KR20180057657A - 글리피칸-3-결합 피브로넥틴 기반 스캐폴드 분자 - Google Patents

글리피칸-3-결합 피브로넥틴 기반 스캐폴드 분자 Download PDF

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다사 리포브섹
조셉 토트
진저 씨. 레이크스트로
이르비트 엠. 카르바잘
스탠리 리차드 주니어 크리스텍
스티븐 알. 오닐
구오동 첸
리차드 와이. 후앙
브라이언 씨. 반하트
존 토마스 로프레도
크리스티나 테라니
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Abstract

글리피칸-3에 결합하는 제10 피브로넥틴 유형 III 도메인 (10Fn3)을 포함하는 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 진단 및 치료 용도에 사용하기 위한 글리피칸-3에 결합하는 10Fn3 도메인을 포함하는 융합 분자가 또한 제공된다. 글리피칸-3 10Fn3 약물 접합체가 또한 제공된다.

Description

글리피칸-3-결합 피브로넥틴 기반 스캐폴드 분자
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 9월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 62/222,633을 우선권 주장하며, 그 내용은 본원에 참조로 구체적으로 포함된다. 본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 임의의 특허, 특허 출원, 및 참고문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
글리피칸-3은 글리코실-포스파티딜이노시톨-고정된 헤파린 술페이트 프로테오글리칸의 글리피칸 패밀리에 속하는 종양태아성 항원이다. 글리피칸은 Wnt, 헤지호그, 골 형태형성 단백질 및 섬유모세포 성장 인자 (FGF)를 포함하는 여러 성장 인자의 활성을 조절한다 (Filmus et al. FEBS J. 2013, 280:2471-2476). 글리피칸은 헤파린술페이트 글리코사미노글리칸으로 칭해지는 폴리사카라이드 쇄를 복합체화하는 공유 연결을 특징으로 한다. 글리피칸은 세포-세포외 매트릭스 계면에서의 세포 신호전달에 수반된다. (Sasisekharan et al., Nature Reviews|Cancer, Volume 2 (2002)). 지금까지, 인간 글리피칸 패밀리의 6종의 별개의 구성원이 확인되었다. 세포 막-결합 글리피칸-3은 1개 이상의 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 서브유닛으로 구성된다.
글리피칸-3은 발생 동안 태아 간 및 태반에서 발현되고 정상 성체 조직에서 하향-조절되거나 또는 침묵된다. 글리피칸-3 유전자의 돌연변이 및 고갈은 인간에서 심슨-골라비-버멜(Simpson-Golabi-Behmel) 또는 심슨 이상형태 증후군을 유발한다. 글리피칸-3은 다양한 암, 특히, 간세포성 암종 ("HCC"), 흑색종, 윌름스 종양, 및 간모세포종에서 발현된다. (Jakubovic and Jothy; Ex. Mol. Path. 82:184-189 (2007); Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005)). 글리피칸-3의 세포 표면 형태는 HCC (>50%) 및 편평 폐암을 포함하는 다른 암 (대략 25%)에서 고도로 발현된다.
글리피칸-3은 시험관내 및 생체내에서 전사 인자 β-카테닌의 시토졸 축적 및 핵 전위를 유도하는 정규 Wnt 신호전달을 자극함으로써 종양 성장을 촉진한다 (Filmus, 상기문헌). GPC3이 여러 Wnt (Capurro et al., Cancer Res., 2005, 65:6245-6254), 및 프리즐드, Wnt에 대한 신호전달 수용체 (Filmus, et al., Genome Biol., 2008, 9:224)와 복합체를 형성할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
HCC는 전세계적으로 암-관련 사망의 세번째 주요 원인이다. 매년, HCC는 약 1백만명의 사망을 차지한다. (Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005)). B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 및 만성 알콜 과다 사용과 이로 인한 간의 간경변증은 HCC의 가장 흔한 원인으로 남아있다. 그의 발생률은 미국에서 C형 간염 바이러스 감염의 확산으로 인해 극적으로 증가하였고 향후 20년 동안 증가할 것으로 예상된다. HCC는 주로 간 이식 또는 종양 절제에 의해 치료된다. 환자 예후는 기저 간 기능 및 종양이 진단된 단계 둘 다에 따라 달라진다. (Parikh and Hyman, Am J. Med. 120(3):194-202 (2007)). 효과적인 HCC 치료 전략이 필요하다.
인간 글리피칸-3에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 (FBS)를 함유하는 폴리펩티드 및 치료제 및 진단제로서 적합한 이들 폴리펩티드의 접합체가 본원에 제공된다.
한 측면에서, 인간 글리피칸-3 (GPC3)에 특이적으로 결합하는 FBS를 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-GPC3 FBS는 치료제 또는 진단제에 접합된다.
또 다른 측면에서, 인간 대상체에게 항-GPC3 FBS 또는 항-GPC3 FBS-약물 접합체를 포함하는 폴리펩티드의 치료 유효량을 투여함으로써, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 암은 비-암성 세포에 비해 글리피칸-3을 과다-발현한다. 일부 실시양태에서, 암은 간암 (예를 들어, 간세포성 암종, 간모세포종), 흑색종, 윌름스 종양 또는 폐암 (예를 들어, 편평 폐암)이다.
또 다른 측면에서, 항-GPC3 FBS의 GPC3에 대한 결합을 허용하는 조건 하에 세포를 항-GPC3 FBS를 포함하는 폴리펩티드와 접촉시키고, 항-GPC3 FBS 및 GPC3을 포함하는 복합체를 검출하는 것을 포함하는, 시험관내 및 생체내에서 GPC3을 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-GPC3 FBS는 검출가능한 표지 (예를 들어, FITC)에 연결된다.
항-GPC3 FBS 폴리펩티드 및/또는 항-GPC3 FBS 약물 접합체를 포함하는, 제약 및 진단 조성물을 포함한, 조성물이 또한 제공된다.
항-GPC3 FBS를 코딩하는 핵산 분자뿐만 아니라 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 항-GPC3 FBS 폴리펩티드 및 항-GPC3 FBS 접합체 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트가 또한 제공된다.
본 발명의 다른 특색 및 이점은 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하는 하기 상세한 설명 및 실시예로부터 명백할 것이다.
도 1은 대표적인 항-GPC3 애드넥틴 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시한다. 4578F03 (서열식별번호(SEQ ID NO): 9), 4578H08 (서열식별번호: 18), 4578B06 (서열식별번호: 35), 4606F06 (서열식별번호: 48), 5273C01 (서열식별번호: 61), 5273D01 (서열식별번호: 74), 5274E01 (서열식별번호: 87), 6561A01 (서열식별번호: 87), 6077F02 (서열식별번호: 102), 6093A01 (서열식별번호: 463).
도 2a-2b는 DAR1 및 DAR2 튜부리신 유사체-GPC3 애드넥틴 약물 접합체의 구조를 도시하는 개략도이다.
도 3a-3d는 인간 글리피칸-3 양성 세포에 대한 항-GPC3 애드넥틴 결합의 유동 세포측정법 결과를 제시한다.
도 4a-4b는 인간 Hep3B 및 H446 세포에 대한 항-GPC3 AdxDC DAR1 및 DAR2 결합의 유동 세포측정법 결과를 제시한다.
도 5a-5b는 항-GPC3 AdxDC DAR1 및 DAR2에 의한 Hep3B 및 H446 세포의 세포 성장 억제를 제시한다.
도 6a-6b는 항-GPC3 AdxDC DAR1 및 DAR2에 의한 Hep3B 및 HepG2 세포의 세포 성장 억제를 제시한다.
도 7a-7b는 H446 및 HepB3 세포 내로의 항-GPC3 애드넥틴, ADX_6077_F02의 내재화 속도를 도시하는 막대 그래프이다.
도 8a-8f는 15분 및 8시간 시점에서의 막 및 내재화된 AF488 표지된 항-GPC3 애드넥틴, ADX_6077_F02를 도시한다.
도 9는 마우스에서의 튜부리신 유사체-항-GPC3 애드넥틴 약물 접합체의 노출 프로파일을 도시하는 그래프이다.
도 10a-10b는 종양 부피 수축 및 퍼센트 체중 변화에 의해 측정된 바와 같은, HepG2 이종이식편 모델에서의 항-GPC3 애드넥틴 약물 접합체의 효능을 도시하는 그래프이다.
도 11a-11d는 종양 부피 수축 및 퍼센트 체중 변화에 의해 측정된 바와 같은, HepG2 이종이식편 모델 (TV0=380-480 mm3)에서의 DAR1 및 DAR2의 효능을 도시하는 그래프이다.
도 12a-12b는 종양 부피 수축 및 퍼센트 체중 변화에 의해 측정된 바와 같은, HepG2 이종이식편 모델 (TV0=228-350 mm3)에서의 DAR2의 효능을 도시하는 그래프이다.
도 13a-13b는 종양 부피 수축 및 퍼센트 체중 변화에 의해 측정된 바와 같은, HepG2 이종이식편 모델 (TV0=514-673 mm3)에서의 DAR2의 효능을 도시하는 그래프이다.
도 14는 질량 분광측정법에 의해 결정된 인간 GPC3에 대한 공통 펩신 펩티드 (서열식별번호: 344의 아미노산 1-559, 이어서 6X his)를 도시한다.
도 15는 HDX-MS에 의해 결정된 바와 같은, 인간 GPC3 상의 ADX_6077_F02 애드넥틴 결합 부위의 그래프 도시이다.
도 16a-16b는 항-GPC3 DG 돌연변이체의 모 항-GPC3 애드넥틴과의 결합 동역학의 그래프 비교이다.
도 17은 Hep3B 종양 세포가 이식된 NSG 마우스에게의 다양한 용량의 GPC3_AdxDC DA 또는 대조군 비-결합 AdxDC의 투여 후 일수의 함수로서 종양 부피를 나타내고, 이는 GPC3_AdxDC DA가 글리피칸-3의 높은 발현을 갖는 세포주 유래 이종이식편에서 효과적이라는 것을 제시한다.
도 18은 H446 종양 세포가 이식된 CB17 SCID 마우스에게의 다양한 용량의 GPC3_AdxDC DA 또는 대조군 비 결합 AdxDC의 투여 후 일수의 함수로서 종양 부피를 나타내고, 이는 GPC3_AdxDC DA가 글리피칸-3의 낮은 발현을 갖는 세포주 유래 이종이식편의 성장을 저속화시킨다는 것을 제시한다.
도 19는 마우스에게의 0.22 μM/kg의 3H GPC3_AdxDC의 투여 후 0.17시간, 1시간, 5시간 및 168시간에 취해진 마우스 조직의 정량적 전신 자가방사선촬영 (QWBA)을 나타내고, 이는 정상 조직에 비해 Hep3B 종양으로의 우선적 흡수를 제시한다.
도 20은 마우스에게의 0.015 μM/kg의 3H GPC3_AdxDC의 투여 후 0.17시간, 1시간, 5시간 및 168시간에 취해진 마우스 조직의 QWBA를 나타내고, 이는 정상 조직에 비해 Hep3B 종양으로의 우선적 흡수를 제시한다.
도 21은 마우스에게의 0.22 μM/kg의 3H GPC3_AdxDC의 투여 후 0.17시간, 1시간, 5시간 및 168시간에 취해진 마우스 조직의 QWBA를 나타내고, 이는 비-결합 대조군 AdxDC의 흡수에 비해 Hep3B 종양으로의 더 높은 흡수를 제시한다.
도 22는 마우스에게의 0.22 μM/kg의 3H RGE_AdxDC (대조군, 비 GPC3-결합 AdxDC)의 투여 후 0.17시간, 1시간, 5시간 및 168시간에 취해진 마우스 조직의 QWBA를 나타내고, 이는 GPC3_AdxDC의 흡수에 비해 Hep3B 종양으로의 더 낮은 흡수를 제시한다.
도 23은 마우스에게 투여된 3H GPC3_AdxDC 또는 비-결합 AdxDC 대조군 ("RGE_ADxDC")의 투여 후 0.17시간, 1시간, 5시간, 24시간, 48시간 및 168시간에서의 다양한 마우스 조직의 총 방사능 농도를 나타낸다. 각각의 조직에 대한 막대는 이전 문장에 제시된 순서로 제시된다.
도 24a-24b는 10 nM (도 24a) 또는 1 nM (도 24b) 인간 글리피칸-3-비오틴을 사용하는 위치 스캐닝에 의해 수득된 GPC3_AdxDC DG의 BC 루프 (서열식별번호: 98의 아미노산 15-21)의 히트 맵(heat map)을 나타낸다. wt BC 루프의 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 15-21에 제시된다.
도 25a-25b는 10 nM (도 25a) 또는 1 nM (도 25b) 인간 글리피칸-3-비오틴을 사용하는 위치 스캐닝에 의해 수득된 GPC3_AdxDC DA의 BC 루프 (서열식별번호: 98의 아미노산 15-21)의 히트 맵을 나타낸다. wt BC 루프의 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 15-21에 제시된다.
도 26a-26b는 10 nM (도 26a) 또는 1 nM (도 26b) 인간 글리피칸-3-비오틴을 사용하는 위치 스캐닝에 의해 수득된 GPC3_AdxDC DG의 DE 루프의 히트 맵을 나타낸다. wt DE 루프의 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 52-55에 제시된다.
도 27a-27b는 10 nM (도 27a) 또는 1 nM (도 27b) 인간 글리피칸-3-비오틴을 사용하는 위치 스캐닝에 의해 수득된 GPC3_AdxDC DA의 DE 루프의 히트 맵을 나타낸다. wt DE 루프의 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 52-55에 제시된다.
도 28은 10 nM 인간 글리피칸-3-비오틴을 사용하는 위치 스캐닝에 의해 수득된 GPC3_AdxDC DG의 FG 루프 (서열식별번호: 98의 아미노산 69-79)의 히트 맵을 나타낸다. wt FG 루프의 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 77-87에 제시된다.
도 29는 1 nM 인간 글리피칸-3-비오틴을 사용하는 위치 스캐닝에 의해 수득된 GPC3_AdxDC DG의 FG 루프 (서열식별번호: 98의 아미노산 69-79)의 히트 맵을 나타낸다. wt FG 루프의 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 77-87에 제시된다.
도 30은 10 nM 인간 글리피칸-3-비오틴을 사용하는 위치 스캐닝에 의해 수득된 GPC3_AdxDC DA의 FG 루프 (서열식별번호: 98의 아미노산 69-79)의 히트 맵을 나타낸다. wt FG 루프의 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 77-87에 제시된다.
도 31은 1 nM 인간 글리피칸-3-비오틴을 사용하는 위치 스캐닝에 의해 수득된 GPC3_AdxDC DA의 FG 루프 (서열식별번호: 98의 아미노산 69-79)의 히트 맵을 나타낸다. wt FG 루프의 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 77-87에 제시된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 조성물이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 조성물이 본원에 기재되어 있다.
용어 "글리피칸-3", "글리피칸 프로테오글리칸 3", "GPC3", "OTTHUMP00000062492", "GTR2-2", "SGB", "DGSX", "SDYS", "SGBS", "OCI-5", 및 "SGBS1"은 상호교환가능하게 사용되고, 인간 글리피칸-3의 변이체, 이소형 및 종 상동체를 포함한다. 예시적인 인간 글리피칸-3의 완전한 아미노산 서열은 진뱅크(Genbank)/NCBI 수탁 번호 NM_004484 (서열식별번호: 344)를 갖는다.
"아미노산 잔기"는 펩티드 결합의 형성 시 물 분자 (질소 측으로부터의 H+ 및 카르복실산 측으로부터의 OH-)가 상실된 후의 아미노산의 나머지 부분이다.
"폴리펩티드"는 길이, 번역후 변형, 또는 기능에 관계없이, 2개 이상의 아미노산의 임의의 서열을 의미한다. 폴리펩티드는 천연 아미노산 및 비-천연 아미노산 예컨대 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,559,126에 기재된 것을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 다양한 표준 화학적 방식 중 어느 것으로 변형될 수 있다 (예를 들어, 아미노산은 보호기로 변형될 수 있거나; 카르복시-말단 아미노산은 말단 아미드 기로 제조될 수 있거나; 아미노-말단 잔기는, 예를 들어, 친지성을 증진시키는 기로 변형될 수 있거나; 또는 폴리펩티드는 안정성 또는 생체내 반감기를 증가시키도록 화학적으로 글리코실화되거나 또는 달리 변형될 수 있음). 폴리펩티드 변형은 폴리펩티드에 대한 또 다른 구조 예컨대 시클릭 화합물 또는 다른 분자의 부착을 포함할 수 있고 또한 1개 이상의 아미노산을 변경된 배위 (즉, R 또는 S; 또는, L 또는 D)로 함유하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
"단리된" 폴리펩티드는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 이는 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 로우리 방법에 의해 결정 시 폴리펩티드의 95 중량% 초과, 및 가장 바람직하게는 99 중량% 초과까지, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 적어도 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기를 수득하는 데 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는, 바람직하게는, 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "10Fn3 도메인" 또는 "10Fn3 모이어티" 또는 "10Fn3 분자"는 야생형 10Fn3 및 그의 생물학적 활성 변이체, 예를 들어, 표적, 예컨대 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 생물학적 활성 변이체를 지칭한다. 야생형 인간 10Fn3 도메인은 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 야생형 인간 10Fn3 도메인의 생물학적 활성 변이체는 서열식별번호: 1을 포함하는 10Fn3 도메인에 비해, 적어도, 많게는 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40 또는 45개의 아미노산 변화, 즉, 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 10Fn3 도메인을 포함한다.
"애드넥틴" 또는 "Adx" 또는 "애드넥틴" 또는 "adx"는 표적에 특이적으로 결합하도록 (야생형 서열에 비해) 변형된 인간 10Fn3 분자를 지칭한다.
"GPC3 애드넥틴" 또는 "항-GPC3 애드넥틴"은 GPC3에 특이적으로, 예를 들어, 1 μM 이하의 KD로 결합하는 애드넥틴이다.
본원에 사용된 바와 같은 10Fn3 도메인 (또는 모이어티 또는 분자)의 "영역"은 루프 (AB, BC, CD, DE, EF 및 FG), β-가닥 (A, B, C, D, E, F 및 G), N-말단 (서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 1-7에 상응함), 또는 C-말단 (서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 93-94에 상응함)을 지칭한다.
10Fn3 도메인 (또는 모이어티)의 "노스 폴 루프(north pole loop)"는 10Fn3 도메인의 BC, DE 및 FG 루프 중 어느 하나를 지칭한다.
10Fn3 도메인 (또는 모이어티)의 "사우스 폴 루프(south pole loop)"는 10Fn3 도메인의 AB, CD 및 EF 루프 중 어느 하나를 지칭한다.
"스캐폴드 영역"은 인간 10Fn3 도메인의 임의의 비-루프 영역을 지칭한다. 스캐폴드 영역은 A, B, C, D, E, F 및 G β-가닥뿐만 아니라 N-말단 영역 (서열식별번호: 1의 잔기 1-7에 상응하는 아미노산) 및 C-말단 영역 (서열식별번호: 1의 잔기 93-94에 상응하는 아미노산)을 포함한다.
본원에서 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우에 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하고, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않은 후, 선택된 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 관련 기술분야 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLASTSM, BLASTSM-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈라인(Megalign) (DNASTAR®) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본원의 목적을 위해, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, B와의, 또는 B 대비 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에 대한, B와의, 또는 B 대비 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다: 100 x 분율 X/Y (여기서 X는 서열 정렬 프로그램, 예컨대 BLASTSM, BLASTSM-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈라인 (DNASTAR®)에 의해 A 및 B의 프로그램의 정렬 시 동일한 매치로 점수화된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 내의 아미노산 잔기의 총수임). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것으로 인지될 것이다.
본원에 사용된 용어 "애드넥틴 결합 부위"는 특정한 애드넥틴과 상호작용하거나 또는 그에 결합하는 단백질 (예를 들어, GPC3)의 부위 또는 부분을 지칭한다. 애드넥틴 결합 부위는 인접 아미노산 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산에 의해 형성된 애드넥틴 결합 부위는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출 시 유지되는 반면에, 3차 폴딩에 의해 형성된 애드넥틴 결합 부위는 전형적으로 변성 용매의 처리 시 상실된다.
본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴에 대한 애드넥틴 결합 부위는 프로테아제 맵핑 및 돌연변이 분석을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 항체의 에피토프 맵핑에 전형적으로 사용되는 표준 기술의 적용에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기는 (1) 잔기의 측쇄 또는 주쇄의 비-수소 원자 중 어느 것이 실험적으로 결정된 복합체의 3차원 구조에 기초하여 결합 표적의 임의의 원자의 5 옹스트롬 내에 존재하는 것으로 밝혀지고/거나, (2) 잔기의 야생형 10Fn3 (예를 들어, 서열식별번호: 1) 내의 그의 등가물로의, 알라닌으로의, 또는 해당 잔기와 크기가 유사하거나 또는 그보다 더 작은 측쇄를 갖는 잔기로의 돌연변이가 표적에 대한 평형 해리 상수의 측정된 증가 (예를 들어, k온의 증가)를 유도하는 경우에 표적에 대한 "결합에 기여"하는 것으로 간주된다.
GPC3에 대한 FBS 결합과 관련하여 본원에 상호교환가능하게 사용된 용어 "특이적으로 결합하다", "특이적 결합", "선택적 결합", 및 "선택적으로 결합하다"는 GPC3에 대한 친화도를 나타내지만, 관련 기술분야에 이용가능한 기술 예컨대, 비제한적으로, 스캐차드 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정 (예를 들어, 경쟁 ELISA, 비아코어(BIACORE) 검정)에 의해 측정 시 상이한 폴리펩티드에 유의하게 결합하지 않는 (예를 들어, 약 10% 미만의 결합) FBS를 지칭한다. 용어는 또한 예를 들어, 본원에 기재된 FBS 결합 도메인이 1종 이상의 종 (예를 들어, 인간, 설치류, 영장류)으로부터의 GPC3에 특이적이지만, 다른 글리피칸 (예를 들어, 글리피칸-1, 글리피칸-2, 글리피칸-5, 글리피칸-6)과 교차-반응하지 않는 경우에 적용가능하다.
GPC3에 대한 애드넥틴 결합과 관련하여 본원에 사용된 용어 "우선적으로 결합하다"는 본원에 기재된 애드넥틴이 관련 기술분야에 이용가능한 기술 예컨대, 비제한적으로, 스캐차드 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정 (예를 들어, 경쟁 ELISA, 비아코어 검정)에 의해 측정 시 상이한 폴리펩티드에 결합하는 것보다 적어도 약 20% 초과로 GPC3에 결합하는 상황을 지칭한다.
GPC3에 대한 애드넥틴 결합과 관련하여 본원에 사용된 용어 "KD"는 표면 플라즈몬 공명 검정 또는 세포 결합 검정을 사용하여 측정 시 특정한 애드넥틴-단백질 (예를 들어, GPC3) 상호작용의 해리 평형 상수 또는 애드넥틴의 단백질 (예를 들어, GPC3)에 대한 친화도를 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같은 "목적하는 KD"는 고려되는 목적에 충분한 애드넥틴의 KD를 지칭한다. 예를 들어, 목적하는 KD는 시험관내 검정, 예를 들어, 세포-기반 루시페라제 검정에서 기능적 효과를 도출하는 데 요구되는 애드넥틴의 KD를 지칭할 수 있다.
단백질에 결합하는 애드넥틴과 관련하여 본원에 사용된 용어 "ka"는 애드넥틴의 애드넥틴/단백질 복합체로의 회합에 대한 회합률 상수를 지칭하는 것으로 의도된다.
단백질에 결합하는 애드넥틴과 관련하여 본원에 사용된 용어 "kd"는 애드넥틴/단백질 복합체로부터의 애드넥틴의 해리에 대한 해리율 상수를 지칭하는 것으로 의도된다.
애드넥틴과 관련하여 본원에 사용된 용어 "IC50"은 시험관내 또는 생체내 검정에서 최대 억제 반응의 50%인 수준까지, 즉, 최대 억제 반응과 비처리된 반응 사이의 절반으로 반응을 억제하는 애드넥틴의 농도를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "글리피칸 활성" 또는 "글리피칸-3" 활성은 GPC3에 의한 세포 신호전달의 활성화, 예를 들어, Wnt 신호전달의 활성화와 연관된 성장-조절 또는 형태형성 활성 중 1개 이상을 지칭한다. 예를 들어, GPC3은 Wnt 및/또는 프리즐드 단백질과의 복합체 형성에 의한 종양 세포 성장을 조정할 수 있다. GPC3은 또한 FGF와 상호작용함으로써 신호전달 경로 및 종양 세포 성장을 활성화시킬 수 있다. GPC3 활성은 관련 기술분야에 인식된 방법, 예컨대 본원에 기재된 것을 사용하여 결정될 수 있다. 어구 "글리피칸-3 활성" 또는 "글리피칸-3 활성을 길항하다" 또는 "글리피칸-3을 길항하다"는 생체내 또는 시험관내에서 GPC3의 활성을 중화시키거나 또는 길항하는 본원에 제공된 항-GPC3 FBS 및 항-GPC3 약물 접합체의 능력을 지칭하는 데 상호교환가능하게 사용된다. 항-GPC3 FBS의 활성과 관련하여 본원에 사용된 용어 "억제하다" 또는 "중화시키다"는 예를 들어, 생물학적 활성 또는 속성, 질환 또는 상태 (예를 들어, 종양 세포 성장)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 억제될 것의 진행 또는 중증도를 실질적으로 길항하거나, 금지하거나, 방지하거나, 억제하거나, 저속화시키거나, 방해하거나, 제거하거나, 정지시키거나, 감소시키거나 또는 역전시키는 능력을 의미한다. 억제 또는 중화는 바람직하게는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 초과이다.
본원에 사용된 용어 "연결된"은 2개 이상의 분자의 회합을 지칭한다. 연결은 공유 또는 비-공유일 수 있다. 연결은 폴리펩티드와 화학적 모이어티 또는 또 다른 폴리펩티드 모이어티 사이일 수 있다. 연결은 또한 유전적 (즉, 재조합적으로 융합됨)일 수 있다. 이러한 연결은 관련 기술분야에 인식된 매우 다양한 기술, 예컨대 화학적 접합 및 재조합 단백질 생산을 사용하여 달성될 수 있다.
용어 "PK"는 "약동학적"에 대한 두문자어이고 화합물의 특성, 예로서, 대상체에 의한 흡수, 분포, 대사, 및 제거를 포괄한다. 본원에 사용된 바와 같은 "PK 조정 단백질" 또는 "PK 모이어티"는 생물학적 활성 분자에 융합되거나 또는 함께 투여되는 경우에 생물학적 활성 분자의 약동학적 특성에 영향을 미치는 임의의 단백질, 펩티드, 또는 모이어티를 지칭한다. PK 조정 단백질 또는 PK 모이어티의 예는 PEG, 인간 혈청 알부민 (HSA) 결합제 (미국 공개 번호 2005/0287153 및 2007/0003549, PCT 공개 번호 WO 2009/083804 및 WO 2009/133208에 개시된 바와 같음), 인간 혈청 알부민 및 그의 변이체, 트랜스페린 및 그의 변이체, Fc 또는 Fc 단편 및 그의 변이체, 및 당 (예를 들어, 시알산)을 포함한다.
폴리펩티드의 혈청 또는 혈장 "반감기"는 일반적으로, 예를 들어 천연 메카니즘에 의한 폴리펩티드의 분해 및/또는 폴리펩티드의 클리어런스 또는 제거로 인해, 폴리펩티드의 혈청 농도가 생체내에서 50%만큼 감소하는 데 소요되는 시간으로서 정의될 수 있다. 반감기는 임의의 방식 그 자체로, 예컨대 약동학적 분석에 의해 결정될 수 있다. 적합한 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 예를 들어, 일반적으로 적합한 용량의 폴리펩티드를 영장류에게 투여하는 단계; 상기 영장류로부터 규칙적 간격으로 혈액 샘플 또는 다른 샘플을 수집하는 단계; 상기 혈액 샘플 중 폴리펩티드의 수준 또는 농도를 결정하는 단계; 및 이와 같이 수득된 데이터(의 플롯)로부터, 폴리펩티드의 수준 또는 농도가 투여 시 초기 수준과 비교하여 50%만큼 감소할 때까지의 시간을 계산하는 단계를 수반할 수 있다. 반감기를 결정하는 방법, 예를 들어, 문헌 [Kenneth et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists (1986); Peters et al., Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach (1996); 및 Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, Second Rev. Edition, Marcel Dekker (1982)]에서 찾아볼 수 있다.
혈청 반감기는 파라미터 예컨대 t1/2-알파, t1/2-베타 및 곡선하 면적 (AUC)을 사용하여 표현될 수 있다. "반감기의 증가"는 이들 파라미터 중 어느 1개, 이들 파라미터 중 어느 2개, 또는 3개의 모든 이들 파라미터의 증가를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 반감기의 증가는 t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 둘 다의 증가를 동반하거나 또는 동반하지 않는 t1/2-베타 및/또는 HL_람다_z의 증가를 지칭한다.
용어 "검출가능한"은 배경 신호를 초과하는 신호를 검출하는 능력을 지칭한다. 용어 "검출가능한 신호"는 비-침습적 영상화 기술 예컨대, 비제한적으로, 양전자 방출 단층촬영 (PET)으로부터 유래된 신호이다. 검출가능한 신호는 검출가능하고 대상체로부터 생성될 수 있는 다른 배경 신호로부터 구별가능하다. 다시 말해서, 측정가능하고 통계적으로 유의한 차이 (예를 들어, 통계적으로 유의한 차이는 검출가능한 신호 및 배경 중에서 구별하는 데 충분한 차이, 예컨대 검출가능한 신호와 배경 사이의 약 0.1%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 40% 또는 그 초과의 차이임)가 검출가능한 신호와 배경 사이에 존재한다. 표준 및/또는 보정 곡선을 사용하여 검출가능한 신호 및/또는 배경의 상대 강도를 결정할 수 있다.
본원에 기재된 영상화제를 포함하는 조성물의 "검출가능한 유효량"은 임상 용도에 이용가능한 장비를 사용하여 허용되는 영상을 수득하는 데 충분한 양으로서 정의된다. 본원에 제공된 영상화제의 검출가능한 유효량은 1회 초과의 주사로 투여될 수 있다. 검출가능한 유효량은 인자 예컨대 개체의 감수성의 정도, 개체의 연령, 성별, 및 체중, 개체의 특이 반응 등에 따라 달라질 수 있다. 영상화 조성물의 검출가능한 유효량은 또한 사용된 기기 및 방법론에 따라 달라질 수 있다. 이러한 인자의 최적화는 충분히 관련 기술분야의 기술의 수준 내에 있다. 특정 실시양태에서, GPC3 영상화제, 예를 들어, 본원에 기재된 것은 2종 이상, 예를 들어, 3, 4, 5종 또는 그 초과의 구별 인자 (즉, 배경 신호에 대해 특이적인 신호)를 제공한다.
본원에 상호교환가능하게 사용된 용어 "개체", "대상체", 및 "환자"는 동물, 바람직하게는 포유동물 (비영장류 및 영장류를 포함함), 예를 들어, 인간을 지칭한다.
"암"은 신체 내의 비정상적 세포의 비제어된 성장을 특징으로 하는 다양한 질환의 광범위한 그룹을 지칭한다. 비조절된 세포 분열 및 성장 분열 및 성장은 이웃 조직을 침습하고 또한 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 원위 부분으로 전이할 수 있는 악성 종양의 형성을 일으킨다.
대상체의 "치료" 또는 "요법"은 질환과 연관된 증상, 합병증, 상태 또는 생화학적 징후의 발병, 진행, 발달, 중증도 또는 재발을 역전시키거나, 완화시키거나, 호전시키거나, 억제하거나, 저속화시키거나 또는 예방할 목적으로 대상체에 대해 수행되는 임의의 유형의 시술 또는 과정, 또는 대상체에게의 활성제의 투여를 지칭한다.
항-GPC3 애드넥틴과 관련하여 본원에 사용된 바와 같이 "투여" 또는 "투여하는"은 본원에 기재된 GPC3 애드넥틴 또는 GPC3 애드넥틴-기반 프로브 또는 표지된 프로브 (또한 "영상화제"로 지칭됨)를 대상체 내로 도입하는 것을 지칭한다. 임의의 투여 경로가 적합하고, 예컨대 정맥내, 경구, 국소, 피하, 복막, 동맥내, 흡입, 질, 직장, 비강, 뇌척수액 내로의 도입, 또는 신체 구획 내로의 점적주입이 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "공-투여" 등은 단일 환자에게 선택된 치료제를 투여하는 것을 포괄하는 것으로 의도되고, 작용제가 동일하거나 또는 상이한 투여 경로에 의해 또는 동일하거나 또는 상이한 시간에 투여되는 요법을 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "치료 유효량"은 대상체에게 치료 이익을 부여하는 데 필요한 작용제의 적어도 최소 용량이지만, 독성 용량 미만을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "유효량"은 적어도 목적하는 결과를 달성하는 데 필요한 투여량 및 기간에서 유효한 양을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "충분한 양"은 목적하는 결과를 달성하는 데 충분한 양을 지칭한다.
용어 "샘플"은 조직 샘플, 세포 샘플, 유체 샘플 등을 지칭할 수 있다. 샘플은 대상체로부터 취해질 수 있다. 조직 샘플은 모발 (뿌리를 포함함), 협측 스왑, 혈액, 타액, 정액, 근육, 또는 임의의 내부 기관으로부터의 것을 포함할 수 있다. 유체는, 비제한적으로, 소변, 혈액, 복수, 흉막액, 척수액 등일 수 있다. 신체 조직은 피부, 근육, 자궁내막, 자궁, 및 자궁경부 조직을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
개관
인간 글리피칸-3에 결합하는 신규 피브로넥틴 기반 스캐폴드 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 이러한 폴리펩티드는 다른 치료제 및 진단제에 커플링될 수 있고, 예를 들어, 치료제 및 진단제를 글리피칸-3을 발현하는 세포 및 조직 (예를 들어, 글리피칸-3을 과다-발현하는 암 세포)에 표적화하는 데 유용하다.
I. 항-GPC3 피브로넥틴 기반 스캐폴드
본원에 사용된 바와 같은 "피브로넥틴 기반 스캐폴드" 또는 "FBS" 단백질 또는 모이어티는 피브로넥틴 유형 III ("Fn3") 반복부에 기초하는 단백질 또는 모이어티를 지칭하고 주어진 표적, 예를 들어, 표적 단백질에 특이적으로 결합하도록 변형될 수 있다. Fn3은 이뮤노글로불린 (Ig) 폴드 (즉, Ig-유사 β-샌드위치 구조, 7개의 β-가닥 및 6개의 루프로 이루어짐)의 구조를 갖는 소형의 (약 10 kDa) 도메인이다. 피브로넥틴은 18개의 Fn3 반복부를 갖고, 반복부 사이의 서열 상동성 낮은 반면에, 이들은 모두 3차 구조에 있어서 높은 유사성을 공유한다. Fn3 도메인은 또한 피브로넥틴 이외의 많은 단백질, 예컨대 부착 분자, 세포 표면 분자, 예를 들어, 시토카인 수용체, 및 탄수화물 결합 도메인에 존재한다. 검토를 위해 문헌 [Bork et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(19):8990-8994 (1992); Bork et al., J. Mol. Biol., 242(4):309-320 (1994); Campbell et al., Structure, 2(5):333-337 (1994); Harpez et al., J. Mol. Biol., 238(4):528-539 (1994)]을 참조한다. 용어 "FBS" 단백질 또는 모이어티는 이들 다른 단백질 (즉, 비 피브로넥틴 분자)로부터의 Fn3 도메인에 기초하는 스캐폴드를 포함하는 것으로 의도된다.
Fn3 도메인은 소형이고, 단량체이고, 가용성이고, 안정하다. 이는 디술피드 결합이 결여되고, 따라서, 환원 조건 하에 안정하다. Fn3 도메인은, N-말단으로부터 C-말단으로의 순서로, 베타 또는 베타-유사 가닥, A; 루프, AB; 베타 또는 베타-유사 가닥, B; 루프, BC; 베타 또는 베타-유사 가닥, C; 루프, CD; 베타 또는 베타-유사 가닥, D; 루프, DE; 베타 또는 베타-유사 가닥, E; 루프, EF; 베타 또는 베타-유사 가닥, F; 루프, FG; 및 베타 또는 베타-유사 가닥, G를 포함한다. 7개의 역평행 β-가닥은 베타 또는 베타-유사 가닥을 연결하는 루프로 구성된 2개의 "면"을 생성하면서, 안정한 코어를 형성하는 2개의 베타 시트로서 배열된다. 루프 AB, CD, 및 EF는 1개의 면 ("사우스 폴")에 위치하고 루프 BC, DE, 및 FG는 대향 면 ("노스 폴")에 위치한다.
Fn3 분자의 루프는 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)과 구조적으로 유사하고, 변경된 경우에, Fn3 분자의 표적, 예를 들어, 표적 단백질에 대한 결합에 수반될 수 있다. Fn3 분자의 다른 영역, 예컨대 베타 또는 베타-유사 가닥 및 N-말단 또는 C-말단 영역은 또한, 변경된 경우에, 표적에 대한 결합에 수반될 수 있다. 루프 AB, BC, CD, DE, EF 및 FG 중 어느 것 또는 모두는 표적에 대한 결합에 참여할 수 있다. 베타 또는 베타-유사 가닥 중 어느 것은 표적에 대한 결합에 수반될 수 있다. Fn3 도메인은 또한 1개 이상의 루프 및 1개 이상의 베타 또는 베타-유사 가닥을 통해 표적에 결합할 수 있다. 결합은 또한 N-말단 또는 C-말단 영역을 필요로 할 수 있다.
항-GPC3 FBS는 1개 이상의 용매 접근가능한 루프가 무작위화되거나 또는 돌연변이된 제10 피브로넥틴 유형 III 도메인, 즉, 인간 Fn3의 제10 모듈 (10Fn3)에 기초할 수 있다. 야생형 인간 10Fn3 모이어티의 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00001
AB, CD 및 EF 루프는 밑줄로 표시되고; BC, FG, 및 DE 루프는 볼드체로 강조되고; β-가닥은 각각의 루프 영역의 사이 또는 그에 인접하여 위치하고; N-말단 영역은 이탤릭체로 제시된다. 서열식별번호: 1의 마지막 2개의 아미노산 잔기는 C-말단 영역의 부분이다. 코어 10Fn3 도메인은 아미노산 9 ("E")로 시작하고 아미노산 94 ("T")로 끝나고 86개의 아미노산 폴리펩티드에 상응한다. 코어 야생형 인간 10Fn3 도메인은 서열식별번호: 2에 제시된다. 변이체 및 야생형 10Fn3 단백질 둘 다는 동일한 구조, 즉 A 내지 G로 지정된 7개의 베타-가닥 도메인 서열 및 7개의 베타-가닥 도메인 서열을 연결하는 6개의 루프 영역 (AB 루프, BC 루프, CD 루프, DE 루프, EF 루프, 및 FG 루프)을 특징으로 한다. N- 및 C-말단에 가장 근접하게 위치하는 베타 가닥은 용액 중에서 베타-유사 입체형태를 채택할 수 있다. 서열식별번호: 1에서, AB 루프는 잔기 14-17에 상응하고, BC 루프는 잔기 23-31에 상응하고, CD 루프는 잔기 37-47에 상응하고, DE 루프는 잔기 51-56에 상응하고, EF 루프는 잔기 63-67에 상응하고, FG 루프는 잔기 76-87에 상응한다.
따라서, 특정 실시양태에서, 항-GPC3 FBS 모이어티 (예를 들어, 항-GPC3 애드넥틴)는 일반적으로 하기 축중성 서열에 의해, 또는 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 N-말단 아미노산이 결여된 서열에 의해 정의되는 10Fn3 도메인을 포함한다:
Figure pct00002
서열식별번호: 3에서, AB 루프는 (X)u에 의해 나타내어지고, BC 루프는 (X)v에 의해 나타내어지고, CD 루프는 (X)w에 의해 나타내어지고, DE 루프는 (X)x에 의해 나타내어지고, EF 루프는 (X)y에 의해 나타내어지고 FG 루프는 Xz에 의해 나타내어진다. X는 임의의 아미노산을 나타내고 X에 이어지는 아래첨자는 아미노산의 수의 정수를 나타낸다. 특히, u, v, w, x, y 및 z는 각각 독립적으로 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, 또는 6-7개의 아미노산 중 임의의 것일 수 있다. 베타 가닥의 서열 (서열식별번호: 3에 밑줄로 표시됨)은 서열식별번호: 3에 제시된 상응하는 아미노산에 비해 모든 7개의 스캐폴드 영역에 걸쳐 0 내지 10, 0 내지 8, 0 내지 6, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2, 또는 0 내지 1개의 치환, 결실 또는 부가 중 임의의 것을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 베타 가닥의 서열은 서열식별번호: 3에 제시된 상응하는 아미노산에 비해 모든 7개의 스캐폴드 영역에 걸쳐 0 내지 10, 0 내지 8, 0 내지 6, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2, 또는 0 내지 1개의 치환, 예를 들어, 보존적 치환 중 임의의 것을 가질 수 있다.
목적하는 표적에 대한 강한 친화도를 갖는 10Fn3 결합 도메인을 달성하기 위해 루프 영역 내의 모든 잔기가 변형되거나 또는 변경될 필요가 없는 것으로 이해되어야 한다. 추가적으로, 루프 영역에서의 삽입 및 결실은 또한 여전히 고친화도 항-GPC3 10Fn3 결합 도메인을 생산하면서 이루어질 수 있다. "변경된"은 주형 서열 (즉, 상응하는 야생형 인간 피브로넥틴 도메인)에 비해 1개 이상의 아미노산 서열 변경을 의미하고 아미노산 부가, 결실, 치환 또는 그의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 FBS 모이어티는 비-루프 영역이 서열식별번호: 1의 비-루프 영역과 적어도 80, 85, 90, 95, 98, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로부터 선택된 적어도 1개의 루프가 변경된 10Fn3 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, AB, BC, CD, DE, EF 및 FG로부터 선택된 1개 이상의 루프는 야생형 인간 10Fn3의 상응하는 루프에 비해 길이가 연장되거나 또는 단축될 수 있다. 임의의 주어진 폴리펩티드에서, 1개 이상의 루프는 길이가 연장될 수 있거나, 1개 이상의 루프는 길이가 감소될 수 있거나, 또는 이들이 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 주어진 루프의 길이는 2-25, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 5-25, 5-20, 5-15, 5-10, 10-25, 10-20, 또는 10-15개의 아미노산만큼 연장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 주어진 루프의 길이는 1-15, 1-11, 1-10, 1-5, 1-3, 1-2, 2-10, 또는 2-5개의 아미노산만큼 감소될 수 있다. 특히, 10Fn3의 FG 루프는 13개의 잔기 길이인 반면에, 항체 중쇄의 상응하는 루프는 4-28개의 잔기의 범위이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 10Fn3의 FG 루프의 길이는 표적 결합을 위해 FG에 의존하는 폴리펩티드에서의 가장 큰 가능한 가요성 및 표적 친화도를 수득하도록 길이뿐만 아니라 서열에서 변경될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 FBS 모이어티는 제10 피브로넥틴 유형 III (10Fn3) 도메인을 포함하며, 여기서 10Fn3 도메인은 루프, AB; 루프, BC; 루프, CD; 루프, DE; 루프 EF; 및 루프 FG를 포함하고; 인간 10Fn3 도메인의 상응하는 루프의 서열에 비해 변경된 아미노산 서열을 갖는, 루프 BC, DE, 및 FG로부터 선택된 적어도 1개의 루프를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 1 또는 2의 비-루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 10Fn3 도메인을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG로부터 선택된 적어도 1개의 루프는 변경된다. 특정 실시양태에서, BC 및 FG 루프가 변경되고, 특정 실시양태에서, BC 및 DE 루프가 변경되고, 특정 실시양태에서, DE 및 FG 루프가 변경되고, 특정 실시양태에서, BC, DE, 및 FG 루프가 변경되며, 즉, 10Fn3 도메인은 비-자연 발생 루프를 포함한다. 특정 실시양태에서, AB, CD 및/또는 EF 루프가 변경된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 특정한 스캐폴드 변경은 1개 이상의 루프 변경과 조합된다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 10Fn3의 비-리간드 결합 서열은 단 10Fn3이 리간드 결합 기능 및/또는 구조적 안정성을 유지하면서 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, 10Fn3 도메인의 비-루프 영역은 1개 이상의 보존적 치환에 의해 변형될 수 있다. 도메인은 10Fn3 내의 5%, 10%, 20% 또는 심지어 30% 또는 그 초과의 아미노산만큼, 10Fn3의 리간드에 대한 친화도를 실질적으로 변경하지 않으면서 보존적 치환에 의해 변경될 수 있다. 특정 실시양태에서, 비-루프 영역, 예를 들어, β-가닥은 0-15, 0-10, 0-8, 0-6, 0-5, 0-4, 0-3, 1-15, 1-10, 1-8, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 2-15, 2-10, 2-8, 2-6, 2-5, 2-4, 5-15, 또는 5-10개의 보존적 아미노산 치환 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 스캐폴드 변형은 10Fn3 결합제의 리간드에 대한 결합 친화도를 100-배, 50-배, 25-배, 10-배, 5-배, 또는 2-배 미만만큼 감소시킬 수 있다. 이러한 변화는 생체내에서 10Fn3의 면역원성을 변경할 수 있고, 면역원성이 감소되는 경우에, 이러한 변화는 바람직할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "보존적 치환"은 상응하는 참조 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한 잔기이다. 즉, 보존적 치환 및 그의 참조 잔기는 유사한 크기, 형상, 전기 전하, 공유 또는 수소 결합 등을 형성하는 능력을 포함하는 화학적 특성을 갖는다. 예시적인 보존적 치환은 허용되는 점 돌연변이에 대해 문헌 [Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352 (1978 and Supp.)]에 정의된 기준을 충족시키는 것을 포함한다. 보존적 치환의 예는 하기 군 내의 치환을 포함한다: (a) 발린, 글리신; (b) 글리신, 알라닌; (c) 발린, 이소류신, 류신; (d) 아스파르트산, 글루탐산; (e) 아스파라긴, 글루타민; (f) 세린, 트레오닌; (g) 리신, 아르기닌, 메티오닌; 및 (h) 페닐알라닌, 티로신.
일부 실시양태에서, Asp 7, Glu 9, 및 Asp 23 중 1개 이상은 또 다른 아미노산, 예컨대, 예를 들어, 비-음으로 하전된 아미노산 잔기 (예를 들어, Asn, Lys 등)에 의해 대체된다. 유익하거나 또는 중성인 10Fn3 스캐폴드에서의 다양한 추가의 변경이 개시되었다. 예를 들어, 문헌 [Batori et al., Protein Eng., 15(12):1015-1020 (December 2002); Koide et al., Biochemistry, 40(34):10326-10333 (Aug. 28, 2001)]을 참조한다.
다른 실시양태에서, 소수성 코어 아미노산 잔기 (상기 서열식별번호: 3 내의 볼드체로 표시된 잔기)는 고정되고, 임의의 치환, 보존적 치환, 결실 또는 부가는 10Fn3 스캐폴드 내의 소수성 코어 아미노산 잔기 이외의 잔기에서 발생한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리펩티드의 소수성 코어 잔기는 야생형 인간 10Fn3 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 1)에 비해 변형되지 않았다.
10Fn3 분자는 Fn3 도메인의 제10 및 제11 반복부 사이에 가요성 링커, 즉, EIDKPSQ (서열식별번호: 369)를 포함할 수 있다. 그의 C-말단에서 EIDKPSQ (서열식별번호: 369)를 갖는 야생형 10Fn3 폴리펩티드는 하기에 의해 나타내어진다.
Figure pct00003
일부 실시양태에서, 인테그린-결합 모티프 "아르기닌-글리신-아스파르트산" (RGD) (서열식별번호: 1의 아미노산 78-80)의 1개 이상의 잔기는 인테그린 결합을 방해하도록 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리펩티드의 FG 루프는 RGD 인테그린 결합 부위를 함유하지 않는다. 한 실시양태에서, RGD 서열은 극성 아미노산-중성 아미노산-산성 아미노산 서열 (N-말단에서 C-말단 방향으로)에 의해 대체된다. 특정 실시양태에서, RGD 서열은 SGE 또는 RGE로 대체된다.
A. 예시적인 항-GPC3 애드넥틴
일부 실시양태에서, 항-GPC3 FBS (예를 들어, 인간 GPC3에 특이적으로 결합하는 애드넥틴)의 BC 루프는 서열식별번호: 6, 19, 32, 45, 58, 71, 84 또는 99에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 임의로, BC 루프는 서열식별번호: 6, 19, 32, 45, 58, 71, 84 또는 99의 BC 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 FBS의 DE 루프는 서열식별번호: 7, 20, 33, 46, 59, 72, 85 또는 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 임의로, DE 루프는 서열식별번호: 7, 20, 33, 46, 59, 72, 85 또는 100의 DE 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 FBS의 FG 루프는 서열식별번호: 8, 21, 34, 47, 60, 73, 86, 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 또는 318에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 임의로, FG 루프는 서열식별번호: 8, 21, 34, 47, 60, 73, 86, 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 또는 318의 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴 (즉, 인간 GPC3에 특이적으로 결합하는 애드넥틴)의 BC 루프는 서열식별번호: 6, 19, 32, 45, 58, 71, 84 또는 99에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 임의로, BC 루프는 서열식별번호: 6, 19, 32, 45, 58, 71, 84 또는 99의 BC 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하고; 항-GPC3 애드넥틴의 DE 루프는 서열식별번호: 7, 20, 33, 46, 59, 72, 85 또는 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 임의로, DE 루프는 서열식별번호: 7, 20, 33, 46, 59, 72, 85 또는 100의 DE 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하고; 항-GPC3 FBS의 FG 루프는 서열식별번호: 8, 21, 34, 47, 60, 73, 86, 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 또는 318에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 임의로, FG 루프는 서열식별번호: 8, 21, 34, 47, 60, 73, 86, 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 또는 318의 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 FBS는 서열식별번호: 6, 19, 32, 45, 58, 71, 84 또는 99에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 BC 루프; 서열식별번호: 7, 20, 33, 46, 59, 72, 85 또는 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DE 루프; 및 서열식별번호: 8, 21, 34, 47, 60, 73, 86, 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 또는 318에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 FG 루프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 FBS는 각각 서열식별번호: 6, 19, 32, 45, 58, 71, 84 또는 99; 7, 20, 33, 46, 59, 72, 85 또는 100; 및 8, 21, 34, 47, 60, 73, 86, 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 또는 318에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하고, FBS가 GPC3에 대한 결합을 유지하도록 하는, BC, DE, 및 FG 루프에서의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 FBS는 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, FG 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴 (예를 들어, 인간 10Fn3을 포함하는 항-FBS 모이어티)은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, FG 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 32, 33 및 34에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 32, 33 및 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, FG 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 45, 46 및 47에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 45, 46 및 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, FG 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 45, 46 및 47의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 58, 59 및 60에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 58, 59 및 60에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, FG 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 58, 59 및 60의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 71, 72 및 73에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 71, 72 및 73에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, FG 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 71, 72 및 73의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 84, 85 및 86에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 84, 85 및 86에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, FG 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 84, 85 및 86의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 99, 100 및 101에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 99, 100 및 101에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, FG 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 99, 100 및 101의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 99, 100 및 129에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 서열식별번호: 99, 100 및 129의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 99, 100 및 156에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 서열식별번호: 99, 100 및 156의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 99, 100 및 183에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 서열식별번호: 99, 100 및 183의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 99, 100 및 210에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 서열식별번호: 99, 100 및 210의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 99, 100 및 237에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 서열식별번호: 99, 100 및 237의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 99, 100 및 264에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 서열식별번호: 99, 100 및 264의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 99, 100 및 291에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 서열식별번호: 99, 100 및 291의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 BC, DE, 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 99, 100 및 318에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 BC 루프는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖고, DE 루프는 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 서열식별번호: 99, 100 및 318의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함한다.
이러한 항-GPC3 애드넥틴의 스캐폴드 영역은 서열식별번호: 3의 스캐폴드 아미노산 잔기에 비해 0 내지 20, 0 내지 15, 0 내지 10, 0 내지 8, 0 내지 6, 0 내지 5, 0 내지 4, 0 내지 3, 0 내지 2, 또는 0 내지 1개의 치환, 보존적 치환, 결실 또는 부가 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 이러한 스캐폴드 변형은 항-GPC3 애드넥틴이 목적하는 KD로 GPC3에 결합할 수 있는 한 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 본원에 개시된 항-GPC3 애드넥틴의 아미노산 서열, 예를 들어, 서열식별번호: 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 및 98 중 어느 하나를 갖는 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 5, 9-18, 22-31, 35-44, 48-57, 61-70, 74-83, 87-98, 102-128, 130-155, 157-182, 184-209, 211-236, 238-263, 265-290, 292-317 및 319-343 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 6, 7, 및 8에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프; 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프; 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 32, 33 및 34에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프; 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 45, 46 및 47에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프; 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 58, 59 및 60에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 71, 72 및 73에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 84, 85 및 86에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 99, 100 및 101에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 99, 100 및 129에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 99, 100 및 129에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 99, 100 및 156에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 99, 100 및 183에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 99, 100 및 210에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 99, 100 및 237에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 99, 100 및 264에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 99, 100 및 291에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 99, 100 및 318에 제시된 바와 같은 BC, DE, 및 FG 루프 및 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 또는 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83, 98, 128, 155, 182, 209, 209, 236, 263, 290 및 317로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 PmXn, PmCXn 및 PmCXn1CXn2로 이루어진 군으로부터 선택된 C-말단 모이어티를 추가로 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산이고 m, n, n1 및 n2는 독립적으로 0 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과의 정수이다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 5, 9-18, 22-31, 35-44, 48-57, 61-70, 74-83, 87-98, 102-128, 130-155, 157-182, 184-209, 211-236, 238-263, 265-290, 292-317 및 319-343으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 98, 102-128, 129-155, 157-182, 184-209, 211-236, 238-263, 265-290, 292-317 및 319-343으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 임의로 C-말단에서 1개 이상의 히스티딘 (예를 들어, 6xHis)을 갖는다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 102-127로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 114-118을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 서열식별번호: 123-127을 포함한다.
인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 폴리펩티드가 본원에 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 ADX_6077_A01의 BC, DE 및 FG 루프, 즉, 서열식별번호: 99, 100 및 101을 포함하는 10Fn3 도메인을 포함한다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 폴리펩티드가 본원에 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 서열식별번호: 99를 포함하는 BC 루프, 서열식별번호: 100을 포함하는 DE 루프 및 서열식별번호: 101을 포함하는 FG 루프를 포함하는 10Fn3 도메인을 포함한다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 폴리펩티드가 또한 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 서열식별번호: 99를 포함하는 BC 루프, 서열식별번호: 100을 포함하는 DE 루프 및 서열식별번호: 101을 포함하는 FG 루프를 포함하는 10Fn3 도메인을 포함하고, 여기서 FG 루프 내의 2개의 아미노산 잔기 DG 중 1개는 또 다른 아미노산으로 치환된다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 폴리펩티드가 또한 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 서열식별번호: 99를 포함하는 BC 루프, 서열식별번호: 100을 포함하는 DE 루프 및 서열식별번호: 101을 포함하는 FG 루프를 포함하는 10Fn3 도메인을 포함하고, 여기서 FG 루프 내의 DG의 아미노산 잔기 D (즉, D78; 넘버링은 서열식별번호: 102의 것을 기준으로 함)는 또 다른 아미노산, 예를 들어, E, S, A, 및 G로 치환된다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 폴리펩티드가 또한 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 서열식별번호: 99를 포함하는 BC 루프, 서열식별번호: 100을 포함하는 DE 루프 및 서열식별번호: 101을 포함하는 FG 루프를 포함하는 10Fn3 도메인을 포함하고, 여기서 FG 루프 내의 DG의 아미노산 잔기 G (즉, D79)는 또 다른 아미노산 잔기, 예를 들어, S, A, L 또는 V로 치환된다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 폴리펩티드가 또한 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 서열식별번호: 99를 포함하는 BC 루프, 서열식별번호: 100을 포함하는 DE 루프 및 서열식별번호: 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 또는 318을 포함하는 FG 루프를 포함하는 10Fn3 도메인을 포함한다. 본 단락에 기재된 폴리펩티드 중 어느 것은 폴리펩티드의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된 시스테인 잔기를 포함할 수 있고/거나 폴리펩티드의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된 하기 아미노산 잔기 또는 서열 중 1개를 포함할 수 있다: P, PC, PCHHHHHH (서열식별번호: 395), PCPPPPPC (서열식별번호: 416) 또는 PCPPPPPCHHHHHH (서열식별번호: 424).
인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 ADX_6077_A01 코어 서열, 즉, 서열식별번호: 98, 또는 그와 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 또는 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 또는 1개의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 결실 또는 부가에 있어서 그와 상이한 아미노산 서열을 포함하는 10Fn3 도메인을 포함한다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 ADX_6077_A01 코어 서열, 즉, 서열식별번호: 98, 또는 그와 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 또는 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 또는 1개의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 결실 또는 부가에 있어서 그와 상이한 아미노산 서열을 포함하는 10Fn3 도메인을 포함하고, 10Fn3 도메인은 서열식별번호: 99를 포함하는 BC 루프, 서열식별번호: 100을 포함하는 DE 루프 및 서열식별번호: 101, 또는 DG의 1개의 아미노산에서 그와 상이한 것을 포함하는 FG 루프를 포함한다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 폴리펩티드가 또한 제공되며, 여기서 폴리펩티드 서열식별번호: 98, 또는 그와 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 또는 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 또는 1개의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 결실 또는 부가에 있어서 그와 상이한 아미노산 서열을 포함하는 10Fn3 도메인을 포함하고, 10Fn3 도메인은 서열식별번호: 99를 포함하는 BC 루프, 서열식별번호: 100을 포함하는 DE 루프 및 서열식별번호: 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 또는 318을 포함하는 FG 루프를 포함한다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 ADX_6077_A01 코어 서열, 즉, 서열식별번호: 98, 또는 그와 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 또는 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 또는 1개의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 결실 또는 부가에 있어서 그와 상이한 아미노산 서열을 포함하는 10Fn3 도메인을 포함하고, 폴리펩티드의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된 시스테인 잔기를 추가로 포함한다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 폴리펩티드는 ADX_6077_A01 코어 서열, 즉, 서열식별번호: 98, 또는 그와 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 또는 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 또는 1개의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 결실 또는 부가에 있어서 그와 상이한 아미노산 서열을 포함하는 10Fn3 도메인을 포함하고, 폴리펩티드의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된 하기 아미노산 잔기 또는 서열 중 1개를 추가로 포함한다: P, PC, PCHHHHHH (서열식별번호: 395), PCPPPPPC (서열식별번호: 416) 또는 PCPPPPPCHHHHHH (서열식별번호: 424).
ADX_6077_A01 또는 ADX_6912_G02의 아미노산 서열 (N-말단 메티오닌을 포함하거나 또는 포함하지 않음)을 포함하며 6xHis 꼬리를 포함하거나 또는 포함하지 않는 폴리펩티드가 본원에 제공된다.
인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하고, ADX_6077_A01의 BC, DE 및 FG 루프, 즉, 서열식별번호: 99, 100 및 101을 포함하는 10Fn3 단백질이 또한 본원에 제공된다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하고, 서열식별번호: 99를 포함하는 BC 루프, 서열식별번호: 100을 포함하는 DE 루프 및 서열식별번호: 101을 포함하는 FG 루프를 포함하는 10Fn3 단백질이 본원에 제공된다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하고, 서열식별번호: 99를 포함하는 BC 루프, 서열식별번호: 100을 포함하는 DE 루프 및 서열식별번호: 101을 포함하는 FG 루프를 포함하는 10Fn3 단백질이 또한 제공되며, 여기서 FG 루프 내의 2개의 아미노산 잔기 DG 중 1개는 또 다른 아미노산으로 치환된다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하고, 서열식별번호: 99를 포함하는 BC 루프, 서열식별번호: 100을 포함하는 DE 루프 및 서열식별번호: 101을 포함하는 FG 루프를 포함하는 10Fn3 단백질이 또한 제공되며, 여기서 FG 루프 내의 DG의 아미노산 잔기 D (즉, D78; 넘버링은 서열식별번호: 102의 것을 기준으로 함)는 또 다른 아미노산, 예를 들어, E, S, A, 및 G로 치환된다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하고, 서열식별번호: 99를 포함하는 BC 루프, 서열식별번호: 100을 포함하는 DE 루프 및 서열식별번호: 101을 포함하는 FG 루프를 포함하는 10Fn3 단백질이 또한 제공되며, 여기서 FG 루프 내의 DG의 아미노산 잔기 G (즉, D79)는 또 다른 아미노산 잔기, 예를 들어, S, A, L 또는 V로 치환된다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하고, 서열식별번호: 99를 포함하는 BC 루프, 서열식별번호: 100을 포함하는 DE 루프 및 서열식별번호: 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 또는 318을 포함하는 FG 루프를 포함하는 10Fn3 단백질이 또한 제공된다. 본 단락에 기재된 10Fn3 단백질 중 어느 것은 그의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된 시스테인 잔기를 포함할 수 있고/거나 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된 하기 아미노산 잔기 또는 서열 중 1개를 포함할 수 있다: P, PC, PCHHHHHH (서열식별번호: 395), PCPPPPPC (서열식별번호: 416) 또는 PCPPPPPCHHHHHH (서열식별번호: 424).
인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하고, ADX_6077_A01 코어 서열, 즉, 서열식별번호: 98, 또는 그와 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 또는 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 또는 1개의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 결실 또는 부가에 있어서 그와 상이한 아미노산 서열을 포함하는 10Fn3 단백질이 또한 제공된다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하고, ADX_6077_A01 코어 서열, 즉, 서열식별번호: 98, 또는 그와 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 또는 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 또는 1개의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 결실 또는 부가에 있어서 그와 상이한 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 99를 포함하는 BC 루프, 서열식별번호: 100을 포함하는 DE 루프 및 서열식별번호: 101, 또는 DG의 1개의 아미노산에서 그와 상이한 것을 포함하는 FG 루프를 포함하는 10Fn3 단백질이 또한 제공된다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하고, 서열식별번호: 98, 또는 그와 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 또는 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 또는 1개의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 결실 또는 부가에 있어서 그와 상이한 아미노산 서열을 포함하고, 서열식별번호: 99를 포함하는 BC 루프, 서열식별번호: 100을 포함하는 DE 루프 및 서열식별번호: 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 또는 318을 포함하는 FG 루프를 포함하는 10Fn3 단백질이 또한 제공된다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하고, ADX_6077_A01 코어 서열, 즉, 서열식별번호: 98, 또는 그와 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 또는 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 또는 1개의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 결실 또는 부가에 있어서 그와 상이한 아미노산 서열을 포함하는 10Fn3 도메인을 포함하고, 그의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된 시스테인 잔기를 추가로 포함하는 10Fn3 단백질이 또한 제공된다. 인간 GPC3에 10-7 이하의 KD로 특이적으로 결합하고, ADX_6077_A01 코어 서열, 즉, 서열식별번호: 98, 또는 그와 적어도 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 또는 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 또는 1개의 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환), 결실 또는 부가에 있어서 그와 상이한 아미노산 서열을 포함하는 10Fn3 도메인을 포함하고, 그의 C-말단에 직접 또는 간접적으로 연결된 하기 아미노산 잔기 또는 서열 중 1개를 추가로 포함하는 10Fn3 단백질이 또한 제공된다: P, PC, PCHHHHHH (서열식별번호: 395), PCPPPPPC (서열식별번호: 416) 또는 PCPPPPPCHHHHHH (서열식별번호: 424).
ADX_6077_A01 또는 ADX_6912_G02의 아미노산 서열 (N-말단 메티오닌을 포함하거나 또는 포함하지 않음)을 포함하며 6xHis 꼬리를 포함하거나 또는 포함하지 않는 10Fn3 단백질이 본원에 제공된다.
약물 모이어티, 예컨대 튜부리신 유사체에 접합된, 상기 단락에 기재된 폴리펩티드 또는 10Fn3 단백질 중 1종을 포함하는 약물 접합체가 또한 제공된다
그의 C-말단에 1개 이상의 시스테인을 포함하는 서열을 포함하는 10Fn3 도메인을 포함하는 10Fn3 단백질 또는 폴리펩티드가 추가로 제공되며, 여기서 적어도 1개의 시스테인은 본원에 기재된 튜부리신 유사체에 접합된다. 예를 들어, 10Fn3 도메인을 포함하는 10Fn3 단백질 또는 폴리펩티드는 아미노산 서열 PmCn을 포함하는 펩티드에 연결될 수 있으며, 여기서 m 및 n은 독립적인 1 이상의 정수이고 1개 이상의 시스테인은 본원에 기재된 튜부리신 유사체에 접합된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴 (예를 들어, 서열식별번호: 5, 9-18, 22-31, 35-44, 48-57, 61-70, 74-83, 87-98, 102-128, 130-155, 157-182, 184-209, 211-236, 238-263, 265-290, 292-317 및 319-343) 중 어느 하나의 BC, DE 및/또는 FG 루프 아미노산 서열은 비-10Fn3 도메인 단백질 스캐폴드 내로 그라프팅된다. 예를 들어, 1개 이상의 루프 아미노산 서열은 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 그의 단편의 1개 이상의 CDR 루프로 교환되거나 또는 그 내로 삽입된다. 다른 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 루프 서열이 교환되거나 또는 삽입된 단백질 도메인은 컨센서스 Fn3 도메인 (센토코르(Centocor), 미국), 안키린 반복 단백질 (몰레큘라 파트너스 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히), 도메인 항체 (도만티스, 리미티드(Domantis, Ltd), 매사추세츠주 캠브리지), 단일 도메인 낙타류 나노바디 (아블링스(Ablynx), 벨기에), 리포칼린 (예를 들어, 안티칼린; 피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이징), 아비머 (암젠(Amgen), 캘리포니아주), 아피바디 (아피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴), 유비퀴틴 (예를 들어, 아필린; 실 프로테인스 게엠베하(Scil Proteins GmbH), 독일 할레), 단백질 에피토프 모방체 (폴리포르 리미티드(Polyphor Ltd), 스위스 알슈빌), 나선형 다발 스캐폴드 (예를 들어 알파바디, 콤플릭스(Complix), 벨기에), Fyn SH3 도메인 (코바겐 아게(Covagen AG), 스위스), 또는 아트리머 (아나포르, 인크.(Anaphor, Inc.), 캘리포니아주)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
B. 교차-경쟁 항-GPC3 애드넥틴
인간 GPC3에 대한 결합에 대해 본원에 기재된 특정한 항-GPC3 애드넥틴과 경쟁 (예를 들어, 교차-경쟁)하는 애드넥틴이 또한 제공된다. 이러한 경쟁 애드넥틴은 표준 GPC3 결합 검정에서 본원의 기재된 애드넥틴의 GPC3에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 그의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 재조합 GPC3 단백질을 플레이트 상에 고정시키고, 애드넥틴 중 하나를 형광 표지하고 표지된 애드넥틴의 결합과 경쟁하는 비-표지된 애드넥틴의 능력을 평가하는 표준 ELISA 검정이 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 경쟁적 ELISA 포맷은 2종의 항-GPC3 애드넥틴이 GPC3 상의 중첩되는 애드넥틴 결합 부위에 결합하는지 여부를 결정하는 데 수행될 수 있다. 한 포맷에서, 애드넥틴 #1을 플레이트 상에 코팅하고, 이어서 차단하고 세척한다. 이 플레이트에 GPC3 단독, 또는 포화 농도의 애드넥틴 #2와 함께 사전-인큐베이션된 GPC3을 첨가한다. 적합한 인큐베이션 기간 후, 플레이트를 세척하고 항-GPC3 항체, 예컨대 비오티닐화 항-GPC3 폴리클로날 항체로 프로빙하고, 이어서 스트렙타비딘-HRP 접합체 및 표준 테트라메틸벤지딘 발색 절차를 사용하여 검출한다. OD 신호가 애드넥틴 #2와의 사전인큐베이션의 존재 또는 부재 하에 동일한 경우에, 2종의 애드넥틴은 서로 독립적으로 결합하고, 그의 애드넥틴 결합 부위는 중첩되지 않는다. 그러나, GPC3/애드넥틴#2 혼합물을 받은 웰에 대한 OD 신호가 GPC3 단독을 받은 것보다 더 낮은 경우에, 애드넥틴 #2의 결합은 애드넥틴 #1의 GPC3에 대한 결합을 차단하는 것으로 확인된다.
대안적으로, 유사한 실험이 표면 플라즈몬 공명 (SPR, 예를 들어, 비아코어)에 의해 수행된다. 애드넥틴 #1을 SPR 칩 표면 상에 고정시키고, 이어서 GPC3 단독 또는 포화 농도의 애드넥틴 #2와 함께 사전-인큐베이션된 GPC3을 주사한다. GPC3/애드넥틴#2 혼합물에 대한 결합 신호가 GPC3 단독의 것과 동일하거나 또는 그보다 더 높은 경우에, 2종의 애드넥틴은 서로 독립적으로 결합하고, 그의 애드넥틴 결합 부위는 중첩되지 않는다. 그러나, GPC3/애드넥틴#2 혼합물에 대한 결합 신호가 GPC3 단독의 결합 신호보다 더 낮은 경우에, 애드넥틴 #2의 결합은 애드넥틴 #1의 GPC3에 대한 결합을 차단하는 것으로 확인된다. 이들 실험의 특색은 포화 농도의 애드넥틴 #2의 사용이다. GPC3이 애드넥틴 #2로 포화되지 않은 경우에, 상기 결론은 유지되지 않는다. 유사한 실험을 사용하여 임의의 2종의 GPC3 결합 단백질이 중첩되는 애드넥틴 결합 부위에 결합하는지 여부를 결정할 수 있다.
상기 예시된 검정 둘 다는 또한 애드넥틴#2를 고정시키고 GPC3-애드넥틴#1을 플레이트에 첨가하는 역순으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 애드넥틴 #1 및/또는 #2는 모노클로날 항체 및/또는 가용성 수용체-Fc 융합 단백질로 대체될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 경쟁은 HTRF 샌드위치 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
후보 경쟁 항-GPC3 애드넥틴은 본원의 기재된 항-GPC3 애드넥틴의 GPC3에 대한 결합을 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%만큼 억제할 수 있고/거나 그의 결합은 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%만큼 억제된다. % 경쟁은 상기 기재된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴과 경쟁하는 분자는 애드넥틴일 필요는 없지만, GPC3에 결합하는 임의의 유형의 분자, 예컨대, 비제한적으로, 항체, 소분자, 펩티드 등일 수 있다.
특정 실시양태에서, 애드넥틴은 본원에 기재된 특정한 항-GPC3 애드넥틴과 GPC3 상의 동일한 애드넥틴 결합 부위에 결합한다. 표준 맵핑 기술, 예컨대 프로테아제 맵핑, 돌연변이 분석, HDX-MS, X선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 사용하여 애드넥틴이 참조 애드넥틴과 동일한 애드넥틴 결합 부위에 결합하는지 여부를 결정할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)] 참조).
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-GPC3 애드넥틴은 인간 GPC3 상의 불연속 애드넥틴 결합 부위에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-GPC3 FBS는, 예를 들어, 서열식별번호: 345를 포함하는 인간 GPC3 (서열식별번호: 344) 내의 10-20개의 아미노산 잔기의 영역에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은, 예를 들어, 서열식별번호: 346을 포함하는 인간 GPC3 (서열식별번호: 344) 내의 10-20개의 아미노산 잔기의 영역에 결합한다. 다른 실시양태에서, 항-GPC3 FBS는, 예를 들어, 각각 1개는 서열식별번호: 345를 포함하고 다른 영역은 서열식별번호: 346을 포함하는 인간 GPC3 (서열식별번호: 344) 내의 10-20개의 아미노산 잔기의 2개의 영역에 결합한다.
C. N-말단 및 C-말단 변형된 항-GPC3 애드넥틴
일부 실시양태에서, 애드넥틴의 N-말단 및/또는 C-말단 영역의 아미노산 서열은, 예를 들어, 서열식별번호: 1을 포함하는 10Fn3 도메인의 상응하는 영역의 아미노산 서열에 비해 결실, 치환 또는 삽입에 의해 변형된다.
특정 실시양태에서, 예를 들어, 예를 들어, 서열식별번호: 1에서와 같이 "VSD"로 시작하는 서열을 갖는 애드넥틴의 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 잔기의 아미노산 서열은 본원에 제공된 폴리펩티드에서 변형되거나 또는 결실될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 예를 들어, 서열식별번호: 1에서와 같이 "VSD"로 시작하는 서열을 갖는 애드넥틴의 아미노산 1-7, 8 또는 9에 상응하는 아미노산은 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 또는 1개의 아미노산 길이를 갖는 대안적 N-말단 영역으로 대체된다.
GPC3 애드넥틴 코어 서열 또는 "VSD"로 시작하는 것에 부가될 수 있는 예시적인 대안적 N-말단 영역은 (단일 문자 아미노산 코드에 의해 나타내어짐) M, MG, G, MGVSDVPRD (서열식별번호: 351) 및 GVSDVPRD (서열식별번호: 352)를 포함한다. 다른 적합한 대안적 N-말단 영역은, 예를 들어, XnSDVPRDL (서열식별번호: 353), XnDVPRDL (서열식별번호: 354), XnVPRDL (서열식별번호: 355), XnPRDL (서열식별번호: 356), XnRDL (서열식별번호: 357), XnDL (서열식별번호: 358), 또는 XnL을 포함하며, 여기서 n = 0, 1 또는 2개의 아미노산이고, 여기서 n = 1인 경우에, X는 Met 또는 Gly이고, n = 2인 경우에, X는 Met-Gly이다. Met-Gly 서열이 10Fn3 도메인의 N-말단에 부가된 경우에, M은 통상적으로 절단 제거되어, G를 N-말단에 남길 것이다. 다른 실시양태에서, 대안적 N-말단 영역은 아미노산 서열 MASTSG (서열식별번호: 359)를 포함한다. 특정 실시양태에서, N-말단 연장은 M, MG, 및 G로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 또는 1개의 아미노산 길이를 갖는 대안적 C-말단 영역은, 예를 들어, 서열식별번호: 1에서와 같이 "RT"로 끝나는 GPC3 애드넥틴의 C-말단 영역에 부가될 수 있다. 대안적 C-말단 영역 서열의 예는, 예를 들어, EIEK (서열식별번호: 360), EGSGC (서열식별번호: 361), EIEKPCQ (서열식별번호: 362), EIEKPSQ (서열식별번호: 363), EIEKP (서열식별번호: 364), EIEKPS (서열식별번호: 365), EIEKPC (서열식별번호: 366), EIDK (서열식별번호: 367), EIDKPCQ (서열식별번호: 368) 또는 EIDKPSQ (서열식별번호: 369)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, C-말단 영역은 EIDKPCQ (서열식별번호: 368)로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 10Fn3 도메인은 E 및 D 잔기를 포함하고, 8 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 5 내지 10, 및 2 내지 4개의 아미노산 길이일 수 있는 C-말단 연장 서열에 연결된다. 일부 실시양태에서, 꼬리 서열은 서열이 ED의 탠덤 반복부를 포함하는 ED-기반 링커를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 꼬리 서열은 2-10, 2-7, 2-5, 3-10, 3-7, 3-5, 3, 4 또는 5개의 ED 반복부를 포함한다. 특정 실시양태에서, ED-기반 꼬리 서열은 또한 추가의 아미노산 잔기, 예컨대, 예를 들어: EI, EID, ES, EC, EGS, 및 EGC를 포함할 수 있다. 이러한 서열은, 부분적으로, 기지의 애드넥틴 꼬리 서열, 예컨대 EIDKPSQ (서열식별번호: 369)에 기초하고, 여기서 잔기 D 및 K는 제거되었다. 일부 실시양태에서, ED-기반 꼬리는 ED 반복부 앞에 E, I 또는 E1 잔기를 포함한다.
특정 실시양태에서, N- 또는 C-말단 연장 서열은 기지의 링커 서열 (예를 들어, 표 13의 서열식별번호: 426-451)을 갖는 10Fn3 도메인에 연결된다. 일부 실시양태에서, 서열은 10Fn3 도메인의 C-말단에 위치하여 약동학적 모이어티의 부착을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 함유 링커 예컨대 GSGC는 C-말단에 부가되어 시스테인 잔기에 대한 부위 지정 PEG화를 용이하게 할 수 있다.
특정 실시양태에서, GPC3 애드넥틴의 C-말단 아미노산 RT (즉, 예를 들어, 서열식별번호: 1에서와 같은 아미노산 94)에 연결될 수 있는 대안적 C-말단 모이어티는 아미노산 PmXn을 포함하며, 여기서 P는 프롤린이고, X는 임의의 아미노산이고, m은 적어도 1인 정수이고 n은 0 또는 적어도 1인 정수이다. 일부 실시양태에서, m은 1, 2, 3 또는 그 초과일 수 있다. 예를 들어, m은 1-3일 수 있거나 또는 m은 1-2일 수 있다. "n"은 0, 1, 2, 3 또는 그 초과일 수 있고, 예를 들어, n은 1-3 또는 1-2일 수 있다.
PmXn 모이어티는 10Fn3 모이어티의 C-말단 아미노산, 예를 들어, 그의 94번째 아미노산 (서열식별번호: 1의 아미노산 넘버링에 기초함)에 직접 연결될 수 있다. PmXn 모이어티는 펩티드 결합을 통해 10Fn3 모이어티의 94번째 아미노산에 연결될 수 있다. 서열식별번호: 1의 말단에서의 단일 프롤린 잔기는 "95Pro" 또는 "Pro95" 또는 "P95" 또는 "95P"로 지칭된다.
특정 실시양태에서, n은 0이 아니고, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과일 수 있다. 예를 들어, n은 0-10, 0-5, 0-3, 1-10, 1-5, 1-3 또는 1-2일 수 있다. 그러나, 10개 초과의 아미노산은 프롤린에 연결될 수 있다. 예를 들어, 탠덤 FBS 모이어티 또는 또 다른 폴리펩티드에 융합된 FBS 모이어티에서, FBS 모이어티의 C-말단 아미노산은 1개 이상의 프롤린에 연결될 수 있고, 마지막 프롤린은 제2 FBS 모이어티 또는 이종 모이어티에 연결된다. 따라서, 특정 실시양태에서, n은 0-100, 0-200, 0-300, 0-400, 0-500 또는 그 초과 범위의 정수일 수 있다.
특정 실시양태에서, GPC3 애드넥틴의 C-말단에 연결된 PmXn은 시스테인을 포함한다. 예를 들어, 프롤린 다음의 첫번째 아미노산은 시스테인일 수 있고, 시스테인은 분자 내의 마지막 아미노산일 수 있거나 또는 시스테인에 이어 1개 이상의 아미노산이 이어질 수 있다. 시스테인의 존재는 이종 모이어티의 FBS 모이어티, 예를 들어, 화학적 모이어티, 예를 들어, PEG에 대한 접합을 허용한다. 시스테인을 포함하는 예시적인 PmXn 모이어티는 PmCXn을 포함하며, 여기서 C는 시스테인이고, 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산이고, m은 적어도 1인 정수이고 n은 0 또는 적어도 1인 정수이다. 일부 실시양태에서, m은 1, 2, 3 또는 그 초과일 수 있다. 예를 들어, m은 1-3일 수 있거나 또는 m은 1-2일 수 있다. "n"은 0, 1, 2, 3 또는 그 초과일 수 있고, 예를 들어, n은 1-3 또는 1-2일 수 있다. 다른 예시적인 PmXn 모이어티는 2개의 시스테인, 예를 들어, PmCXn1CXn2를 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산이고, n1 및 n2는 독립적으로 0 또는 적어도 1인 정수이다. 예를 들어, n1은 1, 2, 3, 4 또는 5일 수 있고 n2는 1, 2, 3, 4 또는 5일 수 있다. 예시적인 PmXn 모이어티는 표 1에 열거된 것을 포함한다.
표 1: 예시적인 PmXn 모이어티
Figure pct00004
특정 실시양태에서, 예를 들어, PmXn 모이어티는 PC, PPC 및 PCC로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, PmXn 모이어티는 PmCXn1CXn2이다. 특정 실시양태에서, PmCXn1CXn2는 PCPPPC (서열식별번호: 415) 및 PCPPPPPC (서열식별번호: 416)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기재된 C-말단 변형 중 어느 것은 GPC3 애드넥틴에 적용될 수 있다.
PmXn 모이어티 중 어느 것, 예를 들어, 표 1에 제시된 것에 히스티딘 꼬리, 예를 들어, 6xHis 태그, 또는 다른 태그가 이어질 수 있다. 이는 PmXn에 히스티딘 꼬리가 포함될 수 있는 것을 배제하지 않는다.
특정 실시양태에서, 피브로넥틴 기반 스캐폴드 단백질은 대안적 N-말단 영역 서열 및 대안적 C-말단 영역 서열 둘 다, 및 임의로 6X his 꼬리를 갖는 10Fn3 도메인을 포함한다.
II. 다가 폴리펩티드
특정 실시양태에서, 단백질은 GPC3 FBS 및 적어도 1종의 다른 FBS를 포함한다. 다가 FBS는 공유 회합된 2, 3종 또는 그 초과의 FBS를 포함할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, FBS 모이어티는 2종의 10Fn3 도메인을 포함하는 이중특이적 또는 이량체 단백질이다.
다가 단백질의 FBS 모이어티, 예를 들어, 10Fn3 도메인은 폴리펩티드 링커에 의해 연결될 수 있다. 예시적인 폴리펩티드 링커는 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 또는 1-2개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 10Fn3 도메인을 연결하는 데 적합한 링커는 별개의 도메인이 서로 독립적으로 폴딩되어 표적 분자에 대한 고친화도 결합을 가능하게 하는 3차원 구조를 형성하도록 허용하는 것이다. 적합한 링커의 구체적 예는 글리신-세린 기반 링커, 글리신-프롤린 기반 링커, 프롤린-알라닌 기반 링커뿐만 아니라 본원에 기재된 임의의 다른 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신-프롤린 기반 링커이다. 이들 링커는 글리신 및 프롤린 잔기를 포함하고 3 내지 30, 10 내지 30, 및 3 내지 20개의 아미노산 길이일 수 있다. 이러한 링커의 예는 GPG, GPGPGPG (서열식별번호: 436) 및 GPGPGPGPGPG (서열식별번호: 437)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 프롤린-알라닌 기반 링커이다. 이들 링커는 프롤린 및 알라닌 잔기를 포함하고 3 내지 30, 10 내지 30, 3 내지 20 및 6 내지 18개의 아미노산 길이일 수 있다. 이러한 링커의 예는 PAPAPA (서열식별번호: 438), PAPAPAPAPAPA (서열식별번호: 439) 및 PAPAPAPAPAPAPAPAPA (서열식별번호: 440)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신-세린 기반 링커이다. 이들 링커는 글리신 및 세린 잔기를 포함하고 8 내지 50, 10 내지 30, 및 10 내지 20개의 아미노산 길이일 수 있다. 이러한 링커의 예는, 예를 들어, (GS)5-10 (서열식별번호: 464), (G4S)2-5 (서열식별번호: 465), 및 (G4S)2G (서열식별번호: 466)를 함유할 수 있다. 이러한 링커의 예는 서열식별번호: 427-439를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 링커는 어떠한 Asp-Lys (DK) 쌍도 함유하지 않는다.
III. 약동학적 모이어티
치료 목적을 위해, 본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴은 약동학적 (PK) 모이어티에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 개선된 약동학은 인지되는 치료적 필요에 따라 평가될 수 있다. 가능하게는 단백질이 투여 후 혈청에서 이용가능하게 유지되는 시간을 증가시킴으로써 생체이용률을 증가시키고/거나 용량 사이의 시간을 증가시키는 것이 종종 바람직하다. 일부 경우에, 시간 경과에 따른 단백질의 혈청 농도의 지속성을 개선시키는 (예를 들어, 투여 직후 및 다음 투여 직전의 단백질의 혈청 농도의 차이를 감소시키는) 것이 바람직하다. 항-GPC3 애드넥틴은 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트 또는 인간)에서의 폴리펩티드의 클리어런스율을 비변형된 항-GPC3 애드넥틴에 비해 2-배 초과, 3-배 초과, 4-배 초과 또는 5-배 초과만큼 감소시키는 모이어티에 부착될 수 있다. 개선된 약동학의 다른 척도는 종종 알파 단계 및 베타 단계로 나누어지는 혈청 반감기를 포함할 수 있다. 단계 중 어느 하나 또는 둘 다는 적절한 모이어티의 부가에 의해 유의하게 개선될 수 있다. 예를 들어, PK 모이어티는 폴리펩티드의 혈청 반감기를 Fn3 도메인 단독에 비해 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 400, 600, 800, 1000% 또는 그 초과만큼 증가시킬 수 있다.
본원에 "PK 모이어티"로 지칭되는, 혈액으로부터의 단백질의 클리어런스를 저속화시키는 모이어티는 폴리옥시알킬렌 모이어티 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜), 당 (예를 들어, 시알산), 및 널리-허용되는 단백질 모이어티 (예를 들어, Fc 및 그의 단편 및 변이체, 트랜스페린, 또는 혈청 알부민)를 포함한다. 항-GPC3 애드넥틴은 또한 미국 공개 번호 2007/0048282에 기재된 바와 같은 알부민 또는 알부민의 단편 (부분) 또는 변이체에 융합될 수 있거나, 또는 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 애드넥틴 결합 혈청 알부민에 융합될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 다른 PK 모이어티는 본원에 참조로 포함된 문헌 [Kontermann et al., (Current Opinion in Biotechnology 2011;22:868-76)]에 기재된 것을 포함한다. 이러한 PK 모이어티는 인간 혈청 알부민 융합체, 인간 혈청 알부민 접합체, 인간 혈청 알부민 결합제 (예를 들어, 애드넥틴 PKE, AlbudAb, ABD), XTEN 융합체, PAS 융합체 (즉, 3개의 아미노산 프롤린, 알라닌, 및 세린에 기초한 재조합 PEG 모방체), 탄수화물 접합체 (예를 들어, 히드록시에틸 스타치 (HES)), 글리코실화, 폴리시알산 접합체, 및 지방산 접합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서 본 발명은 중합체 당인 PK 모이어티에 융합된 항-GPC3 애드넥틴을 제공한다. 일부 실시양태에서, PK 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 또는 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서 PK 모이어티는 혈청 알부민 결합 단백질 예컨대 미국 공개 번호 2007/0178082 및 2007/0269422에 기재된 것이다. 일부 실시양태에서 PK 모이어티는 인간 혈청 알부민이다. 일부 실시양태에서, PK 모이어티는 트랜스페린이다.
일부 실시양태에서, PK 모이어티는 폴리펩티드 링커를 통해 항-GPC3 애드넥틴에 연결된다. 예시적인 폴리펩티드 링커는 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 또는 1-2개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. Fn3 도메인을 연결하는 데 적합한 링커는 별개의 도메인이 서로 독립적으로 폴딩되어 표적 분자에 대한 고친화도 결합을 가능하게 하는 3차원 구조를 형성하도록 허용하는 것이다. 예시적인 실시양태에서, 링커는 어떠한 Asp-Lys (DK) 쌍도 함유하지 않는다. 적합한 링커의 목록은 표 14 (예를 들어, 서열식별번호: 426-451)에 제공된다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은, 예를 들어, 혈액 또는 표적 조직 내의 프로테아제에 의해 절단가능한 프로테아제 부위를 갖는 폴리펩티드 링커를 통해 항-HSA 애드넥틴에 연결된다. 이러한 실시양태는 보다 우수한 전달 또는 치료 특성 또는 보다 효율적인 생산을 위해 항-GPC3 애드넥틴을 방출시키는 데 사용될 수 있다.
추가의 링커 또는 스페이서는 Fn3 도메인과 폴리펩티드 링커 사이의 Fn3 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 도입될 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. PEG는 상업적으로 입수가능하거나 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환 중합에 의해 제조될 수 있는 널리 공지된, 수용성 중합체이다 (Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161). 용어 "PEG"는 크기 또는 PEG의 말단에서의 변형에 관계없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포괄하는 데 광범위하게 사용되고, 화학식: X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH에 의해 나타내어질 수 있으며, 여기서 n은 20 내지 2300이고 X는 H 또는 말단 변형, 예를 들어, C1-4 알킬이다. PEG는 결합 반응에 필요한 추가의 화학적 기를 함유할 수 있고, 이는 분자의 화학적 합성으로부터 생성되거나; 또는 분자의 부분의 최적 거리를 위한 스페이서로서 작용한다. 또한, 이러한 PEG는 함께 연결된 1개 이상의 PEG 측쇄로 이루어질 수 있다. 1개 초과의 PEG 쇄를 갖는 PEG는 다중아암 또는 분지형 PEG로 칭해진다. 분지형 PEG는, 예를 들어, 유럽 공개된 출원 번호 473084A 및 미국 특허 번호 5,932,462에 기재되어 있다.
이뮤노글로불린 Fc 도메인 (및 단편)
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 이뮤노글로불린 Fc 도메인, 또는 그의 단편 또는 변이체에 융합된다. 본원에 사용된 바와 같은 "기능적 Fc 영역"은 FcRn에 결합하는 능력을 보유하는 Fc 도메인 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 기능적 Fc 영역은 FcRn에 결합하지만, 이펙터 기능을 보유하지 않는다. FcRn에 결합하는 Fc 영역 또는 그의 단편의 능력은 관련 기술분야에 공지된 표준 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 다른 실시양태에서, Fc 영역 또는 그의 단편은 FcRn에 결합하고 천연 Fc 영역의 적어도 하나의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항-GPC3 애드넥틴)과 조합될 것을 필요로 하고 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위한 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 1개의 아미노산 변형에 의해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환, 예를 들어, 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에 대해 적어도 약 80% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 그에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 그에 대해 적어도 약 95% 서열 동일성을 보유할 것이다.
예시적인 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 하위부류로부터 유래되지만, 다른 하위부류 (예를 들어, IgG2, IgG3, 및 IgG4)가 또한 사용될 수 있다. 인간 IgG1 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 서열이 하기 제시된다:
Figure pct00005
코어 힌지 서열은 밑줄로 표시되고, CH2 및 CH3 영역은 통상적인 문자로 표시된다. C-말단 리신이 임의적이라는 것이 이해되어야 한다. 이 서열의 동종이형 및 돌연변이체가 또한 사용될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 돌연변이체는 Fc의 다양한 특성, 예를 들어, ADCC, CDC 또는 반감기를 조정하도록 설계될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴 융합에 사용된 Fc 영역은 CH1 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴 융합에 사용된 Fc 영역은 CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴 융합에 사용된 Fc 영역은 CH2, CH3, 및 힌지 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, "힌지" 영역은 IgG1 Fc 영역의 서열식별번호: 463의 위치 1-16에 걸쳐있는 코어 힌지 잔기 (DKTHTCPPCPAPELLG; 서열식별번호: 464)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴-Fc 융합체는, 부분적으로, 힌지 영역 내의 서열식별번호: 의 위치 6 및 9에서의 시스테인 잔기로 인해 다량체 구조 (예를 들어, 이량체)를 채택한다.
IV. 벡터 및 폴리뉴클레오티드
본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴을 코딩하는 핵산이 또한 본원에 제공된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지된 바와 같이, 제3 염기 축중성으로 인해, 거의 모든 아미노산은 코딩 뉴클레오티드 서열에서 1종 초과의 삼중 코돈에 의해 나타내어질 수 있다. 또한, 미미한 염기 쌍 변화는 코딩된 아미노산 서열에서 보존적 치환을 일으킬 수 있지만 유전자 산물의 생물학적 활성을 실질적으로 변경할 것으로 예상되지는 않는다. 따라서, 본원에 기재된 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열에서 약간 변형될 수 있지만 여전히 그의 각각의 유전자 산물을 코딩할 수 있다. 본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴 및 그의 융합체를 코딩하는 특정 예시적인 핵산은 서열식별번호: 452-462에 제시된 서열을 갖는 핵산을 포함한다.
본원에 개시된 항-GPC3 애드넥틴을 포함하는 다양한 단백질 중 어느 것을 코딩하는 핵산은 화학적으로, 효소적으로 또는 재조합적으로 합성될 수 있다. 코돈 용법은 세포에서의 발현을 개선시키도록 선택될 수 있다. 이러한 코돈 용법은 선택된 세포 유형에 따라 달라질 것이다. 특화된 코돈 용법 패턴은 이. 콜라이(E. coli) 및 다른 박테리아뿐만 아니라 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 곤충 세포에 대해 개발되었다. 예를 들어: 문헌 [Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan. 21, 2003); Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(1):96-105 (Oct. 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (Oct. 2001); Makrides et al., Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (Sep. 1996); 및 Sharp et al., Yeast, 7(7):657-678 (Oct. 1991)]을 참조한다.
핵산 조작에 대한 일반적 기술은 예를 들어 본원에 참조로 포함된 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 또는 Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)] 및 주기적 최신판에 기재되어 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 포유동물, 바이러스, 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 이러한 조절 요소는 전사 프로모터, 전사를 제어하는 임의적인 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 통상적으로 복제 기점에 의해 부여되는, 숙주에서 복제하는 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자가 추가적으로 포함된다.
본원에 기재된 단백질은 직접적으로뿐만 아니라, 바람직하게는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드인 이종 폴리펩티드와의 폴리펩티드로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 바람직하게는 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이다. 천연 신호 서열은 인식하고 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은, 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정성 장독소 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열에 의해 치환된다. 효모 분비의 경우 천연 신호 서열은, 예를 들어, 효모 인버타제 리더, 인자 리더 (사카로미세스(Saccharomyces) 및 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 알파-인자 리더를 포함함), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 PCT 공개 번호 WO 90/13646에 기재된 신호에 의해 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 리딩 프레임에서 단백질을 코딩하는 DNA에 라이게이션될 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 둘 다는 벡터가 1종 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 이러한 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제될 수 있게 하는 것이고, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (SV40 기점은 전형적으로 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있음).
발현 및 클로닝 벡터는 또한 선택 마커로 칭해지는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요 영양을 공급하는 단백질을 코딩하고, 예를 들어, 바실루스(Bacilli)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자이다.
효모에 사용하는 데 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어, ATCC® 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다. 문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재 하의 성장에 의해 형질전환을 검출하는 데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC® 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 단백질을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주에 사용하는 데 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터도 적합하다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 단백질을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) (S.D.) 서열을 함유할 것이다.
진핵생물에 대한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 출발점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT (서열식별번호: 465) 영역이며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에 코딩 서열의 3' 말단에의 폴리 A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA (서열식별번호: 466) 서열이 있다. 모든 이들 서열은 진핵 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.
효모 숙주에 사용하는 데 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예컨대 엔올라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루브산염키나아제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하는 데 적합한 벡터 및 프로모터는 유럽 특허 공개 번호 73,657 및 PCT 공개 번호 WO 2011/124718 및 WO 2012/059486에 추가로 기재되어 있다. 또한 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 전사는, 예를 들어, 바이러스 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 수득된 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴(ACTIN)® 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 열-쇼크 프로모터에 의해 제어될 수 있고, 단 이러한 프로모터는 숙주 세포 시스템과 상용성이다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로서 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 번호 4,419,446에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형은 미국 특허 번호 4,601,978에 기재되어 있다. 또한 문헌 [Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982) on expression of human β-interferon cDNA in mouse cells under the control of a thymidine kinase promoter from herpes simplex virus]을 참조한다. 대안적으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부는 프로모터로서 사용될 수 있다.
고등 진핵생물에 의한 단백질을 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질, 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서가 사용될 것이다. 예는 복제 기점의 하류 쪽 (bp 100-270) 상의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 하류 쪽 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한 문헌 [Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) on enhancing elements for activation of eukaryotic promoters]을 참조한다. 인핸서는 폴리펩티드-코딩 서열의 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터의 부위 5'에 위치한다.
진핵 숙주 세포 (예를 들어, 효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및, 때때로 3' 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 1종의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO 94/11026 및 본원에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
재조합 DNA는 또한 단백질을 정제하는 데 유용할 수 있는 임의의 유형의 단백질 태그 서열을 포함할 수 있다. 단백질 태그의 예는 히스티딘 태그, 플래그(FLAG)® 태그, myc 태그, HA 태그, 또는 GST 태그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주에 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌 [Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985)]에서 찾아볼 수 있고, 그의 관련 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
발현 구축물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 바와 같이, 숙주 세포에 적절한 방법을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이는 전기천공; 칼슘 클로라이드, 루비듐 클로라이드, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 사용하는 형질감염; 미세발사체 충격; 리포펙션; 및 (벡터가 감염원인 경우) 감염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 포유동물 세포, 또는 박테리아 세포를 포함한다. 적합한 박테리아는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어, 이. 콜라이 또는 바실루스 종(Bacillus spp.)을 포함한다. 효모, 바람직하게는 사카로미세스 종, 예컨대 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae)로부터의 것이 또한 폴리펩티드의 생산에 사용될 수 있다. 다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 또한 재조합 단백질을 발현시키는 데 사용될 수 있다. 곤충 세포에서의 이종 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템이 문헌 [Luckow et al. (Bio/Technology, 6:47 (1988))]에서 검토된다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예는 내피 세포, COS-7 원숭이 신장 세포, CV-1, L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), 인간 배아 신장 세포, HeLa, 293, 293T, 및 BHK 세포주를 포함한다. 정제된 단백질은 재조합 단백질을 발현시키는 데 적합한 숙주/벡터 시스템을 배양함으로써 제조된다. 이어서 FBS 단백질은 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제된다.
V. 단백질 생산
숙주 세포는 단백질 생산을 위해 본원에 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고 프로모터를 도입하거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키도록 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지 예컨대 햄 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 ((MEM), (시그마)), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코 변형 이글 배지 ((DMEM), (시그마))가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enzymol., 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; PCT 공개 번호 WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 번호 RE30,985에 기재된 배지 중 어느 것이 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 어느 것은 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 겐타마이신(Gentamycin) 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물이 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 이전에 사용된 것이고, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
본원에 개시된 단백질은 또한 무세포 번역 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 이러한 목적을 위해 단백질을 코딩하는 핵산은 mRNA를 생산하는 시험관내 전사를 가능하게 하고 이용되는 특정한 무세포 시스템 (진핵 예컨대 포유동물 또는 효모 무세포 번역 시스템 또는 원핵 예컨대 박테리아 무세포 번역 시스템)에서 mRNA의 무세포 번역을 가능하게 하도록 변형되어야 한다.
단백질은 또한 화학적 합성에 의해 (예를 들어, 문헌 [Solid Phase Peptide Synthesis, Second Edition, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)]에 기재된 방법에 의해) 생산될 수 있다. 단백질에 대한 변형은 또한 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다.
본원에 개시된 단백질은 단백질 화학의 분야에 일반적으로 공지된, 단백질을 위한 단리/정제 방법에 의해 정제될 수 있다. 비제한적 예는 추출, 재결정화, 염석 (예를 들어, 황산암모늄 또는 황산나트륨을 사용함), 원심분리, 투석, 한외여과, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 정상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 겔 여과, 겔 투과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동, 향류 분배 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 정제한 후, 단백질은 상이한 완충제로 교환되고/거나 여과 및 투석을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 어느 것에 의해 농축될 수 있다.
정제된 단백질은 바람직하게는 적어도 85% 순수하고, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수하고, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 순수하다. 순도의 정확한 수치와 관계없이, 단백질은 제약 제품으로서 사용하기에 충분히 순수하다.
이. 콜라이에서 애드넥틴을 발현시키는 한 가지 방법은 하기와 같다. 애드넥틴을 코딩하는 핵산을 HIS6태그의 상류에서 PET9d 벡터 내로 클로닝하고 이. 콜라이 BL21 DE3 plysS 세포 내로 형질전환시키고 이를 50 μg/mL 카나마이신을 함유하는 5 ml LB 배지에 24-웰 포맷으로 접종하고 37℃에서 밤새 성장시킨다. 신선한 5 ml LB 배지 (50 μg/mL 카나마이신) 배양물을 유도성 발현을 위해 밤샘 배양물로부터 200 μl를 흡인하고 이를 적절한 웰에 분주함으로써 제조한다. 배양물을 37℃에서 A600 0.6-0.9까지 성장시킨다. 1 mM 이소프로필-β-티오갈락토시드 (IPTG)로 유도한 후, 배양물을 30℃에서 6시간 동안 발현시키고 2750 g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 수거한다.
세포 펠릿 (24-웰 포맷)을 450 μl의 용해 완충제 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1x 완전 ™ 프로테아제 억제제 칵테일-EDTA 무함유 (로슈(Roche)), 1 mM PMSF, 10 mM CHAPS, 40 mM 이미다졸, 1 mg/ml 리소자임, 30 μg/ml DNAse, 2 μg/ml 아프로토닌, pH 8.0) 중에 재현탁시켜 용해시키고 실온에서 1-3시간 동안 진탕시킨다. 용해물을 소거하고 96-웰, 1.2 ml 캐치 플레이트가 장착된 96-웰 와트만 GF/D 유니필터(Whatman GF/D Unifilter)로 옮겨 96-웰 포맷 내로 재-래킹하고 양압에 의해 여과한다. 소거된 용해물을 평형 완충제 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 40 mM 이미다졸, pH 8.0)로 평형화된 96-웰 니켈 또는 코발트-킬레이트화 플레이트로 옮기고 5분 동안 인큐베이션한다. 미결합 물질을 양압에 의해 제거한다. 수지를 세척 완충제 #1 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 5 mM CHAPS, 40 mM 이미다졸, pH 8.0)을 포함한 0.3 ml/웰로 2회 세척한다. 각각의 세척물을 양압에 의해 제거한다. 용리 전에, 각각의 웰을 50 μl 용리 완충제 (PBS + 20 mM EDTA)로 세척하고, 5분 동안 인큐베이션하고, 이 세척물을 양압에 의해 폐기한다. 단백질을 추가의 100 μl의 용리 완충제를 각각의 웰에 적용함으로써 용리한다. 실온에서 30분 인큐베이션한 후, 플레이트(들)를 5분 동안 200 g에서 원심분리하고 용리 전에 용리 캐치 플레이트의 바닥에 첨가된 5 μl의 0.5 M MgCl2를 함유하는 96-웰 캐치 플레이트에 수집된 단백질을 용리한다. 용리된 단백질을 단백질 표준으로서 야생형 10Fn3 도메인을 사용하는 총 단백질 검정을 사용하여 정량화한다.
불용성 애드넥틴의 중간규모 발현 및 정제 방법은 하기와 같다. 애드넥틴(들)을 코딩하는 핵산에 이어 HIS6태그를 pET9d (EMD 바이오사이언스(EMD Bioscience), 캘리포니아주 샌디에고) 벡터 내로 클로닝하고 이. 콜라이 HMS174 세포에서 발현시킨다. 20 ml의 접종 배양물 (단일 플레이팅된 콜로니로부터 생성됨)을 사용하여 50 μg/ml 카르베니실린 및 34 μg/ml 클로람페니콜을 함유하는 1 리터의 LB 배지에 접종한다. 배양물을 37℃에서 A600 0.6-1.0까지 성장시킨다. 1mM 이소프로필-β-티오갈락토시드 (IPTG)를 사용하여 유도한 후 배양물을 30℃에서 4시간 동안 성장시키고 > 10,000 g에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 수거한다. 세포 펠릿을 -80℃에서 동결시킨다. 세포 펠릿을 얼음 상에서 울트라-투락스(ULTRA-TURRAX)® 균질화기 (IKA 웍스(IKA works))를 사용하여 25 ml의 용해 완충제 (20mM aH2P04, 0.5 M NaCl, lx 완전 프로테아제 억제제 칵테일-EDTA 무함유 (로슈), 1mM PMSF, pH 7.4) 중에 재현탁시킨다. 세포 용해를 모델 M-l 10S 마이크로플루이다이저(MICROFLUIDIZER)® (마이크로플루이딕스(Microfluidics))를 사용하여 고압 균질화 (>18,000 psi)에 의해 달성한다. 불용성 분획을 23,300 g에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 분리한다. 용해물의 원심분리로부터 회수된 불용성 펠릿을 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl, pH7.4로 세척한다. 펠릿을 초음파처리하면서 20 mM 인산나트륨/500M NaCl pH 7.4 중 6.0M 구아니딘 히드로클로라이드 중에 재가용화시키고 이어서 37℃에서 1- 2시간 동안 인큐베이션한다. 재가용화된 펠릿을 0.45 μm로 여과하고 20mM 인산나트륨/500 M NaCl/6.0 M 구아니딘 pH 7.4 완충제로 평형화된 히스트랩(Histrap) 칼럼 상에 로딩한다. 로딩한 후, 칼럼을 추가의 25 CV를 위해 동일한 완충제로 세척한다. 결합된 단백질을 20mM 인산나트륨/500 mM NaCl/6.0 M 구안-HCl pH7.4 중 50mM 이미다졸로 용리한다. 정제된 단백질을 50 mM 아세트산나트륨/150 mM NaCl pH 4.5에 대한 투석에 의해 재폴딩시킨다.
가용성 애드넥틴의 중간규모 발현 및 정제 방법은 하기와 같다. 애드넥틴(들)을 코딩하는 핵산에 이어 HIS6태그를 pET9d (EMD 바이오사이언스, 캘리포니아주 샌디에고) 벡터 내로 클로닝하고 이. 콜라이 HMS174 세포에서 발현시킨다. 20 ml의 접종 배양물 (단일 플레이팅된 콜로니로부터 생성됨)을 사용하여 50 μg/ml 카르베니실린 및 34 μg/ml 클로람페니콜을 함유하는 1 리터의 LB 배지에 접종한다. 배양물을 37℃에서 A600 0.6-1.0까지 성장시킨다. 1 mM 이소프로필-β-티오갈락토시드 (IPTG)를 사용하여 유도한 후, 배양물을 30℃에서 4시간 동안 성장시키고 >10,000 g에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 수거한다. 세포 펠릿을 -80℃에서 동결시킨다. 세포 펠릿을 얼음 상에서 울트라-투락스® 균질화기 (IKA 웍스)를 사용하여 25 ml의 용해 완충제 (20mM NaH2P04, 0.5 M NaCl, lx 완전 프로테아제 억제제 칵테일-EDTA 무함유 (로슈), 1mM PMSF, pH 7.4) 중에 재현탁시킨다. 세포 용해를 모델 M-1 10S 마이크로플루이다이저® (마이크로플루이딕스)를 사용하여 고압 균질화 (>18,000 psi)에 의해 달성한다. 가용성 분획을 23,300 g에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 분리한다. 상청액을 0.45 μm 필터를 통해 정화한다. 정화된 용해물을 20 mM 인산나트륨/500M NaCl pH 7.4로 사전-평형화된 히스트랩 칼럼 (GE) 상에 로딩한다. 이어서 칼럼을 25 칼럼 부피의 동일한 완충제에 이어 20 칼럼 부피의 20mM 인산나트륨/500 M NaCl/25 mM 이미다졸, pH 7.4 및 이어서 35 칼럼 부피의 20mM 인산나트륨/500 M NaCl/40 mM 이미다졸, pH 7.4로 세척한다. 단백질을 15 칼럼 부피의 20 mM 인산나트륨/500 M NaCl/500 mM 이미다졸, pH 7.4로 용리하고, 분획을 A2so에서의 흡광도에 기초하여 합하고 lXPBS, 50 mM Tris, 150mM NaCl; pH 8.5 또는 50 mM NaOAc; 150 mM NaCl; pH4.5에 대해 투석한다. 임의의 침전물을 0.22 μm에서 여과함으로써 제거한다.
VI. 생물물리학적 및 생화학적 특징화
본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴의 결합은 평형 상수 (예를 들어, 해리, KD) 및 동역학적 상수 (예를 들어, 온-레이트(on-rate) 상수, k온 및 오프-레이트(off-rate) 상수, k오프)와 관련하여 평가될 수 있다. 애드넥틴은 일반적으로 1μM, 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM, 또는 100 pM 미만의 KD로 표적 분자에 결합할 것이지만, 보다 높은 KD 값은 k오프가 충분히 낮거나 또는 k온이 충분히 높은 경우에 허용될 수 있다.
결합 친화도에 대한 시험관내 검정
항-GPC3 애드넥틴의 결합 친화도를 결정하는 예시적인 검정은 용액 상 방법 예컨대 동역학적 배제 검정 (KinExA) (Blake et al., JBC 1996; 271:27677-85; Drake et al., Anal Biochem 2004; 328:35-43), 비아코어 시스템 (스웨덴 웁살라) (Welford et al., Opt. Quant. Elect 1991; 23:1; Morton and Myszka, Methods in Enzymology 1998; 295:268)을 사용한 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정 (Newton et al., J Biomol Screen 2008; 13:674-82; Patel et al., Assay Drug Dev Technol 2008; 6:55-68)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 생체분자 상호작용은 SPR을 사용하여 최대 300 nm의 표면의 굴절률의 변화로 인한 유리 지지체 상의 금 박막의 표면에서 광의 공명각의 변화를 검출하는 비아코어 시스템을 사용하여 실시간으로 모니터링될 수 있다. 비아코어 분석은 회합률 상수, 해리율 상수, 평형 해리 상수, 및 친화도 상수를 생성한다. 결합 친화도는 비아코어 표면 플라즈몬 공명 시스템 (비아코어, 인크.(Biacore, Inc.))을 사용하여 회합률 및 해리율 상수를 평가함으로써 수득된다. 바이오센서 칩은 표적의 공유 커플링에 대해 활성화된다. 이어서 표적을 희석하고 칩 상으로 주사하여 고정된 물질의 반응 단위로 신호를 수득한다. 공명 단위 (RU)의 신호가 고정된 물질의 질량에 비례하기 때문에, 이는 매트릭스 상의 고정된 표적 밀도의 범위를 나타낸다. 회합 및 해리 데이터는 전반적 분석에서 동시에 피팅되어 1:1 이분자 상호작용에 대한 순 레이트 표현을 해결하고, 이는 k온, k오프 및 Rmax (포화에서의 최대 반응)에 대한 최적 피팅 값을 산출한다. 결합에 대한 평형 해리 상수인 KD는 SPR 측정으로부터 k오프/k온으로서 계산된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴은 실시예 2에 기재된 SPR 친화도 검정에서 1μM 이하, 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하, 150 nM 이하, 100 nM 이하, 90 nM 이하, 80 nM 이하, 70 nM 이하, 60 nM 이하, 50 nM 이하, 40 nM 이하, 30 nM 이하, 20 nM 이하, 15 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 KD를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 관련된 단백질에 실질적으로 결합하지 않고, 예를 들어, 항-GPC3 애드넥틴은 글리피칸-1, 글리피칸-2, 글리피칸-4 또는 글리피칸-6에 실질적으로 결합하지 않는다.
본원에 상기 기재된 검정은 예시적이고, 단백질 사이의 결합 친화도를 결정하는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법 (예를 들어, 형광 기반-전달 (FRET), 효소-연결 면역흡착 검정, 및 경쟁적 결합 검정 (예를 들어, 방사선면역검정))은 본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴의 결합 친화도를 평가하는 데 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
결합에 대한 세포 검정
일부 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴 및 그의 접합체는 글리피칸-3을 발현하는 세포 내로 내재화된다. 예를 들어, HumZap 내재화 검정을 포함하는 폴리펩티드 내재화를 평가하는 표준 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 종양 세포, 예를 들어 Hep-3b 또는 Hep-G2 (각각 ATCC 기탁 번호 HB-8064 및 HB-8065)에 대한 결합을 평가하기 위해, 세포는 공중 이용가능한 공급원, 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수될 수 있고, 표준 검정, 예컨대 유동 세포측정 분석에 사용될 수 있다.
VII. 약물 접합체
치료제 또는 약물 모이어티에 접합된, FBS 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 애드넥틴이 또한 제공된다. 애드넥틴-약물 접합체 (AdxDC)에서, FBS 모이어티 (예를 들어, 항-GPC3 애드넥틴)는 약물 모이어티에 접합되며, 애드넥틴은 AdxDC를 GPC3을 발현하는 표적 세포, 예컨대 암 세포로 유도하는 표적화제로 기능한다. 약물이 표적 세포 내부 또는 그의 부근으로 방출되면, 치료제로서 작용한다. 예를 들어, 암 요법에서 항체와 함께 사용되는 약물 접합체의 작용 메카니즘 및 용도에 대한 검토를 위해, 문헌 [Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc., 5:147 (2006)]을 참조한다.
약물 접합체에 사용하는 데 적합한 약물 모이어티는 시톡신 또는 방사성독소를 포함한다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 (예를 들어, 사멸시키는) 임의의 작용제를 포함하고, 항대사물, 알킬화제, DNA 작은 홈 결합제, DNA 삽입제, DNA 가교제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 핵 유출 억제제, 프로테아솜 억제제, 토포이소머라제 I 또는 II 억제제, 열 쇼크 단백질 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항생제, 및 항-유사분열제를 포함한다.
적합한 작용제의 예는 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브로민화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 그의 유사체 또는 상동체를 포함한다. 치료제는 또한, 예를 들어, 항대사물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예를 들어, 다우노루비신 (이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다. 본 발명의 항-GPC3 애드넥틴에 접합될 수 있는 치료 세포독소의 다른 바람직한 예는 두오카르마이신, 칼리케아미신, 메이탄신 및 아우리스타틴, 및 그의 유도체를 포함한다.
애드넥틴 약물 접합체는 주어진 생물학적 반응을 변형시키는데 사용될 수 있고, 약물 모이어티는 전형적 화학적 치료제로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 효소적 활성 독소, 또는 그의 활성 단편, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질 예컨대 종양 괴사 인자 또는 인터페론-.감마.; 또는, 생물학적 반응 조절제 예컨대, 예를 들어, 림포카인, 인터류킨-1 ("IL-1"), 인터류킨-2 ("IL-2"), 인터류킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 다른 성장 인자를 포함할 수 있다.
항-GPC3 애드넥틴은 관련 기술분야에 이용가능한 링커 기술을 사용하여 치료제에 접합될 수 있다. 세포독소를 애드넥틴에 접합시키는 데 사용된 링커 유형의 예는 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 및 펩티드-함유 링커를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 리소솜 구획 내의 낮은 pH에 의한 절단 또는 프로테아제, 예컨대 종양 조직에 우선적으로 발현되는 프로테아제 예컨대 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B, C, D)에 의한 절단에 감수성인 링커가 선택될 수 있다. 세포독소는, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,989,452, 7,087,600, 및 7,129,261, 및 PCT 출원 번호 PCT/US02/17210, PCT/US2005/017804, PCT/US06/37793, PCT/US06/060050, PCT/US2006/060711, WO/2006/110476, 및 미국 특허 출원 번호 60/891,028에 기재되어 있고, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드텍틴 및 치료제는 바람직하게는 절단가능한 링커 예컨대 펩티딜, 디술피드, 또는 히드라존 링커를 통해 접합된다. 보다 바람직하게는, 링커는 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (서열식별번호: 467), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, 또는 Glu를 포함할 수 있는 펩티딜 링커이다. FBS-DC는 미국 특허 번호 7,087,600; 6,989,452; 및 7,129,261; PCT 공개 번호 WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; 및 WO 08/103693; 미국 특허 공개 번호 2006/0024317; 2006/0004081; 및 2006/0247295 (그 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 제조될 수 있다.
링커는 그 자체가 항-GPC3 애드넥틴 상의 PmXn 모이어티의 시스테인에, 예를 들어, 말레이미드 화학을 사용하여 연결, 예를 들어, 공유 연결될 수 있으며, 여기서 적어도 1개의 X는 시스테인이다. 예를 들어, 링커는 항-GPC3 애드넥틴-PmXn에 공유 연결될 수 있으며, 여기서 적어도 1개의 X는 시스테인이다. 예를 들어, 링커는 항-GPC3 애드넥틴-PmCn에 연결될 수 있으며, 여기서 P는 프롤린이고, C는 시스테인이고, m 및 n은 적어도 1인 정수, 예를 들어, 1-3이다. 시스테인에 대한 라이게이션은 말레이미드 화학을 사용하여 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Imperiali, B. et al., Protein Engineering: Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol. 22, pp. 65-96, Gross, H.J., ed. (2009)]). 링커를 항-GPC3 FBS 상의 시스테인에 부착시키기 위해, 링커는, 예를 들어, 말레인이미도 모이어티를 포함할 수 있고, 이어서 모이어티는 시스테인과 반응하여 공유 결합을 형성한다. 특정 실시양태에서, 시스테인을 둘러싸는 아미노산은 화학 반응을 용이하게 하기 위해 최적화된다. 예를 들어, 시스테인은 양으로 하전된 아미노산의 스트레치에 의해 둘러싸인 시스테인에 비해 더 빠른 반응을 위해 음으로 하전된 아미노산에 의해 둘러싸일 수 있다 (EP 1074563). 약물 모이어티의 항-GPC3 애드넥틴 상의 시스테인에 대한 연결은 부위 특이적 연결이다.
암 치료를 위해, 약물은 바람직하게는 표적화된 암 세포의 사멸을 유발하는 세포독성 약물이다. 항-GPC3 FBS-DC에 사용될 수 있는 세포독성 약물은, 예를 들어, 하기 유형의 화합물 및 그의 유사체 및 유도체를 포함한다:
(a) 에네디인 예컨대 칼리케아미신 (예를 들어, 문헌 [Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464 and 3466] 참조) 및 운시알라마이신 (예를 들어, 문헌 [Davies et al., WO 2007/038868 A2 (2007); Chowdari et al., US 8,709,431 B2 (2012); 및 Nicolaou et al., WO 2015/023879 A1 (2015)] 참조);
(b) 튜부리신 (예를 들어, 문헌 [Domling et al., US 7,778,814 B2 (2010); Cheng et al., US 8,394,922 B2 (2013); 및 Cong et al., US 8,980,824 B2 (2015)] 참조);
(c) DNA 알킬화제 예컨대 CC-1065의 유사체 및 두오카르마이신 (예를 들어, 문헌 [Boger, US 6,5458,530 B1 (2003); Sufi et al., US 8,461,117 B2 (2013); 및 Zhang et al., US 8,852,599 B2 (2014)] 참조);
(d) 에포틸론 (예를 들어, 문헌 [Vite et al., US 2007/0275904 A1 (2007) 및 US RE42930 E (2011)] 참조);
(e) 아우리스타틴 (예를 들어, 문헌 [Senter et al., US 6,844,869 B2 (2005) 및 Doronina et al., US 7,498,298 B2 (2009)] 참조);
(f) 피롤로벤조디아제핀 (PBD) 이량체 (예를 들어, 문헌 [Howard et al., US 2013/0059800 A1(2013); US 2013/0028919 A1 (2013); 및 WO 2013/041606 A1 (2013)] 참조); 및
(g) 메이탄시노이드 예컨대 DM1 및 DM4 (예를 들어, 문헌 [Chari et al., US 5,208,020 (1993) 및 Amphlett et al., US 7,374,762 B2 (2008)] 참조).
상기 약물 모이어티 참고문헌은, 적절한 약물 모이어티의 개시 이외에도, 또한 이들을 접합시키는 데 적합한 약물-링커 화합물을 제조하는 데 사용될 수 있는 링커를 개시한다. 특히 약물-링커 화합물의 제조와 관련된 관련 개시내용은 문헌 [Chowdari et al., US 8,709,431 B2 (2012); Cheng et al., US 8,394,922 B2 (2013); Cong et al., US 8,980,824 B2 (2015); Sufi et al., US 8,461,117 B2 (2013); 및 Zhang et al., US 8,852,599]에서 발견된다.
바람직하게는, 약물 모이어티는 DNA 알킬화제, 튜부리신, 아우리스타틴, 피롤로벤조디아제핀, 에네디인, 또는 메이탄시노이드 화합물, 예컨대:
Figure pct00006
Figure pct00007
이다.
접합이 시행되는 관능기는 상기 처음 5개의 약물의 경우 아민 (-NH2) 기 및 마지막 2개의 약물의 경우 메틸 아민 (-NHMe) 기이다.
약물을 애드넥틴에 접합시키기 위해, 링커 기가 필요하다. 약물은 링커와 결합하여 약물-링커 화합물을 형성하고, 이어서 애드넥틴에 접합된다. 약물-링커 화합물은 화학식 (I)에 의해 나타내어질 수 있다
Figure pct00008
여기서
D는 약물이고;
T는 자기-희생 기이고;
t는 0 또는 1이고;
AAa 및 각각의 AAb는 독립적으로 알라닌, β-알라닌, γ-아미노부티르산, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, γ-카르복시글루탐산, 시트룰린, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 노르류신, 노르발린, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
p는 1, 2, 3, 또는 4이고;
q는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
r은 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
s는 0 또는 1이다.
화학식 II에서, -AAa-[AAb]p-는 p의 값에 의해 그의 길이가 결정되는 폴리펩티드 (p가 1인 경우 디펩티드, p가 3인 경우 테트라펩티드 등)를 나타낸다. AAa는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 있고 그의 카르복실 기는 약물 D (또는 존재하는 경우에 자기-희생 기 T)의 아민 질소와 함께 펩티드 (아미드) 결합을 형성한다. 반대로, 마지막 AAb는 폴리펩티드의 아미노 말단에 있고 그의 α-아미노 기는 각각 s가 1인지 또는 0인지에 따라
Figure pct00009
과 함께 펩티드 결합을 형성한다. 바람직한 폴리펩티드 -AAa-[AAb]p-는 Val-Cit, Val-Lys, Lys-Val-Ala, Asp-Val-Ala, Val-Ala, Lys-Val-Cit, Ala-Val-Cit, Val-Gly, Val-Gln, 및 Asp-Val-Cit이다 (H2N-Val-Cit-CO2H에서와 같이, 통상적인 N-에서-C 방향으로 기록됨). 보다 바람직하게는, 폴리펩티드는 Val-Cit, Val-Lys, 또는 Val-Ala이다. 바람직하게는, 폴리펩티드 -AAa-[AAb]p-는 표적 (암) 세포 내부에서 발견되는 효소, 예를 들어 카텝신 및 특히 카텝신 B에 의해 절단가능하다.
아래첨자 s가 1인 경우에, 약물-링커 (I)는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 기를 함유하고, 이는 약물-링커 (I)의 용해도를 유리하게 개선시킬 수 있고, 애드넥틴에 대한 접합 - 수성 매질 중에서 수행되는 단계를 용이하게 할 수 있다. 또한, PEG 기는 애드넥틴의 벌크가 펩티드-절단 효소의 작용을 입체적으로 방해하지 않도록 애드넥틴과 펩티드 -AAa-[AAb]p- 사이의 스페이서로서 작용할 수 있다.
0 또는 1인 아래첨자 t에 의해 제시된 바와 같이, 자기-희생 기 T는 임의로 존재한다. 자기-희생 기는 AAa 또는 AAb로부터의 절단이, 경우에 따라, 자기-희생 기가 그 자체로 약물 D로부터 해체되도록 하고 약물 D가 그의 치료 기능을 발휘하기 위해 유리되는 반응 절차를 개시하도록 하는 것이다. 존재하는 경우에, 자기-희생 기 T는 바람직하게는 그의 구조가 하기 제시된 p-아미노벤질 옥시카르보닐 (PABC) 기이고, 별표 (*)는 약물 D의 아민 질소에 결합된 PABC의 말단을 나타내고 파상선 (
Figure pct00010
)은 폴리펩티드 -AAa-[AAb]p-에 결합된 말단을 나타낸다.
Figure pct00011
사용될 수 있는 또 다른 자기-희생 기는 문헌 [Feng, US 7,375,078 B2 (2008)]에 개시된 바와 같은 치환된 티아졸이다.
화학식 (I)의 말레이미드 기는 하기 제시된 바와 같이, 애드넥틴 상의 술프히드릴 기에 의한 마이클 첨가 반응을 통한 애드넥틴에 대한 부착을 위한 반응성 관능기로서 작용한다:
Figure pct00012
대안적으로, 애드넥틴의 리신 잔기의 측쇄의 ε-아미노 기는 2-이미노티올란와 반응하여 유리 티올 (-SH) 기를 도입할 수 있다. 티올 기는 약물-링커 (I)의 말레이미드 기와 반응하여 접합을 실시할 수 있다:
Figure pct00013
이 후자의 방법에 의한 접합은 때때로 이미노티올란에 의해 변형된 리신 잔기의 수 및 위치를 예측하기 어렵기 때문에 "무작위 접합"으로 지칭된다.
특정 실시양태에서, FBS 약물 접합체, 예를 들어, AdxDC 내의 치료제는 튜부리신 또는 튜부리신 유사체이다. 튜부리신은 포몹신, 돌라스타틴, 및 크립토피신을 포함하는 자연 발생 항유사분열 폴리펩티드 및 뎁시펩티드의 군에 속한다 (Hamel et al., Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents, 2002, 2:19-53). 튜부리신은 튜불린의 미세관으로의 조립을 방지하여, 이환 세포가 G2/M 기에 축적되고 아폽토시스를 겪도록 한다 (Khalil et al., ChemBioChem 2006, 7:678-683).
자연 발생 튜부리신 이외에도, 본원에 제공된 FBS 스캐폴드 약물 접합체, 예를 들어, AdxDC에 사용하는 데 적합한, 강력한 세포독성 활성을 갖는 합성 튜부리신 유사체가, 예를 들어, 미국 특허 8,394,922 및 8,980,824 (본원에 참조로 포함됨)에 기재되었다.
일부 실시양태에서, AdxDC 내의 치료제는 합성 튜부리신 유사체이고 화학식 (II)에 의해 나타내어지는 구조를 갖는다:
Figure pct00014
예를 들어, 화학식 II를 갖는 약물 모이어티를 FBS 스캐폴드, 예를 들어, 항-GPC3 FBS 스캐폴드에 접합시키기 위해, 화학식 (III)에 의해 나타내어지는 구조를 갖는 링커 모이어티가 사용된다:
Figure pct00015
이러한 링커 모이어티는 발린-시트룰린 (Val-Cit, 통상적인 N-에서-C 방향으로 열거됨) 디펩티드를 포함하고, 이는 AdxDC가 표적 암 세포에 도달하고 그에 의해 내재화된 후 세포내 효소 카텝신 B에 의해 절단되어, 치료제가 그의 세포독성 효과를 발휘하기 위해 방출되도록 설계된다 (Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem Lett., 1998, 8:3341-3346; Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem Lett., 1998, 8:3347-3352; Dubowchik et al., Bioconjugate Chem., 2002, 13:855-869).
약물 (II) 및 링커 (III)는 커플링되어 화학식 (IV)에 의해 나타내어지는 구조를 갖는 약물-링커 화합물을 생산하고, 이어서 이는 애드넥틴에 접합된다. 약물-링커 (IV)의 제조는 문헌 [Cheng et al., US 8,394,922 B2 (2013)] (예를 들어, 도 20b 및 실시예 22 참조)에 기재되어 있으며, 그 개시내용은 본원에 포함된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 약물-링커 (IV)의 경우에, 임의적인 자기-희생 기 또는 PEG 기가 존재하지 않지만, 이러한 기는 원하는 경우에 혼입될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
AdxDC 접합체의 제조에서, 화학식 (IV)에 의해 나타내어지는 구조를 갖는 치료제-링커 화합물이 제조되고, 이어서 이는 FBS 스캐폴드에 접합된다.
Figure pct00016
일부 실시양태에서, FBS-약물 접합체는 화학식 (V)에 의해 나타내어지는 구조를 갖는다.
Figure pct00017
여기서 m은 1, 2, 3, 4 또는 그 초과이다. 특정 실시양태에서, m은 1이다. 다른 실시양태에서, m은 2이다.
한 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴 (Adx)의 C-말단 시스테인 잔기의 측쇄의 티올 기는 화합물 (V)의 말레이미드 기와 반응하여 접합을 실시한다:
Figure pct00018
또 다른 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴 (Adx)의 C-말단에 위치하는 2개의 시스테인의 티올 기는 화합물 (IV)의 말레이미드 기와 반응하여 애드넥틴당 2개의 약물 분자 (예를 들어, DAR2, 도 2)의 접합을 실시한다.
일부 실시양태에서, 접합체의 항-GPC3Adx는 상기 섹션 IA에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, 이는 시스테인을 포함하는 C-말단 꼬리를 함유하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 항-GPC3Adx는 서열식별번호: 5, 9-10, 18, 22-23, 31, 35-3644, 48-49, 57, 61-62, 70, 74-75, 83, 87-88, 98, 102-105, 128, 130-132, 155, 157-159, 180, 184-186, 20-, 211-213, 236, 238-240, 263, 265-267, 290, 292-294, 317 및 319-321로 이루어진 군으로부터 선택된 코어 아미노산 서열을 포함하고, 이는 시스테인을 포함하는 C-말단 모이어티를 함유하도록 변형된다.
일부 실시양태에서, 항-GPC3Adx는 본원에 정의된 바와 같은 PmCXn 또는 PmCXn1CXn2로 이루어진 C-말단 모이어티를 함유하도록 변형된다. 특정 실시양태에서, C-말단 모이어티는 PC, PCC 또는 본원에 기재된 C-말단 서열, 예를 들어, 서열식별번호: 409-423에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어진다. 특정 실시양태에서, C-말단 모이어티는 PC 또는 PCPPPPPC (서열식별번호: 416)로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 변형된 항-GPC3 Adx는 PmCXn으로 이루어진 C-말단 모이어티를 포함하고, 서열식별번호: 11-14, 24-27, 37-40, 50-53, 63-66, 76-79, 89-93, 106-118, 133-145, 160-172, 187-199, 214-226, 241-253, 268-280, 295-307, 및 322-334로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 변형된 항-GPC3 Adx는 PmCXn1CXn2로 이루어진 C-말단 모이어티를 포함하고, 서열식별번호: 15-17, 28-30, 41-43, 54-57, 67-70, 80-83, 94-97, 119-127, 146-154, 173-181, 200-208, 227-235, 254-262, 281-289, 308-316, 및 335-343으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정한 실시양태에서, 약물 접합체에 사용하기 위한 항-GPC3 Adx는 서열식별번호: 114-118; 123-127; 141-145; 150-154; 168-172; 177-181; 195-199; 204-208; 222-226; 231-235; 249-253; 258-262; 276-280; 285-289; 303-307; 312-316; 330-334; 및 339-343 중 어느 하나이다.
본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴은 또한 방사성 동위원소에 접합되어 세포독성 방사성제약을 생성할 수 있다. 진단상 또는 치료상 사용하기 위한 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 예는 아이오딘131, 인듐111, 이트륨90 및 루테튬177을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 방사성접합체를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 확립되어 있다.
VIII. 제약 조성물
본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴 및 접합체를 포함하는 제약상 허용되는 조성물이 또한 제공되며, 여기서 조성물은 본질적으로 내독소 및/또는 발열원 무함유이다.
제제를 제조하는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법은, 예를 들어, 문헌 ["Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A. R. Gennaro A R., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)]에서 발견된다. 비경구 투여를 위한 제제는, 예를 들어, 부형제, 멸균수, 염수, 폴리알킬렌 글리콜 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 또는 수소화 나프탈렌을 함유할 수 있다. 생체적합성, 생분해성 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체는 화합물의 방출을 제어하는 데 사용될 수 있다. 나노미립자 제제 (예를 들어, 생분해성 나노입자, 고체 지질 나노입자, 리포솜)는 화합물의 생체분포를 제어하는 데 사용될 수 있다. 다른 잠재적으로 유용한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프, 이식형 주입 시스템, 및 리포솜을 포함한다. 제제 중 화합물의 농도는 투여되는 약물의 투여량, 및 투여 경로를 포함하는 다수의 인자에 따라 달라진다.
단백질을 포함하는 치료 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 기재된 단백질을 임의적인 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합시킴으로써 수용액, 동결건조된 또는 다른 건조된 제제의 형태로 보관을 위해 제조된다 (Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition (1980)). 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트란을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 트윈(Tween), 플루로닉(PLURONIC)® 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
폴리펩티드는 임의로 제약 산업에 통상적으로 사용되는 제약상 허용되는 염, 예컨대 비-독성 산 부가염 또는 금속 착물로서 투여될 수 있다. 산 부가염의 예는 유기 산 예컨대 아세트산, 락트산, 파모산, 말레산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 숙신산, 벤조산, 팔미트산, 수베르산, 살리실산, 타르타르산, 메탄술폰산, 톨루엔술폰산, 또는 트리플루오로아세트산 등; 중합체 산 예컨대 탄닌산, 카르복시메틸 셀룰로스 등; 및 무기 산 예컨대 염산, 브로민화수소산, 황산 인산 등을 포함한다. 금속 착물은 아연, 철 등을 포함한다. 한 예에서, 폴리펩티드는 열 안정성을 증가시키기 위해 아세트산나트륨의 존재 하에 제제화된다.
본원의 제제는 또한 치료될 특정한 적응증에 필요한 1종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합물에 적합하게 존재한다.
단백질은 또한 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에서 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균이어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 본원에 기재된 단백질을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 y 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산 산-글리콜산 공중합체 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)® (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 중합체 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100일 초과 동안 분자를 방출할 수 있는 반면에, 특정 히드로겔은 보다 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화 단백질이 긴 시간 동안 신체에 남아있는 경우에, 이들은 37℃에서 수분에 대한 노출의 결과로서 변성되거나 또는 응집되어, 생물학적 활성의 상실 및 면역원성의 가능한 변화를 일으킨다. 수반되는 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간 S--S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우에, 안정화가 술프히드릴 잔기를 변형시키는 것, 산성 용액으로부터 동결건조시키는 것, 수분 함량을 제어하는 것, 적절한 첨가제를 사용하는 것, 및 특정한 중합체 매트릭스 조성물을 개발하는 것에 의해 달성될 수 있다.
치료 용도를 위해, 단백질은 대상체에게 제약상 허용되는 투여 형태로 투여된다. 이들은 볼루스로서 또는 소정 기간에 걸친 연속적으로 정맥내로, 근육내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 투여될 수 있다. 단백질은 또한 국소뿐만 아니라 전신 치료 효과를 발휘하기 위해 종양내, 종양주위, 병변내, 또는 병변주위 경로에 의해 투여될 수 있다. 적합한 제약상 허용되는 담체, 희석제, 및 부형제는 널리 공지되어 있고 임상 상황 근거로서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 적합한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예는: (1) 약 1 mg/ml 내지 25 mg/ml 인간 혈청 알부민을 함유하는 둘베코 포스페이트 완충 염수, pH 약 7.4, (2) 0.9% 염수 (0.9% w/v NaCl), 및 (3) 5% (w/v) 덱스트로스를 포함한다. 본 발명의 방법은 시험관내, 생체내, 또는 생체외에서 실시될 수 있다.
공-투여되든 또는 순차적으로 투여되든 단백질 및 1종 이상의 추가의 치료제의 투여는 치료 용도에 대해 상기 기재된 바와 같이 발생할 수 있다. 공-투여에 적합한 제약상 허용되는 담체, 희석제, 및 부형제는 공-투여될 특정한 치료제의 정체성에 따라 달라진다는 것은 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
동결건조되기보다는 수성 투여 형태로 존재하는 경우에, 단백질은 전형적으로 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 농도로 제제화될 것이지만, 이들 범위의 밖의 광범위한 변동이 허용된다. 질환의 치료를 위해, 단백질의 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 단백질이 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지의 여부, 선행 요법의 경과, 환자의 임상 병력 및 융합체에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 결정될 것이다. 단백질은 적합하게는 환자에게 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여된다.
치료 유효 용량은 투여되는 대상체에 대해 치료 효과를 생성하는 용량을 지칭한다. 정확한 용량은 치료될 장애에 따라 달라질 것이고, 공지된 기술을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있다. 바람직한 투여량은 약 10 mg/제곱 미터 내지 약 2000 mg/제곱 미터, 보다 바람직하게는 약 50 mg/제곱 미터 내지 약 1000 mg/제곱 미터의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-GPC3애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC는 1일 약 0.01 μg/kg 내지 약 50 mg/kg, 1일 0.01 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 또는 1일 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg으로 투여된다.
항-GPC3애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC는 매일 (예를 들어, 1일 1회, 2회, 3회, 또는 4회) 또는 보다 덜 빈번하게 (예를 들어, 격일 1회, 매주 1회 또는 2회, 2주마다 1회, 3주마다 1회 또는 매월) 제공될 수 있다. 또한, 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 연령뿐만 아니라 체중, 전반적 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호작용, 및 질환의 중증도에 대한 조정이 필요할 수 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의한 상용 실험으로 확인가능할 것이다.
IX. 치료 방법
본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴 및 그의 약물 접합체는 GPC3, 예를 들어 건강한 조직에 비해, 예를 들어 높은 수준의 GPC3을 발현하는 종양 세포를 갖는 암의 치료에 사용하는 데 적합하다. 일부 실시양태에서, 암은 간암 (예를 들어, 간세포성 암종 (HCC) 또는 간모세포종), 흑색종, 육종, 폐암 (예를 들어, 편평 폐암) 및 윌름스 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가적으로, 본원에 기재된 GPC3 애드넥틴은 불응성 또는 재발성 악성종양의 치료에 사용하는 데 적합하다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 바람직한 대상체는 GPC3 활성 또는 높은 수준의 GPC3을 발현하는 바람직하지 않은 세포에 의해 매개되는 장애를 갖는 인간 환자를 포함한다. 항-GPC3 애드넥틴 또는 그의 약물 접합체가 또 다른 작용제와 함께 투여되는 경우에, 이 둘은 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다.
예를 들어, 항-GPC3 애드넥틴, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 그의 약물 접합체는 생체내 또는 시험관내에서 하기 생물학적 활성 중 하나 이상을 도출하는 데 사용될 수 있다: GPC3을 발현하는 세포의 성장을 억제하고/거나 GPC3을 발현하는 세포를 사멸시키는 것; 인간 이펙터 세포의 존재 하에 GPC3을 발현하는 세포의 식세포작용 또는 ADCC를 매개하는 것, 또는 예를 들어, GPC3 리간드가 GPC3에 결합하는 것을 차단함으로써, GPC3 활성을 잠재적으로 조정하는 것.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC는 면역원성 작용제, 예를 들어, 암성 세포의 제제, 정제된 종양 항원 (재조합 단백질, 펩티드, 및 탄수화물 분자를 포함함), 항원-제시 세포 예컨대 종양-연관 항원을 보유하는 수지상 세포, 및 면역 자극 시토카인을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포와 조합된다 (He et al., 2004). 사용될 수 있는 종양 백신의 비제한적 예는 흑색종 항원의 펩티드, 예컨대 gpl00, MAGE 항원, Trp-2, MARTI 및/또는 티로시나제의 펩티드, 또는 시토카인 GM-CSF를 발현하도록 형질감염된 종양 세포를 포함한다. GPC3 차단은 또한 화학요법제 요법, 방사선, 수술, 호르몬 박탈 및 혈관신생 억제제를 포함하는 표준 암 치료뿐만 아니라 또 다른 면역요법제 (예를 들어, 항-PD-1, 항-CTLA-4, 및 항-LAG-3 애드넥틴 또는 항체)와 효과적으로 조합될 수 있다.
항-GPC3 애드넥틴 및/또는 항-GPC3 AdxDC가 대상체에서 면역 반응을 자극하여 면역 반응을 증진시키거나, 자극하거나 또는 상향조절하는 데 효과적인 1종 이상의 추가의 작용제, 예를 들어, 소분자 약물, 항체 또는 그의 항원 결합 부분과 함께 (동시에 또는 연속적으로) 투여되는 조합 요법의 방법이 본원에 제공된다.
일반적으로, 항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC, 예를 들어, 본원에 기재된 것은 면역 세포, 예컨대 T 세포에 대한 면역-종양학 작용제, 예를 들어, (i) 자극 (예를 들어, 공동-자극) 분자 (예를 들어, 수용체 또는 리간드)의 효능제 및/또는 (ii) 억제 신호 또는 분자 (예를 들어, 수용체 또는 리간드)의 길항제와 조합될 수 있고, 이들 둘 다는 면역 반응, 예컨대 항원-특이적 T 세포 반응을 증폭시킨다. 특정 측면에서, 면역-종양학 작용제는 선천성 면역에 수반되는 세포, 예를 들어, NK 세포에 대한 (i) 자극 (공동-자극을 포함함) 분자 (예를 들어, 수용체 또는 리간드)의 효능제 또는 (ii) 억제 (공동-억제를 포함함) 분자 (예를 들어, 수용체 또는 리간드)의 길항제이며, 여기서 면역-종양학 작용제는 선천성 면역을 증진시킨다. 이러한 면역-종양학 작용제는 종종 면역 체크포인트 조절제, 예를 들어, 면역 체크포인트 억제제 또는 면역 체크포인트 자극제로 지칭된다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC는 이뮤노글로불린 슈퍼 패밀리 (IgSF)의 구성원인 자극 또는 억제 분자를 표적화하는 작용제와 함께 투여된다. 예를 들어, 항-GPC3 애드넥틴 및 또는 항-GPC3 AdxDC, 예를 들어, 본원에 기재된 것은 면역 반응을 증가시키기 위해 IgSF 패밀리의 구성원을 표적화하는 작용제와 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC는 B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), 및 B7-H6을 포함하는, 막-결합 리간드의 B7 패밀리의 구성원을 표적화하는 (또는 그에 특이적으로 결합하는) 작용제 또는 B7 패밀리 구성원에 특이적으로 결합하는 공동-자극 또는 공동-억제 수용체와 함께 투여될 수 있다.
항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC는 또한 TNF 및 TNFR 패밀리의 구성원인 분자 (리간드 또는 수용체), 예컨대 CD40 및 CD40L, OX-40, GITR, GITRL, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTβR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDA1, EDA2, TNFR1, 림프독소 α/TNFβ, TNFR2, TNFα, LTβR, 림프독소 α 1β2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, 및 NGFR을 표적화하는 작용제와 함께 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1] 참조).
T 세포 반응은 하기 작용제 중 1종 이상을 투여함으로써 자극될 수 있다:
(1) 상기 기재된 바와 같은 T 세포 활성화를 억제하는 단백질 (예를 들어, 면역 체크포인트 억제제), 예컨대 CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, 및 LAG-3, 및 하기 단백질: TIM-3, 갈렉틴 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, 갈렉틴-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, B7-H3, B7-H4, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1, 및 TIM-4 중 어느 것의 길항제 (억제제 또는 차단제); 및/또는
(2) T 세포 활성화를 자극하는 단백질, 예컨대 B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, CD40, DR3 및 CD28H의 효능제.
상기 단백질 중 1종을 조정하고 암을 치료하기 위해 항-GPC3 애드넥틴 및/또는 항-GPC3 AdxDC, 예를 들어, 본원에 기재된 것과 조합될 수 있는 예시적인 작용제는 하기를 포함한다: 예르보이(Yervoy)TM (이필리무맙) 또는 트레멜리무맙 (CTLA-4에 대한 것), 갈릭시맙 (B7.1에 대한 것), BMS-936558 (PD-1에 대한 것), MK-3475 (PD-1에 대한 것), AMP224 (B7DC에 대한 것), BMS-936559 (B7-H1에 대한 것), MPDL3280A (B7-H1에 대한 것), MEDI-570 (ICOS에 대한 것), AMG557 (B7H2에 대한 것), MGA271 (B7H3에 대한 것), IMP321 (LAG-3에 대한 것), BMS-663513 (CD137에 대한 것), PF-05082566 (CD137에 대한 것), CDX-1127 (CD27에 대한 것), 항-OX40 (프로비던스 헬스 서비시즈(Providence Health Services)), huMAbOX40L (OX40L에 대한 것), 아타시셉트 (TACI에 대한 것), CP-870893 (CD40에 대한 것), 루카투무맙 (CD40에 대한 것), 다세투주맙 (CD40에 대한 것), 무로모납-CD3 (CD3에 대한 것), 이필리무맙 (CTLA-4에 대한 것) 및/또는 MK4166.
항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC는 또한 피딜리주맙 (CT-011)과 함께 투여될 수 있지만, PD-1 결합에 대한 그의 특이성이 의문이다.
암의 치료를 위해 항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC와 조합될 수 있는 다른 분자는 NK 세포에 대한 억제 수용체의 길항제 또는 NK 세포에 대한 활성화 수용체의 효능제를 포함한다. 예를 들어, 항-GITR 효능제 항체는 KIR의 길항제 (예를 들어, 리릴루맙)와 조합될 수 있다.
T 세포 활성화는 또한 가용성 시토카인에 의해 조절되고, 항 GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC는 T 세포 활성화를 억제하는 시토카인의 길항제 또는 T 세포 활성화를 자극하는 시토카인의 효능제와 함께, 예를 들어, 암을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC는 면역 반응을 자극하기 위해, 예를 들어, 증식성 질환, 예컨대 암을 치료하기 위해 (i) T 세포 활성화를 억제하는 IgSF 패밀리 또는 B7 패밀리 또는 TNF 패밀리의 단백질의 길항제 (또는 억제제 또는 차단제) 또는 T 세포 활성화를 억제하는 시토카인 (예를 들어, IL-6, IL-10, TGF-ß, VEGF; "면역억제 시토카인")의 길항제 및/또는 (ii) T 세포 활성화를 자극하는 IgSF 패밀리, B7 패밀리 또는 TNF 패밀리의 자극 수용체 또는 시토카인의 효능제와 조합되어 사용될 수 있다.
조합 요법을 위한 또 다른 작용제는 CSF-1R 길항제 예컨대 RG7155 (WO11/70024, WO11/107553, WO11/131407, WO13/87699, WO13/119716, WO13/132044) 또는 FPA-008 (WO11/140249; WO13169264; WO14/036357)을 포함하는 CSF-1R 길항제 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 대식세포 또는 단핵구를 억제하거나 또는 고갈시키는 작용제를 포함한다.
항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC는 또한 TGF-β 신호전달을 억제하는 작용제와 함께 투여될 수 있다.
항-GPC3 애드넥틴 및 또는 항-GPC3 AdxDC와 조합될 수 있는 추가의 작용제는 종양 항원 제시를 증진시키는 작용제, 예를 들어, 수지상 세포 백신, GM-CSF 분비 세포 백신, CpG 올리고뉴클레오티드, 및 이미퀴모드, 또는 종양 세포의 면역원성을 증진시키는 요법 (예를 들어, 안트라시클린)을 포함한다.
항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC와 조합될 수 있는 또 다른 요법은 Treg 세포를 고갈시키거나 또는 차단하는 요법, 예를 들어, CD25에 특이적으로 결합하는 작용제를 포함한다.
항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC와 조합될 수 있는 또 다른 요법은 대사 효소 예컨대 인돌아민 디옥시게나제 (IDO), 디옥시게나제, 아르기나제, 또는 산화질소 신테타제를 억제하는 요법이다.
항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC와 함께 사용될 수 있는 또 다른 부류의 작용제는 아데노신의 형성을 억제하거나 또는 아데노신 A2A 수용체를 억제하는 작용제를 포함한다.
암을 치료하기 위해 항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC와 조합될 수 있는 다른 요법은 T 세포 무반응 또는 소진을 역전/방지하는 요법 및 종양 부위에서의 선천성 면역 활성화 및/또는 염증을 촉발하는 요법을 포함한다.
항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC는 1종 초과의 면역-종양학 작용제와 조합될 수 있고, 예를 들어, 면역 경로의 다중 요소를 표적화하는 조합 접근법, 예컨대 하기 중 하나 이상과 조합될 수 있다: 종양 항원 제시를 증진시키는 요법 (예를 들어, 수지상 세포 백신, GM-CSF 분비 세포 백신, CpG 올리고뉴클레오티드, 이미퀴모드); 예를 들어, CTLA-4 및/또는 PD1/PD-L1/PD-L2 경로를 억제하고/거나 Treg 또는 다른 면역 억제 세포를 고갈시키거나 또는 차단함으로써 음성 면역 조절을 억제하는 요법; 예를 들어, CD-137, OX-40, 및/또는 GITR 경로를 자극하고/거나 T 세포 이펙터 기능을 자극하는 효능제로 양성 면역 조절을 자극하는 요법; 항-종양 T 세포의 빈도를 전신에서 증가시키는 요법; 예를 들어, CD25의 길항제 (예를 들어, 다클리주맙)를 사용하여 또는 생체외 항-CD25 비드 고갈에 의해 Treg, 예컨대 종양에서의 Treg를 고갈시키거나 또는 억제하는 요법; 종양에서의 억제 골수 세포의 기능에 영향을 미치는 요법; 종양 세포의 면역원성을 증진시키는 요법 (예를 들어, 안트라시클린); 유전자 변형된 세포, 예를 들어, 키메라 항원 수용체에 의해 변형된 세포 (CAR-T 요법)를 포함하는 입양 T 세포 또는 NK 세포 전달; 대사 효소 예컨대 인돌아민 디옥시게나제 (IDO), 디옥시게나제, 아르기나제, 또는 산화질소 신테타제를 억제하는 요법; T 세포 무반응 또는 소진을 역전/방지하는 요법; 종양 부위에서의 선천성 면역 활성화 및/또는 염증을 촉발하는 요법; 면역 자극 시토카인의 투여; 또는 면역 억제 시토카인의 차단.
본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴 및 또는 항-GPC3 AdxDC는 양성 공동자극 수용체를 라이게이션하는 효능작용제, 억제 수용체를 통한 신호전달을 약화시키는 차단제, 길항제, 및 항-종양 T 세포의 빈도를 전신에서 증가시키는 1종 이상의 작용제, 종양 미세환경 내의 별개의 면역 억제 경로를 극복하는 (예를 들어, 억제 수용체 진입 (예를 들어, PD-L1/PD-1 상호작용)을 차단하거나, Treg를 고갈시키거나 또는 억제하거나 (예를 들어, 항-CD25 모노클로날 항체 (예를 들어, 다클리주맙)를 사용하거나 또는 생체외 항-CD25 비드 고갈에 의함), 대사 효소 예컨대 IDO를 억제하거나, 또는 T 세포 무반응 또는 소진을 역전/방지하는) 작용제 및 종양 부위에서의 선천성 면역 활성화 및/또는 염증을 촉발하는 작용제 중 1종 이상과 함께 사용될 수 있다.
암을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기재된 임의의 항-GPC3 애드넥틴의 용도가 본원에 제공된다. 본 개시내용은 본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴을 사용하는 치료 방법의 모든 실시양태에 상응하는 본원에 기재된 임의의 항-GPC3 애드넥틴의 의학적 용도를 제공한다.
XI. 검출가능한 표지
본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴은 또한 다양한 진단 및 영상화 용도에 유용하다. 특정 실시양태에서, 항-GPC3 애드넥틴은 생체내에서 검출가능한 모이어티로 표지되고 이러한 표지된 애드넥틴은, 예를 들어, 전신 영상화를 위한 생체내 영상화제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 대상체에서 GPC3 양성 종양을 검출하는 방법은 검출가능한 표지에 연결된 항-GPC3 애드넥틴을 대상체에게 투여하고, 적절한 시간 후에, 대상체에서 표지를 검출하는 것을 포함한다.
항-GPC3 애드넥틴 영상화제는 증가된 수준의 GPC3과 연관된 장애 또는 질환, 예를 들어, 종양이 GPC3을 선택적으로 과다발현하는 암을 진단하는 데 사용될 수 있다. 유사한 방식으로, 항-GPC3 애드넥틴은 대상체, 예를 들어, GPC3 수준 및/또는 GPC3 양성 세포 (예를 들어, 종양 세포)를 감소시키기 위해 치료되고 있는 대상체에서 GPC3 수준을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 항-GPC3 애드넥틴은 변형의 존재 또는 부재 하에 사용될 수 있고, 검출가능한 모이어티의 공유 또는 비-공유 부착에 의해 표지될 수 있다.
검출가능한 표지는 금속 졸 예컨대 콜로이드성 금을 포함하는 미립자 표지, 예를 들어 N2S2, N3S 또는 N4 유형의 펩티드성 킬레이트화제와 함께 제시된 동위원소 예컨대 I125 또는 Tc99, 형광 마커, 비오틴, 발광 마커, 인광 마커 등을 포함하는 발색단뿐만 아니라 주어진 기질을 검출가능한 마커로 전환시키는 효소 표지, 및 증폭 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 후 나타나는 폴리뉴클레오티드 태그를 포함하는 시험관내 진단 분야에서 현재 사용되는 다양한 유형 중 어느 것일 수 있다. 비오티닐화 항-GPC3 FBS는 이어서 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합에 의해 검출가능할 것이다. 적합한 효소 표지는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 등을 포함한다. 예를 들어, 표지는 1,2 디옥세탄 기질 예컨대 아다만틸 메톡시 포스포릴옥시 페닐 디옥세탄 (AMPPD), 이나트륨 3-(4-(메톡시스피로{1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로{3.3.1.1 3,7}데칸}-4-일) 페닐 포스페이트 (CSPD)뿐만 아니라 CDP 및 CDP-STAR® 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 발광 기질, 예를 들어 적합한 란타나이드 예컨대 테르븀(III) 및 유로퓸(III)의 킬레이트의 전환 후 화학발광의 존재 또는 형성을 측정함으로써 검출되는 효소 알칼리성 포스파타제일 수 있다.
사용될 수 있는 검출가능한 모이어티는 방사성 작용제, 예컨대: 방사성 중금속 예컨대 철 킬레이트, 가돌리늄 또는 망가니즈의 방사성 킬레이트, 산소, 질소, 철, 탄소, 또는 갈륨의 양전자 방출체, 18F 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 124I, 86Y, 89Zr, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 44Sc, 47Sc, 11C, 111In, 114mIn, 114In, 125I, 124I, 131I, 123I, 131I, 123I, 32Cl, 33Cl, 34Cl, 74Br, 75Br, 76Br, 77Br, 78Br, 89Zr, 186Re, 188Re, 86Y, 90Y, 177Lu, 99Tc, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 225Ac, 또는 153Sm을 포함한다.
검출 수단은 선택된 표지에 의해 결정된다. 표지 또는 그의 반응 생성물의 출현은 표지가 미립자이고 적절한 수준으로 축적된 경우에, 육안을 사용하거나, 또는 기기 예컨대 분광광도계, 발광측정기, 형광계 등을 모두 표준 실시에 따라 사용하여 달성될 수 있다.
검출가능한 모이어티는 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 시스테인에 연결될 수 있다. 검출가능한 모이어티가 방사성 작용제, 예를 들어, 본원에 추가로 기재된 것인 경우에, 검출가능한 모이어티는 시스테인과 반응성인 킬레이트화제, 예컨대 말레이미드 함유 킬레이트화제, 예컨대 말레이미드-NODAGA 또는 말레이미드-DBCO를 통해 FBS에 연결된다. 말레이미드-NODAGA 또는 말레이미드-DBCO는 (예를 들어, 적어도 1개의 X가 시스테인인 PmXn 모이어티를 통해) FBS의 C-말단 상의 시스테인과 반응하여, 각각 FBS-NODAGA 또는 FBS-DBCO를 수득할 수 있다. 하기 킬레이트화제 중 어느 하나가 사용될 수 있으며, 단 이는 시스테인과 반응하는 반응성 모이어티를 포함하거나, 또는 포함하도록 변형될 수 있다: DFO, DOTA 및 그의 유도체 (CB-DO2A, 3p-C-DEPA, TCMC, Oxo-DO3A), TE2A, CB-TE2A, CB-TE1A1P, CB-TE2P, MM-TE2A, DM-TE2A, 디암사르 및 유도체, NODASA, NODAGA, NOTA, NETA, TACN-TM, DTPA, 1B4M-DTPA, CHX-A"-DTPA, TRAP (PRP9), NOPO, AAZTA 및 유도체 (DATA), H2데드파, H4옥타파, H2아자파, H5데카파, H6포스파, HBED, SHBED, BPCA, CP256, PCTA, HEHA, PEPA, EDTA, TETA, 및 TRITA 기반 킬레이트화제, 및 그의 근접한 유사체 및 유도체.
특정 실시양태에서, FBS는 PET 추적자로 표지되고 생체내 영상화제로서 사용된다. 예를 들어, FBS는 PET 추적자 64Cu로 표지될 수 있다. 64Cu는 킬레이트화제, 예컨대 말레이미드-NODAGA를 사용하여 C-말단 시스테인을 갖는 FBS에 연결될 수 있다.
본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴-기반 영상화제를 합성하기 위해 폴리펩티드를 방사성핵종 예컨대 64Cu 및 18F로 표지하는 다른 관련 기술분야에 인지된 방법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [US2014/0271467; Gill et al., Nature Protocols 2011;6:1718-25; Berndt et al. Nuclear Medicine and Biology 2007;34:5-15, Inkster et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2013;23:3920-6]을 참조하고, 그 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시양태에서, GPC3 영상화제는 영상화제의 혈액 PK를 소량 증분으로 증가시켜 항-GPC3 애드넥틴 기반 영상화제의 영상화 콘트라스트를 증진시키거나 또는 그의 결합력을 증가시키기 위해 PEG 분자 (예를 들어, 5KDa PEG, 6KDa PEG, 7KDa PEG, 8KDa PEG, 9KDa PEG, 또는 10KDa PEG)를 포함한다.
XI. GPC3의 검출
생체내 검출 방법
특정 실시양태에서, 표지된 항-GPC3 애드넥틴은 GPC3-양성 세포 또는 조직, 예를 들어, GPC3 발현 종양을 영상화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 표지된 항-GPC3 애드넥틴은 관심 조직 (예를 들어, GPC3-발현 종양) 내로 표지된 애드넥틴을 흡수시키기에 충분한 양으로 대상체에게 투여된다. 대상체는 이어서 사용된 특정한 방사성핵종에 적절한 양의 시간 동안 영상화 시스템 예컨대 PET를 사용하여 영상화된다. 표지된 항-GPC3 애드넥틴-결합 GPC3-발현 세포 또는 조직, 예를 들어, GPC3-발현 종양이 이어서 영상화 시스템에 의해 검출된다.
GPC3 영상화제를 사용한 PET 영상화는 GPC3을 정성적으로 또는 정량적으로 검출하는 데 사용될 수 있다. GPC3 영상화제는 바이오마커로서 사용될 수 있고, 대상체에서의 GPC3 양성 신호의 존재 또는 부재는, 예를 들어, 대상체가 주어진 요법, 예를 들어, 암 요법에 반응성인지, 또는 대상체가 요법에 반응하고 있는지 또는 그렇지 않은지를 나타낼 수 있다.
특정 실시양태에서, 질환 (예를 들어, 종양)의 진행 또는 퇴행은 시간 또는 치료의 함수로서 영상화될 수 있다. 예를 들어, 종양의 크기는 암 요법 (예를 들어, 화학요법, 방사선요법)을 받는 대상체에서 모니터링될 수 있고 종양의 퇴행의 정도는 표지된 항-GPC3 애드넥틴의 검출에 기초하여 실시간으로 모니터링될 수 있다.
관심 세포 또는 조직 (예를 들어, 종양) 내로 영상화제 (예를 들어, 18F-애드넥틴 영상화제, 64Cu-애드넥틴 영상화제)를 흡수시키는 데 유효한 양은, 예를 들어, 숙주의 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 및 식이; 투여 시간; 투여 경로; 사용된 특정한 프로브의 배출 속도; 치료의 지속시간; 사용된 특정한 조성물과 조합되어 또는 동시에 사용된 다른 약물의 존재; 및 다른 인자를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다.
특정 실시양태에서, GPC3을 발현하는 조직의 영상화는 표지된 항-GPC3 애드넥틴의 투여 전, 그 동안, 및 그 후에 실시된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴은 폐, 심장, 신장, 간, 및 피부, 및 다른 기관, 또는 GPC3을 발현하는 이들 기관과 연관된 종양의 PET 영상화에 유용하다.
특정 실시양태에서, 항-GPC3 영상화제는 적어도 50%, 75%, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과의 콘트라스트를 제공한다. 실시예는 사용된 모든 항-GPC3 애드넥틴이 2 이상의 PET 콘트라스트를 제공하고, 애드넥틴의 친화도는 중요하지 않았다는 것을 제시한다.
짧은 반감기 방사성핵종 (예를 들어, 18F)을 사용한 영상화 (예를 들어, PET)에 사용되는 경우에, 방사성표지된 항-GPC3 애드넥틴은 바람직하게는 정맥내로 투여된다. 다른 투여 경로가 또한 적합하고 이는 사용된 방사성핵종의 반감기에 따라 달라진다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GPC3 영상화제는 대상체에게 본원에 개시된 항-GPC3 영상화제를 투여하고, 영상화제를 검출함으로써 대상체에서 GPC3 양성 세포를 검출하는 데 사용되고, 검출된 영상화제는 대상체에서의 GPC3 양성 세포의 위치를 정한다. 특정 실시양태에서, 영상화제는 양전자 방출 단층촬영에 의해 검출된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GPC3 영상화제는 대상체에게 본원에 개시된 항-GPC3 영상화제를 투여하고, 영상화제를 검출함으로써 대상체에서 GPC3 발현 종양을 검출하는 데 사용되고, 검출된 영상화제는 대상체에서의 종양의 위치를 정한다. 특정 실시양태에서, 영상화제는 양전자 방출 단층촬영에 의해 검출된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-GPC3 영상화제의 영상은 대상체에게 영상화제를 투여하고 양전자 방출 단층촬영에 의해 영상화제의 생체내 분포를 영상화함으로써 수득된다.
따라서, GPC3을 발현하는 세포 또는 조직을 본원에 기재된 항-GPC3 영상화제와 접촉시키고 양전자 방출 단층촬영을 사용하여 GPC3을 발현하는 조직을 검출하거나 또는 정량화하는 것을 포함하는, GPC3을 발현하는 조직 또는 세포의 정량적 영상을 수득하는 방법이 본원에 제공된다.
GPC3-발현 종양을 갖는 대상체에게 본원에 기재된 항-GPC3 영상화제의 영상화-유효량을 투여하고, 양전자 방출 단층촬영을 사용하여 종양에서의 상기 영상화제의 방사성 방출을 검출하는 것을 포함하는, GPC3-발현 종양을 검출하는 방법이 또한 본원에 제공되며, 여기서 방사성 방출은 종양에서 검출된다.
하기를 포함하는, 대상체에서 GPC3-발현 종양의 존재를 진단하는 방법이 또한 본원에 제공한다.
ㆍ GPC3-발현 종양의 진단을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 항-GPC3 영상화제를 투여하는 것; 및
ㆍ 대상체의 적어도 일부의 방사성-영상을 수득하여 영상화제의 존재 또는 부재를 검출하는 것;
ㆍ 여기서 배경을 초과하는 영상화제의 존재 및 위치는 질환의 존재 및 위치를 나타낸다.
하기를 포함하는, 대상체에서 GPC3-발현 종양에 대한 항-종양 요법의 진행을 모니터링하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
ㆍ 제1 시점에서 GPC3-발현 종양에 대한 항-종양 요법의 진행의 모니터링을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 항-GPC3 영상화제를 투여하고 대상체의 적어도 일부의 영상을 수득하여 종양의 크기를 결정하는 것;
ㆍ 대상체에게 항-종양 요법을 투여하는 것;
ㆍ 1개 이상의 후속 시점에서 대상체에게 영상화제를 투여하고 각각의 시점에서의 대상체의 적어도 일부의 영상을 수득하는 것;
ㆍ 여기서 각각의 시점에서의 종양의 치수 및 위치는 질환의 진행을 나타낸다.
시험관내 검출 방법
GPC3을 생체내에서 검출하는 것 이외에도, 항-PDL1 애드넥틴, 예컨대 본원에 기재된 것을 사용하여 샘플 내의 표적 분자를 검출할 수 있다. 방법은 샘플을 본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴과 접촉시키고, 여기서 상기 접촉은 항-GPC3 애드넥틴-표적 복합체가 형성되도록 하는 조건 하에 수행되고; 상기 복합체를 검출하여, 상기 샘플 내의 상기 표적을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 검출은 임의의 관련 기술분야에 인지된 기술, 예컨대, 예를 들어, 방사선촬영, 면역학적 검정, 형광 검출, 질량 분광분석법, 또는 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 수행할 수 있다. 샘플은 인간 또는 다른 포유동물로부터의 것일 수 있다. 진단 목적을 위한 적절한 작용제는 전신 영상화를 위한 방사성동위원소, 및 샘플 시험을 위한 방사성동위원소, 효소, 형광 표지 및 다른 적합한 항체 태그를 포함하는 검출가능한 표지이다.
검출가능한 표지는 금속 졸 예컨대 콜로이드성 금을 포함하는 미립자 표지, 예를 들어 N2S2, N3S 또는 N4 유형의 펩티드성 킬레이트화제와 함께 제시된 동위원소 예컨대 I125 또는 Tc99, 형광 마커, 비오틴, 발광 마커, 인광 마커 등을 포함하는 발색단뿐만 아니라 주어진 기질을 검출가능한 마커로 전환시키는 효소 표지, 및 증폭 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 후 나타나는 폴리뉴클레오티드 태그를 포함하는 시험관내 진단 분야에서 현재 사용되는 다양한 유형 중 어느 것일 수 있다. 비오티닐화 FBS는 이어서 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합에 의해 검출가능할 것이다. 적합한 효소 표지는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 등을 포함한다. 예를 들어, 표지는 1,2 디옥세탄 기질 예컨대 아다만틸 메톡시 포스포릴옥시 페닐 디옥세탄 (AMPPD), 이나트륨 3-(4-(메톡시스피로{1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로{3.3.1.1 3,7}데칸}-4-일) 페닐 포스페이트 (CSPD)뿐만 아니라 CDP 및 CDP-star® 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 발광 기질, 예를 들어 적합한 란타나이드 예컨대 테르븀(III) 및 유로퓸(III)의 킬레이트의 전환 후 화학발광의 존재 또는 형성을 측정함으로써 검출되는 효소 알칼리성 포스파타제일 수 있다. 다른 표지는 상기 영상화 섹션에 제시된 것을 포함한다. 검출 수단은 선택된 표지에 의해 결정된다. 표지 또는 그의 반응 생성물의 출현은 표지가 미립자이고 적절한 수준으로 축적된 경우에, 육안을 사용하거나, 또는 기기 예컨대 분광광도계, 발광측정기, 형광광도계 등을 모두 표준 실시에 따라 사용하여 달성될 수 있다
XII. 키트 및 제조 물품
본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴 및 그의 약물 접합체는 본원에 기재된 치료 또는 진단 방법에서의 사용에 대한 지침서와 함께 미리 결정된 양의 시약의 패키지된 조합인 키트에 제공될 수 있다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에, 또는 본원에 기재된 검출 방법에 사용하는 데 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 시린지, 및 시험 튜브를 포함한다. 용기는 다양한 물질 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 생체내 영상화를 위한 본원에 기재된 조성물을 보유할 수 있고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 활성제는 본원에 기재된 항-GPC3 애드넥틴 또는 항-GPC3 AdxDC이다. 제조 물품은 제약상-허용되는 완충제, 예컨대 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 사용에 대한 지침서를 갖는 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
예시적 실시양태
1. BC, DE 및 FG 루프를 포함하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 (FBS)를 포함하는 폴리펩티드이며, 여기서 루프 중 1개 이상은 야생형 FBS 도메인의 상응하는 루프에 비해 변경되고, 폴리펩티드는 인간 글리피칸-3 (GPC3)에 1 μM 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩티드.
2. 실시양태 1에 있어서, FBS가 피브로넥틴 유형 III (Fn3) 도메인인 폴리펩티드.
3. 실시양태 2에 있어서, Fn3 도메인이 인간 제10 피브로넥틴 유형 III (10Fn3) 도메인인 폴리펩티드.
4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 한 실시양태에 있어서, BC 루프가
(a) 서열식별번호: 6, 19, 32, 45, 58, 71, 84 또는 99; 및
(b) 서열식별번호: 6, 19, 32, 45, 58, 71, 84 또는 99의 BC 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 BC 루프
로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, DE 루프가
(a) 서열식별번호: 7, 20, 33, 46, 59, 72, 85 또는 100; 및
(b) 서열식별번호: 7, 20, 33, 46, 59, 72, 85 또는 100의 DE 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 DE 루프
로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, FG 루프가
(a) 서열식별번호: 8, 21, 34, 47, 60, 73, 86, 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 또는 318, 및
(b) 서열식별번호: 8, 21, 34, 47, 60, 73, 86, 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 또는 318의 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 FG 루프
로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 한 실시양태에 있어서, 각각 BC 루프가 서열식별번호: 6, 19, 32, 45, 58, 71, 84 또는 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; DE 루프가 서열식별번호: 7, 20, 33, 46, 59, 72, 85 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; FG 루프가 서열식별번호: 8, 21, 34, 47, 60, 73, 86, 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 및 318로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 임의로, BC, DE 및/또는 FG 루프는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드.
8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 한 실시양태에 있어서,
(a) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8을 포함하고;
(b) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 6, 7 및 8의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하고;
(c) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21을 포함하고;
(d) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 19, 20 및 22의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하고;
(e) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 32, 33 및 34를 포함하고;
(f) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 32, 33 및 34의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하고;
(g) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 45, 46 및 47을 포함하고;
(h) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 45, 46 및 47의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하고;
(i) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 58, 59 및 60을 포함하고;
(j) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 58, 59 및 60의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하고;
(k) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 71, 72 및 73을 포함하고;
(l) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 71, 72 및 73의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하고;
(m) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 84, 85 및 86을 포함하고;
(n) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 84, 85 및 86의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하고;
(o) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 101을 포함하고;
(p) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 99, 100 및 101의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드.
9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS가 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는
(a) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
(c) 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(d) 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
(e) 각각 서열식별번호: 32, 33 및 34에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(f) 서열식별번호: 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
(g) 각각 서열식별번호: 45, 46 및 47에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(h) 서열식별번호: 45, 46 및 47의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
(i) 각각 서열식별번호: 58, 59 및 60에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(j) 서열식별번호: 58, 59 및 60의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
(k) 각각 서열식별번호: 71, 72 및 73에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(l) 서열식별번호: 71, 72 및 73의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
(m) 각각 서열식별번호: 84, 85 및 86에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(n) 서열식별번호: 84, 85 및 86의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
(o) 각각 서열식별번호: 99, 100 및 101에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
(p) 서열식별번호: 99, 100 및 101의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
(q) 서열식별번호: 99, 100 및 129의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
(r) 서열식별번호: 99, 100 및 156의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
(s) 서열식별번호: 99, 100 및 183의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
(t) 서열식별번호: 99, 100 및 210의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
(u) 서열식별번호: 99, 100 및 237의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
(v) 서열식별번호: 99, 100 및 264의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
(w) 서열식별번호: 99, 100 및 264의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나; 또는
(x) 서열식별번호: 99, 100 및 318의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하는
폴리펩티드.
10. 실시양태 1 내지 9 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS가 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 및 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
11. 실시양태 1 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS가 서열식별번호: 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 및 98 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
12. 실시양태 1 내지 11 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS가 서열식별번호: 5, 9-18, 22-31, 35-44, 48-57, 61-70, 74-83, 87-98, 102-128, 130-155, 157-182, 184-209, 211-236, 238-263, 265-290, 292-317 또는 319-343 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
13. 실시양태 1 내지 12 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS가 서열식별번호: 98, 102-128, 129-155, 157-182, 184-209, 211-236, 238-263, 265-290, 292-317 및 319-343의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩티드.
14. 실시양태 1 내지 13 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS가 서열식별번호: 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83, 98, 128, 155, 182, 209, 209, 236, 263, 290 및 317로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
15. 실시양태 1 내지 14 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS가 서열식별번호: 5, 9-18, 22-31, 35-44, 48-57, 61-70, 74-83, 87-98, 102-128, 130-155, 157-182, 184-209, 211-236, 238-263, 265-290, 292-317 및 319-343으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
16. 실시양태 1 내지 15 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS가 서열식별번호: 98, 102-128, 129-155, 157-182, 184-209, 211-236, 238-263, 265-290, 292-317 및 319-343으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS가 글리피칸-3과의 결합에 대해 서열식별번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 FBS와 경쟁하는 것인 폴리펩티드.
18. 실시양태 1 내지 17 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS가 HQVSFF (서열식별번호: 209)를 포함하는 글리피칸-3 내의 10-20개의 아미노산 잔기의 영역에 결합하는 것인 폴리펩티드.
19. 실시양태 1 내지 18 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS가 EQLLQSASM (서열식별번호: 210)을 포함하는 글리피칸-3 내의 10-20개의 아미노산 잔기의 영역에 결합하는 것인 폴리펩티드.
20. 실시양태 1 내지 19 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS가 HQVSFF (서열식별번호: 209) 및 EQLLQSASM (서열식별번호: 210)을 포함하는 글리피칸-3 내의 불연속 애드넥틴 부위에 결합하는 것인 폴리펩티드.
21. 실시양태 1 내지 20 중 어느 한 실시양태에 있어서, 이종 단백질을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
22. 실시양태 1 내지 21 중 어느 한 실시양태에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜, 시알산, Fc, Fc 단편, 트랜스페린, 혈청 알부민, 혈청 알부민 결합 단백질, 및 혈청 이뮤노글로불린 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 약동학적 (PK) 모이어티를 추가로 포함하는 폴리펩티드.
23. 실시양태 1 내지 22 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS의 C-말단이 아미노산 서열 PmXn으로 이루어진 모이어티에 연결되며, 여기서 P는 프롤린이고, X는 임의의 아미노산이고, m은 적어도 1인 정수이고 n은 0 또는 적어도 1인 정수인 폴리펩티드.
24. 실시양태 23에 있어서, m이 1 또는 2이고, n이 1-10의 정수인 폴리펩티드.
25. 실시양태 23 또는 24에 있어서, 모이어티가 시스테인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
26. 실시양태 25에 있어서, 모이어티가 아미노산 서열 PmCXn으로 이루어지며, 여기서 C는 시스테인이고, 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산인 폴리펩티드.
27. 실시양태 25에 있어서, 모이어티가 아미노산 서열 PmCXn1CXn2로 이루어지며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산이고, n1 및 n2는 독립적으로 0 또는 적어도 1인 정수인 폴리펩티드.
28. 실시양태 28에 있어서, n1 및 n2가 독립적으로 1-5의 정수인 폴리펩티드.
29. 실시양태 23에 있어서, 모이어티가 PI, PC, PID, PIE, PIDK (서열식별번호: 382), PIEK (서열식별번호: 383), PIDKP (서열식별번호: 384), PIEKP (서열식별번호: 385), PIDKPS (서열식별번호: 386), PIEKPS (서열식별번호: 387), PIDKPC (서열식별번호: 388), PIEKPC (서열식별번호: 389), PIDKPSQ (서열식별번호: 390), PIEKPSQ (서열식별번호: 391), PIDKPCQ (서열식별번호: 392), PIEKPCQ (서열식별번호: 393), PHHHHHH (서열식별번호: 394) 및 PCHHHHHH (서열식별번호: 395)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 폴리펩티드.
30. 실시양태 26에 있어서, 모이어티가 PC 또는 PPC인 폴리펩티드.
31. 실시양태 27에 있어서, 모이어티가 PCGC (서열식별번호: 412), PCPC (서열식별번호: 413), PCGSGC (서열식별번호: 414), PCPPPC (서열식별번호: 415), PCPPPPPC(서열식별번호: 416), PCGSGSGC (서열식별번호: 417), PCHHHHHC (서열식별번호: 418), PCCHHHHHH (서열식별번호: 419), PCGCHHHHHH (서열식별번호: 420), PCPCHHHHHH (서열식별번호: 421), PCGSGCHHHHHH (서열식별번호: 422), PCPPPCHHHHHH (서열식별번호: 423), PCPPPPPHHHHHH (서열식별번호: 424) 및 PCGSGSGCHHHHHH (서열식별번호: 425)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 폴리펩티드.
32. 실시양태 31에 있어서, 모이어티가 PCPPPPPC (서열식별번호: 416)인 폴리펩티드.
33. 실시양태 25 내지 32 중 어느 한 실시양태에 있어서, C-말단 모이어티 내의 시스테인이 이종 모이어티에 접합된 것인 폴리펩티드.
34. 실시양태 33에 있어서, 이종 모이어티가 검출가능한 모이어티인 폴리펩티드.
35. 실시양태 33에 있어서, 이종 모이어티가 약물 모이어티이고, FBS 및 약물 모이어티가 FBS-약물 접합체를 형성하는 것인 폴리펩티드.
36. 실시양태 1 내지 31 중 어느 한 실시양태의 FBS 모이어티를 포함하는 FBS-약물 접합체이며, 여기서 약물 모이어티는 링커에 의해 FBS 모이어티에 접합된 것인 FBS-약물 접합체.
37. 실시양태 36에 있어서, 링커가 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 또는 펩티드-함유 링커인 FBS-약물 접합체.
38. 실시양태 37에 있어서, 링커가 펩티딜 링커인 FBS-약물 접합체.
39. 실시양태 38에 있어서, 펩티딜 링커가 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (서열식별번호: 467), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, 또는 Glu인 FBS-약물 접합체.
40. 실시양태 36 내지 39 중 어느 한 실시양태에 있어서, 약물 모이어티가 세포독성 약물인 FBS-약물 접합체.
41. 실시양태 40에 있어서, 세포독성 약물이
(a) 에네디인 예컨대 칼리케아미신 및 운시알라마이신;
(b) 튜부리신;
(c) DNA 알킬화제 예컨대 CC-1065의 유사체 및 두오카르마이신;
(d) 에포틸론;
(e) 아우리스타틴;
(f) 피롤로벤조디아제핀 (PBD) 이량체;
(g) 메이탄시노이드 예컨대 DM1 및 DM4
및 그의 유사체 및 유도체
로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 FBS-약물 접합체.
42. 실시양태 41에 있어서, 약물 모이어티가
Figure pct00019
Figure pct00020
인 FBS-약물 접합체.
43. 실시양태 36 내지 41 중 어느 한 실시양태에 있어서, 약물 모이어티가 화학식 (II)의 구조를 갖는 합성 튜부리신 유사체인 FBS-약물 접합체.
Figure pct00021
44. 실시양태 36 내지 43 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS 및 약물 모이어티가 화학식 (III)의 구조를 갖는 링커 모이어티와 접합된 것인 FBS-약물 접합체.
Figure pct00022
45. 실시양태 44에 있어서, 약물-모이어티-링커가 화학식 (IV)의 구조를 가지며:
Figure pct00023
여기서 말레이미드 기는 FBS의 시스테인의 술프히드릴 기와 반응하여, 약물-모이어티-링커와 FBS 사이에 티오에테르 결합을 형성하는 것인 FBS-약물 접합체.
46. 실시양태 36 내지 45 중 어느 한 실시양태에 있어서, FBS 모이어티가 시스테인을 포함하는 C-말단 모이어티를 포함하는 것인 FBS-약물 접합체.
47. 실시양태 46에 있어서, C-말단 모이어티가 아미노산 서열 PmCXn으로 이루어지며, 여기서 C는 시스테인이고, 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산이고, m은 적어도 1인 정수이고 n은 0 또는 적어도 1인 정수인 FBS-약물 접합체.
48. 실시양태 47에 있어서, m이 1 또는 2이고, n이 1-10의 정수인 FBS-약물 접합체.
49. 실시양태 46에 있어서, 모이어티가 아미노산 서열 PmCXn1CXn2로 이루어지며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산이고, n1 및 n2는 독립적으로 0 또는 적어도 1인 정수인 FBS-약물 접합체.
50. 실시양태 49에 있어서, n1 및 n2가 독립적으로 1-5의 정수인 FBS-약물 접합체.
51. 실시양태 47에 있어서, C-말단 모이어티가 PC 또는 PPC인 FBS-약물 접합체.
52. 실시양태 49에 있어서, 모이어티가 PCGC (서열식별번호: 412), PCPC (서열식별번호: 413), PCGSGC (서열식별번호: 414), PCPPPC (서열식별번호: 415), PCPPPPPC(서열식별번호: 416), PCGSGSGC (서열식별번호: 417), PCHHHHHC (서열식별번호: 418), PCCHHHHHH (서열식별번호: 419), PCGCHHHHHH (서열식별번호: 420), PCPCHHHHHH (서열식별번호: 421), PCGSGCHHHHHH (서열식별번호: 422), PCPPPCHHHHHH (서열식별번호: 423), PCPPPPPHHHHHH (서열식별번호: 424) 및 PCGSGSGCHHHHHH (서열식별번호: 425)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 FBS-약물 접합체.
53. 실시양태 52에 있어서, 모이어티가 PCPPPPPC (서열식별번호: 16)인 FBS-약물 접합체.
54. 화학식 (I)에 의해 나타내어지는 구조를 가지며
Figure pct00024
여기서 m은 1, 2, 3 또는 4이고 Adx는 인간 GPC3에 1μM 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 애드넥틴이고, "Adx"에 연결된 황 원자는 애드넥틴의 시스테인의 술프히드릴 기의 황 원자인 FBS-약물 접합체.
55. 실시양태 54에 있어서, Adx가
(a) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8을 포함하고;
(b) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21을 포함하고;
(c) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 32, 33 및 34를 포함하고;
(d) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 45, 46 및 47을 포함하고;
(e) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 58, 59 및 60을 포함하고;
(f) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 71, 72 및 73을 포함하고;
(g) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 84, 85 및 86을 포함하고;
(h) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 101을 포함하고;
(i) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 129를 포함하고;
(j) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 156을 포함하고;
(k) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 183을 포함하고;
(l) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 210을 포함하고;
(m) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 237을 포함하고;
(n) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 264를 포함하고;
(o) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 264를 포함하고; 또는
(p) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 318을 포함하는
인간 10Fn3 도메인이고,
10Fn3 도메인이 아미노산 서열 PmCXn, 또는 PmCXn1CXn2로 이루어진 C-말단 모이어티를 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산이고, n1 및 n2는 독립적으로 0 또는 적어도 1인 정수인 FBS-약물 접합체.
56. 실시양태 55에 있어서, C-말단 모이어티가 PC 또는 PPC, PCGC (서열식별번호: 412), PCPC (서열식별번호: 413), PCGSGC (서열식별번호: 414), PCPPPC (서열식별번호: 415), PCPPPPPC(서열식별번호: 416), PCGSGSGC (서열식별번호: 417), PCHHHHHC (서열식별번호: 418), PCCHHHHHH (서열식별번호: 419), PCGCHHHHHH (서열식별번호: 420), PCPCHHHHHH (서열식별번호: 421), PCGSGCHHHHHH (서열식별번호: 422), PCPPPCHHHHHH (서열식별번호: 423), PCPPPPPHHHHHH (서열식별번호: 424) 또는 PCGSGSGCHHHHHH (서열식별번호: 425)인 FBS-약물 접합체.
57. 실시양태 52에 있어서, 모이어티가 PC 또는 PCPPPPPC (서열식별번호: 16)인 FBS-약물 접합체.
58. 실시양태 54에 있어서, Adx가 서열식별번호: 12-17, 24-30, 38-43, 51-56, 64-69, 77-82, 90-97, 110-127, 137-154, 164-181, 191-208, 218-235, 245-262, 272-289, 299-316 및 326-343으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 FBS-약물 접합체.
59. 실시양태 54에 있어서, Adx가 서열식별번호: 110-127, 137-154, 164-181, 191-208, 218-235, 245-262, 272-289, 299-316 및 326-343으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 FBS-약물 접합체.
60. 실시양태 54에 있어서, Adx가 서열식별번호: 110-127로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 FBS-접합체.
61. 실시양태 1 내지 35 중 어느 한 실시양태의 폴리펩티드, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
62. 실시양태 36 내지 60 중 어느 한 실시양태의 FBS-약물 접합체를 포함하는 제약 조성물.
63. 실시양태 61 또는 62에 있어서, 본질적으로 내독소-무함유인 조성물.
64. 실시양태 1 내지 35 중 어느 한 실시양태의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
65. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
66. 실시양태 1 내지 35 중 어느 한 실시양태의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포.
67. 실시양태 1 내지 35 중 어느 한 실시양태의 폴리펩티드를 생산하는 방법이며, 폴리펩티드를 발현시키는 데 적합한 조건 하에 실시양태 66의 세포를 배양하고, 폴리펩티드를 정제하는 것을 포함하는, 실시양태 1 내지 35 중 어느 한 실시양태의 폴리펩티드를 생산하는 방법.
68. 대상체에게 실시양태 61 또는 62의 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 글리피칸-3 질환 또는 장애를 약화시키거나 또는 억제하는 방법.
69. 실시양태 68에 있어서, 글리피칸-3 질환 또는 장애가 암인 방법.
70. 실시양태 69에 있어서, 암이 간세포성 암종, 흑색종, 윌름스 종양, 간모세포종, 난소암 또는 편평 폐암인 방법.
71. 실시양태 1 내지 62 중 어느 한 실시양태의 폴리펩티드, FBS-약물 접합체 또는 제약 조성물, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트.
72. 샘플을 실시양태 1 내지 35 중 어느 한 실시양태의 폴리펩티드와 접촉시키고, 글리피칸-3에 대한 FBS의 결합을 검출하거나 또는 측정하는 것을 포함하는, 샘플 내의 글리피칸-3을 검출하거나 또는 측정하는 방법.
73. 화학식 (I)에 의해 나타내어지는 구조를 가지며
Figure pct00025
여기서 m은 1이고 Adx는 서열식별번호: 110-117 및 272-289 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 애드넥틴이고; "Adx"에 연결된 황 원자는 애드넥틴의 C-말단 시스테인의 술프히드릴 기의 황 원자인 FBS-약물 접합체.
74. 화학식 (I)에 의해 나타내어지는 구조를 가지며
Figure pct00026
여기서 m은 2이고 Adx는 서열식별번호: 119-126 및 281-288의 아미노산 서열을 포함하는 애드넥틴이고; "Adx"에 연결된 황 원자는 애드넥틴의 2개의 C-말단 시스테인 각각의 술프히드릴 기의 황 원자인 FBS-약물 접합체.
75. 화학식 (VI)에 의해 나타내어지는 구조를 가지며
Figure pct00027
여기서 시스테인에 연결된 황 원자는 시스테인의 술프히드릴 기의 황 원자인 FBS-약물 접합체.
76. 화학식 (VII)에 의해 나타내어지는 구조를 가지며:
Figure pct00028
여기서 시스테인에 연결된 황 원자는 시스테인의 술프히드릴 기의 황 원자인 FBS-약물 접합체.
참조로 포함
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 진뱅크 서열, 웹사이트, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 전체적으로 또는 부분적으로 본 문서에 기록된 것과 동일한 정도로 명백하게 본원에 참조로 포함된다. PCT/US2015/021466의 내용은 구체적으로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 이제 하기 실시예를 참조하여 기재되며, 이는 단지 예시적이고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명이 상세하게 그의 구체적 실시양태와 관련하여 기재되지만, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 그에 대해 이루어질 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
실시예
실시예 1: 항-글리피칸-3 결합 애드넥틴의 선택, 발현 및 정제
글리피칸-3 (GPC3) 결합 애드넥틴을 글리피칸-3 단백질로 스크리닝된 애드넥틴 라이브러리로부터 단리하거나, 또는 라이브러리에서 확인된 클론으로부터 프로퓨전(PROfusion)에 의해 친화도 성숙시켰다. RNA-단백질 기술 및 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질 라이브러리 스크리닝 방법의 상세한 설명을 위해 본원에 참조로 포함된 문헌 [Szostak et al., U.S. Patent Nos. 6,258,558; 6,261,804; 6,214,553; 6,281,344; 6,207,446; 6,518,018; PCT Publication Nos. WO 00/34784; WO 01/64942; WO 02/032925; 및 Roberts et al., Proc Natl. Acad. Sci., 94:12297-12302 (1997)]을 참조한다.
우수한 결합 및 생물물리학적 특성을 갖는 7개의 애드넥틴의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열이 하기 제공된다:
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
7개의 GPC3 결합 애드넥틴의 결합 특징을 GPC3 양성 CHO 세포주 및 HepG2 인간 종양 세포주를 사용하여, 재조합 GPC3을 사용하는 ELISA 및 유동 세포측정법을 통해 결정하였다. 유동 세포측정법 실험을 위해, CHO-K1 또는 CHO-글리피칸-3 세포 또는 HepG2 종양 세포주를 베르센(Versene)으로 처리하고 FACS 완충제 (PBS 2.5% FBS) 중에 재현탁시켰다. FACS 완충제 중에 희석된 애드넥틴을 세포와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충제 중에서 1회 세척한 후 세포를 2 ug/ml에서 항-His 항체와 함께 인큐베이션하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충제 중에서 2회 세척한 후 세포를 FIX 완충제 (PBS 중 2.5% 포름알데히드) 중에 재현탁시켰다. 분석을 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences) FACS 칸토(FACS Canto)를 사용하여 수행하였다.
ELISA 실험의 결과가 표 3에 제시되고, 예시적인 유동 세포측정법 결과가 도 3a-d에 제시된다. 크기 배제 크로마토그래프 (SEC)에 의해 결정된 바와 같은 애드넥틴의 응집 점수가 또한 표 2에 제공된다. 이들 애드넥틴 중 어느 것도 유의하게 응집되지 않았다.
표 2: 인간 GPC3 결합 애드넥틴의 ELISA 및 SEC 점수
Figure pct00032
ADX_5274_E01의 C-말단을 C-말단 시스테인 및 6xHis 꼬리의 봉입에 의해 변형시켜, 애드넥틴 ADX_6561_A01을 생산하였다:
Figure pct00033
ADX_6561_A01을 코딩하는 핵산을 작은 분율의 치환을 루프 BC, DE 또는 FG 내의 아미노산 잔기를 코딩하는 각각의 뉴클레오티드 위치로 도입함으로써 다양화시켰다. ADX_6561_A01과 관련된 애드넥틴 서열의 생성된 라이브러리를 이어서 고 엄격도 조건 하에 인간 GPC3에 대한 결합에 대해 프로퓨전 (mRNA 디스플레이)에 의한 시험관내 선택에 적용하였다. 선택이 완료된 후 풍부화된 클론을 서열분석하고, HTPP 포맷에서 발현시키고, 추가로 분석하였다.
선택은 애드넥틴 ADX_6077_F02가 인간 GPC3에 고친화도로 결합한다는 것을 확인하였다. ADX_6077_F02의 아미노산 서열, 및 그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:
Figure pct00034
항-GPC3 애드넥틴의 다른 글리피칸 분자에 대한 결합을 시험하였고, 결과는 ADX_6077_F02가 인간 GPC3에 특이적으로 결합하고, 다른 인간 글리피칸 GPC1, GPC2, GPC5 및 GPC6과 교차-반응하지 않는다는 것을 제시한다.
실시예 2: 약물 모이어티의 접합을 위한 C-말단 시스테인을 갖는 애드넥틴
약물 모이어티에 연결된 애드넥틴을 제조하기 위해, 애드넥틴을 그의 C-말단에서 하기 C-말단 아미노산 서열 중 1개를 포함하도록 변형시켰다: NYRTPC (서열식별번호: 466; 단일 약물 모이어티에 연결하기 위해 DAR1 애드넥틴, 즉, 링커에서 단일 시스테인을 갖는 애드넥틴을 형성하는 경우); NYRTPCC (서열식별번호: 467; 시스테인당 1개씩, 2개의 약물 모이어티를 연결하기 위해 DAR2 애드넥틴, 즉, 링커에서 2개의 시스테인을 갖는 애드넥틴을 형성하는 경우); NYRTPCHHHHHH (서열식별번호: 468; 6xHis 꼬리를 갖는 DAR1 애드넥틴을 형성하는 경우) 및 NYRTPCPPPPPCHHHHHH (서열 번호 469; 6xHis 꼬리를 갖는 DAR2 애드넥틴을 형성하는 경우).
1개 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 미접합 애드넥틴의 디술피드-연결된 이량체를 방지하기 위해, 애드넥틴의 시스테인 잔기(들)를 하기와 같이 카르복시메틸화시켰다: 애드넥틴 용액을 환원제 (5mM DTT 또는 5mM TCEP)로 처리하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 아이오도아세트아미드 (500mM, 시그마 P/N A3221-10VL)를 50mM의 최종 농도로 첨가하였다. 샘플을 암실에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 샘플을 PBS 또는 아세트산나트륨 완충제로 투석하였다.
실시예 3: GPC3-애드넥틴 약물 접합체 (GPC3-AdxDC)의 생산
애드넥틴, 예를 들어, GPC3 애드넥틴의 생산: 애드넥틴을 코딩하는 핵산, 예를 들어, 아미노산 서열 MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSDDYHAHRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGEHVTATISGLKPGVDYTITVYAVTYDGEKAATDWSISINYRTPCHHHHHH (서열식별번호: 118; ADX_6077_F02)를 갖는 단백질을 코딩하는 (서열식별번호: 459)를 pET9d (EMD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 샌디에고) 벡터 내로 클로닝하고 이. 콜라이 BL21 DE3 pLys-S 세포에서 발현시켰다. 20 ml의 접종 배양물 (단일 플레이팅된 콜로니로부터 생성됨)을 사용하여 2.5 리터 울트라 일드(Ultra Yield) 플라스크 (톰슨 인스트루먼츠 캄파니(Thomson Instruments Co.) P/N 931136-B)에서 50 μg/ml 카나마이신을 함유하는 1 리터의 매직 배지(Magic Media) 이. 콜라이 발현 배지 (인비트로젠(Invitrogen), 카탈로그 K6803A/B)에 접종하였다. 배양물을 37℃에서 6시간 동안 성장시키고, 이어서 225 RPM에서 진탕시키면서 20℃에서 18시간 동안 성장시켰다. 인큐베이션 기간 후, 배양물을 ≥10,000 g에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 수거하였다. 세포 펠릿을 -80℃에서 동결시켰다. 세포 펠릿을 해동하고 얼음 상에서 울트라-투락스 균질화기 (IKA-웍스)를 사용하여 25 mL의 용해 완충제 (20 mM 인산나트륨, 500mM 염화나트륨, 5mM 디티오트레이톨, 1x 완전™ 프로테아제 억제제 칵테일-EDTA 무함유 (로슈)) 중에 재현탁시켰다. 세포 용해를 모델 M-110P 마이크로플루이다이저 (마이크로플루이딕스)를 사용하여 고압 균질화 (≥18,000psi)에 의해 달성하였다. 불용성 분획을 23,300 g에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 분리하고 폐기하였다. 가용성 분획을 0.2 마이크로미터 진공 필터로 여과하였다. 여과된 상청액을 20mM 인산나트륨/500 mM 염화나트륨 pH 7.4 + 5mM DTT 완충제로 평형화된 히스트랩 칼럼 (지이 헬스케어(GE Healthcare) P/N 17-5248-02) 상에 로딩하였다. 로딩한 후, 칼럼을 10 CV 평형 완충제에 이어, 10 CV의 평형 완충제 중 40mM 이미다졸에 이어, 10 CV PBS 중 2.0M 염화나트륨으로 세척하였다. 결합된 단백질을 20mM 인산나트륨/500mM 염화나트륨 pH 7.4 + 5mM DTT 중 500mM 이미다졸로 용리하였다. 히스트랩 칼럼으로부터의 용리액은 G25 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 50mM 아세트산나트륨/10mM 염화나트륨 pH 5.5로 완충제 교환하였다. 이어서 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼 (SP HP, 지이 헬스케어 17-1152-01)에 적용하였다. 결합된 단백질을 50mM 아세트산나트륨 pH 5.5 완충제 중 증가하는 염화나트륨 농도의 구배로 용리하였다. 분획을 튜부리신과의 접합을 위해 합하였다.
튜부리신 유사체-링커의 생산: 화학식 (IV)의 구조를 갖는 튜부리신 유사체-링커 화합물을 미국 8,394,922 (본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 생산하였다.
Figure pct00035
애드넥틴-약물 접합: C 말단 시스테인을 함유하는 애드넥틴에 대한 튜부리신 유사체-링커의 접합을 하기와 같이 수행하였다:
튜부리신 유사체에 접합될 애드넥틴의 샘플을 5mM TCEP로 처리하고 실온에서 대략 1시간 동안 인큐베이션하였다. TCEP를 50mM NaOAc/10mM NaCl pH 5.5로 평형화된 G25 겔 여과 칼럼 (지이 헬스케어)을 사용하여 제거하였다. 튜부리신 유사체를 100% DMSO 중에 용해시키고 5x 몰의 최종 농도로 첨가하고 반응물을 실온에서 2시간 동안 이어서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 미반응 튜부리신 유사체를 제거하기 위해, 반응 혼합물을 상기 기재된 바와 같이 SP 양이온 교환 칼럼에 재적용하였다.
애드넥틴, 예를 들어, C-말단 부근에 2개의 시스테인 잔기를 함유하는 GPC3 애드넥틴을 DAR2 (약물-애드넥틴 비 2) 애드넥틴을 생성하는 상기 기재된 동일한 방법론을 사용하여 튜부리신 유사체의 2개의 분자에 접합시켰다.
단백질 농도를 나노드롭 8000 분광광도계 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하여 결정하였다. 접합 및 미접합 애드넥틴의 분자량을 조르박스(Zorbax) C8 RRHD 칼럼이 장착된 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies) 6540 UHD 정밀 질량 Q-ToF LC-MS을 사용하는 LC-질량 분광측정법에 의해 결정하였다.
애드넥틴을 발현시키고, 정제하고, 접합시키고 알킬화시키는 이들 기술을 사용하여, 표 3에 열거된 애드넥틴 및 애드넥틴-약물 접합체를 제조하였다.
표 3 - 대조군 및 항-글리피칸-3 결합 애드넥틴
Figure pct00036
Figure pct00037
실시예 4: 항-GPC3 애드넥틴 및 GPC3-AdxDC의 시험관내 특징화
크기 배제 크로마토그래피: 표준 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 중간규모 공정으로부터 생성된 후보 애드넥틴에 대해 수행하였다. 중간규모 물질의 SEC를 A214 nm 및 A280 nm에서의 UV 검출 및 형광 검출 (여기 280 nm, 방출 350 nm)을 사용하는 애질런트 1100 또는 1200 HPLC 시스템 상에서 수퍼덱스(Superdex) 200 10/30 또는 수퍼덱스 75 10/30 칼럼 (지이 헬스케어)을 사용하여 수행하였다. 100 mM 황산나트륨/100 mM 인산나트륨/150 mM 염화나트륨, pH 6.8의 완충제를 사용된 SEC 칼럼에 적절한 유량으로 사용하였다. 겔 여과 표준물 (바이오-라드 래보러토리즈(Bio-Rad Laboratories), 캘리포니아주 허큘레스)을 분자량 보정에 사용하였다.
열안정성: HTPP 애드넥틴의 열 주사 형광 (TSF) 분석을 수행하여 애드넥틴을 상대 열 안정성에 의해 스크리닝하였다. 샘플을 PBS 중 0.2 mg/ml로 정규화하였다. PBS로 1:40 희석된 1 μl의 사이프로(Sypro) 오렌지 염료를 25 μl의 각각의 샘플에 첨가하고 플레이트를 투명한 96 웰 마이크로플레이트 접착 밀봉제로 밀봉하였다. 샘플을 바이오라드 RT-PCR 기계를 사용하여 25℃에서 95℃로 분당 2℃의 속도로 온도를 상승시켜 스캐닝하였다. 데이터를 바이오라드 CFX 매니저 2.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. TSF에 의해 수득된 Th 값은 40℃ 내지 70℃의 용융 범위에 걸쳐 DSC에 의해 수득된 Tm 값과 매우 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 이러한 기술에 대해 허용되는 작동 범위로 간주된다. ND ("데이터 없음")의 결과는 전이 곡선의 기울기가 너무 작아서 그의 유도 피크 (시간에 따른 형광의 변화율)가 노이즈와 구별되지 않는 경우에 수득된다. "ND" 결과는 열안정성의 지표로 해석될 수 없다. 투석된 HTPP'd 및 중간규모 애드넥틴의 시차 주사 열량측정 (DSC) 분석을 수행하여 그의 각각의 Tm을 결정하였다. 0.5 mg/ml 용액을 70 p.s.i 압력 하에 15℃에서 110℃로 분당 1℃의 속도로 온도 상승시킴으로써 VP-모세관 시차 주사 열량계 (지이 마이크로칼(GE Microcal))에서 스캐닝하였다. 데이터를 오리진 소프트웨어(Origin Software) (오리진랩 코포레이션(OriginLab Corp))를 사용하는 최적 피팅을 사용하여 적절한 완충제의 대조 실행에 대비하여 분석하였다.
SPR 친화도 측정: 비아코어 T100 기기 (지이 헬스케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 수행하여 α-GPC3 애드넥틴 및 튜부리신-접합된 AdxDC의 오프-레이트 (kd) 및 결합 친화도를 계산하였다. 재조합 인간 (aa 1-559) 및 뮤린 (aa 25-557) 글리피칸-3 단백질 (알앤디 시스템즈(R&D Systems))을 10mM 아세트산나트륨 pH 4.5 중 10μg/ml로 희석하고 제조업체의 아민 커플링 프로토콜 (지이 헬스케어)에 따라 CM5 바이오센서의 활성 유동 세포 상에 개별적으로 고정시키고, 유동 세포당 ~1000RU 고정화 밀도의 각각의 단백질을 표적화하였다. SPR 실험을 37℃에서 HBS-P+ (10mM HEPES, 150mM NaCl, 0.05% (v/v) 계면활성제 P20, pH 7.4) 구동 완충제 (지이 헬스케어)를 사용하여 수행하였다. 친화도 측정을 위해, 200-1.56nM α-GPC3 애드넥틴 및 AdxDC의 농도 시리즈를 구동 완충제 중에서 제조하고 인간 및 뮤린 GPC3 바이오센서 유동 세포에 걸쳐 30μl/분으로 주사하였다. 오프-레이트 측정을 위해, 단일 200nM 애드넥틴/AdxDC 농도를 동일한 조건을 사용하여 주사하였다. 10mM 글리신 pH 1.7의 1회 30초 주사를 사용하여 결합된 애드넥틴을 제거하고 검정 사이클 사이의 GPC3 표면을 재생시켰다.
속도 상수 ka (k온) 및 kd (k오프)는 비아코어 T100 이밸루에이션 소프트웨어(Evaluation Software) v2.0.4 (지이 헬스케어)의 1:1 결합 모델에 대한 참조-차감된 센소그램 피팅으로부터 유래되었다. 친화도 상수, KD는 속도 상수 kd/ka의 비로부터 계산되었다.
세포 결합 검정: huGPC3 양성 세포 Huh7에 대한 GPC3 애드넥틴의 결합을 본질적으로 하기와 같이 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. Huh7 암종 세포를 DMEM 배지에서 10% FBS와 함께 성장시켰다. 세포를 론자(Lonza), Cat. # 17-711E로부터의 베르센, EDTA 세포 해리 용액을 사용하여 수거하였다. 종양 세포 (1E5세포/반응물)를 FACS 완충제 (PBS, 1% BSA, 0.05% Na 아지드) 중에 현탁시키고 얼음 상에서 1시간 동안 AdxDC의 연속 희석물과 혼합하였다. 세포를 FACS 완충제로 3회 세척하고, 결합된 AdxDC를 사내 항-스캐폴드 모노클로날 Ab 및 (알앤디 시스템즈)로부터의 PE-접합된 항체, cat# NL007로 검출하고, 유동 세포측정기 상에서 판독하였다. 데이터 분석을 플로우조 소프트웨어(FlowJo Software) 사용하여 수행하고, 최대 결합의 50%의 EC50을 프리즘(PRISM)™ 소프트웨어, 버전 5.0 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 미국 캘리포니아주 라호야)을 사용하여 결정하였다.
세포 성장 억제 검정: 3H 티미딘의 혼입의 억제가 시험된 세포주의 증식의 억제를 나타내는 경우에, 3H 티미딘 검정을 사용하여 Hep3B, Huh7및 HepG2 세포의 증식에 대한 AdxDC의 용량-의존성 억제 효과를 평가하였다. 인간 종양 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC) (미국 20108 버지니아주 마나사스 피.오. 박스 1549)으로부터 입수하고, ATCC로부터의 지침서에 따라 배양하였다. 세포를 1.25 x 104개의 세포/웰로 96-웰 플레이트에 시딩하고, GPC3 AdxDC의 1:3 연속 희석물을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 72시간 동안 인큐베이션되도록 하였다. 플레이트를 총 인큐베이션 기간의 마지막 24시간 동안 웰당 1.0 μCi의 3H-티미딘으로 펄싱하고, 수거하고, 탑 카운트(Top Count) 섬광 계수기 (팩커드 인스트루먼츠(Packard Instruments), 코네티컷주 메리덴) 상에서 판독하였다. EC50 값 - 최대 세포 증식 억제의 50%가 달성되는 애드넥틴 약물 접합체 농도 -을 프리즘™ 소프트웨어, 버전 4.0 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 라호야)을 사용하여 결정하였다.
AdxDC 접합체의 DAR1 및 DAR2 형태의 시험관내 특성의 개요가 표 4에 요약되어 있다.
표 4: GPC3-튜부리신 AdxDC의 시험관내 특징화
Figure pct00038
alk - 알킬화 (캡핑된 애드넥틴)에 대해 측정됨; 모든 다른 측정 DAR1 AdxDC (PEG 없음)에 대한 것임
실시예 5: GPC3-AdxDC의 인간 Hep3B 및 H446 종양 세포에 대한 세포 결합
GPC3 AdxDC를 10% FBS를 갖는 MEM에서 성장된 인간 Hep3B 간세포성 암종 세포, 및 10% FBS를 갖는 RPMI에서 성장된 H446 소세포 폐 암종 세포에 대한 결합에 대해 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 세포를 셀스트리퍼, 미디어테크(Mediatech) (코닝(Corning): 20109 버지니아주 마나사스)로부터의 비-효소적 세포 해리 용액, Cat. # 25-056-CL을 사용하여 수거하였다. 종양 세포 (25,000개/반응물)를 FACS 완충제 (PBS+5% FBS+0.01% NaN3) 중에 현탁시키고 얼음 상에서 1시간 동안 AdxDC의 연속 희석물과 혼합하였다. 세포를 FACS 완충제로 3회 세척하고, 결합된 AdxDC를 알앤디 시스템으로부터의 His 태그 PE-접합된 항체, cat# IC050P로 검출하고, 유동 세포측정기 상에서 판독하였다. 데이터 분석을 플로우조 소프트웨어 사용하여 수행하고, 최대 결합의 50%의 EC50을 프리즘™ 소프트웨어, 버전 5.0 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 라호야)을 사용하여 결정하였다.
도 4a-d에 제시된 결과는 ADX_6077_F02 AdxDC DAR1 및 DAR2가 두 가지 유형의 인간 종양 세포에 결합한다는 것을 나타낸다.
실시예 6: GPC3 AdxDC는 Hep3B, H446 및 HepG2 종양 세포의 세포 성장을 억제한다
이 실시예는 GPC3 AdxDC DAR1 및 DAR2가 Hep3B (글리피칸3 높음) HCC 세포, H446 (글리피칸3 낮음) SCLC 세포 및 HepG2 종양 세포의 세포 증식을 억제한다는 것을 나타낸다. 티미딘 혼입 검정을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 5a-b 및 6a-b에 제시된 결과는 GPC3 AdxDC DAR1 및 DAR2가 3종의 상이한 세포주의 세포 성장을 억제하지만, 대조군 AdxDC 애드넥틴 접합체는 이들 세포의 성장을 억제하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 7: GPC3-AdxDC에 대한 세포 표면 결합 검정 시간 경과
내재화 연구 전 최대 표적 진입을 보장하기 위해, ADX_6077_F02 DAR1 (즉, "PC" 말단을 갖지만, 접합되지 않음)의 GPC-3 양성 세포 Hep3B에 대한 결합을 하기 결합 검정을 사용하여 결정하였다: AF-488 형광 표지된 애드넥틴 ADX_6077_F02 및 음성 대조군 (NBC) ADX_6093_A01을 Hep3B 세포 결합 검정에 사용하였다. 결합 분석을 위해, Hep3B 세포를 384 웰 플레이트 내로 플레이팅하고, 16시간 동안 인큐베이션하여 세포가 부착되도록 하고 이어서 세포를 2% 포름알데히드로 고정시켰다. 100nM에서 ADX_6077_F02 및 ADX_6093_A01을 세포 플레이트 내로 첨가하고 실온에서 7개의 시점 동안 인큐베이션하였다: 0분, 10분, 15분, 20분, 60분, 120분 및 180분. 결합한 후, 세포를 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 2회 세척하고 세포당 총 세포 형광 강도를 이어서 고함량 분석을 사용하여 측정하였다.
결과는 ADX_6077_F02가 세포 표면으로의 빠른 회합을 입증하였다는 것을 나타낸다. 2시간이 100 nM의 애드넥틴을 사용하여 95% 초과의 결합 플래토에 도달하기에 충분한 것으로 밝혀졌다.
실시예 8: GPC3-AdxDC의 동역학적 내재화
항-글리피칸 3 애드넥틴 유도된 내재화를 정량화하기 위해, 고함량 알렉사(Alexa) 켄칭 검정을 적용하였다. Hep3B 및 H446 세포를 384 웰 플레이트로 시딩하고 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 100nM에서 AF-488 형광 표지된 ADX_6077_F02 DAR1을 세포 플레이트 내로 첨가하고 37℃에서 고정 및 켄칭 전의 지시된 시간 동안 인큐베이션하였다. 내재화된 애드넥틴을 켄칭불가능한 신호를 초과하는 증가된 형광으로서 측정하였다. 각각의 시점에서의 "켄칭불가능한 대조군"으로부터의 총 형광을 세포에 초기 결합된 애드넥틴의 양의 지시자로서 사용되도록 병행하여 모니터링하였다. 세포의 이미지를 어레이스캔(Arrayscan)에 의해 수득하여 애드넥틴의 국재화를 나타내고, 세포 형광 강도 정량화에 사용하였다.
정량화 연구는 Hep3B 상에서 GPC3 수용체의 높은 발현 수준 (대략 1.1 x 106개 활성 결합 카피/세포) 및 H446 세포 상에서 낮은 수준 (대략 2.6 x 105개 활성 결합 카피/세포)을 확인하였다. 고정 후, 총 및 세포내 FL을 결정하고 애드넥틴 분자의 내재화를 측정하는 데 사용하였다.
이들 검정의 결과는 항-GPC3 애드넥틴이 중간-느린 속도로 (T1/2 > 1시간) Hep3B 및 H446 세포에 의해 내재화되고 (도 7) 6시간 후 > 90% 내재화에 도달한다는 것을 나타낸다. 도 8에 제시된 바와 같이, 15분 시점에서, 대부분의 항-GPC3 애드넥틴은 막 회합되고, 8시간 시점까지 대부분의 GPC3-애드넥틴 신호는 세포의 내부에 있다.
실시예 9: GPC3-AdxDC의 생체내 약동학
항-GPC3 AdxDC (DAR1)의 전신 노출 프로파일을 마우스에서 결정하였다. 암컷 NOD/SCID 마우스 (13주령)에게 하기 실험 설계에 따라 높은 (240 nmol/kg) 단일 용량 및 낮은 (24 nmol/kg) 용량의 GPC3-결합 및 비-결합-대조군 AdxDC (각각 GPC3 DAR1 AdxDC 및 RGE AdxDC)를 정맥내로 투여하였다. 표시된 시점에 CPD 항응고제 (시트레이트-포스페이트-덱스트로스 용액, 시그마 C7165)를 사용하여 일련의 꼬리 정맥에서 혈액을 수집하였다. 이들 혈액 샘플로부터 수득된 혈장을 분취하고 -80℃에서 분석을 위해 준비할 때까지 보관하였다.
표 5 - 이종이식편 모델의 투여 스케줄
Figure pct00039
AdxDC 혈장 수준을 메소스케일 (MSD) 리간드 결합 검정을 2개의 상이한 포맷으로 사용하여 분석하였다. 접합 및 미접합 애드넥틴 검정의 총 수준에 대한 MSD 검정을 사내 생성된 항-His 모노클로날 항체 (4ug/ml)를 포획하는 데, 1:10000 희석물에서 풀링된 사내 생성된 토끼 항-스캐폴드 폴리클로날에 이어 염소 항-토끼 술포태그부착된 항체 (1ug/ml)를 검출하는 데 사용하였다. 무손상 접합된 애드넥틴에 대한 MSD 검정을 사내 생성된 항-His 모노클로날 항체 (4ug/ml)를 포착하는 데, 사내 생성된 술포태그된 마우스 항-튜부리신 항체 (1ug/ml)를 검출하는 데 사용하였다.
표 6 (비 구획 포에닉스 윈논린(Phoenix WinNonlin) 분석, NCA 모델) 및 도 9 (항-튜부리신 MSD 검정)에 요약된 이 검정의 결과는 AdxDC가 마우스에서 짧은 노출 프로파일을 갖는다는 것을 추가로 나타낸다.
표 6 - GPC3 AdxDC의 약동학 파라미터 개요
Figure pct00040
실시예 10: 설치류 이종이식편 모델에서의 종양 성장의 억제
비PEG화 GPC3-튜부리신 약물 접합체를 CD1 마우스 및 피셔 래트에서 시험하였다.
NOD-SCID 및 CD1 암컷 마우스 (13주령, 찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories), 매사추세츠주 윌밍톤으로부터의 것) 및 암컷 피셔 래트 (10주령, 찰스 리버 래보러토리즈, 매사추세츠주 윌밍톤으로부터의 것)를 역전된 12시간 명/암 주기를 갖는 온도-제어된 방에 수용하였다. 물 및 표준 사료 음식물은 자유롭게 이용가능하였다. 안전성 연구를 위한 동물을 무작위화하고 체중 (약 20-25 g)에 기초하여 대조군 또는 시험 AdxDC를 받는 처리군 사이에 분배하였다.
Hep3B, 인간 간세포성 암종을 10% FBS (써모 Cat # ATK-33398)로 보충된 EMEM Cat# ATCC 30-2003을 사용하는 배양물 중에 유지시켰다. 효능 연구를 위해, 이종이식편을 NOD-SCID 마우스의 우측 측복부로의 100ul의 Hep3B 5x106개 세포 (표준 페놀 레드 매트리겔, 코닝 Cat# 354234를 포함한 50% 세포 현탁액)의 피하 이식에 의해 생성하였다. 생체내 효능을 입증하기 위해, AdxDC를 50mM NaOAc/150 mM NaCl / pH 5.5, 또는 포스페이트-완충 염수 (PBS) 중 정맥내 주사에 의해 투여하였다. 대조군을 비-결합 대조군 AdxDC로 처리하였다. 시험 동물 (n=8마리의 동물/군)에게 정맥내로 3일마다 총 6회 용량으로, 다양한 투여량의 AdxDC를 투여하였다. 체중 측정을 무작위화 전, 무작위화 일, 및 처리 기간 동안 1주 2회 및 연구의 종료 시 기록하였다. 종양 성장을 디지털 캘리퍼 측정을 사용하여 1주 2회 모니터링하였다. 결과를 스튜던트 T-검정 양측 대응표본 분석을 사용하여 평가하였다. 3일마다의 투여를 사용한 대표적인 연구 설계 및 결과가 표 7 및 도 10에 나타난다.
표 7: 투여 스케줄
Figure pct00041
매주 투여를 Hep3B 이종이식편에서 평가하였다. 결과는 0.1μmol/kg에서의 ADX_6077_F02-961 DAR1 및 DAR2의 QW 투여가 HepG2 이종이식편 TV0=380-4803 (도 11), TV0=228-350mm3 (도 12), 및 TV0=514-673 mm3 (도 13)을 효과적으로 억제하였다는 것을 나타낸다.
요약하면, GPC3 AdxDC의 매주 투여는 HCC 종양 이종이식편의 성장을 억제하고, DAR1 및 DAR2 GPC3 AdxDC는 표적-의존성인 동등한 종양 성장 억제를 입증한다. 또한, 종양 부담-유도된 체중 감소의 방지는 GPC3 AdxDC의 항-종양 활성과 연관되었다.
마우스 안전성 연구에서, CD1 마우스를 GPC3 및 비-결합 대조군 AdxDC 둘 다로 5X 유효 용량 (0.1umol/kg)인 0.5umol/kg의 가장 높은 용량까지의 다양한 용량에서 총 9회 용량에 대해 격일로 정맥내로 처리하였다. MTD는 CD1 마우스 안전성 연구에서 확인되지 않았다. 신장 독성은 어떠한 군에 대해, 어떠한 용량 또는 빈도에서도 관찰되지 않았다. CD1 마우스에서, AdxDC의 반감기는 대략 20분이었다 (MSD 검정은 상기 기재된 바와 같음). 체중 감소는 관찰되지 않았고 모든 마우스는 처리에서 스케줄링된 부검까지 생존하였다. 혈청 화학 및 혈액학을 각각 아박시스(Abaxis) 수의학적 진단 기기, VETSCAN VS2 및 HM5를 사용하여 투여 기간에 걸쳐 간격을 두고 평가하였다. 기준선과 비교하여 혈청 화학 또는 혈액학에서 관찰된 유의한 차이는 없었다. 조직병리를 연구의 종료 시에 수집된 심장, 간, 비장 및 신장 조직의 H&E 염색을 통해 평가하였다. 평가된 조직 중 어느 것에서 관찰된 용량-제한 독성은 없었고, 최소/경도 세관 상피 신경병증은 모든 군에서 관찰되었다.
피셔 래트 안전성 연구에서, AdxDC의 반감기는 대략 30분이었다 (MSD 검정은 상기 기재된 바와 같음). 일부 용량 의존성 내약성 및 골격근 변성을 0.36umol/kg의 용량의 가장 빈번한 투여 (격일)에서 관찰하였고 골수 또는 간 조직병리 또는 심장 독성의 변화는 없었다. 동일한 래트 연구를 동일한 투여량 범위에서 AdxDC의 매주 투여를 사용하여 수행한 경우에 이들 발견은 관찰되지 않았다.
전체적으로, 낮은 전신 노출과 일치하는 짧은 혈장 반감기 및 낮은 오프-표적 독성에도 불구하고 탁월한 효능이 설치류 종 둘 다에서 관찰되었다.
실시예 11: HDX-MS를 사용하는 인간 GPC3 상의 애드넥틴 결합 부위의 맵핑.
인간 GPC3 상의 애드넥틴 결합 부위 (도 14에 제시된 아미노산 서열)를 수소-중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS)을 사용하여 평가하였다. 수소/중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS) 방법은 백본 아미드 수소에서 중수소 교환 비율 및 정도를 모니터링하여 용액 중 단백질 입체형태 및 입체형태 역학을 프로빙한다. HDX의 수준은 백본 아미드 수소의 용매 접근성 및 단백질의 입체형태에 따라 달라진다. HDX에 따른 단백질의 질량 증가는 MS에 의해 정확하게 측정될 수 있다. 이 기술이 효소적 소화와 연계되는 경우, 펩티드 수준에서의 구조적 특색이 수득될 수 있고, 이는 표면 노출된 펩티드를 내부 폴딩된 펩티드, 또는 단백질-단백질 복합체의 계면에서 격리된 펩티드와 구별해낼 수 있다. 전형적으로, 중수소 표지 및 후속 켄칭 실험이 수행되고, 이어서 온라인 펩신 소화, 펩티드 분리 및 MS 분석이 수행된다.
ADX_6077_F02에 의해 인식된 인간 GPC3 상의 애드넥틴 결합 부위를 HDX-MS에 의해 맵핑하기 전에, 비-중수소화 실험을 수행하여 GPC3 샘플에 대한 공통 펩신 펩티드의 목록을 생성하고, GPC3에 대한 87.4%의 서열 커버리지를 달성하였다 (도 14). 이 실험에서, 10 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.0)를 표지 단계 동안 사용하고, 이어서 켄칭 완충제 (200 mM 포스페이트 완충제 + 4M GdnCl 및 0.4M TCEP, pH 2.5, 1:1, v/v)를 첨가하였다.
애드넥틴 결합 부위 맵핑 실험을 위해, 5 μL의 각각의 샘플 (GPC3 또는 ADX_6077_F02를 포함한 GPC3)을 55 μL HDX 표지 완충제 (D2O 중 10 mM 포스페이트 완충제, pD 7.0)와 혼합하여 표지 반응을 시작하였다. 반응을 상이한 기간 동안 수행하였다: 1분, 10분, 및 240분. 각각의 표지 반응 기간의 말기에, 반응물을 켄칭 완충제 (1:1, v/v)를 첨가하여 켄칭하고 켄칭된 샘플을 분석을 위해 워터스(Waters) HDX-MS 시스템에 주사하였다. 관찰된 공통 펩신 펩티드를 ADX_6077_F02의 존재/부재 하에 그의 중수소 흡수 수준에 대해 모니터링하였다 (도 14 및 15).
HDX-MS 측정으로부터 수득된 실험 데이터는 AADX_6077_F02가 인간 GPC3 내의 2개의 펩티드 영역으로 구성된 불연속 애드넥틴 결합 부위를 인식한다는 것을 나타낸다:
영역 1: HQVRSFF (GPC3의 아미노산 잔기 36-42); 서열식별번호: 356
영역 2: EQLLQSASM (GPC3의 아미노산 잔기 90-98); 서열식별번호: 346
실시예 12: DG 변이체의 생성
ADX_6077_F02의 아미노산 서열의 분석은 분자의 FG 루프 내의 DG가 아스파르테이트 이성질화될 위험이 낮을 수 있다는 것을 나타냈다.
Figure pct00042
DG 부위에서의 돌연변이를 갖는 ADX_6077_F02의 8개의 변이체를 생성하였다. 이들 돌연변이체의 서열은 표 8에 요약되어 있다.
표 8: ADX_6077_F02 변이체
Figure pct00043
실시예 13: DG 변이체의 생물물리학적 특징화
100 내지 150 밀리그램의 각각의 8개의 돌연변이체를 상기 이전과 같이 제조하고, 정제하고 알킬화시켰다. 3 내지 5 밀리그램의 각각의 8개의 알킬화 변이체를 1-3 mg/mL로 SEC, DSC, GPC3 결합 (SPR 1pt 오프-레이트), MS 및 HIC에 적용하였다. 결과가 표 9에 요약되어 있다.
표 9: ADX_6077_F02 DG 변이체의 생물물리학적 특성
Figure pct00044
8개의 DG 돌연변이체 중 6개는 모 애드넥틴과 비교하여 k오프의 3-5배 증가를 입증하였고, 단량체이고 열안정하였다. 알킬화 GPC3 DG 돌연변이체 애드넥틴의 인간 및 뮤린 GPC3에 대한 결합 친화도를 180초 회합, 600초 해리 동안 주사된 200-1.56nM 시리즈로의 인간 및 마우스 GPC3 단백질 [Hu (Fc 2,3) 및 Mu (Fc 4) GPC3-His (알앤디 시스템즈)]의 직접 고정과 함께 HBS-P+ 구동 완충제를 사용하는 비아코어 T100에 의해 추가로 평가하였다. 데이터는 비아이밸루에이션(BiaEvaluation) 소프트웨어의 1:1 결합 모델에 피팅되고 표 10에 요약되어 있다.
표 10 - DG 돌연변이체 애드넥틴의 결합 동역학
Figure pct00045
데이터는 이들 GPC3 DG 돌연변이체가 모 ADX_6077_F02와 비교하여 인간 및 뮤린 GPC3에 대해 대략 3-5배 감소된 친화도를 갖는다는 것을 입증하였다. 친화도의 차이는 보다 빠른 오프-레이트에 의해 유발된 반면에, 온-레이트는 모 애드넥틴과 일치한다 (도 16).
실시예 14: DG 변이체의 세포 결합 및 면역원성 평가
DG GPC3 AdxDC 돌연변이체에서의 huGPC3에 대한 DG 변이체의 결합을 유동 세포측정법에 의해 10% FBS를 갖는 DMEM 배지에서 성장된 Huh7 암종 세포에 대한 결합에 대해 평가하였다. 세포를 론자로부터의 베르센, EDTA 세포 해리 용액, Cat. # 17-711E를 사용하여 수거하였다. 종양 세포 (1E5세포/반응물)를 FACS 완충제 (PBS, 1% BSA, 0.05% Na 아지드) 중에 현탁시키고 얼음 상에서 1시간 동안 AdxDC의 연속 희석물과 혼합하였다. 세포를 FACS 완충제로 3회 세척하고, 결합된 AdxDC를 사내 항-스캐폴드 모노클로날 Ab 및 (알앤디 시스템즈)로부터의 PE-접합된 항체, cat# NL007로 검출하고, 유동 세포측정기 상에서 판독하였다. 데이터 분석을 플로우조 소프트웨어 사용하여 수행하고, 최대 결합의 50%의 EC50을 프리즘™ 소프트웨어, 버전 5.0 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 라호야)을 사용하여 결정하였다.
(비 DG 돌연변이체)의 항-His 검출을 위해, 사내 생성된 APC-접합된 항-His 항체를 사용한 것을 제외하고는 동일한 프로토콜을 사용하였다.
표 11에 제시된 결과는 돌연변이체가 모 애드넥틴의 EC50과 유사한 EC50 값을 가졌다는 것을 나타낸다.
huGPC3에 대한 DG 변이체를 또한 인간 PBMC 증식 검정을 사용하여 인간에서 면역 반응을 도출하는 그의 잠재성에 대해 평가하였다. 세계 인구 빈도와 근접하게 매칭되는 HLA 부류 II 반수체형을 갖는 40명의 공여자로부터의 PBMC를 DG 변이체 또는 대조군의 존재 하에 7일 동안 배양하였다. 검정의 종료 시, CFSE-표지된 CD4+ T 세포를 증식에 대해 FACS에 의해 분석하였다. 증식성 CD4+T 세포를 나타내는 공여자의 백분율을 인간 면역원성 위험에 대한 판독치로서 분석하였다. 검정 결과는 DG에서 DA 돌연변이체 (PI-055660)가 표 11에 요약된 바와 같이 다른 DG 돌연변이체 (36-54% 양성 반응)와 비교하여 면역원성 (IMG)에 대해 유의하게 보다 낮은 위험 (공여자의 18%가 양성 반응함)을 갖는다는 것을 나타낸다.
표 11 - DG 변이체의 세포 결합 동역학
Figure pct00046
DA 변이체 AdxDC DAR1 ("GPC3_AdxDC DA 변이체-DAR1" 또는 "DA 변이체 AdxDC DAR1")의 특징의 개요가 표 12에 제시된다:
표 12: DA 변이체 AdxDC DAR1의 특징
Figure pct00047
* 미접합 단백질에 대해 측정됨
실시예 15: FITC 표지된 및 PEG화 항-GPC3 애드넥틴
FITC 표지: ADX_6077_F02 및 비-결합 대조군 애드넥틴을 DTT 또는 TCEP로 환원시키고 이어서 G25 겔 여과 크로마토그래피 또는 투석하였다. 이어서 과량의 플루오레세인-5-말레이미드 시약 (써모 사이언티픽)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 대략 2시간 동안 인큐베이션하고 이어서 G25 겔 여과 크로마토그래피 또는 광범위하게 투석하였다 (3-4회 완충제 교환). 표지의 생성된 정도를 제조업체의 지침에 따라 흡광도에 의해 및/또는 질량 분광측정법에 의해 측정하였다. FITC-표지된 및 PEG화 GPC3의 인간 및 뮤린 GPC3에 대한 결합 친화도를 이전 실시에에 기재된 바와 같이 평가하였고, 결과가 표 13에 요약되어 있다.
표 13 - 변형된 GPC3 애드넥틴의 동역학
Figure pct00048
데이터는 FITC-표지된 및 PEG화 항-GPC3 애드넥틴 둘 다가 인간 및 뮤린 GPC3 둘 다에 대한 결합 친화도를 유지하였다는 것을 입증하였다.
실시예 16: GPC3_AdxDC DA 및 DG 분자의 추가의 특징
GPC3_AdxDC DA 변이체-DAR1은 가속-안정성 연구에서 화학적으로 및 생물물리학적으로 pH 6.0에서 안정한 것으로 밝혀졌다. 또한, 인간 GPC3에 대한 그의 친화도 (SPR에 의함)는 40℃에서 4주 후에 변하지 않았다.
DA 변이체의 아스파르테이트 이성질화는 모 DG 분자의 것보다 약 4배 더 낮았다. 40℃에서 pH 6 또는 pH 7에서 3주 동안의 인큐베이션 후 DG 분자의 D80의 퍼센트 이성질화는 각각 3.6 및 2.4였다.
GPC3_AdxDC (DG)는 CDF 래트 (Q7Dx4)에서의 매주 투여 하에 유리한 독성 프로파일을 나타낸다 (표 14). 유해한 반응은 CDF 래트에서의 GPC3 AdxDC (Q7Dx4)의 매주 투여 하에 혈액학 또는 혈청 화학 프로파일에서 관찰되지 않았다.
표 14: GPC3_AdxDC (DG)의 독성 프로파일
Figure pct00049
* "NBC"는 비-결합 AdxDC (애드넥틴 약물 접합체)를 지칭한다
실시예 17: GPC3 애드넥틴 약물 접합체는 생체내에서 인간 GPC3 이종이식편 조직에 결합한다
인간 GPC3 높은 발현 Hep3B 이종이식편 조직을 0.04 μg/ml의 농도로 FITC-접합된 GPC3-결합 애드넥틴 DG 분자 ("GPC3_AdxDC (DG)") DAR1과 함께 또는 0.2 μg/ml로 비 GPC3 결합 애드넥틴과 함께 인큐베이션하였다. 결과는 GPC3_AdxDC (DG) 분자가 Hep3B 이종이식편 조직에 결합하는 반면에, 비-결합 애드넥틴은 유의하게 결합하지 않았다는 것을 나타낸다.
다른 조직을 또한 결합에 대해 시험하였고, 결과는 태반에 대한 GPC3_AdxDC (DG)의 일부 비-특이적 결합이 존재한다는 것을 나타낸다. 그러나, 분자는 위, 심장, 신장, 간, 피부 또는 편도 조직에 유의하게 결합하지 않는다.
GPC3_AdxDC (DA) DAR1은 이종이식편 Hep3B에서 유사하지만 보다 약한 결합을 나타낸다. 포화된 결합은 0.2 μg/ml에서 달성되었다.
실시예 18: GPC3_AdxDC (DA)는 글리피칸-3의 높은 발현을 갖는 세포주-유래 이종이식편에서 매우 효과적이다
Hep3B (간세포성 암종; 260,000개 GPC3 분자/세포) 이종이식편을 NSG 마우스에서 사용하였다. GPC3_AdxDC (DA) DAR1 또는 비-결합 대조군 애드넥틴을 매주, 3회, 표 15에 표시된 용량으로 i.v. 투여하였다.
표 15: NSG 마우스에서의 Hep3B 이종이식편의 투여량 및 종양 성장 억제
Figure pct00050
TGID26*: 제26일에서의 종양 성장 억제
표 15 및 도 17에 제시된 결과는 GPC3_AdxDC (DA)가 생체내에서 Hep3B 종양 성장을 억제하는 데 효과적이라는 것을 나타낸다.
유사한 실험을 글리피칸-3의 낮은 발현을 갖는 세포주-유래 이종이식편 (H446)으로 수행하였다. H446 세포는 약 40,000개 인간 PC3 분자/세포를 갖는 소세포 폐 암종 세포이다. 세포를 CB17 SCID 마우스 내로 주사하였다.
표 16: CB17 SCID 마우스에서의 H446 세포의 투여량 및 종양 성장 억제
Figure pct00051
표 16 및 도 18에 제시된 결과는 GPC3_AdxDC (DA)가 이들 종양의 성장을 저속화시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 19: 정상 조직에 비한 Hep3B 종양에의 GPC3_AdxDC의 우선적 흡수
마우스에게 3H 표지된 GPC3_AdxDC를 0.015 또는 0.22 μmol/kg으로 투여하고, 방사능을 전신 자가방사선촬영 (QWBA)에 의해 0.17시간, 1시간, 5시간 및 168시간 후에 측정하였다.
도 19 및 20에 제시된 결과는 하기를 나타낸다:
ㆍ 종양 및 고도의 관류 조직으로의 빠른 분포;
ㆍ 투여 후 168시간에 종양에 남아있는 높은 수준의 방사능 및 다른 조직에서의 없거나, 또는 낮은 방사능;
ㆍ 신장에서의 유의한 방사능: 약 30%의 방사능이 소변으로 배출되었다; 및
ㆍ 높은 및 낮은 용량 군 사이의 발현의 유사한 패턴.
유사한 실험에서, 마우스에게 3H 표지된 GPC3_AdxDC 또는 비-결합 AdxDC 대조군을 0.22 μmol/kg으로 투여하고, 방사능을 QWBA에 의해 0.17시간, 1시간, 5시간 및 168시간 후에 측정하였다.
도 21 및 22에 제시된 결과는 비-결합 대조군 (RGE AdxDC)에 비해 GPC3_AdxDC의 Hep3B 종양으로의 보다 높은 흡수가 존재한다는 것을 나타낸다. GPC3_AdxDC 및 비-결합 AdxDC 대조군의 다른 조직에서의 분포 프로파일은 대등하다.
종양 및 조직에서의 GPC3_AdxDC의 총 방사능 농도가 도 23에 나타난다. 도면은 다른 조직 (신장 제외)에서보다 종양에서의 훨씬 더 높은 수준의 GPC3_AdxDC의 존재를 나타낸다.
실시예 20: 항-GPC3 애드넥틴의 위치 스캐닝
본 실시예는 EIDKPSQ (서열식별번호: 369)가 제거되고 PC가 부가된 6077_F02의 위치 스캐닝을 기재하며, 여기서 아미노산 79 (즉, "DG"의 "D")는 G (원래 클론에서와 같음) 또는 A이다.
단지 아미노산 79에서 상이한 2종의 단백질을 라이브러리 구축 동안 혼합하였다. 인간 글리피칸-3-비오틴에 대한 결합을 100 nM, 10 nM 및 1 nM에서 결정하였다. 각각의 배치에 대해, 10 nM 선택 용리를 플래그 용리와 비교하고 1 nM 선택 용리를 또한 플래그 용리와 비교하였다. 이는 각각의 루프에 대해 4개의 히트 맵을 생성하였다: 79가 G인 경우 10 nM; 79가 G인 경우 1 nM; 79가 A인 경우 10 nM 및 79가 A인 경우 1 nM.
FG 루프의 경우, 3개의 절편을 함께 조합하여 전체 히트 맵을 제시하였다. 위치 79에 대해, G에 대해 정규화된 1개의 히트 맵, 및 A에 대해 정규화된 1개의 히트 맵을 생성하였다.
히트 맵 형태의 결과가 도 24-31에 제시된다. 히트 맵에서, > 1의 수는 유리한 치환을 나타내지만, >0.2의 임의의 수는 또한 치환으로서 허용된다. 수가 더 높을수록, 치환은 더 유리하다. 예를 들어, 히트 맵은 DG 모 애드넥틴에 대해 하기를 나타낸다:
- 루프 BC (즉, 서열 SDDYHAH (서열식별번호: 98의 아미노산 15-21))에서:
○ S23은 임의의 아미노산으로 치환될 수 있고;
○ D24는 바람직하게는 어떠한 다른 아미노산으로도 치환되지 않지만, S 및 E는 허용될 수 있다.
○ 다른 허용되는 치환은 히트 맵으로부터 유래될 수 있으며, 여기서 >0.2의 수를 갖는 임의의 치환은 허용되고 >1의 수가 바람직하다.
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험에 지나지 않는 것을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태의 많은 등가물을 인식할 것이거나, 또는 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
표 1 - 서열의 개요
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Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
SEQUENCE LISTING <110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY <120> GLYPICAN-3-BINDING FIBRONECTIN BASED SCAFFOLD MOLECULES <130> MXI-546PC <140> PCT/US2016/053185 <141> 2016-09-22 <150> US 62/222,633 <151> 2015-09-23 <160> 467 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(94) <223> Full length wild-type human 10Fn3 domain <400> 1 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp 65 70 75 80 Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 2 <211> 86 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(86) <223> Core wild-type human 10Fn3 domain <400> 2 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala 1 5 10 15 Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 3 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(166) <223> Human 10Fn3 domain six loop sequences generically defined <220> <221> misc_feature <222> (14)..(33) <223> At least 2 and up to 20 Xaa may be present; if present, Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (39)..(58) <223> At least 2 and up to 20 Xaa may be present; if present, Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (64)..(83) <223> At least 2 and up to 20 Xaa may be present; if present, Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (87)..(106) <223> At least 2 and up to 20 Xaa may be present; if present, Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (113)..(132) <223> At least 2 and up to 20 Xaa may be present; if present, Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (140)..(159) <223> At least 2 and up to 20 Xaa may be present; if present, Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 3 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Leu Ile Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Arg Ile Thr Tyr Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Phe Thr Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Thr Ile Ser Gly Leu 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile 145 150 155 160 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 165 <210> 4 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(101) <223> Wild-type human 10Fn3 domain C-terminal flexible linker <400> 4 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp 65 70 75 80 Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Ile 85 90 95 Asp Lys Pro Ser Gln 100 <210> 5 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_F03, Core <400> 5 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Pro 1 5 10 15 Pro His Pro Asn Ile Val Ser Tyr His Ile Tyr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Glu Gly Ser Lys Ser Thr 35 40 45 Ala Lys Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Ala Pro Glu Ile Glu Lys Tyr Tyr Gln Ile Trp Ile Asn 65 70 75 80 Tyr Arg Thr <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_F03, BC loop <400> 6 His Pro Pro His Pro Asn Ile Val Ser 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_F03, DE loop <400> 7 Glu Gly Ser Lys Ser Thr 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_F03, DE loop <400> 8 Val Ala Pro Glu Ile Glu Lys Tyr Tyr Gln 1 5 10 <210> 9 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_45708_F03, full-length <400> 9 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Pro Pro His Pro Asn Ile Val Ser Tyr 20 25 30 His Ile Tyr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Glu Gly Ser Lys Ser Thr Ala Lys Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala Pro Glu Ile Glu 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Gln Ile Trp Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 10 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_F03, full-length w/N-terminal leader and C-terminal tail <400> 10 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Pro Pro His Pro Asn Ile Val 20 25 30 Ser Tyr His Ile Tyr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Glu Gly Ser Lys Ser Thr Ala Lys Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala Pro Glu 65 70 75 80 Ile Glu Lys Tyr Tyr Gln Ile Trp Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Gly Ser 85 90 95 Gly Ser <210> 11 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_F03, full-length with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (97)..(101) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 11 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Pro Pro His Pro Asn Ile Val Ser Tyr 20 25 30 His Ile Tyr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Glu Gly Ser Lys Ser Thr Ala Lys Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala Pro Glu Ile Glu 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Gln Ile Trp Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 12 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_F03, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (98)..(102) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 12 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Pro Pro His Pro Asn Ile Val Ser Tyr 20 25 30 His Ile Tyr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Glu Gly Ser Lys Ser Thr Ala Lys Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala Pro Glu Ile Glu 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Gln Ile Trp Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro 85 90 95 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 13 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_F03, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 13 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Pro Pro His Pro Asn Ile Val Ser Tyr 20 25 30 His Ile Tyr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Glu Gly Ser Lys Ser Thr Ala Lys Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala Pro Glu Ile Glu 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Gln Ile Trp Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 <210> 14 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_F03, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) and His6 tag <400> 14 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Pro Pro His Pro Asn Ile Val Ser Tyr 20 25 30 His Ile Tyr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Glu Gly Ser Lys Ser Thr Ala Lys Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala Pro Glu Ile Glu 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Gln Ile Trp Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys His His His 85 90 95 His His His <210> 15 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_F03, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (98)..(102) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (104)..(108) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 15 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Pro Pro His Pro Asn Ile Val Ser Tyr 20 25 30 His Ile Tyr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Glu Gly Ser Lys Ser Thr Ala Lys Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala Pro Glu Ile Glu 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Gln Ile Trp Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro 85 90 95 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 16 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_F03, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1, n1=5, n2=0) <400> 16 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Pro Pro His Pro Asn Ile Val Ser Tyr 20 25 30 His Ile Tyr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Glu Gly Ser Lys Ser Thr Ala Lys Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala Pro Glu Ile Glu 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Gln Ile Trp Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Cys <210> 17 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_F03, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1, n1=5, n2=0) and His6 tag <400> 17 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Pro Pro His Pro Asn Ile Val Ser Tyr 20 25 30 His Ile Tyr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Glu Gly Ser Lys Ser Thr Ala Lys Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala Pro Glu Ile Glu 65 70 75 80 Lys Tyr Tyr Gln Ile Trp Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 <210> 18 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_H08, core <400> 18 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp His Pro 1 5 10 15 Pro His Pro Asn Ile Val Ser Tyr His Ile Tyr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Glu Gly Ser Lys Ser Thr 35 40 45 Ala Lys Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Ala Pro Glu Ile Glu Lys Tyr Tyr Gln Ile Trp Ile Asn 65 70 75 80 Tyr Arg Thr <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_H08, BC loop <400> 19 His Pro Pro His Pro Asn Ile Val Ser 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_H08, DE loop <400> 20 Glu Gly Ser Lys Ser Thr 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_H08, FG loop <400> 21 Val Ala Pro Glu Ile Glu Lys Tyr Tyr Gln 1 5 10 <210> 22 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_H08, full-length <400> 22 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Tyr Asp Tyr Gly Asp Ser Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Asp Gly Ser Asn Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Glu Ala Tyr Gly Lys 65 70 75 80 Gly Tyr Thr Arg Tyr Thr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 23 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_H08, full-length w/N-terminal leader and C-terminal tail <400> 23 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Tyr Asp Tyr Gly Asp Ser 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Asp Gly Ser Asn Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Glu Ala Tyr 65 70 75 80 Gly Lys Gly Tyr Thr Arg Tyr Thr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Glu Ile Asp 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the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 25 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Tyr Asp Tyr Gly Asp Ser Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Asp Gly Ser Asn Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Glu Ala Tyr Gly Lys 65 70 75 80 Gly Tyr Thr Arg Tyr Thr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 26 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_H08, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 26 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Tyr Asp Tyr Gly Asp Ser Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Asp Gly Ser Asn Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Glu Ala Tyr Gly Lys 65 70 75 80 Gly Tyr Thr Arg Tyr Thr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 <210> 27 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_H08, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) and His6 tag <400> 27 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Tyr Asp Tyr Gly Asp Ser Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Asp Gly Ser Asn Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Glu Ala Tyr Gly Lys 65 70 75 80 Gly Tyr Thr Arg Tyr Thr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 28 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_H08, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 28 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Tyr Asp Tyr Gly Asp Ser Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Asp Gly Ser Asn Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Glu Ala Tyr Gly Lys 65 70 75 80 Gly Tyr Thr Arg Tyr Thr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 29 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_H08, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1, n1=5, n2=0) <400> 29 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Tyr Asp Tyr Gly Asp Ser Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Asp Gly Ser Asn Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Glu Ala Tyr Gly Lys 65 70 75 80 Gly Tyr Thr Arg Tyr Thr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 30 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_H08, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1, n1=5, n2=0) and His6 tag <400> 30 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Tyr Asp Tyr Gly Asp Ser Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Asp Gly Ser Asn Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Glu Ala Tyr Gly Lys 65 70 75 80 Gly Tyr Thr Arg Tyr Thr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 <210> 31 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_B06, core <400> 31 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Phe Pro 1 5 10 15 Asp Arg Tyr Val Tyr Tyr Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser 20 25 30 Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Glu Gly His Lys Gln Thr Ala Tyr Ile 35 40 45 Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Ala 50 55 60 Tyr Ile Ser Gly Leu Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 65 70 75 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_B06, BC loop <400> 32 Phe Pro Asp Arg Tyr Val 1 5 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_B06, DE loop <400> 33 Glu Gly His Lys Gln Thr 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_B06, FG loop <400> 34 Ala Tyr Ile Ser Gly Leu 1 5 <210> 35 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_B06, full-length <400> 35 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Phe Pro Asp Arg Tyr Val Tyr Tyr Ile Thr 20 25 30 Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Glu 35 40 45 Gly His Lys Gln Thr Ala Tyr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp 50 55 60 Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Ile Tyr Tyr Tyr Pro Asp Asp Phe Gln 65 70 75 80 Gly Tyr Pro Gln Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 36 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_B06, full-length w/N-terminal leader and C-terminal tail <400> 36 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Phe Pro Asp Arg Tyr Val Tyr Tyr 20 25 30 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr 35 40 45 Val Glu Gly His Lys Gln Thr Ala Tyr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Ile Tyr Tyr Tyr Pro Asp Asp 65 70 75 80 Phe Gln Gly Tyr Pro Gln Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Gly 85 90 95 Ser Gly Ser <210> 37 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_B06, full-length with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (98)..(102) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 37 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Phe Pro Asp Arg Tyr Val Tyr Tyr Ile Thr 20 25 30 Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Glu 35 40 45 Gly His Lys Gln Thr Ala Tyr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp 50 55 60 Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Ile Tyr Tyr Tyr Pro Asp Asp Phe Gln 65 70 75 80 Gly Tyr Pro Gln Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro 85 90 95 Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 38 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_B06, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (99)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 38 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Phe Pro Asp Arg Tyr Val Tyr Tyr Ile Thr 20 25 30 Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Glu 35 40 45 Gly His Lys Gln Thr Ala Tyr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp 50 55 60 Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Ile Tyr Tyr Tyr Pro Asp Asp Phe Gln 65 70 75 80 Gly Tyr Pro Gln Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro 85 90 95 Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 39 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_B06, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 39 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Phe Pro Asp Arg Tyr Val Tyr Tyr Ile Thr 20 25 30 Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Glu 35 40 45 Gly His Lys Gln Thr Ala Tyr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp 50 55 60 Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Ile Tyr Tyr Tyr Pro Asp Asp Phe Gln 65 70 75 80 Gly Tyr Pro Gln Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 <210> 40 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_B06, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) and His6 tag <400> 40 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Phe Pro Asp Arg Tyr Val Tyr Tyr Ile Thr 20 25 30 Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Glu 35 40 45 Gly His Lys Gln Thr Ala Tyr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp 50 55 60 Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Ile Tyr Tyr Tyr Pro Asp Asp Phe Gln 65 70 75 80 Gly Tyr Pro Gln Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys His His 85 90 95 His His His His 100 <210> 41 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_B06, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (99)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (105)..(109) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 41 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Phe Pro Asp Arg Tyr Val Tyr Tyr Ile Thr 20 25 30 Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Glu 35 40 45 Gly His Lys Gln Thr Ala Tyr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp 50 55 60 Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Ile Tyr Tyr Tyr Pro Asp Asp Phe Gln 65 70 75 80 Gly Tyr Pro Gln Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro 85 90 95 Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 42 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_B06, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1, n1=5, n2=0) <400> 42 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Phe Pro Asp Arg Tyr Val Tyr Tyr Ile Thr 20 25 30 Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Glu 35 40 45 Gly His Lys Gln Thr Ala Tyr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp 50 55 60 Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Ile Tyr Tyr Tyr Pro Asp Asp Phe Gln 65 70 75 80 Gly Tyr Pro Gln Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys 100 <210> 43 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_B06, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1, n1=5, n2=0) and His6 tag <400> 43 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Phe Pro Asp Arg Tyr Val Tyr Tyr Ile Thr 20 25 30 Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Glu 35 40 45 Gly His Lys Gln Thr Ala Tyr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp 50 55 60 Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Ile Tyr Tyr Tyr Pro Asp Asp Phe Gln 65 70 75 80 Gly Tyr Pro Gln Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 <210> 44 <211> 81 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4606_F06, core <400> 44 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asn Ser 1 5 10 15 Gly His Ser Gly Gln Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly 20 25 30 Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Arg Tyr Gly Tyr Thr Ala 35 40 45 Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr 50 55 60 Ala Val Ala His Ser Glu Ala Ser Ala Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 65 70 75 80 Thr <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4606_F06, BC loop <400> 45 Asn Ser Gly His Ser Gly Gln Tyr 1 5 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4606_F06, DE loop <400> 46 Pro Arg Tyr Gly Tyr Thr 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4606_F06, FG loop <400> 47 Val Ala His Ser Glu Ala Ser Ala Pro 1 5 <210> 48 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4606_F06, full-length <400> 48 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asn Ser Gly His Ser Gly Gln Tyr Tyr Arg 20 25 30 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr 35 40 45 Val Pro Arg Tyr Gly Tyr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala His Ser Glu Ala Ser 65 70 75 80 Ala Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 49 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4606_F06, full-length w/N-terminal leader and C-terminal tail <400> 49 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asn Ser Gly His Ser Gly Gln Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Arg Tyr Gly Tyr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala His Ser Glu 65 70 75 80 Ala Ser Ala Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Ile Asp Lys Pro 85 90 95 Ser Gln <210> 50 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4606_F06, full-length with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (95)..(99) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 50 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asn Ser Gly His Ser Gly Gln Tyr Tyr Arg 20 25 30 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr 35 40 45 Val Pro Arg Tyr Gly Tyr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala His Ser Glu Ala Ser 65 70 75 80 Ala Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa <210> 51 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4606_F06, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (96)..(100) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 51 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asn Ser Gly His Ser Gly Gln Tyr Tyr Arg 20 25 30 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr 35 40 45 Val Pro Arg Tyr Gly Tyr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala His Ser Glu Ala Ser 65 70 75 80 Ala Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 52 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4606_F06, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 52 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asn Ser Gly His Ser Gly Gln Tyr Tyr Arg 20 25 30 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr 35 40 45 Val Pro Arg Tyr Gly Tyr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala His Ser Glu Ala Ser 65 70 75 80 Ala Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 <210> 53 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4606_F06, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) and His6 tag <400> 53 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asn Ser Gly His Ser Gly Gln Tyr Tyr Arg 20 25 30 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr 35 40 45 Val Pro Arg Tyr Gly Tyr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala His Ser Glu Ala Ser 65 70 75 80 Ala Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys His His His His His 85 90 95 His <210> 54 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4606_F06, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (96)..(100) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 54 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asn Ser Gly His Ser Gly Gln Tyr Tyr Arg 20 25 30 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr 35 40 45 Val Pro Arg Tyr Gly Tyr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala His Ser Glu Ala Ser 65 70 75 80 Ala Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 55 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4606_F06, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1, n1=5, n2=0) <400> 55 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asn Ser Gly His Ser Gly Gln Tyr Tyr Arg 20 25 30 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr 35 40 45 Val Pro Arg Tyr Gly Tyr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala His Ser Glu Ala Ser 65 70 75 80 Ala Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro 85 90 95 Cys <210> 56 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4606_F06, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1, n1=5, n2=0) and His6 tag <400> 56 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asn Ser Gly His Ser Gly Gln Tyr Tyr Arg 20 25 30 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr 35 40 45 Val Pro Arg Tyr Gly Tyr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Ala His Ser Glu Ala Ser 65 70 75 80 Ala Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro 85 90 95 Cys His His His His His His 100 <210> 57 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_C01, core <400> 57 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Pro Tyr Glu Glu Glu Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Ala Phe His Thr Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Lys His Lys Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Pro Pro Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_C01, BC loop <400> 58 Ser Asp Pro Tyr Glu Glu Glu Arg Tyr 1 5 <210> 59 <211> 6 <212> PRT 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35 40 45 Thr Val Pro Ala Phe His Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Lys His Lys 65 70 75 80 Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 64 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_C01, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 64 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Pro Tyr Glu Glu Glu Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Ala Phe His Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Lys His Lys 65 70 75 80 Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 65 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_C01, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 65 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Pro Tyr Glu Glu Glu Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Ala Phe His Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Lys His Lys 65 70 75 80 Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 <210> 66 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_C01, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) and His6 tag <400> 66 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Pro Tyr Glu Glu Glu Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Ala Phe His Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Lys His Lys 65 70 75 80 Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 67 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_C01, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 67 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Pro Tyr Glu Glu Glu Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Ala Phe His Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Lys His Lys 65 70 75 80 Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 68 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_C01, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1, n1=5, n2=0) <400> 68 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Pro Tyr Glu Glu Glu Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Ala Phe His Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Lys His Lys 65 70 75 80 Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 69 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_C01, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1, n1=5, n2=0) and His6 tag <400> 69 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Pro Tyr Glu Glu Glu Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Ala Phe His Thr Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Lys His Lys 65 70 75 80 Tyr Ala Tyr Tyr Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 <210> 70 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_D01, core <400> 70 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Glu Pro 1 5 10 15 Ser Tyr Lys Asp Asp Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Ser Phe His Gln Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 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Ala Val Thr Tyr Glu Pro Asp 65 70 75 80 Glu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 75 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_D01, full-length w/N-terminal leader and C-terminal tail <400> 75 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Glu Pro Ser Tyr Lys Asp Asp Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Ser Phe His Gln Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu 65 70 75 80 Pro Asp Glu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln 100 <210> 76 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_D01, full-length with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (100)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 76 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Glu Pro Ser Tyr Lys Asp Asp Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Ser Phe His Gln Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Pro Asp 65 70 75 80 Glu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 77 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_D01, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 77 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Glu 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_D01, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) and His6 tag <400> 79 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Glu Pro Ser Tyr Lys Asp Asp Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Ser Phe His Gln Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Pro Asp 65 70 75 80 Glu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 80 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_D01, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 80 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Glu Pro Ser Tyr Lys Asp Asp Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Ser Phe His Gln Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Pro Asp 65 70 75 80 Glu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 81 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_D01, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1, n1=5, n2=0) <400> 81 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Glu Pro Ser Tyr Lys Asp Asp Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Ser 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<400> 83 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly 1 5 10 15 Asp Tyr His Pro His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Glu Thr 35 40 45 Ala Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr 50 55 60 Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu Lys Ala Asp Lys Tyr Pro Pro 65 70 75 80 Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5274_E01, BC loop <400> 84 Ser Gly Asp Tyr His Pro His Arg Tyr 1 5 <210> 85 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5274_E01, DE loop <400> 85 Pro Gly Glu His Glu Thr 1 5 <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5274_E01, FG loop <400> 86 Val Thr Tyr Asp Gly Glu Lys Ala Asp Lys Tyr Pro Pro 1 5 10 <210> 87 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5274_E01, full-length <400> 87 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Asp Tyr His Pro His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Glu Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Asp Lys Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 88 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5274_E01, full-length w/N-terminal leader and C-terminal tail <400> 88 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Asp Tyr His Pro His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Glu Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Asp Lys Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln 100 <210> 89 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5274_E01, full-length w/ C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (100)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 89 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Asp Tyr His Pro His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Glu Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Asp Lys Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 90 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5274_E01, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 90 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Asp Tyr His Pro His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Glu Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Asp Lys Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 91 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADC_5274_E01, core with PmCXn C-terminal modification (m=1; n=0); aka ADX_6561_A01 core <400> 91 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly 1 5 10 15 Asp Tyr His Pro His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Glu Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu Lys Ala Asp Lys Tyr Pro Pro Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 <210> 92 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5274_E01, full-length with C-terminal PmCXn (m=1; n=0)] <400> 92 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Asp Tyr His Pro His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Glu Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Asp Lys Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 <210> 93 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5274_E01, full-length with C-terminal PmCXn (m=1; n=0) and His6 tag <400> 93 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Asp Tyr His Pro His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Glu Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Asp Lys Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 94 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5274_A01, full-length w/N-terminal leader, C-terminal PmCXn (m=1; n=0) and His6 tag <400> 94 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Asp Tyr His Pro His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Glu Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Asp Lys Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys His His His His His His 100 <210> 95 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5274_E01, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 95 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Asp Tyr His Pro His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Glu Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Asp Lys Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 96 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5274_E01, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 96 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Asp Tyr His Pro His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Glu Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Asp Lys Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 97 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5274_E01, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) and His6 tag <400> 97 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Gly Asp Tyr His Pro His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Glu Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Asp Lys Tyr Pro Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 <210> 98 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_A01, core <400> 98 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, BC loop <400> 99 Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 1 5 <210> 100 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, DE loop <400> 100 Pro Gly Glu His Val Thr 1 5 <210> 101 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, FG loop <400> 101 Val Thr Tyr Asp Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser 1 5 10 <210> 102 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length <400> 102 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 103 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with C-terminal tail <400> 103 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Glu Ile 85 90 95 Glu Lys Pro Cys Gln 100 <210> 104 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with N-terminal leader (G) <400> 104 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 105 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with N-terminal leader (MG) <400> 105 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 106 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, core with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (92)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 106 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 <210> 107 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (100)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 107 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 108 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 108 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 109 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 109 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 110 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, core with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 110 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa <210> 111 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 111 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 112 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 112 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 113 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 113 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 114 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, core with C-terminal PmCXn (m=1; n=0) <400> 114 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 <210> 115 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with C-terminal PmCXn (m=1; n=0) <400> 115 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 <210> 116 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6007_F02, full-length w/ N-terminal leader (G) and PmCXn C-terminal modification (m=1; n=0) <400> 116 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys <210> 117 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length w/ N-terminal eader (MG) and PmCXn C-terminal modification (m=1; n=0) <400> 117 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys <210> 118 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length w/ PmCXn C-terminal modification, (m=1; n=0) and His6 tag <400> 118 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys His His His His His His 100 <210> 119 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, core with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (99)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 119 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 120 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 120 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 121 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(112) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 121 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 122 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (109)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 122 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa <210> 123 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, core with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 123 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 85 90 <210> 124 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 124 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 125 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 125 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 126 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length w/N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 126 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 127 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, full-length w/C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0)and His6 tag <400> 127 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 110 <210> 128 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, core, <400> 128 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 129 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, FG loop <400> 129 Val Thr Tyr Glu Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser 1 5 10 <210> 130 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length <400> 130 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 131 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with N-terminal leader (G) <400> 131 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 132 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with N-terminal leader (MG) <400> 132 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 133 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, core with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (92)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 133 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 <210> 134 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (100)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 134 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 135 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 135 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 136 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 136 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 137 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, core with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 137 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa <210> 138 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 138 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 139 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 139 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 140 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 140 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 141 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, core with C-terminal PmCXn (m=1; n=0) <400> 141 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 <210> 142 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 142 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 <210> 143 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length w/ N-terminal leader (G) and PmCXn C-terminal modification (m=1; n=0) <400> 143 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys <210> 144 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length w/ N-terminal eader (MG) and PmCXn C-terminal modification (m=1; n=0) <400> 144 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys <210> 145 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) and His6 tag <400> 145 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 146 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (99)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 146 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 147 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 147 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 148 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(112) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 148 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 149 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (109)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 149 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa <210> 150 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 150 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 85 90 <210> 151 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 151 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 152 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 152 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Met Gly Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly 50 55 60 Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr 65 70 75 80 Glu Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 85 90 95 Thr Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 105 <210> 153 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 153 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 154 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->EG mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0), and His6 tag <400> 154 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Glu Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 <210> 155 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, core <400> 155 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 156 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, FG loop <400> 156 Val Thr Tyr Ser Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser 1 5 10 <210> 157 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length <400> 157 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 158 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with N-terminal leader (G) <400> 158 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 159 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with N-terminal leader (MG) <400> 159 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 160 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, core with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (92)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 160 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 <210> 161 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (100)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 161 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 162 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 162 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 163 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 163 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 164 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, core with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 164 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa <210> 165 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 165 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 166 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 166 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 167 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 167 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 168 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, core with C-terminal PmCXn (m=1; n=0) <400> 168 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 <210> 169 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 169 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 <210> 170 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length w/ N-terminal leader and PmCXn(m=1; n=0) <400> 170 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys <210> 171 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length w/ N-terminal eader (MG) and PmCXn C-terminal modification (m=1; n=0) <400> 171 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys <210> 172 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) and His6 tag <400> 172 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 173 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (99)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 173 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 174 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 174 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 175 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(112) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 175 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 176 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (109)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 176 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa <210> 177 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 177 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 85 90 <210> 178 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 178 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 179 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 179 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 180 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 180 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 181 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->SG mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0), and His6 tag <400> 181 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ser Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 <210> 182 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, core <400> 182 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 183 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, FG loop <400> 183 Val Thr Tyr Ala Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser 1 5 10 <210> 184 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length <400> 184 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 185 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with N-terminal leader (G) <400> 185 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 186 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with N-terminal leader (MG) <400> 186 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 187 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, core with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 187 Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser 1 5 10 15 Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr 20 25 30 Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val 35 40 45 Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr 50 55 60 Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser 65 70 75 80 Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa <210> 188 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (100)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 188 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 189 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 189 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 190 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 190 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 191 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, core with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 191 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa <210> 192 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 192 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 193 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 193 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 194 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 194 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 195 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, core with C-terminal PmCXn (m=1; n=0) <400> 195 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 <210> 196 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 196 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 <210> 197 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length w/ N-terminal leader (G) and PmCXn C-terminal modification (m=1; n=0) <400> 197 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys <210> 198 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length w/ N-terminal leader (MG) and PmCXn C-terminal modification (m=1; n=0) <400> 198 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys <210> 199 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) and His6 tag <400> 199 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu 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Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 201 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 201 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 202 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(112) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 202 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 203 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (109)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 203 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa <210> 204 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 204 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 85 90 <210> 205 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 205 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 206 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 206 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 207 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->AG mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 207 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 208 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 AG->AG mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0), and His6 tag <400> 208 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Ala Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 <210> 209 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, core <400> 209 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 210 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, FG loop <400> 210 Thr Tyr Gly Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser 1 5 10 <210> 211 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length <400> 211 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 212 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with N-terminal leader (G) <400> 212 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 213 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with N-terminal leader (MG) <400> 213 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 214 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, core with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (92)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 214 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 <210> 215 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (100)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 215 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 216 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 216 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 217 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 217 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 218 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, core with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 218 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa <210> 219 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 219 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 220 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 220 Met Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 221 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 221 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 222 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, core with C-terminal PmCXn (m=1; n=0) <400> 222 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 <210> 223 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 223 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 <210> 224 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 224 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys <210> 225 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, Full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 225 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys <210> 226 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) and His6 tag <400> 226 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 227 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (99)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 227 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 228 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 228 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 229 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(112) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 229 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 230 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (109)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 230 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa <210> 231 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 231 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 85 90 <210> 232 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 232 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 233 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 233 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 234 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 234 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly 65 70 75 80 Gly Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 235 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->GG mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0), and His6 tag <400> 235 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Gly Gly Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 <210> 236 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, core <400> 236 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 237 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, FG loop <400> 237 Val Thr Tyr Asp Ser Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser 1 5 10 <210> 238 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length <400> 238 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 239 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with N-terminal leader (G) <400> 239 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 240 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with N-terminal leader (MG) <400> 240 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Ser Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 241 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, core with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (92)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 241 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 <210> 242 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (100)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 242 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 243 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 243 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 244 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 244 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Ser Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 245 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, core with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 245 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa <210> 246 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 246 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 247 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 247 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 248 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 248 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Ser Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 249 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, core with C-terminal PmCXn (m=1; n=0) <400> 249 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 <210> 250 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 250 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 <210> 251 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length w/ N-terminal leader (G) and PmCXn C-terminal modification (m=1; n=0) <400> 251 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys <210> 252 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length w/ N-terminal eader (MG) and PmCXn C-terminal modification (m=1; n=0) <400> 252 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Ser Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys <210> 253 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) and His6 tag <400> 253 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 254 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (99)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 254 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 255 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 255 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 256 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(112) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 256 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 257 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (109)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 257 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Ser Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa <210> 258 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 258 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 85 90 <210> 259 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 259 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 260 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 260 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 261 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 261 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Ser Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 262 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DS mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0), and His6 tag <400> 262 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ser Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 <210> 263 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, core <400> 263 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 264 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, FG loop <400> 264 Val Thr Tyr Asp Ala Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser 1 5 10 <210> 265 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length <400> 265 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 266 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with N-terminal leader (G) <400> 266 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 267 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with N-terminal leader (MG) <400> 267 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Ala Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 268 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, core with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (92)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 268 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 <210> 269 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, DG ->DA mutant, full-length with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (100)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 269 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 270 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 270 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 271 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 271 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Ala Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 272 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, core with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 272 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa <210> 273 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 273 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 274 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 274 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 275 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 275 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Ala Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 276 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, core with C-terminal PmCXn (m=1; n=0) <400> 276 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 <210> 277 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 277 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 <210> 278 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length w/ N-terminal leader and PmCXn C-terminal modification, (m=1; n=0) <400> 278 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys <210> 279 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length w/ N-terminal eader (MG) and PmCXn C-terminal modification (m=1; n=0) <400> 279 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Ala Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys <210> 280 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) and His6 tag <400> 280 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 281 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (99)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 281 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 282 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 282 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 283 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(112) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 283 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 284 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (109)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 284 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Ala Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa <210> 285 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 285 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 85 90 <210> 286 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DAmutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 286 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 287 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 287 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 288 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 288 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Ala Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 289 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG ->DA mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0), and His6 tag <400> 289 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Ala Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 <210> 290 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, core <400> 290 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 291 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, FG loop <400> 291 Val Thr Tyr Asp Leu Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser 1 5 10 <210> 292 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length <400> 292 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 293 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with N-terminal leader (G) <400> 293 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 294 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with N-terminal leader (MG) <400> 294 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Leu Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 295 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, core with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (92)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 295 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 <210> 296 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (100)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 296 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 297 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 297 Met Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 298 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 298 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Leu Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 299 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, core with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 299 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa <210> 300 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 300 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 301 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 301 Met Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 302 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 302 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Leu Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 303 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, core with C-terminal PmCXn (m=1; n=0) <400> 303 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 <210> 304 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 304 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 <210> 305 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length w/ N-terminal leader and PmCXn C-terminal modification, (m=1; n=0) <400> 305 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys <210> 306 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length w/ N-terminal eader (MG) and PmCXn C-terminal modification (m=1; n=0) <400> 306 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Leu Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys <210> 307 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) and His6 tag <400> 307 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 308 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (99)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 308 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 309 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 309 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 310 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(112) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 310 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 311 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (109)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 311 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Leu Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa <210> 312 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 312 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 85 90 <210> 313 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 313 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 314 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 314 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 315 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 315 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Leu Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 316 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DL mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0), and His6 tag <400> 316 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Leu Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 <210> 317 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, core <400> 317 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 318 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, FG loop <400> 318 Val Thr Tyr Asp Val Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser 1 5 10 <210> 319 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length <400> 319 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 320 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with N-terminal leader (G) <400> 320 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 321 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with N-terminal leader (MG) <400> 321 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Val Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 <210> 322 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, core with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (92)..(96) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 322 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 <210> 323 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (100)..(104) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 323 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 324 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 324 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 325 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 325 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Val Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 326 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, core with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 326 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa <210> 327 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 327 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 328 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with N-terminal leader (G) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 328 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 329 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with N-terminal leader (MG) and C-terminal PmCXn <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn, up to 5 proline and up to 5 Xaa may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 329 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Val Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 <210> 330 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, core with C-terminal PmCXn (m=1; n=0) <400> 330 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 <210> 331 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) <400> 331 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 <210> 332 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length w/ N-terminal leader (G) and PmCXn C-terminal modification (m=1; n=0) <400> 332 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys <210> 333 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length w/ N-terminal eader (MG) and PmCXn C-terminal modification (m=1; n=0) <400> 333 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Val Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys <210> 334 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with C-terminal PmCXn(m=1; n=0) and His6 tag <400> 334 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 His His His His His His 100 <210> 335 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (93)..(97) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (99)..(103) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 335 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 <210> 336 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (101)..(105) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (107)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 336 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 337 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (102)..(106) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (108)..(112) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 337 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 338 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 <220> <221> misc_feature <223> In the C-terminal PmCXn1CXn2, up to 5 proline and up to 5 Xaa (before and after the last Cys) may or may not be present <220> <221> misc_feature <222> (103)..(107) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (109)..(113) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 338 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Val Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa <210> 339 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, core with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 339 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp 1 5 10 15 Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly 20 25 30 Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val 50 55 60 Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile 65 70 75 80 Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 85 90 <210> 340 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0) <400> 340 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 341 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with N-terminal leader (G), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 341 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val 65 70 75 80 Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 342 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with N-terminal leader (MG), and C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5, n2=0) <400> 342 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Val Glu Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 100 <210> 343 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 DG->DV mutant, full-length with C-terminal PmCXn1CXn2 (m=1; n1=5; n2=0), and His6 tag <400> 343 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Asp Asp Tyr His Ala His Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Glu His Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Tyr Asp Val Glu 65 70 75 80 Lys Ala Ala Thr Asp Trp Ser Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro Cys 85 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 <210> 344 <211> 580 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Human GPC3 <400> 344 Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp 20 25 30 Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly 35 40 45 Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val 50 55 60 Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys 65 70 75 80 Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala 85 90 95 Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln 100 105 110 Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala 115 120 125 Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe 130 135 140 Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp 145 150 155 160 Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro 165 170 175 Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu 180 185 190 Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe 195 200 205 Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln 210 215 220 Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile 225 230 235 240 Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu 245 250 255 Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys 260 265 270 Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly 275 280 285 Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu 290 295 300 Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu 305 310 315 320 Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys 325 330 335 Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser 340 345 350 Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile 355 360 365 Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu 370 375 380 Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser 385 390 395 400 Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala 405 410 415 Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr 420 425 430 Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His 435 440 445 Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp 450 455 460 Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys 465 470 475 480 Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly 485 490 495 Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly 500 505 510 Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr 515 520 525 Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro 530 535 540 Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser 545 550 555 560 Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe 565 570 575 Phe Leu Val His 580 <210> 345 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Human GPC3 Adnectin binding region 1 <400> 345 His Gln Val Ser Phe Phe 1 5 <210> 346 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Human CPC3 Adnectin binding region 2 <400> 346 Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met 1 5 <210> 347 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6093_A01 core, (non-binding control) <400> 347 Ser Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp 1 5 10 15 Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr 20 25 30 Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser 35 40 45 Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr 50 55 60 Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Glu Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 <210> 348 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6093_A01 full-length w/N-leader, PmCXn C-terminal modification, (m=1; n=0), and His6 tag <400> 348 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 65 70 75 80 Gly Glu Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys His His His His His His 100 <210> 349 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6093_A01 full-length w/N-leader, PmCXn C-terminal modification, (m=1; n=0) <400> 349 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu 35 40 45 Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly 65 70 75 80 Glu Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr Pro 85 90 95 Cys <210> 350 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6093_A01 full-length w/N-leader, PmCXn C-terminal modification, (m=1; n=7), and His6 tag <400> 350 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 65 70 75 80 Gly Glu Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys His His His His His His 100 105 110 <210> 351 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: N-terminal leader <400> 351 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp 1 5 <210> 352 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: N-terminal leader <400> 352 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp 1 5 <210> 353 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: N-terminal leader <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Any one or all Xaa can either be present or absent; if present, Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 353 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asp Val Pro Arg Asp 1 5 10 <210> 354 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: N-terminal leader <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Any one or all Xaa can either be present or absent; if present, Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 354 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Val Pro Arg Asp 1 5 10 <210> 355 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: N-terminal leader <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Any one or all Xaa can either be present or absent; if present, Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 355 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Pro Arg Asp 1 5 <210> 356 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: N-terminal leader <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Any one or all Xaa can either be present or absent; if present, Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 356 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Arg Asp 1 5 <210> 357 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: N-terminal leader <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Any one or all Xaa can either be present or absent; if present, Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 357 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Asp 1 5 <210> 358 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: N-terminal leader <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> Any one or all Xaa can either be present or absent; if present, Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 358 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp 1 5 <210> 359 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: N-terminal leader <400> 359 Met Ala Ser Thr Ser Gly 1 5 <210> 360 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 360 Glu Ile Glu Lys 1 <210> 361 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 361 Glu Gly Ser Gly Cys 1 5 <210> 362 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 362 Glu Ile Glu Lys Pro Cys Gln 1 5 <210> 363 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 363 Glu Ile Glu Lys Pro Ser Gln 1 5 <210> 364 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 364 Glu Ile Glu Lys Pro 1 5 <210> 365 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 365 Glu Ile Glu Lys Pro Ser 1 5 <210> 366 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 366 Glu Ile Glu Lys Pro Cys 1 5 <210> 367 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 367 Glu Ile Asp Lys 1 <210> 368 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 368 Glu Ile Asp Lys Pro Cys Gln 1 5 <210> 369 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 369 Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln 1 5 <210> 370 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: 6X His tail <400> 370 His His His His His His 1 5 <210> 371 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 371 Glu Ile Glu Pro Lys Ser Ser 1 5 <210> 372 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 372 Glu Ile Asp Lys Pro Cys 1 5 <210> 373 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 373 Glu Ile Asp Lys Pro 1 5 <210> 374 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 374 Glu Ile Asp Lys Pro Ser 1 5 <210> 375 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 375 Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln Leu Glu 1 5 <210> 376 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 376 Glu Ile Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp 1 5 10 <210> 377 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 377 Glu Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 378 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 378 Glu Ile Asp Lys Pro Cys Gln Leu Glu 1 5 <210> 379 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 379 Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln His His His His His His 1 5 10 <210> 380 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 380 Gly Ser Gly Cys His His His His His His 1 5 10 <210> 381 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 381 Glu Gly Ser Gly Cys His His His His His His 1 5 10 <210> 382 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 382 Pro Ile Asp Lys 1 <210> 383 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 383 Pro Ile Glu Lys 1 <210> 384 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 384 Pro Ile Asp Lys Pro 1 5 <210> 385 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 385 Pro Ile Glu Lys Pro 1 5 <210> 386 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 386 Pro Ile Asp Lys Pro Ser 1 5 <210> 387 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 387 Pro Ile Glu Lys Pro Ser 1 5 <210> 388 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 388 Pro Ile Asp Lys Pro Cys 1 5 <210> 389 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 389 Pro Ile Glu Lys Pro Cys 1 5 <210> 390 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 390 Pro Ile Asp Lys Pro Ser Gln 1 5 <210> 391 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 391 Pro Ile Glu Lys Pro Ser Gln 1 5 <210> 392 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 392 Pro Ile Asp Lys Pro Cys Gln 1 5 <210> 393 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 393 Pro Ile Glu Lys Pro Cys Gln 1 5 <210> 394 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 394 Pro His His His His His His 1 5 <210> 395 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 395 Pro Cys His His His His His His 1 5 <210> 396 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 396 Pro Pro Ile Asp 1 <210> 397 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 397 Pro Pro Ile Glu 1 <210> 398 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 398 Pro Pro Ile Asp Lys 1 5 <210> 399 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 399 Pro Pro Ile Glu Lys 1 5 <210> 400 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 400 Pro Pro Ile Asp Lys Pro 1 5 <210> 401 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 401 Pro Pro Ile Glu Lys Pro 1 5 <210> 402 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 402 Pro Pro Ile Asp Lys Pro Ser 1 5 <210> 403 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 403 Pro Pro Ile Glu Lys Pro Ser 1 5 <210> 404 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 404 Pro Pro Ile Asp Lys Pro Cys 1 5 <210> 405 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 405 Pro Pro Ile Glu Lys Pro Cys 1 5 <210> 406 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 406 Pro Pro Ile Asp Lys Pro Ser Gln 1 5 <210> 407 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 407 Pro Pro Ile Glu Lys Pro Ser Gln 1 5 <210> 408 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 408 Pro Pro Ile Asp Lys Pro Cys Gln 1 5 <210> 409 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 409 Pro Pro Ile Glu Lys Pro Cys Gln 1 5 <210> 410 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 410 Pro Pro His His His His His His 1 5 <210> 411 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 411 Pro Pro Cys His His His His His His 1 5 <210> 412 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 412 Pro Cys Gly Cys 1 <210> 413 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 413 Pro Cys Pro Cys 1 <210> 414 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 414 Pro Cys Gly Ser Gly Cys 1 5 <210> 415 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 415 Pro Cys Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 416 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 416 Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys 1 5 <210> 417 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 417 Pro Cys Gly Ser Gly Ser Gly Cys 1 5 <210> 418 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 418 Pro Cys Cys His His His His His His 1 5 <210> 419 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 419 Pro Cys His His His His His His Cys 1 5 <210> 420 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 420 Pro Cys Gly Cys His His His His His His 1 5 10 <210> 421 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 421 Pro Cys Pro Cys His His His His His His 1 5 10 <210> 422 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 422 Pro Cys Gly Ser Gly Cys His His His His His His 1 5 10 <210> 423 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 423 Pro Cys Pro Pro Pro Cys His His His His His His 1 5 10 <210> 424 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 424 Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys His His His His His His 1 5 10 <210> 425 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: C-terminal tail <400> 425 Pro Cys Gly Ser Gly Ser Gly Cys His His His His His His 1 5 10 <210> 426 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(100) <223> At least one PSPEPPTPEP and up to ten PSPEPPTPEP may be present <400> 426 Pro Ser Pro Glu Pro Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ser Pro Glu Pro Pro 1 5 10 15 Thr Pro Glu Pro Pro Ser Pro Glu Pro Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ser 20 25 30 Pro Glu Pro Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ser Pro Glu Pro Pro Thr Pro 35 40 45 Glu Pro Pro Ser Pro Glu Pro Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ser Pro Glu 50 55 60 Pro Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ser Pro Glu Pro Pro Thr Pro Glu Pro 65 70 75 80 Pro Ser Pro Glu Pro Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ser Pro Glu Pro Pro 85 90 95 Thr Pro Glu Pro 100 <210> 427 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) <223> At least one EEEEDE and up to ten EEEEDE may be present <400> 427 Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 10 15 Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu 20 25 30 Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu 35 40 45 Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu 50 55 60 <210> 428 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 428 Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser 1 5 10 15 Pro Ser <210> 429 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 429 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 430 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 430 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 431 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 431 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 432 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 432 Gly Ser Glu Gly Ser Glu Gly Ser Glu Gly Ser Glu Gly Ser Glu 1 5 10 15 <210> 433 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 433 Gly Gly Ser Glu Gly Gly Ser Glu 1 5 <210> 434 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 434 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 435 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 435 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 436 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 436 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 437 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 437 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 438 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 438 Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly 1 5 <210> 439 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 439 Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly 1 5 10 <210> 440 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 440 Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 <210> 441 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 441 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 <210> 442 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 442 Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala 1 5 10 15 Pro Ala <210> 443 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 443 Pro Ser Pro Glu Pro Pro Thr Pro Glu Pro 1 5 10 <210> 444 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 444 Pro Ser Pro Glu Pro Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ser Pro Glu Pro Pro 1 5 10 15 Thr Pro Glu Pro 20 <210> 445 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 445 Pro Ser Pro Glu Pro Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ser Pro Glu Pro Pro 1 5 10 15 Thr Pro Glu Pro Pro Ser Pro Glu Pro Pro Thr Pro Glu Pro 20 25 30 <210> 446 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 446 Pro Ser Pro Glu Pro Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ser Pro Glu Pro Pro 1 5 10 15 Thr Pro Glu Pro Pro Ser Pro Glu Pro Pro Thr Pro Glu Pro Pro Ser 20 25 30 Pro Glu Pro Pro Thr Pro Glu Pro 35 40 <210> 447 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 447 Glu Glu Glu Glu Asp Glu 1 5 <210> 448 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 448 Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu 1 5 10 <210> 449 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 449 Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Glu Glu Asp Glu 20 <210> 450 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 450 Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu 20 25 30 <210> 451 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Linker <400> 451 Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu 1 5 10 15 Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro 20 <210> 452 <211> 297 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_F03 nucleotide sequence encoding (SEQ ID NO: 10) <400> 452 atgggagttt ctgatgtgcc gcgcgacttg gaagtggttg ccgccacccc caccagcctg 60 ctgatctctt ggcatccgcc gcatccgaac atcgtttctt accatatcta ctacggcgaa 120 acaggaggca atagccctgt ccaggagttc actgtggaag gttctaaatc tactgctaaa 180 atcagcggcc ttaaacctgg cgttgattat accatcactg tgtacgctgt tgctccggaa 240 atcgaaaaat actaccagat ttggattaat taccgcacag aaggcagcgg ttcctaa 297 <210> 453 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_H08 <400> 453 atgggagttt ctgatgtgcc gcgcgacctg gaagtggttg ctgccacccc caccagcctg 60 ctgatcagct ggtctggtta cgactacggt gactcttatt accgcatcac ttacggcgaa 120 acaggaggca atagccctgt ccaggagttc actgtgcctg acggttctaa cacagctacc 180 atcagcggcc ttaaacctgg cgttgattat accatcactg tgtatgctgt cgaagcttac 240 ggtaaaggtt acactcgtta cactccaatt tccattaatt accgcacaga aattgacaaa 300 ccatcccagt aa 312 <210> 454 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4578_B06 <400> 454 atgggagttt ctgatgtgcc gcgcgacttg gaagtggttg ccgccacccc caccagcctg 60 ctgatctctt ggttcccgga ccgttacgtt tactacatca cttacggcga aacaggaggc 120 aatagccctg tccaggagtt cactgtggaa ggtcataaac agactgctta catcagcggc 180 cttaaacctg gcgttgatta taccatcact gtgtacgcta tctactacta cccggacgac 240 ttccagggtt acccgcagcc gatttctatt aattaccgca cagaaggcag cggttcctaa 300 <210> 455 <211> 297 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_4606_F06 <400> 455 atgggagttt ctgatgtgcc gcgcgacctg gaagtggttg ctgccacccc caccagcctg 60 ctgatcagct ggaactctgg tcattctggt cagtattacc gcatcactta cggcgaaaca 120 ggaggcaata gccctgtcca ggagttcact gtgcctcgtt acggttacac agctaccatc 180 agcggcctta aacctggcgt tgattatacc atcactgtgt atgctgtcgc tcattctgaa 240 gcttctgctc caatttccat taattaccgc acagaaattg acaaaccatc ccagtaa 297 <210> 456 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_C01 <400> 456 atgggagttt ctgatgtgcc gcgcgacctg gaagtggttg ctgccacccc caccagcctg 60 ctgatcagct ggtctgaccc gtacgaagaa gaacgatatt accgcatcac ttacggcgaa 120 acaggaggca atagccctgt ccaggagttc actgtgcctg ctttccatac tacagctacc 180 atcagcggcc ttaaacctgg cgttgattat accatcactg tgtatgctgt cacttacaaa 240 cataaatacg cttactacta cccgccaatt tccattaatt accgcacaga aattgacaaa 300 ccatcccagt aa 312 <210> 457 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5273_D01 <400> 457 atgggagttt ctgatgtgcc gcgcgacctg gaagtggttg ctgccacccc caccagcctg 60 ctgatcagct gggaaccgtc ttacaaagac gaccgatatt accgcatcac ttacggcgaa 120 acaggaggca atagccctgt ccaggagttc actgtgcctt ctttccatca gacagctacc 180 atcagcggcc ttaaacctgg cgttgattat accatcactg tgtatgctgt cacttacgaa 240 ccggacgaat actacttcta ctacccaatt tccattaatt accgcacaga aattgacaaa 300 ccatcccagt aa 312 <210> 458 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_5274_E01 <400> 458 atgggagttt ctgatgtgcc gcgcgacctg gaagtggttg ctgccacccc caccagcctg 60 ctgatcagct ggtctggtga ctaccatccg catcgatatt accgcatcac ttacggcgaa 120 acaggaggca atagccctgt ccaggagttc actgtgcctg gtgaacatga aacagctacc 180 atcagcggcc ttaaacctgg cgttgattat accatcactg tgtatgctgt cacttacgac 240 ggtgaaaaag ctgacaaata cccgccaatt tccattaatt accgcacaga aattgacaaa 300 ccatcccagt aa 312 <210> 459 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02 <400> 459 atgggagttt ctgatgtgcc gcgcgacctg gaagtggttg ctgccacccc caccagcctg 60 ctgatcagct ggtctgatga ctaccatgcg catcgatatt accgcatcac ttacggcgaa 120 acaggaggca atagccctgt ccaggagttc actgtgcctg gtgaacatgt gacagctacc 180 atcagcggcc ttaaacctgg cgttgattat accatcactg tgtatgctgt cacttacgac 240 ggtgaaaagg ctgccacaga ttggtcaatt tccattaatt accgcacacc gtgccaccat 300 caccaccacc actga 315 <210> 460 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, w/o His-tag and including leader sequence <400> 460 ggtgttagtg atgttccgcg tgatctggaa gttgttgcag caaccccgac cagcctgctg 60 attagctggt cagatgatta tcatgcccat cgttattatc gcattaccta tggtgaaacc 120 ggtggtaata gtccggttca agaattcacc gttccgggtg aacatgttac cgcaaccatt 180 agcggtctga aaccgggtgt tgattacacc attaccgttt atgcagttac ctacgatggt 240 gaaaaagcag caaccgattg gagcattagc attaactatc gtaccccgtg ttaa 294 <210> 461 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, w/ leader sequence and PCPPPPPC <400> 461 atgaaaaaaa tctggctggc actggcaggt ctggttctgg catttagcgc tagcgccggt 60 gttagtgatg ttccgcgtga tctggaagtt gttgcagcaa ccccgaccag cctgctgatt 120 agctggtcag atgattatca tgcccatcgt tattatcgca ttacctatgg tgaaaccggt 180 ggtaatagtc cggttcaaga attcaccgtt ccgggtgaac atgttaccgc aaccattagc 240 ggtctgaaac cgggtgttga ttacaccatt accgtttatg cagttaccta cgatggtgaa 300 aaagcagcaa ccgattggag cattagcatt aactatcgta ccccgtgtcc gccgccaccg 360 ccgtgttgat aa 372 <210> 462 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6077_F02, w/ leader sequence and PCPPPPPCH6 <400> 462 atgggagttt ctgatgtgcc gcgcgacctg gaagtggttg ctgccacccc caccagcctg 60 ctgatcagct ggtctgatga ctaccatgcg catcgatatt accgcatcac ttacggcgaa 120 acaggaggca atagccctgt ccaggagttc actgtgcctg gtgaacatgt gacagctacc 180 atcagcggcc ttaaacctgg cgttgattat accatcactg tgtatgctgt cacttacgac 240 ggtgaaaagg ctgccacaga ttggtcaatt tccattaatt accgcacacc gtgcccgccg 300 ccaccgccgt gtcaccatca ccaccaccac tga 333 <210> 463 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ADX_6093_A01 full length <400> 463 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Glu 65 70 75 80 Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 464 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: linker <400> 464 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser 20 <210> 465 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: linker <400> 465 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 466 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: linker <400> 466 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 467 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: linker <400> 467 Pro Val Gly Val Val 1 5

Claims (76)

  1. BC, DE 및 FG 루프를 포함하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 (FBS)를 포함하는 폴리펩티드이며, 여기서 루프 중 1개 이상은 야생형 FBS 도메인의 상응하는 루프에 비해 변경되고, 폴리펩티드는 인간 글리피칸-3 (GPC3)에 1 μM 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, FBS가 피브로넥틴 유형 III (Fn3) 도메인인 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, Fn3 도메인이 인간 제10 피브로넥틴 유형 III (10Fn3) 도메인인 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, BC 루프가
    (a) 서열식별번호: 6, 19, 32, 45, 58, 71, 84 또는 99; 및
    (b) 서열식별번호: 6, 19, 32, 45, 58, 71, 84 또는 99의 BC 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 BC 루프
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, DE 루프가
    (a) 서열식별번호: 7, 20, 33, 46, 59, 72, 85 또는 100; 및
    (b) 서열식별번호: 7, 20, 33, 46, 59, 72, 85 또는 100의 DE 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 DE 루프
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, FG 루프가
    (a) 서열식별번호: 8, 21, 34, 47, 60, 73, 86, 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 또는 318, 및
    (b) 서열식별번호: 8, 21, 34, 47, 60, 73, 86, 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 또는 318의 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 FG 루프
    로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 BC 루프가 서열식별번호: 6, 19, 32, 45, 58, 71, 84 또는 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; DE 루프가 서열식별번호: 7, 20, 33, 46, 59, 72, 85 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; FG 루프가 서열식별번호: 8, 21, 34, 47, 60, 73, 86, 101, 129, 156, 183, 210, 237, 264, 291 및 318로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 임의로, BC, DE 및/또는 FG 루프는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8을 포함하고;
    (b) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 6, 7 및 8의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하고;
    (c) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21을 포함하고;
    (d) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 19, 20 및 22의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하고;
    (e) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 32, 33 및 34를 포함하고;
    (f) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 32, 33 및 34의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하고;
    (g) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 45, 46 및 47을 포함하고;
    (h) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 45, 46 및 47의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하고;
    (i) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 58, 59 및 60을 포함하고;
    (j) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 58, 59 및 60의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하고;
    (k) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 71, 72 및 73을 포함하고;
    (l) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 71, 72 및 73의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하고;
    (m) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 84, 85 및 86을 포함하고;
    (n) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 84, 85 및 86의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하고;
    (o) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 101을 포함하고;
    (p) BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 1개가 각각의 서열식별번호: 99, 100 및 101의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, FBS가 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 각각 (X)v, (X)x, 및 (X)z에 의해 나타내어진 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프는
    (a) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (b) 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
    (c) 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (d) 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
    (e) 각각 서열식별번호: 32, 33 및 34에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (f) 서열식별번호: 32, 33 및 34의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
    (g) 각각 서열식별번호: 45, 46 및 47에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (h) 서열식별번호: 45, 46 및 47의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
    (i) 각각 서열식별번호: 58, 59 및 60에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (j) 서열식별번호: 58, 59 및 60의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
    (k) 각각 서열식별번호: 71, 72 및 73에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (l) 서열식별번호: 71, 72 및 73의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
    (m) 각각 서열식별번호: 84, 85 및 86에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (n) 서열식별번호: 84, 85 및 86의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
    (o) 각각 서열식별번호: 99, 100 및 101에 제시된 BC, DE 또는 FG 루프 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나;
    (p) 서열식별번호: 99, 100 및 101의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
    (q) 서열식별번호: 99, 100 및 129의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
    (r) 서열식별번호: 99, 100 및 156의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
    (s) 서열식별번호: 99, 100 및 183의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
    (t) 서열식별번호: 99, 100 및 210의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
    (u) 서열식별번호: 99, 100 및 237의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
    (v) 서열식별번호: 99, 100 및 264의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나;
    (w) 서열식별번호: 99, 100 및 264의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하거나; 또는
    (x) 서열식별번호: 99, 100 및 318의 아미노산 서열을 갖는 BC, DE, 및 FG 루프를 포함하는
    폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, FBS가 서열식별번호: 3, 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 및 98의 비-BC, DE, 및 FG 루프 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, FBS가 서열식별번호: 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83 및 98 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, FBS가 서열식별번호: 5, 9-18, 22-31, 35-44, 48-57, 61-70, 74-83, 87-98, 102-128, 130-155, 157-182, 184-209, 211-236, 238-263, 265-290, 292-317 또는 319-343 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, FBS가 서열식별번호: 98, 102-128, 129-155, 157-182, 184-209, 211-236, 238-263, 265-290, 292-317 및 319-343의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, FBS가 서열식별번호: 5, 18, 31, 44, 57, 70, 83, 98, 128, 155, 182, 209, 209, 236, 263, 290 및 317로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, FBS가 서열식별번호: 5, 9-18, 22-31, 35-44, 48-57, 61-70, 74-83, 87-98, 102-128, 130-155, 157-182, 184-209, 211-236, 238-263, 265-290, 292-317 및 319-343으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, FBS가 서열식별번호: 98, 102-128, 129-155, 157-182, 184-209, 211-236, 238-263, 265-290, 292-317 및 319-343으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, FBS가 글리피칸-3과의 결합에 대해 서열식별번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 FBS와 경쟁하는 것인 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, FBS가 HQVSFF (서열식별번호: 209)를 포함하는 글리피칸-3 내의 10-20개의 아미노산 잔기의 영역에 결합하는 것인 폴리펩티드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, FBS가 EQLLQSASM (서열식별번호: 210)을 포함하는 글리피칸-3 내의 10-20개의 아미노산 잔기의 영역에 결합하는 것인 폴리펩티드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, FBS가 HQVSFF (서열식별번호: 209) 및 EQLLQSASM (서열식별번호: 210)을 포함하는 글리피칸-3 내의 불연속 애드넥틴 부위에 결합하는 것인 폴리펩티드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 단백질을 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜, 시알산, Fc, Fc 단편, 트랜스페린, 혈청 알부민, 혈청 알부민 결합 단백질, 및 혈청 이뮤노글로불린 결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 약동학적 (PK) 모이어티를 추가로 포함하는 폴리펩티드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, FBS의 C-말단이 아미노산 서열 PmXn으로 이루어진 모이어티에 연결되며, 여기서 P는 프롤린이고, X는 임의의 아미노산이고, m은 적어도 1인 정수이고 n은 0 또는 적어도 1인 정수인 폴리펩티드.
  24. 제23항에 있어서, m이 1 또는 2이고, n이 1-10의 정수인 폴리펩티드.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 모이어티가 시스테인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  26. 제25항에 있어서, 모이어티가 아미노산 서열 PmCXn으로 이루어지며, 여기서 C는 시스테인이고, 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산인 폴리펩티드.
  27. 제25항에 있어서, 모이어티가 아미노산 서열 PmCXn1CXn2로 이루어지며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산이고, n1 및 n2는 독립적으로 0 또는 적어도 1인 정수인 폴리펩티드.
  28. 제28항에 있어서, n1 및 n2가 독립적으로 1-5의 정수인 폴리펩티드.
  29. 제23항에 있어서, 모이어티가 PI, PC, PID, PIE, PIDK (서열식별번호: 382), PIEK (서열식별번호: 383), PIDKP (서열식별번호: 384), PIEKP (서열식별번호: 385), PIDKPS (서열식별번호: 386), PIEKPS (서열식별번호: 387), PIDKPC (서열식별번호: 388), PIEKPC (서열식별번호: 389), PIDKPSQ (서열식별번호: 390), PIEKPSQ (서열식별번호: 391), PIDKPCQ (서열식별번호: 392), PIEKPCQ (서열식별번호: 393), PHHHHHH (서열식별번호: 394) 및 PCHHHHHH (서열식별번호: 395)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 폴리펩티드.
  30. 제26항에 있어서, 모이어티가 PC 또는 PPC인 폴리펩티드.
  31. 제27항에 있어서, 모이어티가 PCGC (서열식별번호: 412), PCPC (서열식별번호: 413), PCGSGC (서열식별번호: 414), PCPPPC (서열식별번호: 415), PCPPPPPC(서열식별번호: 416), PCGSGSGC (서열식별번호: 417), PCHHHHHC (서열식별번호: 418), PCCHHHHHH (서열식별번호: 419), PCGCHHHHHH (서열식별번호: 420), PCPCHHHHHH (서열식별번호: 421), PCGSGCHHHHHH (서열식별번호: 422), PCPPPCHHHHHH (서열식별번호: 423), PCPPPPPHHHHHH (서열식별번호: 424) 및 PCGSGSGCHHHHHH (서열식별번호: 425)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 폴리펩티드.
  32. 제31항에 있어서, 모이어티가 PCPPPPPC (서열식별번호: 416)인 폴리펩티드.
  33. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 모이어티 내의 시스테인이 이종 모이어티에 접합된 것인 폴리펩티드.
  34. 제33항에 있어서, 이종 모이어티가 검출가능한 모이어티인 폴리펩티드.
  35. 제33항에 있어서, 이종 모이어티가 약물 모이어티이고, FBS 및 약물 모이어티가 FBS-약물 접합체를 형성하는 것인 폴리펩티드.
  36. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 FBS 모이어티를 포함하는 FBS-약물 접합체이며, 여기서 약물 모이어티는 링커에 의해 FBS 모이어티에 접합된 것인 FBS-약물 접합체.
  37. 제36항에 있어서, 링커가 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 또는 펩티드-함유 링커인 FBS-약물 접합체.
  38. 제37항에 있어서, 링커가 펩티딜 링커인 FBS-약물 접합체.
  39. 제38항에 있어서, 펩티딜 링커가 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (서열식별번호: 467), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, 또는 Glu인 FBS-약물 접합체.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 모이어티가 세포독성 약물인 FBS-약물 접합체.
  41. 제40항에 있어서, 세포독성 약물이
    (a) 에네디인 예컨대 칼리케아미신 및 운시알라마이신;
    (b) 튜부리신;
    (c) DNA 알킬화제 예컨대 CC-1065의 유사체 및 두오카르마이신;
    (d) 에포틸론;
    (e) 아우리스타틴;
    (f) 피롤로벤조디아제핀 (PBD) 이량체;
    (g) 메이탄시노이드 예컨대 DM1 및 DM4
    및 그의 유사체 및 유도체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 FBS-약물 접합체.
  42. 제41항에 있어서, 약물 모이어티가
    Figure pct00082

    Figure pct00083

    인 FBS-약물 접합체.
  43. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 모이어티가 화학식 (II)의 구조를 갖는 합성 튜부리신 유사체인 FBS-약물 접합체.
    Figure pct00084
  44. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, FBS 및 약물 모이어티가 화학식 (III)의 구조를 갖는 링커 모이어티와 접합된 것인 FBS-약물 접합체.
    Figure pct00085
  45. 제44항에 있어서, 약물-모이어티-링커가 화학식 (IV)의 구조를 가지며:
    Figure pct00086

    여기서 말레이미드 기는 FBS의 시스테인의 술프히드릴 기와 반응하여, 약물-모이어티-링커와 FBS 사이에 티오에테르 결합을 형성하는 것인 FBS-약물 접합체.
  46. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, FBS 모이어티가 시스테인을 포함하는 C-말단 모이어티를 포함하는 것인 FBS-약물 접합체.
  47. 제46항에 있어서, C-말단 모이어티가 아미노산 서열 PmCXn으로 이루어지며, 여기서 C는 시스테인이고, 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산이고, m은 적어도 1인 정수이고 n은 0 또는 적어도 1인 정수인 FBS-약물 접합체.
  48. 제47항에 있어서, m이 1 또는 2이고, n이 1-10의 정수인 FBS-약물 접합체.
  49. 제46항에 있어서, 모이어티가 아미노산 서열 PmCXn1CXn2로 이루어지며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산이고, n1 및 n2는 독립적으로 0 또는 적어도 1인 정수인 FBS-약물 접합체.
  50. 제49항에 있어서, n1 및 n2가 독립적으로 1-5의 정수인 FBS-약물 접합체.
  51. 제47항에 있어서, C-말단 모이어티가 PC 또는 PPC인 FBS-약물 접합체.
  52. 제49항에 있어서, 모이어티가 PCGC (서열식별번호: 412), PCPC (서열식별번호: 413), PCGSGC (서열식별번호: 414), PCPPPC (서열식별번호: 415), PCPPPPPC(서열식별번호: 416), PCGSGSGC (서열식별번호: 417), PCHHHHHC (서열식별번호: 418), PCCHHHHHH (서열식별번호: 419), PCGCHHHHHH (서열식별번호: 420), PCPCHHHHHH (서열식별번호: 421), PCGSGCHHHHHH (서열식별번호: 422), PCPPPCHHHHHH (서열식별번호: 423), PCPPPPPHHHHHH (서열식별번호: 424) 및 PCGSGSGCHHHHHH (서열식별번호: 425)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 FBS-약물 접합체.
  53. 제52항에 있어서, 모이어티가 PCPPPPPC (서열식별번호: 16)인 FBS-약물 접합체.
  54. 화학식 (I)에 의해 나타내어지는 구조를 가지며
    Figure pct00087

    여기서 m은 1, 2, 3 또는 4이고 Adx는 인간 GPC3에 1μM 이하의 KD로 특이적으로 결합하는 애드넥틴이고, "Adx"에 연결된 황 원자는 애드넥틴의 시스테인의 술프히드릴 기의 황 원자인 FBS-약물 접합체.
  55. 제54항에 있어서, Adx가
    (a) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8을 포함하거나;
    (b) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 19, 20 및 21을 포함하거나;
    (c) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 32, 33 및 34를 포함하거나;
    (d) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 45, 46 및 47을 포함하거나;
    (e) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 58, 59 및 60을 포함하거나;
    (f) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 71, 72 및 73을 포함하거나;
    (g) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 84, 85 및 86을 포함하거나;
    (h) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 101을 포함하거나;
    (i) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 129를 포함하거나;
    (j) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 156을 포함하거나;
    (k) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 183을 포함하거나;
    (l) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 210을 포함하거나;
    (m) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 237을 포함하거나;
    (n) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 264를 포함하거나;
    (o) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 264를 포함하거나; 또는
    (p) BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 99, 100 및 318을 포함하는
    인간 10Fn3 도메인이고,
    10Fn3 도메인이 아미노산 서열 PmCXn, 또는 PmCXn1CXn2로 이루어진 C-말단 모이어티를 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 임의의 아미노산이고, n1 및 n2는 독립적으로 0 또는 적어도 1인 정수인 FBS-약물 접합체.
  56. 제55항에 있어서, C-말단 모이어티가 PC 또는 PPC, PCGC (서열식별번호: 412), PCPC (서열식별번호: 413), PCGSGC (서열식별번호: 414), PCPPPC (서열식별번호: 415), PCPPPPPC(서열식별번호: 416), PCGSGSGC (서열식별번호: 417), PCHHHHHC (서열식별번호: 418), PCCHHHHHH (서열식별번호: 419), PCGCHHHHHH (서열식별번호: 420), PCPCHHHHHH (서열식별번호: 421), PCGSGCHHHHHH (서열식별번호: 422), PCPPPCHHHHHH (서열식별번호: 423), PCPPPPPHHHHHH (서열식별번호: 424) 또는 PCGSGSGCHHHHHH (서열식별번호: 425)인 FBS-약물 접합체.
  57. 제52항에 있어서, 모이어티가 PC 또는 PCPPPPPC (서열식별번호: 16)인 FBS-약물 접합체.
  58. 제54항에 있어서, Adx가 서열식별번호: 12-17, 24-30, 38-43, 51-56, 64-69, 77-82, 90-97, 110-127, 137-154, 164-181, 191-208, 218-235, 245-262, 272-289, 299-316 및 326-343으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 FBS-약물 접합체.
  59. 제54항에 있어서, Adx가 서열식별번호: 110-127, 137-154, 164-181, 191-208, 218-235, 245-262, 272-289, 299-316 및 326-343으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 FBS-약물 접합체.
  60. 제54항에 있어서, Adx가 서열식별번호: 110-127로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 FBS-접합체.
  61. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  62. 제36항 내지 제60항 중 어느 한 항의 FBS-약물 접합체를 포함하는 제약 조성물.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 본질적으로 내독소-무함유인 조성물.
  64. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  65. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  66. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포.
  67. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 생산하는 방법이며, 폴리펩티드를 발현시키는 데 적합한 조건 하에 제66항의 세포를 배양하고, 폴리펩티드를 정제하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  68. 대상체에게 제61항 또는 제62항의 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 글리피칸-3 질환 또는 장애를 약화시키거나 또는 억제하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 글리피칸-3 질환 또는 장애가 암인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 암이 간세포성 암종, 흑색종, 윌름스 종양, 간모세포종, 난소암 또는 편평 폐암인 방법.
  71. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, FBS-약물 접합체 또는 제약 조성물, 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트.
  72. 샘플을 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 접촉시키고, 글리피칸-3에 대한 FBS의 결합을 검출하거나 또는 측정하는 것을 포함하는, 샘플 내의 글리피칸-3을 검출하거나 또는 측정하는 방법.
  73. 화학식 (I)에 의해 나타내어지는 구조를 가지며
    Figure pct00088

    여기서 m은 1이고 Adx는 서열식별번호: 110-117 및 272-289 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 애드넥틴이고; "Adx"에 연결된 황 원자는 애드넥틴의 C-말단 시스테인의 술프히드릴 기의 황 원자인 FBS-약물 접합체.
  74. 화학식 (I)에 의해 나타내어지는 구조를 가지며
    Figure pct00089

    여기서 m은 2이고 Adx는 서열식별번호: 119-126 및 281-288의 아미노산 서열을 포함하는 애드넥틴이고; "Adx"에 연결된 황 원자는 애드넥틴의 2개의 C-말단 시스테인 각각의 술프히드릴 기의 황 원자인 FBS-약물 접합체.
  75. 화학식 (VI)에 의해 나타내어지는 구조를 가지며
    Figure pct00090

    여기서 시스테인에 연결된 황 원자는 시스테인의 술프히드릴 기의 황 원자인 FBS-약물 접합체.
  76. 화학식 (VII)에 의해 나타내어지는 구조를 가지며:
    Figure pct00091

    여기서 시스테인에 연결된 황 원자는 시스테인의 술프히드릴 기의 황 원자인 FBS-약물 접합체.
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