KR20180132766A - 신규한 ｔｓｌｐ 저해인자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 흉선 간질 림포포이에틴 (TSLP) 활성의 저해인자로서 흉선 간질 림포포이에틴 수용체 (TSLPR) 의 세포외 부분 및 인터루킨-7 수용체 알파 (IL-7R알파) 의 세포외 부분을 포함하는 단량체성 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이에 제한되지 않으나, 염증성 질환, 암 및 섬유증의 치료에서의 약제로서의 상기 저해인자의 용도에 관한 것이다.

Description

신규한 ＴＳＬＰ 저해인자

본 발명은 흉선 간질 림포포이에틴 (Thymic Stromal Lymphopoietin) (TSLP) 활성의 저해인자로서 흉선 간질 림포포이에틴 수용체 (Thymic Stromal Lymphopoietin Receptor) (TSLPR) 의 세포외 부분 및 인터루킨-7 수용체 알파 (Interleukin-7 Receptor alpha) (IL-7R알파) 의 세포외 부분을 포함하는 단량체성 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이에 제한되지 않으나, 염증성 질환, 암 및 섬유증의 치료에서의 약제로서의 상기 저해인자의 용도에 관한 것이다.

흉선 간질 림포포이에틴 (TSLP) 은 폐 및 소화관에서 장벽 표면의 상피 세포에 의해, 및 피부에서 표피 각질형성세포에 의해 생산되는 인터루킨-2 (IL-2) 패밀리 사이토카인이다. 그것은 미성숙한 수지상 세포 (Dendritic Cell) (DC), 비만 세포, 호염기구, 호산구 및 림프구의, 유형 2 분극화 표현형 (type 2 polarizing phenotype) 으로의 활성화를 추진함으로써 면역력을 조절한다 (Bell et al., 2013; Ziegler, 2010, 2012; Ziegler and Artis, 2010; Ziegler et al., 2013). TSLP 에 의해 매개되는 세포 신호전달은 세포 표면에서 그것의 동일계통 수용체, TSLPR (CRLF2 에 의해 인코딩됨) (Pandey et al., 2000; Park et al., 2000), 및 IL-7R알파 (T-세포 발달 및 항상성을 조절하는 IL-7 에 대한 동일계통 수용체로서의 역할을 또한 하는 수용체) (Mackall et al., 2011) 와의 헤테로머성 (heteromeric) 수용체 복합체를 통해 개시된다. 실제로, TSLPR 및 IL-7R알파와의 복합체에서 마우스 TLSP 의 결정 구조는 어떻게 TSLP 가 그것의 두 가지 수용체와 광범위한 경계면을 확립하여 세포내 신호전달을 할 태세를 취하는 막-근위 수용체-수용체 접촉을 유발하는지를 드러냈다. 게다가, TSLPR 에 대한 TSLP 의 결합은 높은-친화도 삼원 복합체로의 IL-7R알파의 동원을 위한 기계론적 전제조건이다 (Verstraete et al., 2014).

TSLP 에 의한 이상 신호전달은 인간 건강에 심각한 결과를 갖고, 거대한 건강관리 및 사회경제적 발자국을 남긴다. 이는 활성화된 수지상 세포 (DC) 에 의해 초회감작되는 유형 2 헬퍼 T 세포 (type 2 helper T cell) (Th2)-매개되는 염증성 응답이, 기도, 피부 및 소화관의 광범위한 알레르기성 질환의 개시에 중추적이기 때문이다. 실제로, TSLP 은 현재 대부분의 우세한 염증성 알레르기성 장애, 예컨대 아토피성 질환 (천식, 아토피성 피부염 및 아토피성 비염), 만성 폐쇄성 폐 질환 (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) (COPD), 및 호산구성 식도염의 삼징후 (triad) 에 대한 마스터 조절인자인 것으로 널리 여겨지고 (Noti et al., 2013; Redhu and Gounni, 2012; Siracusa et al., 2013; Ziegler, 2012; Ziegler et al., 2013), 천식 (Hunninghake et al., 2010; Liu et al., 2012; Torgerson et al., 2011) 및 호산구성 식도염 (Rothenberg et al., 2010) 의 발달에 대한 유전적 위험 인자로서 주석이 달아졌다. 게다가, 이들 질환 중 일부 사이에 분명한 병리생리학적 관련성이 존재한다. 예를 들어, 아토피성 피부염을 갖는 환자의 70% 는 "아토피 행진" 으로 호칭되어 온 것을 통해 천식을 발달시키기 시작하며 (Spergel, 2010), 한편 활성 천식을 갖는 성인은 비-천식 개체와 비교할 때 COPD 에 매우 취약하다 (Guerra, 2009). 여러 최근의 발달은 TSLP 의 병리생리학적 다면발현에 새로운 차원을 더했다. 첫째로, TSLP 매개되는 신호전달은 아토피성 피부염과 연관되는 가려움을 유발하는 피부 상피와 신경 세포 사이의 분자 연락으로서 식별되었다 (Wilson et al., 2013). 둘째로, TSLP 은 DC 에 의한 IL-23 생산에 대한 그것의 효과 덕분에, 대규모 자가면역 질환인, 건선의 발달에 기여하는 새로운 분자 인자로서 식별되었다 (Volpe et al., 2014). 셋째로, TSLP 은 유방- 및 췌장 암에서 종양 진행의 면에서 원인적 효과를 갖는 것으로 보고되었고 (De Monte et al., 2011; Pedroza-Gonzalez et al., 2011), TSLPR 유전자 (CRLF2) 에서의 유전자 재배열 및 돌연변이가 소아 급성 림프모구 백혈병에서 보고되었다 (Perez-Andreu et al., 2013). 넷째로, TSLP 은 유형 2 면역 응답에 의해 특징지어지는 비-알레르기성 질환의 발병기전에서 및 기관 섬유증의 촉진에서 연루됨이 보여졌다 (Ying et al., 2015).

위에 기재된 병리생리학적 프로파일 및 전 세계적으로 증가하는 알레르기성 질환의 유병률을 고려할 때, TSLP 이, 특히 아토피성 질환의 치료를 위한, 치료 표적으로서 부각된 것은 놀랍지 않다 (Borowski et al., 2013; Romeo et al., 2013, 2014; Zhang et al., 2011). 이와 관련하여, 영장류 동물 모델을 이용한 최근의 연구는 TSLPR 의 봉쇄가 알레르기성 염증을 감소시킨다는 것을 보여줬다 (Cheng et al., 2013). 최근에, 인간에서 치료 표적으로서의 TSLP 의 타당성은 천식 환자가 항-TSLP 모노클로날 항체로 처리된 임상 시험에서 추가로 입증되었다 (Gauvreau et al., 2014). 그럼에도 불구하고, TSLP/TSLPR/IL-7R알파 복합체를 표적으로 하는 현재 입수가능한 제제의 시험관내 (in vitro) 효능의 증거에도 불구하고, 생체내 (in vivo) 효과는 약한 것 같다. 또한 최근에 기재된 짧은 형태의 인간 TSLP 와의 가능한 교차반응성으로 인해, TSLP 에 대항하는 모노클로날 항체의 유효성에 관해 불확실성이 발생할 수 있다 (Bjerkan et al., 2015; Fornasa et al., 2015). 게다가, EP2703414 (Amgen Inc) 는 이합체성이고 매우 큰 융합 단백질인 가용성 huIL-7Ra-huTSLPR-Fc 단백질 융합체로 이루어지는 대안적 TSLP 차단제를 공개한다. EP2703414 에서 치료적 모노클로날 항체 및 융합 단백질의 고유의 결점은 불량한 조직 침투, Fc-매개되는 면역자극 효과, 투여 및 투여량 지시에서의 제한 및 생산의 비용이며, 이들은 대안적 전략의 탐구를 필요하게 만든다. 따라서, 그리고 이용가능한 효과적 치료가 존재하지 않으므로, 위에서 언급된 제한을 갖지 않고 TSLP 관련 질환의 효과적 치료에 사용될 수 있는 TSLP 신호전달의 강력한 저해인자에 대한 충족되지 않은 필요가 존재한다.

놀랍게도 본원에서 TSLPR 의 세포외 부분 및 IL-7R알파의 세포외 부분을 포함하는 단량체성 융합 단백질 (본원에서 "TSLP-트랩" 으로서 언급됨) 이 강한 TSLP 중화 활성을 가질 수 있다는 것이 보여졌다. 이는 예상 밖이며, 이는 세포외 TSLPR 단독, 세포외 IL-7R알파 단독, 둘의 혼합물 모두가 TSLP 매개되는 신호전달 사건에 대해 강한 저해 활성을 보이지 않기 때문이다.

본 발명의 하나의 태양은 TSLPR 의 세포외 부분 및 IL-7R알파의 세포외 부분을 포함하는 단량체성 융합 단백질을 제공한다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 위에 기재된 바와 같은 단량체성 융합 단백질로서, 상기 TSLPR 의 세포외 부분 및 상기 IL-7R알파의 세포외 부분이 링커에 의해 연결되어 있으며, 상기 링커가 적어도 10 개의 아미노산을 포함하고/포함하거나, 상기 링커가 5 내지 20 개의 GGS 단위 (이는 15 내지 60 개의 아미노산과 부합한다) 로 이루어지는 GGS 링커인, 단량체성 융합 단백질을 구상한다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 위에 기재된 바와 같은 단량체성 융합 단백질로서, SEQ ID N°1 의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 SEQ ID N°2 의 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단량체성 융합 단백질을 구상한다. 또한 구상되는 것은 위에 기재된 바와 같은 융합 단백질로서, SEQ ID N°1 의 아미노산 서열 및 SEQ ID N°2 의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질이다.

본 발명의 하나의 태양은 적어도 위에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명의 하나의 태양은 위에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또한 구상되는 것은 상기 융합 단백질의 생산에서 사용하기 위한 상기 숙주 세포이다.

또한 구상되는 것은, 약제로서 사용하기 위한, 염증성 질환 (여기에서 상기 염증성 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 호산구성 식도염, 류마티스성 관절염 및 건선으로 이루어지는 군으로부터 선택된다) 의 치료에서 사용하기 위한, 및 암 및 섬유증의 치료에서 사용하기 위한, 위에 기재된 바와 같은 단량체성 융합 단백질이다.

본 발명의 하나의 태양은 약학적으로 허용가능한 담체와의 연합으로 위에 기재된 바와 같은 단량체성 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 목적은 뒤따르는 설명으로부터 분명할 것이다.

도 1 은 단량체성 TSLP-트랩 융합 단백질 TSLP-트랩1 (a) 및 TSLP-트랩2 (b) 의 도식적 표현을 보여준다. (GGS)₂₀: 20 개의 글라이신-글라이신-세린 (GGS) 반복체로 이루어지는 링커; pHLsec-SS: pHLsec-벡터의 분비 신호 (Aricescu et al., 2006); His-태그: 폴리히스티딘 태그. TSLPR 및 IL-7R알파의 아미노산 잔기 번호의 범위가 양쪽 트랩에 대해 표시되어 있고, 인간 아미노산 서열에 관한 것이다.
도 2 는 정제된 인간 TSLP-트랩1 단백질의 분석을 보여준다. (a) Superdex 200 칼럼에서의 정제된 TSLP-트랩1 의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 용출 프로파일. (b) 환원 조건 하에서의 정제된 TSLP-트랩1 의 SDS-PAGE 겔. 단백질 밴드를 TGX 스테인-프리 기술 (stain-free technology) (Biorad) 을 사용하여 시각화했다. SDS-PAGE 겔에서 분석된 피크 분획이 (a) 에서 SEC 프로파일에 명시되어 있다. Laemmli-완충제와 혼합한 후에, 샘플을 로딩 전에 변성 처리하거나 (끓임) 또는 변성 처리하지 않았다 (끓이지 않음).
도 3 은, 생물막 간섭측정법 (biolayer interferometry) 에 의해 평가된, TSLP 에 대한 친화도를 보여준다. 시간의 함수로서의 간섭측정 파장 변위 (nm) 가 회색 실선으로서 그래프에 그려져 있다. 적합 곡선이 검은색 파선으로서 그래프에 그려져 있다. 그래프 상의 농도는 하기 분석된 리간드의 농도를 나타낸다: (a) TSLPR, (b) IL-7R알파 및 (c) TSLP-트랩1. 보고된 K_D-값은 3 회 반복검증 (replicate) 측정으로부터의 평균을 나타낸다.
도 4 는, STAT5-루시퍼라제 리포터 어세이에서 평가된, pMET7-Flag-hTSLPR, pMET7-HA-hIL-7R알파 및 pGL3-β-카세인-luci 로 트랜스펙션된 HEK293T 세포에 대한 TSLP 결합의 투여량 응답 곡선을 보여준다. 세포를 증가하는 농도의 TSLP 로 자극하고, 루시퍼라제 활성에 대한 효과를 확인했다. TSLP 는 이 어세이에서 9 pM 의 EC50 값을 갖는다.
도 5 는 HEK293T 세포에서의 TSLP 유도되는 STAT5-루시퍼라제 리포터 어세이에 대한 TSLP-트랩의 저해 효과를 보여준다. 세포를 증가하는 농도의 TSLP-트랩1 또는 TSLP-트랩2 중 어느 하나 및 10 pM TSLP 와 동시-인큐베이션했다. 이 어세이에서, TSLP-트랩1 은 67 pM 의 IC50 값을 갖고, TSLP-트랩2 은 44 pM 의 IC50 값을 갖는다.
도 6 은 HEK293T 세포에서의 TSLP 유도되는 STAT5-루시퍼라제 리포터 어세이에 대한 항-TSLP 모노클로날 항체 (Mab, WO2009035577 에 기재됨) 및 그로부터 유래된 Fab 단편의 저해 효과를 보여준다. 세포를 증가하는 농도의 Mab 또는 Fab 단편 중 어느 하나 및 10 pM TSLP 와 동시-인큐베이션했다. 이 어세이에서, 항체는 1.4 nM 의 IC50 값을 갖고, Fab 단편은 1.7 nM 의 IC50 값을 갖는다.
도 7 은 HEK293T 세포에서의 TSLP 유도되는 STAT5-루시퍼라제 리포터 어세이에 대한 TSLPR 세포외 부분 (TSLPR엑토) 및/또는 IL-7R알파 세포외 부분 (IL-7R엑토) 의 효과를 보여준다. 세포를 상이한 농도의 TSLPR 의 세포외 부분 또는 IL-7R알파와 또는 양쪽 수용체의 세포외 부분 (링커를 통해 함께 융합되지 않은, 별개의 단백질 사슬로서) 과 조합된 10 pM TSLP 와 동시-인큐베이션했다. 세포외 부분은 이 어세이에서 오직 최고 시험된 농도에서 약간의 저해를 보여준다.
도 8 A) WT 마우스 또는 TSLPR^-/- 마우스를 면도하고, PBS 에 피부표면에서 (epicutaneously) (e.c.) 노출시키거나 (음성 대조군), 또는 10x 테이프 스트립핑하고 (tape stripped) 후속적으로 집먼지 진드기 (House Dust Mite) (HDM) 에 e.c. 감작시킨다. 7 일 후에, 모든 마우스는 5 연속일 동안 매일 폐에 HDM 챌린지 (challenge) 를 받았고, 마지막 챌린지 후 3 일 째에 분석을 수행했다. 하나의 군을 TSLP-트랩으로 처리했다; e.c. 감작 동안 피하에 50 ㎍ 및 각각의 HDM 챌린지 동안 비강내에 (intranasally) (i.n.) 25 ㎍. B) 기관지 폐포 세척 유체 (Broncho-Alveolar Lavage Fluid) (BALF) 에서의 세포 침윤 및 C) 생체 외에서 (ex vivo) 3 일 동안 HDM 로 재자극된, 세로칸 림프절 (mediastinal lymph node) (MLN) 세포에 의한 사이토카인 분비. 데이타는 평균 ± SEM, n = 3-5 (p <0,05, Mann-Whitney U 시험에 의해 계산됨; * PBS 군과 비교됨, # 기타와 비교됨) 를 나타낸다.
도 9 마우스를 7 일 동안 매일 PBS 또는 TSLP-트랩 (5 ㎍ 또는 25 ㎍) 으로 처리하고, 그에 뒤이어 MC903 (1 nmol) 또는 에탄올을 귀에 국소 적용했다. 귀 두께를 다이얼 두께 게이지를 사용하여 매일 측정했다. 데이타는 ± SEM (n=5) 로서 표시되어 있다.
도 10 상이한 조건 하에서의 귀 배수 림프절 (ear draining lymph node) (EDLN) 의 세포질의 확인
도 11 귀 배수 림프절의 림프구를 단리하고 계수했다. 180.000 개의 림프구를 시험관 내에서 CD3/CD28 로 재자극했다. 72 시간의 자극 후에, 배지를 수집하고, ELISA 에 의해 IL-13 생산에 관해 어세이했다. 데이타는 ± SEM (n=5) 로서 표시되어 있다.

상세한 설명

본 발명은 특정 구현예에 관해서 특정 도면을 참조하여 기재될 것이나, 본 발명은 그에 의해 제한되지 않으며, 오직 청구범위에 의해 제한된다. 청구범위의 임의의 참조 부호는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 도시된 도면은 오직 개략적인 것이며, 비제한적이다. 도면에서, 예시 목적을 위하여 일부 요소의 크기는 과장된 것일 수 있으며, 일정한 축척으로 도시되지 않을 수 있다. 용어 " ~ 를 포함하는" 이 본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 경우, 이는 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않는다. 단수 명사의 지칭시, 부정관사 또는 정관사, 예를 들어 "하나" 또는 "한", "그" 가 사용되는 경우, 이는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 상기 명사의 복수형을 포함한다.

추가로, 본 명세서 및 청구범위의 용어 제 1, 제 2, 제 3 등은 유사한 요소 사이를 구별하기 위해 사용되며, 필연적으로 순차 또는 시간 순서를 기재하는 것은 아니다. 이렇게 사용된 용어는 적절한 상황 하에 상호교환 가능하며, 본 명세서에 기재된 본 발명의 구현예는 본 명세서에 기재되거나 예시된 것 이외의 다른 순서로 실시될 수 있음이 이해되어야 한다.

하기 용어 또는 정의는 오직 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다. 본 명세서에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 용어는 본 발명의 기술분야의 당업자가 인식하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 당업계의 정의 및 용어에 관하여, 실무자는 특히 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4^th ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2012); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999) 을 참조한다. 본 명세서에서 제공되는 정의는 당업자가 이해하는 바보다 더 좁은 범위를 갖는 것으로 해석되어서는 안된다.

"융합 단백질" 또는 키메라 단백질은 원래 별개의 단백질 또는 별개의 단백질의 부분이었던 둘 이상의 단백질 또는 단백질 부분의 연결을 통해 생성된 단백질이다.

"단량체성 융합 단백질" 은 원래 별개의 단백질 또는 별개의 단백질의 부분이었던 둘 이상의 단백질 또는 단백질 부분의 연결을 통해 생성된 단량체성 키메라 단백질이다. 따라서, 본 발명의 단량체성 융합 단백질은 EP2703414 에 기재된 이합체성 융합 단백질과 상이하다. 실제로, EP2703414 에 기재된 융합 단백질은 세포에서 발현시 Fc 영역 사이의 황 (S-S) 가교에 의해 형성되는 이합체를 초래하는 Fc - 융합 단백질이다. 그와 같이 본 발명의 "단량체성 융합 단백질" 은 EP2703414 에서 형성된 2 사슬 융합 단백질과 상이한 단일 사슬 융합 단백질이다.

본 발명에서 표현 "융합 단백질" 또는 "본 발명의 융합 단백질" 은 "단량체성 융합 단백질" 을 의미한다.

"단백질", "폴리펩티드" 또는 "펩티드" 는 아미노산의 중합체를 언급하고, 분자의 특정 길이를 언급하지 않는다. 이 용어는 또한 번역후 수식, 예컨대 당화, 인산화 및 아세틸화를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는, 용어 단백질의 "세포외 부분" (또는 엑토도메인 (ectodomain)) 은 세포외 공간으로 노출되어 있는 내재성 (integral) 막 단백질의 부분을 언급하며, 상기 내재성 막 단백질은 소수성 아미노산으로 우세하게 구성되는 하나 이상의 막관통 도메인을 함유한다. 그러한 세포외 부분은 전형적으로 단백질의 접힌 구조의 표면에 위치하는 친수성 아미노산을 주로 포함하고, 그에 따라 수성 환경에서 가용성이다. 대부분의 세포 표면 수용체 단백질의 경우에, 세포외 부분 또는 세포외 도메인은 특정 리간드에 결합하는 역할을 하며, 한편 세포내 도메인은 신호 변환에서 중요한 역할을 수행한다.

본원에서 사용되는, "링커" 는 둘 이상의 단백질 또는 둘 이상의 단백질 부분을 연결하는 임의의 링커 또는 스페이서이다. 이러한 정의는 펩티드-기반 링커 뿐만 아니라 비-펩티드 링커를 포함한다.

본원에서 사용되는, 용어 "핵산" 은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태인, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중 어느 하나, 또는 그의 유사체를 언급한다. 핵산은 임의의 3-차원 구조를 가질 수 있고, 알려진 또는 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 핵산의 비제한적 예는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 제어 영역, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 핵산 분자는 선형 또는 고리형일 수 있다.

본원에서 사용되는 "치료" 및 "치료하는" 은, 심지어 치료가 부분적이거나 또는 궁극적으로 성공하지 못하더라도, 그 목적이 표적이 되는 장애 (예를 들어, 암) 또는 장애의 증상을 저해 또는 둔화 (경감), 또는 증상을 개선하는 것인, 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 언급한다. 치료를 필요로 하는 대상은 이미 장애를 갖는 것으로 진단 받은 대상 뿐만 아니라 장애에 걸리기 쉬운 또는 그런 성향이 있는 대상 또는 장애가 방지되어야 하는 대상을 포함한다. 예를 들어, 종양 (예를 들어, 암) 치료에서, 치료제는 종양 세포의 병적 측면을 직접 감소시킬 수 있거나, 또는 종양 세포를 다른 치료제에 의한 또는 대상의 자신의 면역계에 의한 치료에 더욱 감수성이 되게 만들 수 있다.

본원에서 사용되는, "암" 은 신체 기관 및 계의 정상 기능을 간섭할 수 있는 세포의 임의의 제어되지 않는 성장을 언급하고, 일차 및 전이성 종양 둘 모두를 포함한다. 그들의 원래의 위치 및 근원 중요 기관으로부터 이주하는 일차 종양 또는 암은 영향 받는 기관의 기능적 열화를 통해 결국 대상의 사망을 초래할 수 있다. 전이는 일차 종양으로부터 신체의 다른 부분으로의 암 세포의 전파로부터 초래되는, 일차 종양 위치와는 별개의, 암 세포 또는 암 세포의 군이다. 전이는 결국 대상의 사망을 초래할 수 있다. 예를 들어, 암은 양성 및 악성 암, 폴립, 과다형성, 뿐만 아니라 휴면 종양 또는 미세전이를 포함할 수 있다.

본 발명의 첫번째 태양은 TSLPR 의 세포외 부분 (엑토도메인) 및 IL-7R알파의 세포외 부분 (엑토도메인) 을 포함하는 단량체성 융합 단백질에 관한 것이다. 또다른 구현예에서 본 발명은 TSLPR 의 기능적 세포외 부분 (기능적 엑토도메인) 및 IL-7R알파의 기능적 세포외 부분 (기능적 엑토도메인) 을 포함하는 단량체성 융합 단백질을 제공한다. TSLPR 및 IL-7R알파는 통상의 기술자에게 알려져 있다 (인간 TSLPR 의 경우 Uniprot ID: Q9HC73, 인간 IL-7R알파의 경우 Uniprot ID: P16871). TSLP 와 TSLPR 의 결합을 측정하기 위한 또는 IL7 에 대한 또는 TSLP 에 대한 IL-7R알파의 결합을 측정하기 위한 기능적 어세이가 통상의 기술자에게 알려져 있다. 세포외 수용체의 N-말단 및 카르복시-말단 단부는 그들의 기능을 유지하기 위해서 일부 유연성을 용인하는 것으로 알려져 있다. 합리적인 디자인에 기반하여 우리는 SEQ ID NO: 1 (TSLPR 와 부합함) 및 SEQ ID NO: 2 (IL-7R알파와 부합함) 가 TSLPR 및 IL-7R알파의 기능적 세포외 부분이라고 추정했다. 또다른 구현예에서, 기능적 TSLPR 엑토도메인은 포유동물에서 유래하고, 기능적 IL-7R알파 엑토도메인은 포유동물에서 유래한다. 포유동물은, 인간 및 비인간 영장류 예컨대 침팬지 및 기타 유인원 및 원숭이 종; 농장 동물 예컨대 소, 양, 돼지, 염소, 라마 및 말; 애완 포유동물 예컨대 개 및 고양이; 설치류 예컨대 마우스, 랫트, 및 기니아 피그 등을 포함하는 실험실 동물을, 제한 없이, 포함하는, 포유류 강의 임의의 일원을 언급한다. 이 용어는 특정 연령 또는 성별을 지칭하지 않는다. 따라서, 성체 및 신생 대상체, 뿐만 아니라 태아가, 남성이든 또는 여성이든, 이 용어의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 하나의 특정 구현예에서, TSLPR 세포외 부분은 인간 TSLPR 에서 유래되고, IL-7R알파 세포외 부분은 인간 IL-7R알파에서 유래된다. 대안적으로, 각 단백질의 상동체가 사용될 수 있다. 상동체는 문제의 비수식 단백질에 상대적으로 아미노산 치환 (예컨대 돌연변이), 결실 및/또는 삽입을 갖고 그들이 유래되는 비수식 단백질과 유사한 생물학적 및 기능적 활성을 갖는 단백질을 망라한다. 다양한 구현예에서, 융합 단백질은 SEQ ID N°1 과 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열 및 SEQ ID N°2 와 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 융합 단백질은 SEQ ID N°1 과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 서열 및 SEQ ID N°2 와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 SEQ ID N°1 의 서열 및 SEQ ID N°2 의 서열을 포함한다. 본 출원의 융합 단백질은 분비 신호, 예컨대 - 이에 제한되지 않으나 - 인간 TSLPR 의 분비 신호 (SEQ ID N°5) 또는 pHLsec-벡터의 분비 신호 (SEQ ID N°6) 로 발현될 수 있다. 전형적으로, 상기 분비 신호는 단백질 성숙의 과정 동안 절단되고, 성숙한, 분비된 단백질에 존재하지 않는다. 위에 기재된 융합 단백질의 융합은 TSLPR 의 세포외 부분의 아미노-말단 또는 카르복시-말단 단부에서 일어날 수 있다. 이는 기재된 세포외 부분의 조합의 유연성을 허용한다. 하나의 구현예에서, 융합은 TSLPR 의 세포외 부분의 아미노-말단 단부에서 일어난다. 하나의 구현예에서, 융합은 TSLPR 의 세포외 부분의 카르복시-말단 단부에서 일어난다. 하나의 특정 구현예에서, 융합 단백질은 SEQ ID N°3 의 인간 TSLP-트랩1 이다. 하나의 특정 구현예에서, 융합 단백질은 SEQ ID N°4 의 인간 TSLP-트랩2 이다.

특정 구현예에 따르면, TSLPR 의 세포외 부분 및 IL-7R알파의 세포외 부분은 링커에 의해 연결되어 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질에서 사용되는 링커의 길이 또는 유연성에는 특별한 제한이 없다. 하나의 구현예에서, 링커는 펩티드-기반 링커, 예컨대 적합한 아미노산 서열일 수 있다. 특히, 링커는 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5 개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열일 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 링커는 적어도 10 개의 아미노산, 적어도 15 개의 아미노산, 적어도 20 개의 아미노산, 적어도 25 개의 아미노산 또는 적어도 30 개의 아미노산을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 링커는 글라이신-글라이신-세린 (GGS) 링커이며, 즉 상기 링커는 GGS 단위로 이루어진다. 특정 구현예에서, 상기 GGS 링커는 5 내지 20 개의 GGS 단위 (이는 15 내지 60 개의 아미노산에 부합한다) 로 이루어진다. 하나의 구현예에서, 링커는 비-펩티드 링커이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 비-펩티드 링커는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 에 기반하지 않는다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 비-펩티드 링커는 PEG 기반 스페이서이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 PEG 링커는 술프히드릴-반응성 화학기, 예컨대 - 이에 제한되지 않으나 - 할로아세틸, 말레이미드, 아지리딘, 아크릴로일, 아릴화제, 비닐술폰, 피리딜 디술피드, TNB-티올, BMH (비스말레이미도헥산), BMB (1,4-비스말레이미도부탄), 비스말레이미도에탄, 디티오비스말레이미도에탄, 트리스(2-말레이미도에틸)아민 및 디술피드 환원제로 활성화된다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 PEG 링커는 단백질에서의 아미노- 및/또는 카르복실-기에 반응성인 화학기, 예컨대 - 이에 제한되지 않으나 - N-히드록시숙신이미드, 일차 아민 기 및 tert-부틸옥시카르보닐 보호된-아미노 기로 활성화된다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 PEG 링커는 술프히드릴-반응성 화학기 및 단백질에서의 아미노- 및/또는 카르복실-기에 반응성인 화학기로 활성화된다. 또한 구상되는 것은 동일한 유형의 기능기의 연결을 허용하는 동종이기능성 크로스-링커이다. 또한 구상되는 것은 두 개의 구별되는 기능기의 연결을 허용하는 이종이기능성 크로스-링커이다. 하나의 구현예에서, 링커는 TSLPR 의 세포외 부분에 및 IL-7R알파의 세포외 부분에 - 이에 제한되지 않으나 - TSLPR 및/또는 IL-7R알파의 서열의 자연 발생적 시스테인 잔기를 통해 또는 조작된 (engineered) 시스테인을 통해 접합될 수 있다.

본원에 기재된 단량체성 융합 단백질은 단백질 태그, 예컨대 - 이에 제한되지 않으나 - 히스티딘 (His) 태그를 함유할 수 있다. 상이한 구현예에서, 본원에 기재된 단량체성 융합 단백질은 단백질 태그를 함유하지 않는다.

상기 단량체성 융합 단백질은 TSLPR 엑토도메인 및 IL-7R알파 엑토도메인을 포함하는 둘 이상의 단백질 또는 단백질 부분을 포함하는 임의의 구축물일 수 있다. 다시 말해서, 상기 단량체성 융합 단백질은 추가의 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 추가의 모이어티는 TSLP 에 결합하거나 또는 결합하지 않을 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명의 융합 단백질의 유도체에 증가된 반감기를 제공하기 위하서, 상기 단량체성 융합 단백질은 반감기를 연장하는 하나 이상의 기 또는 모이어티 (예컨대 - 이에 제한되지 않으나 - PEG) 에 (화학적으로 또는 그와 다르게) 연결될 수 있다.

다양한 구현예에서, TSLP 의 전장 및/또는 성숙한 형태 및/또는 동형 및/또는 스플라이스 변이체 및/또는 단편 및/또는 단량체성 및/또는 중합체성 형태 및/또는 임의의 기타 자연 발생적 또는 합성 유사체, 변이체, 또는 돌연변이체 (단량체성 및/또는 중합체성 형태를 포함함) 에 대한 본 발명의 단량체성 융합 단백질의 결합 친화도는 평형 해리 상수 (K_D) 에 의해 기술될 수 있다. 다양한 구현예에서, 단량체성 융합 단백질은 TSLP 의 전장 및/또는 성숙한 형태 및/또는 동형 및/또는 스플라이스 변이체 및/또는 단편 및/또는 임의의 기타 자연 발생적 또는 합성 유사체, 변이체, 또는 돌연변이체 (단량체성 및/또는 중합체성 형태를 포함함) 에 100 nM 미만, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM 또는 10 pM 의 K_D 로 결합한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 단량체성 융합 단백질은 수식되어 있는, 즉, 융합 단백질에 대한 임의의 유형의 분자의 공유적 부착 (이러한 공유적 부착은 단백질의 활성을 방지하지 않는다) 에 의한, 유도체를 포함한다. 예를 들어, 그러나 제한으로서가 아니라, 유도체는, 특히, 당화, 지질화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 알려진 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질가수분해 절단, 리간드 또는 기타 단백질에의 연결 등에 의해, 수식된 융합 단백질을 포함한다. 임의의 다수의 화학적 수식이 통상의 기술자에게 알려진 기술에 의해 수행될 수 있다.

본원에서 사용되는, "저해" 는 단량체성 융합 단백질이 시험관내 효능 어세이, 예컨대 - 이에 제한되지 않으나 - TSLP 유도되는 STAT5 리포터 어세이에서 측정되는 신호전달 사건을 유도하는 TSLP 의 능력을 방해/저해/방지/역전 또는 둔화시키는 사실을 언급한다. 저해는, 또한 중화로서 언급되며, 완전 중화 (TSLP 유도되는 신호가 관찰가능하지 않음) 를 의미할 수 있거나 또는 부분 중화를 의미할 수 있다. 중화 활성은 전형적으로 적합한 대조군 (예를 들어, 무관한 단백질에 의한 처리) 과 비교하여 평가될 것이며, 대조군은 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 것이다. 알려진 농도의 융합 단백질의 경우에, 저해 활성은 50% 저해 농도 (IC50) 로서 표현될 수 있다. IC50 은 50% 저해 (또는 중화) 가 달성되는 융합 단백질 농도이다. 그것은 단백질의 저해 잠재력 (또한 효능으로서 언급됨) 의 척도이다. 다양한 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 TSLP 유도되는 신호전달을 100 nM 미만, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM 또는 10 pM 의 효능으로 저해한다.

추가의 태양에 따르면, 융합 단백질은 그대로 제공되지 않고, 핵산, 즉 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자로서 제공된다. 추가의 태양에 따르면, 또한 제공되는 것은 그러한 핵산 또는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터이다. 또다른 태양에서, 위에 기재된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 구상된다. 본원에서 사용되는, 숙주 세포는 상기 융합 단백질의 생산에 적합한 임의의 세포일 수 있다. 전형적으로, 핵산은 숙주 세포에 트랜스펙션, 형질전환 또는 형질도입 기술에 의해 도입될 것이지만, 핵산이 숙주 세포에 도입되는 방식은 본 발명을 제한하지 않는다. 본원에 기재된 핵산 (또는 벡터) 을 포함하는 숙주 세포는 융합 단백질의 생산에 특히 적합하다. 따라서, 그러한 생산을 위한 용도는 본원에서 명백히 구상된다. 예시적 숙주 세포는 대장균 (E.coli) 세포, 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary) (CHO) 세포, 인간 배아 신장 293 (Human embryonic kidney 293) (HEK 293) 세포, HeLa 세포, 원숭이 신장 세포 (monkey kidney cell) (COS) 및 효모 세포이다. 형질전환된 숙주 세포는 숙주 세포가 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 유전자를 발현하는 것을 허용하는 조건 하에 성장될 수 있다. 구체적 발현 및 정제 조건은 이용되는 발현 시스템에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 유전자가 대장균에서 발현될 경우에, 그것은 첫째로 조작된 유전자를 적합한 박테리아 프로모터, 예를 들어, Trp 또는 Tac, 및 원핵생물 신호 서열보다 하류에 배치함으로써 발현 벡터 내로 클로닝된다. 또다른 예에서, 조작된 유전자가 진핵생물 숙주 세포, 예를 들어, CHO 세포에서 발현될 경우에, 그것은 첫째로 예를 들어, 적합한 진핵생물 프로모터, 분비 신호, 인핸서, 및 다양한 인트론을 함유하는 발현 벡터 내로 삽입된다. 유전자 구축물은 트랜스펙션, 형질전환, 또는 형질도입 기술을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 융합 단백질을 인코딩하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포를 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에 성장시킴으로써 생산될 수 있다. 발현 후에, 단백질은 당업계에 잘 알려진 기술, 예를 들어, 친화도 태그 예컨대 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 및 히스티딘 (His) 태그를 사용하여 또는 크로마토그래피에 의해 수확 및 정제될 수 있다. 하나의 구현예에서, 융합 단백질은 His-태그를 포함한다.

하나의 구현예에 따르면, 단량체성 융합 단백질은 본원에서 의료에서 사용하기 위해 제공된다. 다시 말해서, 융합 단백질은 약제로서 사용하기 위해 제공된다. 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 또는 재조합 발현 벡터도 마찬가지이며, 즉 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 또는 벡터는 약제로서 사용하기 위해 제공된다는 것이 구상된다. 특정 구현예에 따르면, 융합 단백질 (또는 그들을 인코딩하는 핵산 또는 벡터) 은 염증성 질환 또는 상태, 예컨대 염증, 급성 염증, 만성 염증, 호흡기 질환, 죽상동맥경화증, 재협착, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 건선, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 호산구성 식도염, 패혈 쇼크, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 염증성 골반 질환, 통증, 안구 염증성 질환, 복강 질환, 레이 증후군, 글리세롤 키나제 결핍증, 가족성 호산구증가증 (FE), 보통염색체 열성 경직 운동실조, 후두 염증성 질환, 결핵, 만성 쓸개염, 기관지확장증, 규폐증 및 기타 진폐증의 치료에서 사용하기 위해 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 천식, COPD, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 호산구성 식도염, 류마티스성 관절염 및 건선의 치료에서 사용하기 위해 제공된다.

특정 구현예에 따르면, 단량체성 융합 단백질 (또는 그들을 인코딩하는 핵산 또는 벡터) 은 암의 치료에서 사용하기 위해 제공된다. 치료될 수 있는 예시적 암은 기저 세포 암종, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 중추 신경계 암, 유방암, 복막암, 자궁경부암, 융모암종, 결장 및 직장 암, 결합 조직 암, 소화계의 암, 자궁내막암, 식도암, 안암, 두경부암, 위암 (위장암을 포함함), 교아세포종, 간 암종, 간세포암, 상피내 신생물, 콩팥 또는 신장 암, 후두암, 백혈병, 간암, 폐암 (예를 들어, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평세포 암종), 흑색종, 골수종, 신경아세포종, 구강암 (입술, 혀, 입, 및 후두), 난소암, 췌장암, 전립선암, 망막아종, 횡문근육종, 직장암, 호흡기계의 암, 침샘 암종, 육종, 피부암, 편평세포암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁 또는 자궁내막 암, 비뇨기계의 암, 음문 암, 림프종 예를 들어 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 뿐만 아니라 B-세포 림프종 (예를 들어 저등급/여포성 비-호지킨 림프종 (NHL), 소 림프구성 (SL) NHL, 중등급/여포성 NHL, 중등급 미만성 NHL, 고등급 면역모세포성 NHL, 고등급 림프모구성 NHL, 고등급 소 비-절단 세포 NHL, 벌키 (bulky) 질환 NHL, 맨틀 세포 림프종, AIDS-관련 림프종, 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 털세포 백혈병, 만성 골수모구성 백혈병, 뿐만 아니라 기타 암종 및 육종, 및 이식후 림프구증식 장애 (PTLD), 뿐만 아니라 모반증, 부종 (예를 들어, 뇌종양과 연관된 것), 및 메이그 증후군과 연관되는 비정상 혈관 증식을 포함하나, 그에 제한되지 않는다.

특정 구현예에 따르면, 단량체성 융합 단백질 (또는 그들을 인코딩하는 핵산 또는 벡터) 은 섬유증의 치료에서 사용하기 위해 제공된다. 예시적 예는 기관 섬유증, 폐 섬유증, 기도 재형성, 근육섬유모세포 과다형성, 천식성 기도 재형성 및 섬유증, 특발성 폐 섬유증 및 피부 전신 경화증을 포함하나, 그에 제한되지 않는다.

이는 방법이, 치료 유효량의 융합 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체를 위한 염증성 질환, 암 또는 섬유증의 치료를 위해 제공된다고 말하는 것과 같다. 그러한 방법은 전형적으로 상기 대상체에서 질환의 증상의 개선을 초래할 것이다. 여기에서 또한, 단량체성 융합 단백질은 단백질로서, 약학적 조성물로서 제공될 수 있거나 또는 단량체성 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자로서 또는 그러한 핵산 분자를 포함하는 벡터로서 투여될 수 있다. 단량체성 융합 단백질이 단백질로서 투여되는 경우에, 상이한 투여 경로가 구상될 수 있다. 예를 들어 - 그러나 제한으로서가 아니라 - 투여 경로는 하기를 포함한다: 경구, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 설하, 비강내, 뇌내, 질내, 경피, 직장내, 흡입으로, 또는 국소. 투여는 국소 또는 전신일 수 있다. 투여 방식은 의사의 재량에 맡겨질 수 있고, 의학적 상태의 자리에 부분적으로 의존한다. 대부분의 경우에, 투여는 본원에 기재된 융합 단백질의 혈류 내로의 방출을 초래한다. 융합 단백질이 핵산 또는 벡터로서 제공되는 경우에, 단량체성 융합 단백질이 유전자 요법을 통해 투여되는 것이 특히 구상된다.

추가의 태양에서, 본 공개는, 약학적으로 허용가능한 담체와의 연합으로, 위에 기재된 바와 같은 단량체성 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 고려한다. 전형적으로, 그러한 약학적 조성물은 적어도 융합 단백질을 포함한다. 상기 약학적 조성물은 추가의 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 추가의 모이어티는 TSLP 에 결합되거나 또는 결합되지 않을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 통상의 기술자에게 알려져 있고, 본질적으로 비독성 및 비치료적이다. 담체는, 비제한적 예로서, 링거 용액, 덱스트로스 용액 또는 행크 용액일 수 있다. 비수성 용액 예컨대 고정유 및 에틸 올레에이트가 또한 사용될 수 있다. 바람직한 담체는 염류 중 5% 덱스트로스이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 소량의 첨가제 예컨대, 완충제 및 보존제를 포함하는, 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질을 함유할 수 있다. 약학적 조성물은 약제로서 사용하기 위해 제공된다는 것이 본원에서 구상된다. 특히, 약학적 조성물은 염증성 질환, 암 또는 섬유증의 치료에서 사용하기 위해 제공된다. 이는 방법이, 본원에 기재된 약학적 조성물을 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상을 위해 염증성 질환, 암 또는 섬유증의 치료를 위해 제공된다고 말하는 것과 같다. 여기에서 또한, 약학적 조성물의 상이한 투여 경로가 구상될 수 있다. 예를 들어 - 그러나 제한으로서가 아니라 - 투여 경로는 하기를 포함한다: 경구, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 설하, 비강내, 뇌내, 질내, 경피, 직장내, 흡입으로, 또는 국소. 투여는 국소 또는 전신일 수 있다. 투여 방식은 의사의 재량에 맡겨질 수 있고, 의학 상태의 자리에 부분적으로 의존한다. 대부분의 경우에, 투여는 본원에 기재된 약학적 조성물의 혈류 내로의 방출을 초래한다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 부가적 치료제(들)과 함께 동시-투여된다. 동시-투여는 동시 또는 순차적일 수 있다.

특정 구현예, 특정 구성 뿐만 아니라 재료 및/또는 분자가, 본원에서 본 발명에 따른 세포 및 방법에 관해 논의되었지만, 본 발명의 범위 및 주제에서 벗어나지 않으면서 형식적인 상세한 다양한 변화 또는 변형이 만들어질 수 있다고 이해될 것이다. 하기 실시예는 특정 구현예를 더 잘 설명하기 위해 제공되고, 본 출원을 제한하는 것으로 여겨져서는 안된다. 본 출원은 오직 청구항에 의해 제한된다.

실시예

실시예에 대한 재료 및 방법

TSLP-트랩의 디자인

인간 TSLP-트랩1 은 TSLPR 엑토도메인의 C-말단 및 IL-7R알파 엑토도메인의 N-말단을 연결하는 (GGS)₂₀-링커 영역을 통해 인간 IL-7R알파 엑토도메인 (Uniprot ID: P16871 로부터의 잔기 21 내지 239, SEQ ID N°8) 에 상호연결된 인간 TSLPR 엑토도메인 (Uniprot ID: Q9HC73 로부터의 잔기 25 내지 231, SEQ ID N°7) 으로 이루어진다.

인간 TSLP-트랩2 는 IL-7R알파 엑토도메인의 C-말단 및 TSLPR 엑토도메인의 N-말단을 연결하는 (GGS)₂₀-링커 영역을 통해 인간 TSLPR 엑토도메인 (Uniprot ID: Q9HC73, 잔기 23 내지 231) 에 상호연결된 인간 IL-7R알파 엑토도메인 (Uniprot ID: P16871, 잔기 21 내지 239) 으로 이루어진다.

포유동물 세포로부터 TSLP-트랩의 분비를 가능하게 하기 위해서, TSLP-트랩 단백질을 인코딩하는 열린 해독 틀에 분비 신호를 포함시킨다. 이러한 분비 신호는 성숙한 단백질로부터 단백질가수분해로 제거된다. TSLP-트랩1 의 경우에, 인간 TSLPR 의 선천 분비 신호 (Uniprot ID: Q9HC73 으로부터의 잔기 1 내지 24; SEQ ID N°5) 를 사용하며, TSLP-트랩2 의 경우에 pHLsec-벡터로부터의 신호 펩티드를 사용한다 (Aricescu et al., 2006; SEQ ID N°6). 양쪽 TSLP-트랩1 및 TSLP-트랩2 는 그들의 C-말단에서 His-태그를 운반한다. 인간 TSLP-트랩1 및 TSLP-트랩2 융합 단백질은 도 1 에서 도식적으로 보여진다.

TSLP, TSLPR, IL-7R알파 및 TSLP-트랩의 클로닝 및 재조합 생산

전장 인간 TSLP_R127A_R130S (NP_149024.1; 잔기 1 - 159), 인간 TSLPR (NP_071431.2; 잔기 1 - 221) 및 인간 IL-7R알파 (NP_002176.2; 잔기 1 - 239) 및 인간 TSLP-트랩1 의 세포외 단편을 인코딩하는 cDNA 단편을 C-말단 His-태그와 프레임을 맞춰 pcDNA4/TO-발현 벡터 (Thermofisher) 의 멀티클로닝 자리 내로 클로닝했다. 인간 TSLP 은 잠재적 푸린 절단 자리를 제거하는 R127A 및 R130S 돌연변이 (TSLP_R127A_R130S) 를 운반한다 (Lyman et al., 2013). 인간 TSLP-트랩2 를 pHLsec-벡터 (SEQ ID N°6) 로부터의 신호 펩티드를 운반하는 pcDNA4/TO 벡터의 수식된 버전 내로 그것의 멀티클로닝 자리에서 클로닝했다.

TSLP_R127A_R130S 및 TSLPR 및 IL-7R알파 엑토도메인에 대한 안정적, 테트라사이클린-유도성 세포주를 HEK293S MGAT1-/- 세포에서 생성했다 (Reeves et al., 2002). TSLP-트랩1 및 TSLP-트랩2 에 대한 안정적, 테트라사이클린-유도성 세포주를 T-REx™-293 세포 (Thermo Fisher Scientific) 에서 생성했다. HEK293S MGAT1-/- 및 T-REx™-293 세포를 37℃ 에서 5% CO₂ 분위기에서 10% 소 태아 혈청, 10⁶ units·L^-1 페니실린 G 및 1 gL^-1 스트렙토마이신이 보충된 고-글루코스 DMEM 배지에서 성장시켰다. T-REx™-293 세포의 성장을 위해, 배지에 5 ㎍/㎖ 블라스티시딘을 보충했다.

안정적 세포주를 Verstraete et al., 2011 에 기재된 바와 같이 200 ㎎/㎖ 제오신을 이용한 선별에 의해 생성했다. 발현을 유도하기 위해서, 융합 성장한 (confluently grown) 세포의 배지를 2 ㎍/㎖ 테트라사이클린이 보충된 무혈청 배지로 교환했다. 안정적 트랜스펙션된 세포의 푸울 (pools) 로부터의 재조합 단백질 발현을 C-말단 His-태그에게로 향하는 HRP-커플링된 항체 (Invitrogen, catalogue No. R931-25) 를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 또는 배치 모드에서 2 ㎖ 의 조건화된 배지를 사용하는 소규모 고정화 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC) 정제 (GE Healthcare 로부터의 Ni 세파로스 비드를 사용) 에 의해 확인했다. 대규모 발현 실험을 위해, 안정적 트랜스펙션된 세포의 푸울을 삼십 개의 175 ㎠ 조직-배양 플라스크로 확장시켰다. 테트라사이클린을 이용한 유도 후 4 내지 5 일째에 조건화된 배지를 수확하고, 원심분리 및 0.22 ㎛ 바틀 탑 필터를 통한 여과에 의해 청소했다. 재조합 단백질을 정화된 조건화된 배지로부터 cOmplete His-태그 정제 칼럼 (Roche) 을 사용하는 IMAC 정제에 의해 포획하고, Superdex 200 또는 Superdex 75 칼럼 (GE Healthcare) 과 영동 완충제로서 HBS pH 7.4 를 사용하는 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 에 의해 추가로 정제했다. 예로서, TSLP-트랩1 에 관한 SEC 용출 프로파일 및 SDS-PAGE 겔 (환원 조건 하에) 은 TSLP-트랩1 제제의 샘플 균질성 및 순도를 입증한다 (도 2).

중화 항-TSLP 항체의 생산

람다 경쇄를 갖는 중화 인간 항-TSLP IgG2 모노클로날 항체 (Mab), 및 그로부터 유래된 Fab-단편을 HEK293T 세포에서 일시적 트랜스펙션에 의해 재조합 생산했다. 특허 WO2009035577 에 기재된 항체 A5 의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 cDNA 단편을 Gen9 로부터 주문했다. Fab 단편을 생성하기 위해, V_H-C_H1 중쇄 단편을 PCR 에 의해 생성했다. 모든 cDNAs 를 pHLsec 발현 플라스미드의 AgeI 및 KpnI 자리 사이에, 벡터의 신호 펩티드와 프레임을 맞춰, 클로닝했다 (Aricescu et al. 2006). 중쇄 및 V_H-C_H1 중쇄 단편을 C-말단 헥사히스티딘 태그와 프레임을 맞춰 클로닝했으며, 한편 경쇄는 정지 코돈을 운반했다. HEK293T 세포를 1:1 비의 V_H-C_H1-단편 또는 경쇄 및 중쇄에 관한 발현 플라스미드로 동시-트랜스펙션시켜 전장 Mab 또는 Fab-단편을 생산했다. Mab 또는 Fab-단편을 조건화된 배지로부터 IMAC 및 SEC 에 의해 정제했다.

생물막 간섭측정법

TSLP_R127A_R130S 및 TSLPR 엑토도메인, IL-7R알파 엑토도메인 및 TSLP-트랩1 사이의 상호작용에 관한 결합 친화도 및 결합 동역학을 생물막 간섭측정법 (BLI) 에 의해 조사했다. 스트렙타비딘-코팅된 바이오센서를 비오틴화된 TSLP_R127A_R130S 로 기능화시키고, 10 ㎍/㎖ 비오틴 용액으로 켄칭하고, 그 후 상이한 농도의 리간드에 노출시켰다.

비오틴화된 TSLP 를 생산하기 위해서, TSLP_R127A_R130S 를 인코딩하는 cDNA 단편을 pHL-AVITAG 벡터의 EcoRI 및 KpnI 자리 사이에 클로닝했다 (Aricescu et al., 2006). HEK293T 세포에서 트랜스펙션에 앞서, 배양 배지를 무혈청 DMEM 배지로 바꾸고, 거기에 100 μM D-비오틴을 첨가했다. 특정 C-말단 생체내 비오틴화를 허용하기 위해서 pHL-TSLP_R127A_R130S-AVITAG 구축물을 5:1 비로 pDisplay-BirA-ER 플라스미드와 동시-트랜스펙션시켰다 (Howarth et al., 2008). 트랜스펙션 후 5 일째에 조건화된 배지를 수확하고, Ni 세파로스 칼럼 (GE Healthcare) 내로 로딩했다. 재조합 단백질을 이미다졸로 용출하고, Superdex 75 칼럼 상에 영동 완충제로서의 HBS 와 함께 로딩했다.

모든 BLI 실험을 0.01% (w/v) BSA 및 0.002% (v/v) Tween 20 이 보충된 PBS 완충제에서, 25℃ 에서 작동하는, Octet RED96 기구 (ForteBio) 를 사용하여 수행했다.

상호작용 어세이 동안 비특이적 결합이 존재하지 않았다는 것을 입증하기 위해서, 비-기능화된 바이오센서를 대조군으로서 사용했다. 모든 데이타를 1:1 리간드 모델을 사용하여 ForteBio 데이타 분석 9.0.0.4 소프트웨어로 적합시켰다. 적합된 파라미터에 관해 보고된 값은 3 회 반복검증 측정으로부터의 평균 (및 표준 편차) 를 나타낸다.

TSLP 유도되는 STAT5 리포터 어세이를 위한 구축물

pMET7-Flag-hTSLPR 및 pMET7-HA-hIL-7R알파는 전장 FLAG-태그된 인간 TSLPR 및 전장 HA-태그된 인간 IL-7R알파의 발현을 허용한다. 코돈 최적화된 hTSLPR cDNA 서열을 ClaI/XbaI 열린 (opened) pMet7-FLAG-mTSLP 벡터 내로 결찰시킴으로써 pMET7-Flag-hTSLPR 를 제작했다 (Verstraete et al., 2014). 코돈 최적화된 hIL-7R알파 cDNA 서열을 BspEI/XbaI 열린 pMet7-HA-mIL-7R알파 벡터 내로 결찰시킴으로써 pMET7-HA-hIL-7R알파를 제작했다 (Verstraete et al., 2014).

TSLP 유도되는 STAT5 리포터 어세이

HEK293T 세포에서 TSLP 신호전달을 측정하기 위해, HEK293T 세포를 6-웰 플레이트의 웰 마다 1.5 ng pMET7-Flag-hTSLPR, 1.5 ng pMET7-HA-hIL-7R알파, 893 ng 빈 (empty) pMET7 벡터 및 23.5 ng pGL3-β-카세인-luci 리포터 플라스미드로 동시-트랜스펙션했다. 트랜스펙션을 위해, 우리는 DNA 를 선형 PEI 25 kda (Polysciences) 와 2.17:1 PEI:DNA 비로 12 분 동안 무혈청 Optimem I 배지 (Life technologies) 에서 인큐베이션하고, 그 후 이러한 DNA:PEI 믹스를 세포에 첨가했다. pGL3-β-카세인-luci 루시퍼라제 리포터는 β-카세인 프로모터의 5 개의 반복되는 STAT5-응답성 모티프를 함유한다 (Verstraete et al., 2014). 트랜스펙션 다음 날에, 세포를 세포 해리 완충제 (Life Technologies) 로 탈착시키고, DMEM + 10% 소 태아 혈청에 재현탁시켰다. 세포의 3% 를 96 웰 플레이트의 웰 마다 50 ㎕ 배지에 파종하고, 50 ㎕ 배지를 증가하는 농도의 포유동물-세포 유래된 재조합 TSLP (TSLP_R127A_R130S) 로 자극했다. 트랜스펙션 후 이틀째에, 96 웰 플레이트에서의 루시퍼라제 활성을 Envision 화학발광 계수기에서 이전에 기재된 바와 같이 확인했다 (Peelman et al., 2004). TSLP 자극된 세포의 발광 신호 (cps) 를 자극되지 않은 세포의 발광 신호로 나눔으로써 루시퍼라제 활성의 배수 유도 (fold induction) 를 계산했다. 데이타를 GraphPad Prism 에서 log 아고니스트 (agonist) 대 응답 곡선으로 적합시켰다.

TSLP 유도되는 STAT5 리포터 어세이에서의 저해

TSLP 유도되는 STAT5 리포터 어세이에 대한 상이한 저해인자 (트랩, 수용체 엑토도메인, 항-TSLP 항체 또는 유래된 Fab 단편) 의 효과를 연구하기 위해서, HEK293T 세포를 위에 기재된 바와 같이 파종하고 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 다음 날, 세포를 세포 해리 완충제 (Life Technologies) 로 탈착시키고, DMEM + 10% 소 태아 혈청에 재현탁시켰다. 세포의 3% 를 96 웰 플레이트의 웰 마다 50 ㎕ 배지에 파종했다. 별개의 플레이트에서, 배지 중 포유동물 세포 유래된 재조합 TSLP (TSLP_R127A_R130S) 를 증가하는 농도의 저해인자와 30 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 이러한 예비-인큐베이션 후에, 50 ㎕ 의 이러한 TSLP-저해인자 믹스를 파종된 세포에 첨가했다. 저해인자 및 TSLP 에 관해 보고된 농도 (10 pM) 는 이러한 100 ㎕ 부피에서의 그들의 최종 농도이다. 세포를 이 혼합물과 밤새 인큐베이션하고, 자극을 시작한지 24 시간 후에, 위에 기재된 바와 같이, STAT5 리포터 루시퍼라제 활성을 측정했다. TSLP 자극된 세포의 발광 신호 (cps) 를 자극되지 않은 세포의 발광 신호로 나눔으로써 루시퍼라제 활성의 배수 유도를 계산했다. 데이타를 GraphPad Prism 에서 log 저해인자 대 응답 곡선으로 적합시켰다.

마우스 균주

C57Bl/6J (WT) 마우스를 Janvier labs 에서 구입하고, TSLPR^-/- (Crlf2^-/-) 마우스는 M. Comeau 에 의해 제공되었다. 마우스를 VIB-UGent Center of Inflammation Research 의 동물 시설에 특정 무병원체 조건 하에 유지했다. 실험을 Ghent University 의 동물 윤리 위원회 및 VIB-UGent Center for Inflammation Research 에 의해 승인받았다.

실시예 1: TSLP-트랩의 생성

조작된 인간 TSLP-트랩은, 본원에서 유연한 Gly-Gly-Ser (GGS) 링커로 예시되는, 아미노산 링커에 의해 분리되는, 인간 TSLPR 및 인간 IL-7R알파의 세포외 영역으로 이루어지는 단량체성 융합 단백질을 인코딩한다. 인간 TSLP-트랩의 하나의 예에서, GGS-링커 영역은 TSLPR 엑토도메인의 C-말단을 IL-7R알파 엑토도메인의 N-말단에 연결시킨다 (TSLP-트랩1 로서 표시됨, 도 1a). 또다른 예에서, GGS-링커 영역은 IL-7R알파 엑토도메인의 C-말단을 TSLPR 엑토도메인의 N-말단에 연결시킨다 (TSLP-트랩2 로서 표시됨, 도 1b). TSLP-트랩은 포유동물 세포에서 발현될 때 배지 분획 내로 재조합 단백질의 분비를 초래하는 신호 펩티드를 함유한다. 예를 들어 TSLPR 의 선천 분비 신호를 운반하는 TSLP-트랩1 에서와 같이, 신호 펩티드로서, TSLPR 또는 IL-7R알파의 선천 분비 신호가 사용될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 pHLsec-벡터의 분비 신호를 운반하는 TSLP-트랩2 에서와 같이, TSLP-트랩 융합 단백질은 또다른 분비 신호를 운반할 수 있다 (Aricescu et al., 2006). C-말단 His-태그는 트랜스펙션된 세포의 조건화된 배지로부터 TLSP-트랩의 용이한 검출 및 정제를 허용한다. TSLP-트랩1 및 TSLP-트랩2 를 IMAC 및 SEC 의 조합에 의해, SDS-PAGE 분석에 의해 판단되는, ~95% 의 순도로 정제했다. 예로서, 정제된 TSLP-트랩1 의 최종 SEC-프로파일 및 SDS-PAGE 분석이 도 2 에서 보여진다.

실시예 2: TSLP-트랩은 TSLP 에 대해 높은 친화도를 갖는다

TSLP 및 TSLPR 엑토도메인 사이의 상호작용을 특성분석하기 위해서, IL-7R알파 엑토도메인 및 TSLP-트랩1 실시간 동역학적 생물막 간섭측정법 (BLI) 실험을 수행했다. 리간드로서 C-말단에서 비오틴화된 인간 TSLP 를 스트렙타비딘-코팅된 바이오센서 팁에 부동화시켰다. 첫째로, TSLPR 엑토도메인이 TSLP 에 3,2E-08 M 의 친화도 (K_D) 및 1,7E+05 M^-1s^-1 의 연합 속도 (k_on) 및 5,2E-03 s^-1 의 해리 속도 (k_off) 로 결합하는 것을 확인되었으며 (도 3a), 한편 IL-7R알파의 경우에 100 nM 의 농도까지 상호작용이 관찰되지 않았다 (도 3b). TSLP 및 IL-7R알파 사이의 가능한 낮은 친화도 상호작용을 프로브하기 위해 더 높은 농도의 IL-7R알파를 사용하여, 사용한 실험 조건 하에 IL-7R알파의 비-특정 결합이 초래되었다.

놀랍게도, TSLP-트랩1 은 부동화된 TSLP 에 1,2E-10 M 의 친화도 (K_D) 및 1,4E+05 M^-1s^-1 의 연합 속도 (k_on) 및 1,7E-05 s^-1 의 해리 속도 (k_off) 로 매우 강하게 결합한다는 것이 본원에서 보여진다 (도 3c). TSLP-트랩의 동역학적 프로파일은 이러한 강한 결합 친화도가 융합되지 않은 엑토도메인의 해리 속도와 비교할 때 현저히 더 낮은 해리 속도 상수 (k_off = 1,72E-05 s^-1) 로부터 발생한다는 것을 드러낸다.

실시예 3: TSLP-트랩은 TSLP 의 강력한 저해인자이다

TSLP 의 사이토카인 활성을 차단하는 조작된 TSLP-트랩의 잠재력을 시험관내 바이오어세이에 의해 평가했다. TSLP-트랩의 저해 효능을 TSLPR 및 IL-7R알파 엑토도메인 단독과, 양쪽 엑토도메인의 조합과, 그리고 중화 항-TSLP 모노클로날 항체 (Mab, WO2009035577 에 기재됨) 및 그로부터 유래된 Fab 단편과 비교했다. 그들의 차단하는 능력을 TSLP 유도되는 STAT5 리포터 어세이에서 전장 TSLPR 및 IL-7R알파로 트랜스펙션된 HEK293T 세포에서 평가했다. 트랜스펙션된 세포의 TSLP 에 의한 자극은 STAT5-의존적 루시퍼라제 활성을 9 pM 의 EC50 값으로 강하게 유도한다 (도 4). 고정된 농도의 TSLP (10 pM) 와 증가하는 농도의 TSLP-트랩1 또는 TSLP-트랩2 의 예비-인큐베이션은 TSLP 의존적 STAT5-활성화를, TSLP-트랩1 및 TSLP-트랩2 의 경우에, 각각, 67 pM 및 44 pM 의 IC50 값으로 효과적으로 저해한다 (도 5). 10 pM TSLP 와 특허 WO2009035577 에 기재된 중화 인간 항-TSLP IgG2 모노클로날 항체 (Mab), 또는 그로부터 유래된 Fab-단편과의 예비-인큐베이션은, 각각, 1.4 nM 및 1.7 nM 의 IC50 값을 초래했다 (도 6). 다른 한편으로는, 10 pM TSLP 와 TSLPR 또는 IL-7R알파 엑토도메인 단독과의, 또는 양쪽 엑토도메인의 조합과의 예비-인큐베이션은 유의한 저해를 초래하지 않았다 (도 6). 이는 놀랍게도 TSLPR 및 IL-7R알파 엑토도메인의 연결이 TSLP 신호전달을 저해하는 것을 목적으로 할 때 큰 이점을 준다는 것을 입증한다. 더욱이, 본원에 기재된 TSLP-트랩은 중화 항-TSLP 항체와 비교할 때 20- 내지 40-배수 더 낮은 IC50 값을 보여주며, TSLP-트랩의 저해 효능을 시사한다.

실시예 4: HDM-유도되는 알레르기성 기도 염증의 마우스 모델에서 TSLP-트랩의 효과

WT 및 TSLPR^-/- 마우스를 등의 피부를 면도하고, 10x 테이프-스트립핑하고, 피부 상의 폐쇄 패치 (occlusive patch) 아래에 10 ㎍ HDM 에 노출시켰다. 음성 대조군으로서, WT 마우스를 면도된 피부 상의 패치 아래에 PBS 에 노출시켰다. 하나의 군 (TSLP-트랩) 은 HDM 노출시에 피하에 (s.c.) 50 ㎍ TSLP-트랩의 주입을 받았고, 이러한 처리를 8 시간 후에 반복했다. 7 일 후에, 모든 마우스를 5 연속일 동안 폐를 통해 HDM 로 챌린지하고, TSLP-트랩 군을 25 ㎍ TSLP-트랩의 비강내 투여 (i.n.) 로 동시에 처리했다 (도 8A 참조). 알레르기성 기도 염증의 특색을 마지막 챌린지 후 3 일 째에 평가했다.

TSLPR-결핍 마우스에서 Th2 응답의 결여는 TSLP 신호전달이, HDM 에의 피부표면에서의 (e.c.) 감작을 통해 유도된, 알레르기성 기도 염증의 모델에서 폐 호산구증가증의 발달에 기여했다는 것을 시사한다. TSLP-트랩의 주입에 의한 TSLP 의 치료적 제거는 또한 BALF 에서의 호산구의 침윤을 유의하게 감소시킬 수 있었다 (도 8B 참조). 생체 외에서 3 일 동안 HDM 로 재자극된, 세로칸 림프절 (MLN) 세포에 의한 Th2 사이토카인 (IL-5 및 IL-13) 의 생산은, 마우스가 이전에 TSLP-트랩으로 처리되었을 때 유의하게 감소했다. 이들 실험은 TSLP-트랩에 의한 TSLP 신호전달의 불활성화가 e.c. HDM 감작의 모델에서 Th2-매개되는 알레르기성 기도 염증의 감소를 초래한다는 것을 시사한다 (도 8C 참조). 우리는 HDM-유도되는 알레르기성 기도 염증의 마우스 모델에서 TSLP-트랩이 폐 호산구증가증을 억제할 수 있다는 결론을 내린다.

실시예 5: 아토피성 피부염 마우스 모델에서 TSLP-트랩의 효과

아토피성 피부염에 대한 치료제로서의 TSLP-트랩의 잠재력을 연구하기 위해서, 우리는 비타민 D3 유사체 MC903 에 의해 유도되는 아토피성 피부염을 저해하는 TSLP-트랩의 능력을 시험했다. 이러한 마우스 모델에서, 아토피성 피부염을 MC903 에 의해 TSLP-의존적 방식으로 유도한다 (Li M. et al (2009) J. Invest. Dermatol. 129: 498-502; Li M. et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci USA 103: 11736-41). 7 일 동안, 마우스에게 매일 TSLP-트랩 (5 ㎍ 또는 25 ㎍) 또는 PBS 를 복강내 주입하고, 그 후 MC903 (1 nmol) 또는 에탄올을 귀에 국소 적용한다. 아토피성 피부염-유사 염증을 평가하기 위해서, 귀의 두꺼워짐을 다이얼 두께 게이지를 사용하여 매일 측정했다. 25 ㎍ 의 투여량의 TSLP-트랩으로 처리된 마우스는 PBS-처리된 대조군과 비교할 때 MC903 적용 후에 귀의 더 적은 두꺼워짐을 보였다 (도 9). 7 일 후에, 마우스를 희생시키고, 귀 배수 림프절 (EDLN) 로부터 림프구를 단리했다. EDLN 의 세포질은 MC903 치료 후에 증가되었지만, PBS 및 5 ㎍ 및 25 ㎍ TSLP-트랩으로 처리된 군 사이에서 상이하지 않았다 (도 10). 그 다음, 시험관내 CD3/CD28 재자극에 응답하는 림프구에 의한 IL-13 사이토카인 생산을 어세이했다. MC903 으로 처리된 마우스로부터 유래된 림프구는 25 ㎍ TSLP-트랩을 받은 마우스에서 덜 현저했던 IL-13 사이토카인 생산의 강한 유도를 보였다 (도 11). 이들 데이타는 함께 아토피성 피부염에 관한 마우스 모델에서 TSLP-트랩에 관한 보호 역할을 가리킨다.

서열

SEQ ID N°1: 인간 TSLPR 의 세포외 영역의 부분 (잔기 29 - 211) 의 아미노산 서열

SEQ ID N°2: 인간 IL-7R알파의 세포외 영역의 부분 (잔기 38 - 229) 의 아미노산 서열

SEQ ID N°3: 인간 TSLP-트랩1 아미노산 서열 (분비 신호 없음)

SEQ ID N°4: 인간 TSLP-트랩2 아미노산 서열 (분비 신호 없음)

SEQ ID N°5: 인간 TSLPR 의 분비 신호

SEQ ID N°6: pHLsec-벡터의 분비 신호 (Aricescu et al., 2006)

SEQ ID N°7: 도 1 에 도시된 바와 같은 인간 TSLPR 의 세포외 부분 (잔기 25 - 231) 의 아미노산 서열

SEQ ID N°8: 도 1 에 도시된 바와 같은 인간 IL-7R알파의 세포외 부분 (잔기 21 - 239) 의 아미노산 서열

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> VIB VZW UNIVERSITEIT GENT <120> NOVEL TSLP INHIBITORS <130> SaSa/TSLP/547 <150> EP 16163883.8 <151> 2016-04-05 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Val Gln Ile Gln Ile Ile Tyr Phe Asn Leu Glu Thr Val Gln Val 1 5 10 15 Thr Trp Asn Ala Ser Lys Tyr Ser Arg Thr Asn Leu Thr Phe His Tyr 20 25 30 Arg Phe Asn Gly Asp Glu Ala Tyr Asp Gln Cys Thr Asn Tyr Leu Leu 35 40 45 Gln Glu Gly His Thr Ser Gly Cys Leu Leu Asp Ala Glu Gln Arg Asp 50 55 60 Asp Ile Leu Tyr Phe Ser Ile Arg Asn Gly Thr His Pro Val Phe Thr 65 70 75 80 Ala Ser Arg Trp Met Val Tyr Tyr Leu Lys Pro Ser Ser Pro Lys His 85 90 95 Val Arg Phe Ser Trp His Gln Asp Ala Val Thr Val Thr Cys Ser Asp 100 105 110 Leu Ser Tyr Gly Asp Leu Leu Tyr Glu Val Gln Tyr Arg Ser Pro Phe 115 120 125 Asp Thr Glu Trp Gln Ser Lys Gln Glu Asn Thr Cys Asn Val Thr Ile 130 135 140 Glu Gly Leu Asp Ala Glu Lys Cys Tyr Ser Phe Trp Val Arg Val Lys 145 150 155 160 Ala Met Glu Asp Val Tyr Gly Pro Asp Thr Tyr Pro Ser Asp Trp Ser 165 170 175 Glu Val Thr Cys Trp Gln Arg 180 <210> 2 <211> 192 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln His 1 5 10 15 Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn Leu 20 25 30 Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn Phe 35 40 45 Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu Leu 50 55 60 Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu Thr 65 70 75 80 Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro Phe 85 90 95 Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val Thr 100 105 110 Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met His 115 120 125 Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His Val 130 135 140 Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln Pro 145 150 155 160 Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr Phe 165 170 175 Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr Pro 180 185 190 <210> 3 <211> 499 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Ala Ala Glu Gly Val Gln Ile Gln Ile Ile Tyr Phe Asn Leu Glu 1 5 10 15 Thr Val Gln Val Thr Trp Asn Ala Ser Lys Tyr Ser Arg Thr Asn Leu 20 25 30 Thr Phe His Tyr Arg Phe Asn Gly Asp Glu Ala Tyr Asp Gln Cys Thr 35 40 45 Asn Tyr Leu Leu Gln Glu Gly His Thr Ser Gly Cys Leu Leu Asp Ala 50 55 60 Glu Gln Arg Asp Asp Ile Leu Tyr Phe Ser Ile Arg Asn Gly Thr His 65 70 75 80 Pro Val Phe Thr Ala Ser Arg Trp Met Val Tyr Tyr Leu Lys Pro Ser 85 90 95 Ser Pro Lys His Val Arg Phe Ser Trp His Gln Asp Ala Val Thr Val 100 105 110 Thr Cys Ser Asp Leu Ser Tyr Gly Asp Leu Leu Tyr Glu Val Gln Tyr 115 120 125 Arg Ser Pro Phe Asp Thr Glu Trp Gln Ser Lys Gln Glu Asn Thr Cys 130 135 140 Asn Val Thr Ile Glu Gly Leu Asp Ala Glu Lys Cys Tyr Ser Phe Trp 145 150 155 160 Val Arg Val Lys Ala Met Glu Asp Val Tyr Gly Pro Asp Thr Tyr Pro 165 170 175 Ser Asp Trp Ser Glu Val Thr Cys Trp Gln Arg Gly Glu Ile Arg Asp 180 185 190 Ala Cys Ala Glu Thr Pro Thr Pro Pro Lys Pro Lys Leu Ser Lys Ser 195 200 205 Arg Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 210 215 220 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 245 250 255 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Gln Glu 260 265 270 Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp Asp 275 280 285 Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln His 290 295 300 Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn Leu 305 310 315 320 Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn Phe 325 330 335 Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu Leu 340 345 350 Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro Phe 370 375 380 Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val Thr 385 390 395 400 Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met His 405 410 415 Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His Val 420 425 430 Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln Pro 435 440 445 Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr Phe 450 455 460 Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr Pro 465 470 475 480 Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Gly Thr Lys His His His 485 490 495 His His His <210> 4 <211> 504 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Thr Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala 1 5 10 15 Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn 20 25 30 Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn 35 40 45 Thr Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys 50 55 60 Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys 65 70 75 80 Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu 85 90 95 Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro 100 105 110 Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp 115 120 125 Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys 130 135 140 Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys 145 150 155 160 Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg 165 170 175 Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro 180 185 190 Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr 195 200 205 Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Ser Arg 210 215 220 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 245 250 255 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 260 265 270 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Gln Gln Gly 275 280 285 Gly Ala Ala Glu Gly Val Gln Ile Gln Ile Ile Tyr Phe Asn Leu Glu 290 295 300 Thr Val Gln Val Thr Trp Asn Ala Ser Lys Tyr Ser Arg Thr Asn Leu 305 310 315 320 Thr Phe His Tyr Arg Phe Asn Gly Asp Glu Ala Tyr Asp Gln Cys Thr 325 330 335 Asn Tyr Leu Leu Gln Glu Gly His Thr Ser Gly Cys Leu Leu Asp Ala 340 345 350 Glu Gln Arg Asp Asp Ile Leu Tyr Phe Ser Ile Arg Asn Gly Thr His 355 360 365 Pro Val Phe Thr Ala Ser Arg Trp Met Val Tyr Tyr Leu Lys Pro Ser 370 375 380 Ser Pro Lys His Val Arg Phe Ser Trp His Gln Asp Ala Val Thr Val 385 390 395 400 Thr Cys Ser Asp Leu Ser Tyr Gly Asp Leu Leu Tyr Glu Val Gln Tyr 405 410 415 Arg Ser Pro Phe Asp Thr Glu Trp Gln Ser Lys Gln Glu Asn Thr Cys 420 425 430 Asn Val Thr Ile Glu Gly Leu Asp Ala Glu Lys Cys Tyr Ser Phe Trp 435 440 445 Val Arg Val Lys Ala Met Glu Asp Val Tyr Gly Pro Asp Thr Tyr Pro 450 455 460 Ser Asp Trp Ser Glu Val Thr Cys Trp Gln Arg Gly Glu Ile Arg Asp 465 470 475 480 Ala Cys Ala Glu Thr Pro Thr Pro Pro Lys Pro Lys Leu Ser Lys Gly 485 490 495 Thr Lys His His His His His His 500 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Gly Arg Leu Val Leu Leu Trp Gly Ala Ala Val Phe Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Trp Met Ala Leu Gly Gln Gly 20 <210> 6 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretion signal of the pHLsec-vector <400> 6 Met Gly Ile Leu Pro Ser Pro Gly Met Pro Ala Leu Leu Ser Leu Val 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Met Gly Cys Val Ala 20 25 <210> 7 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Ala Ala Glu Gly Val Gln Ile Gln Ile Ile Tyr Phe Asn Leu Glu 1 5 10 15 Thr Val Gln Val Thr Trp Asn Ala Ser Lys Tyr Ser Arg Thr Asn Leu 20 25 30 Thr Phe His Tyr Arg Phe Asn Gly Asp Glu Ala Tyr Asp Gln Cys Thr 35 40 45 Asn Tyr Leu Leu Gln Glu Gly His Thr Ser Gly Cys Leu Leu Asp Ala 50 55 60 Glu Gln Arg Asp Asp Ile Leu Tyr Phe Ser Ile Arg Asn Gly Thr His 65 70 75 80 Pro Val Phe Thr Ala Ser Arg Trp Met Val Tyr Tyr Leu Lys Pro Ser 85 90 95 Ser Pro Lys His Val Arg Phe Ser Trp His Gln Asp Ala Val Thr Val 100 105 110 Thr Cys Ser Asp Leu Ser Tyr Gly Asp Leu Leu Tyr Glu Val Gln Tyr 115 120 125 Arg Ser Pro Phe Asp Thr Glu Trp Gln Ser Lys Gln Glu Asn Thr Cys 130 135 140 Asn Val Thr Ile Glu Gly Leu Asp Ala Glu Lys Cys Tyr Ser Phe Trp 145 150 155 160 Val Arg Val Lys Ala Met Glu Asp Val Tyr Gly Pro Asp Thr Tyr Pro 165 170 175 Ser Asp Trp Ser Glu Val Thr Cys Trp Gln Arg Gly Glu Ile Arg Asp 180 185 190 Ala Cys Ala Glu Thr Pro Thr Pro Pro Lys Pro Lys Leu Ser Lys 195 200 205 <210> 8 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp Ala Glu Leu Asp 1 5 10 15 Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val Asn Gly Ser Gln 20 25 30 His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val Asn Thr Thr Asn 35 40 45 Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val Lys Cys Leu Asn 50 55 60 Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr Lys Lys Phe Leu 65 70 75 80 Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly Glu Lys Ser Leu 85 90 95 Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys Pro Glu Ala Pro 100 105 110 Phe Asp Leu Ser Val Ile Tyr Arg Glu Gly Ala Asn Asp Phe Val Val 115 120 125 Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val Lys Val Leu Met 130 135 140 His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn Lys Trp Thr His 145 150 155 160 Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln Arg Lys Leu Gln 165 170 175 Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile Pro Asp His Tyr 180 185 190 Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr Tyr Phe Arg Thr 195 200 205 Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp 210 215

Claims (15)

1. 흉선 간질 림포포이에틴 수용체 (TSLPR) 의 기능적 세포외 부분 및 인터루킨-7 수용체 알파 (IL-7R알파) 의 기능적 세포외 부분을 포함하는 단량체성 융합 단백질.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 TSLPR 의 세포외 부분 및 상기 IL-7R알파의 세포외 부분이 링커에 의해 연결되어 있는, 단량체성 융합 단백질.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 링커가 적어도 10 개의 아미노산을 포함하는, 단량체성 융합 단백질.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 5 내지 20 개의 GGS 단위로 이루어지는 GGS 링커인, 단량체성 융합 단백질.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 SEQ ID N°1 의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 및 SEQ ID N°2 의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단량체성 융합 단백질.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 SEQ ID N°1 의 아미노산 서열 및 SEQ ID N°2 의 아미노산 서열을 포함하는, 단량체성 융합 단백질.
7. 적어도 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 인코딩하는 핵산.
8. 제 7 항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 융합 단백질의 생산에서 사용하기 위한, 숙주 세포.
10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한, 단량체성 융합 단백질.
11. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 질환의 치료에서 사용하기 위한, 단량체성 융합 단백질.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 염증성 질환이 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 호산구성 식도염, 류마티스성 관절염 및 건선으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 단량체성 융합 단백질.
13. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료에서 사용하기 위한, 단량체성 융합 단백질.
14. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유증의 치료에서 사용하기 위한, 단량체성 융합 단백질.
15. 약학적으로 허용가능한 담체와의 연합으로, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 단량체성 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물.

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