JP2003528632A

JP2003528632A - 血管内皮成長因子（ｖｅｇｆ）−媒介性脈管形成を阻害するペプチド、該ペプチドをエンコードするポリヌクレオチド及びその使用方法

Info

Publication number: JP2003528632A
Application number: JP2001571760A
Authority: JP
Inventors: トゥルネール，ロズリーヌ; ドマンジェル，カロリーヌ; デルバン，クロード; ペレ，ジェラール; マジ，ジャン−クロード; プルエ，ジャン; ヴァシ，ロジェ
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 2000-03-31
Filing date: 2001-03-29
Publication date: 2003-09-30
Also published as: US20020068697A1; US20030171289A1; US20050019826A1; AU4445601A; WO2001072829A3; US6559126B2; CA2404528A1; EP1268544A2; WO2001072829A2

Abstract

(57)【要約】この発明は、VEGFと相互作用でき、KDR又は抗-VEGF抗体とのVEGFの相互作用を阻害でき、それにより、VEGF媒介性脈管形成又は脈管形成関連疾患を阻害するペプチド、ペプチドをエンコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、ペプチドを含む医薬組成物及びペプチドでの脈管形成の阻害方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】既存の血管からの新生による血管形成である脈管形成は、直径2〜3mmを越える
充実性腫瘍の成長及び腫瘍の転移に必須である(Folkman, 1995; Bouckら、1996
参照)。新しい毛細血管の発生は、始まりとなる管膜の溶解、内皮細胞の移動と
増殖、ならびに新しい血管形成を含む多段階工程を伴う(Cliff, 1963; Schoefl,
1963; Ausprunck 及び Folkman, 1977)。これらの工程のいずれかひとつを抑止
すると、新しい管の形成が阻害され、この結果、腫瘍の成長と転移の発生に影響
が及ぼされる。実際、ひとつの内皮細胞を除くと、100個の腫瘍細胞の成長が阻
害されるものと推測される(Thorpeら、1995)。さらに、内皮細胞は遺伝学的に安
定で、このために薬剤耐性変異体に突然変異しないものと考えられる(Young, 19
89; Kerbel, 1991; Boehmら、1997)。細胞は血管内に並んでいるので、循環して
いる薬剤に容易に接触できる。この特徴は、内皮細胞を標的とする抗-脈管形成
治療が、癌治療に将来有望なメカニズムを供していることを示唆している。

【０００２】これまで、VPFつまりバスキュロトロピン(vasculotropin)としても公知(Ferra
ra, 1993; Ferrara 及び Davis-Smyth, 1997参照)の、特に有力な血管内皮成長
因子(VEGF)を含む幾つかの脈管形成因子が同定されている(Folkman, 1995; Hana
hanら、1996参照)。他の脈管形成因子と異なって、VEGFは、脈管形成中に内皮細
胞-特異的なマイトジェンとして作用する(Termanら、1992及びFerrara, 1993)。
VEGFに対して生じる抗体はインビボで腫瘍成長を抑制することが分かっており(K
imら、1993)、VEGFアンタゴニストが、腫瘍-誘発性脈管形成阻害剤として治療上
適用し得ることを示している。

【０００３】 VEGFは、ろ胞星状細胞の調節培地と種々の腫瘍細胞系から最初に精製された(F
erraraら、1989; Plouetら、1989; Myokenら、1991)。それは、PDGF (血小板由
来成長因子)をも含むシスチン-ノットファミリー成長因子のメンバーである。最
近、幾つかのVEGF構造同族体が同定された: VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D 及び胎盤
成長因子(PlGF) (Klagsbrun 及び D'Amore, 1996; Ferrara, 1999参照)。VEGFを
エンコードするヒト遺伝子は、7個のイントロンで分断される8個のエキソンに組
織化されている。VEGF遺伝子のmRNAを代替的にスプライシングすると、成熟モノ
マーで121、145、165、189又は206アミノ酸残基を有する5つの異なる分子種が生
成される(Tisherら、1991; Houckら、1991)。エキソン6でエンコードされる残基
を欠くVEGF₁₆₅だけが、成熟かつ活性型のVEGFである。それは、ヘパリンと細胞
表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合し、遊離又は細胞膜結合型として発現
される(Houckら、1992)。2つのチロシンキナーゼレセプターが、VEGFが高親和性
リガンドとして作用するものとして同定された: fms-様チロシンキナーゼ-1 (Fl
t-1 又はVEGFR-1) 及びキナーゼドメインレセプター(KDR/Flk-1 又は VEGFR-2)
(Matthewsら、1991; Termanら、1991; De Vriesら、 1992; Millauerら、1993)
。Flt-1は、KDRより50倍高い親和性でVEGFを結合するが(De Vriesら、1992)、VE
GF脈管形成特性の多く(マイトジェン活性、走化性、及び形態学的変化の誘導)は
、KDRとの相互作用で媒介される(Waltenbergerら、1994)。したがって、VEGFとK
DRとの相互作用は、脈管形成を阻害するために中断するのに最も適当である。

【０００４】ファージ-ディスプレイ・ライブラリーのスクリーニングは、タンパク質表面
を模倣するペプチドの同定に強力な技術である(Smith, 1985; Hoess, 1993; Fel
iciら、1995)。各ペプチドは遺伝学上の粒子に物理学的に結合するので、標的分
子を特異的に結合するクローンは、インビトロのバイオパニング及びインビボの
増幅の連続サイクルによって選択することができる。細胞膜レセプターに対する
新規なアゴニストとアンタゴニスト、例えば血小板上でGPIIb/IIIaレセプター(O
'Neilら、1992)又は5 1 インテグリン(Koivunenら、1993)を結合するペプチドを
含むRGDが、この方法を用いて成功裏に同定されている(Cwirlaら、1990; Corte
seら、1996)。選択されたペプチドは、インテグリン-媒介性細胞付着に拮抗する
ことができた。

【０００５】この発明者らは、KDRへのVEGFの結合を阻害するペプチドを同定した。繊維状
ファージでディスプレイされるランダムペプチドライブラリー(Corteseら、1996
)を、2つの同目的のストラテジを用いてスクリーンした。最初に、組換えKDRを
発現する細胞を用いて(Plouetら、1997)、第二にVEGFに対するモノクローナル抗
体を用いて、ペプチドレパートリーをスクリーンした。この抗体はVEGF-依存性
内皮細胞増殖を阻害したので、その抗原結合部位は、KDRとのVEGFの相互作用表
面の全て又は一部を模倣しているものと仮定した。両ストラテジにより、インビ
トロでヒト内皮細胞増殖を特異的に阻害する、ペプチドATWLPPR (SEQ ID NO:1)
を含む、KDRに結合するVEGFと競合するペプチドが単離された。さらに、それは
、インビボでのVEGF-誘発性脈管形成を完全に破壊した。VEGF-KDR相互作用の特
異的アンタゴニストとしてのATWLPPR (SEQ ID NO:1)は、有効な抗腫瘍剤となる
可能性がある。

【０００６】したがって、この発明のひとつの目的は、VEGFと相互作用しうるペプチドのス
クリーニング方法を提供することである。この発明の別の目的は、VEGFとKDRの相互作用を阻害する新規なペプチドを提
供することである。この発明の別の目的は、そのようなペプチドをエンコードする新規なポリヌク
レオチド配列を提供することである。この発明の別の目的は、そのようなペプチドをエンコードするポリヌクレオチ
ドからなるベクターを提供することである。この発明の別の目的は、そのようなペプチドを用いて、脈管形成及び脈管形成
によって影響を及ぼされる疾患の阻害方法を提供することである。この発明の別の目的は、そのようなペプチドを含む医薬組成物を提供すること
である。以下の詳細な説明から明らかになるこれら及び他の目的は、ここに記載される
新規なペプチドについての発明者の発見によって達成される。

【０００７】図1. CHO-KDR細胞は、機能的KDRを発現する。(A) VEGF 結合のスキャッチャ
ード分析。遊離のVEGF分子に対する結合割合(B/F)を、結合VEGF濃度に対してプ
ロットした。(B) ヘパリンの作用。CHO-KDR細胞へのVEGFの結合は、種々の量の
ヘパリンの存在下で測定した。(C) PlGFの作用。CHO-KDR細胞へのVEGF(100 ng/m
l)の結合を、ヘパリン(1.8 μg/ml)の不在下(白いバー)又は存在下(黒いバー)で
試験し、PlGF (50 ng/ml) 又はPBS (対照)に比較した。データは、同じ3つのサ
ンプルの平均及び標準偏差に相当する。全結合実験を2回行い、同様の結果を得
た。

【０００８】図2. 選択したファージ-ディスプレイ・ペプチドは、ELISAで特異的にKDRに結
合する。KDR結合(10¹³ pfu/ml) (A) 又は抗-VEGF抗体結合 (10¹²pfu/ml) (B)
によって選択したクローンを、M13ファージ粒子(対照)と比較した。結果は、3つ
の個々のアッセイを示す。図3. 抗-VEGF抗体は、CPAE細胞成長を阻害する。CPAE細胞成長は、種々の濃度
の抗-VEGF 抗体を補った培地で測定し、非処理培養物と比較した。データは、同
じ3つのサンプルの増殖阻害についての平均と標準偏差を示し、2つの個々の実験
を示している。

【０００９】図4. 合成ペプチドは、KDR結合についてVEGFと競合する。KDR結合(A)又は抗-VE
GF結合(B)で選択したペプチドを、ヘパリン(1.8 μg/ml)の存在下、2,1x10^-4 M
濃度のCHO-KDR細胞への結合についてVEGFとの競合で試験した。データは、同じ3
つのサンプルの平均と標準偏差を示す。同様の結果は、3つの個々の実験で得た
。図5. V1は、KDRへのVEGFの結合を破壊することができる。種々の濃度のVEGF (A
)又はV1ペプチド(B)を、CHO-KDR細胞への結合について放射活性ラベルしたVEGF
との競合で試験した。非阻害対象として、V5を同一条件で試験した。データは、
同じ3つのサンプルの平均と標準偏差を示す。同様の結果は、2つの異なる実験で
得た。

【００１０】図6. V1は、CPAE細胞増殖を阻害する。CPAE細胞成長は、抗体結合(A)又はKDR結
合(B)によって選択した合成ペプチドの存在下で24時間培養後に測定し、非処理
培養物と比較した。データは、同じ3つのサンプルの増殖阻害についての平均と
標準偏差を示し、3つの個々の実験を示している。図7. V1は、用量依存的にVEGF 又はAIAで誘発されるヒト内皮細胞の増殖を阻
害する。HUAE細胞培養物を、VEGF (A) 又は抗-イディオタイプ抗体(B)の存在下
で成長させ、種々の濃度のV1又はV5を毎日追加した。細胞を5日後に計測した。
データは、同じ3つのサンプルの増殖阻害割合の平均である。

【００１１】図8. V1は、内皮細胞で特異的に作用する。CPAEとNIH 3T3 線維芽細胞を、V1ペ
プチドを用いて、又は用いないで培養し、細胞増殖変化を24時間後に測定した。
データは、同じ3つのサンプルの増殖阻害割合の平均と標準偏差を示す。同様の
結果は、2つの個々の実験で得た。図9. V1は、インビボで角膜脈管形成を阻害する。VEGF 存在又は不在下の、V1
、V5又はPBS (賦形剤)を含むインプラントにおける新血管形成を、ウサギの角膜
ポケット(corneal pocket)に挿入してから12日後に評価した: A) 各インプラン
ト群の代表図、B)8インプラント群について測定した脈管形成スコアの平均及び
標準誤差。

【００１２】図10. V1誘導体によるCHO-KDRトランスフェクト細胞への¹²⁵I-VEGF 165の結合
の置換曲線。実験は、最終濃度7 pM の¹²⁵I-VEGF (Amersham Fr)と+4℃で3時間
のあいだ細胞(500,000細胞/ウェル)をインキュベートし、ヘパリン存在下(1μg/
ml)で最終用量0.3ml中の種々のペプチド類似体濃度(0〜500μg/ml)を増して行っ
た。特異的結合は、最終濃度3 nMでVEGF 165 (R&D system UK)の存在下で生じな
かった。図11. ペプチドV1、A9、A10及びA7によるCHO-KDRトランスフェクト細胞への¹²⁵ I-VEGF165の結合の置換曲線の比較。実験条件は、図10の凡例に示す。

【００１３】図12. アラニンによるアルギニンへの上流の6アミノ酸の置換で得られるペプチ
ドA11によるCHO-KDRトランスフェクト細胞への¹²⁵I-VEGF165の結合の置換曲線。
実験条件は、図10の凡例に示す。図13. V1 (400 μg/ml) VEGF165誘発性HUVEC増殖の作用。種々の濃度のVEGF165
を96時間のあいだ加えた。図14. VEGF R2 (KDR)/Fc キメラ(R&D UK)への¹²⁵I VEGF 165の結合に対するV1
の作用。ジスルフィド結合ホモダイマータンパク質を、イムロン(Immulon)ポリ
スチレンウェル(Dynatech VA)の表面に固定化した。VEGFを+4℃で一晩インキュ
ベートした。3回洗浄後、結合した放射活性を測定した。

【００１４】図15 A及びB (A) 生理食塩水(白抜きの円)又は50 μg/ml V1 (黒塗りの円)いず
れかの存在下における、濃度を増加させたVEGF165 によるCHO-KDRトランスフェ
クト細胞への¹²⁵I-VEGF 165の結合の置換曲線。(B) スキャッチャード図。実験
条件を図10の凡例に示す。図16 A 及び B (A 及び B) 対照のHUV-EC細胞に対する¹²⁵I-VEGF 165のスキャ
ッチャード図。(C) V1 40 μg/ml存在下のHUV-EC細胞に対する¹²⁵I-VEGF 165の
スキャッチャード図。実験条件は、図10の凡例に示す。

【００１５】図17. 生理食塩水(白抜きの円)又は最終濃度50μg/mlのV1ペプチド(黒塗りの円
)いずれかの存在下におけるトランスフェクトCHO細胞に対する¹²⁵I-VEGF 165の
結合についてのヘパリン作用。実験条件は、図10の凡例に示す。図18. V1の濃度を増すことによるMDA MB 細胞への¹²⁵I-VEGF 165の結合の置換
曲線。実験条件は、図10の凡例に示す。図19. HUV-EC細胞に対する¹²⁵I VEGF165 (160pM)の架橋結合。 1: 全結合、2:
非特異的結合(VEGF 4,5 nM)、3: V1、(2,4 x 10^-4M)、4: V1、(4,8 x 10^-4M)
。

【００１６】この明細書に挙げられる全ての特許出願、特許及び刊行物は、完全に引用する
ことによりここに組みこまれる。矛盾する場合には、定義を含むこの記載を優先
する。 VEGFと相互作用しうるペプチドによって、この発明は、VEGFの活性を誘導又は
調節し得るいずれかのペプチド又は化学生成物を包含する。例えば、VEGF特性を
阻害する活性は、脈管形成に関与した。ここで用いられるように、「阻害する」、「阻害している」又は「阻害」は、
VEGFとKDR又は抗-VEGFの相互作用; 脈管形成; 脈管形成に相関する疾患の症状;
又はVEGFが媒介し得るいずれかの他の活性における測定可能で再現性ある低下を
含む。

【００１７】ここで用いられるように、疾患を治療する化合物の有効量は、症状を改善又は
何らかの方法で軽減するか、あるいは症状の進行を止めるか又は後退させるのに
十分な量である。そのような量は、1回の服用として投与してもよく、あるいは
それによって有効となる養生法にしたがって投与してもよい。ここで用いられるように、治療は、症状、疾患又は疾病の徴候あるいは病状が
改善されるか、さもなければ有意に変化される方法を意味する。治療は、ここで
組成物の医薬用途も包含する。ここで用いられるように、特定の医薬組成物の投与による特定疾患の症状の改
善は、組成物の投与に帰するか、あるいはそれに伴う永続的又は暫定的、持続的
あるいは過渡的なものであろうとなかろうと、何らかの低下を意味する。

【００１８】タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列に関する、「本質的に..からなる」は
、明細書及び請求の範囲の目的のために以降で用いられる用語で、タンパク質又
はペプチドの第三次配置が実質的に変化しないような配列中の1以上のアミノ酸
の同類置換又は修飾を意味する。「同類置換」は上記機能によって定義され、置
換されるアミノ酸として電荷、大きさ、親水性及び/又は芳香族性が実質的に同
じアミノ酸の置換を含む。このような置換は、当業者に知られており、グリシン
-アラニン-バリン; イソロイシン-ロイシン; トリプトファン-チロシン; アスパ
ラギン酸-グルタミン酸; アルギニン-リジン; アスパラギン-グルタミン; 及び
セリン-トレオニンを含む。タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列に関連して
、「修飾」は、コンフォメーション、つまりタンパク質又はペプチド配列の生物
活性を変えない1以上のアミノ酸の欠失として機能的に定義される。

【００１９】従来のアミノ酸は、アラニン(A)、システイン(C)、アスパラギン酸(D)、グル
タミン酸(E)、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシ
ン(I)、リジン(K)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アスパラギン(N)、プロリン(
P)、グルタミン(Q)、アルギニン(R)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)、
トリプトファン(W)及びチロシンである。

【００２０】この発明のペプチドに含まれ得るさらなるアミノ酸には、以下が含まれる: Nl
e = L-ノルロイシン; Aabu = アミノブチル酸; Hphe = L-ホモフェニルアラニン
; Nva = L-ノルバリン; Dala = D-アラニン; Dcys = D-システイン; Dasp = D-
アスパラギン酸; Dglu = D-グルタミン酸; Dphe = D-フェニルアラニン; Dhis =
D-ヒスチジン; Dile = D-イソロイシン; Dlys = D-リジン; Dleu = D-ロイシン
; Dmet = D-メチオニン; Dasn = D-アスパラギン; Dpro = D-プロリン; Dgln =
D-グルタミン; Darg = D-アルギニン; Dser = D-セリン; Dthr = D-トレオニン;
Dval = D-バリン; Dtrp = D-トリプトファン; Dtyr = D-チロシン; Dorn = D-
オミチン(omithine); Aib = アミノイソブチル酸; Etg = L-エチルグリシン; Tb
ug = L-t-ブチルグリシン; Pen = ペニシルアミン; Anap = I-ナフチルアラニン
; Chexa = シクロヘキシルアラニン; Cpen = シクロペンチルアラニン; Cpro =
アミノシクロプロパンカルボキシレート; Norb = アミノノルボルニル(aminonor
bornyl) カルボキシレート; Mala = L-α-メチルアラニン; Mcys = L-α-メチル
システイン; Masp = L-α-メチルアスパラギン酸; Mglu = L-α-メチルグルタミ
ン酸; Mphe = L-α-メチルフェニルアラニン; Mhis = L α-メチルヒスチジン;
Mile = L-α-メチルイソロイシン; Mlys = L-α-メチルリジン; Mleu = L-α-メ
チルロイシン; Mmet = L-α-メチルメチオニン; Masn = L-α-メチルアスパラギ
ン; Mpro = L-α-メチルプロリン; Mgln = L-α-メチルグルタミン; Marg = L-
α-メチルアルギニン; Mser = L-a-メチルセリン; Mthr = L-α-メチルトレオニ
ン; Mval = L-a-メチルバリン; Mtrp = L-α-メチルトリプトファン; Mtyr = L-
a-メチルチロシン; Morn = L-α-メチルオルニチン; Mnle = L-a-メチルノルロ
イシン; アミノ-α-メチルブチル酸; Mnva = L-a-メチルノルバリン; Mhphe = L
-α-メチルホモフェニルアラニン; Metg = L-a-メチルエチルグリシン; メチル
-γ-アミノブチル酸;メチルアミノイソブチル酸; Mtbug = L-α-メチル-t-ブチ
ルグリシン; メチル-ペニシルアミン;メチル-α-ナフチルアラニン; メチルシ
クロヘキシルアラニン; メチルシクロペンチルアラニン; Dmala = D-α-メチル
アラニン; Dmorn = D-α-メチルオルニチン; Dmcys = D-αメチルシステイン; D
masp = D-α-メチルアスパラギン酸; Dmglu = D-α-メチルグルタミン酸; Dmphe
= D-α-メチルフェニルアラニン; Dmhis = D-α-メチルヒスチジン; Dmile = D
-α-メチルイソロイシン; Dmlys = D-α-メチルリジン; Dmleu = D-α-メチルロ
イシン; Dmmet = D-α-メチルメチオニン; Dmasn = D-α-メチルアスパラギン;
Dmpro = D-α-メチルプロリン; Dmgln = D-α-メチルグルタミン; Dmarg = D-α
-メチルアルギニン; Dmser = D-α-メチルセリン; Dmthr = D-α-メチルトレオ
ピン; Dmvai = D-α-メチルバリン; Dmtrp = D-α-メチルトリプトファン; Dmty
r = D-α-メチルチロシン; Nmala = L-N-メチルアラニン; Nmcys = L-N-メチル
システイン; Nmasp = L-N-メチルアスパラギン酸; Nmglu = L-N-メチルグルタミ
ン酸; Nmphe = L-N-メチルフェニルアラニン; Nmhis = L-N-メチルヒスチジン;
Nmile = L-N-メチルイソロイシン; Nmlys = L-N-メチルリジン; Nmleu = L-N-メ
チルロイシン; Nmmet = L-N-メチルメチオニン; Nmasn = L-N-メチルアスパラ
ギン; Nmchexa = N-メチルシクロヘキシルアラニン; Nmgln = L-N-メチルグルタ
ミン; Nmarg = L-N-メチルアルギニン; Nmser = L-N-メチルセリン; Nmthr = L-
N-メチルトレオニン; Nmval = L-N-メチルバリン; Nmtrp = L-N-メチルトリプ
トファン; Nmtyr = L-N-メチルチロシン; Nmorn = L-N-メチルオミチン; Nmnle
= L-N-メチルノルロイシン; Nmaabu = N-アミノ-α-メチルブチル酸; Nmnva = L
-N-メチルノルバリン; Nmhphe = L-N-メチルホモフェニルアラニン; Nmetg = L-
N-メチルエチルグリシン; Nmgabu = N-メチル-y-アミノブチル酸; Nmcpen = N-
メチルシクロペンチルアラニン; Nmtbug = L-N-メチル-t-ブチルグリシン; Nmp
en = N-メチルペニシルアミン; Nmanap = N-メチル-a-ナフチルアラニン; Nmaib
= N-メチルアミノイソブチル酸; Naeg = N-(2-アミノエチル)グリシン; Dnmal
a = D-N-メチルアラニン; Dnmorn = D-N-メチルオミチン; Dnmcys = D-N-メチ
ルシステイン; Dnmasp = D-N-メチルアスパラギン酸; Dnmglu = D-N-メチルグル
タミン酸; Dnmphe = D-N-メチルフェニルアラニン; Dnmhis = D-N-メチルヒスチ
ジン; Dnmile = D-N-メチルイソロイシン; Dnmlys = D-N-メチルリジン; Dnmleu
= D-N-メチルロイシン; Dnmmet = D-N-メチルメチオニン; Dnmasn = D-N-メチ
ルアスパラギン; Dnmpro = D-N-メチルプロリン; Dnmgln = D-N-メチルグルタミ
ン; Dnmarg = D-N-メチルアルギニン; Dnmser = D-N-メチルセリン; Dnmthr = D
-N-メチルトレオニン; Dnmval = D-N-メチルバリン; Dnmtrp = D-N-メチルトリ
プトファン; Dnmtyr = D-N-メチルチロシン; Nala = N-メチルグリシン(サルコ
シン); Nasp = N-(カルボキシメチル)グリシン; Nglu = N-(2-カルボキシエチル
)グリシン; Nphe = N-ベンジルグリシン; Nhhis = N-(イミダゾリルエチル)グリ
シン; Nile = N-(1-メチルプロピル)グリシン; Nlys = N-(4-アミノブチル)グリ
シン; Nleu = N-(2-メチルプロピル)グリシン; Nmet = N-(2-メチルチオエチル)
グリシン; Nhser = N-(ヒドロキシエチル)グリシン; Nasn = N-(カルバミルメチ
ル)グリシン; Ngln = N-(2-カルバミルエチル)グリシン; Nval = N-(1-メチルエ
チル)グリシン; Narg = N-(3-グアニジノプロピル)グリシン; Nhtrp = N-(3-イ
ンドリルエチル)グリシン; Nhtyr = N-(p-ヒドロキシフェネチル)グリシン; Nth
r = N-(1-ヒドロキシエチル)グリシン; Ncys = N-(チオメチル)グリシン; Norn
= N-(3-アミノプロピル)グリシン; Ncpro = N-シクロプロピルグリシン; Ncbut
= N-シクロブチルグリシン; Nchex = N-シクロヘキシルグリシン; Nchep = N-
シクロヘプチルグリシン; Ncoct = N-シクロオクチルグリシン; Ncdec = N-シク
ロデシルグリシン; Ncund = N-シクロウンデシルグリシン; Ncdod = N-シクロド
デシルグリシン; Nbhm = N-(2,2-ジフェニルエチル)グリシン; Nbhe = N-(3,3-
ジフェニルプロピル)グリシン; Nnbhm = N-(N-(2,2-ジフェニルエチル)カルバミ
ル-メチル)グリシン; Nnbhe = N-(N-(3,3-ジフェニルプロピル)カルバミルメチ
ル)グリシン; 及び Nbmc = 1-カルボキシ-1-(2,2-ジフェニルエチルアミノ)シク
ロプロパン。

【００２１】核酸配列に関連して「本質的に..からなる」は、明細書及び請求の範囲の目的
のため以降に用いられる用語であり、第三塩基の縮重に関連するようなヌクレオ
チドの置換を意味する。当業者に認められるように、第三塩基の縮重のため、ほ
ぼ全てのアミノ酸は、コードしているヌクレオチド配列において1以上のトリプ
レットコドンにより示すことができる。さらに、マイナーな塩基対の変化は、エ
ンコードされるアミノ酸配列に変化(同類置換)を生じ、遺伝子産物の生物活性を
実質的に変えないものと予測される。したがって、ここに開示されるタンパク質
又はペプチドをエンコードする核酸配列は、配列でわずかに修飾されていてもよ
く(例えばトリプレットコドンのヌクレオチドの置換)、同一アミノ酸配列の各DN
A産物を依然としてエンコードしていてもよい。

【００２２】用語「発現ベクター」は、この発明のペプチドをエンコードし、選択された宿
主細胞での発現に必要な配列を供するオリゴヌクレオチドを意味する。発現ベク
ターは、一般に転写プロモーター及びターミネーターを含むか、あるいは内因性
プロモーターに隣合った導入のために供する。発現ベクターは、通常は、さらに
複製起点と1以上の選択マーカーを含むプラスミドである。しかし、発現ベクタ
ーは、代替的に、宿主を感染するようデザインされたウイルス組換え体、又は宿
主ゲノム内の好ましい部位に組み込むようデザインされた組み込みベクターであ
ってもよい。ウイルス組み換え体の例は、アデノ-関連ウイルス(AAV)、アデノウ
イルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、及び当該分野
で公知の他のRNA又はDNAウイルス発現ベクターである。他の発現ベクターの例は
、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual第2版、Sambrook, Fritsch 及び M
aniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に開示されている。

【００２３】そのアミノ酸配列は、この発明によって開示されているので、この発明のペプ
チドは、その配列に基づいて既知の化学合成法 (例えば、液相合成法、固相合成
法など; Izumiya, N., Kato, T., Aoyagi, H., Waki, M., "Basis and Experime
nts of Peptide Synthesis", 1985, Maruzen Co., Ltd.)により産生することが
できる。この発明のペプチドは、1以上の保護されたアミノ酸残基を含んでいてもよい
。保護されたアミノ酸は、官能基又は官能基類が公知の方法により保護基又は保
護基類で保護されているアミノ酸で、種々の保護されたアミノ酸は市販されてい
る。

【００２４】この発明のペプチドを合成する際、後述の保護基のいずれかを選択することが
好ましい。第一に、アミノ酸のα-アミノ基に対する保護基は、Boc (t-ブチルオ
キシカルボニル) 又はFmoc (9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)である。
アルギニン(Arg)のグアニジノ基に対する保護基は、Tos (トシル)、NO.sub.2 (
ニトロ)、Mtr (4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル)又はPmc (2,2
,5,7,8-ペンタメチル-クロマン-6-スルホニル)である。リジン(Lys)のε-アミノ
基に対する保護基は、Z (ベンジルオキシカルボニル)又はCl.Z (2-クロロベンジ
ルオキシカルボニル)、Boc又はNpys (3-ニトロ-2-ピリジンスルフェニル)である
。ヒスチジン(His)のイミダゾリル基に対する保護基は、Tos、Z、Pac (フェナシ
ル)、Bom (ベンジルオキシメチル)、Dnp (ジニトロフェニル)又はTrt (トリチル
)である。システイン(Cys)のメルカプト基に対する保護基は、Bzl (ベンジル)、
MBzl (4-メトキシベンジル)、4-MeBzl (4-メチルベンジル)、Acm (アセトアミド
メチル)、Trt、Npys、t-Bu (t-ブチル)又はt-BuS (t-ブチルチオ)である。好ま
しいのは、MBzl、4-MeBzl、Trt、Acm及びNpysである。チロシン(Tyr)のヒドロキ
シル基に対する保護基は、Bzl、Cl.sub.2、Bzl (2,6-ジクロロベンジル)又はt-B
uであり、あるいはTyrのヒドロキシル基は保護されていなくともよい。トリプト
ファン(Trp)のインドール基に対する保護基はCHO (ホルミル)であるか、 Trp の
インドール基は保護されていなくともよい。メチオニン(Met)のチオメチル基に
対する保護基はメチルスルホキシドであるか、あるいはMetのチオメチル基は保
護されていなくともよい。セリン(Ser)及びトレオニン(Thr)のヒドロキシル基に
対する保護基は、Bzl又はt-Buである。アスパラギン酸(Asp)及びグルタミン酸(G
lu)のカルボキシル基に対する保護基は、OBzl (ベンジルエステル)、OtBu (t-ブ
チルエステル)、OcHex (シクロヘキシルエステル)、OPac (フェナシルエステル)
等である。アスパラギン(Asn)及びグルタミン(Gln)のカルバミド基に対する保護
基は、Trt又はXan (キサンチル)である。

【００２５】各保護基は、ペプチド合成の条件によって、それ自体公知の基から適宜選択す
ることが好ましい。保護されたアミノ酸の結合は、通常の縮合方法、例えばDCC (ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド)法、DIPCDI (ジイソプロピルカルボジイミド)法(Tartar, A.,
ら; J. Org. Chem., 44, 5000 (1979))、活性化エステル法、混合又はシンメト
リー酸無水物法、カルボニルジイミダゾール法、DCC-HONSu (N-ヒドロキシスク
シンイミド)法(Weygand, F.,ら、Z. Naturforsch., B, 21, 426 (1966))、DCC-H
OBt (1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)法(Koenig, W.,ら; Chem. Ber., 103, 7
88, 2024, 2034 (1970))、ジフェニルホスホリルアジド法、BOP試薬(ベンゾトリ
アゾリル-N-ヒドロキシ-トリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロホス
フィド)を用いるBOP-HOBt法(Hudson, D., J. Org. Chem., 53, 617 (1988))、HB
TU (2-(1H-ベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキ
サフルオロホスフェート)-HOBt 法 (Knorr, R.,ら、Tetrahedron Lett., 30, 19
27 (1989))、TBTU (2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3- テトラメチル
ウロニウムテトラフルオロボーレイト)-HOBt 法(Knorr, R.,ら、Tetrahedron Le
tt., 30, 1927 (1989))などによって達成される。しかし、これらの方法のうち
、好ましいのはDCC法、DCC-HOBt法、BOP-HOBt法、HBTU-HOBt法及びシンメトリー
酸無水物法である。

【００２６】縮合反応は、通常、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド(DMF)、N-メチル
ピロリドン(NMP) など又はそれらからなる混合溶媒のような有機溶媒中で行われ
る。 α-アミノ基の保護基に対する除去試薬としては、トリフルオロ酢酸/ジクロロ
メタン、HCl/ジオキサン、ピペリジン/DMF又はピペリジン/NMPなどを用いること
ができ、これらは、保護基の種類によって適宜選択される。各合成段階での縮合反応の進行の程度は、E. Kaiserら[Anal. Biochem., 34,
595 (1970)] (ニンヒドリン反応)の方法によって調べることができる。上記のように、所望のアミノ酸配列を有する保護ペプチド樹脂を得ることがで
きる。

【００２７】フッ化水素、TFMSA (トリフルオロメタンスルホン酸) [E. Gross 編集、Yajim
a, H.ら; "The Peptide" 5, 65 (1983), Academic Press]、TMSOTf (トリメチル
シリルトリフラート[Fujii, N., ら; J. Chem. Soc., Chem. Commun., 274 (198
7)]、TMSBr (トリメチルブロミド[Fujii, N., ら; Chem. Pharm. Bull., 35, 38
80 (1987)]、トリフルオロ酢酸などでの保護ペプチド樹脂の処理によって、樹脂
と保護基を同時に除くことができる。上記の除去試薬は、使用されるストラテジ
(Boc 又はFmoc)及び樹脂と保護基の種類によって適宜選択される。この発明のペ
プチドは、上記の一連の方法によって製造することができる。あるいは、この発明のペプチドは、この発明のペプチドのアミノ酸配列に相当
するポリヌクレオチド(DNA又はRNA)を産生し、ポリヌクレオチドを用いて遺伝子
工学技術によりペプチドを産生することによって生じることができる。アミノ酸
残基についての配列をコード化するポリヌクレオチドは当該分野で知られており
、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook
, Fritsch, and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に開示
されている。

【００２８】したがって、この発明のペプチドは、タンパク質化学の分野で一般的に知られ
ているタンパク質の単離/精製法によって精製することができる。さらに詳しく
は、例えば、抽出、再結晶化、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどでの脱塩
(salting out)、遠心分離、透析、限外ろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー
、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲルパーミエーションクロマトグラフ
ィー、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動、向流分配など及びこれらの
組合わせが挙げられる。生産されるこの発明のペプチドは、酸、例えば塩酸、メタンスルホン酸などで
加水分解することができ、そのアミノ酸組成は、公知の方法で調べることができ
る。これにより、この発明のペプチドが正しく製造されているかどうかを推測す
ることができる。

【００２９】より厳密には、生産されるペプチドのアミノ酸配列は、この発明のペプチドが
正しく製造されているかどうかを確認するため、公知のアミノ酸配列決定法(例
えば、エドマン分解技術等)によって決定される。この発明のペプチドには、その塩の形態が含まれる。後述するように、この発
明のペプチドは薬剤として特に有用であり、したがって、ペプチドの塩は好まし
くは医薬的に許容される塩である。この発明のペプチドは、酸の付加により塩を形成してもよい。酸の例には、無
機酸(例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸及び硫酸)又は有機カルボン酸(
例えば酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石
酸、及びサリチル酸)、酸性糖、例えばグルクロン酸、ガラクツロン酸、グルコ
ン酸、アスコルビン酸など、酸性多糖類、例えばヒアルロン酸、コンドロイチン
硫酸、アルギン酸、又は有機スルホン酸(例えばメタンスルホン酸、及び p-トル
エンスルホン酸)などが含まれる。これらの塩のうち、医薬的に許容される塩が
好ましい。

【００３０】この発明のペプチドは、塩基性物質との塩を形成してもよい。塩の例には、例
えばアルカリ金属塩(ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩など)、アルカリ土
類金属塩、アンモニウム塩などのような無機塩基との塩又はジエタノールアミン
塩、シクロヘキシルアミン塩などのような有機塩基との塩から選択される医薬的
に許容される塩が含まれる。この発明で用いられる医薬的に許容される担体は特に限定されず、医薬分野で
使用できる賦形剤、結合剤、滑剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張剤、保存剤、
麻酔剤などが含まれる。

【００３１】この発明の医薬は、治療目的による適当な投与方法によって適用でき、注射(
皮下、皮内、静脈内、腹腔内など)、滴眼、点滴、経皮投与、経口投与、吸入な
どから選択される。また、注射可能な製剤(溶液剤、懸濁剤、使用時に溶解される固体剤等)、錠剤
、カプセル剤、顆粒剤、粉剤、液剤、リポソーム封入体、軟膏、ゲル、外用粉剤
、噴霧剤、吸入粉剤、目薬、眼軟膏剤、坐薬、膣坐薬などのような投薬形態は、
投与方法によって適宜選択され、この発明のペプチドがしたがって製剤化できる
。製剤化は、一般に、Comprehensive Medicinal Chemistry, Volume 5, Hansch
ら編集、Pergamon Press 1990の25.2章に記載されている。

【００３２】この発明の医薬の用量は、投与目的(予防、維持(悪化の防止))、緩和(症状の
改善)又は治癒); 疾患の種類；患者の症状、性別及び年齢；投与方法などによっ
て個々に設定されるべきであり、特に限定されない。この発明のペプチドと特異的に反応する抗体も、この発明に含まれる。特異的
なペプチドフラグメントに対する抗体の製造方法は、当該分野で公知である。こ
のような各方法は、ここに参照して導入されるAntibodies, A Laboratory Manua
l, Harlow 及び Lane, Cold Spring Harbor Press, 1988に開示されている。この発明を一般的に記載することにより、例示目的のためにのみここに示され
、特に断らない限り、限定を意図しない詳細な実施例を参照して、さらなる理解
を得ることができる。

【００３３】実施例材料と方法細胞系 KDR-発現細胞(CHO-KDR)は、psV-7d 発現ベクター(Plouetら、1997)でグリコサ
ミノグリカン-欠損pgsA 745チャイニーズハムスター卵巣 (CHO)細胞(Esko, 1991
)をトランスフェクトして得た。CHO細胞とCHO-KDR細胞系は、10% (v/v) ウシ胎
児血清、50単位/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン及び2 mM L-グルタ
ミンを補足したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で通常どおり成長させた。ウ
シの肺動脈内皮細胞(CPAE)はDr. Binetruy (CNRS UPR 9079, Villejuif, France
)から親切に供せられ、20 % (v/v)ウシ胎児血清、50単位/mlペニシリン、50μg/
mlストレプトマイシン及び2 mM L-グルタミンを補足した最少イーグル培地(MEM)
で成長させた。ヒト臍帯動脈内皮細胞(HUAE)を、抗生物質と15% (v/v)ウシ胎児
血清を補足したEGM培地のゼラチン化-ディッシュに通常どおり成長させた。スト
ックのHUAE培養物を、その他の全ての日に1 ng/ml VEGFを加えて維持した。NIH3
T3線維芽細胞系は、抗生物質と10% (v/v)ウシ胎児血清を補足したMEM培地で通常
どおり成長させた。

【００３４】抗-VEGF抗体でのライブラリースクリーニング Ph.D.-7 キット標準法(New England Biolabs, Beverly, MA)から、バイオパニ
ングを適合させた。抗-ヒトVEGFモノクローナル抗体(V-4758, Sigma, St Louis
, MO)を用いて、マイクロタイタープレートを10μg/mlでコートした。pH 2.2の
酸性緩衝液中の結合ファージの非特異的溶出を用いて、3回選択を行った。選択
したクローンを分析するために、大腸菌(ER2537株)の一晩培養物を1:100に希釈
し、単一クローンで感染させ、37℃で振盪しながら5時間成長させ、ファージ粒
子を含む培養上清を収穫した。このファージストックを用いて、ELISA結合アッ
セイを行い、Ph.D.-7 キットのガイドラインに記載されるようにして配列をエン
コードするペプチドを決定した。

【００３５】 CHO-KDR細胞でのライブラリースクリーニング選択方法は、Wattersら(1997)から採用した。10¹¹個のファージ粒子を2x10⁶個
のCHO-KDR細胞とインキュベートして、バイオパニングを4回行った。最後に増幅
させた溶出液を、2x10⁶個の非-組換えCHO細胞に2回吸収させ、特異的にKDRを結
合するファージクローンを増やした。 DNA及びアミノ酸配列解析ペプチド配列は、GCGソフトウエアパッケージ(Wisconsin, USA)で分析した。'
Pileup'分析で行ったマルチ配列アラインメントを用いて、関連ペプチド群を決
定した。'Gap'分析を用いて、コンセンサスモチーフと VEGF一次配列間の最適ア
ラインメントを見出した。

【００３６】 CHO-KDR細胞へのファージ-ディスプレイ・ペプチドの結合についてのELISA 指数的に成長するCHO-KDR細胞を、7x10⁴細胞/ウェルの 96-ウェルマイクロタ
イタープレートに接種し、一晩37℃に置いた。細胞を室温で15分パラホルムアル
デヒド(PBS中4%)を用いて固定し、PBSで洗浄した。次いで、ウェルをPBS-グリシ
ン0.2%で満たし、室温で15分維持し、次いでPBSで洗浄した。ファージ粒子(10¹² 又は10¹³/ml)を各ウェルに加え、室温で2時間インキュベートした。ウェルをPBS
で洗浄し、結合ファージ量を、ペルオキシダーゼ-結合抗-M13ファージ血清(Phar
macia Biotech, Uppsala, Sweden)を用いて検出した。

【００３７】 CHO-KDR細胞への結合の競合アッセイ CHO-KDR細胞を、5x10⁵ 細胞/ウェルの密度で24-ウェルのプレートに接種した
。24時間後、やや融合しているプレートを4℃に移し、以降の全操作を4℃で行っ
た。細胞をPBSで2回洗浄し、結合緩衝液(20 mM Hepes, pH 7.4, 及び2 mg/ml ゼ
ラチンを補足したDMEM 培地)中の¹²⁵I-VEGF (30000 cpm, Amersham, Buckingham
shire, UK) とインキュベートした。種々の濃度の未ラベルのヒト組換えVEGF (P
harmingen, San Diego, CA)、ヘパリン(Sigma, St Louis, MO)、胎盤成長因子(P
lGF, R & D Systems, Minneapolis, MN)又はペプチド(Neosystem, Strasbourg,
France)を0.3mlの最終容量に加えた。3時間後、細胞を結合緩衝液で5回洗浄し、
0.5 M NaOHを加えて可溶化した。細胞に結合した放射活性量は、ガンマカウンタ
ー(LKB 1261 Multigamma)で計測した。レセプターの親和性と細胞当たりの結合
部位数は、スキャッチャード分析で測定した(Scatchard, 1986)。

【００３８】細胞増殖アッセイ抗-VEGF抗体中和作用を試験するために、CPAE細胞を、500 細胞/ウェルの密度
で96-ウェルの組織培養プレートにプレートした。24時間後、種々の濃度の抗-VE
GF抗体を加えた。細胞をさらに1日培養し、細胞増殖をBoerhinger (Indianapoli
s, IN)の細胞増殖ELISAキットを用いて測定した。細胞をBrdUと4時間37℃でイン
キュベートし、新たに合成されたDNAにおけるBrdUの導入を、製造者により記載
されているようなイムノアッセイにより定量した。ペプチドの作用を調べるため
に、CPAE細胞成長から24時間後、2.1x10^-4Mの合成ペプチドを培養培地に毎日加
えた。細胞増殖を、上記に記載されるように24時間、48時間又は72時間後に評価
した。2 ng /ml VEGF 又は100 ng/ml免疫精製KDR抗-イディオタイプ抗体(Ortega
ら、1997)を含み、種々の濃度のV1又はV5ペプチドを毎日補足した培地で、12ウ
ェルのプレートに5,000細胞/ウェルでHUAE細胞を接種した。細胞をトリプシン処
理し、Coulterカウンターを用いて5日後に計測した。

【００３９】ウサギの角膜ポケットアッセイペプチド30 nmolの存在下又は不在下、ウシ血清アルブミン25μgと2 pmol VEG
Fを含む2lのPBS中で、ヒドロゲルの放出遅延インプラント(2x1 mm)を再度水和し
た。これらのインプラントを、角膜縁から2mm離れたニュージーランドラビット(
Elevage du Trottis, Esperce, France)の角膜ストロマに挿入した (Favardら、
1991)。新血管新生を、第12日目に細隙灯で直接検査することにより評価し、4つ
のグレードのスケールで点数につけた(グレード1: 1mm長より短い新血管、グレ
ード2: 1 mm長の新血管、グレード3: 1〜2 mm長の新血管、グレード4: インプラ
ントを越える新血管)。平均及び標準偏差は、各条件について8個のインプラント
群について測定した。

【００４０】結果 CHO-KDR細胞は、VEGF結合KDRを発現する。 KDRを結合するペプチドを見出すために、まず、パニング技術を行うことがで
きるようなレセプターを探した。種々の条件でのVEGFへの結合能について、膜表
面で組換えKDRを発現するCHO細胞を試験した。図1Aは、CHO-KDR細胞におけるVEG
Fの解離定数が334 pMであることを示している。ヘパリンは、CHO-KDR細胞へのVE
GFの結合を増すことができ、最適濃度は1.8μg/ml である(図1B)。PlGFはCHO-KD
R細胞へのVEGF 結合を変えなかった(図1C)。ひとまとめにして考えると、これら
のデータは全て、組換えCHO 細胞によって発現されるKDRが、VEGF へ結合するた
めの内皮レセプターと同一の特性を示すことを示唆した。

【００４１】 KDRに特異的に結合するペプチドの同定このレセプターはVEGFを結合できるので、この相互作用を模倣でき、同一条件
でKDRを結合できるペプチドを見出すことにした。2x10⁹個の個々のクローンから
なるランダムな7-マーのライブラリーを、CHO-KDR細胞に結合させてスクリーン
した。選択の最後に、24個のクローンを単離し、分析した。DNAシーケンシング
により、7個の独立したペプチドが選択され(K1〜K7)、配列にホモロジーのない
ことが示された(表1)。それぞれに選択されたクローンのKDRへの結合は、CHO-KDR細胞でELISAにより
試験した。全てのクローンが、対照のバクテリオファージのものより著しく高い
ELISAシグナルを生じた (図2A)。しかし、ELISAシグナルは10¹³/mlより高いファ
ージ濃度についてのみ検出でき、選択されたペプチドが、低い親和性ではあるが
、特異的にKDRを結合できることを示唆した。

【００４２】

【表１】

【００４３】 VEGF-KDR相互作用を阻害する抗-VEGF抗体親和性の高いKDRを結合するペプチドを見出すために、代替的なストラテジを
用いてペプチドライブラリーをスクリーンすることに決定した。多くのモノクロ
ーナル抗体の抗原結合部位を模倣するペプチドは、ファージ-ディスプレイ・ラ
イブラリーから成功裏に単離されている(Feliciら、1995参照)。内皮細胞でその
生物活性を中和する抗-VEGF抗体を用いて我々のレパートリーをスクリーンする
ことにより、VEGF でKDR結合部位を模倣し、その結果、VEGF-KDR相互作用を阻害
するペプチドを同定することができる。まず、ヒト抗-VEGF抗体V-4758が内皮細
胞の増殖を阻害し得るかどうかを確認した。ウシ肺動脈内皮細胞(CPAE)は、VEGF
-依存性増殖のモデル細胞として用いた。図3に示すように、抗-VEGF抗体は、こ
れらの細胞で増殖について用量依存性の阻害活性を示し、細胞分裂の完全な停止
は、30μg/ml抗体の存在下で達成された。同一濃度で、この抗体は、NIH3T3 線
維芽細胞の成長に阻害作用を持たなかった(示さず)。これらの結果から、抗-VEG
F抗体は、 KDR結合部位でVEGFを結合することによってVEGF-KDR相互作用を阻害
できることが確認された。

【００４４】抗-VEGF抗体を特異的に結合するペプチドの同定ペプチドライブラリーは、次いで抗-VEGF 抗体への結合によりスクリーンした
。選択の最後に、24個のクローンを単離し、分析した。DNAシーケンシングによ
り、共通モチーフがない7個の独立したペプチドを選択し(V1〜V7)、但しLPPモチ
ーフはそのうちの2つ(V1 及びV6)で認められることが分かった(表1)。 CHO-KDR細胞でのKDRへの結合をELISAによって試験した際、選択したクローン
全てが強力なELISAシグナルを生じ、それらが細胞レセプターを結合できること
が確認された(図2B)。さらに、10倍未満のファージ濃度を用いて、KDR結合で選
択したペプチドより高い反応性が示された。これは、それらがレセプターに高い
親和性を有することを示唆している。興味深いことに、最善の反応性はV1 とV6
で認められた。

【００４５】選択したクローンのDNA配列解析は、共通のLPP/A モチーフを強調する。このKDRに対する増強された親和性の原因である残基を同定するために、選択
した配列全てについてマルチプルアラインメント解析を行った。表2は、下線を
付した残基に相当する3つの共通基が同定され得ることを示している。群Aは4ク
ローンからなり、チロシン残基が常に最初の位置で始まるモチーフYX(I/T)(M/P)
P (SEQ ID NO:15)で特徴付けられた。この群の2つのペプチドK1とV7は、特に疎
水性である3つの同一残基と強力な配列ホモロジーを共有した。群Bは、長いモチ
ーフHSSLQPRXL (SEQ ID NO:16)によって特徴付けられた。興味深いことに、異な
る選択ストラテジから得られた2つのクローンの2対、HSSXQ を含むK5とV4、PRXL
モチーフを有するK7とV2は、有意なホモロジーを示す。短い共通のLP(A/P)は、
群Cで認められた。興味深いことに、この群は、同様のモチーフLPAを有するK4ク
ローンで拡張された、モチーフLPPを示す2つのクローンを含んだ。ペプチド配列
を、VEGFの一次配列にも比較した(表2)。個々に選択したクローン又はVEGFとの
共通モチーフのアラインメントは、全く有意なホモロジーを生じず、選択したペ
プチドが不連続の結合部位を模倣していることを示唆している。

【００４６】

【表２】

【００４７】 V1は、KDRへのVEGFの結合を阻害する。選択したペプチドは全てKDRを結合できたので、レセプターとのVEGFの相互作
用を阻害できるかどうかを試験した。選択したクローンのアミノ酸配列ベースの
合成ペプチドを、合成した。次に、固定したペプチド濃度(2.1x10^-4M)を用いて
、CHO-KDR細胞への結合について、それらをVEGFと競合させて試験した。2つのペ
プチドのみ、V1及び、それより低い程度で、K4が、この濃度でのKDRへのVEGFの
結合に阻害作用を示した(図4)。図5は、VEGF自体(A)又はV1 (B)によるCHO-KDR
細胞へのVEGF結合の用量-依存性阻害を比較している。V1は、320 M 濃度でVEGF
結合をほとんど阻害できた。そのIC₅₀は、8x10^-5 Mと見積もられる。他方、同一
条件で試験されたV5は、VEGF結合を変えなかった。抗-VEGF 抗体を結合する他の
ペプチドは、この濃度でKDRへのVEGFの結合の阻害作用を全く示さなかった(デー
タ示さず)。

【００４８】 V1は、血管内皮細胞の増殖を特異的に阻害する。選択したペプチドはKDRへのVEGFの結合を阻害でき、内皮細胞増殖はVEGFに依
存しているので、内皮細胞の増殖がインビトロで阻害されるかどうかを試験した
。細胞成長について、2.1x10^-4Mの合成ペプチドを補足したCPAE細胞培養物を未
処理培養物と比較した(図6)。インキュベーションから24時間後、V1存在下のCPA
E細胞増殖は60%まで低下した。驚くべきことに、KDRへのVEGF結合に作用しないV
6ペプチドは、同様の作用を示した。また、他のペプチドは細胞分裂で阻害作用
を有したが、低い反応性を示した(約15 %)。全てのペプチドについて、細胞増殖
に対する阻害作用は、ペプチドを毎日補足することによって48時間及び72時間の
培養で同様のレベルに維持できた(データ示さず)。

【００４９】ヒト内皮細胞のVEGF-誘発増殖を阻害するV1の能力も調べた。図7Aに示すよう
に、V1は用量依存的にVEGFのマイトジェン活性を抑制したが、V5は阻害作用を有
しなかった。V1とKDRとの相互作用の特異性を調べるために、KDR抗-イディオタ
イプ抗体(AIA)を用いて同じ実験を繰り返した。AIAを生じたところ、インビトロ
で内皮細胞増殖を促進したので、KDRに選択的なアゴニストであることが分かっ
た(データ示さず)。図7Bは、V5と異なって、V1がAIA-依存性細胞増殖を抑制でき
ることを示しており、V1の作用がKDRとの直接的な相互作用によって媒介される
ことを示している。この作用が内皮細胞に特異的であるかどうかを調べるために、NIH 3T3線維芽
細胞の成長に対するV1の作用を試験した。V1ペプチドはこれらの細胞の増殖を変
えず、それがVEGF-依存性細胞成長のみを阻害することが確認された(図8)。

【００５０】 V1は、インビボで角膜の脈管形成を阻害する。ウサギの角膜ポケットアッセイを用いて、V1がインビボで脈管形成を阻害でき
るかどうかを決定した。ペプチドの存在下又は不在下のVEGF含有角膜インプラン
トにおける新血管新生を測定した(図9A及び9B)。賦形剤のみと比較すると、V1及
びV5は新しい血管生成を改善しなかった。VEGFは有意な脈管形成反応を誘発した
が、それはV5の添加で変化しなかった。この刺激作用はV1によって完全に破壊さ
れ、V1がVEGF-誘発性角膜脈管形成を阻害しうることを立証している。構造と活性の関係 A- アラニンによるアミノ酸の組織的置換(Ala scan)で得られるV1の類似体 ATWLPPR (V1) ペプチドの各アミノ酸を、以下の表3に示すようにL-アラニン残
基で置換した(AlaScan)。

【００５１】

【表３】表３：アラニンによる1つのアミノ酸の組織的置換で得られるペプチド構造

【００５２】 B- V1 類似体の効率研究: CHO-KDRトランスフェクト細胞への¹²⁵I-VEGF165の結合に対するL-アラニン残
基による各アミノ酸の置換(AlaScan)の効果は、ATWLPPRペプチド類似体の濃度を
増す置換実験で¹²⁵I-VEGF165の結合を測定して調べ、曲線の適合性を使用して分
析した(図10)。分子は、活性を完全に破壊されたAla7-置換類似体(A7)を除いて
、アラニン置換(A2〜A6)に比較的耐性であった(表4)。

【００５３】

【表４】表4 : CHO-KDR トランスフェクト細胞へのVEGFの結合に対するL-アラニン残基で
の各アミノ酸置換(AlaScan)の作用(CI₅₀)

【００５４】 C- C-末端アルギニンの特異性 : C-末端アルギニン残基の特異性を決定するために、リジンによるその置換(A9)
及びこの残基の抑制(A10)(表5)を研究した。

【００５５】

【表５】表5: C-末端アルギニンの機能研究に用いたペプチドの構造

【００５６】ペプチド類似体A10によるCHO-KDR トランスフェクト細胞への¹²⁵I-VEGF 165の
結合についての置換曲線は、C-末端領域のアルギニン残基欠損が著しくペプチド
の効力を低下させることを示した。リジンによるアルギニンの置換(A9)はペプチ
ドの効力を減じ、このアルギニン残基の作用がその正の電気電荷のみに起因して
いないことを示した(図11)。 D- C-末端アルギニン残基の上流に位置する6 アミノ酸のアラニン置換 C-末端アルギニン残基の上流の6 アミノ酸の置換は、10の係数(factor)でV1ペ
プチド阻害効力を破壊した(図12)。上記の結果は、V1の阻害効力が、脂肪族又は芳香族の中性アミノ酸(プロリン
含む)で先行されるC-末端の塩基性アミノ酸(ArgはLysよりかなり有力である)の
存在に関連していることを立証している。

【００５７】作用機序 A- 内皮細胞増殖に対するV1の阻害作用一次培養でのヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC) に対するV1の阻害作用。VEGF-誘発
性HUVEC増殖は、非競合的にV1で阻害された(図13)。 B- 組換えヒトVEGFR2/Fcキメラへの¹²⁵I VEGF165の結合についてのV1の作用 V1は、VEGF R2 (KDR)/Fc キメラへのVEGF結合を阻害できなかった(図14)。 C トランスフェクトCHO細胞で発現されるVEGF-R2への¹²⁵I VEGFの結合に対する
V1の阻害作用特性: V1は、トランスフェクトCHO細胞で発現されるVR2への¹²⁵I VEGF165の結合を阻
害した。スキャッチャード結合分析から、高親和性の特異的レセプターの存在が
示された。この親和性は、V1の存在下で低下する(図15 A 及びB)。

【００５８】 D HUV-EC細胞でのVEGF-R2への¹²⁵I VEGF 165の結合に対するV1の阻害作用特性 HUV-ECへの¹²⁵I-VEGF 165の結合の置換曲線分析のため、生理食塩水又はV1ペ
プチドの存在下で、細胞を、濃度を増したVEGFとインキュベートした。放射性リ
ガンドレセプター結合のスキャッチャード分析から、Kd 117 及び 2300 pMで、H
UV-EC細胞系表面における¹²⁵I VEGF165に対する特異的レセプターの存在が示さ
れた。V1は、高親和性レセプターへのVEGFの結合のみを阻害した(図16 A、B 及
び C参照)。 E VEGF-R2トランスフェクトCHO細胞への¹²⁵I VEGF 165 の結合に対するV1とヘ
パリンの相互作用: トランスフェクトCHO細胞へのVEGF 165の結合は、10〜1000 ng/mlの濃度範囲
でヘパリン-依存的に作動する(agonize)。V1は、このヘパリンの反発作用を阻害
した (図17参照)。

【００５９】 F MDA-MB 231 細胞への¹²⁵I VEGF165の結合に対するV1の阻害作用: 胸部腫瘍細胞系MDA-MB 131はVEGF-R2レセプターを持たないが、ニューロピリ
ン(neuropilin) 1 (NP1)を発現する。¹²⁵I VEGF 165のこの細胞への結合は、V1
ペプチドで阻害された(CI₅₀ = 38 μg/ml) (図18)。 G HUV-ECへの¹²⁵I VEGF165の架橋結合に対するV1ペプチドの作用 HUV-EC細胞への¹²⁵I VEGF165の架橋結合は、2つのラベル¹²⁵I-VEGF-レセプタ
ー複合体を示した。240-260 kDaの複合体はVEGF-R2-2EGF165複合体に相当し、16
0-170 kDaの複合体はNP1-VEGF 165複合体に相当する。2つの複合体のラベリング
は、V1ペプチドの存在を低下させた(図19)。上記の結果は、V1作用の機序が、VEGF-R2の結合リガンドドメインからのVEGF1
65の置換のみならず、NP1及びヘパリラン硫酸プロテオグリカンを含むコ-レセプ
ター(co-receptor)との潜在的な相互作用を伴うことを立証している。

【００６０】以前の研究は、抗脈管形成治療が、癌治療に将来有望な方法であることを立証
している(Folkman, 1995)。充実腫瘍成長及び腫瘍転移は、腫瘍の血管新生に依
存している。さらに、種々の充実性腫瘍患者の臨床試験から、腫瘍管の密度と副
次的な予後とに直接的な関係が示されている(Weidnerら、1991; Alboら、1994)
。 VEGFとそのシグナル変換チロシンキナーゼレセプターVEGFR-2 (KDR/flk-1)は
、腫瘍-誘発性脈管形成の主要媒介物である(Termanら、1992; Ferrara, 1993)。
また、VEGFは、脈管形成中に内皮細胞特異的なマイトジェンとして作用するので
、他の成長因子とは異なる(Plouetら、1989; Leungら、1989; Ferrara, 1993)。
以前の研究は、抗体を用いて VEGF-VEGFレセプター経路を阻害することにより、
マウス及びヒトで腫瘍が退行することを示している(Kimら、1993; Chengら、199
6)。ここで、ファージ-ディスプレイ・ペプチドライブラリーの使用による、VE
GFのペプチドアンタゴニストの同定を報告する。

【００６１】主としてクローン結合非特異的決定因子の除去が難しいので、細胞レセプター
でのペプチドライブラリーの直接スクリーニングの例はごく限られている。細胞
-ディスプレイuPAR (ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化レセプター)を結合す
るペプチドを選択するために、Goodson らは、組換えSf9昆虫細胞又はCOS-7細胞
を用いてバイオパニングを何度も行った(1994)。この研究では、選択方法の最後
に、非組換え細胞に対するネガティブな選択を2回行った。これにより、非特異
的クローンが効率的に除かれた。というのは、単離されたファージクローンは全
てELISで特異的にKDRを結合できるためである。

【００６２】別の可能性のある方法は、レセプターとリガンドとの相互作用を阻害する抗体
を用いてペプチドライブラリーをスクリーンすることである。これは、リガンド
における抗体結合部位がレセプターと相互作用する残基を含むことを仮定してい
る。レセプターへの結合を阻害する抗塩基性線維芽細胞因子(bFGF)抗体を用いて
、Yayonら(1993)は、血管内皮細胞のbFGF-誘発性増殖を阻害しうるペプチドを成
功裏に単離した。しかし、bFGFの治療標的としての使用は、それが広範囲の細胞
種スペクトルで作用すること、及び内皮細胞によるそのレセプターのインビボ発
現は議論されているとの事実で制限される。逆に、VEGFは、レセプターが血管内
皮細胞でほとんど排他的に発現され、そのために治療上の関心が大きい、分泌内
皮細胞-特異的なマイトジェンである(Millauerら、1993; Petersら、1993)。VEG
Fアンタゴニストを単離するために、バクテリオファージM13でディスプレイされ
る7-マーのランダムなペプチドライブラリーを用い、一方はKDRへの結合に基づ
いて、他方は抗-VEGF阻害抗体への結合に基づいて2回選択を行った。これにより
、2つのストラテジにより選択された配列を比較でき、アンタゴニスト活性の原
因となる残基を同定できた。

【００６３】 KDRへの結合についてのライブラリースクリーニングを、膜表面で組換えレセ
プターを発現するCHO細胞で行ったところ、この分子が天然のレセプターと同様
にVEGFを結合できることが立証された。実際、組換えレセプターの親和性は、内
皮細胞で測定される定数に匹敵していた(Termanら、1992; Klasgsbrun 及び D'A
more, 1996)。また、ヘパリンは、CHO-KDR細胞への VEGF 結合を増すことができ
た。この現象は、VEGF の結合を改善する低濃度ヘパリンと阻害作用を持つ高濃
度の2つのモードがあり(bimodal)、天然のKDRへのVEGFの結合に対しヘパリンの
作用を再現する(Gitay-Gorenら、1992, 1993)。以前の研究によれば、PlGFはKDR
発現細胞へのVEGF結合を変えなかった(Termanら、1994)。KDR結合について選択
したペプチドの反応性は比較的低く、そのうちの1つだけが10^-4 Mの濃度範囲でK
DR結合に対しVEGFと競合できた。さらに、インビトロでの内皮細胞の成長抑制で
有効なものはなく、選択したペプチドがVEGF結合部位から離れた領域でKDRを結
合し、そのためにVEGF-KDR相互作用にあまり干渉していないことが示唆された。

【００６４】抗体結合のためのライブラリースクリーニングはVEGF-KDR相互作用のペプチド
アンタゴニストを単離するのに間接的な方法であったが、それにもかかわらず、
最も有力なペプチドを同定した。V1ペプチド(ATWLPPR)は、ELISAでの最も高い反
応性と内皮細胞成長での最も高い阻害作用を示した。重要なことに、V1は、非内
皮細胞の成長に影響せずにヒト内皮細胞のVEGF-誘導性増殖を阻害し、ウサギの
角膜モデルでインビボでのVEGF-誘導性脈管形成を阻害することができた。これ
は、V1の作用がKDRへの直接結合で媒介されていることを示唆している、最近、S
oker ら(1998)は、内皮細胞と腫瘍細胞で発現されるVEGFの新しいレセプターを
同定した。このレセプターは、神経細胞ガイダンスを媒介するコラプシン/セマフ
ォリン(semaphorin)ファミリーのレセプターであるヒトNRP-1と同一である。細
胞においてKDRと同時発現される際、NRP-1はKDRへのVEGFの結合を増した。逆に
、NRP-1へのVEGFの結合阻害は、KDRへのその結合及び内皮細胞に対するその後の
マイトジェン活性を阻害した。実際、NRP-1は、KDRによって媒介されるVEGF-誘
発性活性を増すコ-レセプターとして作用し得る。V1がKDRと特異的に反応するか
どうかを調べるために、KDR抗-イディオタイプ抗体との競合でKDRに対するV1の
結合を試験した。V1が、これらの抗体で誘発される内皮細胞の増殖を阻害できる
ことが認められ、その阻害作用はKDRとの特異的な相互作用に起因していること
が分かった。

【００６５】興味深いことに、V1と共通のLPPモチーフを共有するV6は、内皮細胞の増殖を
著しく阻害したが、KDRへのVEGFの結合に影響しなかった。逆に、K4ペプチドはL
PAモチーフを含み、KDRへのVEGFの結合を部分的に阻害できるが、内皮の成長に
あまり影響しなかった。これは、反応性の欠如はプロリンの代わりにアラニン残
基が存在することに起因し、LPPモチーフがペプチドのアンタゴニスト活性に必
須であることを示唆している。 VEGFの一次配列との個々の選択クローンのアラインメントは、全くホモロジー
を生じなかった。特に、LPPモチーフは認められなかった。これは、VEGFに対す
るKDR結合部位が不連続であること、及び選択ペプチドはVEGFの一次配列に離れ
て残基を含み得るが、フォールド分子では極めて近接していることを示唆してい
る。これは、最近解析されたVEGFの結晶構造と一致している(Mullerら、1997)。
突然変異分析から、KDR結合に関わる2つの残基スポットがVEGFモノマーの各プー
ルに局在し、ダイマーで機能的な結合部位を構成し得ることが明らかになった (
Mullerら、1997)。現在は、選択モチーフに相当する残基がVEGFダイマー表面で
、及びフォールド分子で極めて近接して接触できるかどうかが調べられている。

【００６６】脈管形成は、種々のヒトの疾患に関与している。VEGF/KDR相互作用は、癌のみ
ならず、糖尿病性網膜症(Pierceら、1995)、乾癬(Detmarら、1994)、血管腫(Wi
zigmann-Voosら、1995)及びAIDS患者でのカポジ肉腫(Albiniら、1996)でも役割
を果たしていることが分かっている。したがって、VEGFアンタゴニストの同定は
、種々のヒトの疾患の治療に有効に適用し得る。さらに治療上の用途の場合、小
さなサイズは有機分子への移行に修正しやすいので、小分子が好ましい。ペプチ
ドにより、経口投与可能な安価な薬剤の設計用のリード分子が提供される。我々の結果は、ATWLPPRペプチドがVEGFの有効なアンタゴニストで、脈管形成の
阻害剤であることを立証している。このペプチドは、腫瘍の脈管形成の有効な阻
害剤であり、脈管形成が関わる疾患で全体的に興味深い。これに関連して、この
ペプチドを用いるインビボの抗-腫瘍化学療法アッセイを調べる必要がある。

【００６７】この明細書で、この発明は、脈管形成阻害及び/又は癌、糖尿病性網膜症、乾
癬、血管腫及びカポジ肉腫からなる群から選択される疾患の治療で用いられるA
TWLPPRペプチドにも関連している。明らかに、上記内容に照らせば、この発明についての多くの変更及び変化が可
能である。したがって、添付した請求の範囲内で、この発明がここに具体的に記
載される以外に実践されることが理解される。

【００６８】参考文献・ Albini, A., Soldi, R., Giunciuglio, D., Benelli, R., Primo, L., N
oonan, D., Salio, M., Camussi, G., Rockl, W. 及びBussolino, F. (1996) Th
e angiogenesis induced by HIV-1 tat protein is mediated by the Flk-1/KDR
on endothelial cells. Nat. Med., 2, 1371-1375. ・ Albo, D., Granick, M.S., Jhala, N., Atkinson, B.及び Solomon, M.P
. (1994) The relationship of angiogenesis biological activity in human s
quamous cell carcinomas of the head and neck. Ann. Plastic Surg., 32, 58
8-594. ・ Ausprunk, D.H. 及び Folkman, J. (1977) Migration and proliferatio
n of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels durin
g angiogenesis. Microvasc. Res., 14, 53-65. ・ Boehm, T., Fokman, J., Browder, T. 及び O'Reilly, M.S. (1997) Ant
iangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug
resistance. Nature, 390, 404-407. ・ Bouck, N., Stellmach, V. 及び Hsu, S.C. (1996) How tumors become
angiogenic. Adv. in Cancer Res., 69, 135-174. ・ Cheng, S.Y., Huang, H.J.S., Nagane, M., Ji, X.D., Wang, D., Shih,
C.C.Y, Arap, W., Huang, C.M. 及び Cavenee, W. K. (1996) Suppression of
glioblastoma angiogenicity and tumorigenicity by inhibition of endogenou
s expression of vascular endothelial growth factor. Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 93, 8502-8507. ・ Cliff, W. J. (1963) Observations on healing tissues: a combined l
ight and electron microscopic investigation. Philosophical Transactions
of the Royal Society, 246, 305-325. ・ Cortese, R., Monaci, P., Luzzago, A., Santini, C., Bartoli, F., C
ortese, I., Fortugno, P., Galfre, G., Nicosia, A., 及び Felici, F. (1996
) Selection of biologically active peptides by phage display of random p
eptides libraries. Curr. Opin. Biotechnol., 7, 616-621. ・ Cwirla, S.E., Peters, E.A., Barrett, R.W.及び Dower, W.J.(1990) P
eptides of phage: a vast library of peptides for identifying ligands. Pr
oc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 6378-6382. ・ Detmar, M., Brown, L.F., Claffey, K.P., Yeo, K. T., Kocher, O., J
ackman, R.W., Berse, B. 及び Dvorak, H.F. (1994) Overexpression of vascu
lar permeability factor/vascular endothelial growth factor and its recep
tor in psoriasis. J. Exp. Med. , 180, 1141-1146. ・ De Vries, C., Escobedo, J.A., Ueno, H., Houck, K., Ferrara, N. 及
び Williams, L.T. (1992) The fms-like tyrosine kinase, a receptor for va
scular endothelial growth factor. Science, 255, 989-991. ・ Esko, J.D. (1991) Genetic analysis of proteoglycan structure, fun
ction and metabolism. Curr. Opin. Cell Biol., 3, 805-816. ・ Favard, C., Moukadiri, H., Dorey, C., Praloran, V. 及び Plouet, J
. (1991) Purification and biological properties of vasculotropin, a new
angiogenic cytokine. Biol. Cell. , 73, 1-6. ・ Felici, F., Luzzago, A., Monaci, P., Nicosia, A., Sollazo, M. 及
び Traboni, C. (1995) Peptide and protein display on the surface of fila
mentous bacteriophage. In Raafat El-Gewely, M. (編集), Biotechnology Ann
ual Review. Amsterdam, The Nederlands: Elsevier, pp.149-183. ・ Ferrara, N. 及び Henzel, W.J. (1989) Pituitary follicular cells s
ecrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endot
helial cells . Biochem. Biophys. Res. Commun., 161, 851-858. ・ Ferrara, N. (1993) Vascular endothelial growth factor. Trends Car
diovasc. Med., 3, 244-250. ・ Ferrara, N. 及び Davis-Smyth T. (1997) The biology of vascular en
dothelial growth factor. Endocrine Rev., 18, 4-25. ・ Ferrara, N. (1999) Molecular and biological properties of vascula
r endothelial growth factor. J. Mol. Med., 77, 527-543. ・ Folkman, J. (1995) Angiogenesis in cancer, vascular rheumatoid an
d other diseases. Nat. Med., 1, 27-30. ・ Folkman, J.(1995) Clinical applications of research on angiogenes
is. N. Engl. J. Med., 333, 1757-1763. ・ Gita-Goren, H., Soker, S., Vlodavsky, I. 及び Neufeld, G. (1992)
The binding of vascular endothelial growth factor to its receptor is dep
endent on cell surface-associated heparin-like molecules. J. Biol. Chem.
, 267, 6093-6098. ・ Gita-Goren, H., Halaban, R. 及び Neufeld, G. (1993) Human melanom
a cells but not normal melanocytes express vascular endothelial growth f
actor receptors. Biochem. Biophys. Res. Commun., 190, 702-709. ・ Goodson, R.J., Doyle, M.V., Kaufman, S.E. 及びRosenberg, S. (1994
) High-affinity urokinase receptor antagonists identified with bacteriop
hage peptide display. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7129-7133. ・ Hanahan, D. 及び Folkman, J. (1996) Patterns and emerging mechani
sms of the angiogenic switch during tumorigenesis cell. Cell, 86, 353-36
4. ・ Hoess, R.H. (1993) Phage display of peptide and protein domains.
Curr. Opin. Stuct. Biol., 3, 572-579. ・ Houck K., Ferrara N , Winer J. , Cachianes, G., Li, B. 及び Leung
D.W (1991) The vascular endothelial growth factor family: identificatio
n of a fourth molecular species and characterization of alternative spli
cing of RNA. Molecular Endocrinol., 5, 1806-1814. ・ Houck K., Leung D.W., Rowland A. M., Winer J. 及び Ferrara N. (19
92) Dual regulation of vascular endothelial growth factor biovailability
by genetic and proteolytic mechanisms. J. Biol. Chem., 267, 26031-26036
. ・ Kerbel R.S. (1991) Inhibition of tumor angiogenesis as a strategy to circumvent acquired resistance to anti-cancer therapeutic agents. Bi
oassays, 13, 31-36. ・ Kim, K.J., Li, B., Winer, J., Armanini, M., Gillett N., Philips,
H.S. 及びFerrara, N. (1993) Inhibition of vascular endothelial growth fa
ctor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nature, 362,
841-844. ・ Klagsbrun, M. 及び D'Amore, P.A. (1996) Vascular endothelial grow
th factor and its receptors. Cytokine Growth Factor Rev., 7, 259-270. ・ Koivunen, E., Gay, D.A. 及び Ruoslahti, E. (1993) Selection of pe
ptides binding to the 5 1 integrin from phage display library. J. Biol.
Chem., 268, 20205-20210. ・ Leung, D.L., Cachianes, G., Kuang, W.6J., Goeddel, D.V. anf Ferra
ra, N. (1989) Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogeni
c mitogen. Science, 246, 1306-1309. ・ Matthews, W., Jordan, C.T., Gavin, M., Jenkins, N.A., Copeland, N
.G. 及び Lemischka, I.R. (1991) A receptor tyrosine kinase, cDNA isolate
d from a population of enriched primitive hematopoietic cells and exhibi
ting close genetic linkase to c-kit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 902
6-9030. ・ Millauer, B., Wizigmann-Voos, S., Schnurch, H., Martinez, R., Mol
ler, N.P.H., Risau, W. 及び Ullrich, A. (1993) High affinity VEGF bindin
g and developmental expression suggest Flk-1 as a major regulator of vas
culogenesis and angiogenesis. Cell, 72, 835-846. ・ Muller, Y.A., Christinger, H.W., Bruce, A.K. 及び De Vos, A.M. (1
997) The crystal structure of vascular endothelial growth factor (VEGF)
refined to 1.93 A resolution: multiple copy flexibility and receptor bin
ding. Stucture, 5, 1325-1338. ・ Muller, Y.A., Li, B., Christinger, H.W., Wells, J.A., Cunningham,
B.C. 及び De Vos, A.M. (1996) Vascular endothelial growth factor: cryst
al structure and functional mapping of the kinase domain receptor bindin
g site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7192-7197. ・ Myoken, Y., Kayada, Y., Okamoto, T., Kan, M., Sato, G.H. 及び Sat
o, J.D. (1991) Vascular endothelial cell growth factor (VEGF) produced b
y A-431 human eperdimoid carcinoma cells and identification of VEGF memb
rane binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 5819-5823. ・ O'Neil, K.T., Hoess, R.H., Jackson, S.A., Ramachandran, N.S., Mou
sa, S.A. 及びDegrado W.F. (1992) Identification of novel peptide antagon
ists for gpIIB/IIIa from a conformationnnaly constrained phage peptide l
ibrary. Proteins, 14, 509-515. ・ Ortega N., Jonca F., Vincent S., Favard C., Malavaud B., Ruchoux
M-M, Plouet J. (1997) Systemic activation of the vascular endothelial gr
owth factor receptor flk-1 selectively triggers angiogenic endothelial c
ells. Am. J. Pathol., 151, 1215-1224. ・ Peters, K.G., De Vries, C. 及び Williams, L.T. (1993) Vascular en
dothelial growth factor receptor expression during embryogenesis and tis
sue repair suggests a role in endothelial differentiation and blood vess
el growth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8915-8919. ・ Pierce, E.A., Avery, R.L., Foley, E.D., Aiello, L.P. 及びSmith, L
.R.H. (1995) Vascular endothelial growth factor/vascular permeability fa
ctor expression in a mouse model of retinal neovascularization. Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 92, 905-909. ・ Plouet, J., Schilling, J. 及び Gospodarowicz, D. (1989) Isolation
and characterization of newly identified endothelial cell mitogen produ
ced by AtT-20 cells. EMBO J., 8, 3801-3806. ・ Plouet, J., Moro, F., Bertagnolli, S., Coldeboeuf, N., Mazarguil,
H., Clamens, S. 及びBayard, F. (1997) Extracellular cleavage of the vas
cular endothelial growth factor 189-amino acid form by urokinase is requ
ired for its mitogenic effect. J. Biol. Chem., 272, 13390-13396. ・ Scatchard, G. (1986) The attraction of proteins for small molecul
es and ions. Ann. NY Acad. Sci., 261, 4660-4662. ・ Schoefl, G.I. (1963) Studies on inflammation. III. Growing capill
aries: their structure and permeability. Virchows Arch. Pathol. Anat., 3
37, 97-141. ・ Smith, G.P. (1985) Filamentous fusion phage: novel expression vec
tors that display cloned antigens on the virion surface. Science, 228, 1
315-1317. ・ Soker, S., Takashima, S., Miao, H.Q., Neufeld, G. 及びKlagsbrun,
M. (1998) Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an
isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor. Cell,
92, 735-745. ・ Terman, B.I., Carrion, M.E., Kovacs, E., Rasmussen, B.A., Eddy, R
.L. 及びShows, T.B. (1991) Identification of a new endothelial growth fa
ctor receptor tyrosine kinase. Oncogene, 6, 1677-1683. ・ Terman, B., Dougher-Vermazen, M., Carrion, M., Dimitrov, D., Arme
llino, D., Gospodarowicz, D., 及びBohlen, P. (1992) Identification on th
e KDR tyrosine kinase as a receptor for vascular endothelial growth fact
or Biochem. Biophys. Res. Commun., 187, 1579-1586. ・ Terman, B.I., Khandke, L., Dougher-Vermazan, M., Maglione, D., La
ssam, N.J., Gospodarowicz, D., Persico, M.G., Bohlen, P. 及び Eisenger M
. (1994) VEGF receptor subtypes KDR and FLT1 show different sensitivitie
s to heparin and placenta growth factor. Growth factor, 11, 187-195. ・ Tisher, E., Mitchell, R., Hartman, T., Silva, M., Gospodarowicz,
D., Fiddes, J.C. 及びAbraham, J.A. (1991) The human gene for vascular en
dothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alte
rnative exon splicing. J. Biol. Chem., 266, 11947-11954. ・ Thorpe, P.E 及び Burrows, F.J. (1995) Antibody-directed targeting
of the vasculature of solid tumors. Breast Cancer Research and Treatmen
ts, 36, 237-251. ・ Waltenberger, J., Claesson-Welsh, L., Siegbahn, M. 及び Heldin, C
.H. (1994) Different signal transduction properties of KDR and FLT-1, tw
o receptors for vascular endothelial growth factor. J. Biol. Chem., 269,
26988-26995. ・ Watters, J.M., Telleman, P. 及び Junghans R.P. (1997) An optimize
d method for cell-based phage displayed panning. Immunotechnol., 3, 21-2
9. ・ Weidner, N., Semple, J.P., Welch, W.R. 及び Folkman, J. (1991) Tu
mor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma
. N. Engl. J. Med., 324, 1-8. ・ Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W. 及び Plate, K.H. (1995)
Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptor in
von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Ca
ncer Res., 55, 1358-1364. ・ Yayon, A., Aviezer, D., Safran, M., Gross, J.L., Heldman, Y., Cab
illy, S., Givol, D. 及び Katchalski-Katzir, E. (1993) Isolation of pepti
des that inhibit binding of basic fibroblast growth factor to its recept
or from a random phage-epitope library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10643-10647. ・ Young, R.C. (1989) Drug resistance: the clinical problem. Cancer
treat. Res., 48, 1-12.

【図面の簡単な説明】

【図１】 CHO-KDR細胞は、機能的KDRを発現する。(A) VEGF 結合のスキャッチャード分
析。遊離のVEGF分子に対する結合割合(B/F)を、結合VEGF濃度に対してプロット
した。(B) ヘパリンの作用。CHO-KDR細胞へのVEGFの結合は、種々の量のヘパリ
ンの存在下で測定した。(C) PlGFの作用。CHO-KDR細胞へのVEGF(100 ng/ml)の結
合を、ヘパリン(1.8 μg/ml)の不在下(白いバー)又は存在下(黒いバー)で試験し
、PlGF (50 ng/ml) 又はPBS (対照)に比較した。データは、同じ3つのサンプル
の平均及び標準偏差に相当する。全結合実験を2回行い、同様の結果を得た。

【図２】選択したファージ-ディスプレイ・ペプチドは、ELISAで特異的にKDRに結合す
る。KDR結合(10¹³ pfu/ml) (A) 又は抗-VEGF抗体結合 (10¹²pfu/ml) (B) によ
って選択したクローンを、M13ファージ粒子(対照)と比較した。結果は、3つの個
々のアッセイを示す。

【図３】抗-VEGF抗体は、CPAE細胞成長を阻害する。CPAE細胞成長は、種々の濃度の抗-
VEGF 抗体を補った培地で測定し、非処理培養物と比較した。データは、同じ3つ
のサンプルの増殖阻害についての平均と標準偏差を示し、2つの個々の実験を示
している。

【図４】合成ペプチドは、KDR結合についてVEGFと競合する。KDR結合(A)又は抗-VEGF結
合(B)で選択したペプチドを、ヘパリン(1.8 μg/ml)の存在下、2,1x10^-4 M濃度
のCHO-KDR細胞への結合についてVEGFとの競合で試験した。データは、同じ3つの
サンプルの平均と標準偏差を示す。同様の結果は、3つの個々の実験で得た。

【図５】 V1は、KDRへのVEGFの結合を破壊することができる。種々の濃度のVEGF (A)又
はV1ペプチド(B)を、CHO-KDR細胞への結合について放射活性ラベルしたVEGFとの
競合で試験した。非阻害対象として、V5を同一条件で試験した。データは、同じ
3つのサンプルの平均と標準偏差を示す。同様の結果は、2つの異なる実験で得た
。

【図６】 V1は、CPAE細胞増殖を阻害する。CPAE細胞成長は、抗体結合(A)又はKDR結合(B
)によって選択した合成ペプチドの存在下で24時間培養後に測定し、非処理培養
物と比較した。データは、同じ3つのサンプルの増殖阻害についての平均と標準
偏差を示し、3つの個々の実験を示している。

【図７】 V1は、用量依存的にVEGF 又はAIAで誘発されるヒト内皮細胞の増殖を阻害する
。HUAE細胞培養物を、VEGF (A) 又は抗-イディオタイプ抗体(B)の存在下で成長
させ、種々の濃度のV1又はV5を毎日追加した。細胞を5日後に計測した。データ
は、同じ3つのサンプルの増殖阻害割合の平均である。

【図８】 V1は、内皮細胞で特異的に作用する。CPAEとNIH 3T3 線維芽細胞を、V1ペプチ
ドを用いて、又は用いないで培養し、細胞増殖変化を24時間後に測定した。デー
タは、同じ3つのサンプルの増殖阻害割合の平均と標準偏差を示す。同様の結果
は、2つの個々の実験で得た。

【図９】 V1は、インビボで角膜脈管形成を阻害する。VEGF 存在又は不在下の、V1、V5
又はPBS (賦形剤)を含むインプラントにおける新血管形成を、ウサギの角膜ポケ
ットに挿入してから12日後に評価した: A) 各インプラント群の代表図、B)8イン
プラント群について測定した脈管形成スコアの平均及び標準誤差。

【図１０】 V1誘導体によるCHO-KDRトランスフェクト細胞への¹²⁵I-VEGF 165の結合の置換
曲線。実験は、最終濃度7 pM の¹²⁵I-VEGF (Amersham Fr)と+4℃で3時間のあい
だ細胞(500,000細胞/ウェル)をインキュベートし、ヘパリン存在下(1μg/ml)で
最終用量0.3ml中の種々のペプチド類似体濃度(0〜500μg/ml)を増して行った。
特異的結合は、最終濃度3 nMでVEGF 165 (R&D system UK)の存在下で生じなかっ
た。

【図１１】ペプチドV1、A9、A10及びA7によるCHO-KDRトランスフェクト細胞への¹²⁵I-VEG
F165の結合の置換曲線の比較。実験条件は、図10の凡例に示す。

【図１２】アラニンによるアルギニンへの上流の6アミノ酸の置換で得られるペプチドA11
によるCHO-KDRトランスフェクト細胞への¹²⁵I-VEGF165の結合の置換曲線。実験
条件は、図10の凡例に示す。

【図１３】 V1 (400 μg/ml) VEGF165誘発性HUVEC増殖の作用。種々の濃度のVEGF165を96
時間のあいだ加えた。

【図１４】 VEGF R2 (KDR)/Fc キメラ(R&D UK)への¹²⁵I VEGF 165の結合に対するV1の作用
。ジスルフィド結合ホモダイマータンパク質を、イムロン(Immulon)ポリスチレ
ンウェル(Dynatech VA)の表面に固定化した。VEGFを+4℃で一晩インキュベート
した。3回洗浄後、結合した放射活性を測定した。

【図１５】 A及びB (A) 生理食塩水(白抜きの円)又は50 μg/ml V1 (黒塗りの円)いずれか
の存在下における、濃度を増加させたVEGF165 によるCHO-KDRトランスフェクト
細胞への¹²⁵I-VEGF 165の結合の置換曲線。(B) スキャッチャード図。実験条件
を図10の凡例に示す。

【図１６】 A 及び B (A 及び B) 対照のHUV-EC細胞に対する¹²⁵I-VEGF 165のスキャッチ
ャード図。(C) V1 40 μg/ml存在下のHUV-EC細胞に対する¹²⁵I-VEGF 165のスキ
ャッチャード図。実験条件は、図10の凡例に示す。

【図１７】生理食塩水(白抜きの円)又は最終濃度50μg/mlのV1ペプチド(黒塗りの円)いず
れかの存在下におけるトランスフェクトCHO細胞に対する¹²⁵I-VEGF 165の結合に
ついてのヘパリン作用。実験条件は、図10の凡例に示す。

【図１８】 V1の濃度を増すことによるMDA MB 細胞への¹²⁵I-VEGF 165の結合の置換曲線。実
験条件は、図10の凡例に示す。

【図１９】 HUV-EC細胞に対する¹²⁵I VEGF165 (160pM)の架橋結合。 1: 全結合、2: 非特
異的結合(VEGF 4,5 nM)、3: V1、(2,4 x 10^-4M)、4: V1、(4,8 x 10^-4M)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 27/02 Ｃ０７Ｋ 7/06 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 ＺＣＣＣ０７Ｋ 7/06 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 ＺＣＣ 1/21 1/19 15/00 ＺＮＡＡ 1/21 5/00 Ａ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シアンティフィク−シーエヌアールエスＣＥＮＴＲＥＮＡＴＩＯＮＡＬＤＥＬＡＲＥＣＨＥＲＣＨＥＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ−ＣＮＲＳフランス国 75794 パリ・セデックス 16リュ・ミシェル・アンジュ３ (71)出願人ユニヴェルシテパリ 13 ノールＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＰＡＲＩＳ 13 ＮＯＲＤフランス、エフ−93430 ヴィルタヌーズ、アヴェニュジャン−バプティストクレマン、99 99，ａｖｅｎｕｅＪｅａｎ−ＢａｐｔｉｓｔｅＣｌｅｍｅｎｔ，Ｆ−93430 Ｖｉｌｌｅｔａｎｅｕｓｅ，ＦＲＡＮＣＥ (72)発明者トゥルネール，ロズリーヌフランス、エフ−06640 ラゴード、ドメーヌドレトワール、アヴェニュマルセルパニョル、1448 (72)発明者ドマンジェル，カロリーヌオーストラリア、ニューサウスウェールズ 2034、コイー、アーデンストリート３／24 (72)発明者デルバン，クロードフランス、エフ−91190 ジフ−シュル− イヴェット、リュデプレ３ (72)発明者ペレ，ジェラールフランス、エフ−95160 モントモランシ、リュクリスティーヌ３ (72)発明者マジ，ジャン−クロードフランス、エフ−92600 アスニエールシュルセーヌ、リュデジャルダン、 24 (72)発明者プルエ，ジャンフランス、エフ−31400 トールーズ、リュノレ、29 (72)発明者ヴァシ，ロジェフランス、エフ−93500 パンタン、リュラヴォワジェ、３Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 BA63 BA80 CA02 DA02 EA02 EA04 GA11 4B065 AA01X AA72X AA91X AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA23 BA35 CA53 CA56 CA59 NA13 NA14 ZA332 ZA362 ZA892 ZB262 ZC352 4H045 AA10 AA30 BA14 EA20 EA28 FA20 FA72 FA73 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ランダムなペプチドライブラリーを生成し； VEGFを結合し得るリガンドにライブラリーを接触させ；リガンドに結合するライブラリーから分子を選択することからなる、VEGFと相互作用しうるペプチド分子のスクリーニング方法。
【請求項２】リガンドが、KDRである請求項１の方法。
【請求項３】リガンドが、細胞の膜上で発現される請求項２の方法。
【請求項４】リガンドが、抗-VEGF抗体である請求項１の方法。
【請求項５】ランダムなペプチドライブラリーが、7アミノ酸のペプチド
からなる請求項１の方法。
【請求項６】 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、
SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14からなる群から選択され、ペプチド
がKDRへのVEGFの結合を阻害する精製ペプチド。
【請求項７】ペプチドが、SEQ ID NO:11である請求項６のペプチド。
【請求項８】請求項６のペプチドをエンコードする単離されたポリヌクレ
オチド。
【請求項９】請求項８のポリヌクレオチドからなる組換えベクター。
【請求項１０】ベクターが、細菌発現ベクター、酵母発現ベクター及び哺
乳動物発現ベクターからなる群から選択される請求項９のベクター。
【請求項１１】哺乳動物の発現ベクターが、ウイルスベクターである請求
項１０のベクター。
【請求項１２】請求項８の単離されたポリヌクレオチドからなる原核細胞
。
【請求項１３】請求項８の単離されたポリヌクレオチドからなる真核細胞
。
【請求項１４】請求項６のペプチド及び医薬的に許容される担体からなる
医薬組成物。
【請求項１５】 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7からなる群から選択され、ペプチドがV
EGFへの抗-VEGF抗体の結合を阻害する精製ペプチド。
【請求項１６】ペプチドが、SEQ ID NO:1である請求項１５のペプチド。
【請求項１７】請求項１５のペプチドをエンコードする単離されたポリヌ
クレオチド。
【請求項１８】請求項１７のポリヌクレオチドからなる組換えベクター。
【請求項１９】ベクターが、細菌発現ベクター、酵母発現ベクター及び哺
乳動物発現ベクターからなる群から選択される請求項１８のベクター。
【請求項２０】哺乳動物発現ベクターが、ウイルスベクターである請求項
１９のベクター。
【請求項２１】請求項１７の単離されたポリヌクレオチドからなる原核細
胞。
【請求項２２】請求項１７の単離されたポリヌクレオチドからなる真核細
胞。
【請求項２３】請求項１５のペプチド及び医薬的に許容される担体からな
る医薬組成物。
【請求項２４】配列 ATWLPPR (SEQ ID NO:1)の精製ペプチド。
【請求項２５】ペプチドが、VEGFと相互作用しうる請求項２４のペプチド
。
【請求項２６】ペプチドが、VEGFとKDRとの相互作用を阻害し得る請求項
２４のペプチド。
【請求項２７】ペプチドが、VEGFによって媒介される血管内皮細胞の増殖
を阻害し得る請求項２４のペプチド。
【請求項２８】ペプチドが、VEGFによって媒介される脈管形成を阻害し得
る請求項２４のペプチド。
【請求項２９】脈管形成阻害に用いるための請求項２４によるペプチド。
【請求項３０】癌、糖尿病性網膜症、乾癬、血管腫及びカポジ肉腫からな
る群から選択される疾患の治療に用いるための請求項２４のペプチド。
【請求項３１】請求項２４のペプチドをエンコードする単離されたポリヌ
クレオチド。
【請求項３２】請求項３１のポリヌクレオチドからなる組換えベクター。
【請求項３３】ベクターが、細菌発現ベクター、酵母発現ベクター及び哺
乳動物発現ベクターからなる群から選択される請求項３２のベクター。
【請求項３４】哺乳動物の発現ベクターが、ウイルスベクターである請求
項３３のベクター。
【請求項３５】請求項３１の単離されたポリヌクレオチドからなる原核細
胞。
【請求項３６】請求項３１のベクターからなる真核細胞。
【請求項３７】請求項２４のペプチド及び医薬的に許容される担体からな
る医薬組成物。