TWI496582B - 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子 - Google Patents

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Description

雙重專一性之EGFR/IGFIR結合分子
本發明係關於EGFR結合域以及用於診斷、研究及治療應用中之包含EGFR結合域及不同的IGFIR結合域之雙重專一性分子。本發明進一步係關於包含此等蛋白質之細胞、編碼此等蛋白質之聚核苷酸或其片段，及包含編碼新穎蛋白質之聚核苷酸的載體。例示性EGFR結合域及雙重專一性分子包括基於第十纖維結合蛋白第III型域之抗體樣蛋白質二聚體。
本申請案主張2008年11月24日申請之美國臨時申請案第61/200,164號；2008年11月26日申請之美國臨時申請案第61/200,282號；2009年4月17日申請之美國臨時申請案第61/212,966號；2009年5月14日申請之美國臨時申請案第61/178,279號；及2009年7月21日申請之美國臨時申請案第61/227,330號的權益，該等申請案係以全文引用的方式併入本文中。
受體酪胺酸激酶信號傳導之活化對於癌症發生極為重要(例如參看Grimberg A. Cancer Biol Ther. 2003 2(6):630-5及Mendelsohn J. J Clin Oncol. 2003 21(14):2787-99)。受體酪胺酸激酶具有保守的域結構，包括細胞外域、跨膜域及細胞內酪胺酸激酶域。細胞外域可與配位體結合，諸如與多肽生長因子或與細胞膜締合之分子結合。受體酪胺酸激酶之配位體結合或配位體結合誘導之二聚化通常會活化受體之細胞內酪胺酸激酶催化域且隨後活化信號轉導。
受體酪胺酸激酶之實例包括(但不限於)ERBB受體(例如EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4)、產生紅血球生成素之肝細胞(EPH)受體、纖維母細胞生長因子(FGF)受體(例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5)、血小板衍生生長因子(PDGF)受體(例如PDGFR-A、PDGFR-B)、血管內皮生長因子(VEGF)受體(例如VEGFR1/FLT1、VEGFR2/FLK1、VEGF3)、具有免疫球蛋白樣及EGF樣域之酪胺酸激酶(TIE)受體、類胰島素生長因子(IGF)受體(例如INS-R、IGFIR、IR-R)、盤狀結構域(Discoidin Domain，DD)受體、c-Met之受體(MET)、受體酪胺酸激酶(recepteur d'origine nantais，RON)(亦稱為巨噬細胞刺激因子1受體)、Flt3 fins相關酪胺酸激酶3(Flt3)、群落刺激因子1(CSF1)受體、黏著相關激酶受體(例如Axl)、c-kit之受體(KIT)及胰島素受體相關(IRR)受體。
抑制受體酪胺酸激酶已成為某些人類惡性疾病之有效治療策略(關於評述，參看Roussidis AE,In Vivo. 2002 16(6):459-69)。
儘管靶向單藥療法最初可能有效治療癌症，但接著經常可能會因其他信號傳導級聯上調而出現治療抗性(例如參看Nahta R等人，Breast Cancer Res. 2006 8(6):215及Horn L等人，Clin Lung Cancer. 2007 8:S68-73)。因此，需要開發經改良之癌症治療。
在一態樣中，本申請案提供具有新穎序列之結合EGFR之第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)。亦提供具有共同序列之EGFR結合10 Fn3。此等EGFR結合10 Fn3可為單體，或可作為一部分包括在融合蛋白中。
在另一態樣中，本申請案提供結合EGFR及IGFIR之雙重專一性分子，其在本文中稱作「E/I結合物(E/I binder)」。本發明所涵蓋之E/I結合物包括雙重專一性抗體及配位體結合骨架蛋白之二聚體(例如澱粉酶抑肽(tendamistat)、親和體(affibody)、纖維結合蛋白第III型域、抗運載蛋白(anticalin)、四連接素(tetranectin)及錨蛋白(ankyrin))。當構築為單一多肽鏈時，可在任何方向上構築E/I結合物，例如自N端至C端呈E-I布置或I-E布置。
在一態樣中，提供抗體樣蛋白質二聚體，其包含EGFR結合10 Fn3與IGFIR結合10 Fn3共價或非共價連接。10 Fn3以小於500nM之KD 結合其靶(EGFR或IGFIR)。個別10 Fn3各獨立地具有與SEQ ID NO:32至少70%、80%、85%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列，其中n為1-20之整數，o為1-20之整數且p為1-40之整數。在一些實施例中，n為8-12之整數，o為4-8之整數，且p為4-28之整數。在一些實施例中，n為10，o為6，且p為12。
在一些實施例中，抗體樣蛋白質二聚體包含IGFIR結合10 Fn3經由多肽連接子或聚乙二醇部分與EGFR結合10 Fn3共價連接。在一些實施例中，抗體樣蛋白質二聚體包含與SEQ ID NO:20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210及211-216中任一者至少80%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，E/I結合物包含具有SEQ ID NO:20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210及211-216中任一者之胺基酸序列，其中(i)EGFR結合10 Fn3及/或IGF-IR結合10 Fn3包含相對於SEQ ID NO:1之相應骨架胺基酸具有在0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1之間之任何數目個取代、保守性取代、缺失或添加之10 Fn3骨架；且/或(ii)EGFR結合10 Fn3相對於SEQ ID NO:5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200或219-327中任一者之相應環序列具有在0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1之間之任何數目個取代、保守性取代、缺失或添加，且/或IGF-IR結合10 Fn3相對於SEQ ID NO:3之相應環序列具有在0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1之間之任何數目個取代、保守性取代、缺失或添加。
在一態樣中，提供醫藥學上可接受之組合物，其包含如本文所述之抗體樣蛋白質二聚體及醫藥學上可接受之載劑，其中該組合物基本上無熱原質。
在另一態樣中，提供治療個體之過度增生性病症(諸如癌症)之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之醫藥學上可接受的包含如本文所述之抗體樣蛋白質二聚體之組合物。
在另一態樣中，本申請案提供一種編碼如本文所述之抗體樣蛋白質二聚體之核酸。亦提供一種包含編碼如本文所述之抗體樣二聚體之核酸的載體。適合之載體包括例如表現載體。亦提供包含編碼如本文所述之抗體樣蛋白質二聚體之核酸、包含編碼如本文所述之抗體樣蛋白質二聚體之核酸之載體或表現載體的宿主細胞。適合之宿主細胞包括原核及真核宿主細胞。例示性原核細胞為細菌細胞，諸如大腸桿菌細胞。例示性真核細胞為哺乳動物細胞，諸如CHO細胞。亦提供製造如本文所述之抗體樣蛋白質二聚體的方法，其包含培養包含編碼抗體樣蛋白質二聚體之核酸、包含編碼抗體樣蛋白質二聚體之核酸之載體或表現載體的宿主細胞，及自培養物中回收經表現之抗體樣蛋白質二聚體。
 定義
如本文中所用，以下術語及短語應具有下文所述之含義。除非另作定義，否則本文中所用之所有科技術語均具有與一般熟習此項技術者通常所瞭解相同之含義。
除非上下文另作清楚規定，否則單數形式「一」及「該」包括複數個參考物。
術語「包含」係以包括性、開放含義使用，意謂可包括其他要素。
術語「包括」用以意謂「包括(但不限於)」。「包括」及「包括(但不限於)」可互換使用。
術語「抗體樣蛋白質」係指具有「免疫球蛋白樣摺疊」之非免疫球蛋白蛋白質，亦即其包含約80-150個在結構上組織成一組β或β樣股從而形成β摺疊之胺基酸殘基，其中β或β樣股係藉由插入環部分來連接。β摺疊形成抗體樣蛋白質之穩定核心，同時產生由連接β或β樣股之環構成的兩個「面」。如本文所述，此等環可變化以產生定製之配位體結合位點，且可在不破壞蛋白質總體穩定性之情況下產生此等變化。此抗體樣蛋白質之實例為「基於纖維結合蛋白之骨架蛋白」，其意謂基於纖維結合蛋白第III型域(Fn3)之多肽。在一態樣中，抗體樣蛋白質係基於第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)。
「多肽」意謂任何具有兩個或兩個以上胺基酸之序列，不論長度、轉譯後修飾或功能。「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用。
「胺基酸序列一致性百分比(%)」在本文中定義為在比對序列且必要時引入間隙以達成序列一致性最大百分比，且不將任何保守性取代視作序列一致性之一部分之後，候選序列中胺基酸殘基與所選序列中胺基酸殘基一致之百分比。可以此項技術內之多種方式，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體，達成比對以測定胺基酸序列一致性百分比。熟習此項技術者可決定測量比對之適當參數，包括達成比較序列全長的最大比對所需之任何演算法。然而，為本文目的，胺基酸序列一致性%值係如下述使用序列比較電腦程式ALIGN-2獲得。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech,Inc.編寫，已經以使用說明書申請於美國著作權局(U.S. Copyright Office,Washington D.C.,20559)，以美國著作權註冊編號TXU510087註冊，且經由Genentech,Inc.(South San Francisco,Calif)公開可得。ALIGN-2程式應編輯用於UNIX操作系統，較佳數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不變。
為本文目的，如下計算既定胺基酸序列A對於、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可稱為既定胺基酸序列A具有或包含某種對於、與、或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%)：100乘以分數X/Y，其中X為經序列比對程式ALIGN-2比對A與B評為一致匹配之胺基酸殘基的數目，其中Y為B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A對B之胺基酸序列一致性%將不等於B對A之胺基酸序列一致性%。
術語「治療有效量」係指有效治療哺乳動物之疾病或病症之藥物量。在癌症之情況下，治療有效量之藥物可減少癌細胞數目；減小腫瘤尺寸；抑制(亦即在某種程度上減緩且較佳停止)癌細胞浸潤至周邊器官中；抑制(亦即在某種程度上減緩且較佳停止)腫瘤轉移；在某種程度上抑制腫瘤生長；及/或在某種程度上減輕一或多種與病症相關之症狀。就藥物可防止癌細胞生長及/或殺死現存癌細胞而言，其可具有細胞抑制性及/或細胞毒性。對於癌症療法，可例如藉由評定疾病進展時間(TTP)及/或測定反應速率(RR)來量測活體內功效。
胺基酸序列或化合物之半衰期一般可定義為由例如該序列或化合物降解及/或該序列或化合物經天然機制清除或螯合引起的活體內多肽血清濃度降低50%所用之時間。可以此項技術中已知之任何方式，諸如藉由藥物動力學分析，來測定半衰期。例如參看M Gibaldi及D Perron「Pharmacokinetics」,Marcel Dekker出版，第2修訂版(1982)。
術語「E/I結合物」係指包含EGFR結合域及獨特IGFIR結合域之雙重專一性分子。兩個域可共價或非共價連接。例示性E/I結合物為抗體樣二聚體，其包含EGFR結合10 Fn3及IGFIR結合10 Fn3，亦即基於E/I10 Fn3之結合物。
概述
表皮生長因子受體(EGFR)及類胰島素生長因子受體(IFGR)在若干類人類癌症之腫瘤形成過程中起到關鍵作用。任一受體之抑制均會在臨床前模型中以及臨床上有效減少腫瘤生長。在活體外腫瘤模型中，阻斷EGFR路徑將誘導轉換至IGFR路徑以推動生長。因此，同時阻斷兩種受體可藉由克服路徑轉換而達成優於阻斷任一單獨路徑之功效。在例示性實施例中，與E/I結合物中之單體組份相比較，E/I結合物之活性為協同性的。
本說明書特別描述結合EGFR及IGFIR之雙重專一性分子(在本文中稱作「E/I結合物」)。申請者已發現，此等雙重專一性分子可以比相應單專一性結合物高之效能抑制癌症模型細胞株增殖(例如參見實例9及圖8)。
E/I結合物將適用於眾多治療應用中，尤其適用於癌症治療中。除治療應用外，E/I結合物亦可用於需要偵測EGFR及/或IGFIR之任何情形。
E/I結合物具有EGFR結合域及獨特IGFIR結合域。典型結合域包括抗體；因此，可產生雙重專一性抗體以用作E/I結合物。此項技術中已知包含VH 及VL 區之互補對的雙重專一性抗體。此等雙重專一性抗體包含兩對VH 與VL ，各VH/L 對均與單一抗原結合(例如參看Hu等人，Cancer Res. 1996 56:3055-306；Neri等人，J. Mol. Biol. 1995 246:367-373；Atwell等人，Mol. Immunol. 1996 33:1301-1312；及Carter等人，Protein Sci. 1997 6:781-788)。例示性雙重專一性抗體為雙功能抗體，亦即具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含在同一多肽鏈中重鏈可變域與輕鏈可變域連接(Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993 90:6444-6448)。
E/I結合物亦涵蓋配位體結合骨架蛋白之二聚體。骨架蛋白充分描述於文獻中且包括例如澱粉酶抑肽、親和體、纖維結合蛋白第III型域、抗運載蛋白、四結合素及錨蛋白。可用以產生E/I結合物之其他骨架蛋白係評述於Binz等人，Nature Biotech 23:1257-1268(2005)中。骨架蛋白係基於對於測定三維結構及使三維結構穩定極為重要之剛性核心結構或『構架』。在該骨架之固定殘基或保守殘基之間存在可經隨機化以改變配位體結合之可變區，諸如環、表面或空腔。在固定骨架殘基之間之可變區中具有極大胺基酸差異，以提供與靶分子之專一性結合。
例示性配位體結合骨架蛋白係基於纖維結合蛋白第III型域(Fn3)。纖維結合蛋白為在細胞外基質形成及細胞-細胞相互作用中起到重要作用之大蛋白質；其係由多個三種類型(第I型、第II型及第III型)小域之重複組成。
Fn3為小型、單體、可溶且穩定的。其不含雙硫鍵且因此在還原條件下穩定。Fn3之總體結構類似於免疫球蛋白摺疊。Fn3域自N端至C端依次包含β或β樣股A；環AB；β或β樣股B；環BC；β或β樣股C；環CD；β或β樣股D；環DE；β或β樣股E；環EF；β或β樣股F；環FG；及β或β樣股G。七條反平行β股布置成兩個β摺疊，形成穩定核心，同時產生由連接β或β樣股之環構成的兩個「面」。環AB、CD及EF位於一面上且環BC、DE及FG位於相對面上。環AB、BC、CD、DE、EF及FG中任一者或全部均可參與配位體結合。存在至少15個不同的Fn3模塊，且儘管分子之間之序列同源性較低，但其三級結構皆共有高相似性。
AdnectinsTM (Adnexus，Bristol-Myers Squibb R＆D Company)為基於第十纖維結合蛋白第III型域(亦即第十個Fn3模塊)(10 Fn3)之配位體結合骨架蛋白。天然存在之人類10 Fn3的胺基酸序列係以SEQ ID NO:1闡述。
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVR YYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKST
ATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKP ISINYRT(SEQ ID NO:1)(BC、FG及DE突出顯示)
在SEQ ID NO:1中，AB環對應於殘基15-16，BC環對應於殘基21-30，CD環對應於殘基39-45，DE環對應於殘基51-56，EF環對應於殘基60-66，且FG環對應於殘基76-87。(Xu等人，Chemistry ＆ Biology 2002 9:933-942)。BC、DE及FG環沿分子之一面排列，且AB、CD及EF環沿分子之相對面排列。在SEQ ID NO:1中，β股A對應於殘基9-14，β股B對應於殘基17-20，β股C對應於殘基31-38，β股D對應於殘基46-50，β股E對應於殘基57-59，β股F對應於殘基67-75，且β股G對應於殘基88-94。該等股經由相應環彼此連接，例如在形成股A、環AB、股B中，股A與B經由環AB連接，等等。形成疏水核心所涉及之殘基(「核心胺基酸殘基」)包括對應於SEQ ID NO:1中以下胺基酸之胺基酸：L8、V10、A13、L18、I20、W22、Y32、I34、Y36、F48、V50、A57、I59、L62、Y68、I70、V72、A74、I88、I90及Y92，其中該等核心胺基酸殘基係以單字母胺基酸編碼繼之以其在SEQ ID NO:1內所處之位置表示。例如參看Dickinson等人，J. Mol. Biol. 236:1079-1092(1994)。
如上所述，對應於SEQ ID NO:1之殘基21-30、51-56及76-87之胺基酸殘基分別界定BC、DE及FG環。然而，應瞭解並非環區內之每一殘基均需經修飾以獲得對所需靶(諸如IGF-IR或EGFR)具有強親和力之10 Fn3結合物。舉例而言，在許多本文所述之實例中，僅對應於SEQ ID NO:1之胺基酸23-30、52-55及77-86之殘基經修飾以產生高親和力10 Fn3結合物(參看圖46)。因此，在某些實施例中，可由對應於SEQ ID NO:1之殘基23-30的胺基酸界定BC環，可由對應於SEQ ID NO:1之殘基52-55的胺基酸界定DE環，且可由對應於SEQ ID NO:1之殘基77-86的胺基酸界定FG環。
10 Fn3之結構及功能均類似於抗體，尤其抗體之可變區。儘管可將10 Fn3域描述為「抗體模擬物」或「抗體樣蛋白質」，但其會提供許多優於習知抗體之優勢。詳言之，其顯示比抗體更好之摺疊及熱穩定特性，且其不含已知在某些條件下會阻礙或防止適當摺疊之雙硫鍵。例示性基於E/I10 Fn3之結合物主要為單體，且Tm平均值為約50℃。
10 Fn3之BC、DE及FG環類似於免疫球蛋白之互補決定區(CDR)。此等環區中胺基酸序列之變化將改變10 Fn3之結合專一性。CDR樣環外之蛋白質序列類似於免疫球蛋白之構架區且在10 Fn3之結構構形中起作用。只要結構構形未變成破壞配位體結合的形式，則10 Fn3中構架樣區之變化為可允許的。已在PCT公開案第WO 00/034787號、第WO 01/64942號及第WO 02/032925號(其揭示高親和力TNFα結合物)；PCT公開案第WO 2008/097497號(其揭示高親和力VEGFR2結合物)；及PCT公開案第WO 2008/066752號(其揭示高親和力IGFIR結合物)中描述產生10 Fn3配位體專一性結合物之方法。其他論述10 Fn3結合物及選擇結合物之方法的參考文獻包括PCT公開案第WO 98/056915號、第WO 02/081497號及第WO 2008/031098號以及美國公開案第2003186385號。
基於10 Fn3骨架之抗體樣蛋白質一般可由以下序列定義：VSDVPRDLEVVAATPTSLLI(X)n YYRITYGETGGNSPVQEFTV(X)o ATISGLKPGVDYTITVYAV(X)p ISINYRT(SEQ ID NO:32)，其中n為1-20之整數，o為1-20之整數，且p為1-40之整數。BC、DE及FG環分別係以(X)n 、(X)o 及(X)p 表示。
10 Fn3一般係以對應於SEQ ID NO:1之編號1的胺基酸殘基開始。然而，本發明亦涵蓋缺失胺基酸之域。在一些實施例中，缺失對應於SEQ ID NO:1之前八個胺基酸的胺基酸殘基。亦可將其他序列添加至N端或C端。舉例而言，可將其他MG序列置於10 Fn3之N端。M通常會被裂解掉，從而在N端留下G。在一些實施例中，可將序列置於10 Fn3域之C端，例如EIDKPSQ(SEQ ID NO:9)、EIDKPCQ(SEQ ID NO:10)、EGSGS(SEQ ID NO:96)或EGSGC(SEQ ID NO:97)。
可改變10 Fn3之非配位體結合序列，亦即「10 Fn3骨架」，前提為10 Fn3保持配位體結合功能及/或結構穩定性。在一些實施例中，Asp 7、Glu 9及Asp 23中之一或多者經另一胺基酸置換，該另一胺基酸諸如為不帶負電荷之胺基酸殘基(例如Asn、Lys等)。據報導，與野生型形式相比，此等突變在中性pH值下具有較大的促進突變10 Fn3穩定之作用(參看PCT公開案第WO 02/04523號)。已揭示10 Fn3骨架中將有利或呈中性之多種其他變化。例如參看Batori等人，Protein Eng. 2002 15(12):1015-20；Koide等人，Biochemistry 2001 40(34):10326-33。
10 Fn3骨架可藉由一或多個保守性取代來修飾。10 Fn3骨架中多達5%、10%、20%或者甚至30%或30%以上之胺基酸可藉由保守性取代來改變，而不實質上改變10 Fn3對配位體之親和力。舉例而言，骨架修飾較佳使10 Fn3結合物對配位體之結合親和力降低不到100倍、50倍、25倍、10倍、5倍或2倍。此等變化可能會改變活體內10 Fn3之免疫原性，且當免疫原性降低時，將需要此等變化。如本文中所用，「保守性取代」為物理上或功能上類似於相應參考殘基之殘基。亦即，保守性取代與其參考殘基具有類似尺寸、形狀、電荷、化學特性(包括形成共價鍵或氫鍵之能力)或其類似特性。較佳保守性取代為滿足Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352(1978及增刊)中關於可接受之點突變所定義之準則的取代。保守性取代之實例為以下各組內之取代：(a)纈胺酸、甘胺酸；(b)甘胺酸、丙胺酸；(c)纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；(d)天冬胺酸、麩胺酸；(e)天冬醯胺、麩胺醯胺；(f)絲胺酸、蘇胺酸；(g)離胺酸、精胺酸、甲硫胺酸；及(h)苯丙胺酸、酪胺酸。
E結合物
在一態樣中，本發明提供包含EGFR結合10 Fn3域之抗體樣蛋白質。在某些實施例中，EGFR結合10 Fn3可作為融合蛋白或多聚體之一部分提供。舉例而言，EGFR結合10 Fn3可與至少一第二10 Fn3結合域共價或非共價連接。該第二10 Fn3結合域可與EGFR或與不同靶結合。在例示性實施例中，EGFR結合10 Fn3可與IGF-IR結合10 Fn3共價或非共價連接。
在例示性實施例中，本文所述之EGFR結合10 Fn3蛋白係以小於500nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、50pM或10pM之KD 與EGFR結合。
在例示性實施例中，EGFR結合10 Fn3蛋白之BC環對應於SEQ ID NO:1之胺基酸23-30，EGFR結合10 Fn3蛋白之DE環對應於SEQ ID NO:1之胺基酸52-55，且EGFR結合10 Fn3蛋白之FG環對應於SEQ ID NO:1之胺基酸77-86。
在一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸29及30之位置具有YQ的BC環。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸29及30之位置具有YQ的BC環；及十五個胺基酸長之FG環，例如因在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸77-86的殘基之間插入五個胺基酸而長度延長五個胺基酸之FG環。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸29及30之位置具有YQ的BC環，及在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸54之位置具有V、I、L、M或A殘基之DE環。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸29及30之位置具有YQ的BC環；在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸54之位置具有V、I、L、M或A殘基之DE環；及十五個胺基酸長之FG環，例如因在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸77-86的殘基之間插入五個胺基酸而長度延長五個胺基酸之FG環。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸29及30之位置具有YQ的BC環，及在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸77之位置包含D或N之FG環。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸29及30之位置具有YQ的BC環；及FG環，其(i)十五個胺基酸長，例如因在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸77-86的殘基之間插入五個胺基酸而長度延長五個胺基酸之FG環，且(ii)在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸77的位置包含D或N。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸54的位置包含V、I、L、M或A殘基的DE環，及在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸77的位置包含D或N之FG環。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸54的位置包含V、I、L、M或A殘基的DE環；及FG環，其(i)十五個胺基酸長，例如因在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸77-86的殘基之間插入五個胺基酸而長度延長五個胺基酸之FG環，且(ii)在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸77的位置包含D或N。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸29及30之位置具有YQ的BC環；在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸54之位置包含V、I、L、M或A殘基之DE環；及在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸77的位置包含D或N之FG環。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸29及30之位置具有YQ的BC環；在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸54之位置包含V、I、L、M或A殘基之DE環；及FG環，其(i)十五個胺基酸長，例如因在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸77-86的殘基之間插入五個胺基酸而長度延長五個胺基酸之FG環，且(ii)在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸77的位置包含D或N。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含：包含胺基酸序列XXXXXXYQ之BC環、包含胺基酸序列XX(V/I/L/M/A) X之DE環及包含胺基酸序列(D/N) Xn 之FG環，其中X為任何胺基酸且n為9-14個胺基酸。在一例示性實施例中，n為14個胺基酸。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含對應於SEQ ID NO:1之胺基酸23-30且包含胺基酸序列XXXXXXYQ的BC環；對應於SEQ ID NO:1之胺基酸52-55且包含胺基酸序列XX(V/I/L/M/A) X的DE環；及對應於SEQ ID NO:1之胺基酸77-86且包含胺基酸序列(D/N) Xn 的FG環，其中X為任何胺基酸且n為9-14個胺基酸。在一例示性實施例中，n為14個胺基酸。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含：包含胺基酸序列XXXXXXYQ之BC環、包含胺基酸序列XX(V/I/L/M/A) X之DE環，及包含選自以下之胺基酸序列的FG環：
i.　(D/N)(Y/M)(Y/A/M)(Y/H/F)(K/Q/V)(E/P/R)(Y/T/K) X(E/Y/Q)(Y/G/H)；及
ii.　D(Y/F/W)(Y/F/K)(N/D/P)(P/H/L)(A/T/V)(T/D/S)(H/Y/G)(E/P/V)(Y/H)(T/K/I)(Y/F)(H/N/Q)(T/Q/E)(T/S/I)；
其中X為任何胺基酸。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含：包含胺基酸序列XXXXXXYQ之BC環、包含胺基酸序列(G/Y/H)(D/M/G)(V/L/I) X之DE環及包含胺基酸序列(D/N)(Y/M)(Y/A/M)(Y/H/F)(K/Q/V)(E/P/R)(Y/T/K) X(E/Y/Q)(Y/G/H)之FG環，其中X為任何胺基酸。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含：包含胺基酸序列XXXXXXYQ之BC環、包含胺基酸序列(G/Y/H)(D/M/G)(V/L/I) X之DE環及包含胺基酸序列D(Y/F/W)(Y/F/K)(N/D/P)(P/H/L)(A/T/V)(T/D/S)(H/Y/G)(E/P/V)(Y/H)(T/K/I)(Y/F)(H/N/Q)(T/Q/E)(T/S/I)之FG環，其中X為任何胺基酸。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含：包含胺基酸序列XXXXXXYQ之BC環、包含胺基酸序列XX(V/I/L/M/A) X之DE環，及包含選自以下之胺基酸序列的FG環：
i. DY(A/Y) GKPYXEY；
ii. DY(A/Y) Y(K/R/Q/T) PYXEY；
iii. (D/N) Y(A/Y)(Y/F)(K/R/Q/T) EYXE(Y/H)；
iv. DYY(H/Y) X(R/K) X(E/T) YX；
v. DYY(H/Y)(K/H/Q)(R/K) T(E/T) Y(G/P)；
vi. (D/N) MMHV(E/D) YXEY；
vii. DYMHXXYXEY；及
viii. D(M/Y) YHX(K/R) X(V/I/L/M) YG；
其中X為任何胺基酸。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含：包含胺基酸序列XXXXXXYQ之BC環、包含胺基酸序列XX(V/I/L/M/A) X之DE環，及包含選自以下之胺基酸序列的FG環：
i. D(Y/F)(Y/F) NPXTHEYXYXXX；
ii. D(Y/F)(Y/F) D(P/L) X(T/S) HXYXYXXX；及
iii. D(Y/F)(K/R) PHXDGPH(T/I) YXE(S/Y)；
其中X為任何胺基酸。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含：包含胺基酸序列XXXXXXYQ之BC環、包含胺基酸序列XX(V/I/L/M/A) X之DE環及包含胺基酸序列(D/N)(M/Y)(M/A/W)(H/F/Y)(V/K) EY(A/Q/R/S/T) E(Y/H/D)之FG環，其中X為任何胺基酸。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含：包含胺基酸序列XXXXXXYQ之BC環、包含胺基酸序列XX(V/I/L/M/A) X之DE環及包含胺基酸序列D(Y/F/W)(Y/F/K)(N/P/D)(P/H/L) X(T/D/S)(H/G/Y)(E/P/Y)(Y/H) XYXXX之FG環，其中X為任何胺基酸。
在各種實施例中，EGFR結合10 Fn3之DE環均可包含序列(G/Y/H)(D/M/G)(V/L/I) X。
在另一實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含包括選自以下之胺基酸序列的FG環：
i.　D(Y/F)(Y/F) NPXTHEYXYXXX；
ii.　D(Y/F)(Y/F) D(P/L) X(T/S) HXYXYXXX；及
iii.　D(Y/F)(K/R) PHXDGPH(T/I) YXE(S/Y)；
其中X為任何胺基酸。
在某些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含任何上文提供之共同序列，其限制條件為EGFR結合10 Fn3不包含以下一或多個序列：
i.VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWQVPRPMYQRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYMHSEYRQYPISINYRT，及
ii.VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWQVPRPMYQYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYMHSEYRQYPISINYRT，及
iii.VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWQVPRPMYQRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGGVRTATISGLKPGVDYTITVYAVTDYMHSEYRQYPISINYRTEIDKPCQ。
在某些實施例中，包含一個上文提供之共同序列的EGFR結合10 Fn3與SEQ ID NO:1具有至少40%、50%、60%、70%、75%或80%一致性。在某些實施例中，包含一個上文提供之共同序列的EGFR結合10 Fn3之總體結構類似於免疫球蛋白摺疊。在某些實施例中，包含一個上文提供之共同序列的EGFR結合10 Fn3進一步包含骨架之核心胺基酸殘基。在某些實施例中，包含一個上文提供之共同序列的EGFR結合10 Fn3與SEQ ID NO:5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200或219-327中任一者具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性。在某些實施例中，包含一個上文提供之共同序列的EGFR結合10 Fn3與SEQ ID NO:5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200或219-327中任一者之對應於SEQ ID NO:1之E9至SEQ ID NO:1之T94的胺基酸殘基之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致性。在某些實施例中，包含一個上文提供之共同序列的EGFR結合10 Fn3包含相對於SEQ ID NO:1之骨架胺基酸殘基具有在0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1之間之任何數目個取代、保守性取代、缺失或添加的10 Fn3骨架。
在某些實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:219-327中任一者之胺基酸23-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:219-327中任一者之胺基酸52-55中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:219-327中任一者之胺基酸77-86中所述之胺基酸序列的FG環。在某些實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:219-327中任一者之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:219-327中任一者之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:219-327中任一者之胺基酸76-87中所述之胺基酸序列的FG環。在某些實施例中，本發明提供一種EGFR結合10 Fn3，其包含與SEQ ID NO:219-327中任一者至少60%、75%、80%、85%、90%、95%或98%一致之胺基酸序列。
在一實施例中，提供一種抗體狀蛋白質，其包含第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)，該10 Fn3域以小於500nM之KD 結合EGFR，且包含具有SEQ ID NO:5之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:5之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:5之胺基酸76-92中所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg DSGRGSYQXh (SEQ ID NO:40)之BC環、具有胺基酸序列Xi GPVHXj (SEQ ID NO:42)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DHKPHADGPHTYHEXl (SEQ ID NO:44)之FG環；其中X為任何胺基酸且g、h、i、j、k及l為獨立地選自0至5之整數。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWDSGRGSYQ(SEQ ID NO:39)之BC環、具有胺基酸序列PGPVHT(SEQ ID NO:41)之DE環及具有胺基酸序列TDHKPHADGPHTYHESP(SEQ ID NO:43)之FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:5或6至少80%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
在一實施例中，提供一種抗體狀蛋白質，其包含第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)，該10 Fn3域以小於500nM之KD 結合EGFR，且包含具有SEQ ID NO:7之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:7之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:7之胺基酸76-87中所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xm VAGAEDYQXn (SEQ ID NO:34)之BC環、具有胺基酸序列Xo HDLVXp (SEQ ID NO:36)之DE環，及具有胺基酸序列Xq DMMHVEYTEHXr (SEQ ID NO:38)之FG環；其中X為任何胺基酸且m、n、o、p、q及r為獨立地選自0至5之整數。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWVAGAEDYQ(SEQ ID NO:33)之BC環、具有胺基酸序列PHDLVT(SEQ ID NO:35)之DE環及具有胺基酸序列TDMMHVEYTEHP(SEQ ID NO:37)之FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:7或8至少80%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
在一實施例中，提供一種抗體狀蛋白質，其包含第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)，該10 Fn3域以小於500nM之KD 結合EGFR，且包含具有SEQ ID NO:82之胺基酸23-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:82之胺基酸51-55中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:82之胺基酸76-86中所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xs LPGKLRYQXt (SEQ ID NO:60)之BC環、具有胺基酸序列Xu HDLRXw (SEQ ID NO:62)之DE環，及具有胺基酸序列Xy NMMHVEYSEYXz (SEQ ID NO:64)之FG環；其中X為任何胺基酸且s、t、u、w、y及z為獨立地選自0至5之整數。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列LPGKLRYQ(SEQ ID NO:59)之BC環、具有胺基酸序列PHDLR(SEQ ID NO:61)之DE環及具有胺基酸序列TNMMHVEYSEY(SEQ ID NO:63)之FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:52或82至少80%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
在一實施例中，提供一種抗體狀蛋白質，其包含第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)，該10 Fn3域以小於500nM之KD 結合EGFR，且包含具有SEQ ID NO:106之胺基酸23-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:106之胺基酸51-55中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:106之胺基酸76-86中所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg HERDGSRQXh (SEQ ID NO:134)之BC環、具有胺基酸序列Xi GGVRXj (SEQ ID NO:135)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DYFNPTTHEYIYQTTXl (SEQ ID NO:136)之FG環；其中X為任何胺基酸且g、h、i、j、k及l為獨立地選自0至5之整數。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWHERDGSRQ(SEQ ID NO:109)之BC環、具有胺基酸序列PGGVRT(SEQ ID NO:110)之DE環及具有胺基酸序列TDYFNPTTHEYIYQTTP(SEQ ID NO:111)之FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:106-108中任一者至少80%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
在一實施例中，提供一種抗體狀蛋白質，其包含第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)，該10 Fn3域以小於500nM之KD 結合EGFR，且包含具有SEQ ID NO:112之胺基酸23-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:112之胺基酸51-55中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:112之胺基酸76-86中所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg WAPVDRYQXh (SEQ ID NO:137)之BC環、具有胺基酸序列Xi RDVYXj (SEQ ID NO:138)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DYKPHADGPHTYHESXl (SEQ ID NO:139)之FG環；其中X為任何胺基酸，且g、h、i、j、k及l為獨立地選自0至5之整數。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWWAPVDRYQ(SEQ ID NO:115)之BC環、具有胺基酸序列PRDVYT(SEQ ID NO:116)之DE環及具有胺基酸序列TDYKPHADGPHTYHESP(SEQ ID NO:117)之FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:112-114中任一者至少80%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
在一實施例中，提供一種抗體狀蛋白質，其包含第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)，該10 Fn3域以小於500nM之KD 結合EGFR，且包含具有SEQ ID NO:141之胺基酸13-22中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:141之胺基酸43-48中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:141之胺基酸68-84中所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg TQGSTHYQXh (SEQ ID NO:146)之BC環、具有胺基酸序列Xi GMVYXj (SEQ ID NO:147)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DYFDRSTHEYKYRTTXl (SEQ ID NO:148)之FG環；其中X為任何胺基酸且g、h、i、j、k及l為獨立地選自0至5之整數。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWTQGSTHYQ(SEQ ID NO:143)之BC環、具有胺基酸序列PGMVYT(SEQ ID NO:144)之DE環及具有胺基酸序列TDYFDRSTHEYKYRTTP(SEQ ID NO:145)之FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:140-142中任一者至少80%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
在一實施例中，提供一種抗體狀蛋白質，其包含第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)，該10 Fn3域以小於500nM之KD 結合EGFR，且包含具有SEQ ID NO:156之胺基酸13-22中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:156之胺基酸43-48中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:156之胺基酸68-84中所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg YWEGLPYQXh (SEQ ID NO:161)之BC環、具有胺基酸序列Xi RDVNXj (SEQ ID NO:162)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DWYNPDTHEYIYHTIXl (SEQ ID NO:163)之FG環；其中X為任何胺基酸且g、h、i、j、k及l為獨立地選自0至5之整數。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWYWEGLPYQ(SEQ ID NO:158)之BC環、具有胺基酸序列PRDVNT(SEQ ID NO:159)之DE環及具有胺基酸序列TDWYNPDTHEYIYHTIP(SEQ ID NO:160)之FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:155-157中任一者至少80%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
在一實施例中，提供一種抗體狀蛋白質，其包含第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)，該10 Fn3域以小於500nM之KD 結合EGFR，且包含具有SEQ ID NO:171之胺基酸13-22中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:171之胺基酸43-48中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:171之胺基酸68-84中所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg ASNRGTYQXh (SEQ ID NO:176)之BC環、具有胺基酸序列Xi GGVSXj (SEQ ID NO:177)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DAFNPTTHEYNYFTTX1 (SEQ ID NO:178)之FG環；其中X為任何胺基酸且g、h、i、j、k及l為獨立地選自0至5之整數。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWASNRGTYQ(SEQ ID NO:173)之BC環、具有胺基酸序列PGGVST(SEQ ID NO:174)之DE環及具有胺基酸序列TDAFNPTTHEYNYFTTP(SEQ ID NO:175)之FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:170-172中任一者至少80%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
在一實施例中，提供一種抗體狀蛋白質，其包含第+纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)，該10 Fn3域以小於500nM之KD 結合EGFR，且包含具有SEQ ID NO:186之胺基酸13-22中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:186之胺基酸43-48中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:186之胺基酸68-84中所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg DAPTSRYQXh (SEQ ID NO:190)之BC環、具有胺基酸序列Xi GGLSXj (SEQ ID NO:191)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DYKPHADGPHTYHESXl (SEQ ID NO:139)之FG環；其中X為任何胺基酸且g、h、i、j、k及l為獨立地選自0至5之整數。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWDAPTSRYQ(SEQ ID NO:188)之BC環、具有胺基酸序列PGGLST(SEQ ID NO:189)之DE環及具有胺基酸序列TDYKPHADGPHTYHESP(SEQ ID NO:117)之FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:185-187中任一者至少80%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
在一實施例中，提供一種抗體狀蛋白質，其包含第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)，該10 Fn3域以小於500nM之KD 結合EGFR，且包含具有SEQ ID NO:199之胺基酸13-22中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:199之胺基酸43-48中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:199之胺基酸68-84中所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg DAGAVTYQXh (SEQ ID NO:203)之BC環、具有胺基酸序列Xi GGVRXj (SEQ ID NO:135)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DYKPHADGPHTYHEYXl (SEQ ID NO:204)之FG環；其中X為任何胺基酸且g、h、i、j、k及l為獨立地選自0至5之整數。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWDAGAVTYQ(SEQ ID NO:201)之BC環、具有胺基酸序列PGGVRT(SEQ ID NO:110)之DE環及具有胺基酸序列TDYKPHADGPHTYHEYP(SEQ ID NO:202)之FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:198-200中任一者至少80%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，EGFR結合10 Fn3域係與EGF-IR結合10 Fn3域共價或非共價連接。在例示性實施例中，IGF-IR結合10 Fn3可包含具有SEQ ID NO:3之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:3之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:3之胺基酸76-83中所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，IGF-IR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xa SARLKVAXb (SEQ ID NO:46)之BC環、具有胺基酸序列Xc KNVYXd (SEQ ID NO:48)之DE環，及具有胺基酸序列Xe RFRDYQXf (SEQ ID NO:50)之FG環，其中X為任何胺基酸且a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k及l為獨立地選自0至5之整數，或其中a為2且b-f為1，或其中a-f為零。在一些實施例中，IGF-IR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，IGF-IR結合10 Fn3包含相對於SEQ ID NO:1之骨架胺基酸殘基具有在0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1之間之任何數目個取代、保守性取代、缺失或添加的10 Fn3骨架。在某些實施例中，IGF-IR結合10 Fn3相對於SEQ ID NO:3之相應環序列具有在0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1之間之任何數目個取代、保守性取代、缺失或添加。
10 Fn3 E/I結合物
本發明之一個態樣提供由抗體樣蛋白質多聚體構築之E/I結合物。在一些實施例中，抗體樣蛋白質多聚體包含至少一種EGFR結合10 Fn3與至少一種IGFIR結合10 Fn3共價或非共價連接。在某些實施例中，本文所述之E/I結合物可構築為單一多肽鏈，其中E及I次單元可為任一定向，例如自N端至C端呈E-I定向或呈I-E定向。
本發明部分係關於一項驚人發現：多個經由多肽連接子接合之10 Fn3彼此獨立地正確摺疊，保持高親和力結合，且各域保持其功能特性(例如參看實例5-10)。另外，此等基於E/I10 Fn3之結合物顯示所需生物物理學特性，諸如較少聚集及高熔融溫度(Tm )(例如參看實例4)。各實例將表徵多種基於E/I10 Fn3之結合物。例示性IGFIR結合10 Fn3以SEQ ID NO:4闡述。例示性EGFR結合10 Fn3以SEQ ID NO:6、8、52、107、113、140、155、170、185及198闡述。
在一些實施例中，E/I結合物包含EGFR結合10 Fn3及IGFIR結合10 Fn3，其獨立地具有與SEQ ID NO:1中所示之人類10 Fn3域至少40%、50%、60%、70%或80%一致之胺基酸序列。大部分可變性一般將存在於一或多個環中。
在一些實施例中，E/I結合物包含EGFR結合10 Fn3及IGFIR結合10 Fn3，其獨立地具有與SEQ ID NO:32至少70%、80%、85%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列，其中n為1-20之整數，o為1-20之整數且p為1-40之整數。在一些實施例中，n為8-12之整數，o為4-8之整數，且p為4-28之整數。在一些實施例中，n為10，o為6，且p為12。
在一些實施例中，本發明提供具有至少一個選自環BC、DE及FG之環的10 Fn3之多聚體，其相對於人類10 Fn3之相應環的序列具有改變之胺基酸序列。「改變」意謂相對於模板序列(相應人類纖維結合蛋白域)存在一或多個胺基酸序列變化且包括胺基酸添加、缺失及取代。改變胺基酸序列可經由一般核酸編碼序列之有意、無意(blind)或自發序列變異來實現，且可藉由任何技術，例如PCR、易錯PCR(error-prone PCR)或化學DNA合成，來發生。在一些實施例中，藉由以天然存在之胺基酸取代或添加天然存在之胺基酸來改變胺基酸序列。
在一些實施例中，一或多個選自BC、DE及FG之環的長度可相對於相應人類纖維結合蛋白環有所延長或縮短。詳言之，人類10 Fn3之FG環為12個殘基長，而抗體重鏈中之相應環之長度在4-28個殘基之範圍內。因此，為優化抗原結合，10 Fn3中FG環的長度可藉由長度以及序列改變以在抗原結合中獲得最大之可能可撓性及親和力。
在10 Fn3分子之一些實施例中，經改變之BC環具有多至10個胺基酸取代、多至9個胺基酸缺失、多至10個胺基酸插入，或者取代與缺失或插入之組合。在一些實施例中，經改變之DE環具有多至6個胺基酸取代、多至5個胺基酸缺失、多至14個胺基酸插入，或者取代與缺失或插入之組合。在一些實施例中，FG環具有多至12個胺基酸取代、多至11個胺基酸缺失、多至28個胺基酸插入，或者取代與缺失或插入之組合。
天然存在之10 Fn3在FG環中包含「精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸」(RGD)整合素結合基元。較佳之10 Fn3多聚體不含RGD整合素結合基元。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含a)與b)共價或非共價連接：a) EGFR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:5之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:5之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:5之胺基酸76-92中所述之胺基酸序列的FG環；b) IGFIR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:3之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:3之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:3之胺基酸76-83所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:5至少80%、90%、95%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，IGFIR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，E/I結合物包含與SEQ ID NO:20、21、23、24、90、92、101或103至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含a)與b)共價或非共價連接：a) EGFR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:7之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:7之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:7之胺基酸76-87中所述之胺基酸序列的FG環；b) IGFIR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:3之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:3之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:3之胺基酸76-83所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:7至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，IGFIR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，E/I結合物包含與SEQ ID NO:26、27、29、30、89、91、100或102至少80%、85%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含a)與b)共價或非共價連接：a) EGFR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:82之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:82之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:82之胺基酸76-87中所述之胺基酸序列的FG環；b) IGFIR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:3之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:3之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:3之胺基酸76-83所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:82至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，IGFIR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，E/I結合物包含與SEQ ID NO:53、54、87、88、98、99、104或105至少80%、85%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含a)與b)共價或非共價連接:a) EGFR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:106之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:106之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:106之胺基酸76-92中所述之胺基酸序列的FG環；b) IGFIR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:3之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:3之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:3之胺基酸76-83所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:106至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，IGFIR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，E/I結合物包含與SEQ ID NO:118-125至少80%、85%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含a)與b)共價或非共價連接：a)EGFR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:112之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:112之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:112之胺基酸76-92中所述之胺基酸序列的FG環；b) IGFIR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:3之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:3之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:3之胺基酸76-83所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:112至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，IGFIR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，E/I結合物包含與SEQ ID NO:126-133至少80%、85%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含a)與b)共價或非共價連接：a) EGFR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:141之胺基酸13-22中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:141之胺基酸43-48中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:141之胺基酸68-84中所述之胺基酸序列的FG環；b) IGFIR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:3之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:3之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:3之胺基酸76-83所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:140、141、142或300至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，IGFIR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，E/I結合物包含與SEQ ID NO:149-154至少80%、85%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含a)與b)共價或非共價連接：a)EGFR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:156之胺基酸13-22中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:156之胺基酸43-48中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:156之胺基酸68-84中所述之胺基酸序列的FG環；b)IGFIR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:3之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:3之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:3之胺基酸76-83所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:155、156、157或305至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，IGFIR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，E/I結合物包含與SEQ ID NO:158-166至少80%、85%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含a)與b)共價或非共價連接：a) EGFR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:171之胺基酸13-22中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:171之胺基酸43-48中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:171之胺基酸68-84中所述之胺基酸序列的FG環；b) IGFIR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:3之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:3之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:3之胺基酸76-83所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:170、171、172或311至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，IGFIR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，E/I結合物包含與SEQ ID NO:179-184至少80%、85%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含a)與b)共價或非共價連接：a) EGFR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:186之胺基酸13-22中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:186之胺基酸43-48中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:186之胺基酸68-84中所述之胺基酸序列的FG環；b) IGFIR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:3之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:3之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:3之胺基酸76-83所述之胺基酸序列的FG 環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:185、186、187或320至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，IGFIR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，E/I結合物包含與SEQ ID NO:192-197至少80%、85%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含a)與b)共價或非共價連接:a) EGFR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:199之胺基酸13-22中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:199之胺基酸43-48中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:199之胺基酸68-84中所述之胺基酸序列的FG環；b) IGFIR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:3之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:3之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:3之胺基酸76-83所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:198、199、200或327至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，IGFIR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:3至少80%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，E/I結合物包含與SEQ ID NO:205-210至少80%、85%、90%、95%、98%或100%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xa SARLKVAXb (SEQ ID NO:46)之BC環、具有胺基酸序列Xc KNVYXd (SEQ ID NO:48)之DE環，及具有胺基酸序列Xe RFRDYQXf (SEQ ID NO:50)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg DSGRGSYQXh (SEQ ID NO:40)之BC環、具有胺基酸序列Xi GPVHXj (SEQ ID NO:42)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DHKPHADGPHTYHEXl (SEQ ID NO:44)之FG環；其中X為任何胺基酸且a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k及l為獨立地選自0至5之整數。在一些實施例中，a、g及1為2；b-f及i-k為1；且h為零。在一些實施例中，a-1為零。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO:45)之BC環、具有胺基酸序列PRNVYT(SEQ ID No:47)之DE環，及具有胺基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO:49)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWDSGRGSYQ(SEQ ID NO:39)之BC環、具有胺基酸序列PGPVHT(SEQ ID NO:41)之DE環，及具有胺基酸序列TDHKPHADGPHTYHESP(SEQ ID NO:43)之FG環。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xa SARLKVAXb (SEQ ID NO:46)之BC環、具有胺基酸序列Xc KNVYXd (SEQ ID NO:48)之DE環，及具有胺基酸序列Xe RFRDYQXf (SEQ ID NO:50)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xm VAGAEDYQXn (SEQ ID NO:34)之BC環、具有胺基酸序列Xo HDLVXp (SEQ ID NO:36)之DE環，及具有胺基酸序列Xq DMMHVEYTEHXr (SEQ ID NO:38)之FG環；其中X為任何胺基酸且a、b、c、d、e、f、m、n、o、p、q及r獨立地為0至5之整數。在一些實施例中，a及m為2；b-f及o-r為1；且n為零。在一些實施例中，a-f及m-r為零。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO:45)之BC環、具有胺基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO:47)之DE環，及具有胺基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO:49)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWVAGAEDYQ(SEQ ID NO:33)之BC環、具有胺基酸序列PHDLVT(SEQ ID NO:35)之DE環，及具有胺基酸序列TDMMHVBYTEHP(SEQ ID NO:37)之FG環。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xa SARLKVAXb (SEQ ID NO:46)之BC環、具有胺基酸序列Xc KNVYXd (SEQ ID NO:48)之DE環，及具有胺基酸序列Xe RFRDYQXf (SEQ ID NO:50)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xs LPGKLRYQXt (SEQ ID NO:60)之BC環、具有胺基酸序列Xu HDLRXw (SEQ ID NO:62)之DE環，及具有胺基酸序列Xy NMMHVEYSEYXz (SEQ ID NO:64)之FG環；其中X為任何胺基酸且a、b、c、d、e、f、s、t、u、w、y及z獨立地為0至5之整數。在一些實施例中，a及s為2；b-f、u、w、y及z為1；且t為零。在一些實施例中，a-f、s-u、w、y及z為零。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO:45)之BC環、具有胺基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO:47)之DE環，及具有胺基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO:49)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWLPGKLRYQ(SEQ ID NO:59)之BC環、具有胺基酸序列PHDLRT(SEQ ID NO:61)之DE環，及具有胺基酸序列TNMMHVEYSEYP(SEQ ID NO:63)之FG環。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xa SARLKVAXb (SEQ ID NO:46)之BC環、具有胺基酸序列Xc KNVYXd (SEQ ID NO:48)之DE環，及具有胺基酸序列Xe RFRDYQXf (SEQ ID NO:50)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg HERDGSRQXh (SEQ ID NO:134)之BC環、具有胺基酸序列Xi GGVRXj (SEQ ID NO:135)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DYFNPTTHEYIYQTTXl (SEQ ID NO:136)之FG環；其中X為任何胺基酸且a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k及l獨立地為0至5之整數。在一些實施例中，a及g為2；b-f及i-l為1；且h為零。在一些實施例中，a-l為零。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO:45)之BC環、具有胺基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO:47)之DE環，及具有胺基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO:49)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWHERDGSRQ(SEQ ID NO:109)之BC環、具有胺基酸序列PGGVRT(SEQ ID NO:110)之DE環，及具有胺基酸序列TDYFNPTTHEYIYQTTP(SEQ ID NO:111)之FG環。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xa SARLKVAXb (SEQ ID NO:46)之BC環、具有胺基酸序列Xc KNVYXd (SEQ ID NO:48)之DE環，及具有胺基酸序列Xe RFRDYQXf (SEQ ID NO:50)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg WAPVDRYQXh (SEQ ID NO:137)之BC環、具有胺基酸序列Xi RDVYXj (SEQ ID NO:138)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DYKPHADGPHTYHESXl (SEQ ID NO:139)之FG環；其中X為任何胺基酸且a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k及l獨立地為0至5之整數。在一些實施例中，a及g為2；b-f及i-l為1；且h為零。在一些實施例中，a-l為零。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO:45)之BC環、具有胺基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO:47)之DE環，及具有胺基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO:49)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWWAPVDRYQ(SEQ ID NO:115)之BC環、具有胺基酸序列PRDVYT(SEQ ID NO:116)之DE環及具有胺基酸序列TDYKPHADGPHTYHESP(SEQ ID NO:117)之FG環。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xa SARLKVAXb (SEQ ID NO:46)之BC環、具有胺基酸序列Xc KNVYXd (SEQ ID NO:48)之DE環，及具有胺基酸序列Xe RFRDYQXf (SEQ ID NO:50)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg TQGSTHYQXh (SEQ ID NO:146)之BC環、具有胺基酸序列Xi GMVYXj (SEQ ID NO:147)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DYFDRSTHEYKYRTTX1 (SEQ ID NO:148)之FG環；其中X為任何胺基酸且a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k及l獨立地為0至5之整數。在一些實施例中，a及g為2；b-f及i-l為1；且h為零。在一些實施例中，a-l為零。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO:45)之BC環、具有胺基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO:47)之DE環，及具有胺基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO:49)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWTQGSTHYQ(SEQ ID NO:143)之BC環、具有胺基酸序列PGMVYT(SEQ ID NO:144)之DE環及具有胺基酸序列TDYFDRSTHEYKYRTTP(SEQ ID NO:145)之FG環。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xa SARLKVAXb (SEQ ID NO:46)之BC環、具有胺基酸序列Xc KNVYXd (SEQ ID NO:48)之DE環，及具有胺基酸序列Xe RFRDYQXf (SEQ ID NO:50)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg YWEGLPYQXh (SEQ ID NO:161)之BC環、具有胺基酸序列Xi RDVNXj (SEQ ID NO:162)之DE環及具有胺基酸序列Xk DWYNPDTHEYIYHTIXl (SEQ IDNO:163)之FG環；其中X為任何胺基酸且a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k及l獨立地為0至5之整數。在一些實施例中，a及g為2；b-f及i-l為1；且h為零。在一些實施例中，a-l為零。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO:45)之BC環、具有胺基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO:47)之DE環，及具有胺基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO:49)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWYWEGLPYQ(SEQ ID NO:158)之BC環、具有胺基酸序列PRDVNT(SEQ ID NO:159)之DE環，及具有胺基酸序列TDWYNPDTHEYIYHTIP(SEQ ID NO:160)之FG環。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xa SARLKVAXb (SEQ ID NO:46)之BC環、具有胺基酸序列Xc KNVYXd (SEQ ID NO:48)之DE環，及具有胺基酸序列Xe RFRDYQXf (SEQ ID NO:50)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg ASNRGTYQXh (SEQ ID NO:176)之BC環、具有胺基酸序列Xi GGVSXj (SEQ ID NO:177)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DAFNPTTHEYNYFTTX1 (SEQ ID NO:178)之FG環；其中X為任何胺基酸且a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k及l獨立地為0至5之整數。在一些實施例中，a及g為2；b-f及i-l為1；且h為零。在一些實施例中，a-l為零。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO:45)之BC環、具有胺基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO:47)之DE環，及具有胺基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO:49)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWASNRGTYQ(SEQ ID NO:173)之BC環、具有胺基酸序列PGGVST(SEQ ID NO:174)之DE環，及具有胺基酸序列TDAFNPTTHEYNYFTTP(SEQ ID NO:175)之FG環。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xa SARLKVAXb (SEQ ID NO:46)之BC環、具有胺基酸序列Xc KNVYXd (SEQ ID NO:48)之DE環，及具有胺基酸序列Xe RFRDYQXf (SEQ ID NO:50)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg DAPTSRYQXh (SEQ ID NO:190)之BC環、具有胺基酸序列Xi GGLSXj (SEQ ID NO:191)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DYKPHADGPHTYHESX1 (SEQ ID NO:139)之FG環；其中X為任何胺基酸且a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k及l獨立地為0至5之整數。在一些實施例中，a及g為2；b-f及i-l為1；且h為零。在一些實施例中，a-l為零。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO:45)之BC環、具有胺基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO:47)之DE環，及具有胺基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO:49)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWDAPTSRYQ(SEQ ID NO:188)之BC環、具有胺基酸序列PGGLST(SEQ ID NO:189)之DE環，及具有胺基酸序列TDYKPHADGPHTYHESP(SEQ ID NO:117)之FG環。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xa SARLKVAXb (SEQ ID NO:46)之BC環、具有胺基酸序列Xc KNVYXd (SEQ ID NO:48)之DE環，及具有胺基酸序列Xe RFRDYQXf (SEQ ID NO:50)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg DAGAVTYQXh (SEQ ID NO:203)之BC環、具有胺基酸序列Xi GGVRXj (SEQ ID NO:135)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DYKPHADGPHTYHEYXl (SEQ ID NO:204)之FG環；其中X為任何胺基酸且a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k及l獨立地為0至5之整數。在一些實施例中，a及g為2；b-f及i-l為1；且h為零。在一些實施例中，a-l為零。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含IGFIR結合10 Fn3與EGFR結合10 Fn3共價或非共價連接，該IGFIR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO:45)之BC環、具有胺基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO:47)之DE環，及具有胺基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO:49)之FG環；該EGFR結合10 Fn3包含具有胺基酸序列SWDAGAVTYQ(SEQ ID NO:201)之BC環、具有胺基酸序列PGGVRT(SEQ ID NO:110)之DE環，及具有胺基酸序列TDYKPHADGPHTYHEYP(SEQ ID NO:202)之FG環。
在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含a)與b)共價或非共價連接：a) IGFIR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:3之胺基酸23-29中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:3之胺基酸52-55中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:3之胺基酸77-82中所述之胺基酸序列的FG環；b) EGFR結合10 Fn3，其包含如SEQ ID NO:219-327中任一者中所述之BC、DE及FG環(例如參看圖45，其中各EGFR結合10 Fn3之BC、DE及FG環序列加下劃線)。在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質二聚體，其包含a)與b)共價或非共價連接：a) IGFIR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:3之胺基酸23-29中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO:3之胺基酸52-55中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO:3之胺基酸77-82中所述之胺基酸序列的FG環；b) EGFR結合10 Fn3，其包含具有SEQ ID NO:5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200或219-327中任一者之對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基23-30的胺基酸中所述之胺基酸序列的BC環，具有SEQ ID NO:5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200或219-327中任一者之對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基52-55的胺基酸中所述之胺基酸序列的DE環，及具有對應於SEQ ID NO:15-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200或219-327之胺基酸殘基77-86的胺基酸中所述之胺基酸序列的FG環。在一些實施例中，抗體樣蛋白質二聚體中之EGFR結合10 Fn3包含與SEQ ID NO:5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200或219-327中任一者之對應於SEQ ID NO:1之E9至SEQ ID NO:1之T94的胺基酸殘基之胺基酸序列至少80%、90%、95%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體樣蛋白質二聚體中之IGFIR結合10 Fn3具有與SEQ ID NO:3之對應於SEQ ID NO:1之E9至SEQ ID NO:1之T94的胺基酸殘基之胺基酸序列至少80%、90%、95%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，E/I結合物包含與SEQ ID NO:20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210及211-216中任一者至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。
如本文所定義之X較佳為天然存在之胺基酸。
在某些實施例中，本文所述之E結合物或者E/I結合物中之E及/或I單體可在對應於SEQ ID NO:1之絲胺酸62或絲胺酸91的位置含有使Ser成為Cys之胺基酸取代。
在某些態樣中，本發明提供介導EGFR結合之短肽序列。此等序列之實例包括對應於SEQ ID NO:5、7、82、106、112、141、156、171、186及199之BC、DE及FG環的胺基酸殘基。此等序列之其他實例包括對應於SEQ ID NO:219-327之BC、DE及FG環的胺基酸殘基。在一些實施例中，該等肽以小於500nM、100nM、50nM、5nM或5nM以下之解離常數(KD )與其各別配位體結合。此等序列可以分離之形式或當插入特定蛋白質結構(諸如免疫球蛋白域或免疫球蛋白樣域)中時介導配位體結合。
在一實施例中，抗體樣蛋白質二聚體包含具有結構A-B-C之多肽，其中A為包含結合EGFR之10 Fn3域、基本上由結合EGFR之10 Fn3域組成或由結合EGFR之10 Fn3域組成的多肽，B為多肽連接子，且C為包含結合IGF-IR之10 Fn3域、基本上由結合IGF-IR之10 Fn3域組成或由結合IGF-IR之10 Fn3域組成的多肽。在另一實施例中，抗體樣蛋白質二聚體包含具有結構A-B-C之多肽，其中A為包含結合IGF-IR之10 Fn3域、基本上由結合IGF-IR之10 Fn3域組成或由結合IGF-IR之10 Fn3域組成的多肽，B為多肽連接子，且C為包含結合EGFR之10 Fn3域、基本上由結合EGFR之10 Fn3域組成或由結合EGFR之10 Fn3域組成的多肽。具有結構A-B-C之抗體樣蛋白質二聚體之具體實例為包含以下之多肽：(i)具有SEQ ID NO:20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210及211-216中任一者中所述之胺基酸序列的多肽，或(ii)包含與SEQ ID NO:20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210及211-216中所述之胺基酸序列中任一者至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽。
在某些實施例中，A或C區為包含結合EGFR之10 Fn3域的多肽；其中10 Fn3域自N端至C端具有以下結構：β股A、環AB、β股B、環BC、β股C、環CD、β股D、環DE、β股E、環EF、β股F、環FG、β股G；其中:(i) BC環具有SEQ ID NO:33或34之胺基酸序列，DE環具有SEQ ID NO:35或36之胺基酸序列，且FG環具有SEQ ID NO:37或38之胺基酸序列；(ii)BC環具有SEQ ID NO:39或40之胺基酸序列，DE環具有SEQ ID NO:41或42之胺基酸序列，且FG環具有SEQ ID NO:43或44之胺基酸序列；(iii) BC環具有SEQ ID NO:59或60之胺基酸序列，DE環具有SEQ ID NO:61或62之胺基酸序列，且FG環具有SEQ ID NO:63或64之胺基酸序列；(iv) BC環具有SEQ ID NO:109或134之胺基酸序列，DE環具有SEQ ID NO:110或135之胺基酸序列，且FG環具有SEQ ID NO:111或136之胺基酸序列；(v) BC環具有SEQ ID NO:115或137之胺基酸序列，DE環具有SEQ ID NO:116或138之胺基酸序列，且FG環具有SEQ ID NO:117或139之胺基酸序列；(vi) BC環具有SEQ ID NO:143或146之胺基酸序列，DE環具有SEQ ID NO:144或147之胺基酸序列，且FG環具有SEQ ID NO:145或148之胺基酸序列；(vii) BC環具有SEQ ID NO:158或161之胺基酸序列，DE環具有SEQ ID NO:159或162之胺基酸序列，且FG環具有SEQ ID NO:160或163之胺基酸序列；(viii) BC環具有SEQ ID NO:173或176之胺基酸序列，DE環具有SEQ ID NO:174或177之胺基酸序列，且FG環具有SEQ ID NO:175或178之胺基酸序列；(ix) BC環具有SEQ ID NO:188或190之胺基酸序列，DE環具有SEQ ID NO:189或191之胺基酸序列，且FG環具有SEQ ID NO:117或139之胺基酸序列；(x) BC環具有SEQ ID NO:201或203之胺基酸序列，DE環具有SEQ ID NO:110或135之胺基酸序列，且FG環具有SEQ ID NO:202或204之胺基酸序列，或(xi) BC、DE及FG環具有如SEQ ID NO:219-327中任一者中所述之胺基酸序列(例如參看圖45，其中SEQ ID NO:219-327之每一者中之BC、DE及FG環加下劃線)；其中10 Fn3域摺疊成抗體重鏈可變區樣結構；且其中多肽以小於100nM之KD 與EGFR結合。結合EGFR之10 Fn3域較佳摺疊成以下結構：其中7條β股分布於相互填充從而形成穩定核心之兩個β摺疊之間，且其中β股係藉由六個暴露於溶劑之環連接。在例示性實施例中，10 Fn3域之長度為80-150個胺基酸。
在例示性實施例中，A或C區為以小於100nM之KD 結合EGFR之10 Fn3域，其具有選自由如下文所述之SEQ ID NO:83-85及466-472組成之群的序列：EVVAAT Xn1 SLLI Xa1 SWVAGAEDYQ Xa2 YYRITYGE Xn2 QEFTV Xa3 PHDLVT Xa4 ATI Xn3 DYTITVYAV Xa5 TDMMHVEYTEHP Xa6 ISINYRT (SEQ ID NO:83)；EVVAAT Xn1 SLLI Xa1 SWDSGRGSYQ Xa2 YYRITYGE Xn2 QEFTV Xa3 PGPVHT Xa4 ATI Xn3 DYTITVYAV Xa5 TDHKPHADGPHTYHESP Xa6 ISINYRT (SEQ ID NO:84)；或EVVAAT Xn1 SLLI Xa1 SWLPGKLRYQ Xa2 YYRITYGE Xn2 QEFTV Xa3 PHDLRT Xa4 ATI Xn3 DYTITVYAV Xa5 TNMMHVEYSEYP Xa6 ISINYRT (SEQ ID NO:85)。
EVVAAT Xn1 SLLI Xa1 SWHERDGSRQ Xa2 YYRITYGE Xn2 QEFTV Xa3 PGGVRT Xa4 ATI Xn3 DYTITVYAV Xa5 TDYFNPTTHEYIYQTTP Xa6 ISINYRT (SEQ ID NO:466)。
EVVAAT Xn1 SLLI Xa1 SWWAPVDRYQ Xa2 YYRITYGE Xn2 QEFTV Xa3 PRDVYT Xa4 ATI Xn3 DYTITVYAV Xa5 TDYKPHADGPHTYHESP Xa6 ISINYRT (SEQ ID NO:467)。
EVVAAT Xn1 SLLI Xa1 SWTQGSTHYQ Xa2 YYRITYGE Xn2 QEFTV Xa3 PGMVYT Xa4 ATI Xn3 DYTITVYAV Xa5 TDYFDRSTHEYKYRTTP Xa6 ISINYRT (SEQ ID NO:468)。
EVVAAT Xn1 SLLI Xa1 SWYWEGLPYQ Xa2 YYRITYGE Xn2 Q EFTV Xa3 PRDVNT Xa4 ATI Xn3 DYTITVYAV Xa5 TDWYNPDTHEYIYHTIP Xa6 ISINYRT (SEQ ID NO:469)。
EVVAAT Xn1 SLLI Xa1 SWASNRGTYQ Xa2 YYRITYGE Xn2 QEFTV Xa3 PGGVST Xa4 ATI Xn3 DYTITVYAV Xa5 TDAFNPTTHEYNYFTTP Xa6 ISINYRT (SEQ ID NO:470)。
EVVAAT Xn1 SLLI Xa1 SWDAPTSRYQ Xa2 YYRITYGE Xn2 QEFTV Xa3 PGGLST Xa4 ATI Xn3 DYTITVYAV Xa5 TDYKPHADGPHTYHESP Xa6 ISINYRT (SEQ ID NO:471)。
EVVAAT Xn1 SLLI Xa1 SWDAGAVTYQ Xa2 YYRITYGE Xn2 QEFTV Xa3 PGGVRT Xa4 ATI Xn3 DYTITVYAV Xa5 TDYKPHADGPHTYHEYP Xa6 ISINYRT (SEQ ID NO:472)。
在SEQ ID NO:83-85及466-472中，BC、DE及FG環具有如以粗體所示之固定序列，或與粗體所示之序列至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之序列，AB環係以Xn1 表示，CD環係以Xn2 表示，且EF環係以Xn3 表示，且β股A-G加下劃線。X表示任何胺基酸且X之後之下標表示胺基酸數目之整數。詳言之，n1可為在1-15、2-15、1-10、2-10、1-8、2-8、1-5、2-5、1-4、2-4、1-3、2-3或1-2之間之任何數目個胺基酸；n2及n3可各獨立地為在2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7或6-7之間之任何數目個胺基酸；且a1-a6可各獨立地包含0-10、0-5、1-10、1-5或2-5個胺基酸。在較佳實施例中，n1為2個胺基酸，n2為7個胺基酸，n3為7個胺基酸，且a1-a6為0個胺基酸。β股之序列在所有7個骨架區內相對於SEQ ID NO:1中所示之相應胺基酸可具有在0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1之間之任何數目個取代、缺失或添加。在例示性實施例中，β股之序列在所有7個骨架區內相對於SEQ ID NO:1中所示之相應胺基酸可具有在0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1之間之任何數目個保守性取代。在某些實施例中，核心胺基酸殘基為固定的且任何取代、保守性取代、缺失或添加均在除核心胺基酸殘基外之其他殘基處發生。在某些實施例中，EGFR結合物係以一個以下胺基酸序列表示:EVVAATPTSLLISW VAGAEDYQ YYRITYGETGGNSPVQEFTVP HDLV TATISGLKPGVDYTITVYAVT DMMHVEYTEH PISINYRT (SEQ ID NO:66)；EVVAATPTSLLISW DSGRGSYQ YYRITYGETGGNSPVQEFTVP GPVH TATISGLKPGVDYTITVYAVT DHKPHADGPHTYHES PISINYRT (SEQ ID NO:67)；EVVAATPTSLLISW LPGKLRYQ YYRITYGETGGNSPVQEFTVP HDLR TATISGLKPGVDYTITVYAVT NMMHVEYSEY PISINYRT (SEQ ID NO:68)；EVVAATPTSLLISW HERDGSRQ YYRITYGETGGNSPVQEFTVP GGVR TATISGLKPGVDYTITVYAVT DYFNPTTHEYIYQTT PISINYRT (SEQ ID NO:108)；或EVVAATPTSLLISW WAPVDRYQ YYRITYGETGGNSPVQEFTVP RDVY TATISGLKPGVDYTITVYAVT DYKPHADGPH TYHES PISINYRT (SEQ ID NO:114)。
EVVAATPTSLLISW TQGSTHYQ YYRITYGETGGNSPVQEFTVP GMVY TATISGLKPGVDYTITVYAVT DYFDRSTHEYKYRTT PISINYRT (SEQ ID NO:141)
EVVAATPTSLLISW YWEGLPYQ YYRITYGETGGNSPVQEFTV PRDVN TATISGLKPGVDYTITVYAVT DWYNPDTHEYIYHTI PISINYRT (SEQ ID NO:156)
EVVAATPTSLLISW ASNRGTYQ YYRITYGETGGNSPVQEFTVP GGVS TATISGLKPGVDYTITVYAVT DAFNPTTHEYNYFTT PISINYRT (SEQ ID NO:171)
EVVAATPTSLLISW DAPTSRYQ YYRITYGETGGNSPVQEFTVP GGLS TATISGLKPGVDYTITVYAVT DYRPHADGPHTYHES PISINYRT (SEQ ID NO:186)
E112
EVVAATPTSLLISW DAGAVTYQ YYRITYGETGGNSPVQEFTVP GGVR TATISGLKPGVDYTITVYAVT DYKPHADGPHTYHEY PISINYRT (SEQ ID NO:199)
在SEQ ID NO:66-68、108、114、141、156、171、186及199中，BC、DE及FG環之序列具有如以粗體所示之固定序列，或與粗體所示之序列至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之序列，且剩餘加下劃線之序列(例如7條β股以及AB、CD且EF環之序列)相對於SEQ ID NO:66-68、108、114、141、156、171、186及199中所示之相應胺基酸具有在0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1之間之任何數目個取代、保守性取代、缺失或添加。在某些實施例中，核心胺基酸殘基為固定的且任何取代、保守性取代、缺失或添加均在除核心胺基酸殘基外之其他殘基處發生。結合EGFR之10 Fn3域可視情況包含1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2或1個胺基酸長之N端延伸。例示性N端延伸包括(以單字母胺基酸編碼表示) M、MG、G、MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:69)、GVSDVPRDL(SEQ ID NO:70)及VSDVPRDL(SEQ ID NO:71)，或SEQ ID NO 69、70或71中任一者之N端截短。其他適合之N端延伸包括例如Xn SDVPRDL(SEQ ID NO:72)、Xn DVPRDL(SEQ ID NO:73)、Xn VPRDL(SEQ ID NO:74)、Xn PRDL(SEQ ID NO:75)、Xn RDL(SEQ ID NO:76)、Xn DL(SEQ ID NO:77)或Xn L，其中n=0、1或2個胺基酸，其中當n=1時，X為Met或Gly，且當n=2時，X為Met-Gly。結合EGFR之10 Fn3域可視情況包含C端尾。例示性C端尾包括1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2或1個胺基酸長之多肽。C端尾之具體實例包括EIDKPSQ(SEQ ID NO:9)、EIDKPCQ(SEQ ID NO:10)及EIDK(SEQ ID NO:78)。在其他實施例中，適合之C端尾可為SEQ ID NO:9、10或78之C端截短片段，包括例如一個以下胺基酸序列(以單字母胺基酸編碼表示)：E、EI、EID、EIDKP(SEQ ID NO:79)、EIDKPS(SEQ ID NO:80)或EIDKPC(SEQ ID NO:81)。其他適合之C端尾包括例如ES、EC、EGS、EGC、EGSGS(SEQ ID NO:96)、EGSGC(SEQ ID NO:97)或EIEK(SEQ ID NO:217)。在某些實施例中，結合EGFR之10 Fn3域包含N端延伸與C端尾。在例示性實施例中，A區包含以Gly或Met-Gly開始之N端延伸及不含半胱胺酸殘基之C端延伸，且B區包含不以Met起始之N端延伸及包含半胱胺酸殘基之C端延伸。結合EGFR之10 Fn3域之具體實例為多肽，包含(i)具有SEQ ID NO:5-8、52、66-68、82-85、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、185-187、198-200及219-327中任一者中所述之胺基酸序列的多肽，或(ii)包含與SEQ ID NO:5-8、52、66-68、82-85、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、185-187、198-200及219-327中任一者中所述之胺基酸序列至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽。
在某些實施例中，A或C區為包含結合IGF-IR之10 Fn3域之多肽，其中10 Fn3域自N端至C端具有以下結構：β股A、環AB、β股B、環BC、β股C、環CD、β股D、環DE、β股E、環EF、β股F、環FG、β股G，其中BC環具有SEQ ID NO:45或46之胺基酸序列，DE環具有SEQ ID NO:47或48之胺基酸序列，且FG環具有SEQ ID NO:49或50之胺基酸序列，其中10 Fn3域摺疊成抗體重鏈可變區樣結構，且其中多肽以小於100nM之KD 與IGF-IR結合。結合IGF-IR之10 Fn3域較佳摺疊成以下結構：其中7條β股分布於相互毗鄰堆疊從而形成穩定核心之兩個β摺疊之間，且其中β股係藉由六個暴露於溶劑之環連接。在例示性實施例中，10 Fn3域之長度為80-150個胺基酸。
在例示性實施例中，A或C區為以小於100nM之KD 與IGF-IR結合10 Fn3域，其具有下文所述之序列：EVVAAT Xn1 SLLI Xa1 SWSARLKVAR Xa2 YYRITYGE Xn2 QEFTV Xa3 PKNVYT Xa4 ATI Xn3 DYTITVYAV Xa5 TRFRDYQP Xa6 ISINYRT (SEQ ID NO:86)。
在SEQ ID NO:86中，BC、DE及FG環具有如以粗體所示之固定序列，或與粗體所示之序列至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之序列，AB環係以Xn1 表示，CD環係以Xn2 表示，且EF環係以Xn3 表示，且β股A-G加下劃線。X表示任何胺基酸且X之後之下標表示胺基酸數目之整數。詳言之，n1可為在1-15、2-15、1-10、2-10、1-8、2-8、1-5、2-5、1-4、2-4、1-3、2-3或1-2之間之任何數目個胺基酸；n2及n3可各獨立地為在2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7或6-7之間之任何數目個胺基酸；且a1-a6可各獨立地包含0-10、0-5、1-10、1-5或2-5個胺基酸。在較佳實施例中，n1為2個胺基酸，n2為7個胺基酸，n3為7個胺基酸，且a1-a6為0個胺基酸。β股之序列在所有7個骨架區內相對於SEQ ID NO:1中所示之相應胺基酸可具有在0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1之間之任何數目個取代、缺失或添加。在例示性實施例中，β股之序列在所有7個骨架區內相對於SEQ ID NO:1中所示之相應胺基酸可具有在0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1之間之任何數目個保守性取代。在某些實施例中，核心胺基酸殘基為固定的且任何取代、保守性取代、缺失或添加均在除核心胺基酸殘基外之其他殘基處發生。在某些實施例中，IGF-IR結合物係以以下胺基酸序列表示：EVVAATPTSLLISW SARLKVA RYYRITYGETGGNSPVOEFTVP KNVY TATISGLKPGVDYTTTVYAVT RFRDYQ PISINYRT (SEQ ID NO:65)。
在SEQ ID NO:65中，BC、DE及FG環之序列具有如以粗體所示之固定序列，或與粗體所示之序列至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之序列，且剩餘加下劃線之序列(例如7條β股以及AB、CD及EF環之序列)相對於SEQ ID NO:65中所示之相應胺基酸具有在0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2或0至1之間之任何數目個取代、保守性取代、缺失或添加。在某些實施例中，核心胺基酸殘基為固定的且任何取代、保守性取代、缺失或添加均在除核心胺基酸殘基外之其他殘基處發生。結合IGF-IR 之10 Fn3域可視情況包含1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2或1個胺基酸長之N端延伸。例示性N端延伸包括(以單字母胺基酸編碼表示) M、MG、G、MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:69)、GVSDVPRDL(SEQ ID NO:70)及VSDVPRDL(SEQ ID NO:71)，或SEQ ID NO:69、70或71中任一者之N端截短。其他適合之N端延伸包括例如Xn SDVPRDL(SEQ ID NO:72)、Xn DVPRDL(SEQ ID NO:73)、Xn VPRDL(SEQ ID NO:74)、Xn PRDL(SEQ ID NO:75)、Xn RDL(SEQ ID NO:76)、Xn DL(SEQ ID NO:77)或Xn L，其中n=0、1或2個胺基酸，其中當n=1時，X為 Met或Gly，且當n=2時，X為Met-Gly。結合IGF-IR之10 Fn3域可視情況包含C端尾。例示性C端尾包括1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、1-2或1個胺基酸長之多肽。C端尾之具體實例包括EIDKPSQ(SEQ ID NO:9)、EIDKPCQ(SEQ ID NO:10)及EIDK(SEQ ID NO:78)。在其他實施例中，適合之C端尾可為SEQ ID NO:9、10或78之C端截短片段，包括例如一個以下胺基酸序列(以單字母胺基酸編碼表示)：E、EI、EID、EIDKP(SEQ ID NO:79)、EIDKPS(SEQ ID NO:80)或EIDKPC(SEQ ID NO:81)。其他適合之C端尾包括例如ES、EC、EGS、EGC、EGSGS(SEQ ID NO:96)、EGSGC(SEQ ID NO:97)或EIEK(SEQ ID NO:217)。在某些實施例中，結合IGF-IR之10 Fn3域包含N端延伸與C端尾。在例示性實施例中，A區包含以Gly或Met-Gly開始之N端延伸及不含半胱胺酸殘基之C端延伸，且B區包含不以Met起始之N端延伸及包含半胱胺酸殘基之C端延伸。結合IGF-IR之10 Fn3域之具體實例為多肽，包含(i)具有SEQ ID NO:3、4、65或86中任一者中所述之胺基酸序列的多肽，或(ii)包含與SEQ ID NO:3、4、65或86中任一者中所述之胺基酸序列至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽。
B區為如在本文中進一步描述之連接子。在例示性實施例中，B區為多肽連接子。例示性多肽連接子包括具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3或1-2個胺基酸之多肽。適合之多肽連接子的具體實例將於本文中進一步描述，且包括例如具有選自由SEQ ID NO:11-19、51、93-95及218組成之群之序列的連接子。在某些實施例中，連接子可為如本文所述之C端尾多肽、如本文所述之N端延伸多肽，或其組合。
在一實施例中，抗體樣蛋白質二聚體包含具有結構X1 -A-X2 -B-X3 -C-X4 之多肽，其中X1 為視情況選用之N端延伸，A為結合EGFR之10 Fn3域，X2 為視情況選用之C端尾，B為多肽連接子，X3 為視情況選用之N端延伸，C為結合IGF-IR之10 Fn3域，且X4 為視情況選用之C端尾。在另一實施例中，抗體樣蛋白質二聚體包含具有結構X1 -A-X2 -B-X3 -C-X4 之多肽，其中X1 為視情況選用之N端延伸，A為結合IGF-IR之10 Fn3域，X2 為視情況選用之C端尾，B為多肽連接子，X3 為視情況選用之N端延伸，C為結合EGFR之10 Fn3域，且X4 為視情況選用之C端尾。適合之N端延伸及C端尾之具體實例如上文所述。在某些實施例中，X1 、X2 、B、X3 或X4 中一或多者可包含適於聚乙二醇化之胺基酸殘基，諸如半胱胺酸或離胺酸殘基。在例示性實施例中，X4 包含至少一個適於聚乙二醇化之胺基酸，諸如半胱胺酸或離胺酸殘基。下文將進一步描述適合之多肽連接子的具體實例。具有結構X1 -A-X2 -B-X3 -C-X4 之抗體樣蛋白質二聚體之具體實例為多肽，包含(i)具有SEQ ID NO:20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210及211-216中任一者中所述之胺基酸序列的多肽，或(ii)包含與SEQ ID NO:20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210及211-216中任一者中所述之胺基酸序列至少85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽。
在某些實施例中，可能需要調整本文所述之抗體樣蛋白質二聚體中一個10 Fn3結合域相對於另一10 Fn3結合域之效能。舉例而言，若第一10 Fn3域之結合親和力明顯高於第二10 Fn3域之結合親和力，則第一10 Fn3域之生物作用可蓋過第二10 Fn3域之作用。因此，在某些實施例中，可能需要抗體樣蛋白質二聚體中第一與第二10 Fn3域之結合親和力彼此類似，例如彼此結合親和力差異在100倍、30倍、10倍、3倍、1倍、0.3倍或0.1倍內，或彼此結合親和力差異在0.1倍至10倍內、在0.3倍至10倍內、在0.1倍至3倍內、在0.3倍至3倍內、在0.1倍至1倍內、在0.3倍至1倍內、在1倍至10倍內、在3倍至10倍內、在3倍至30倍內，或在1倍至3倍內。
結合
抗體樣蛋白質多聚體可經共價或非共價連接。在一些實施例中，EGFR結合10 Fn3可與IGFIR結合10 Fn3直接連接，或經由多肽連接子間接連接。接合Fn3之適合連接子為允許單獨域彼此獨立地摺疊形成允許高親和力結合靶分子之三維結構的連接子。
本發明提供許多滿足此等要求之適合連接子，包括基於甘胺酸-絲胺酸之連接子、基於甘胺酸-脯胺酸之連接子，以及具有胺基酸序列PSTSTST(SEQ ID NO:12)之連接子。本文所述之實例顯示，經由多肽連接子接合之Fn3域保留其靶結合功能。在一些實施例中，連接子為基於甘胺酸-絲胺酸之連接子。此等連接子包含甘胺酸及絲胺酸殘基，且長度可在8與50、10與30及10與20個胺基酸之間。實例包括具有胺基酸序列GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS(SEQ ID NO:11)、GSGSGSGSGS(SEQ ID NO:13)、GGGGS GGGGS GGGGS(SEQ ID NO:14)、GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS(SEQ ID NO:15)、GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS(SEQ ID NO:16)或GGGGSGGGGSGGGSG(SEQ ID NO:17)之連接子。在一些實施例中，連接子為基於甘胺酸-脯胺酸之連接子。此等連接子包含甘胺酸及脯胺酸殘基，且長度可在3與30、10與30及3與20個胺基酸之間。實例包括具有胺基酸序列GPGPGPG(SEQ ID NO:18)、GPGPGPGPGPG(SEQ ID NO:19)及GPG(SEQ ID NO:51)之連接子。在一些實施例中，連接子為基於脯胺酸-丙胺酸之連接子。此等連接子包含脯胺酸及丙胺酸殘基，且長度可在3與30、10與30、3與20及6與18個胺基酸之間。此等連接子之實例包括SEQ ID NO:93、94及95。預期最佳連接子長度及胺基酸組成可藉由此項技術中熟知之方法藉由常規實驗確定。
在一些實施例中，抗體樣蛋白質多聚體係經由具有可經血液或靶組織中之蛋白酶裂解之蛋白酶位點的多肽連接子連接。此等實施例可用以釋放兩種或兩種以上治療性蛋白質以達成比單獨產生此等蛋白質更好之傳遞或治療特性或者更有效之製造。
可將其他連接子或間隔子(例如SEQ ID NO:9及10)引入Fn3域與多肽連接子之間Fn3域之C端。其他連接子或間隔子可引入Fn3域與多肽連接子之間Fn3域之N端。
在一些實施例中，抗體樣蛋白質多聚體可直接連接，或經由聚合連接子間接連接。聚合連接子可用以最佳地改變各蛋白質部分之間的距離，從而產生具有以下一或多種特徵之蛋白質：1)當與相關蛋白質結合時具有減小或增加之一或多種蛋白質域之結合位阻；2)較高之蛋白質穩定性或溶解度；3)較少之蛋白質聚集；及4)較高之蛋白質總體親合力(avidity)或親和力。
在一些實施例中，抗體樣蛋白質多聚體係經由生物相容性聚合物(諸如聚合糖)連接。聚合糖可包括可經血液或靶組織中之酶裂解的酶促裂解位點。此等實施例可用以釋放兩種或兩種以上治療性蛋白質，以達成比單獨產生此等蛋白質更好之傳遞或治療特性或者更有效之製造。
在一些實施例中，抗體樣蛋白質多聚體係經由聚氧化烯、特定言之聚乙二醇(PEG)部分連接。抗體樣蛋白質可包含含有半胱胺酸之連接子，諸如SEQ ID NO:10、81、97或218中所述之連接子。PEG可與連接子序列中之半胱胺酸部分結合且可操作性連接兩個域。
藥物動力學部分
在一態樣中，本發明提供進一步包含藥物動力學(PK)部分之E結合物及E/I結合物。在一些實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質多聚體，特定言之，EGFR結合10 Fn3與IGFIR結合10 Fn3之二聚體。可根據所感知之治療需求來評定藥物動力學之改良。經常需要提高生物可用性及/或增加各給藥之間的時間，其可能藉由增加給藥後蛋白質在血清中保持可用之時間實現。在一些情況下，需要改良血清蛋白質濃度隨時間流逝之持續性(例如減小在投與之後不久與下次投與之前不久的血清蛋白質濃度之差異)。E結合物及E/I結合物可連接至使多肽在哺乳動物(例如小鼠、大鼠或人類)中之清除率相對於未經修飾之多肽降低超過三倍的部分。藥物動力學改良之其他量度可包括血清半衰期，其經常分成α期及β期。任一期或兩期均可藉由添加適當部分得到顯著改良。
傾向於自血液緩慢清除蛋白質之部分包括聚環氧烷部分(例如聚乙二醇)；糖(例如唾液酸)；及耐受性良好之蛋白質部分(例如Fc、Fc片段、運鐵蛋白或血清白蛋白)。
在一些實施例中，PK部分為血清白蛋白結合蛋白，諸如美國公開案第2007/0178082號及第2007/0269422號中所述者。
在一些實施例中，PK部分為血清免疫球蛋白結合蛋白，諸如美國公開案第2007/0178082號中所述者。
在一些實施例中，PK部分為聚乙二醇(PEG)。
PK修飾之抗體樣蛋白質多聚體之血清清除率相對於未經修飾之E/I結合物之清除率可降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或甚至90%。PK修飾之多聚體可具有相對於未經修飾之多聚體之半衰期增加的半衰期(t1/2 )。PK結合多肽之半衰期相對於未經修飾多聚體之半衰期可增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或500%，或甚至1000%。在一些實施例中，多聚體半衰期係在活體外(諸如在緩衝生理鹽水溶液或血清中)測定。在其他實施例中，多聚體半衰期為活體內半衰期，諸如在動物之血清或其他體液中多聚體之半衰期。
在一些實施例中，PK部分係經由至少一個雙硫鍵、肽鍵、多肽、聚合糖或聚乙二醇部分與抗體樣蛋白質多聚體連接。例示性多肽連接子包括PSTSTST(SEQ ID NO:12)、EIDKPSQ(SEQ ID NO:9)及諸如GSGSGSGSGS(SEQ ID NO:13)之GS連接子，及其多聚體。
結合/篩選
本發明提供E結合物及E/I結合物，特定言之抗體樣蛋白質多聚體，諸如EGFR結合10 Fn3與IGFIR結合10 Fn3之二聚體。可以平衡常數(例如解離常數KD )及動力學常數(例如締合速率常數kon 及解離速率常數koff )評定與EGFR或IGFIR之結合。在一些實施例中，抗體樣蛋白質單體或多聚體將以小於500nM、100nM、50nM、5nM或5nM以下之KD 與EGFR結合。在一些實施例中，抗體樣蛋白質單體或多聚體將以小於500nM、100nM、50nM、5nM或5nM以下之KD 與IGFIR結合。當koff 足夠低或kon 足夠高時，可容許較高KD 值。
E結合物及E/I結合物可與EGFR之任何部分(包括EGFR之細胞外域，特定言之EGFR之配位體結合域)結合。E結合物及E/I結合物與EGFR之結合可破壞EGFR與一或多種配位體(包括TGF-α及EGF)之相互作用，且/或破壞受體二聚化。在一些實施例中，E結合物及E/I結合物與抗EGFR抗體競爭結合EGFR。抗EGFR抗體可選自任何已知抗EGFR抗體，包括帕尼單抗(panitumumab；Amgen)、尼妥珠單抗(nimotuzumab；YM Biosciences)、紮魯單抗(zalutumumab；Genmab)、EMD72000(Merck KGaA)及西妥昔單抗(cetuximab；ImClone Systems)。
在一些實施例中，E結合物及E/I結合物抑制EGFR之下游信號傳導。EGFR配位體結合引起同型二聚體或異型二聚體受體與EGFR或另一HER家族成員之二聚化。二聚化促進受體自體磷酸化，而這又使若干信號傳導路徑活化。
E/I結合物可與IGFIR之任何部分(包括IGFIR之細胞外域，特定言之IGFIR之配位體結合域)結合。E/I結合物與IGFIR之結合可破壞IGFIR與一或多種配位體(例如IGF-I及IGF-II)之相互作用，且/或破壞受體異型四聚體之組裝。在一些實施例中，E/I結合物與抗IGFIR抗體競爭結合IGFIR。抗IGFIR抗體可選自任何已知抗IGFIR抗體。
在一些實施例中，E/I結合物抑制IGFIR之下游信號傳導。IGF-I受體由兩種類型之次單元構成：α次單元(完全在細胞外且在配位體結合中起作用之130-135kDa蛋白質)及β次單元(95kDa跨膜蛋白，具有跨膜及細胞質域)。IGFIR最初係以單鏈前受體多肽形式合成，其經糖基化、蛋白質水解裂解及共價鍵結加工而組裝成包含兩個α次單元及兩個β次單元之成熟460kDa異型四聚體。β次單元具有配位體活化之酪胺酸激酶活性。
EGFR及IGFIR受體信號傳導獨立地活化MAPK路徑，包括MEK之磷酸化。另一活化路徑為磷脂醯肌醇-3激酶(PI3K)路徑，包括AKT之磷酸化。受體信號傳導轉導至核，使得各種轉錄因子活化。
篩選檢定可經設計以鑑別及表徵E結合物及E/I結合物。諸如表面電漿共振及ELISA之結合檢定，及偵測經活化信號傳導路徑之檢定在此項技術中為熟知的，例如參看實例5。已製造出各種與EGFR及IGFIR之磷酸化、活性同功異型物專一性結合之抗體(包括許多市售抗體)，例如參看實例6及7。下游信號傳導事件亦可用作受體抑制之指標，諸如藉由量測AKT磷酸化之程度，例如參看實例8。細胞增殖檢定亦為表徵候選E/I結合物結合及抑制EGFR及IGFIR信號傳導之能力的有用方法，例如參看實例9。
聚合物結合
與生物相容性聚合物結合可用以連接抗體樣蛋白質多聚體且/或改良蛋白質之藥物動力學。選擇聚合物之身分、尺寸及結構以便改良多聚體之循環半衰期，或降低多聚體之抗原性而無不可接受之活性降低。
適用於本發明中之聚合物的實例包括(但不限於)聚(烷二醇)，諸如聚乙二醇(PEG)。聚合物不限於特定結構且可為線性的(例如烷氧基PEG或雙官能PEG)，或為非線性的，諸如呈分支、分叉、多枝(例如與多元醇核心連接之PEG)及樹突狀。
PEG及其他水溶性聚合物(亦即聚合試劑)通常經適於與多肽上之所需位點偶合之適合活化基團活化。因此，聚合試劑將具有可與多肽反應之反應性基團。使此等聚合物與活性部分結合之代表性聚合試劑及方法在此項技術中為熟知的且進一步描述於Zalipsky,S等人，「Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides」,Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications,J. M. Harris,Plenus Press,New York(1992)，及Zalipsky(1995) Advanced Drug Reviews 16:157-182中。
聚合物之重量平均分子量通常為約100道爾頓(Dalton)至約150,000道爾頓。生物相容性聚合物之例示性重量平均分子量包括約20,000道爾頓、約40,000道爾頓、約60,000道爾頓及約80,000道爾頓。亦可使用具有任何前述總分子量之分支型式的生物相容性聚合物。
在一些實施例中，聚合物為PEG。PEG為熟知之水溶性聚合物，其為市售的或可根據此項技術中熟知之方法藉由乙二醇開環聚合製備(Sandler及Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York,第3卷，第138-161頁)。術語「PEG」廣泛用以涵蓋任何聚乙二醇分子，而不論尺寸或PEG末端修飾如何，且可以下式表示：X-O(CH2 CH2 O)n-1 CH2 CH2 OH，其中n為20至2300且X為H或末端修飾，例如C1-4 烷基。PEG可含有結合反應必需之其他化學基團，其可由分子之化學合成產生；或其充當使分子各部分保持最佳距離的間隔子。另外，此類PEG可由一或多條連接在一起之PEG側鏈組成。具有一條以上PEG鏈之PEG稱為多枝或分支PEG。分支PEG例如描述於歐洲公開申請案第473084A號及美國專利第5，932，462號中。
為實現聚合物分子與多肽之共價連接，聚合物分子之羥基端基必須以活化形式(亦即具有反應性官能基)提供。經活化聚合物分子宜為市售，例如來自Nektar Therapeutics,Inc.,Huntsville,Ala.,USA；PolyMASC Pharmaceuticals plc,UK；或SunBio Corporation,Anyang City,South Korea。或者，可藉由此項技術中已知之習知方法(例如揭示於WO 90/13540中之方法)活化聚合物分子。經活化PEG聚合物之具體實例包括以下線性PEG：NHS-PEG、SPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PEG、SG-PEG、SCM-PEG、NOR-PEG、BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、OPSS-PEG、IODO-PEG及MAL-PEG，以及分支PEG，諸如PEG2-NHS、PEG2-MAL，及美國專利第5,932,462號及美國專利第5,643,575號中所揭示者，該兩個專利均係以引用的方式併入本文中。
在PEG分子與抗體樣蛋白質多聚體上之半胱胺酸殘基結合的一些實施例中，半胱胺酸殘基為蛋白質原生的，而在其他實施例中，一或多個半胱胺酸殘基係經工程改造至蛋白質中。可將突變引入蛋白質編碼序列中以產生半胱胺酸殘基。此可例如藉由使一或多個胺基酸殘基突變為半胱胺酸來達成。突變為半胱胺酸殘基之較佳胺基酸包括絲胺酸、蘇胺酸、丙胺酸及其他親水殘基。欲突變為半胱胺酸之殘基較佳為表面暴露殘基。此項技術中熟知基於一級序列或蛋白質預測殘基之表面可達性之演算法。或者，可藉由比較結合多肽之胺基酸序列來預測表面殘基，假定基於所設計及發展之結合多肽之構架的晶體結構已得到解決(參看Himanen等人，Nature.(2001)20-27;414(6866):933-8)，且由此鑑別出表面暴露殘基。在一些實施例中，將半胱胺酸殘基引入抗體樣蛋白質多聚體之N端及/或C端，或N端及/或C端附近，或環區內。半胱胺酸殘基之聚乙二醇化可使用例如PEG-馬來醯亞胺、PEG-乙烯基碸、PEG-碘乙醯胺或PEG-二硫化正吡啶進行。
在一些實施例中，聚乙二醇化抗體樣蛋白質多聚體包含PEG分子與N端胺基酸之α胺基共價連接。位點專一性N端還原胺化描述於Pepinsky等人，(2001) JPET,297,1059及美國專利第5,824,784號中。使用PEG-醛利用其他可用親核胺基還原胺化蛋白質描述於美國專利第4,002,531號；Wieder等人，(1979) J. Biol. Chem. 254,12579，及Chamow等人，(1994) Bioconjugate Chem. 5,133中。
在另一實施例中，聚乙二醇化抗體樣蛋白質多聚體包含一或多個PEG分子與連接子共價連接，該連接子又與結合多肽N端胺基酸殘基之α胺基連接。此方法揭示於美國公開案第2002/0044921號及PCT公開案第WO 94/01451號中。
在一些實施例中，抗體樣蛋白質多聚體之C端經聚乙二醇化。可藉由在C端引入疊氮基-甲硫胺酸且隨後經由施陶丁格反應(Staudinger reaction)結合甲基-PEG-三芳基膦化合物，來使蛋白質C端聚乙二醇化。此C端結合法描述於Cazalis等人，C-Terminal Site-Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity,Bioconjug Chem. 2004;15(5):1005-1009中。
可使用此項技術中已知之習知分離及純化技術來純化聚乙二醇化抗體樣蛋白質多聚體，該等技術諸如尺寸排除法(例如凝膠過濾法)及離子交換層析法。亦可使用SDS-PAGE分離產物。可分離之產物包括單-、二-、三-、多聚乙二醇化及未聚乙二醇化之結合多肽，以及游離PEG。可藉由彙集溶離峰周圍較寬範圍之溶離份來控制單-PEG結合物之百分比，以增加組合物中單-PEG之百分比。約百分之九十之單-PEG結合物呈現產率與活性之良好平衡。
在一些實施例中，聚乙二醇化抗體樣蛋白質多聚體較佳保留至少約25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%之與未經修飾蛋白質相關之生物活性。在一些實施例中，生物活性係指如藉由KD 、kon 或koff 評定之其與EGFR及IGFIR結合之能力。在一些實施例中，聚乙二醇化抗體樣蛋白質多聚體展示相對於未聚乙二醇化蛋白質增加之與EGFR及/或IGFIR之結合。
結合多肽之脫免疫化
可改變E結合物及E/I結合物、特定言之抗體樣蛋白質多聚體(諸如EGFR結合10 Fn3與IGFIR結合10 Fn3之二聚體)之胺基酸序列以消除一或多個B細胞或T細胞抗原決定基。可使蛋白質或蛋白質多聚體脫免疫化以使既定物質不具免疫原性，或具有較小免疫原性。可經由蛋白質之結構變化達成脫免疫化。可採用熟習此項技術者已知之任何脫免疫化技術，例如參看WO 00/34317，其揭示內容係全文併入本文中。
在一實施例中，可分析E結合物及E/I結合物序列中第II類MHC結合基元之存在。舉例而言，可用MHC結合基元之資料庫，例如藉由在全球資訊網sitewehil.wehi.edu.au上搜索「基元」資料庫，來進行比較。或者，可使用套絲計算法(computational threading method)，諸如Altuvia等人設計之方法(J. Mol. Biol. 249 244-250(1995)，來鑑別第II類MHC結合肽，藉此測試來自該多肽之連續重疊肽與第II類MHC蛋白質之結合能。結合預測計算演算法包括iTopeTM 、Tepitope、SYFPEITHI、EpiMatrix(EpiVax)及MHCpred。為了輔助鑑別第II類MHC結合肽，可搜索與成功提供之肽有關的相關序列特徵，諸如兩親性(amphipathicity)及Rothbard基元，以及組織蛋白酶B及其他加工酶之裂解位點。
在鑑別出可能之(例如人類) T細胞抗原決定基之後，接著藉由視需要改變一或多個胺基酸以消除T細胞抗原決定基，來消除此等抗原決定基。此通常會涉及改變T細胞抗原決定基本身內之一或多個胺基酸。此可涉及改變蛋白質一級結構中與抗原決定基相鄰之胺基酸，或在一級結構中不相鄰但在該分子之二級結構中相鄰之胺基酸。所涵蓋之常見改變為胺基酸取代，但在某些情形中胺基酸添加或缺失有可能為適當的。所有改變均可藉由重組DNA技術實現，以致可藉由重組宿主表現(例如藉由公認方法)來製備最終分子，但亦可使用蛋白質化學或任何其他分子改變方式。
在移除所鑑別之T細胞抗原決定基後，即可再次分析脫免疫化之序列以確保未產生新T細胞抗原決定基，且若其已產生，則可使抗原決定基缺失。
並非所有以計算方式鑑別之T細胞抗原決定基均需移除。熟習此項技術者應瞭解特定抗原決定基之「強度」或確切言之潛在免疫原性之重要性。各種計算方法將產生潛在抗原決定基之分數。熟習此項技術者將認識到可能僅需移除得分高的抗原決定基。熟習此項技術者亦將認識到在移除潛在抗原決定基與保持蛋白質之結合親和力之間存在一個平衡。因此，一個策略為在該蛋白質中依次引入取代且接著測試抗原結合及免疫原性。
在一態樣中，脫免疫化蛋白質之免疫原性比人類個體中之原始蛋白質低(或確切言之，引發較少之HAMA反應)。測定免疫原性之檢定剛好在熟習此項技術者之知識範疇內。可進行技術認可之測定免疫反應之方法以監測特定個體中或在臨床試驗期間之HAMA反應。可在投與該療法開始時及在該療法投與之整個過程中評定投與脫免疫化蛋白質之個體之免疫原性。例如藉由使用此項技術者已知之方法(包括表面電漿共振技術(BIAcore)及/或固相ELISA分析)偵測個體之血清樣本中脫免疫化蛋白質之抗體來量測HAMA反應。另外，經設計以量測T細胞活化事件之活體外檢定亦可指示免疫原性。
其他修飾
在某些實施例中，E結合物及E/I結合物、特定言之抗體樣蛋白質多聚體(諸如EGFR結合10 Fn3與IGFIR結合10 Fn3之二聚體)可進一步包含轉譯後修飾。例示性轉譯後蛋白質修飾包括磷酸化、乙醯化、甲基化、ADP-核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、類泛素化(sumoylation)、生物素化或者添加多肽側鏈或疏水基團。因此，經修飾E結合物及E/I結合物可含有非胺基酸元件，諸如脂質、多醣或單醣及磷酸鹽。糖基化之較佳形式為唾液酸化，其使一或多個唾液酸部分與多肽結合。唾液酸部分將改良溶解度及血清半衰期，同時亦降低蛋白質之可能之免疫原性。例如參看Raju等人Biochemistry. 2001年7月31日；40(30):8868-76。可針對此等非胺基酸元件在EGFR及IGFIR信號傳導功能中之拮抗作用，來測試其對E結合物或E/I結合物之功能性的影響。
在一些實施例中，E結合物及E/I結合物經修飾以增強抗原依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。在一些實施例中，E/I結合物為EGFR結合10 Fn3與IGFIR結合10 Fn3之二聚體，其進一步包含Fc區。在一些實施例中，Fc區為增強ADCC或CDC之變異體。Fc區變異體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，該序列在一或多個胺基酸位置，包括位置256、290、298、312、326、330、333、334、360、378或430，包含胺基酸修飾(例如取代)，其中Fc區中殘基之編號為如Kabat中之EU指數進行之編號。
載體及聚核苷酸實施例
本發明亦包括編碼任何本文所述之蛋白質的核酸序列。如熟習此項技術者所瞭解，因為第三鹼基具有簡幷性，所以編碼核苷酸序列中之幾乎每一個胺基酸均可以一個以上三聯密碼子表示。另外，少量鹼基對之變化可能會引起所編碼之胺基酸序列之保守性取代，但預期此實質上不會改變基因產物之生物活性。因此，編碼本文所述之蛋白質之核酸序列的序列可略經修飾，而仍能編碼其各別基因產物。
編碼本文所述之E/I結合物的例示性核酸包括具有SEQ ID NO:442-465之核酸，或具有與SEQ ID NO:442-465中任一者至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致序列的核酸。因遺傳密碼之簡併性而不同於SEQ ID NO:442-465中所述核酸的經分離核酸亦在本發明之範疇內。亦提供包含一種由與SEQ ID NO:328至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列編碼之I單體的E/I結合物，及/或包含一種由與SEQ ID NO:329-441或495中任一者80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列編碼之E單體的E/I結合物。亦提供由一種與SEQ ID NO:329-441或495中任一者80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致之核苷酸序列編碼之E結合物。在某些實施例中，編碼E/I結合物、E單體或I單體之核苷酸序列不含編碼6XHis標籤之序列。
編碼本文所揭示之多種蛋白質或多肽中任一種之核酸可以化學方式合成。可選擇密碼子使用以改良細胞中之表現。此密碼子使用將視所選細胞類型而定。已研發出大腸桿菌及其他細菌，以及哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞及昆蟲細胞專有的密碼子使用型式。參看例如Mayfield等人，Proc Natl Acad Sci USA. 2003 100(2):438-42；Sinclair等人，Protein Expr Purif. 2002(1):96-105；Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001(5):446-9；Makrides等人，Microbiol Rev. 1996 60(3):512-38；及Sharp等人，Yeast. 1991 7(7):657-78。
核酸操作之通用技術係在熟習此項技術者之範圍內，且亦描述於例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Labo-ratory Manual,第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版，1989，或F. Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing及Wiley-Interscience:New York,1987)及定期更新中，以引用的方式併入本文中。編碼蛋白質之DNA可操作地連接於源自哺乳動物、病毒或昆蟲基因之適當轉錄或轉譯調控元件。此等調控元件包括轉錄啟動子、視情況之控制轉錄之操縱序列、編碼適合mRNA核糖體結合位點之序列，及控制轉錄及轉譯終止之序列。另外亦併入通常由複製起點賦予在宿主中複製之能力，及有助於識別轉型體之選擇基因。適合之調控元件在此項技術中熟知。
本文所述之蛋白質可以與異源多肽融合之融合蛋白的形式產生，其較佳為在成熟蛋白質或多肽之N端具有專一性裂解位點之信號序列或其他多肽。所選異源信號序列較佳為宿主細胞可識別及加工(亦即藉由信號肽酶裂解)之序列。對於不識別及加工原生信號序列之原核宿主細胞，以選自例如鹼性磷酸酶、青黴素酶(penicillinase)、lpp或熱穩定性腸毒素II前導序列之群的原核信號序列取代信號序列。對於酵母分泌，可例如以酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列(包括酵母(Saccharomyces)及克魯維酵母(Kluyveromyces)α因子前導序列)或酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌(C. albicans)葡糖澱粉酶前導序列或PCT公開案第WO 90/13646號中所述之信號取代原生信號序列。在哺乳動物細胞表現過程中，哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導序列(例如單純性疱疹gD信號)為可用的。此等前驅體區域之DNA可在閱讀框中與編碼蛋白質之DNA接合。
用於真核宿主細胞(例如酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類，或來自其他多細胞生物體之有核細胞)中之表現載體亦將含有終止轉錄及使mRNA穩定所必需之序列。此等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5'及偶爾3'非轉譯區獲得。此等區域含有編碼多價抗體之mRNA之非轉譯部分中轉錄成聚腺苷酸化片段之核苷酸區段。一種適用之轉錄終止組件為牛生長激素聚腺苷酸化區。參看PCT公開案第WO 94/11026號及其中所揭示之表現載體。
重組DNA亦可包括適用於純化蛋白質之任何類型之蛋白質標籤序列。蛋白質標籤之實例包括(但不限於)組胺酸標籤、FLAG標籤、myc標籤、HA標籤或GST標籤。適用於細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主之選殖及表現載體可見於Cloning Vectors:A Laboratory Manual,(Elsevier,New York,1985)，其相關揭示內容係以引用的方式併入本文中。
使用如對熟習此項技術者顯而易知之適於宿主細胞之方法將表現構築體引入宿主細胞中。此項技術中已知多種將核酸引入宿主細胞中之方法，包括(但不限於)電穿孔；採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-聚葡萄糖或其他物質進行之轉染；微彈轟擊(microprojectile bombardment)；脂質體轉染；及感染(其中載體為感染物)。
適合之宿主細胞包括原核生物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞或細菌細胞。適合之細菌包括革蘭氏(gram)陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或桿菌屬(Bacillus spp.)。酵母，較佳來自酵母屬之酵母(諸如釀酒酵母(S. cerevisiae))，亦可用於製造多肽。各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統亦可用以表現重組蛋白質。Luckow及Summers(Bio/Technology,6:47,1988)曾評述在昆蟲細胞中製造異源蛋白質之桿狀病毒系統。在一些情況中，將需要在脊椎動物細胞中製造蛋白質，諸如用於糖基化，且在培養物(組織培養物)中繁殖脊椎動物細胞已變成常規程序。適合之哺乳動物宿主細胞株的實例包括內皮細胞、COS-7猴腎細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚腎細胞、HeLa、293、293T及BHK細胞株。在許多應用中，本文所述之蛋白質多聚體的小尺寸將使得大腸桿菌為較佳表現方法。
蛋白質製造
用本文所述之用於蛋白質製造之表現或選殖載體轉型宿主細胞，且於改良成宜誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因的習知營養培養基中培養。
用以製造本發明之蛋白質的宿主細胞可培養於多種培養基中。市售培養基，諸如漢氏F10(Ham's F10)(Sigma)、最低必需培養基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜貝可氏經改良伊格爾氏培養基((Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、Sigma)，均適於培養宿主細胞。另外，以下文獻中所述之任何培養基均可用作宿主細胞之培養基：Ham等人，Meth. Enz. 58:44(1979)；Barnes等人，Anal. Biochem. 102:255(1980)；美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號或第5,122,469號；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利第RE 30,985號。任一此等培養基均可在必要時補充有激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPFS)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM 藥物)、微量元素(定義為通常以在微莫耳濃度範圍內之最終濃度存在之無機化合物)及葡萄糖或等效能源。亦可包括熟習此項技術者已知之適當濃度的任何其他必要補充。諸如溫度、pH值及其類似條件之培養條件為先前選擇用於表現之宿主細胞所用之條件且對於一般熟習此項技術者為顯而易知的。
本文所揭示之蛋白質亦可使用細胞轉譯系統來產生。出於此等目的，須對編碼蛋白質之核酸進行修飾以允許活體外轉錄以產生mRNA，且允許在所用特定無細胞系統中無細胞轉譯mRNA。例示性無真核細胞之轉譯系統包括例如無哺乳動物或酵母細胞之轉譯系統，且例示性無原核細胞之轉譯系統包括例如無細菌細胞之轉譯系統。
本文所揭示之蛋白質亦可藉由化學合成(例如藉由Solid Phase Peptide Synthesis,第2版，1984,The Pierce Chemical Co.,Rockford,IL中所述之方法)來產生。蛋白質之修飾亦可藉由化學合成來產生。
本文所揭示之蛋白質可藉由蛋白質化學領域中一般已知之蛋白質分離/純化法來純化。非限制性實例包括萃取、再結晶、鹽析(例如用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超濾、吸附層析、離子交換層析、疏水性層析、正相層析、反相層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析、親和層析、電泳、反流分布或此等方法之任何組合。在純化後，可將蛋白質交換至不同緩衝液中且/或藉由此項技術已知之多種方法(包括(但不限於)過濾及透析)中之任一種濃縮。
經純化蛋白質較佳至少85%純，更佳至少95%純，且最佳至少98%純。不論純度之確切數值如何，蛋白質均需對於用作藥品足夠純。
成像、診斷及其他應用
本文所述之E結合物可標記可偵測物且用以接觸表現EGFR之細胞以供成像或診斷應用。本文所述之E/I結合物可標記可偵測物且用以接觸表現EGFR及/或IGFIR之細胞以供成像或診斷應用。可採用此項技術中已知之使蛋白質與可偵測部分結合之任何方法，包括Hunter等人，Nature 144:945(1962)；David等人，Biochemistry 13:1014(1974)；Pain等人，J. Immunol. Meth. 40:219(1981)；及Nygren,J. Histochem. and Cytochem. 30:407(1982)中所述之彼等方法。
在某些實施例中，本文所述之E結合物及E/I結合物進一步與能夠被偵測之標記(例如該標記可為放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔助因子)連接。標記可為放射性試劑，諸如：放射性重金屬，諸如鐵螯合物、釓或錳之放射性螯合物；氧、氮、鐵、碳或鎵之正電子發射體；43 K、52 Fe、57 Co、67 Cu、67 Ga、68 Ga、123 I、125 I、131 I、132 I或99 Tc。附接此部分之E結合物或E/I結合物可用作成像劑且以有效用於診斷諸如人類之哺乳動物之量投與，且接著偵測成像劑之定位及累積。成像劑之定位及累積可藉由放射性閃爍攝影術、核磁共振成像、電腦斷層攝影術或正電子發射斷層攝影術來偵測。如熟習此項技術者將顯而易見，欲投與之放射性同位素之量視放射性同位素而定。一般熟習此項技術者根據用作活性部分之既定放射性核種之比活性及比能可容易地調配欲投與之成像劑之量。
E結合物及E/I結合物亦適用作親和純化劑。在此方法中，使用此項技術中熟知之方法將蛋白質固定於適當支撐物(諸如葡聚糖凝膠樹脂(Sephadex resin)或濾紙)上。該等蛋白質可用於任何已知之檢定法中，諸如競爭性結合檢定、直接及間接夾層檢定以及免疫沈澱檢定(Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,第147-158頁(CRC Press,Inc.,1987))。
E結合物適用於偵測樣本中之EGFR之方法中。E/I結合物亦適用於偵測樣本中之EGFR及/或IGFIR之方法中。樣本常常為生物樣本，諸如活組織檢查樣本，且尤其腫瘤、疑似腫瘤之活組織檢查樣本。樣本可來自人類或其他哺乳動物。E結合物或E/I結合物可標記有標記部分，諸如放射性部分、螢光部分、發色部分、化學發光部分或半抗原部分；且可固定於固體支撐物上。可使用任何此項技術中已知之技術進行偵測，該等技術諸如放射線照相術、免疫檢定、螢光偵測、質譜或表面電漿共振。
治療/活體內使用
本文所述之E結合物亦適用於治療對EGFR生物活性之抑制起反應之病狀的方法。本文所述之E/I結合物亦適用於治療對EGFR及/或IGFIR生物活性之抑制起反應之病狀的方法。EGFR及IGFIR直接或間接涉及各種細胞活動(包括增殖、黏附及遷移，以及分化)之信號轉導路徑。
在一態樣中，本申請案提供以治療有效量之E結合物或E/I結合物治療罹患過度增生性病症之個體的方法。特定言之，E結合物及E/I結合物適用於治療及/或預防腫瘤及/或腫瘤轉移。在例示性實施例中，E/I結合物為抗體樣蛋白質多聚體，諸如EGFR結合10 Fn3與IGFIR結合10 Fn3之二聚體。
在一些實施例中，向罹患腫瘤(包括(但不限於)腦瘤、泌尿生殖道腫瘤、淋巴系統腫瘤、胃部腫瘤、喉部腫瘤、單核細胞性白血病、肺腺癌、小細胞肺癌、胰腺癌、神經膠母細胞瘤及乳癌)或癌性疾病(包括(但不限於)鱗狀細胞癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、腎癌、結腸直腸癌、乳癌、頭癌、頸癌、食道癌、婦科癌症、甲狀腺癌、淋巴瘤、慢性白血病及急性白血病)之個體投與包含E結合物或E/I結合物之醫藥組合物。
E結合物或E/I結合物可單獨投與或與一或多種其他療法組合投與，該等其他療法諸如化學療法、放射線療法、免疫療法、外科介入或此等療法之任何組合。如本文所述，在其他治療策略之情形中，長期療法同樣可能為輔助性療法。投藥技術及劑量視特定多肽之類型及所治療之特定病狀而改變，但可由熟習此項技術者容易地確定。
可與E/I結合物一起使用之其他藥劑
本申請案之一個態樣提供E結合物或E/I結合物與另一治療劑(諸如細胞毒性劑)之組合。在一些實施例中，E結合物或E/I結合物與細胞毒性劑連接。此等實施例適當時可藉由活體外或活體內方法製備。活體外方法包括此項技術中熟知之結合化學，諸如與半胱胺酸及離胺酸殘基結合。為了將細胞毒性劑與多肽連接，使用連接基團或反應性基團。適合之連接基團為此項技術中所熟知且包括二硫基、硫醚基、酸不穩定性基團、光不穩定性基團、肽酶不穩定性基團及酯酶不穩定性基團。細胞毒性劑亦可經由中間載劑分子(諸如血清白蛋白)與E結合物或E/I結合物連接。
可與E結合物或E/I結合物連接之例示性細胞毒性劑包括美登素類(maytansinoid)、紫杉烷(taxane)、CC-1065之類似物、細菌毒素、植物毒素、蓖麻毒素、相思子毒素、核糖核酸酶(RNase)、DNase I(一種蛋白酶)、葡萄球菌腸毒素-A(Staphylococcal enterotoxin-A)、美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、白樹素(gelonin)、白喉毒素、假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、假單胞菌內毒素、豹蛙酶(Ranpimase，Rap)、Rap(N69Q)、甲胺喋呤(methotrexate)、道諾黴素(daunorubicin)、小紅莓(doxorubicin)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)及刺孢黴素(calicheamicin)。
在其他治療性處理或組合物中，E結合物或E/I結合物係與一或多種其他治療劑共投與或依次投與。適合之治療劑包括(但不限於)細胞毒性劑或細胞生長抑制劑，諸如癌症治療劑。
癌症治療劑為試圖殺死癌細胞或限制癌細胞生長同時對患者具有最小影響之藥劑。因此，此等藥劑可利用癌細胞與健康宿主細胞之任何特性(例如代謝、血管形成或細胞表面抗原呈遞)差異。可與E/I結合物組合以改良抗癌功效之治療劑包括腫瘤學實踐中所用之不同藥劑(參考文獻：Cancer,Principles ＆ Practice of Oncology,DeVita,V. T.,Hellman,S.,Rosenberg,S. A.,第6版，Lippincott-Raven,Philadelphia,2001)，諸如小紅莓、表柔比星(epirubicin)、環磷醯胺、曲妥珠單抗(trastuzumab)、卡培他濱(capecitabine)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、來曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole)、氟維司群(fulvestrant)、依西美坦(exemestane)、戈舍瑞林(goserelin)、奧賽力鉑(oxaliplatin)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、地塞米松(dexamethasone)、安替肽(antide)、貝伐單抗(bevacizumab)、5-氟尿嘧啶、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、左美索(levamisole)、伊立替康(irinotecan)、依託泊苷(etoposide)、拓朴替康(topotecan)、吉西他濱(gemcitabine)、長春瑞賓(vinorelbine)、雌莫司汀(estramustine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、阿巴瑞克(abarelix)、唑來膦酸鹽(zoledronate)、鏈脲黴素(streptozocin)、利妥昔單抗(rituximab)、黃膽素(idarubicin)、白消安(busulfan)、苯丁酸氮芥、氟達拉濱(fludarabine)、伊馬替尼(imatinib)、阿糖胞苷(cytarabine)、替伊莫單抗(ibritumomab)、托西莫單抗(tositumomab)、干擾素α-2b、美法侖、硼替佐米(bortezomib)、六甲蜜胺(altretamine)、天冬醯胺酶(asparaginase)、吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlonitib)、抗EGF受體抗體(例如西妥昔單抗或帕尼單抗)、伊沙匹隆(ixabepilone)、艾普塞隆(epothilones)或其衍生物、鉑試劑(諸如卡鉑、奧賽力鉑、順鉑)、紫杉烷(諸如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel))及喜樹鹼(camptothecin)。
治療性調配物及投藥模式
本申請案提供治療對EGFR及/或IGFIR生物活性之抑制起反應之病狀的方法。投藥技術及劑量視特定多肽之類型及所治療之特定病狀而改變，但可由熟習此項技術者容易地確定。一般而言，管理機構要求調配欲用作治療劑之蛋白質試劑以致其具有可接受之低熱原質含量。因此，治療性調配物與其他調配物之不同之處一般在於其實質上不含熱原質，或如藉由適當管理機構(例如FDA)測定，至少含有不超過可接受量之熱原質。
在一些實施例中，E結合物及E/I結合物對於哺乳動物(特定言之人類)為醫藥學上可接受的。「醫藥學上可接受」之多肽係指向動物投與而無顯著不利之醫學結果之多肽。醫藥學上可接受之E結合物及E/I結合物之實例包括不含整合素結合域(RGD)之10 Fn3域及基本上無內毒素或具有極低內毒素含量之10 Fn3域。
治療性組合物可與醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑一起以單位劑型投與。在非限制性實例中，投藥可為非經腸(例如靜脈內、皮下)、經口或經表面投藥。另外，可採用使用編碼E結合物或E/I結合物之核酸的任何基因療法技術，諸如裸DNA傳遞、重組基因及載體、基於細胞之傳遞(包括離體操作患者細胞)及其類似技術。
組合物可為供經口投與之丸劑、錠劑、膠囊、液體或持續釋放錠劑形式；供經靜脈內、皮下或非經腸投與之液體形式；或供局部投與之凝膠、洗劑、軟膏、乳膏或者聚合物或其他持續釋放媒劑形式。
此項技術中熟知之製造調配物之方法見於例如「Remington:The Science and Practice of Pharmacy」(第20版，A.R. Gennaro AR.編，2000,Lippincott Williams ＆ Wilkins,Philadelphia,PA)。供非經腸投與之調配物可例如含有賦形劑、無菌水、生理鹽水、諸如聚乙二醇之聚伸烷二醇、植物來源之油或氫化萘。生物相容、生物可降解之丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物可用以控制化合物之釋放。奈米顆粒調配物(例如生物可降解奈米粒子、固體脂質奈米粒子、脂質體)可用以控制化合物之生物分布。其他可能有用之非經腸傳遞系統包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物粒子、滲透泵、可植入輸注系統及脂質體。調配物中之化合物濃度視許多因素(包括欲投與之藥物之劑量及投藥途徑)而改變。
多肽可視情況以醫藥學上可接受之鹽形式(諸如醫藥行業中常用之無毒酸加成鹽或金屬錯合物)投與。酸加成鹽之實例包括有機酸，諸如乙酸、乳酸、雙羥萘酸、順丁烯二酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、丁二酸、苯甲酸、棕櫚酸、辛二酸、水楊酸、酒石酸、甲烷磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸或其類似物；聚合酸，諸如鞣酸、羧甲基纖維素或其類似物；及無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸或其類似物。金屬錯合物包括鋅、鐵及其類似物。在一個實例中，在乙酸鈉存在下調配多肽以提高熱穩定性。
經口使用之調配物包括錠劑，其含有活性成份與醫藥學上可接受之無毒賦形劑的混合物。此等賦形劑可為例如惰性稀釋劑或填充劑(例如蔗糖及山梨糖醇)、潤滑劑、滑動劑及抗黏著劑(例如硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、二氧化矽、氫化植物油或滑石粉)。
經口使用之調配物亦可以咀嚼錠形式，或以硬明膠膠囊形式(其中活性成份係與惰性固體稀釋劑混合)，或以軟明膠膠囊形式(其中活性成份係與水或油介質混合)提供。
治療有效劑量係指產生投藥需達成之治療作用之劑量。確切劑量將視待治療之病症而定，且可由熟習此項技術者使用已知技術來確定。E結合物或E/I結合物通常係以每日約0.01μg/kg至約50mg/kg，較佳每日0.01mg/kg至約30mg/kg，最佳每日0.1mg/kg至約20mg/kg投與。多肽可每日(例如每日一次、兩次、三次或四次)給予或以較低頻率(例如每隔一天一次、每週一次或兩次或者每月一次)給予。另外，如此項技術中已知，可能需要跟據年齡以及體重、一般健康狀況、性別、飲食、投藥時間、藥物相互作用及疾病嚴重程度進行調節，且此可由熟習此項技術者利用常規實驗確定。
例證
藉由參考以下實例將較容易地瞭解現大體上描述之本發明，包括該等實例僅為達成說明本發明之某些態樣及實施例之目的，且並不意欲以任何方式限制本發明。
序列概述
本申請案中提及之許多序列均概述於下表中。除非另作說明，否則N端延伸係以單下劃線指示，C端尾係以雙劃線指示，且連接子序列係以粗體指示。
實例1：篩選EGFR活性之細胞內西方檢定(In Cell Western Assay)
細胞內西方檢定係開發用於針對抑制EGFR活性之能力篩選各種單個10 Fn3純系，以便鑑別出可與IGF1R10 Fn3結合物連接以構築E/I結合物之彼等者。細胞內西方檢定亦用以篩選及測定特定E/I10 Fn3結合物之相對效能。開展兩個細胞內西方檢定以量測1)對於EGF刺激之EGFR磷酸化之抑制或2)對於EGF刺激之ERK磷酸化之抑制。以24,000個細胞/孔將A431表皮樣癌或FaDu頭及頸癌細胞接種至塗布聚D-離胺酸之96孔微量滴定盤(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中，且使其黏附隔夜。洗滌細胞一次且接著在無血清培養基中培育24小時。接著將基於10 Fn3之結合物之連續稀釋液施加至細胞且培育2-3小時，隨後以100ng/ml EGF刺激10分鐘。在刺激之後，在含有3.7%甲醛之PBS中固定細胞20分鐘，且接著在含有0.1%曲通X-100(triton-X-100)之PBS中滲透15分鐘。在奧德賽阻斷劑(Odyssey blocker)(Li-Cor Biosciences,Lincoln,Nebraska)中阻斷細胞一小時，且與抗體一起培育以偵測酪胺酸1068(Cell Signaling,Beverly,MA)及β-肌動蛋白(Sigma,St Louis,MO)上之磷酸化EGFR或pERK(酪胺酸202/蘇胺酸204上之磷酸化MAP激酶)及總ERK(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)。在含有0.1%吐溫20(tween-20)之PBS中洗滌三次之後，添加二次抗體(Invitrogen,Carlsbad,CA或Rockland,Gilbertsville,PA)。在含有0.1%吐溫20之PBS中洗滌細胞三次，且在Li-Cor奧德賽紅外成像系統((Li-Cor Odyssey Infrared Imaging System)，Li-Cor Biosciences,Lincoln,Nebraska)上成像。一式兩份或一式三份檢定各純系，且在pEGFR檢定中相對於β-肌動蛋白且在pERK檢定中相對於總ERK校正各值。藉由對最大信號減去背景之抑制百分比作線性回歸分析來計算IC50值。
結果得到具有抑制EGFR活性之能力的多種10 Fn3純系，且顯示某些特定E/I10 Fn3結合物具有與圖9中所示之實例類似的活性。
實例2：基於 10 Fn3之結合物之表現
藉由使用甘胺酸-絲胺酸連接子將EGFR結合10 Fn3與IGFIR結合10 Fn3共價連接藉此產生10 Fn3二聚體來製得E/I結合物，其中各10 Fn3域與不同靶結合。先前在PCT公開案第WO 2008/066752號中將IGFIR結合10 Fn3(I1)描述為SEQ ID NO:226。藉由篩選RNA-蛋白質融合物庫(如PCT公開案第WO 2008/066752號中所述)中結合EGFR-Fc(R＆D Systems,Minneapolis,MN)之結合物來鑑別兩種新穎的EGFR結合10 Fn3(E2及E1)。以下實例描述使用多種標記His之基於E/I10 Fn3之結合物(未經聚乙二醇化)之結果：E2-GS10-I1(SEQ ID NO:25)、E1-GS10-I1(SEQ ID NO:31)、I1-GS10-E1(SEQ ID NO:28)及I1-GS10-E2(SEQ ID NO:22)。
以下實例亦描述利用以下經聚乙二醇化之標記His的基於E/I10 Fn3之結合物的結果：E1-GS10-I1(SEQ ID NO:55)、E2-GS10-I1(SEQ ID NO:56)、E3-GS10-I1(SEQ ID NO:53)、I1-GS10-E1(SEQ ID NO:57)、I1-GS10-E2(SEQ ID NO:58)、I1-GS10-E3(SEQ ID NO:54)、E4-GS10-I1(SEQ ID NO:120)、I1-GS10-E4(SEQ ID NO:124)、E5-GS10-I1(SEQ ID NO:128)、I1-GS10-E5(SEQ ID NO:132)、E85-GS10-I1(SEQ ID NO:149)、I1-GS10-E85(SEQ ID NO:152)、E90-GS10-I1(SEQ ID NO:164)、E96-GS10-I1(SEQ ID NO:179)、E105-GS10-I1(SEQ ID NO:192)、I1-GS10-E105(SEQ ID NO:195)、E112-GS10-I1(SEQ ID NO:205)、I1-GS10-E112(SEQ ID NO:208)、I1-GSGCGS8-E5(SEQ ID NO:211)、I1-GS10-E5-GSGC(SEQ ID NO:212)、I1(S62C)-GS10-E5(SEQ ID NO:213)、I1-GS10-E5(S62C)(SEQ ID NO:214)、I1(S91C)-GS10-E5(SEQ ID NO:215)及I1-GS10-E5(S91C)(SEQ ID NO:216)。
實例亦描述使用以下得到之結果：標記His之基於IGFRIR10 Fn3之結合物I1(SEQ ID NO:4)；及十種標記His之基於EGFR10 Fn3之結合物E2(SEQ ID NO:6)、E1(SEQ ID NO:8)、E3(SEQ ID NO:52)、E4(SEQ ID NO:107)、E5(SEQ ID NO:113，其中X=Ser且在C端具有His標籤)、聚乙二醇化E5(SEQ ID NO:113，其中X=Cys且在C端具有His標籤)、E85(SEQ ID NO:140)、E90(SEQ ID NO:155)、E96(SEQ ID NO:170)、E105(SEQ ID NO:185)及E112(SEQ ID NO:198)。實例32亦描述具有圖45中所述之序列且在C端包括His標籤之多種E單體。
使用高通量蛋白質製造方法(HTPP)純化各種基於10 Fn3之結合物。將所選結合物選殖至pET9d載體中以產生標記His6 之融合物。將DNA轉型至大腸桿菌HMS174(DE3)中，且將細胞接種於24孔格式中之5ml含有50μg/mL康黴素(kanamycin)之LB培養基中，且在37℃下生長隔夜。藉由自隔夜培養物中抽吸200μl且將其分配於適當孔中來製備5ml新鮮LB培養基(50μg/mL康黴素)培養物，以進行誘導性表現。使培養物在37℃下生長至A600 值為0.6-0.9。以1mM異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導之後，使培養物在30℃下再生長6小時且藉由在4℃下以3220×g離心10分鐘來收集。在80℃下冷凍細胞小球。
藉由將細胞小球(呈24孔格式)再懸浮於450μl溶解緩衝液(50mM NaH2 PO4 、0.5 MNaCl、1x CompleteTM 無EDTA蛋白酶抑制劑混合物(Roche)、1mM PMSF、10mM CHAPS、40mM咪唑、1mg/ml溶菌酶、30μg/ml DNAse、2μg/ml抑肽酶(aprotonin)，pH 8.0)中來使其溶解，且在室溫下震盪1小時。澄清溶解產物且藉由轉移至配備有96孔、650μl收集盤(catch plate)之96孔Whatman GF/D Unifilter中來將其重新放置於96孔格式中，且以200×g離心5分鐘。將澄清溶解產物轉移至已用平衡緩衝液(50mM NaH2 PO4 、0.5M NaCl、10mM CHAPS、40mM咪唑，pH 8.0)平衡之96孔鎳螯合培養盤中，且培育5分鐘。藉由真空移除未結合之物質。以每孔0.3毫升1號洗滌緩衝液(50mM NaH2 PO4 、0.5M NaCl、5mM CHAPS、40mM咪唑，pH 8.0)洗滌樹脂2次，其中藉由真空移除各次之洗滌液。接著，以每孔0.3毫升PBS洗滌樹脂3次，其中藉由真空移除各步驟之洗滌液。在溶離之前，以50μl溶離緩衝液(PBS+20mM EDTA)洗滌各孔，培育5分鐘，且藉由真空清除洗滌液。藉由向各孔再施加100μl溶離緩衝液來溶離蛋白質。在室溫下培育30分鐘之後，以200×g離心培養盤5分鐘且在含有5μl附於鎳培養盤底部之0.5M MgCl2 的96孔收集盤中收集經溶離之蛋白質。使用BCA蛋白質檢定，以SEQ ID NO:2作為蛋白質標準物，來定量經溶離之蛋白質。
HTPP得到基於10 Fn3之活性結合物，其係以可溶形式表現且自細菌細胞溶質之可溶部分純化得到。圖1描繪一種基於E/I10 Fn3之結合物的例示性SDS-PAGE分析。在Superdex 200 5/150 GL上以移動相100mM NaPO4 、100mM NaSO4 、150mM NaCl(pH 6.8)(GE Healthcare)進行之SEC分析主要顯示單體蛋白質(參看實例4)。
另外，進行所選基於10 Fn3之結合物的中等規模之表現及純化。將與His6 標籤融合之所選結合物選殖至pET9d或pET29載體中且在大腸桿菌HMS174(DE3)或BL212(DE3)(EMD Biosciences,San Diego,CA)細胞中表現。使用20m接種培養物(由單一經塗布菌落產生)接種1公升含有50μg/ml康黴素之LB培養基。使培養物在37℃下生長直至A600 值為0.6-1.0。以1mM異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導之後，使培養物在30℃下再生長6小時。或者，使用自動誘導培養基(「ONE」培養基，EMD Biosciences,San Diego,CA)在37℃下初始生長之後，在18℃下進行表現。藉由在4℃下以離心30分鐘來收集細胞小球，且在80℃下冷凍。在冰上使用Ultra-turrax均質機使細胞小球再懸浮於25mL溶解緩衝液(20mM NaH2 PO4 、0.5M NaCl、1x CompleteTM 無EDTA蛋白酶抑制劑混合物(Roche)，pH 7.4)中。使用M-110S型微射流機(Microfluidics)藉由高壓均質化()來達成細胞溶解。藉由在4℃下以23,300×g離心30分鐘來分離可溶部分。經由0.45μm過濾器澄清上清液。將澄清溶解產物裝載至經20mM NaH2 PO4 、0.5M NaCl(pH 7.4)預先平衡之HisTrap管柱(GE)上。接著依次以25管柱體積之20mM NaH2 PO4 、0.5M NaCl(pH 7.4)；20管柱體積之20mM NaH2 PO4 、0.5M NaCl、25mM咪唑(pH 7.4)；及35管柱體積之20mM NaH2 PO4 、0.5M NaCl、40mM咪唑(pH 7.4)洗滌管柱。以15管柱體積之20mM NaH2 PO4 、0.5M NaCl、500mM咪唑(pH 7.4)溶離蛋白質，根據在A280 下之吸光度彙集溶離份，且相對於1x PBS、50mM Tris、150mM NaCl(pH 8.5)或者50mM NaOAc、150mM NaCl(pH 4.5)進行透析。藉由在0.22μm下適濾移除任何沈澱。
中等規模表現及純化得到具有高純度及活性之蛋白質，其係以可溶形式表現且自細菌細胞溶質之可溶部分純化得到。在Superdex 200 10/30GL上以移動相100mM NaPO4 、100mM NaSO4 、150mM NaCl(pH 6.8)(GE Healthcare)進行之SEC分析主要顯示單體蛋白質(參看實例4)。
實例3：基於E/I 10 Fn3之結合物之聚乙二醇化
基於多價纖維結合蛋白之骨架蛋白，諸如基於E/I10 Fn3之結合物，可用各種尺寸及類型之PEG聚乙二醇化。為實現聚乙二醇化，通常在C端附近藉由使胺基酸(通常為絲胺酸)單一點突變成為半胱胺酸來對蛋白質進行修飾。蛋白質在單一半胱胺酸殘基處之聚乙二醇化係經由與各種經馬來醯亞胺衍生化之PEG形式結合，藉由組合衍生化PEG試劑與蛋白質溶液且培育來實現。可藉由分離未聚乙二醇化蛋白質與聚乙二醇化蛋白質之SDS-PAGE及/或SE-HPLC方法來確定聚乙二醇化結合反應之進程及確定。
舉例而言，藉由以半胱胺酸置換位置221之絲胺酸使構築體E2-GS10-I1(SEQ ID NO:25)聚乙二醇化。接著使所得構築體SEQ ID NO:56與經馬來醯亞胺衍生化之40kDa分支PEG(NOF America Corporation,White Plains,NY)結合。將衍生化PEG試劑與蛋白質構築體溶液混合且在pH 7.40下在室溫下培育直至反應完成，通常為30分鐘，或在4℃下為隔夜。藉由透析或使用尺寸排除管柱層析快速脫鹽至50 NaOAc、150mM NaCl緩衝液中，將pH值降低至pH 4.5或pH 5.0。接著在低pH值下將聚乙二醇化反應之產物與過量反應物之混合物裝載至陽離子交換層析管柱上，且以150mM至1M NaCl梯度溶離。亦如在上一段落中所述進行確定聚乙二醇化之研究。可用標記His或無His標籤型式之蛋白質進行結合。
在需要排除樣本中大腸桿菌內毒素污染之情況下，採用兩種彼此獨立或彼此聯合使用之方法。首先依次以通常5管柱體積補充有0.5%曲通X-100之NaOAc緩衝液、20管柱體積(或20管柱體積以上)無曲通x-100之相同緩衝液洗滌陽離子交換管柱。另外，使蛋白質極慢地通過Sartorius SartobindQ過濾器(Sartorius Stedim Biotech Bohemia,New York)；或使蛋白質極慢地通過該過濾器來代替此程序。
使用替代程序將兩種基於E/I10 Fn3之結合物E2-GS10-I1-cys(具有his)(SEQ ID NO:56)及E3-GS10-I1-Cys(具有his)(SEQ ID NO:53)聚乙二醇化。由單一經塗布菌落產生5ml BL21(DE3)大腸桿菌細胞的接種培養物，且用其接種1公升含有50μg/ml康黴素之自動誘導培養基(「ONE」培養基，EMD Biosciences,San Diego,CA)，該接種培養物含有編碼E2-GS10-I1-cys(具有his)或E3-GS10-I1-Cys(具有his)的T7聚合酶驅動之pET29質體。在37℃下初始生長之後在18℃下進行表現，且藉由在4℃下以約10,000×g離心10分鐘來收集。在80℃下冷凍細胞小球。將細胞小球再懸浮於10mL溶解緩衝液(20mM NaH2 PO4 、0.5M NaCl、5mM咪唑，pH 7.4)中且使用Avestin均質機以機械方式溶解。藉由在4℃下以23，300×g離心15分鐘來分離可溶部分。傾析上清液且將小球溶解於補充有4M至6M鹽酸胍(GdnHCl)之溶解緩衝液(如上文)中。接著在經補充有GdnHCL之溶解緩衝液預先平衡的尺寸適當之NiNTA管柱(Qiagen，Inc.)上純化經溶解蛋白質。接著以5至10管柱體積之相同緩衝液洗滌管柱，接著以補充有300mM咪唑之相同緩衝液溶離。將自管柱溶離出之含有相關蛋白質之溶離份稀釋至2-3mg/mL蛋白質且接著與1.2-1.5莫耳過量之固體NEM-PEG(40kDa分支鏈或其他形式)組合。使混合物在室溫下反應30分鐘或直至反應完成。接著將整個反應體積置放至透析袋(5,000Da之截留分子量)中且使混合物經歷透析再摺疊處理(dialysis refolding process)。舉例而言，此處理可由相對於50mM NaOAc、150mM NaCl(pH 4.5)進行的兩次10-16小時之500:1(緩衝液：透析物)透析交換組成。來自此程序之透析物含有適當摺疊之聚乙二醇化物質外加過量反應物。經由離心或過濾使聚乙二醇化反應之產物與過量反應物之混合物澄清，隨後將其裝載至陽離子交換層析管柱(SP Sepharose或Resource S,GE Healthcare)上。以NaOAc背景緩衝液中之150mM至1M NaCl梯度展開管柱。如上所述進行確定聚乙二醇化之研究。
實例4：基於 10 Fn3之結合物之生物物理學表徵
對自HTPP及中等規模方法純化之蛋白質(對於HTPP為0.1至1μg蛋白質，且對於中等規模方法為10-50μg)進行標準尺寸排阻層析(SEC)。HTPP來源之物質之SEC係使用Superdex 200 5/150管柱(GE Healthcare)或在Superdex 200 10/30管柱(GE Healthcare)上進行，中等規模方法來源之物質之SEC係在Agilent 1100或1200 HPLC系統上進行，其中UV偵測係在A214 nm及A280 nm下進行且利用螢光偵測(激發=280 nm，發射=350 nm))。採用適當SEC管柱流動速率之含100mM硫酸鈉、100mM磷酸鈉、150mM氯化鈉(pH 6.8)之緩衝液。使用凝膠過濾標準物(Bio-Rad Laboratories,Hercules,C)進行分子量校正。
經HTPP純化之基於10 Fn3之結合物的SEC結果主要顯示單體蛋白質，及相對於球狀凝膠過濾標準物(BioRad)在接近25kDa之範圍內之溶離。
中等規模純化之基於10 Fn3之結合物的SEC結果主要顯示單體蛋白質，及相對於球狀凝膠過濾標準物(BioRad)在接近25kDa之範圍內之溶離。圖2描繪基於E/I10 Fn3之結合物(圖2A中之I1-GS10-E2及圖2B中之E2-GS10-I1)之例示性SEC概況。
藉由LC-MS(Water 2695液相層析HPLC系統與Waters Q-TOF API質譜儀耦合，Waters Corporation,Milford,MA)進一步分析所選中等規模之基於10 Fn3之結合物。以HPLC級水將樣本稀釋至約0.5mg/ml。將約5μl稀樣本注射至Jupiter C18管柱(目錄號00G-4053-80,Phenomenex)上。緩衝液A：含0.02% TFA+0.08%甲酸之HPLC級水，緩衝液B：含0.02% TFA+0.08%甲酸之HPLC級乙腈。在0.2毫升/分鐘流動速率下梯度(表1)溶離樣本。
以約1:1之比率分開HPLC溶離液，且一半送至UV偵測器且另一半送至質譜儀。質譜儀具有以下儀器設置：毛細管電壓3.5KV，錐孔電壓40，源溫度80℃，脫溶劑氣溫度250℃，脫溶劑氣流450及多通道光偵測器電壓2200。以MaxEn1(Waters Corporation)將原始光譜反卷積。
藉由LC-MS量測之I1-GS10-E2(SEQ ID NO:22)之分子量為24,445道爾頓，其與由胺基酸組成計算之分子量之差異在1道爾頓內。此表明蛋白質具有正確胺基酸組成且N端甲硫胺酸經處理。該蛋白質不存在其他轉譯後修飾。
對中等規模I1-GS10-E2進行差示掃描熱量測定(DSC)分析以測定Tm 。藉由在3個大氣壓下，使溫度以1度/分鐘之速率自5℃勻變至95℃，在N-DSC II量熱計(Calorimetry Sciences Corp)中掃描1mg/ml溶液。使用Orgin軟體(OrginLab Corp)，使用最佳擬合，相對於適當緩衝液對照物之操作來分析資料。此檢定之結果顯示E/I結合物具有50.69℃之Tm 值(參看圖3A)。使用相同方法，測定E2-GS10-I1(具有Peg)之Tm 值為50.72℃且E2-GS10-I1(無Peg)之Tm 值為56.82℃(參看圖3B)。
實例5：結合親和力之測定
對溶液相基於10 Fn3之結合物進行表面電漿共振(BIAcore)分析，以便使用經捕獲EGFR-Fc及IGF1R-Fc來測定解離速率及/或結合親和力。將人類IGF1R之細胞外域(胺基酸1-932)選殖至含有人類IgG1之鉸鏈區及恆定區之哺乳動物表現載體中。質體之短暫轉染產生融合蛋白IGF1R-Fc，隨後藉由蛋白質A層析加以純化。重組人類EGFR-Fc(人類EGFR之細胞外域之胺基酸1-645與人類Fc之融合物)係購自R＆D systems(Minneapolis,MN)。IGF1R-Fc係在固定之蛋白質A上捕獲，而EGFR-Fc係在固定之抗人類抗體上捕獲。
在一典型實驗中，遵照製造商之建議(GE Healthcare,Piscataway,NJ)將抗人類IgG固定於CM5晶片之流槽(flow cell)1及2上。將5μL EGFR-Fc(50nM)注射至流槽2(Fc2)上，歷時2分鐘。使用兩次30秒之3M MgCl2 注射，以自抗人類IgG表面再生經結合EGFR-Fc。在乙酸鹽(pH 4.5)中將蛋白質A稀釋至80μg/mL且固定至CM5晶月表面之流槽3及4上達到約3000RU。在Fc 4上捕獲約1300RU之IGF1R-Fc。使用兩次30秒之50mM甘胺酸(pH 1.5)注射，以在樣本之間再生表面。
評估100nM至1nM濃度系列之經HTPP純化之蛋白質(收集三個資料點)或300nM至0.05nM濃度系列之經中等規模純化之蛋白質(收集十一個資料點)與EGFR-Fc或IGF1R-Fc之結合。獲得在各濃度下之感測器圖譜(Sensorgram)，且使用Biacore T100評估軟體1.1.1版(GE healthcare/Biacore)進行評估以測定速率常數ka (kon )及kd (koff )。為進行HTPP評估，自3點曲線擬合解離速率。由速率常數比koff /kon 來計算親和力KD 值。
以類似格式，使用抗人類IgG捕獲HER2-Fc來評估基於EGFR10 Fn3之結合物之專一性。基於10 Fn3之結合物在觀察到與EGFR-Fc之穩固結合的條件下，不顯示任何可辨別之與經捕獲HER2-Fc之結合。
如表2中所示，基於E/I10 Fn3之結合物之兩個域均具功能性，保留其與各別靶之結合特性。表2中所示之解離速率係自中等規模物質得到，且類似於利用HTPP物質得到之定性結果。
實例6：H292細胞中IGFR活性之抑制
在活體外檢定中使用H292細胞來測定基於E/I10 Fn3之結合物抑制IGF1R在酪胺酸1131上磷酸化之能力。簡言之，將65×103 個H292細胞塗於96孔微定量盤(Biocoat公司之塗布聚D-離胺酸之96孔培養盤，目錄號356640，Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中含有10mM Hepes(pH 7.4)及10%胎牛血清之RPMI-1640培養基中之。使細胞在37℃、5%CO2 下黏附24小時。次日，以每孔200微升無血清RPMI-1640洗滌細胞一次且在每孔100微升無血清RPMI-1640中培育隔夜。添加HTPP物質之連續稀釋液且再培育細胞3小時。在37℃下以100ng/ml IGF-1(目錄號500-P11,PeproTech,Rocky Hill,NJ)刺激細胞10分鐘。自培養盤倒出培養基且將100μL細胞溶解緩衝液(Cell Signaling,目錄號9803,Beverly,MA)添加至各孔中。在室溫下培育細胞15分鐘以使其溶解且將溶解產物轉移至磷酸-IGFR ELISA(目錄號7302,Cell Signaling,Beverly,MA)中。遵照製造商之程序進行ELISA。
如圖4中所示，標記His之E1-GS10-I1抑制IGF1刺激之IGF1R之磷酸化(IC50 =0.004μM)，其與經分離之IGF1R結合物I1(IC50 =0.018μM)具有相當之效能。單獨EGFR結合物E1對IGF1R磷酸化具有極小影響(IC50 >3.5μM)。如圖9中所示，其他E/I結合物顯示出以在0.1nM至19nM範圍內之IC50值抑制IGF1R刺激之磷酸化的能力，包括所測試之若干聚乙二醇化E/I結合物。詳言之，聚乙二醇化E/I結合物E1-GS10-I1及I1-GS10-E1分別顯示0.9nM及4nM之對於pIGFR之抑制。聚乙二醇化E/I結合物E2-GS10-I1及I1-GS10-E2分別顯示0.3nM及0.8nM之對於pIGFR之抑制。
實例7：H292細胞中EGFR活性之抑制
在活體外檢定中使用H292細胞來測定基於E/I10 Fn3之結合物抑制EGFR在酪胺酸1068上磷酸化之能力。如實例6中所述進行檢定，但以100ng/ml EGF(目錄號236-EG-200,R＆D Systems,Minneapolis,MN)刺激細胞且進行磷酸-EGFR ELISA(目錄號7240,Cell Signaling,Beverly,MA)。遵照製造商之程序進行ELISA。
如圖5中所示，標記His之E1-GS10-I1抑制EGF刺激之EGFR之磷酸化(IC50 =0.020μM)，其與經分離之EGFR結合物E1(IC50 =0.007μM)具有相當之效能。單獨IGF1R結合物I1對EGFR磷酸化具有極小影響(IC50 >6.21μM)。如圖9中所示，其他E/I結合物顯示出以在7nM至127nM範圍內之IC50值抑制EGF刺激之磷酸化的能力，包括所測試之若干聚乙二醇化E/I結合物。詳言之，聚乙二醇化E2-GS10-I1及I1-GS10-E2分別顯示32nM及47nM之對於pEGFR之抑制。圖11中展示聚乙二醇化E/I結合物E2-GS10-I1及I1-GS10-E2之類似資料。
實例8： H292細胞中EGF + IGF1誘導之pAKT之抑制
在活體外檢定中使用H292細胞來測定基於E/I10 Fn3之結合物抑制AKT在絲胺酸473上磷酸化之能力。如實例6中所述進行檢定，但以如上所述之EGF與IGF1同時刺激細胞且以磷酸-AKT ELISA(目錄號7160,Cell Signaling,Beverly,MA)分析溶解產物。遵照製造商之程序進行ELISA。
EGFR及IGF1R之信號轉導饋入PI3K-AKT信號傳導路徑中且刺激AKT之磷酸化。如圖6中所示，E1-GS10-I1抑制H292細胞中EGF及IGF1刺激之AKT之磷酸化。基於E/I10 Fn3之結合物之阻斷AKT活化之能力(IC50 =0.004μM)比單獨IGF1R結合物I1(IC50 =0.031μM)略微有效。EGFR結合物E1在其藉由兩種配位體阻斷AKT活化之能力方面僅顯示適度活性(IC50 =1.28μM)。如圖9中所示，其他E/I結合物顯示出以在0.1nM至26nM範圍內之IC50值抑制EGF及IGF1刺激之AKT之磷酸化的能力，包括所測試之若干聚乙二醇化E/I結合物。
實例9：RH41及H292細胞中細胞增殖之抑制
在H292非小細胞肺癌細胞株(視供生長之EGFR信號傳導而定)或RH41尤文氏(Ewing)肉瘤細胞株(視供生長之IGF1R信號傳導而定)中評估基於E/I10 Fn3之結合物之抗增殖活性。藉由以CyQuantNF螢光染色劑(目錄號C35006,Invitrogen,Carlsbad,CA)對細胞DNA染色，來評定單層培養物中結合物之抗增殖活性。簡言之，將2×103 個H292或5×103 個RH41細胞塗於96孔微定量盤(View Plates 96F,目錄號6005225,Perkin-Elmer,Waltham,MA)中含有10mM Hepes(pH 7.4)及10%胎牛血清之RPMI-1640培養基中，且使其在37℃、5% CO2 下黏附24小時。在檢定期間，維持呈指數生長單層之細胞且將其保持在對數生長期，且在檢定過程期間未達到匯合。在塗布後24小時，添加中等規模物質之連續稀釋液且將細胞再培育72小時。在此培育之後，以CyQuantNF試劑處理細胞且使其在37℃下將染料併入細胞DNA中，歷時1小時。藉由在CytoFluor 4000儀器(Applied Biosystems,Framingham,MA)上在485nm激發及530nm發射下讀取螢光來定量總DNA。細胞暴露於藥物之總時間為72小時。在各實驗中均包括標準化合物以檢驗檢定效能及再現性。對測試化合物之抑制百分比作線性回歸分析以測定IC50 值。
如圖7中所示，在RH41細胞中，標記His之E1-GS10-I1(IC50 =0.009μM)以與IGFR結合物I1(IC50 =0.028μM)相當之效能抑制增殖。單獨EGFR結合物E1對此細胞株中之增殖具有極小影響(IC50 >12.5μM)。
如圖8中所示，在H292細胞中，標記His之E2-GS10-I1(IC50 =0.329μM)以大於IGFR結合物I1(IC50 =0.699μM)或EGFR結合物E2(IC50 =0.553μM)之效能抑制增殖。參看下表4中E及I單體之IC50值。
實例10：競爭性EGF配位體結合檢定
在基於細胞之競爭性EGF配位體結合檢定中，在A431細胞中測試E/I結合物E1-GS10-I1、I1-GS10-E1、E2-GS10-I1及I1-GS10-E2(HTPP物質)，且與基於EGFR10 Fn3之結合物E1及E2(中等規模物質)相比較。將A431細胞以15000個細胞/孔塗於96孔培養盤中之DMEM+10% FBS中且培育48小時。以饑餓培養基(starvation media)(DMEM+0.1% BSA)洗滌細胞且於饑餓培養基中培育1小時。移除饑餓培養基且以於饑餓培養基中稀釋之基於10 Fn3之結合物替換，且在37℃下將細胞預培育30分鐘以使蛋白質與細胞表面上之EGF受體結合。將於饑餓培養基中稀釋之10nM最終濃度的標記銪(Eu)之EGF(Perkin Elmer,Boston,MA)添加至經預培育之細胞中，且在4℃下在黑暗中培育培養盤3小時。以冷PBS洗滌培養盤兩次且將50微升/孔增強溶液(Perkin Elmer,Boston,MA)添加至培養盤中且在37℃下培育1小時。在Flexstation II(Molecular Devices)上讀取培養盤。利用Softmax+軟體(Softmax plus software)對資料作圖，且計算IC50值，亦即抑制50% Eu-EGF配位體與細胞表面上之EGF受體結合所需之基於10 Fn3之結合物的濃度。
E2及E1與E2-GS10-I1、I1-GS10-E2、E1-GS10-I1及I1-GS10-E1比較之結果概括於表3中。此等資料表明基於E/I10 Fn3之結合物以與基於EGFR10 Fn3之結合物類似之效能與EGF競爭與A431細胞上EGFR受體之結合且抑制EGF與A431細胞上之EGFR受體結合。參看下表4中E及I單體之IC50值。
實例11：在基於細胞之檢定中之活化及信號傳導活性
藉由免疫墨點(immunoblotting)評估DiFi結腸癌細胞中各種基於E/I10 Fn3之結合物的靶作用。以每一25cm2 燒瓶中4×105 個細胞來接種細胞且在37℃下於5% CO2 中培育隔夜。次日，開始處理且將細胞再培育在1.5至120小時之間之各種時間。接著將細胞溶解於HNTG(50mM Hepes、150mM NaCl、0.5%曲通X-100、8%甘油、2mM Na3 VO4 、1.5mM MgCl2 、1mM EDTA，含有蛋白酶抑制劑AEBSF、抑肽酶、抗纖維蛋白溶酶肽(leupeptin)、貝他定(bestatin)、胃蛋白酶抑制劑-A(pepstatin-A)及E64)中，且以BCA蛋白質檢定(Pierce,Waltham,MA)定量總蛋白質。藉由20微克總蛋白質之SDS-PAGE分析，接著將蛋白質轉移至硝化纖維素且用專一性抗體進行免疫墨點來偵測總EGFR、總IGF1R之含量及EGFR、MAP激酶蛋白ERK1/2同功異型物之磷酸化狀態。亦以β-肌動蛋白探測墨點以顯示各樣本具有相等負載。
在此檢定中，聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物E1-GS10-I1(SEQ ID NO:55)、E2-GS10-I1(SEQ ID NO:56)及E3-GS10-I1(SEQ ID NO:53)均顯示降解EGFR之能力。另外，對於E3-GS10-I1(SEQ ID NO:53)，亦觀察到IGF1R降解。圖10中展示聚乙二醇化結合物E2-GS10-I1對EGFR降解之影響，以及對信號傳導分子之其他影響。另外，未聚乙二醇化型式之結合物E2-GS10-I1顯示類似之EGFR降解(資料未圖示)。圖10展示對於聚乙二醇化結合物I1-GS10-E2，不存在EGFR降解。下表4概括E單體之各種特性。
實例12：對於裸小鼠中生長之H292腫瘤異種移植物上之某些基於E/I 10 Fn3之結合物的評估
在H292腫瘤異種移植模型中評估聚乙二醇化E/I結合物E2-GS10-I1及E3-GS10-I1以及單株抗體帕尼單抗。對於活體內模型，帕尼單抗係以市售藥物之形式獲得且如上所述純化E/I結合物。在投藥至動物中之前，藉由測試在EGF刺激之pEGFR及IGF1刺激之pIGFR檢定中各目標物(end)在H292細胞中之功能性，來驗證所有E/I結合物之活體外活性。在實驗開始時，於磷酸鹽緩衝之生理鹽水(PBS)中稀釋E/I結合物且在2-4℃下儲存達各研究之持續時間。經腹膜內(i.p.)投與500微升/注射/小鼠之總體積之兩種化合物且在投與之前平衡至室溫。
小鼠及腫瘤繁殖 。5-6週齡之雌性無胸腺(裸)小鼠係自Harlan Sprague-Dawley Co.(Indianapolis,IN)獲得，且在將其用於腫瘤繁殖或藥物功效測試之前約3週進行隔離檢疫。無限制地向動物提供食物及水。在遵守AAALAC及Bristol-Myers Squibb準則之情況下進行動物護理。藉由在裸小鼠中經皮下(s.c)植入腫瘤來使其繁殖。約每二至四週發生腫瘤傳代。
活體內抗腫瘤測試 。使用下式計算估計腫瘤重量：腫瘤重量(mg)=(w2* 1)/2；其中w=寬度且1=長度(mm)。利用腫瘤生長抑制(TGI)%評估抗腫瘤活性，其中% TGI>50%被視為具有活性。相對腫瘤生長抑制%係以% TGI=[(Ct -Tt )/(Ct -C0 )]×10計算，其中Ct =對照小鼠在腫瘤植入之後時間t(天)時之中值腫瘤重量，Tt =經治療小鼠在時間t時之中值腫瘤重量，C0 =對照小鼠在時間0時之中值腫瘤重量。計算在1.5天之腫瘤體積倍增時間(tumor volume doubling times)後開始之各個時點的TGI%值且(可能時)持續達3天之腫瘤體積倍增時間(TVDT)之時間段。其中，TVDT=對照腫瘤達到目標尺寸之中值時間(天)-對照腫瘤達到目標尺寸之一半之中值時間(天)。治癒小鼠的定義為當在治療後超過10天之TVDT評定時腫瘤不可偵測或<35mg之小鼠。產生最大治療作用之化合物劑量稱為最佳劑量(OD)。具有超過一例由藥物毒性造成之死亡的治療組(通常8隻小鼠)視為接受過度毒性之治療且其資料不被用於抗腫瘤活性之評估中。最大耐受劑量(MTD)係定義為剛好低於出現過度毒性(亦即超過一例死亡)之劑量的劑量。在腫瘤達到目標尺寸之前死亡的經治療小鼠視為死於藥物毒性。使用葛漢氏一般化魏氏測試(Gehan's generalized Wilcoxon test)(Gehan,EA,A Generalized Wilcoxon Test for Comparing Arbitrarily Slightly-Censored Sam ples,Biometrika 52:203-223,1965)進行資料之統計學評估。
量測腫瘤之藥效學終點。 自未經治療或經藥物治療之小鼠收集腫瘤且在液氮中速凍。將樣本稱重且使每毫克組織在10μl溶解緩衝液(50mM Hepes、150mM NaCl、0.5%曲通X-100、8%甘油、2mM Na3 VO4 、1.5mM MgCl2 、1mM EDTA，含有每15ml緩衝液一粒complete小型蛋白酶抑制劑錠劑(Sigma #S8820)，及磷酸酶抑制劑混合物(Sigma #P5726))中均質化。用兩個刮刀將組織切碎放入100mm皮氏培養皿(petri dish)中，轉移至Falcon #2059聚丙烯圓底管中且以手持均質機離解30秒。將勻漿轉移至1.5ml艾本德管(eppendorf tube)中且在微量離心機(microfuge)中以15000×g離心2分鐘。將澄清上清液轉移至新管中且以Pierce BCA蛋白質檢定(Pierce Biotechnology)測定總蛋白質濃度。藉由免疫墨點或根據製造商之建議在Meso scale MSD Sector Imager 6000多點檢定系統(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)上分析樣本。
在無胸腺小鼠中之H292 NSCLC中測試聚乙二醇化E/I結合物E2-GS10-I1及E3-GS10-I1。將腫瘤以1mm3 H292腫瘤片段皮下植入後脅(hind flank)中，且使其在腫瘤植入後第6天起始治療之前達到50-150mg之尺寸。按照TIWX3時程經腹膜內投與劑量為100mg/kg之聚乙二醇化E/I結合物以評定抗腫瘤活性。帕尼單抗係以市售藥物之形式獲得，且按照Q3DX5時程以1毫克/小鼠之最佳劑量及0.1毫克/小鼠之較低劑量經腹膜內投與。圖12A中展示計算的8隻小鼠之群組之平均腫瘤尺寸。1毫克/小鼠及0.1毫克/小鼠劑量之帕尼單抗因分別具有101%及100%之TGI%值而為具活性的，且此等值明顯不同於對照動物(p=0.0002，表5)。聚乙二醇化E2-GS10-I1因具有96%之TGI%值而亦為具顯著活性的(p=0.0005)。聚乙二醇化E3-GS10-I1在此研究中不具活性(TGI%值為31%)，其與對照組在統計學上並無不同(p=0.416)。給藥後之分析表明約三分之二之聚乙二醇化E3-GS10-I1聚集(在一批中具有66.64%聚集體/33.36%單體，且在另一批中為72.53%聚集體/27.47%單體)，其可解釋在此檢定中聚乙二醇化E3-GS10-I1具有不良活性之原因。相反地，聚乙二醇化E2-GS10-I1在給藥後之研究中顯示僅較小百分比之聚集(1.79%聚集體/98.21%單體)。
在整個研究過程中，所有治療均為良好耐受的，無治療相關死亡或過度體重減輕。臨床觀察揭示在整個療法過程中在可接受之界限內並無毒性及平均重量變化之證據(圖12B)。
自H292腫瘤研究得到之藥效學終點。 分析來自未經治療對照組、經帕尼單抗及經E/I結合物治療之組之腫瘤樣本中磷酸化EGFR、ErbB2及IGFR之含量(其將指示靶抑制)。亦分析腫瘤中之總EGFR含量以確定是否發生EGF受體降解。在第20天，投與最後一次治療且在給藥後1小時自2隻動物、在給藥後4小時自3隻動物及在給藥後24小時自3隻動物移除腫瘤。所有治療均顯示對磷酸化EGFR及ErbB2之顯著抑制，而磷酸化IGFR之基礎含量過低以致不能辨別此研究之差異(圖13)。所有治療均顯示總EGFR量之減少，表明已發生受體降解。
實例13：對IGF1R抑制劑具有抗性之MCF7細胞的選擇及表徵
在37℃下，在5% CO2 存在下於含有10mM hepes及10% FBS之RPMI培養基中培養MCF7細胞(美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)，目錄號HTB-22,Manassas,VA)。將小分子IGF1R抑制劑BMS-754807添加至培養基中，且經10個月時間以逐步增量增大濃度直至細胞在200mM BMS-54807存在下顯示持續增殖。抗性細胞指定為MCF7r，且如在如先前所述(Carboni等人，Cancer Res. 69:161-170(2009))進行之增殖檢定中所量測，BMS-754807之IC50值為1239nM，而親本MCF7細胞之IC50值為120nM。接著自培養基中移除藥物且使MCF7r細胞在完全培養基中再傳代20或60天以移除所有痕量之殘餘BMS-754807。藉由免疫墨點對MCF7r細胞進行之分析揭示與親本MCF7細胞相比較，抗性細胞中明顯過度表現EGFR(圖14)。另外，當使MCF7及MCF7r細胞血清饑餓且接著以EGF刺激7分鐘時，在親本MCF7細胞中不能偵測到磷酸化EGFR(可能歸因於EGFR含量較低)，但在MCF7r細胞中明顯可見磷酸化EGFR。在經IGF配位體刺激之血清饑餓細胞中，在親本MCF7細胞中見到磷酸化IGFR，然而儘管MCF7r細胞中存在略微較高含量之總IGFR，但幾乎無法觀察到pIGFR。此顯示抗性MCF7r細胞中之IGFR喪失對IGF1刺激起反應而活化IGFR之能力(圖14)。如藉由pERK活化所量測，在MCF7r細胞中對EGF刺激起反應而活化MAP激酶路徑較強。
實例14：MCF7及MCF7r異種移植物中之抗腫瘤研究
在T75燒瓶中擴增MCF7r細胞且藉由離心分離。以Vi-CELL XR(Beckman Coulter,Fullerton,CA)藉由錐蟲藍排除(trypan blue exclusion)來量測活細胞數目，再懸浮於PBS中達到5×106 個活細胞/毫升且以0.2ml體積經皮下植入無胸腺小鼠之後脅中。對於MCF7及MCF7r腫瘤生長，所有小鼠均補充有0.25mg經90天釋放之17-β-雌二醇片(Innovative Research of America,Sarasota,FL,目錄號NE-121)。腫瘤繁殖直至其達到500-1000mg之中值尺寸，此時將其切除且將1mm3 片段再植入新無胸腺小鼠之後脅中。在小鼠中藉由連續套管針傳代(serial trocar passage)至少生長四輪使腫瘤適於實體腫瘤生長，在此期間監測各代之腫瘤體積倍增時間及成瘤率(take rate)。觀察生長特徵以確定該等異種移植物是否顯示充當可靠、可再現模型可接受之特性。MCF7r型腫瘤顯示可接受之成瘤率及倍增時間且因此滿足用作異種移植模型之準則。先前已使用相同技術建立了MCF7親本腫瘤模型。對於MCF7親本異種移植物，將1mm3 腫瘤片段經皮下植入後脅中且使其在腫瘤植入後第13天起始治療之前達到50-150mg之尺寸。西妥昔單抗係以市售藥物之形式獲得，且按照Q3DX5時程(在第13、16、19、22、25天投與劑量)以1毫克/小鼠之最佳劑量及0.1毫克/小鼠之較低劑量經腹膜內投與。圖15A中展示計算的8隻小鼠之群組之平均腫瘤尺寸。在MCF7異種移植模型中，1毫克/小鼠及0.1毫克/小鼠劑量之西妥昔單抗因TGI%值分別為-9%及3.2%而不具活性，且腫瘤尺寸與對照組在統計學上並無不同(表6)。
對於MCF7r抗性異種移植物，將1mm3 腫瘤片段經皮下植入後脅中且使其在腫瘤植入後第6天起始治療之前達到50-150mg之尺寸。西妥昔單抗係以市售藥物之形式獲得，且按照Q3DX5時程(在第6、9、12、15、18天投與劑量)以1毫克/小鼠之最佳劑量及0.1毫克/小鼠之較低劑量經腹膜內投與。圖15B中展示計算的8隻小鼠之群組之平均腫瘤尺寸。在MCF7r異種移植模型中，西妥昔單抗之劑量因TGI%值分別為105%及75%而為具活性的。高劑量西妥昔單抗具有超過100%之TGI值，此表明其使腫瘤消退至小於起始治療時之開始尺寸。兩種劑量均使腫瘤尺寸在統計學上顯著不同於對照組(表7)。
實例15：GEO異種移植物中之抗腫瘤研究
藉由將1mm3 腫瘤片段經皮下植入無胸腺小鼠之後脅中且使其在腫瘤植入後第18天起始治療之前達到50-150mg之尺寸，從而形成GEO腫瘤。按照Q3DX5時程(在第18、21、24、27、30天投與劑量)以0.25毫克/小鼠經腹膜內投與西妥昔單抗。按照QDX21時程以25mg/kg投與IGFR激酶抑制劑BMS-754807。圖16中展示計算的8隻小鼠之群組之平均腫瘤尺寸。0.25毫克/小鼠之西妥昔單抗為具活性的(TGI%值為67%)。BMS-754807為具活性的(TGI%值為80%)，且兩者之組合之活性明顯高於任一單獨藥劑(TGI%值為94%)(表8)。所有治療組均在統計學上不同於對照組(第26天)(表8)。
實例16：H292異種移植物中之抗腫瘤研究
將H292細胞以1mm3 片段形式經皮下植入無胸腺小鼠之後脅中且使其在腫瘤植入後第12天起始治療之前達到50-150mg之尺寸。按照Q3DX5時程以0.1毫克/小鼠經腹膜內投與西妥昔單抗。MAB391為抗IGF1R抗體(R＆D Systems,Minneapolis,MN,目錄號MAB391)且按照BIWX3時程以40mg/kg之劑量投與。圖17中展示計算的8隻小鼠之群組之平均腫瘤尺寸。0.1毫克/小鼠之西妥昔單抗為具活性的(TGI%值為95.1%)且40mg/kg之MAB391為不具活性的(TGI%值為10.5%)(表9)。給予西妥昔單抗與MAB391之組合的小鼠顯示109.2%之TGI%值，表明組合組中腫瘤消退(表9)。在停止給藥之後，經西妥昔單抗治療之組中之腫瘤比經西妥昔單抗與MAB391組合治療之組更快地再生長(圖17)。
實例17：群落形成檢定
為測定測試化合物對抑制H292細胞群落形成之能力的影響，將400個細胞接種至24孔培養盤(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ,目錄號351143)中之完全培養基中且使其黏附隔夜。次日，移除培養基且以含有2% FBS之培養基替換。將測試化合物稀釋至含有2% FBS之培養基中且將連續稀釋液添加至細胞中。在37℃下培育細胞14天。14天之後，棄置培養基且以2ml PBS沖洗各孔一次。以0.5ml考馬斯染色溶液(Coomassie Stain Solution)(Bio-Rad,Hercules,CA,目錄號161-0436)將細胞染色20分鐘。抽吸染色劑且以1X脫染色溶液考馬斯R-250(1X Destain Solution Coomassie R-250)(Bio-Rad,目錄號161-0438)迅速洗滌各孔。以每孔1ml水進行最後一次沖洗且倒置培養盤並使之乾燥。在較低放大倍數(10X-20X)下對由(至少) 50個或50個以上細胞組成之群落進行目測計數。一式三份測試所有樣本且由對照組抑制百分比之線性回歸來計算IC50值。圖18中展示聚乙二醇化E/I結合物之代表性結果，且表10中展示各種基於E/I10 Fn3之結合物、基於IGF1R10 Fn3之單專一性結合物及EGFR抗體之IC50值。
實例18：抗原決定基定位檢定
利用市售抗體開展抗原決定基定位檢定，對於該等抗體，根據各種文獻報導粗略瞭解其在EGFR細胞外域上之結合位點。此檢定中所用之抗體列於表11中且圖19A描繪抗體如何定位以接近EGFR之結合域。該檢定為先前所述之細胞內西方檢定的變體，且評定與A431或其他表現EGFR之細胞預培育之基於EGFR10 Fn3之結合物阻斷結合來自表11中所列之全部抗體之偵測抗體的能力。如下進行檢定：藉由胰蛋白酶化來收集處於對數期生長之A431細胞且以24,000個細胞/孔(總體積為100微升/孔)接種於96孔培養盤中。次日，倒出培養基且將於冷DMEM基培養基中稀釋的基於EGFR10 Fn3之結合物添加至培養盤中且使其在4℃下結合1小時以防止EGFR內化。結合之後，以0.2ml PBS+0.1%吐溫20洗滌細胞且在室溫下在PBS+3.7%甲醛中固定20分鐘。在室溫下，在0.2ml奧德賽阻斷緩衝液中阻斷細胞1小時。接著，以每孔50μl奧德賽阻斷劑稀釋一級抗體且在室溫下培育1-2小時。藉由倒置培養盤來倒出一級抗體，且以200μl PBS+0.1%吐溫20洗滌各孔3次。二次抗體為與用於細胞內西方檢定中相同之抗體且適於所偵測抗體種類。將此等二次抗體以奧德賽阻斷劑+0.2%吐溫20稀釋(1:800)，且將其與以(1:3000)稀釋之TOPRO3(Invitrogen,Carlsbad,CA,目錄號T3605)一起以每孔50μl之體積添加至對比染色細胞中以供校正。在室溫下在實驗台上培育細胞1小時。倒出二次抗體且在室溫下以200μl PBS+0.1%吐溫20洗滌各孔4次歷時5分鐘。在Licor儀器上以160μm解析度、中等品質、3mm之偏焦量、強度5取得培養盤影像。此檢定亦以市售藥物抗體西妥昔單抗、帕尼單抗及尼妥珠單抗進行，以確定基於EGFR10 Fn3之結合物是否干擾其與A431細胞上之EGFR的結合。圖19B中展示代表性結果。
吾人已使用各種方法確定EGFR單體E3與EGFR之域I結合。因為其他E單體在各種實驗中具有類似特性，所以認為其他E單體亦與EGFR之域I結合。
實例19：I單體之特性
基於可溶纖維結合蛋白之骨架蛋白的BIAcore分析
使用BIAcore 2000或3000生物感測器(Pharmacia Biosensor)量測I單體與靶結合之動力學。利用IGF-IR-Fc融合物來開展捕獲檢定。Forbes等人(Forbes等人，2002,European J. Biochemistry,269,961-968)中已描述類似試劑。將人類IGF-IR之細胞外域(胺基酸1-932)選殖至含有人類IgG1之鉸鏈區及恆定區之哺乳動物表現載體中。質體之短暫轉染產生融合蛋白IGF-IR-Fc，隨後藉由蛋白質A層析純化且藉由胺偶合將其捕獲至固定於Biasensor CM5晶片上之蛋白質A上。動力學分析涉及將IGF-IR-Fc捕獲至蛋白質A上，接著注射基於纖維結合蛋白之骨架蛋白溶液，且藉由甘胺酸(pH 2.0)再生蛋白質A表面。獲得各濃度之感測器圖譜，且使用程式Biaevaluation,BIA Evaluation 2.0(BIAcore)加以評估以測定速率常數ka (kon )及kd (koff )。由速率常數比koff /kon 計算解離常數KD 。通常，評估一系列濃度(2μM至0μM)之經純化基於纖維結合蛋白之骨架蛋白與蛋白質A所捕獲之人類IGF-IR-Fc融合蛋白的結合。
對於測定與人類胰島素受體結合之實驗，遵照Biacore(Uppsala,Sweden)所建議之標準程序，藉由胺基鍵聯將重組人類胰島素受體(IR)及重組人類VEGF-R2-Fc與CM5 Biasensor晶片直接偶合。簡言之，將稀釋於乙酸鹽4.5中之60μg/mLIR偶合/固定於流槽2上達到8300RU之含量，且將稀釋於乙酸鹽5.0中之11.9μg/mL VEGF-R2-Fc固定於流槽3上達到9700RU之含量。在FC1上製備空白參照表面。藉由減去所觀察到的空白參照流槽1之結合來計算與IR或VEGF-R2-Fc之專一性結合。將基於纖維結合蛋白之骨架蛋白於HBS-EP(10mM Hepes、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%界面活性劑P20)中稀釋至10μM，且在25℃下以20μL/min經3分鐘注射至各流槽中，且經10分鐘觀察解離。
基於細胞之受體阻斷檢定
將人類乳腺癌MCF-7(ATCC,Manassas,VA)以每孔50,000個細胞之濃度塗於24孔培養盤中含有10%胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)之RPMI 1640(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。次日，在由含有0.1% BSA(Sigma,St. Louis,MO)之RPMI 1640組成的結合緩衝液中洗滌細胞，且接著在冰上在200μL含有IGF-IR競爭劑之結合緩衝液中預培育30分鐘。在預培育階段之後，將相當於約60000計數/分鐘之40pM[125 I]-IGF-I(Perkin Elmer,Wellesley,MA)添加至各孔中，且在溫和攪拌下在冰上再培育三小時。接著以含有0.1% BSA之冰冷PBS洗滌各孔。以500μL由0.1% SDS+0.5N NaOH組成之緩衝液溶解細胞。使用Wallac 1470 γ計數儀(Perkin Elmer,Wellesley,MA)量測溶解產物之放射性，且使用SigmaPlot(Systat Software,Point Richmond,CA)分析資料。
pIGFR檢定
評估基於纖維結合蛋白之骨架蛋白與Fc之融合物抑制Rh41人類橫紋肌肉瘤細胞中IGF-1R磷酸化之能力。採用西方墨點法來評估I單體抑制Rh41人類橫紋肌肉瘤細胞中IGF-1R磷酸化之能力。以IGF-I、IGF-II、胰島素配位體(50ng/ml)刺激細胞，或不進行刺激(NS)，且接著以各種濃度之I單體處理。以磷酸-專一性抗體探測膜。
Rh41(人類橫紋肌肉瘤及H929人類多發性骨髓瘤)中之細胞增殖
在暴露於試劑72小時之後，藉由將[3 H]-胸苷併入DNA中來評估增殖。將Rh41細胞以3500個細胞/孔之密度塗於96孔微量滴定盤中，且在24小時後將其暴露於多種濃度之I單體。在37℃下培育72小時之後，以4μCi/ml[3 H]胸苷(Amersham Pharmacia Biotech,UK)脈衝標記(pulsed)細胞3小時，胰蛋白酶化，收集於UniFilter-96GF/B培養盤(PerkinElmer,Boston,MA)上，且在TopCount NXT(Packard,CT)上量測閃爍。結果係以IC50值表示，其為抑制細胞增殖並使其降低至未經處理對照細胞之50%所需之藥物濃度。數據為三個重複孔之平均值，同時展示標準偏差。
I單體表徵之結果如下表12中所示。
實例20：基於EGFR 10 Fn3及基於IGF-IR 10 Fn3之單專一性及雙重專一性結合物之其他特徵
使用mRNA呈現之生物化學選擇技術(其中蛋白質係與其編碼核酸序列共價連接)來鑑別結合EGFR或IGF-IR之基於10 Fn3之結合物。將當提供1至10nM之濃度之受體時結合IGF-IR或EGFR的基於10 Fn3之蛋白質-mRNA融合物群體選殖至大腸桿菌中且表現為基於10 Fn3之蛋白質。鑑別出阻斷EGFR或IGF-IR信號傳導且具有適當生物物理特性的靶結合物之子集(表13)。優化此等初始純系在越來越低之靶濃度下進行再次mRNA選擇之靶結合親和力及細胞效能以及對於較低解離速率常數之選擇。在選擇程序期間獲得之IC50 值在9nM至304nM之範圍內，說明自構築基於10 Fn3之雙重專一性結合物之多個效能值選擇分子之機會。藉由細胞內西方篩選檢定來測試基於EGFR10 Fn3之結合物對於EGFR及ERK(EGFR活化之下游信號傳導分子)磷酸化之阻斷(類似於實例1之方法)。對最佳的IGF-IR結合物進行類似研究。最佳之EGFR結合純系(E3、E1及E2)抑制EGFR在Y1068上之磷酸化且在活體外抑制ERK在p42/p44之Y204上之下游磷酸化，其中IC50 值在9nM至40nM範圍內，效能比親本EGFR純系高100倍以上(表13，類似於實例1之方法)。
I1以0.11nM之KD 值與IGF-IR結合且以0.2nM之IC50 值抑制IGF-I刺激之IGF-IR之磷酸化(表13，類似於實例6之方法)。根據尺寸排阻層析法，最佳之基於IGF-IR及EGFR10 Fn3之單域結合物>95%為單體，具有>56℃之熔融溫度(表13，類似於實例4之方法)，且如由EpiMatrix(6個環中有5個<7)(一種定位T細胞抗原決定基之基於矩陣之演算法)(De Groot AS,Moise L(2007) Prediction of immunogenicity for therapeutic proteins:state of the art. Curr Opin Drug Discovery Devel 10:332-340)所預測，其顯示最小免疫原性可能。選擇基於10 Fn3之結合物E1、E2及E3以進行進一步研究，且如自Biacore檢定所測定，其具有在0.7nM至10nM範圍內之EGFR結合常數(表13，類似於實例5之方法)。如藉由使用標記銪之EGF的置換檢定(類似於實例10之方法)所量測，此等基於10 Fn3之結合物結合EGFR與EGF結合EGFR相競爭(表13)。類似地，I1抑制IGF-I與IGF-IR結合(表13，類似於實例19之方法)。
基於10 Fn3之雙重專一性結合物的生物物理表徵。所選基於E/I10 Fn3之結合物的Tm 值在49-58℃之範圍內，且其SEC概況表明該蛋白質>90%為單體(表14，類似於實例4之方法)。儘管基於10 Fn3之單專一性結合物與基於E/I10 Fn3之結合物展示相當之結合親和力，但當基於10 Fn3之單域結合物連接在一起時Tm 值略有降低(表13及14)。為增大活體內應用之血清半衰期，以40kDa分支PEG聚乙二醇化基於E/I10 Fn3之結合物(類似於實例3之方法)。基於E/I10 Fn3之結合物之聚乙二醇化因締合速率常數減小而使其結合親和力相對於未聚乙二醇化之構築體降低10至20倍，但並不降低Tm 。此外，聚乙二醇化不會顯著降低對細胞中EGFR/IGF-IR磷酸化之抑制。根據ELISA，聚乙二醇化E-I定向(其中EGFR結合物在N端，且IGF1R在C端)顯示比I-E定向略低之抑制EGFR及IGF-IR磷酸化之IC50 值。儘管發現聚乙二醇化E-I定向與I-E定向之間存在極小之KD 值及生物活性差異，但不存在一致趨勢。
實例21：基於E/I 10 Fn3之結合物之物種交叉反應性
使用表面電漿共振(BIAcore)分析(方法與實例5一致)來分析聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物與來自小鼠、大鼠及猴之EGFR的結合親和力。小鼠EGFR係購自R＆D systems(Minneapolis,MN)，大鼠EGFR為自製的，且猴EGFR係購自KEMP(Frederick,MD)。
如表15中所示，所有聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物均以低奈莫耳濃度之親和力結合小鼠、大鼠及猴EGFR，表明所有聚乙二醇化E/I結合物均與人類、小鼠、大鼠及猴EGFR交叉反應。
實例22：其他基於E/I 10 Fn3之結合物之表徵
圖43概括其他基於E/I10 Fn3之結合物之各種特徵。
使用如先前在實例1中所述之方法測試聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物，以測定對A431中EGF誘導之EGFR及ERK磷酸化之抑制。結果顯示聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物以在12nM-297nM範圍內之IC50值抑制EGF誘導之EGFR磷酸化，且以在12nM-295nM範圍內之IC50值抑制ERK磷酸化(圖43，a及b行)。
亦使用先前在實例6及7中所述之方法在H292細胞中檢驗聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物抑制IGFR及EGFR活性之能力。結果表明聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物以在0.2nM-6nM範圍內之IC50值抑制IGFR活性(圖43，d行)且以在1.3nM-123nM範圍內之IC50值抑制EGFR活性(圖43，c行)。
測試聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物，以確定其是否能在Difi細胞中誘導EGFR及IGFR降解，如圖43之e及f行中所示。以1μM聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物處理細胞且在自7小時時開始且在120小時時結束之間之各時點收集，且藉由西方墨點分析測定EGFR及IGF1R含量。將降解強度評為(+)，表明該串聯降解該受體但降解並未持續，且受體表現在該時程期間再出現；或評為(++)，表明該串聯降解該受體且在整個時程中持續該降解。結果(圖43，e及f行)顯示，聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物呈現各種模式之EGFR及IGF1R降解：僅IGFR降解、EGFR與IGFR均降解或任一受體均未降解。所測試之串聯均未顯示僅降解EGFR之能力。
藉由如先前在實例5中所述之表面電漿共振(BIAcore)分析來評定聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物與EGFR及IGF1R之結合親和力。結果顯示聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物以介於3.35nM-57.9nM之間之範圍內的親和力與EGFR結合，且以介於0.37nM-2.43nM之間之範圍內的親和力與IGF1R結合(圖43，g及h行)。
使用如先前在實例10中所述之方法測試聚乙二醇化之基 於E/I10 Fn3之結合物，以測定其阻斷EGF與A431細胞表面上之EGFR結合的效能。聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物以在19.5nM至238nM範圍內之IC50值阻斷EGF與A431細胞的結合(圖43，i行)。
使用實例17中所述之方法評定聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物抑制H292細胞群落形成之能力。如圖43j行中所示，聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物以在1nM-560nM範圍內之IC50值抑制群落形成，且四種所測試聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物中有三種的效能比抗EGFR單株抗體帕尼單抗高23-140倍。第四種聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物的效能比帕尼單抗低4倍。聚乙二醇化I1單體僅具有有限之抑制H292群落形成之活性(其中IC50>15μM)，且因為H292細胞之生長主要係由EGFR信號傳導而非IGF1R信號傳導推動，所以此係在預料之中。
藉由DSC(如先前在實例4中所述)或熱染熔融法(thermal dye melt methodology)評定聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物的熔融溫度。在熱染熔融法評定中，將聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物於50mM NaAc緩衝液(pH 4.5)中稀釋至0.2mg/mL。將1μL於DMSO緩衝液中之200x Sypro Orange(最終濃度為0.5%染料)外加至各樣本。將各樣本裝載至96孔盤中且塗布5μL矽油。使盤以1,000RPM短暫離心且裝載至Bio-Rad CFX96系統上，且選擇以下方法：25℃下10分鐘+培養盤讀取(以0.5℃增量將25℃升至95℃，歷時15分鐘)+培養盤讀取。利用CFX軟體對拐點進行資料 分析。如圖43k行所示，所有聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物均具有類似的Tm量測值(在49-62.5攝氏度之範圍內)。聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物的Tm量測值與濃度無關且在所有測試濃度下均保持一致。在於PBS中1mg/ml之蛋白質濃度下以15-95℃之掃描範圍量測的例示性結合物聚乙二醇化I1-GS10-E5之DSC分析得到55.2℃的Tm量測值，如圖20中所示。
如先前在實例4中所述，對聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物進行尺寸排阻層析(SEC)。如圖43(表之1行)中所示，SEC分析揭示所有聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物>95%為單體。
實例23：具有所選胺基酸變化之基於E/I 10 Fn3之結合物聚乙二醇化I1-GS10-E5的生物化學及生物物理特性
在無6HIS標籤情況下且對連接區產生各種改變來構築聚乙二醇化I1-GS10-E5。另外，對第一單體之C端尾具有天冬胺酸變為麩胺酸(D變為E)之單點變化的所有構築體進行全局改變。製得所選絲胺酸殘基突變成半胱胺酸(S變為C)之若干純系以提供替代性聚乙二醇化位點。比較此等變化對分子之生物化學及生物物理特性的影響且將其概括於表16中。實例7中描述量測pEGFR抑制之方法，實例6中描述量測pIGFR抑制之方法，實例1中描述量測pERK抑制之方法，實例4中描述量測Tm值之方法，實例5中描述量測EGFR及IGFR KD之方法。亦對此等純系進行詳細的結合動力學分析且呈現於表17及18中(使用與實例5中所述類似之方法)。
(1)無His標籤用於此構築體。(2)對聚乙二醇化I1-GS10-E5之所有替代性構築體 (其中第一單體之C端尾具有天冬胺酸變為麩胺酸(D變為E)之單點變化)均進行 全局改變。(3)I1單體經GSGC加GS8與E5連接。(4)I1經GS10與E5連接且E5尾 部存在GSGC。(5)I1經GS10與E5連接，其中I1在位置62具有絲胺酸變為半胱 胺酸之單點變化。(6)I1經GS10與E5連接，其中E5在位置62具有絲胺酸變為半 胱胺酸之單點變化。(7)I1經GS10與E5連接，其中I1在位置91具有絲胺酸變為 半胱胺酸之單點變化。(8)I1經GS10與E5連接，其中E5在位置91具有絲胺酸變 為半胱胺酸之單點變化。(9)此構築體顯示與流槽之非專一性結合，因此在此 實驗中不可能精確測定親和力。
(1)無His標籤用於此構築體。(2)對聚乙二醇化I1-GS10-E5之所有替代性構築體(其中第一單體之C端尾具有天冬胺酸變為麩胺酸(D變為E)之單點變化)均進行全局改變。(3)I1單體經GSGC加GS8與E5連接。(4)I1經GS10與E5連接且E5尾部存在GSGC。(5)I1經GS10與E5連接，其中I1在位置62具有絲胺酸變為半胱胺酸之單點變化。(6)I1經GS10與E5連接，其中E5在位置62具有絲胺酸變為半胱胺酸之單點變化。(7)I1經GS10與E5連接，其中I1在位置91具有絲胺酸變為半胱胺酸之單點變化。(8)I1經GS10與E5連接，其中E5在位置91具有絲胺酸變為半胱胺酸之單點變化。
(1)無His標籤用於此構築體。(2)對聚乙二醇化I1-GS10-E5之所有替代性構築體(其中第一單體之C端尾具有天冬胺酸變為麩胺酸(D變為E)之單點變化)均進行全局改變。(3)I1單體經GSGC加GS8與E5連接。(4)I1經GS10與E5連接且E5尾部存在GSGC。(5)I1經GS10與E5連接，其中I1在位置62具有絲胺酸變為半胱胺酸之單點變化。(6)I1經GS10與E5連接，其中E5在位置62具有絲胺酸變為半胱胺酸之單點變化。(7)I1經GS10與E5連接，其中I1在位置91具有絲胺酸變為半胱胺酸之單點變化。(8)I1經GS10與E5連接，其中E5在位置91具有絲胺酸變為半胱胺酸之單點變化。
實例24：EGFR與IGFR之共用下游信號傳導路徑之抑制
以與先前在實例8中所述一致之pAKT ELISA分析下游信號傳導路徑之抑制。此研究之結果顯示聚乙二醇化I1-GS10-E5比單獨聚乙二醇化I1更有效地阻斷H292細胞中IGF1刺激之AKT活化。單獨EGFR單專一性結合物聚乙二 醇化E5不能有效防止IGF1刺激之AKT活化(圖21)。
實例25：藉由基於 10 Fn3之結合物及比較抗體抑制細胞增殖
如實例9中所述進行H292及RH41細胞增殖實驗。基於EGFR10 Fn3之單專一性結合物聚乙二醇化E5以0.016μM之IC50值抑制H292細胞增殖。基於IGFR10 Fn3之單專一性結合物聚乙二醇化I1具有>8.4μM之IC50值，而相比之下，基於E/I10 Fn3之結合物聚乙二醇化I1-GS10-E5略微有效，其IC50值為0.006μM(圖22)。H292細胞株為肺癌細胞株且對IGFR及EGFR之抑制敏感(Akashi Y等人(2008)Enhancement of the antitumor activity of ionising radiation by nimotuzumab,a humanised monoclonal antibody to the epidermal growth factor receptor,in non-small cell lung cancer cell lines of differing epidermal growth factor receptor status.Br.J.Cancer 98：749-755；及Buck E等人(2008)Feedback mechanisms promote cooperativity for small molecule inhibitors of epidermal and insulin-like growth factor receptors.Cancer Res.68：8322-8332.)。相比之下，僅聚乙二醇化I1-GS10-E5結合物及聚乙二醇化I1結合物抑制RH41細胞增殖(IC50值分別為0.0002μM及0.0004μM，圖23)。此係在預料中，因為RH41為已知主要由IGFR信號傳導推動之兒童橫紋肌肉瘤細胞株(Huang F等人(2009).The mechanisms of differential sensitivity to an insulin-like growth factor-1 receptor inhibitor(BMS-536924)and rationale for combining with EGFR/HER2 inhibitors.Cancer Res.69:161-170)，且因此對EGFR阻斷不敏感。
實例26：在活體外藉由聚乙二醇化及未聚乙二醇化之基於 10 Fn3之結合物抑制受體活化及下游信號傳導
為瞭解EGFR/IGFR信號傳導及其經聚乙二醇化I1-GS10-E5抑制之動力學，使DiFi、H292或BxPC3細胞血清饑餓，暴露於1μM或0.1μM之聚乙二醇化E5、聚乙二醇化I1或聚乙二醇化I1-GS10-E5或者媒劑對照物2小時，接著以EGF、IGF-I或EGF+IGF-I刺激10分鐘。
在活體外培養細胞，使其血清饑餓隔夜且接著暴露於基於10 Fn3之結合物2小時，隨後以100ng/ml EGF或IGF刺激。在溶解緩衝液((1%曲通X-100、5%甘油、0.15M NaCl、20mM Tris-HCl(pH 7.6)、Complete蛋白酶抑制劑混合物錠劑[Roche,Indianapolis,IN]及磷酸酶抑制劑混合物2[Sigma-Aldrich Corp.])中製備細胞溶解產物。藉由SDS-PAGE解析溶解產物(30μg)，轉移至膜，且利用抗體對在含0.1%吐溫20之奧德賽阻斷緩衝液(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)中之磷酸-EGFR及總EGFR(Santa Cruz Biotechnology,Carlsbad,CA)、磷酸-AKT(Ser 473)、磷酸-p44/42 MAPK(Thr202/Tyr204)(Cell Signaling Technology,Beverly,MA)或總肌動蛋白(Chemicon International,Temecula,CA)進行免疫墨點分析。將膜與適當二次抗體一起培育。使用LI-COR Biosciences奧德賽紅外成像系統進行蛋白質觀測。
如圖24中所示，在血清剝奪(serum deprivation)之後，幾乎不能偵測到磷酸化EGFR、IGF-IR及AKT之基礎含量。在DiFi細胞中，聚乙二醇化I1-GS10-E5或聚乙二醇化E5(單專一性EGFR結合物)均不能夠完全抑制EGF刺激之EGFR磷酸化。在H292及BxPC3細胞中，聚乙二醇化I1-GS10-E5與聚乙二醇化E5對於EGFR磷酸化均存在強烈抑制。在DiFi及BxPC3細胞中，聚乙二醇化I1-GS10-E5阻斷IGF刺激之IGFR磷酸化的能力強於單獨聚乙二醇化I1(單專一性IGFR結合物)。在H292細胞中，僅當阻斷EGFR時，IGF刺激才能交叉活化EGFR。在DiFi中，聚乙二醇化I1-GS10-E5抑制EGF刺激之pAKT；在EGF刺激之H292中pAKT增加，而在BxPC3 EGF中並不活化pAKT。在DiFi、H292及BxPC3細胞中，聚乙二醇化I1-GS10-E5抑制IGF刺激之pIGFR的能力強於單獨之個別聚乙二醇化E5及聚乙二醇化I1。聚乙二醇化I1-GS10-E5對DiFi、H292或BxPC3中EGF刺激之pERK具有極小(若有的話)影響。IGF刺激在任何所檢驗之細胞株中均不誘導pERK。
在利用未聚乙二醇化之基於10 Fn3之結合物之另一實驗中，使H292細胞血清饑餓，暴露於1μM未聚乙二醇化之單專一性EGFR結合物E2、IGFR結合物I1或E2-GS10-I1或者媒劑對照物1小時，接著以EGF、IGF-I或EGF+IGF-I刺激10分鐘。在血清剝奪之後，幾乎不能偵測到磷酸化EGFR、IGFR及AKT之基礎含量(圖25)。EGF刺激誘導EGFR磷酸化，但並不轉活化IGFR。由E2及E2-GS10-I1可阻斷EGFR之磷酸化，但I1不能。類似地，IGF-I刺激誘導IGFR之劇烈磷酸化，其被I1及E2-GS10-I1阻斷，但不能被E2阻斷。EGF刺激僅使AKT磷酸化略微增加，而IGF-I或EGF+IGF-I強烈誘導AKT磷酸化，其受I1與E2-GS10-I1抑制而降低至基礎含量。IGF-I與EGF之組合誘導AKT磷酸化的能力強於任一單獨生長因子。E2部分降低由EGF與IGF-I之組合誘導的pAKT。然而，I1顯示最顯著之pAKT降低，表明以EGF+IGF-I刺激係經由IGFR路徑引起AKT之強烈磷酸化。令人驚訝地是，以E2阻斷EGFR路徑，接著以EGF配位體刺激實際上會增加AKT之磷酸化，此或許歸因於AKT之活化與EGFR無關(Dobashi Y等人(2009) EGFR-dependent and independent activation of Akt/mTOR cascade in bone and soft tissue tumors. Mod Pathol(Epub Ahead of Print)。此等結果說明在EGFR及IGFR路徑與反饋機制之間存在複雜的串話(cross-talk)。
實例27：利用基於E/I 10 Fn3之結合物進行之競爭結合研究
在Biacore競爭實驗中，使用標準EDC/NHS醯胺偶合化學將EGFR-Fc(3μg/mL於乙酸鈉(pH 5.0)中)固定於Biacore CM5晶片表面上，達到300 RU之表面密度。EGFR抗體係以市售藥物形式獲得，且藉由結合450nM E2(30μL/min，200秒接觸時間)，緊接著450nM單獨E2或者450nM E2加450nM西妥昔單抗、帕尼單抗或尼妥珠單抗之混合物(30μL/min，200秒接觸時間)來評定單專一性EGFR結合物E2與抗體之間關於結合EGFR-Fc的競爭。使用兩次10秒之50mM NaOH脈衝(流動速率為30μL/min)在各循環之間成功再生表面。初始注射E2展示與晶片表面上EGFR之結合。第二次注射E2與等量西妥昔單抗、帕尼單抗或尼妥珠單抗之混合物展示E2並不與抗體競爭與EGFR之結合(圖26A)。
利用表面電漿共振(BIAcore)分析說明基於E/I10 Fn3之結合物同時接合(simultaneous engagement)經捕獲EGFR-Fc及溶液相IGF1R。重組人類EGFR-Fc(人類EGFR細胞外域之胺基酸1-645與人類Fc之融合物)係購自R＆D systems(Minneapolis,MN)。重組IGF1R(經蛋白水解裂解且與二硫化物連接的人類IGF1R前肽之胺基酸1-932)係購自R＆D systems(Minneapolis,MN)。為說明同時接合，遵照製造商之建議(GE Healthcare,Piscataway,NJ)，將抗人類IgG固定於CM5晶片之流槽1及2上。將EGFR-Fc(50nM)以10μL/min捕獲於流槽2上，歷時2分鐘。藉由以10μL/min將基於10 Fn3之蛋白質樣本(100nM)注射至兩個流槽上保持2分鐘來達成基於E/I10 Fn3之結合物與EGFR-Fc之結合。藉由隨後以30μL/min將IGF1R(0,100nM)注射至兩個流槽上保持2分鐘來探測EGFR-Fc及IGF1R之同時接合。監測複合物之解離300秒。使用兩次30秒之3M MgCl2 注射自抗人類IgG表面再生經結合複合物。利用Biacore T100評估軟體2.0.1版(GE healthcare/Biacore)重疊各感測器圖譜且移除airspike。如圖26B中所示，基於E/I10 Fn3之結合物之兩個域均具功能性且能夠與EGFR-Fc與IGF1R同時結合。
如實例5中所述藉由Biacore評定聚乙二醇化E2-GS10-I1與HER家族受體之結合專一性。將HER-2-Fc、HER-3-Fc及HER-4-Fc(R＆D Systems)捕獲於具有抗人類IgG之CM5晶片表面上。聚乙二醇化E2-GS10-I1在可見與EGFR-Fc(HER-1)之穩固結合之條件下並不顯示任何可辨別之與其他HER家族成員之結合(表19)。
實例28：量測血漿生物標誌
量測在異種移植研究結束時小鼠血漿中或在治療後之各個時刻無腫瘤小鼠中可溶生物標誌TGFα及mIGF1之含量。藉由終端心臟穿刺收集至含有EDTA作為抗凝血劑之管中來獲得血液。藉由在4℃下以1300×g離心血液10分鐘且移除澄清上清液至獨立管中來製備血漿。根據製造商(R&D Systems,Minneapolis,MN)之建議利用ELISA檢定，量測0.1ml血漿中之TGFα含量，量測0.02ml血漿中之mIGF1含量。在以聚乙二醇化I1-GS10-E5或單專一性EGFR結合物聚乙二醇化E5治療之小鼠中，TGFα之血漿含量提高，但以西妥昔單抗治療之小鼠不能(圖27A-C)。TGFα可自人類腫瘤分泌或可為內源性小鼠TGFα。由於人類與小鼠TGFα之間具有高同源性(93%胺基酸一致)，故ELISA可與小鼠TGFα交叉反應。此外，由植入腫瘤分泌之人類TGFα可與小鼠EGFR結合。因為聚乙二醇化I1-GS10-E5及聚乙二醇化E5可結合人類與小鼠EGFR，所以所有宿主及腫瘤EGFR 結合位點均經此等基於10 Fn3之結合物阻斷，而西妥昔單抗並不結合小鼠EGFR。為確定此等基於10 Fn3之結合物是否使內源性小鼠TGFα增加及ELISA是否與小鼠TGFα交叉反應，對無腫瘤裸小鼠給予100mg/kg聚乙二醇化I1-GS10-E5，且在給藥後4、24、48、72小時獲取血漿樣本。實際上觀察到在過去72小時裏一直持續之小鼠TGFα之增加(圖28A)。亦以小鼠專一性ELISA測試來自無腫瘤小鼠之血漿樣本中的mIGF1且亦觀察到此配位體之增加(圖28B)。
實例29：各種基於E/I 10 Fn3之結合物之活體內人類腫瘤異種移植研究的結果
在頭對頭(head-to-head)H292 NSCLC研究(實例12中所述之方法)中評估低於先前所用之劑量之若干基於E/I10 Fn3之結合物以便發現相對活性之差異。比較0.625毫克/小鼠之單次劑量的基於E/I10 Fn3之結合物聚乙二醇化E2-GS10-I1、聚乙二醇化E4-GS10-I1、聚乙二醇化I1-GS10-E5、聚乙二醇化I1-GS10-E85、聚乙二醇化I1-GS10-E4、聚乙二醇化I1-GS10-E105與兩種劑量(1毫克/小鼠及0.1毫克/小鼠)之帕尼單抗的功效。
在此研究中藉由腫瘤生長抑制(TGI)終點評估兩種劑量之帕尼單抗及所有基於E/I10 Fn3之結合物均為具活性的。在給藥階段期間，聚乙二醇化E4-GS10-I1、聚乙二醇化I1-GS10-E5、聚乙二醇化I1-GS10-E4及帕尼單抗均使腫瘤消退(表20，TGI值大於100%)，而聚乙二醇化E2-GS10-I1、聚乙二醇化I1-GS10-E85及聚乙二醇化I1-GS10-E105引起 腫瘤生長抑制(表20，TGI值高至100%)。當與對照組相比較時，活性差異為統計學上顯著的。在整個研究過程中，所有治療均良好耐受，且無治療相關死亡或過度體重減輕。基於E/I10 Fn3之結合物與帕尼單抗之功效之比較呈現於下表20及圖29中。在圖29A中，截止至第43天之量測值展示在停止給藥後腫瘤之再生長模式。圖29B展示截止至第27天之量測值且擴大y軸以說明各治療組間活性之相對差異。
a 媒劑為磷酸鹽緩衝之生理鹽水。所用縮寫如下：ip，腹膜內途徑；%TGI，相對腫瘤生長抑制%，其係以%TGI=[(Ct -Tt )/(Ct -C0 )]×100計算，其中Ct =對照小鼠在腫瘤植入之後時間t(天)時之中值腫瘤重量，Tt =經治療小鼠在時間t時的中值腫瘤重量，C0 =對照小鼠在時間0時之中值腫瘤重量。TGI%值係以兩點以第20天、第24天及第27天之平均抑制計算得到。結果，若治療方案產生統計學上顯著之>50%之TGI%值，則認為該治療方案為有效的；q3dx5；6，在腫瘤植入後第六天開始每隔兩天投與化合物，共計六劑；6on/1off；6，一天一次投與化合物歷時6天，接著不加治療1天，且在腫瘤植入後第六天開始此方案。p值係在第20天時相對於對照組以雙尾配對分析計算(每組8個量測值)。
在各種異種移植模型中使用實例12中所述之方法，以下文所選之基於E/I10 Fn3之結合物進行進一步活體內研究各種異種移植模型之描述如下：H292係非小細胞肺癌(NSCLC)且較詳細地描述於實例12中；MCF7r乳癌係描述於實例14中；且GEO結腸癌係描述於實例15中。DiFi人類結腸癌表現高含量之活性EGFR且亦表現IGFR；RH41為已知主要由IGFR信號傳導推動之兒童橫紋肌肉瘤細胞株(Huang F等人(2009)The mechanisms of differential sensitivity to an insulin-like growth factor-1 receptor inhibitor(BMS-536924)and rationale for combining with EGFR/HER2 inhibitors.Cancer Res.69：161-170)且因此對EGFR阻斷不敏感；Cal27為表現高含量EGFR及中等含量IGFR之人類頭及頸癌；BxPC3為人類胰腺癌；且H441為NSCLC。
所選基於E/I10 Fn3之結合物之功效比較呈現於表21中。在此等功效研究中，所有基於E/I10 Fn3之結合物均顯示與帕尼單抗相當之活性，且所有治療均能夠使H292腫瘤消退至小於其起始尺寸，如由超過100%之TGI%值所指示。在DiFi研究中，1毫克/小鼠劑量之帕尼單抗使腫瘤消退且0.1毫克/小鼠之劑量為具活性的，而所有基於E/I10 Fn3之結合物均不具活性，但聚乙二醇化I1-GS10-E5顯示出對腫瘤生長之某種程度抑制(TGI=43.8%)。在RH41研究中，任一劑量之帕尼單抗均無活性，聚乙二醇化E2構築體無活性，而基於E/I10 Fn3之結合物及聚乙二 醇化I1構築體均具有活性。圖32展示在RH41模型中代表性構築體聚乙二醇化E2-GS10-I1之抗腫瘤功效(資料亦展示於表22中)。在Cal27研究中，1毫克/小鼠劑量之帕尼單抗使腫瘤消退且0.1毫克/小鼠之劑量為具活性的，但在基於E/I10 Fn3之結合物中，僅E/I10 Fn3構築體聚乙二醇化I1-GS10-E5為具活性的。
設計用於評定協同作用之利用聚乙二醇化I1-GS10-E5以及個別I1及E5組件進行之人類腫瘤異種移植研究的結果呈現於表22中。此等組合(協同作用)研究係構造成包括基於E/I10 Fn3之結合物之個別部分(亦即IGFR及EGFR單專一性聚乙二醇化型式)，以致能辨別除經分離端之貢獻外的抗腫瘤作用。在MCF7r研究中，聚乙二醇化I1無活性，而聚乙二醇化E5、(聚乙二醇化E5+聚乙二醇化I1)及聚乙二醇化I1-GS10-E5純系均有活性且顯示類似活性，意謂所有抗腫瘤活性均可能來自EGFR之抑制，且阻斷IGFR路徑並不提供任何增強。1毫克/小鼠劑量之西妥昔單抗使腫瘤消退且0.1毫克/小鼠之劑量無活性。BMS-754807亦無活性，表明以小分子抑制劑阻斷IGFR路徑在此模型中不會產生功效。
在BxPC3研究中，聚乙二醇化I1無活性，而聚乙二醇化E5及(聚乙二醇化E5+聚乙二醇化I1)純系有活性(TGI分別為61.2%及68.8%)。聚乙二醇化I1-GS10-E5純系的活性(TGI=78%)比產生該純系之個別部分高，且根據雙尾配對T測試，該差異為統計學上顯著的，表明其在此模型中具 有協同活性。所有研究劑量之西妥昔單抗均有活性，但藉由將其與聚乙二醇化I1組合來增加對於IGFR之抑制並不產生協同作用。
在GEO研究中，聚乙二醇化I1無活性，而聚乙二醇化E5及(聚乙二醇化E5+聚乙二醇化I1)及聚乙二醇化I1-GS10-E5純系有活性(TGI分別為83.5%、92.1%及92.1%)。儘管在此模型中可能藉由將EGFR與IGFR抑制組合在一起提供某種程度之增強，但差異並不顯著高於單獨聚乙二醇化E5。兩種研究劑量之西妥昔單抗均有活性，但藉由將其與聚乙二醇化I1組合來增加對於IGFR之抑制並不產生協同作用。
在H441研究中，單獨聚乙二醇化I1及聚乙二醇化E5均無活性，但(聚乙二醇化E5+聚乙二醇化I1)有活性(TGI=54.5%)。聚乙二醇化I1-GS10-E5純系的活性(TGI=69.2%)比產生該純系之個別部分高，但差異在統計學上並不顯著，表明其在此模型中提供增強之活性而非協同作用。1毫克/小鼠劑量之西妥昔單抗有活性且0.1毫克/小鼠之劑量無活性。藉由將其與聚乙二醇化I1組合來增加對於IGFR之抑制在此模型中並不引起任何增強。
a 對於所有治療，媒劑均為磷酸鹽緩衝之生理鹽水。所用縮寫如下：iP，腹膜內途徑；po，經口途徑；%TGI，相對腫瘤生長抑制%，其係以%TGI=[(Ct-Tt)/(Ct-C0)]×100計算，其中Ct=對照小鼠在腫瘤植入之後時間t(天)時之中值腫瘤重量，Tt=經治療小鼠在時間t時的中值腫瘤重量，C0=對照小鼠在時間0時之中值腫瘤重量。以兩點計算TGI%值：對於H292，第19天與第23天之平均抑制；對於DiFi，第39天與第41天之平均抑制；對於RH41，第34天與第37天之平均抑制(1-6組)以及第35天、第36天及第39天之平均抑制(7-10組)；對於Cal27，第18天與第20天之平均抑制。結果，若治療方案產生統計學上顯著之>50%之TGI%值，則認為該治療方案有效；q3dx5；6，在腫瘤植入後第六天開始每隔兩天投與化合物，共計六劑；TIWX3；6，一週三次投與化合物歷時3週且在腫瘤植入後第六天開始此方案。對於H292在第23天、對於DiFi在第39天、對於RH41在第37天(1-6組)及第39天(7-10組)且對於Cal27在第20天相對於對照組以雙尾配對分析計算p值(每組8個量測值)。
a 對於所有治療，媒劑均為磷酸鹽緩衝之生理鹽水。所用縮寫如下：ip，腹膜 內途徑；po，經口途徑；%TGI，相對腫瘤生長抑制%，其係以%TGI=[(Ct- Tt)/(Ct-C0)]×100計算，其中Ct=對照小鼠在腫瘤植入之後時間t(天)時之中值腫 瘤重量，Tt=經治療小鼠在時間t時的中值腫瘤重量，C0=對照小鼠在時間0時 之中值腫瘤重量。以兩點計算TGI%值：對於MCF7r，第22天與第26天之平均 抑制；對於BxPC3，第23天與第27天之平均抑制；對於GEO，第29天與第31 天之平均抑制；且對於H441，第17天與之平均抑制。結果，若治療方案產生 統計學上顯著之>50%之TGI%值，則認為該治療方案有效；q3dx5；6，在腫瘤 植入後第六天開始每隔兩天投與化合物，共計六劑；TIWX3；6，一週三次投 與化合物歷時3週且在腫瘤植入後第六天開始此方案。對於MCF7r在第26天、 對於BxPC3在第27天、對於GEO在第29天且對於H441在第17天相對於對照組 以雙尾配對分析來計算p值(每組8個量測值)。
實例30：各種基於E/I 10 Fn3之結合物在小鼠中之藥物動力學概況
經由腹膜內注射評定小鼠中聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物E2-GS10-I1的藥物動力學概況。經腹膜內給予每劑量組三隻裸小鼠10及100mg/kg於PBS中調配之E2-GS10-I1，在給藥前、給藥後0.5、2、4、8、12、24、48、72、96、144及168小時，收集血漿樣本至檸檬酸磷酸葡萄糖溶液中。使用開發用於偵測及定量血漿樣本中聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物的定量電化學發光(ECL)檢定來評定血漿樣本中聚乙二醇化之基於E2-GS10-I1 Fn3之結合物的含量。在此檢定中，在4℃下將對EGFR結合區具有專一性之小鼠單株抗體吸附至Meso Scale Discovery盤隔夜以允許捕獲血漿樣本中聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物。將血漿樣本添加至該等盤中且在22℃下培育1小時。藉由對基於E/I10 Fn3之結合物之骨架區具有專一性的兔多株抗體與連接SULFO-TAG之山羊抗兔抗體之混合物偵測所捕獲的聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物。在洗滌以移除未結合之SULFO-TAG試劑之後，添加讀取緩衝液(read buffer)且使用ECL偵測。基於與聚乙二醇化之基於E2-GS10-I1 Fn3之結合物之標準曲線的4參數擬合比較來計算血漿樣本中聚乙二醇化E2-GS10-I1之含量。
經腹膜內(ip)投與10mg/kg或100mg/kg聚乙二醇化E2-GS10-I1之小鼠分別產生約200μg/mL及1700μg/mL之峰值含量，顯示與劑量成正比之藥物動力學(圖30)。以與下文 段落中所述類似之方式計算圖30之藥物動力學參數(注意「T 1/2」可與「HL_λ_z」互換，且AUC可與「AUCINF_obs」互換)。小鼠中聚乙二醇化E2-GS10-I1之半衰期為15.75±1.52小時(圖30)。根據此等藥物動力學參數，在人類腫瘤異種移植研究中每週三次(TIW)投與100mg/kg能夠保持比活體外IC50值高10至100倍的藥物含量。
對若干聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物進行其他藥物動力學實驗，其中向小鼠經腹膜內(ip)投與10mg/kg或100mg/kg，且對於聚乙二醇化I1-GS10-E5，經皮下(sc)投與10mg/kg或64mg/kg，如上所述收集血漿且加以分析以量測聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物的含量。藉由血漿(血清)濃度相對於時間資料之非隔室模型分析獲得此等各種基於E/I10 Fn3之結合物之藥物動力學參數。使用WinNonlin軟體(5.1版，Pharsight Corp.Mountain View CA)計算終末半衰期(terminal half-life)(HL_λ_z)、最大觀測濃度(Cmax)、自時間點零外推至無限大之曲線下面積(AUCINF_obs)、清除率(CL_F_obs)、終末期之分布體積(Vz_F_obs)及外推至無限大之平均滯留時間(MRTINF_obs)。如圖44及圖31中所示，結果顯示聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物的半衰期係介於12.1-20.9小時之間。
實例31：藥效學
在研究結束時自表21中所述之H292及DiFi異種移植模型取樣，且如實例12中在量測腫瘤之藥效學終點 下所略述進行處理以分析EGFR及IGFR蛋白以及磷酸化EGFR及IGFR之總含量。如實例11中所述藉由免疫墨點法評估聚乙二醇化I1-GS10-E5及帕尼單抗之目標作用。在圖33A中，在DiFi異種移植模型研究結束時，經聚乙二醇化I1-GS10-E5處理之腫瘤中總EGFR、pEGFR及總IGFR之含量低於未經處理之腫瘤。在圖33B中，pEGFR含量在經帕尼單抗及聚乙二醇化I1-GS10-E5處理之腫瘤中較低。總EGFR之含量僅在經聚乙二醇化I1-GS10-E5處理之腫瘤中較低，而在經帕尼單抗處理之腫瘤中並非如此。總IGFR之含量在經聚乙二醇化I1-GS10-E5處理之腫瘤中與在一個經帕尼單抗處理之腫瘤中均較低，而在另一經帕尼單抗處理之腫瘤中並非如此。此等模型中pIGFR之量均過低以致在處理之後不能偵測到差異。以GAPDH探測免疫墨點以說明蛋白質具有相等負載。
實例32：基於EGFR 10 Fn3之結合物之優化及共同序列分析
基於10 Fn3之結合物679F09(如PCT WO 2009/102421中所述)(圖34)係鑑別為與EGFR胞外域-Fc融合蛋白(R＆D Systems)之結合物。使用塗有EGFR-Fc及基於10 Fn3之結合物(與其核酸編碼序列偶合)之珠粒來選擇結合活性(例如參看Xu等人，Directed Evolution of High-Affinity Antibody Mimics Using MRNA Display,Chem. Biol. 9:933-942(2002))。亦鑑別在BC、DE及FG環之胺基酸序列中具有改變之親本EGFR結合物679F09的更有效之變異體。
序列分析I：所選與EGFR高親和力結合之所有基於 10 Fn3之結合物
為了揭示確定對EGFR具有強親和力之序列模式，使用若干方法分析所有獨特EGFR結合序列(1044)。首先，藉由各環中各位置之胺基酸的頻率來分析序列(圖35-38)。僅分析各環之獨特序列。
自上述序列分析，確定以下主要序列基元：
1號序列基元
(a)　BC環：位置7-8(亦即對應於SEQ ID NO:1之位置29及30)之「YQ」
(b)　DE環：位置3(亦即對應於SEQ ID NO:1之位置54)之脂族殘基(「V/I/L/M/A」)
(c)　FG環：位置1(亦即對應於SEQ ID NO:1之位置77)之「D/N」
所有所分析之1044序列(除一個序列外)均遵循FG環序列模式(c)。在所有所分析之獨特序列中，BC環有90%遵循模式(a)且DE環有95%遵循模式(b)。所有所分析之序列(除四個序列之外)均遵循上述三種模式中之至少兩種。另外，15個胺基酸之FG環長度為值得注意之序列特徵。
除上文確定之1號主要序列基元之外，亦使用圖35-38中之資料確定基於各位置之優勢殘基(dominant residue)的第二序列基元。若頭3個頻率最高的胺基酸之總和具有大於50%之頻率，則此基元中包括該等殘基。
2號序列基元
(a)　BC環：XXXXXXYQ(與1號基元相同)，其中X為任何胺基酸
(b) DE環：(G/Y/H)(D/M/G)(V/L/I) X，其中X為任何胺基酸
(c) FG環，10個胺基酸之長度：
(D/N)(Y/M)(Y/A/M)(Y/H/F)(K/Q/V)(E/P/R)(Y/T/K) X(E/Y/Q)(Y/G/H)，其中X為任何胺基酸
(d) FG環，15個胺基酸之長度：
D(Y/F/W)(Y/F/K)(N/D/P)(P/H/L)(A/T/V)(T/D/S)(H/Y/G)(E/P/V)(Y/H)(T/K/I)(Y/F)(H/N/Q)(T/Q/E)(T/S/I)
用以確定1號及2號序列基元之分析法將評估各環內之每一殘基位置。為了揭示環內跨越多個殘基之任何序列基元，對基於10 Fn3之結合物進行進一步分析。在此分析中，使用ClustalW(Thompson JD等人，CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Researc h 22 :4673-4680,1994)比對環序列。自此比對，使用手動檢查將序列家族分組。對於BC及DE環，觀察到類似於1號及2號序列基元之序列模式。然而，可確定10及15個胺基酸長之FG環的其他序列基元。
3號序列基元
(a) 10個胺基酸長之FG環
(1) DY(A/Y) GKPYXEY，其中X為任何胺基酸
(2) DY(A/Y) Y(K/R/Q/T) PYXEY，其中X為任何胺基酸
(3) (D/N) Y(A/Y)(Y/F)(K/R/Q/T) EYXE(Y/H)，其中X為任何胺基酸
(4) DYY(H/Y) X(R/K) X(E/T) YX，其中X為任何胺基酸
(5) DYY(H/Y)(K/H/Q)(R/K) T(E/T) Y(G/P)
(6) (D/N)MMHV(E/D) YXEY，其中X為任何胺基酸
(7) DYMHXXYXEY(類似於679F09之FG環)，其中X為任何胺基酸
(8) D(M/Y)YHX(K/R)X(V/I/L/M)YG，其中X為任何胺基酸
(b) 15個胺基酸長之FG環
(1) D(Y/F)(Y/F)NPXTHEYXYXXX，其中X為任何胺基酸
(2) D(Y/F)(Y/F)D(P/L)X(T/S)HXYXYXXX，其中X為任何胺基酸
(3) D(Y/F)(K/R) PHXDGPH(T/I) YXE(S/Y)，其中X為任何胺基酸
序列分析II：對於EGFR磷酸化顯示更有效之抑制的基於 10 Fn3之結合物
對在基於細胞之檢定中顯示最有效活性的基於10 Fn3之結合物之子集進行另一總體序列分析(與序列分析I相對，其係經由Profusion對所選與EGFR高親和力結合之所有結合物進行)。因為許多結合物僅用於基於細胞之單點檢定，所以在此分析中包括在100nM之固定濃度下顯示大於75%之對於EGFR磷酸化之抑制的結合物。在既定濃度下之抑制百分比與IC50值有關：抑制%=100×濃度/(濃度+IC50)。
通常藉由擬合各種濃度之抑制%數據來計算IC50值。然而，假定各結合物僅得到單一數據點，則使用此單一數據點計算IC50值係不適當的。因此，使用在單一濃度點下EGFR信號傳導之抑制百分比作為結合物效能之近似值。儘管結合物在100nM之濃度下可顯示75%抑制，但增加濃度將會使該純系在較高濃度下顯示100%抑制。抑制%與IC50成逆相關；亦即抑制%愈高，則IC50值愈低且結合物愈有效。若結合物在100nM之濃度下顯示75%抑制，則認為其為達成序列分析II之目的之「有效」結合物。然而，在100nM濃度下顯示小於75%抑制之結合物在極大程度上仍與EGFR結合且仍會影響EGFR信號傳導。舉例而言，抗EGFR單株抗體尼妥珠單抗(Friedlander E等人，ErbB-directed immunotherapy:antibodies in current practice and promising new agents.Immunol Lett 116: 126-140,2008)當前正被開發用作治療劑，但其在EGFR磷酸化檢定中在100nM濃度下顯示<5%抑制(資料未圖示)。圖45中展示所有經檢定之「有效」結合物之序列及其在100nM濃度下對於EGFR磷酸化之抑制%。
在100nM濃度下顯示>75%抑制之獨特的基於10 Fn3之結合物之總數為111。如前所述，首先藉由各環中各位置之胺基酸的頻率來分析序列(圖39-42)。因為此等結合物為在Profusion期間所選與EGFR高親和力結合之所有結合物的子集，所以其亦遵循1號序列基元(參看上文)。所有所分析之「有效」序列均遵循FG環序列模式(位置1為「D/N」)。在所有所分析之獨特「有效」序列中，93%遵循BC環模式(位置7-8為「YQ」)，且98%遵循DE環模式(位置3為脂族殘基(「V/I/L/M/A」))。所有所分析之「有效」序列均遵循1號序列基元之三種模式中之至少兩種。
值得注意的是，15個胺基酸之FG環長度似乎亦常常出現在最「有效」結合物中。儘管15個胺基酸長之FG僅佔所選與EGFR高親和力結合之所有結合物的55%(序列分析I)，但具有15個胺基酸之FG環佔在100nM濃度下對EGFR磷酸化具有超過50%抑制之結合物的86%，及具有超過75%抑制之結合物的91%(序列分析II中之「有效」結合物)。因此，較長之具有15個胺基酸的FG環似乎為與較大效能相關之序列模式。
在111種所分析之「有效」序列中，僅10種含有10個胺基酸長之FG環，且其中有6種為獨特的。因此，單一序列基元可涵蓋每一「有效」之具有10個胺基酸的FG環序列。根據此6種序列確定4號序列基元。
4號序列基元
10個胺基酸長之FG環，「有效」結合物
(D/N)(M/Y)(M/A/W)(H/F/Y)(V/K) EY(A/Q/R/S/T) E(Y/H/D)
具有15個胺基酸之FG環之「有效」結合物的序列分析亦進一步闡明哪個殘基位置最保守，從而得以確定5號序列基元。此序列基元中之「X」表示不存在三個優勢胺基酸之位置。
5號序列基元
15個胺基酸長之FG環，「有效」結合物
D(Y/F/W)(Y/F/K)(N/P/D)(P/H/L) X(T/D/S)(H/G/Y)(E/P/Y)(Y/H) XYXXX，其中X為任何胺基酸
所有所分析之EGFR結合物均為親本679F09之子代且構成序列「家族」，亦即其均與根據上述序列基元之序列相關。679F09結合物家族之各個成員可耐受T51I骨架突變且保留結合活性。因此，T51I骨架突變可與任一上述序列基元組合，以致亦產生與EGFR高親和力結合之結合物。
最後，應注意在蛋白質序列中，具有類似特性之胺基酸可經常經取代而對結構或功能具有極小影響或無影響。此實務上亦為基於10 Fn3之結合物之情況，其中環或骨架區中之保守性胺基酸取代仍能產生與EGFR結合之結合物。舉例而言，以「Y」取代結合物E98之FG環之第二位的「H」將產生結合物E99，且兩種結合物在抑制EGFR磷酸化方面顯示類似效能(圖45)。
圖1.I1-GS10-E2之SDS-PAGE分析。使由表現I1-GS10-E2且經HisTrap層析柱純化之HMS174(DE3)細菌細胞小球溶解得到的樣本在4-12% NuPAGE微型凝膠(minigel)上跑膠，且藉由Sypro-Orange染色且藉由STORM成像器觀測。標記12種分子量標準(色帶1)；溶解產物可溶(色帶2)；溶解產物不可溶(色帶3)；HisTrap裝載(色帶4)；非結合HisTrap(色帶5)；彙集之HisTrap溶離液(色帶6)；透析至50mM NaOAc、150mM NaCl(pH 4.5)中(色帶7)；透析至PBS中(色帶8)；透析至Tris、150 mM NaCl(pH 8.5)中(色帶9)；
圖2. A.經中等規模純化之I1-GS10-E2的SEC分析。將22μg透析至PBS(pH 7.4)中之經HisTrap純化的I1-GS10-E2裝載至移動相為100mM NaPO4 、100mM NaSO4 、150mM NaCl(pH 6.8)之Superdex 200 10/30 SEC管柱(GE Healthcare)上，且使用A280來量測。相對於球狀凝膠過濾標準物(BioRad)，I1-GS10-E2之主要溶離物為分子量範圍為約24.6kDa之單一單體物質。B. E2-GS10-I1之SEC分析；
圖3. A.進行PBS中經中等規模純化之I1-GS10-E2之差示掃描熱量測定(DSC)以測定Tm 。在3個大氣壓下以1度/分鐘之速率自5℃至95℃掃描1mg/ml I1-GS10-E2溶液。相對於對照PBS緩衝液之操作來分析資料。B. E2-GS10-I1之DSC；
圖4. H292細胞中IGFR活性之抑制。以100ng/mL IGF-1及100ng/mL EGF刺激細胞，且以●I1、□E1或ΔE1-GS10-I1 HTP製劑處理。藉由ELISA測定酪胺酸1131上IGFIR之磷酸化；
圖5. H292細胞中EGFR活性之抑制。以100ng/mL IGF-1及100ng/mL EGF刺激細胞，且以●I1、□E1或ΔE1-GS10-I1 HTPP製劑處理。藉由ELISA測定酪胺酸1068上EGFR之磷酸化；
圖6. H292細胞中AKT磷酸化之抑制。以100ng/mL IGF-1及100ng/mL EGF刺激細胞，且以●I1、□E1或ΔE1-GS10-I1 HTPP製劑處理。藉由ELISA測定絲胺酸473上AKT之磷酸化；
圖7. RH41細胞增殖之抑制。以●I1、□E1或ΔE1-GS10-I1 HTPP製劑處理細胞且測定增殖抑制百分比；
圖8. H292細胞增殖之抑制。以●I1、□E1或ΔE1-GS10-I1 HTPP製劑處理細胞且測定增殖抑制百分比；
圖9.　概述在基於細胞之功能檢定中經分離EGFR單連接素(mononectin)；在C端位置具有絲胺酸且未添加PEG之基於E/I10 Fn3之結合物；及在C端位置具有半胱胺酸且與40kDa分支PEG結合之基於E/I10 Fn3之結合物的IC50值。展示代表性資料；
圖10. E2在N端及C端位置之聚乙二醇化之基於E/I10 Fn3之結合物的免疫墨點分析。儘管兩種構築體在關於抑制EGFR之H292細胞檢定中顯示相當之活性，但E2在C端位置之基於E/I10 Fn3之結合物並不降解EGFR，而E2在N端位置之基於E/I10 Fn3之結合物則降解EGFR。兩種構築體在此細胞株中均展示極弱之IGFR降解甚至無IGFR降解。包括β-肌動蛋白以說明所有色帶具有相等負載。亦檢驗EGFR、ERK及Shc之磷酸化狀態；
圖11. H292細胞中EGF刺激之EGFR磷酸化之抑制。兩種構築體在關於抑制EGFR之H292細胞檢定中顯示相當之活性。E2-GS10-I1(具有PEG)(○)、I1-GS10-E2(具有PEG)(□)、帕尼單抗(----)；
圖12.　腫瘤異種移植研究之結果。圖12A：H292人類腫瘤異種移植模型中之臨床前抗腫瘤活性。展示由8隻小鼠之群組計算之以下之平均腫瘤尺寸(以mg表示)：對照動物(■)、給予100mg/kg E3-GS10-I1(w/PEG)(○)、給與100mg/kg E2-GS10-I1(PEG)(□)、給予1毫克/小鼠(Δ)或0.1毫克/小鼠(▽)帕尼單抗。x軸上之字母表示所投與之E/I結合物之劑量且p表示所投與之帕尼單抗之劑量。圖12B：展示在整個研究過程中各組之平均重量變化。各符號係如圖12A圖例中所述；
圖13. H292 NSCLC腫瘤異種移植模型中之藥效學影響。如實例12中所述測定腫瘤溶解產物中所示分析物之含量。(A)磷酸-EGFR、(B)磷酸-ErbB2、(C)磷酸-IGFR及(D)總EGFR。格紋條=帕尼單抗，空心條=E2-GS10-I1(具有PEG)，陰影線條=E3-GS10-I1(具有PEG)；
圖14. MCF7r細胞與MCF7親本細胞之西方墨點分析的比較；
圖15.　裸小鼠中進行之MCF7(圖A)及MCF7r(圖B)人類腫瘤異種移植研究。展示由每組8隻小鼠計算之兩種研究之平均腫瘤尺寸；
圖16.　裸小鼠中進行之GEO人類腫瘤異種移植研究；
圖17.　裸小鼠中進行之H292人類腫瘤異種移植研究；
圖18.利用H292 NSCLC細胞進行之群落形成檢定。A.展示單一培養盤之代表性資料。B.以誤差杠展示由三次重複量測計算之一種基於E/I10 Fn3之結合物的IC50值；
圖19.抗原決定基定位檢定。圖A中展示結合各種EGFR之抗體之抗原決定基結合位置。該等抗體之描述提供於實例18表11中。表11中左邊一行提供與圖A中所示之經編號抗體相關之各抗EGFR抗體之編號。圖B展示如實例18中所述之例示性抗原決定基定位檢定；
圖20.利用15-95℃之掃描範圍以於PBS中1mg/ml蛋白質濃度量測的基於E/I10 Fn3之結合物聚乙二醇化I1-GS10-E5之DSC分析，得到55.2℃之Tm量測值；
圖21.如藉由ELISA量測的基於E/I10 Fn3之結合物對H292細胞中AKT磷酸化之抑制的評估。就阻斷IGF1刺激之AKT磷酸化而言，聚乙二醇化I1-GS10-E5(○)比單獨聚乙二醇化I1(■)或單獨聚乙二醇化E5(▲)有效；
圖22.基於E/I10 Fn3之結合物對H292細胞中細胞增殖之抑制的評估。聚乙二醇化I1-GS10-E5(□)對於抑制H292細胞生長比單獨聚乙二醇化I1(▲)有效且單獨聚乙二醇化E5(●)對於抑制H292細胞生長僅具有微弱影響。以一式三份進行檢定。展示代表性資料；
圖23.基於E/I10 Fn3之結合物對RH41細胞中細胞增殖之抑制的評估。聚乙二醇化I1-GS10-E5(□)對於抑制RH41細胞生長比單獨聚乙二醇化I1(▲)略微有效且單獨聚乙二醇化E5(●)或帕尼單抗(虛線)對於抑制RH41細胞生長幾乎無影響。以一式三份進行檢定。展示代表性資料；
圖24.　基於10 Fn3之結合物(經聚乙二醇化)對配位體刺激之信號傳導之抑制。基於E/I10 Fn3之結合物(聚乙二醇化I1-GS10-E5)對DiFi、H292或BxPC3細胞中受體活化及細胞信號傳導之影響。使細胞血清饑餓且以1μM基於10 Fn3之結合物處理2小時，隨後以EGF、IGF1或EGF+IGF1之組合刺激。探測GAPDH以說明所有色帶中具有相等負載；
圖25.　基於10 Fn3之結合物(未聚乙二醇化)對H292細胞中配位體刺激之信號傳導之抑制。基於E/I10 Fn3之結合物(E2-GS10-I1)對H292細胞中受體活化及細胞信號傳導之影響。使細胞血清饑餓且以1μM基於10 Fn3之結合物處理2小時，隨後以EGF、IGF1或EGF+IGF1之組合刺激。探測GAPDH以說明所有色帶中具有相等負載；
圖26.　利用基於E/I10 Fn3之結合物之競爭性結合研究。A.基於EGFR10 Fn3之結合物不與EGFR競爭與EGFR抗體之結合。最初注射基於EGFR10 Fn3之結合物展示與晶片表面上之EGFR結合。第二次注射與等量西妥昔單抗、帕尼單抗或尼妥珠單抗混合之基於EGFR10 Fn3之結合物展示基於EGFR10 Fn3之結合物不與EGFR競爭與抗體之結合。B.基於E/I10 Fn3之結合物可同時結合EGFR及IGF-IR。最初注射基於E/I10 Fn3之結合物展示與固定於晶片表面上之EGFR結合。第二次注射基於E/I10 Fn3之結合物可溶IGF-IR展示sIGF-IR與經固定基於E/I10 Fn3之結合物之另一端結合；
圖27.　在異種移植研究之最後一次給藥之後4小時TGFα之血漿含量。分析在治療結束時自表24中所述之BxPC3、GEO及H441異種移植研究取得的血漿樣本之循環TGFα含量；
圖28.　在給予聚乙二醇化I1-GS10-E5後無腫瘤裸小鼠中TGFα及IGF1之血漿含量。給予無腫瘤小鼠單次劑量之基於聚乙二醇化I1-GS10-E510 Fn3之結合物且分析循環TGFα及IGF1含量；
圖29.　H292異種移植研究中使用基於E/I10 Fn3之結合物與使用帕尼單抗的比較。H292異種移植物未經處理(■)，或一週三次給予於PBS中調配之基於10 Fn3之結合物(其中個別構築體如圖式中所述)，或每隔兩天經腹膜內給予1毫克/小鼠(○)或0.1毫克/小鼠(□)帕尼單抗。基於10 Fn3之結合物及帕尼單抗(▲)之實際劑量在x軸上指示，其中三角形下方最接近x軸之帕尼單抗劑量指示基於10 Fn3之結合物之劑量；
圖30.　小鼠中聚乙二醇化E2-GS10-I1之藥物動力學參數概況；
圖31. 100mg/kg及10mg/kg IP以及10mg/kg及64mg/kg SC之各種基於E/I10 Fn3之結合物之半衰期的比較；
圖32. RH41模型中聚乙二醇化E2-GS10-I1之抗腫瘤功效；
圖33.　腫瘤中之藥效學終點之量測。在治療結束時，在最後一次給藥之後4小時自DiFi異種移植模型(圖A)及H292異種移植模型(圖B)移出腫瘤，且檢驗磷酸-EGFR、磷酸-IGFR、總EGFR及總IGFR之含量。將等量總蛋白質溶解產物裝載至凝膠之各色帶中，且亦以GAPDH探測各墨點以說明所有色帶中具有相等負載；
圖34.　抗EGFR結合物679F09之序列。變化之環殘基加下劃線；
圖35.　BC環序列分析I。EGFR結合序列之BC環中各位置之胺基酸的頻率。使用WebLogo產生影像(Crooks GE,Hon G,Chandonia JM,Brenner SE. WebLogo:A sequence logo generator.Genome Research ,14:1188-1190,2004)；
圖36.　DE環序列分析1。EGFR結合序列之DE環中各位置之胺基酸的頻率(分析263種獨特之DE環序列)；
圖37.　FG環(10個胺基酸長)序列分析I。具有10個胺基酸長之FG環的EGFR結合序列之FG環中各位置之胺基酸的頻率(分析228種獨特之10個胺基酸長之FG環)；
圖38.　FG環(15個胺基酸長)序列分析I。具有15個胺基酸長之FG環的EGFR結合序列之FG環中各位置之胺基酸的頻率(分析349種獨特之15個胺基酸長之FG環)；
圖39.　BC環序列分析II。所有「有效」序列之BC環中各位置之胺基酸的頻率(分析85種獨特之BC環序列)；
圖40.　DE環序列分析II。所有「有效」序列之DE環中各位置之胺基酸的頻率(分析60種獨特之DE環序列)；
圖41.　FG環(10個胺基酸長)序列分析II。具有10個胺基酸長之FG環的所有「有效」序列之FG環中各位置之胺基酸的頻率(分析6種獨特之10個胺基酸長之FG環)；
圖42. FG環(15個胺基酸長)序列分析II。具有15個胺基酸長之FG環的所有「有效」序列之FG環中各位置之胺基酸的頻率(分析65種獨特之15個胺基酸長之FG環)；
圖43.概括如實例22中所述之基於E/I10 Fn3之結合物的各種特徵之表；
圖44.概括如實例30中所述之基於E/I10 Fn3之結合物的各種藥物動力學參數之表；
圖45.如實例32中所述之E單體之胺基酸序列。各序列中之BC、DE及FG環均加下劃線；
圖46.野生型核心序列(SEQ ID NO:1之胺基酸9-94)與I1核心序列(SEQ ID NO:65)、E1核心序列(SEQ ID NO:66)、E2核心序列(SEQ ID NO:67)、E3核心序列(SEQ ID NO:68)、E4核心序列(SEQ ID NO:108)、E5核心序列(SEQ ID NO:114)、E85核心序列(SEQ ID NO:141)、E90核心序列(SEQ ID NO:156)、E96核心序列(SEQ ID NO:171)、E105核心序列(SEQ ID NO:186)及E112核心序列(SEQ ID NO:199)之比對。野生型序列中之BC、DE及FG環係以粗體展示且加下劃線。與野生型比較，I及E核心序列中實際上變化之胺基酸殘基係以粗體展示且加下劃線；
圖47. E及I單體之核酸序列。除非另有說明，否則核苷酸序列編碼具有N+10個N端延伸、Ser尾及his標籤之單體；及
圖48.基於E/I10 Fn3之結合物之核酸序列。所有核苷酸序列均編碼在構築體之第一單體上具有N+10個之N端延伸且在構築體之第二單體上具有Cys尾及his標籤之基於E/I10 Fn3之結合物。
(無元件符號說明)

Claims (14)

  1. 一種抗體樣蛋白質二聚體，其包含a)以小於500nM之KD 結合IGF-IR的第十纖維結合蛋白(fibronectin)第III型域(10 Fn3)與b)以小於500nM之KD 結合EGFR的10 Fn3共價或非共價連接；其中該IGF-IR結合之10 Fn3包含具有SEQ ID NO：3之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO：3之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO：3之胺基酸76-83中所述之胺基酸序列的FG環，及其中該EGFR結合之10 Fn3包含具有SEQ ID NO：112之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO：112之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO：112之胺基酸76-92中所述之胺基酸序列的FG環。
  2. 一種抗體樣蛋白質二聚體，其包含以小於500nM之KD 結合IGF-IR的第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)與以小於500nM之KD 結合EGFR的10 Fn3共價或非共價連接；其中該IGFIR結合之10 Fn3包含具有胺基酸序列Xa SARLKVAXb (SEQ ID NO：46)之BC環、具有胺基酸序列Xc KNVYXd (SEQ ID NO：48)之DE環，及具有胺基酸序列Xe RFRDYQXf (SEQ ID NO：50)之FG環；其中該EGFR結合之10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg WAPVDRYQXh (SEQ ID NO：137)之BC環、具有胺基酸 序列Xi RDVYXj (SEQ ID NO：138)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DYKPHADGPHTYHESXl (SEQ ID NO：139)之FG環；及其中X為任何胺基酸，a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k及l為獨立地選自0至5之整數。
  3. 如請求項2之抗體樣蛋白質二聚體，其中該IGF-IR結合之10 Fn3包含具有胺基酸序列SWSARLKVAR(SEQ ID NO：45)之BC環、具有胺基酸序列PKNVYT(SEQ ID NO：47)之DE環，及具有胺基酸序列TRFRDYQP(SEQ ID NO：49)之FG環；及EGFR結合之10 Fn3包含具有胺基酸序列SWWAPVDRYQ(SEQ ID NO：115)之BC環、具有胺基酸序列PRDVYT(SEQ ID NO：116)之DE環，及具有胺基酸序列TDYKPHADGPHTYHESP(SEQ ID NO：117)之FG環。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體樣蛋白質二聚體，其中該IGF-IR結合之10 Fn3具有與SEQ ID NO：3至少90%一致之胺基酸序列，及該EGFR結合之10 Fn3骨架具有與SEQ ID NO：112至少90%一致之胺基酸序列。
  5. 如請求項1至3中任一項之抗體樣蛋白質二聚體，其中該IGF-IR結合之10 Fn3係經由多肽連接子或聚乙二醇部分與該EGFR結合之10 Fn3共價連接。
  6. 如請求項5之抗體樣蛋白質二聚體，其包含與SEQ ID NO：126-132中任一者至少90%一致之胺基酸序列。
  7. 一種抗體樣蛋白質，其包含以小於500nM之KD 結合 EGFR的第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)，其中該EGFR結合之10 Fn3包含具有SEQ ID NO：112之胺基酸21-30中所述之胺基酸序列的BC環、具有SEQ ID NO：112之胺基酸51-56中所述之胺基酸序列的DE環，及具有SEQ ID NO：112之胺基酸76-92中所述之胺基酸序列的FG環。
  8. 一種抗體樣蛋白質，其包含以小於500nM之KD 結合EGFR的第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)，其中該EGFR結合之10 Fn3包含具有胺基酸序列Xg WAPVDRYQXh (SEQID NO：137)之BC環、具有胺基酸序列Xi RDVYXj (SEQ ID NO：138)之DE環，及具有胺基酸序列Xk DYKPHADGPHTYHESXl (SEQ ID NO：139)之FG環；其中X為任何胺基酸，a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k及l為獨立地選自0至5之整數。
  9. 如請求項8之抗體樣蛋白質，其中該EGFR結合之10 Fn3包含具有胺基酸序列SWWAPVDRYQ(SEQ ID NO：115)之BC環、具有胺基酸序列PRDVYT(SEQ ID NO：116)之DE環，及具有胺基酸序列TDYKPHADGPHTYHESP(SEQ ID NO：117)之FG環。
  10. 如請求項7至9中任一項之抗體樣蛋白質，其進一步包含第二個第十纖維結合蛋白第III型域(10 Fn3)。
  11. 如請求項10之抗體樣蛋白質，其中該第二個10 Fn3與IGF-IR結合。
  12. 如請求項10之抗體樣蛋白質，其中該第二個10 Fn3係經由多肽連接子或聚乙二醇部分與該EGFR結合之10 Fn3共價 連接。
  13. 一種醫藥學上可接受之組合物，其包含如請求項1至12中任一項之抗體樣蛋白質二聚體或抗體樣蛋白質，其中該組合物基本上無熱原質。
  14. 一種如請求項13之組合物的用途，其用於製造供治療個體之過度增生性病症之藥物。
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