JP2021507717A - 抗原結合性ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年12月18日に出願された米国特許仮出願第62/599,902号の優先権を主張する。この出願の内容は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
本発明は、CD4結合性ポリペプチドおよび抗HIV広域中和抗体(抗HIV bnAb)を含む抗原結合性ポリペプチドに関する。より詳しくは、本発明は、CD4と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドドメインポリペプチド(CD4 Adnectin(商標))および抗HIV bnAbポリペプチド部分またはその組合せを含むポリペプチドに関する。gp41のN17ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドドメインポリペプチド(N17 Adnectin(商標))および/またはgp41と結合するHIV融合ペプチド阻害剤部分などのさらなるポリペプチド部分も存在し得る。本発明はまた、HIVを治療および/または予防するための治療的および予防的適用における、広域中和抗体を有する革新的ポリペプチドの使用に関する。
本出願は、2018年12月18日にPatent−In 3.5を使用して作成された574kBの大きさのPR66475_WO_Sequence_Listing_Txtと題された電子配列表において列挙された配列を含有し、その内容および配列は参照により本明細書に組み込まれる。
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および組成物が、本発明の実施または試験において使用されてもよいが、好ましい方法および組成物は、本明細書に記載される。
CDRまたは最小結合ユニットは、少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失または付加によって改変されてもよく、バリアント抗原結合性タンパク質は、未改変タンパク質、例えば、10e8/10E8v4 bnAbまたは表8に列挙された任意の未改変bnAbの生物学的特徴を実質的に保持する。
用語「エピトープ」とは、本明細書で使用される場合、抗原結合性タンパク質の特定の結合ドメインと接触させる抗原のその部分を指す。エピトープは、直鎖であっても、コンホメーション/不連続であってもよい。コンホメーションまたは不連続エピトープは、その他の配列、すなわち、抗原の一次配列では連続配列中にないものによって分けられているアミノ酸残基を含む。残基は、ペプチド鎖の異なる領域に由来する場合もあるが、それらは、抗原の三次元構造では極接近している。多量体抗原の場合には、コンホメーションまたは不連続エピトープは、異なるペプチド鎖に由来する残基を含み得る。エピトープ内に含まれる特定の残基は、コンピュータモデリングプログラムによって、またはX線結晶学などの当技術分野で公知の方法によって得られた三次元構造によって、決定され得る。
抗原結合性タンパク質(例えば、抗HIV bnAbである、またはそれを含有する)と参照抗体との間の競合は、競合ELISA、FMATまたはBIAcoreによって決定され得る。この競合について、いくつかの可能性ある理由がある:2種のタンパク質は、同一または重複するエピトープと結合する場合がある、結合の立体阻害がある場合がある、または第1のタンパク質の結合が、抗原のコンホメーション変化を誘導し、それが、第2のタンパク質の結合を妨げるまたは低減する場合がある。
CDR L1、L2、L3、H1およびH2は、有限数の主鎖コンホメーションのうち1つを構造的に示す傾向がある。CDRの特定の基準構造クラスは、CDRおよびフレームワーク領域両方中の重要な位置に局在する残基(構造的に決定する残基またはSDR)によって決定される、CDRの長さおよびループパッキングの両方によって定義される。MartinおよびThornton(1996年;J Mol Biol 263巻:800〜815頁)は、「重要残基」基準鋳型を規定するための自動法を作出した。クラスター解析は、CDRのセットの基準クラスを定義するために使用され、次いで、埋め込まれた疎水性物質、水素結合残基ならびに保存されたグリシンおよびプロリンを解析することによって基準鋳型が同定される。抗体配列のCDRは、配列を重要な残基鋳型に対して比較することおよび同一性または類似性マトリックスを使用して各鋳型をスコア付けすることによって基準クラスに割り当てられ得る。
抗原結合断片は、抗体または非抗体タンパク質スキャフォールド上での1つまたは複数のCDRの配置によって提供され得る。「タンパク質スキャフォールド」は、本明細書で使用される場合、それだけには限らないが、免疫グロブリン(Ig)スキャフォールド、例えば、4鎖もしくは2鎖の抗体であり得る、または抗体のFc領域のみを含み得る、または定常領域がヒトもしくは霊長類起源のものであり得る、またはヒトおよび霊長類定常領域の人工キメラであり得る、抗体由来の1つもしくは複数の定常領域を含み得るIgGスキャフォールドを含む。タンパク質スキャフォールドは、Igスキャフォールド、例えば、IgGまたはIgAスキャフォールドであり得る。IgGスキャフォールドは、抗体のいくつかまたはすべてのドメイン(すなわち、CH1、CH2、CH3、VH、VL)を含み得る。抗原結合性タンパク質は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgG4PEから選択されるIgGスキャフォールドを含み得る。例えば、スキャフォールドは、IgG1であり得る。スキャフォールドは、抗体のFc領域からなり得る、または含み得る、またはその一部である。
VHもしくはVL(またはHCもしくはLC)配列は、最大10のアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有するバリアント配列であり得る、またはCDもしくはFGループ配列は、最大5のアミノ酸置換を有するバリアント配列であり得る。例えば、VHもしくはVLバリアント配列は、最大9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1つのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有し得る、またはCDもしくはFGループバリアント配列は、最大5、4、3、2もしくは1つのアミノ酸置換、付加もしくは欠失を有し得る。
IgG抗体の長い半減期は、FcRnとのその結合に左右されると報告されている。したがって、定常領域を操作することによる、標的との相互作用のpH依存を維持しながら、pH6.0(エンドソームにおけるpH)でのIgGのFcRnとの結合親和性を増大する置換は、大規模に研究されてきた(Ghetieら、Nature Biotech.15巻:637〜640頁、1997年;Hintonら、JBC 279巻:6213〜6216頁、2004年;Dall’Acquaら、10 J Immunol 117巻:1129〜1138頁、2006年)。本発明の抗原結合性タンパク質のin vivo半減期は、中の重鎖定常ドメインまたはFcRn(Fc受容体新生児)結合ドメインの改変によって変更され得る。
本発明の抗原結合性タンパク質は、FcRnの定常ドメインまたはその断片の親和性を増大するアミノ酸改変を有し得る。治療用および診断用IgG抗体ならびにその他の生物活性分子の半減期(すなわち、血清半減期)を増大することは、これらの分子の投薬の量および/または頻度を低減することを含む多数の利益を有する。一実施形態では、本発明の抗原結合性タンパク質は、以下のアミノ酸改変のうち1つまたは複数を有するIgG定常ドメインのすべてまたは一部(FcRn結合部分)を含む。
本出願人らは、CD4結合性ポリペプチド(CD4 Adnectin(商標)などの抗CD4ポリペプチド)を、抗HIV広域中和抗体(抗HIV bnAb)に連結することによって、HIVエンベロープ融合の破壊における得られた抗CD4−抗HIV bnAb融合ポリペプチドの効果が、抗HIV bnAb単独、CD4結合性ポリペプチドの効果と、またはCD4結合性ポリペプチドおよび抗HIV bnAbの混合物と比較して著しく増強されることを見い出した。本出願人らは、驚くべきことに、HIV融合に対して抗CD4−抗HIV bnAb融合ポリペプチドが有する効果が、相乗的であると思われるということを見い出した。図2は、抗CD4 Adnectin(商標)単独を用いる、または抗HIV bnAb単独(10E8v4抗体)を用いる、または抗CD4 Adnectin(商標)および抗HIV bnAbの混合物もしくは抗CD4−抗HIV bnAbを含む2つの融合ポリペプチド1および2を用いる、それらのHIV−1感染細胞の処置後の、宿主細胞の、HIV−1複製のIC50(HIV複製が50%阻害される濃度)に基づく種々の成分の抗ウイルス効力を示す。図2においてわかるように、抗CD4 Adnectin(商標)−抗HIV bnAb融合ポリペプチドについて得られたIC50値は、単一成分または混合物(CD4 Adnectin(商標)、抗HIV bnAbまたはCD4 Adnectin(商標)および抗HIV bnAbの混合物)について得られたIC50値よりもかなり低い。見てわかるように、抗CD4 Adnectin(商標)−抗HIV bnAb融合ポリペプチドのウイルス複製に対する効果(したがって、その抗ウイルス効力)は、HIV複製に対する個々の抗CD4 Adnectin(商標)および抗HIV bnAb成分の効果の単なる付加よりも大きく、HIV 複製に対する抗CD4 Adnectin(商標)および抗HIV bnAbの混合物の効果よりも大きい。
本出願の一態様は、溶媒接近可能ループのうち1つまたは複数の一部またはすべてが、ランダム化または突然変異されている、フィブロネクチンIII型(Fn3)ドメインを含む抗CD4および抗gp41 Adnectin(商標)を提供する。一部の実施形態では、非ループベータ鎖のうち1つまたは複数中の1個または複数の残基もランダム化または突然変異されている。一部の実施形態では、Fn3ドメインは、ヒトフィブロネクチンの10番目の3型モジュール(10Fn3)に由来するFn3ドメインである:
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(配列番号1)(BC、CD、DEおよびFGループには下線が引かれている)
ある特定の実施形態では、本発明のAdnectin(商標)分子は、N末端延長配列および/またはC末端延長を含むように改変され得る。例えば、MG配列は、配列番号1によって定義される10Fn3のN末端に配置され得る。Mは、普通、切断除去され、N末端にGが残る。本明細書に記載されるAdnectin(商標)はまた、本明細書において末端切断型C末端またはC末端延長配列と呼ばれる代替C末端テール配列を含み得る。さらに、末端切断型版は、末端切断型形態で治療用分子として使用されてもよく、またはHis6タグなどの代替C末端延長が末端切断型版に付加されてもよい。ある特定の実施形態では、C末端延長配列(「テール」とも呼ばれる)は、EおよびD残基を含み、8〜50、10〜30、10〜20、5〜10および2〜4アミノ酸長であり得る。ある特定の実施形態では、C末端延長の第1の残基は、プロリンである。ある特定の他の実施形態では、C末端延長の第1の残基は、グルタミン酸である。
本発明の抗CD4 Adnectin(商標)ドメインは、以下の配列を含む:
抗CD4 Adnectin(商標)(配列番号3)
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVHSYHIQYWPLGSYQRYQVFSVPGSKSTATISGLKPGVEYQIRVYAETGRGESDQSLGWIQIGYRTE
抗CD4 Adnectin(商標)(配列番号4)
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVHSYHIQYWPLGSYQRYQVFSVPGSKSTATISGLKPGVEYQIRVYAETGRGESDQSLGWIQIGYRTP
抗CD4 Adnectin(商標)(配列番号5)
GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVHSYHIQYWPLGSYQRYQVFSVPGSKSTATISGLKPGVEYQIRVYAETGGADSDQSFGWIQIGYRTP
本発明の抗CD4 Adnectin(商標)ループ領域CDおよびFGのアミノ酸配列は、それだけには限らないが、以下の表3に列挙される配列組合せを含む。表3に記載されるCDループは、配列番号1によって定義される10Fn3のR30からT49を置き換える。表3に記載されるFGループは、配列番号1によって定義される10Fn3のD67からN91を置き換える。
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、抗HIV bnAbに連結された表5に記載されるような抗gp41 Adnectin(商標)(N17 Adnectin(商標))配列またはその断片を含む。
gp41のアミノ酸配列、およびHIV−1の異なる株間のその変動は周知である。膜融合ドメイン(しばしば、融合ペプチドまたはFPと呼ばれる)は、標的細胞膜への挿入および破壊に関与すると考えられる。膜貫通アンカー配列を含有する膜貫通ドメインは、タンパク質のC末端に向かって配置される。膜融合ドメインと膜貫通アンカーとの間は、ヘプタッドリピート(HR)領域として知られる2つの別個の領域であり、各領域は複数のヘプタッドを有する。HR1領域を含むアミノ酸配列およびHR2領域を含むアミノ酸配列は、それぞれ、HIV−1エンベロープタンパク質中の比較的保存された領域である。gp41(クレードBコンセンサス)の外部ドメインの代表的な配列は以下の通りである:
512 AVGIGAMFL GFLGAAGSTM GAASVTLTVQ ARQLLSGIVQ QQNNLLRAIE
561 AQQHLLQLTV WGIKQLQARV LAVERYLKDQ QLLGIWGCSG KLICTTAVPW
611 NASWSNKSLD EIWNNMTWME WEREIDNYTG LIYTLIEESQ NQQEKNEQEL
661 LELDKWASLW NWFDITNWLW YIK(配列番号2)
本発明のHIV融合ペプチド阻害剤は、それだけには限らないが、以下の表6中の配列を含む。
本発明のポリペプチドの種々の成分は、共有結合または非共有結合によって連結されてもよい。一部の実施形態では、PK部分は、直接的に、またはポリペプチドリンカーを介して間接的に、本発明のポリペプチドに連結されてもよい。適切なリンカーは、別々のドメインが互いに独立して折り畳まれ、標的分子への高親和性結合を可能にする三次元構造を形成することを可能にするものである。
一態様では、本出願は、抗CD4部分および抗HIV bnAbを含むポリペプチド、ならびにその組合せを提供し、ポリペプチドは、未改変ポリペプチドと比べて、改善された薬物動態を提供するために改変される。改善された薬物動態は、認知される治療的必要性に従って、評価されてもよい。多くの場合、場合によりタンパク質が投与後の血清中で利用可能なままである時間を増加させることによって、生物学的利用率を増加させること、および/または投与間の時間を増加させることが望ましい。一部の例では、経時的にタンパク質の血清濃度の連続性を改善すること(例えば、投与直後および次の投与直前のタンパク質の血清濃度の差を減少させること)が望ましい。
一部の実施形態では、本発明の抗HIV bnAbポリペプチド部は、改変された機能的Fcドメイン、またはその断片もしくはバリアントを有する。本明細書で使用される場合、「機能的Fc領域」は、FcRnに結合する能力を保持するFcドメインまたはその断片である。一部の実施形態では、機能的Fc領域はFcRnに結合するが、エフェクター機能は持たない。FcRnに結合するFc領域またはその断片の能力は、当技術分野で公知の標準的な結合アッセイによって決定され得る。他の実施形態では、改変Fc領域またはその断片はFcRnに結合し、天然Fc領域の少なくとも1つの「エフェクター機能」を改善する。例示的な「エフェクター機能」として、C1q結合、補体依存性細胞傷害(CDC)、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介性傷害(ADCC)、食作用、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体、BCR)の下方制御などが挙げられる。
一態様では、本発明は、CD4、またはgp41のn17ドメインに結合するフィブロネクチンIII型ドメインを含むAdnectin(商標)を提供する。特異的結合特性を有するFn3ドメインを迅速に作製および試験する1つの方法は、核酸−タンパク質融合技術である。本開示は、核酸−タンパク質融合物(RNA−およびDNA−タンパク質融合物)を利用して、タンパク質への結合のために重要である新規ポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを特定する、「PROfusion」と称されるin vitro発現およびタグ化技術を用いる。核酸−タンパク質融合技術は、タンパク質をそのコード遺伝情報に共有結合によってカップリングする技術である。RNA−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質ライブラリースクリーニング方法の詳細な説明については、これらのすべてが、参照により本明細書に組み込まれる、Szostakら、米国特許第6,258,558号、米国特許第6,261,804号、米国特許第6,214,553号、米国特許第6,281,344号、米国特許第6,207,446号、米国特許第6,518,018号および米国特許第6,818,418号;Robertsら、Proc.Natl.Acad.Sci.、94号:12297〜12302頁(1997年);ならびにKurzら、Molecules、5巻:1259〜1264頁(2000年)を参照のこと。
表4に記載される抗CD4 Adnectin(商標)配列は、抗HIV広域中和抗体(抗HIV bnAb)またはその断片に連結されていてもよい。このような抗HIV bnAbとして、それだけには限らないが、表8に記載される抗HIV bnAbが挙げられる。
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本明細書に開示される種々のタンパク質またはポリペプチド(例えば、抗原結合性ポリペプチドまたは融合ポリペプチド)のいずれかをコードする核酸は、化学的に合成されてもよい。コドン使用頻度は、細胞における発現を改善するように選択され得る。このようなコドン使用頻度は、選択される細胞型に依存する。特定化されたコドン使用頻度パターンは、大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞のために開発されている。例えば、Mayfieldら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、100巻(2号):438〜442頁(2003年1月21日);Sinclairら、Protein Expr.Purif.、26巻(I):96〜105頁(2002年10月);Connell,N.D.、Curr.Opin.Biotechnol.、12巻(5号):446〜449頁(2001年10月);Makridesら、Microbiol.Rev.、60巻(3号):512〜538頁(1996年9月);およびSharpら、Yeast、7巻(7号):657〜678(1991年10月)を参照のこと。
Adnectin(商標)などの融合タンパク質(例えば、抗原結合性ポリペプチド)の成分を産生する細胞株の作出および単離は、本明細書において記載されるもの、およびその全内容が参照により本明細書に組み込まれる、WO20160414のような、当技術分野で公知の標準技術を使用して、達成され得る。
本発明のタンパク質の標的分子(例えば、CD4またはgp41)への結合は、平衡定数(例えば、解離、Kd)に関して、および速度定数(例えば、結合速度定数、kon、および解離速度定数、koff)に関して、評価されてもよい。本発明のタンパク質は、一般に、500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pMまたは100pM未満のKdで標的分子に結合するが、より高いKd値が許容され得、その場合、koffが十分に低いか、またはkonが十分に高い。
CD4またはgp41に結合するポリペプチド(Adnectin(商標)など)は、各種のin vitroアッセイを使用して特定され得る。好ましくは、アッセイは、複数の候補を同時にスクリーニングすることを可能にするハイスループットアッセイである。
HIV感染、特に、HIV−1感染に対する本発明のbnAb融合ポリペプチド(または個々の阻害剤もしくはそれらの組合せ)の効力の調査を可能にする当技術分野において認識されている種々のin vitro系が存在する。これらは、培養細胞または末梢血単球培養物中の実験室由来ウイルスまたは臨床分離株の各種の株の完全な複製を可能にする系を含む。加えて、感染の初期の細胞内移行段階を再現する系は、生存可能なウイルスを使用することなく、本発明のポリペプチド、個々の阻害剤またはそれらの組合せの有効性を解析するために使用され得る。これらとして、それだけには限らないが、感染性ビリオンの産生を不可能にさせる欠失を含有する「シュードタイプ」ウイルス、または標的細胞に対するHIV特異的融合反応を監視するために使用され得るHIV gp160遺伝子のみを発現する細胞が挙げられる。
当業者は、複製を可能にし、一部の場合では、HIV感染の症状を再現することを可能にする、当該技術分野において認識されている各種の動物モデルを知っている。これらのモデルは、本発明のポリペプチド、個々の阻害剤または本発明のそれらの組合せの有効性を試験するために使用され得る。
一態様では、本発明は、HIV感染の治療または予防のために有用な本発明の融合ポリペプチド(例えば、抗原結合性ポリペプチド)を提供する。したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、有効量の本発明のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象におけるHIV融合を減弱または阻害するための方法を提供する。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、哺乳動物、特にヒトに対して、薬学的に許容される。「薬学的に許容される」ポリペプチドとは、重大な有害な医学的結果なしで、動物に投与されるポリペプチドを指す。
本発明は、本明細書に記載される本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質を含む医薬組成物をさらに提供し、組成物は、エンドトキシンを本質的に含まないか、または少なくとも、適切な規制当局(例えば、FDA)によって決定される許容レベル以下のエンドトキシンを含有する。
本発明のポリペプチドまたは本発明のその融合タンパク質を含む医薬組成物は、非経口、肺、経皮、筋肉内、経鼻、頬側、舌下、または坐剤投与を含む標準的な投与技術を使用して、HIVを有する対象に投与され得る。好ましくは、本発明のポリペプチドの投与は、非経口である。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、経膣または腹腔内投与を含む。静脈内、または腹腔内、または皮下注射による末梢全身送達が好ましい。
本発明のポリペプチドは、所定量の試薬と本発明の治療方法または診断方法における使用説明書との包装された組合せのキットで提供され得る。
HIVポリペプチドFc構築物;哺乳動物細胞培養
DNAは、適した哺乳動物細胞にトランスフェクトされる。
細胞は、細胞培養において増殖される。
遠心分離および/または濾過によって回収される。
アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製する。
タンジェント流濾過を使用して、製剤化および濃縮する。
ポリペプチドの効力アッセイ
MT−2細胞、HEK 293T細胞およびNL4−3のプロウイルスDNAクローンは、NIH AIDS Research and Reference Reagent Programから入手された。MT−2細胞は、10%の熱不活性化されたウシ胎仔血清(FBS)、10mMのHEPES緩衝液pH7.55、および2mMのL−グルタミンで補充されたRPMI1640培地中で増殖された。HEK 293T細胞は、10%の熱不活性化されたFBS、10mMのHEPES緩衝液pH7.55、および2mMのL−グルタミンで補充されたDMEM培地中で増殖された。NL4−3のプロウイルスクローン由来のnef遺伝子の一部分がRenillaルシフェラーゼ遺伝子で置き換えられた組換えNL−Rlucウイルスは、Bristol−Myers Squibbで構築された。複製可能なウイルスは、改変されたpNLRlucプロウイルスクローンによるHEK293T細胞のトランスフェクションから3日後に回収された。トランスフェクションは、製造者の指示に従って、Lipofectamine Plus(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して、行われた。ウイルスは、バイオマーカーとしてルシフェラーゼ酵素活性を使用して、MT−2細胞において力価測定された。NL−Rlucウイルスは、MT−2細胞を1時間、0.01の多重度で感染させるために使用された後、96ウェルプレート中のペプチドに添加された。ペプチドは、4倍に連続希釈され、11個の濃度が、三連で播種された。インキュベーションから4〜5日後、細胞は、処理され、発現したルシフェラーゼの量によってウイルス増殖について定量化された。ルシフェラーゼは、Promega(Madison、WI)のDual Luciferaseキットを使用して、製造業者のプロトコールに修正を加えて、定量化された。希釈されたPassive溶解溶液は、再懸濁されたルシフェラーゼアッセイ試薬と予め混合され、次いで、STOP & GLO(登録商標)基質に再懸濁された(2:1:1の比)。合計50μLの混合物は、アッセイプレート上のそれぞれの吸引されたウェルに添加され、ルシフェラーゼ活性は、Wallac TriLux(Perkin−Elmer、Waltham、MA)で直ちに測定された。50%有効濃度(EC50)は、ペプチドが添加されていないウェルと比較して、阻害ペプチドの存在中で産生されたルシフェラーゼの量を比較することによって、産出された。5個のパラメータのシグモイド方程式が、得られたシグナル対濃度曲線をフィットさせるために使用され、50%の最大阻害を生じるそれぞれの阻害剤の濃度(EC50)が決定された。3つの独立した実験の結果は、平均化およびプロットされ、エラーバーは1標準偏差に相当する。
10E8v4 bnAbおよび10E8v4 bnAb−CD4 Adnectin(商標)融合体を産生させるための方法(図2):
10E8v4抗体をコードする重鎖および軽鎖遺伝子、ならびに重鎖−CD4 AまたはB Adnectin(商標)融合体は、pTT5発現ベクターにクローニングされた。得られたプラスミドは、293HEK細胞に共トランスフェクトされた。条件付けされた細胞培地は、回収され、抗体のために一般に使用される標準的な手順によって、プロテインAがコンジュゲートされた樹脂による精製に付された。
本発明の特定の実施形態は、CD4 A Adnectin(商標)を有し、任意選択でHIV融合ペプチド阻害剤を有する、10E8v4抗HIV bnAbの重鎖または軽鎖のいずれかを含む融合ポリペプチドを提供する。本発明の特定の実施形態は、CD4 A Adnectin(商標)を有し、任意選択でHIV融合ペプチド阻害剤を有する、VRC01抗HIV bnAbを含む融合ポリペプチドを提供する。本発明の他の特定の実施形態は、N17 Adnectin(商標)を有し、任意選択でHIV融合ペプチド阻害剤を有する、10E8v4抗HIV bnAbの重鎖または軽鎖のいずれかを含む融合ポリペプチドを提供する。bnAb部分とAdnectin(商標)部分および任意選択のHIV融合ペプチド阻害剤との間のリンカーは、必要に応じて変わってもよい。このようなAdnectin(商標)−抗HIV bnAb融合ポリペプチドの特定の例は、配列番号749から配列番号767に示される。
抗HIV bnAb 10E8v4由来のHC配列、およびCD4 Adnectin(商標)と、ドメイン2結合(A)またはドメイン4結合(B)CD4 Adnectin(商標)のいずれかと、異なるリンカーを含む特定の抗原結合性ポリペプチドは、配列番号755および配列番号756(CD4 A)、または配列番号757および配列番号758(CD4 B);ならびに配列番号759および配列番号760(CD4 A)、または配列番号761および配列番号762(CD4 B)として、以下に示される。以下の種々の融合ポリペプチドについて、CD4 Adnectin(商標)配列は下線で示され、リンカーはイタリックであり、bnAb 10E8v4またはVRC01重鎖/軽鎖配列は太字であり、存在する場合、N17 Adnectin(商標)は、二重下線付きであり、存在する場合、HIV融合ペプチド阻害剤は点線下線の太字で示す。
本発明の他の実施形態は、以下に配列番号763および配列番号764(10E8 bnAbとN17 Adnectin(商標))として示される、抗HIV bnAbと、CD4 Adnectin(商標)の代わりにN17 Adnectin(商標)とを含むbnAb−Adnectin(商標)融合体を提供する。抗HIV bnAb 10E8v4からのHC配列、gp41のN17ドメイン(N17 Adnectin(商標))と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチド、およびHIV融合ペプチド阻害剤を含む、1つの特定の抗原結合性ポリペプチドは、以下に配列番号763として示され、抗HIV bnAb 10E8v4からのLC配列、gp41のN17ドメイン(N17 Adnectin(商標))と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチド、およびHIV融合ペプチド阻害剤を含む、別の特定の抗原結合性ポリペプチドは、以下に配列番号764として示される。配列番号763および764について、抗HIV bnAb部分は太字であり、N17 Adnectin(商標)部分は二重下線付きであり、HIV融合体部分は点線下線付きであり、リンカー部分はイタリック体である。
抗HIV bnAbおよび抗HIV bnAb−CD4 Adnectin(商標)融合体を産生させるための一般的方法(図4A〜D):
異なるエピトープまたは作用機構を有することが公知の抗HIV bnAbのパネルが選択された。次いで、N17 Adnectin(商標)ポリペプチドおよび/またはCD4 Adnectin(商標)ポリペプチドとの融合は、実施例3に記載されているようにして行われた。それぞれのbnAb−Adnectin(商標)ポリペプチドの効力は、親のbnAb単独、またはbnAbのAdnectin(商標)ポリペプチドとの非融合組合せと比較されて、どの抗HIV bnAbエピトープ(複数可)および/または作用機構(複数可)が、相乗効果を示すのか、および最良の効力を有するのかを特定し、スクリーニングされたbnAbのすべてのパネルから、bnAbのクラスの最良の代表的なbnAbが特定された。
HIVに対する抗ウイルス活性におけるAdnectin(商標)/抗HIV bnAb融合ポリペプチドの活性
阻害活性および結合親和性は、上記のIX項において、および本明細書に記載されるようなCD4/N17/抗HIV bnAb融合ポリペプチドを使用する実施例において記載されるようにして測定された。
123個のHIV臨床エンベロープを用いる細胞−細胞融合アッセイ
123個の臨床エンベロープに対するCD4 A/10E8v4融合ポリペプチドまたはCD4 B/10E8v4融合ポリペプチドの活性の幅が行われた。
ポリペプチド薬物動態の評価
ヒトCD4トランスジェニックマウスモデル
雄および雌のホモ接合性ヒトCD4マウスは、GenOway、リヨン、フランスから入手される。
8〜21日の単回IVボーラス用量研究は、種々の本発明のポリペプチドのPK特性を評価するために雌C57Bl/6 WTマウスにおいて行われる。本発明のAdnectin(商標)−bnAb融合ポリペプチドは、5mg/kgから最大で10mg/kgで投薬され得る。血漿試料は、リン酸クエン酸塩デキストロースチューブ(CPD)中に回収され、解析するまで−80℃で保存され得る。
7〜10日の単回IVボーラス用量研究は、標的の存在下で種々の本発明のポリペプチドのPK特性を評価するために、ヘテロ接合性hCD4マウスにおいて行われ得る。本発明のポリペプチドの用量および試料の回収方法は、WTマウスについて上に記載されたものと同じである。
1週間の単回用量研究は、本発明のポリペプチドのPKを決定するために雌カニクイザル(cyno)において実施される。1mg/kgの投薬後、血清試料は、指示された時間で回収され、等分され、MSDまたはLC/MS解析のために急速凍結される。
薬物レベルは、Mesoscale技術プラットフォームまたは比色分析ELISAフォーマットを使用して、マウスまたはカニクイザルの血漿中で測定され得る。Fc−ポリペプチド融合体は、本発明のポリペプチドのペプチド成分に特異的に結合するタンパク質PRD828(BMS)を介して捕捉され得、ヤギ抗ヒトIgG Fc−HRPコンジュゲート化pAb(Pierce#31413)を使用して、検出される。HSA−ポリペプチド融合体は、PRD828を介して捕捉され得、ルテニウム標識されたHSAに対するヤギpAb(Bethyl、TX#A80−229A)を使用して検出され得る。試料濃度は、5パラメータの対数フィットを使用して、標準曲線から算出され得る。非コンパートメント解析は、血漿モデルおよびリニアアップ/ログダウン算出法を使用するPhoenix WINNONLIN(登録商標)6.3(Pharsight Corporation、Mountain View、CA)を使用して行われ得る。
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Claims (46)
- 第1および第2のポリペプチドドメインを含む抗原結合性ポリペプチドであって、
第1のポリペプチドドメインが、(i)CD4結合性ポリペプチド、または(ii)gp41のN17ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、
第2のポリペプチドドメインが、抗HIV広域中和抗体(bnAb)ポリペプチドまたはその断片である、抗原結合性ポリペプチド。 - 第1、第2および第3のポリペプチドドメインを含む抗原結合性ポリペプチドであって、
第1のポリペプチドドメインは、CD4と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、
第2のポリペプチドドメインは、gp41のN17ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、
第3のポリペプチドドメインは、抗HIV bnAbまたはその断片である、抗原結合性ポリペプチド。 - CD4と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよびgp41のN17ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドがそれぞれ、リンカーによって抗HIV bnAbまたはその断片に接続されている、請求項2に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- CD4と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよびgp41のN17ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドがそれぞれ、抗HIV bnAbのHC領域またはLC領域に接続されている、請求項3に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 抗HIV bnAbのHC領域が、配列番号7、配列番号8、配列番号777、配列番号778または配列番号779の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一である配列を含む、請求項3に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- CD4と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよびgp41のN17ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドがそれぞれ、抗HIV bnAbのLC領域に接続されている、請求項4に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- CD4と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよびgp41のN17ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、抗HIV bnAbのHC領域に接続されている、請求項4に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- CD4と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、抗HIV bnAbのLCに接続されており、gp41のN17ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、抗HIV bnAbのHCに接続されている、請求項3に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- CD4と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、抗HIV bnAbのHCに接続されており、gp41のN17ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、抗HIV bnAbのLCに接続されている、請求項3に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 抗HIV bnAbのLC領域が、配列番号6、配列番号780または配列番号781の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一である配列を含み、抗HIV bnAbのHC領域が、配列番号7、配列番号8、配列番号777、配列番号778または配列番号779の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一である配列を含む、請求項8または9に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 抗HIV bnAbのLC領域が、配列番号6の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一である配列を含む、請求項3に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 抗HIV bnAbのLC領域が、配列番号790のLC領域の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一である配列を含む、請求項10に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 抗HIV bnAbのLC領域が、配列番号781のLC領域の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一である配列を含む、請求項10に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 抗HIV bnAbのHC領域が、配列番号7の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一である配列を含む、請求項10に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 抗HIV bnAbのHC領域が、配列番号8の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一である配列を含む、請求項10に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 抗HIV bnAbのHC領域が、配列番号777のHC領域の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一である配列を含む、請求項10に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 抗HIV bnAbのHC領域が、配列番号778のHC領域の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一である配列を含む、請求項10に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 抗HIV bnAbのHC領域が、配列番号779のHC領域の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一である配列を含む、請求項10に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- HIV融合ペプチド阻害剤をさらに含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- HIV融合ペプチド阻害剤が、gp41のN17ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドに接続されている、請求項19に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 第1のポリペプチドドメインが、CD4と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、第2のポリペプチドドメインが、抗HIV広域中和抗体(bnAb)ポリペプチドまたはその断片である、請求項1に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 第1および第2のポリペプチドドメインを含む抗原結合性ポリペプチドであって、
第1のポリペプチドドメインが、CD4と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドであり、
第2のポリペプチドドメインが、(i)抗HIV bnAbもしくはその断片、(ii)1、2もしくは3つのアミノ酸改変を有する(i)のCDRバリアント、(iii)配列番号6、配列番号780もしくは配列番号781の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%もしくは100%同一である配列を含むLC領域、および/または(iv)配列番号7、配列番号8、配列番号777、配列番号778もしくは配列番号779の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%もしくは100%同一である配列を含むHC領域である、抗原結合性ポリペプチド。 - 第1のポリペプチドドメインが、配列番号13〜71のうちいずれか1つに対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるFGループ配列またはCDループ配列を含み、第2のポリペプチドドメインが、表8に記載される抗HIV bnAbまたはその断片を含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- CD4と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、配列番号72〜91のうちいずれか1つのアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項2〜23のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 抗HIV bnAbポリペプチドが、Apex(V1/V2)bnAb、N332グリカンbnAb、CD4結合部位(CD4bs)bnAb、gp120−gp41インターフェイスbnAbおよびMPER bnAbまたはそれらの断片から選択される抗HIV bnAbのクラスから選択される、請求項1〜24のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- CD4と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号78に対して100%同一である配列を含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- CD4と結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドおよび請求項21に記載の抗HIV bnAbを含む抗原結合性ポリペプチドであって、gp41のN17 dドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドをさらに含む、抗原結合性ポリペプチド。
- gp41のN17ドメインと結合するフィブロネクチンベースのスキャフォールドポリペプチドが、配列番号92〜348のうちいずれか1つのアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一である配列を含む、請求項27に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 第1および第2および/または第3のポリペプチドドメインが、リンカーによって、任意の順序で互いに接続されている、請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 抗HIV bnAbまたはその断片が、N6 bnAb、VRC01抗HIV bnAbおよび10E8v4抗HIV bnAbから選択される、請求項25〜29のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- ポリペプチド配列が、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号749、配列番号750、配列番号751、配列番号752、配列番号753、配列番号754、配列番号755、配列番号756、配列番号757、配列番号758、配列番号759、配列番号760、配列番号761、配列番号762、配列番号763、配列番号764、配列番号765、配列番号766、または配列番号767のうちいずれか1つを含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号768、配列番号769、配列番号770、配列番号771、または配列番号772に対して100%同一である抗HIV bnAb配列を含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- CD4結合性ポリペプチドが、カニクイザルCD4と交差反応しない、請求項1〜32のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- HIV CD4の二次または三次構造内のコンホメーションエピトープと結合する、請求項1〜33のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 療法において使用するための、請求項1〜34のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
- 療法がHIV感染のためである、請求項35に記載の療法において使用するための抗原結合性ポリペプチド。
- 請求項1〜36のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドおよび担体を含む医薬組成物。
- HIV感染の治療において使用するための、請求項1〜36のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドまたは請求項37に記載の医薬組成物。
- HIV感染のための医薬の調製のための、請求項1〜36のいずれか一項に記載の抗原結合性タンパク質の使用。
- 請求項1〜39のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドまたはその医薬組成物の有効量を投与することを含む、対象においてHIVを治療する方法。
- 請求項1〜36のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸配列。
- bnAbポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12のbnAbポリペプチド領域をコードする核酸配列を含む、請求項41に記載の核酸配列。
- CD4結合性ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号749、配列番号750、配列番号751、配列番号752、配列番号753、配列番号754、配列番号755、配列番号756、配列番号757、配列番号758、配列番号759、配列番号760、配列番号761、配列番号762、配列番号763、配列番号764、配列番号765、配列番号766、または配列番号767のCD4結合性ポリペプチド領域をコードする核酸配列を含む、請求項41に記載の核酸配列。
- 請求項41、42または請求項43に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
- 請求項41、42または43に記載の核酸配列または請求項44に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
- 請求項1〜36のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドの産生のための方法であって、請求項45に記載の宿主細胞を、核酸配列またはベクターの発現に適した条件下で培養することを含み、それによって、CD4結合性ポリペプチドおよび抗HIV bnAbポリペプチドを含む抗原結合性ポリペプチドが産生される、方法。
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