JP7097465B2 - キメラ抗原受容体細胞療法と併用するｉｌ－１０剤の組成およびその使用方法 - Google Patents

キメラ抗原受容体細胞療法と併用するｉｌ－１０剤の組成およびその使用方法 Download PDF

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Description

本発明は、疾患、障害、および病態の治療または予防における免疫応答を調節するために、キメラ抗原受容体細胞療法と併用してＩＬ－１０剤を使用する方法に関する。具体的には、本開示は、キメラ抗原受容体－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）療法と併用したＩＬ－１０剤の使用を記載する。
序論
インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する作用を通して多数の免疫応答を制御する、多面的サイトカインである。その多面的活性の結果として、ＩＬ－１０は、炎症性病態、免疫関連障害、線維性障害、代謝障害、および癌を含む、幅広い疾患、障害、および病態に関連付けられている。いくつかのそのような疾患、障害、および病態に対するＩＬ－１０による臨床および前臨床評価は、様々なヒト治療への用途での治療におけるその治療潜在性を実証している。ＩＬ－１０活性を保持する、天然に存在するおよび合成の両方の様々なＩＬ－１０誘導体、バリアント、および類似体が生成されてきた。ヒトＩＬ－１０（ｈＩＬ－１０）は、２つのＩＬ－１０ポリペプチドのホモ二量体であり、各単量体は１７８アミノ酸を含み、最初の１８アミノ酸は、細胞発現中に切除され、成熟ＩＬ－１０分子の一部を形成しないシグナルペプチドを含む。ＩＬ－１０ポリペプチドは、非共有結合して、二量体ＩＬ－１０分子を形成する。特に、ペグ化型のＩＬ－１０は、ある特定の治療環境において、活性の改善、半減期の延長、および有用性を有することが示されている。
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、特にＢ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫の治療における癌の新たな治療法を表す。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、養子細胞移植（ＡＣＴ）の使用を含み、これは、キメラ抗原受容体（または「ＣＡＲ」）と呼ばれる合成Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）を発現するために組換えＤＮＡ技術を使用して改変される対象自身のＴ細胞を使用するプロセスは、操作されたＴ細胞を標的細胞に結合させるために、Ｔ細胞の生来の向性を変化させる。ＣＡＲは、典型的には、ＣＡＲが相互作用するように操作されたリガンドに接触すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞が活性化されるように、合成Ｔ細胞受容体を提供する操作された融合ポリタンパク質である。キメラ抗原受容体は、典型的には、多数の機能ドメイン、典型的には、ＣＡＲをコードする発現ベクターで形質転換されたＴ細胞の外面上に発現する標的化外部ドメインを含む単一のポリペプチドである。ＣＡＲは、細胞膜にまたがる膜貫通ドメインと、外部ドメインがその標的に結合すると細胞内シグナル伝達を提供する化学反応を媒介する細胞質内エンドドメインと、をさらに含む。例えば、ＣＡＲの外部ドメインは、標的細胞上に存在する既知の抗原に特異的であり得る。多くの場合、ＣＡＲは、腫瘍細胞の表面上に発現するマーカーに結合するように操作される。
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の典型的な実践では、Ｔ細胞は、アフェリシス（ａｐｈｅｒｉｓｉｓ）によって対象から単離され、単離されたＴ細胞を、ＣＡＲをコードする組換えベクターでエクスビボでトランスフェクトして、組換え改変されたＣＡＲ－Ｔ細胞の集団をもたらすことによってＣＡＲを発現するように遺伝子操作される。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、しばしば、ＣＡＲを発現するように組換え改変された患者由来のメモリＣＤ８＋Ｔ細胞を使用して生成される。エクスビボ増幅に続いて、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、典型的には、ＣＡＲの外部ドメインがその標的結合リガンドに遭遇し、標的細胞集団に対する選択的免疫応答をもたらすまで、ＣＡＲ－Ｔ細胞が循環する場合には、注入して患者に戻す。
以下でさらに考察されるように、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、標的抗原を発現する正常組織を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞による抗原特異的毒性の誘導およびＣＡＲ－Ｔ細胞治療の極端な効力の両方によって部分的に制限されてきた。これらの毒性は、生命を脅かすサイトカイン放出症候群を引き起こすことが観察されている。特に、有意な抗原負荷を伴う高親和性Ｔ細胞受容体相互作用は、活性化誘導細胞死につながり得ることが観察されている。本発明は、より低用量のＣＡＲ－Ｔ細胞の使用を容易にし、それによってＣＡＲ－Ｔ細胞療法に関連する有害事象を最小限に抑える、操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞の増強された活性を提供する組成物および方法を提供する。
本開示は、対象における標的細胞集団に対するＴ細胞媒介性免疫応答を調節するために、ＩＬ－１０剤と併用してＣＡＲ－Ｔ細胞療法を使用する組成物および方法を企図する。
本開示のある特定の実施形態において、本開示は、対象における標的細胞集団に対するＴ細胞媒介性免疫応答を調節する方法であって、
（ａ）対象からの複数のＴ細胞を得ることと、
（ｂ）単離された複数のＴ細胞を組換えベクターと接触させることであって、組換えベクターは、Ｔ細胞において機能的な発現制御配列に作動可能に連結されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、接触は、複数のＴ細胞による核酸配列の取り込みを可能にする条件である、接触させることと、
（ｃ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｔ細胞）をコードする核酸配列を発現する組換えベクターと接触した複数のＴ細胞からそれらのＴ細胞を単離することと、
（ｄ）対象に、治療上有効な量のＩＬ－１０剤と併用して、治療量のステップ（ｃ）の単離されたＣＡＲ－Ｔ細胞を投与することと、を含む、方法を提供する。
本開示のある特定の実施形態において、本開示は、対象における標的細胞集団に対するＴ細胞媒介免疫応答を調節する方法であって、対象に、
（ａ）治療上有効な量のＣＡＲを発現するＣＡＲ Ｔ細胞であって、その抗原認識ドメインは、標的細胞集団に結合することができる、ＣＡＲ Ｔ細胞と、
（ｂ）治療上有効な量のＩＬ－１０剤と、を投与することを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、治療上有効な量のＩＬ－１０剤を用いて、疾患、障害、または病態に罹患している対象を治療する方法であって、ＩＬ－１０剤は、対象に、治療上有効な量のＣＡＲ－Ｔ細胞の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与され、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲの抗原認識ドメインは、疾患、障害、または病態に特徴的な標的細胞集団の細胞表面分子に結合することができる、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、疾患、障害、または病態に罹患している対象を治療する方法であって、治療上有効な量のＣＡＲ－Ｔ細胞の投与を含み、ＣＡＲ－ＴのＣＡＲの抗原認識ドメインは、疾患、障害、または病態に特徴的な標的細胞集団の細胞表面分子に結合することができ、（ａ）一定期間、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＩＬ－１０剤とエクスビボで接触させるステップと、（ｂ）対象に、治療上有効な量のステップ（ａ）のＣＡＲ－Ｔ細胞を投与するステップと、を含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、疾患、障害、または病態に罹患している対象を治療する方法であって、治療上有効な量のＣＡＲ－Ｔ細胞の投与を含み、ＣＡＲ－ＴのＣＡＲの抗原認識ドメインは、疾患、障害、または病態に特徴的な標的細胞集団の細胞表面分子に結合することができ、（ａ）一定期間、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＩＬ－１０剤とエクスビボで接触させるステップと、（ｂ）ＩＬ－１０剤（対象に投与されるＩＬ－１０剤は、投与前にＣＡＲ－Ｔ細胞を処理するために使用されるＩＬ－１０剤と同じであるかまたは異なる）と併用して、対象に、治療上有効な量のステップ（ａ）のＣＡＲ－Ｔ細胞を投与するステップと、を含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団の細胞毒性活性を増強する方法であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞がエクスビボでＩＬ－１０剤と接触する、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団の免疫調節活性を増強する方法であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞がエクスビボでＩＬ－１０剤と接触する、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、対象にそれらを投与する前に、ＩＬ－１０剤でエクスビボで処理されるＣＡＲ－Ｔ細胞療法を用いて、疾患、障害、または病態に罹患している対象を治療する方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、疾患、障害、または病態に罹患している対象を治療する方法であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を用いて、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、対象にそれらを投与し、続いて、対象に、ＩＬ－１０剤（対象に投与されるＩＬ－１０剤は、投与前にＣＡＲ－Ｔ細胞を処理するために使用されるＩＬ－１０剤と同じであるかまたは異なる）と併用してＩＬ－１０で処理したＣＡＲ－Ｔ細胞を投与する前に、ＩＬ－１０剤を用いてエクスビボで処理される、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、疾患、障害、または病態に罹患している対象を治療する方法であって、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を用いて、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、対象にそれらを投与する前に、ＩＬ－１０剤を用いてエクスビボで処理され、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＡＲおよびＩＬ－１０剤をコードする組換えベクターでトランスフェクトされ、ベクターでコードされたＩＬ－１０剤が、投与前に、この細胞をエクスビボで処理するために使用されるＩＬ－１０剤と同じであるかまたは異なる、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法で疾患、障害、または病態に罹患している対象を治療する方法であって、ＣＡＲは、腫瘍性細胞に存在する癌抗原を特異的に認識し、結合する抗原特異的ドメイン（ＡＳＤ）を含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＩＬ－１０剤の投与と併用したＣＡＲ－Ｔ細胞療法を用いて、疾患、障害、または病態に罹患している対象を治療する方法であって、ＩＬ－１０剤が、活性化メモリＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を増強する、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＩＬ－１０剤の投与と併用したＣＡＲ－Ｔ細胞療法を用いて、疾患、障害、または病態に罹患している対象を治療する方法であって、ＩＬ－１０剤は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性機能を増強するのに十分な量で対象に投与される、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＩＬ－１０剤の投与と併用したＣＡＲ－Ｔ細胞療法を用いて、疾患、障害、または病態に罹患している対象を治療する方法であって、ＩＬ－１０剤は、一定期間にわたって、少なくとも１ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１０血清中トラフ濃度を維持するのに十分な量で対象に投与される、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＩＬ－１０剤の投与と併用してＣＡＲ－Ｔ細胞療法を用いて、疾患、障害、または病態に罹患している対象を治療する方法であって、ＩＬ－１０剤は、対象に皮下投与される、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＩＬ－１０剤の投与と併用したＣＡＲ－Ｔ細胞療法を用いて、疾患、障害、または病態に罹患している対象を治療する方法であって、ＩＬ－１０剤は、ＩＬ－１０剤を発現するように遺伝子改変された細胞の対象への導入と併せて、対象における疾患、障害、または病態（例えば、癌関連障害）の治療または予防のために対象に投与される、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＩＬ－１０剤の投与と併用したＣＡＲ－Ｔ細胞療法を用いて、疾患、障害、または病態に罹患している対象を治療する方法であって、投与が、対象における標的細胞集団へのＴ細胞媒介性免疫応答を調節し、対象に、ａ）キメラ抗原受容体であって、当該キメラ抗原受容体が、標的細胞集団に結合することができる少なくとも１つの抗原特異的標的化領域を含む、キメラ抗原受容体と、ｂ）治療上有効な量のＩＬ－１０剤と、を発現するように遺伝子改変された治療上有効な複数の細胞を対象に導入することを含む、方法を提供する。
ＣＡＲ－Ｔ細胞がＩＬ－１０剤を発現するように改変されるいくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体およびＩＬ－１０剤は、同じベクターによって発現されるが、他の実施形態において、キメラ抗原受容体およびＩＬ－１０剤は、異なるベクターによって発現される。
特定の実施形態において、治療上有効な複数の細胞は、治療上有効な量がＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性機能を増強するのに十分な量である、治療上有効な量でＩＬ－１０剤を発現するベクターでトランスフェクトされる。ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。特定の実施形態において、ＩＬ－１０剤の発現は、発現制御要素によって調節される。特定の実施形態において、ＩＬ－１０剤の発現は、約０．１ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１．５ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ以上のＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度、またはＩＬ－１０剤のＥＣ５０を維持するために、発現制御要素によって調節される。
特定の実施形態において、複数の細胞が対象から得られ、エクスビボで遺伝子改変される。複数の細胞は、アフェレーシスによって対象から得られ得る。いくつかの実施形態において、複数の細胞は、メモリＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、複数の細胞は、対象由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、投与される対象に由来しない。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＩＬ－１０剤の投与と併用したＣＡＲ－Ｔ細胞療法で疾患、障害、または病態に罹患している対象を治療する方法であって、対象に、ａ）キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変された治療上有効な第１の複数の細胞であって、当該キメラ抗原受容体が、標的細胞集団に結合することができる少なくとも１つの抗原特異的標的領域を含む、治療上有効な第１の複数の細胞と、ｂ）治療上有効な量のＩＬ－１０剤を発現し、任意に分泌するように遺伝子改変された第２の複数の細胞と、を導入することを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、治療上有効な第２の複数の細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性機能を増強するのに十分な量でＩＬ－１０剤を発現するベクターでトランスフェクトされる。特定の実施形態において、治療上有効な第２の複数の細胞は、ＩＬ－１０剤を発現するベクターでトランスフェクトされた患者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
特定の実施形態において、第１の複数の細胞は、対象から得られ、エクスビボで遺伝子改変され、他の実施形態において、第２の複数の細胞は、対象から得られ、エクスビボで遺伝子改変される。本開示は、第１の複数の細胞および第２の複数の細胞が、アフェレティック（ａｐｈａｅｒｅｔｉｃ）プロセスによって対象から得られる実施形態を企図する。いくつかの実施形態において、第１の複数の細胞は、メモリＣＤ８＋Ｔ細胞であり、第２の複数の細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、第１の複数の細胞および第２の複数の細胞は、自己の腫瘍細胞である。
本開示はまた、ＩＬ－１０剤（例えばＰＥＧ－ＩＬ－１０）の投与またはＩＬ－１０剤を発現するベクターの導入と併用して、対象における疾患、障害、または病態（例えば、癌関連障害）の治療または予防のためのＣＡＲ－Ｔ細胞療法の使用も企図する。
特定の実施形態は、癌関連の疾患、障害、または病態（例えば、腫瘍）を有する対象を治療する方法であって、ａ）キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変された治療上有効な複数の細胞を対象に導入することであって、当該キメラ抗原受容体が、標的細胞集団の標的細胞の表面に存在する抗原に特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原特異的ドメインを含む、導入することと、ｂ）対象に、治療上有効な量のＩＬ－１０剤を投与することと、を含む、方法を含む。
本開示のある特定の実施形態において、そのような方法は、対象における癌関連疾患、障害、または病態の予防のための治療プロトコルで使用され、他の実施形態において、そのような方法は、免疫関連障害の予防のための治療プロトコルで使用される。ＩＬ－１０剤の投薬パラメータおよびレジメン、ならびにそのような薬剤の例示的なタイプを含む、上記の方法のさらなる態様は、本明細書の別の箇所に記載されている。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲおよびＩＬ－１０剤をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよびそれらの使用方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍抗原に向けられ、ＩＬ－１０剤は、ｈＩＬ－１０である。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＣＡＲをコードする第１の核酸配列およびＩＬ－１０剤をコードする第２の核酸配列を含み、第１および第２の核酸配列は、それぞれ、第１および第２の発現制御要素に作動可能に連結され、第１および第２の発現制御要素は、同じであるかまたは異なる。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲおよびＩＬ－１０剤をコードする核酸配列を含む、組換えベクターであって、このベクターは、ＣＡＲをコードする第１の核酸配列およびＩＬ－１０剤をコードする第２の核酸配列を含むポリシストロン性核酸を含み、ポリシストロン性核酸配列は、発現制御要素に作動可能に連結され、ポリシストロン性核酸は、任意に、第２の核酸配列（例えば、ＩＲＥＳまたはＦＭＶＤ２Ａ配列）の発現を増強する介在配列を提供する、組換えベクターを提供する。ある特定の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲおよびＩＬ－７剤をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよびそれらの使用方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲおよびＩＬ－１２剤をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよびそれらの使用方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲおよびＩＬ－１５剤をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよびそれらの使用方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲおよびＩＬ－１８剤をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよびそれらの使用方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲおよびＩＴＩＭ阻害剤をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよびそれらの使用方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲおよびＩＬ－７受容体をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよびそれらの使用方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲおよびＩＬ－１０受容体をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよびそれらの使用方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲおよびＩＬ－１２受容体をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよびそれらの使用方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲおよびＩＬ－１５受容体をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよびそれらの使用方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲおよびＩＬ－１８受容体をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよびそれらの使用方法を提供する。
本開示の追加の実施形態は、癌関連疾患、障害、または病態を有する対象を治療する方法であって、対象に、ａ）キメラ抗原受容体であって、当該キメラ抗原受容体が、標的細胞集団に結合することができる少なくとも１つの抗原特異的標的化領域を含む、キメラ抗原受容体と、ｂ）ＩＬ－１０剤と、を発現するように遺伝子改変された治療上有効な複数の細胞を導入することを含む、方法を企図する。いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体およびＩＬ－１０剤は、同じベクターによって発現され、他の実施形態において、キメラ抗原受容体およびＩＬ－１０剤は、異なるベクターによって発現される。
特定の実施形態において、治療上有効な複数の細胞は、Ｔ細胞の細胞毒性機能を増強するのに十分な量でＩＬ－１０剤を発現するベクターでトランスフェクトされる。ベクターは、例えば、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターであり得る。本開示はまた、ＩＬ－１０剤を発現する任意の他の手段の使用も企図する。特定の実施形態において、ＩＬ－１０剤の発現は、発現制御要素によって調節される。特定の実施形態において、発現制御要素は、調節可能なプロモーターである。特定の実施形態において、発現制御要素は、組織特異的プロモーターである。
上記の実施形態において、複数の細胞は、対象から得られ、エクスビボで遺伝子改変され得る。本開示のいくつかの実施形態によれば、複数の細胞は、増殖後、投与前のある期間、少なくとも１つのＩＬ－１０剤で処理されたアフェレティックプロセスによって対象から得られ、ある期間は、対象への投与前の約４８時間未満、約３６時間未満、約２４時間未満、約１８時間未満、約１２時間未満、約６時間未満、約４時間未満、約２時間未満、または約１時間未満である。複数の細胞は、特定の実施形態において、メモリＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、他の実施形態において、自己の腫瘍細胞を含む。
本開示のさらにさらなる実施形態は、癌関連の疾患、障害、または病態を有する対象を治療する方法であって、対象に、ａ）キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変された治療上有効な第１の複数の細胞であって、当該キメラ抗原受容体が、標的細胞集団に結合することができる少なくとも１つの抗原特異的標的化領域を含む、治療上有効な第１の複数の細胞と、ｂ）ＩＬ－１０剤を発現するように遺伝子改変された治療上有効な第２の複数の細胞と、を導入することを含む、方法を企図する。
ある特定の実施形態において、上記の方法は、対象における癌または免疫関連の疾患、障害、または病態を含む、疾患、障害、または病態の予防のための治療プロトコルにおいて使用される。
特定の実施形態において、治療上有効な第１の複数の細胞は、細胞毒性機能を増強するのに十分な量でＩＬ－１０剤を発現するベクターでトランスフェクトされる。さらに他の実施形態において、治療上有効な第２の複数の細胞は、ＩＬ－１０剤を発現するベクターでトランスフェクトされたＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
特定の実施形態において、第１の複数の細胞は、対象から得られ、エクスビボで遺伝子改変され、他の実施形態において、第２の複数の細胞は、対象から得られ、エクスビボで遺伝子改変される。本開示は、第１の複数の細胞および第２の複数の細胞が、アフェレティック（ａｐｈａｅｒｅｔｉｃ）プロセスによって対象から得られる実施形態を企図する。いくつかの実施形態において、第１の複数の細胞は、メモリＣＤ８＋Ｔ細胞であり、第２の複数の細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらに他の実施形態において、第１の複数の細胞および第２の複数の細胞は、自己の腫瘍細胞である。
前述の実施形態の各々において、標的細胞集団は、腫瘍抗原を含み得、その例は、本明細書の別の箇所で記載される。
本開示は、本明細書に記載のＩＬ－１０剤をコードする核酸分子を企図する。ある特定の実施形態において、ＩＬ－１０剤（複数可）をコードする核酸分子は、ＤＮＡ分子で形質転換された細胞においてＩＬ－１０剤をコードする核酸分子の発現を与える発現制御要素に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）は、核酸分子を含む。ＩＬ－１０剤を発現する形質転換細胞または宿主細胞も本明細書で企図される。
本開示は、追加の化学療法剤、免疫チェックポイント調節剤を含む免疫調節分子、サイトカイン剤、サイトカインバリアント薬剤、サイトカイン類似体剤、ならびにそのようなサイトカイン剤の融合タンパク質およびそのペグ化形態を特異的に含む修飾されたサイトカイン剤の投与を含むが、これらに限定されない、追加の治療法と併用する前述の薬剤および方法の使用を企図する。
一実施形態において、本発明は、腫瘍性疾患に罹患している哺乳動物対象を治療する方法であって、
ａ．患者由来のＴ細胞の試料を得ることと、
ｂ．試料中のＴ細胞の一部をベクターで形質導入することであって、ベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、核酸配列が、１つ以上の制御要素と作動可能に会合して、Ｔ細胞内のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列の転写および翻訳をもたらして、ＣＡＲを発現するＴ細胞の集団を生成する、形質導入することと、
ｃ．ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を単離することと、
ｄ．ＩＬ－１０剤の存在下でＣＡＲ－Ｔ細胞をエクスビボで培養することと、
ｅ．哺乳動物対象に、ステップ（ｄ）からのＣＡＲ－Ｔ細胞を投与することと、を含む、方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、（ｆ）対象に、治療上有効な量のＩＬ－１０剤を含む医薬製剤を投与するさらなるステップを提供する。一実施形態において、ステップ（ｄ）のＩＬ－１０剤およびステップ（ｆ）の医薬製剤のＩＬ－１０剤は、同じＩＬ－１０剤である。一実施形態において、ステップ（ｄ）のＩＬ－１０剤およびステップ（ｆ）の医薬製剤のＩＬ－１０剤は、異なるＩＬ－１０剤である。一実施形態において、ステップ（ｄ）のＩＬ－１０剤は、ｒｈＩＬ－１０であり、ステップ（ｆ）のＩＬ－１０剤の医薬製剤は、ペグ化ＩＬ－１０剤を含む。一実施形態において、医薬製剤は、モノペグ化ＩＬ－１０剤を含む。一実施形態において、医薬製剤は、モノペグ化ＩＬ－１０剤とジペグ化ＩＬ－１０剤との混合物を含む。一実施形態において、ＩＬ－１０剤を含む医薬製剤の投与は、少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．０１ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．０５ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌの対象におけるＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である。
一実施形態において、本開示は、対象における標的細胞集団に対するＴ細胞媒介性免疫応答を調節する方法であって、
ａ）対象に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変された治療上有効な複数の細胞を導入することであって、キメラ抗原受容体が、標的細胞集団に結合することができる少なくとも１つの抗原特異的標的領域を含む、導入することと、
ｂ）対象に、治療上有効な量のＩＬ－１０剤を投与することであって、ＩＬ－１０剤の投与が、少なくとも０．０１ｎｇ／ｍｌの血清中トラフレベルをもたらす、投与することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１０剤は、モノペグ化ＩＬ－１０剤であるか、またはモノペグ化ＩＬ－１０剤とジペグ化ＩＬ－１０剤との混合物である。いくつかの実施形態において、対象へのＩＬ－１０剤の投与は、少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．０３ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．０６ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも１ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも２ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも５ｎｇ／ｍｌの対象におけるＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である。
本開示は、さらに、対象における標的細胞集団に対するＴ細胞媒介性免疫応答を調節する方法であって、対象に、
ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、当該キメラ抗原受容体が、標的細胞集団に結合することができる少なくとも１つの抗原特異的標的領域を含む、キメラ抗原受容体と、
ｂ）ＩＬ－１０剤と、を発現するように遺伝子改変された治療上有効な複数の細胞を導入し、
それにより、Ｔ細胞性免疫反応を調節することを含む、方法を提供する。
別の実施形態において、本開示は、対象における標的細胞集団に対するＴ細胞媒介性免疫応答を調節する方法であって、対象に、
ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変された治療上有効な第１の複数の細胞であって、当該キメラ抗原受容体が、標的細胞集団に結合することができる少なくとも１つの抗原特異的標的領域を含む、治療上有効な第１の複数の細胞と、
ｂ）ＩＬ－１０剤を発現するように遺伝子改変された治療上有効な第２の複数の細胞と、を導入することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された細胞によるＩＬ－１０剤の発現は、少なくとも０．００５ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．０１ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．０５ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．２ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも１ｎｇ／ｍｌ、またはあるいは少なくとも２ｎｇ／ｍｌの標的細胞微小環境において、局所ＩＬ－１０剤濃度を提供する。
別の実施形態において、本開示は、Ｔ細胞を有効量のＩＬ－１０剤と接触させることによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞中のアポトーシスを阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、エクスビボで実施され、ＩＬ－１０剤の量は、約０．００５ｎｇ／ｍｌを超える、あるいは少なくとも０．０１ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．０５ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．２ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも１ｎｇ／ｍｌ、またはあるいは少なくとも２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１０剤の濃度を有する緩衝液中で提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、対象においてインビボで実施され、対象に投与されるＩＬ－１０剤の量は、少なくとも２４時間の期間にわたって、少なくとも０．０３ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．０６ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも１ｎｇ／ｍｌ、あるいは少なくとも２ｎｇ／ｍｌ、またはあるいは少なくとも５ｎｇ／ｍｌの対象におけるＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である。
いくつかの実施形態において、使用されるＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原認識ドメイン（ＡＲＤ）であって、ＣＡＲのＡＲＤが、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、テロメラーゼ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、Ｔ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＦＡＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、５Ｔ４、ＷＴ１、ＫＧ２Ｄリガンド、葉酸受容体（ＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体Ａ、またはＷｎｔ１抗原に特異的に結合するポリペプチドである、抗原認識ドメイン（ＡＲＤ）を提供する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＡ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２－ｎｅｕ ｓｃＦｖ、抗ＶＥＧＦ－Ｒ２ ｓｃＦｖ、抗Ｔ１ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ、抗メソテリンｓｃＦｖ、抗ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ ｓｃＦｖ、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦｖ、抗ＦＡＰ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ、抗ＧＤ－２ ｓｃＦｖ、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ、抗ＭＡＧＥ ｓｃＦｖ、抗Ａ３ ｓｃＦｖ、抗５Ｔ４ ｓｃＦｖ、抗ＷＴ１ ｓｃＦｖ、または抗Ｗｎｔ１ ｓｃＦｖからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるように使用されるＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインであって、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７ ＣＤ２７８、ＣＤ１３４、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、ＣＤ２、ＣＤ５、またはＣＤ２８の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含む、細胞内シグナル伝達ドメインを提供する。一実施形態において、本方法の実施に使用されるＣＡＲ－Ｔ細胞について、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、およびＣＤ４０の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインを提供する。前述の方法は、化学療法剤、免疫チェックポイント調節剤、ＩＬ－２剤、ＩＬ－７剤、ＩＬ－１２剤、ＩＬ－１５剤、およびＩＬ－１８剤を含み、特に、免疫チェックポイント調節剤が、ＰＤ１調節剤、ＰＤＬ１調節剤、ＣＴＬＡ４調節剤、ＬＡＧ－３調節剤、ＴＩＭ－３調節剤、ＩＣＯＳ調節剤、ＯＸ４０調節剤、ｃｄ－２７調節剤、ＣＤ－１３７調節剤、ＨＶＥＭ調節剤、ＣＤ２８調節剤、ＣＤ２２６調節剤、ＧＩＴＲ調節剤、ＢＴＬＡ調節剤、Ａ２Ａ調節剤、ＩＤＯ調節剤、およびＶＩＳＴＡ調節剤からなる群から選択される、１つ以上の補助剤の対象への投与と組み合わせられ得る。
一実施形態において、本開示は、組換えベクターであって、ＩＬ－１０剤、ＣＡＲ、およびサイトカインをコードする核酸配列を含み、核酸配列は、発現制御配列に作動可能に連結されている、組換えベクターを提供する。いくつかの実施形態において、組換えベクターは、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、テロメラーゼ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、Ｔ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＦＡＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、５Ｔ４、ＷＴ１、ＫＧ２Ｄリガンド、葉酸受容体（ＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体Ａ、またはＷｎｔ１抗原に特異的に結合するポリペプチドをコードし、特に、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＡ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２－ｎｅｕ ｓｃＦｖ、抗ＶＥＧＦ－Ｒ２ ｓｃＦｖ、抗Ｔ１ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ、抗メソテリンｓｃＦｖ、抗ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ ｓｃＦｖ、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦｖ、抗ＦＡＰ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ、抗ＧＤ－２ ｓｃＦｖ、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ、抗ＭＡＧＥ ｓｃＦｖ、抗Ａ３ ｓｃＦｖ、抗５Ｔ４ ｓｃＦｖ、抗ＷＴ１ ｓｃＦｖ、または抗Ｗｎｔ１ ｓｃＦｖからなる群から選択される。他の実施形態において、組換えベクターは、ＣＡＲをコードし、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７ ＣＤ２７８、ＣＤ１３４、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、ＣＤ２、ＣＤ５、またはＣＤ２８の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含み、任意にまたは加えて、ポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、およびＣＤ４０の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する１つ以上の共刺激ドメインに由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターによってコードされるサイトカインは、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ１８、ならびにそれらのバリアントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターを含むウイルスベクターである。
本開示は、さらに、前述のベクターで形質転換された改変Ｔ細胞を提供する。
本開示は、さらに、ＩＬ－１０剤がペグ化されている場合を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ－１０剤を含む医薬製剤を提供する。
他の実施形態は、本開示の教示に基づいて当業者には明らかであろう。本開示は、一般に、癌の治療のためにＣＡＲ－Ｔ細胞療法を使用するという文脈で説明されているが、そのような療法はさほど限定されないことを理解されたい。
Ａ．一般的解釈および構築：
本開示についてさらに記載する前に、本開示が、本明細書に明記される特定の実施形態に限定されないことが理解されるべきであり、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態の記載を目的とするに過ぎず、限定的であることは意図されないこともまた理解されるべきである。
値の範囲が提供される場合、別段文脈が明確に指示しない限り、下限の単位の１０分の１までの、その範囲の上限と下限との間の各介在値、および任意の他の述べられた範囲またはその述べられた範囲内の介在値が、包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は独立して、より小さな範囲に含めることができ、それらもまた、述べられた範囲内のあらゆる具体的に除外される限度を条件として、本発明に包含される。述べられた範囲が、限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限度の一方または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」は、別段文脈が明確に指示しない限り、複数の参照物を含むことに留意しなくてはならない。さらに、特許請求の範囲は、いかなる任意の要素を除外するように起草されてもよいことに留意されたい。したがって、この陳述は、特許請求要素の引用に関連して、「単独で」および「唯一の」などの排他的な用語を使用するための、または「否定的な」限定を使用するための、先行基準として機能することが意図される。
別段示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏（℃）であり、圧力は大気圧または大気圧付近でのものである。以下、ｂｐ＝塩基対（複数可）、ｋｂ＝キロベース（複数可）、ｐｌ＝ピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃ＝秒（複数可）、ｍｉｎ＝分（複数可）、ｈまたはｈｒ＝時間（複数可）、ａａ＝アミノ酸（複数可）、ｋｂ＝キロベース（複数可）、ｎｔ＝ヌクレオチド（複数可）、ｐｇ＝ピコグラム、ｎｇ＝ナノグラム、μｇ＝マイクログラム、ｍｇ＝ミリグラム、ｇ＝グラム、ｋｇ＝キログラム、ｄｌまたはｄＬ＝デシリットル、μｌまたはμＬ＝マイクロリットル、ｍｌまたはｍＬ＝ミリリットル、ｌまたはＬ＝リットル、μＭ＝マイクロモル、ｍＭ＝ミリモル、Ｍ＝モル、ｋＤａ＝キロダルトン、ｉ．ｍ．＝筋肉内（に）、ｉ．ｐ．＝腹腔内（に）、ＳＣまたはＳＱ＝皮下（に）、ＱＤ＝１日１回、ＢＩＤ＝１日２回、ＱＷ＝１週間に１回、ＱＭ＝１ヶ月に１回、ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー、ＢＷ＝体重、Ｕ＝単位、ｎｓ＝統計的に有意ではない、ＰＢＳ＝リン酸緩衝食塩水、ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応、ＮＨＳ＝Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ＨＳＡ＝ヒト血清アルブミン、ＭＳＡ＝マウス血清アルブミン、ＤＭＥＭ＝ダルベッコ変法イーグル培地、ＧＣ＝ゲノムコピー、ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸を含む、標準的な略語が使用される。
分子生物学における標準的な方法は、科学文献に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、ならびに細菌細胞内でのクローニングおよびＤＮＡ変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合多糖およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、ならびに生物情報学（Ｖｏｌ．４）について記載する、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。科学文献は、免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含む、タンパク質精製、ならびに化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の産生、およびタンパク質のグリコシル化のための方法について記載している（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｓ．１－２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹを参照されたい）。
本開示全体にわたって、アミノ酸は１文字表記または３文字表記に従って言及されることが理解される。読者の便宜のため、１文字および３文字表記を以下に提供する：
Figure 0007097465000001
別段示されない限り、以下の用語は、以下に明記される意味を有することが意図される。他の用語は、本明細書全体を通して別の箇所で定義される。別段定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有すると解釈されるべきである。
Ｂ．定義：
活性：本明細書で使用される場合、「活性」という用語は、分子に関して使用され、システム（例えば、試験システムまたは生物学的機能、例えば、分子の別の分子への結合の程度、生物学的因子の触媒活性、遺伝子発現または細胞シグナル伝達、分化、または成熟を調節する能力、免疫応答などの免疫学的活性を調節する能力などに関する分子の特性を説明する。「活性」は、触媒活性（カタール）、結合活性（ｍｏｌ－１／Ｌ）、特定の活性、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］、または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］、国際単位（ＩＵ）、プラーク形成単位（ｐｆｕ）、生物学的区画内の濃度などとして表され得る。「増殖活性」という用語は、例えば、細胞分裂、ならびに腫瘍性疾患、線維症、異形成、細胞形質転換、転移、および血管新生で観察されるような調節不全の細胞分裂を増強、促進する、それに必要であるか、またはそれと特異的に関連する、活性を包含する。
投与する／投与：「投与」および「投与する」という用語は、対象の細胞、組織、臓器、または体液をインビトロ、インビボ、またはエキソビボで薬剤（例えば、ＩＬ－１０剤、ＣＡＲ－Ｔ細胞、化学療法剤、抗体、チェックポイント経路調節剤、または前述のものを含む医薬製剤）と接触させることを含む、対象と接触する作用を指すために本明細書では互換的に使用される。薬剤の投与は、局所、静脈内（静脈内注入を含む）、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、頭蓋内、腫瘍内、皮下、経皮、経粘膜、リンパ内、胃内、前立腺内、血管内（静脈内、動脈内を含む）、膀胱内（例えば、膀胱へ）、イオン泳動、肺、眼内、腹腔内、病巣内、卵巣内、脳内、および脳室内注射（ＩＣＶＩ）などを含むが、これらに限定されない、様々な当該技術分野で認められた方法のいずれかを通して達成することができる。「投与」という用語は、薬剤を細胞に接触させること、および薬剤を流体（この流体は、細胞と接触している）に接触させることを含む。
有害事象：本明細書で使用される場合、「有害事象」という用語は、患者における治療剤または治療法の使用に関連する任意の望ましくない経験を指す。有害事象は、投与された薬剤によって引き起こされる必要はない。有害事象は、軽度、中等度、または重度であり得る。腫瘍性疾患の治療に関して本明細書で使用される有害事象の分類は、米国保健福祉省の国立衛生研究所国立癌研究所によって発行された、２０１７年１１月２７日付けの有害事象の一般用語基準ｖ５．０（ＣＴＣＡＥ）に準拠している。
親和性：本明細書で使用する「親和性」という用語は、その標的に分子（例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲ、ＡＲＤ、または抗体）の特異的結合の程度を指し、分子とその標的の間の解離定数（Ｋｏｆｆ）および分子とその標的の間の結合定数（Ｋｏｎ）の比率、Ｋｄとして表される結合反応速度によって測定される。本明細書で使用される場合、「高親和性」という用語は、Ｋｄ＜１０－７を有する分子に関して使用される。本発明の好ましいＣＡＲは、２５℃で約１００ｐＭ以下の標的抗原１に対するＫｄを有する。本発明のより好ましいＣＡＲは、２５℃で約１０ｐＭ以下の腫瘍抗原に対する結合親和性を有する。
薬剤：本明細書で使用される場合、「薬剤」という用語は、識別可能な特徴を有し、インビトロまたはインビボで生物学的または化学的活性を示す分子（例えば、小分子もしくはポリペプチド）または治療法（例えば、外部ビーム放射線および内部放射線療法）を指す。
アゴニスト：本明細書で使用される場合、「アゴニスト」または「アクチベーター」という用語は、標的と相互作用して、標的の活性または標的へのリガンドの結合に関連する効果の増加を促進する、増強する、容易にするか、または引き起こす分子を指すために本明細書では互換的に使用される。アゴニストまたはアクチベーターの作用の非限定的な例には、核酸配列の転写および／または翻訳の増加、酵素の活性の増加、抗体のその標的への結合の動力学またはエネルギーの増加、ＴＣＲのその標的への結合、またはＣＡＲのその標的への結合が含まれ得る。
アンタゴニスト：本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」または「阻害剤」という用語は、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、生物学的経路（免疫チェックポイント経路を含む）を、低下、遮断、予防、その活性化を遅延、不活性化、脱感作、または下方制御する分子を指すために本明細書では互換的に使用される。一態様では、アンタゴニストは、アゴニストの活性を防止、低減、阻害、または中和する。別の態様では、アンタゴニストは、特定されたアゴニストが存在しない場合でさえ、標的、例えば、標的受容体の活性を防止、阻害、または低減する。
抗体：本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は集合的に、（ａ）標的分子に特異的に結合するグリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリン（哺乳動物免疫グロブリンクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない）、ならびに（ｂ）標的分子への結合について、それが由来する免疫グロブリンと競合する、ＩｇＧ（１－４）デルタＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、ｄｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）３、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、および（ｓｃＦｖ）２を含むがこれらに限定されない、免疫グロブリン誘導体を指す。抗体という用語は、任意の特定の哺乳動物種に由来する免疫グロブリンに制限されず、マウス、ヒト、ウマ、ラクダ、抗体、およびヒト抗体を含む。「抗体」という用語は、天然源から単離可能な天然に存在する抗体、ならびにモノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲ移植、ベニア、または（例えば、Ｔ細胞エピトープを除去するための）脱免疫化抗体を含む、操作された抗体を包含する。「抗体」という用語は、任意の特定の合成手段に限定されるものと解釈されるべきではなく、天然源から単離可能な天然に存在する抗体、ならびにヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれらから調製されたハイブリドーマについてトランスジェニックであるトランスジェニック動物から単離された抗体、抗体の発現をもたらす核酸構築物で形質転換された宿主細胞から単離された抗体、ファージ提示ライブラリを含むコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体を含む、「組換え」手段によって得られる操作された抗体分子を含む。一実施形態において、「抗体」は、結合およびエフェクター機能を提供する可変ドメインおよび定常ドメインを含む「完全長抗体」である、哺乳動物免疫グロブリンである。ほとんどの場合、完全長抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含み、各軽鎖は、可変領域および定常領域を含む。一実施形態において、抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む「完全長抗体」であり、各軽鎖は、結合およびエフェクター機能を提供する可変領域および定常領域を含む。好ましい実施形態において、定常領域および可変領域は、「ヒト」である（すなわち、ヒト免疫グロブリンに特徴的なアミノ酸配列を有する）。
ＣＡＲまたはキメラ抗原受容体：本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」および「ＣＡＲ」という用語は、配列のアミノ末端からカルボキシ末端に配置された多数の機能ドメインを含むポリタンパク質を指すために互換的に使用される：（ａ）シグナルペプチド配列、（ｂ）細胞外抗原認識ドメイン（ＡＲＤ）、（ｃ）膜貫通ドメイン（ＴＳＤ）、（ｄ）前述のドメイン（ａ）～（ｄ）が任意に１つ以上の（ｅ）スペーサードメインによって連結され得る１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）。「ＣＡＲ」という用語はまた、シグナルペプチド配列の翻訳後の切断に続いて細胞中で発現されるポリタンパク質を指すためにも使用され、ＣＡＲは、配列のアミノ末端からカルボキシ末端に配置された多数の機能ドメインを含む：（ａ）細胞外抗原認識ドメイン（ＡＲＤ）、（ｂ）膜貫通ドメイン（ＴＳＤ）、（ｃ）前述のドメイン（ａ）～（ｄ）が任意に１つ以上のスペーサードメインによって連結され得る１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）。
ＣＡＲ－Ｔ細胞：本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体Ｔ細胞」および「ＣＡＲ－Ｔ細胞」という用語は、ＣＡＲを発現するように組換え改変されたＴ細胞を指すために互換的に使用される。
ＣＤＲ（複数可）：本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖免疫グロブリンポリペプチドおよび軽鎖免疫グロブリンポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非隣接の抗原結合部位を意味することを意図している。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９９１）（本明細書ではＫａｂａｔ １９９１とも呼ばれる）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７、およびＭａｃＣａｌｌｕｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５によって記載されており、定義には、互いに比較したときのアミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体または移植された抗体またはそれらのバリアントのＣＤＲを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内にあることを意図している。本明細書におけるＣＤＲ位置の番号付けは、Ｋａｂａｔの番号付け規則に従って提供される。
循環腫瘍細胞：本明細書で使用される場合、「循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）」という用語は、対象の腫瘍体積から末梢循環へと脱落した腫瘍細胞を指す。
同等：本明細書で使用される場合、「同等」という用語は、評価可能な定性的または定量的パラメータの２つの測定における差異の程度を記載するのに使用される。例えば、評価可能なパラメータの第１の測定および評価可能なパラメータの第２の測定が、許容範囲（すなわち、当業者が、その状況における、２つの結果間の効果の統計的に有意な差をもたらさないと認識する範囲）を超えて逸脱しない場合に、２つの測定は、「同等」であると見なされ得る。場合によっては、１つの測定が、３５％未満だけ、３０％未満だけ、２５％未満だけ、２０％未満だけ、１５％未満だけ、１０％未満だけ、７％未満だけ、５％未満だけ、４％未満だけ、３％未満だけ、２％未満だけ、または１％未満だけ別の測定から逸脱する場合に、測定は、「同等」であると見なすことができる。特定の実施形態において、１つの測定は、それが１５％未満だけ、１０％未満だけ、または５％未満だけ参照標準から逸脱する場合に、参照標準と同等である。「同等の」という用語はまた、幸福感、食欲、エネルギー、無気力などのような定量化できない臨床的に評価可能なパラメータの改善などの定性的および定量的パラメータに関して使用され得る。
に由来する：本明細書で使用される場合、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ－１０ポリペプチド「に由来する」アミノ酸配列）の文脈において使用される「に由来する」という用語は、ポリペプチドまたは核酸が、参照ポリペプチドまたは核酸（例えば、天然に存在するＩＬ－１０ポリペプチドまたはＩＬ－１０をコードする核酸）の配列に基づく配列を有することを示すことが意図され、タンパク質または核酸が作製される源または方法に関して限定的であることは意図されない。例えば、天然に存在するポリペプチドの配列に関して保存的アミノ酸置換を有する固相化学合成によって合成されたポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドアミノ酸配列に由来すると見なされる。例として、「に由来する」という用語は、参照アミノ酸またはＤＮＡ配列のホモログまたはバリアントを含む。
ドライバー変異：本明細書で使用される場合、「ドライバー変異」という用語は、腫瘍の成長および生存に寄与し、それにより選択的利点を付与する腫瘍性細胞内の変異を指す。
濃縮された：本明細書で使用される場合、「濃縮された」という用語は、目的の分子が、（ａ）出発試料中の分子の濃度よりも高い濃度（例えば、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも６４倍高い、もしくはそれ以上）で存在するように、試料が、（例えば、「人間の手」によって）非自然的に操作されることを指す。出発試料は、例えば、分子が天然に存在する試料（例えば、天然に存在する材料の試料）、または投与後に存在する試料、または分子が合成的に調製された環境の試料（例えば、組換え細菌細胞培養、化学合成、細胞培養上清などから得られる試料）であり得る。分子の試料は、環境またはその合成環境に関して分子の純度が向上している可能性があるが、実質的に純粋ではない可能性がある。
ＩＬ－１０剤：本明細書で使用される場合、「ＩＬ－１０剤」という用語は、分子が、（ａ）ＩＬ－１０受容体に結合し、その結合が、ＩＬ－１０として１つ以上のシグナル伝達経路の調節をもたらすことができ、（ｂ）ＩＬ－１０に特徴的な生物学的応答を誘発することができる、２つのＩＬ－１０ポリペプチドを含むＩＬ－１０活性を有する、二量体分子を指す。ＩＬ－１０剤という用語は、アミノ酸の置換、欠失、または修飾（ＩＬ－１０類似体およびＩＬ－１０バリアント）ならびに修飾されたＩＬ－１０剤（例えば、ペグ化ＩＬ－１０）を含む、ＩＬ－１０分子を含む。
ＩＬ－１０類似体：本明細書で使用される場合、「ＩＬ－１０類似体」という用語は、ＩＬ－１０と同じ作用機構を通して作動し（すなわち、ＩＬ－１０受容体、およびＩＬ－１０に類似した様式でＩＬ－１０と同じシグナル伝達経路を調節する薬剤に結合し、その活性を調節し）、ＩＬ－１０と同等の（またはそれを超える）生物学的応答を誘発することができる、ＩＬ－１０剤を指す。
ポリペプチド類似体：本明細書で使用される場合、「ポリペプチド類似体」という用語は、それらが由来する親ポリペプチドと同じ作用機構を作動し（すなわち、親ポリペプチドの受容体、および親ポリペプチドに類似した様式で親ポリペプチドと同じシグナル伝達経路を調節する薬剤に特異的に結合し、その活性を調節し）、親ポリペプチドと同等の（またはそれを超える）生物学的応答を誘発することができる、ポリペプチド薬剤を指す。本発明の実施において有用なポリペプチド類似体の例には、ＩＬ－１０ポリペプチド類似体、ＩＬ－１２ポリペプチド類似体、ＩＬ－７ポリペプチド類似体、ＩＬ－１５ポリペプチド類似体、ＩＬ－２ポリペプチド類似体、およびＩＬ－１８ポリペプチド類似体が含まれるが、これらに限定されない。
変化をもたらすのに十分な量で：「変化をもたらすのに十分な量で」という語句は、特定の薬剤の投与前に測定された指標のレベル（例えば、ベースラインレベル）とその投与後のレベルとの間に検出可能な差異が存在することを意味するために本明細書で使用される。指標には、任意の客観的パラメータ（例えば、体温、ＩＬ－１０の血清中濃度）または主観的パラメータ（例えば、対象の幸福感）が含まれる。「変化をもたらすのに十分な」量は、治療上有効な量であり得るが、「変化をもたらすのに十分な」そのような量は、治療上有効な量よりも多くても少なくてもよい。
と併用して：本明細書で使用される場合、「と併用して」という用語は、対象への第１の薬剤および第２の薬剤の投与を指す。本発明の目的のために、第１の薬剤および第２の薬剤の治療効果が重複するように、第１の薬剤の投与から生じる生物学的効果が、第２の薬剤の投与の時点で対象において持続している場合に、１つの薬剤（例えば、ＩＬ－１０剤）は、第２の薬剤（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）と併用して投与されるものと見なされる。例えば、市販のＣＡＲ－Ｔ細胞療法（例えば、Ｋｙｍｒｉａｈ商標のチサゲンレクロイセル）は、典型的には、頻度が低く（または１回のみ）、投与される一方で、ｈＩＬ－１０またはペグ化ｈＩＬ－１０などの本開示によって企図される分子と併用される薬剤は、一般的には、１日１回皮下投与される。しかしながら、第１の薬剤の投与が、長期間にわたって治療効果を提供し、第２の薬剤の投与が、第１の薬剤の治療効果が依然として進行中である間に、その治療効果を提供することで、第１の薬剤が、第２の薬剤の投与の時点から有意に離れた（例えば、数日間または数週間）時点で投与されているにも関わらず、第２の薬剤は、第１の薬剤と併用して投与されるものと見なされる。「と併用して」という用語はまた、第１の薬剤および第２の薬剤が同時にまたは同時期に投与される状況も指す。本開示の文脈において、第１および第２の薬剤が互いに３０分以内に投与される場合、第１の薬剤は、第２の薬剤と同時に投与されるものと見なされる。本開示の文脈において、第１および第２の薬剤が、互いに約２４時間以内、好ましくは互いに約１２時間以内、好ましくは互いに約６時間以内、好ましくは互いに約２時間以内、または好ましくは互いに約３０分以内に投与される場合、第１の薬剤は、第２の薬剤と「同時期に」投与されるものと見なされる。「と併用して」という用語はまた、第１の薬剤および第２の薬剤が単一の医薬的に許容される製剤で共製剤化され、第１および第２の薬剤を含む共製剤が対象に投与される状況にも適用されるものと理解されるものとする。
治療を必要とする：本明細書で使用される「治療を必要とする」という用語は、対象が治療を必要とするまたは治療から益を得るであろうという医師または他の介護者によって下される判断を指す。この判断は、医師または介護者の専門知識の領域にある多様な因子に基づいて下される。
予防を必要とする：本明細書で使用される「予防を必要とする」という用語は、対象が予防的ケアを必要とする、または予防的ケアから益を得るであろうという医師または他の介護者によって下される判断を指す。この判断は、医師または介護者の専門知識の領域にある多様な因子に基づいて下される。
阻害剤：阻害剤は、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、または細胞を減少させる、遮断する、防止する、活性化を遅らせる、不活性化する、脱感作する、または下方調節する分子である。阻害剤はまた、構成的活性を低減、遮断、または不活性化する分子としても定義され得る。
腫瘍内異質性：本明細書で使用される場合、「腫瘍内異質性（ＩＴＨ）」という用語は、対象における腫瘍内、または同じ患者における個々の腫瘍病変間の細胞の遺伝的変動および表現型の変動を指す。
単離された：ポリペプチドの文脈において、「単離された」という用語は、天然に存在する場合、天然に存在することができる環境とは異なる環境に存在する、目的とするポリペプチドを指す。「単離された」は、目的とするポリペプチドが実質的に富化された、および／または目的とするポリペプチドが部分的にまたは実質的に精製された試料中にあるポリペプチドを含むことを意味する。ポリペプチドが天然に存在しない場合、「単離された」は、ポリペプチドが、合成手段または組換え手段のいずれかによって作製された環境から分離されたことを示す。
Ｋａｂａｔ番号付け：本明細書で使用される、「Ｋａｂａｔ番号付け」という用語は、当該技術分野で認識されており、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖領域における他のアミノ酸残基よりも可変的である（例えば、超可変である）アミノ酸残基を番号付けするシステムを指す（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２－９３（１９７１）、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２（１９９１））。本開示の目的のために、抗体の可変領域におけるＣＤＲの配置は、Ｋａｂａｔ番号付け、または単に「Ｋａｂａｔ」に従う。
リガンド：本明細書で使用される場合、リガンドという用語は、それが結合する生体分子の活性に変化をもたらすように、生体分子に結合し、それと複合体を形成する分子を指す。一実施形態において、「リガンド」という用語は、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る、分子またはその複合体を指す。「リガンド」は、天然および合成のリガンド、例えば、サイトカイン、サイトカインバリアント、類似体、変異タンパク質、および抗体に由来する結合組成物を包含する。「リガンド」はまた、小分子、サイトカインのペプチド模倣体、および抗体のペプチド模倣物を包含する。リガンドという用語はまた、アゴニストでもアンタゴニストでもないが、受容体がその生物学的活性（例えば、シグナル伝達、触媒作用、または接着）を保持する（またはその活性の増強を示す）ことを可能にしつつ、受容体に結合することができる分子を包含する。さらに、この用語は、例えば、化学法または組換え法によって、膜結合リガンドの可溶性バージョンに変換される膜結合リガンドを含む。リガンドまたは受容体は、完全に細胞内にあってもよく、すなわち、それは、サイトゾル、核、またはいくつかの他の細胞内コンパートメントに存在することができる。リガンドおよび受容体の複合体は、「リガンド－受容体複合体」と称される。
転移：本明細書で使用される場合、「転移」という用語は、原発腫瘍から周辺組織および対象の遠隔臓器への癌細胞の蔓延を記載する。
修飾ポリペプチド剤：「修飾ポリペプチド剤」という用語は、ペグ化グリコシル化（Ｎ結合およびＯ結合）；ポリシアリル化；血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含むアルブミン融合分子；例えば、共役脂肪酸鎖を通したアルブミン結合（アシル化）；ならびにＦｃ融合タンパク質などの１つ以上の修飾によって修飾されたポリペプチドである。修飾ＩＬ－１０剤は、１つ以上の特性、例えば、免疫原性の調節；水溶性、生体利用能、血清半減期および／もしくは治療半減期を増大させる方法；ならびに／または生物学的活性の調節を増強するために調製することができる。ある特定の修飾はまた、免疫原性を増強するために、例えば、検出アッセイで使用するための抗体（例えば、ジフテリアまたはテタンタス毒素およびそれらの断片およびトキソイド、エピトープタグなどの免疫原性担体分子）を生じさせるため、および／または精製（例えば、ポリヒスチジル配列などの遷移金属イオンキレートペプチド配列）を促進するために有用であり得る。本発明の実施に有用な修飾ポリペプチド剤の例には、修飾ポリペプチドＩＬ－１０剤、修飾ポリペプチドＩＬ－１２剤、修飾ポリペプチドＩＬ－７剤、修飾ポリペプチドＩＬ－１５剤、修飾ポリペプチドＩＬ－２剤、および修飾ポリペプチドＩＬ－１８剤が含まれるが、これらに限定されない。
調節する：本明細書で使用される場合、「調節する」および「調節」などの用語は、薬剤が生物系を含む系または生化学的経路において、正もしくは負、または直接的もしくは間接的に応答をもたらす能力を指す。調節剤という用語は、アゴニストおよびアンタゴニストの両方を含む。
腫瘍性疾患：本明細書で使用される場合、「腫瘍性疾患」という用語は、細胞の過剰増殖または制御されない（もしくは制御不全の）細胞複製から生じる、対象における障害または病態を指す。腫瘍性疾患という用語は、対象における腫瘍の存在から生じる障害を指す。腫瘍は、（１）良性、（２）前悪性（または「前癌性」）、または（３）悪性（または「癌性」）として分類することができる。「腫瘍性疾患」という用語は、腫瘍性疾患に直接的または間接的に関連する病態を指す、腫瘍性関連疾患、障害、および病態を含み、例えば、血管新生および前癌性病態（異形成など）を含む。
Ｎ末端：ポリペプチドの構造との関連において本明細書で使用される場合、「Ｎ末端」（または「アミノ末端」）および「Ｃ末端」（または「カルボキシ末端」）は、それぞれ、ポリペプチドのアミノ極端およびカルボキシル極端を指し、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」という用語は、それぞれ、Ｎ末端およびＣ末端に対するポリペプチドのアミノ酸配列の相対位置を指し、それぞれ、Ｎ末端およびＣ末端で残基を含み得る。「最Ｎ末端の」または「最Ｃ末端の」は、第１および第２のアミノ酸残基が共有結合して、近接するアミノ酸配列を提供する、第２のアミノ酸残基に対する第１のアミノ酸残基の位置を指す。
核酸：「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」などの用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体を指すために本明細書では互換的に使用される。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、線状および環状の核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、およびプライマーなどが含まれる。
癌遺伝子中毒：本明細書で使用される場合、「癌遺伝子中毒」という用語は、癌細胞の生存が、変異した癌遺伝子の継続的な活性に依存する現象を指す。
パッセンジャー変異：本明細書で使用される場合、「パッセンジャー変異（複数可）」という用語は、変異速度の増加の結果として腫瘍の発生中に生じるが、腫瘍の成長には寄与しない変異（複数可）を指す。
ＰＤ－１：本明細書で使用される場合、「ＰＤ－１」（または「ＰＤ１」）という用語は、以下のアミノ酸配列を有する２８８アミノ酸のポリペプチドを指す：
ＭＱＩＰＱＡＰＷＰＶ ＶＷＡＶＬＱＬＧＷＲ ＰＧＷＦＬＤＳＰＤＲ ＰＷＮＰＰＴＦＳＰＡ ＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡ ＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳ ＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭ ＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡ ＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧ ＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬ ＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶ ＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴ ＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰ ＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡ ＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥ ＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰ ＲＰＡＧＱＦＱＴＬＶ ＶＧＶＶＧＧＬＬＧＳ ＬＶＬＬＶＷＶＬＡＶ ＩＣＳＲＡＡＲＧＴＩ ＧＡＲＲＴＧＱＰＬＫ ＥＤＰＳＡＶＰＶＦＳ ＶＤＹＧＥＬＤＦＱＷ ＲＥＫＴＰＥＰＰＶＰ ＣＶＰＥＱＴＥＹＡＴ ＩＶＦＰＳＧＭＧＴＳ ＳＰＡＲＲＧＳＡＤＧ ＰＲＳＡＱＰＬＲＰＥ ＤＧＨＣＳＷＰＬ（配列番号５８）
ＰＤ－１のアミノ酸残基の番号付けは、配列番号５８に示される完全長ポリペプチドを指す。配列番号５８のアミノ酸１～２０は、翻訳処理中に除去され、配列番号５８のアミノ酸２１～２８８を含む「成熟ＰＤ１」分子をもたらす、シグナル配列を定義する。配列番号５８のアミノ酸１７１～１９１は、膜貫通ドメインを定義し、残基１９２～２８８は、細胞質ドメインを定義する。ＰＤ－１という用語には、２１５位でアラニンがバリンに置換された天然に存在するバリアントを含む天然に存在するバリアントが含まれる。アミノ酸２１～１７０は、以下のアミノ酸配列を有するＰＤ－１の１５０アミノ酸の細胞外ドメインを定義する。
ＰＧＷＦＬＤＳＰＤＲ ＰＷＮＰＰＴＦＳＰＡ ＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡ ＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳ ＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭ ＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡ ＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧ ＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬ ＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶ ＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴ ＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰ ＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡ ＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥ ＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰ ＲＰＡＧＱＦＱＴＬＶ（配列番号５９）
細胞外ドメインは、残基４９、５８、７４、および１１６に４つのグリコシル化部位を有し、残基５４と１２３の間にジスルフィド結合が存在する。
ＰＤ１受容体（複数可）：本明細書で使用される場合、ＰＤ１受容体という用語は、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１（以下「ＰＤ－Ｌ１」）およびＢ７－ＤＣ／ＰＤ－Ｌ２以下「ＰＤ－Ｌ２」）からなる群のいずれかを指す。
ＰＥＧ－ＩＬ１０：ポリエチレングリコール分子との共有結合修飾によって修飾された修飾ＩＬ－１０剤を指す。「ＰＥＧ－ＩＬ－１０剤」という用語は、ＩＬ－１０ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合（共役）した少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含む修飾ＩＬ－１０剤を指す。「モノペグ化ＩＬ－１０剤」および「モノ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０剤」という用語は、一般にリンカーを介して、ＩＬ－１０二量体の１つのＩＬ－１０ポリペプチド上の単一のアミノ酸残基に共有結合したポリエチレングリコール分子を有するＩＬ－１０剤を指す。本明細書で使用される場合、「ジペグ化ＩＬ－１０」および「ジ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０」という用語は、少なくとも１つのポリエチレングリコール分子が、一般にリンカーを介して、ＩＬ－１０二量体のＩＬ－１０ポリペプチド上の単一の残基に結合していることを示す。
ポリペプチド：本明細書で互換的に使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、遺伝子的にコードされたおよび遺伝子的にコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたポリペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。ポリペプチドという用語は、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体）、異種および同種のリーダー配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端のメチオニン残基を有するかまたは有しない融合タンパク質、免疫学的に標識されたタンパク質を有する融合タンパク質、免疫学的に活性なタンパク質の融合タンパク質（例えば、抗原性ジフテリアもしくは破傷風毒素断片）などを含むが、これらに限定されない、多数の機能的ドメインからなる隣接するポリマーアミノ酸配列を含む。
予防する：「予防する」、「予防すること」、および「予防」などの用語は、対象が（例えば、臨床症状の不在によって決定される）疾患、障害、もしくは病態などを発症する、または一般に特定の疾患、障害、もしくは病態を有する遺伝的、経験的、もしくは環境因子により影響を受けやすい対象の文脈において、それらの発症を遅延させるリスクを一時的もしくは永続的に予防、抑制、阻害、または低減するために、疾患、障害、病態、またはそれらの症状の発症前に、対象に対して開始される作用の過程を指す。場合によっては、「予防する」、「予防すること」、「予防」という用語はまた、疾患、障害、または病態の進行を遅らせること、またはより有害なもしくはあまり望ましくない状態への進行を遅らせることを指すために使用される。予防接種は、予防の一例である。
組換え：本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用して生成されたポリペプチドおよび核酸を指す。分子に関して、例えば、「組換えヒトＩＬ－１０」または「ｒｈＩＬ－１０」は、分子が形質転換された宿主細胞に発現する（および任意に分泌する）ように、分子（またはそのサブユニット）をコードする核酸配列で形質転換された宿主細胞などによって組換えＤＮＡ技術によって生成された分子を示すために使用される。組換えＤＮＡ技術のための技術およびプロトコルは、本発明が関係する当業者によく知られている。
応答：例えば、細胞、組織、臓器、または生物体の「応答」という用語は、生化学的または生理学的挙動、例えば、生物学的コンパートメント内の濃度、密度、接着、もしくは移動、遺伝子発現率、または分化の状態における変化を包含し、その変化が、活性化、刺激、もしくは処理、または遺伝子プログラミングなどの内部機構と相関する。ある特定の文脈において、「活性化」、「刺激」などの用語は、内部機構および外部または環境因子によって調節される細胞活性化を指し、「阻害」、「下方調節」などの用語は、逆の効果を指す。
小分子（複数可）：「小分子」という用語は、約１０ｋＤａ未満、約２ｋＤａ未満、または約１ｋＤａ未満の分子量を有する、化学化合物を指す。小分子には、無機分子、有機分子、無機構成成分を含有する有機分子、放射性原子を含有する分子、および合成分子が含まれるが、これらに限定されない。治療的には、最も大きな分子と比較して、小分子は、細胞透過性の向上、腸からの吸収の改善、免疫原性の低下、および特に高温での安定性の向上をもたらすことが観察されている。「小分子」という用語は、製薬分野の当業者によく理解されている用語である。
特異的に結合する：「特異的に結合する」という用語は、１つの分子が別の分子に結合する選択性または親和性の程度を指すために本明細書で使用される。結合対（例えば、リガンド／受容体、抗体／抗原、抗体／リガンド、抗体／受容体結合対）の文脈において、結合対の第１の分子が、試料中に存在する他の構成成分に有意な量で結合しない場合に、結合対の第１の分子は、結合対の第２の分子に特異的に結合すると言われる。第２の分子に対する第１の分子の親和性が、試料中に存在する他の構成成分に対する第１の分子の親和性よりも、少なくとも２倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも２０倍高い、または少なくとも１００倍高い場合に、結合対の第１の分子は、結合対の第２の分子に特異的に結合すると言われる。特定の実施形態において、結合対の第１の分子が抗体である場合、結合対の第２の分子に対する抗体の親和性が、例えば、スキャッチャード分析（Ｍｕｎｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．１９８０Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０－２３９）によって決定されるように、約１０９リットル／モルよりも高いか、あるいは約１０１０リットル／モルよりも高いか、約１０１１リットル／モルよりも高いか、約１０１２リットル／モルよりも高い場合に、抗体は、結合対の第２の分子（例えば、タンパク質、抗原、リガンド、または受容体）に特異的に結合する。特異的結合は、競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ、および／またはＫＩＮＥＸＡ（登録商標）アッセイを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の技術を使用して評価することができる。
対象：「患者」または「対象」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物を指すために互換的に使用される。哺乳動物対象の例には、スーパーファミリーＣｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｏｉｄｅａおよびＨｏｍｉｎｏｉｄｅａのメンバー、特にヒトを含むヒト科のメンバーが含まれるが、これらに限定されない。「対象」という用語はまた、イヌ科（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓを含む）、ネコ科（ネコ科およびネコ属の種、具体的には、特にイエネコ（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ）を含む）、ウマ科（特に、飼いならされたウマなどのウマ属の種を含む）、ならびにウシ科（ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）などのウシ族の種を含む）のメンバーも含まれる。
に罹患している：本明細書で使用される場合、「に罹患している」という用語は、決定が、Ｘ線、ＣＴスキャン、従来の研究室診断検査（例えば、血球数など）、ゲノムデータ、タンパク質発現データ、病状の免疫組織化学検査を含むが、これらに限定されない、疾患、障害、または病態の特定のために、当該分野で一般に受け入れられる入手可能な情報に基づいた対象に関して、ならびに対象が必要とするか、または治療から益を得るであろう、医師によって行われる、疾患に関して使用される。
実質的に純粋な：本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」という用語は、ある構成成分（例えば、ポリペプチド）が、組成物の総含有量の約５０％超および典型的には総ポリペプチド含有量の約６０％超を占めることを示す。より典型的には、「実質的に純粋な」は、全組成物の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはそれ以上が、目的の構成成分である、組成物を指す。いくつかの場合には、ポリペプチドは、組成物の全含有量の約９０％超、または約９５％超を構成することになる。
治療上有効な量：本明細書で使用される、「治療上有効な量」という語句は、単独であれ医薬組成物または治療レジメンの一部としてであれ、単回用量であれ一連の用量の一部としてであれ、対象に投与されたときに疾患、障害、または病態の任意の症状、側面、もしくは特徴に対して任意の検出可能なプラスの効果を有することが可能な量での、薬剤の対象への投与を指す。治療上有効量は、関連性のある生理学的効果を測定することによって確認することができ、それは、投薬レジメンおよび対象の病態の診断的分析などに関連して調整することができる。例として、投与後に生成される炎症性サイトカインの量の測定は、治療上有効な量が使用されたかどうかを示すことができる。薬剤の治療上有効な量の決定に寄与するものには、年齢、体重、性別、全身健康、ＥＣＯＧスコア、観察可能な生理学的パラメータなどの容易に識別可能な兆候が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、または加えて、臨床設定で一般的に評価される他のパラメータをモニタリングして、体温、心拍数、血液化学の正常化、血圧の正常化、コレステロール値の正常化、または疾患、障害、もしくは病態の任意の症状、側面、もしくは特徴、バイオマーカー（炎症性サイトカイン、ＩＦＮ－γ、グランザイムなど）、血清腫瘍マーカーの減少、固体腫瘍における反応評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）の改善、免疫関連応答基準（ｉｒＲＣ）の改善、生存期間の延長、無増悪生存率の延長期間、無増悪期間の延長、治療失敗までの期間の増加、無事象生存期間の延長期間、次の治療までの期間の延長、客観的奏効率の改善、奏効期間の改善、薬剤の投与に応答した対象の病態の改善を評価するために、現場の臨床医によって信頼される腫瘍負荷の減少、完全応答、部分応答、安定疾患などの治療上有効な量の薬剤が対象に投与されたかどうかを決定することができる。本明細書で使用される場合、標的病変に関する「完全応答（ＣＲ）」、「部分応答（ＰＲ）」、「安定疾患（ＳＤ）」、および「進行性疾患（ＰＤ）」という用語、ならびに非標的病変に関する「完全応答（ＣＲ）」、「不完全反応／安定疾患（ＳＤ）」、および進行性疾患（ＰＤ）という用語は、ＲＥＣＩＳＴ基準で定義されているとおりであると理解される。本明細書で使用される場合、「免疫関連完全応答（ｉｒＣＲ）」、「免疫関連部分応答（ｉｒＰＲ）」、「免疫関連進行性疾患（ｉｒＰＤ）」、および「免疫関連安定疾患（ｉｒＳＤ）」という用語は、免疫関連応答基準（ｉｒＲＣ）に従って定義されるとおりである。本明細書で使用される場合、「免疫関連応答基準（ｉｒＲＣ）」という用語は、Ｗｏｌｃｈｏｋ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ：Ｉｍｍｕｎｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１５（２３）：７４１２－７４２０に記載の免疫療法に対する応答の評価のためのシステムを指す。治療上有効な量は、投薬レジメンおよび／または対象の病態の評価、ならびに前述の因子の変動に関連して、対象の治療の過程にわたって調整することができる。一実施形態において、治療上有効な量は、単独で、または別の薬剤と併用して使用した場合に、哺乳動物対象への投与の過程で、不可逆的で深刻な有害事象をもたらさない薬剤の量である。
治療：「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、疾患、障害、もしくは病態、またはそれらの症状が診断された、観察された、および同様のことの後に開始される、対象が罹患した疾患、障害、もしくは病態の根本的な原因のうちの少なくとも１つ、または対象が罹患した疾患、障害、もしくは病態に関連する症状のうちの少なくとも１つを、一時的であれ永続的であれ、排除する、低減する、抑制する、軽減する、または寛解させるような行為の過程（ＩＬ－１０、ＣＡＲ－Ｔ細胞、またはそれらを含む医薬組成物を投与することなど）を指す。治療は、行為の過程が、対象における疾患の阻害をもたらす（例えば、疾患、障害、または病態の発症を阻止するか、またはそれに関連する１つ以上の症状を改善する）場合に、疾患に罹患している対象に関して取られる行動の過程を含む。
バリアント：本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、天然に存在するバリアントおよび天然に存在しないバリアントを包含する。天然に存在する変異体には、相同体（それぞれアミノ酸またはヌクレオチド配列が種ごとに異なるポリペプチドおよび核酸）、ならびに対立遺伝子変異体（それぞれアミノ酸またはヌクレオチド配列がある種において個体ごとに異なるポリペプチドおよび核酸）が含まれる。天然に存在しないバリアントには、それぞれ、アミノ酸またはヌクレオチド配列の変化を含むポリペプチドおよび核酸が含まれ、配列の変化は、人工的に導入され（例えば、変異タンパク質）、例えば、変化は、人間の介入（「人の手」）によって研究室で生成される。したがって、本明細書において「変異タンパク質」は、通常、単一または多数のアミノ酸置換を有し、部位特異的またはランダム突然変異誘発を受けたクローン化遺伝子、または完全に合成されたコード配列にしばしば由来する変異組換えタンパク質を広く指す。例示的なＩＬ－１０変異タンパク質は、２０１５年２月２日公開のＥａｔｏｎらの米国特許出願公開第Ｓ２０１５／００３８６７８Ａ１号、２００３年１０月２日公開のＨａｎｓｅｎらの米国特許出願公開第ＵＳ２０３／０１８６３８６Ａ１号、および２０１６年３月１０日公開のＶａｎ Ｖｌａｓｓｅｌａｅｒらの米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／００６８５８３Ａ１号に記載されている。本発明の実施に有用なポリペプチド類似体の例には、ＩＬ－１０ポリペプチドバリアント、ＩＬ－１２ポリペプチドバリアント、ＩＬ－７ポリペプチドバリアント、ＩＬ－１５ポリペプチドバリアント、ＩＬ－２ポリペプチドバリアント、およびＩＬ－１８ポリペプチドバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
Ｃ．ＩＬ－１０ポリペプチド：
ＩＬ－１０ポリペプチドという用語は、広く解釈されるべきであり、それには、例えば、相同体、バリアント（変異タンパク質を含む）、およびそれらの断片を含む、ヒトおよび非ヒトＩＬ－１０関連ポリペプチド、ならびに例えば、リーダー配列（例えば、シグナルペプチド）を有するＩＬ－１０ポリペプチド、ならびに前述のものの修飾バージョンが含まれる。さらなる特定の実施形態において、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０ポリペプチド（複数可）、およびＩＬ－１０剤（複数可）は、アゴニストである。
「ＩＬ１０ポリペプチド」という用語は、保存的アミノ酸置換を含むＩＬ－１０ポリペプチドを含む。「保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質中のアミノ酸（複数可）を、その側鎖と類似の酸性度、塩基性度、電荷、極性、またはサイズの側鎖を有するアミノ酸で置き換えることによって、タンパク質の活性を保存する置換を指す。保存的アミノ酸置換は、一般に、次の群（ａ）Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ；（ｂ）Ｒ、Ｋ；（ｃ）Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｗ、Ｒ；（ｄ）Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｓ；（ｅ）Ｑ、Ｎ；および／または（ｆ）Ｄ、Ｅ内のアミノ酸残基の置換を伴う。置換、挿入、または欠失のガイダンスは、異なるバリアントタンパク質または異なる種からのタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントに基づくことができる。したがって、任意の天然に存在するＩＬ－１０ポリペプチドに加えて、本開示は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の置換、挿入、または欠失を有するＩＬ－１０ポリペプチドを企図する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１０ポリペプチドは、２０、１０、または５個以下のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有し、置換は、通常、保存的アミノ酸置換である。
場合によっては、ＩＬ－１０ポリペプチドは、ペプチド結合以外の１つ以上の結合を含み、例えば、少なくとも２つの隣接するアミノ酸は、望ましくないタンパク質分解もしくは他の分解手段を低減または排除するように、および／または血清安定性を増加させるように、および／または構造的柔軟性を制限もしくは増加させるように、アミド結合以外の結合を介して接合され、ＩＬ－１０のバックボーン内の１つ以上のアミド結合は、置換されてもよい。ＩＬ－１０ポリペプチド中の１つ以上のアミド結合（－ＣＯ－ＮＨ－）は、－ＣＨ２ＮＨ－、－ＣＨ２Ｓ－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ＝ＣＨ－（シスおよびトランス）、－ＣＯＣＨ２－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＳＯ－などのアミド結合の同配体である結合で置き換えることができる。ＩＬ－１０中の１つ以上のアミド結合はまた、例えば、還元同配体偽ペプチド結合によって置き換えることもできる。Ｃｏｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４１：１８１－１８４を参照されたい。そのような置換およびそれらに影響を及ぼす方法は、当業者に既知である。
「ＩＬ１０ポリペプチド」という用語は、ａ）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、（Ｓ）－２－アミノ酪酸、（Ｓ）－シクロヘキシルアラニンまたは分岐、環状、および直鎖アルキル、アルケニル、またはアルキニル置換を含むＣ１－Ｃ１０炭素の脂肪族側鎖によって置換されている他の単純なα－アミノ酸を含む、アルキル置換疎水性アミノ酸の置換、ｂ）フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、スルホチロシン、ビフェニルアラニン、１－ナフチルアラニン、２－ナフチルアラニン、２－ベンゾチエニルアラニン、３－ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジン（上記に列挙した芳香族アミノ酸のアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨード）、または（Ｃ１－Ｃ４由来の）アルコキシ置換形態を含み、これらの例示となる例は、２－、３－、または４－アミノフェニルアラニン、２－、３－、または４－クロロフェニルアラニン、２－、３－、または４－メチルフェニルアラニン、２－、３－、または４－メトキシフェニルアラニン、５－アミノ－、５－クロロ－、５－メチル－、または５－メトキシトリプトファン、２’－、３’－、または４’－アミノアラニン、２’－、３’－、または４’－クロロアラニン、２、３、または４－ビフェニルアラニン、２’－、３’－、または４’－メチルアラニン、２－、３－、または４－ビフェニルアラニン、および２－または３－ピリジルアラニンである）を含む、芳香族置換疎水性アミノ酸の置換、ｃ）アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、２，３－ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニン（置換がヘテロ原子（α－窒素または遠位の窒素（複数可）など）上にあるかα－炭素（例えば、プロ－Ｒ位におけるもの）上にあるかに関わらず、前のアミノ酸の（Ｃ１－Ｃ１０分岐状、直鎖状、または環状由来の）アルキル、アルケニル、またはアリール置換誘導体を含む）を含む、塩基性側鎖を含有するアミノ酸の置換、が含まれるが、これらに限定されない、１つ以上のアミノ酸置換を含むＩＬ－１０ポリペプチドを含む。例示となる例として機能する化合物には、Ｎ－イプシロン－イソプロピル－リジン、３－（４－テトラヒドロピリジル）－グリシン、３－（４－テトラヒドロピリジル）－アラニン、Ｎ，Ｎ－ガンマ、ガンマ’－ジエチル－ホモアルギニンが挙げられる。α－メチル－アルギニン、α－メチル－２，３－ジアミノプロピオン酸、α－メチル－ヒスチジン、α－メチル－オルニチンなどの化合物もまた挙げられ、アルキル基は、α－炭素のプロ－Ｒ位を占める。アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族（ヘテロ芳香族基が、１つ以上の窒素、酸素、または硫黄原子を単独または組み合わせで有する場合）、カルボン酸、または多くの周知の活性化誘導体のいずれか（塩化物、活性エステル、活性アゾリド、および関連誘導体など）から形成されるアミド、ならびにリジン、オルニチン、または２，３－ジアミノプロピオン酸、ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、２，４－ジアミノプリオピオン酸、オルニチン、またはリジンのチロシン、アルキル、アリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールスルホンアミド、ならびにテトラゾール置換アルキルアミノ酸を含む、酸性アミノ酸の置換、ｅ）アスパラギン、グルタミン、およびアスパラギンまたはグルタミンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む、側鎖アミド残基の置換、ならびにｆ）セリン、スレオニン、ホモセリン、２，３－ジアミノプロピオン酸、およびセリンまたはスレオニンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む、ヒドロキシル含有アミノ酸の置換もまた挙げられる。
「ＩＬ１０ポリペプチド」という用語は、１つ以上の天然に存在する非遺伝的にコードされたＬ－アミノ酸、合成Ｌ－アミノ酸、またはアミノ酸のＤ－鏡像異性体を含むＩＬ－１０ポリペプチドを含む。例えば、ＩＬ－１０は、Ｄ－アミノ酸のみを含んでもよい。例えば、ＩＬ－１０ポリペプチドは、以下の残基、ヒドロキシプロリン、β－アラニン、ｏ－アミノ安息香酸、ｍ－アミノ安息香酸、ｐ－アミノ安息香酸、ｍ－アミノメチル安息香酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、α－アミノイソ酪酸、Ｎ－メチルグリシン（サルコシン）、オルニチン、シトルリン、ｔ－ブチルアラニン、ｔ－ブチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン３－ベンゾチエニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、２－フルオロフェニルアラニン、３－フルオロフェニルアラニン、４－フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、β－２－チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ－アセチルリジン、２，４－ジアミノ酪酸、ｒｈｏ－アミノフェニルアラニン、Ｎ－メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ε－アミノヘキサン酸、ω－アミノヘキサン酸、ω－アミノヘプタン酸、ω－アミノオクタン酸、ω－アミノデカン酸、ω－アミノテトラデカン酸、シクロヘキシルアラニン、α，γ－ジアミノ酪酸、α，β－ジアミノプロピオン酸、δ－アミノ吉草酸、および２，３－ジアミノ酪酸の１つ以上を含んでもよい。
「ＩＬ１０ポリペプチド」という用語は、ＩＬ－１０ポリペプチドがジスルフィド結合を介して別のポリペプチドに結合するのを促進するため、またはＩＬ－１０ポリペプチドの環化を提供するための、１つ以上の追加のシステイン残基またはシステイン類似体を含むＩＬ－１０ポリペプチドを含む。システインまたはシステイン類似体を導入する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第８，０６７，５３２号を参照されたい。
「ＩＬ１０ポリペプチド」という用語は、環化ポリペプチドを含む。環化結合は、架橋の導入を可能にする官能基を有するアミノ酸の任意の組み合わせを用いて（またはアミノ酸および－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－または－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ６Ｈ４－ＣＯ－を用いて）生成することができる。いくつかの例は、ジスルフィド、ジスルフィド模倣物（－（ＣＨ２）ｎ－カルバ架橋など）、チオアセタール、チオエーテル架橋（シスタチオニンまたはランチオニン）、ならびにエステルおよびエーテルを含有する架橋である。これらの例では、ｎは、任意の整数であり得るが、しばしば１０未満である。
「ＩＬ１０ポリペプチド」という用語は、例えば、Ｎ－アルキル（またはアリール）置換（ψ［ＣＯＮＲ］）、またはラクタムおよび他の環状構造を構築するための骨格架橋を含む、追加の修飾を含む。他の誘導体には、Ｃ末端ヒドロキシメチル誘導体、ｏ修飾誘導体（例えば、Ｃ末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル）、アルキルアミドおよびヒドラジドなどの置換アミドを含むＮ末端修飾誘導体が含まれる。
「ＩＬ１０ポリペプチド」という用語は、レトロインベルソ類似体を含む（例えば、Ｓｅｌａ ａｎｄ Ｚｉｓｍａｎ（１９９７）ＦＡＳＥＢＪ．１１：４４９を参照されたい）。レトロインベルソペプチド類似体は、アミノ酸配列の方向が逆転（レトロ）しており、例えば、Ｌ－アミノ酸ではなくＤ－アミノ酸を使用するなどして、その中の１つ以上のアミノ酸のキラリティー（Ｄ－またはＬ－）が逆位（インベルソ）である、線状ポリペプチドの異性体である。［例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３６８：７４４およびＢｒａｄｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３６８：６９２を参照されたい］。
「ＩＬ１０ポリペプチド」という用語は、「タンパク質形質導入ドメイン」（ＰＴＤ）を含むような修飾を含む。「タンパク質形質導入ドメイン」という用語は、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、または小胞膜の横断を促進する、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機もしくは無機分子を指す。別の分子に結合したＰＴＤは、分子による膜の横断（例えば、細胞外空間から細胞内空間への移動、またはサイトゾルからオルガネラ内への移動）を促進する。いくつかの実施形態において、ＰＴＤは、ＩＬ－１０ポリペプチドのアミノ末端に共有結合される一方で、他の実施形態において、ＰＴＤは、ＩＬ－１０ポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合される。例示的なタンパク質形質導入ドメインには、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを含むＨＩＶ－１ ＴＡＴの残基４７～５７に対応、配列番号１）、細胞内への進入を指向するのに十分ないくつかのアルギニン残基を含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０～５０個のアルギニン）、ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９－９６）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ５２（７）：１７３２－１７３７）、切断型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ２１：１２４８－１２５６）、ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：１３００３－１３００８）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号２）、トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号４）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５）が含まれるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤには、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号７）、３個のアルギニン残基～５０個のアルギニン残基のアルギニンホモポリマーが含まれるが、これらに限定されず、例示的なＰＴＤドメインのアミノ酸配列には、以下、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号８）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号９）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１０）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号１１）、およびＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号１２）のうちのいずれかが含まれるが、これらに限定されない。
ＩＬ－１０ポリペプチドのＣ末端にあるアミノ酸のカルボキシル基ＣＯＲ３は、遊離形態（Ｒ３＝ＯＨ）、または生理学的に許容されるアルカリもしくはアルカリ土類塩の形態（例えば、ナトリウム、カリウム、もしくはカルシウム塩）で存在することができる。カルボキシル基はまた、第一級、第二級、または第三級アルコール（例えば、メタノールなど）、分岐状または非分岐状Ｃ１－Ｃ６－アルキルアルコール（例えば、エチルアルコールまたはｔｅｒｔ－ブタノール）でエステル化されてもよい。カルボキシル基はまた、第一級または第二級アミン（アンモニアなど）、分岐状または非分岐状Ｃ１－Ｃ６アルキルアミンまたはＣ１－Ｃ６ジアルキルアミン（例えば、メチルアミンまたはジメチルアミン）でアミド化されてもよい。
ＩＬ－１０ポリペプチドのＮ末端にあるアミノ酸ＮＲ１Ｒ２のアミノ基は、遊離形態（Ｒ１＝ＨおよびＲ２＝Ｈ）、または生理学的に許容される塩の形態（例えば、塩化物もしくは酢酸塩）で存在することができる。アミノ基はまた、Ｒ１＝ＨおよびＲ２＝アセチル、トリフルオロアセチル、またはアダマンチルなどの酸でアセチル化されてもよい。アミノ基は、上記に提供されるもの（例えば、Ｆｍｏｃ、ベンジルオキシ－カルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、およびＡｌｌｏｃ）などの、ペプチド化学で従来使用されるアミノ保護基によって保護された形態で存在することができる。アミノ基は、Ｎ－アルキル化されてもよく、Ｒ１および／またはＲ２＝Ｃ１－Ｃ６アルキルまたはＣ２－Ｃ８アルケニルまたはＣ７－Ｃ９アラルキルである。アルキル残基は、直鎖状、分岐状、または環状（例えば、それぞれ、エチル、イソプロピル、およびシクロヘキシル）であり得る。
「ＩＬ１０ポリペプチド」という用語は、ＩＬ－１０ポリペプチドの活性断片を含む。「活性ＩＬ－１０ポリペプチド断片」という用語は、天然に存在するＩＬ－１０種に由来する近接するアミノ酸残基を含有する天然に存在するＩＬ－１０種の断片（例えば、部分配列）であり、別のＩＬ－１０ポリペプチドとともに二量体化することができる（そのような二量体は、ＩＬ－１０活性を有する）、ＩＬ－１０ポリペプチドを指す。ペプチドまたはポリペプチド部分配列の近接するアミノ酸残基の長さは、部分配列が由来する特定の天然に存在するアミノ酸配列に応じて変動する。一般に、ペプチドおよびポリペプチドは、約２０アミノ酸長～約４０アミノ酸長、約４０アミノ酸長～約６０アミノ酸長、約６０アミノ酸長～約８０アミノ酸長、約８０アミノ酸長～約１００アミノ酸長、約１００アミノ酸長～約１２０アミノ酸長、約１２０アミノ酸長～約１４０アミノ酸長、約１４０アミノ酸長～約１５０アミノ酸長、約１５０アミノ酸長～約１５５アミノ酸長、約１５５アミノ酸長～最大で完全長ペプチドまたはポリペプチドであり得る。「ＩＬ－１０ポリペプチドの活性断片」という用語は、成熟した（すなわち、シグナルペプチド配列を含まない）ＩＬ－１０ポリペプチドのＮ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３アミノ酸の欠失を含むＩＬ－１０ポリペプチドを含む。「ＩＬ－１０ポリペプチドの活性断片」という用語は、成熟した（すなわち、シグナルペプチド配列を含まない）ＩＬ－１０ポリペプチドのＣ末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３アミノ酸の欠失を含むＩＬ－１０ポリペプチドを含む。
加えて、ＩＬ－１０ポリペプチドは、定義された長さの近接するアミノ酸（例えば、「比較ウインドウ」）にわたって、参照配列と比較して、定義された配列同一性を有し得る。比較のための配列アラインメント方法は、当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局地的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似性検索法、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動アラインメントおよび目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）によって行うことができる。例えば、抗原断片、リーダー配列、タンパク質折り畳み、機能ドメイン、グリコシル化部位、および配列整列を決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが、利用可能である（例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＤｅＣｙｐｈｅｒ（商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ，ＮＶ）を参照されたい）。
一例として、好適なＩＬ－１０ポリペプチドは、約２０アミノ酸長～約４０アミノ酸長、約４０アミノ酸長～約６０アミノ酸長、約６０アミノ酸長～約８０アミノ酸長、約８０アミノ酸長～約１００アミノ酸長、約１００アミノ酸長～約１２０アミノ酸長、約１２０アミノ酸長～約１４０アミノ酸長、約１４０アミノ酸長～約１５０アミノ酸長、約１５０アミノ酸長～約１５５アミノ酸長、約１５５アミノ酸長～最大で完全長ペプチドまたはポリペプチドの近接する区間と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
以下でさらに考察されるように、ＩＬ－１０ポリペプチドは、天然源（例えば、それが天然に存在する環境以外の環境）から単離することができ、組換えにより（例えば、細菌、酵母、Ｐｉｃｈｉａ、および昆虫細胞などの遺伝子組換え宿主細胞内で）作製することもでき、遺伝子組換え宿主細胞は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で修飾される。ＩＬ－１０ポリペプチドはまた、合成により（例えば、無細胞化学合成によって）生成することもできる。
本開示は、オルソログを含む様々な哺乳動物源および非哺乳動物源から得られるＩＬ－１０ポリペプチド、ならびにそれらの修飾形態で構成される、ＩＬ－１０剤を企図する。ヒトポリペプチドおよびそれらをコードする核酸分子に加えて、本開示は、マウス、ラット（受託ＮＰ＿０３６９８６．２、ＧＩ１４８７４７３８２）、ウシ（受託ＮＰ＿７７６５１３．１、ＧＩ４１３８６７７２）、ヒツジ（受託ＮＰ＿００１００９３２７．１、ＧＩ５７１６４３４７）、イヌ（受託ＡＢＹ８６６１９．１、ＧＩ１６６２４４５９８）、およびウサギ（受託ＡＡＣ２３８３９．１、ＧＩ３２４２８９６）を含む他の種に由来する、ＩＬ－１０ポリペプチドおよび対応する核酸分子を企図する。非哺乳動物源に由来するＩＬ－１０剤の例には、ヘルペスウイルス科ベータヘルペスウイルス亜科、ヒトサイトメガロウイルスを含むサイトメガロウイルス属（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＲ３１６５６およびＡＣＲ４９２１７）、ミドリザルサイトメガロウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＥＶ８０４５９）、アカゲザルサイトメガロウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＦ５９９０７）、ヒヒサイトメガロウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＦ６３４３６）、ヨザルサイトメガロウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＥＶ８０８００）、およびリスザルサイトメガロウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＥＶ８０９５５）；ガンマヘルペスウイルス科リンホクリプトウイルス属エプスタイン・バーウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＤ５３３８５）、ボノボヘルペスウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＰ＿００３８０４２０６．１）、アカゲザルリンホクリプトウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＫ９５４１２）、ヒヒリンホクリプトウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＦ２３９４９）；ヒツジヘルペスウイルス２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＸ５８０４０）を含むマカウイルス属；ウマヘルペスウイルス２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ１３８５７）を含むペルカウイルス属；コイヘルペスウイルス３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＧ４２９６１０）、ウナギヘルペスウイルス１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦＫ２５３２１）を含むアロヘルペスウイルス科コイヘルペスウイルス属；羊鵞口瘡ウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＲ９８３５２）、ウシ丘疹性口内炎ウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＲ９８４８３）、偽牛痘ウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＤＣ５３７７０）を含むポックスウイルス科コードポックスウイルス（ｃｈｏｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ）亜科；ランピースキン病ウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＫ８４９６６）、羊痘ウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿６５９５７９）、山羊痘ウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＹＰ＿００１２９３１９）を含むカプリポックスウイルス属；ならびにカナリアポックスウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿９５５０４１）を含むトリポックスウイルスに由来するウイルスＩＬ－１０が含まれる。
一実施形態において、ＩＬ－１０ポリペプチドは、ヒトＩＬ－１０ポリペプチドである。本明細書で使用される場合、「ヒトＩＬ－１０」または「ｈＩＬ１０」という用語は、２つのヒトｉＩＬ－１０ポリペプチドで構成されるＩＬ１０剤を指す。一実施形態において、ヒトＩＬ－１０ポリペプチドは、（アミノ末端からカルボキシ末端へ）以下のアミノ酸配列を有する１６０アミノ酸ポリペプチドである。
ＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮ ＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰ ＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦ ＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫ ＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥ ＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬ ＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱ ＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡ ＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨ ＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴ ＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲ ＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡ ＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫ ＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭ ＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩ ＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ（配列番号１３）
一実施形態において、ヒトＩＬ－１０ポリペプチドは、（アミノ末端からカルボキシ末端へ）以下のアミノ酸配列を有する１６１アミノ酸ポリペプチドである。
ＭＳＰＧＱＧＴＱＳＥ ＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬ ＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡ ＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭ ＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫ ＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹ ＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩ ＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱ ＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡ ＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫ ＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨ ＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫ ＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮ ＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡ ＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹ ＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲ Ｎ（配列番号１４）
一実施形態において、ヒトＩＬ－１０ポリペプチドは、（アミノ末端からカルボキシ末端へ）以下のアミノ酸配列を有する１６１アミノ酸ポリペプチドである。
Ｎ－ホルミル－ＭＳＰＧＱＧＴＱＳＥ ＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬ ＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡ ＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭ ＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫ ＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹ ＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩ ＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱ ＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡ ＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫ ＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨ ＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫ ＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮ ＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡ ＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹ ＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲ Ｎ（配列番号１５）
本開示のポリペプチドおよび核酸分子に関連するいかなる「ヒト」への言及も、ポリペプチドもしくは核酸が得られる様式または源に関して限定的であることは意図されず、むしろ配列（それは、天然に存在するヒトポリペプチドまたは核酸分子の配列に対応し得るため）に言及するに過ぎないことに留意されたい。
Ｄ．ＩＬ－１０活性：
「ＩＬ－１０活性」という用語は、ＩＬ－１０剤が、典型的には、ＩＬ－１０受容体に結合することによってそれらの効果を発揮することを指す。ＩＩ型サイトカイン受容体であるＩＬ－１０受容体は、それぞれＲ１およびＲ２とも称される、アルファおよびベータサブユニットからなる。受容体の活性化には、アルファおよびベータの両方への結合が必要とされる。二量体ＩＬ－１０の一方のＩＬ－１０単量体は、アルファに結合し、ＩＬ－１０の他方のＩＬ－１０単量体は、ベータに結合する。ＩＬ－１０活性は、当該技術分野で周知のアッセイによって評価することができる。例えば、ＩＬ－１０剤のＩＬ－１０活性は、ＴＮＦ－α阻害アッセイ、ＭＣ９増殖アッセイ、ＣＤ８ Ｔ細胞ＩＦＮγ分泌アッセイを使用して、または以下に提供される腫瘍モデルおよび腫瘍分析において決定することができる。しかしながら、以下のアッセイは、ＩＬ－１０活性を決定するためのアッセイの代表的なものであり、排他的なものではないことが当業者に理解される。当業者は、ＩＬ－１０活性を測定するための任意の当該技術分野で認識されているアッセイまたは方法論を単独または組み合わせで使用して、本明細書に記載のＩＬ－１０剤の活性を評価することができることを理解する。
ＩＬ－１０剤のＩＬ－１０活性は、実質的に以下のＴＮＦα阻害アッセイに従って評価することができる。簡潔には、Ｕ９３７細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（番号８５０１１４４０）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能な肺由来のリンパ芽球ヒト細胞株）のＰＭＡ刺激が、細胞にＴＮＦαを分泌させ、その後これらのＴＮＦα分泌細胞を、ＩＬ－１０活性を有する試験剤で処理することにより、用量依存的な様式でＴＮＦα分泌の低下がもたらされる。例示的なＴＮＦα阻害アッセイは、以下のプロトコルを使用して実行することができる。１０％のＦＢＳ／ＦＣＳおよび抗生物質を含有するＲＭＰＩ中でＵ９３７細胞を培養した後、９６ウェルの平底プレート（任意のプラズマ処理された組織培養プレート（例えば、Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用することができる）に、１つの条件当たり三連で、１×１０５個、９０％の生存Ｕ９３７細胞を播種する。細胞を播種して、以下の条件（すべて少なくとも三連、「培地単独」については、２分の１が１０ｎＭのＰＭＡとのインキュベーション後の生存に使用されるため、ウェルの数は倍になる）を提供する：５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ単独；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋０．１ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１０００ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋０．１ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ－ｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ－ｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１０ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ－ｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ－ｒｈＩＬ－１０；および５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１０００ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ－ｒｈＩＬ－１０。各ウェルを２００μＬ中１０ｎＭのＰＭＡに２４時間曝露し、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター内で培養した後、細胞の約９０％が接着性であるはずである。３つの余分なウェルを再懸濁し、細胞を計数して、生存率を評価する（９０％超が生存可能である必要がある）。新鮮な非ＰＭＡ含有培地で穏やかに、しかし完全に３回洗浄し、細胞がウェル内に残ることを確実にする。１ウェル当たり１００μＬの適切な濃度のＩＬ－１０剤を含有する培地を添加し（体積が１００％だけ希釈されるため、２倍になる）、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター内で３０分間インキュベートする。１ウェル当たり１００μＬの１０ｎｇ／ｍＬのストックＬＰＳを添加して、各ウェル内で５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳの最終濃度を達成し、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター内で１８～２４時間インキュベートする。上清を除去し、製造業者の取扱説明書に従ってＴＮＦαＥＬＩＳＡを実行する。各条件付けされた上清を、ＥＬＩＳＡ内、二連で実行する。
ＩＬ－１０剤のＩＬ－１０活性は、実質的に以下のＭＣ／９細胞増殖アッセイに従って評価することができる。簡潔には、ＭＣ／９細胞に対するＩＬ－１０活性を有する化合物の投与は、用量依存的な様式で細胞増殖の増加を引き起こす。ＭＣ／９は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡから入手可能な肥満細胞の特徴を有するマウス細胞株である。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－Ｓｎｉｐｅｓ，Ｌ．ら（（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：５０７－１０）は、ＭＣ／９細胞にＩＬ３＋ＩＬ１０およびＩＬ３＋ＩＬ４＋ＩＬ１０を補った標準的なアッセイプロトコルについて記載している。当業者であれば、細胞にＩＬ－１０のみを補うように、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－Ｓｎｉｐｅｓ，Ｌ．らに記載の標準的なアッセイプロトコルを変更することができる。
ＩＬ－１０剤のＩＬ－１０活性は、実質的に以下のＣＤ８ Ｔ細胞ＩＦＮγ分泌アッセイに従って評価することができる。簡潔には、活性化初代ヒトＣＤ８ Ｔ細胞は、ＩＬ－１０活性を有する化合物で処理し、その後抗ＣＤ３抗体で処理したときに、ＩＦＮγを分泌する。以下のプロトコルは、例示的なＣＤ８ Ｔ細胞ＩＦＮγ分泌アッセイを提供する。ヒト初代末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、任意の標準的なプロトコルに従って単離することができる（例えば、Ｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ７．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹを参照されたい）。２．５ｍＬのＰＢＭＣ（１０００万個の細胞／ｍＬの細胞密度）は、任意の標準的な組織培養処理された６ウェルプレート（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）内、ＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、およびペニシリン／ストレプトマイシンカクテル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する完全ＲＰＭＩとともに、ウェルごとに培養することができる。その後、ＩＬ－１０剤を、１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度でウェルに添加し、阻害性受容体／チェックポイント受容体の機能を遮断する、１０μｇ／ｍＬの最終濃度の抗体もまた、ＩＬ－１０剤と併用して添加してもよい。細胞を、５％のＣＯ２を有する３７℃の加湿インキュベーター内で６～７日間培養することができる。インキュベーション後、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＭＡＣＳ細胞分離技術を、製造業者の取扱説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に実質的に従って使用して、ＣＤ８ Ｔ細胞を単離する。その後、単離したＣＤ８ Ｔ細胞を、任意の標準的な組織培養プレート内、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含有する完全ＲＰＭＩとともに、４時間培養することができる。４時間のインキュベーション後、培地を収集し、製造業者の取扱説明書に実質的に従って、市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、ＩＦＮγについてアッセイする。
腫瘍モデルはまた、様々な腫瘍に対するＩＬ－１０剤の活性の評価にも使用することができる。本明細書以下に記載の腫瘍モデルおよび腫瘍分析は、利用可能な腫瘍モデルおよび腫瘍分析の代表的なものである。同系マウス腫瘍細胞を、１回の腫瘍接種当たり１０４、１０５、または１０６個の細胞で、皮下または皮内注射する。Ｅｐ２乳癌、ＣＴ２６結腸癌、ＰＤＶ６皮膚の扁平上皮癌、および４Ｔ１乳癌モデルを使用することができる（例えば、Ｌａｎｇｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ４４２：４６１－４６５を参照されたい）。免疫適格性Ｂａｌｂ／ＣまたはＢ細胞欠損Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用することができる。マウスＩＬ－１０種に基づくＩＬ－１０剤を、免疫適格性マウスに投与することができ、ヒトＩＬ－１０または他の非マウス種処理に基づくＩＬ－１０剤を、典型的には、Ｂ細胞欠損マウスに提供する。腫瘍成長は、典型的には、電子ノギスを使用して、１週間に２回監視する。腫瘍体積は、式（幅２×長さ／２）を使用して計算することができ、式中、長さは、より長い方の寸法である。ＩＬ－１０試験剤の投与前に、腫瘍を、９０～２５０ｍｍ３のサイズに到達させる。ＩＬ－１０剤または緩衝液対照を、腫瘍移植から離れた部位に投与する。ＩＬ－１０試験剤の投与後の腫瘍成長を、典型的には、上記の電子ノギスを使用して、１週間に２回監視し、ＩＬ－１０試験剤の投与に応答した腫瘍体積に対する効果を、経時的に評価する。腫瘍組織およびリンパ器官を、様々なエンドポイントで採取して、いくつかの炎症マーカーのｍＲＮＡ発現を測定し、いくつかの炎症細胞マーカーの免疫組織化学を実行する。組織を、液体窒素中で急速冷凍し、－８０℃で保管する。
Ｅ．ＩＬ－１０ポリペプチドの入手
ＩＬ－１０ポリペプチドは、天然源（例えば、それが天然に存在する環境以外の環境）から単離することができ、組換えにより（例えば、細菌、酵母、Ｐｉｃｈｉａ、および昆虫細胞などの遺伝子組換え宿主細胞内で）作製することもでき、遺伝子組換え宿主細胞は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で修飾されている。ＩＬ－１０ポリペプチドはまた、合成により（例えば、無細胞または固相化学合成によって）生成することもできる。
ＩＬ－１０ポリペプチドが、化学的に合成される場合、合成は、液相または固相を介して進行することができる。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、非天然アミノ酸および／またはペプチド／タンパク質の骨格修飾の組み込みを可能にする。本開示のポリペプチドの合成には、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）などのＳＰＰＳの様々な形態が利用可能である。化学合成の詳細は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｇａｎｅｓａｎ Ａ．（２００６）Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：３－１０、およびＣａｍａｒｅｒｏ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３－８）。
固相ペプチド合成は、本明細書以下に記載のように実行することができる。アルファ機能（Ｎα）および反応性側鎖は、酸に不安定な基または塩基に不安定な基で保護されている。保護基は、アミド結合の連結のための条件下では安定しているが、形成されたペプチド鎖を傷害することなく容易に切断することができる。α－アミノ機能に好適な保護基には、以下、Ｂｏｃ、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、Ｏ－クロルベンジルオキシカルボニル、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ－アミルオキシカルボニル（Ａｍｏｃ）、α，α－ジメチル－３，５－ジメトキシ－ベンジルオキシカルボニル、ｏ－ニトロスルフェニル、２－シアノ－ｔ－ブトキシ－カルボニル、Ｆｍｏｃ、および１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）エチル（Ｄｄｅ）などが含まれるが、これらに限定されない。
好適な側鎖保護基には、アセチル、アリル（Ａｌｌ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｏ－ブロモベンジルオキシカルボニル、ｔ－ブチル（ｔＢｕ）、ｔ－ブチルジメチルシリル、２－クロロベンジル、２－クロロベンジルオキシカルボニル、２，６－ジクロロベンジル、シクロヘキシル、シクロペンチル、１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキサ－１－イリデン）エチル（Ｄｄｅ）、イソプロピル、４－メトキシ－２，３－６－トリメチルベンジルスルホニル（Ｍｔｒ）、２，３，５，７，８－ペンタメチルクロマン－６－スルホニル（Ｐｍｃ）、ピバリル、テトラヒドロピラン－２－イル、トシル（Ｔｏｓ）、２，４，６－トリメトキシベンジル、トリメチルシリル、およびトリチル（Ｔｒｔ）が含まれるが、これらに限定されない。
固相合成では、Ｃ末端アミノ酸は、好適な支持材料にカップリングする。好適な支持材料は、合成プロセスの段階的な縮合および切断反応のための試薬および反応条件に対して不活性であり、かつ使用される反応培地中に溶解しないものである。市販の支持材料の例には、反応性基および／またはポリエチレングリコールで修飾されたスチレン／ジビニルベンゼン共重合体、クロロメチル化スチレン／ジビニルベンゼン共重合体、ならびにヒドロキシメチル化またはアミノメチル化スチレン／ジビニルベンゼン共重合体などが含まれる。ペプチド酸の調製が所望される場合、ポリスチレン（１％）－ジビニルベンゼン、または４－ベンジルオキシベンジル－アルコール（Ｗａｎｇアンカー）または２－クロロトリチルクロリドで誘導体化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）を使用することができる。ペプチドアミドの場合、ポリスチレン（１％）－ジビニルベンゼン、または５－（４’－アミノメチル）－３’，５’－ジメトキシフェノキシ）吉草酸（ＰＡＬアンカー）またはｐ－（２，４）－ジメトキシフェニル－アミノメチル）－フェノキシ基（Ｒｉｎｋアミドアンカー）で誘導体化されたＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）を使用することができる。
重合体支持体への結合は、エタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ－メチルピロリドン、または類似の溶媒中の活性化試薬を添加することによって、室温または高温（例えば、４０℃～６０℃）および例えば、２～７２時間の反応時間で、Ｃ末端Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を支持材料と反応させることによって達成することができる。
Ｎα保護アミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃアミノ酸）の、ＰＡＬ、Ｗａｎｇ、またはＲｉｎｋアンカーへのカップリングは、例えば、Ｎ、Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）または他のカルボジイミド、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）または他のウロニウム塩、Ｏ－アシル－ウレア、ベンゾトリアゾール－１－イル－トリス－ピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）または他のホスホニウム塩、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、他のＮ－ヒドロキシイミドまたはオキシムなどのカップリング試薬の助けを借りて、１－ヒドロキシベンゾトリアゾールまたは１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾールの存在下または不在下で、例えば、ＨＯＢｔを添加したＴＢＴＵの助けを借りて、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリエチルアミン、またはＮ－メチルモルホリンなどの塩基を添加するかまたは添加せずに、例えば、ジイソプロピルエチルアミンで２～７２時間の反応時間で（例えば、１．５～３倍過剰のアミノ酸およびカップリング試薬中で３時間、例えば、２倍過剰および約１０℃～５０℃の温度で、例えば、ジメチルホルムアミド、Ｎ－メチルピロリドン、またはジクロロメタンなどの溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド）中２５℃で）実行することができる。
カップリング試薬の代わりに、活性エステル（例えば、ペンタフルオロフェニルまたはｐ－ニトロフェニルなど）、Ｎα－Ｆｍｏｃ－アミノ酸の対称無水物、その酸塩化物または酸フッ化物を、上述の条件下で使用することもまた可能である。
Ｎα保護アミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃアミノ酸）は、１０～１２０分間、例えば、２０分間の反応時間を有して、ＤＩＥＡを添加したジクロロメタン中の２－クロロトリチル樹脂にカップリングすることができるが、この溶媒およびこの塩基の使用には限定されない。
保護アミノ酸の連続的なカップリングは、ペプチド合成における従来の方法に従って、典型的には、自動化ペプチド合成機内で実行することができる。例えば、ジメチルホルムアミド中のピペリジン（１０％～５０％）で５～２０分間、例えば、ＤＭＦ中５０％のピペリジンで、２×２分間、ＤＭＦ中２０％のピペリジンで、１×１５分間処理することによって、固相にカップリングしたアミノ酸のＮα－Ｆｍｏｃ保護基を切断した後、３～１０倍過剰、例えば、１０倍過剰の次の保護アミノ酸を、ジクロロメタン、ＤＭＦ、またはその２つの混合物などの不活性、非水性極性溶媒中、および約１０℃～５０℃の温度、例えば、２５℃で、前のアミノ酸にカップリングする。第１のＮα－Ｆｍｏｃアミノ酸を、ＰＡＬ、Ｗａｎｇ、またはＲｉｎｋアンカーにカップリングするための前述の試薬が、カップリング試薬として好適である。保護アミノ酸の活性エステル、またはその塩化物もしくはフッ化物もしくは対称無水物もまた、代替物として使用することができる。
固相合成の終了時に、側鎖保護基を同時に切断しながら、ペプチドを支持材料から切断する。切断は、５～２０％Ｖ／Ｖのスカベンジャー（ジメチルスルフィド、エチルメチルスルフィド、チオアニソール、チオクレゾール、ｍ－クレゾール、アニソールエタンジチオール、フェノール、または水、例えば、１５％ｖ／ｖのジメチルスルフィド／エタンジチオール／ｍ－クレゾール１：１：１）を添加したトリフルオロ酢酸または他の強酸性培地を用いて、０．５～３時間以内、例えば、２時間、実行することができる。２－クロロトリチルアンカーを氷酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン２：２：６で切断することによって、側鎖が完全に保護されたペプチドが得られる。保護ペプチドを、シリカゲルでのクロマトグラフィーで精製してもよい。ペプチドが、Ｗａｎｇアンカーを介して固相に結合している場合、およびＣ末端がアルキルアミド化したペプチドを得ることが意図される場合は、切断は、アルキルアミンまたはフルオロアルキルアミンを用いたアミノ分解によって実行することができる。アミノ分解は、約－１０℃～５０℃（例えば、約２５℃）の温度で、および約１２～２４時間（例えば、約１８時間）の反応時間で実行される。加えて、ペプチドは、例えば、メタノールでの再エステル化によって支持体から切断することができる。
得られた酸性溶液を、３～２０倍量の冷エーテルまたはｎ－ヘキサン、例えば、１０倍過剰のジエチルエーテルと混合して、ペプチドを沈殿させることで、エーテル中に残るスカベンジャーおよび切断された保護基を分離することができる。氷酢酸からペプチドを数回再沈殿させることによって、さらなる精製を実行することができる。得られた沈殿物は、水もしくはｔｅｒｔ－ブタノール、または２つの溶媒の混合物中、例えば、１：１でｔｅｒｔ－ブタノール／水の混合物中に取り込み、凍結乾燥することができる。
得られたペプチドは、アセテート形態の弱塩基性樹脂でのイオン交換；非誘導体化ポリスチレン／ジビニルベンゼン共重合体（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ）での疎水性吸着クロマトグラフィー；シリカゲルでの吸着クロマトグラフィー；例えば、カルボキシメチルセルロースでのイオン交換クロマトグラフィー；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ－２５での分配クロマトグラフィー；向流分配クロマトグラフィー；または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、例えば、オクチルもしくはオクタデシルシリルシリカ（ＯＤＳ）相での逆相ＨＰＬＣを含む、様々なクロマトグラフィー法で精製することができる。
ヒトおよびマウスＩＬ－１０の調製について記載する方法は、例えば、組換え技術および他の合成技術を含む、ＩＬ－１０活性を有するタンパク質の産生のための方法を教示する、米国特許第５，２３１，０１２号に見出すことができる。ＩＬ－１０は、ウイルス起源のものであってもよく、エプスタイン・バーウイルス（ＢＣＲＦ１タンパク質）からのウイルスＩＬ－１０のクローニングおよび発現は、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４８：１２３０に開示されている。ＩＬ－１０は、本明細書に記載のものなどの、当該技術分野で既知の標準的な技術を使用して、いくつかの方法で得ることができる。組換えヒトＩＬ－１０はまた、例えば、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊからも市販されている。
それらの天然に存在するおよび天然に存在しないアイソフォーム、対立遺伝子変異体、およびスプライス変異体を含む、ＩＬ－１０剤をコードする核酸分子が、本開示によって企図される。本開示はまた、天然に存在するＤＮＡ配列とは１つ以上の塩基が変動するが、遺伝暗号の縮重のためにＩＬ－１０ポリペプチドに対応するアミノ酸配列に依然として翻訳される、核酸配列も包含する。
ポリペプチドが、組換え技術を使用して産生される場合、ポリペプチドはそれぞれ、任意の好適な構築物および任意の好適な宿主細胞（原核細胞もしくは真核細胞（細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）など）であり得る）または酵母宿主細胞を使用して、細胞内タンパク質として、または分泌タンパク質として産生されてもよい。宿主細胞として使用することができる真核細胞の他の例には、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および／または植物細胞が含まれる。哺乳動物宿主細胞が使用される場合、それらには、ヒト細胞（例えば、ＨｅＬａ、２９３、Ｈ９、およびＪｕｒｋａｔ細胞）、マウス細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ細胞、およびＣ１２７細胞）、霊長類細胞（例えば、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７、およびＣＶ１）、ならびにハムスター細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）が含まれ得る。
当該技術分野で既知の標準的な手順に従って、ポリペプチドの発現に好適な様々な宿主－ベクター系を用いることができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓを参照されたい。遺伝子材料を宿主細胞に導入するための方法には、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、共役、およびリン酸カルシウム法などが含まれる。導入のための方法は、導入されるポリペプチドをコードする核酸の安定した発現を提供するように選択することができる。ポリペプチドをコードする核酸は、遺伝性エピソーム要素（例えば、プラスミド）として提供されてもよく、またはゲノム的に組み込まれてもよい。目的のポリペプチドの産生に使用するための様々な適切なベクターが、市販されている。
ベクターは、宿主細胞内で染色体外維持を提供することができるか、または宿主細胞ゲノムへの組み込みを提供することができる。発現ベクターは、転写および翻訳制御配列を提供し、コード領域が転写開始領域ならびに転写および翻訳終結領域の転写制御下で作動可能に結合している、誘導性発現または構成的発現を提供することができる。一般に、転写および翻訳制御配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれ得るが、これらに限定されない。プロモーターは、構成的であっても誘導性であってもよく、強力な構成的プロモーター（例えば、Ｔ７）であってもよい。
発現構築物は一般に、目的のタンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するための、プロモーター配列の近くに位置する好都合な制限部位を有する。ベクターを含有する細胞の選択を促進するために、発現宿主内で作動する選択可能なマーカーが存在してもよい。さらに、発現構築物は、追加の要素を含んでもよい。例えば、発現ベクターは、１つまたは２つの複製システムを有してもよく、それにより生物内で（例えば、発現のために哺乳動物細胞または昆虫細胞内で、ならびにクローンニングおよび増幅のために原核生物宿主内で）それを維持することが可能になる。加えて、発現構築物は、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択可能なマーカー遺伝子を含有してもよい。選択可能な遺伝子は、当該技術分野で周知であり、使用される宿主細胞とともに変動する。
タンパク質の単離および精製は、当該技術分野で既知の方法に従って達成することができる。例えば、タンパク質は、構成的におよび／もしくは誘導時にタンパク質を発現するように遺伝子改変された細胞の溶解物から、または一般に試料を抗タンパク質抗体と接触させることと、洗浄して非特異的に結合した材料を除去することと、特異的に結合したタンパク質を溶出することとを伴う免疫親和性精製によって合成反応混合物から、単離することができる。単離されたタンパク質は、透析およびタンパク質精製で通常用いられる他の方法によってさらに精製することができる。一実施形態において、タンパク質は、金属キレートクロマトグラフィー法を使用して単離することができる。タンパク質は、単離を促進するための修飾を含有してもよい。
ポリペプチドは、実質的に純粋な形態または単離された形態（例えば、他のポリペプチドを含まない）で調製することができる。ポリペプチドは、存在し得る他の構成成分（例えば、他のポリペプチドまたは他の宿主細胞構成成分）と比較して、ポリペプチドが濃縮されている組成物中に存在してもよい。例えば、精製されたポリペプチドは、ポリペプチドが他の発現タンパク質を実質的に含まない（例えば、約９０％未満、約６０％未満、約５０％未満、約４０未満％、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満）組成物中に存在するように提供されてもよい。
ＩＬ－１０ポリペプチドは、当該技術分野で既知の異なるＩＬ－１０関連核酸を操作して、ＩＬ－１０ポリペプチドをコードすることができる構築物を提供する、組換え技術を使用して生成することができる。特定のアミノ酸配列が提供される場合、当業者は、その背景および例えば、分子生物学における経験を考慮して、そのようなアミノ酸配列をコードする様々な異なる核酸分子を認識することが理解される。
Ｆ．ペグ化ＩＬ－１０：
一実施形態において、修飾ＩＬ－１０剤は、ＰＥＧ－ＩＬ１０剤である。ＩＬ－１０剤のペグ化は、薬物動態学的パラメータ（例、血清半減期）を含む特定の特性の改善、活性の増強、物理的および熱的安定性の改善、酵素分解への感受性に対する保護、溶解性の増加、より長いインビボ循環半減期およびクリアランスの低下、免疫原性および抗原性の低減、ならびに毒性の低減をもたらす。薬物動態学的パラメータに対するペグ化の有益な効果に加えて、ペグ化自体が、活性を増強することができる。例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０は、非ペグ化ＩＬ－１０よりも特定の癌に対して有効であることが示されている（例えば、ＥＰ２０６６３６Ａ２を参照されたい）。
ある特定の実施形態において、本開示で使用されるＰＥＧ－ＩＬ－１０剤は、１～９個のＰＥＧ分子が、ＩＬ－１０二量体の１つのＩＬ－１０ポリペプチドのＮ末端で、アミノ酸残基のα－アミノ基にリンカーを介して共有結合している、モノ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０剤である。１つのＩＬ－１０ポリペプチドのモノペグ化は一般に、サブユニットのシャッフリングのために、非ペグ化、モノペグ化、およびジペグ化ＩＬ－１０ポリペプチドの不均一な混合物をもたらす。本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の方法によって生成されるモノジペグ化ＩＬ－１０剤とジペグ化ＩＬ－１０剤との混合物の投与を含む。特定の実施形態において、モノペグ化ＩＬ－１０とジペグ化ＩＬ－１０との混合物は、２０１４年４月８日に発行されたＢｌａｉｓｄｅｌｌらの米国特許第８，６９１，２０５Ｂ２号（その全教示は参照により本明細書に組み込まれる）、およびＢｌａｉｓｄｅｌｌ、欧州特許第２３７９１１５Ｂ１号（２０１７年１０月２５日付与）の教示に実質的に従って調製された、約１：１の比率のモノペグ化およびジペグ化ｒｈＩＬ－１０である。
ＰＥＧ－ＩＬ－１０剤の生物学的活性は、米国特許第７，０５２，６８６号に記載のように、細菌抗原（リポ多糖（ＬＰＳ））に曝露され、かつＰＥＧ－ＩＬ－１０で治療される対象の血清中の炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－αまたはＩＦＮ－γ）のレベルによって評価することができる。
ＩＬ－１０へのＰＥＧ結合の方法または部位は、重要ではないが、特定の実施形態において、ペグ化は、ＩＬ－１０剤の活性を改変しないか、または最小限にしか改変しない。ある特定の実施形態において、半減期の増加は、生物学的活性のいかなる低下よりも大きい。
ＩＬ－１０ポリペプチド配列への共役に好適なＰＥＧは一般に、室温で水溶性であり、一般式Ｒ（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎＯ－Ｒ（式中、Ｒは、水素または保護基（アルキルもしくはアルカノール基など）であり、ｎは、１～１０００の整数である）を有する。Ｒが保護基である場合、それは一般に、１～８個の炭素を有する。ポリペプチド配列に共役したＰＥＧは、線状または分岐状であり得る。
分岐状ＰＥＧ誘導体、「スターＰＥＧ」およびマルチアームＰＥＧは、本開示によって企図される。
本開示で使用されるＰＥＧの分子量は、いかなる特定の範囲にも制限されない。ＰＥＧ－ＩＬ－１０剤のＰＥＧ構成成分は、約５ｋＤａ超、約１０ｋＤａ超、約１５ｋＤａ超、約２０ｋＤａ超、約３０ｋＤａ超、約４０ｋＤａ超、または約５０ｋＤａ超の分子質量を有することができる。いくつかの実施形態において、分子質量は、約５ｋＤａ～約１０ｋＤａ、約５ｋＤａ～約１５ｋＤａ、約５ｋＤａ～約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約１５ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約２５ｋＤａ、または約１０ｋＤａ～約３０ｋＤａである。
本開示はまた、ＰＥＧが異なるｎ値を有し、それにより様々な異なるＰＥＧが特定の比率で存在する、共役体の組成物も企図する。例えば、いくつかの組成物は、ｎ＝１、２、３、および４である、共役体の混合物を含む。いくつかの組成物では、ｎ＝１が１８～２５％である共役体のパーセンテージ、ｎ＝２が５０～６６％である共役体のパーセンテージ、ｎ＝３が１２～１６％である共役体のパーセンテージ、およびｎ＝４が最大で５％である共役体のパーセンテージ。そのような組成物は、当該技術分野で既知の反応条件および精製方法によって生成することができる。クロマトグラフィーを使用して、共役体画分を分解することができ、その後例えば、所望の数のＰＥＧが結合し、未修飾タンパク質配列および他の数のＰＥＧが結合した共役体を含まないように精製した共役体を含有する画分を特定する。
ポリペプチド配列への共役に好適なＰＥＧは一般に、室温で水溶性であり、一般式Ｒ（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎＯ－Ｒ（式中、Ｒは、水素または保護基（アルキルもしくはアルカノール基など）であり、ｎは、１～１０００の整数である）を有する。Ｒが保護基である場合、それは一般に、１～８個の炭素を有する。
２つの広く使用されている第１世代の活性化モノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）は、スクシンイミジルカーボネートＰＥＧ（ＳＣ－ＰＥＧ、例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：１００－１１４、およびＭｉｒｏｎ ａｎｄ Ｗｉｌｃｈｅｃｋ（１９９３）Ｂｉｏ－ｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．４：５６８－５６９を参照されたい）ならびにベンゾトリアゾールカーボネートＰＥＧ（ＢＴＣ－ＰＥＧ、例えば、Ｄｏｌｅｎｃｅらの米国特許第５，６５０，２３４号を参照されたい）であり、これらは、リジン残基と優先的に反応して、カルバメート結合を形成するが、ヒスチジン残基およびチロシン残基と反応することも知られている。特定の分子（例えば、ＩＦＮα）上のヒスチジン残基への結合は、加水分解に不安定なイミダゾールカルバメート結合であることが示されている（例えば、Ｌｅｅ ａｎｄ ＭｃＮｅｍａｒの米国特許第５，９８５，２６３号を参照されたい）。第２世代のペグ化技術は、これらの不安定な結合、および残基の反応性における選択性の欠如を回避するように設計されている。ＰＥＧ－アルデヒドリンカーの使用は、還元的アミノ化を通してポリペプチドのＮ末端上の単一部位を標的とする。
ポリペプチド配列に共役したＰＥＧは、線状または分岐状であり得る。分岐状ＰＥＧ誘導体、「スターＰＥＧ」およびマルチアームＰＥＧは、本開示によって企図される。本発明の実施において有用な特定の実施形態のＰＥＧには、１０ｋＤａの線状ＰＥＧ－アルデヒド（例えば、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＥ－１００ＡＬ、ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｏｎｅ Ｎｏｒｔｈ Ｂｒｏａｄｗａｙ，Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＹ１０６０１ＵＳＡ）、１０ｋＤａの線状ＰＥＧ－ＮＨＳエステル（例えば、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＥ－１００ＣＳ、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＥ－１００ＡＳ、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＥ－１００ＧＳ、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＥ－１００ＨＳ、ＮＯＦ）、２０ｋＤａの線状ＰＥＧ－アルデヒド（例えば、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＥ－２００ＡＬ、ＮＯＦ）、２０ｋＤａの線状ＰＥＧ－ＮＨＳエステル（例えば、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＥ－２００ＣＳ、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＥ－２００ＡＳ、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＥ－２００ＧＳ、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＥ－２００ＨＳ、ＮＯＦ）、２０ｋＤａの２アーム分岐状ＰＥＧ－アルデヒド、２つの１０ｋＤＡ線状ＰＥＧ分子を含む２０ｋＤＡのＰＥＧ－アルデヒド（例えば、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＧＬ２－２００ＡＬ３、ＮＯＦ）、２０ｋＤａの２アーム分岐状ＰＥＧ－ＮＨＳエステル、２つの１０ｋＤＡの線状ＰＥＧ分子を含む２０ｋＤＡのＰＥＧ－ＮＨＳエステル（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＧＬ２－２００ＴＳ、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＧＬ２００ＧＳ２、ＮＯＦ）、４０ｋＤａの２アーム分岐状ＰＥＧ－アルデヒド、２つの２０ｋＤＡの線状ＰＥＧ分子を含む４０ｋＤＡのＰＥＧ－アルデヒド（例えば、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＧＬ２－４００ＡＬ３）、４０ｋＤａの２アーム分岐状ＰＥＧ－ＮＨＳエステル、２つの２０ｋＤＡの線状ＰＥＧ分子を含む４０ｋＤＡのＰＥＧ－ＮＨＳエステル（例えば、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＧＬ２－４００ＡＬ３、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＧＬ２－４００ＧＳ２、ＮＯＦ）、線状３０ｋＤａのＰＥＧ－アルデヒド（例えば、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＥ－３００ＡＬ）、および線状３０ｋＤａのＰＥＧ－ＮＨＳエステルが含まれる。
ペグ化は、ポリペプチドのＮ末端のα－アミノ基、リジン残基の側鎖上のイプシロンアミノ基、およびヒスチジン残基の側鎖上のイミダゾール基で最も頻繁に生じる。ほとんどの組換えポリペプチドは、単一のアルファ基ならびにいくつかのイプシロンアミノ基およびイミダゾール基を有するため、リンカー化学に応じて、多数の位置異性体を生成することができる。当該技術分野で既知の一般的なペグ化戦略が、本明細書に適用され得る。
ＰＥＧは、ポリペプチド配列の１つ以上の遊離アミノ基またはカルボキシル基とポリエチレングリコールとの間の結合を媒介する末端反応性基（「スペーサー」）を介して、本開示のＩＬ－１０ポリペプチドに結合することができる。遊離アミノ基に結合することができるスペーサーを有するＰＥＧは、ポリエチレングリコールのコハク酸エステルをＮ－ヒドロキシスクシニルイミドで活性化することによって調製することができる、Ｎ－ヒドロキシスクシニルイミドポリエチレングリコールを含む。遊離アミノ基に結合することができる別の活性化ポリエチレングリコールは、２，４－ビス（Ｏ－メトキシポリエチレングリコール）－６－クロロ－ｓ－トリアジンであり、これは、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルをシアヌル酸クロリドと反応させることによって調製することができる。遊離カルボキシル基に結合している活性化ポリエチレングリコールは、ポリオキシエチレンジアミンを含む。
本開示のＩＬ－１０ポリペプチド配列の１つ以上の、スペーサーを有するＰＥＧへの共役は、様々な従来の方法によって実行することができる。例えば、共役反応は、４：１～３０：１の試薬対タンパク質のモル比を利用して、５～１０のｐＨで溶液中、４℃～室温の温度で、３０分～２０時間実行することができる。反応条件は、主に所望の程度の置換を生成するように反応を指向するように選択することができる。一般に、低温、低ｐＨ（例えば、ｐＨ＝５）、および短い反応時間は、結合するＰＥＧの数を低下させる傾向がある一方で、高温、中性～高ｐＨ（例えば、ｐＨ≧７）、およびより長い反応時間は、結合するＰＥＧの数を増加させる傾向がある。当該技術分野で既知の様々な手段を使用して、反応を停止させることができる。いくつかの実施形態において、反応は、反応混合物を酸性化し、例えば、－２０℃で凍結することによって停止される。様々な分子のペグ化は、例えば、米国特許第５，２５２，７１４号、同第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号、同第５，９３２，４６２号、および同第５，９８５，２６３号で考察されている。ＰＥＧ－ＩＬ－１０は、例えば、米国特許第７，０５２，６８６号に記載されている。本明細書での使用が企図される特定の反応条件は、実験の節に明記されている。
ペグ化は、ポリペプチドのＮ末端のアルファ－アミノ基、リジン残基の側鎖上のイプシロンアミノ基、およびヒスチジン残基の側鎖上のイミダゾール基で最も頻繁に生じる。ほとんどの組換えポリペプチドは、単一のアルファ基ならびにいくつかのイプシロンアミノ基およびイミダゾール基を有するため、リンカー化学に応じて、多数の位置異性体を生成することができる。当該技術分野で既知の一般的なペグ化戦略が、本明細書に適用され得る。
本開示のポリペプチド配列の１つ以上の、スペーサーを有するＰＥＧへの共役は、様々な従来の方法によって実行することができる。例えば、共役反応は、４：１～３０：１の試薬対タンパク質のモル比を利用して、５～１０のｐＨで溶液中、４℃～室温の温度で、３０分～２０時間実行することができる。反応条件は、主に所望の程度の置換を生成するように反応を指向するように選択することができる。一般に、低温、低ｐＨ（例えば、ｐＨ＝５）、および短い反応時間は、結合するＰＥＧの数を低下させる傾向がある一方で、高温、中性～高ｐＨ（例えば、ｐＨ≧７）、およびより長い反応時間は、結合するＰＥＧの数を増加させる傾向がある。当該技術分野で既知の様々な手段を使用して、反応を停止させることができる。いくつかの実施形態において、反応は、反応混合物を酸性化し、例えば、－２０℃で凍結することによって停止される。様々な分子のペグ化は、例えば、米国特許第５，２５２，７１４号、同第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号、同第５，９３２，４６２号、および同第５，９８５，２６３号で考察されている。ＰＥＧ－ＩＬ－１０は、例えば、米国特許第７，０５２，６８６号に記載されている。
本開示は、当業者に既知の任意の手段によるペグ化ＩＬ－１０の合成を企図するが、以下は、モノ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０を生成するためのいくつかの代替的な合成スキームを提供し、モノ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０とジ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０との混合物は、例示を意図したものに過ぎない。モノ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０、およびモノ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０とジ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０との混合物の両方は、多くの同等の特性を有するが、選択的にペグ化したモノ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０とジ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０との混合物は、最終ペグ化生成物の収率を改善させる（例えば、米国特許第７，０５２，６８６号および米国特許公開第２０１１／０２５０１６３号を参照されたい）。本開示の実施に好適なＰＥＧ（および他の薬物送達技術）の生成および使用における自身の技術を活用することに加えて、当業者はまた、ＰＥＧ関連技術（および他の薬物送達技術）の多くの商業的供給業者にも精通している。例として、ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）は、単官能性線状ＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、マルチアームＰＥＳ、分岐状ＰＥＧ、ヘテロ官能性ＰＥＧ、フォーク型ＰＥＧ、および放出可能ＰＥＧを供給しており、Ｐａｒｃｈｅｍ（Ｎｅｗ Ｒｏｃｈｅｌｌｅ，ＮＹ）は、ＰＥＧ生成物および他の特殊原材料の世界的卸売業者である。
例示的なＰＥＧ－ＩＬ－１０合成スキーム番号１。ＩＬ－１０を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭのＮａＣｌに対して透析する。透析したＩＬ－１０を、透析緩衝液を使用して、約０．５～１２ｍｇ／ｍＬの濃度まで３．２倍に希釈する。リンカー、ＳＣ－ＰＥＧ－１２Ｋ（Ｄｅｌｍａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｙｗｏｏｄ，Ｉｌｌ．）の添加前に、１体積の１００ｍＭの四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．１）を９体積の希釈ＩＬ－１０に添加して、ＩＬ－１０溶液のｐＨを８．６まで上昇させる。ＳＣ－ＰＥＧ－１２Ｋリンカーを、透析緩衝液中に溶解させ、適切な体積のリンカー溶液（１モルのＩＬ－１０あたり１．８～３．６モルのリンカー）を希釈ＩＬ－１０溶液に添加して、ペグ化反応を開始する。反応の速度を制御するために５℃で反応を実行し、反応溶液を穏やかに撹拌する。サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によって決定されるモノ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０の収率が、４０％に近づいたとき、１Ｍのグリシン溶液を３０ｍＭの最終濃度まで添加することによって、反応を停止させる。ＨＣｌ溶液を使用して、反応溶液のｐＨを７．０に緩徐に調整し、反応物を０．２ミクロンで濾過し、－８０℃で保管する。
例示的なＰＥＧ－ＩＬ－１０合成スキーム番号２。メトキシ－ＰＥＧ－アルデヒド（ＰＡＬＤ－ＰＥＧ）をリンカーとして使用して、モノ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０を調製する（Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）、ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）からも入手可能）。ＰＡＬＤ－ＰＥＧは、５ＫＤａ、１２ＫＤａ、または２０ＫＤａの分子量を有し得る。反応緩衝液のｐＨが６．３～７．５であることを除いて、ＩＬ－１０を、上述のように透析および希釈する。活性化ＰＡＬＤ－ＰＥＧリンカーを、１：１のモル比で反応緩衝液に添加する。水性シアノ水素化ホウ素を、０．５～０．７５ｍＭの最終濃度になるまで反応混合物に添加する。室温（１８～２５℃）で１５～２０時間、穏やかに撹拌しながら、反応を実行する。１Ｍのグリシンで反応を停止させる。ＳＥ－ＨＰＬＣによって収率を分析する。モノ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０を、未反応のＩＬ－１０、ＰＥＧリンカー、およびジ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０から、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分離し、ＲＰ－ＨＰＬＣおよびバイオアッセイ（例えば、ＩＬ－１０応答性細胞または細胞株の刺激）によって特性評価する。
例示的なＰＥＧ－ＩＬ－１０合成スキーム番号３。ＩＬ－１０（例えば、げっ歯類または霊長類）を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ範囲５～７．４）に対して透析する。１：１～１：７のモル比の５Ｋ ＰＥＧ－プロピルアルデヒドを、０．７５～３０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下、１～１２ｍｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－１０と反応させる。あるいは、反応は、類似の様式で、ピコリンボランで活性化してもよい。反応物を、５～３０℃で３～２４時間インキュベートする。ペグ化反応物のｐＨを６．３に調整し、７．５ｍｇ／ｍＬのｈＩＬ－１０をＰＥＧと反応させて、ＩＬ－１０対ＰＥＧリンカーの比を１：３．５にする。シアノ水素化ホウ素の最終濃度は、約２５ｍＭであり、反応は、１５℃で１２～１５時間実行される。モノ－ＰＥＧ ＩＬ－１０およびジ－ＰＥＧ ＩＬ－１０は、最大の反応生成物であり、反応停止時の各々の濃度は、約４５～５０％である。反応は、グリシンもしくはリジンなどのアミノ酸、またはあるいはトリス緩衝液を使用して、停止させることができる。ゲル濾過、陰イオンおよび陽イオン交換クロマトグラフィー、ならびにサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）などの多数の精製方法を用いて、所望のペグ化ＩＬ－１０分子を単離することができる。
いくつかの実施形態において、ＰＥＧ－ＩＬ－１０剤は、ＡＭ－００１０である。ＡＭ００１０という用語は、約１：１のモノペグ化ｒｈＩＬ－１０ポリペプチドとジペグ化ｒｈＩＬ－１０ポリペプチドとの混合物を含み、リンカーを介してＩＬ－１０ポリペプチドのＮ末端に結合した５ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる、組換えヒトインターロイキン１０（ｒＨｕＩＬ－１０）を指す。ＡＭ００１０は、２つの非共有結合で関連付けられたｒＨｕＩＬ－１０ポリペプチド単量体で構成される非グリコシル化ホモ二量体タンパク質であり、各単量体は、直接的発現の組換え細菌産生から生じる天然ヒトＩＬ－１０ポリペプチドには存在しないＮ末端メチオニンを含む、１６１個のアミノ酸で構成され、各単量体は、２つの分子内ジスルフィド結合を含み、第１のジスルフィド結合は、１６１個のアミノ酸のｒＨｕＩＬ－１０ポリペプチドの１３位および１０９位のシステインの間であり、第２のジスルフィド結合は、６３位および１１５位のシステインの間である（天然に存在するｈＩＬ－１０ポリペプチドの、１２位および１０８位のシステインならびに６２位および１１４位のシステインに対応する）。ＡＭ００１０は、多数の臨床試験で評価されており、２０マイクログラム／ｋｇの１日１回の皮下用量で単剤として良好な耐容性を示しており、腎細胞癌（ＲＣＣ、２５％のＯＲＲ）、ブドウ膜黒色腫における客観的応答、ならびに皮膚Ｔ細胞リンパ腫における最大で２．５年間の耐久性のある応答を有するＣＲ、ならびにＣＲＣおよびＰＤＡＣにおける持続的な安定疾患が観察された。
Ｇ．グリコシル化ＩＬ－１０：
本発明の一実施形態において、修飾ＩＬ－１０剤は、グリコシル化ＩＬ－１０である。本開示の目的のために、「グリコシル化」は、グリカンを、タンパク質、脂質、または他の有機分子に結合させる酵素プロセスを広く指すことが意図される。本開示と併せた「グリコシル化」という用語の使用は一般に、（基礎をなすグリコシル化部位の除去、または化学的および／もしくは酵素的手段によるグリコシル化の欠失のいずれかによる）１つ以上の炭水化物部分の追加または欠失、ならびに／あるいは天然配列内に存する可能性も存在しない可能性もある１つ以上のグリコシル化部位の追加を意味することが意図される。加えて、この語句は、存在する様々な炭水化物部分の性質および割合の変化を伴う、天然タンパク質のグリコシル化の定性的変化を含む。グリコシル化は、ＩＬ－１０などのポリペプチドの物理的特性（溶解性など）に劇的な影響を与える可能性があり、タンパク質の安定性、分泌、および細胞内局在化にも重要である可能性がある。グリコシル化ポリペプチドはまた、増強した安定性を呈することもでき、半減期などの１つ以上の薬物動態学的特性を改善することもできる。加えて、溶解性の改善により、例えば、非グリコシル化ポリペプチドを含む製剤よりも薬剤投与に好適な製剤の生成が可能になる。
グリコシル化部位の付加は、ＩＬ－１０ポリペプチドのアミノ酸配列を改変することにより達成することができる。ＩＬ－１０ポリペプチドへの改変は、例えば、１つ以上のセリンもしくはスレオニン残基（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）またはアスパラギン残基（Ｎ結合型グリコシル化部位の場合）の付加、またはそれによる置換によって行うことができる。Ｎ結合型およびＯ結合型オリゴ糖の構造、ならびに各種類に見出される糖残基は、異なる場合がある。両方に一般的に見出される糖の１つの種類は、Ｎ－アセチルノイラミン酸（本明細書以下、シアル酸と称される）である。シアル酸は、通常、Ｎ結合型オリゴ糖およびＯ結合型オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷により、糖タンパク質に酸性特性を付与することができる。本開示の特定の実施形態は、Ｎ－グリコシル化変異体の生成および使用を含む。グリコシル化部位を組み込むための修飾アミノ酸配列を含むＩＬ－１０ポリペプチドの例は、例えば、２０１６年３月１０日公開のＶａｎ Ｖｌａｓｓｅｌａｅｒらの米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／００６８５８３Ａ１号に提供されている。本開示のＩＬ－１０ポリペプチド配列は、核酸レベルの変化を通して、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成して、グリコシル化部位の導入を促進するように、ポリペプチドをコードする核酸を事前選択した塩基で変異させることによって、任意で改変されてもよい。
Ｈ．ポリシアル化ＩＬ－１０
本発明の一実施形態において、修飾ＩＬ－１０剤は、ポリシアル化ＩＬ－１０である。「ポリシアリル化」という用語は、ポリペプチドの安定性およびインビボ薬物動態を改善するための、ポリペプチドと天然に存在する生分解性α－（２→８）結合ポリシアル酸（「ＰＳＡ」）との共役を指す。ＰＳＡは、高度に親水性である、生分解性で非毒性の天然重合体であり、これにより血中の見かけの分子量が高くなり、その血清半減期が増加する。加えて、様々なペプチドおよびタンパク質治療剤のポリシアリル化は、タンパク質分解の著しい低減、インビボ活性における活性の保持、ならびに免疫原性および抗原性の低減をもたらしている（例えば、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ３００（１－２）：１２５－３０を参照されたい）。部位特異的ポリシアリル化のための様々な技術が、利用可能である（例えば、Ｔ．Ｌｉｎｄｈｏｕｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＮＡＳ １０８（１８）７３９７－７４０２を参照されたい。
Ｉ．ＩＬ－１０融合タンパク質
本発明の一実施形態において、修飾ＩＬ－１０剤は、本明細書では「ＩＬ－１０アルブミン融合体」と称されるアルブミンに共役される。ＩＬ－１０アルブミン融合体の文脈で使用される場合、「アルブミン」という用語は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カニクイザルアルブミン、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのアルブミンを含む。本開示に従うと、アルブミンは、カルボキシル末端、アミノ末端、カルボキシル末端およびアミノ末端の両方、ならびに内部において、ＩＬ－１０ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のポリペプチド）に共役させることができる（例えば、ＵＳＰ５，８７６，９６９およびＵＰＳ７，０５６，７０１を参照されたい）。本開示によって企図されるＨＳＡ－ＩＬ－１０ポリペプチド共役体では、アルブミン分泌プレ配列、ならびにそれらの変異体、それらの断片および変異体、およびＨＳＡ変異体などの様々な形態のアルブミンを使用することができる。そのような形態は一般に、１つ以上の所望のアルブミン活性を有する。追加の実施形態において、本開示は、アルブミン、アルブミン断片、およびアルブミンバリアントなどに直接的または間接的に融合したＩＬ－１０ポリペプチドを含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、非融合薬物分子よりも高い血漿安定性を有し、かつ／または融合タンパク質は、非融合薬物分子の治療活性を保持する。いくつかの実施形態において、間接的な融合は、リンカー、例えば、ペプチドリンカーまたはその修飾バージョンによって行われる。
あるいは、ＩＬ－１０アルブミン融合は、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチド配列およびＩＬ－１０ポリペプチドを含む融合タンパク質である、ＩＬ－１０ポリペプチドを含む。上記に言及したように、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチド配列およびＩＬ－１０ポリペプチドを含む融合タンパク質は、例えば、ＨＳＡまたはその断片をコードする核酸が１つ以上のＩＬ－１０ポリペプチド配列をコードする核酸に接合されるような遺伝子操作によって行われ得る。
ＩＬ－１０剤への共役のための追加の好適な構成成分および分子には、例えば、チログロブリン；破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；ポリ（Ｄ－リジン：Ｄ－グルタミン酸）などのポリアミノ酸；ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド；インフルエンザウイルスヘマグルチニン、インフルエンザウイルス核タンパク質；キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）；ならびにＢ型肝炎ウイルスのコアタンパク質および表面抗原；または前述のものの任意の組み合わせが含まれる。
本開示は、別のポリペプチド（例えば、主題のポリペプチドに対して異種のアミノ酸配列を有するポリペプチド）などのポリペプチド配列、または担体分子の、Ｎ末端および／またはＣ末端における１つ以上の追加の構成成分または分子の共役を企図する。したがって、例示的なポリペプチド配列は、別の構成成分または分子との共役体として提供され得る。
ＩＬ－１０ポリペプチドはまた、タンパク質；セファロース、アガロース、セルロース、またはセルロースビーズなどの多糖；ポリグルタミン酸などの重合体アミノ酸、またはポリリジン；アミノ酸共重合体；不活性化ウイルス粒子；ジフテリア、破傷風、コレラ、またはロイコトキシン分子由来のトキソイドなどの不活性化細菌毒素；不活化細菌；および樹状細胞などの、大きく、緩徐に代謝される巨大分子に共役させることもできる。そのような共役形態は、所望される場合、本開示のポリペプチドに対する抗体の産生に使用してもよい。
共役のための追加の候補構成成分および分子には、単離または精製に好適なものが含まれる。特定の非限定的な例には、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対）などの結合分子、抗体、受容体、リガンド、レクチン、または例えば、プラスチックもしくはポリスチレンビーズ、プレートもしくはビーズ、磁気ビーズ、試験片、および膜を含む固体支持体を含む分子が含まれる。
ある特定の実施形態において、本開示のＩＬ－１０ポリペプチド配列のアミノ末端またはカルボキシル末端を免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ヒトＦｃ）と融合させて、融合共役体（または融合分子）を形成することができる。Ｆｃ融合共役体は、バイオ医薬品の全身半減期を増加させることが示されており、それによりバイオ医薬品生成物は、より少ない頻度の投与を必要とし得る。Ｆｃは、血管を覆う内皮細胞内の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、結合時に、Ｆｃ融合分子は、分解から保護され、循環に再放出され、分子の循環をより長く保つ。このＦｃ結合は、内因性ＩｇＧがその長い血漿半減期を保持する機構であると考えられている。より最近のＦｃ融合技術は、バイオ医薬品の単一コピーを抗体のＦｃ領域に結合させて、従来のＦｃ融合共役体と比較して、バイオ医薬品の薬物動態学的および薬力学的特性を最適化する。
本開示は、１つ以上の特性を改善するためのＩＬ－１０剤の他の修飾の使用を企図する。例には、ヘシル化（その様々な態様は、例えば、米国特許出願第２００７／０１３４１９７号および同第２００６／０２５８６０７号に記載されている）、ならびに融合タグとしてＳＵＭＯを含むＩＬ－１０ポリペプチド融合分子（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ，Ｉｎｃ．；Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）が含まれる。
本開示はまた、ＩＬ－１０ポリペプチドが、ＩＬ－１０ポリペプチドおよび１つ以上のＰＥＧ模倣物の融合タンパク質である、ＩＬ－１０剤も企図する。いくつかの追加の有利な特性を付与しながら、ＰＥＧの属性（例えば、増強した血清半減期）を保持する、ポリペプチドＰＥＧ模倣物が開発されている。例として、ＰＥＧと類似した拡張構造を形成することができる単純なポリペプチド鎖（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒを含む）を、目的のペプチドまたはタンパク質薬物に既に融合された状態で、組換えにより生成することができる（例えば、ＡｍｕｎｉｘのＸＴＥＮ技術、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。そのようなポリペプチド配列の融合タンパク質を含むＩＬ－１０剤は、この融合タンパク質をコードする核酸配列の発現による組換え手段によって生成することができ、これは、製造プロセス中の追加の共役ステップの必要性を取り除く。さらに、確立された分子生物学技術は、ポリペプチド鎖の側鎖組成の制御を可能にし、これにより免疫原性および製造特性の最適化が可能となる。
リンカーおよびそれらの使用については、上述されている。本開示のポリペプチド配列の修飾に使用される前述の構成成分および分子のいずれも、任意で、リンカーを介してＩＬ－１０剤またはＩＬ－１０ポリペプチドに共役させることができる。好適なリンカーには、修飾ポリペプチド配列と結合した構成成分および分子との間のいくらかの移動を許容するのに一般に十分な長さである「可撓性リンカー」が含まれる。リンカー分子は一般に、約６～５０原子長である。リンカー分子はまた、例えば、アリールアセチレン、２～１０個の単量体単位を含有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであってもよい。好適なリンカーは、容易に選択することができ、１アミノ酸長（例えば、Ｇｌｙ）、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０～２０、２０～３０、３０～５０アミノ酸長、または５０以上のアミノ酸長などの任意の好適な長さのものであり得る。
可撓性リンカーの例には、グリシン重合体（Ｇ）ｎ、グリシン－セリン重合体（例えば、（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ（配列番号１６）、およびＧＧＧＳｎ（配列番号１７）（式中、ｎは、少なくとも１の整数である））、グリシン－アラニン重合体、アラニン－セリン重合体、ならびに他の可撓性リンカーが含まれる。グリシン重合体およびグリシン－セリン重合体は、比較的構造不定であるため、構成成分間の中性テザーとして機能することができる。
可撓性リンカーのさらなる例には、グリシン重合体（Ｇ）ｎ、グリシン－アラニン重合体、アラニン－セリン重合体、グリシン－セリン重合体（例えば、（ＧｍＳｏ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１８）、（ＧｍＳｏＧｍ）ｎ（配列番号１９）、（ＧｍＳｏＧｍＳｏＧｍ）ｎ（配列番号２２０）、（ＧＳＧＧＳｍ）ｎ（配列番号２１）、（ＧＳＧＳｍＧ）ｎ（配列番号２２）、および（ＧＧＧＳｍ）ｎ（配列番号２３）、ならびにそれらの組み合わせ（式中、ｍ、ｎ、およびｏは、各々独立して、少なくとも１～２０の整数、例えば、１～１８、２～１６、３～１４、４～１２、５～１０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０から選択される）、ならびに他の可撓性リンカーが含まれる。グリシン重合体およびグリシン－セリン重合体は、比較的構造不定であるため、構成成分間の中性テザーとして機能することができる。可撓性リンカーの例には、ＧＧＳＧ（配列番号２４）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２５）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２６）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２７）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２８）、およびＧＳＳＳＧ（配列番号２９）が含まれるが、これらに限定されない。
追加の可撓性リンカーには、グリシン重合体（Ｇ）ｎまたはグリシン－セリン重合体（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１６）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１７）、および（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３０）（式中、ｎ＝１～５０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０～２０、２０～３０、３０～５０である）が含まれる。例示的な可撓性リンカーには、ＧＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３２）、ＧＧＳＧ（配列番号３３）、ＧＧＳＧＧ（配列番号３４）、ＧＳＧＳＧ（配列番号３５）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３６）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３７）、およびＧＳＳＳＧ（配列番号３８）が含まれるが、これらに限定されない。これらのリンカー配列の多量体（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０～２０、２０～３０、または３０～５０）をともに結合させて、異種アミノ酸配列の、本明細書に開示されるポリペプチドへの共役に使用され得る、可撓性リンカーを提供してもよい。本明細書に記載のように、異種アミノ酸配列は、アルブミンおよびＦｃ配列などのシグナル配列および／または融合パートナーであり得る。
Ｊ．キメラ抗原受容体：
本発明の実施に有用なＣＡＲは、当該技術分野で周知の原理に従って調製される。例えば、２０１０年６月２２日に発行されたＥｓｈｈａａｒらの米国特許第７，７４１，４６５Ｂ１号、Ｓａｄｅｌａｉｎ，ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ３（４）：３８８－３９８（キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）設計の基本原理）、Ｊｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｒｉｄｄｅｌｌ（２０１５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３：９－１５（腫瘍を効果的かつ安全に標的とするキメラ抗原受容体の設計）、Ｇｒｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８６（２４）：１００２４－１００２８（抗体型特異性を有する機能的受容体としての免疫グロブリン－Ｔ細胞受容体キメラ分子の発現）、Ｃｕｒｒａｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ １４（６）：４０５－１５を参照されたい。本発明の文脈におけるＣＡＲおよびその機能的ドメインの構築に関する考慮を以下で考察する。
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法製品は、米国食品医薬品局によって米国での商業的使用が承認されており、本開示の教示に従う使用に適している。本明細書に記載の方法および組成物と組み合わせて使用することができる市販のＣＡＲ－Ｔ細胞製品の例には、アキシカブタジェンシロルーセル（ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ）（Ｇｉｌｅａｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから市販されているＹｅｓｃａｒｔａ（登録商標）として販売されている）およびチサゲンレクロイセル（ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ）（Ｎｏｖａｒｔｉｓから市販されているＫｙｍｒｉａｈ（登録商標）として販売されている）が含まれる。
（ａ）シグナル配列；
本発明のＣＡＲは、ＡＲＤの表面表示を容易にするためのシグナルペプチドを含む（以下を参照）。本発明の実施において、任意の真核生物シグナルペプチド配列が、使用され得る。シグナルペプチドは、表面発現タンパク質の天然のシグナルペプチドに由来し得る。本発明の一実施形態において、ＣＡＲのシグナルペプチドは、ヒト血清アルブミンシグナルペプチド、プロラクチンアルブミンシグナルペプチド、ヒトＩＬ２シグナルペプチド、ヒトトリプシノーゲン－２、ヒトＣＤ－５、ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖、ヒトアズロシジン、ガウシアルシフェラーゼ、およびそれらの機能的誘導体からなる群から選択されるシグナルペプチドである。シグナルペプチドを使用して分泌効率を高めるための特定のアミノ酸置換は、Ｓｔｅｒｎ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１－１７およびＫｏｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１１０（４）：１１６４－７３に記載されている。あるいは、シグナルペプチドは、確立された原理に従って調製された合成配列であり得る。例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０（１）：１－６（原核生物および真核生物のシグナルペプチドの同定およびそれらの切断部位の予測）、Ｂｅｎｄｔｓｅｎ，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３４０（４）：７８３－７９５（シグナルペプチドＳｉｇｎａｌＰ ３．０の改善された予測）、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８：７８５－７９６（Ｓｉｇｎａｌ Ｐ４．０；シグナルペプチドを膜貫通領域と区別する）を参照されたい。
（ｂ）細胞外抗原認識ドメイン
本発明のＣＡＲは、標的細胞の表面上に発現する抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメイン（「ＡＲＤ」）をさらに含む。ＡＲＤは、標的細胞の表面上に発現する抗原に特異的に結合する任意の一本鎖ポリペプチドであり得る。標的細胞の表面上に発現する抗原の選択は、ＡＲＤの設計および選択を決定する。ある特定の実施形態において、標的細胞集団は、腫瘍抗原を含み得る。Ｖｉｇｎｅｒｏｎ，Ｎ．ら（（２０１３年７月１５日）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：１５）は、４００を超える腫瘍抗原ペプチドを含むＴ細胞定義のヒト腫瘍抗原のデータベースについて説明する。ＣＡＲのＡＲＤによって標的とされ得る腫瘍抗原の例には、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、テロメラーゼ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、Ｔ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＦＡＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、５Ｔ４、ＷＴ１、ＫＧ２Ｄリガンド（ＭＩＣＡ／ＢならびにＵＬＢＰ－１、－２、－３、および－４を含む）、葉酸受容体（ＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体Ａ（ＰＤＧＦＲαとも呼ばれる）、ならびにＷｎｔ１抗原を含まれるが、これらに限定されない、群から選択される１つ以上の抗原が含まれる。
一実施形態において、ＡＲＤは、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）である。ＳｃＦｖは、ペプチドリンカーによって共有結合された抗体の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域で構成されるポリペプチドである（Ｂｉｒｄ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：５８７９－５８８３、Ｓ－ｚ Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，３０５５－３０６１、Ｌａｄｎｅｒの１９９０年８月７日に発行された米国特許第４９４６７７８号）。抗標的抗原ＳｃＦｖの調製は、抗標的抗原ＳｃＦｖが由来する標的抗原に対するモノクローナル抗体を生成することによって進行する。モノクローナル抗体の生成およびハイブリドーマの単離は、当業者によく知られている技術である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ７（Ｅ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｅｄ．２０１４ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。免疫応答は、ミョウバン、アルミニウム塩、またはフロイント、ＳＰ－２１などの当該技術分野でよく知られているアジュバントの同時投与によって増強され得る。生成された抗体は、ファージディスプレイおよび指向性進化などの当該技術分野でよく知られている技術を通して特定の所望の特徴を有する抗体を選択するように最適化され得る。例えば、Ｂａｒｂａｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８８：７９７８－８２、Ｌａｄｎｅｒらの１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５，２２３，４０９号、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９－９１、Ｇａｒｒａｒｄの１９９８年１０月１３日に発行された米国特許第５，８２１，０４７号、Ｃａｍｐｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）１００（１７）：９７２７－３２、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの１９８６年６月３日に発行された米国特許第４，５９３，００２号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの２００４年１０月１９日に発行された米国特許第６，８０６，０７９号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの２００９年１２月２２日に発行された米国特許第７，６３５，６６６号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの２０１０年２月１６日に発行された米国特許第７，６６２，５５７号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの２０１０年５月２５日に発行された米国特許第７，７２３，２７１号、および／またはＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第７，７３２，３７７号を参照されたい。モノクローナル抗体配列に基づくＳｃＦｖの生成は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｊｏｈｎ Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｅｄ．（２００２）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ １５０“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓを参照されたい。いくつかの実施形態において、ＡＲＤは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＡ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２－ｎｅｕ ｓｃＦｖ、抗ＶＥＧＦ－Ｒ２ ｓｃＦｖ、抗Ｔ１ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ、抗メソセリンｓｃＦｖ、抗ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ ｓｃＦｖ、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦｖ、抗ＦＡＰ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ、抗ＧＤ－２ ｓｃＦｖ、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ、抗ＭＡＧＥ ｓｃＦｖ、抗Ａ３ ｓｃＦｖ、抗５Ｔ４ｓｃＦｖ、抗ＷＴ１ ｓｃＦｖ、または抗Ｗｎｔ１ ｓｃＦｖに由来する。
別の実施形態において、ＡＲＤは、ラクダまたはラマを標的細胞由来の抗原で免疫化することによって得られる単一ドメイン抗体である。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．（２００１）Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７－３０２を参照されたい。
あるいは、ＡＲＤは、ペプチドライブラリーの生成および所望の標的細胞抗原結合特性を有する化合物の単離を介して完全に合成的に生成され得る。そのような技術は、科学文献でよく知られている。例えば、Ｗｉｇｌｅｒらの１９９９年１１月１２日に発行された米国特許第６３０３３１３Ｂ１号、Ｋｎａｐｐｉｋらの２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９６，２４８Ｂ１号、Ｂｉｎｚ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１２５７－１２６８、Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：２４５－２５４を参照されたい。
標的細胞発現抗原に対して親和性を有するＡＲＤに加えて、ＡＲＤはまた、追加の分子に対して親和性を有し得る。例えば、本発明のＡＲＤは、二重特異性であり得る、すなわち、第１の標的細胞発現抗原および第２の標的細胞発現抗原への特異的結合を提供することができる。二価の一本鎖ポリペプチドの例は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｔｈｉｒｉｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ５（６）：５０７－５１１、ＤｅＫｒｕｉｆ ａｎｄ Ｌｏｇｅｎｂｅｒｇ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１（１３）７６３０－７６３４、およびＫａｙらの２０１５年１１月５日に公開された米国特許出願公開第２０１５／０３１５５６６号を参照されたい。
代替の実施形態において、ＣＡＲまたはＣＡＲのＡＲＤは、免疫療法に応答して誘導されたクローンのＴＣＲに由来し得る。新規腫瘍特異的ＴＣＲ配列を同定し、これらの配列を含むＣＡＲ Ｔ細胞の産生にそのような配列を組み込むための方法は、２０１７年７月２０日にＷＯ２０１７／１２３５５７Ａ１として公開されたＭｕｍｍらのＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１２８８２に記載されており、その全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。簡単に言えば、ＩＬ－１０剤療法は、ＩＬ－１０剤を患者に投与した後、疾患抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を患者の末梢に誘導する結果となる。患者が一定期間ＩＬ－１０剤療法を受けた後、リンパ球を含む組織試料、例えば、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を含む末梢血試料が、白血球アフェレーシスなどの従来の手順によって患者から収集され得る。組織試料を収集した後、試料中の核酸を配列決定によって分析して、ＴＣＲ配列（例えば、可変アルファ（Ｖα）ＴＣＲポリペプチドをコードするおよび／または可変ベータ（Ｖβ）ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸）を得る。配列決定の読みを分析して、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現する、すなわち試料中の抗原特異的Ｔ細胞の細胞表面上に機能的に存在するＴＣＲに対してＶα ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸および／またはＶβ ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸の存在量の推定値を得ることができる。試料中のＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現するＴＣＲに対してＶα ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸および／またはＶβ ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸の存在量を、ＩＬ－１０剤療法中のより早い時点で参照試料中のＶα ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸および／またはＶβ ＴＣＲポリペプチドをコードする核酸ＶαＴＣＲポリペプチドおよび／または核酸をコードする核酸の存在量と比較することによって、Ｖβ ＴＣＲポリペプチドをコードすることにより、（α鎖およびβ鎖ＴＣＲ対配列によって定義される）抗原特異的ＴＣＲを発現する特定のＴ細胞集団が、ＩＬ－１０剤療法に応答して、クローン的に広がった、クローン的に収縮、または新たに生成されていることを同定することが可能である。ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上に発現するＴＣＲのアルファ鎖とベータ鎖の対をコードする核酸を配列決定した後、各鎖のＣＤＲ領域を含むアルファ鎖およびベータ鎖のアミノ酸配列が、決定され得る。これらのＴＣＲ対アミノ酸配列を使用して、完全長α鎖およびβ鎖ＴＣＲ対アミノ配列をコードする核酸構築物、またはα鎖およびβ鎖ＴＣＲ対アミノ配列の可変領域を含むキメラ抗原受容体を形質導入することによって、組換え疾患抗原特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成し得る。次いで、そのような疾患抗原特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞は、そのＣＡＲ－Ｔ細胞が対象の腫瘍細胞に対する活性のために特に選択され得るため、新規ＴＣＲ配列が単離された患者を含む、疾患の治療を必要とする好適な患者に投与され得る。新生抗原誘導Ｔ細胞を単離するための方法は、Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １２５（１０）：３９８１－３９９１に記載されている。そのような患者由来の配列は、免疫療法、特にＩＬ－１０療法に応答して誘導されるこれらの新規Ｔ細胞クローンが、対象に存在する腫瘍細胞の集団に対して選択された親和性を有するＴＣＲを含み、したがって、「一般的な」腫瘍抗原と比較して、特異性および標的効率の向上を提供することが期待され得る場合に、本発明の実施において特に有用である。
ｃ）膜貫通ドメイン：
本発明の実施に有用なＣＡＲは、抗標的抗原ＡＲＤ（または含まれる場合はスペーサー）をＣＡＲの細胞内ドメインに連結する膜貫通ドメインをさらに提供する。膜貫通ドメインは、真核生物の細胞膜で熱力学的に安定している任意の配列からなる。本発明の実施に有用なＣＡＲの構築に有用な膜貫通ドメインは、アルファヘリックス二次構造を有する形成に有利な約２０個のアミノ酸からなる。膜貫通ドメインは、天然に存在する膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインに由来し得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であり得る。合成膜貫通ドメインの設計においては、アルファヘリックス構造に有利なアミノ酸が、好ましい。アルファヘリックスの形成に有利なアミノ酸は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ７５：４２２－４２７を参照されたい。
（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲの細胞内ドメインは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ鎖）を含む。一実施形態において、細胞内シグナルドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列と、抗原受容体の関与および機能的誘導体およびそのサブ断片に続いてシグナル伝達を開始する共受容体と、を含む。さらに、または代替的に、ＣＡＲの細胞質ドメインは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。細胞内シグナル伝達ドメインの例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８の細胞質ドメイン、ＣＤ１３７の細胞質ドメイン（４－１ＢＢおよびＴＮＦＲＳＦ９とも称される）、ＣＤ２７８の細胞質ドメイン（ＩＣＯＳとも称される）、ＰＩ３キナーゼｐ１１０α、β、またはδ触媒サブユニット）、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ１３４の細胞質ドメイン（ＯＸ４０およびＴＮＦＲＳＦ４とも称される）が含まれるが、これらに限定されない。ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖など）、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３ポリペプチド（δ、Δ、およびε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ ７０など）、ｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎなど）、ならびにＣＤ２、ＣＤ５、およびＣＤ２８などのＴ細胞形質導入に関与する他の分子。本発明の一実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ鎖である。本発明の別の実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ鎖およびＣＤ２８の細胞質ドメインを含む。本発明の別の実施形態において、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８の細胞質ドメインＳ、およびＯＸ４０を含む三量体構造である。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ１３７のシグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態において、細胞質ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメインならびにＣＤ２８およびＣＤ１３７のシグナル伝達ドメインを含む。細胞内ドメインはまた、１つのシグナル伝達ドメインに加えて、１つ以上の「共刺激ドメイン」（ＣＳＤ）も提供し得る。共刺激ドメインとは、メモリ細胞の増殖、生存、または発達を促進するＣＡＲの部分を指す。本開示のいくつかの実施形態において、ＣＳＤは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーの１つ以上、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、またはそれらの組み合わせを含む。当業者は、本開示の教示と併せて使用され得る他の共刺激ドメインを認識している。
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は比較的急速に進行しており（一般に、米国特許出願公開第２０１５／００３８６８４号を参照）、その多くは細胞内シグナル伝達ドメインの性質に焦点を合わせている。いわゆる「第１世代のＣＡＲ」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のＣＤ３ζ活性化鎖への抗原認識ドメインの融合を対象とした。これらの第１世代のＣＡＲは、インビトロでＴ細胞エフェクター機能を誘導したが、インビボでの有効性は、その不十分な抗腫瘍効力によって大きく制限された。ＣＡＲ技術の発展によって、「第２世代のＣＡＲ」がもたらされ、これは１つのＣＳＤと並んでＣＤ３ζ活性化鎖を含み、この例には、ＣＤ２８または様々なＴＮＦ受容体ファミリー分子、例えば４－１ＢＢ（４１ＢＢ、ＣＤ１３７）およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）由来の細胞内ドメインが含まれる。ＣＤ３ζ活性化鎖に加えて２つの共刺激シグナルを含む「第３世代のＣＡＲ」が開発され、ＣＳＤは最も一般的にはＣＤ２８および４－１ＢＢに由来する。第２世代および第３世代のＣＡＲは、抗腫瘍効力を劇的に向上させた。第２世代および第３世代のＣＡＲの効力の増大は、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する抗原標的が非標的細胞上に発現する可能性があることと相まって、重度の毒性の危険性も増大させた。（例えば、Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６（９）：３３６０－６５、Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６８（１６）：１５０９－１８）を参照されたい）、その結果、このような第２世代および第３世代のＣＡＲ－Ｔの使用は、第１世代のＣＡＲ－Ｔに通常関連する用量よりも低い用量で評価する必要がある。
本発明のいくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、以下の配列においてアミノからカルボキシに配置された以下のドメインのポリペプチドを含む：
－ＣＤ３ζ
－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ，
－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
－ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
－ＯＸ４０－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
－ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ
－ＩＣＯＳ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
－４１ＢＢ－ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ
－４１ＢＢ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ、および
－４１ＢＢ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ。
（ｅ）リンカー
本発明の実施に有用なＣＡＲは、任意に、ＣＡＲのドメイン、特にＡＲＤとＣＡＲの膜貫通ドメインとの間の結合を連結する１つ以上のポリペプチドスペーサーを含み得る。ＣＡＲ構造の必須要素ではないが、スペーサードメインを含めることは、ＡＲＤによる抗原認識を容易にするために一般的に望ましいと考えられている。Ｍｏｒｉｔｚ ａｎｄ Ｇｒｏｎｅｒ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２（８）５３９－５４６。本明細書に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞技術と併せて使用される場合、「リンカー」、「リンカードメイン」、および「リンカー領域」という用語は、本開示のＣＡＲのドメイン／領域のうちのいずれかを一緒に連結する、約１～１００アミノ酸長のオリゴ領域またはポリペプチド領域を指す。リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに自由に移動できるように、グリシンおよびセリンのような可撓性残基から構成され得る。ある特定の実施形態は、２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にすることが望ましい場合に、より長い長さのリンカーの使用を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは切断不可能であるが、他の実施形態において、リンカーは切断可能である（例えば、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ））、２Ａ様リンカーまたはそれらの機能的同等物、および前述の組み合わせである。スペーサー機能を達成するために必要なアミノ酸の特定の配列はないが、スペーサーの典型的な特性は、ＡＲＤの動きの自由を可能にして標的抗原認識を容易にする柔軟性である。同様に、ＣＡＲ機能を維持しながらスペーサーの長さにかなりの寛大さが存在することが見出されている。Ｊｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｒｉｄｄｅｌｌ（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗ ２５７（１）１２７－１４４。本発明の実施に有用なＣＡＲの構築においてスペーサーとして有用な配列には、ＩｇＧ１のヒンジ領域、免疫グロブリン１ＣＨ２－ＣＨ３領域、ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ３、およびＩｇＧ４ヒンジが含まれるが、これらに限定されない。ヒンジおよび膜貫通ドメインは、ＣＤ８－アルファのヒンジおよび膜貫通ドメインなどと同じ分子に由来し得る。Ｉｍａｉ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １８（４）：６７６－６８４。リンカーが、ピコルナウイルス２Ａ様リンカー、ブタテッショウウイルス（Ｐ２Ａ）のＣＨＹＳＥＬ配列、ゾゼアアシグナ（ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）、またはそれらの組み合わせ、バリアント、および機能的均等物を含む、本開示の実施形態が企図される。さらに別の実施形態において、リンカー配列は、２Ａグリシンと２Ｂプロリンとの間の切断をもたらすＡｓｐ－Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（２Ａ）－プロ（２Ｂ）モチーフを含む。
本発明のいくつかの実施形態において、ＣＡＲは、以下のようにアミノからカルボキシ末端に配置された、介在またはスペーサー配列を提供し得る以下の機能的ドメインを含むポリペプチドである：
抗ＣＤ２０－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ２０－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ、
抗ＣＤ２０－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ２０－ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ２０－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ２０－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ２０－ＯＸ４０－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ２０－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ２０－ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ２０－ＩＣＯＳ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ２０－４１ＢＢ－ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ２０－４１ＢＢ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ２０－４１ＢＢ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＨＥＲ２－ＣＤ３ζ
抗ＨＥＲ２－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＨＥＲ２－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＨＥＲ２－ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＨＥＲ２－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＨＥＲ２－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＨＥＲ２－ＯＸ４０－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＨＥＲ２－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＨＥＲ２－ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ
抗ＨＥＲ２－ＩＣＯＳ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＨＥＲ２－４１ＢＢ－ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ
抗ＨＥＲ２－４１ＢＢ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＨＥＲ２－４１ＢＢ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＣＥＡ－ＣＤ３ζ
抗ＣＥＡ－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＣＥＡ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＣＥＡ－ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＣＥＡ－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＣＥＡ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＣＥＡ－ＯＸ４０－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＣＥＡ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＣＥＡ－ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ
抗ＣＥＡ－ＩＣＯＳ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＣＥＡ－４１ＢＢ－ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ
抗ＣＥＡ－４１ＢＢ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＣＥＡ－４１ＢＢ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＶＥＧＦ－ＣＤ３ζ
抗ＶＥＧＦ－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＶＥＧＦ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＶＥＧＦ－ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＶＥＧＦ－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＶＥＧＦ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＶＥＧＦ－ＯＸ４０－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＶＥＧＦ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＶＥＧＦ－ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ
抗ＶＥＧＦ－ＩＣＯＳ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＶＥＧＦ－４１ＢＢ－ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ
抗ＶＥＧＦ－４１ＢＢ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＶＥＧＦ－４１ＢＢ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ１９－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ１９－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ１９－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ１９－ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ１９－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ１９－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ１９－ＯＸ４０－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ１９－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ１９－ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ１９－ＩＣＯＳ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ１９－４１ＢＢ－ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ１９－４１ＢＢ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＣＤ１９－４１ＢＢ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＥＧＦＲ－ＣＤ３ζ
抗ＥＧＦＲ－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＥＧＦＲ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＥＧＦＲ－ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＥＧＦＲ－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＥＧＦＲ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ
抗ＥＧＦＲ－ＯＸ４０－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ
抗ＥＧＦＲ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＥＧＦＲ－ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ
抗ＥＧＦＲ－ＩＣＯＳ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ
抗ＥＧＦＲ－４１ＢＢ－ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ
抗ＥＧＦＲ－４１ＢＢ－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ、および
抗ＥＧＦＲ－４１ＢＢ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ。
Ｋ．ＣＡＲ発現ベクター
本発明の実施に有用なＣＡＲ Ｔ細胞の調製は、単離されたＴ細胞を、上記のＣＡＲポリタンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換することによって達成される。
Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現のための発現ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。「非ウイルスベクター」という用語は、正常なゲノムとは異なり、標的細胞におけるコード配列の発現に影響を与えることができる非選択的条件下での細胞生存に必須ではない、自律的に複製する染色体外環状ＤＮＡ分子を指す。プラスミドは、非ウイルスベクターの例である。標的細胞のトランスフェクションを容易にするために、標的細胞は、非ウイルスベクターの取り込みを容易にする条件下で、非ウイルスベクターに直接曝露され得る。哺乳動物細胞による外来核酸の取り込みを促進する条件の例は、当該技術分野でよく知られており、化学的手段（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなど）、高塩、磁場（エレクトロポレーション）が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、非ウイルスベクターは、非ウイルス送達システムで提供され得る。非ウイルス送達システムは、典型的には、核酸がカチオン性脂質（ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ）、界面活性剤、生物学的物質（ゼラチン、キトサン）、金属（金、磁性鉄）、および合成ポリマー（ＰＬＧ、ＰＥＩ、ＰＡＭＡＭ）などの薬剤と複合体を形成する核酸カーゴによる標的細胞の形質導入を促進するための複合体である。非ウイルス送達システムの多数の実施形態は、脂質ベクターシステム（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１４：１７３－２０６）、ポリマー被覆リポソーム（Ｍａｒｉｎらの１９９３年５月２５日に発行された米国特許第５，２１３，８０４号、Ｗｏｏｄｌｅらの１９９１年５月７日に発行された米国特許第５，０１３，５５６号）、カチオン性リポソーム（Ｅｐａｎｄらの１９９４年２月１日に発行された米国特許第５，２８３，１８５号、Ｊｅｓｓｅｅ，Ｊ．Ａ．の１９９６年１１月２６日に発行された米国特許第５，５７８，４７５号、Ｒｏｓｅらの１９９４年１月１８日に発行された米国特許第５，２７９，８３３号、Ｇｅｂｅｙｅｈｕらの１９９４年８月２日に発行された米国特許第５，３３４，７６１号）を含む当該技術分野でよく知られている。非ウイルスベクターを用いるＴ細胞におけるＣＡＲ配列の発現効率は、いわゆるＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾンシステムなどのトランスポゾン／トランスポザーゼシステム（例えば、Ｇｅｕｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ８（１）：１０８－１１７を参照されたい）を使用することで大幅に向上させることができ、ｐｉｇｇｙＢａｃシステム（例えば、Ｍａｎｕｒｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１（４）：４２７－４３７を参照されたい）を使用して、ヒトＴ細胞への抗標的抗原ＣＡＲをコードする核酸配列を含む非ウイルス性ベクター（例えばプラスミド）を安定して導入することができる。
別の実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターであり得る。本明細書で使用される場合、ウイルスベクターという用語は、その従来の意味で、タンパク質合成またはエネルギー産生機構を有さない義務的な細胞内寄生虫のうちのいずれかを指すために使用され、外因性の導入遺伝子を哺乳類細胞に送達するために一般に使用される、エンベロープまたは非エンベロープ動物ウイルスのうちのいずれかを指す。ウイルスベクターは、複製可能（例えば、実質的に野生型）、条件付き複製（ある特定の条件下で複製するように組換え操作される）、または複製欠損（ウイルスの欠失した機能を補完することができる細胞株の不在下で実質的に複製できない）であり得る。ウイルスベクターは、それを「選択的に複製する」ようにする、すなわち、それは、ある特定の細胞型または表現型細胞状態、例えば、癌性において優先的に複製するためのある特定の修飾を有することができる。本発明の実施に有用なウイルスベクターシステムには、例えば、天然に存在するまたは組換えウイルスベクターシステムが含まれる。本発明の実施に有用なウイルスの例には、組換え改変されたエンベロープまたは非エンベロープＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。例えば、ウイルスベクターは、ヒトまたはウシアデノウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シンドビスウイルス、およびレトロウイルス（ルース肉腫ウイルスを含むがこれらに限定されない）、およびＢ型肝炎ウイルスのゲノムに由来し得る。典型的には、目的の遺伝子がそのようなベクターに挿入されて、典型的には付随するウイルスゲノム配列を伴う遺伝子構築物のパッケージングを可能にし、続いて感受性宿主細胞の感染をもたらし、目的の遺伝子（例えば、標的抗原）の発現をもたらす。加えて、抗標的抗原ＣＡＲをコードする発現ベクターもまた、ｍＲＮＡベクターであり得る。ウイルスベクターシステムをトランスフェクションに使用する場合、レトロウイルスまたはレンチウイルス発現ベクターは、これらのシステムを使用したＴ細胞への遺伝子導入の有効性が高まり、臨床応用のためのかなりの量のＴ細胞の培養時間が短縮されるため、Ｔ細胞をトランスフェクトすることが好ましい。特に、ガンマレトロウイルスは、臨床グレードのＴ細胞の遺伝子改変に特に好ましく、治療効果があることが示されている。Ｐｕｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １４（１１）：１２６４－１２７０。同様に、自己不活化レンチウイルスベクターはまた、静止状態のＴ細胞に組み込まれることが実証されているため、有用である。Ｊｕｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９（１０）：７０４－７１６。ＣＡＲ配列（および任意の追加の導入遺伝子）の発現に有用な特定のレトロウイルスベクターは、Ｎａｌｄｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｌｅ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎｄｉｖｉｄｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３－２６７、Ｎａｌｄｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．１１３８２－１１３８８、Ｄｕｌｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａ Ｔｈｉｒｄ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（１１）：８４６３－８４７１、Ｍｉｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ１３７ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４、Ｋｉｎｇｓｍａｎらの２０００年８月１日に発行された米国特許第６，０９６，５３８号、およびＫｉｎｇｓｍａｎらの２００５年８月２日に発行された米国特許第６，９２４，１２３号に記載されるものであり、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の一実施形態において、ＣＡＲ発現ベクターは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａからのライセンスの下で入手可能なＬｅｎｔｉｖｅｃｔｏｒ（登録商標）レンチウイルスベクターである。
Ｌ．ＣＡＲベクターによってコードおよび発現された任意の導入遺伝子
ＣＡＲの発現ベクターは、標的抗原に加えて、１つ以上のポリペプチドをコードし得る。本発明の実施のように多数のポリペプチドを発現する場合、各ポリペプチドは、発現制御配列（モノシストロン性）に作動可能に連結され得るか、または多数のポリペプチドは、多数の核酸配列が単一の発現制御配列に作動可能に連結され、任意に、介在配列（例えばＩＲＥＳ要素）を提供する場合に、ポリシストロン性構築物によってコードされ得る。
一実施形態において、標的抗原をコードする発現ベクターは、任意に、１つ以上の免疫学的調節剤をさらにコードし得る。本発明の実施に有用な免疫学的調節剤の例には、サイトカインが含まれるが、これに限定されない。そのようなサイトカインの例は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＴＮＦ－アルファ、インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロン－ベータ、インターフェロン－ガンマ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ１－アルファ、ＭＩＰ１－ベータ、ＭＩＰ３－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、および免疫応答を調節することができる他の適切なサイトカインを含むが、これらに限定されないインターロイキンである。発現されたサイトカインは、細胞内発現に向けられ得るか、または細胞外提示もしくは分泌のためのシグナル配列で発現され得る。
ＩＬ－１２：一実施形態において、ベクターは、一実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の文脈において増強された抗腫瘍効果を提供すると報告されているＩＬ－１２四量体を生成するために必要なＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）コード配列を提供することによって、ポリペプチドＩＬ－１２剤をコードする核酸配列をさらに含む（例えば、Ｐｅｇｒａｍ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｂｌｏｏｄ １１９（１８）：４１３３－４１４１、２０１７年９月５日にオンラインで公表されるＹｅｋｕ，ｅｔ ａｌ（２０１７）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｖｏｌ．７，商品番号：１０５４１）。
ＩＬ１５剤：別の実施形態において、ベクターは、ポリペプチドＩＬ－１５剤をコードする核酸配列をさらに含む。ポリペプチドＩＬ－１５剤という用語には、ヒトＩＬ－１５分子のバリアント、類似体が含まれる。別の実施形態において、ベクターは、以下の配列を有するプレ－プロ－ヒトＩＬ－１５ポリペプチド（ｈＩＬ１５）をコードする核酸配列をさらに含む。
ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳ ＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬ ＬＮＳＨＦＬＴＥＡＧ ＩＨＶＦＩＬＧＣＦＳ ＡＧＬＰＫＴＥＡＮＷ ＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩ ＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤ ＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨ ＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣ ＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬ ＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴ ＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮ ＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥ ＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥ ＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳ ＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮ ＴＳ（配列番号３９）
別の実施形態において、ベクターは、以下の配列を有するプレ－ヒトＩＬ－１５ポリペプチド（ｈＩＬ１５）をコードする核酸配列をさらに含む。
ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳ ＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬ ＬＮＳＨＦＬＴＥＡＮ ＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫ ＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩ ＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶ ＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫ ＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳ ＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤ ＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮ ＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴ ＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬ ＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱ ＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩ ＮＴＳ（配列番号４０）
別の実施形態において、ベクターは、以下の配列を有するプロ－ヒトＩＬ－１５ポリペプチド（ｈＩＬ１５）をコードする核酸配列をさらに含む。
ＧＩＨＶＦＩＬＧＣＦ ＳＡＧＬＰＫＴＥＡＮ ＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫ ＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩ ＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶ ＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫ ＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳ ＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤ ＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮ ＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴ ＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬ ＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱ ＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩ ＮＴＳ（配列番号４１）
リーダー配列なしで直接発現される場合、任意に、Ｎ末端メチオニル残基を提供する。別の実施形態において、ベクターは、以下の配列を有する成熟ヒトＩＬ－１５ポリペプチド（ｈＩＬ１５）をコードする核酸配列をさらに含む。
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫ ＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨ ＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤ ＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭ ＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩ ＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨ ＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡ ＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶ ＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥ ＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬ ＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦ ＩＮＴＳ（配列番号４２）
リーダー配列なしで直接発現される場合、任意に、Ｎ末端メチオニル残基を提供する。本発明の好ましい実施において、ＩＬ－１５剤は、システイン残基８３～１３３と９０～１３６との間のジスルフィド結合を保持し、かつ／または１２７位にＮ結合型グリコシル化ＧｌｃＮＡｃである。
前述のポリペプチドＩＬ－１５剤をコードする核酸配列を得ることは、当業者によく知られている。例えば、Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ Ｔ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｂｅｔａ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６５－９６８、Ｋｒａｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５ ｇｅｎｅ（ＩＬ１５），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８：６６７－６７４、および／またはＴａｇａｙａ，ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔａｂｌｅ ａｎｄ ｎｏｎｓｅｃｒｅｔａｂｌｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １５ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｕｓａｇｅ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９４：１４４４４－１４４４９を参照されたい。
ＩＬ－２剤：別の実施形態において、ベクターは、ポリペプチドＩＬ－２剤をコードする核酸配列をさらに含む。ポリペプチドＩＬ－２剤という用語には、ヒトＩＬ－２分子のバリアント、類似体が含まれる。別の実施形態において、ベクターは、以下の配列を有するプレ－ヒトＩＬ－２ポリペプチド（ｈＩＬ２）をコードする核酸配列をさらに含む。
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩ ＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴ ＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤ ＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮ ＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬ ＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡ ＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥ ＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬ ＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬ ＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮ ＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥ ＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥ ＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲ ＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳ ＴＬＴ（配列番号４３）
別の実施形態において、ベクターは、以下の配列を有する成熟ｈＩＬ－２ポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴ ＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤ ＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮ ＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬ ＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡ ＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥ ＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬ ＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬ ＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮ ＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥ ＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥ ＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲ ＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳ ＴＬＴ（配列番号４４）
リーダー配列なしで直接発現される場合、任意に、Ｎ末端メチオニル残基を提供する。本発明の好ましい実施において、ＩＬ－２剤は、システイン残基７８～１２５の間のジスルフィド結合を保持し、かつ／または２３位でグリコシル化される。
前述のＩＬ－２剤をコードする核酸配列を得ることは、当業者によく知られている。例えば、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０２：３１５－３１０、Ｄｅｖｏｓ，ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１：４３０７－４３２３、またはＦｕｊｉｔａ，ｅｔ ａｌ（１９８３）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８０：７３４７－７４４１を参照されたい。
ＩＬ－７剤：別の実施形態において、ベクターは、ポリペプチドＩＬ－７剤をコードする核酸配列をさらに含む。ポリペプチドＩＬ－７剤という用語には、ヒトＩＬ－７分子のバリアント、類似体が含まれる。一実施形態において、ベクターは、以下の配列を有するプレ－ヒトＩＬ－７ポリペプチド（ｈＩＬ７）をコードする核酸配列をさらに含む。
ＭＦＨＶＳＦＲＹＩＦ ＧＬＰＰＬＩＬＶＬＬ ＰＶＡＳＳＤＣＤＩＥ ＧＫＤＧＫＱＹＥＳＶ ＬＭＶＳＩＤＱＬＬＤ ＳＭＫＥＩＧＳＮＣＬ ＮＮＥＦＮＦＦＫＲＨ ＩＣＤＡＮＫＥＧＭＦ ＬＦＲＡＡＲＫＬＲＱ ＦＬＫＭＮＳＴＧＤＦ ＤＬＨＬＬＫＶＳＥＧ ＴＴＩＬＬＮＣＴＧＱ ＶＫＧＲＫＰＡＡＬＧ ＥＡＱＰＴＫＳＬＥＥ ＮＫＳＬＫＥＱＫＫＬ ＮＤＬＣＦＬＫＲＬＬ ＱＥＩＫＴＣＷＮＫＩ ＬＭＧＴＫＥＨ（配列番号４５）
別の実施形態において、ベクターは、以下の配列を有する成熟ｈＩＬ－７ポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。
ＤＣＤＩＥＧＫＤＧＫ ＱＹＥＳＶＬＭＶＳＩ ＤＱＬＬＤＳＭＫＥＩ ＧＳＮＣＬＮＮＥＦＮ ＦＦＫＲＨＩＣＤＡＮ ＫＥＧＭＦＬＦＲＡＡ ＲＫＬＲＱＦＬＫＭＮ ＳＴＧＤＦＤＬＨＬＬ ＫＶＳＥＧＴＴＩＬＬ ＮＣＴＧＱＶＫＧＲＫ ＰＡＡＬＧＥＡＱＰＴ ＫＳＬＥＥＮＫＳＬＫ ＥＱＫＫＬＮＤＬＣＦ ＬＫＲＬＬＱＥＩＫＴ ＣＷＮＫＩＬＭＧＴＫ
ＥＨ（配列番号４６）
リーダー配列なしで直接発現される場合、任意に、Ｎ末端メチオニル残基を提供する。本発明の好ましい実施において、ＩＬ－７剤は、システイン残基２７～１６６、５９～１５４、および７２～１１７の間のジスルフィド結合を保持し、かつ／または９５、１１６、および／もしくは１４１位のうちの１つ以上でグリコシル化される。前述のポリペプチドＩＬ－７剤をコードする核酸配列を得ることは、当業者によく知られている。
ＩＬ－１８剤：別の実施形態において、ベクターは、ポリペプチドＩＬ－１８剤をコードする核酸配列をさらに含む。ポリペプチドＩＬ－１８剤という用語には、ヒトＩＬ－１８分子のバリアント、類似体が含まれる。一実施形態において、ポリペプチドＩＬ－１８剤は、以下のアミノ酸配列を有するシグナル配列を有するｈＩＬ－１８のアイソフォーム１の前駆体である。
ＭＡＡＥＰＶＥＤＮＣ ＩＮＦＶＡＭＫＦＩＤ ＮＴＬＹＦＩＡＥＤＤ ＥＮＬＥＳＤＹＦＧＫ ＬＥＳＫＬＳＶＩＲＮ ＬＮＤＱＶＬＦＩＤＱ ＧＮＲＰＬＦＥＤＭＴ ＤＳＤＣＲＤＮＡＰＲ ＴＩＦＩＩＳＭＹＫＤ ＳＱＰＲＧＭＡＶＴＩ ＳＶＫＣＥＫＩＳＴＬ ＳＣＥＮＫＩＩＳＦＫ ＥＭＮＰＰＤＮＩＫＤ ＴＫＳＤＩＩＦＦＱＲ ＳＶＰＧＨＤＮＫＭＱ ＦＥＳＳＳＹＥＧＹＦ ＬＡＣＥＫＥＲＤＬＦ ＫＬＩＬＫＫＥＤＥＬ ＧＤＲＳＩＭＦＴＶＱ ＮＥＤ（配列番号４７）
別の実施形態において、ベクターは、以下の配列を有する成熟ｈＩＬ－１８アイソフォーム１ポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。
ＹＦＧＫＬＥＳＫＬＳ ＶＩＲＮＬＮＤＱＶＬ ＦＩＤＱＧＮＲＰＬＦ ＥＤＭＴＤＳＤＣＲＤ ＮＡＰＲＴＩＦＩＩＳ ＭＹＫＤＳＱＰＲＧＭ ＡＶＴＩＳＶＫＣＥＫ ＩＳＴＬＳＣＥＮＫＩ ＩＳＦＫＥＭＮＰＰＤ ＮＩＫＤＴＫＳＤＩＩ ＦＦＱＲＳＶＰＧＨＤ ＮＫＭＱＦＥＳＳＳＹ ＥＧＹＦＬＡＣＥＫＥ ＲＤＬＦＫＬＩＬＫＫ ＥＤＥＬＧＤＲＳＩＭ ＦＴＶＱＮＥＤ（配列番号４８）
一実施形態において、ポリペプチドＩＬ－１８剤は、以下のアミノ酸配列を有するシグナル配列を有するｈＩＬ－１８のアイソフォーム２（カノニカル配列のデルタ２７～３０）の前駆体である。
ＭＡＡＥＰＶＥＤＮＣ ＩＮＦＶＡＭＫＦＩＤ ＮＴＬＹＦＩＥＮＬＥ ＳＤＹＦＧＫＬＥＳＫ ＬＳＶＩＲＮＬＮＤＱ ＶＬＦＩＤＱＧＮＲＰ ＬＦＥＤＭＴＤＳＤＣ ＲＤＮＡＰＲＴＩＦＩ ＩＳＭＹＫＤＳＱＰＲ ＧＭＡＶＴＩＳＶＫＣ ＥＫＩＳＴＬＳＣＥＮ ＫＩＩＳＦＫＥＭＮＰ ＰＤＮＩＫＤＴＫＳＤ ＩＩＦＦＱＲＳＶＰＧ ＨＤＮＫＭＱＦＥＳＳ ＳＹＥＧＹＦＬＡＣＥ ＫＥＲＤＬＦＫＬＩＬ ＫＫＥＤＥＬＧＤＲＳ ＩＭＦＴＶＱＮＥＤ（配列番号４９）
前述のポリペプチドＩＬ－１８剤をコードする核酸配列を得ることは、当業者によく知られている。
一実施形態において、標的抗原の発現カセットに加えて、発現ベクターは、ＩＬ－１０ポリペプチド、特に分泌リーダー配列を含むＩＬ－１０ペプチドをコードする核酸配列を含む発現カセットをさらに含む。多数の発現カセットを使用する代わりに、ＣＡＲおよびＩＬ－１０ポリペプチドをコードする核酸配列は、ポリシストロン性構築物によってコードされ得、発現カセットは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素、ＥＦ１ａコアプロモーター、または標的細胞での共発現を促進するための口蹄疫ウイルスタンパク質２Ａ（ＦＭＶＤ２Ａ）の核酸配列を含むが、これらに限定されない、ポリシストロン構築物の下流コード配列の発現を促進するために、配列を使用する核酸配列ＣＡＲおよびＩＬ－１０ポリペプチドを含む。
発現ベクターは、任意に、「レスキュー」遺伝子をコードする核酸配列を含む追加の発現カセットを提供し得る。「レスキュー遺伝子」は、その発現が細胞を外的因子による死滅に対して感受性を示すか、または細胞が死滅するように細胞に毒性状態を引き起こす、核酸配列である。レスキュー遺伝子を提供することにより、形質導入された細胞の選択的な細胞死滅を可能にする。したがって、レスキュー遺伝子は、構築物が哺乳動物対象の細胞に組み込まれる場合にさらなる安全予防策を提供して、形質導入された細胞の望ましくない拡大または複製可能なベクター系の影響を防ぐ。一実施形態において、レスキュー遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である（例えば、１９９７年５月２０日に発行されたＷｏｏらの米国特許第５，６３１，２３６号、および１９９７年２月１１日に発行されたＦｒｅｅｍａｎらの米国特許第５，６０１，８１８号を参照のこと）であり、ＴＫ遺伝子産物を発現する細胞は、ガンシクロビルの投与による選択的死滅の影響を受けやすい。あるいは、レスキュー遺伝子は、既知の細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２０またはＥＧＦＲ）をコードし得、そのような細胞を標的とする分子（例えば、ＣＤ２０発現細胞の選択的除去にはリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）またはＥＧＦＲ発現細胞の選択的除去にはセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ商標））の投与によってＣＡＲ－Ｔ細胞の選択的死滅を可能にする。
一実施形態において、発現ベクターは、任意に、ＩＴＩＭに対する結合分子をコードする核酸配列を含むさらなる発現カセットを提供し得る。一実施形態において、発現ベクターは、任意に、その活性を阻害する免疫系の阻害性受容体の細胞質ドメイン上の免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に結合する分子をコードする核酸配列を含むさらなる発現カセットを提供し得る。ＩＴＩＭは、典型的には、配列Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌのアミノ酸の保存配列である。ＩＴＩＭを保有する阻害性受容体がそれらのリガンドと相互作用する場合、それらのＩＴＩＭモチーフは、ホスホチロシンホスファターゼＳＨＰ－１および／もしくはＳＨＰ－２またはＳＨＩＰと呼ばれるＳＨＩＰイノシトールホスファターゼなどの他の酵素を動員する能力を促進するＳｒｃキナーゼファミリー酵素によってリン酸化される。これらのホスファターゼは、細胞シグナル伝達に関与する分子の活性を下方調節する。そのようなＩＴＩＭモチーフに結合する分子の例は、当該技術分野で知られており、例えば、ＳＨＰ－１、ＳＨＰ－２、およびＳＨＩＰのうちの１つ以上を含むがこれらに限定されない、ホスホチロシンホスファターゼまたはイノシトールホスファターゼによって媒介される免疫機能の下方調節を阻害するために、ＣＡＲ発現ベクターからの細胞内発現が可能な結合分子（例えばＳｃＦｖ）の設計に使用することができる。
代替の実施形態において、発現ベクターは、任意に、特にヘテロ多量体受容体（例えば、ＩＬ－１２）の場合、受容体および／または受容体サブユニットをコードする核酸配列を含むさらなる発現カセットを提供し得る。特定の実施形態において、ベクターによってコードされる受容体は、ＩＬ２受容体、ＩＬ７受容体、ＩＬ１０受容体、ＩＬ１２受容体、ＩＬ１７受容体、ＩＬ１８受容体、およびその機能的類似体からなる群から選択される受容体のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＣＡＲ Ｔ細胞の表面上でのベクターの提示を促進するために、分泌リーダー配列を有する前述の受容体のうちの１つ以上をコードする核酸配列をさらに含む。
Ｍ．ＣＡＲ－Ｔ細胞源細胞の入手：
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、上記の教示に実質的に従って、ＣＡＲをコードする発現ベクターでの形質導入によって組換え改変されたＴ細胞である。抗標的抗原ＣＡＲをコードする発現ベクターでＴ細胞を形質転換するための前提条件は、複数のＴ細胞を得ることである。本明細書で企図されるＣＡＲ－Ｔ細胞の調製に有用なＴ細胞には、ナイーブＴ細胞、中央メモリＴ細胞、エフェクターメモリＴ細胞、またはそれらの組み合わせが含まれる。
一実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、当該技術分野で利用可能な様々なＴ細胞株のうちのいずれかによって、対象自身の（自己）Ｔ細胞から調製される（例えば、Ｓｎｏｏｋ ａｎｄ Ｗａｌｄｍａｎ（２０１３）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １５（８１）：１２０－２５）。形質転換のためのＴ細胞は、典型的には、治療される哺乳動物対象から得られる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、脾臓組織、および腫瘍を含む、哺乳動物対象の多くの供給源から得られ得る。一実施形態において、Ｔ細胞は、白血球アフェレーシスなどのアフェレーシス手順によって得られる。白血球アフェレーシスは、当業者によく知られているプロセスであり、製造業者によって提供される取扱説明書に実質的に従って、Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ（登録商標）５＋（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，４００ Ｗｏｏｄ Ｒｏａｄ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ ＭＡ ０２１８４から市販されている）、またはＣＯＢＥ（登録商標）２９９１細胞プロセッサ（ＴｅｒｕｍｏＢＣＴ，Ｉｎｃ．１０８１１ Ｗｅｓｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ａｖｅｎｕｅ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ ＣＯ ８０２１５から市販されている）を含むが、これらに限定されない、市販の機器を用いて達成され得る。代替の実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、同種異系であり得る（例えば、Ｇｏｕｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｏｆ ｏｆ ｃｏｎｃｅｐｔ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ＵＣＡＲＴ１９，ａｎ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ“ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ”ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｇａｉｎｓｔ ＣＤ１９＋Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ；Ｂｌｏｏｄ １２４：４６８９を参照のこと）。
一実施形態において、Ｔ細胞は、末梢血から単離され、特定のＴ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞など）は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共役ビーズとのインキュベーションである、当該技術分野でよく知られている選択技術によって単離され得る。単離されたＴ細胞の集団から、特定のマーカーが濃縮されたＴ細胞のサブセットが、得られ得る。典型的には、Ｔ細胞のサブセットは、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２５＋、またはＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞を含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞上の１つ以上の細胞表面マーカーの発現に基づいて単離される。１つ以上の特定のマーカーが濃縮されたＴ細胞のサブセットの調製は、製造業者の取扱説明書に実質的に従って、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＰｌｕｓおよびＰｒｏｄｉｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．，２３０３ Ｌｉｎｄｂｅｒｇｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ ９５６０２から市販されている）を含むが、これらに限定されない、市販の機器を使用する当該技術分野でよく知られている技術によって達成され得る。一実施形態において、ＣＤ３＋ＣＡＲ－Ｔ細胞が濃縮された集団が、さらなるプロセシングのために使用される。しかしながら、ナイーブＴ細胞、中央メモリ、またはメモリ幹細胞などのＴ細胞の他のサブセットも使用され得る。
上記の手順に実質的に従って調製された処理済みＴ細胞は、さらなる処理に使用され得るか、または凍結保存され得る。
Ｎ．ＣＡＲ発現ベクターによるＴ細胞の形質転換：
ＣＡＲ発現ベクターによるＴ細胞の形質導入は、ウイルスベクターを用いた宿主Ｔ細胞との共インキュベーション、エレクトロポレーション、および／または化学的に増強された送達を含むが、これらに限定されない、当該技術分野でよく知られている技術を使用して達成され得る。例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｌｅ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎｄｉｖｉｄｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３－２６７、Ｎａｌｄｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．１１３８２－１１３８８、Ｄｕｌｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａ Ｔｈｉｒｄ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（１１）：８４６３－８４７１、Ｍｉｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ１３７ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４、Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ｂｏｙｅｒｉｎａｓ （２１０６）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ４：９を参照されたい。
Ｏ．ＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大
形質転換後、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号に記載されているような方法を一般的に使用して活性化および拡大することができる。一般に、本発明のＴ細胞は、表面と接触して細胞を培養することにより増殖し、ＣＤ３ ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤（例えば、抗ＣＤ３抗体）およびＴ細胞の表面上に共刺激分子を刺激する薬剤（例えば抗ＣＤ２８抗体）を提供する表面で接触する細胞を培養することによって拡大される。Ｔ細胞培養に適した条件は、Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １１（７）：９１２－９２２（表現型および多機能抗原に特異的なＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞応答をモニタリングするための堅牢なヒトＴ細胞培養法の最適化および検証）、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４：ｅ３１ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １６ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５（「新規の異種フリーＣＴＳ免疫細胞血清置換を使用した養子免疫療法のためのヒトＴ細胞のエクスビボでの拡大」）の当該技術分野でよく知られている。標的細胞は、成長を支援するために必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気プラス５％ＣＯ２）の下で維持される。エクスビボでのＴ細胞活性化は、細胞ベースのＴ細胞活性化、抗体ベースの活性化、または様々なビーズベースの活性化試薬を使用する活性化を含む、当該技術分野で確立した手順によって達成され得る。細胞ベースのＴ細胞活性化は、樹状細胞などの抗原提示細胞または照射されたＫ５６２細胞などの人工抗原提示細胞へのＴ細胞の曝露によって達成され得る。可溶性抗ＣＤ３モノクローナル抗体によるＴ細胞表面ＣＤ３分子の抗体ベースの活性化もまた、ＩＬ－２の存在下でのＴ細胞活性化を支援するか、あるいは、臨床使用のためのＣＡＲ－Ｔ細胞の調製のために当該技術分野で受け入れられるビーズベースのＴ細胞活性化を得る。Ｔ細胞のビーズベースの活性化は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）ＣＴＳ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ３／２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡから市販されている）またはＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ ＥｘｐＡｃｔ ＴｒｅｇビーズまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ ＧＭＰ ＴｒａｎｓＡｃｔ（登録商標）ＣＤ３／２８ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．から市販されている）を含むが、これらに限定されない、多種多様な市販のＴ細胞活性化試薬を使用して達成され得る。ＧＥ ＷＡＶＥバイオリアクターシステム、Ｇ－Ｒｅｘバイオリアクター、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙシステム、および再帰的ＡＡＰＣ刺激を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞の実験室または商業規模の拡張に使用可能である。
Ｐ．培地：
本発明は、ＩＬ－１０剤を補充したＣＡＲ－Ｔ細胞の培養のための培地をさらに提供する。一実施形態において、本発明の培地は、ＩＬ－１０剤が少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも０．２ｎｇ／ｍｌ、少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２ｎｇ／ｍｌ、少なくとも３ｎｇ／ｍｌ、少なくとも４ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１５００ｎｇ／ｍｌの濃度を達成するためにＩＬ－１０剤が補充される完全な培地である。
培地中のＩＬ－１０のレベルは、ＩＬ－１０がＴ細胞に対して毒性があるレベルよりも低いレベルで、任意に、毒性ＩＬ－１０剤濃度の５０％未満、任意に、毒性ＩＬ－１０剤濃度の３０％未満、任意に、毒性ＩＬ－１０剤濃度の２０％未満、または任意に、毒性ＩＬ－１０剤濃度の１０％未満で維持するべきである。
Ｔ細胞の培養および増殖に有用な培地は、当該技術分野でよく知られている。Ｔ細胞の完全な培地の培養の技術の一般的な実践において。Ｔ細胞などの白血球の培養に使用される典型的な完全培地は、Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（１９６７）Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．，１９９：５１９に記載されるＲＰＭＩ培地、およびＭｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ，Ｌ．Ｋ．，”Ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ＲＰＭＩ １６０３，ＲＰＭＩ １６３４，ＲＰＭＩ １６４０ ａｎｄ ＧＥＭ １７１７．”Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，ｖ．３，５０３－５０８（１９７６）に記載されるそのバリアントである。ＲＰＭＩ培地の例示的な製剤は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からカタログ番号１１８７５として入手可能なＲＰＭＩ １６４０培地であり、水溶液中に以下の製剤を有する。
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Ｑ．治療的および予防的使用
本開示は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の治療効果を増強するために、本明細書に記載のＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）の使用を企図する。より具体的には、ＩＬ－１０剤は、対象における標的細胞集団へのＴ細胞媒介性免疫応答の調節を目的とした方法であって、キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変された治療上有効な複数の細胞を対象に導入することであって、当該キメラ抗原受容体が、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の治療効果を増強するために、ＩＬ－１０剤と併用して標的細胞集団に結合することができる少なくとも１つの抗原特異的標的化領域を含む、導入することを含む、方法に使用される。
Ｒ．治療に適している新生物：
本発明の組成物および方法は、良性および悪性腫瘍を含む腫瘍、ならびに腫瘍性疾患の治療に有用である。本発明の組成物および方法を使用する治療に適した良性腫瘍の例には、腺腫、線維腫、血管腫、および脂肪腫が含まれるが、これらに限定されない。本発明の組成物および方法を使用する治療に適した前悪性腫瘍の例には、過形成、非定型性、化生、および異形成が含まれるが、これらに限定されない。本発明の組成物および方法を使用する治療に適した悪性腫瘍の例には、癌腫（皮膚、または内臓を覆う組織などの上皮組織から生じる癌）、白血病、リンパ腫、および（典型的には、骨、脂肪、筋肉、血管、または結合組織に由来する）肉腫が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍という用語には、ウイルス誘導腫瘍（疣贅など）およびＥＢＶ誘導疾患（すなわち、伝染性単核症）、瘢痕形成、過剰増殖性血管疾患（内膜平滑筋細胞過形成、再狭窄、および血管閉塞などを含む）もまた含まれる。
「腫瘍性疾患」という用語は、乳癌；肉腫（骨肉腫および血管肉腫ならびに線維肉腫を含むがこれらに限定されない）、白血病、リンパ腫、泌尿生殖器癌（卵巣癌、尿道癌、膀胱癌、および前立腺癌を含むがこれらに限定されない）；消化器癌（結腸食道癌および胃癌を含むがこれらに限定されない）；肺癌；骨髄腫；膵臓癌；肝臓癌；腎臓癌；内分泌癌；皮膚癌；ならびに神経膠腫および神経芽腫、星状細胞腫、骨髄異形成障害を含む、悪性または良性の脳腫瘍または中枢および末梢神経（ＣＮＳ）系腫瘍；子宮頸上皮内癌；腸ポリープ症；口腔白板症；組織球増殖症、過剰増殖性瘢痕（ケロイド瘢痕を含む）、血管腫；過剰増殖性動脈狭窄、乾癬、炎症性関節炎；角質増殖症および丘疹鱗屑性発疹（関節炎を含む）を含むが、これらに限定されない、固形腫瘍および非固形腫瘍によって特徴付けられる癌を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲのＡＲＤは、例えば、アルツハイマー病の治療のための抗Ａβ ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、関節炎の治療のための抗ＴＮＦ ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、プラーク乾癬の治療のための抗ＩＬ１７ＲＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、前立腺癌および良性前立腺過形成の治療のための抗ＰＳＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、皮膚炎の治療のための抗ＩＬ４ＲＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、高コレステロール血症の治療のための抗ＰＣＳＫ９ ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、加齢性黄斑変性症の治療のための抗ＶＥＧＦＲ１ ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、加齢性黄斑変性症の治療のための抗ＶＥＧＦＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、リウマチ関節炎の治療のための抗ＩＬ－６Ｒ ＣＡＲ－Ｔ細胞、例えば、乾癬、関節炎、およびクローン病の治療のための抗ＩＬ－２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞、ならびに例えば、ＨＩＶ感染の治療のための抗ＣＤ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞組成物を含むがこれらに限定されない、非癌性炎症および過剰増殖状態に関連する細胞表面マーカーと相互作用するように、それらの使用の関連方法が設計される。
「腫瘍性疾患」という用語は、骨髄性腫瘍およびリンパ系腫瘍を含む。各カテゴリは、形態学、病理生物学、治療、および／または予後を定義する特徴を有する、異なる種類の造血癌を含有する。最適な治療を可能にするには、予後または化学療法に対する応答に影響を与える可能性がある追加の因子の特定とともに、正しい分類が不可欠である。骨髄性腫瘍には、骨髄増殖性腫瘍、好酸球増加症を伴う骨髄性およびリンパ系障害、骨髄増殖性／骨髄異形成性腫瘍、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病および関連する前駆腫瘍、ならびに分化系統不明瞭な急性白血病が含まれるが、これらに限定されない。リンパ系腫瘍には、前駆リンパ系腫瘍、成熟Ｂ細胞腫瘍、成熟Ｔ細胞腫瘍、ホジキンリンパ腫、および免疫不全関連リンパ増殖性障害が含まれるが、これらに限定されない。造血系の他の癌には、組織球性腫瘍および樹状細胞腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
Ｓ．抗腫瘍効果および臨床反応の評価：
癌の治療における臨床有効性の決定は一般に、病変の低減、特に転移性病変の低減、転移の低減、腫瘍体積の低減、およびＥＣＯＧスコアの改善などの、１つ以上の当該技術分野で認識されているパラメータの達成に関連付けられる。治療に対する応答の決定は、そのような療法に対する対象の応答の存在および程度、ならびにそのような療法によって引き起こされる有害作用の存在および程度を含む、ＩＬ－１０または免疫経路調節剤のいかなる態様でも有用な、再現性のある情報を提供することができるバイオマーカーの測定を通して、評価することができる。限定ではなく、例として、バイオマーカーには、ＩＦＮγの増強、ならびにグランザイムＡ、グランザイムＢ、およびパーフォリンの上方制御、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数および機能の増加、ＩＦＮγの増強、ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＩＣＯＳ発現の増加ＩＬ－１０発現ＴＲｅｇ細胞の増強を含む。エフェクター分子ＩＰ－１０（誘導性タンパク質１０）およびＭＩＧ（ＩＦＮγによって誘導されるモノカイン）の発現は、ＬＰＳまたはＩＦＮγのいずれかによって、特定のＩＬ－１０発現腫瘍内で増加することが知られており、これらのエフェクター分子はまた、本明細書に記載のコンビナトリアル療法によって増強され得る潜在的な血清バイオマーカーとして活用することもできる。治療に対する応答は、従来の臨床有効性の指標の向上によって特性評価することができ、完全応答（ＣＲ）、部分応答（ＰＲ）、安定疾患（ＳＤ）、および標的病変に関しては、ＲＥＣＩＳＴによって定義される、完全応答（ＣＲ）、不完全応答／安定疾患（ＳＤ）、ならびに免疫関連応答基準（ｉｒＲＣ）によって定義される、免疫関連完全応答（ｉｒＣＲ）、免疫関連部分応答（ｉｒＰＲ）、および免疫関連安定疾患（ｉｒＳＤ）などを用いることができ、当業者は、哺乳動物（例えばヒト）対象における腫瘍性疾患の治療における有効性を証明するものと見なす。
さらなる実施形態は、併用における最適な量の薬剤（複数可）を決定するための方法またはモデルを含む。最適な量は、例えば、対象または対象集団において最適な効果を達成する量、または１つ以上の薬剤に関連する悪影響を最小化もしくは排除しながら、治療効果を達成する量であり得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１０とＣＡＲ－Ｔ細胞自体との組み合わせの要素は、対象（例えば、ヒト）または対象集団における、本明細書に記載の疾患、障害、または病態（例えば、癌性病態）の治療または予防に有効であることが既知であるか、または決定されており、１つの薬剤の量が、他の薬剤（複数可）の量を一定に保ちながら、滴定される。この様式で薬剤（複数可）の量を操作することによって、臨床医は、例えば、特定の疾患、障害、もしくは病態の治療、または副作用の排除もしくはその状況下で許容されるような副作用の低減に最も有効な薬剤の比率を決定することができる。
特定の実施形態において、治療上有効な量のＩＬ－１０剤（例えば、皮下）および治療上有効な複数のＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、静脈内）が、対象に非経口的に投与される。他の実施形態において、キメラ抗原受容体およびＩＬ－１０剤を発現するように遺伝子改変された治療上有効な複数の細胞が、静脈内注入によって対象に導入される。他の実施形態において、キメラ抗原受容体およびＩＬ－１０剤を発現するように遺伝子改変された治療上有効な複数の細胞が、腫瘍内注射によって対象に導入される。他の実施形態において、キメラ抗原受容体およびＩＬ－１０剤を発現するように遺伝子改変された治療上有効な複数の細胞が、局所領域注入によって対象に導入される。さらに別の実施形態において、活性化誘導細胞死を防止または制限するのに十分な治療上有効な量のＩＬ－１０剤が、ＩＬ－１０剤を発現するように遺伝子改変された細胞によって対象に導入され、それによって発現構築物はＣＡＲを発現する細胞とは異なる細胞中に存在する。
ＣＡＲ－Ｔ細胞がＩＬ－１０剤も発現するこれらの実施形態において、その直接的および局所的効果のために、治療上有効な量を達成するために必要なＩＬ－１０剤の量は、ＩＬ－１０剤の全身投与による治療効果を達成するために必要とされるものよりも有意に低くてもよい。本明細書に記載されるように、ＩＬ－１０の発現のレベルは、原位置でのＩＬ－１０の発現レベルの調節を容易にする調節可能なプロモーターの制御下にあり得る。
Ｔ．投与／投薬：
一般に、治療剤の投薬パラメータは、投薬量が、対象に不可逆的に毒性であり得る量（すなわち、最大耐量、「ＭＴＤ」）未満であり、かつ対象に測定可能な効果をもたらすのに必要な量未満ではないことを指示する。そのような量は、例えば、投与経路および他の因子を考慮して、ＡＤＭＥに関連する薬物動態学的および薬力学的パラメータによって決定される。
有効用量（ＥＤ）は、それを服用する対象の一部において治療応答または所望の効果をもたらす薬剤の用量または量である。ある薬剤の「有効用量中央値」またはＥＤ５０は、それが投与される集団の５０％において治療応答または所望の効果をもたらす薬剤の用量または量である。ＥＤ５０は一般的に、薬剤の効果の妥当な期待値の尺度として使用されるが、臨床医が必ずしもすべての関連する因子を考慮して適切と見なし得る用量であるわけではない。したがって、いくつかの状況では、有効量は、ＥＤ５０計算値を超える可能性があり、他の状況では、有効量は、ＥＤ５０計算値未満である可能性があり、さらに他の状況では、有効量は、ＥＤ５０計算値と同じである可能性がある。
本開示の治療剤（例えば、ＩＬ－１０剤およびＣＡＲ－Ｔ細胞）は、例えば、投与の目標（例えば、所望の消散の程度）；製剤が投与される対象の年齢、体重、性別、健康状態、および体調；ならびに投与経路に依存する量で、対象に投与することができる。治療上有効な量および投薬レジメンは、例えば、安全性および用量漸増試験、インビボ研究（例えば、動物モデル）、ならびに当業者に既知の他の方法から決定することができる。
１．ＩＬ－１０剤の投与／投薬：
一実施形態において、ＩＬ－１０剤および他の薬剤（複数可）による治療は、一定期間にわたって維持される。別の実施形態において、少なくとも１つの他の薬剤（複数可）による治療は、低減または中止され（例えば、対象は安定している場合）、その間、本開示のＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）は、一定の投薬レジメンで維持される。さらなる実施形態において、他の薬剤（複数可）による治療は、低減または中止され（例えば、対象が安定している場合）、一方、本開示のＩＬ－１０剤による治療は、低減される（例えば、より低い用量、より低い頻度の投薬、またはより短い治療レジメン）。さらに別の実施形態において、他の薬剤（複数可）による治療は、低減または中止され（例えば、対象が安定している場合）、本開示のＩＬ－１０剤による治療は、増大される（例えば、より高い用量、より高い頻度の投薬、またはより長い治療レジメン）。さらに別の実施形態において、他の薬剤（複数可）による治療は、維持され、本開示のＩＬ－１０剤による治療は、低減または中止される（例えば、より低い用量、より低い頻度の投薬、またはより短い治療レジメン）。さらに別の実施形態において、他の薬剤（複数可）による治療および本開示のＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）による治療は、低減または中止される（例えば、より低い用量、より低い頻度の投薬
本明細書に記載の方法におけるＩＬ－１０の血漿レベルは、（１）ある特定のレベルを超えるか、またはあるレベルの範囲内の、平均ＩＬ－１０血清中トラフ濃度、（２）ある期間にわたって、ある特定のレベルを超える平均ＩＬ－１０剤血清中トラフ濃度、（３）ある特定のレベルを超えるかもしくはそれ未満であるか、またはあるレベルの範囲内の、定常状態のＩＬ－１０血清濃度レベル、あるいは（４）ある特定のレベルを超えるかもしくはそれ未満であるか、またはあるレベルの範囲内の、濃度プロファイルのＣｍａｘを含む、いくつかの様式で特性評価することができる。本明細書に明記されるように、平均ＩＬ－１０血清中トラフ濃度は、ある特定の適応症における有効性にとって特に重要であることが見出されている。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１０血清中トラフ濃度は、一定期間にわたって、約０．１ｎｇ／ｍＬ超、約０．２ｎｇ／ｍＬ超、約０．３ｎｇ／ｍＬ超、約０．４ｎｇ／ｍＬ超、約０．５ｎｇ／ｍＬ超、約０．６ｎｇ／ｍＬ超、約０．７ｎｇ／ｍＬ超、約０．８ｎｇ／ｍＬ超、約０．９ｎｇ／ｍＬ超、約１．０ｎｇ／ｍＬ超、約１．５ｎｇ／ｍＬ超、約２．０ｎｇ／ｍＬ超、約２．５ｎｇ／ｍＬ超、約３．０ｎｇ／ｍＬ超、約３．５ｎｇ／ｍＬ超、約４．０ｎｇ／ｍＬ超、約４．５ｎｇ／ｍＬ超、約５．０ｎｇ／ｍＬ超、約５．５ｎｇ／ｍＬ超、約６．０ｎｇ／ｍＬ超、約６．５ｎｇ／ｍＬ超、約７．０ｎｇ／ｍＬ超、約７．５ｎｇ／ｍＬ超、約８．０ｎｇ／ｍＬ超、約８．５ｎｇ／ｍＬ超、約９．０ｎｇ／ｍＬ超、約９．５ｎｇ／ｍＬ、または約１０．０ｎｇ／ｍＬ超のレベルで維持される。
本開示の特定の実施形態において、平均ＩＬ－１０剤血清中トラフ濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１０．０ｎｇ／ｍＬの範囲内である。さらに他の実施形態において、平均ＩＬ－１０剤血清中トラフ濃度は、１．０ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬの範囲内である。例として、一実施形態において、平均ＩＬ－１０剤血清濃度は、０．５ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬの範囲内であり得る。さらなる例として、本開示の特定の実施形態は、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１０．５ｎｇ／ｍＬ、約１．０ｎｇ／ｍＬ～約１０．０ｎｇ／ｍＬ、約１．０ｎｇ／ｍＬ～約９．０ｎｇ／ｍＬ、約１．０ｎｇ／ｍＬ～約８．０ｎｇ／ｍＬ、約１．０ｎｇ／ｍＬ～約７．０ｎｇ／ｍＬ、約１．５ｎｇ／ｍＬ～約１０．０ｎｇ／ｍＬ、約１．５ｎｇ／ｍＬ～約９．０ｎｇ／ｍＬ、約１．５ｎｇ／ｍＬ～約８．０ｎｇ／ｍＬ、約１．５ｎｇ／ｍＬ～約７．０ｎｇ／ｍＬ、約２．０ｎｇ／ｍＬ～約１０．０ｎｇ／ｍＬ、約２．０ｎｇ／ｍＬ～約９．０ｎｇ／ｍＬ、約２．０ｎｇ／ｍＬ～約８．０ｎｇ／ｍＬ、および約２．０ｎｇ／ｍＬ～約７．０ｎｇ／ｍＬの範囲内の平均ＩＬ－１０血清中トラフ濃度を含む。
特定の実施形態において、１～２ｎｇ／ｍＬの平均ＩＬ－１０血清中トラフ濃度は、治療期間にわたって維持される。本開示はまた、平均ＩＬ－１０血清中ピーク濃度が、治療期間にわたって約１０．０ｎｇ／ｍＬ以下である実施形態も企図する。
本開示は、一定期間にわたって、上記に明記されるＩＬ－１０血清中トラフ濃度のうちのいずれかの維持をもたらす、任意の用量および投薬レジメンの投与を企図する。限定ではなく、例として、対象がヒトである場合、非ペグ化ｈＩＬ－１０は、０．５μｇ／ｋｇ／日超、１．０μｇ／ｋｇ／日超、２．５μｇ／ｋｇ／日超、５μｇ／ｋｇ／日超、７．５μｇ／ｋｇ超、１０．０μｇ／ｋｇ超、１２．５μｇ／ｋｇ超、１５μｇ／ｋｇ／日超、１７．５μｇ／ｋｇ／日超、２０μｇ／ｋｇ／日超、２２．５μｇ／ｋｇ／日超、２５μｇ／ｋｇ／日超、３０μｇ／ｋｇ／日超、または３５μｇ／ｋｇ／日超の用量で投与することができる。加えて、限定ではなく、例として、対象がヒトである場合、比較的小さいＰＥＧを含むペグ化ｈＩＬ－１０（例えば、５ｋＤａのモノ－ジ－ＰＥＧ－ｈＩＬ－１０）は、０．５μｇ／ｋｇ／日超、０．７５μｇ／ｋｇ／日超、１．０μｇ／ｋｇ／日超、１．２５μｇ／ｋｇ／日超、１．５μｇ／ｋｇ／日超、１．７５μｇ／ｋｇ／日超、２．０μｇ／ｋｇ／日超、２．２５μｇ／ｋｇ／日超、２．５μｇ／ｋｇ／日超、２．７５μｇ／ｋｇ／日超、３．０μｇ／ｋｇ／日超、３．２５μｇ／ｋｇ／日超、３．５μｇ／ｋｇ／日超、３．７５μｇ／ｋｇ／日超、４．０μｇ／ｋｇ／日超、４．２５μｇ／ｋｇ／日超、４．５μｇ／ｋｇ／日超、４．７５μｇ／ｋｇ／日超、または５．０μｇ／ｋｇ／日超の用量で投与することができる。
さらなる実施形態において、ＩＬ－１０剤の血清中トラフレベルが維持される前述の期間は、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１カ月間、少なくとも６週間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも９カ月間、または１２カ月間超である。
本開示の特定の実施形態において、平均ＩＬ－１０血清中トラフ濃度は、この期間の少なくとも８５％、この期間の少なくとも９０％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％維持される。
特定のＩＬ－１０血清濃度などを達成するために必要なＩＬ－１０血清濃度、用量、および治療プロトコルに関する前述の考察は、ＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）による単剤療法に関係しているが、当業者（例えば、薬理学者）は、ＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）が１つ以上の追加の治療法と併用して投与される場合、最適な投薬レジメン（複数可）を決定することができる。
２．ＣＡＲ－Ｔ細胞剤の投与／投薬
前に考察されたように、ＣＡＲ－Ｔ剤は、ＣＡＲ－Ｔ融合タンパク質をコードする組換えベクターの宿主として患者自身のＴ細胞を使用して調製される。結果として、投与される細胞の集団は、対象に必然的に可変である。さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞剤が変動するため、そのような薬剤への応答は、変動し得、したがって、治療に関連する毒性の継続的なモニタリングおよび管理が含まれる。
マウスの動物モデルに基づいて、治療過程ごとに動物あたり５００万個の細胞の投与は、有意な抗腫瘍反応を示す。ヒトに対して計量される場合、この用量は、約０．５×１０１０個の生存ＣＡＲ－Ｔ細胞の用量とほぼ等しい。
本発明の実施におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の投与の典型的な範囲は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の過程ごとに対象体重１ｋｇあたり約１×１０５～５×１０８の生存可能なＣＡＲ－Ｔの範囲である。したがって、体重に対して調節され、ヒト対象における生存Ｔ細胞の投与のための典型的な範囲は、治療過程において、個約１×１０６～約１×１０１３個の生存ＣＡＲ－Ｔ細胞、あるいは約５×１０６～約５×１０１２個、あるいは約１×１０７～約１×１０１２個、あるいは約５×１０７～約１×１０１２個、あるいは約１×１０８～約１×１０１２個、あるいは約５×１０８～約１×１０１２個、あるいは約１×１０９～約１×１０１２個の範囲に及ぶ。一実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞の用量は、治療過程ごとに２．５～５×１０９個の生存ＣＡＲ－Ｔ細胞の範囲内である。健康な成人のＴ細胞の平均数は、約１×１０１２個の細胞であると推定され、用量範囲は、Ｔ細胞の総体重の約１％未満である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、５０ｋｇ以上の患者には、体重１ｋｇ当たり０．２～５．０×１０６個のＣＡＲ陽性生存Ｔ細胞を単回投与し、≦５０ｋｇ未満の患者には、０．１～２．５×１０８個のＣＡＲ陽性生存Ｔ細胞を単回投与されるＫｙｍｒｉａｈである。
ＣＡＲ－Ｔ細胞剤による治療過程は、一定期間にわたって、単回投与または多数回投与であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、単回投与で投与される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２１、２８、３０、６０、９０、または１２０日の期間にわたって、投与される２つ以上の分割用量で投与される。そのような分割投与プロトコルで投与される細胞の量は、各投与で同じであり得るか、または異なるレベルを提供し得る。例えば、複数日間の３回投与分割投与プロトコルで提供される治療過程は、１日目に１０％、２日目に３０％、および３日目に６０％、あるいは１日目に１０％、２日目に４０％、３日目に５０％、あるいは１日目に２５％、２日目に２５％、３日目に５０％、あるいは１日目に５０％、１４日目に５０％、あるいは１日目に５０％、７日目に５０％、あるいは１日目に５０％、３０日目に５０％、あるいは１日目に２５％、１４日目に２５％、３０日目に５０％、あるいは１日目に５０％、１４日目に２５％、３０日目に２５％、あるいは１日目に６０％、１４日目に３０％、３０日目に１０％、またはあるいは１日目に５０％、３０日目に２５％、６０日目に２５％の投与を提供し得る。
前に考察されたように、ＣＡＲ－Ｔ剤は、ＣＡＲ－Ｔ融合タンパク質をコードする組換えベクターの宿主として患者自身のＴ細胞を使用して調製され得る。結果として、投与される細胞の集団は、対象に必然的に非常に可変である。結果として、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の投与に関連する投薬量も可変であり、しばしば毒性の管理の機能である。薬理学的免疫抑制またはＢ細胞枯渇の過程で管理される過剰な免疫応答（サイトカイン放出症候群を含む）における同種または自己Ｔ細胞注入に関連する毒性の一形態。全身性コルチコルステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン）を含むそのような免疫抑制療法の例。Ｂ細胞枯渇の治療法には、血清免疫グロブリンレベルの正常レベルを回復するための確立された臨床投与ガイドラインによる静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）が含まれる。
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞療法の投与前に、対象は、任意に、リンパ球枯渇レジメンに供され得る。そのようなリンパ球枯渇レジメンの一例は、対象への、フルダラビン（３０ｍｇ／ｍ２の静脈内［ＩＶ］を４日間毎日）およびシクロホスファミド（５００ｍｇ／ｍ２のＩＶを２日間毎日、フルダラビンの第１の投与から開始して）の投与からなる。このようなリンパ球枯渇は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法における反応の改善と関連している。
本明細書に記載されるように、ＩＬ－１０剤（および任意に、追加の免疫調節剤および治療剤）と併用したＣＡＲ－Ｔ細胞の投与は、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性および免疫調節特性を増強する。結果として、所与の疾患、障害、または病態の治療に従来使用されているＣＡＲ－Ｔ細胞のレベルは、ＩＬ－１０剤と併用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法で潜在的に特定される副作用の低減を達成する場合に低減され得る。したがって、本発明は、ＩＬ－１０剤と併用したＣＡＲ－Ｔ細胞剤の投与によって、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に関連する副作用を低減する方法を企図する。本発明の組成物および方法を使用することによって緩和され得る副作用の例には、サイトカイン放出症候群、標的外反応性、免疫抑制、および炎症が含まれるが、これらに限定されない。
Ｕ．さらなる化学療法剤との組み合わせ：
本明細書に記載されるＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ－１０剤の併用療法と併せて、本開示は、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ－１０剤の併用療法への１つ以上の活性剤（「補助剤」）の追加を企図する。そのようなさらなる併用は、「補助的併用」、「補助的併用療法」と称され、ＣＡＲ－Ｔ細胞とＩＬ－１０剤との併用療法に添加される薬剤は、「補助剤」と称され得る。
本明細書で使用される場合、「補助的併用」は、例えば、別々の投与のために別々に製剤化された別々に投与または導入することができるこれらの併用（例えば、キット中で提供され得るものなど）、および一緒に投与または導入することができる治療薬を含むことを意味する。ある特定の実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ－１０剤の併用療法および補助剤（複数可）は、例えば、１つの薬剤が、１つ以上の他の薬剤の前に投与される場合には、連続して投与または適用される。他の実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞／ＩＬ－１０剤の併用療法および補助剤（複数可）は、例えば、２つ以上の薬剤が同時にまたはほぼ同時に投与され、これらの２つ以上の薬剤は、２つ以上の別々の製剤中に存在してもよく、あるいは単一の製剤（すなわち、同時製剤）に組み合されてもよい場合には、同時に投与される。薬剤が連続的に投与されるのか同時に投与されるのかにかかわらず、これらは、本開示の目的では組み合わせて投与されると見なされる。
一実施形態において、補助剤は、化学療法剤である。「化学療法剤」という用語は、チオテパおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メトレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチルオロメラミンを含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン；キオランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート、葉酸などの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（Ａｒａ－Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル、ｎａｂ－パクリタキセル、およびドセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金および白金配位錯体（シスプラチン、オキサプラチン、およびカルボプラチンなど）；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含むが、これらに限定されない。「化学療法剤」という用語はまた、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、オナプリストン、およびトレミフェンなどの抗エストロゲン；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体などの、腫瘍に対するホルモン作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含む。いくつかの実施形態において、補助剤は、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニスト（ＩＬ－１２など）、ＩＮＦα、または抗上皮成長因子受容体、放射線療法、イリノテカン；テトラヒドロ葉酸代謝拮抗剤（ペメトレキセドなど）；腫瘍抗原に対する抗体、モノクローナル抗体と毒素との複合体、Ｔ細胞アジュバント、骨髄移植、または抗原提示細胞（例えば、樹状細胞療法）、抗腫瘍ワクチン、複製可能ウイルス、およびシグナル伝達阻害剤（例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）もしくはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））または腫瘍成長の相加的または相乗的抑制を達成するための免疫調節剤、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、シクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）阻害剤、ステロイド、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標））、インターフェロン－β１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標））、およびインターフェロン－β１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標））、ならびにＴＡＣ、ＦＯＬＦＯＸ、ＴＰＣ、ＦＥＣ、ＡＤＥ、ＦＯＬＦＯＸ－６、ＥＰＯＣＨ、ＣＨＯＰ、ＣＭＦ、ＣＶＰ、ＢＥＰ、ＯＦＦ、ＦＬＯＸ、ＣＶＤ、ＴＣ、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＰＣＶ、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ、ＩＣＥ－Ｖ、ＸＥＬＯＸ、および当業者によって認められているその他のものが含まれるが、これらに限定されない、腫瘍性疾患の治療に有用なものとして当該技術分野で特定される、１つ以上の化学的または生物学的薬剤であってもよい。
一実施形態において、補助剤は、１つ以上の非薬理学的モダリティ（例えば、局所放射線療法または全身放射線療法）である。例として、本開示は、放射線相が、１つ以上のさらなる療法（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法およびＩＬ－１０剤の投与）または本明細書に記載される薬剤による治療の前または後に続く治療レジメンを企図する。いくつかの実施形態において、本開示は、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、または他のタイプの移植治療と併用したＣＡＲ－Ｔ細胞療法およびＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）の使用をさらに企図する。
本発明の一実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与前に、対象は、既存のＴ細胞を除去するために「化学プライミング」を受ける。典型的な診療では、化学プライミングは、シクロホスファミドとフルダカルビンの併用投与などのシクロホスファミド化学療法レジメン、プラチナベースの化学療法レジメン、タキサン、テモゾロミドを含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞の減少または切除をもたらす１つ以上の治療モダリティの投与によって達成される。
Ｖ．チェックポイント調節剤との組み合わせ：
別の実施形態において、「補助剤」は、対象における腫瘍性疾患、ならびに腫瘍性疾患に関連する疾患、障害、または病態の治療および／または予防のための免疫チェックポイント調節剤である。「免疫チェックポイント経路」という用語は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現する第１の分子（例えば、ＰＤ１などのタンパク質）が、免疫応答の刺激（例えば、Ｔ細胞活性の上方制御）または阻害（例えば、Ｔ細胞活性の下方制御）のいずれかを通して免疫応答を調節する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）上に発現する第２の分子（例えば、ＰＤＬ１などのタンパク質）に結合することによって引き起こされる、生物学的応答を指す。免疫応答を調節する結合対の形成に関与する分子は一般に、「免疫チェックポイント」と称される。そのような免疫チェックポイント経路によって調節される生物学的応答は、細胞活性化、サイトカイン産生、細胞遊走、細胞毒性因子分泌、および抗体産生などの下流免疫エフェクター経路をもたらす細胞内シグナル伝達経路によって媒介される。免疫チェックポイント経路は一般に、第１の細胞表面発現分子が免疫チェックポイント経路に関連する第２の細胞表面分子に結合すること（例えば、ＰＤ１がＰＤＬ１に、ＣＴＬＡ４がＣＤ２８に結合することなど）によって引き起こされる。免疫チェックポイント経路の活性化は、免疫応答の刺激または阻害をもたらすことができる。
その活性化が免疫応答の阻害または下方制御をもたらす免疫チェックポイントは、本明細書では「負の免疫チェックポイント経路」と称される。負の免疫チェックポイントの活性化から生じる免疫応答の阻害は、宿主免疫系が腫瘍関連抗原などの外来抗原を認識する能力を低下させる。負の免疫チェックポイント経路という用語には、ＰＤ１がＰＤＬ１に、ＰＤ１がＰＤＬ２に、およびＣＴＬＡ４がＣＤＣＤ８０／８６に結合することによって調節される生物学的経路が含まれるが、これらに限定されない。そのような負の免疫チェックポイントアンタゴニストの例には、ＰＤ１（ＣＤ２７９とも称される）、ＴＩＭ３（Ｔ細胞膜タンパク質３、ＨＡＶｃｒ２としても知られる）、ＢＴＬＡ（ＢおよびＴリンパ球減衰因子、ＣＤ２７２としても知られる）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）受容体、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３、ＣＤ２３３としても知られる）、ならびにＣＴＬＡ４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４、ＣＤ１５２としても知られる）を含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞阻害性受容体に結合するアンタゴニスト（例えば、アンタゴニスト抗体）が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、その活性化が免疫応答の刺激をもたらす免疫チェックポイント経路は、本明細書では「正の免疫チェックポイント経路」と称される。正の免疫チェックポイント経路という用語には、ＩＣＯＳＬがＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）に、Ｂ７－Ｈ６がＮＫｐ３０に、ＣＤ１５５がＣＤ９６に、ＯＸ４０ＬがＯＸ４０に、ＣＤ７０がＣＤ２７に、ＣＤ４０がＣＤ４０Ｌに、およびＧＩＴＲＬがＧＩＴＲに結合することによって調節される生物学的経路が含まれるが、これらに限定されない。正の免疫チェックポイントを刺激する分子（免疫応答を刺激する結合対の構成成分に対する、そのような天然または合成リガンド）は、免疫応答の上方制御に有用である。そのような正の免疫チェックポイントアゴニストの例には、例えば、ＩＣＯＳ（ＪＴＸ－２０１１、Ｊｏｕｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓなど）、ＯＸ４０（ＭＥＤＩ６３８３、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅなど）、ＣＤ２７（バルリルマブ、Ｃｅｌｌｄｅｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓなど）、ＣＤ４０（ダセツズマブ、ＣＰ－８７０、８９３、Ｒｏｃｈｅ、Ｃｈｉ Ｌｏｂ７／４など）、ＨＶＥＭ、ＣＤ２８、ＣＤ１３７ ４－１ＢＢ、ＣＤ２２６、およびＧＩＴＲ（ＭＥＤＩ１８７３、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ、ＩＮＣＡＧＮ１８７６、Ａｇｅｎｕｓなど）のＴ細胞活性化受容体に結合するアゴニスト抗体が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント経路調節剤」という用語は、免疫適格性哺乳動物を含む生物系における免疫チェックポイント経路の活性を阻害または刺激する分子を指す。免疫チェックポイント経路調節剤は、免疫チェックポイントタンパク質（癌細胞および／もしくは免疫Ｔエフェクター細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現する免疫チェックポイントタンパク質など）に結合することによってその効果を発揮することができるか、または免疫チェックポイント経路の上流および／もしくは下流の反応に対してその効果を発揮することができる。例えば、免疫チェックポイント経路調節剤は、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４シグナル伝達に関与するチロシンホスファターゼであるＳＨＰ２の活性を調節することができる。「免疫チェックポイント経路調節剤」という用語は、阻害性免疫チェックポイント（本明細書では「免疫チェックポイント経路阻害剤」または「免疫チェックポイント経路アンタゴニスト」と称される）の機能を少なくとも部分的に下方制御することができる免疫チェックポイント経路調節剤（複数可）、および刺激性免疫チェックポイント（本明細書では「免疫チェックポイント経路エフェクター」または「免疫チェックポイント経路アゴニスト」と称される）の機能を少なくとも部分的に上方制御することができる免疫チェックポイント経路調節剤（複数可）の両方を包含する。
免疫チェックポイント経路によって媒介される免疫応答は、Ｔ細胞媒介性免疫応答に限定されない。例えば、ＮＫ細胞のＫＩＲ受容体は、ＮＫ細胞によって媒介される腫瘍細胞に対する免疫応答を調節する。腫瘍細胞は、ＨＬＡ－Ｃと呼ばれる分子を発現し、この分子が、ＮＫ細胞のＫＩＲ受容体を阻害し、減少または抗腫瘍免疫応答をもたらす。ＨＬＡ－ＣのＫＩＲ受容体への結合をアンタゴナイズする薬剤（抗ＫＩＲ３マブ（例えば、リリルマブ、ＢＭＳ）など）の投与は、ＨＬＡ－ＣがＮＫ細胞阻害性受容体（ＫＩＲ）に結合する能力を阻害し、それによりＮＫ細胞が癌細胞を検出および攻撃する能力を回復させる。したがって、ＨＬＡ－ＣがＫＩＲ受容体に結合することによって媒介される免疫応答は、その阻害が非Ｔ細胞媒介性免疫応答の活性化をもたらす、負の免疫チェックポイント経路の一例である。
一実施形態において、免疫チェックポイント経路調節剤は、負の免疫チェックポイント経路阻害剤／アンタゴニストである。別の実施形態において、ＩＬ－１０剤と併用して用いられる免疫チェックポイント経路調節剤は、正の免疫チェックポイント経路アゴニストである。別の実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞および／またはＩＬ－１０剤と併用して用いられる免疫チェックポイント経路調節剤は、免疫チェックポイント経路アンタゴニストである。
前に考察されたように、「負の免疫チェックポイント経路阻害剤」は、負の免疫チェックポイント経路の活性化を妨害し、免疫応答の上方制御または増強をもたらす、免疫チェックポイント経路調節剤を指す。例示的な負の免疫チェックポイント経路阻害剤には、プログラム死１（ＰＤ１）経路阻害剤、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）経路阻害剤、ＴＩＭ３経路阻害剤、および抗細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）経路阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、免疫チェックポイント経路調節剤は、ＰＤ１のＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２への結合を阻害する負の免疫チェックポイント経路のアンタゴニスト（「ＰＤ１経路阻害剤」）である。ＰＤ１経路阻害剤は、Ｔ細胞の消耗の逆転、サイトカイン産生の回復、抗原依存性Ｔ細胞の拡大などの、様々な好ましい免疫応答の刺激をもたらす。ＰＤ１経路阻害剤は、黒色腫、肺癌、腎臓癌、ホジキンリンパ腫、頭頸部癌、膀胱癌、および尿路上皮癌を含む様々な癌の治療についてＵＳＦＤＡから承認を受けており、様々な癌に有効であるものとして認識されている。
ＰＤ１経路阻害剤という用語は、ＰＤ１のＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２への結合を妨害するモノクローナル抗体を含む。抗体ＰＤ１経路阻害剤は、当該技術分野で周知である。ＰＤ１のＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２への結合を妨害するモノクローナル抗体である市販のＰＤ１経路阻害剤の例には、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＢｒｉｓｔｏｌＭｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ ＮＪから市販されている）、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）ＭＫ－３４７５、ラムブロリズマブ、Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ ＮＪから市販されている）、およびアテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）が含まれる。デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１、ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ１１０５、ＢｒｉｓｔｏｌＭｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ならびにアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、Ｍｅｒｃｋ Ｓｅｒｏｎｏ／Ｐｆｉｚｅｒ）およびＳＨＲ－１２１０（Ｉｎｃｙｔｅ）を含むがこれらに限定されない、さらなるＰＤ１経路阻害剤抗体が、臨床開発段階にある。さらなる抗体ＰＤ１経路阻害剤は、２０１２年７月１０日に発行された米国特許第８，２１７，１４９号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）、２０１２年５月１日に発行された米国特許第８，１６８，７５７号（Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ａｎｄ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．）、２０１１年８月３０日に発行された米国特許第８，００８，４４９号（Ｍｅｄａｒｅｘ）、２０１１年５月１７日に発行された米国特許第７，９４３，７４３号（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ）に記載されている。
本発明の一実施形態において、ＰＤ１免疫チェックポイント経路調節剤は、以下の表３に提供されるＣＤＲ配列を含む抗体である。
Figure 0007097465000003
本発明の一実施形態において、ＰＤ１免疫チェックポイント経路阻害剤は、以下の表４に提供される可変ドメイン配列（配列番号５６および配列番号５７）を含む抗体である。
Figure 0007097465000004
 本発明の一実施形態において、ＰＤ１アンタゴニスト抗体は、ＡＭ０００１であり、これは、ラムダ２軽鎖、および２２８位にセリンからプロリンへの置換（Ｓ２２８Ｐ）を有することで、「ヒンジ安定化」重鎖を提供するＩｇＧ４を有する、モノクローナル抗体であり、上記の表３に明記される配列番号５０～５５に対応するアミノ酸配列を有するＶＬおよびＶＨ ＣＤＲを特徴とし、軽鎖可変領域は、配列番号５６の配列を特徴とし、重鎖可変領域は、配列番号５７のアミノ酸配列を特徴とする。ＡＭ０００１抗体は、２５℃で、約１０ｐＭ以下のヒトおよびカニクイザルＰＤ－１に対する結合親和性（Ｋｄ）を有することを特徴とする。バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって測定されるＡＭ０００１の結合親和性を、以下の表５に示す。
Figure 0007097465000005
ＡＭ０００１の重鎖および軽鎖の完全長アミノ酸配列を、以下に提供する。
ＡＭ０００１成熟重鎖タンパク質配列（ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐフレームワーク）：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＰＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＧＷＶＳＤＩＳＧＧＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＧＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＧＴＶＶＴＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号６０）
ＡＭ０００１成熟軽鎖タンパク質配列（ヒトラムダ－２フレームワーク）：
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＲＶＴＣＧＧＮＳＩＧＳＹＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＶＹＤＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＡＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＴＳＳＹＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（配列番号６１）
ＰＤ－１経路阻害剤抗体は、組換え手段によって産生することができる。本発明は、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６０、および配列番号６１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、本開示は、ＰＤ１アンタゴニスト抗体がＡＭ０００１である場合の核酸配列を提供し、ＡＭ０００１の重鎖および軽鎖をコードする核酸配列（配列番号６０および配列番号６１）は、それぞれ、配列番号６２および配列番号６３として以下に明記されるとおりである。
ＡＭ０００１成熟重鎖ＤＮＡ配列（ヒトＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐフレームワーク）：
ＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣＧＧＣＴＣＧＣＴＣＣＧＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＣＧＴＡＣＴＡＣＧＣＧＧＡＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＴＣＣＧＧＡＡＣＧＧＴＴＧＴＧＡＣＴＧＡＴＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＴＣＧＣＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧＴＴＧＣＣＴＣＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＴＣＡＴＧＧＡＡＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＣＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＧＴＧＣＴＣＣＡＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＧＴＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＣＣＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＣＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＧＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＧＡＴＡＡＧＣＧＡＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＧＡＡＧＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣＧＧＡＣＧＣＣＧＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＣＧＴＣＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＧＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＴＴＡＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＧＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＧＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＧＴＴＣＴＡＣＣＣＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＡＧＴＣＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＧＡＣＣＣＣＣＣＣＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＴＣＧＣＧＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＧＡＣＡＡＧＴＣＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＧＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧ（配列番号６２）
ＡＭ０００１成熟軽鎖タンパク質配列（ヒトラムダ－２フレームワーク）：
ＡＧＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＧＧＴＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＡＧＡＣＧＧＣＡＣＧＴＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＣＡＴＣＧＧＣＴＣＣＴＡＣＴＣＧＧＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＧＧＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＡＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＣＧＧＣＡＴＣＣＣＣＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＴＣＡＡＡＣＡＧＣＧＧＧＡＡＣＡＣＣＧＣＧＧＣＣＣＴＧＡＣＧＡＴＣＴＣＧＣＧＣＧＴＣＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧＡＣＧＡＡＧＣＣＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＣＧＧＣＣＡＧＣＣＧＡＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣＡＧＴＡＡＣＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＣＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＣＡＧＧＣＧＡＡＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＣＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＣＣＴＣＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＧＣＧＧＧＣＧＴＧＧＡＧＡＣＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＣＴＣＴＣＧＣＴＧＡＣＡＣＣＣＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＴＡＣＴＣＧＴＧＣＣＡＧＧＴＡＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣＣＣＣＡＣＣＧＡＧＴＧＣＡＧＣ（配列番号６３）
ＰＤ１経路阻害剤という用語は、アンタゴニスト抗体に限定されない。ＰＤ－Ｌ２ ＩｇＧ２ａ融合タンパク質であるＡＭＰ－２２４を含む非抗体生物学的ＰＤ１経路阻害剤もまた、臨床開発中であり、ＰＤＬ２融合タンパク質であるＡＭＰ－５１４は、ＡｍｐｌｉｍｍｕｎｅおよびＧｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって臨床開発中である。アプタマー化合物はまた、ＰＤ１経路阻害剤として有用であるものとして、文献にも記載されている（Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１ Ｘ－Ａｐｔａｍｅｒｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ（印刷中）、２０１７年９月１１日時点で、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｃｈｉ．２０１７．０９．００６．のインターネットアドレスにてオンラインで入手可能）。
ＰＤ１経路阻害剤という用語は、２０１６年８月２３日に発行されたＳａｓｉｋｕｍａｒらの米国特許第９，４２２，３３９号、および２０１４年１２月９日に発行されたＳａｓｉｌｋｕｍａｒらの米国特許第８，９０７，０５３号に記載されたものなどの、ペプチジルＰＤ１経路阻害剤を含む。ＣＡ－１７０（ＡＵＰＭ－１７０、Ａｕｒｉｇｅｎｅ／Ｃｕｒｉｓ）は、免疫チェックポイントＰＤＬ１およびＶＩＳＴＡを標的とする、経口で生体利用可能な小分子であると報告されている。Ｐｏｔｔａｙｉｌ Ｓａｓｉｋｕｍａｒ，ｅｔ ａｌ．Ｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＤ－Ｌ１／ＶＩＳＴＡ ｏｒ ＰＤ－Ｌ１／Ｔｉｍ３ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．［要約］．Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ１０７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２０１６Ａｐｒ１６－２０；Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＰＡ）：ＡＡＣＲ；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ２０１６；７６（１４Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．４８６１．ＣＡ－３２７（ＡＵＰＭ－３２７、Ａｕｒｉｇｅｎｅ／Ｃｕｒｉｓ）は、免疫チェックポイント、プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）、ならびにＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ３）を阻害する、経口で利用可能な小分子であると報告されている。
ＰＤ１経路阻害剤という用語は、小分子ＰＤ１経路阻害剤を含む。本発明の実施に有用な小分子ＰＤ１経路阻害剤の例は、Ｓａｓｉｋｕｍａｒらの、免疫調節剤としての１，２，４－オキサジアゾールおよびチアジアゾール化合物（２０１６年３月７日に出願されたＰＣＴ／ＩＢ２０１６／０５１２６６、ＷＯ２０１６１４２８３３Ａ１として２０１６年９月１５日に公開）、ならびにＳａｓｉｋｕｍａｒらの、免疫調節剤としての３－置換－１，２，４－オキサジアゾールおよびチアジアゾール化合物（２０１６年３月９日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１６／０５１３４３号、ＷＯ２０１６１４２８８６Ａ２として公開）、以下の構造を有するＢＭＳ－１１６６およびＢＭＳ－１００１（Ｓｋａｌｎｉａｋ，ｅｔ ａｌ（２０１７）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８（４２）：７２１６７－７２１８１）を含む当該技術分野に記載されている。
Figure 0007097465000006
 および
Figure 0007097465000007
 Ｃｈｕｐａｋ ＬＳ ａｍｄ Ｚｈｅｎｇ Ｘ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｕｓｅｆｕｌ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ．Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．２０１５ ＷＯ２０１５／０３４８２０ Ａ１、ＥＰ３０４１８２２Ｂ１（２０１７年８月９日に認可）、ＷＯ２０１５０３４８２０ Ａ１、およびＣｈｕｐａｋ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｕｓｅｆｕｌ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ．Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．２０１５ ＷＯ２０１５／１６０６４１ Ａ２．ＷＯ２０１５／１６０６４１ Ａ２、Ｃｈｕｐａｋ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｕｓｅｆｕｌ ａｓ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ．Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．Ｓｈａｒｐｅ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｄ－１，ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ ｔｈｅｒｅｏｆ、ＷＯ２０１１０８２４００ Ａ２（２０１１年７月７日に公開）、米国特許第７，４８８，８０２号（Ｗｙｅｔｈ）（２００９年２月１０日に発行）。
本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞および／またはＩＬ－１０剤の組成物およびそれらの方法は、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部癌、腎細胞癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮体癌、子宮頸癌、子宮肉腫、胃癌、食道癌、ＤＮＡミスマッチ修復欠損結腸癌、ＤＮＡミスマッチ修復欠損子宮内膜癌、肝細胞癌、乳癌、メルケル細胞癌、甲状腺癌、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、菌状息肉症、末梢Ｔ細胞リンパ腫を含むが、これらに限定されない、疾患の治療のためのＦＤＡの承認または臨床試験における臨床有効性の実証を通して、ＰＤ１経路阻害剤がヒトにおける臨床効果を実証している腫瘍性病態の治療に特に適している。
おそらく、最も多くの臨床経験を有する最もよく研究された免疫療法は、抗ＰＤ１モノクローナル抗体のペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））およびニボルマブを用いて得られている。これらの生成物は、有意な有効性を実証しており、現在、多種多様な癌に対して多数の承認を取得している。これらの薬剤の臨床経験は、成功の可能性が最も高いことを示す一連のパラメータを実証している。抗ＰＤ１療法は、高レベルのＰＤＬ１の発現が存在する腫瘍内で最高レベルの有効性を実証しており（ＧａｒｏｎらのＮＥＪＭ ２０１４）、ここで腫瘍は、腫瘍変異負荷を有し（ＲｉｚｖｉらのＳｃｉｅｎｃｅ ２０１５、ＣａｒｂｏｎｅらのＮＥＪＭ ２０１７）、腫瘍内の高レベルのＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴｕｍｅｈらのＮａｔｕｒｅ ２０１４）、ＩＦＮγに関連する免疫活性化シグネチャ（ＰｒａｔらのＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７、ＡｙｅｒｓらのＪＣＩ ２０１７）、および転移性疾患、特に肝臓転移の欠如（ＴｕｍｅｈらのＣａｎｃｅｒ Ｉｍｍ．Ｒｅｓ．２０１７、ＰｉｌｌａｉらのＡＳＣＯ ２０１７）が存在する。これらの因子は、ＰＤ１療法の有効性を、比較的小さな範囲の腫瘍に制限する。多種多様な腫瘍は、稀なネオ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による低ネオ抗原負荷を有し、高ネオ抗原負荷を有する腫瘍は、最終的にＩＣＩから逃れている。他の状況では、腫瘍微小環境内に、Ｔ細胞が消耗し、アポトーシスした、免疫砂漠が存在し、Ｔ細胞発現の欠如は、腫瘍内の低レベルのグランザイムおよびＩＦＮγ発現をもたらす。ＩＬ－１０単剤療法は、これらのパラメータの多くに対処する。ＩＬ－１０は、腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を増加させ、グランザイムであるＦａｓＬおよびＩＦＮγのレベルを増加させることが観察されている。Ｍｕｍｍ，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、Ｅｍｍｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｆｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ。これらの障害物（これまでのスライドに提示される）への対処におけるＩＬ－１０の確立された有用性のために、我々は、抗ＰＤ１Ｍａｂ療法と併用したＩＬ－１０剤を評価した。
一実施形態において、免疫チェックポイント経路調節剤は、ＣＴＬＡ４のＣＤ２８への結合を阻害する負の免疫チェックポイント経路のアンタゴニスト（「ＣＴＬＡ４経路阻害剤」）である。免疫チェックポイント受容体ＣＴＬＡ４は、ＰＤ１、ＢＴＬＡ、リンパ球減衰因子、ＴＩＭ３、およびＴ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン抑制因子もまた含む、受容体の免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。ＣＤ８０（Ｂ７．１としても知られる）およびＣＤ８６（Ｂ７．２としても知られる）は、ＣＴＬＡ４受容体リガンドとして特定されている。臨床的に標的とされる第１の免疫チェックポイント受容体であるＣＴＬＡ４は、もっぱらＴ細胞上にのみ発現され、Ｔ細胞上で、それは、主にＴ細胞活性化の初期段階の振幅を制御する。それは、Ｔ細胞共刺激受容体ＣＤ２８の活性を相殺することが示されている。
抗原認識時、ＣＤ２８シグナル伝達は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達を強く増幅して、Ｔ細胞を活性化する。［例えば、Ｒｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１１７９０－９５を参照されたい］。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞活性化後に転写的に誘導される。ＣＴＬＡ４は、活性化ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞によって発現されるが、その主な生理学的役割は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の２つの主要なサブセットに対する異なる効果、つまりｉ）ヘルパーＴ細胞活性の下方調節、およびｉｉ）制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性の増強を通して顕在化すると考えられている。具体的には、ＣＴＬＡ４遮断は、ヘルパーＴ細胞に依存した免疫応答の増強をもたらす一方で、制御性Ｔ細胞のＣＴＬＡ４関与は、それらの抑制機能を増加させる。［例えば、Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｐｒｏｃ．４：３３０－３６を参照されたい］。ＣＴＬＡ４経路阻害剤の例は、当該技術分野で周知である（例えば、２００４年１月２７日に発行された米国特許第６，６８２，７３６号（Ａｂｇｅｎｉｘ）、２００７年５月２９日に発行された米国特許第６，９８４，７２０号（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）、２００９年１０月２０日に発行された米国特許第７，６０５，２３８号（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）を参照されたい。
現在、ＣＴＬＡ４経路阻害剤抗体治療アプローチに、欠点がないわけではない。例として、ヒト化抗ＣＴＬＡ４アンタゴニスト抗体を用いた転移性黒色腫の治療は、ある特定の自己免疫毒性（例えば、腸の炎症および皮膚炎）を引き起こすことが報告されており、許容される治療ウィンドウの決定が促進されている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．８：１４２０－３０）。ＣＴＬＡ４経路阻害剤（例えば、イピリムマブなどの抗体）とＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）との併用の増強された治療有効性は、治療有効性を維持しながら投薬量を低減する潜在性を提供する。
一実施形態において、免疫チェックポイント経路調節剤は、ＢＴＬＡのＨＶＥＭへの結合を阻害する負の免疫チェックポイント経路のアンタゴニスト（「ＢＴＬＡ経路阻害剤」）である。ＢＴＬＡは、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１に構造的および機能的に関連する共阻害分子である。ＢＴＬＡは、ウイルス特異的なヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現されるが、それは、それらがナイーブ表現型からエフェクター表現型へと分化した後、漸進的に下方制御される（Ｐａｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，（Ｊａｎ．２０１０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０（１）：７６－８０）。ある特定の腫瘍細胞型（例えば、黒色腫）および腫瘍関連内皮細胞上に発現する、ヘルペスウイルス侵入媒介因子（ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ１４としても知られる）は、ＢＴＬＡリガンドとして特定されている。ＢＴＬＡとＨＶＥＭとの間の相互作用は、複雑であるため、ＢＴＬＡの治療阻害戦略は、他の免疫チェックポイント経路阻害受容体およびリガンドの場合よりも単純ではない。［Ｐａｒｄｏｌｌ，（Ａｐｒｉｌ ２０１２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １２：２５２－６４］。抗ＢＴＬＡ抗体およびアンタゴニストＨＶＥＭ－Ｉｇを使用してＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ経路を標的とする、いくつかのアプローチが評価されており、そのようなアプローチは、移植、感染、腫瘍、および自己免疫疾患を含む、いくつかの疾患、障害、および病態において見込みがある有用性を示唆している（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．８：１４２０－３０）。
一実施形態において、免疫チェックポイント経路調節剤は、ＴＩＭ３がＴＩＭ３活性化リガンドに結合する能力を阻害する負の免疫チェックポイント経路のアンタゴニスト（「ＴＩＭ３経路阻害剤」）である。ＴＩＭ３は、Ｔヘルパー１（ＴＨ１）細胞応答を阻害し、抗ＴＩＭ３抗体は、抗腫瘍免疫を増強することが示されている。ＴＩＭ３経路の調節に関与する分子であるガレクチン９は、乳癌を含む様々な種類の癌において上方制御される。ＴＩＭ３は、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞上にＰＤ１とともに同時発現されることが報告されている。癌精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１によって刺激されると、両方の分子の二重阻害により、ヒトＴ細胞のインビトロでの増殖およびサイトカイン産生が大幅に増強される。さらに、動物モデルでは、ＰＤ１およびＴＩＭ３の協調的な遮断が、個々の分子の遮断によるわずかな影響のみが観察される状況で、抗腫瘍免疫応答を増強することが報告された。［例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ，（Ａｐｒｉｌ ２０１２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １２：２５２－６４、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１２４５－５２、Ｎｇｉｏｗ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７１：３５４０－５１）を参照されたい］。ＴＩＭ３経路阻害剤の例は、当該技術分野で既知であり、代表的で非限定的な例は、２０１６年９月１５日に公開された米国特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１００５号、２０１６年９月８日に公開されたＬｉｆｋｅらの米国特許公開第ＵＳ２０１６／０２５７７４９Ａ１号（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ－ＬａＲｏｃｈｅ）、２０１７年４月２７日に発行されたＫａｒｕｎｓｋｙの米国特許第９，６３１，０２６号、２０１４年９月２３日に発行された（ｉｓｕｅｄ）Ｋａｒｕｎｓｋｙ、Ｓａｂａｔｏｓ－Ｐｅｙｔｏｎらの米国特許第８，８４１，４１８号、米国特許第９，６０５，０７０号、および２０１３年１０月８日に発行されたＴａｋａｙａｎａｇｉらの米国特許第８５５２１５６号に記載されている。
ＬＡＧ３は、制御性Ｔ（ＴＲｅｇ）細胞の機能を増強する役割、および独立してＣＤ８＋エフェクターＴ細胞機能を阻害する役割を果たすことが示されている。ＬＡＧ３のリガンドであるＭＨＣクラスＩＩ分子は、いくつかの上皮癌で（しばしばＩＦＮγに応答して）上方制御され、腫瘍浸潤マクロファージおよび樹状細胞上でも発現される。ＬＡＧ３－ＭＨＣクラスＩＩの相互作用の役割は、決定的には解明されていないが、この相互作用は、ＴＲｅｇ細胞機能の増強におけるＬＡＧ３の役割の重要な構成要素である可能性がある。
ＬＡＧ３は、ＴＲｅｇ細胞およびアネルギーＴ細胞の両方で協調的に上方制御されるいくつかの免疫チェックポイント受容体のうちの１つである。ＬＡＧ３およびＰＤ１の同時遮断は、１つの受容体のみの遮断と比較して、アネルギー状態の逆転の増強を引き起こすことができる。実際、ＬＡＧ３およびＰＤ１の遮断は、慢性感染の設定では、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞とウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞との間のアネルギーを相乗的に逆転させることが示されている。ＩＭＰ３２１（ＩｍｍｕＦａｃｔ）は、黒色腫、乳癌、および腎細胞癌において評価されている。［一般に、Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７２：９１７－２７、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４４：２６９－７８、Ｐａｒｄｏｌｌ，（Ａｐｒｉｌ ２０１２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １２：２５２－６４、Ｇｒｏｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７：３３８３－３９２を参照されたい］。
Ａ２ａＲは、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｒｅｇ細胞へと発達するように刺激することによって、Ｔ細胞応答を阻害する。Ａ２ａＲは、腫瘍免疫において特に重要であるが、これは、細胞の代謝回転による腫瘍内の細胞死の速度が高く、瀕死の細胞がＡ２ａＲのリガンドであるアデノシンを放出するためである。加えて、Ａ２ａＲの欠失は、感染に対する炎症応答の増強、および場合によっては病理学的な炎症応答に関連付けられている。Ａ２ａＲの阻害は、アデノシン結合を阻害する抗体によって、またはアデノシン類似体によってもたらすことができる。そのような薬剤は、癌およびパーキンソン病などの障害において有用である可能性がある。［一般に、Ｚａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｂｌｏｏｄ １１１：２５１－５９、Ｗａｉｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２５ Ｎｏｖ ２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２６２－０１１－１１５５－７）を参照されたい］。
ＩＤＯ（インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ）は、通常、腫瘍細胞内および活性化免疫細胞内で発現される、免疫制御酵素である。ＩＤＯは、トリプトファンの酸化を通した免疫応答を下方制御する。これは、Ｔ細胞活性化の阻害およびＴ細胞アポトーシスの誘導をもたらし、これにより、腫瘍特異的細胞毒性Ｔリンパ球が機能的に不活性化されるか、または対象の癌細胞を攻撃することができない環境が作り出される。インドキシモド（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）は、転移性乳癌において評価されているＩＤＯ阻害剤である。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生、精製、および断片化は、記載されおり（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、リガンド／受容体相互作用を特性評価するための標準的な技術が利用可能であり（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹを参照されたい）、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能であり（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪを参照されたい）、例えば、診断試薬として使用するための、核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチド、ならびに抗体を含む、核酸の修飾に好適な蛍光試薬が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ．、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
以前に記載したように、本発明は、２つ、３つ、またはそれ以上の免疫チェックポイント経路を調節する免疫チェックポイント経路調節剤を含む、少なくとも１つの免疫チェックポイント経路を調節する薬剤（複数可）と併用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞および／またはＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）を投与することによる、哺乳動物対象における腫瘍性疾患（例えば、癌）の治療方法を提供する。
一実施形態において、多数の免疫チェックポイント経路は、多数の免疫チェックポイント経路の調節剤として作用することができる多機能分子の投与によって調節することができる。そのような多重免疫チェックポイント経路調節剤の例には、二重特異性抗体または多特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。調節剤または多数の免疫チェックポイント経路として作用することができる多特異性抗体の例は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許公開第２０１３／０１５６７７４号は、ＰＤ１およびＴＩＭ３を同時発現する細胞を標的とするための二重特異性薬剤および多重特異性薬剤（例えば、抗体）、ならびにそれらの使用方法を記載している。さらに、ＢＴＬＡおよびＰＤ１の二重遮断は、抗腫瘍免疫を増強することが示されている（Ｐａｒｄｏｌｌ，（Ａｐｒｉｌ ２０１２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ１２：２５２－６４）。本開示は、ＰＤ１およびＬＡＧ３の両方に結合する二重特異性抗体を含むがこれに限定されない、多数の免疫チェックポイント経路を標的とする免疫チェックポイント経路調節剤と併用した、ＩＬ－１０剤の使用を企図する。したがって、抗腫瘍免疫は、多数のレベルで増強することができ、様々な機構的考察を考慮して、コンビナトリアル戦略を生成することができる。
他の実施形態は、多数のチェックポイント経路調節剤と併用したＩＬ－１０剤の投与を企図し、さらなる実施形態は、３つ以上の免疫チェックポイント経路調節剤と併用したＩＬ－１０剤の投与を企図する。ＣＡＲ－Ｔ細胞および／またはＩＬ－１０剤と多数の免疫チェックポイント経路調節剤とのそのような組み合わせは、免疫チェックポイント経路が、異なる作用機構を有することができ、これが、多数の異なる治療角度から基礎疾患、障害、または病態を攻撃する機会を提供するという点で、有利であり得る。ＩＬ－１０剤の投与と併用することができる免疫チェックポイント経路調節剤の代表的な併用（以下に特定されるように、それらのいくつかは臨床試験中である）には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
（ａ）ＰＤ１／ＰＤＬ１経路阻害剤（ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ＰＤＲ００１、ＭＥＤＩ４７３６、アテゾリズマブ、およびデュルバルマブを含むがこれらに限定されない）と、ＬＡＧ３アンタゴニスト抗体（例えば、ＢＭＳ－９８６０１６、臨床試験識別子ＮＣＴ０１９６８１０９）、ＣＴＬＡ４アンタゴニスト抗体（例えば、イピルムマブ）、Ｂ７－Ｈ３アンタゴニスト抗体（例えば、エノブリツズマブ、臨床試験識別子ＮＣＴ０１９６８１０９）、ＫＩＲアンタゴニスト抗体（例えば、リリルマブ、臨床試験識別子ＮＣＴ０１７１４７３９）との併用、
（ｂ）ＰＤ１／ＰＤＬ１経路阻害剤（ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ＰＤＲ００１、ＭＥＤＩ４７３６、アテゾリズマブ、およびデュルバルマブを含むがこれらに限定されない）と、４－１ＢＢに対するアゴニスト抗体（レルマブ、臨床試験識別子ＮＣＴ０２２５３９９２）、ＩＣＯＳに対するアゴニスト抗体（例えば、ＪＴＸ－２０１１、例えば、臨床試験識別子ＮＣＴ０２９０４２２６）、ＣＤ２７に対するアゴニスト抗体（例えば、バルリルマブ、例えば、臨床試験識別子ＮＣＴ０２３３５９１８）、ＧＩＴＲに対するアゴニスト抗体（例えば、ＧＷＮ３２３、例えば、臨床試験識別子ＮＣＴ０２７４０２７０）、およびＯＸ４０に対するアゴニスト抗体（例えば、ＭＥＤＩ６３８３（例えば、臨床試験識別子ＮＣＴ０２２２１９６０））などの正の免疫チェックポイントアゴニスト抗体との併用、
（ｃ）ＣＴＬＡ４経路阻害剤（イピルムアブを含むがこれに限定されない）と、ＬＡＧ３アンタゴニスト抗体（例えば、ＢＭＳ－９８６０１６）、ＴＩＭ３アンタゴニスト抗体との併用。
ＩＬ－１０剤の追加によって補うことができるＰＤ１／ＰＤＬ１経路阻害剤を用いた他の代表的な併用療法には、ＰＤ１／ＰＤＬ１経路阻害剤と、ＢＲＡＦ／ＭＥＫ阻害剤、スニチニブ（ＮＣＴ０２４８４４０４）などのキナーゼ阻害剤、オラパリブなどのＰＡＲＰ阻害剤（ＮＣＴ０２４８４４０４）、オシメルチニブなどのＥＧＦＲ阻害剤（Ａｈｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ １１：Ｓ１１５）、エパカドスタットなどのＩＤＯ阻害剤、およびタリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ－ＶＥＣ）などの腫瘍溶解性ウイルスとの併用が含まれる。ＩＬ－１０剤の追加によって補うことができるＣＴＬ４経路阻害剤を用いた他の代表的な併用療法には、ＣＴＬ４経路阻害剤と、ＩＬ２、ＧＭＣＳＦ、およびＩＦＮ－αとの併用が含まれる。
免疫チェックポイント経路阻害剤に対する治療応答は、しばしば、チロシンキナーゼ阻害剤などの従来の化学療法に対する応答よりもはるかに後に顕在化することに留意すべきである。場合によっては、免疫応答チェックポイント経路阻害剤を用いた治療開始後、治療応答の客観的な兆候が観察されるまでに、６カ月以上かかる可能性がある。加えて、抗ＣＴＬＡ４抗体療法に関与する場合によっては、転移性病変は、実際に、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャンでサイズが増加してから、その後に退縮する［例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ，（Ａｐｒｉｌ ２０１２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ１２：２５２－６４を参照されたい］。したがって、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞および／またはＩＬ－１０剤と併用した免疫チェックポイント経路阻害剤（複数可）を用いた治療についての決定は、しばしば従来の化学療法よりも長い進行までの時間にわたって行わなくてはならない。所望の応答は、その状況下で好ましいと思われる任意の結果であり得る。いくつかの実施形態において、所望の応答は、疾患、障害、または病態の進行の予防である一方で、他の実施形態において、所望の応答は、疾患、障害、または病態の１つ以上の特徴の退縮または安定化（例えば、腫瘍サイズの低減）である。さらに他の実施形態において、所望の応答は、併用の１つ以上の薬剤に関連する１つ以上の有害作用の低減または排除である。
３．補助剤としてのケモカインおよびサイトカイン剤：
ＣＡＲベクターでの共発現の代わりに、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ１８などのサイトカイン、ならびにそれらの類似体およびバリアントを、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法とともに補助剤として投与することができる。追加の補助剤の例には、ＩＬ－７剤、修飾ポリペプチドＩＬ－１０剤、修飾ポリペプチドＩＬ－１２剤、修飾ポリペプチドＩＬ－７剤、修飾ポリペプチドＩＬ－１５剤、ペグ化ＩＬ－２剤、および修飾ポリペプチドＩＬ－１８剤、具体的には、ペグ化ＩＬ－７剤、ペグ化ＩＬ－１２剤、ペグ化ＩＬ－７剤、ペグ化ＩＬ－１５剤（特にＭｃＣａｕｌｅｙらのＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６７０４２に開示されているもの、２０１７年６月２９日に公開された国際公開ＷＯ２０１７／１１２５２８）、ペグ化ＩＬ－２剤（ＮＫＴＲ－２１４，Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．を含むがこれらに限定されない）、ペグ化ＩＬ－１８剤、ＩＬ－７バリアント、ＩＬ－１０バリアント、ＩＬ－１２バリアント、ＩＬ－７バリアント、ＩＬ－１５バリアント、ＩＬ－２バリアント、ＩＬ－１８バリアント、ＩＬ－７類似体、ＩＬ－１０類似体、ＩＬ－１２類似体、ＩＬ－７類似体、ＩＬ－１５類似体、ＩＬ－２類似体、およびＩＬ－１８類似体を含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ペグ化ＩＬ－１５分子は、以下の構造を有する：
Figure 0007097465000008
式中、ｗ、ｘ、およびｚがＰＥＧ分子であり、ｘ、ｗ、およびｚの各々のＭＷが同じであり、ｘ、ｗ、およびｚのうちの少なくとも１つのＭＷが異なり、ｘおよびｚの各々のＭＷが同じであり、ｘおよびｚの各々のＭＷが異なる。本開示は、ＰＥＧのＭＷが、７．５ｋＤａ～８０ｋＤａである、１５ｋＤａ～４５ｋＤａである、１５ｋＤａ～６０ｋＤａである、１５ｋＤａ～８０ｋＤａである、２０ｋＤａ～３０ｋＤａである、２０ｋＤａ～４０ｋＤａである、２０ｋＤａ～６０ｋＤａである、２０ｋＤａ～８０ｋＤａである、３０ｋＤａ～４０ｋＤａである、３０ｋＤａ～５０ｋＤａである、３０ｋＤａ～６０ｋＤａである、３０ｋＤａ～８０ｋＤａである、４０ｋＤａ～６０ｋＤａである、または４０ｋＤａ～８０ｋＤａである、実施形態を企図する。特定の実施形態において、ｘおよびｚの各々のＭＷは２０ｋＤａであり、ｗのＭＷは１０ｋＤａである。
Figure 0007097465000009
式中、ｘおよびｚはＰＥＧ分子であり、ｘおよびｚはＰＥＧの構成成分を表し、ＩＬ－１５は、ＰＥＧ分子でもあり得るリンカーｗを介してＰＥＧに共有結合している。ある特定の実施形態において、ＰＥＧ ｘまたはｚ ＰＥＧのＭＷは、約２０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約６０ｋＤａ、約７０ｋＤａ、もしくは約８０ｋＤａであるか、またはそれを超える。ｘおよびｚの各々のＭＷが、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａである、特定の実施形態が企図される。
Ｖ．活性化誘導細胞死
特異的標的抗原に対する遺伝子改変Ｔ細胞（ｃａｒ Ｔ細胞など）の注入は、長期の疾患管理、細胞毒性化学療法のものまたは標的療法と同様の作用の急速な開始、ならびにＴ細胞レパートリーの免疫寛容およびＭＨＣ制限の両方の回避を含めた、いくつかの潜在的な利点を有する。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法によるある特定の癌（例えば、非Ｂ細胞悪性腫瘍）の治療は、標的抗原を発現する正常組織を標的とする抗原特異的毒性の誘導と生命を脅かすサイトカイン放出症候群をもたらすこともあるＣＡＲ－Ｔ細胞治療の極端な効力の両方によって部分的に制限されてきた（Ｍａｇｅｅ（Ｎｏｖ．２０１４）Ｄｉｓｃｏｖ Ｍｅｄ １８（１００）：２６５－７１）。特に、著しい抗原負荷を伴う高親和性Ｔ細胞受容体相互作用は、活性化誘導細胞死につながり得ることが観察されている（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ １１９（３）：６９６－７０６、Ｈｏｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２１（１２）：２２６８－７７）。
Ｆａｓリガンド（例えば、ＦａｓＬ、ＣＤ９５リガンド）とＦａｓ受容体（例えば、Ｆａｓ、ＣＤ９５）との相互作用から生じるプログラム細胞死である活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）は、末梢性免疫寛容を維持するのに役立つ。ＡＩＣＤエフェクター細胞はＦａｓＬを発現し、Ｆａｓ受容体を発現する細胞でアポトーシスが誘導される。活性化誘導細胞死は、そのＴ細胞受容体の反復性刺激に起因する活性化Ｔリンパ球の負の調節因子である。このプロセスを変更することは、自己免疫疾患につながり得る（Ｚｈａｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１（３）：１８６－９２）。
機構的に、Ｆａｓ受容体へのＦａｓリガンドの結合は、Ｆａｓ受容体の三量体化を誘発し、次いで、その細胞質内ドメインがアダプタータンパク質ＦＡＤＤ（デスドメインを有するＦａｓ結合タンパク質）のデスドメインと結合することができる。プロカスパーゼ８はＦＡＤＤのデスエフェクタードメインに結合し、タンパク質分解的にカスパーゼ８を自己活性化し、Ｆａｓ、ＦＡＤＤ、およびプロカスパーゼ８は、デス誘導シグナル伝達複合体を一緒に形成する。活性化されたカスパーゼ８は、サイトゾルに放出され、そこでアポトーシスを引き起こすカスパーゼカスケードを活性化する（Ｎａｇａｔａ Ｓ．（１９９７）Ｃｅｌｌ．８８（３）：３５５－６５ｓ。
基本的に、ｃａｒ Ｔ細胞の活性化誘導細胞死は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の効果の長期的な維持を妨げる問題である。
活性化誘導増殖とエフェクター細胞死とのバランスは、Ｔ細胞の恒常性増殖において重要な点である。休止状態のＴ細胞はアポトーシスになりやすいが、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、およびＩＬ－１２）の存在下でのＴＣＲ／ＣＤ３を介するＴ細胞の刺激は、クローン性増殖をもたらす。興味深いことに、Ｔ細胞の恒常性におけるこれらの分子の役割は、矛盾していることもある。例として、ＩＬ－２はＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖および生存に必要であるが、活性化誘導細胞死の必要条件でもある。さらに、ＩＬ－１８が、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および生存を促進することが示された。ＩＬ－１８は、刺激への曝露後に特定の機能を有するＣＤ８＋Ｔ細胞集団のサイズを調節することによって、免疫／炎症反応に影響し得る。活性化Ｔ細胞の増殖および活性化誘導細胞死の調節は、免疫／炎症反応と密接に関連している（Ｌｉ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（Ｊｕｌｙ ２００７）Ｊ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏ ８２（１）：１４２－５１）。
本発明の一実施形態において、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＩＬ－１０剤と接触させ、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けている対象に、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の投与前、投与中、または投与後に、ＩＬ－１０剤（ペグ化ＩＬ－１０剤を含む）を投与することによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞アポトーシスを阻害するための方法および組成物を提供し、この投与は、ＣＡＲ－Ｔ細胞剤の投与と同時に、またはＣＡＲ－Ｔ細胞療法に関連する治療ウィンドウ内である。さらに、本発明の一実施形態において、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を改変してポリペプチドＩＬ－１０剤を発現させることによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞アポトーシスを阻害するための方法および組成物を提供し、この改変は、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＩＬ－１０ポリペプチドの発現させることができる配列を含むベクターを導入することによって達成される。一実施形態において、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＩＬ－１０剤と接触させることによって、エクスビボでＣＡＲ－Ｔ細胞のアポトーシスを阻害する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、ＩＬ－１０剤を含む溶液中にＣＡＲ－Ｔ細胞を懸濁することによって、エクスビボでＣＡＲ－Ｔ細胞の寿命を延ばすための組成物および方法を提供する。
Ｗ．ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に対するＩＬ－１０の効果
ＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）の特徴は、本明細書の他の箇所に記載されている。抗炎症および免疫抑制分子として、ＩＬ－１０は、抗原提示、ＣＤ４＋Ｔ細胞機能、ＣＤ８＋Ｔ細胞病原体特異的機能（Ｂｉｓｗａｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７９（７）：４５２０－２８）、ウイルスエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞ＩＦＮγ応答（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７１（９）：４７６５－７２）、および抗ＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）ＣＤ８＋Ｔ細胞応答（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０５（５１）：２０４２８－４３３）を阻害する。
ＩＬ－１０は、活性化誘導細胞死の増強との関連で考察されてきたが（Ｇｅｏｒｇｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １００（１０）：２６２２－３３）、本明細書に提示されたインビトロおよびインビボデータは、ＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）が、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法と併用して、活性化誘導細胞死を予防または制限し、一方で、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能および生存を増強することができることを示す。
例として、実験セクションの実施例１に提示する発見は、ＰＥＧ－ＩＬ－１０の投与がＣＤ８＋Ｔ細胞免疫活性化を媒介したことを示唆している。実施例１に記載されるように、腫瘍学の患者において、ＰＥＧ－ｒＨｕＩＬ－１０による治療の前後に、ＰＤ－１およびＬＡＧ３を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の数を比較した（実施例１を参照のこと）。ＰＤ－１およびＬＡＧ３の両方は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および細胞毒性機能のマーカーである。ＰＤ－１を発現する末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は約２倍まで増加し、ＬＡＧ３を発現する末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は約４倍まで増加した。全体として見れば、これらのデータは、ＰＥＧ－ＩＬ－１０の投与がＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫活性化を媒介したことを示す。
ＰＥＧ－ＩＬ－１０の投与は、活性化メモリＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を増強することも観察された（実施例２を参照のこと）。メモリＴ細胞（抗原経験Ｔ細胞とも称される）は、以前の感染、癌への曝露、または以前のワクチン接種の間に、その同族抗原に以前に遭遇および応答したＴリンパ球のサブセット（例えば、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）および細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８＋））である。対照的に、ナイーブＴ細胞は末梢内でその同族抗原に遭遇しておらず、これは、一般に、活性化マーカーのＣＤ２５、ＣＤ４４、またはＣＤ６９がないこと、およびメモリＣＤ４５ＲＯアイソフォームがないことを特徴とする。一般にＣＤ４５ＲＯ＋であるメモリＴ細胞は、ナイーブＴ細胞よりも速く強力な免疫応答を再現および開始することができる。
考察されたように、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、しばしば、メモリＣＤ８＋Ｔ細胞に由来し、メモリＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＰＥＧ－ＩＬ－１０の効果は、インビトロで評価された。実施例２に提示するデータは、活性化メモリＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を増強するためのＰＥＧ－ＩＬ－１０の効果と矛盾がない。
ＣＡＲ－Ｔ細胞と併用したＩＬ－１０剤の投与の効果を評価するために、インビトロ研究を行って、以下の実施例により完全に記載されるように、標的腫瘍細胞に曝露されたＣＡＲ－Ｔ細胞中の細胞毒性、ＩＦＮγ放出、およびＣＡＲ－ＴにおけるグランザイムＢ誘導に対するＩＬ－１０剤の影響を評価した。前述のように、これらの実験で使用されたＩＬ－１０剤は、約５０／５０のモノペグ化組換えヒトＩＬ－１０とジペグ化組換えヒトＩＬ－１０との混合物であるＡＭ００１０であった。これらの実験で使用されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗ＣＤ－１９ ＣＤ２８－ＣＤ３ｚキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする組換えレンチウイルスベクターで形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞であった。標的細胞は、ＣＤ１９＋ＨｅＬａヒト子宮頸癌細胞であった。約１０，０００個のＣＤ１９／ＨｅＬａ標的細胞を、Ｅプレートマイクロタイタープレート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されている）の各ウェルに添加した。細胞を、約２４時間の間増殖させて、コンフルエンスに到達した。抗ＣＤ－１９ ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、血液バンクから得られたヒトＰＢＭＣを使用して調製し、抗ＣＤ－１９ ＣＤ２８－ＣＤ３ｚキメラ抗原受容体をコードする核酸構築物を発現する組換えレンチウイルスベクターでトランスフェクトした。抗ＣＤ－１９ ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、以下の量：（ａ）１００，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞（１０：１のＥ：Ｔ比）、（ｂ）５０，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞（５：１のＥ：Ｔ比）、（ｃ）２０，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞（２：１のＥ：Ｔ比）、および（ｅ）１０，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞（１：１のＥ：Ｔ比）で、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔエフェクター細胞対ＣＤ１９／ＨｅＬａ標的細胞の様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、各ウェルに（３重に）添加した。ＩＬ－１０剤であるＡＭ００１０を、各Ｅ：Ｔ比に関して、ＨｅＬａ細胞と抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞への曝露過程中、ＡＭ－００１０を含まない対照ウェルを用いて、１０００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌの４つの濃度で各ウェルに添加した。ＩＬ－１０剤ＡＭ００１０の非存在下での細胞毒性、ＩＦＮγ誘導、およびグランザイムＢ放出に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の効果も評価された。対照として、ＩＬ－１０剤ＡＭ００１０の存在下および非存在下での非形質導入Ｔ細胞の細胞毒性、ＩＦＮγ誘導、およびグランザイムＢ放出に対する効果も、２：１および１０：１の２つのＥ：Ｔ比で評価した。
ＩＬ－１０の存在下での標的ＣＤ１９－ＨｅＬａ細胞の曝露は、ＩＬ－１０で前治療せずに様々な濃度のＡＭ－００１０の存在下での抗ＣＤ１９ ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＥ：Ｔ比の変化に応答して標的ＣＤ１９－ＨｅＬａ細胞のグランザイムＢ誘導応答から判断した場合に、ＩＬ－１０の用量依存的な様式でグランザイムＢの分泌を増加させた。グランザイムＢは、ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加してから８時間後および２４時間後に、製造業者によって提供された取扱説明書に実質的に従って、市販のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイキットカタログ番号ＤＹ２９０６－０５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，６１４ ＭｃＫｉｎｌｅｙ Ｐｌａｃｅ ＮＥ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ ５５４１３から市販している）を使用して測定した。
免疫活性化の特徴であり、抗腫瘍免疫応答と相関するＩＦＮγは、ＣＡＲ－Ｔ細胞を添加してから８時間および２４時間後に、製造業者によって提供された取扱説明書に実質的に従って、従来のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイキットカタログ番号ＫＨＣ４０１２（市販のＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １６８ Ｔｈｉｒｄ Ａｖｅｎｕｅ Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＵＳＡ ０２４５１）を使用して測定した。実施例でより完全に記載されているように、ＩＬ－１０で前治療せずに様々な濃度のＡＭ－００１０の存在下での抗ＣＤ１９ ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＥ：Ｔ比の変化に応答して標的ＣＤ１９－ＨｅＬａ細胞のインターフェロン－ガンマ誘導応答のインビトロ分析から得られるデータは、ＩＬ－１０の用量依存的な様式でＴ細胞活性化の特徴であるインターフェロン－ガンマ発現の分泌の増加をもたらすＩＬ－１０の存在下での標的ＣＤ１９－ＨｅＬａ細胞の曝露を示す。
細胞毒性は、ＡＣＥＡ ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（登録商標）リアルタイム細胞分析（ＲＴＣＡ）システム（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与後約２５時間の期間にわたって、約５分ごとに評価された。このシステムでは、付着した標的細胞がマルチウェル電子マイクロタイタープレート（「Ｅプレート」）のウェルに播種され、金の微小電極のアレイが提供される。細胞が表面全体で増殖するにつれて、電極アレイ全体の電気インピーダンスが増加する。細胞が死んでプレートから浮き上がると、電気インピーダンスが低下する。したがって、アレイを横断する電子流のインピーダンスを測定することによって、細胞の生存率をリアルタイムで測定することができる。付着細胞によって引き起こされる電子流のインピーダンスは、細胞指数（ＣＩ）として報告され、単位のないパラメータは、細胞指数（ＣＩ）＝（時点ｎでのインピーダンス－細胞がない場合のインピーダンス）／公称インピーダンス値として計算される。付着細胞がプレートの表面全体に増殖すると、電気インピーダンスの増加を反映してＣＩが上昇する。ＣＩがプラトーになると、細胞はプレート上でコンフルエントになると推定される。付着した標的細胞が死滅すると、それらは、電子マイクロタイターウェル表面から持ち上がり、電気インピーダンスの低下（伝導率の増加）をもたらし、各プレートに対して測定することができ、経時的に細胞毒性の連続的評価を可能にする。実験中、電気抵抗データは５分ごとに収集され、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）システムを備えているソフトウェアを使用してデータが分析された。同じソフトウェアを使用して、３つの各ウェルからのデータを組み合わせて平均化した。
この研究から得られた結果は、ＣＡＲ－Ｔ細胞へのＩＬ－１０剤の添加が、ＩＬ－１０剤の用量依存的な様式でＣＡＲ－Ｔ細胞毒性の特異的増強を媒介したことを実証する。特に、データの比較は、ＩＬ－１０剤の存在下での標的細胞の細胞毒性の有意な増強を実証する。特に、標的腫瘍性細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性効果の増強は、非常に低濃度のＩＬ－１０（０．１ｎｇ／ｍｌ）でも観察される。結果として、約０．１ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０８ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０６ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０５ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０３ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０１ｎｇ／ｍｌ未満の血清中トラフ濃度を達成するためのＩＬ－１０剤の投与が、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の治療効果を増強する（またはその毒性を低減する）のに有用であろう。前に考察されたように、いくつかのＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、ヒト対象の治療における重大な有害事象と関連している。このデータはまた、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法（特に「ブラックボックス」警告を含む重篤な副作用を有するＣＡＲ－Ｔ細胞療法）とＩＬ－１０剤の組み合わせがＣＡＲ－Ｔ細胞療法の低用量の投与（より低い数の細胞の投与、より低いＥ：Ｔ比での投与）を促進し、それにより、有害事象、特にＣＡＲ－Ｔ細胞療法に関連する有害事象の減少を達成しつつ、より高いＣＡＲ－Ｔ細胞用量が観察された治療的有用性に匹敵する治療的有用性を対象に提供することを実証する。特に、標的腫瘍性細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性効果の増強は、非常に低濃度のＩＬ－１０（０．１ｎｇ／ｍｌ）でも観察される。結果として、約０．１ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０８ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０６ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０５ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０３ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０１ｎｇ／ｍｌ未満のＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を達成するためのＩＬ－１０剤の投与が、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の治療効果を増強する（および／またはその毒性を低減する）のに有用であろう。
前述の実験から得られた細胞毒性データは、抗ＣＤ－１９ＣＡＲ－Ｔ細胞と併用し、様々な量の抗ＣＤ－１９ＣＡＲ－Ｔ細胞で示すように、様々な濃度（０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、および１０００ｎｇ／ｍｌ）でＩＬ－１０剤（ＡＭ００１０）を添加することによって、１０，０００個のＣＤ１９／ＨｅＬａ細胞の培養に対する細胞毒性効果の増強を示すヒストグラムとして再プロットされた。ＡＭ００１０の添加は、ＡＭ－００１０のすべての試験濃度で、ＣＤ１９／ＨｅＬａ細胞に対する抗ＣＤ－１９ ＣＡＲ－Ｔのすべての比率で、ＣＤ１９／ＨｅＬａ細胞に対する抗ＣＤ－１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性効果を増強した。
対象に移植する前に、エクスビボでのＩＬ－１０剤によるＣＡＲ Ｔ細胞の前処理の効果を評価するために、さらなる研究が行われた。ＣＤ１９－ＨｅＬａ標的腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性を、ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与からの８および２４時間後に、様々な濃度のＡＭ－００１０の存在下で、抗ＣＤ１９ ＣＤ２８－ＣＤ３ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の様々なＥ：Ｔ比に応答して、上記のように評価し、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、実施例により完全に記載されるように、標的細胞への曝露の前にＩＬ－１０とプレインキュベートされた。ＩＬ－１０の存在下での標的ＣＤ１９－ＨｅＬａ細胞の曝露は、８時間の時点でＩＬ－１０の用量依存的な様式でＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性の増加をもたらした。さらに、ＩＬ－１０の存在下での標的ＣＤ１９－ＨｅＬａ細胞の曝露は、ＩＬ－１０の用量依存的な様式でＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性の増加をもたらした。ＩＬ－１０の存在下での標的ＣＤ１９－ＨｅＬａ細胞の曝露は、ＩＬ－１０の用量依存的な様式でＴ細胞の活性化および抗腫瘍効果の特徴であるＩＦＮγ発現の増加をもたらした。
前述のインビトロ研究に加えて、マウスにおける腫瘍性疾患のインビボ腫瘍モデルにおけるＩＬ－１０剤（ＡＭ－００１０）と抗腫瘍ＣＡＲ－Ｔ細胞療法との組み合わせの効果を評価するために、追加のインビボ研究が実施された。簡単に説明すると、５匹の雌ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ）マウスのコホートに、全身生物発光が腫瘍成長を評価することを可能にするルシフェラーゼ遺伝子を提供するベクターによる形質導入によるＲａｊｉ細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８６）を操作することによって構築されたＣＤ１９＋Ｒａｊｉヒトバーキットリンパ腫細胞株である０．５×１０６個のＲａｊｉ－ｌｕｃ細胞を腹腔内接種した。
実施例、特に実施例１７でより完全に記載されているように、マウス癌モデルにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞活性のインビボ分析の結果から。対照（治療なし）は急速な死亡をもたらし、研究の２１日目までにすべてのマウスが死亡し、動物における疾患の急速な進行を示した。ＡＭ００１０単独、ＡＭ－００１０なしまたはＡＭ－００１０ありの非形質導入（すなわち、非ＣＡＲ）Ｔ細胞の効果は、ある程度の抗腫瘍効果をもたらしたが、それでも研究の３５日目までに動物の多数の死亡を伴う著しく高い死亡率を示した。全身生物発光イメージングデータは、腫瘍（暗い領域）が動物全体に急速に広がり、コホート内のすべての動物に罹患率および死亡率をもたらし、研究の３５日目までに多数の動物が死亡することを示す。
５００万個のＣＡＲ－Ｔ細胞の投与は、５匹すべての動物が研究の３５日目まで生存したという治療的有用性を示した。しかしながら、５００万個のＣＡＲ－Ｔ細胞の投与と併用した０．５ｍｇ／ｋｇのＡＭ－００１０へのマウスの曝露の結果は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法単独でＩＬ－１０剤の存在下で投与された場合のＣＡＲ－Ｔ細胞療法の有意な改善を実証し、この組み合わせは大多数の動物で有意な腫瘍の減少を実証した。マウスに０．５ｍｇ／ｋｇのＡＭ－００１０を投与せずに、より少ない（２５０万）量のＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた同様の実験を行った。２５０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞へのマウスの曝露は、５匹すべての動物が研究の３５日目まで生存したという治療的有用性を示した。しかしながら、これらのデータとＩＬ－１０剤の投与と併用した治療的有用性との対照は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法単独でＩＬ－１０剤の存在下で投与された場合のＣＡＲ－Ｔ細胞療法の有意な改善を実証し、この組み合わせは大多数の動物で有意な腫瘍の減少を実証した。
これらの結果は、全身生物発光データによって確認されている。５００万個のＣＡＲ－Ｔ細胞の投与と関連する生物発光データを生成し、５匹すべての動物が研究の３５日目まで生存したという治療的有用性を示した。５００万個のＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた０．５ｍｇ／ｋｇのＡＭ－００１０による治療から得られた全身生体発光データを生成し、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法単独でＩＬ－１０剤の存在下で投与された場合のＣＡＲ－Ｔ細胞療法の有意な治療的改善をもたらし、この組み合わせは、３５日目に５匹の動物のうちの３匹の動物で有意な腫瘍の減少および腫瘍の明らかな欠如を実証する。
２５０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞による治療から得られた全身生体発光データは、５匹すべての動物が研究の３５日目まで生存したという治療的有用性を示した。０．５ｍｇ／ｋｇのＡＭ－００１０および２５０万個のＣＡＲ－Ｔ細胞の併用治療レジメンに関連する全身生物発光データは、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法単独よりも併用治療の重要な利点を実証する。
前述のインビボデータは、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法をＩＬ－１０剤の投与と併用することによって提供される増強した抗腫瘍効果の当該技術分野で認識されている腫瘍モデルを実証する。
Ｘ．医薬組成物
ＣＡＲ－Ｔ細胞および／またはＩＬ－１０剤が対象に投与される場合、本開示は、そのような薬剤の対象への投与に適した任意の形態の組成物の使用を企図する。一般に、そのような組成物は、ＣＡＲ－Ｔ細胞および／またはＩＬ－１０剤と、１つ以上の薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤と、任意に、捕足的な治療剤と、を含む「医薬組成物」である。医薬組成物は、本開示の方法で使用することができ、それにより例えば、医薬組成物を、エキソビボまたはインビボで対象に投与して、本明細書に記載の治療および予防の方法および使用を実施することができる。
本開示の医薬組成物は、意図される投与方法または経路と互換性であるように製剤化され得、例となる投与経路は本明細書に示される。さらに、本医薬組成物は、本開示によって企図される疾患、障害、および病態を治療または予防するために、本明細書に記載される他の治療的に活性な薬剤または化合物と組み合わせて使用することができる。
本医薬組成物は、典型的には、治療上有効な量の本開示によって企図されるＩＬ－１０剤と、１つ以上の医薬的および生理学的に許容される製剤と、を含む。好適な薬学的に許容されるかまたは生理学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤には、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸および重硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルまたはｎ－プロピル、ｐ－ヒドロキシベンゾエート）、乳化剤、懸濁剤、分散剤、溶媒、充填剤、増量剤、洗剤、緩衝液、ビヒクル、希釈剤、ならびに／またはアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。例えば、好適なビヒクルは、おそらく非経口投与用の医薬組成物中で一般的な他の材料を補充した、生理食塩水またはクエン酸緩衝食塩水であり得る。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。
当業者は、本明細書で企図される医薬組成物および剤形で使用することができる様々な緩衝液を容易に認識するであろう。典型的な緩衝液には、薬学的に許容される弱酸、弱塩基、またはそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。一例として、緩衝液構成成分は、リン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびそれらの塩などの水溶性材料であり得る。許容される緩衝剤には、例えば、トリス緩衝液、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、およびＮ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）が含まれる。
医薬組成物を製剤化した後、それは、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体、または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末として、無菌バイアル内で保管することができる。そのような製剤は、使用準備済みの形態、使用前に再構成が必要な凍結乾燥形態、使用前に希釈が必要な液体形態、または他の許容される形態のいずれかで保管することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、使い捨て容器（例えば、使い捨てバイアル、アンプル、シリンジ、または自動注射器（例えば、ＥｐｉＰｅｎ（登録商標）に類似したもの））内に提供される一方で、他の実施形態において、多用途容器（例えば、多用途バイアル）が提供される。留置剤（例えば、留置可能ポンプ）およびカテーテル系、緩徐注射ポンプおよびデバイスを含む、ＩＬ－１０を送達するための任意の薬物送達装置を使用することができ、これらはすべて、当業者に周知である。一般に皮下または筋肉内投与されるデポ注射もまた、本明細書に開示されるポリペプチドを定義された期間にわたって放出するために利用することができる。デポ注射は、通常、固体ベースまたは油ベースのいずれかであり、一般に本明細書に明記される製剤構成成分の少なくとも１つを含む。当業者は、可能な製剤およびデポ注射の使用に精通している。
医薬組成物は、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、本明細書で言及される好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、既知の技術に従って製剤化することができる。無菌の注射可能な調製物はまた、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液としての、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の、無菌の注射可能な溶液または懸濁液であってもよい。用いることができる許容される希釈剤、溶媒、および分散培地には、水、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、ならびにそれらの好適な混合物が含まれる。加えて、無菌の固定油は、溶媒または懸濁培地として従来用いられている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激の固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製において用途を見出している。特定の注射可能な製剤の吸収延長は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチン）を含めることによって達成することができる。
活性剤を含有する医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、乳濁液、硬質もしくは軟質カプセル、またはシロップ、溶液、マイクロビーズ、もしくはエリキシル剤としての、経口使用に好適な形態であり得る。特定の実施形態において、本明細書に記載のＩＬ－１０剤と同時投与される薬剤の活性成分は、経口使用に好適な形態である。経口使用が意図される医薬組成物は、医薬組成物の製造について当該技術分野で既知の任意の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、例えば、甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤などの１つ以上の薬剤を含有することで、医薬的に上品で口当たりのよい調製物を提供することができる。錠剤およびカプセルなどは、錠剤の製造に好適な非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合された、活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなどの希釈剤；造粒剤および崩壊剤、例えば、コーンスターチまたはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、またはアラビアゴム；ならびに潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクであってもよい。
水性懸濁液は、その製造に好適な賦形剤と混合された活性材料を含有する。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル－ピロリドン、トラガントゴムおよびアラビアゴム；分散剤または湿潤剤、例えば、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ステアリン酸ポリオキシ－エチレン）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノールの場合）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物（例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合生成物（例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタン）であり得る。水性懸濁液はまた、１つ以上の保存剤を含有してもよい。
油性懸濁液は、活性成分を、植物油、例えば、ピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはヤシ油中に、または流動パラフィンなどの鉱物油中に懸濁させることによって製剤化され得る。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、ミツロウ、固形パラフィン、またはセチルアルコールを含有してもよい。上記に明記されるものなどの甘味剤、および香味剤を添加して、口当たりのよい経口調製物を提供することができる。
水の添加による水性懸濁液の調製に好適な分散性粉末および顆粒は、分散もしくは湿潤剤、懸濁剤、および１つ以上の防腐剤との混合物中の活性成分を提供する。好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、本明細書に例証されている。
本開示の医薬組成物はまた、水中油型乳濁液の形態であってもよい。油性相は、植物油（例えば、オリーブ油もしくはラッカセイ油）、または鉱物油（例えば、流動パラフィン）、あるいはこれらの混合物であり得る。好適な乳化剤は、天然に存在するゴム、例えば、アラビアゴムまたはトラガントガム；天然に存在するホスファチド、例えば、ダイズ、レシチン、および脂肪酸に由来するエステルまたは部分エステル；ヘキシトール無水物、例えば、モノオレイン酸ソルビタン；ならびに部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンであり得る。
製剤はまた、インプラント、リポソーム、ヒドロゲル、プロドラッグ、およびマイクロカプセル送達系を含む、制御放出製剤等の、組成物を急速な分解または身体からの排泄から保護するための担体を含み得る。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を、単独またはワックスと併用して使用することができる。
本開示は、直腸投与のための座薬の形態にあるＩＬ－１０ポリペプチドの投与を企図する。坐薬は、常温では固体であるが直腸温度では液体であるため、薬物と、直腸内で溶けて薬物を放出する好適な非刺激性賦形剤とを混合することによって調製することができる。そのような材料には、カカオバターおよびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。
ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）、ならびに本開示によって企図される他の薬剤は、現在既知であるか、または将来開発される任意の他の好適な医薬組成物の形態（例えば、経鼻または吸入使用のためのスプレー）であり得る。
製剤中のポリペプチド（例えば、ＩＬ－１０）またはその断片の濃度は、広く異なり得（例えば、約０．１重量％未満から、通常、約２重量％で、または少なくとも約２重量％で、最大２０重量％～５０重量％以上）、通常は、例えば、選択される特定の投与様式に従って、主に、液量、粘度、および対象に基づく因子に基づいて選択されることになる。
本開示のＩＬ－１０剤およびＣＡＲ－Ｔ細胞（ならびにＩＬ－１０／ＣＡＲ－Ｔ細胞療法と併用して投与するための補助剤）は、対象への投与に適した組成物の形態であり得る。一般に、かかる組成物は、ＩＬ－１０および／またはＣＡＲ－Ｔ細胞と、１つ以上の薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とを含む「医薬組成物」である。ある特定の実施形態において、ＩＬ－１０剤およびＣＡＲ－Ｔ細胞は各々、治療的に許容される量で存在する。ＣＡＲ－Ｔ細胞がＩＬ－１０剤とエクスビボでプレインキュベートされる本発明のそれらの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、投与前のＣＡＲ－Ｔ細胞からＩＬ－１０剤を除去する必要なしにプレインキュベーションＩＬ－１０剤と併用して投与され得る。医薬組成物は、本開示の方法で使用することができ、それにより例えば、医薬組成物を、エキソビボまたはインビボで対象に投与して、本明細書に記載の治療および予防の方法および使用を実施することができる。
一実施形態において、本発明は、ＩＬ－１０剤およびＣＡＲ－Ｔ細胞を含む医薬的に許容される製剤を提供する。一実施形態において、ＩＬ－１０剤およびＣＡＲ－Ｔ細胞を含む医薬的に許容される製剤を含む薬理学的に許容される製剤は、凍結される。一実施形態において、医薬的に許容される製剤は、ある量のＣＡＲ－Ｔ細胞を解凍し、解凍されたＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＩＬ－１０剤を含む医薬的に許容される製剤と接触させることによって調製される。一実施形態において、ＩＬ－１０剤およびＣＡＲ－Ｔ細胞を含む医薬的に許容される製剤を含む許容される製剤は、対象への投与前２４時間以内、任意に対象への投与前１２時間以内、任意に対象への投与前８時間以内、任意に対象への投与前６時間以内、任意に対象への投与前４時間以内、任意に対象への投与前２時間以内、任意に対象への投与前１時間以内、または任意に対象への投与前３０分以内に調製される。本発明の一実施形態において、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ－１０剤を含む医薬製剤の投与によって、疾患、障害、または病態の治療方法を提供する。本発明の一実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ－１０剤を含む医薬製剤の投与によって、疾患、障害、または病態の治療方法を提供し、ＩＬ－１０剤およびＣＡＲ－Ｔ細胞を含む医薬的に許容される製剤は、対象への投与前２４時間以内、任意に対象への投与前１２時間以内、任意に対象への投与前８時間以内、任意に対象への投与前６時間以内、任意に対象への投与前４時間以内、任意に対象への投与前２時間以内、任意に対象への投与前１時間以内、または任意に対象への投与前３０分以内に調製される。一実施形態において、治療される疾患の障害、または病態は、腫瘍性、炎症性、または過剰増殖性の疾患、障害、または病態からなる群から選択される。
Ｙ．投与経路
本開示は、任意の好適な様式における、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）、ならびにそれらの組成物の投与を企図する。好適な投与経路には、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、皮下（例えば、注射またはインプラント）、腹腔内、嚢内、関節内、腹腔内、脳内（実質内および脳室内）、経口、鼻腔内、膣内、舌下、眼内、直腸内、局所（例えば、経皮）、舌下、および吸入が含まれる。一般に皮下または筋肉内投与されるデポ注射もまた、本明細書に開示されるＩＬ－１０剤を定義された期間にわたって放出するために利用することができる。
本開示のいくつかの特定の実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）は非経口的に投与され、さらに特定の実施形態において、非経口投与は皮下投与される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、静脈内に提供され、ＩＬ－１０剤は、皮下に投与される。
ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に関しては、対象に、キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子改変された治療上有効な複数の細胞を導入するための代替手段が、本明細書に記載されており、キメラ抗原受容体は、標的細胞集団に結合することができる少なくとも１つの抗原特異的標的領域を含み、標的細胞集団へのキメラ抗原受容体標的化領域の結合は、活性化誘導性細胞死を誘発することができる。
Ｚ．キット
本開示はまた、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）、ならびにそれらの医薬組成物を含むキットも企図する。キットは一般に、後述のように、様々な構成要素を収容する物理的構造の形態であり、例えば、上述の方法を実施する際に利用することができる。キットは、本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）（例えば、滅菌容器で提供される）を含み得、これらは、対象への投与に適した医薬組成物の形態であり得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ－１０剤（例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０）ＩＬ－１０剤は、即時使用可能な形態、または例えば投与前に、解凍、再構築、もしくは希釈が必要な形態で提供され得る。ＣＡＲ－Ｔ細胞および／またはＩＬ－１０剤が、ユーザーによる再構成が必要な形態である場合、キットはまた、ＩＬ－１０剤とともに、またはそれらとは別個にパッケージ化された、緩衝液、薬学的に許容される賦形剤なども含むことができる。キットには、ＩＬ－１０剤および／または使用する特定のＣＡＲ－Ｔ細胞療法の成分の両方を含めることもでき、キットには、複数のエージェントを個別に含めることもできるか、またはキット内ですでに組み合わせることができる。本開示のキットは、その中に収容される構成要素を適切に維持するために必要な条件（例えば、冷蔵または冷凍）のために設計することができる。
キットは、その中の構成要素を特定する情報ならびにそれらの使用に関する指示（例えば、投薬パラメータ、活性成分（複数可）の臨床薬理学（作用機構（複数可）を含む）、薬物動態学および薬力学、有害作用、禁忌症など）を含む、ラベルまたはパッケージ挿入物を含有してもよい。キットの各構成要素は、個々の容器内に封入されてもよく、様々な容器のすべては、単一のパッケージ内にあってもよい。ラベルまたは文書は、ロット番号および有効期限などの製造業者の情報を含むことができる。ラベルまたは添付文書は、例えば、構成要素を収容する物理的構造内に組み込まれる、物理的構造体内に別個に含有される、またはキットの構成要素（例えば、アンプル、シリンジ、またはバイアル）に貼付され得る。
ラベルまたは文書は、ディスク（例えば、ハードディスク、カード、メモリディスク）、光ディスク（ＣＤ－もしくはＤＶＤ－ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープなど）、または電気メモリ媒体（ＲＡＭおよびＲＯＭなど）、またはこれらのハイブリッド（磁気／光メモリ媒体、ＦＬＡＳＨ媒体、もしくはメモリ型カードなど）などのコンピュータ可読媒体をさらに含む、またはそれらに組み込むことができる。いくつかの実施形態において、実際の説明書は、キット内に存在しないが、例えば、政府の規制（例えばＨＩＰＡＡ）に準拠するためのパスワード（またはＩＬ－１０もしくはＣＡＲ－Ｔ細胞の容器におけるバーコードもしくはＱＲコードなどのスキャン可能なコード）を提供することによって安全なアクセスを含む、インターネットサイトを介して遠隔源から説明書を得るための手段が提供される。
以下の実施例は、当業者に本発明をどのように作製および使用するかの完全なる開示および説明を提供するように提示され、発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験が、実行されたものであり、また実行され得る実験のすべてであると表すようにも意図されていない。現在形で書かれている例となる説明は必ずしも実行されておらず、むしろそれらの説明は、本明細書に記載のデータなどを生成するために実行され得ることを理解されたい。使用される数値（例えば、量、温度など）に対する正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験によるエラーおよび偏差が計上されるはずである。
別段示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏（℃）であり、圧力は大気圧または大気圧付近でのものである。標準的な省略形が使用され、これには以下が含まれる：ｓまたはｓｅｃ＝秒（複数可）；ｍｉｎ＝分（複数可）；ｈまたはｈｒ＝時間（複数可）；ａａ＝アミノ酸（複数可）；ｂｐ＝塩基対（複数可）；ｋｂ＝キロベース（複数可）；ｎｔ＝ヌクレオチド（複数可）；ｎｇ＝ナノグラム；μｇ＝マイクログラム；ｍｇ＝ミリグラム；ｇ＝グラム；ｋｇ＝キログラム；ｄｌまたはｄＬ＝デシリットル；μｌまたはμＬ＝マイクロリットル；ｍｌまたはｍＬ＝ミリリットル；ｌまたはＬ＝リットル；ｎＭ＝ナノモル；μＭ＝マイクロモル；ｍＭ＝ミリモル；Ｍ＝モル；ｋＤａ＝キロダルトン；ｉ．ｍ．＝筋肉内（に）、ｉ．ｐ．＝腹腔内（に）；ＳＣまたはＳＱ＝皮下（に）；ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー；ＢＷ＝体重；Ｕ＝単位；ｎｓ＝統計的に有意ではない；ＰＭＡ＝Ｐｈｏｒｂｏｌ１２－ミリステート１３－アセテート；ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水；ＤＭＥＭ＝ダルベッコ改変イーグル培地；ＰＢＭＣ＝一次末梢血単核細胞；ＦＢＳ＝ウシ胎児血清；ＦＣＳ＝ウシ胎児血清；ＨＥＰＥＳ＝４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸；ＬＰＳ＝リポ多糖；ＲＰＭＩ＝ロズウェルパーク記念研究所培地；ＡＰＣ＝抗原提示細胞；ＦＡＣＳ＝蛍光活性化セルソーティング。
以下の一般的な材料および方法は、指示されている場合に使用されたか、または以下の実施例で使用され得る。
分子生物学的手順。分子生物学における標準的な方法は、科学文献に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、ならびに細菌細胞内でのクローニングおよびＤＮＡ変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合多糖およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、ならびに生物情報学（Ｖｏｌ．４）について記載する、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１－４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
抗体関連プロセス。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生、精製、および断片化は、記載されおり（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、リガンド／受容体相互作用を特性評価するための標準的な技術が利用可能であり（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹを参照されたい）、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能であり（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪを参照されたい）、例えば、診断試薬として使用するための、核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチド、ならびに抗体を含む、核酸の修飾に好適な蛍光試薬が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ．、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）。抗体のさらなる考察は、本明細書の他の箇所に現れる。
ソフトウェア。例えば、抗原断片、リーダー配列、タンパク質折り畳み、機能ドメイン、グリコシル化部位、および配列整列を決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが、利用可能である（例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＤｅＣｙｐｈｅｒ（商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ，ＮＶ）を参照されたい）。
ペグ化。本明細書に記載のペグ化ＩＬ－１０は、当業者に知られている任意の手段によって合成することができる。モノ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０およびモノ－／ジ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０の混合物を生成するための例示的な合成スキームが記載されている（例えば、米国特許第７，０５２，６８６号、米国特許公開第２０１１／０２５０１６３号、ＷＯ２０１０／０７７８５３を参照されたい）。本開示の特定の実施形態は、選択的にペグ化されたモノ－およびジ－ＰＥＧ－ＩＬ－１０の混合物を含む。本開示の実施に好適なＰＥＧ（および他の薬物送達技術）の生成および使用における自身の技術を活用することに加えて、当業者は、ＰＥＧ関連技術の多くの商業的供給業者（例えば、ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）およびＰａｒｃｈｅｍ（Ｎｅｗ Ｒｏｃｈｅｌｌｅ，ＮＹ））に精通している。
動物。当業者に知られている様々なマウスおよび他の動物系統を、本開示の教示と併せて使用することができる。例えば、免疫適格性Ｂａｌｂ／ＣまたはＢ細胞欠損Ｂａｌｂ／Ｃマウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥから得ることができ、標準的な手順に従って使用し得る（例えば、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９（１１）：７０６７－７３およびＣｏｍｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．５４（６）：６８１－８９を参照されたい）。
ＩＬ－１０濃度。血清ＩＬ－１０濃度レベルおよび曝露レベルは、当該技術分野で使用される標準的な方法によって決定することができる。例えば、実験対象が、マウスである場合、血清曝露レベルアッセイは、単純な毛細管の中に切り取ったマウスの尾から全血（約５０μＬ／マウス）を収集し、血清と血液細胞とを遠心分離によって分離させ、標準的なＥＬＩＳＡキットおよび技法によってＩＬ－１０曝露レベルを決定することによって行うことができる。
ＦＡＣＳ分析。ＦＡＣＳ分析のための多数のプロトコル、材料、および試薬が市販されており、本明細書の教示と併せて使用することができる（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｎｆｏｒｄ，ＭＡ、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）。直接フローサイトメトリー（すなわち、共役一次抗体を使用する）および間接フローサイトメトリー（すなわち、一次抗体および共役二次抗体を使用する）の両方を使用することができる。例示的な直接フロープロトコルは、以下のとおりである：収集した細胞を洗浄し、氷冷したＰＢＳ、１０％ＦＣＳ、１％アジ化ナトリウム中の細胞懸濁液で１～５×１０６個の細胞／ｍＬの濃度に調整する。ポリスチレンの丸底１２×７５ｍｍ２のファルコンチューブ中で、細胞を染色することができる。細胞の喪失がほとんどない状態であるが、細胞を再懸濁するのが困難でない程度で、細胞を十分に遠心分離して、それで上清液を除去することができる。一次標識抗体を添加し（０．１～１０μｇ／ｍＬ）、必要に応じて３％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈物を作製することができる。４℃で少なくとも３０分間インキュベートした後、細胞を４００ｇで５分間遠心分離して３回洗浄し、０．５～１ｍＬの氷冷したＰＢＳ、１０％ＦＣＳ、１％アジ化ナトリウム中に再懸濁することができる。細胞は、分析するまで（好ましくは同じ日以内に）、暗所の氷上で維持することができる。細胞を数日間保つために標準的な方法論を使用して細胞を固定することもでき、異なる抗原の固定は、抗原特異的な最適化を必要とする場合がある。
ＰＢＭＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞遺伝子発現アッセイ。以下のプロトコルは、遺伝子発現を調べるための例示的なアッセイを提供する。ヒトＰＢＭＣは、任意の標準的なプロトコルに従って単離することができる（例えば、Ｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ７．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹを参照されたい）。ＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、およびペニシリン／ストレプトマイシンカクテル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する完全ＲＰＭＩを用いて、任意の標準的な組織培養処理６ウェルプレート（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）において、１ウェル当たり２．５ｍＬのＰＢＭＣ（８００万個の細胞／ｍＬの細胞密度）を、培養することができる。ヒトペグ化ＩＬ－１０を、１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度でウェルに添加し、７日間インキュベートすることができる。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃのＭＡＣＳ細胞分離技術を使用して、製造業者のプロトコル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に従って、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから分離することができる。ＲＮＡを抽出することができ、ｃＤＮＡを、製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ Ｎ．Ｖ．；Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に従って、それぞれ、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットおよびＲＴ２ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄキットを使用して単離したＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させたＰＢＭＣから合成することができる。ＱｉａｇｅｎのＲＴ２ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘおよびプライマー（ＩＤＯ１、ＧＵＳＢ、およびＧＡＰＤＨ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、ｃＤＮＡテンプレートに対して定量的ＰＣＲを実施することができる。ＩＤＯ１ Ｃｔ値は、ハウスキーピング遺伝子、ＧＵＳＢおよびＧＡＰＤＨの平均Ｃｔ値に正規化することができる。
ＰＢＭＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞サイトカイン分泌アッセイ。活性化一次ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＥＧ－ＩＬ－１０、次いで抗ＣＤ３抗体で処理した場合に、ＩＦＮ－γを分泌する。以下のプロトコルは、サイトカイン分泌を調べるための例示的なアッセイを提供する。
ＴＮＦα阻害アッセイ。Ｕ９３７細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（番号８５０１１４４０）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能な肺由来のリンパ芽球ヒト細胞株）のＰＭＡ刺激が、細胞にＴＮＦαを分泌させ、その後、これらのＴＮＦα分泌細胞のヒトＩＬ－１０活性による処理は、用量依存的な様式で、ＴＮＦα分泌の低下をもたらす。例示的なＴＮＦα阻害アッセイは、以下のプロトコルを使用して実行することができる。
１０％のＦＢＳ／ＦＣＳおよび抗生物質を含有するＲＭＰＩ中でＵ９３７細胞を培養した後、９６ウェルの平底プレート（任意のプラズマ処理された組織培養プレート（例えば、Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用することができる）に、１つの条件当たり三連で、１×１０５個、９０％の生存Ｕ９３７細胞を播種する。細胞を播種して、以下の条件（すべて少なくとも三連、「培地単独」については、２分の１が１０ｎＭのＰＭＡとのインキュベーション後の生存に使用されるため、ウェルの数は倍になる）を提供する：５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ単独；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋０．１ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１０００ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋０．１ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ－ｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ－ｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１０ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ－ｒｈＩＬ－１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ－ｒｈＩＬ－１０；および５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１０００ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ－ｒｈＩＬ－１０。各ウェルを２００μＬ中１０ｎＭのＰＭＡに２４時間曝露し、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター内で培養した後、細胞の約９０％が接着性しているべきである。３つの余分なウェルを再懸濁させることができ、細胞を計数して、生存率を評価する（９０％超が生存可能であるべきである）。新鮮な非ＰＭＡ含有培地で穏やかに、しかし完全に３回洗浄し、細胞がウェル内に残ることを確実にする。１ウェル当たり１００μＬの、適切な濃度（体積が１００％に希釈されるため、２倍）のｒｈＩＬ－１０またはＰＥＧ－ｒｈＩＬ－１０を含有する培地を添加し、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター内で３０分間インキュベートする。１ウェル当たり１００μＬの１０ｎｇ／ｍＬのストックＬＰＳを添加して、各ウェル内で５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳの最終濃度を達成し、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター内で１８～２４時間インキュベートする。上清を除去し、製造業者の取扱説明書に従ってＴＮＦαＥＬＩＳＡを実行する。各条件付けされた上清を、ＥＬＩＳＡ内、二連で実行する。
ＭＣ／９細胞増殖アッセイ。ＭＣ／９細胞（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡから入手可能な肥満細胞の特徴を備えたマウス細胞株）へのＩＬ－１０投与は、用量依存的な様式で細胞増殖の増大を引き起こす。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－Ｓｎｉｐｅｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：５０７－１０）は、ＭＣ／９細胞がＩＬ３＋ＩＬ－１０およびＩＬ－３＋ＩＬ－４＋ＩＬ－１０で補う標準的なアッセイプロトコルについて記載している。供給業者（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ；およびＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）は、ｒｈＩＬ－１０のロットリリースアッセイとしてこのアッセイを使用する。当業者であれば、細胞にＩＬ－１０のみを補うように、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－Ｓｎｉｐｅｓ，Ｌ．らに記載の標準的なアッセイプロトコルを変更することができる。
活性化誘導細胞死アッセイ。以下のプロトコルは、例示的な活性化誘導細胞死アッセイを提供する。
ヒトＰＢＭＣは、任意の標準的なプロトコルに従って単離することができる（例えば、Ｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ７．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹを参照されたい）。ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋）は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃの抗ＣＤ４５ＲＯ ＭＡＣＳビーズおよびＭＡＣＳ細胞分離技術を製造業者のプロトコル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ；Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に従って使用して単離することができる。細胞を活性化するために、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でプレコーティングされた標準的な２４ウェルプレート（ＢＤ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中で、ＡＩＭ Ｖ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で、１ｍＬの単離細胞（３×１０６細胞／ｍＬの密度）を３日間培養することができる。プレコーティングプロセスは、１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３および２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体を含有する、３００μＬの炭酸緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．５Ｍ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＨ８．３）を各ウェルに添加し、３７°Ｃで２時間インキュベートし、ＡＩＭＶ培地で各ウェルを洗浄することによって行うことができる。３日間の活性化期間に続いて、細胞を収集し、計数し、収集することができ、標準的な２４ウェルプレートに１ｍＬのＡＩＭ Ｖ培地（２×１０６細胞／ｍＬの密度）に再播種し、１００ｎｇ／ｍｌのＰＥＧ－ｈＩＬ－１０で３日間処理することができる。ＰＥＧ－ｈＩＬ－１０による活性化および処理のプロセスを繰り返すことができ、その後、製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、トリパンブルー排除によって生細胞を計数することができる。
腫瘍モデルおよび腫瘍分析。当該技術分野で認められている任意の腫瘍モデル、アッセイなどを使用して、本明細書に記載のＩＬ－１０剤が様々な腫瘍に与える影響を評価することができる。本明細書以下に記載の腫瘍モデルおよび腫瘍分析は、利用可能な腫瘍モデルおよび腫瘍分析の代表的なものである。同系マウス腫瘍細胞を、１回の腫瘍接種当たり１０４、１０５、または１０６個の細胞で、皮下または皮内注射する。Ｅｐ２乳癌、ＣＴ２６結腸癌、ＰＤＶ６皮膚の扁平上皮癌、および４Ｔ１乳癌モデルを使用することができる（例えば、Ｌａｎｇｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４２：４６１－４６５を参照されたい）。免疫適格性Ｂａｌｂ／ＣまたはＢ細胞欠損Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用することができる。ＰＥＧ １０－ｍＩＬ－１０を免疫適格性マウスに投与し得、一方でＰＥＧ－ｈＩＬ－１０治療は、Ｂ細胞欠乏性マウスにおいて行い得る。腫瘍を、治療開始前に、１００～２５０ｍｍ３のサイズに到達させる。ＩＬ－１０、ＰＥＧ－ｍＩＬ－１０、ＰＥＧ－ｈＩＬ－１０、または緩衝液対照を、腫瘍移植部から離れた部位に皮下投与する。腫瘍成長は、典型的には、電子ノギスを使用して、１週間に２回監視する。腫瘍組織およびリンパ器官を、様々なエンドポイントで採取して、いくつかの炎症マーカーのｍＲＮＡ発現を測定し、いくつかの炎症細胞マーカーの免疫組織化学を実行する。組織を、液体窒素中で急速冷凍し、－８０℃で保管する。一次腫瘍成長は、電子キャリパーを使用して、典型的には週に２回監視する。腫瘍体積は、式（幅２×長さ／２）を使用して計算することができ、式中、長さは、より長い方の寸法である。腫瘍を、治療開始前に、９０～２５０ｍｍ３のサイズに到達させる。
実施例１．ＰＥＧ－ＩＬ－１０は、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫活性化を媒介する
ＰＥＧ－ｒＨｕＩＬ－１０による治療の２９日前と後の癌患者において、ＰＤ－１およびＬＡＧ３を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の数の変化を、測定した。持続性の部分応答を伴って療法に応答した２人の患者は、血中のＰＤ１＋ＣＤ８ Ｔ細胞が増加した。１人目の患者（腎細胞癌）は、２０μｇ／ｋｇのＰＥＧ－ｒＨｕＩＬ－１０ ＳＣを毎日投与され、２２週間後に総腫瘍量が７１％減少した。２人目の患者（黒色腫）は、４０μｇ／ｋｇのＰＥＧ－ｒＨｕＩＬ－１０ ＳＣを毎日投与され、２２週間後に総腫瘍量が５７％減少した。
末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）は、治療前および治療期間中に各患者の末梢から分離され、ＦＡＣＳ分析に供された。ＰＤ－１を発現する末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、２９日以内に約２倍まで増加し、治療期間中も増加し続け、ＬＡＧ３を発現する末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、２９日以内に約４倍まで増加した。ＰＤ－１およびＬＡＧ３の両方は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および細胞毒性機能のマーカーである。これらの所見は、ＰＥＧ－ｒＨｕＩＬ－１０の投与がＣＤ８＋Ｔ細胞免疫活性化を媒介したことを示唆している。
実施例２．ＰＥＧ－ＩＬ－１０は、活性化メモリＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を増強する
メモリＴ細胞（抗原経験Ｔ細胞とも称される）は、以前の感染、癌への曝露、または以前のワクチン接種の間に、その同族抗原に以前に遭遇および応答したＴリンパ球のサブセット（例えば、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）および細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８＋））である。対照的に、ナイーブＴ細胞は末梢内でその同族抗原に遭遇しておらず、これは、一般に、活性化マーカーのＣＤ２５、ＣＤ４４、またはＣＤ６９がないこと、およびメモリＣＤ４５ＲＯアイソフォームがないことを特徴とする。一般にＣＤ４５ＲＯ＋であるメモリＴ細胞は、ナイーブＴ細胞よりも速く強力な免疫応答を再現および開始することができる。
ＣＡＲ－Ｔ細胞が、メモリＣＤ８＋Ｔ細胞に由来することを考えれば、メモリＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＰＥＧ－ＩＬ－１０の効果は、標準的な方法論を使用してインビトロで評価され、この実施例は、本明細書に記載されている。ＰＥＧ－ＩＬ－１０は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞ではなく、メモリＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋）でのＩＦＮγ産生を優先的に増強する。これらのデータは、活性化メモリＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を増強するためのＰＥＧ－ＩＬ－１０の効果と矛盾がない。
実施例３．ＰＥＧ－ＩＬ－１０処理は、活性化メモリＣＤ８＋Ｔ細胞を増加する
本明細書に記載されるように、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、メモリＣＤ８＋Ｔ細胞に由来する。効果的であるためには、注入されたメモリＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞毒性を示すだけでなく、持続しなければならない（Ｃｕｒｒａｎ ＫＪ，Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ＲＪ．（２０ Ａｐｒ ２０１５）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ｐｉｉ：ＪＣＯ．２０１４．６０．３４４９、Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（Ｊａｎ ２００８）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１８（１）：２９４－３０５）。しかしながら、Ｔ細胞の反復活性化は、活性化誘導細胞死を引き起こし、細胞数を減少させ、したがって全体的な治療効果を減少させる。
本明細書に記載の手順を使用して、２人のドナーからのヒトＣＤ４５ＲＯ＋メモリＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化誘導細胞死を、ＰＥＧ－ＩＬ－１０での処理の有無にかかわらず決定した。２ラウンドのＴＣＲおよび共刺激誘導活性化後のＰＥＧ－ＩＬ－１０によるヒトＣＤ４５ＲＯ＋メモリＣＤ８＋Ｔ細胞の処理は、より多くの生細胞をもたらした。これらのデータは、ＰＥＧ－ＩＬ－１０が活性化誘導細胞死を制限することができ、その結果、より多くの活性化メモリＴ細胞が持続することを示す。これらの観察は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法と併用したＰＥＧ－ＩＬ－１０の使用が、さらなる臨床的利益を提供することを示唆している。
実施例４．ＩＬ２分泌アッセイ：
分泌されたＩＬ－２のレベルは、製造業者の取扱説明書に実質的に従って、ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＥＨ２ＩＬ２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １６８ Ｔｈｉｒｄ Ａｖｅｎｕｅ Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＵＳＡ ０２４５１として市販されている）を使用することによって決定された。
実施例５．ＩＦＮ－ガンマ分泌アッセイ
分泌されたインターフェロンガンマのレベルは、製造業者の取扱説明書に実質的に従って、ヒトＩＦＮ－ｇ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＫＨＣ４０１２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １６８ Ｔｈｉｒｄ Ａｖｅｎｕｅ Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＵＳＡ ０２４５１）を使用することによって決定された。
実施例６．グランザイムＢアッセイ
グランザイムＢのレベルは、製造業者の取扱説明書に実質的に従って、ＤｕｏＳｅｔ Ｈｕｍａｎ Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＹ２９０６－０５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ６１４ ＭｃＫｉｎｌｅｙ Ｐｌａｃｅ ＮＥ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ ５５４１３，ＵＳＡ）を使用することによって決定された。
実施例７．ＦＡＣＳ－細胞染色
細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および０．１％アジ化ナトリウムおよび０．４％ＢＳＡ）に懸濁した。細胞を、１×１０６個のアリコートに分割した。
Ｆｃ受容体は、正常ヤギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でブロックした。１００μｌの１：１０００で希釈した正常ヤギｌｇＧを、各チューブに添加し、氷上で１０分間インキュベートした。１．０ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液を、各チューブに添加し、よく混合し、３００ｇで５分間遠心分離した。ビオチン標識されたポリクローナルヤギ抗マウス－Ｆ（ａｂ）２抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して、ＣＤ１９ ｓｃＦｖを検出した。ビオチン標識された正常ポリクローナルヤギＩｇＧ抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して、アイソタイプ対照として機能を果たした。（１：２００の希釈、１００μｌの反応体積）。
細胞を、４℃で２５分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、１００μｌの１：１０００で希釈した正常マウスｌｇＧを、各チューブに添加することによって、正常マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロックし、氷上で１０分間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１００μｌのＦＡＣ緩衝液に再懸濁する。次いで、細胞を、フィコエリトリン（ＰＥ）標識されたストレプトアビジン（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識されたＣＤ３（ｅＢｉｏｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した。１．０μｌのＰＥおよびＡＰＣを、それぞれ、チューブ２および３に添加した。
フローサイトメトリーの取得は、ＢＤ ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実行し、分析は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ．Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて実行した。
実施例８．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
全血を、１０ｍＬのヘパリンバキュテナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で、個々のドナーまたは混合ドナーから（必要とされる血液の量に応じて）収集した。約１０ｍｌの全抗凝固血液を、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ ｐＨ７／４、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）緩衝液と混合して、５０ｍｌのコニカル遠心チューブで２０ｍｌの最終体積を達成した。１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＰＬＵＳ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－１４４０－０３）を、滅菌５０ｍＬのコニカル遠心チューブに入れ、２０ｍＬの体積の血液／ＰＢＳを、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）の表面に重層し、４００ｘｇで３０～４０分間室温で遠心分離した。血漿／フィコール界面に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む細胞の層を、注意深く除去した。ＰＢＭＣを、４０ｍｌの総体積のＰＢＳで２回洗浄し、２００ｘｇで１０分間室温で遠心分離し、細胞を血球計で計数した。
洗浄したＰＢＭＣをすぐに使用した場合、細胞をＣＡＲ－Ｔ培地で１回洗浄した。ＣＡＲ－Ｔ培地は、５％ＡＢ血清および１．２５ｕｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補ったＡＩＭＶ－ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからカタログ番号３１０３５０２５として市販されている）である。
洗浄したＰＢＭＣをすぐに使用しなかった場合、細胞を再懸濁し、洗浄し、断熱バイアルに移し、液体窒素で保存する前に－８０℃で２４時間冷蔵した。
実施例９．ＰＢＭＣの活性化：
ＰＢＭＣは、上記の実施例＿の教示に実質的に従って調製した。新しく単離したＰＢＭＣを使用した場合、単離された細胞（１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なし）は、１×１０６個の細胞／ｍＬの濃度で、ＣＡＲ－Ｔ培地中で１回洗浄した。細胞を、３００ＩＵ／ｍＬのｈｕＩＬ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＣＡＲ－Ｔ培地中で１×１０６個の細胞／ｍＬの最終濃度に再懸濁した。凍結ＰＢＭＣを使用した場合、細胞を解凍し、１０％ＦＢＳ、１００ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシンの存在下で、９ｍＬの予熱（３７℃）ｃＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１×１０６個の細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。細胞を、３００×ｇで５分間遠心分離することによってペレット化し、ＣＡＲ－Ｔ培地中で１回洗浄し、３００ＩＵ／ｍＬのｈｕＩＬ－２を用いて、ＣＡＲ－Ｔ培地中で１×１０６個の細胞／ｍＬの最終濃度に再懸濁した。
抗ヒトＣＤ２８およびＣＤ３抗体共役磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、磁気ラックを使用して１ｍＬの滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、ビーズを溶液から単離し、３００ＩＵ／ｍＬのｈｕＩＬ－２で補ったＣＡＲ－Ｔ培地中で４×１０７個のビーズ／ｍＬの最終濃度に再懸濁した。
ＰＢＭＣ細胞ならびにＣＤ２８およびＣＤ３抗体共役磁気ビーズを、１：１のビーズ対細胞比で混合した。
アリコートを、１２ウェル低結合または非処理細胞培養プレートの単一のウェルに移し、ＣＯ２の存在下で、ウイルス形質導入前に２４時間インキュベートした。
実施例１０．レンチウイルスＣＡＲ発現ベクター構築物：
ＣＤ８ヒンジ、４－１－ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ活性化ドメインに連結された、抗ＣＤ１９一本鎖抗体の細胞外配列をコードする核酸配列を含むＣＡＲ発現カセット（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ１９ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｂ ｌｉｎｅａｇｅ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｍａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３４：１１５７－１１６５に記載されているＦＭＣ６３のＳｃＦｖ配列を、調製した。ＣＡＲ発現カセットを、レンチウイルスプラスミドＬｅｎｔｉ ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１ａ－ｐｕｒｏ（Ａｌｓｔｅｍ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．）にクローニングして、プラスミドＳＴ１１６５を調製した。これらのプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、組換えレンチウイルスを生成し、これを使用して、一次ヒトＴ細胞を形質導入して、全血から単離した。
実施例１１．レンチウイルスＣＡＲ Ｐｌｕｓ ＩＬ－１０発現ベクター構築物：
ＣＡＲおよびｈＩＬ－１０の両方を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するために、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）レンチウイルスプラスミドＰＭＣ ３０３を、核酸配列が、ＩＬ－１０コード配列の発現を促進するために、介在ＥＦ１ａコアプロモーター配列を有するＣＡＲコード配列のＣＡＲの下流に挿入された上記の実施例１０の教示に実質的に従って調製した。
実施例１２．レンチウイルス粒子の生成
レンチウイルス粒子の産生には、３つの成分：１）レンチウイルスベクター、２）必要なすべてのウイルス構造タンパク質を含むパッケージングベクター、３）水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質（Ｇ）を発現するエンベロープベクター、が一般に必要である。レンチウイルスパッケージングは、製造業者の取扱説明書に実質的に従って、ＳｕｐｅｒＬｅｎｔｉ（商標）レンチウイルスパッケージングシステム（Ａｌｓｔｅｍ ＬＬＣ，２６００ Ｈｉｌｌｔｏｐ Ｄｒｉｖｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂ，ＳＴＥ Ｃ３２８，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ ９４８０６から市販されている）を使用して達成された。
実施例１３．Ｔ細胞の形質導入および増殖
本明細書の実施例８および９に従って調製された活性化ＰＢＭＣは、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。活性化ＰＢＭＣは、本明細書の実施例１２に従って調製された高力価レンチウイルス粒子で、５の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。細胞は、１×１０６個の細胞／ｍＬの細胞濃度を維持するために、時独添加されている培地を用いた所望のＣＡＲ－Ｔ細胞の数に応じて、１２～１４日間、ヒトＩＬ－２の３００ＩＵ／ｍＬの存在下で増殖した。抗ＣＤ１９ＣＡＲの発現は、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを検出するために抗マウスＦａｂ抗体断片を使用して、フローサイトメトリーによって検出した。
実施例１４．ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡを使用した細胞毒性の評価
インビトロで、コンフルエンスおよび細胞毒性は、製造業者から提供された取扱説明書に実質的に従って、ＲＴＣＡ ｉＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）システムおよびソフトウェア（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，６７７９ Ｍｅｓａ Ｒｉｄｇｅ Ｒｏａｄ，＃１００，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ ９２１２１から市販されている）を使用したｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）リアルタイム細胞分析（ＲＴＣＡ）手順を使用して細胞インピーダンスアッセイによって評価した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムは、マルチウェルプレートである「Ｅプレート」を使用し、各ウェルの底部は、電極アレイを含浸した表面を提供する。細胞が表面全体で増殖するにつれて、電極アレイ全体の電気インピーダンスが増加する。細胞が死んでプレートから浮き上がると、電気インピーダンスが低下する。したがって、アレイを横断する電子流のインピーダンスを測定することによって、細胞の生存率をリアルタイムで頻繁に測定することができる。付着細胞によって引き起こされる電子流のインピーダンスは、細胞指数（ＣＩ）として報告され、単位のないパラメータは、
Figure 0007097465000010
付着細胞がプレートの表面全体に増殖すると、電気インピーダンスの増加を反映してＣＩが上昇する。ＣＩがプラトーになると、細胞はプレート上でコンフルエントになると推定される。
データは、ＣＡＲ－Ｔ細胞へのＩＬ－１０剤の添加が、ＩＬ－１０剤の用量依存的な様式でＣＡＲ－Ｔ細胞毒性の特異的増強を媒介したことを実証する。特に、データは、ＩＬ－１０剤の存在下での標的細胞の細胞毒性の有意な増強を実証する。特に、標的腫瘍性細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性効果の増強は、非常に低濃度のＩＬ－１０（０．１ｎｇ／ｍｌ）でも観察されている。このデータは、約０．１ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０８ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０６ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０５ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０３ｎｇ／ｍｌ未満、あるいは約０．０１ｎｇ／ｍｌ未満の血清中トラフ濃度を達成するためのＩＬ－１０剤の投与が、ヒト対象におけるＣＡＲ－Ｔ細胞療法の治療効果を増強する（またはその毒性を低減する）のに有用であろう。
実施例１５．細胞毒性ＣＡＲ－Ｔ細胞に対するＩＬ－１０による前処理の効果
ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性に対するＩＬ－１０の前処理の効果を評価するために、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を洗浄し、濃度：（ａ）１０００ｎｇ／ｍｌ、（ｂ）１００ｎｇ／ｍｌ、（ｃ）１０ｎｇ／ｍｌ、（ｅ）１ｎｇ／ｍｌ、（ｆ）ＡＭ００１０なし、で様々な濃度のＩＬ－１０剤であるＡＭ００１０を含む培地中で（ＩＬ－２の不在下で）、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
ＣＡＲ－Ｔ細胞のインキュベーション期間と並行して、ウェルごとにＣＤ１９（「ＣＤ１９／ＨｅＬａ細胞」）を３重に安定的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）を、ウェルあたり約１０，０００個の細胞を用いてｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ Ｅプレート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に付着させた。細胞がコンフルエンスに到達したことを反映してＣＩ値がプラトーになるまで（約１８～２０時間）、細胞を付着させた。
次いで、上記のように調製した抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、濃度：（ａ）１００，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞（１０：１のＥ：Ｔ比）、（ｂ）５０，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞（５：１のＥ：Ｔ比）、（ｃ）２０，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞（２：１のＥ：Ｔ比）、および（ｅ）１０，０００個のＣＡＲ－Ｔ細胞（１：１のＥ：Ｔ比）で、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞対ＣＤ１９／ＨｅＬａ細胞の様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比（Ｅ：Ｔ比）で、ＣＤ１９／ＨｅＬａ細胞プレートに（３重に）添加した。
ＩＬ－１０剤であるＡＭ００１０を、各Ｅ：Ｔ比に関して、ＨｅＬａ細胞と抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞への曝露過程中、ＩＬ－１０剤の前インキュベーションレベル（すなわち、１０００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、および０ｎｇ／ｍｌ）を維持するために、各ウェルに添加した。ＨｅＬａ細胞に対する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性は、ＣＡＲ－Ｔ細胞がプレートから剥離するＨｅｌａ細胞を死滅させるときの電気抵抗の減少によって評価される。実験過程中、電気抵抗データは２分ごとに収集され、ｉＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（登録商標）システムを備えるソフトウェアを使用してデータが分析された。同じソフトウェアを使用して、３つの各ウェルからのデータを組み合わせて平均化した。
観察された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の添加時点から約１時間のインピーダンスの増加は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムによって測定されるように、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞がプレートに付着して、インピーダンスを増加させた結果によるものであった。しかしながら、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の添加後約１時間の時点から、ＣＩの着実な減少が観察され、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＣＤ１９／ＨｅＬａ細胞の効果的な死滅、および評価したＩＬ－１０剤のすべてのレベルで有意に増強された細胞毒性効果を示した。このデータは、ＩＬ－１０の添加が腫瘍細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性を増強することを実証する。
前述の実験から得られたデータは、抗ＣＤ－１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞と併用し、様々な量の抗ＣＤ－１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞で示すように、様々な濃度（０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、および１０００ｎｇ／ｍｌ）でＩＬ－１０剤（ＡＭ００１０）を添加することによって、１０，０００個のＣＤ１９／ＨｅＬａ細胞の培養に対する細胞毒性効果の増強を示すヒストグラムとして再プロットされた。ＡＭ００１０の添加は、ＡＭ－００１０のすべての試験濃度で、ＣＤ１９／ＨｅＬａ細胞に対する抗ＣＤ－１９ ＣＡＲ－Ｔのすべての比率で、ＣＤ１９／ＨｅＬａ細胞に対する抗ＣＤ－１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性効果を増強した。
実施例１６．ＩＬ－１０剤による治療はＣＡＲ－Ｔ細胞活性化を増強する：
加えて、ＩＬ－１０剤への曝露に応答したＴ細胞活性化の特徴は、ＩＦＮ－ガンマの発現の増強である。治療へのＩＬ－１０の添加は、ＩＬ－１０用量依存的な様式でＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＩＦＮ－ガンマ産生の有意な上方調節をもたらした。
実施例１７．インビボ評価：
マウスの腫瘍性疾患のインビボ腫瘍モデルにおいて、ＩＬ－１０剤（ＡＭ－００１０）と抗腫瘍ＣＡＲ－Ｔ細胞療法との組み合わせの効果を評価するために、研究が実施された。
簡単に説明すると、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂからの５匹の雌ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ）マウスのコホートに、ルシフェラーゼ遺伝子を提供するベクターによる形質導入によるＲａｊｉ細胞株（ＣＣＬ－８６としてＡＴＣＣから得られる）を操作することによって構築されたＣＤ１９＋Ｒａｊｉヒトバーキットリンパ腫細胞株である０．５×１０６個のＲａｊｉ－ｌｕｃ細胞を腹腔内接種した。ルシフェラーゼ遺伝子の発現により、生物発光イメージングが、当該技術分野でよく知られている技術（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ；（２０１２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ５９（１）：１２．２４．１－１２．２４．１１）に従って全身生物発光によって腫瘍成長を評価することができるようになる。
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、上記の実施例ＸＸＸの教示に実質的に従って調製した。要約研究設計治療群および投与された試験薬剤を、以下の表６に提供する。
Figure 0007097465000011
研究０日目に、５０万個のＲａｊｉ－ｌｕｃ腫瘍細胞を、各マウスに１００マイクロリットルの体積で静脈内注射によって投与した。治療開始前の同じ日に、マウスを画像化した。
研究０日目に、ＡＭ－００１０による治療を開始した。ＡＭ００１０を、研究１～８日目に毎日腹腔内投与し、９日目以降に皮下投与に切り替えた。
研究２日目および９日目に、ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴ細胞（模擬）を受容する動物において、ＣＡＲ－ＴまたはＴ細胞は、１００マイクロリットルの体積で表６に従って投与した。
研究０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、および３５日目に、製造業者の取扱説明書に実質的に従って、ＩＶＩＳ（登録商標）（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，９４０ Ｗｉｎｔｅｒ Ｓｔ．Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ ０２４５１から市販している）を使用して、マウスをイメージングした。
示されるように、癌は両方の群で急速に進行し、各群のすべての動物が実験の２１日目までに死亡した。
さらなる腫瘍成長が本質的に阻止されたため、Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞のみの効果があった。治療群２の５匹の動物のうちの２匹が、２１日目までに死亡し、治療群３の３匹目の動物が、３５日目までに死亡した。
群４および５の場合、ＩＬ－１０剤ＡＭ００１０の存在下での５００万個のＣＡＲ－Ｔ細胞の投与の効果は、ＣＡＲ－Ｔ剤と併用してＩＬ－１０剤で治療した群における腫瘍減少の顕著な改善を実証する。各治療群のすべての動物は、研究の３５日目には生存していた。
群６および７の場合、データは、上で考察されたように提供されたデータと比較して、この低用量のＣＡＲ－Ｔ細胞でＣＡＲ－Ｔ剤と併用してＩＬ－１０剤で治療した群における腫瘍減少の顕著な改善を実証する。各治療群のすべての動物は、研究の３５日目には生存していた。
前述のデータは、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法をＩＬ－１０剤の投与と併用することによって提供される増強した抗腫瘍効果の当該技術分野で認識されている腫瘍モデルを実証する。
本発明者らに既知である、本発明を実行するための最良の機序を含む、本発明の特定の実施形態が、本明細書に記載されている。前述の記載の閲読時に、開示された実施形態の変形が、当業者に明らかになる可能性があり、当業者は、そのような変形を必要に応じて用いることができることが期待される。したがって、本発明が、本明細書に具体的に記載される方法以外の方法で実施されること、ならびに本発明が、適用可能な法によって許容されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題のすべての修正および同等物を含むことが意図される。さらに、そのすべての可能な変形における上述の要素のいかなる組み合わせも、別段本明細書で指示されない限り、または別段文脈が明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
本明細書で引用されるすべての出版物、特許出願、受託番号、および他の参考文献は、あたかも個々の各出版物または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．腫瘍性疾患に罹患している哺乳動物対象を治療する方法であって、
ａ．患者由来のＴ細胞の試料を得ることと、
ｂ．前記試料中のＴ細胞の一部をベクターで形質導入することであって、前記ベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、１つ以上の制御要素と作動可能に会合して、Ｔ細胞内のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする前記核酸配列の転写および翻訳をもたらして、前記ＣＡＲを発現するＴ細胞の集団を生成する、形質導入することと、
ｃ．前記ＣＡＲを発現する前記Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を単離することと、
ｄ．ＩＬ－１０剤の存在下で前記ＣＡＲ－Ｔ細胞をエクスビボで培養することと、
ｅ．前記哺乳動物対象に、ステップ（ｄ）から前記ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与することと、を含む、方法。
２．ｆ．前記対象に、治療上有効な量のＩＬ－１０剤を含む医薬製剤を投与するステップをさらに含む、上記１に記載の方法。
３．ステップ（ｄ）の前記ＩＬ－１０剤およびステップ（ｆ）の前記医薬製剤の前記ＩＬ－１０剤が、同じＩＬ－１０剤である、上記２に記載の方法。
４．ステップ（ｄ）の前記ＩＬ－１０剤およびステップ（ｆ）の前記医薬製剤の前記ＩＬ－１０剤が、異なるＩＬ－１０剤である、上記２に記載の方法。
５．ステップ（ｄ）の第１のＩＬ－１０剤が、ｒｈＩＬ－１０であり、ステップ（ｆ）のＩＬ－１０剤の前記医薬製剤が、ペグ化ＩＬ－１０剤を含む、上記４に記載の方法。
６．ＩＬ－１０剤を含む前記医薬製剤が、モノペグ化ＩＬ－１０剤を含む、上記５に記載の方法。
７．ＩＬ－１０剤を含む前記医薬製剤が、モノペグ化ＩＬ－１０剤とジペグ化ＩＬ－１０剤との混合物を含む、上記５に記載の方法。
８．前記ＩＬ－１０剤を含む医薬製剤の前記投与が、少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．０１ｎｇ／ｍｌの前記対象における前記ＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である、上記２に記載の方法。
９．前記ＩＬ－１０剤を含む医薬製剤の前記投与が、少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．０５ｎｇ／ｍｌの前記対象における前記ＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である、上記２に記載の方法。
１０．前記ＩＬ－１０剤を含む医薬製剤の前記投与が、少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌの前記対象における前記ＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である、上記２に記載の方法。
１１．前記ＩＬ－１０剤を含む医薬製剤の前記投与が、少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌの前記対象における前記ＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である、上記２に記載の方法。
１２．前記ＩＬ－１０剤が、ｈＩＬ－１０に由来するＩＬ－１０バリアントである、上記１～１１のいずれかに記載の方法。
１３．前記ＣＡＲの抗原認識ドメインが、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、テロメラーゼ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、Ｔ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＦＡＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、５Ｔ４、ＷＴ１、ＫＧ２Ｄリガンド、葉酸受容体（ＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体Ａ、またはＷｎｔ１抗原に特異的に結合するポリペプチドである、上記１に記載の方法。
１４．前記ＣＡＲの抗原認識ドメインが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＡ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２－ｎｅｕ ｓｃＦｖ、抗ＶＥＧＦ－Ｒ２ ｓｃＦｖ、抗Ｔ１ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ、抗メソテリンｓｃＦｖ、抗ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ ｓｃＦｖ、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦｖ、抗ＦＡＰ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ、抗ＧＤ－２ ｓｃＦｖ、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ、抗ＭＡＧＥ ｓｃＦｖ、抗Ａ３ ｓｃＦｖ、抗５Ｔ４ ｓｃＦｖ、抗ＷＴ１ ｓｃＦｖ、または抗Ｗｎｔ１ ｓｃＦｖからなる群から選択される、上記１に記載の方法。
１５．前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７ ＣＤ２７８、ＣＤ１３４、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、ＣＤ２、ＣＤ５、またはＣＤ２８の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、上記１に記載の方法。
１６．前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、およびＣＤ４０の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含む、上記１に記載の方法。
１７．前記方法が、前記対象への１つ以上の補助剤の投与をさらに含む、上記１～１６のいずれかに記載の方法。
１８．前記１つ以上の補助剤が、化学療法剤、免疫チェックポイント調節剤、ＩＬ－２剤、ＩＬ－７剤、ＩＬ－１２剤、ＩＬ－１５剤、およびＩＬ－１８剤からなる群から選択される、上記１７に記載の方法。
１９．前記１つ以上の補助剤が、１つ以上の化学療法剤である、上記１７に記載の方法。
２０．前記１つ以上の補助剤が、ＰＤ１調節剤、ＰＤＬ１調節剤、ＣＴＬＡ４調節剤、ＬＡＧ－３調節剤、ＴＩＭ－３調節剤、ＩＣＯＳ調節剤、ＯＸ４０調節剤、ｃｄ－２７調節剤、ＣＤ－１３７調節剤、ＨＶＥＭ調節剤、ＣＤ２８調節剤、ＣＤ２２６調節剤、ＧＩＴＲ調節剤、ＢＴＬＡ調節剤、Ａ２Ａ調節剤、ＩＤＯ調節剤、およびＶＩＳＴＡ調節剤からなる群から選択される１つ以上の免疫チェックポイント調節剤である、上記１７に記載の方法。
２１．前記免疫チェックポイント調節剤が、抗体である、上記２０に記載の方法。
２２．対象における標的細胞集団に対するＴ細胞媒介性免疫応答を調節する方法であって、
ａ）前記対象に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変された治療上有効な複数の細胞を導入することであって、前記キメラ抗原受容体が、前記標的細胞集団に結合することができる少なくとも１つの抗原特異的標的領域を含む、ことと、
ｂ）前記対象に、治療上有効な量のＩＬ－１０剤を投与することであって、前記ＩＬ－１０剤の前記投与が、少なくとも０．０１ｎｇ／ｍｌの血清中トラフレベルをもたらす、ことと、を含む、方法。
２３．前記ＩＬ－１０剤が、モノペグ化ＩＬ－１０剤である、上記２２に記載の方法。
２４．前記ＩＬ－１０剤が、モノペグ化ＩＬ－１０剤とジペグ化ＩＬ－１０剤との混合物である、上記２２に記載の方法。
２５．前記ＩＬ－１０剤の前記投与が、少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．０３ｎｇ／ｍｌの前記対象における前記ＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である、上記２２に記載の方法。
２６．前記ＩＬ－１０剤の前記投与が、少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．０６ｎｇ／ｍｌの前記対象における前記ＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である、上記２２に記載の方法。
２７．前記ＩＬ－１０剤の前記投与が、少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌの前記対象における前記ＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である、上記２２に記載の方法。
２８．前記ＩＬ－１０剤の前記投与が、少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌの前記対象における前記ＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である、上記２２に記載の方法。
２９．前記ＩＬ－１０剤が、ｈＩＬ－１０に由来するＩＬ－１０バリアントである、上記２２～２８のいずれかに記載の方法。
３０．前記ＣＡＲの抗原認識ドメインが、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、テロメラーゼ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、Ｔ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＦＡＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、５Ｔ４、ＷＴ１、ＫＧ２Ｄリガンド、葉酸受容体（ＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体Ａ、またはＷｎｔ１抗原に特異的に結合するポリペプチドである、上記２２に記載の方法。
３１．前記ＣＡＲの抗原認識ドメインが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＡ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２－ｎｅｕ ｓｃＦｖ、抗ＶＥＧＦ－Ｒ２ ｓｃＦｖ、抗Ｔ１ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ、抗メソテリンｓｃＦｖ、抗ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ ｓｃＦｖ、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦｖ、抗ＦＡＰ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ、抗ＧＤ－２ ｓｃＦｖ、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ、抗ＭＡＧＥ ｓｃＦｖ、抗Ａ３ ｓｃＦｖ、抗５Ｔ４ ｓｃＦｖ、抗ＷＴ１ ｓｃＦｖ、または抗Ｗｎｔ１ ｓｃＦｖからなる群から選択される、上記２２に記載の方法。
３２．前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７ ＣＤ２７８、ＣＤ１３４、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、ＣＤ２、ＣＤ５、またはＣＤ２８の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、上記２２に記載の方法。
３３．前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、およびＣＤ４０の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含む、上記２２に記載の方法。
３４．前記方法が、前記対象への１つ以上の補助剤の投与をさらに含む、上記２２～３３のいずれかに記載の方法。
３５．前記１つ以上の補助剤が、化学療法剤、免疫チェックポイント調節剤、ＩＬ－２剤、ＩＬ－７剤、ＩＬ－１２剤、ＩＬ－１５剤、およびＩＬ－１８剤からなる群から選択される、上記３４に記載の方法。
３６．前記１つ以上の補助剤が、１つ以上の化学療法剤である、上記３４に記載の方法。
３７．前記１つ以上の補助剤が、ＰＤ１調節剤、ＰＤＬ１調節剤、ＣＴＬＡ４調節剤、ＬＡＧ－３調節剤、ＴＩＭ－３調節剤、ＩＣＯＳ調節剤、ＯＸ４０調節剤、ｃｄ－２７調節剤、ＣＤ－１３７調節剤、ＨＶＥＭ調節剤、ＣＤ２８調節剤、ＣＤ２２６調節剤、ＧＩＴＲ調節剤、ＢＴＬＡ調節剤、Ａ２Ａ調節剤、ＩＤＯ調節剤、およびＶＩＳＴＡ調節剤からなる群から選択される１つ以上の免疫チェックポイント調節剤である、上記３４に記載の方法。
３８．前記免疫チェックポイント調節剤が、抗体である、上記３７に記載の方法。
３９．対象における標的細胞集団に対するＴ細胞媒介性免疫応答を調節する方法であって、前記対象に、
ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記キメラ抗原受容体が、前記標的細胞集団に結合することができる少なくとも１つの抗原特異的標的領域を含む、キメラ抗原受容体と、
ｂ）ＩＬ－１０剤と、を発現するように遺伝子改変された治療上有効な複数の細胞を導入し、
それにより、前記Ｔ細胞媒介性免疫応答を調節することを含む、方法。
４０．遺伝子改変された細胞による前記ＩＬ－１０剤の前記発現が、少なくとも０．０１ｎｇ／ｍｌの前記標的細胞微小環境における局所的ＩＬ－１０剤濃度を提供する、上記３９に記載の方法。
４１．前記ＣＡＲの抗原認識ドメインが、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、テロメラーゼ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、Ｔ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＦＡＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、５Ｔ４、ＷＴ１、ＫＧ２Ｄリガンド、葉酸受容体（ＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体Ａ、またはＷｎｔ１抗原に特異的に結合するポリペプチドである、上記３９に記載の方法。
４２．前記ＣＡＲの抗原認識ドメインが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＡ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２－ｎｅｕ ｓｃＦｖ、抗ＶＥＧＦ－Ｒ２ ｓｃＦｖ、抗Ｔ１ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ、抗メソテリンｓｃＦｖ、抗ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ ｓｃＦｖ、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦｖ、抗ＦＡＰ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ、抗ＧＤ－２ ｓｃＦｖ、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ、抗ＭＡＧＥ ｓｃＦｖ、抗Ａ３ ｓｃＦｖ、抗５Ｔ４ ｓｃＦｖ、抗ＷＴ１ ｓｃＦｖ、または抗Ｗｎｔ１ ｓｃＦｖからなる群から選択される、上記３９に記載の方法。
４３．前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７ ＣＤ２７８、ＣＤ１３４、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、ＣＤ２、ＣＤ５、またはＣＤ２８の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、上記３９に記載の方法。
４４．前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、およびＣＤ４０の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含む、上記３９に記載の方法。
４５．前記方法が、前記対象への１つ以上の補助剤の前記投与をさらに含む、上記３９～４４のいずれかに記載の方法。
４６．前記１つ以上の補助剤が、化学療法剤、免疫チェックポイント調節剤、ＩＬ－２剤、ＩＬ－７剤、ＩＬ－１２剤、ＩＬ－１５剤、およびＩＬ－１８剤からなる群から選択される、上記４５に記載の方法。
４７．前記１つ以上の補助剤が、１つ以上の化学療法剤である、上記４５に記載の方法。
４８．前記１つ以上の補助剤が、ＰＤ１調節剤、ＰＤＬ１調節剤、ＣＴＬＡ４調節剤、ＬＡＧ－３調節剤、ＴＩＭ－３調節剤、ＩＣＯＳ調節剤、ＯＸ４０調節剤、ｃｄ－２７調節剤、ＣＤ－１３７調節剤、ＨＶＥＭ調節剤、ＣＤ２８調節剤、ＣＤ２２６調節剤、ＧＩＴＲ調節剤、ＢＴＬＡ調節剤、Ａ２Ａ調節剤、ＩＤＯ調節剤、およびＶＩＳＴＡ調節剤からなる群から選択される１つ以上の免疫チェックポイント調節剤である、上記４５に記載の方法。
４９．前記免疫チェックポイント調節剤が、抗体である、上記４８に記載の方法。
５０．前記ＩＬ－１０剤が、ｈＩＬ－１０に由来するＩＬ－１０バリアントである、上記３９～４９のいずれかに記載の方法。
５１．対象における標的細胞集団に対するＴ細胞媒介性免疫応答を調節する方法であって、前記対象に、
ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変された治療上有効な第１の複数の細胞であって、前記キメラ抗原受容体が、前記標的細胞集団に結合することができる少なくとも１つの抗原特異的標的領域を含む、治療上有効な第１の複数の細胞と、
ｂ）ＩＬ－１０剤を発現するように遺伝子改変された治療上有効な第２の複数の細胞と、を導入することを含む、方法。
５２．前記第２の複数の細胞による前記ＩＬ－１０剤の前記発現が、少なくとも１時間の期間にわたって、少なくとも０．０１ｎｇ／ｍｌの前記標的細胞微小環境における局所的ＩＬ－１０剤濃度を提供する、上記３９に記載の方法。
５３．前記ＣＡＲの抗原認識ドメインが、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、テロメラーゼ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、Ｔ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＦＡＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、５Ｔ４、ＷＴ１、ＫＧ２Ｄリガンド、葉酸受容体（ＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体Ａ、またはＷｎｔ１抗原に特異的に結合するポリペプチドである、上記５１に記載の方法。
５４．前記ＣＡＲの抗原認識ドメインが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＡ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２－ｎｅｕ ｓｃＦｖ、抗ＶＥＧＦ－Ｒ２ ｓｃＦｖ、抗Ｔ１ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ、抗メソテリンｓｃＦｖ、抗ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ ｓｃＦｖ、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦｖ、抗ＦＡＰ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ、抗ＧＤ－２ ｓｃＦｖ、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ、抗ＭＡＧＥ ｓｃＦｖ、抗Ａ３ ｓｃＦｖ、抗５Ｔ４ ｓｃＦｖ、抗ＷＴ１ ｓｃＦｖ、または抗Ｗｎｔ１ ｓｃＦｖからなる群から選択される、上記５１に記載の方法。
５５．前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７ ＣＤ２７８、ＣＤ１３４、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、ＣＤ２、ＣＤ５、またはＣＤ２８の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、上記５１に記載の方法。
５６．前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、およびＣＤ４０の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含む、上記５１に記載の方法。
５７．前記方法が、前記対象への１つ以上の補助剤の前記投与をさらに含む、上記５１～５６のいずれかに記載の方法。
５８．前記１つ以上の補助剤が、化学療法剤、免疫チェックポイント調節剤、ＩＬ－２剤、ＩＬ－７剤、ＩＬ－１２剤、ＩＬ－１５剤、およびＩＬ－１８剤からなる群から選択される、上記５７に記載の方法。
５９．前記１つ以上の補助剤が、１つ以上の化学療法剤である、上記５７に記載の方法。
６０．前記１つ以上の補助剤が、ＰＤ１調節剤、ＰＤＬ１調節剤、ＣＴＬＡ４調節剤、ＬＡＧ－３調節剤、ＴＩＭ－３調節剤、ＩＣＯＳ調節剤、ＯＸ４０調節剤、ｃｄ－２７調節剤、ＣＤ－１３７調節剤、ＨＶＥＭ調節剤、ＣＤ２８調節剤、ＣＤ２２６調節剤、ＧＩＴＲ調節剤、ＢＴＬＡ調節剤、Ａ２Ａ調節剤、ＩＤＯ調節剤、およびＶＩＳＴＡ調節剤からなる群から選択される１つ以上の免疫チェックポイント調節剤である、上記５７に記載の方法。
６１．前記免疫チェックポイント調節剤が、抗体である、上記６０に記載の方法。
６２．前記ＩＬ－１０剤が、ｈＩＬ－１０に由来するＩＬ－１０バリアントである、上記５１～６１のいずれかに記載の方法。
６３．Ｔ細胞を有効量のＩＬ－１０剤と接触させることによってＣＡＲ－Ｔ細胞中のアポトーシスを阻害する、方法。
６４．前記方法が、エクスビボで実施され、ＩＬ－１０剤の量が、約０．００５ｎｇ／ｍｌを超える前記ＩＬ－１０剤の濃度を有する緩衝液中に提供される、上記６３に記載の方法。
６５．前記方法が、対象においてインビボで実施され、前記対象に投与されるＩＬ－１０剤の量が、少なくとも２４時間の期間にわたって、前記対象における少なくとも０．０１ｎｇ／ｍｌの前記ＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である、上記６３に記載の方法。
６６．前記対象における前記ＩＬ－１０剤の前記血清中トラフ濃度が、少なくとも２４時間の期間にわたって、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌである、上記６５に記載の方法。
６７．ＩＬ－１０剤、ＣＡＲ、およびサイトカインをコードする核酸配列を含む、組換えベクターであって、前記核酸配列が、発現制御配列に作動可能に連結されている、組換えベクター。
６８．前記ＣＡＲの抗原認識ドメインが、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、テロメラーゼ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、Ｔ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＦＡＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、５Ｔ４、ＷＴ１、ＫＧ２Ｄリガンド、葉酸受容体（ＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体Ａ、またはＷｎｔ１抗原に特異的に結合するポリペプチドである、上記６７に記載の組換えベクター。
６９．前記ＣＡＲの抗原認識ドメインが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＡ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２－ｎｅｕ ｓｃＦｖ、抗ＶＥＧＦ－Ｒ２ ｓｃＦｖ、抗Ｔ１ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ、抗メソテリンｓｃＦｖ、抗ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ ｓｃＦｖ、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦｖ、抗ＦＡＰ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ、抗ＧＤ－２ ｓｃＦｖ、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ、抗ＭＡＧＥ ｓｃＦｖ、抗Ａ３ ｓｃＦｖ、抗５Ｔ４ ｓｃＦｖ、抗ＷＴ１ ｓｃＦｖ、または抗Ｗｎｔ１ ｓｃＦｖからなる群から選択される、上記６７に記載の組換えベクター。
７０．前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７ ＣＤ２７８、ＣＤ１３４、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、ＣＤ２、ＣＤ５、またはＣＤ２８の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含む、上記６７に記載の組換えベクター。
７１．前記の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、およびＣＤ４０の細胞質伝達ドメインに由来する１つ以上の共刺激ドメインに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドをさらに含む、上記６７に記載の組換えベクター。
７２．前記サイトカインが、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ１８、ならびにそれらのバリアントからなる群から選択される、上記６７に記載の組換えベクター。
７３．前記ベクターが、ウイルスベクターである、上記６７～７１のいずれかに記載のベクター。
７４．前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、上記７３に記載のベクター。
７５．上記６７～７４のいずれかに記載のベクターでトランスフェクトされた、組換え改変されたＴ細胞。
７６．ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＩＬ－１０剤を含む、医薬製剤。
７７．前記ＣＡＲの抗原認識ドメインが、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、テロメラーゼ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、Ｔ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＦＡＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、５Ｔ４、ＷＴ１、ＫＧ２Ｄリガンド、葉酸受容体（ＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体Ａ、またはＷｎｔ１抗原に特異的に結合するポリペプチドである、上記７６に記載の医薬製剤。
７８．前記ＣＡＲの抗原認識ドメインが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＡ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２－ｎｅｕ ｓｃＦｖ、抗ＶＥＧＦ－Ｒ２ ｓｃＦｖ、抗Ｔ１ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ、抗メソテリンｓｃＦｖ、抗ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ ｓｃＦｖ、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦｖ、抗ＦＡＰ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ、抗ＧＤ－２ ｓｃＦｖ、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ、抗ＭＡＧＥ ｓｃＦｖ、抗Ａ３ ｓｃＦｖ、抗５Ｔ４ ｓｃＦｖ、抗ＷＴ１ ｓｃＦｖ、または抗Ｗｎｔ１ ｓｃＦｖからなる群から選択される、上記７６に記載の医薬製剤。
７９．前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７ ＣＤ２７８、ＣＤ１３４、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、ＣＤ２、ＣＤ５、またはＣＤ２８の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含む、上記７６に記載の医薬製剤。
８０．前記の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、およびＣＤ４０の細胞質伝達ドメインに由来する１つ以上の共刺激ドメインに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドをさらに含む、上記７６に記載の医薬製剤。
８１．前記ＩＬ－１０剤が、ヒトＩＬ－１０剤である、上記７６～８０のいずれかに記載の医薬製剤。
８２．前記ＩＬ－１０剤が、ペグ化されている、上記８１に記載の医薬製剤。
８３．前記ＩＬ－１０剤が、ヒトＩＬ－１０剤である、上記８１に記載の医薬製剤。
８４．前記ＩＬ－１０剤が、モノペグ化ＩＬ－１０とジペグ化ＩＬ－１０との混合物である、上記８１に記載の医薬製剤。
８５．前記ＩＬ－１０剤が、ＡＭ－００１０である、上記８１に記載の医薬製剤。

Claims (21)

  1. 腫瘍性疾患に罹患している哺乳動物対象を治療する方法における使用のための、ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む組成物であって、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞が抗腫瘍効果を有し、前記方法が、
    ａ．患者由来のＴ細胞の試料を得ることと、
    ｂ．前記試料中のＴ細胞をベクターで形質導入することであって、前記ベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列が、１つ以上の制御要素と作動可能に会合して、Ｔ細胞内のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする前記核酸配列の転写および翻訳をもたらして、前記ＣＡＲを発現するＴ細胞の集団を生成する、形質導入することと、
    ｃ．前記ＣＡＲを発現する前記Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を単離することと、
    ｄ．ＩＬ－１０剤の存在下で前記ＣＡＲ－Ｔ細胞をエクスビボで培養することと、
    ｅ．前記哺乳動物対象に、ステップ（ｄ）から前記ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与することと、を含む、組成物。
  2. 前記方法が、ｆ．前記対象に、治療上有効な量のＩＬ－１０剤を含む医薬製剤を投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  3. ステップ（ｄ）の前記ＩＬ－１０剤およびステップ（ｆ）の前記医薬製剤の前記ＩＬ－１０剤が、同じＩＬ－１０剤である、請求項２に記載の組成物。
  4. ステップ（ｄ）の前記ＩＬ－１０剤およびステップ（ｆ）の前記医薬製剤の前記ＩＬ－１０剤が異なる、請求項２に記載の組成物。
  5. ステップ（ｄ）の第１のＩＬ－１０剤が、ｒｈＩＬ－１０であり、ステップ（ｆ）のＩＬ－１０剤の前記医薬製剤が、ペグ化ＩＬ－１０剤を含む、請求項４に記載の組成物。
  6. ＩＬ－１０剤を含む前記医薬製剤が、モノペグ化ＩＬ－１０剤を含む、請求項５に記載の組成物。
  7. ＩＬ－１０剤を含む前記医薬製剤が、モノペグ化ＩＬ－１０剤とジペグ化ＩＬ－１０剤との混合物を含む、請求項５に記載の組成物。
  8. 前記ＩＬ－１０剤を含む医薬製剤の前記投与が、少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．０１ｎｇ／ｍｌの前記対象における前記ＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である、請求項２に記載の組成物。
  9. 前記ＩＬ－１０剤を含む医薬製剤の前記投与が、少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．０５ｎｇ／ｍｌの前記対象における前記ＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である、請求項２に記載の組成物。
  10. 前記ＩＬ－１０剤を含む医薬製剤の前記投与が、少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌの前記対象における前記ＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である、請求項２に記載の組成物。
  11. 前記ＩＬ－１０剤を含む医薬製剤の前記投与が、少なくとも７２時間の期間にわたって、少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌの前記対象における前記ＩＬ－１０剤の血清中トラフ濃度を維持するのに十分である、請求項２に記載の組成物。
  12. 前記ＩＬ－１０剤が、ｈＩＬ－１０に由来するＩＬ－１０バリアントである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記ＣＡＲの抗原認識ドメインが、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、テロメラーゼ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、Ｔ１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＦＡＰ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、５Ｔ４、ＷＴ１、ＫＧ２Ｄリガンド、葉酸受容体（ＦＲａ）、血小板由来増殖因子受容体Ａ、またはＷｎｔ１抗原に特異的に結合するポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記ＣＡＲの抗原認識ドメインが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＡ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、抗ＣＥＡ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖ、抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ、抗ＨＥＲ２－ｎｅｕ ｓｃＦｖ、抗ＶＥＧＦ－Ｒ２ ｓｃＦｖ、抗Ｔ１ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ２２ ｓｃＦｖ、抗ＲＯＲ１ ｓｃＦｖ、抗メソテリンｓｃＦｖ、抗ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ ｓｃＦｖ、抗ｃ－Ｍｅｔ ｓｃＦｖ、抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖ、抗糖脂質Ｆ７７ ｓｃＦｖ、抗ＦＡＰ ｓｃＦｖ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｓｃＦｖ、抗ＧＤ－２ ｓｃＦｖ、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ｓｃＦｖ、抗ＭＡＧＥ ｓｃＦｖ、抗Ａ３ ｓｃＦｖ、抗５Ｔ４ ｓｃＦｖ、抗ＷＴ１ ｓｃＦｖ、および抗Ｗｎｔ１ ｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  15. 前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７ ＣＤ２７８、ＣＤ１３４、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ、ＣＤ２、ＣＤ５、またはＣＤ２８の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
  16. 前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、またはＣＤ４０の細胞質ドメインに由来するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  17. 前記方法が、前記対象への１つ以上の補助剤の投与をさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記１つ以上の補助剤が、化学療法剤、免疫チェックポイント調節剤、ＩＬ－２剤、ＩＬ－７剤、ＩＬ－１２剤、ＩＬ－１５剤、およびＩＬ－１８剤からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記１つ以上の補助剤が、１つ以上の化学療法剤である、請求項１７に記載の組成物。
  20. 前記１つ以上の補助剤が、ＰＤ１調節剤、ＰＤＬ１調節剤、ＣＴＬＡ４調節剤、ＬＡＧ－３調節剤、ＴＩＭ－３調節剤、ＩＣＯＳ調節剤、ＯＸ４０調節剤、ｃｄ－２７調節剤、ＣＤ－１３７調節剤、ＨＶＥＭ調節剤、ＣＤ２８調節剤、ＣＤ２２６調節剤、ＧＩＴＲ調節剤、ＢＴＬＡ調節剤、Ａ２Ａ調節剤、ＩＤＯ調節剤、およびＶＩＳＴＡ調節剤からなる群から選択される１つ以上の免疫チェックポイント調節剤である、請求項１７に記載の組成物。
  21. 前記免疫チェックポイント調節剤が、抗体である、請求項２０に記載の組成物。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA201890171A1 (ru) 2015-06-30 2018-08-31 Сэнфорд-Бернхем Медикал Рисерч Инститьют Слитые белки btla агонисты и их применение
EP4100426A1 (en) * 2020-02-06 2022-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Il-10 and uses thereof
IL313935A (en) * 2021-12-30 2024-08-01 Tr1X Inc CD4+ T cells expressing IL-10 chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2025148750A1 (zh) * 2024-01-08 2025-07-17 上药生物治疗（香港）有限公司 膜表达il-10及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010504977A (ja) 2006-09-28 2010-02-18 シェーリング コーポレイション 癌を処置するためのペグ化ｉｌ−１０の使用
WO2016191587A1 (en) 2015-05-28 2016-12-01 Armo Biosciences, Inc. Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer
WO2017123557A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-10 in production of antigen-specific cd8+ t cells and methods of use of same

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4593002A (en) 1982-01-11 1986-06-03 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Viruses with recombinant surface proteins
CA1202840A (en) 1985-06-10 1986-04-08 Jonathan R. Kleinsasser Combination wet and dry feeder for animals
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5231012A (en) 1989-06-28 1993-07-27 Schering Corporation Nucleic acids encoding cytokine synthesis inhibitory factor (interleukin-10)
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US6916605B1 (en) 1990-07-10 2005-07-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
JPH06509578A (ja) 1991-07-26 1994-10-27 ユニバーシティ・オブ・ロチェスター 悪性細胞利用による癌治療法
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
US5334761A (en) 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5578475A (en) 1993-07-12 1996-11-26 Life Technologies, Inc. Composition and methods for transfecting eukaryotic cells
US5631236A (en) 1993-08-26 1997-05-20 Baylor College Of Medicine Gene therapy for solid tumors, using a DNA sequence encoding HSV-Tk or VZV-Tk
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
GB9510272D0 (en) 1995-05-22 1995-07-19 Isis Innovation Retroviral vectors
US6828422B1 (en) 1995-08-18 2004-12-07 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
US6924123B2 (en) 1996-10-29 2005-08-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Lentiviral LTR-deleted vector
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
NZ517202A (en) 1999-08-24 2004-05-28 Medarex Inc Human CTLA-4 antibodies and their uses
US20030186386A1 (en) 2000-02-11 2003-10-02 Hansen Christian Karsten Interleukin 10
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
AU4328801A (en) 2000-02-24 2001-09-03 Xcyte Therapies Inc Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
WO2002026265A2 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Schering Corporation Pegylated interleukin-10
CN1753912B (zh) 2002-12-23 2011-11-02 惠氏公司 抗pd-1抗体及其用途
UY29460A1 (es) 2005-04-08 2006-11-30 Noxxon Pharma Ag Acidos nucleicos de union a ghrelin
ES2720160T3 (es) 2005-05-09 2019-07-18 Ono Pharmaceutical Co Anticuerpos monoclonales humanos contra muerte programada 1(PD-1) y métodos para tratar el cáncer usando anticuerpos dirigidos contra PD-1 solos o junto con otras sustancias inmunoterapéuticas
EA019344B1 (ru) 2005-07-01 2014-03-31 МЕДАРЕКС, Эл.Эл.Си. Человеческие моноклональные антитела против лиганда-1 запрограммированной гибели клеток (pd-l1) и их применения
US20080017377A1 (en) 2006-07-19 2008-01-24 Cowan Kenneth M Well fluid formulation and method
WO2008089491A2 (en) 2007-01-19 2008-07-24 Kai Pharmaceuticals, Inc. Modifications of peptide compositions to increase stability and delivery efficiency
EP2262837A4 (en) 2008-03-12 2011-04-06 Merck Sharp & Dohme PD-1 BINDING PROTEINS
HUE065752T2 (hu) 2008-12-09 2024-06-28 Hoffmann La Roche Anti-PD-L1 antitestek és felhasználásuk T-sejt funkció elõsegítésére
JP5888980B2 (ja) 2008-12-17 2016-03-22 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． モノ−およびジ−ｐｅｇｉｌ１０の製造および用途
US20130022629A1 (en) 2010-01-04 2013-01-24 Sharpe Arlene H Modulators of Immunoinhibitory Receptor PD-1, and Methods of Use Thereof
ES2682078T3 (es) 2010-06-11 2018-09-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anticuerpo anti-TIM-3
WO2011159877A2 (en) 2010-06-18 2011-12-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
US8907053B2 (en) 2010-06-25 2014-12-09 Aurigene Discovery Technologies Limited Immunosuppression modulating compounds
US9845362B2 (en) * 2010-10-08 2017-12-19 The University Of North Carolina At Charlotte Compositions comprising chimeric antigen receptors, T cells comprising the same, and methods of using the same
WO2013006490A2 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to tim3
EP2814846B1 (en) 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
CN104245722A (zh) 2012-02-29 2014-12-24 Ambrx公司 白细胞介素-10多肽结合物和其用途
CN104245726A (zh) 2012-03-29 2014-12-24 奥瑞基尼探索技术有限公司 来自人pd1的bc环的免疫调节环状化合物
US20160068583A1 (en) 2013-04-24 2016-03-10 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-10 Compositions and Uses Thereof
EA029901B1 (ru) 2013-09-04 2018-05-31 Бристол-Майерс Сквибб Компани Соединения для применения в качестве иммуномодуляторов
MX2016005915A (es) * 2013-11-11 2016-12-16 Armo Biosciences Inc Metodos de uso de interleucina-10 para tratar enfermedades y trastornos.
DK3099717T3 (da) 2014-01-31 2019-07-01 Novartis Ag Antistofmolekyler med tim-3 og anvendelser deraf
US9850225B2 (en) 2014-04-14 2017-12-26 Bristol-Myers Squibb Company Compounds useful as immunomodulators
US20150315566A1 (en) 2014-04-30 2015-11-05 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Method for generating high affinity, bivalent binding agents
PL3215532T3 (pl) 2014-11-06 2020-03-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Przeciwciała anty-TIM3 i sposoby ich zastosowania
WO2016142886A2 (en) 2015-03-10 2016-09-15 Aurigene Discovery Technologies Limited 3-substituted-1,2,4-oxadiazole and thiadiazole compounds as immunomodulators
MX384444B (es) 2015-03-10 2025-03-14 Aurigene Discovery Tech Ltd Compuestos de 1,2,4-oxadiazol y tiadiazol como inmunomoduladores
JP2019503348A (ja) 2015-12-21 2019-02-07 アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド インターロイキン−１５組成物及びその使用
CN105949325B (zh) * 2016-07-08 2019-07-16 重庆精准生物技术有限公司 包含cd27胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010504977A (ja) 2006-09-28 2010-02-18 シェーリング コーポレイション 癌を処置するためのペグ化ｉｌ−１０の使用
WO2016191587A1 (en) 2015-05-28 2016-12-01 Armo Biosciences, Inc. Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer
WO2017123557A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-10 in production of antigen-specific cd8+ t cells and methods of use of same

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioessays, 2013, Vol.35, pp.623-631
Cancer Immunology, Research, 2014, Vol.2, No.3, pp.194-199
Receptors Clin. Investig., 2015, 2(4)

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