PT2697257T - Proteínas de fusão fc compreendendo novos ligantes ou arranjos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

PROTEÍNAS DE FUSÃO FC COMPREENDENDO NOVOS LIGANTES OU

ARRANJOS

ANTECEDENTES A utilidade de muitos agentes terapêuticos, particularmente agentes biológicos como péptidos, polipéptidos e polinucleótidos, sofre de semividas séricas inadequadas. Isto requer a administração de tais agentes terapêuticos a elevadas frequências e%ou doses mais elevadas, ou a utilização de formulações de libertação sustentada, de modo a manter os níveis séricos necessários para os efeitos terapêuticos. A administração sistémica frequente de fármacos está associada com efeitos secundários negativos consideráveis. Por exemplo, as injeções sistémicas frequentes representam um desconforto considerável para o indivíduo, e apresentam um risco elevado de infeções relacionadas com a administração, e podem necessitar de hospitalização ou visitas frequentes ao hospital, em particular quando o agente terapêutico deve ser administrado por via intravenosa. Além disso, nos tratamentos a largo prazo, as injeções intravenosas diárias também podem conduzir a efeitos secundários consideráveis de cicatrização tecidual e patologias vasculares causadas pela punção repetida dos vasos. Problemas semelhantes são conhecidos para todas as administrações sistémicas frequentes de agentes terapêuticos, como, por exemplo, a administração de insulina a diabéticos, ou fármacos de interferão em pacientes que sofrem de esclerose múltipla. Todos estes fatores conduzem a uma diminuição da colaboração do paciente e a custos aumentados para o sistema de saúde.

Um método para aumentar a semivida sérica de uma proteína consiste em ligá-la a uma fração farmacocinética.

Um tipo de fração farmacocinética que foi utilizada é um domínio " Fc" de um anticorpo. Os anticorpos compreendem duas partes funcionalmente independentes, um domínio variável conhecido como "Fab", que se liga a antigénios, e um domínio constante conhecido como "Fc", que se liga a tais funções efetoras como a ativação do complemento e ataque por células fagocíticas. Um domínio Fc tem uma semivida sérica longa. Capon et al. 0 1989(, Nature 337: 525-31. Quando fundido a uma proteína terapêutica, um domínio Fc pode proporcionar uma semivida mais longa ou incorporar tais funções como ligação de recetor Fc, ligação de proteína A, fixação do complemento e, talvez até, transferência placentária.

Os conjugados de moléculas de ligação à base de fibronectina e outras frações como domínios Fc são descritos nos documentos WO 2009%083804 e US 2011%009323.

Este pedido proporciona novas proteínas de fusão Fc que aumentam a semivida sérica de vários agentes terapêuticos, polipéptidos que têm semivida sérica aumentada e ácidos nucleicos que codificam os ditos polipéptidos. Adicionalmente, são descritos no presente documento métodos para aumentar a semivida sérica de agentes terapêuticos.

SUMÁRIO 0 pedido proporciona polipéptidos que compreendem um domínio Fc de imunoglobulina e um domínio 10Fn3, em que o domínio 10Fn3 está fundido ao terminal C do domínio Fc por um ligante polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90 ® idêntica à SEQ ID NO: 84 OU SEQ ID NO:86.

Num aspeto, o polipéptido compreende: E a( um domímo 10Fn3 que tem uma sequência de aminoácidos alterada em relação à sequência de tipo selvagem, em que o domínio 10Fn3 se liga a uma molécula alvo com uma KD inferior a 500 nM; M b ( um domínio Fc de imunoglobulina I Ig(; e 0 ai(na sequência de dobradiça.

Em determinadas formas de realização, o polipéptido pode ter o seguinte arranjo desde o terminal N até ao terminal C: dobradiça-domínio Fc-ligante-domínio 10Fn3.

Em formas de realização exemplificativas, o polipéptido é um dímero. 0 dímero forma-se preferentemente através de uma ligação de dissulfureto entre resíduos de cisteína livres na região de dobradiça.

Em determinadas formas de realização, o polipéptido compreende adicionalmente um segundo domínio 10Fn3 que tem uma sequência de aminoãcidos alterada em relação à sequência de tipo selvagem e em que o segundo domínio 10Fn3 se liga a uma molécula alvo com uma KD inferior a 500 nM. Os dois domínios 10Fn3 podem ligar-se ao mesmo alvo ou a alvos diferentes.

Em determinadas formas de realização, o domínio Fc do polipéptido pode ser de uma IgG, IgM, IgD, IgE ou IgA. Em formas de realização exemplificativas, o domínio Fc é derivado a partir de uma IgG, como uma IgGl.

Em várias formas de realização, a sequência de dobradiça e o domínio Fc podem ser derivados a partir do mesmo ou de diferentes isotipos de Ig.

Em determinadas formas de realização, a região de dobradiça compreende os resíduos 104-119 da SEQ ID NO: 22 ou uma sequência tendo pelo menos 90 ® de identidade de sequência com a mesma. 0 pedido proporciona um polipéptido que compreendem um domínio Fc de imunoglobulina e um domínio i0Fn3, em que o domínio 10Fn3 está fundido ao terminal C do domínio Fc por um ligante polipeptídico que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90 ® idêntica a SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 86 que são derivadas a partir da região de cauda C-terminal da cadeia pesada de uma imunoglobulina ligada à membrana.

Em determinadas formas de realização, o ligante polipeptídico compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 51-54 e 63-65.

Em determinadas formas de realização, o polipéptido compreende dois domínios 10Fn3, em que os dois domínios i0Fn3 se podem ligar ao mesmo alvo ou a alvos diferentes.

Noutro aspeto, o pedido proporciona um ácido nucleico que codifica as proteínas de fusão Fc proporcionadas no presente documento. Também são proporcionados vetores, incluindo vetores de expressão, que compreendem um ácido nucleico que codifica qualquer uma das proteínas de fusão Fc descritas no presente documento. Também são descritas no presente documento células hospedeiras como vetores de expressão e métodos para produção das proteínas de fusão Fc descritas no presente documento nas células hospedeiras. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Inibição de PCSK9:EGFA 0 painel esquerdo( e PCSK9: ATI - 972 0 painel direito ( por PRD460 num ensacb FRET.

Figura 2. Inibição do esgotamento de LDLR induzido por PCSK9 a partir da superfície celular de HepG2 por Adnectinas anti-PCSK9.

Figura 3. Inibição da entrada celular de PCSK9-AF647 em células HepG2 por Adnectinas anti-PCSK9.

Figura 4. Níveis plasmáticos de hPCSK9 não ligado em ratinhos transgénicos tratados com PRD460 0 doses administradas por via i.p.(.

Figura 5. Efeito de PRD460 0 15 mg%kg i.v.( em LDL-Ce PCSK9 livre em macacos cinomolgos 0 média ™%- SEM, n= 3(. Figura 6. Farmacocinética de PRD460 e ATI-1081 depois da administração intravenosa em macacos cinomolgos.

Figura 7. Farmacocinética de PRD460 e Adn-1 depois da administração intravenosa em macacos cinomolgos.

Figura 8. Farmacocinética de C7FLFc, Adn-2 e Adn-3 depois da administração intravenosa em macacos cinomolgos.

Figura 9. Farmacocinética de Adn-1 em macacos cinomolgos depois da administração intravenosa e subcutânea.

Figura 10. Farmacocinética de PRD460, PRD461, PRD239, PRD713, Adn-1, Adn-4, Adn-5, Adn-6 e Adn-7 depois da administração intravenosa em ratinhos.

Figura 11. Farmacocinética de C7FLFc, Adn-8, Adn-3 e Adn-9 depois da administração intravenosa em ratinhos.

Figura 12. Farmacocinética de PRD239 e PRD713 depois da administração intravenosa em ratinhos.

Figura 13. Farmacocinética de PRD460 depois da administração intravenosa em ratinhos C57B1%6 e nus. Figura 14. Farmacocinética de PRD460 e PRD461 depois da administração intravenosa em ratinhos.

Figura 15. Inibição da proliferação de BaF3 por C7FL-Fc. Figura 16. Inibição do esgotamento de LDLR induzido por PCSK9 a partir da superfície celular de HepG2 por proteínas de fusão Fc-10Fn3 anti-PCSK9.

Figura 17. Inibição do esgotamento de LDLR induzido por PCSK9 a partir da superfície celular de HepG2 por proteínas de fusão Fc-10Fn3 anti-PCSK9.

Figura 18. Rendimento médio de proteínas Fc-10Fn3 expressas em mamíferos de elevado rendimento.

Figura 19. Pontuação de monómeros de proteínas Fc-10Fn3 expressas em mamíferos de elevado rendimento.

Figura 20. Rendimento médio de proteínas Fc-10Fn3 expressas em média escala.

Figura 21. Pontuação de monómeros de proteínas Fc-10Fn3 expressas em média escala.

Figura 22. Dados de LC-MS de proteínas Fc-i0Fn3 expressas em média escala.

Figura 23. Dados de DSC de proteínas Fc-10Fn3 expressas em média escala.

Figura 24. Dados de sensorgrama de SPR para a ligação de proteínas Fc-10Fn3 expressas em média escala ao alvo. Figura 25. Comparação da sequência de aminoácidos de Fc 13 Fel ( de região constantey! humana de tipo selvagem com variantes de Fc, Fc4 a Fcl7. 0 domínio CH1 da região constante γΐ humana não faz parte do Fc e, portanto, não é mostrado.

As localizações da região de dobradiça, o domínio CH2 e o domínio CH3 são indicados. Os resíduos Cys normalmente envolvidos na ligação de dissulfureto à região constante de cadeia leve I LC( e região constante de cadeia peada 13 HC ( são indicados. Um ". " indica identidade com o tipo selvagem naquela posição. Um indica um intervalo introduzido na sequência para otimizar o alinhamento. Apenas são mostradas localizações onde as variantes de Fc diferem do tipo selvagem, caso contrário, as sequências Fc correspondem com a sequência de tipo selvagem mostrada. As posições na sequência são numeradas de acordo com o sistema de numeração do índice EU universalmente aceite para proteínas imunoglobulinas. *** indica a localização do terminal carboxilo e inclui-se para esclarecer a diferença no terminal carboxilo de Fc6 em relação a outras versões de Fc.

Figura 26. Comparação das sequências de aminoácidos de Fc de região constante y2a de ratinho BALB%c de tipo selvagem 13 mFcl ( e de Fc de região constante γ2ο de ratinho C57BL%6 de tipo selvagem 13 mFc3( com função efetora de Fc de ratinho menos variantes mFc2 e mFc4 A localização da região de dobradiça, o domínio CH2 e o domínio CH3 são indicados. Os resíduos Cys normalmente envolvidos na ligação de dissulfureto à região constante de cadeia pesada 13 HC( são indicados. Um indica identidade com o tipo selvagem naquela posição. Um " -" indica um intervalo introduzido na sequência para maximizar o alinhamento. As posições na sequência são numeradas de acordo com o sistema de numeração do índice EU universalmente aceite para proteínas imunoglobulinas. Figura 27. Imunogenicidade de 1571G04-PEG em macacos cinomolgos.

Figura 28. Imunogenicidade de 1571GQ4-Fc em macacos cinomolgos. DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

Por um "polipéptido" entende-se qualquer sequência de dois ou mais aminoácidos, independentemente do comprimento, modificação pós-tradução, ou função. "Polipéptido", "péptidos" e "proteína" são utilizados indistintamente no presente documento. Os polipéptidos podem incluir aminoácidos naturais e aminoácidos não naturais como aqueles descritos no documento de Patente U.S. N. 0 6.559.126. Os polipéptidos também podem ser modificados em qualquer de uma variedade de maneiras químicas padrão (por exemplo, um aminoácido pode ser modificado com um grupo protetor; o aminoácido carboxi-terminal pode ser tornado num grupo amida-terminal; o resíduo amino-terminal pode ser modificado com grupos para, por exemplo, potenciar a lipofilieidade; ou o polipéptido pode ser quimicamente glicosilado ou, de outra forma, modificado para aumentar a estabilidade ou semivida in vivo). As modificações de polipéptidos podem incluir a ligação ao polipéptido de outra estrutura como um composto cíclico ou outra molécula e também podem incluir polipéptidos que contêm um ou mais aminoácidos numa configuração alterada (isto é, R ou S; ou, L ou D). "Percentagem (%) de identidade da sequência de aminoácidos" é definida no presente documento como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos com os resíduos de aminoácidos numa sequência selecionada, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para alcançar a máxima percentagem de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservatives como parte da identidade da sequência. 0 alinhamento para propósitos de determinação da percentagem de identidade da sequência de aminoácidos pode ser alcançada em várias formas que estão dentro da perícia da técnica, por exemplo, utilizando programas de computador disponíveis publicamente, tais como os programas BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign 0 DNASTAR(. Aqueles peritos na especialidade podem determinar parâmetros apropriados para medição do alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo sob o comprimento total das sequências a serem comparadas, Para os propósitos do presente documento, no entanto, são obtidos valores de ® de identidade de sequência de aminoãcidos como é descrito posteriormente utilizando o programa informático de comparação de sequências ALIGN-2. 0 programa informático de comparação de sequências ALIGN-2 foi criado por Genentech, Inc., foi depositado com documentação de utilizados no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde se encontra registado sob o N.0 de Registo de Direitos de Autor U.S. TXU510087, e está publicamente disponível através de Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. 0 programa ALIGN-2 deverá ser compilado para utilização num sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequências são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam.

Para os propósitos do presente documento, a ® de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A a, com, ou frente a uma dada sequência de aminoácidos B 0 que pode alternativamehe ser mencionado como dada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma determinada ® de identidade de sequência de aminoácidos a, com, ou frente a uma dada sequência de aminoácidos B ( é calculada conforme se segue: 100 vezes a fração X%Y onde X é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento desse programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será apreciado que quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não seja igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a ® de identidade de sequência de aminoácidos de A com B não será igual à ® de identidade de sequência de aminoácidos de B com A.

As notações "mpk", "mg%kg", ou "mg por kg" referem-se a miligramas por quilograma. Todas as notações são utilizadas indistintamente ao longo da presente divulgação. A "semivida" de um polipéptido pode ser geralmente definida como o tempo necessário para que a concentração sérica do polipéptido seja reduzida em 50 ®, in vivo, por exemplo, devido à degradação do polipéptido e%ou eliminação ou sequestro do polipéptido por mecanismos naturais. A semivida pode ser determinada de qualquer forma conhecida per se, tal como por análise farmacocinética. Técnicas adequadas serão claras para o perito na especialidade, e podem, por exemplo, geralmente envolver as etapas de administrar uma dose adequada de um polipéptido a um roedor ou primata; recolher amostras de sangue ou outras amostras a partir do dito primata em intervalos regulares,· determinar o nível ou concentração do polipéptido na dita amostra de sangue e calcular a partir 0 de um gráf io ( dos dados assim obtidos, o tempo até que o nível ou concentração do polipéptido tenha sido reduzida em 50 ® em comparação com o nível inicial depois da administração da dose. Métodos para determinar a semivida podem ser encontrados, por exemplo, em Kenneth et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists E 1986 (,- Peters et al. , Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach IEI 1996 (,- e "Pharmacokinetics", MGibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a Edição Rev. B 1982 ( . A semivida pode ser expressa utilizando parâmetros como tl%2-alfa, tl%2-beta, HL_Lambda_z, e a área sob a curva 0 AUC(. Na presente memória descritiva, um "amento da semivida" refere-se a um aumento em qualquer um destes parâmetros, quaisquer dois destes parâmetros, quaisquer três destes parâmetros ou todos os quatro destes parâmetros. Um "aumento da semivida" refere-se, em particular, a um aumento de tl%2-beta e%ou HL_Lambda_z, seja com ou sem um aumento de tl%2-alfa e%ou de AUC, ou ambos. Outros parâmetros PK que podem ser avaliados incluem o volume de distribuição 0 VD(, eliminação 0 CL( e topo de permanência médio 0 MRT(. Na presente memória descrtiva, uma "alteração na farmacocinética" refere-se a alterações em qualquer um destes parâmetros, quaisquer dois destes parâmetros, ou quaisquer três destes parâmetros, na presença ou ausência de alterações nos parâmetros de semivida listados acima.

Proteínas de fusão Fc

Este pedido refere-se a novas proteínas de fusão Fc que têm propriedades melhoradas. 0 pedido proporciona proteínas de fusão Fc-X que têm novos ligantes que conferem propriedades favoráveis como expressão aumentada, imunogenicidade reduzida e%ou resistência a protéases aumentada. 0 pedido também se refere a novas fusões Fc polipéptido de estrutura baseada em fibronectina que têm propriedades farmacocinéticas melhoradas em comparação com os seus homólogos de fusão não Fc. As novas fusões Fc polipéptido de estrutura baseada em fibronectina descritas no presente documento podem ser concebidas para se ligarem a qualquer alvo de interesse. Em formas de realização exemplificativas, o alvo é um antigénio, um polipéptido ou uma proteína alvo terapêutica de interesse. Alvos terapeuticamente desejáveis exemplificativos incluem, por exemplo, fator de necrose tumoral alfa 0 TNF-alfa(,proteína 4 tipo delta 0 DLL4(, interleucina 17 0 IL-17(, propteína convertase subtilisina kexina de tipo 9 0 PCSK9(, reetor de pregnano X 0 PXR(, recetor de fator de crescimento epidérmico Kl EGFR (, recetor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina 3 IGF-1R(, recetor de fator de crescimento endotelial vascular Kl VEGFR2 ( e interleaina 23 Kl IL-23 ( .

Proteínas de fusão Fc-X com novos ligantes

Em muitos casos, as proteínas de fusão Fc que têm o arranjo Fc-X 0 por exemplo, um polipéptido heterólog ligado ao terminal C do domínio Fc ( contêm uma sequência ligante que separa o domínio de imunoglobulina Kl domínio Ig( do polipéptido heterólogo. Estes ligantes tipicamente são domínios flexíveis artificiais, como GGGGS. Contudo, estas sequências não são sequências naturais e podem conduzir a propriedades indesejáveis, como imunogenicidade.

Consequentemente, num aspeto, o pedido proporciona novas proteínas de fusão Fc melhoradas utilizando sequências de ligante derivadas a partir de sequências de anticorpos de ocorrência natural, incluindo variantes de splicing ou alélicas naturais. Em particular, o pedido proporciona novas proteínas de fusão Fc que têm o arranjo desde o terminal N até ao terminal C: Fc-Li-X, onde Fc é um domínio Fc Kl como descrito mais abaixo (, f· é uma sequência ligante derivada a partir da sequência de cauda natural de uma forma ligada à membrana de um anticorpo, e X é um domínio 10Fn3. 0 ligante será posicionado na proteína de fusão Fc no seu contexto natural, por exemplo, no seu lugar natural na sequência de CH3 ou CH4 de Ig. Estas sequências ligantes naturais permitirão a construção de proteínas de fusão Fc com ligantes de comprimento variável que estarão num contexto natural e, portanto, serão suscetíveis a ter propriedades favoráveis no que diz respeito à expressão, imunogenicidade e%ou resistência a protéases. A maioria das i munog1obu1inas existe na isoforma solúvel e ligada à membrana. A isoforma ligada à membrana consiste da forma solúvel com uma cauda alternativamente submetida splicing no domínio CH3 ou CH4 em direção ao terminal C antes do codão de terminação. A cauda da isoforma ligada à membrana consiste de um ligante, um segmento transmembrana e um segmento intracelular. Determinadas imunoglobulinas, como IgA, contêm segmentos de cauda nas suas formas secretórias, que também podem ser utilizados como ligantes.

Numa forma de realização, o pedido proporciona uma proteína de fusão Fc que tem o arranjo Fc-Li-X, em que Ln é uma sequência ligante derivada a partir do segmento de cauda de uma forma ligada à membrana de uma imunoglobulina. Sequências ligantes exemplificativas incluem, por exemplo: 0 i{ a região de cauda da isoforma longa de membranade IgAl 0 mlL(: SCSVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN 0 SEQ ID NO: 51 ( , 0 ii ( a região de cauda da isoforma longa variante d membrana de IgAl 0 mlL com extra cys (: SCCVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN 0 SEQ ID NO: 52 (, 0ii ( a região de cauda da isoforma curta de membrana de IgAl 0 mals com uma eliminação N-terminal de 6 aminoácidos(: DWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN 0 SEQ ID NO: 53 (, e 0 ivã região de cauda da forma ligada à membrana de IgA2: SCCVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN 0 SEQ ID NO: 54(.

Adicionalmente, a região de cauda da forma ligada à membrana de IgD: YLAMTPLEPQSKDENSDDYTTFDDVGS 0 SEQ 3D NO: 55 (, a região de cauda da forma ligada à membrana de IgE: ELDVCVEEAEGEAPW 0 SEQ ID MO: 56(, a região de caudada forma ligada à membrana de IgG: ELQLEESCAEAQDGELDG 0 SEQ 3D NO: 57(, e a região de cauda da forma ligada à membrana de IgM EGEVSADEEGFEN 0 SEQ ID NO: 58 ( são descritas no preente documento.

Adicionalmente, o pedido proporciona uma proteína de fusão Fc que tem o arranjo Fc-L:1.-X, em que Li. é uma sequência ligante derivada a partir do segmento de cauda de uma forma secretõria ou solúvel de uma imunoglobulina. Sequências ligantes exemplificativas incluem, por exemplo: 0 i ( a região de cauda da forma solúvel de IgAl: KPTHVNVSWMAEVDGTCY E SEQ ID NO: 59(, E ii ( a regiãde cauda da forma solúvel de IgA2 : KPTHVNVSWMAEVDGTCY IE! SEQ ID NO: 60(, E iii ( a região de cauda da forma solúvel de I§: YVTDHGPMK 0 SEQ ID NO: 61(, e 0 iv (: a região de caadda forma solúvel de IgM: PTLYNVSLVMSDTAGTCY 0 SEQ ID ΝΘ 62(.

Em determinadas formas de realização, pode ser desejável ter uma sequência ligante contendo um resíduo de cisteína livre de modo a permitir a formação de uma ligação de dissulfureto entre os ligantes formando, desta forma, dímeros das proteínas de fusão Fc. Noutras formas de realização, pode ser desejável alterar as sequências ligantes para remover resíduos de cisteína livres, por exemplo, através da mutação de um ou mais resíduos de cisteína num ligante para outro resíduo, como uma serina, alanina ou glicina. Exemplos de sequências ligantes derivadas a partir das regiões de cauda de imunoglobulinas ligadas à membrana que foram alteradas para remover resíduos de cisteína livres incluem: E i ( SXSVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN, em que X é serna, alanina ou glicina 0 SEQ ID NO: 63 (, 0 ii ( SXXVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN, em que cada X é independentemente selecionado a partir de serina, alanina ou glicina E SEQ ID NO: 64(, E iii( SXXVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN, em que cada X ê independentemente selecionado a partir de serina, alanina ou glicina E SEQ ID NO: 65 (, E iv ( ELDVXVEEAEGEAPW, me que X é serina, alanina ou glicina E SEQ ID NO: 66 (, e S( ELQLEESXAEAQDGELDG, em que X é serina, alanina ou glicina 0 SEQ ID NO: 67 (. Exemplos de sequências ligantes derivadas a partir das regiões de cauda de formas secretórias de imunoglobulinas que foram alteradas para remover resíduos de cisteína livres incluem: 0 i ( KPTHVNVSWMAEVDGTXY, em que X é serina, alanina ou glicina E SEQ ID NO: 68(, E ii( KPTHVNVSWMAEVDGTXYçm que X é serina, alanina ou glicina 0 SEQ ID NO: 69 (, e iii ( PTLYNVSLVMSDTAGTXY, em que X é serina, alanina ou glicina 0 SEQ ID NO: 70(.

Numa forma de realização, o pedido proporciona uma proteína de fusão Fc que tem o arranjo Fc-Li-X, em que Li é uma sequência ligante que compreende, consiste essencialmente em, ou consiste numa sequência de aminoácidos que compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 51-54 e 63-65. Em determinadas formas de realização, a sequência ligante não contém um resíduo de cisteína. Em determinadas formas de realização, a sequência ligante pode ser prolongada em comprimento por repetição, concatenação ou combinação de qualquer das SEQ ID NOs: 51-70, ou fragmentos das mesmas.

Em determinadas formas de realização, as proteínas de fusão Fc-Li-X proporcionadas no presente documento podem ter uma expressão aumentada, imunogenicidade diminuída, e%ou resistência às protéases aumentada em relação a proteínas de fusão Fc que têm sequências ligantes diferentes. Por exemplo, uma célula hospedeira que compreende um vetor de expressão que codifica uma proteína de fusão Fc-Lj-X proporcionada no presente documento pode proporcionar uma expressão pelo menos 10 ®, 20 ®, 30 ®, 40®, 50®, 75® ou 100® maior do que uma proteína de fusão Fc equivalente que tem uma sequência ligante que ocorre não naturalmente, ou níveis de expressão pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou 10 vezes mais elevados que uma proteína de fusão Fc equivalente que tem uma sequência ligante que ocorre não naturalmente. Em determinadas formas de realização, uma proteína de fusão Fc-Li-X proporcionada no presente documento pode ter uma imunogenicidade reduzida em relação a uma proteína de fusão Fc equivalente que tem uma sequência ligante que ocorre não naturalmente. A imunogenicidade de um polipéptido descrito no presente documento pode ser avaliada, por exemplo, por um ou mais dos seguintes métodos: ligação a Antigénio

Leucocitário Humano § "HLA"(, previsão de ligação aHLA in silico § por exemplo, com o programa Epimatrix(, ativaçãode células T humanas in vitro, resposta imunitária em animais in vivo, ou outros métodos para avaliação do potencial de imunogenicidade. Noutras formas de realização, uma proteína de fusão Fc-Li-X proporcionada no presente documento pode ter uma resistência a protéases aumentada em relação a uma proteína de fusão Fc equivalente que tem uma sequência ligante que ocorre não naturalmente.

As proteínas de fusão Fc-Li-X descritas no presente documento contêm uma porção X que é um polipéptido que compreende um domínio 10Fn3, incluindo, por exemplo, um polipéptido que compreende um domínio i0Fn3 que se liga a um alvo como fator de necrose tumoral alfa 0 TNF-alfi(, proteína 4 tipo delta 0 DLL4 (, interleucina 17 0 IL7Í, proproteína convertase subtilisina kexina de tipo 9 0 PCSK9 (, recetor de pregnano X 0 PXR (, recetor de far de crescimento epidérmico 0 EGFR(, recetor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina 0 IGF-1R(, recebr de fator de crescimento endotelial vascular 0 VEGFR2( e interleucina 23 0 IL-23(.

Fusões Fc-Prote£na de estrutura baseada em fibronectina São descritas no presente documento proteínas de fusão Fc que compreendem um domínio Fc fundido com um polipéptido que se liga a um alvo. 0 polipéptido que se liga a um alvo pode ser derivado a partir de uma molécula de fibronectina ou tenascina, ou pode ser uma molécula sintética que se baseia nas sequências e estrutura de moléculas de fibronectina e tenascina. Os polipéptidos que podem ser utilizados nas proteínas de fusão Fc são descritos, por exemplo, no documento W02010%051274, W0201Q%051310 e W02009%086116.

Num aspeto, o pedido proporciona proteínas de fusão Fc que compreendem um domínio Fc fundido, um polipéptido que compreende um domínio 10Fn3 e uma sequência de dobradiça.

Estas fusões são referidas coletivamente no presente documento como fusões Fc-10Fn3. Numa forma de realização exempli f icat iva, uma proteína de fusão Fc-10Fn3 tem o seguinte arranjo desde o terminal N até ao terminal C: dobradiça-domínio Fc-L2-10Fn3, em que dobradiça se refere a uma sequência de dobradiça de imunoglobulina como descrita adicionalmente no presente documento, Fc refere-se a um domínio Fc de imunoglobulina, L2 refere-se a um ligante como adicionalmente definido no presente documento, e 10Fn3 refere-se a um polipéptido que compreende um domínio 10Fn3. Numa outra forma de realização exemplar, uma proteína de fusão Fc-10Fn3 tem o seguinte arranjo desde o terminal N até ao terminal C: domínio Fc-L2-10Fn3, em que Fc se refere a um domínio Fc de imunoglobulina, L2 refere-se a um ligante como adicionalmente definido no presente documento e 10Fn3 refere-se a um polipéptido que compreende um domínio i0Fn3. As proteínas de fusão Fc-10Fn3 descritas no presente documento podem conter adicionalmente uma metionina N-terminal e%ou uma sequência líder 13 porexemplo, para expressão em células de mamífero(.

Em determinadas formas de realização, as proteínas de fusão Fc-10Fn3 descritas no presente documento compreendem uma sequência de dobradiça, preferentemente uma sequência de dobradiça que contém um resíduo de cisteína livre que é capaz de formar uma ligação de dissulfureto de modo que a proteína de fusão Fc-10Fn3 forma um dímero. A sequência de dobradiça pode, naturalmente, conter um resíduo de cisteína, ou pode ser manipulada para conter um ou mais resíduos de cisteína.

As proteínas de fusão Fc-10Fn3 descritas no presente documento podem conter uma região de dobradiça de imunoglobulina. A região de dobradiça pode ser derivada a partir de anticorpos que pertencem a qualquer uma das classes de imunoglobulinas, isto é, IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM. Em determinadas formas de realização, a região de dobradiça é derivada a partir de qualquer uma das subclasses de anticorpo de IgG, isto é, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Em algumas formas de realização, a região de dobradiça pode incluir adicionalmente resíduos derivados a partir das regiões CHI e CH2 que flanqueiam a sequência de dobradiça nuclear, conforme discutido mais abaixo.

Abaixo é mostrada a sequência de uma região constante de imunoglobulina IgGl humana, e a posição relativa de cada domínio dentro da região constante é indicada com base no formato de numeração EU: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL

VKD YFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPA VLQSSGLYS

LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDY^mCPPCPAPEhLGGPSV FLFP

P KP KDT LM IS RT PE VT CVWDV S H ED P E VKFNW YVDGVE VHNA.KTKPRE EQ YN S T YR

WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 0 SEQ ID NO: 22( . A sequência de dobradiça nuclear está sublinhada, e a região CHI está em itálico; as regiões CH2 e CH3 estão em texto regular. Deve entender-se que a lisina C-terminal é opcional. Em determinadas formas de realização, a lisina C-terminal de uma sequência de IgG pode ser removida ou substituída com um aminoácido que não seja lisina, como alanina, para aumentar adicionalmente a semivida sérica da proteína de fusão Fc.

Em determinadas formas de realização, as proteínas de fusão Fc-10Fn3 descritas no presente documento compreendem uma região de dobradiça derivada a partir de uma IgGl humana. Em algumas formas de realização, a região de dobradiça compreende os resíduos de dobradiça nuclear que se estendem nas posições 104-119 da SEQ ID NO: 22 0 DKTHTCPPCPAPELLG; SEQ ID NO: 23( de IgGl, que coresponde às posições 221-236 de acordo com a numeração EU.

Em determinadas formas de realização, a sequência de dobradiça pode incluir substituições que conferem propriedades farmacocinéticas, biofísicas e%ou biológicas desejáveis. Algumas sequências de dobradiça exemplificativas incluem EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS 0SEQ ID NO: 24; região de dobradiça nuclear sublinhada(, EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS 0 SEQ ID NO: 25; região de dobradiça nuclear sublinhada(, EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS S SEQ ID NO: 26; região de dobradiça nuclear sublinàda(, DKTHTCPPCPAPELLGGPS BI SEQ ID NO: 27; região de dobrdiça nuclear sublinhada (, e DKTHTCPPCPAPELLGGSS BI SEQ IDNO: 28, região de dobradiça nuclear sublinhada(. Numa forma de realização, a sequência de dobradiça é um derivado de uma dobradiça de IgGl que compreende uma substituição P122S com base na numeração na SEQ ID NO: 22 0 numeração EU 28( 0 por exemplo, o resíduo de prolina na posição 122 na SEQ ID NO: 22 é substituído com serina(. A substituição P122S remove a função efetora Fc e é exemplificada pelas dobradiças que têm qualquer uma das SEQ ID NOs: 25, 26 e 28. Noutra forma de realização, a sequência de dobradiça é um derivado de uma dobradiça de IgGl que compreende substituições D104G e K105S com base na numeração na SEQ ID NO: 22 0 numeação EU 221-222(. As substituições D104G e K105S removem um sítio de clivagem potencial e, portanto, aumentam a resistência âs protéases da molécula de fusão. Uma dobradiça tendo as substituições D104G e K105S é exemplificada na SEQ ID NO: 26. Noutra forma de realização, a sequência de dobradiça é um derivado de uma dobradiça de IgGl que compreende uma substituição C103S com base na numeração na SEQ ID NO: 22 12 numeração EU 220 (. A substituição C103S impede a õrmação incorreta de ligações cisteína na ausência de uma cadeia leve. Dobradiças que têm uma substituição C103S são exemplificadas pelas SEQ ID NOs: 24-26.

Numa forma de realização, o pedido proporciona uma proteína de fusão Fc-10Fn3, em que a sequência de dobradiça compreende, consiste essencialmente em, ou consiste numa sequência de aminoácidos que é pelo menos 50 ®, 60 ®, 75 ®, 80 ®, 85 ®, 90 ®, 95 ®, 96 ®, 97 ®, 98 ® ou 99 ® idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 24-28, ou compreende, consiste essencialmente em, ou consiste numa sequência de aminoãcidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 24-28. Noutra forma de realização, o pedido proporciona uma proteína de fusão Fc-10Fn3, em que a porção de dobradiça compreende pelo menos 2, 5, 10, 12, 15, 18 ou 20 resíduos de aminoãcidos contíguos a partir de qualquer das SEQ ID NOs: 24-28, ou uma sequência que compreende desde 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 2-5, 2-10, 2-15, 2-20, 5-10, 5-15, 5-20, 10-15, 10-20 ou 15-20 resíduos de aminoãcidos contíguos a partir de qualquer das SEQ ID NOs: 24-28. Em formas de realização exemplificativas, a sequência de dobradiça compreende um resíduo de cisteína.

Em determinadas formas de realização, uma proteína de fusão Fc não compreende uma dobradiça. Por exemplo, uma proteína de fusão Fc pode compreender um domínio Fc ligado a uma proteína heteróloga, por exemplo, no formato Fc-X ou X-Fc, sem compreender uma dobradiça ou uma dobradiça nuclear. Num exemplo, uma proteína de fusão Fc não compreende a sequência EPKSSDKTHTGPPCP IEI SEQ ID NO: 89 ( ou uma variante da mesma.

As proteínas de fusão Fc-10Fn3 descritas no presente documento compreendem um domínio Fc, como descrito mais abaixo. Em determinadas formas de realização, o domínio Fc e a região de dobradiça podem ser derivados a partir de uma classe ou subclasse de anticorpo. Por exemplo, a região de dobradiça e o domínio Fc podem ser derivados a partir de IgGl. Noutras formas de realização, o domínio Fc e a região de dobradiça podem ser derivados a partir de diferentes classe ou subclasse de anticorpo. Por exemplo, o domínio Fc pode ser derivado a partir de IgG2 ou IgG4 e a região de dobradiça pode ser derivada a partir de IgGl.

Em determinadas formas de realização, a proteína de fusão Fe-10Fn3 descrita no presente documento tem o arranjo dobradiça-domínio Fc-L2-10Fn3, em que L2 é um ligante que conecta o domínio Fc ao polipéptido que compreende um domínio χ0Ρη3. Em formas de realização exemplificativas, o ligante L2 é selecionado a partir do grupo que consiste em: qualquer uma das SEQ ID NOs: 51-54, 63-65, 84 e 86. Noutras formas de realização, o ligante L2 compreende, consiste essencialmente em, ou consiste numa sequência de aminoácidos que é pelo menos 90 ®, 95 ® 96 ® 97 ® 98 ® ou 99 ® idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 51-54, 63-65, 84 e 86, ou compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em qualquer uma das SEQ ID NOs: 51-54, 63-65, 84 e 86. Em determinadas formas de realização, a sequência ligante L2 não contém um resíduo de cisteína. Em determinadas formas de realização, a sequência ligante pode ser prolongada em comprimento por repetição, concatenação ou combinação de qualquer das SEQ ID NOs: 33, 37-38, 45-70, 81-88 e 90-98, ou fragmentos das mesmas.

Domínios Fc e polipéptidos compreendendo domínios 10Fn3 adequados para utilização nas proteínas Fc-10Fn3 são descritos mais abaixo.

Em determinadas formas de realização, as proteínas de fusão Fc-10Fn3 proporcionadas no presente documento podem ter uma semivida sérica aumentada em relação a um domínio lúFn3 sem a fusão Fc ou em relação a um domínio 10Fn3 fundido a uma fração farmacocinética diferente como, por exemplo, uma fração de polietilenoglicol IEI PEG (. Por exemplo, uma proteína de fusão Fc-10Fn3 proporcionada no presente documento pode ter uma semivida sérica que é pelo menos 10 ®, 20 ®, 30 ®, 40 ®, 50 ®, 75 ® ou 100 ® superior do que a semivida sérica de um domínio 10Fn3 equivalente sem o domínio Fc ou em relação a um domínio 10Fn3 equivalente fundido a uma fração farmacocinética diferente como, por exemplo, uma fração de polietilenoglicol 0 PEG(. Em determinadas formas de realização, uma proteína de fusão Fc-10Fn3 proporcionada no presente documento tem uma semivida sérica que é pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou 10 vezes mais longa do que a semivida sérica de um domínio 10Fn3 equivalente sem o domínio Fc ou em relação a um domínio ±0Fn3 equivalente fundido a uma fração farmacocinética diferente como, por exemplo, uma fração de polietilenoglicol 0 PEG(. Em determinadas formas de realização, uma proteína de fusão Fc, por exemplo, uma proteína de fusão Fc-10Fn3, é um dímero, em que cada monómero compreende uma proteína de fusão Ξ um homoâmero(. Em determinadas formas de realização, uma proteína de fusão Fc, por exemplo, uma proteína de fusão Fc-10Fn3, é um heterodímero que compreende, por exemplo, um monómero que compreende uma proteína de fusão Fc e um monómero que compreende um Fc que não está ligado a uma proteína heteróloga, A porção Fc de um monómero pode compreender uma ou mais modificações 13 ou mutações ( de aminoácidos m relação a um Fc de tipo selvagem, que favorecem a formação de dímeros com outro Fc. Por exemplo, um Fc de um dímero pode compreender um "orifício" e o outro Fc do dímero pode compreender uma "saliência" ou "protuberância", como descrito, por exemplo, nos documento W096%027011; US 5.731.168 e US 5.821.333. Outra modificação, como modificações eletrostáticas podem ser utilizadas para potenciar a formação de dímeros. Modificações exemplificativas são descritas, por exemplo, nos documento W02007%11Q205; W02009%089004 e W02010%129304. Tais alterações são particularmente úteis para potenciar a associação de dois monómeros heterólogos para formar um dímero, como um dímero que compreende um monómero compreendendo uma proteína de fusão Fc e um monómero compreendendo um Fc que é diferente de uma proteína de fusão Fc, por exemplo, pela falta de uma proteína heteróloga. Os monómeros do dímero podem ser ligados uns aos outros de forma covalente ou não covalente.

Em determinadas formas de realização, uma proteína de fusão compreende um monómero que compreende a estrutura X-Fc e um monómero que compreende a estrutura Fc-X 0 α Fc-Y(, em que cada monómero pode opcionalmente compreender um ligante e opcionalmente compreender uma dobradiça.

Domínios Fc São descritas no presente documento fusões polipeptídicas que compreendem uma porção Fc fundida a um domínio i0Fn3 .

Conforme utilizado no presente documento, "porção Fc" engloba domínios derivados a partir da região constante de uma imunoglobulina, preferentemente uma imunoglobulina humana, incluindo um fragmento, análogo, variante, mutante ou derivado da região constante. Imunog1obu1inas adequadas incluem IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, e outras classes como IgA, IgD, IgE e IgM. A região constante de uma imunoglobulina é definida como um polipéptido de ocorrência natural ou produzido de maneira sintética, homólogo à região C-terminal da imunoglobulina, e pode incluir um domínio CHI, uma dobradiça, um domínio CH2, um domínio CH3 ou um domínio CH4, separadamente ou em combinação. A região constante de uma imunoglobulina é responsável por muitas funções de anticorpo importantes incluindo ligação do recetor Fc 0 FcR ( e fixação do complement). Existem cinco classes principais de região constante de cadeia pesada, classificadas como IgA, IgG IgD, IgE IgM cada com funções efetoras características designadas por isotipo. Por exemplo, A IgG é separada em quatro subclasses conhecidas como IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4.

As moléculas de Ig interagem com múltiplas classes de recetores celulares. Por exemplo, as moléculas de IgG interagem com três classes de recetores Fcy 0 FçR( específicos para a classe de anticorpo IgG, nomeadamente FcyR, FcyRII e FcyRIII. Foi relatado que as sequências importantes para a ligação de IgG aos recetores FcyR estão localizadas nos domínios CH2 e CH3. A semivida sérica de um anticorpo é influenciada pela capacidade desse anticorpo para se ligar a um recetor Fc 0 FcR (. De forma semelhante, a semivida sérica de proteínas de fusão IgFc é também influenciada pela capacidade de ligação a tais recetores 0 Gillies S Det al., 0 1999( Cancer Res. 59:2159-66(.

As proteínas de fusão divulgadas no presente documento compreendem uma porção Fc que inclui pelo menos uma porção do terminal carboxi de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Por exemplo, a porção Fc pode compreender: um domínio CH2, um domínio CH3, um domínio CH4, um domínio CH2-CH3, um domínio CH2-CH4, um domínio CH2-CH3-CH4, um domínio dobradiça-CH2, um domínio dobradiça-CH2CH3, um domínio dobradiça-CH2-CH4 ou um domínio dobradiça-CH2-CH3-CH4. 0 domínio Fc pode ser derivado a partir de anticorpos que pertencem a qualquer uma das classes de i munog1obu1i na, isto é, IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM ou qualquer uma das subclasses de anticorpo IgG, isto é, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. 0 domínio Fc pode ser uma sequência Fc de ocorrência natural, incluindo variantes de splicing ou alélicas naturais. Alternativamente, o domínio Fc pode ser um domínio híbrido que compreende uma porção de um domínio Fc a partir de dois ou mais isotipos diferentes, por exemplo, um domínio Fc híbrido de IgG2%IgG4. Em formas de realização exemplificativas, o domínio Fc é derivado a partir de uma molécula de i munog1obu1ina humana. Alternativamente, o domínio Fc pode ser uma versão humanizada ou desimunizada de um domínio Fc a partir de um animal não humano, incluindo, mas não limitado a, ratinho, rato, coelho, camelo lama, dromedário e macaco.

Em determinadas formas de realização, o domínio Fc é uma sequência Fc variante, por exemplo, uma sequência Fc que foi modificada 0 por exemplo, por substituição, eliminação e%ou inserção de aminoácidos( em relação a uma sequência Fc parental 0 por exemplo, um polipéptidoFc não modificado que é subsequentemente modificado para gerar uma variante (, para proporcionar características estruturais e%ou atividade biológica desejável.

Por exemplo, podem ser feitas modificações na região Fc de modo a gerar uma variante de Fc que 0 a ( tem citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo 0 ADCC ( aumentada ou diminuída, 0 b( citotoxicidade ediada pelo complemento ESI CDC ( aumentada ou diminuída, 0 c (tem afinidade para Clq aumentada ou diminuída e%ou 13 d( tem afinidade para um recetor Fc aumentada ou diminuída em relação ao Fc parental. Tais variantes da região Fc compreenderão, geralmente, pelo menos uma modificação de aminoácidos na região Fc. Acredita-se que a combinação de modificações de aminoácidos é particularmente desejável. Por exemplo, a região Fc variante pode incluir dois, três, quatro, cinco, etc. substituições na mesma, por exemplo, das posições da região Fc específicas identificadas no presente documento.

Um domínio Fc variante também pode compreende uma alteração de sequência em que os sítios envolvidos na formação das ligações de dissulfureto são removidos. Tal remoção pode evitar a reação com outras proteínas que contêm cisterna presentes na célula hospedeira para produzir as moléculas da invenção. Para este propósito, o segmento que contém cisteína no terminal N pode ser truncado ou os resíduos de cisteína podem ser eliminados ou substituídos com outros aminoácidos 0 por exemplo, àanilo, serilo(. Mesmo quando os resíduos de cisteína são removidos, os domínios Fc de cadeia simples ainda podem formar um domínio Fc dimérico que é mantido em conjunto de forma não covalente. Noutras formas de realização, um domínio Fc nativo pode ser modificado para torná-lo mais compatível com uma célula hospedeira selecionada. Por exemplo, pode-se remover a sequência PA próxima ao terminal N de um Fc nativo típico, que pode ser reorganizada por uma enzima digestiva em E. coli, como prolina imunopeptidase.

Também é possível adicionar um resíduo de metionina N-terminal, especialmente quando a molécula é expressa de forma recombinante numa célula bacteriana tal como E. coli. Noutra forma de realização, uma porção do terminal N de um domínio Fc nativo é removida para impedir a heterogeneidade no terminal N quando expresso numa célula hospedeira selecionada. Para este efeito, é possível eliminar qualquer dos primeiros 20 resíduos de aminoácidos no terminal N, particularmente aqueles nas posições 1, 2, 3, 4 e 5.

Noutras formas de realização, um ou mais sítios de glicosilação dentro do domínio Fc podem ser removidos. Os resíduos que são tipicamente glicosilados § por exeplo, asparagina( podem conferir uma resposta citolítica. Tais resíduos podem ser eliminados ou substituídos com resíduos não glicosilados 0 por exemplo, alanina(. Noutras fornas de realização, os sítios envolvidos na interação com o complemento, como o sítio de ligação a Clq, podem ser removidos do domínio Fc. Por exemplo, é possível eliminar ou substituir a sequência EKK da IgGl humana. Em determinadas formas de realização, os sítios que afetam a ligação a recetores Fc podem ser removidos, preferentemente sítios diferentes dos sítios de ligação ao recetor de recuperação. Noutras formas de realização, um domínio Fc pode ser modificado para remover um sítio de ADCC. Os sítios de ADCC são conhecidos na técnica; veja-se, por exemplo, Molec. Immunol. 29 0 5 (: 633-9 0 1992 ( em lação aos sítios de ADCC em IgGl. Exemplos específicos de domínios Fc variantes são divulgados, por exemplo, nos documentos WO 97%34631 e WO 96%32478.

Em determinadas formas de realização, uma proteína de fusão Fc descrita no presente documento compreende as regiões CH2 e CH3 de uma IgGl humana como mostrado abaixo: VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK 0 SEQ ID NO: 31 ( . Sve ser entendido que a glicina e lisina no final da SEQ ID NO: 31 são opcionais. Noutras formas de realização, uma proteína de fusão Fc descrita no presente documento compreende um domínio Fc que é pelo menos 50 ®, 60 ®, 75 ®, 80 ®, 85 ®, 90 ®, 95 ®, 96 ®, 97 ®, 98 ® ou 99 ® idêntica à SEQ ID NO: 31. Noutras formas de realização, uma proteína de fusão Fc descrita no presente documento compreende um domínio Fc que tem pelo menos 50, 100 ou 150 aminoãcidos contíguos da SEQ ID NO: 31. Noutras formas de realização, uma proteína de fusão Fc descrita no presente documento compreende um domínio Fc que tem desde 50-100, 50-150, ou 100-150 aminoãcidos contíguos da SEQ ID NO: 31. Ainda noutras formas de realização, uma proteína de fusão Fc descrita no presente documento compreende um domínio Fc que compreende a SEQ ID NO: 31 com desde 1-5, 1-10, 1-15, 1-20 ou 1-25 substituições ou substituições conservatives.

Variantes de Fc adicionais são descritas abaixo. Entende-se que as regiões Fc da divulgação compreendem o esquema de numeração de acordo com o índice EU como em Kabat et ai. 0 1991, Publicação NIH 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.(. A presente divulgação engloba porções Fc variantes que têm propriedades de ligação alteradas para um ligando Fc em relação a uma molécula de Fc parental não modificada. Por exemplo, uma proteína de fusão Fc descrita no presente documento pode compreender uma região Fc que tem um ou mais dos resíduos de aminoãcidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 substituídos para um resíduo de aminoácido diferente, de modo que a região Fc variante tenha uma afinidade alterada para um ligando efetor, por exemplo, um recetor Fc ou o componente Cl do complemento, como descrito nos documentos de patente U.S. N.°s 5.624.821 e 5.648.260; ambos para Winter et al.

Noutro exemplo, um ou mais dos resíduos de aminoãcidos 329, 331 e 322 podem ser substituídos de modo que a região Fc variante possui ligação a Clq alterada e%ou citotoxicidade dependente do complemento 0 CDC ( re dia ida ou inexistente, como descrito no documento de patente U.S. N.° 6.194.551 por Idusogie et al.

Noutro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro das posições de aminoácidos 231 e 239 podem ser alterados para, deste modo, alterar a capacidade da região Fc variante para fixar o complemento. Esta abordagem é adicionalmente descrita no documento WO 94%29351 por Bodmer et al.

Ainda noutro exemplo, a região Fc pode ser modificada para aumentar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo 0 ADCC( e%ou para aumentar a afinidade paa um recetor Fcy ao modificar um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 ou 439. Substituições exemplificativas incluem 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D e 332E. Variantes exemplificativas incluem 239D%332E, 236A%332E, 236A%239D%332E, 268F%324T, 267E%268F, 267E%324T e 267E%268F%324T. Outras modificações para potenciar as interações de FcyR e o complemento incluem, mas não estão limitadas a, substituições 298A, 333A, 334A, 326A, 2471, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 3051 e 396L. Estas e outras modificações são revistas em Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691.

As modificações de Fc que aumentam a ligação a um recetor Fc gama incluem modificações de aminoácidos em qualquer uma ou mais das posições de aminoácidos 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 279, 280, 283, 285, 298, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 312, 315, 324, 327, 329, 330, 335, 337, 3338, 340, 360, 373, 376, 379, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437 438 OU. 43 9 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat 0 WO 00%42072(.

Outras modificações de Fc que podem ser feitas em Fcs são aquelas para reduzir ou eliminar a ligação a FcyRs e%ou proteínas do complemento reduzindo ou eliminando, desta forma, funções efetoras mediadas por Fc como ADCC, ADCP e CDC. Modificações exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, substituições, inserções e eliminações nas posições 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325 e 328, em que a numeração é de acordo com o índice EU. Substituições exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L e 328R, em que a numeração é de acordo com o índice EU. Uma variante de Fc pode compreender 236R%328R. Outras modificações para reduzir as interações de FcyR e o complemento incluem substituições 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P e 234V, bem como a remoção a glicosilação na posição 297 por meios mutacionais ou enzimãticos ou por produção em organismos como bactérias que não glicosilam proteínas. Estas e outras modificações são revistas em Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20:685-691.

Opcionalmente, a região Fc pode compreender um resíduo de aminoãcido de ocorrência natural em posições adicionais e%ou alternativas conhecidas para o perito na especialidade 0 veja-se, por exemplo, os documentos de patente U.S N.0s 5.624.821; 6.277.375; 6.737.056; 6.194.551; 7.317.091; 8.101.720; publicações de patente PCT WO 00%42072; WO 01%58957; WO 02%06919; WO 04%016750; WO 04%029207; WO 04%035752; WO 04%074455; WO 04%099249; WO 04%063351; WO 05%070963; WO 05%040217( WO 05%0S2925 e WO 06%020114.

As variantes de que poteneiam a afinidade para urn. recetor FcyRIIb inibitório também podem ser utilizadas. Tais variantes podem proporcionar uma proteína de fusão Fc com atividade imunomoduladoras relacionadas com células FcyRl 1b incluindo, por exemplo, células B e monócitos. Numa forma de realização, as variantes de Fc proporcionam afinidade seletivamente potenciada para FcyRllb em relação a um ou mais recetores de ativação. As modificações para alterar a ligação a FcyRl lb incluem uma ou mais modificações numa posição selecionada a partir do grupo que consiste em 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328 e 332, de acordo com o índice EU.

Substituições exemplificativas para potenciar a afinidade de FcvRl lb incluem, mas não estão limitadas a, 234D, 234E, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y e 332E. Substituições exemplificativas incluem 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W e 328Y. Outras variantes de Fc para potenciar a ligação a FcyRl lb incluem 235Y%267E, 236D%267E, 239D%268D, 239D%267E, 267E%268D, 267E%268E e 267E%328F.

As afinidades e propriedades de ligação de uma região Fc para o seu ligando podem ser determinadas por uma variedade de métodos de ensaio in vitro 0 ensaios de base bioquímica ou imunológica( conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, métodos de equilíbrio 0 por exmplo, ensaio de imunoabsorção enzimática 0 ELISA(, ou radioimunoensaio 0 RIA((, ou cinética 0 por exemploanálise BIACORE(, e outros métodos como ensaios de ligação indiretos, ensaios de inibição competitiva, transferência de energia ressonante de fluorescência 0 FRET(, eletoforese em gel e cromatografia 0 por exemplo, filtração em §1 (. Estes e outros métodos podem utilizar um marcador sobre um ou mais dos componentes que estão a ser examinados e%ou empregar uma variedade de métodos de deteção, incluindo mas não limitados a, marcadores cromogénicos, fluorescentes, luminescentes ou isotópicos. Uma descrição detalhada das afinidades de ligação e cinética pode ser encontrada em Paul, W. E. , ed. , Fundamental Immunology, 4a Ed. , Lippincott-Raven, Filadélfia 0 1999(, que se foca na interações de anticorpo-imunogénio.

Uma proteína de fusão Fc da presente divulgação também pode compreender uma porção Fc que aumenta a semivida sérica da proteína de fusão Fc. Por exemplo, isto pode ser feito aumentando a afinidade de ligação da região Fc para FcRn. Por exemplo, um ou mais dos seguintes resíduos podem ser mutados: 252, 254, 256, 433, 435, 436, como descrito no documento de patente U.S. N.° 6.277.375.

Outras variantes exemplificativas que aumentam a ligação a FcRn e%ou melhoram as propriedades farmacocinéticas incluem substituições nas posições 259, 308, 428 e 434, incluindo por exemplo 2591, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y e 434M. Outras variantes que aumentam a ligação de Fc a FcRn incluem: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q%428L 0 Hinton et al. , 2004, J. Biol. Chem. 2790 8 (: 6213-6216, Hintonet al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356(, 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 307Q, 31 ΙΑ, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A 0 Shieldset al. , Journal of Biological Chemistry, 2001 , 2760 9 (:6591-6604 (, 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 311S, 433R, 433S, 4331, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y%254T%256E, 433K%434F%436H, 308T%309P%311S 0 Dal Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171 -5180, Dali'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281 :23514-23524 (. Outras modificações para modular a ligação de FCRn são descritas em Yeung et al. , 2010, J Immunol, 182:7663-7671. Em determinadas formas de realização, isotipos de IgG híbridos com caracteristicas biológicas particulares podem ser utilizados. Por exemplo, uma variante híbrida IgGl%IgG3 pode ser construída por substituição das posições de IgGl na região CHI e%ou CH3 com os aminoácidos de IgG3 nas posições onde os dois isotipos diferem. Assim, pode ser construído um anticorpo IgG variante híbrido que compreende uma ou mais substituições, por exemplo, 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 4221, 435R e 436F. Noutras formas de realização da invenção, uma variante híbrida IgGl%IgG3 pode ser construída por substituição das posições de IgG2 na região CH2 e%ou CH3 com aminoácidos de IgGl nas posições onde os dois isotipos diferem. Assim, pode ser construído um anticorpo IgG variante híbrido que compreende uma ou mais substituições, por exemplo, uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos: 233E, 234L, 235L, 236G 0 com referência a uma inserção de uma glicina na posição 236( e 32 7A.

Em determinadas formas de realização, a glicosilação do Fc é modificada. Oligossacarídeos que estão ligados de forma covalente à região Fc podem ser alterados, por exemplo, através de expressão de uma IgG em vários organismos ou linhas celulares 0 por exemplo, célula CHO Lec-13 ou células YB2%0 de hibridoma(, manipulação ou, de outra forma, por regulação de enzimas envolvidas na via de glicosilação 0 por exemplo, FUT8 [al,6-fucosiltransease] e%ou βΐ-4-N-acetilglucosaminiltransferase III [GnTIII](, por modificação de um ou mais hidrato de carbono depois da IgG ter sido expressa, ou por expressão de uma proteína de fusão Fc na presença de análogos de fucose como inibidores enzimáticos. Outros métodos para a modificação de glicoformas de proteínas de fusão Fc incluem a utilização de estirpes glicomanipuladas de levedura 0 Liet al., 2006, Nature Biotechnology 240 2(:210-215(, musgo 0 Nechafety et al., 2007, Mol Immunjol 440 7(: 1826-8(, e plantas 0 £oet al. , 2006, Nat Biotechnol 240 12(:1591 -7 (. Numa forma de realização, as fusões Fc são glicomanipuladas para alterar o nível de sialilação. Níveis mais elevados de glicanos de

Fc sialilados em moléculas Fc podem afetar adversamente a funcionalidade 0 Scallon et al. , 2007, Mol Immunol. 440 7 (: 1524-34(, e diferenças nos níveis de sialilação de Fc podem resultar numa atividade anti- inflamatória modificada 0 Kaneko et al., 2006, Science 313:670-673(. 0 nível de gi icosilação de uma molécula Fc pode também ser modificado por mutações específicas. Por exemplo, uma mutação na posição de aminoácidos 297 ou 299 remove a glicosilação na posição 297. Tais mutantes também podem ser utilizados com proteínas de fusão Fc.

Outras modificações de Fc que podem ser utilizadas nas proteínas de fusão Fc incluem aquelas descritas nos documentos W088%07054, W088%07089, US 6.277.375, WO99%051642, W001%058957, W02003%074679, W02004%029207, US 7.317.091 e W02004%099249.

Adicionalmente, as seguintes variantes de Fc também podem ser utilizadas para a porção Fc das proteínas de fusão Fc descritas no presente documento. A Figura 25 mostra a comparação de Fc de região constante γΤ humana de tipo selvagem 0 Fc de IgGl humana; designada como Fé na Figura 25( com Fc4 0 SEQ ID NO: 99(, Fc5 0 SEQ ID N0100(, Fc6 0 SEQ ID NO: 101 (, Fc7 0 SEQ ID NO: 102 (, Fc8 0QSED NO: 103 (, Fc9 0 SEQ ID NO: 104 (, FclO 0 SEQ ID NO: 105 (Fell 0 SEQ ID NO: 106(, Fcl2 0 SEQ ID NO: 107(, Fcl3 0 SE© NO: 108(, Fcl4 0 SEQ ID NO: 109(, Fc-15 0 SEQ ID NO: 11Q(Fcl6 0 SEQ ID NO: 111(, Fcl7 0 SEQ ID NO: 112(, Fcl8 0 SE© NO: 113 (, Fcl90 SEQ ID NO: 114 (, Fc21 0 SEQ ID NO: 115 (Fc22 0 SEQ ID NO: 116 (, Fc23 0 SEQ ID NO: 117 ( . Em algunaspetos, uma proteína de fusão Fc descrita no presente documento compreende um domínio Fc que tem pelo menos 50, 100 ou 150 aminoácidos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 99-117. Noutras formas de realização, uma proteína de fusão Fc descrita no presente documento compreende um domínio Fc que tem desde 50-100, 50-150, ou 100-150 aminoácidos contíguos das SEQ ID NOs: 99-117. Ainda noutras formas de realização, uma proteína de fusão Fc descrita no presente documento compreende um domínio Fc que compreende as SEQ ID NOs: 99-117 com desde 1-5, 1-10, 1-15, 1-20 ou 1-25 substituições ou substituições conservatives. A sequência de região constante γΐ de tipo selvagem humana foi descrita por primeira vez pelo grupo de Leroy Hood em Ellison et al. , Nucl. Acids Res. 10:4071 S 1982(. posições do índce EU 356, 358 e 431 definem o haplotipo Glmyl. A sequência de tipo selvagem mostra aqui é de GlmS 1(, posições 356e 368, e haplotipo nGImS 2(, posição 431. A variante de Fc4 contém uma região de dobradiça vl, mas Arg 218 foi introduzido na região de dobradiça para incluir a sequência de reconhecimento da enzima de restrição BglII para facilitar a clonagem. Cys 220 é o resíduo Cys que forma uma ligação de dissulfureto com a região constante de cadeia leve numa proteína de imunoglobulina IgGl intacta. Fc4 também inclui uma substituição de um resíduo de Cys por Ser para impedir efeitos deletérios devido à potencial presença de um grupo sulfidrilo não emparelhado. A região CH4 de Fc4 baseia-se na CH2 de yl e contém três substituições de aminoácidos que reduzem a ligação do recetor I Fc γ 0 FçRI (. Estas são as substituições nas posições de índice de EU 234, 235 e 237. Estas substituições foram descritas pelo grupo de Greg Winter em Duncan et al., Nature 332:563 0 1988( e foram demonstradas nesse artigo como reduzindo a ligação ao Fc γ RI.

Duas substituições de aminoácidos no sítio de ligação a Clq do complemento foram introduzidas para reduzir a fixação do complemento. Estas são as substituições nas posições de índice EU 330 e 331. A importância, ou relevância, das posições 330 e 331 na ligação a Clq do complemento 0 ou falta de fixação ou ativação do complemento( é descrita pelo grupo de Sherie Morrison em

Tao et al. , J. Exp. Med. 178:661 E 1993 ( e Canfield e Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 El 1991(. A região CH na variante de CH4 permanece idêntica ao Fc γΐ de tipo selvagem.

Fc5 é uma variante de Fc4. Na região de dobradiça de Fc5, a substituição Arg 218 foi devolvida ao resíduo Lys 218 de tipo selvagem. Fc5 contém a mesma substituição de Ser por Cys 220 como descrito acima para Fc4. Fc5 contém as mesmas substituições de CH2 como Fc4 e a região CH2 de Fc5 é idêntica ao Fc yl de tipo selvagem. A variante Fc6 contém as mesmas substituições da região de dobradiça que Fc5 e contém as mesmas substituições de CH2 que Fc4. A região CH3 de Fc6 não contém um resíduo de lisina no terminal carboxilo. Este resíduo de Lys particular não tem um número do índice EU atribuído. Esta lisina é removida num grau variável a partir de imunoglobulinas maduras e, portanto, não é predominantemente encontrada em anticorpos em circulação. A ausência deste resíduo em proteínas de fusão Fc pode resultar num produto mais homogéneo. A variante Fc7 é idêntica ao Fc yl de tipo selvagem na região de dobradiça. A sua região CH2 está baseada na CH2 de γΐ, mas o sítio de ligação de hidrato de carbono Ν'-ligado no resíduo Asn-297 é alterado para Gin para produzir um Fc desglicosilado. S Veja-se por exemplo, Tao e Mrrison H 1989( J. Immunol. 143:2595-2601(. A região CH3 é dêntica ao Fc γΐ de tipo selvagem. A variante Fc8 tem uma região de dobradiça que é idêntica a Fc4, e ambas a região CH2 e a região CH3 são idênticas às regiões de Fc γΐ de tipo selvagem correspondentes. A variante Fc9 contém uma dobradiça de vl encurtada no resíduo Asp imediatamente carboxi-terminal em relação ao resíduo de Cys envolvido na ligação de dissulfureto à cadeia leve. A sequência de dobradiça restante é idêntica à da dobradiça de γΐ de tipo selvagem. Ambas a sequência de região CH2 e a sequência de região CH3 são idênticas às regiões correspondentes para o Fc yl de tipo selvagem. A variante FclO contém a mesma substituição da região de dobradiça que Fc5. Ambas a sequência de região CH2 e a sequência de região CH3 são idênticas às regiões correspondentes para o Fc γ1 de tipo selvagem. A variante Fell contém as mesmas substituições da região de dobradiça que Fc5. 0 seu domínio CH2 está baseado na CH2 de yl, mas contém as substituições para diminuir a ligação ao recetor Fey 0 substituições nas posições do índice EU 234, 235 e 237 ( . Fell é de tipo selvagem para a ligação a Clq e fixação do complemento. 0 domínio CH3 de Fell é idêntico ao CH3 de vl de tipo selvagem. A variante Fcl2 contém uma dobradiça de yl com substituições Cys 220 Ser, Cys 226 Ser, e Cys 229 Ser, tem um domínio CH2 que é idêntico ao de Fc5 e tem um domínio CH3 de yl de tipo selvagem. A variante Fcl3 contém uma dobradiça de yl com substituições Cys 220 Ser, Cys 226 Ser, e Cys 229 Ser, tem um domínio CH2 que é idêntico ao de Fc5 e tem um domínio CH3 de yl de tipo selvagem com substituição Tyr 407 Gly. A variante Fcl4 contém uma dobradiça de yl com substituições Cys 220 Ser, Cys 226 Ser, e Cys 229 Ser, tem um CH2 de yl de tipo selvagem e tem um CH3 de yl de tipo selvagem com substituição Tyr 407 Gly. A variante Fcl5 contém uma dobradiça de y4 com uma substituição Ser 228 Pro para diminuir a "troca de Fab" de IgG4 e tem domínios CH2 e CH3 de v'4 de tipo selvagem. A variante Fcl6 contém uma dobradiça de yl que contém uma substituição Cys 220 Ser, tem um domínio CH2 idêntico ao CH2 de yl e tem um domínio CH3 idêntico a CH3 de y4 de tipo selvagem. A variante Fcl7 contém uma dobradiça de yl com uma substituição Cys 220 Ser, tem um domínio CH2 de yl com uma substituição Phe 243 Ala e tem um domínio CH3 idêntico a CH3 de vl de tipo selvagem. A variante FclS contém uma dobradiça de yl com uma substituição Cys 220 Ser, tem um domínio CH2 de vl idêntico ao CH2 de γΐ de tipo selvagem e contém um CH3 de γΐ com uma substituição His 435 Ala. A variante Fcl9 contém uma dobradiça idêntica a Fc5, tem um domínio CH2 idêntico a Fc5, exceto que o sítio de ligação de hidrato de carbono N-ligado no resíduo Asn-297 é alterado para Gin para produzir um Fc desglicosilado, e tem um domínio CH3 idêntico a CH3 de γΐ de tipo selvagem. A variante Fc21 contém uma dobradiça de γΐ com substituições Cys 220 Ser, Cys 226 Ser e Cys 229 Ser, tem um domínio CH2 idêntico a Fc5, e tem um CH3 de yl com substituições Phe 405 Ala e Tyr 407 Gly. A variante Fc22 contém uma dobradiça de yl com substituições Cys 220 Ser, Cys 226 Ser e Cys 229 Ser, tem um domínio CH2 idêntico a Fel, e tem um CH3 de γ1 com substituições Phe 405 Ala e Tyr 407 Gly. A variante Fc23 contém uma dobradiça de yl com uma substituição Cys 22 0 Ser, tem um domínio CH2 de γ1 com substituições Leu 234 Ala, Leu 235 Glu, Pro 331 Ser e um domínio CH3 idêntico a Fc yl de tipo selvagem. A Figura 26 mostra um alinhamento de variantes de Fc adicionais que também podem ser utilizadas para a porção Fc das proteínas de fusão Fc descritas no presente documento. A Figura 26 mostra a comparação das sequências de aminoácidos de Fc de região constante de v2a de ratinhos BALB%c de tipo selvagem 0 mFcl; SEQ ID NO: 118( Fc d região constante de y2c de ratinhos BALB%c de tipo selvagem 0 mFc3; SEQ ID MO: 119 ( com duas variantes de Fc de ratinho, mFc2 0 SEQ ID NO: 12 0( e mFc4 0 SEQ ID NO: 121 (, que têmopca ou nenhuma função efetora. 0 y2c de C57BL%6 de tipo selvagem foi inicialmente isolado e sequenciado no início dos anos 80 e referido como o y2c de ratinho, alotipo b 0 Schreieret al. PNAS 78:4495 13 1981((. Comparações de análise de sequência subsequentes mostraram que o gene corresponde, de facto, a y2a de ratinho 0 Fukui et al. , J. Mol. Cell. Immunol. 1:321 S 1984( e Morgado et al. , EMBO J. 8:3245 0 1989((. Note-se que existem vários alotipos para abas as sequências de y2a e y2c. A sequência de mFcl corresponde ao n.° de Acesso Genbank V00825 enquanto a sequência de mFc3 corresponde ao n.° de Acesso Genbank Y10606.

Em alguns aspetos, uma proteína de fusão Fc descrita no presente documento compreende um domínio Fc que tem pelo menos 50, 100 ou 150 aminoácidos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 118-121. Noutras formas de realização, uma proteína de fusão Fc descrita no presente documento compreende um domínio Fc que tem desde 50-100, 50-150 ou 100-150 aminoácidos contíguos das SEQ ID NOs: 118-121.

Ainda noutras formas de realização, uma proteína de fusão Fc descrita no presente documento compreende um domínio Fc que compreende as SEQ ID NOs: 118-121 com desde 1-5, 1-10, 1-15, 1-20 ou 1-25 substituições ou substituições conservativas. A variante mFcl contém um Fc de y2a de ratinho BALB%c de tipo selvagem. A variante mFc2 contém uma dobradiça de y2a de ratinho BALB%c com uma substituição Gly 219 Ser. 0 domínio CH2 de mFc2 contém uma substituição de aminoácidos relativa a y2a de tipo selvagem de ratinho na posição 235 13 Leu a Gu ( para inativar a ligação a FcyRI e FcyRII como descrito em Duncan et al. , Nature 332:563 0 1988( e Zheng et al. , J Immunol. 163:4041 13 1999 (. Três alterações adicionais foram realizadas no sítio de ligação a Clq do complemento para reduzir a fixação do complemento nas posições 318, 320 e 322. Estas substituições também são descritas por Zheng et al. A interação de IgG e Clq foi originalmente identificada em Duncan e Winter, Nature 332:738 0 1988(. 0 dominó CH3 é idêntico ao Fc de y2a de ratinho de tipo selvagem. A variante mFc3 contém um Fc de y2c de ratinho C57BL%6 de tipo selvagem. A variante mFc3 é idêntica a mFc3 exceto que contém as substituições Gly 219 Ser e Leu 235 Glu presentes em mFc2.

Outras modificações%substituições%adições%deleções do domínio Fc serão prontamente aparentes para os peritos na especialidade.

Polipéptidos que compreendem domínios 10Fn3

As proteínas de fusão Fc proporcionadas no presente documento compreendem um domínio 10Fn3, que é uma proteína de estrutura baseada em fibronectina. As proteínas de estrutura baseada em fibronectina utilizam, geralmente, uma estrutura derivada a partir de uma fibronectina de tipo III 0 Fn3( ou de um domínio do tipo Fn3 e funcionam de ma forma característica de anticorpos naturais ou manipulados 0 isto é, policlonais, monoclonais, ou anticorpos de cadeia simples( e, adicionalmente, possuem vantagens estruturais. Especificamente, a estrutura destes imitadores de anticorpos foi concebida para uma dobragem, estabilidade e solubilidade ótimas, mesmo sob condições que normalmente conduzem à perda de estrutura e função nos anticorpos. Um exemplo de proteínas de estrutura baseada em fibronectina são as Adnectinas™ S Adnexus, uma subsidiária integal da Bristol-Myers Squibb(. As proteínas de estrutura baseada em fibronectina e Adnectinas™ podem ser monovalentes ou multivalentes.

Um domínio Fn3 é pequeno, monomérico, solúvel e estável. Carece de ligações de dissulfureto e, como tal, é estável sob condições de redução. A estrutura global de Fn3 assemelha-se à dobra de imunoglobulina. Os domínios Fn3 compreendem, em ordem desde o terminal N até ao terminal C, uma cadeia beta ou de tipo beta, A; uma ansa, AB; uma cadeia beta ou de tipo beta, B; uma ansa, BC; uma cadeia beta ou de tipo beta, C; uma ansa, CD; uma cadeia beta ou de tipo beta, D; uma ansa, DE; uma cadeia beta ou de tipo beta, E; uma ansa, EF; uma cadeia beta ou de tipo beta, F; uma ansa, FG e uma cadeia beta ou de tipo beta, G. As sete cadeias-β antiparalelas estão dispostas como duas folhas beta que formam um núcleo estável, enquanto criam duas "faces" compostas pelas ansas que conectam as cadeias beta ou de tipo beta. As ansas AB, CD e EF estão localizadas numa face e as ansas BC, DE e FG estão localizadas na face oposta. Qualquer ou todas as ansas AB, BC, CD, DE, EF e FG podem participar na ligação de ligandos. Existem pelo menos 15 módulos diferentes de Fn3 e enquanto a homologia de sequência entre os módulos é baixa, todos partilham uma elevada semelhança da estrutura terciária. A sequência de aminoãcidos do domínio décimo de fibronectina de tipo III humano, isto é, o décimo módulo de Fn3 humano (10Fn3), é estabelecida na SEQ ID NO: 1: VSDVPRDLEWAATPTS LLISWDAPAVTVRYYRITYGETCGNSPVQE FTVPGSKST ATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO: 1) (as ansas AB, CD e EF estão sublinhadas, e as ansas BC, FG e DE estão enfatizadas em negrito).

Na SEQ ID N0:1, a ansa AB corresponde aos resíduos 15-16, a ansa BC corresponde aos resíduos 21-30, a ansa CD corresponde aos resíduos 39-45, a ansa DE corresponde aos resíduos 51-56, a ansa EF corresponde aos resíduos 60-66 e a ansa FG corresponde aos resíduos 76-87. Veja-se, por exemplo, Xu et al., Chemistry & Biology 2002 9:933-942. As ansas BC, DE e FG alinham-se ao longo de uma face da molécula (por vezes referida como as ansas do "polo norte") e a ansas AB, CD e EF alinham-se ao longo da face oposta da molécula (por vezes referidas como ansas do "polo sul"). Na SEQ ID NO: 1, a cadeia beta A corresponde aos resíduos 9-14, a cadeia beta B corresponde aos resíduos 17-20, a cadeia beta C corresponde aos resíduos 31-38, a cadeia beta D corresponde aos resíduos 46-50, a cadeia beta E corresponde aos resíduos 57-59, a cadeia beta F corresponde aos resíduos 67-75 e a cadeia beta G corresponde aos resíduos 88-94. As cadeias estão conectadas umas às outras através da ansa correspondente, por exemplo, as cadeias A e B estão conectadas através da ansa AB na formação da cadeia A, ansa AB, cadeia B, etc. Os primeiros 8 aminoãcidos da SEQ ID NO:1 0 em itálico acima( podem ser eliminados enquanto ainda se mantém a atividade de ligação da molécula. Os resíduos envolvidos na formação do núcleo hidrofóbico 0 os "resíduos de aminoãcidos nucleares’( incluem os aminoãcidos que correspondem aos seguintes aminoãcidos da SEQ ID NO: 1: L8, V10, A13, L18, 120, W22, Y32, 134, Y36, F48, V50, A57, 159, L62, Y68, 170, V72, A74, 188 190 e Y92, em que os resíduos de aminoãcidos nucleares estão representados pelo código de aminoácido de letra única seguido pela posição na qual estão localizados dentro da SEQ ID NO: 1. Veja-se, por exemplo, Dickinson et al., J. Mol. Biol. 236: 1079-1092 0 1994(.

Os domínios lúFn3 são estrutural e funcionalmente análogos a anticorpos, especificamente a região variável de um anticorpo. Enquanto os domínios 10Fn3 podem ser descritos como "imitadores de anticorpos" ou "proteínas semelhantes a anticorpo", eles oferecem uma série de vantagens em relação aos anticorpos convencionais. Em particular, exibem propriedades de dobragem e termoestabilidade melhores em comparação com os anticorpos, e carecem de ligações de dissulfureto, que são conhecidas por impedir ou prevenir a dobragem adequada sob determinadas condições.

As ansas BC, DE e FG dos domínios i0Fn3 são análogas às regiões de determinação de complementaridade 0 CBs( das imunoglobulinas. A alteração da sequência de aminoãcidos nestas regiões de ansa altera a especificidade de ligação de luFn3 . Domínios 10Fn3 com modificações nas ansas AB, CD e EF também podem ser feitos de modo a produzir uma molécula que se liga a um alvo desejado. As sequências proteicas fora das ansas são análogas às regiões estruturais das imunoglobulinas e desempenham um papel na conformação estrutural de 10Fn3. Alterações nas regiões semelhantes às estruturais de 10Fn3 são permissíveis na medida em que a conformação estrutural não é alterada de modo a perturbar a ligação do ligando. Métodos para gerar ligant.es específicos de ligando 10Fn3 foram descritos nas Publicações PCT N.°s WO 00%034787, WO 01%64942 e WO 02%032925, que divulgam ligantes de TNFa de alta afinidade, Publicação PCT N° WO 2008%097497, que divulga ligantes de VEGFR2 de alta afinidade e Publicação PCT N° WO 2008%066752, que divulga ligantes de IGFIR de alta afinidade. Referências adicionais que discutem os ligantes 10Fn3 e métodos para selecionar ligantes incluem as Publicações PCT N.°s WO 98%056915, WO 02%081497 e WO 2008%031098 e Publicação U.S. N. 0 2003186385.

Conforme descrito acima, os resíduos de aminoãcidos correspondentes aos resíduos 21-30, 51-56 e 76-87 da SEQ ID NO: 1 definem as ansas BC, DE e FG, respetivamente. Contudo, deve ser entendido que nem todos os resíduos dentro da região de ansa têm de ser modificados de modo a alcançar um ligante i0Fn3 tendo uma forte afinidade para um alvo desejado. Por exemplo, em muitos casos, apenas são modificados os resíduos que correspondem aos aminoãcidos 23-30 da ansa BC e 52-55 da ansa DE e resultam em ligantes i0Fn3 de alta afinidade. Consequentemente, em determinadas formas de realização, a ansa BC pode ser definida por aminoãcidos que correspondem aos resíduos 23-30 da SEQ ID NO: 1, e a ansa DE pode ser definida por aminoãcidos que correspondem aos resíduos 52-55 da SEQ ID NO: 1. Adicionalmente, também podem ser realizadas inserções e eliminações nas regiões de ansa enquanto se produz ao mesmo tempo ligantes 10Fn3 de alta afinidade.

Consequentemente, em algumas formas de realização, uma ou mais ansas selecionadas a partir de BC, DE e FG podem ser prolongadas ou encurtadas em comprimento em relação à ansa correspondente no 10Fn3 humano de tipo selvagem. Em algumas formas de realização, o comprimento da ansa pode ser prolongado em 2-25 aminoãcidos. Em algumas formas de realização, o comprimento da ansa pode ser diminuído em 1-11 aminoãcidos. Em particular, a ansa FG de 10Fn3 tem 12 resíduos de comprimento, enquanto a ansa correspondente nas cadeias pesadas de anticorpo varia desde 4-28 resíduos. Para otimizar a ligaçao a antigenios, como tal, o comprimento da ansa FG de 10Fn3 pode ser alterado em extensão bem como em sequência para cobrir o intervalo de CDR3 de 4-28 resíduos para obter a maior flexibilidade e afinidade possíveis na ligação a antigénios. Nalgumas formas de realização, o motivo de ligação a integrina "arginina-glicina-ácido aspãrtico" 0 RGD(, localizad nos resíduos 79-81 da SEQ ID NO: 1, pode ser modificado de modo a perturbar a ligação a integrina. Por exemplo, a sequência RGD pode ser substituída com SGE ou RGE,

Como descrito no presente documento, as sequências de ligação não ligando de 10Fn3, isto é, a "estrutura de 10Fn3", podem ser alteradas desde que o 10Fn3 retenha a função de ligação de ligando e%ou estabilidade estrutural. Nalgumas formas de realização, um ou mais de Asp 7, Glu 9 e Asp 23 são substituídos por outro aminoácido, como, por exemplo, um resíduo de aminoácido não carregado negativamente 0 por exemplo, Asn, Lys, etc.(. Estasmutações foram relatadas como tendo o efeito de promover uma maior estabilidade do mutante 10Fn3 a pH neutro em comparação com a forma de tipo selvagem 0 Veja-se, a Publicação PCTN.0 WO 02%04523(. Foram divulgadas uma variedade de alterações adicionais na estrutura de 10Fn3 que são benéficas ou neutras. Veja-se, por exemplo, Batori et al., Protein Eng. 2002 150 12(:1015-20,- Koide et al. , Biochemistry 2001 400 34(:10326-33. Em algumas formas de realização, θ aminoãcidos nucleares hidrofóbicos não são modificados em relação à sequência de tipo selvagem. Noutras formas de realização, os seguintes aminoãcidos hidrofóbicos podem ser mutados : W22 e%ou L62. A estrutura de 10Fn3 pode ser modificada por uma ou mais substituições conservativas. Até 5 ®, 10 ®, 20 ® ou mesmo 30 ® ou mais dos aminoãcidos na estrutura de 10Fn3 pode ser alterado por uma substituição conservative sem alterar substancialmente a afinidade de 10Fn3 para um ligando. Em determinadas formas de realização, a estrutura pode compreender entre 0-15, 0-10, 0-8, 0-6, 0-5, 0-4, 0-3, 1- 15, 1-10, 1-8, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 2-15, 2-10, 2-8, 2-6, 2- 5, 2-4, 5-15 ou 5-10 substituições de aminoãcidos conservativas. Em determinadas formas de realização, as substituições na estrutura não incluem substituições dos resíduos de aminoãcidos nucleares hidrofóbicos.

Preferentemente, a modificação da estrutura reduz a afinidade de ligação do ligante 10Fn3 para um ligando em menos 100 vezes, 50 vezes, 25 vezes, 10 vezes, 5 vezes ou 2 vezes. Pode acontecer que tais alterações alterem a imunogenicidade de 10Fn3 in vivo, e quando a imunogenicidade for diminuída, tais alterações serão desejáveis. Como utilizado no presente documento, "substituições conservativas" refere-se à substituição de um aminoãcido com outro aminoácido que é física e funcionalmente semelhante ao aminoãcido que está a ser substituído. Isto é, uma substituição conservativa e o seu resíduo de referência têm um tamanho, forma, carga elétrica, propriedades químicas semelhantes incluindo a capacidade de formar ligações covalentes ou de hidrogénio, ou semelhantes. Substituições conservativas preferidas são aquelas que satisfazem os critérios definidos para uma mutação pontual aceite em Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 0 1978 & Supp.(. Esmplos de substituições conservativas são substituições nos seguintes grupos: 0 a( valina, glicina; 0 b( glicina, alanina; 0 c( valina, isoleucina, leucina; 0 d( ácido aspártico, ácido glutâmico; S e( asparagina, glutamma; S f( serina, treonina; 13 g( lisina, arginina, metionina e I h( fenilalanina, tirosina.

Em algumas formas de realização, o pedido proporciona uma proteína de fusão Fc compreendendo um domínio 10Fn3, em que o polipéptido 10Fn3 tem pelo menos 40® 50®, 55®, 60 ®, 65 ®, 70 ®, 75 ®, 80 ®, 85 ® ou 90 ® de identidade com o domínio 10Fn3 humano que tem a sequência de aminoãcidos da SEQ ID NO: 1. Muita da variabilidade irá ocorrer, geralmente, numa ou mais das ansas. Cada uma das cadeias beta ou de tipo beta de um domínio 10Fn3 numa proteína de estrutura baseada em fibronectina podem compreender, consistir essencialmente em, ou consistir numa sequência de aminoãcidos que é pelo menos 80 ®, 85 ®, 90 ®, 95 ® ou 100 ® idêntica a uma sequência de uma cadeia beta ou de tipo beta correspondente da SEQ ID NO: 1, desde que tal variação não perturbe a estabilidade do polipéptido em condições fisiológicas. Em formas de realização exemplificativas, o domínio l0Fn3 liga-se a um alvo desejado com uma KD inferior a 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 100 nM ou menos, Em formas de realização exemplificativas, a proteína de estrutura baseada em fibronectina liga-se especificamente a um alvo que não é ligado por um domínio i0Fn3 de tipo selvagem, particularmente o domínio i0Fn3 humano de tipo selvagem.

Em algumas formas de realização, o pedido proporciona uma proteína de fusão Fc compreendendo um domínio i0Fn3, em que o polipéptido 10Fn3 tem uma sequência de aminoãcidos pelo menos 80, 85, 90, 95, 98 ou 100 ® idêntica às regiões não ansa da SEQ ID NO: 1, em que pelo menos uma ansa selecionada a partir de BC, DE e FG é alterada. Em algumas formas de realização, a ansa BC alterada tem até 10 substituições de aminoãcidos, até 4 eliminações de aminoãcidos, até 10 inserções de aminoãcidos ou uma combinação dos mesmos. Em algumas formas de realização, a ansa DE alterada tem até 6 substituições de aminoãcidos, até 4 eliminações de aminoãcidos, até 13 inserções de aminoãcidos ou uma combinação dos mesmos. Em algumas formas de realização, a ansa FG tem até 12 substituições de aminoãcidos, até 11 eliminações de aminoãcidos, até 25 inserções de aminoãcidos ou uma combinação dos mesmos.

Em algumas formas de realização, o pedido proporciona proteínas de fusão Fc compreendendo um domínio iCIFn3, em que o domínio 10Fn3 compreende uma ansa, AB; uma ansa, BC; uma ansa, CD; uma ansa, DE; uma ansa, EF; e uma ansa, FG; e tem pelo menos uma ansa selecionada a partir da ansa BC, DE e FG com uma sequência de aminoãcidos alterada relativa à sequência da ansa correspondente do domínio ~°Fn3 humano. Em algumas formas de realização, as ansas BC e FG são alteradas. Em algumas formas de realização, as ansas BC, DE e FG são alteradas, isto é, o domínio 10Fn3 compreende ansas de ocorrência não natural. Por "alterado" entende-se uma ou mais sequências de aminoãcidos relativas a uma sequência molde 0 ou seja, o domínio de fibronectinahumano correspondente( e inclui adições, eliminações e substituições de aminoãcidos. A alteração de uma sequência de aminoãcidos pode ser conseguida através de variação de sequências intencional, cega ou espontânea, geralmente de uma sequência de codificação de ácidos nucleicos, e pode ocorrer através de qualquer técnica, por exemplo, PCR, PCR propenso a erros ou síntese química de ADN.

Em determinadas formas de realização, o pedido proporciona proteínas de fusão Fc compreendendo um domínio 10Fn3, em que o domínio luFn3 pode ser definido geralmente pela seguinte sequência de aminoãcidos nuclear: EWAAT0 XjSLLI0 X^YRITYGElEI XrfQEFTV0 Xv(ATI0 X4PYTITVYAV0 Xl ISINYRT0 SEQ ID NO:2(.

Na SEQ ID NO: 2, a ansa AB é representada por Xa, a ansa CD é representada por Xb, a ansa EF é representada por Xc, a ansa BC é representada por Xx, a ansa DE é representada por XY, e a ansa FG é representada por Xz. X representa qualquer aminoácido e o subscrito a seguir ao X representa um número inteiro do número de aminoácidos. Em particular, a pode ser qualquer de entre 1-15, 2-15, 1-10, 2-10, 1-8, 2-8, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1-3, 2-3 ou 1-2 aminoácidos; e b, c, x, y e z podem cada ser independentemente qualquer de entre 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5- 20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7 ou 6- 7 aminoácidos. Em formas de realização preferidas, a é dois aminoácidos, b ê 7 aminoácidos, c é 7 aminoácidos, x é 9 aminoácidos, y é 6 aminoácidos e z é 12 aminoácidos. As sequências das cadeias beta 13 sublinhadas na SEQ IDNO: 2( podem ter qualquer desde 0 a 10, desde 0 até 8, desde 0 até 6, desde 0 até 5, desde 0 até 4, desde 0 até 3, desde 0 até 2, ou desde 0 até 1 substituições, eliminações ou adições através de todas as 7 regiões de estrutura em relação aos aminoácidos correspondentes mostrados na SEQ ID NO; 2. Numa forma de realização exemplificativa, as sequências das cadeias beta podem ter qualquer desde 0 até 10, desde 0 até 8, desde 0 até 6, desde 0 até 5, desde 0 até 4, desde 0 até 3, desde 0 até 2, ou desde 0 até 1 substituições conservativas através de todas as 7 regiões de estrutura em relação aos aminoácidos correspondentes mostrados na SEQ ID NO: 2. Em determinadas formas de realização, os resíduos de aminoácidos nucleares hidrofóbicos são fixos e quaisquer substituições, substituições conservativas, eliminações ou adições ocorrem em resíduos diferentes dos resíduos de aminoácidos nucleares. Em formas de realização exemplificativas, as ansas BC, DE e FG como representadas por 13 Xi, 0 X(y e 13 X,( respetivamente, são substituídas com polipéptidos que compreendem sequências de ansa BC, DE e FG que se ligam a alvos específicos.

Em determinadas formas de realização, o pedido proporciona proteínas de fusão Fc compreendendo um domínio 10Fn3, em que o domínio 10Fn3 pode ser definido geralmente pela sequencia:

EWAATPTSLLIfXVYYRITYGETGGNSPVOEFTVQaATiSGLKPGVDYTITVYAVOaiS INYRT {SEP IP N0:3).

Na SEQ ID NO: 3, a ansa BC é representada por Xx, a ansa DE é representada por Xy, e a ansa FG é representada por Xz. X representa qualquer aminoácido e o subscrito a seguir ao X representa um número inteiro do número de aminoãcidos. Em particular, x, y e z podem cada ser independentemente qualquer de entre 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5- 20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7 ou 6- 7 aminoãcidos. Em formas de realização preferidas, x é 9 aminoãcidos, y é 6 aminoãcidos e z é 12 aminoãcidos. As sequências das cadeias beta e ansas do polo sul M sublinhadas na SEQ ID NO: 3( podem ter qualquer dede 0 a 10, desde 0 até 8, desde 0 até 6, desde 0 até 5, desde 0 até 4, desde 0 até 3, desde 0 até 2, ou desde 0 até 1 substituições, eliminações ou adições através de todas as 7 regiões de estrutura e ansas do polo sul em relação aos aminoãcidos correspondentes mostrados na SEQ ID NO: 3. Numa forma de realização exemplificativa, as sequências das cadeias beta e ansas do polo sul podem ter qualquer desde 0 até 10, desde 0 até 8, desde 0 até 6, desde 0 até 5, desde 0 até 4, desde 0 até 3, desde 0 até 2, ou desde 0 até 1 substituições conservativas através de todas as 7 regiões de estrutura e ansas do polo sul em relação aos aminoãcidos correspondentes mostrados na SEQ ID NO: 3. Em determinadas formas de realização, os resíduos de aminoãcidos nucleares são fixos e quaisquer substituições, substituições conservativas, eliminações ou adições ocorrem em resíduos diferentes dos resíduos de aminoãcidos nucleares. Em formas de realização exemplificativas, as ansas BC, DE e FG como representadas por E> X^, 0 X-^i, e 0 X^, respetivamente, são substituídas com polipéptidos que compreendem sequências de ansa BC, DE e FG que se ligam a alvos específicos.

Um domínio i0Fn3 como descrito no presente documento pode opcionalmente conter uma sequência N e%ou C terminal modificada. Por exemplo, com referência à SEQ ID NO:2 ou 3, o domínio 10Fn3 pode compreender uma extensão N-terminal e%ou uma cauda C-terminal como descrito mais abaixo.

Em determinadas formas de realização, o domínio 10Fn3 como mostrado na SEQ ID NO: 2 ou 3 pode opcionalmente compreender uma extensão N-terminal de desde 1-20, 1-15, Ι-ΙΟ, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ou 1 aminoãcidos de comprimento. Extensões N-terminais exemplificativas incluem 0 representadas pelo código de aminoãcido de letra úica( M, MG, G, MGVSDVPRDL Kl SEQ ID NO: 4(, VSDVPRDL Kl SEQ ΙΕΓΟ: 5(, e GVSDVPRDL Kl SEQ ID NO: 6(, ou truncagens N-terminâs de qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 5 ou 6. Outras extensões N-terminais adequadas incluem, por exemplo, XnSDVPRDL Kl SEQ ID NO: 7 (, XnDVPRDL Kl SEQ ID NO: 8(, pTRDL Kl SEQ ID NO: 9(, XnPRDL Kl SEQ ID NO: 10 (, XRDL Kl SEQ ID NO: 11 ( , gDL K! SEQ ID NO: 12 (, ou XnL, em que n = 0, 1 ou 2 aminoãcidos, em que quando n = 1, X é Met ou Gly, e quando n = 2, X é Met-Gly. Quando uma sequência MetGly é adicionada ao terminal N de um domínio 10Fn3, o M será normalmente separado por clivagem, deixando um G no terminal N.

Em determinadas formas de realização, o domínio 10Fn3 como mostrado na SEQ ID NO: 2 ou 3 pode opcionalmente compreender uma cauda C-t.erminal de desde 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5 ou 1-4 aminoãcidos de comprimento. Exemplos específicos das sequências de causa incluem, por exemplo, polipéptidos que compreendem, consistem essencialmente em, ou consistem em, EIEK Kl SEQ ID NO: 13 (, EGSGC Kl SEQDINO: 14 (, EIEKPCQ Kl SEQ ID NO: 15 (, EIEKPSQ Kl SEQ ID NO: 6%, ΕΙΞΚΡ H SEQ ID NO: 17 (, EIEKPS E SEQ ID NO: 18 (, EIEE Kl SEQ ID NO: 19 (, EIDKPSQ Kl SEQ ID NO: 20 (, OU EIDKPSQLE llEQ ID NO: 21 (. Em determinadas formas de realização, o domínio 10Fn3 compreende uma cauda C-terminal que compreende a sequência XKi ED^, em que n é um número inteiro desde 2-10, 2-8, 2-5, 3-10, 3-8, 3-7, 3-5, 4-7 ou em que n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 9 ou 10, e X é opcional, e quando presente é um E, I ou EI. Tais caudas de repetição de ED podem potenciar a solubilidade e%ou reduzir a agregação do domínio lúFn3. Em formas de realização exemplificativas, a cauda C-terminal compreende, consiste essencialmente em, ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15. Em formas de realização preferidas, as sequências C-terminais carecem de sequências DK.

Em determinadas formas de realização, as proteínas de estrutura baseada em fibronectina compreendem um domínio 10Fn3 tendo ambas uma extensão N-terminal e uma cauda exterminai .

Em determinadas formas de realização, um domínio 10Fn3 é um domínio estabelecido no documento WO 2012%016245. Proteínas de estrutura baseada em fibronectina multivalentes

Em determinadas formas de realização, o pedido proporciona uma proteína de fusão Fc que compreende um polipéptido que tem dois ou mais domínios 10Fn3, por exemplo, uma proteína de estrutura baseada em fibronectina multivalente. Por exemplo, uma proteína de estrutura baseada em fibronectina multivalente pode compreender 2, 3 ou mais domínios 10Fn3 que estão associados de forma covalente. Em formas de realização exemplificativas, a proteína de estrutura baseada em fibronectina é uma proteína biespecífica ou dimérica que compreende dois domínios i0Fn3. Em determinadas formas de realização, uma estrutura proteica baseada em fibronectina multivalente compreende um primeiro domínio 10Fn3 que se liga a uma primeira molécula alvo e um segundo domínio 10Fn3 que se liga a uma segunda molécula alvo. A primeira e segunda moléculas alvo podem ser as mesmas ou moléculas alvo diferentes. Quando a primeira e segunda moléculas alvo são as mesmas, os domínios i0Fn3, isto é, as ansas de ligação, podem ser as mesmas ou diferentes. Além disso, quando o primeiro e segundo domínios ~°Fn3 se ligam ao mesmo alvo, eles podem ligar-se ao mesmo ou a epítopos diferentes sobre o alvo.

Em formas de realização exemplificativas, cada domínio 10Fn3 de uma estrutura proteica baseada em fibronectina multivalente liga-se a um alvo desejado com uma KD inferior a 1 mM, 100 μΜ, 10 μΜ, 1 μΜ, 500 ηΜ, 100 ηΜ, 10 ηΜ, 1 ηΜ, 500 ρΜ, 100 ηΜ ou menos, Em formas de realização exemplificativas, cada domínio 10Fn3 de uma estrutura proteica baseada em fibronectina liga-se especificamente a um alvo que não é ligado por um domínio 10Fn3 de tipo selvagem, particularmente o domínio 10Fn3 humano de tipo selvagem. Em formas de realização exemplificativas, nenhum dos domínios 10Fn3 de uma estrutura proteica baseada em fibronectina multivalente se liga a uma proteína integrina.

No caso de proteínas de estrutura baseada em fibronectina multivalentes, preferentemente, nenhum dos domínios 10Fn3 compreende uma cauda N-terminal contendo uma sequência DK. Em formas de realização exemplificativas, uma proteína de estrutura baseada em fibronectina multivalente compreende dois ou mais domínios 10Fn3, em que cada domínio compreende uma cauda C-terminal que não contém uma sequência DK. Em determinadas formas de realização, uma proteína de estrutura baseada em fibronectina multivalente compreende dois ou mais domínios 10Fn3, em que cada domínio compreende uma cauda C-terminal que não contém uma sequência DK.

Os domínios luFn3 numa proteína de estrutura baseada em fibronectina multivalente podem ser conectados por um ligante peptídico. Ligantes peptídicos exemplificativos incluem péptidos que têm desde 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-5, 1-4, 1-3 ou 1-2 aminoãcidos. Ligantes adequados para unir os domínios 10Fn3 são aqueles que permitem que os domínios separados se dobrem independentemente uns dos outros formando uma estrutura tridimensional que permite uma ligação de alta afinidade a uma molécula alvo. Em algumas formas de realização, ligantes adequados que permitem que os domínios ou porções separadas se dobrem independentemente umas das outras compreendem ligantes à base de glicina-serina, ligantes à base de glicina-prolina e ligantes à base de prolina-alanina. Os Exemplos descritos no documento WO 2009%142773 demonstram que os domínios Fn3 unidos através destes ligantes retêm a sua função de ligação ao alvo. Em algumas formas de realização, o ligante é um ligante à base de glicina-serina. Estes ligantes compreendem resíduos de glicina e serina e podem ter entre 8 e 50, 10 e 30 e 10 e 20 aminoácidos de comprimento. Exemplos de tais ligantes incluem GSGSGSGSGS E SEQ 3D NO: 32 (, GSGSGSGSGSGS E SEQ ID NO: 33 (, GSGSGSGSGSGSGSGSSGS E SEQ ID NO: 34 (, GGGGSGGGGSGGGGS E SEQ ID NO: 35 (, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS E SEQ ID NO: 80(, e GGGGSGGGGSGGGSG 0 SEQ ID NO: 36 ( . Em algumas formas de realização, o ligante é um ligante à base de glicina- prolina. Estes ligantes compreendem resíduos de glicina e prolina e podem ter entre 3 e 30, 10 e 30 e 3 e 20 aminoácidos de comprimento. Exemplos de tais ligantes incluem GPG E SEQ ID NO: 39(, GPGPGPG E SEQ ID NO: 40 e GPGPGPGPGPG E SEQ ID NO: 41 ( . Em algumas formas de realizaçao, o ligante e um ligante a base de prolina- alanina. Estes ligantes compreendem resíduos de prolina e alanina e podem ter entre 3 e 30, 10 e 30, 3 e 20 e 6 e 18 aminoácidos de comprimento. Exemplos de tais ligantes incluem PAPAPA El SEQ ID NO: 42 (, PAPAPAPAPAPA 0 SEQ Dl NO: 43( e PAPAPAPAPAPAPAPAPA E SEQ ID NO: 44(. Noutras õrmas de realização, o ligante compreende a sequência PSTSTST 0 SEQ ID NO: 71(. Está contemplado, que o comprimento de ligante e composição de aminoácidos ótimos podem ser determinados por experimentação de rotina com base nos ensinamentos proporcionados no presente documento. Em formas de realização exemplificativas, o ligante não contém quaisquer sequências DK.

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Noutras formas de realização, o pedido proporciona ácidos nucleicos que codificam qualquer das proteínas de fusão Fc divulgadas no presente documento. A utilização de codões podem ser selecionada de modo a melhorar a expressão numa célula. Tal utilização de codões dependerá do tipo celular selecionado. Padrões de utilização de codões especializados foram desenvolvidos para a E. coli e outras bactérias, bem como células mamíferas, células vegetais, células de levedura e células de inseto. Veja-se por exemplo: Mayfield et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 1000 2(:438-442 0 21 de jan de 2003 (; Sinclairet al., Protein Expr. Purif. 260 1(:96-105 0 out. de 2002 (; fíoell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 120 5(:446-449 0 outed2Q01(; Makrides et al. , Microbiol Rev., 600 3(:512-538 0 set de 1996 (,- e Sharp et al. , Yeast, 70 7(:657-678 0 out de 1991(. Técnicas gerais para a manipulação de ácidos nucleicos são descritas, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, vols. 1-3. Cold Spring Harbor Laboratory Press 0 1989(, ou Ausubel, F. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, Nova Iorque 0 198( e atualizações periódicas. Geralmente, o ADN que codifica o polipéptido é operativamente ligado a elementos reguladores transcricionais ou de tradução adequados derivados a partir de genes mamíferos, virais ou de insetos. Tais elementos reguladores incluem um promotor da transcricional, uma sequência operadora opcional para controlar a transcrição, uma sequência que codifica sítios de ligação ribossomal de ARNm, e sequências que controlam a terminação da transcrição e tradução. A capacidade de replicação num hospedeiro, habitualmente conferida por uma origem de replicação, e um gene de seleção para facilitar o reconhecimento de transformant.es é adicionalmente incorporado.

As proteínas de fusão Fc descritas no presente documento podem ser produzidas de forma recombinante não apenas diretamente, mas também como um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo, que é preferentemente uma sequência sinal ou outro polipéptido com um sítio de clivagem específico no terminal N da proteína ou polipéptido maduro. A sequência sinal heteróloga selecionada, é preferentemente, uma que é reconhecida e processada Kl isto é, clivada por uma peptidase sinal (pela célula hospedeira. Uma sequência líder N-terminal exemplificativa para a produção de polipéptidos num sistema mamífero é METDTLLLWVLLLWVPGSTG Kl SEQ ID NO: 29 (, qe é removida pela célula hospedeira depois da expressão.

Para células hospedeiras procariotas que não reconhecem nem processam a sequência sinal nativa, a sequencia sinal e substituída por uma sequencia sinal procariota selecionada, por exemplo, a partir do grupo de líderes da fosfatase alcalina, penicilase, Ipp ou de enterotoxina termoestavel II.

Para a secreção de leveduras, a sequência sinal nativa pode ser substituída, por exemplo, pelo líder de invertase de levedura, líder do fator α Kl incluindo os líderes dos fatores c* de Saccharomyces e Kluyveromyces(, ou líder da fosfatase ácida, o líder da glucosamilase de C. albicans, ou o sinal descrito no documento de Patente N.° 5.631.144. Na expressão de células de mamífero, as sequências sinal de mamífero, bem como os líderes de secreção virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex, estão disponíveis. 0 ADN para tais regiões precursoras pode ser ligado num quadro de leitura ao ADN que codifica a proteína.

Tantos os vetores de expressão como de clonagem contêm uma sequência de ácidos nucleicos que permite que o vetor se replique numa ou mais células hospedeiras selecionadas.

Geralmente, nos vetores de clonagem esta sequência é uma que permite que o vetor se replique independentemente do ADN cromossómico hospedeiro, e inclui origens de replicação ou sequências de replicação autónoma. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem da replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo de 2 micrómetros é adequada para leveduras, e várias origens virais 13 SV40, polioma, adenovirus, VSV ou BPV ( são úteis para a clonagem de vetores em células de mamíferos. Geralmente, o componente de origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamífero 13 a origem de SV40 pode tipicmente ser utilizada apenas porque contém o promotor precoce(.

Os vetores de expressão e clonagem podem conter um gene de seleção, também designado marcador selecionãvel. Os genes de seleção típicos codificam proteínas que B á conferem resistência a antibióticos e outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, 13 b( complementam deficiências auxotróicas, ou 0 c( fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, por exemplo, o gene que codifica a D-alanina racemase para Bacilli.

Os vetores de expressão e clonagem contêm normalmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operativamente ligado ao ácido nucleico que codifica a proteína divulgada no presente documento, por exemplo, uma proteína de estrutura baseada em fibronectina. Promotores adequados para utilização com hospedeiros procariotas incluem o promotor phoA, os sistemas promotores de beta-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, um sistema de promotor de triptofano 0 trp ( e promotores híbridos tais como o promotor tac. Contudo, outros promotores bacterianos conhecidos são adequados. Os promotores para utilização em sistemas bacterianos também conterão uma sequência de

ShineDalgarno El S.D.( operativamente ligada ao ADN qe codifica a proteína divulgada no presente documento. Sequências de promotores são conhecidas para eucariotas. Virtualmente, todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do sítio onde a transcrição é iniciada. Uma outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleótido. Na extremidade 3! da maioria dos genes eucarióticos está uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para a adição da cauda poli-A à extremidade 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências são adequadamente inseridas em vetores de expressão eucarióticos.

Exemplos de sequências promotoras adequadas para utilização com hospedeiros de levedura incluem os promotores para a 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase e glucoquinase. A transcrição a partir de vetores em células hospedeiras de mamíferos pode ser controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir de genomas de vírus como poliomavírus, vírus da varíola aviária, adenovirus H tal como Adenovirus 2(, papilomavírus bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovirus, vírus da hepatite B e mais preferivelmente o Vírus Símio 40 0 SV40(, apartir de promotores de mamífero heterólogos, por exemplo, o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira. A transcrição de um ADN que codifica proteínas divulgadas no presente documento por eucariotas superiores é frequentemente aumentada inserindo uma sequência potenciadora no vetor. Muitas sequências potenciadoras são agora conhecidas de genes de mamíferos E3 globina, eàstase, albumina, a-fetoproteína e insulina(. Tipicamente, contudo, utilizar-se-á um potenciador de um vírus de células eucarióticas. Exemplos incluem o potenciador do SV40 na última parte da origem de replicação 0 100-270 pb(, o potenciador do promotor inicial de citomegalovírus, o potenciador de polioma na última parte da origem de replicação e potenciadores de adenovirus. Veja-se também Yaniv, Nature, 297:17-18 El 1982( sobre elementos potenciadores para ativação de promotores eucarióticos. 0 potenciador pode ser unido no vetor numa posição 5' ou 3' à sequência de codificação do péptido, mas é preferentemente localizado num sítio 5’ do promotor.

Os vetores de expressão utilizados nas células hospedeiras eucarióticas 0 por exemplo, de leveduras fúngicas, de insetos vegetais animais, de ser humano, ou células nucleadas de outros organismos multicelulares( irão também conter sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do ARNm. Tais sequências estão normalmente disponíveis a partir das regiões não traduzidas 5’ e, ocasionalmente, 3' de ADN ou ADNc eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm que codifica a proteína divulgada no presente documento. Um componente de terminação da transcrição útil é a região de poliadenilação da hormona de crescimento bovina. Veja-se o documento WO 94%11026 e o vetor de expressão divulgado neste. 0 ADN recombinante também pode incluir qualquer tipo de sequência de etiqueta proteica que pode ser útil para purificar a proteína. Exemplos de etiquetas proteicas incluem, mas não estão limitadas a, uma etiqueta de histidina, uma etiqueta FLAG, uma etiqueta myc, uma etiqueta HA ou uma etiqueta GST. Vetores de expressão e clonagem adequados para utilização com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e de mamífero, podem ser encontrados em Cloning Vectors: A Laboratory Manual, S Elsevier, Nova Iorque 0 1985((. A construção de expressão é introduzida na célula hospedeira utilizando um método apropriado para a célula hospedeira, como será aparente para um perito na especialidade. Uma variedade de métodos para a introdução de ácidos nucleicos nas células hospedeiras são conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado a, eletroporação, transfeção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, ou outras substâncias; bombardeamento de microprojéteis; lipofeção e infeção E onde o vetor é um agente infecioso(. Células hospedeiras adequadas incluem procariotas, leveduras, células de mamíferos ou células bacterianas. Bactérias adequadas incluem organismos gram negativos ou gram positivos, por exemplo, E. coli ou Bacillus spp. Leveduras, preferentemente da espécie Saccharcmyces, como S. cerevisiae, também podem ser utilizadas para a produção de polipéptidos. Também podem ser vantajosamente empregues vários sistemas de cultura celular de mamíferos ou de insetos para expressar proteínas recombinantes. Os sistemas de baculovírus para produção de proteínas heterõlogas em células de insetos são revistos por Luckow et al., S Bio%Technology, 6:47 0 1988((. Exemplos de linhas ed células hospedeiras de mamífero adequadas incluem linhas celulares de células endoteliais, células de rim de macaco COS-7, CV-1, células L, C127, 3T3, linhas celulares de ovário de hamster chinês 0 CHO(, células renais embronárias humanas, HeLa, 293, 293T, e BHK. Polipéptidos purificados são preparados por cultura de sistemas de hospedeiro%vetor adequados para expressar as proteínas recombinantes. Para várias aplicações, o pequeno tamanho dos polipéptidos divulgados no presente documento tornaria a expressão em E. coli como o método preferido para a expressão. A proteína é depois purificada a partir de meios de cultura ou extratos celulares.

Produção de proteínas

Noutros aspetos, o pedido proporciona células hospedeiras que contêm vetores que codificam as proteínas de fusão Fc descritas no presente documento e descreve métodos para a produção das proteínas de fusão Fc descritas no presente documento. As células hospedeiras podem ser transformadas com os vetores de expressão ou clonagem descritos no presente documento para a produção de proteínas e podem ser cultivadas em meios nutritivos convencionais, modificados conforme apropriado para indução de promotores, seleção de transformantes, ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas. Células hospedeiras úteis para a produção de proteínas de elevado desempenho 0 HTPP ( e produção a média escala, indue a estirpe bacteriana HMS174. As células hospedeiras usadas para produzir as proteínas divulgadas no presente documento podem ser cultivadas numa variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis tais como FIO de Ham S Sgma (, Meio Essencial Mínimo 0 0 MEM(, 0 Sigma((, RPMI-164®i§ma(, e meio de Eagle modificado por Dulbecco 0 0 DMEM(, §ma ( são adequados para a cultura de células hospedeiras. Além disso, muitos dos meios descritos em Ham et al. , Meth. Enzymol., 58:44 § 1979(, Barites et al., Anal. Biochem., 102:255 0 1980(, os documentos de Patente U.S. N° 4767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655, 5.122.469, 6.048.728, 5.672.502, ou U.S N.° RE 30.985 podem ser utilizados como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios podem ser suplementados conforme necessário com hormonas e%ou outros fatores de crescimento 0 cmo insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico (, sais 0 como cloreto de sódio, cálcio, agnésio, e fosfato(, tampões 0 como HEPES(, nucleótidos 0 como adenosina e timidina(, antibióticos 0 como fármaco Gentamicina(, oligoelementos 0 definidos como compofeos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais no intervalo micromolar(, e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidas pelos peritos na especialidade. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e semelhantes, são aquelas previamente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão aparentes para o perito na especialidade.

As proteínas de fusão Fc proporcionadas no presente documento também podem ser produzidas utilizando sistemas de tradução celular. Para tais finalidades, os ácidos nucleicos que codificam a proteína de fusão devem ser modificados para permitir a transcrição in vitro para produzir ARNm e para permitir a tradução livre de células do ARNm no sistema livre de células particular a ser utilizado 0 eucariótico como um sistema de traduçãolivre de células de mamífero ou levedura ou procariótico como um sistema de tradução livre de células de bactérias.

As proteínas de fusão Fc divulgadas no presente documento também podem ser produzidas por síntese química 0 por exemplo, pelos métodos descritos em Solid Phae Peptide Synthesis, 2a Edição, The Pierce Chemical Co. , Rockford, IL 0 1984((. Modificações nas proteínas de fusão Fc também podem ser produzidas por síntese química.

As proteínas de fusão Fc divulgadas no presente documento podem ser purificadas por métodos de isolamento%purificação para proteínas geralmente conhecidos no campo da química proteica. Exemplos não limitantes incluem extração, recristalização, salificação 0 por exemplo, com sulfato de amónio ou sulfato de sódio(, centrifugação diãlise, ultrafiltração, cromatografia de adsorção, cromatografia de permuta iõnica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de fase normal, cromatografia de fase reversa, filtração em gel, cromatografia de permeação em gel, cromatografia de afinidade, eletroforese, distribuição contracorrente ou quaisquer combinações das mesmas. Depois da purificação, os polipéptidos podem ser trocados em diferentes tampões e%ou concentrados por qualquer de uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a, filtração e diãlise.

As proteínas de fusão Fc purificadas são preferentemente pelo menos 85 ® puras, ou preferentemente pelo menos 95 ® puras e ainda mais preferentemente pelo menos 98 ® puras. Independentemente do valor numérico exato da pureza, a proteína de fusão Fc é suficientemente pura para utilização como um produto farmacêutico.

Utilizações exemplificativas

Num aspeto, o pedido proporciona proteínas de fusão Fc que são úteis como agentes de diagnóstico e terapêuticos. As proteínas de fusão Fc úteis como agentes de diagnóstico podem ser marcados com uma fração detetável. As proteínas de fusão Fc podem ser utilizadas para uma variedade de aplicações de diagnóstico. A fração detetável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, direta ou indiretamente, um sinal detetável. Por exemplo, a fração detetável pode ser um radioisótopo, como H3, C14, C13, P32, S3 5 ou 1131, um composto fluorescente ou quimioluminescente, como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina; ou uma enzima, como fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou peroxidase de rábano.

Qualquer método conhecido na técnica para conjugar uma proteína à fração detetável pode ser empregue, incluindo os métodos descritos por Hunter, et al. , Nature 144:945 0 1962 (; David, et al. , Biochemistry 13:1014 0 1974(,- Pain, et al. , J. Immunol. Meth. 40:219 0 1981(,- e Nygren, J.

Histochem. and Cytochem. 30:407 El 1982(. Métodos in vitro, incluem química de conjugação bem conhecida na técnica incluindo química compatível com proteínas, como química específica para aminoácidos, como Cys e Lys. De modo a ligar uma fração detetável a uma proteína Fc, é utilizado um grupo de ligação ou um grupo reativo. Ligações químicas adequadas são bem conhecidas na técnica e incluem ligações de dissulfureto, grupos tioéter, grupos ácido-lãbeis, grupos fotolábeis, grupos lãbeis frente a peptidase e grupos lábeis frente a esterase. Grupos de ligação preferidos são grupos dissulfureto e grupos tioéter dependendo da aplicação. Para polipéptidos sem um aminoácido Cys, uma Cys podem ser manipulada numa localização para permitir que a atividade da proteína exista enquanto se cria uma localização para conjugação.

As proteínas de fusão ligadas com uma fração detetável são úteis para a obtenção de imagens in vitro ou in vivo. 0 polipéptido pode ser ligado a um agente radiopaco ou radioisõtopo, administrado a um indivíduo, preferentemente na corrente sanguínea, e a presença e localização da proteína marcada no indivíduo podem ser avaliadas. Esta técnica de obtenção de imagens é útil, por exemplo, no estadiamento e tratamento de neoplasias malignas quando a proteína de fusão Fc se liga a um alvo associado com cancro. A proteína de fusão Fc pode ser marcada com qualquer fração que seja detetável num indivíduo, seja por ressonância magnética nuclear, radiologia ou outros meios de deteção conhecidos na técnica.

As proteínas de fusão Fc também são úteis como agentes de purificação de afinidade. Neste processo, as proteínas de fusão Fc são imobilizadas num suporte adequado, como resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na técnica.

As proteínas de fusão Fc podem ser empregues em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ensaios de ligação competitiva, ensaios de tipo sandwich diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação 13 Zola, Mooclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 0 CE Press, Inc ., 1987((.

Adicionalmente, o pedido descreve métodos para deteção de uma molécula alvo numa amostra. Um método pode compreender colocar a amostra em contacto com uma proteína de fusão Fc descrita no presente documento, em que o dito contacto é levado a cabo sob condições que permitem a formação de complexos de proteína de fusão Fc-alvo; e detetar o dito complexo, detetando, desta forma, o dito alvo na dita amostra. A deteção pode ser levada a cabo utilizando qualquer técnica conhecida na técnica, como, por exemplo, radiografia, ensaio imunológico, deteção de fluorescência, espectroscopia de massa ou ressonância de plasmón superficial. A amostra será normalmente uma amostra biológica, como uma biópsia e particularmente uma biópsia de um tumor, ou uma suspeita de tumor, onde a proteína de fusão Fc se liga a um alvo associado com cancro. A amostra

pode ser a partir de um ser humano ou outro mamífero. A proteína de fusão Fc pode ser marcada com uma fração de marcação, como uma fração radioativa, uma fração fluorescente, uma fração cromogénica, uma fração quimioluminescente ou uma fração de hapteno. A proteína de fusão Fc pode ser imobilizada num suporte sólido.

Num aspeto, a aplicação proporciona proteínas de fusão Fc úteis no tratamento de distúrbios. As doenças e distúrbios que podem ser tratados serão ditados pela identidade da proteína fundida ao domínio Fc. Proteínas terapêuticas exemplificativas que podem ser ligadas ao domínio Fc incluem, por exemplo, interferão alfa 0 pra o tratamento de hepatite(, L-asparaginase 0 para o tr&amento de leucemia linfoblástica aguda(, ou fator de estimulação de colónias de granulócitos 0 para o tratamento de neutropenia induzida por quimioterapia para cancro(. Em determinadas formas de realização, as proteínas de fusão Fc descritas no presente documento compreendem um anticorpo, ou fragmento do mesmo, como, por exemplo, um anticorpo anti-TNF-alfa 0 para o tratamento de doenças autoimnes como artrite reumatoide ou doença de Crohn(. Em cada caso, a proteína de fusão Fc descrita no presente documento compreende um domínio 10Fn3, por exemplo, um domínio 10Fn3 que se liga a um alvo como o fator de necrose tumoral alfa 0 TNF-alfa(, proteína 4 tipo delta 0 DLL4(, interlemna 17 0 IL-17(, proproteína convertase subtilisina kexinade tipo 9 0 PCSK9(, recetor de pregnano X 0 PXR(, recetor déator de crescimento epidérmico 0 EGFR(, recetor de fator de crescimento 1 semelhante a insulina 0 IGF-1R(, receòr do fator de crescimento endotelial vascular 0 VEGFR2( e interleucina 23 0 IL-23 ( . Os domínios 10Fn3 que se ligam a TNF-alfa podem ser utilizados para tratar distúrbios autoimunes como artrite reumatoide, doença inflamatória do intestino, psoríase e asma; os domínios 10Fn3 que se ligam a IL-17 podem ser utilizados para tratar asma; os domínios 10Fn3 que se ligam a DLL4, EGFR, VEGFR2 ou IGF-1R podem ser utilizados para tratar doenças e distúrbios hiperproliferativos associados com a angiogénese indesejada, como cancros ou tumores e os domínios 10Fn3 que se ligam a PCSK9 podem ser utilizados para tratar aterosclerose, hipercolesterolemia e outras doenças relacionadas com colesterol. 0 pedido também descreve métodos para administrar proteínas de fusão Fc a um indivíduo. 0 indivíduo pode ser um ser humano. As proteínas de fusão Fc podem ser farmaceuticamente aceitáveis para um mamífero, em particular um ser humano. Uma composição "farmaceuticamente aceitável” refere-se a uma composição que é administrada a um animal sem consequências médicas adversas significativas. Exemplos de composições farmaceuticamente aceitáveis incluem composições que são essencialmente isentas de endotoxinas e agentes pirogénicos ou que têm níveis muito baixos de endotoxinas ou agentes pirogénicos. Formulação e administração 0 pedido descreve adicionalmente composições farmaceuticamente aceitáveis que compreendem as proteínas de fusão Fc descritas no presente documento. Formulações terapêuticas que compreendem proteínas de fusão Fc são preparadas para armazenamento através de mistura das proteínas descritas, que têm o grau desejado de pureza, com veículos, excipientes ou estabilizantes opcionais farmaceuticamente aceitáveis Kl Remington's Pharmacetiical Sciences 16 a edição, Osol, A. Ed. Kl 1980((, sob a forna de soluções aquosas, formulações liofilizadas ou outras secas. Veículos, excipientes, ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os recetores nas dosagens e concentrações empregues, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes Kl tais como cloeto de octadecildimetilbencilamonio; cloreto de hexametonio; cloreto de benzalconio, cloreto de benzetonio; fenol, butilo ou álcool benzílico; parabenos de alquilo tais como parabeno de metilo ou propilo; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol(; polipéptidos de baixa massa molecular Kl menos do que 10 resíduos (; poteínas tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidine, arginina, ou lisina; monossacandeos, dissacarídeos, e outros hidratos de carbono incluindo glicose, manose ou dextranos; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos Kl por exemplo, complexos de Zn-proteína(; e%ou tensioativos não iónicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol 0 PEG(. A formulação no presente documento também pode conter mais de um composto ativo conforme for necessário para a indicação particular a ser tratada, preferentemente aqueles que têm atividades complementares que não se afetam de forma adversa entre si. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

As proteínas de fusão Fc também podem ser aprisionadas em microcãpsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcãpsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcãpsulas de poliES metilmetacrilato (, respetivamente, em sistemas de distribuição de fármacos coloidais § por exemplo, lipossomas, microsferas de albumina, microemulsões, nanopartícuias e nanocãpsulas( ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em

Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A.

Ed, 0 1980(.

As formulações a serem utilizadas para a administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis.

Podem ser preparadas preparações de libertação sustentada. Exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo as proteínas de estrutura baseada em fibronectina descritas no presente documento, cujas matrizes estão sob a forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcãpsulas. Exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis E por exemplo, poliS 2-hidroxietil-metacrilato(, ou poliS álcool vinílico((, polilãctidos 0 documento dáPatente U.S. N.0 3.773.919(, copolímeros de ácido L-glutâmico e y etil-L-glutamato, copolímeros de etileno-acetato de vinilo não degradáveis, de ácido glicólico-ãcido láctico degradáveis como o LUPRON DEPOT™ 0 microesferas injfeáveis compostas por copolímero de ácido lãctico-ãcido glicólico e acetato de leuprolida(, e ácido poli-D-ÍH -(-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como etileno vinilo acetato e ácido láctico-ácido glicólico possibilitam a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, determinados hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando as proteínas encapsuladas permanecem no corpo durante um período de tempo longo, elas podem desnaturar-se ou agregar-se como um resultado da exposição à humidade a 37 °C, resultando numa perda de atividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser concebidas para a estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se se descobre que o mecanismo de agregação consiste na formação de ligações S-S intermoleculares através do intercâmbio de tio-dissulfureto, a estabilização pode ser alcançada através da modificação dos resíduos de sulfidrilo, liofilização de soluções ácidas, controlo do teor de humidade, utilização de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matriz polimérica específicas.

Enquanto o perito na especialidade entenderá que a dosagem de cada proteína de fusão Fc será dependente da identidade da proteína, as dosagens preferidas podem variar desde cerca de 10 mg%metro quadrado até cerca de 2000 mg%metro quadrado, mais preferentemente desde cerca de 50 mg%metro quadrado até cerca de 1000 mg%metro quadrado.

Para aplicações terapêuticas, as proteínas de fusão Fc são administradas a um indivíduo, numa forma farmacêutica farmaceuticamente aceitável. Elas podem ser administradas por via intravenosa como um bólus ou por infusão contínua durante um período de tempo, intramuscular, subcutânea, intra-articular, intrassinovial, intratecal, oral, tópica, ou por vias de inalação. A proteína também pode ser administrada por vias intratumorais, peritumorais, intralesional ou. perilesional, par’s exercer afeitos terapêuticos locais bem como sistémicos. Veículos, diluentes e excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados são bem conhecidos na técnica e podem ser determinados pelos peritos na especialidade conforme o exija a situação clínica. Exemplos de veículos, diluentes e%ou excipientes adequados incluem: S 1( solução salna tamponada com fosfato de Dulbecco, pH cerca de 7,4, contendo 1 mg%m! a 2 5 mg%ml de albumina sérica humana, 0 2 ( solução salina a 0,9 ® 0 NaCl 0,9 ® p%v( e E 3( dexòse 5 ® 0 p%v(. Os métodos da presente invenção podem ser petos em prática in vitro, in vivo, ou ex vivo, A administração de proteínas de fusão Fc, e um ou mais agentes terapêuticos adicionais, seja em coadministração ou administrados sequencialmente, pode ocorrer como descrito acima para aplicações terapêuticas. Será entendido pelo perito na especialidade que os veículos, diluentes e excipientes farmaceuticamente aceitáveis para coadministração dependerão da identidade do agente terapêutico particular a ser coadministrado.

Quando presente numa forma farmacêutica aquosa, em vez de ser liofilizada, a proteína de fusão Fc será tipicamente formulada a uma concentração de cerca de 0,1 mg%ml até 100 mg%ml, embora seja permitida uma ampla variação fora destes intervalos. Para o tratamento de doença, a dosagem apropriada das proteínas de fusão Fc dependerá do tipo de doença a ser tratada, da gravidade e curso da doença, de se as proteínas de fusão Fc são administradas para propósitos preventivos ou terapêuticos, do curso da terapêutica anterior, do historial clínico do paciente e da resposta à proteína de fusão Fc e do julgamento do médico assistente. A proteína de fusão Fc é adequadamente administrada ao paciente numa vez ou durante uma série de tratamentos.

Lista de sequências Sequência de 10Fn3 WT VSD VPRDL EVVAATPTSLL1SWD APA VTVRYYRlTYGETGGNSPVQEFi VPGSKST AT]SG1JÇPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO: 1)

Sequência de 10Fn3 nuclear WT EWAAT0 XjSLLI0 Xv(YYRITYGE0 X (QEFTV0 ffiTlB X1DYTITVYAV0 Xi ISINYRT 0 SEQ ID NO: 2( EVVAATPTSLLIfXkYYRJTYGETGGNSPVOEFTViXKATjSGLKPGVDYTITVYAViX'iJS INYRT (SEQ ID NO: 3) MGVSDVPRDL 0 SEQ ID NO: 4( VSDVPRDL 0 SEQ ID NO: 5( GVSDVPRDL 0 SEQ ID NO: 6(

XnSDVPRDL 0 SEQ ID NO: 7(

XnDVPRDL 0 SEQ ID NO: 8(

XnVPRDL 0 SEQ ID NO: 9(

XnPRDL 0 SEQ ID NO: 10(

XnRDL 0 SEQ ID NO: 11(

XnDL 0 SEQ ID NO: 12( EIEK 0 SEQ ID NO: 13( EGSGC 0 SEQ ID NO: 14( EIEKPCQ 0 SEQ ID NO: 15( EIEKPSQ 0 SEQ ID NO: 16( EIEKP 0 SEQ ID NO: 17( EIEKPS 0 SEQ ID NO: 18( EIEKPC 0 SEQ ID NO: 19( EIDKPSQ 0 SEQ ID NO: 20( EIDKPSQLE 0 SEQ ID NO: 21(

Região constante de IgGl humana

ASTKGPSVFPLÂPSSKSTSGGTAÁLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS

LSSyVTVPSSSLGTOTYlCNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKJHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP

PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR

VVSVLTVLHQDWLNGKJBYKCKVSN1CALPAPIHKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 22) DKTHTCPPCPAPELLG 0 SEQ ID NO: 23( EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS 0 SEQ ID NO: 24; região de dobradiça nuclear sublinhada( EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS 0 SEQ ID NO: 25; região de dobradiça nuclear sublinhada( EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS 0 SEQ ID NO: 26; região de dobradiça nuclear sublinhada( DKTHTCPPCPAPELLGGPS 0 SEQ ID NO: 27; região de dobrdiça nuclear sublinhada( DKTHTCPPCPAPELLGGSS 0 SEQ ID NO: 28, região de dobrdiça nuclear sublinhada( METDTLLLWVLLLWVPGSTG 0 SEQ ID NO: 29(

Sequência de aminoãcidos de PRD460 G VSD VPRDLE WAÁ TPTSLL1SWVPPSDD YG YYRITYGETGGNSP VQEFTVPIGKGTA TlSGLK PG VD YTITVYA VEFP WPHA G YYHRPiSINYR mF.FKSSOSTHTCPPCPAPELLGGSSVFI.FPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQRSLSLSPGK (SEQ ID NO: 30)

Regiões CH2 e CH3 de IgGl humana VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP1EKT1SKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 31) GSGSGSGSGS H SEQ ID NO: 32( GSGSGSGSGSGS 0 SEQ ID NO: 33( GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS 0 SEQ ID NO: 34( GGGGSGGGGSGGGGS 0 SEQ ID NO: 35( GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 0 SEQ ID NO: 80( GGGGSGGGGSGGGSG 0 SEQ ID NO: 36( AGGGGSG 0 SEQ ID NO: 37( AGGGGSGG 0 SEQ ID NO: 38( GPG 0 SEQ ID NO: 39( GPGPGPG 0 SEQ ID NO: 40( GPGPGPGPGPG 0 SEQ ID NO: 41( PAPAPA 0 SEQ ID NO: 42( PAPAPAPAPAPA 0 SEQ ID NO: 43( PAPAPAPAPAPAPAPAPA 0 SEQ ID NO: 44( QPDEPGGS 0 SEQ ID NO: 45( ELQLEESAAEAQDGELD 0 SEQ ID NO: 46( TVAAPS 0 SEQ ID NO: 47( QPDEPGGSG 0 SEQ ID NO: 48( ELQLEESAAEAQDGELDG 0 SEQ ID NO: 49( TVAAPSG 0 SEQ ID NO: 50( SCSVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN 0 SEQ ID NO: 51( SCCVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN 0 SEQ ID NO: 52( DWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN 0 SEQ ID NO: 53( SCCVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN 0 SEQ ID NO: 54( YLAMTPLIPQSKDENSDDYTTFDDVGS 0 SEQ ID NO: 55( ELDVCVEEAEGEAPW 0 SEQ ID NO: 56( ELQLEESCAEAQDGELDG 0 SEQ ID NO: 57( EGEVSADEEGFEN 0 SEQ ID NO: 58( KPTHVNVSWMAEVDGTCY 0 SEQ ID NO: 59( KPTHVNVSWMAEVDGTCY 0 SEQ ID NO: 60( YVTDHGPMK 0 SEQ ID NO: 61( PTLYNVSLVMSDTAGTCY 0 SEQ ID NO: 62( SXSVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN, em que X é serina, alanina ou glicina 0 SEQ ID NO: 63( SXXVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN, em que cada X é independentemente selecionado a partir de serina, alanina ou glicina 0 SEQ ID NO: 64( SXXVADWQMPPPYWLDLPQETLEEETPGAN, em que cada X é independentemente selecionado a partir de serina, alanina ou glicina 0 SEQ ID NO: 65( ELDVXVEEAEGEAPW, em que X é serina, alanina ou glicina 0 SEQ ID NO: 66( ELQLEESXAEAQDGELDG, em que X é serina, alanina ou glicina 0 SEQ ID NO: 67( KPTHVNVSWMAEVDGTXY, em que X é serina, alanina ou glicina 0 SEQ ID NO: 68( KPTHVNVSWMAEVDGTXY, em que X é serina, alanina ou glicina 0 SEQ ID NO: 69 ( PTLYNVSLVMSDTAGTXY, em que X é serina, alanina ou glicina 0 SEQ ID NO: 70( PSTSTST 0 SEQ ID NO: 71(

Sequência de aminoãcidos de ATI-1174 MG VSDVPRDLE VVAAÍ PTSLL1S WVPPSDD Y GYYRITYGETG GNSPVQ EFTVPIG KGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFPWPHAGYYHRPISINYRTEIEKPCQ (SEQ ID NO: 72)

Sequência de ácidos nucleicos de ATI-1174

ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAG

CCTGCTGATCAGCTGGGTCCCGCCTTCAGATGATTACGGTTATTACCGCATCACTTA cggcgaaacaggaggcaatagccctgtccaggagttcactgtgcctattggtaaag

GAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATG CTGTCGAGTTTCCGTGGCCACATGCTGGTTACTATCATCGGCCAATTTCCATTAATT ACCGCACAGAAATTGAGAAACCATGCCAGTG (SEQ ID NO: 73)

Sequência de aminoãcidos de ATI-1081 MGVSDVPRDLEWAATPTSLL1SVWPPSDDYGYYR1TYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTA TISGLKPGVDYT1TVYAVEFPWPHAGYYHRP1SINYRTEIDKPSQ (SEQ ID NO: 74)

Sequência de ácidos nucleicos de ATI-1081 ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAG CCTGCTGATCAGCTGGGTCCCGCCTTCAGATGATTACGGTTATTACCGCATCACTTA CGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGTAAAG GAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTGTATG CTGTCGAGTTTCCGTGGCCACATGCTGGTTACTATCATCGGCCAATTTCCATTAATT ACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO: 75)

Sequência de aminoácidos de ATI-1114 MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVPPSDDYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTA TISGLKPG VDYTITV YAVEFPWPHAGYYHRPISINYRTG SGC (SEQ ID NO: 76)

Sequência de ácidos nucleicos de ATI-1114 ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAG CCTGCTGATCAGCTGGGTCCCGCCTTCAGATGATTACGGTTATTACCGCATCACTTA CGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGTAAAG G AAC AGCTACCATC AGCGGCCTT AAACCTGGCGTTGATT ATACC ATC ACT GTGT ATG CTGTCGAGTTTCCGTGGCCACATGCTGGTTACTATCATCGGCCAATTTCCATTAATT ACCGCACAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO: 77)

Sequência de aminoácidos de ATI-972 MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWPPPSHGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPGKGTA TISGLKPGVDYT1TVYAVEYPYKHSGYYHRPISINYRTEIDKPCQ (SEQ ID NO: 78)

Sequência de ácidos nucleicos de ATI-972

ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCACCAG

CCTGCTGATCAGCTGGCCGCCGCCGTCTCATGGTTACGGTTATTACCGCATCACTTA cggcgaaacaggaggcaatagccctgtccaggagttcactgtgccgcctggtaaag

GT ACAGCTACC ATC AGCGGCCTT A AACCTGG CGTTG ATT ATACC ATCA CTGTGT ATG ctgtcgaatacccgtacaaacattctggttactaccatcgtccaatttccattaatt ACCGCACAGAAATTGACAAACCATGCCAGCACCATCACCACCACCAC ISEQ ID NO: 79) QPDEP 0 SEQ ID NO: 81( PVPPPPP E SEQ ID NO: 82( EDEDEDEDEDE SS SEQ ID NO: 83( DLPQETLEEETPGA E SEQ ID NO: 84( VPSTPPTPSPST E SEQ ID NO: 85( ELQLEESAAEAQEGELE E SEQ ID NO: 86( ESPKAQASSVPTAQPQAE B SEQ ID NO: 87( PAVPPP E SEQ ID NO: 88( EPKSSDKTHTCPPCP E SEQ ID NO: 89( VPSTPPTPSPSTG E SEQ ID NO: 90( VPSTPPTPSPSTPPTPSPSG E SEQ ID NO: 91( GRGGEEKKKEKEKEEG E SEQ ID NO: 92( GRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPG E SEQ ID NO: 93( ESPKAQASSG E SEQ ID NO: 94( ESPKAQASSVPTAQPQAEG E SEQ ID NO: 95( SVEEKKKEKEKEEQEERETKTPG E SEQ ID NO: 96( PSVEEKKKEKEKEEQEERETKTPG E SEQ ID NO: 97( GSVEEKKKEKEKEEQEERETKTPG E SEQ ID NO: 98(

Fc4

EPRSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSi

EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKLNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY kttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsjlspgk. (SEQ ID NO: 99)

Fc5 EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKLPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KrrPPVLDSDGSFFLYSKETVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGR (SEQ ID NO: 100)

Fc6 EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPK.PKDTLM1SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKLF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSS1 EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 101)

Fc7

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK.PKDTLMJSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVÍCF

NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP

IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT1CNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNY kttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (SEQ ID NO: 102)

Fc8

EPRSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF

NWYVDGVEVHNAKTK.PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP

1EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDÍAVEWESNGQPENNY

KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 103)

Fc9

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVK.FNWYV DGVEVUNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 104)

FclO

EPK.SSDK.THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK.PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF

NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP

IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRJDELTK.NQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKXTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 105)

Fell

EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKJF

NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP lEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 106)

Fcl2

EPK.SSDKTH'I'SPPSPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKJTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 107)

Fcl3 EPKSSDKTHTSPPSPAPEAEGAPSVFLFPPKPK.DTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSJE KT1SKAKGQPREPQ VYT LPPS RDELTKNQV SLTCL VKGF YPSDIA V £ W ESNGQPENN YK. TTPPVLDSDGSFFLGSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 108)

Fcl4 EPKSSDfCTHTSPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAXTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK.VSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK. TTPPVLDSDGSFFLGSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 109)

Fcl5

ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVKPNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKT] SKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDÍAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 110)

Fcl6

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF

NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGJCEYKCRVSNKALPAP

1EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK.SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 111)

Fcl7

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLAPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF

NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSI

EKTÍSKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKJTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGIC (SEQ ID NO: 112)

Fcl8

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF

NWYVDGVEVHNAK.TKLPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP

1EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY

KTTPPVLDSDGSFFLYSKJLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 113)

Fcl 9

EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPRDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF

NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSI

EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD1CSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 314)

Fc21

EPKSSDKTHTSPPSPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN

WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCiCVSNKALPSSIE

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK

TTPPVLDSDGSFALGSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 115)

Fc22 epkssdkthtsppspapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfn

WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFALGSKLTVDICSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 116)

Fc23

EPKSSDKTHTCPPCPAPEAGGGPSVFLFPPKPKDTLMTSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKE N WYV DC VE VHN A KTKPREEQ YNSTY RV VSVLTVLHQD WLN G K.E Y K-CK VSN KALPAS

1EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENMY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK. (SEQ ID NO: 117) mFcl

EPRGPT1KPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKJKDVLMISLSPIVTCVWDVSEDDPDVQIS

WFVNNVEVHTAQTQTHREDY1MSTLRVVSALP1QHQDWMSGKEFKCKVNMKDLPAPJE RTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNY KLNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSWHEGLUNHHTTKSFSRTPGK (SEQ ID NO: 118) mFc3

EPRVP1TQNPCPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIK.DVLMISLSPMVTCWVDVSEDD pdvqiswfvmsjvevhtaqtqthredynstlrvvsalpiqhqdwmsgkefkckvnnra

LPSP1EKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAE1AVDWTSNGRTE QNYKNTATVLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSWHEGLHNHLTTKTiSRSLG K (SEQ ID NO: 119) mFc2

EPRSPTIKPCPPCKCPAPNLEGGPSVF1FPPKIKDVLMISLSPIVTCVWDVSEDDPDVQIS

WFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALP1QHQDWMSGKAFACAVNNKDLPAPIE

RTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNY

KNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSWHEGLHNHHTTKSFSRTPGK (SEQ ID NO: 120) mFc4 EPRSPITQNPCPPLKECPPCAAPDLEGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDD PDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALP1QHQDWMSGKAFACAVNNRA LPSPIEKTISKPRGPVRAPQWVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGELPAEIAVDWTSNGRTE QNYKNTATVLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSVVHEGLHNHLTTKTISRSLG K (SEQ ID NO: 121) PRD289 GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRPPIHAYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIVEGTATIS GLKPGVDYTITVYAVEYTFKHSGYYHRPISINYRTEIEPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS VFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTC V V VD VSH F.DPEVKFNWYV DGVE VHNAKTKPRE EQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT1SKAKGQPREPQVYTLPPSRD E LT KNQ VSLTCL VKGFYPSDIA V EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 122) PRD292 EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSSVFLFPPKPKJDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFF'

WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK ttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgaggg gsggvsdvprdlevvaatptslliswrppihaygyyritygetggnspvqeftvpivegt ATISGLKPGVDYTITVYAVEYTFKHSGYYHRPISINYRTEI (SEQ ID NO: 123) PRD290

GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSPPANGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVGRGTATI sglkpgvdytitvyaveytykgsgyyhrpisinyrteiepkssgsthtcppcpapellggs

SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY

NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCfCVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDlAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSfCLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 124) PRD293

EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKT KPREEQYN STY RVVS VLTV LHQ DWLN GKE YKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK.NQVSLrCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSK.LTVDK.SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGG GSGGVSDVPRDLEWAATPTSLLISWSPPANGYGYYRJTYGETGGNSPVQEFTVPVGRG TATISGLKPGVDYTITVYAVEYTYKGSGYYHRPISINYRTEI (SEQ ID NO: 125) PRD713

GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWGHYPLHVRYYRJTYGETGGNSPVQEFTVPPRSHTATI

SGLKPGVDYT1TVYAVTYYAQENYKEÍP1SINYRTEIEPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSSV

FLFPPKEKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK.FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS

TYRWSVLTVLHQDWLNGKLEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE

LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKJLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 126) PRD239

EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN

WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNYK

TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGG

GSGGVSDVPRDLEWAATPTSLLISWGHYPLHVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPRSH TATISGLKPGVDYTÍTVYAVTYYAQENYKE1 PISINYRTEAS (SEQ ID NO: 127) C7FL-FC 0 PRD1309(

G S VS D VPRDLEW AATPTS LLIS WRHPHFPTR YYRJTY GETGGN S PVQEFT VPLQPPTATI SGLKPGVDYTJTVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSSV FLFPPKPK.DTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO; 128) C7FL-FC 0 PRD1308(

GSVSDVPRDLEWAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPFrATI

SGLKPGVDYT1TVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSV

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS

TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP1EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE

LTK.NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSICLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 129)

EXEMPLOS A invenção tendo agora sido geralmente descrita, será mais prontamente entendida com referência aos seguintes exemplos que são incluídos meramente para finalidades de ilustração de determinados aspetos e formas de realização da presente invenção, e não se destinam a limitar a invenção de qualquer forma.

Exemplo 1: Clones de adnectina anti-PCSK9

Domínios luFn3 que se ligam com afinidade a PCSK9 foram identificados utilizando o método ProFusion. Veja-se, por exemplo, o documento WO02%032925. ATI-1174 é uma Adnectina anti-PCSK9 peguilada que tem a

seguinte sequência de aminoãcidos: MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVPPSDDYGYYRJTYGETGGNSPVQEFTVPIGKGTA TISGLKPGVDYTITVYAVEFPWPHAGYYHRPISINYRTE1EKPCQ (SEQ ID NO: 72). ATI-1174 é codificada pela seguinte sequência de nucleótidos: ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCA CC AGCCTGCTG ATCAGCTGGGT CCCGCCTTC AGATGATT ACGGTT ATT ACCGC ATC A CTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGT AAAGGAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGT GTATGCTGTCGAGTTTCCGTGGCCACATGCTGGTTACTATCATCGGCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGAAATTGAGAAACCATGCCAGTG (SEQ ID NO: 73). ATI-1081 é uma Adnectina anti-PCSK9 que tem a seguinte sequência de aminoãcidos e uma etiqueta 6x His:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWVPPSDDYGYYRJTYGETGGNSPVQEFTVPIG KGTATISGLKPGVDYT1TVYAVEFPWPHAGYYHRPISINYRTEIDKPSQ (SEQ ID NO: 74). ATI-1081 é codificada pela seguinte sequência de nucleótidos:

ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCA

CCAGCCTGCTGATCAGCTGGGTCCCGCCTTCAGATGATTACGGTTATTACCGCATCA

CTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGT

AAAGGAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGT

GTATGCTGTCGAGITTCCGTGGCCACATGCTGGITACTATCATCGGCCAATTTCCAT

TAATrACCGCACAGAAATTGACAAACCATCCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO: 75). ATI-1114 é uma Adnectina anti-PCSK9 peguilada que é um derivado de ATI-1081 que tem uma sequência de cauda C-terminal diferente e uma etiqueta 6x His:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLL1SWVPPSDDYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPTG KGTATISGLKPGVDYTITVYAVEFPWPDAGYYHRPISINYRTGSGC (SEQ ID NO: 76). ATI-1114 é codificada pela seguinte sequência de nucleótidos:

ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCA

CCAGCCTGCTGATCAGCTGGGTCCCGCCTTCAGATGATTACGGTTATTACCGCATCA

CTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTATTGGT

AAAGGAACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGT

GTATGCTGTCGAGTTTCCGTGGCCACATGCTGGTTAGTATCATCGGCCAATTTCCAT TAATTACCGCACAGGTAGCGGTTGCCACCATCACCACCATCAC (SEQ ID NO. 77). ATI- 972 é uma adnectina anti-PCSK9 biotinilada com o terminal C com 6 histidinas e biotinilação na cisteína, e que tem a seguinte sequência: MGV SDVPR DLEVVAATPTSLLf S WPPPSHG Y GYY RITYGETGGNSPVQEFTVPPG K.GTATISGLKPGVDYTITVYAVEYPYKHSGYYHRPISIN YRTEIDKPCQ (SEQ ID NO: 78). ATI-972 é codificada pela seguinte sequência de nucleótidos: ATGGGAGTnCTGATGTGCCGCGCGACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCCCA CCAGCCTGCTGATCAGCTGGCCGCCGCCGTCTCATGGTTACGGTTATTACCGCATCA CTTACGGCGAAACAGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCGCCTGGT AAAGGTACAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGCGTTGATTATACCATCACTGTG TATGCTGTCGAATACCCGTACAAACATTCTGGTTACTACCATCGTCCAATTTCCATT AATTACCGCACAGAAATTGACAAACCATGCCAGCACCATCACCACCACCAC (SEQ ID NO; 79).

PRD460 é uma proteína de fusão Fc-adnectina anti-PCSK9 que tem a seguinte sequência de aminoácidos: GVSDVPRDLEWAATPTSLLISWVPPSDDYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIGKGT ATISGLK PGVDYTITVYA

VEFPWPHAGYYHRPISINYRTEIEPYLSSGSTETCPPCPAPELLGGSSYFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ Q GNVFSCSVMHEALHN- HYTQKSLSLSPGK E SEQ ID NO: 30 ( . O domínio 10Fn3 que se liga a PCSK9 é mostrado em itálico; a sequência de dobradiça está sublinhada; e as regiões CH2 e CH3 mostradas em texto normal são derivadas a partir de IgGl.

As adnectinas anti-PCSK9 podem ser expressas em E. coli com uma metionina M-terminal, ou em células de mamífero com a seguinte sequência líder: METDTLLLWVLLLWVPGSTG E SEQ ID NO: 29(. T? V <SOVf*V 1 Λ O · Ώ ^ 11 Λ S Λ fij 1 "V* "1 f "j â Λ â Λ Λ T* A Í" fit "J YTl S €8 <&amp; · ir xouuçao θ p\xxro.x:ícaçao ue

Expressão e purificação a média escala de ligantes de proteínas de estrutura baseada em fibronectina insolúveis

Para a expressão de clones insolúveis, o um ou mais clones, seguidos pela etiqueta HISs, são clonados num vetor pET9d E EMD Bioscience, San Diego, CA( e são expreses em células HMS174 de E. coli. Vinte ml de uma cultura de inoculo E gerada a partir de uma colónia simples ( sã utilizados para inocular 1 litro de meio LB contendo carbenicilina a 50 pg%ml e cloranfenicol a 34 pg%ml. A cultura é cultivada a 37 °C até Α600 0,6 -1,0. Depois da indução com isopropil-p-tiogalactósido 0 IPTG( a 1 mM, a cultura cresce durante 4 horas a 30 °C e é colhida por centrifugação durante 3 0 minutos a > 10.000 g a 4 °C. Os sedimentos celulares são congelados a -80 °C. 0 sedimento celular é ressuspendido em 25 ml de tampão de lise B NaiP04 a 20 mM, NaCl a 0,5 M, Ix cocktail de inibidor de protease completo isento de EDTA 0 Roche (, PMSF a 1 mM, pH 74 ( utilizando um homogeneizador Ultra-turrax 0 ΙΚΆ work( em gelo. A lise celular foi alcançada por homogeneização a alta pressão S>18.000 psi ( utilizando um MICROFLUIDIZER® Modelo M-110S 0 Microfluidics(. A fração insolúvel é separada por centrifugação durante 30 minutos a 23.300 g a 4 °C. 0 sedimento insolúvel recuperado a partir de centrifugação do lisado é lavado com fosfato de sódio a 20 mM%NaCl a 500 mM, pH 7,4. 0 sedimento é solubilizado novamente em cloridrato de guanidina a 6,0 M em fosfato de sódio a 20 mM%NaCl a 500 M pH 7,4 com sonicação seguida por incubação a 37 graus durante 1-2 horas. 0 sedimento re-solubilizado é filtrado para 0,45 pm e carregado sobre uma coluna Histrap equilibrada com o tampão de fosfato de sódio a 2 0 mM%NaCl a 5 00 M%guanidina a 6,0 M pH 7,4. Depois do carregamento, a coluna é lavada ao longo de 25 CV adicionais com o mesmo tampão. A proteína ligada é eluída com imidazol a 50 mM em fosfato de sódio a 20 mM%NaCl a 500 mM%guan-HCl a 6,0 M, pH 7,4. A proteína purificada é redobrada por diálise contra acetato de sódio a 50 mM%NaCl a 150 mM, pH 4,5.

Expressão e purificação a média escala de ligantes de proteínas de estrutura baseada em fibronectina solúveis

Para a expressão de clones solúveis, o um ou mais clones, seguidos pela etiqueta HISs, foram clonados num vetor pET9d 0 EMD Bioscience, San Diego, CA( e foram expressos em células HMS174 de E. coli. Vinte ml de uma cultura de inoculo 0 gerada a partir de uma colóniasimples( foram utilizados para inocular 1 litro de meio LB contendo carbenicilina a 50 pg%ml e cloranfenicol a 34 pg%ml. A cultura foi cultivada a 37 °C até A600 0,6 -1,0. Depois da indução com isopropil-3~tiogalactósido 0 IPTG( a 1 mM, a cultura cresceu durante 4 horas a 30 °C e foi colhida por centrifugação durante 30 minutos a > 10.000 g a 4 °C. Os sedimentos celulares foram congelados a -80 °C. 0 sedimento celular foi ressuspendido em 25 ml de tampão de lise 0 NaiF04 a 20 mM, NaCl a 0,5 M, Ix cocktail de inibidor de protease completo isento de EDTA 0 Roche (, PMSF a ImM, pH 7,4( utilizando um homogeneizador Ultra-turrax 0 IKAworks( em gelo. A lise celular foi alcançada por homogeneização a alta pressão 0 >18.000 psi ( utilizando um MICROFLUIIBZER® Modelo M-110S 0 Microfluidics(. A fração solúvel foi separada por centrifugação durante 30 minutos a 23.300 g a 4 °C. 0 sobrenadante foi clarificado através de um filtro de 0,45 pm. 0 lisado clarificado foi carregado numa coluna Histrap 0 GE ( pré-equilibrada com fosfato de sódio a 20 mM%NaCl a 500 M, pH 7,4. A coluna foi depois lavada com 25 volumes de coluna do mesmo tampão, seguidos por 20 volumes de coluna de fosfato de sódio a 20 mM%NaCl a 500 M%imidazol a 25 mM, pH 7,4 e depois 35 volumes de coluna de fosfato de sódio a 20 mM%NaCl a 500 M%imidazol a 40 mM, pH 7,4. A proteína foi eluída com 15 volumes de coluna de fosfato de sódio a 20 mM%NaCl a 500 M%imidazol a 500 mM, pH 7,4, as frações foram agrupadas com base na absorvãncia a A28o e foram submetidas a diãlise contra lx PBS, Tris a 50 mM, NaCl a 150 mM, pH 8,5 ou NaOAc a 50 mM; NaCl a 150mM, pH 4,5. Qualquer precipitado foi removido por filtração a 0,22 pm.

As fusões de Fc podem ser feitas em células de mamífero ou em E. coli.

Exemplo 3: KD de PRD460 por SPR

Um vetor que codifica PRD460 foi transfetado em células HEK-293 6E utilizando polietilenimina 0 PEI{ As células foram cultivadas a 37 °C durante 5 dias com 80® de humidade e 5 ® C02. As células foram depois sedimentadas, o sobrenadante foi passado através de um filtro de 0,22 μηι e depois carregado numa coluna de proteína A. A coluna foi lavada com PBS e a proteína foi eluída com glicina a 20 mM, NaCl a 150 mM, pH 2,8. A proteína eluída foi concentrada e passada sobre uma coluna superdex200 em MES a 50 mM, NaCl a 100 mM, pH 5,8.

As características de ligação foram caracterizadas por Ressonância de Plasmõn Superficial 0 SPR(. Anticorpo anti-humano foi imobilizado sobre um chip Biacore, e PRD460 foi capturada sobre a superfície do chip. Concentrações variáveis de hPCSK9 foram colocadas na solução de fluxo utilizando MgCl2 S3 M( para a regeneração do chip entre ciclos. Para comparação, ATI-1081 foi capturada num anticorpo anti-His imobilizado num chip Biacore. Experiências em duplicado para PRD460 foram realizadas em dias diferentes. Determinações cinéticas foram realizadas a 25 °C. A avaliação dos parâmetros cinéticos foi realizada utilizando o algoritmo de ligação 1:1 no software de avaliação Biacore.

Sob estas condições, ATI-1081 ligada a PCSK9 humana com uma constante de dissociação S gC( de 6,7 nM a 25 °C e PRD460 ligada a PCSK9 humana com uma constante de dissociação EI &amp;( de 3,29 ™%- 0,55 nM a 25 °C, indicando uma afinidade de ligação equivalente das versões formatadas de Fc e não Fc de ATI 1081 ESQuadro 1 ( . As determinações de dissociação utilizando este formato de ensaio podem ser artificialmente limitadas pela dissociação do ligando capturado a partir do anticorpo de captura imobilizado, assim, o formato de ensaio que utiliza imobilização direta de PCSK9 é um reflexo mais preciso da constante de dissociação EI gC( para ATI-1081.

Quadra 1

Exemplo 4: Ensaios de FRET de ligação de PCSK9

Dois ensaios baseados em transferência de energia ressonante de fluorescência 0 FRET( foram utilizados para determinar a potência de ligação competitiva de PRD460 e outras adnectinas a hPCSK9. 0 ensaio de FRET de PCSK9:EGFA medem a ligação de PCSK9 a LDLR, utilizando um péptido de domínio de homologia A precursor do fator de crescimento epidérmico E EGFA( e PCSK9 humana recombinante. 0 esaio de FRET de PCSK9:ATI 972 mede o deslocamento competitivo por adnectinas da adnectina biotinilada, ATI-972 de PCSK9.

No ensaio de FRET de PCSK9:EGFA E a PCSK9 a 5 nM (, PRD460 deslocou completa e potentemente EGFA a partir do sítio de ligação de PCSK9 com CE50 = 0,7 nM I Fig, 1 painel esquerdo (. PRD460 foi mais potente neste ensaio do que ATI-1174 0 CE5Q =1,9 nM( ou ATI-1081 H CE50 =3,7 nM( HgF 1(. A maior potência aparente de PRD460 neste ensaio pode ser explicada pela ligação bivalente 13 2:1 ( da adnectinaPRD460 a PCSK9 0 teoricamente( em comparação com a ligação monovalente S 1:1( por ATI-1081 e ATI-1174.

Utilizando o ensaio de FRET de PCSK9: ATI - 972 13 a PSK9 humana a PCSK9 (, PRD460 inibiu com CE5Q = 0,3 nM, em comparação com 0,8 nM para ATI-1114 e 2,8 nm para ATI-1081 0 Fig. 2(. Estas verificações indicam que PRD460 potencialmente deslocou a adnectina biotinilada ATI-972 do seu sítio de ligação em PCSK9. A potência mais elevada de PRD460 em relação a ATI-1081 e ATI-1174 é consistente com a ligação bivalente por PRD460.

Exemplo 5: Inibição do esgotamento de LDLR induzido por PCSK9 em células HepG2 PCSK9 humana promove o esgotamento de LDLR da superfície de células HepG2. A pré-incubação de PCSK9 com adnectinas para PCSK9 inibe a ligação de PCSK9 a LDLR e impede o esgotamento de LDLR a partir da superfície celular. Este ensaio foi utilizado para medir a potência de ATI-1081, ATI-1174 e PRD460 para inibir o esgotamento de LDLR induzido por PCSK9 da superfície celular.

Uma série de diluições de adnectinas para PCSK9 foi pré-incubada com PCSK9 humana a 10 nM durante 1 hora a 37 graus, a mistura pré-incubada foi adicionada a células HepG2, e as células foram incubadas durante 24 horas. Após esta incubação, o nível de LDLR nas células HepG2 foi medido utilizando análise por FACS. A percentagem de inibição do esgotamento de LDLR induzido por PCSK9 foi calculada e representada graficamente 0 Fig. 2(. NeBe ensaio ATI-1081, ATI-1174 e PRD460 inibiram PCSK9 com CE50s comparáveis 0 9 nM, 8 nM, 6 nM respetivamente ( emboa um desvio à esquerda da curva de resposta tenha sido consistentemente observado para PRD460. Estas CE50s representam o limite do ensaio.

Este ensaio também foi utilizado para determinar a importância da orientação de Fc na atividade biológica de proteínas de fusão Fc-10Fn3, Para esta finalidade, a capacidade de 1784F03 0 sem Fc (, 1784FQ3-FC E orienção X-

Fc, em que X é o domínio 10Fn3 ( e Fc-1784F03 H orientação Fc-XÍ para inibir o esgotamento de LDLR induzido por PCSK9 da superfície celular foi avaliada. A capacidade de 1813E02 E3 sem Fc(, FC-1813E02 H orientação X-Fc( e Fc-1813E02 E orientação Fc-X( para inibir o esgotamento de LDLR induzido por PCSK9 da superfície celular também foi avaliada.

Uma série de diluições foi preparada e pré-incubada como acima com PCSK9 humano a 10 nM durante 1 h a 37 graus, depois adicionada a células HepG2 e as células foram incubadas durante 24 horas. Após esta incubação, o nível de LDLR nas células HepG2 foi medido utilizando análise por FACS. A percentagem de inibição do esgotamento de LDLR induzido por PCSK9 foi calculada e representada graficamente 0 Figs. 16-17, e Quadros 17-18(. Nesteensaio, 17S4F03, 1784F03-Fc, 1813E02 e 1813E02-FC inibiram PCSK9 com CI50s comparáveis 0 13 nM, 9 nM, 10 nM e 4 nM, respetivamente(, enquanto FC-1784F03 e Fc-1813E02 tiveram CI5Qs significativamente mais elevadas H 47 nM e 37 nM, respetivamente(. Portanto, estes resultados indicam que a orientação X-Fc pode ser importante para que os domínios 10Fn3 para PCSK9 retenham a sua atividade biológica quando fundidos a uma fração Fc.

Quadro 17 - Resumo da inibição do esgotamento de HepG2 por 1784F03, 1784F03-Fc e FC-1784F03

Quadro 18 - Resumo da inibição do esgotamento de HepG2 por 1813E02, 1813E02

-Fc e FC-1813E02

Exemplo 6: Ensaio de entrada celular de PCSK9 em células HepG2 A ligação de PCSK9 a LDLR na superfície de hepatócitos resulta na co-internalização do complexo LDLR-PCSK9 durante a endocitose de LDLR, conduzindo a uma degradação potenciada de LDLR. Um ensaio baseado em células foi desenvolvido para medir a entrada celular de PCSK9 fluorescente dependente de LDLR. PCSK9 humana foi marcada de forma covalente utilizando o fluorõforo Alexa Fluor- 647Í2 AF647 ( PCSK9-AF647 foi incubado com células Heg2 com ou sem adnectinas para PCSK9 e a fluorescência intracelular foi quantificada por análise de imagem e microscopia fluorescente de conteúdo elevado 12 Cellomics(. A depndência da entrada celular de PCSK9-AF647 na endocitose de LDLR foi estabelecida em experiências preliminares. Células HepG2 foram incubadas com PCSK9-AF647 a 10 11M e vários níveis de adnectinas durante 4 horas a 37 graus. Neste ensaio, foi observada uma potente inibição da fluorescência intracelular de PCSK9-AF647 para PRD460 12 CE50 = 6 M( bem como para ATI-1174 0 CE50 = 10 nM( 0 Fig. 3(, Estas verificações indicam que a adnectina PRD460 e ATI-1174 bloquearam de forma eficaz e equivalente a ligação de PCSK9 a LDLR da superfície celular numa linha celular hepática derivada de humano em cultura, reduzindo, desta forma, a internalização de PCSK9-AF647 durante a endocitose de LDLR. Exemplo 7: Estudo em ratinhos transgénicos in vivo

Estudos in vivo foram realizados no modelo de ratinho transgénico hPCSK9 genómico linha 66 desenvolvido por BMS. Esta linha expressa níveis fisiológicos de hPCSK9 12-1-5 nM(. Prevê-se que a ligação de adnectinas a PCSK9 no plasma resulta numa diminuição na quantidade medida de PCSK9 circulante não ligada 0 livre(. A diminuição em PCSH não ligada é o evento farmacodinâmico inicial que resulta na inibição da interação de PCSK9-LDLR e na diminuição do colesterol LDL. A administração de doses únicas de PRD460 M doses i.p. desde 0,6 a 18 mg%kg( aos ratinhos traagénicos resultou em diminuições rápidas e fortes nos níveis plasmáticos de hPCSK9 não ligada 12 Fig. 4(. As diminições dependentes da dose em PCSK9 não ligada foram observadas com uma DE50 <0,6 mg%kg no ponto de tempo de 3 h. Estas verificações no modelo de ratinho transgénico de PCSK9 humano expressor normal mostram que PRD460 se liga de forma forte e potente a hPCSK9 circulante in vivo.

Exemplo 8: Farmacodinâmica in vivo em macacos cinomolgos

Os efeitos farmacodinâmicos da adnectina PRD460 para PCSK9 foram avaliados em macacos cinomolgos magros normais. PRD460 foi administrada a macacos por via i.v. a 15 mg%kg e amostras plasmáticas foram recolhidas em intervalos de tempo ao longo de 4 semanas para o ensaio de LDL-C e níveis de PCSK9 livre. Uma única dose de PRD460 reduziu rapidamente os níveis plasmáticos de LDL-C nos macacos, atingindo um efeito máximo médio de 42 ® de LDL-C basal 0 redução de 58 ®; n = 3 macacos ( pelo dia 3 depois da administração das doses 0 Fig. 5(. Os níveis de LDLC foram reduzidos em 50 ® ou mais durante uma semana a esta dose, permanecendo significativamente abaixo do valor basal durante 3 semanas e voltando ao valor basal às 4 semanas. 0 colesterol total mostrou um padrão semelhante mas não foi observado qualquer efeito sobre o HDL 0 não mostradó. 0 tratamento com PRD460 provocou uma queda imediata para próximo de zero 0 abaixo do limite inferior de quantificação( na forma plasmática de PCSK9 livre, não ligada 0 Fig. 5(. Os níveis de PCSK9 livre permaneceam próximos dos limites inferiores de deteção durante vários dia voltando, depois, gradualmente para os níveis basais até ao final de 4 semanas, consistente com uma relação de causa%efeito com LDL-C plasmãtico. Os dados indicam que a diminuição de LDL plasmático refletiu a queda nos níveis de PCSK9 livre, consistente com a inibição de PCSK9 regulando a função de LDLR após o tratamento com PRD4 6 0 in vivo. A análise farmacocinética revelou que a semivida plasmática da adnectina PRD460 foi de aproximadamente 70 horas neste estudo em macacos cinomolgos. Estas verificações indicam que uma proteína de fusão adnectina PCSK9-Fc é altamente eficaz e de rápida atuação com efeitos robustos, específicos e de longa duração sobre a diminuição de LDL-C no modelo de macaco cinomolgo.

Exemplo 9. Propriedades farmacocinéticas de proteínas de fusão Fc-10Fn3

As propriedades farmacocinéticas das proteínas de fusão Fc-luFn3 foram avaliadas em ratinhos e macacos cinomolgos. Os resultados destas experiências encontram-se resumidos no Quadro 2.

Quadro 2 - Resumo das propriedades farmacocinéticas de várias fusões 10Fn3-Fc a várias proteínas diferentes em ratinhos e macacos cinomolgos

Desenhos de estudos in vivo em macacos

Para determinar a PK de várias proteínas de fusão Fc-i0Fn3 em macacos, macacos foram administrados com doses desde 0,5-15 mg%kg por via IV ou SC com a proteína de fusão de interesse e amostras de soro ou plasma foram recolhidas em pontos de tempo específicos ao longo de 4 semanas. As amostras foram recolhidas e processadas em K2EDTA ou SST para plasma ou soro, respetivamente, e armazenadas a -80 °C até à análise.

Método de ELISA%ECLA

Na maioria dos casos, foram desenvolvidos ensaios de ELISA ou ECLA para determinar a concentração plasmática de fusões Fc-10Fn3 em plasma de ratinho ou de macaco. No geral, foram utilizados alvo biotinilado, fusão alvo-Fc ou anticorpos anti — idiotrpicos para capturar as fusões Fc — 10Fn3 no plasma ou soro. A deteção foi alcançada através de um anticorpo anti-hu-Fc acoplado a HRP ou sulfo-tag, ou anticorpos que se ligam às regiões constantes do domínio 10Fn3 em combinação com anticorpos policlonais anti-coelho-HRP ou marcados com sulfo-tag. Num caso, ambas a captura e deteção foram alcançadas através de policlonais anti-hu-Fc nos quais o anticorpo de deteção estava acoplado a HRP. A leitura era colorimétrica através de TMB ou eletroquimioluminescente utilizando a plataforma Mesoscale Discovery. As concentrações plasmãticas foram tipicamente calculadas com base num ajuste de 4 ou 5 parâmetros de uma curva padrão de 8 pontos.

Método de LC%MS%MS

Em alguns casos, foram desenvolvidos métodos de LC%MS%MS para determinar a concentração plasmática de fusões Fc-10Fn3 em plasma ou soro de ratinho ou de macaco. A análise utiliza digestão com tripsina das proteínas alvo para gerar um péptido substituto a partir da porção de adnectina das moléculas e um péptido substituto a partir da região Fc. Os péptidos substitutos foram detetados por espectrometria de massa em tandem. A base da quantificação é a relação estequiométrica entre as proteínas adnectinas e os substitutos.

Foram preparadas curvas padrão na mesma matriz que as amostras do estudo. As curvas padrão e amostras de estudo foram submetidas a desnaturação térmica seguida por digestão tríptica antes da precipitação das proteínas, seguida por análise de LC-MS%MS. As concentrações plasmáticas foram tipicamente calculadas com base num ajuste quadrático de uma curva padrão.

Análise farmacocinética

Os parâmetros farmacocinéticos 0 PK( para fusões Fe 10Fn3 foram calculados utilizando Phoenix WinNonlin versão 6.2 ESI Pharsight Corp, Mountain View, California ( anãise não compartimentai ou software comparável. A concentração pico 0 Cmáx( foi registada diretamente a partir de obsersções experimentais. Os valores da área sob a curva 0 AUC (foram calculados utilizando uma combinação de somas lineares e log-trapezoidais. A eliminação plasmática total 0 CLF__obs (, volume de distribuição 0 Vz__F__obs ou Vss(, semividaterminal 0 T-HALF( e tempo de permanência médio 0 MRT ( foram estimados.

Propriedades farmacocínétícas de proteínas de fusão Fc-±0Fn3 em macacos cinomolgos. A semivida El t%2 ( da adnectina PRD460 0 Fc-°Fn3 ( para PCSK9 e da adnectina ATI-1081 0 sem Fc ( para PCSK9 £>i determinada após a administração em macacos cinomolgos. Os resultados mostram que a fração Fc potência a semivida de proteínas 10Fn3 0 Fig. 6 e Quadros 2 e 3(.

Quadro 3 - Propriedades farmacocinéticas de PRD460 frente a ATI-1081

Foi realizada uma experiência para comparar a semivida 0 t*2 ( de proteínas de fusão Fc-10Fn3 que têm como alvo ligandos solúveis. A farmacocinética de PRD460 para PCSK9 e outra proteína de fusão Fc-10Fn3 para um alvo de ligando solúvel diferente 0 Adn-1( foi avaliada após a adminstração IV em macacos cinomolgos. Adn-1 exibiu um t1%2 significativamente mais longo do que PRD460 indicando que o alvo ou componente de 10Fn3 pode influenciar as propriedades farmacocinéticas das proteínas de fusão Fc-lúFn3. Os resultados estão resumidos na Fig. 7 e Quadros 2 e 4 .

Quadro 4 - Propriedades farmacocinéticas de Adn-l e PRD460

Foi realizada outra experiência para comparar a semivida 0 t%2 ( de proteínas de fusão Fc-iCIFn3 que têm como alvo recetores da superfície celular. A farmacocinética de uma proteína de fusão 10Fn3-Fc 0 C7FLFc( anti-VEGFR2 e de duas outras proteínas de fusão Fc-10Fn3 a um alvo de recetor de superfície celular diferente S Adn-2 e Ad-3( foi avaliada após a administração IV em macacos cinomolgos. 0 VD e CL de Adn-2 e Adn-3 foram semelhantes entre si mas superiores aos observados para C7FLFc, sugerindo uma influência do alvo nas propriedades PK das proteínas de fusão Fc-10Fn3. Os resultados estão resumidos na Fig. 8 e Quadros 2 e 5.

Quadro 5 - Propriedades farmacocinéticas de C7FLFc, Adn-2 e

Adn-3

Foi realizada outra experiência para determinar a biodisponibilidade de uma proteína de fusão Fc-10Fn3; Adn- 1, em macacos cinomolgos. Depois da administração intravenosa 0 IV (, o volume de distribuição 0DV de Adn-i foi de 81 ml%kg. A eliminação plasmãtica corporal total de Adn-1 foi baixa 0 0,31 ml%h%kg( e a semivida 0i%t ( foi de 188 h 0 Fig. 9 e Quadro 6(. Adn-1 demonstrou uma biodisponibilidade 0 SC( de 92 ® 0 Fig. 9 e Quadro 6(

Quadro 6 - Parâmetros farmacocinéticos de dose única (média + DP) de Adn-1 em macacos.

Propriedades farmacocinéticas de proteínas de fusão Fc-10Fn3 em ratinhos.

Materiais e Métodos

Desenhos de estudo in vivo em ratinhos

Para determinar as propriedades farmacocinéticas de várias proteínas de fusão Fc-lúFn3 em ratinhos, ratinhos foram administrados com doses por via IV ou SC com a proteína de fusão de interesse e amostras de soro ou plasma foram recolhidas em pontos de tempo específicos ao longo de 2-3 semanas. As amostras foram recolhidas através da veia da cauda ou no seio retro-orbital em CPD ou K2EDTA para plasma ou em SST para soro e foram armazenadas a -80 °C até à análise. Os detalhes de vários desenhos de estudo estão listados no Quadro 7 abaixo.

Quadro 7 - Desenhos de estudo in vivo em ratinhos

Propriedades farmacocinêticas de proteínas de fusão Fc-10Fn3 em ratinhos.

Foi realizada uma série de experiências em ratinhos para avaliar as propriedades PK e semivida H t%2 ( de várias proteínas de fusão Fc- 10FN3. Os resultados encontram-se resumidos nas Figs. 10-14 e Quadros 2,8-10. Os perfis de PK das proteínas de fusão Fc- i0FN3 que têm como alvo ligandos solúveis são mostrados na Figura 10 e as semividas 0 t%2 ( são resumidas no Quadro 2. Os resultados indicam perfis de PK semelhantes para a maioria das proteínas de fusão Fc-1ÚFN3 examinadas. As semividas variaram desde 25-126 horas em ratinhos. Duas proteínas de fusão Fc-l0FN3 exibiram um perfil diferente da maioria do grupo e estes resultados sugerem uma influência do componente 10FN3 sobre a PK.

Os perfis de PK das proteínas de fusão Fc-i0FN3 que têm como alvo recetores da superfície celular são mostrados na Figura 11 e as semividas E £%2 ( são resumidas no Quadro 2. Os resultados indicam perfis de PK semelhantes para a maioria das proteínas de fusão Fc-10FN3 examinadas. As semividas variaram desde 23-73 horas em ratinhos. Duas proteínas de fusão Fc-l0FN3 exibiram um perfil diferente da maioria do grupo e estes resultados sugerem uma influência do componente 10FN3 e%ou alvo sobre a PK.

Foi realizada uma experiência para determinar se a orientação X-Fc ou Fc-X influencia a farmacocinética E PK( da proteína de fusão Fc-10FN3. As propriedades PK de PRD239 e PRD713, duas proteínas de fusão Fc-10Fn3 criadas com o mesmo componente 10FN3 foram avaliadas depois da administração IV em ratinhos nus. Como mostrado na Figura 12 e Quadros 2 e 8, a orientação não afeta as propriedades PK em ratinhos.

Quadro 8 - Propriedades farmacocinéticas de duas adnectinas para IL-23, PRD239 e PRD713

Foi realizada uma experiência para determinar se a estirpe de ratinho influencia a farmacocinética S Pit da proteína de fusão Fc-10FN3, As propriedades PK de PRD460 foram avaliadas depois da administração em ratinhos nus ou ratinhos C57B1%6. Como mostrado na Figura 13 e Quadros 2 e 9, a estirpe de ratinho não afeta as propriedades PK das proteínas de fusão Fc-luFn3.

Quadro 9 - Propriedades farmacocinéticas de PRD460 em rat-inhns CR7BI/fí e nus

Foi realizada uma experiência para determinar se o componente 10Fn3 afeta a farmacocinética S PK( da proteína de fusão Fc-10FN3. As propriedades PK de duas proteínas de fusão Fc-i0FN3 que têm como alvo PCSK9, PRD4 6 0 e PRD4 61, foram avaliadas depois da administração IV em ratinhos nus. Como mostrado na Figura 14 e Quadros 2 e 10, o componente 10Fn3 para PCSK9 pode a afetar as propriedades PK das proteínas de fusão Fc-10FN3,

Quadro 10 - Propriedades farmacocinéticas de PRD460 e PRD461 (ambos ligantes de PCSK9(

Exemplo 10. Afinidade de ligação das fusões Fc-10Fn3 frente a proteínas 10Fn3 não-Fc

As propriedades das proteínas de fusão Fc-10Fn3 e proteínas l0Fn3 não-Fc foram caracterizadas por Ressonância de Plasmón Superficial S SPR(. Anticorpo anti-humano ou anti-histidina foi imobilizado sobre um chip Biacore, e as proteínas 10Fn3 e fusões Fc-10Fn3 foram capturadas na superfície do chip. Concentrações variáveis de alvo foram colocadas na solução de fluxo utilizando MgCl2 0 3 M( para a regeneração do chip entre ciclos. Determinações cinéticas foram realizadas a 2 5 °C. A avaliação dos parâmetros cinéticos foi realizada utilizando o algoritmo de ligação 1:1 no software de avaliação Biacore.

Os resultados são mostrados no Quadro 11 abaixo. Nalguns casos, a orientação de 10Fn3 em relação a Fc não afetou a ligação, enquanto noutros sim. Em geral, estes resultados mostram que a presença de Fc não afeta negativamente a afinidade de ligação.

Quadro 11 - Parâmetros cinéticos para proteínas de fusão Fc-10Fn3 e proteínas 10Fn3 não modificadas contra alvos capturados.

Exemplo 11. Ensaio de proliferação Ba/F3 A capacidade de C7FL-Fc 0 Fc-°Fn3 anti-VEGFR2 { para inibir a proliferação de células Ba%F3 foi comparada com a inibição por CT322 0loFn3 anti-VEGFR2(. Células Ba%F3 que expressam de forma estável uma proteína de fusão VEGFR2 0 compreendendo o domínio extracelular de hVEGFR2 e o domínio intracelular de hEpoR( foram colocadas em placas de 96 poços a 25.000 células%poço em 90 μΐ de meio de crescimento contendo 15 ng%ml de VEGF-A, VEGF-C ou VEGF-D. Diluições seriadas de CT322 ou C7FL-Fc foram preparadas a lOx a concentração final, e 10 μΐ de CT322 ou C7FL-Fc foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas a 37 °C%5 ® de C02 durante 48-72 horas. 20 μΐ de CellTiter 960 Aqueous One Solution Reagent 0 Promega( foi adiciondo a cada poço, e as placas foram adicionalmente incubadas durante 3-4 horas a 37 °C. No final do período de incubação, a absorvância foi lida a 490 nm utilizando um leitor de placas de microtitulação. A Fig. 15 mostra que C7FL-Fc pode inibir a proliferação de Ba%F3 de forma equivalente a CT322. Os resultados estão resumidos no Quadro 12.

Quadro 12 - Resumo do ensaio de proliferação de Ba/F3

Exemplo 12. Avaliação de ligantes para a geração de proteínas de fusão Fc-10Fn3

Foram realizadas experiências para avaliar o desempenho de 8 ligantes diferente para a geração de proteínas de fusão Fc-10Fn3. As proteínas de fusão foram avaliadas com base em quatro critérios: 0 i( concentação de proteína, 0 ii( teor de monõmeros, 0 iii( temperaturade fusão e 0 iv( afinidade de ligação para o alvo. 0 Qadro 13 lista os diferentes ligantes escolhidos para este estudo.

Quatro moléculas de 10Fn3 diferentes, cada específica para um alvo diferente, foram fundidas a cada ligante, na orientação Fc-X. As quatro moléculas de i0Fn3 diferentes são Adn-1, C7FL, Adn-10 e 2013. No total, 32 moléculas de fusão Fc diferentes foram geradas e analisadas.

Ouadro 13

- Licrantes

Análise de proteína expressa em mamíferos de alto desempenho (HMEP)

As construções de expressão que codificam as 32 proteínas de fusão Fc-10Fn3 foram transfetadas em 4 ml de cultura HEK-293-6E utilizando placas de 24 poços profundos e incubadas a 37 °C. Cinco dias depois da transfeção, as células foram lisadas e a proteína foi purificada utilizando HP Multitrap de Proteína A. A preparação de proteína resultante foi avaliada quanto ao rendimento proteico utilizando um ensaio de proteína BCA com SGE 0 Adnectina™ de controlo( como o padrão proteico. A Fig. 18 é um gráfico que resume o rendimento médio por volume de transfeção de cada série de fusão Fc-10Fn3. Os losangos representam a série Adn-1, os quadrados representam a série Fc-C7FL, os triângulos representam a série Adn-10 e as cruzes representam a série Fc-2013. No geral, a série Adn-1 teve o rendimento médio mais elevado por volume de transfeção.

Cromatografia por exclusão de tamanho 0 SEC( foi realizada nas proteínas de fusão Fc-10Fn3 resultantes da HMEP. A SEC foi realizada utilizando uma coluna Superdex 200 5%150 ou Superdex 75 5%150 0 GE Healthcare( numsistema de HPLC Agilent 1100 ou 1200 com deteção UV a A2i4 nm e A28o nm e com deteção de fluorescência S excitação = 280 nm, emissão = 350 nm ( . Foi empregue um tampão de sulfato de sódio a 100 mM, fosfato de sódio a 100 mM, cloreto de sódio a 150 mM, pH 6,8 a uma taxa de fluxo apropriada da coluna de SEC. Padrões de filtração em gel 0 Bio-Rad Labor&amp;ories, Hercules, CA( foram utilizados para calibração da massa molecular. A Fig. 19 é um gráfico que resume a pontuação de monómeros de cada série de fusão Fc-10Fn3. Os marcadores são os mesmos que na Fig. 18. Os resultados mostram que as fusões Fc-10Fn3 com o ligante 8 têm uma elevada percentagem de pontuação de monómeros.

Análise de proteína expressa a média escala A série de ligante Adn-1 foi escolhida para a análise de média escala. As construções de expressão que codificam a série de ligante Adn-1 foram transfetadas em 175 ml de HEK-293-6E. Cinco dias após a transfeção, as células foram lisadas e a proteína foi purificada utilizando purificação de Proteína A num AKTA 100. A preparação de proteína resultante foi avaliada quanto ao rendimento proteico utilizando um ensaio de proteína BCA com SGE 0 Adnefcina™ de controlo( como o padrão proteico. A Fig. 2 0 é um gráfico que resume o rendimento médio para a série ligante de Adn-1. Os resultados mostram que o rendimento é alto para a maioria das fusões Adn-1. A análise de SEC das fusões Adn-1 purificadas a média escala demonstrou que a maioria das fusões Adn-1 têm um elevado teor de monómeros. A Fig. 21 é um gráfico que resume a pontuação de monómeros de cada das fusões Adn-1.

Cromatografia líquida-espectrometria de massa 0 LCMS ( foi realizada nas proteínas de fusão Fc-10Fn3 purificadas a média escala. A Fig. 22 resume os resultados de LC-MS, que confirmam as identidades de sete das fusões Adn-1 testadas. São mostrados gráficos de LC-MS representativos para fusões com ligantes 5 e 7.

As temperaturas de fusão das proteínas de fusão Fc-10Fn3 purificadas a média escala foram medidas por calorimetria de varrimento diferencial 0 DSC(. Uma elução a 1 mg%ml de cada das preparações de proteína de fusão Fc-10Fn3 foi submetida a varrimento num calorímetro N-DSC II 0 Calorimetry Sciences Corp( incrementando a temper&amp;ura desde 5 °C até 95 °C a uma taxa de 1 grau por minuto sob 3 atm de pressão. Os dados foram analisados frente a uma corrida de controlo do tampão apropriado utilizando um melhor ajuste utilizando o Orgin Software 0 OrginLabCorpo(. A Fig. 2 3 mostra as temperaturas de fusão para cada das fusões Adn-1 em comparação com o controlo, que nesta experiência são os domínios CH2 e CH3 de Fc. Em geral, as fusões Adn-1 têm temperaturas de fusão comparáveis com aquela de Adn-1 não modificada 0 sem Fc (, que foi previamente determinada como sendo 57 °C.

As características de ligação de cada das proteínas de fusão Fc-*°Fn3 purificadas a média escala ao alvo foram caracterizadas por Ressonância de Plasmón Superficial 0 SPR(. A Fig. 24 resume as propriedades de ligaçãoda série Adn-1 ao alvo imobilizado. Os resultados mostram que todas as fusões Adn-1 retêm a afinidade de ligação ao alvo. Exemplo 13. Caracterização imunogénica de ligantes utilizados para a geração de proteínas de fusão Fc-10Fn3. A resposta imunitária adaptativa é iniciada pelo processamento e digestão de uma proteína internalizada por uma célula apresentadora de antigénio B APC(, como ma célula dendrítica. A APC anexa a proteína internalizada a péptidos curtos e depois exibe os péptidos nas suas moléculas de MHC de Classe II superficiais. 0 sítio de ligação ao péptido da molécula de MHC de Classe II é longo e estreito, como um pão de cachorro-quente, e mantém o seu péptido num formato estendido, com espaço para nove aminoácidos no seu sítio de ligação primário 0 e gealmente permite a presença de caudas curtas de cada lado do péptido(. Determinados bolsos no sítio de ligação de MHC são dominantes na determinação da ligação peptídica. Estes bolsos correspondem às posições de aminoácidos 1, 4, 6 e 9 a porção ancorada do péptido de 9 mero. Um péptido que tem cadeias laterais favoráveis de cada destas quatro posições irá no geral ligar-se bem a HLA B uma molécula de MH de Classe II(.

Acredita-se que a posição 1 é o "resíduo de ancoragem" mais importante envolvido na ligação entre o péptido e a molécula de HLA. A posição 1 geralmente favorece uma cadeia lateral hidrofóbica - assim, 9 mero que normalmente se ligam a HLA são iniciados com V, I, L, M, F, Y ou W. As outras posições são muito mais variáveis, com diferentes alelos de HLA favorecendo diferentes grupos de aminoácidos em cada lado. A ligação a HLA pode ser prevista in silico, por exemplo, utilizando EpiMatrix. EpiMatrix é um algoritmo informático com direitos de propriedade desenvolvido por EpiVax, que é utilizado para rastreio de sequências proteicas quanto à presença de motivos de ligação a HLA putativos. As sequências de entrada são analisadas em quadros de 9 mero sobrepostos, onde cada quadro se sobrepõe ao último por 8 aminoãcidos. Cada um dos quadros resultantes é depois pontuado quanto à afinidade de ligação prevista em relação a um painel de oito alelos de HLA de Classe II Kl DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*O01, DRB1*0801, DRB1*1101, DRB1*1301 e DRB1*1501(. As pontuações brutas são normalizadas contra as pontuações de uma amostra grande de péptidos gerados aleatoriamente. É relatada a pontuação "Z" resultante. Qualquer péptido de 9 mero com uma pontuação Z de EpiMatrix acima de 1,64 é considerado como um motivo de ligação a HLA putativo. A imunogenicidade dos ligantes utilizados para gerar proteínas de fusão Fc-10Fn3 foi prevista utilizando o método in silico descrito anteriormente, 0 Quadro 14 lista as sequências de aminoãcidos dos ligantes analisados Kl realçados a cinza ( mais as regiões f lanqueantes, este caso, o terminal C de Fc de IgGl e o terminal N do domínio 10Fn3 . 0 Quadro 15 mostra a pontuação de EpiMatrix para cada um dos ligantes analisados. Todas as pontuações são muito baixas 0 números negativos na coluna "PONTUAÇÃO DO ONJUNTO EpiMatrix"(, indicando que se prevê que os ligantes têm uma imunogenicidade muito baixa.

Quadro 14 - Sequências de ligantes analisados quanto â imunooenicidade

Quadres 15 - Resultados de EpiMatrix de liganfees

Exemplo 14. Imunogenicidade da proteína de fusão Fc-10Fn3 em macacos cinomolgos

Foram realizadas experiências para examinar se a fusão a um Fc de cinomolgo poderia diminuir a imunogenicidade de proteínas 10Fn3. Nestas experiências, a resposta de imunogenicidade em macacos cinomolgos induzida por i0Fn3 -Fc B 1571G04-Fc( anti-IL23 foi comparada com a respsta de imunogenicidade por i0Fn3-PEG S 1571G04- PEG ( anti -IL23. Estas duas moléculas partilham a mesma porção 10Fn3.

Três macacos cinomolgos fora injetados por via i.v. com 3 mg%kg de 1571G04-PEG ou 1571G04-FC nos dias 1, 8 e 15. As amostras plasmãticas foram recolhidas nos dias 1, 8, 15 antes de cada injeção bem como 168, 240, 336, 408 e 504 horas depois da 3a dose. 0 plasma foi analisado quanto a anticorpo anti-adnectina num ensaio ELISA típico. Em resumo, 1571G04- PEG ou 1571GQ4-FC foram adsorvidas em placas de microtitulação e anticorpos anti-fármaco em amostras plasmãticas são capturados e detetados com anticorpos de coelho anti-IgG humana conjugados com HRP. Uma resposta positiva é definida como mais do que duas vezes o nível de fundo observado no ponto de tempo da pré-dose 1 para cada animal.

Como mostrado na Figura 27, 1571G04-PEG induziu uma resposta de IgG anti-10Fn3 significativa depois de três injeções i.v. semanais de 3 mg%kg. Em contraste e mostrado na Figura 28, a molécula 1571GQ4-FC induziu muito pouca resposta de IgG anti-10Fn3, de modo que não se observou um aumento nos anticorpos em qualquer ponto temporal analisado.

Estes resultados sugerem que a fusão de proteínas iCIFn3 e um Fc de cinomolgo pode diminuir a imunogenicidade inerente das proteínas luFn3 em macacos cinomolgos, sugerindo que um Fc humano fundido a proteínas 10Fn3 pode diminuir a imunogenicidade de proteínas 10Fn3 em seres humanos.

Exemplo 15. Método de fosforilação de STAT3 em células Kit225

Parham et al. 13 A receptor for the heterodimeric cytokine IL-23 is composed of IL-12Rbetal and a novel cytokine receptor subunit, IL-23R. J Immunol. 1 jun 2002; 16813 11(:5699-708( clonaram IL-23R a partir da linha de células T dependente de IL-2 humana, Kit225. Estas células foram caracterizadas quanto à expressão de ambos IL-12RB1 e 1L-23R por análise FACS e responderam a UL-23 por estimulação de pSTAT3 e a IL-12 por estimulação de pSTAT4. As células Kit.225 foram semeadas em placas de 96 poços e deixadas em repouso na ausência de FBS e IL-2 durante 3 horas a 37 °C. Depois desta incubação, IL-23 recombinante humana a 10 pM 0 ou IL-23 pré-incubada com antagoniSa durante 1 hora( foi aplicada e as células devolvidas à incubadora durante 15 minutos a 37 °C para estimular a fosforilação de STAT3 13 abreviada como p-STAT3 ( . Cad condição foi avaliada em duplicado em placas de 96 poços. A estimulação foi interrompida colocando as células em gelo e adicionando PBS gelado. Finalmente, as células foram sedimentadas e lisadas seguindo protocolos padrão e a produção de pSTAT3 foi detetada por ELISA.

Resultados

A estimulação de IL23R por IL23 em células Kit225 foi avaliada através da medição de pSTAT3. Esta estimulação foi eficazmente inibida pelo clone de adnectina anti-IL23 de base 1571G04 resultando numa CI50 de 86,1 ± 8,1 pM. A inibição de IL23 pela proteína de fusão 1571G04-FC foi comparável à adnectina não formatada, dando uma CI50 de 153 ± 19 pM. A orientação alternativa de Fc-1571G04 resultou numa perda significativa de atividade neste ensaio 13 Cio = 692 ± 159 pM(. Estes resultados são resumidos no Quadro 16.

Quadro 16. Fosforilação de STAT3 em células Kit225

Exemplo 16. Sequências de aminoácidos de proteínas de fusão utilizadas nos Exemplos PRD289:

GVSDVPRDLEVVAATPTSLL1SWRPP1HAYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPIVEGTATIS

GLKLPGVDYTITVYAVEYTFKHSGYYHRPISINYRTEIEPKSSGSTIITCPPCPAPELLGGSS VFLFPPKPKDTLMjSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR£EQYM STYR WS VLT VL HQD WLNGKEYKCKVSN KALPAPI EKTISKAKGQ PREPQ V YTLPPS RD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 122).

PRD289 tem a seguinte dobradiça: EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS

0 SEQ ID NO: 26( e um Fc de IgGl humana. PRD292: EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVFINAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK.EYK.CKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSK.LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHTMHYTQKSLSLSPGAGGG GSGGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRPPIHAYGYYRJTYGETGGNSPVQEFTVPIVEGT ATISGLKPGVDYTITVYAVEYTFK.HSGYYHRPIS1NYRTEI (SEQ ID NO: 123) PRD292 tem a seguinte dobradiça: EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS e o seguinte ligante: AGGGGSG e um Fc de IgGl humana. PRD290:

GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSPPANGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVGRGTATI

SGLK.PGVDYTITVYAVEYTYKGSGYYHRPISINYRTEIEPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGS

SVFLFPPKPKLDTLMISRTPEVICVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY

NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR

DELTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK.SLSLSPG (SEQ ID NO: 124) PRD290 tem a seguinte dobradiça: EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS e uma Fc de IgGl humana. PRD293:

EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN

WYVDGVEVHNAKTKEREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE

KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK

TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGG gsggvsdvprdlevvaatptslliswsppangygyyritygetggnspvqeftvpvgrg TATISGLKPGVDYTITVYAVEYTYKGSGYYHRPTSINYRTEI (SEQ ID NO: 325) PRD293 tem a seguinte dobradiça: EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS e o seguinte ligante: AGGGGSG e um Fc de IgGl humana. PRD713:

GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWGHYPLtíVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPPRSHTATI

SGLKPGVDYTJTVYAVTYYAQENYKEIPISINYRTEIEPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSSV

FLFPPKPK.DTLM1SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK.FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGK-EYKCKVSNKALPAPIEKT1SKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 126)

PRD713 tem a seguinte dobradiça: EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS

e um Fc de IgGl humana. PRD239: EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN

V/YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVS LTCL VKGFYPS Dl AVEW ESN GQPENTNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK.SLSLSPGAGGG GSGGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWGHYPLHVRYYR3TYGETGGNSPVQEFTVPPRSH TATISGLKPGVDYTITVYAVTYYAQENYKEIPISINYRTEAS (SEQ ID NO: 327) PRD239 tem a seguinte dobradiça: EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS e o seguinte ligante AGGGGSG e um Fc de IgGl humana. C7FL-Fc 0 PRD1309(: GSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATl

SGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRELS1PISINYRTE1EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSSV

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKLFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS

TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE

LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKJSLSLSPGK (SEQ ID NO: 128) C7FL-Fc S PRD1309( tem a seguinte dobradiça: EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS e um Fc de IgGl humana. C7FL-Fc H PRD1308(:

GSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRTTYGETGGNSPVQEFTVPLQPFTATI

SGLKPGVDYTITVYAVTDGRMGRLLSIP1SINYRTEIEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSV

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS

TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK.GQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVÍCGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 129) C7FL-Fc 0 PRD1308 ( tem a seguinte dobradiça: EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS e um Fc de IgGl humana. PRD4 61 é uma proteína de fusão que compreende um Fc ligado à adnectina 2013E01 anti-PCSK9, cuja sequência é proporcionada no documento W02011%130354. As sequências de aminoácidos para as adnectinas 1784F03 e 1813E02 anti-PCSK9 são proporcionadas no documento W02011%130354. A sequência de aminoácidos da adnectina 1571G04 anti-IL-23 é proporcionada no documento W02011%103105.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 2009083804 A [0003] • US 2011009323 A [0003] • US 6559126 B [0018] • WO 2010051274 A [0033] • WO 2010051310 A [0033] • WO 2009086116 A [0033] • WO 96027011 A [0045] • US 5731168 A [0045] • US 5821333 A [0045] • WO 2007110205 A [0045] • WO 2009089004 A [0045] • WO 2010129304 A [0045] • WO 9734631 A [0054] • WO 9632478 A [0054] • US 5624821 A [0057] [0063] • US 5648260 A, Winter [0057] • US 6194551 B, Idusogie [0058] [0063] • WO 9429351 A, Bodmer [0059] • WO 0042072 A, Kabat [0061] [0063] • US 6277375 B [0063] [0066] [0068] • US 6737056 B [0063] • US 7317091 B [0063] [0068] • US 8101720 B [0063] • WO 0158957 A [0063] • WO 0206919 A [0063] • WO 04016750 A [0063] • WO 04029207 A [0063] • WO 04035752 A [0063] • WO 04074455 A [0063] • WO 04099249 A [0063] • WO 04063351 A [0063] • WO 05070963 A [0063] • WO 05040217 A [0063] • WO 05092925 A [0063] • WO 06020114 A [0063] • WO 8807054 A [0068] • WO 8807089 A [0068] • WO 99051642 A [0068] • WO 01058957 A [0068] • WO 2003074679 A [0068] • WO 2004029207 A [0068] • WO 2004099249 A [0068] • WO 00034787 A [0101] • WO 0164942 A [0101] • WO 02032925 A [0101] [0161] • WO 2008097497 A [0101] • WO 2008066752 A [0101] • WO 98056915 A [0101] • WO 02081497 A [0101] • WO 2008031098 A [0101] • US 2003186385 A [0101] • WO 0204523 A [0104] • WO 2012016245 A [0117] • WO 2009142773 A [0121] • US 5631144 A [0126] • WO 9411026 A [0133] • US 4767704 A [0137] • US 4657866 A [0137] • US 4927762 A [0137] • US 4560655 A [0137] • US 5122469 A [0137] • US 6048728 A [0137] • US 5672502 A [0137] • US RE30985 E [0137] • US 3773919 A [0154] • WO 2011130354 A [0223] • WO 2011103105 A [0223]

Documentos de não patente citados na descrição • CAPON et al. Nature, 1989, vol. 337, 525-31 [0002] • KENNETH et al. Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists. 1986 [0022] • PETERS et al. Pharmacokinete analysis: A Practical Approach, 1996 [0022] • M GIBALDI ; D PERRON. Pharmacokinetics. Marcel Dekker, 1982 [0022] • GILLIES S D et al. Cancer Res. , 1999, vol. 59, 2159-66 [0050] • Molec. Immunol., 1992 , vol. 29 0 5(, 633-9 [0054] • STROHL. Current Opinion in Biotechnology, 2009, vol. 20, 685-691 [0060] [0062] • Fundamental Immunology. Lippincott-Raven, 1999 [0065] • HINTON et al. J. Biol. Chem. , 2004, vol. 279 0 8(, 6213- 6216 [0067] • HINTON et al. Journal of Immunology, 2006, vol. 176, 346-356 [0067] • SHIELDS et al. Journal of Biological Chemistry, 2001, vol. 276 0 9(, 6591-6604 [0067] • BALL ACQUA et al. Journal of Immunology, 2002, vol. 169, 5171-5180 [0067] • DALL'ACQUA et al. Journal of Biological Chemistry, 2006, vol. 281, 23514-23524 [0067] • YEUNG et al. J Immunol, 2010, vol. 182, 7663-7671 [0067] • LI et al. Nature Biotechnology, 2006, vol. 24 0 2(, 210- 215 [0068] • NECHANSKY et al. Mol Immunjol, 2007, vol. 44 0 7(, 1826-8 [0068] • COX et al. Nat Biotechnol, 2006, vol. 24 El 12(, 1591-7 [0068] • SCALLON et al. Mol Immunol., 2007, vol. 44 S 7(, 1524-34 [0068] • KANEKO et al. Science, 2006, vol. 313, 670-673 [0068] • Nucl. Acids Res., 1982, vol. 10, 4071 [0069] • DUNCAN et al. Nature, 1988, vol. 332, 563 [0070] [0092] • TAO et al. J. Exp. Med., 1993, vol. 178, 661 [0071] • CANFIELD ; MORRISON. J. Exp. Med. , 1991, vol . 173, 1483 [0071] • TAO; MORRISON. J. Immunol., 1989, vol . 143, 2595-2601 [0074] • SCHREIER et al. PNAS, 1981, vol. 78, 4495 [0089] • FUKUI et al. J. Mol. Cell. Immunol. , 1984, vol. 1, 321 [0089] • MORGADO et al. EMBO J., 1989, vol. 8, 3245 [0089] • ZHENG et al. J Immunol., 1999, vol. 163, 4041 [0092] • DUNCAN ; WINTER. Nature, 1988, vol. 332, 738 [0092] • XU et al. Chemistry &amp; Biology, 2002, vol. 9, 933-942 [0099] • DICKINSON et al. J. Mol. Biol., 1994, vol. 236, 1079-1092 [0099] • BATORI et al. Protein Eng., 2002, vol. 15 El 12(, 1015-20 [0104] • KOIDE et al. Biochemistry, 2001, vol. 40 El 34(, 10326-33 [0104] ® DAYHOFF et al. Atlas of Protein Sequence and Structure. 1978, vol. 5, 345-352 [0105] • MAYFIELD et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 21 January 2003, vol. 100 El 2(, 438-442 [0122] • SINCLAIR et al. Protein Expr. Purif. , October 2002, vol. 26 El I (, 96-105 [0122] • CONNELL, N.D. Curr. Opin. Biotechnol., October 2001, vol. 12 El 5(, 446-449 [0122] • MAKRIDES et al. Microbiol Rev., September 1996, vol. 60 03(, 512-538[0122] • SHARP. Yeast, October 1991, vol. 7 0 7(, 657-678 [0122] • SAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, vol. 1-3 [0123] • AUSUBEL, F. Current Protocols in Molecular Biology. Green Publishing and Wiley-Interscience, 1987 [0123] • YANIV. Nature, 1982, vol. 297, 17-18 [0132] ® Cloning Vectors: A Laboratory Manual. Elsevier, 1985 [0134] • LUCKOW et al. Bio/Technology, 1988, vol. 6, 4 7 [013 6] • HAM et al. Meth. Enzymol., 1979, vol. 58, 44 [0137] • BARITES et al. Anal. Biochem., 1980, vol. 102, 255 [0137] ® Solid Phase Peptide Synthesis. The Pierce Chemical Co, 1984 [0139] • HUNTER et al. Nature, 1962, vol. 144, 945 [0143] • DAVID et al. Biochemistry, 1974, vol. 13, 1014 [0143] • PAIN et al. J. Immunol. Meth., 1981, vol. 40, 219 [0143] • NYGREN. J. Histochem. and Cytochem. , 1982, vol. 30, 407 [0143] • ZOLA. Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Inc, 1987, 147-158 [0146] • Remington's Pharmaceutical Sciences. 1980 [0150] [0152] • J Immunol., 01 June 2002, vol. 168 0 11(, 5699-708 [0220]

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um polipéptido que compreende um domínio Fc de imunoglobulina e um domínio 10Fn3, em que o domínio i0Fn3 está fundido ao terminal C do domínio Fc por um ligante polipeptídico que compreende uma sequência de aminoãcidos que é pelo menos 90 ® idêntica à SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO:86. 2. 0 polipéptido de acordo com a reivindicação 1, em que o domínio iCIFn3 tem uma sequência de aminoãcidos alterada em relação à sequência de tipo selvagem estabelecida na SEQ ID NO: 1, em que o domínio 10Fn3 alterado se liga a uma molécula alvo com uma KD inferior a 500 nM, 3. 0 polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o ligante polipeptídico compreende a SEQ ID NO: 86. 4. 0 polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o ligante polipeptídico compreende a SEQ ID NO: 84. 5. 0 polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o polipéptido tem o seguinte arranjo desde o terminal N até ao terminal C: dobradiça-domínio Fc-ligant.e-domínio i0Fn3 . 6. 0 polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o polipéptido compreende um segundo domínio *°Fn3 . 7. 0 polipéptido de acordo com a reivindicação 6, em que os domínios 10Fn3 se ligam a alvos diferentes. 8. 0 polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o domínio Fc de Ig é derivado a partir de uma IgG, IgM, igD, IgE ou IgA.
2. 9. O polipéptido de acordo com a reivindicação 8, em que o domínio Fc de Ig é derivado a partir de IgG. 10. 0 polipéptido de acordo com a reivindicação 9, em que o domínio Fc de Ig é derivado a partir de IgGl.
3. 11. Um ácido nucleico que codifica um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
4. 12. Um vetor que compreende o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11. 13. 0 vetor de acordo com a reivindicação 12, em que o vetor é um vetor de expressão.
5. 14. Uma célula hospedeira que compreende o vetor de acordo com a reivindicação 13.