合，结果表明ADX_6077_F02与人GPC3特异性地结合，并且不与其他的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC1、GPC2、GPC5和GPC6交叉反应。
实施例2：用于缀合药物模块的具有C端半胱氨酸的Adnectin
为了制备与药物模块连接的Adnectin，将Adnectin在其C端进行修饰以包含以下C端氨基酸序列之一：NYRTPC(SEQ ID NO:466；用于形成DAR1Adnectin，即，在接头中具有单个半胱氨酸的Adnectin，用于与单个药物模块连接)；NYRTPCC(SEQ ID NO:467；用于形成DAR2Adnectin，即，在接头中具有两个半胱氨酸的Adnectin，用于与两个药物模块连接，每个半胱氨酸一个)；NYRTPCHHHHHH(SEQ ID NO:468；用于形成具有6xHis尾的DAR1Adnectin)和NYRTPCPPPPPCHHHHHH(SEQ ID NO:469；用于形成具有6xHis尾的DAR2Adnectin)。
为了防止产生含有一个或多个半胱氨酸残基的未缀合的Adnectin的二硫键(dislufide)连接的二聚体，将Adnectin的半胱氨酸残基如下进行羧甲基化：用还原剂(5mMDTT或5mM TCEP)处理Adnectin溶液并在室温下温育30分钟。加入碘乙酰胺(Ioodoaceamide)(500mM，Sigma P/N A3221-10VL)至终浓度为50mM。样品在室温下在黑暗中温育1小时。然后将样品在PBS或乙酸钠缓冲液中透析。
实施例3：GPC3-Adnectin药物缀合物(GPC3-AdxDC)的产生
Adnectin、例如GPC3 Adnectin的产生：将编码Adnectin的核酸，例如编码具有氨基酸序列
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSDDYHAHRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGEHVTATISGLKPGVDYTITVYAVTYDGEKAATDWSISINYRTPCHHHHHH(SEQ ID NO:118；ADX_6077_F02)的蛋白质的(SEQ ID NO:459)，克隆到pET9d(EMD Biosciences,San Diego,CA)载体中，在大肠杆菌BL21 DE3 pLys-S细胞中表达。将20ml接种物培养物(从单个平板接种的菌落产生)用于接种在2.5升的Ultra Yield flask(Thomson Instruments Co.P/N 931136-B)中的含有50μg/ml卡那霉素的1升Magic Media大肠杆菌表达培养基(Invitrogen，目录号K6803A/B)中。培养物在37℃下生长6小时，随后在20℃在225RPM下振摇18小时。在温育期后，通过在4℃以≥10,000g离心30分钟收获培养物。在-80℃下冷冻细胞沉淀。在冰上使用Ultra-Turrax匀浆器(IKA-Works)将细胞沉淀融化并重悬于25mL裂解缓冲液(20mM磷酸钠、500mM氯化钠、5mM二硫苏糖醇、1x无EDTA的CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物(Roche))中。通过使用M-110P型微射流均质机(Microfluidics)进行高压均质化(≥18,000psi)实现细胞裂解。通过在4℃下以23,300g离心30分钟来分离不溶部分并弃之。用0.2微米真空过滤器将可溶部分过滤。将过滤的上清液上样到用20mM磷酸钠/500mM氯化钠(pH 7.4)+5mM DTT缓冲液平衡的Histrap柱(GE Healthcare P/N 17-5248-02)上。上样后，将所述柱用10个CV的平衡缓冲液洗涤，然后用10个CV的在平衡缓冲液中的40mM咪唑洗涤，然后用10个CV的在PBS中的2.0M氯化钠洗涤。用在20mM磷酸钠/500mM氯化钠(pH 7.4)+5mM DTT中的500mM咪唑洗脱结合的蛋白质。使用G25凝胶过滤色谱将来自HisTrap柱的洗脱液与50mM乙酸钠/10mM氯化钠(pH5.5)缓冲交换。然后将样品施用于阳离子交换色谱柱(SP HP,GE Healthcare 17-1152-01)上。在50mM乙酸钠(pH 5.5)缓冲液中以渐增的氯化钠浓度梯度洗脱结合的蛋白质。将级分合并，用于与微管溶素缀合。
微管溶素类似物-接头的产生：按照U.S.8,394,922(通过提述并入本文)中所述产生具有式(IV)的结构的微管溶素类似物-接头化合物。
Adnectin-药物缀合：如下进行微管溶素类似物-接头与包含C端半胱氨酸的Adnectin的缀合：
用5mM TCEP处理将要与微管溶素类似物缀合的adnectin样品，并在室温下温育约1小时。使用用50mM NaOAc/10mM NaCl(pH 5.5)平衡的G25凝胶过滤柱(GE Healthcare)除去TCEP。将微管溶素类似物溶于100％DMSO中并加至终浓度为5x摩尔，反应在室温下温育2小时，然后在4℃下过夜。为了去除未反应的微管溶素类似物，将反应混合物重新施用到如上所述的SP阳离子交换柱上。
使用上述相同的方法，将在C端附近含有两个半胱氨酸残基的Adnectin(例如GPC3Adnectin)与微管溶素类似物的两个分子缀合，以产生DAR2(药物-Adnectin比率为2)Adnectin。
使用Nanodrop 8000分光光度计(Thermo Scientific)确定蛋白这浓度。使用配备有Zorbax C8RRHD柱的Agilent Technologies 6540UHD Accurate Mass Q-ToF LC-MS，通过LC质谱法确定缀合的和未缀合的Adnectin的分子量。
使用这些表达、纯化、缀合和烷基化Adnectin的技术，制备了表3中列出的Adnectin和Adnectin-药物缀合物。
表3–对照和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3结合性Adnectin
/>
/>
实施例4：抗GPC3 Adnectin和GPC3-AdxDC的体外表征
尺寸排阻色谱法：对从中等规模过程生成的候选Adnectin进行标准尺寸排阻色谱法(SEC)。使用Superdex 20010/30或在Agilent 1100或1200HPLC系统上的Superdex 7510/30柱(GE Healthcare)上进行中等规模材料的SEC，其中在A214nm和A280nm进行UV检测，并进行荧光检测(激发280nm，发射350nm)。针对所采用的SEC柱，以适当的流率使用pH 6.8的100mM硫酸钠/100mM磷酸钠/150mM氯化钠的缓冲液。使用凝胶过滤标准品(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)进行分子量校准。
热稳定性：进行HTPP Adnectin的热扫描荧光(TSF)分析，以通过相对热稳定性来筛选它们。将样品标准化至在PBS中的0.2mg/ml。1μl的Sypro橙色染料用PBS以1:40稀释，添加至25μl的各样品，用透明的96孔微孔板密封胶密封所述板。通过使温度从25℃以每分钟2度的速率逐渐上升到95℃，使用BioRad RT-PCR机扫描样品。使用BioRad CFX manager 2.0软件分析数据。通过TSF获得的值已经显示出与在40℃到70℃的熔融范围的通过DSC获得的Tm值良好关联。这被视为这项技术的可接受的工作范围。当过渡曲线的斜率太小而不允许其导数峰(随着时间的荧光的变化速率)从噪音中区分时，获得ND(“没有数据”)结果。“ND”结果不能被解释为热稳定性的指示。进行透析的HTPP’d和中规模的Adnectin的差示扫描量热法(DSC)分析来确定其对应的Tm’s。通过使温度以每分钟1度的速率从15℃逐渐上升(ramping)到110℃在70p.s.i压力下在VP-毛细管差示扫描量热仪(GE Microcal)中扫描0.5mg/ml溶液。使用Origin Software(OriginLab Corp)，利用最佳拟合分析相对于适当缓冲液对照运行的数据。
SPR亲和力测量：使用Biacore T100仪(GE Healthcare)进行表面等离子体共振(SPR)，以计算α-GPC3adnectin和微管溶素缀合的AdxDC的解离速率(kd)和结合亲和力。遵循制造商的胺偶联方案(GE Healthcare)，在10mM乙酸钠(pH 4.5)中将重组人(aa 1-559)和鼠(aa 25-557)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白(R&D Systems)稀释至10μg/ml，并单独固定在CM5生物传感器的活性流动池上，目标是每流动池约1000RU固定密度的每种蛋白质。使用HBS-P+(10mM HEPES、150mM NaCl、0.05％(v/v)表面活性剂P20，pH 7.4)运行缓冲液(GEHealthcare)在37℃下进行SPR实验。对于亲和力测量，在运行缓冲液中制备200-1.56nM浓度系列的α-GPC3adnectin和AdxDC，并以30μl/min注射到人和鼠GPC3生物传感器流动池。对于解离速率测量，使用相同的条件注射单一200nM浓度的adnectin/AdxDC。在测定周期之间，使用10mM甘氨酸(pH 1.7)的一次30秒注射来除去结合的adnectin并且使GPC3表面再生。
在Biacore T100评估软件2.0.4(GE Healthcare)中，从拟合至1:1结合模型的减去了参比的传感图推导出速率常数ka(kon)和kd(koff)。根据速率常数kd/ka的比率计算出亲和常数KD。
细胞结合测定：基本上如下通过流式细胞术评估GPC3adnectin与huGPC3阳性细胞Huh7的结合。Huh7癌细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中生长。使用来自Lonza目录号17-711E的乙二胺四乙酸(Versene)(一种EDTA细胞解离溶液)收获细胞。将肿瘤细胞(1E5个细胞/反应)悬浮于FACS缓冲液(PBS、1％BSA、0.05％叠氮化钠)中，并在冰上与系列稀释的AdxDC混合一小时。用FACS缓冲液洗涤细胞三次，用内部抗支架单克隆Ab和来自(RnDSystems)目录号NL007的PE-缀合的抗体检测结合的AdxDC，并在流式细胞仪上读数。使用FlowJo软件进行数据分析，使用版本5.0的PRISMTM软件(GraphPad Software,La Jolla,CA,USA)确定50％最大结合的EC50。
细胞生长抑制测定：使用3H胸苷测定法评估AdxDC对Hep3B、Huh7和HepG2细胞增殖的剂量依赖性抑制作用，其中3H胸苷掺入的抑制指示测试细胞系增殖的抑制。从美国典型培养物保藏中心(ATCC)(邮箱1549，Manassas，VA 20108，USA)获得人肿瘤细胞系，并根据来自ATCC的说明书进行培养。将细胞以1.25x 104个细胞/孔接种在96孔板中，并将1:3系列稀释的GPC3 AdxDC加入孔中。允许所述板温育72小时。在总温育期的最后24小时，每孔用1.0μCi的3H-胸苷脉冲所述板，收获，并在Top Count闪烁计数器(Packard Instruments,Meriden,CT)上读数。使用版本4.0的PRISMTM软件(GraphPad Software,La Jolla,CA,USA)确定EC50值-达到最大细胞增殖抑制的50％时的Adnectin药物缀合物浓度。
表4中概括了DAR1和DAR2形式的AdxDC缀合物的体外特性的总结。
表4：GPC3-微管溶素AdxDC的体外表征
alk-针对烷基化的(封端的Adnectin)测量；针对DAR1AdxDC(没有PEG)的所有其他测量值
实施例5：GPC3-AdxDC与人Hep3B和H446肿瘤细胞的细胞结合
通过流式细胞术评估GPC3 AdxDC与在含有10％FBS的MEM中生长的人Hep3B肝细胞癌细胞的结合以及在含有10％FBS的RPMI中生长的H446小细胞肺癌细胞的结合。使用来自Mediatch(Corning:Manassas,VA20109)目录号25-056-CL的非酶促细胞解离溶液Cellstripper收获细胞。将肿瘤细胞(25,000个/反应)悬浮于FACS缓冲液(PBS+5％FBS+0.01％NaN3)中，并在冰上与系列稀释的AdxDC混合1小时。用FACS缓冲液洗涤细胞三次，用来自R&D System目录号IC050P的His标签PE-缀合的抗体检测结合的AdxDC，并在流式细胞仪上读数。使用FlowJo软件进行数据分析，使用版本5.0的PRISMTM软件(GraphPadSoftware,La Jolla,CA,USA)确定50％最大结合的EC50。
在图4A-D中显示的结果表明，ADX_6077_F02AdxDC DAR1和DAR2与两种类型的人肿瘤细胞都结合。
实施例6：GPC3 AdxDC抑制Hep3B、H446和HepG2肿瘤细胞的细胞生长
本实施例表明，GPC3 AdxDC DAR1和DAR2抑制Hep3B(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3高)HCC细胞、H446(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3低)SCLC细胞和HepG2肿瘤细胞的细胞增殖。如上所述进行胸苷掺入测定。在图5A-B和6A-B中显示的结果表明，GPC3 AdxDC DAR1和DAR2抑制三种不同细胞系的细胞生长，但对照AdxDC adnectin缀合物不抑制这些细胞的生长。
实施例7：GPC3-AdxDC的细胞表面结合测定的时间过程
为了确保内化研究之前的最大靶标接合，使用以下结合测定法来确定ADX_6077_F02DAR1(即，具有“PC”末端，但不缀合)与GPC-3阳性细胞Hep3B的结合：在Hep3B细胞结合测定中，使用了AF-488荧光标记的adnectin ADX_6077_F02和阴性对照(NBC)ADX_6093_A01。对于结合分析，将Hep3B细胞平板接种到384孔板中，温育16小时以使细胞粘附，然后用2％甲醛固定细胞。将100nM的ADX_6077_F02和ADX_6093_A01加入到细胞板中，并在室温下温育7个时间点：0分钟、10分钟、15分钟、20分钟、60分钟、120分钟和180分钟。在结合后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次，然后使用高内涵分析测量每细胞的总细胞荧光强度。
结果表明，ADX_6077_F02表现出与细胞表面的快速结合。使用100nM Adnectin，发现两小时足以达到大于95％的结合平台期。
实施例8：GPC3-AdxDC的动力学内化
为了定量抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3adnectin诱导的内化，应用了高内涵Alexa淬灭测定。将Hep3B和H446细胞接种在384孔板中并在37℃下温育16小时。然后将100nM的AF-488荧光标记的ADX_6077_F02DAR1加入到细胞板中，并在固定和淬灭之前在37℃温育指定时间。内化的Adnectin量度为在不能淬灭的信号之上的荧光增加。平行监测每个时间点来自“未淬灭对照”的总荧光，将其用作与细胞初始结合的adnectin量的指示物。通过Arrayscan拍摄细胞的图像以显示adnectin的定位，并将细胞的图像用于细胞荧光强度定量。
定量研究证实Hep3B上高表达水平的GPC3受体(大约1.1x 106活性结合拷贝/细胞)以及在H446细胞上较低水平的GPC3受体(大约2.6x 105活性结合拷贝/细胞)。固定后，确定总的和细胞内的FL并用于测量Adnectin分子的内化。
这些测定的结果表明，抗GPC3adnectin以中等-慢速率(T1/2>1小时)被Hep3B和H446细胞(图7)内化，并且在6小时后达到>90％内化。如图8中所示，在15分钟的时间点，大部分的抗GPC3adnectin与膜结合，并且在8小时的时间点，大部分的GPC3-Adectin信号位于细胞内部。
实施例9：GPC3-AdxDC的体内药代动力学
确定了抗GPC3 AdxDC(DAR1)在小鼠中的全身暴露状况。按照下面的实验设计，对雌性NOD/SCID小鼠(13周龄)静脉内给予高(240nmol/kg)和低(24nmol/kg)剂量的单剂量GPC3结合性和非结合对照AdxDC(分别为GPC3DAR1AdxDC和RGE AdxDC)。指示的采血时间点是使用CPD抗凝剂(柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖溶液，Sigma C7165)的连续尾静脉采血。将从这些血液样品获得的血浆分装，并在-80℃储存直至准备分析时为止。
表5-异种移植模型的给药方案
使用具有两种不同形式的中规模(MSD)配体结合测定法分析AdxDC血浆水平。对于缀合和未缀合的Adnectin测定的总水平的MSD测定法，其用于捕获内部产生的抗His单克隆抗体(以4μg/ml)，并且用于检测以1:10000稀释的汇集的内部产生的兔抗支架多克隆抗体、随后的山羊抗兔磺基标记的(sulfotagged)抗体(以1μg/ml)。对于完整的缀合的Adnectin的MSD测定法，其用于捕获内部产生的抗His单克隆抗体(以4μg/ml)，并且用于检测内部产生的磺基标记的小鼠抗微管溶素抗体(以1μg/ml)。
这项测定的结果总结在表6(非房室Phoenix WinNonlin分析，NCA模型)和图9(抗微管溶素MSD测定法)中，其进一步表明，AdxDC在小鼠体内具有短的暴露概貌(exposureprofile)。
表6-GPC3 AdxDC的药代动力学参数总结
实施例10：在啮齿动物异种移植模型中肿瘤生长的抑制
在CD1小鼠和Fischer大鼠中测试了未PEG化的GPC3-微管溶素药物缀合物的功效。
将NOD-SCID和CD1雌性小鼠(13周龄，来自Charles River Laboratories，Wilmington，MA)和雌性Fischer大鼠(10周龄，来自Charles River laboratories，Wilmington，MA)关在温控室中，颠倒12小时光照/黑暗周期。可随意获得水和标准食物。用于安全性研究的动物被随机分组并在治疗组之间分配，根据体重(约20-25g)接受对照或测试AdxDC。
使用补充有10％FBS(Thermo目录号ATK-33398)的EMEM目录号ATCC 30-2003，将Hep3B(人肝细胞癌)维持在培养物中。对于功效研究，通过在NOD-SCID小鼠的右胁腹皮下植入100μl的5x106个Hep3B细胞(50％细胞悬液，含有标准酚红基质胶(Phenol RedMatrigel)，Corning目录号354234)而产生异种移植物。为了证明体内功效，通过用50mMNaOAc/150mM NaCl/pH5.5或磷酸盐缓冲盐水(PBS)静脉内注射来施用AdxDC。用非结合对照AdxDC处理对照。每三天给试验动物(n＝8只动物/组)静脉内给药，总共6个剂量，其中AdxDC剂量的不同。记录在随机化之前和随机化当天的体重测量值，在治疗期间记录体重测量值每周两次，并且研究结束时记录体重测量值。使用数字卡尺测量监测肿瘤生长，每周两次。使用学生t检验双尾配对分析评估结果。表7和图10中提供了代表性的研究设计和使用每三天给药方案的结果。
表7：给药方案
评估在Hep3B异种移植物中的每周给药。结果表明，0.1μmol/kg的ADX_6077_F02-961DAR1和DAR2的QW施用有效抑制了HepG2异种移植物：TV0＝380-480mm3(图11)，TV0＝228-350mm3(图12)和TV0＝514-673mm3(图13)。
总之，GPC3 AdxDC的每周给药抑制了HCC肿瘤异种移植物的生长，并且DAR1和DAR2GPC3 AdxDC表现出等效的肿瘤生长抑制，其是靶标依赖性的。另外，肿瘤负荷诱导的体重减轻的预防与GPC3 AdxDC的抗肿瘤活性相关。
在小鼠安全性研究中，以不同剂量每隔一天静脉注射CD1小鼠，共9个剂量，最高剂量达到0.5μmol/kg的GPC3和非结合对照AdxDC，为有效剂量(0.1μmol/kg)的5倍。在CD1小鼠安全性研究中未鉴定MTD。在任何剂量或频率下，对于任何组都没有观察到肾毒性。在CD1小鼠中，AdxDC的半衰期大约为20分钟(如上所述的MSD测定)。一直到预定的尸体解剖，未观察到体重减轻，并且所有小鼠在治疗中存活。分别使用Abaxis Veterinary Diagnostics仪VETSCAN VS2和HM5在给药期间间隔进行血清化学和血液学评价。观察到在血清化学或血液学方面与基线相比没有显著差异。在研究结束时，通过采集的心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织的H&E染色进行组织病理学评价。在任何评价的组织中均未观察到剂量限制性毒性，并且在所有组中均观察到极轻的/轻度的肾小管上皮神经病。
在Fischer大鼠安全性研究中，AdxDC的半衰期大约为30分钟(如上所述的MSD测定)。在0.36μmol/kg剂量的最频繁给药(每隔一天)的情况下，观察到一定的剂量依赖性耐受性和骨骼肌变性，其中在骨髓或肝组织病理学或心脏毒性方面没有变化。当使用相同剂量范围的AdxDC每周给药进行相同的大鼠研究时，未观察到这些发现。
总体而言，尽管具有短的血浆半衰期和低脱靶毒性，在两种啮齿动物物种中都观察到与低全身暴露一致的优异功效。
实施例11：使用HDX-MS对人GPC3上的Adnectin结合位点作图.
使用氢-氘交换质谱(HDX-MS)评价人GPC3上的Adnectin结合位点(图14中所示的氨基酸序列)。氢/氘交换质谱(HDX-MS)方法通过监测主链酰胺氢中的氘交换速率和程度来探测溶液中的蛋白质构象和构象动力学。HDX的水平取决于骨架酰胺氢的溶剂可及性以及蛋白质的构象。通过MS可以精确测量蛋白质在HDX上的质量增加。当这项技术与酶消化配对时，可以获得在肽水平的结构特征，使得表面暴露的肽与内部折叠的那些肽或与蛋白质-蛋白质复合物界面处隔离的那些肽相区别。通常，进行氘标记和随后的淬灭实验，然后进行在线胃蛋白酶消化、肽分离和MS分析。
在通过HDX-MS对被ADX_6077_F02识别的人GPC3上的Adnectin结合位点作图之前，进行非氘代实验以产生GPC3样品的常见胃酶解肽的列表，从而实现GPC3的87.4％的序列覆盖(图14)。在这项实验中，在标记步骤过程中使用10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，然后加入淬灭缓冲液(含4M GdnCl和0.4M TCEP的200mM磷酸盐缓冲液，pH 2.5，1:1，v/v)。
对于Adnectin结合位点作图实验，将5μL的每种样品(GPC3或具有ADX_6077_F02的GPC3)与55μL HDX标记缓冲液(在D2O中的10mM磷酸盐缓冲液，pD 7.0)混合以开始标记反应。反应进行不同的时间：1分钟、10分钟和240分钟。在每个标记反应期结束时，通过加入淬灭缓冲液(1:1，v/v)将反应淬灭，并将淬灭的样品注射到Waters HDX-MS系统中用于分析。在不存在/存在ADX_6077_F02的情况下监测观察到的常见胃酶解肽的氘摄取水平(图14和15)。
从HDX-MS测量获得的实验数据表明，AADX_6077_F02识别由人GPC3中的两个肽区域组成的不连续Adnectin结合位点：
区域1：HQVRSFF(GPC3的氨基酸残基36-42)；SEQ ID NO:356
区域2：EQLLQSASM(GPC3的氨基酸残基90-98)；SEQ ID NO:346
实施例12：DG变体的生成
ADX_6077_F02的氨基酸序列的分析表明，该分子的FG环中的DG可能具有低的天冬氨酸异构化风险。
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSDDYHAHRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGEHVTATISGLKPGVDYTITVYAVTYDGEKAATDWSISINYRTPCHHHHHH(SEQ ID NO:118)
生成了在DG位点具有突变的八个ADX_6077_F02变体。表8中总结了这些突变体的序列。
表8：ADX_6077_F02变体
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实施例13：DG变体的生物物理学表征
如上所述，八个突变体中的每一个制备100-150毫克，纯化并烷基化。八个烷基化变体中的每一个的3至5毫克以1-3mg/mL进行SEC、DSC、GPC3结合(SPR 1pt解离速率)、MS和HIC。结果总结在表9中。
表9：ADX_6077_F02DG变体的生物物理学特性
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与亲本adnectin相比，8个DG突变体中的6个表现出koff增加3-5倍，并且是单体性的和热稳定的。通过Biacore T100使用HBS-P+运行缓冲液进一步评价烷基化的GPC3DG突变体adnectin对人和鼠GPC3的结合亲和力，其中以200-1.56nM系列注射直接固定人和小鼠GPC3蛋白[Hu(Fc 2,3)和Mu(Fc 4)GPC3-His(R&D Systems)]，进行180秒结合，600秒解离。数据拟合BiaEvaluation软件中的1:1结合模型，并且总结在表10中。
表10-DG突变体Adnectin的结合动力学
数据证明，与亲本ADX_6077_F02相比，这些GPC3DG突变体对人和鼠GPC3的亲和力降低约3-5倍。亲和力的差异是由更快的解离速率驱动的，而结合速率与亲本adnectin一致(图16)。
实施例14：DG变体的细胞结合和免疫原性评估
通过流式细胞术评价了DG GPC3 AdxDC突变体中针对huGPC3的DG变体与在含有10％FBS的DMEM培养基中培养的Huh7癌细胞的结合。使用来自Lonza目录号17-711E的乙二胺四乙酸(Versene)(一种EDTA细胞解离溶液)收获细胞。将肿瘤细胞(1E5个细胞/反应)悬浮于FACS缓冲液(PBS、1％BSA、0.05％叠氮化钠)中，并在冰上与系列稀释的AdxDC混合一小时。用FACS缓冲液洗涤细胞三次，用内部抗支架单克隆Ab和来自(RnD Systems)目录号NL007的PE-缀合的抗体检测结合的AdxDC，并在流式细胞仪上读数。使用FlowJo软件进行数据分析，使用版本5.0的PRISMTM软件(GraphPad Software,La Jolla,CA,USA)确定50％最大结合的EC50。
对于(非DG突变体)的抗His检测，使用相同的方案，不同的是使用内部生成的APC缀合的抗His抗体。
表11中显示的结果表明，突变体具有与亲本Adnectin相似的EC50值。
还使用人PBMC增殖测定法评估了针对huGPC3的DG变体在人类中引出免疫应答的潜力。在DG变体或对照存在的情况下，将来自具有与世界人口频率密切匹配的HLA II类单体型的40位供体的PBMC培养7天。在测定结束时，通过FACS分析CFSE标记的CD4+T细胞的增殖。分析了显示增殖的CD4+T细胞的供体的百分比，作为人免疫原性风险的读出(read-out)。正如表11中总结的，测定结果表明，与其他DG突变体(36-54％阳性应答)相比，DG至DA突变体(PI-055660)具有显著更低的免疫原性(IMG)风险(18％供体应答阳性)。
表11-DG变体的细胞结合动力学
表12中列出了DA变体AdxDC DAR1(“GPC3_AdxDC DA变体-DAR1”或“DA变体AdxDCDAR1”)的特征总结：
表12：DA变体AdxDC DAR1的特征
*针对未缀合的蛋白质测量
实施例15：FITC标记的和聚乙二醇化的抗GPC3 Adnectin
FITC标记：将ADX_6077_F02和非结合对照Adnectin用DTT或TCEP还原，然后进行G25凝胶过滤色谱法或透析。然后加入过量的荧光素-5-马来酰亚胺试剂(ThermoScientific)，并将混合物在室温下温育大约2小时，随后进行G25凝胶过滤色谱法或大量透析(更换3-4次缓冲液)。根据制造商的说明书和/或质谱法通过吸光度量度得到的标记程度。如前述实施例中所述评价FITC标记的和PEG化的GPC3对人和鼠GPC3的结合亲和力，结果总结在表13中。
表13-修饰的GPC3 Adnectin的动力学
数据证明，FITC标记的和聚乙二醇化的抗GPC3adnectin两者都保留了与人GPC3和鼠GPC3两者的结合亲和力。
实施例16：GPC3_AdxDC DA和DG分子的其他特征
在加速稳定性研究中，GPC3_AdxDC DA变体-DAR1显示出在pH 6.0时的化学和生物物理学稳定性。另外，在40℃下4周之后，它对人GPC3(通过SPR)的亲和力没有变化。
DA变体的天冬氨酸异构化比亲本DG分子的异构化低约4倍。在40℃、pH 6或pH 7下温育3周之后，DG分子的D80异构化百分比分别为3.6和2.4。
在CDF大鼠中每周给药(Q7Dx4)的情况下，GPC3_AdxDC(DG)显示出有利的毒性特征(表14)。在CDF大鼠中每周给予(Q7Dx4)GPC3 AdxDC的情况下，在血液学或血清化学特征方面未见不良反应。
表14：GPC3_AdxDC(DG)的毒性特征
*“NBC”是指非结合AdxDC(Adnectin药物缀合物)
实施例17：GPC3 Adnectin药物缀合物体内结合人GPC3异种移植组织
将人GPC3高表达Hep3B异种移植组织与浓度为0.04μg/ml的FITC缀合的GPC3结合性Adnectin DG分子(“GPC3_AdxDC(DG)”)DAR1或与0.2μg/ml的非GPC3结合性Adnectin一起温育。结果表明，GPC3_AdxDC(DG)分子结合Hep3B异种移植组织，而非结合性Adnectin没有显著结合。
还测试了其他组织的结合，结果表明，GPC3_AdxDC(DG)与胎盘有一定的非特异性结合。然而，所述分子不与胃、心脏、肾、肝、皮肤或扁桃体组织显著结合。
GPC3_AdxDC(DA)DAR1在异种移植Hep3B中显示出相似的但较弱的结合。在0.2μg/ml达到饱和结合。
实施例18：GPC3_AdxDC(DA)在高表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞系来源的异种移植物中高度有效
在NSG小鼠中使用Hep3B(肝细胞癌；260,000个GPC3分子/细胞)异种移植物。以表15中指示的剂量每周3次静脉内给予GPC3_AdxDC(DA)DAR1或非结合对照Adnectin。
表15：在NSG小鼠中的剂量和Hep3B异种移植物的肿瘤生长抑制
TGID26*:第26天的肿瘤生长抑制
表15和图17中显示的结果表明，GPC3_AdxDC(DA)在体内抑制Hep3B肿瘤生长方面是有效的。
用低表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞系(H446)衍生的异种移植物进行相似的实验。H446细胞是具有约40,000个人PC3分子/细胞的小细胞肺癌细胞。将细胞注射到CB17SCID小鼠中。
表16：在CB17 SCID小鼠中的剂量和H446细胞的肿瘤生长抑制
表16和图18中显示的结果表明，GPC3_AdxDC(DA)减缓了这些肿瘤的生长。
实施例19：Hep3B肿瘤相对于正常组织优先摄取GPC3_AdxDC
用0.015或0.22μmol/kg的3H标记的GPC3_AdxDC对小鼠给药，并且在0.17小时、1小时、5小时和168小时后通过全身放射自显影术(QWBA)测量放射性。
结果如图19和20所示，表明如下：
●快速分布到肿瘤和高灌注组织；
●在给药后168小时的肿瘤中仍有高水平的放射性，而在其他组织中无放射性或具有低放射性；
●肾脏中的显著放射性：大约30％的放射性在尿中排泄；和
●在高剂量组和低剂量组之间相似的表达模式。
在相似的实验中，用0.22μmol/kg的3H标记的GPC3_AdxDC或非结合AdxDC对照对小鼠给药，并且在0.17小时、1小时、5小时和168小时后通过QWBA测量放射性。
图21和22中显示的结果表明，相对于非结合对照(RGE AdxDC)，使用GPC3_AdxDC的Hep3B肿瘤具有更高的摄取。GPC3_AdxDC和非结合AdxDC对照在其他组织中的分布特征是相当的。
图23中提供了GPC3_AdxDC在肿瘤和组织中的总放射性浓度。该图显示肿瘤中GPC3_AdxDC的水平远高于其他组织(肾脏除外)。
实施例20：抗GPC3 Adnectin的位置扫描
本实施例描述了其中除去EIDKPSQ(SEQ ID NO:369)并且添加PC的6077_F02的位置扫描，其中氨基酸79(即“DG”的“D”)是G(如在原始克隆中)或A。
在文库构建过程中，将仅在第79位氨基酸处不同的这两种蛋白质混合。确定在100nM、10nM和1nM时与人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3-生物素的结合。对于每个批次，将10nM选择洗脱与标志(flag)洗脱比较，并且还将1nM选择洗脱与标志洗脱比较。这对于每个环生成了4个热图：当79为G时的10nM；当79为G时的1nM；当79为A时的10nM以及当79为A时的1nM。
对于FG环，将三个区段合并在一起而显示完整的热图。对于位置79，生成了在将其归一化为G时的一个热图、以及在归一化为A时的一个热图。
结果以热图的形式显示在图24-31中。在热图中，>1的数字表示有利的取代，然而，>0.2的任何数字作为取代也是可接受的。数字越高，取代越有利。例如，对于DG亲本adnectin，热图指示下列内容：
-在BC环(即，序列SDDYHAH(SEQ ID NO:98的氨基酸15-21))中：
o S23可以被任何氨基酸取代；
o D24优选不被任何其他氨基酸取代，尽管S和E可以是可接受的。
o可以根据热图推导出其他可接受的取代，其中任何具有>0.2的数字的取代是可接受的，并且数字>1是优选的。
等效形式
本领域技术人员将认识到、或能够确定使用不超出常规的实验、本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效形式。这样的等效形式预期被下列权利要求涵盖。
表1-序列总结
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Claims (82)

1.一种含有包含BC、DE和FG环的人纤连蛋白III型第十结构域(10Fn3)的多肽，其中所述多肽以1μM或更低的KD与人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)特异性地结合，且其中：
(a)所述多肽包含分别如SEQ ID NO:99、100和156的氨基酸序列所示的BC、DE和FG环；
(b)所述多肽包含分别如SEQ ID NO:99、100和183的氨基酸序列所示的BC、DE和FG环；
(c)所述多肽包含分别如SEQ ID NO:99、100和210的氨基酸序列所示的BC、DE和FG环；
(d)所述多肽包含分别如SEQ ID NO:99、100和237的氨基酸序列所示的BC、DE和FG环；
(e)所述多肽包含分别如SEQ ID NO:99、100和264的氨基酸序列所示的BC、DE和FG环；
(f)所述多肽包含分别如SEQ ID NO:99、100和291的氨基酸序列所示的BC、DE和FG环；
(g)所述多肽包含分别如SEQ ID NO:99、100和318的氨基酸序列所示的BC、DE和FG环；或
(h)所述多肽包含分别如SEQ ID NO:99、100和129的氨基酸序列所示的BC、DE和FG环。
2.权利要求1的多肽，其中所述10Fn3结构域包含选自SEQ ID NO:128、155、182、209、236、263、290和317的氨基酸序列。
3.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:263的氨基酸序列或由该序列组成。
4.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:265的氨基酸序列或由该序列组成。
5.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:266的氨基酸序列或由该序列组成。
6.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列或由该序列组成。
7.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列或由该序列组成。
8.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:269的氨基酸序列或由该序列组成。
9.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:270的氨基酸序列或由该序列组成。
10.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:271的氨基酸序列或由该序列组成。
11.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列或由该序列组成。
12.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:273的氨基酸序列或由该序列组成。
13.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:274的氨基酸序列或由该序列组成。
14.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:275的氨基酸序列或由该序列组成。
15.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:276的氨基酸序列或由该序列组成。
16.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:277的氨基酸序列或由该序列组成。
17.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列或由该序列组成。
18.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列或由该序列组成。
19.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列或由该序列组成。
20.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:281的氨基酸序列或由该序列组成。
21.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:282的氨基酸序列或由该序列组成。
22.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:283的氨基酸序列或由该序列组成。
23.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:284的氨基酸序列或由该序列组成。
24.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:285的氨基酸序列或由该序列组成。
25.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:286的氨基酸序列或由该序列组成。
26.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:287的氨基酸序列或由该序列组成。
27.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:288的氨基酸序列或由该序列组成。
28.权利要求1或权利要求2的多肽，其中所述10Fn3结构域包含SEQ ID NO:289的氨基酸序列或由该序列组成。
29.前述权利要求中任一项的多肽，其进一步包括异源蛋白。
30.前述权利要求中任一项的多肽，其进一步包含一个或多个选自下组的药代动力学(PK)模块：聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、转铁蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白结合性蛋白和血清免疫球蛋白结合性蛋白。
31.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述10Fn3结构域的C端与由氨基酸序列PmXn组成的模块连接，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，m是至少为1的整数，并且n是0或至少为1的整数。
32.权利要求31的多肽，其中m是1或2，并且n是1-10的整数。
33.权利要求31或32的多肽，其中所述模块包含半胱氨酸，且所述半胱氨酸连接于所述10Fn3结构域的C端。
34.权利要求33的多肽，其中所述模块由氨基酸序列PmCXn组成，其中C是半胱氨酸，每个X独立地是任何氨基酸。
35.权利要求34的多肽，其中所述模块由氨基酸序列PmCXn1CXn2组成，其中每个X独立地是任何氨基酸，n1和n2独立地是0或至少为1的整数。
36.权利要求35的多肽，其中n1和n2独立地是1-5的整数。
37.权利要求31的多肽，其中所述模块选自下组：PI、PC、PCC、PID、PIE、PIDK(SEQ IDNO:382)、PIEK(SEQ ID NO:383)、PIDKP(SEQ ID NO:384)、PIEKP(SEQ ID NO:385)、PIDKPS(SEQ ID NO:386),PIEKPS(SEQ ID NO:387)、PIDKPC(SEQ ID NO:388)、PIEKPC(SEQ ID NO:389)、PIDKPSQ(SEQ ID NO:390)、PIEKPSQ(SEQ ID NO:391)、PIDKPCQ(SEQ ID NO:392)、PIEKPCQ(SEQ ID NO:393)、PHHHHHH(SEQ ID NO:394)、PCHHHHHH(SEQ ID NO:395)、和PCPPPPPHHHHHH(SEQ ID NO:424)。
38.权利要求37的多肽，其中所述模块是PC或PPC。
39.权利要求35的多肽，其中所述模块选自下组：PCGC(SEQ ID NO:412)、PCPC(SEQ IDNO:413)、PCGSGC(SEQ ID NO:414)、PCPPPC(SEQ ID NO:415)、PCPPPPPC(SEQ ID NO:416)、PCGSGSGC(SEQ ID NO:417)、PCHHHHHC(SEQ ID NO:418)、PCCHHHHHH(SEQ ID NO:419)、PCGCHHHHHH(SEQ ID NO:420)、PCPCHHHHHH(SEQ ID NO:421)、PCGSGCHHHHHH(SEQ ID NO:422)、PCPPPCHHHHHH(SEQ ID NO:423)和PCGSGSGCHHHHHH(SEQ ID NO:425)。
40.权利要求39的多肽，其中所述模块是PCPPPPPC(SEQ ID NO:416)。
41.一种多肽缀合物，其包含权利要求33-40中任一项的多肽，其中C端模块中的半胱氨酸与异源模块缀合。
42.权利要求41的多肽缀合物，其中所述异源模块为可检测模块。
43.权利要求41的多肽缀合物，其中所述异源模块是药物模块，并且所述多肽和药物模块形成FBS-药物缀合物。
44.权利要求43的FBS-药物缀合物，其中所述药物模块通过接头与所述10Fn3结构域缀合，其中所述接头是腙、硫醚、酯、二硫键、肽基接头、或含肽接头。
45.权利要求44的FBS-药物缀合物，其中所述接头是肽基接头。
46.权利要求45的FBS-药物缀合物，其中所述肽基接头是Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQ ID NO:467)、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser、或Glu。
47.权利要求43-46中任一项的FBS-药物缀合物，其中所述药物模块是细胞毒性药物。
48.权利要求47的FBS-药物缀合物，其中所述细胞毒性药物选自下组：
(a)烯二炔类；
(b)微管溶素；
(c)DNA烷化剂类；
(d)埃坡霉素类；
(e)奥里斯他汀；
(f)吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)二聚体类；和
(g)美登木素生物碱类。
49.权利要求48的FBS-药物缀合物，其中所述药物模块是：
50.权利要求43-48中任一项的FBS-药物缀合物，其中所述药物模块是具有式(II)的结构的合成微管溶素类似物：
51.权利要求43-50中任一项的FBS-药物缀合物，其中所述FBS和药物模块用具有式(III)的结构的接头模块缀合：
52.权利要求51的FBS-药物缀合物，其中所述药物-模块-接头具有式(IV)的结构：
(IV)
其中马来酰亚胺基团与所述10Fn3结构域的半胱氨酸的巯基反应，
由此在药物-模块-接头和所述10Fn3结构域之间形成硫醚键。
53.权利要求44-52中任一项的FBS-药物缀合物，其中所述10Fn3结构域含有包含半胱氨酸的C端模块。
54.权利要求53的FBS-药物缀合物，其中所述C端模块由氨基酸序列PmCXn组成，其中C是半胱氨酸，每个X独立地是任何氨基酸，m是至少为1的整数，并且n是0或至少为1的整数。
55.权利要求54的FBS-药物缀合物，其中m是1或2，并且n是1-10的整数。
56.权利要求53的FBS-药物缀合物，其中所述C端模块由氨基酸序列PmCXn1CXn2组成，其中每个X独立地是任何氨基酸，n1和n2独立地是0或至少为1的整数。
57.权利要求56的FBS-药物缀合物，其中n1和n2独立地是1-5的整数。
58.权利要求54的FBS-药物缀合物，其中所述C端模块选自下组：PI、PC、PCC、PID、PIE、PIDK(SEQ ID NO:382)、PIEK(SEQ ID NO:383)、PIDKP(SEQ ID NO:384)、PIEKP(SEQ ID NO:385)、PIDKPS(SEQ ID NO:386),PIEKPS(SEQ ID NO:387)、PIDKPC(SEQ ID NO:388)、PIEKPC(SEQ ID NO:389)、PIDKPSQ(SEQ ID NO:390)、PIEKPSQ(SEQ ID NO:391)、PIDKPCQ(SEQ IDNO:392)、PIEKPCQ(SEQ ID NO:393)、PHHHHHH(SEQ ID NO:394)、PCHHHHHH(SEQ ID NO:395)、和PCPPPPPHHHHHH(SEQ ID NO:424)。
59.权利要求54的FBS-药物缀合物，其中所述C端模块是PC或PPC。
60.权利要求56的FBS-药物缀合物，其中所述C端模块选自下组：PCGC(SEQ ID NO:412)、PCPC(SEQ ID NO:413)、PCGSGC(SEQ ID NO:414)、PCPPPC(SEQ ID NO:415)、PCPPPPPC(SEQ ID NO:416)、PCGSGSGC(SEQ ID NO:417)、PCHHHHHC(SEQ ID NO:418)、PCCHHHHHH(SEQID NO:419)、PCGCHHHHHH(SEQ ID NO:420)、PCPCHHHHHH(SEQ ID NO:421)、PCGSGCHHHHHH(SEQ ID NO:422)、PCPPPCHHHHHH(SEQ ID NO:423)、PCPPPPPHHHHHH(SEQ ID NO:424)和PCGSGSGCHHHHHH(SEQ ID NO:425)。
61.权利要求60的FBS-药物缀合物，其中所述模块是PCPPPPPC(SEQ ID NO:16)。
62.一种具有由式(I)表示的结构的FBS-药物缀合物，
其中m是1或2，并且Adx是权利要求31-40中任一项的多肽，并且其中与Adx连接的硫原子是所述多肽的半胱氨酸的巯基的硫原子。
63.一种包含权利要求1-40中任一项的多肽或权利要求41-43中任一项的多肽缀合物，和药学上可接受的载体的药物组合物。
64.一种包含权利要求43-62中任一项的FBS-药物缀合物的药物组合物。
65.权利要求63或64的组合物，其中所述组合物基本上不含内毒素。
66.一种编码权利要求1-40中任一项的多肽的分离的核酸分子。
67.一种包含编码权利要求1-40中任一项的多肽的核苷酸序列的表达载体。
68.一种包含编码权利要求1-40中任一项的多肽的核酸的细胞。
69.一种产生权利要求1-40中任一项的多肽的方法，所述方法包括在适合于表达所述多肽的条件下培养权利要求68的细胞，并纯化所述多肽。
70.权利要求1-40中任一项的多肽、权利要求41-43中任一项的多肽缀合物、或者权利要求43-62中任一项的FBS-药物缀合物用于制备用于减轻或抑制表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的癌症的药物组合物的用途，其中所述癌症是肝细胞癌、黑素瘤、维尔姆斯瘤、肝母细胞瘤、卵巢癌或鳞状肺癌。
71.一种包含权利要求1-65中任一项的多肽、多肽缀合物、FBS-药物缀合物或药物组合物以及使用说明书的试剂盒。
72.权利要求1-40中任一项的多肽或权利要求41-43中任一项的多肽缀合物在制备用于检测或测量所述多肽与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的结合的药物组合物中的用途。
73.一种具有由式(I)表示的结构的FBS-药物缀合物，
其中m是1并且Adx是包含SEQ ID NO:110-117和272-289中任一者的氨基酸序列的多肽；并且其中与Adx连接的硫原子是所述多肽的C端半胱氨酸的巯基的硫原子。
74.一种具有由式(I)表示的结构的FBS-药物缀合物，
其中m是2并且Adx包含SEQ ID NO:119-126和281-288的氨基酸序列；并且其中与Adx连接的硫原子是Adx的两个C端半胱氨酸中的每一个的巯基的硫原子。
75.一种具有由式(VI)表示的结构的FBS-药物缀合物，
(VI)
其中与半胱氨酸连接的硫原子是半胱氨酸的巯基的硫原子。
76.一种具有由式(VII)表示的结构的FBS-药物缀合物，
(VII)
其中与半胱氨酸连接的硫原子是半胱氨酸的巯基的硫原子。
77.一种药物组合物，其包含权利要求73-76中任一项的FBS-药物缀合物。
78.权利要求73-76中任一项的FBS-药物缀合物用于制备用于减轻或抑制受试者中的表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的癌症的药物组合物中的用途，其中所述癌症是肝细胞癌、黑素瘤、维尔姆斯瘤、肝母细胞瘤、卵巢癌或鳞状肺癌。
79.一种试剂盒，其包含权利要求76-78中任一项的FBS-药物缀合物或权利要求77的药物组合物，以及使用说明。
80.权利要求42的多肽缀合物，其中所述可检测模块是放射性物质。
81.权利要求80的多肽缀合物，其中所述放射性物质是18F、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、86Y、89Zr、66Ga、67Ga、68Ga、44Sc、47Sc、11C、111In、114mIn、114In、125I、124I、131I、123I、32Cl、33Cl、34Cl、74Br、75Br、76Br、77Br、78Br、186Re、188Re、90Y、177Lu、99Tc、212Bi、213Bi、212Pb、225Ac、或153Sm。
82.权利要求42、80或81中任一项的多肽缀合物在制备用于检测或测量样品中所述可检测模块的存在的药物组合物中的用途。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115322253A (zh) 2014-03-20 2022-11-11 百时美施贵宝公司 稳定化的基于纤连蛋白的支架分子
ES2822990T3 (es) 2014-11-25 2021-05-05 Bristol Myers Squibb Co Novedosos polipéptidos de unión a PD-L1 para obtención de imágenes
EA034516B1 (ru) 2014-11-25 2020-02-14 Бристол-Маерс Сквибб Компани Способы и композиции для мечения радиоактивным изотопомf биологических препаратов
KR20180057657A (ko) 2015-09-23 2018-05-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 글리피칸-3-결합 피브로넥틴 기반 스캐폴드 분자
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
CA3006000A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Seattle Genetics, Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
US10994033B2 (en) 2016-06-01 2021-05-04 Bristol-Myers Squibb Company Imaging methods using 18F-radiolabeled biologics
KR102397783B1 (ko) 2016-06-01 2022-05-12 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Pd-l1 결합 폴리펩티드에 의한 pet 영상화
KR102617252B1 (ko) 2018-05-21 2023-12-26 삼성전자주식회사 전자 장치 및 그 파노라마 촬영 모드 자동 전환 방법
PE20211279A1 (es) 2018-10-23 2021-07-19 Dragonfly Therapeutics Inc Proteinas heterodimericas fusionadas con fc
KR102154683B1 (ko) * 2019-11-08 2020-09-11 주식회사 압타머사이언스 글리피칸-3 특이적 변형 압타머 및 이의 용도
KR20230004746A (ko) 2020-04-22 2023-01-06 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. 이종이량체 fc-융합 단백질에 대한 제형, 투여 요법 및 제조 방법
KR20240000505A (ko) * 2021-04-23 2024-01-02 상하이 헨리우스 바이오테크, 인크. 항gpc3 항체, 다중 특이적 항체 및 사용 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012065978A1 (en) * 2010-11-15 2012-05-24 Pieris Ag Muteins of human lipocalin 2 with affinity for glypican-3 (gpc3)

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
WO1994011026A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
DK0971946T3 (da) 1997-01-21 2006-10-30 Gen Hospital Corp Selektion af proteiner ved anvendelse af RNA-protein-fusioner
US6261804B1 (en) 1997-01-21 2001-07-17 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
ATE386802T1 (de) * 1997-06-12 2008-03-15 Novartis Int Pharm Ltd Künstliche antikörperpolypeptide
CA2351346C (en) 1998-12-10 2015-09-01 Phylos, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7115396B2 (en) * 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
JP4118462B2 (ja) 1999-07-19 2008-07-16 株式会社リコー 携帯電子機器
EP1074563A1 (en) 1999-08-02 2001-02-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimeric polypeptides enhancing dimer formation through electrostatic interactions and disulfide bond, method for production and uses thereof
US20050287153A1 (en) 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
JP2003528632A (ja) 2000-03-31 2003-09-30 インスティティ・パスツール 血管内皮成長因子（ｖｅｇｆ）−媒介性脈管形成を阻害するペプチド、該ペプチドをエンコードするポリヌクレオチド及びその使用方法
US6545853B1 (en) 2000-07-10 2003-04-08 Hughes Electronics Corporation Alternate grounding method
CA2418835A1 (en) 2000-10-16 2002-04-25 Phylos, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
CN1463270A (zh) 2001-05-31 2003-12-24 梅达莱克斯公司 细胞毒素、其有用的前体药物、连接基团和稳定剂
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
PT2316852E (pt) 2002-11-08 2014-06-23 Ablynx Nv Anticorpos de domínio único estáveis
KR101424624B1 (ko) 2003-05-14 2014-07-31 이뮤노젠 아이엔씨 약물 콘쥬게이트 조성물
ZA200603619B (en) 2003-11-06 2008-10-29 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
MXPA06009072A (es) 2004-02-09 2007-03-29 Human Genome Sciences Inc Proteinas de fusion de albumina.
JP5064037B2 (ja) 2004-02-23 2012-10-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド 複素環式自壊的リンカーおよび結合体
US7778814B2 (en) 2004-03-30 2010-08-17 Siemens Aktiengesellschaft Method and device for simulating an automation system
NZ550934A (en) 2004-05-19 2010-05-28 Medarex Inc Chemical linkers and conjugates thereof
US7691962B2 (en) 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
AU2006294554B2 (en) 2005-09-26 2013-03-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Antibody-drug conjugates and methods of use
WO2007038868A2 (en) 2005-10-03 2007-04-12 The University Of British Columbia Novel enediyne compound and uses thereof
KR20080068084A (ko) 2005-10-26 2008-07-22 메다렉스, 인코포레이티드 씨씨-1065 유사체를 제조하기 위한 방법 및 화합물
WO2007059404A2 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
US20070269422A1 (en) 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
AR061181A1 (es) 2006-05-25 2008-08-13 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de aziridinil-epotilona
PE20080102A1 (es) 2006-05-25 2008-02-11 Bristol Myers Squibb Co Conjugados de analogos de aziridinil-epotilona y composiciones farmaceuticas que comprenden los mismos
TWI412367B (zh) 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
CN101616911A (zh) 2007-02-21 2009-12-30 梅达莱克斯公司 具有单个氨基酸的化学连接物及其偶联物
CN101965198A (zh) 2007-12-27 2011-02-02 诺瓦提斯公司 改进的基于纤连蛋白的结合分子及其用途
PT2439212T (pt) 2008-05-02 2017-03-29 Novartis Ag Moléculas de ligação baseadas em fibronectina melhoradas e suas utilizações
EP2799448A1 (en) * 2008-05-22 2014-11-05 Bristol-Myers Squibb Company Multivalent fibronectin based scaffold domain proteins
US8394922B2 (en) 2009-08-03 2013-03-12 Medarex, Inc. Antiproliferative compounds, conjugates thereof, methods therefor, and uses thereof
PT2949670T (pt) 2009-12-10 2019-05-20 Hoffmann La Roche Anticorpos que se ligam preferencialmente ao domínio extracelular 4 do csf1r e respetiva utilização
EA201270713A1 (ru) * 2010-02-18 2013-01-30 Бристол-Майерс Сквибб Компани Белки на основе фибронектина с каркасными доменами, которые связывают ил-23
BR112012022046A2 (pt) 2010-03-05 2017-02-14 F Hoffamann-La Roche Ag ''anticorpo,composição farmacêutica,ácido nucleico ,vetores de expressão,célula hospedeira e método para a produção de um anticorpo recombinante''.
KR101656548B1 (ko) 2010-03-05 2016-09-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 인간 ｃｓｆ-1ｒ에 대한 항체 및 이의 용도
CN106977608A (zh) 2010-04-09 2017-07-25 阿尔布麦狄克斯公司 白蛋白衍生物和变体
CN102834114A (zh) * 2010-04-13 2012-12-19 米迪缪尼有限公司 基于纤连蛋白iii型结构域的多聚体支架
BR112012026216B1 (pt) * 2010-04-13 2022-07-26 Bristol-Myers Squibb Company Proteínas com domínio "scaffold" baseado em fibronectina que se ligam à pcsk9, seu uso, bem como composição farmacêutica compreendendo as mesmas
BR112012026410B8 (pt) 2010-04-15 2023-01-31 Spirogen Dev Sarl Composto e conjugado de pirrolobenzodiazepinas e usos dos mesmos
JP5870400B2 (ja) 2010-04-15 2016-03-01 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド 標的化ピロロベンゾジアゼピンコンジュゲート
SI2566517T1 (sl) 2010-05-04 2019-01-31 Five Prime Therapeutics, Inc. Protitelesa, ki vežejo CSF1R
EP3248987A1 (en) * 2010-07-30 2017-11-29 Novartis AG Fibronectin cradle molecules and libraries thereof
US20130225496A1 (en) 2010-11-01 2013-08-29 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin Variants
KR102385507B1 (ko) * 2010-11-30 2022-04-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복해서 결합하는 항원 결합 분자
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
KR101860174B1 (ko) 2011-09-20 2018-05-21 메디뮨 리미티드 표적 접합체 내의 내포를 위한 비대칭 이량체 pbd 화합물로서 피롤로벤조디아제핀
US10023643B2 (en) 2011-12-15 2018-07-17 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human CSF-1R and uses thereof
WO2013119716A1 (en) 2012-02-06 2013-08-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for using csf1r inhibitors
WO2013122823A1 (en) 2012-02-13 2013-08-22 Bristol-Myers Squibb Company Enediyne compounds, conjugates thereof, and uses and methods therefor
AR090263A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
BR112014028013A2 (pt) 2012-05-11 2018-02-27 Five Prime Therapeutics Inc métodos para tratar uma condição associada com artrite reumatoide, artrite reumatoide, lesões de pele, nefrite lúpica, lúpus, uma condição inflamatória, distúrbio de cd16+, método para reduzir o número de monócitos cd16+, métodos para desacelerar a progressão de uma condição renal,de formação de panos e de perda óssea
SG10201906328RA (en) 2012-08-31 2019-08-27 Five Prime Therapeutics Inc Methods of treating conditions with antibodies that bind colony stimulating factor 1 receptor (csf1r)
DK2956173T3 (en) 2013-02-14 2017-07-17 Bristol Myers Squibb Co TUBULYSIS RELATIONSHIPS, METHODS OF PRODUCING AND USING THEREOF
US9433689B2 (en) 2013-03-12 2016-09-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junio Probes and methods of imaging non-Hodgkins lymphoma
US20160000946A1 (en) * 2013-03-14 2016-01-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Radiolabeled anti-glypican-3 immunoconjugates for immuno-pet imaging of hepatocellular carcinoma
EA201690388A1 (ru) * 2013-08-14 2016-07-29 Уильям Марш Райс Юниверсити Новые производные унциаламицина, способы их синтеза и их применение в качестве противоопухолевых агентов
CN115322253A (zh) * 2014-03-20 2022-11-11 百时美施贵宝公司 稳定化的基于纤连蛋白的支架分子
KR20180057657A (ko) 2015-09-23 2018-05-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 글리피칸-3-결합 피브로넥틴 기반 스캐폴드 분자

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012065978A1 (en) * 2010-11-15 2012-05-24 Pieris Ag Muteins of human lipocalin 2 with affinity for glypican-3 (gpc3)

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Adnectins: engineered target-binding protein therapeutics;LIPOVSEK D;《PROTEIN ENGINEERING, DESIGN AND SELECTION》;20110101;第24卷(第1-2期);第3-9页 *
Human 10Fn3 domain derived peptide li-38 SEQ:174.Database accession no. BBL29072;EBI;《EBI》;20140925;全文 *

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