ES2682078T3 - Anticuerpo anti-TIM-3 - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal que se une a una región extracelular de una TIM-3 humana, en el que el anticuerpo presenta una actividad de ADCC y es un anticuerpo monoclonal que comprende VH de un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 20 a 140 de SEC ID nº 8 y comprende VL de un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 21 a 127 de SEC ID nº 10.

Description

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El anticuerpo monoclonal comprende una cadena pesada (en adelante denominada "cadena H") de un anticuerpo que comprende las regiones determinantes de complementariedad (en adelante denominadas "RDC") 1 a 3 que comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID nº 1 a nº 3, respectivamente, y comprende una cadena ligera (en adelante denominada "cadena L") de un anticuerpo que comprende las RDC 1 a 3 que comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID nº 4 a nº 6, respectivamente.

El anticuerpo monoclonal incluye un monoclonal que comprende la VH de un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 20 a 140 de la SEC ID nº 8 y comprende la VL de un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 21 a 127 de la SEC ID nº 10.

El anticuerpo monoclonal de la presente invención incluye un anticuerpo producido por un hibridoma y un anticuerpo recombinante producido por un transformante transformado con un vector de expresión que contiene un gen codificante del anticuerpo.

El anticuerpo monoclonal es un anticuerpo secretado por un único clon de células productoras de anticuerpos y reconoce únicamente un epítopo (también denominado determinante antigénico) y presenta una secuencia de aminoácidos uniforme (estructura primaria).

Entre los ejemplos del epítopo se incluyen una única secuencia de aminoácidos, una estructura tridimensional que comprende la secuencia de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos unida mediante cadena sacárida, una estructura tridimensional que comprende una secuencia de aminoácidos unida mediante cadena sacárida y similares, que reconoce y a la que se une un anticuerpo monoclonal.

El anticuerpo monoclonal de la presente invención se une preferentemente a la secuencia de aminoácidos en las posiciones 22 a 131 del dominio IgV de la TIM-3 humana en las regiones extracelulares de la TIM-3 humana representada por la SEC ID nº 53. Específicamente, la secuencia de aminoácidos a la que se une el anticuerpo monoclonal de la presente invención preferentemente es la secuencia de aminoácidos entre las posiciones 67 y 105, más preferentemente la secuencia de aminoácidos entre las posiciones 67 y 96, y todavía más preferentemente la secuencia de aminoácidos entre las posiciones 67 y 87 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 53.

El epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal de la presente invención preferentemente puede incluirse en el dominio IgV de la TIM-3 humana representada por la secuencia de aminoácidos entre las posiciones 22 y 131 de la región extracelular de la TIM-3 humana representada por la SEC ID nº 53. Específicamente, el epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal de la presente invención preferentemente se encuentra incluido en la secuencia de aminoácidos entre las posiciones 67 y 105, más preferentemente se encuentra incluido en la secuencia de aminoácidos entre las posiciones 67 y 96 y todavía más preferentemente se encuentra incluido en la secuencia de aminoácidos entre las posiciones 67 y 87 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 53.

La secuencia de aminoácidos del epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal de la presente invención preferentemente puede incluir por lo menos un aminoácido seleccionado de entre la secuencia de aminoácidos entre las posiciones 67 y 87 de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 53 en el dominio IgV de la TIM-3 humana, y más preferentemente incluye por lo menos un aminoácido seleccionado de entre los aminoácidos en las posiciones 67, 74, 76, 78, 79, 81, 83 y 85.

La secuencia de aminoácidos del epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal dela presente invención preferentemente puede incluir por lo menos dos o más aminoácidos continuos seleccionados entre las posiciones 67 y 87 del dominio IgV de la TIM-3 humana y más preferentemente puede incluir por lo menos un aminoácido seleccionado de entre los aminoácidos en las posiciones 67, 74, 76, 78, 79, 81, 83 y 85 e incluye por lo menos dos o más aminoácidos continuos seleccionados de la secuencia de aminoácidos entre las posiciones 67 y 87 en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 53.

Específicamente, entre los ejemplos de la secuencia de aminoácidos del epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal de la presente invención se incluye la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos entre las posiciones 67 y 74, la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos entre las posiciones 67 y 76, la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos entre las posiciones 67 y 78, la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos entre las posiciones 67 y 79, la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos entre las posiciones 67 y 81, la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos entre las posiciones 67 y 83, la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos entre las posiciones 67 y 85,

la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos entre las posiciones 74 y 76, la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos entre las posiciones 74 y 78, la secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos entre las posiciones 74 y 79, la secuencia de aminoácidos que comprende los

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El anticuerpo terapéutico incluye un anticuerpo contra un antígeno en el que se induce apoptosis mediante la unión del anticuerpo, un anticuerpo contra un antígeno que participa en la formación del estado patológico de tumor, un anticuerpo contra un antígeno que regula la función inmunológica y un anticuerpo contra un antígeno relacionado con la angiogénesis en la parte patológica.

El antígeno en que se induce apoptosis mediante la unión del anticuerpo incluye un grupo de diferenciación (en adelante "CD") 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80 (B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86 (B7.2), antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II, receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y similares.

Entre los antígenos que participan en la formación del estado patológico del tumor o los antígenos que regulan la función inmunológica se incluyen CD40, ligando de CD40, la molécula de la familia B7 (CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3, B7-H4), la molécula ligando de la familia B7 (CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1, BTLA), OX-40, ligando de OX-40, CD137, moléculas de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (DR4, DR5, TNFR1, TNFR2), moléculas de la familia del receptor de ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL), moléculas de la familia de receptores de TRAIL (TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4), receptor activador del factor nuclear kappa B (RANK), ligando de RANK, CD25, receptor 4 del ácido fólico, citocina [IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, factor de crecimiento transformante (TGF) β, TNFα, etc.], receptores de dichas citocinas, quimocinas (SLC, ELC, 1-309, TARC, MDC, CTACK, etc.) y receptores de dichas quimocinas.

Entre los antígenos del anticuerpo que inhibe la angiogénesis en la parte patológica se incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la angiopoyetina, el factor de crecimiento fibroblástico (FGF), EGF, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), la eritropoyetina (EPO), TGFβ, IL-8, efilina, SDF-1, receptores de los mismos y similares.

Puede producirse un anticuerpo de fusión con una proteína o anticuerpo terapéutico mediante la unión de un ADNc codificante de un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo a un ADNc codificante de la proteína, construyendo un ADN codificante del anticuerpo de fusión, insertando el ADN en un vector de expresión para procariotas o eucariotas y después introduciendo el vector de expresión en un procariota o eucariota para expresar el anticuerpo de fusión.

En el caso en que el conjugado de anticuerpo anteriormente indicado se utilice como método de detección, método para la determinación cuantitativa, reactivo de detección, reactivo para la determinación cuantitativa o agente diagnóstico en la presente invención, entre los ejemplos del agente al que el anticuerpo monoclonal de la presente invención que reconoce específicamente la TIM-3 humana y se une a una secuencia de aminoácidos de la región extracelular o estructura tridimensional de la misma, se incluye un marcaje utilizado en el método rutinario de detección o medición inmunológica.

El marcaje incluye enzimas, tales como la fosfatasa alcalina, la peroxidasa y la luciferasa; materiales luminiscentes, tales como el éster de acridinio y la lofina, materiales fluorescentes, tales como el isotiocianato de fluoresceína (FITC) y el isotiocianato de tetrametilrodamina (RITC) y similares.

Además, la presente invención incluye un agente para el tratamiento de una enfermedad relacionada con una célula positiva para TIM-3, que comprende el anticuerpo monoclonal de la presente invención como principio activo.

La enfermedad relacionada con la célula positiva para TIM-3 es cáncer.

El cáncer incluye cáncer hematológico, cáncer de mama, cáncer uterino, cáncer colorrectal, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer rectal, cáncer de tiroides, cáncer del cuello uterino, cáncer del intestino delgado, cáncer de próstata y cáncer pancreático, Entre los ejemplos preferentes de cáncer se incluyen cáncer hematológico, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepático y cáncer de próstata.

Entre los ejemplos de cáncer hematológico se incluyen la leucemia mieloide aguda (LMA), la leucemia mieloide crónica (LMC), los síndromes mielodisplásicos (SMD), el mieloma múltiple, el linfoma de células T cutáneo (LCTC), el linfoma de células T periférico (LCTP), el linfoma de células grandes anaplásico (LCGA), el leucemia linfocítico agudo (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), otras leucemias linfoides, el linfoma de células NK, el linfoma de Hodgkin, el linfoma no de Hodgkin, tal como el linfoma de Burkitt y similares.

El agente terapéutico puede comprender el anticuerpo monoclonal anteriormente indicado de la presente invención como principio activo.

El agente terapéutico que comprende el anticuerpo monoclonal de la presente invención o conjugado del mismo puede comprender sólo el anticuerpo o conjugado del mismo como principio activo. Resulta generalmente

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método para la introducción de ADN en la célula hospedadora, y entre los ejemplos se incluye un método que utiliza un ion calcio, descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, 1972; Gene 17:107, 1982, y en Molecular & General Genetics 168:111, 1979, y similares.

En el caso de que se utilice una célula animal como la célula hospedadora, puede utilizarse cualquier vector de expresión, con la condición de que pueda funcionar en la célula animal. Entre los ejemplos se incluyen pcDNAI, pcDM8 (preparado por Funakoshi), pAGE107 [solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 22979/91; Cytotechnology 3:133, 1990], pAS3-3 (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 227075/90), pCDM8 [Nature 329:840, 1987], pcDNAI/Amp (preparado por Invitrogen), pcDNA3.1 (preparado por Invitrogen), pREP4 (preparado por Invitrogen), pAGE103 [J. Biochemistry 101:1307, 1987], pAGE210, pME18SFL3, pKANTEX93 (documento nº 97/10354) y similares.

Puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en una célula animal. Entre los ejemplos se incluye un promotor de un gen temprano inmediato (IE) de citomegalovirus (CMV), un promotor temprano del SV40, un promotor de retrovirus, un promotor metalotioneína, un promotor de choque térmico, un promotor SRα, un promotor o intensificador del virus de la leucemia murina de Moloney y similares. Además, el intensificador del gen IE del CMV humano puede utilizarse junto con el promotor.

La célula hospedadora incluye la célula de leucemia de Namalwa humana, la célula COS de ratón, la célula de ovario de hámster chino (CHO) [Journal of Experimental Medicine 108:945, 1958; Genetics 55:513, 1968; Chromosoma 41:129, 1973; Methods in Cell Science 18:115, 1996; Radiation Research 148:260, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60:1275, 1968; Cell 6:121, 1975; Molecular Cell Genetics, apéndices I y II (páginas 883 a 900)], CHO/DG44, CHO-K1 (ATCC nº de acceso CCL-61), DUkXB11 (ATCC nº de acceso CCL-9096), Pro-5 (ATCC nº de acceso CCL-1781), CHO-S (Life Technologies, nº de cat. 11619), Pro-3, célula de mieloma de rata YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (también denominada YB2/0), célula de mieloma de ratón NS0, célula de mieloma de ratón SP2/0-Ag14, célula de hámster sirio BHK o HBT5637 (solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 299/88) y similares.

Puede utilizarse cualquier método de introducción del vector recombinante, con la condición de que sea un método de introducción de ADN en una célula animal, y entre los ejemplos se incluye la electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990], el método de fosfato de calcio (solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 227075/90), el método de lipofección [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987] y similares.

Puede producirse la TIM-3 mediante el cultivo del transformante derivado de un microorganismo, célula animal o similar que presente un vector recombinante que comprenda el ADN codificante de TIM-3 en un medio para la formación y acumulación de TIM-3 en el cultivo y la recuperación a partir del mismo. El método de cultivo del transformante en el medio se lleva a cabo según el método habitual utilizado en el cultivo de huéspedes.

En el caso de que TIM-3 se expresa en una célula derivada de un eucariota, puede obtenerse la TIM-3 a la que pueden unirse azúcares o cadenas de azúcares.

En el caso de que se cultive un microorganismo transformado con un vector recombinante que contiene un promotor inducible, puede añadirse al medio un inductor, en caso necesario. Por ejemplo, puede añadirse isopropil-β-D-tiogalactopiranósido o similar al medio en el caso de que se cultive un microorganismo transformado con un vector recombinante, utilizando el promotor lac, o puede añadirse ácido indolacrílico o similar al mismo durante la transformación de un microorganismo con un vector recombinante, utilizando el promotor trp.

En el caso de que se cultive un transformante obtenido utilizando una célula animal como célula hospedadora, el medio incluye el medio de utilización general RPMI 1640 [The Journal of the American Medical Association 199:519, 1967], el medio MEM de Eagle [Science 122:501, 1952], medio MEM modificado por Dulbecco [Virology 8:396, 1959] y el medio 199 [Proceedings of the Society for the Biological Medicine 73:1, 1950], medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), medio al que se añade suero de feto bovino, etc., y similares. El cultivo se lleva a cabo generalmente a un pH de entre 6 y 8 y a una temperatura de entre 30ºC y 40ºC durante 1 a 7 días en la presencia de 5% de CO2. En caso necesario, puede añadirse un antibiótico al medio durante el cultivo, tal como canamicina o penicilina.

Con respecto al método de expresión del gen codificante de TIM-3, además de la expresión directa, puede llevarse a cabo la producción secretoria, la expresión de proteína de fusión y similares según el método descrito en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

El procedimiento para producir TIM-3 incluye un método de expresión intracelular en una célula hospedadora, un método de secreción extracelular a partir de una célula hospedadora, un método de producción sobre la membrana externa de una célula hospedadora y similares. El método apropiado puede seleccionarse cambiando la célula hospedadora utilizada y la estructura de la TIM-3 producida.

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En el caso de que se produzca TIM-3 en una célula hospedadora o sobre la cubierta exterior de la membrana celular de un huésped, TIM-3 puede ser positivamente secretado extracelularmente según el método de Paulson et al. [J. Biol. Chem. 264:17619, 1989], el método de Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8227, 1989; Genes Develop. 4:1288, 1990], los métodos descritos en la solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 336963/93 y el documento nº WO 94723021 y similares.

Además, puede incrementarse la cantidad producida de TIM-3 de acuerdo con el método descrito en la solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 227075/90 utilizando un sistema de amplificación génica utilizando un gen de dihidrofolato reductasa.

La TIM-3 resultante puede aislarse y purificarse, por ejemplo, de la manera siguiente.

En el caso de que TIM-3 se exprese intracelularmente en un estado disuelto, las células después del cultivo se recuperan mediante centrifugación, se suspenden en un tampón acuoso y después se fragmentan utilizando un ultrasonicador, prensa francesa, homogeneizador de Manton Gaulin, molino Dynomill o similar con el fin de obtener un extracto libre de células.

El extracto libre de células se centrifuga para obtener un sobrenadante y puede obtenerse una preparación purificada sometiendo el sobrenadante a un aislamiento general de proteínas y a técnicas de purificación, tales como la extracción con solvente, la precipitación salina (“salting out”), la precipitación con un solvente orgánico, la cromatografía de intercambio aniónico utilizando una resina tal como dietilaminoetil (DEAE)-sefarosa, DIAION HPA-75 (fabricada por Mitsubishi Chemical), la cromatografía de intercambio catiónico utilizando una resina tal como S-Sepharose FF (fabricada por Pharmacia), la cromatografía hidrofóbica utilizando una resina tal como butil-sefarosa o fenil-sefarosa, la filtración en gel utilizando un tamiz molecular, la cromatografía de afinidad, el cromatoenfoque, la electroforesis, tal como el enfoque isoeléctrico, y similares, que pueden utilizarse por sí solos

o en combinación.

En el caso de que TIM-3 se exprese intracelularmente mediante la formación de un cuerpo de inclusión, se recuperan las células, se fragmentan y se centrifugan de la misma manera, y se recupera el cuerpo de inclusión de TIM-3 en forma de una fracción de precipitación. El cuerpo de inclusión recuperado de la proteína TIM-3 se solubiliza con un agente desnaturalizante de proteínas. La proteína adquiere su estructura tridimensional normal mediante dilución o diálisis de la solución solubilizada y después se obtiene una preparación purificada de polipéptido mediante el mismo método de aislamiento y purificación indicado anteriormente.

En el caso de que TIM-3 o derivado, tal como un producto glucosilado, se secrete extracelularmente, TIM-3 o el derivado, tal como un producto glucosilado, puede recuperarse a partir del sobrenadante de cultivo. Es decir, el cultivo se trata mediante un método, tal como la centrifugación, de la manera indicada anteriormente, con el fin de obtener una fracción soluble, puede obtenerse una preparación purificada de TIM-3 a partir de la fracción soluble mediante el método de aislamiento y purificación indicado anteriormente.

Además, la TIM-3 utilizada en la presente invención puede producirse mediante un método de síntesis química, tal como un método de Fmoc o de tBoc. Además, puede sintetizarse químicamente utilizando un sintetizador de péptidos fabricado por Advanced ChemTech, Perkin-Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu Corporation o similar.

(2) Inmunización de animales y preparación de células productoras de anticuerpos para la fusión

Un ratón, rata o hámster y similar de 3 a 20 semanas de edad se inmuniza con el antígeno preparado en (1), anteriormente, y las células productoras de anticuerpos en el bazo, ganglio linfático o sangre periférica del animal se recolectan. Además, en el caso de que el incremento de un título suficiente en el animal anteriormente indicado no se identifique debido a una baja inmunogenicidad, puede utilizarse un ratón con desactivación de TIM-3 como animal que debe inmunizarse.

La inmunización se lleva a cabo mediante la administración del antígeno en el animal mediante inyección subcutánea, intravenosa o intraperitoneal con un adyuvante apropiado (por ejemplo, adyuvante de Freund completo, una combinación de gel de hidróxido de aluminio con vacuna de pertussis o similar). En el caso de que el antígeno sea un péptido parcial, se produce un conjugado con una proteína portadora, tal como BSA (por sus siglas en inglés, albúmina de suero bovino), KLH (por sus siglas en inglés, hemocianina de lapa americana) o similar, que se utiliza como el antígeno.

La administración del antígeno se lleva a cabo 5 a 10 veces cada semana o cada dos semanas después de la primera administración. El tercer a séptimo día después de cada administración, se extrae una muestra de sangre del fondo del ojo, se somete a ensayo la reactividad del suero con el antígeno, por ejemplo mediante inmunoensayo enzimático [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] o similar. Como fuente de células productoras de anticuerpos para la fusión se utiliza un animal que muestra un título de anticuerpos suficiente en el suero contra el antígeno utilizado para la inmunización.

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Tres a siete días después de la administración final del antígeno, se extrajo el tejido que contenía las células productoras de anticuerpos, tal como el bazo, del animal inmunizado a fin de recolectar las células productoras de anticuerpos. En caso de utilizar células de bazo, el bazo se extirpa y tritura, seguido de centrifugación. A continuación, se obtienen las células productoras de anticuerpos para la fusión mediante la eliminación de los eritrocitos.

(3) Preparación de la célula de mieloma

Como células de mieloma se utilizó una línea celular establecida obtenida del ratón. Entre los ejemplos se incluyen la línea celular de mieloma de ratón (derivado de BALB/c) resistente a 8-azaguanina, P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology 18:1, 1978], P3-NS1/1-Ag41 (NS-1) [European J. Immunology 6:511, 1976], SP2/0-Ag14 (SP-2) [Nature 276:269, 1978], P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunology 123:1548, 1979], P3-X63-Ag8 (X63) [Nature 256:495, 1975] y similares.

Las células de mieloma se subcultivaron en un medio normal [un medio al que se añade glutamina, 2mercaptoetanol, gentamicina, FBS y 8-azaguanina a medio RPMI-1640] 3 o 4 días antes de la fusión celular con el fin de garantizar un número celular de 2x107 o superior el día de la fusión.

(4) Fusión celular y preparación de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales

Las células productoras de anticuerpos para la fusión obtenidas en (2), anteriormente, y las células de mieloma obtenidas en (3), anteriormente, se lavaron suficientemente con un medio esencial mínimo (MEM) o PBS (1,83 g de hidrogenofosfato disódico, 0,21 g de dihidrogenofosfato potásico, 7,65 g de cloruro sódico, 1 litro de agua destilada, pH 7,2) y se mezclaron, proporcionando una proporción de células productoras de anticuerpos:células de mieloma=5 a 10:1, seguido de centrifugación. A continuación, se descartó el sobrenadante.

El grupo celular precipitado se disgregó suficientemente. Tras disgregar las células precipitadas, se añadió a la célula bajo agitación a 37ºC la mezcla de polietilenglicol-1000 (PEG-1000), MEM y dimetilsulfóxido. Además, se añadió 1 a 2 ml de medio MEM varias veces cada uno o dos minutos y se añadió MEM, proporcionando una cantidad total de 50 ml. Tras la centrifugación, se descartó el sobrenadante. Tras disgregar suavemente las células, se suspendieron con cuidado en medio HAT [un medio normal que contiene hipoxantina, timidina y aminopterina]. La suspensión se cultivó en un incubador con 5% de CO2 durante 7 a 14 días a 37ºC.

Tras el cultivo, se muestreó una parte del sobrenadante de cultivo y se seleccionó un hibridoma que era reactivo con un antígeno que contenía TIM-3 y no era reactivo con un antígeno que no contiene TIM-3, mediante el ensayo de unión descrito posteriormente. A continuación, la clonación se llevó a cabo dos veces mediante un método de dilución limitante [En primer lugar, se utilizó medio HT (medio HAT del que se había eliminado la aminopterina) y, en segundo lugar, se utilizó medio normal] y se seleccionó un hibridoma que mostraba establemente un elevado título de anticuerpos, como hibridoma productor de anticuerpos monoclonales.

(5) Preparación de anticuerpos monoclonales purificados

Se administraron las células de hibridoma productoras de anticuerpo monoclonal obtenidas en (4), anteriormente, mediante inyección intraperitoneal en ratones de 8 a 10 semanas desnudos tratados con 0,5 ml de pristano (se administró por vía intraperitoneal 2,6,10,14-tetrametilpentadecano (pristano), seguido de alimentación durante 2 semanas). El hibridoma desarrolló tumor de ascites en 10 a 21 días. Se recolectó el líquido ascítico de los ratones, se centrifugó para eliminar los sólidos, se sometió a precipitación salina con sulfato amónico al 40-50% y después se precipitó con ácido caprílico, pasándolo por una columna de DEAE-sefarosa, una columna de proteína A o una columna de filtración en gel a fin de recolectar una fracción de IgG o IgM en forma de anticuerpo monoclonal purificado.

Además, se cultivó un hibridoma productor de anticuerpos monoclonales obtenido en (4), anteriormente, en medio RPMI1640 que contenía FBS al 10% o similar y se separó el sobrenadante mediante centrifugación. Las células precipitadas se suspendieron en medio de hibridoma-SFM y se cultivó durante 3 a 7 días. El anticuerpo monoclonal purificado puede obtenerse mediante centrifugación de la suspensión celular obtenida, seguido de purificación a partir del sobrenadante resultante utilizando una columna de proteína A o una columna de proteína G para recolectar las fracciones de IgG. Además, el medio de hibridoma-SFM puede contener 5% de DIGO GF21.

La subclase del anticuerpo puede determinarse utilizando un kit de tipado de subclase mediante inmunoensayo enzimático. La cantidad de la proteína puede determinarse mediante el método de Lowry o a partir de la absorbancia a 280 nm.

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ejemplos se incluye CH perteneciente a la subclase γ1, CL perteneciente a la clase κ y similares. Como ADN codificantes de CH y CL de un anticuerpo humano, puede utilizarse de manera general el ADNc y también puede utilizarse un ADN cromosómico que comprenda un exón y un intrón.

Como el vector de expresión para células animales, puede utilizarse cualquier vector de expresión, con la condición de que pueda insertarse en el mismo y expresarse a partir del mismo un gen codificante de la región C de un anticuerpo humano. Entre los ejemplos se incluyen pAGE107 [Cytotechnol. 3:133, 1990], pAGE103 [J. Biochem. 101:1307, 1987], pHSG274 [Gene 27:223, 1984], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527, 1981], pSG1bd2-4 [Cytotechnol. 4:173, 1990], pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol. 13:79, 1993] y similares.

Entre los ejemplos de promotor e intensificador utilizados para un vector de expresión para células animales se incluyen un promotor temprano del SV40 [J. Biochem. 101:1307, 1987], un RTL de virus de la leucemia de Moloney del ratón [Biochem. Biophys. Res. Commun. 149:960, 1987], un promotor de cadena H de inmunoglobulina [Cell 41:479, 1985] y un intensificador [Cell 33:717, 1983] y similares.

El vector de expresión de anticuerpo recombinante puede ser de un tipo en el que se encuentra presente un gen codificante de una cadena H de anticuerpo y un gen codificante de una cadena L de anticuerpo en vectores separados o de un tipo en el que ambos genes se encuentran presentes en el mismo vector (tipo tándem). Con respecto a la facilidad de construcción del vector de expresión de anticuerpo recombinante, la facilidad de introducción en células animales y el equilibrio entre las cantidades de expresión de las cadenas H y L de anticuerpo en las células animales, para la expresión de anticuerpo recombinante resulta más preferente el tipo tándem de vector [J. Immunol. Methods 167:271, 1994]. Entre los ejemplos del tipo tándem de vector de expresión de anticuerpos recombinantes se incluye pKANTEX93 (documento nº WO 97/10354), pEE18 [Hybridoma 17:559, 1998] y similares.

(2) Obtención de ADNc codificante de región V de anticuerpo derivada de animal no humano y análisis de la secuencia de aminoácidos

La obtención de los ADNc codificantes de VH y VL de un anticuerpo no humano y el análisis de la secuencia de aminoácidos se llevan a cabo de la manera siguiente.

Se extrajo el ARNm de las células de hibridoma productoras de un anticuerpo no humano a fin de sintetizar el ADNc. El ADNc sintetizado se clonó en un vector, tal como un fago o un plásmido, con el fin de preparar una biblioteca de ADNc.

Se aisló un fago recombinante o un plásmido recombinante que contenía ADNc codificante de VH o VL a partir de la biblioteca utilizando ADN codificante de una parte de la región C o región V de un anticuerpo de ratón a modo de sonda. Se determinó la longitud completa de las secuencias de nucleótidos de VH y VL de un anticuerpo de ratón de interés en el fago recombinante o plásmido recombinante y se dedujo la longitud completa de las secuencias de aminoácidos de VH y VL a partir de las secuencias de nucleótidos respectivas.

Entre los ejemplos de animal no humano para la preparación de una célula de hibridoma que produce un anticuerpo no humano se incluyen el ratón, la rata, el hámster, el conejo o similares. Puede utilizarse cualquier animal con la condición de que pueda producirse una célula de hibridoma a partir del mismo.

Entre los ejemplos de método para la preparación de ARN total a partir de una célula de hibridoma se incluye un método de tiocianato de guanidina-trifluoroacetato de cesio [Methods in Enzymol. 154:3, 1987], la utilización de un kit, tal como el kit RNeasy (fabricado por Qiagen) y similares.

Entre los ejemplos del método de preparación de ARNm a partir del ARN total se incluyen un método de columna de celulosa con oligo (dT) inmovilizado [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], un método que utiliza un kit, tal como el kit de purificación de ARNm Oligo-dT30 <Super> (fabricado por Takara Bio) y similares. Además, entre los ejemplos del método de preparación de ARNm se incluye un método que utiliza el kit de aislamiento de ARNm Fast Track (fabricado por Invitrogen) o el kit de purificación de ARNm QuickPrep (fabricado por Pharmacia) y similares.

Entre los ejemplos de método de síntesis de ADNc y de preparación de una biblioteca de ADNc se incluyen métodos conocidos [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, suplemento nº 1, John Wiley & Sons, 1987-1997], un método que utiliza un kit tal como el sistema plasmídico Super Script para la síntesis de ADNc y la clonación de plásmidos (fabricado por Invitrogen), el kit de síntesis de ADNc ZAP-cDNA (fabricado por Stratagene) y similares.

El vector en el que se inserta el ADNc sintetizado con el ARNm extraído de una célula de hibridoma como molde, para la preparación de una biblioteca de ADNc, puede ser cualquier vector, con la condición de que pueda insertarse el ADNc. Entre los ejemplos se incluyen ZAP ExPress [Strategies 5:58, 1992], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research 17:9494, 1989], λZAPII (fabricado por Stratagene), λgt10 y λgt11 [DNA Cloning: A

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Además, se amplificó por PCR el ADNc codificante de VH o VL de un anticuerpo de animal no humano utilizando un ADN sintético que presentaba una secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción apropiado en ambos extremos y se clonó cada uno de ellos con el vector de expresión de anticuerpo recombinante obtenido en (1), anteriormente.

(4) Construcción de ADNc codificante de la región V de anticuerpo con injerto de RDC humano

Los ADNc codificantes de VH o VL de un anticuerpo con injerto de RDC humano pueden obtenerse de la manera siguiente.

Se seleccionaron, respectivamente, secuencias de aminoácidos de la región marco (en adelante denominada "RM") en VH o VL de un anticuerpo humano en el que se trasplantaron secuencias de aminoácidos de las RDC en VH o VL de un anticuerpo derivado de un anticuerpo de un animal no humano. Pueden utilizarse cualesquiera secuencias de aminoácidos de RM de un anticuerpo humano, con la condición de que sean de origen humano.

Entre los ejemplos se incluyen secuencias de aminoácidos de RM de anticuerpos humanos registrados en una base de datos tal como Protein Data Bank o similar, y secuencias de aminoácidos comunes a subgrupos de RM de anticuerpos humanos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991] y similares. Con el fin de inhibir la reducción de la actividad de unión del anticuerpo, se seleccionaron las secuencias de aminoácidos con una homología elevada (como mínimo de 60%) respecto a la secuencia de aminoácidos de la RM en VH o VL del anticuerpo original.

A continuación, se injertaron las secuencias de aminoácidos de las RDC del anticuerpo original en la secuencia de aminoácidos seleccionada de la RM en VH o VL del anticuerpo humano, respectivamente, a fin de diseñar cada secuencia de aminoácidos de VH o VL de un anticuerpo humanizado. Las secuencias de aminoácidos diseñadas se convirtieron en secuencias de ADN mediante la consideración de la frecuencia del uso de codones observado en secuencias de nucleótidos de genes de anticuerpos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991] y se diseñó la secuencia de ADN codificante de la secuencia de aminoácidos de VH o VL de un anticuerpo humanizado.

Basándose en las secuencias de nucleótidos diseñadas, se sintetizaron varios ADN sintéticos con una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y se llevó a cabo una PCR utilizando dichos ADN. En este caso resultaba preferente el diseño de 6 ADN sintéticos por cada una de las cadenas H y L en vista de la eficiencia de reacción de la PCR y las longitudes de los ADN que pueden sintetizarse.

Además, el ADNc codificante de VH o VL de un anticuerpo con injerto de RDC humano podía clonarse fácilmente en el vector para la expresión de anticuerpo con injerto de RDC humano construido en (1) mediante la introducción de la secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción apropiado en el extremo 5'-terminal de los ADN sintéticos existentes en ambos extremos.

De lo contrario, puede llevarse a cabo utilizando un ADN sintético como ADN codificante de la cadena H de longitud completa y de la cadena L de longitud completa, basándose en la secuencia de ADN diseñada.

Después de la PCR, se clonó un producto amplificado en un plásmido, tal como pBluescript SK (-) (fabricado por Stratagene) o similar, y se determinó la secuencia de nucleótidos según un método similar al método descrito en

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con el fin de obtener un plásmido con una secuencia de ADN codificante de la secuencia de aminoácidos de VH o VL de un anticuerpo humanizado deseado.

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Modificación de la secuencia de aminoácidos de la región V del anticuerpo con injerto de RDC humano

Es conocido que al producir un anticuerpo con injerto de RDC humana mediante la simple injerto de sólo las RDC en VH y VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano en las RM de VH y VL de un anticuerpo humano, su actividad de unión a antígeno es más baja que la del anticuerpo original derivado de un animal no humano [Bio/Technology 9:266, 1991].

En los anticuerpos con injerto de RDC humana, entre las secuencias de aminoácidos de las RM en VH y VL de un anticuerpo humano, se identificó un residuo aminoácido relacionado directamente con la unión a antígeno, un residuo aminoácido que interactúa con un residuo aminoácido en la RDC y un residuo aminoácido que mantiene la estructura tridimensional del anticuerpo y que se relaciona indirectamente con la unión a un antígeno, y se modificaron por un residuo aminoácido presente en el anticuerpo no humanizado original, incrementando de esta manera la actividad de unión a antígeno que se había reducido.

Con el fin de identificar los residuos aminoácidos relacionados con la actividad de unión a antígeno en la RM, puede construirse la estructura tridimensional del anticuerpo y llevar a cabo un análisis mediante cristalografía de rayos X [J. Mol. Biol. 112:535, 1977], el modelado por ordenador [Protein Engineering 7:1501, 1994] o similar. Además, el anticuerpo con injerto de RDC humano modificado con suficiente actividad de unión contra el

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antígeno puede obtenerse mediante diversos esfuerzos, tales como la producción de varios anticuerpos modificados de cada anticuerpo y el examen de sus actividades de unión.

La modificación de la secuencia de aminoácidos de la RM en VH y VL de un anticuerpo humano puede llevarse a cabo utilizando diversos ADN sintéticos para la modificación de acuerdo con la PCR tal como se indica en (4). Con respecto al producto amplificado obtenido mediante PCR, se determinó la secuencia de nucleótidos según el método descrito en (2), de manera que se confirmase que la modificación objetivo había sido realizada.

(6) Construcción de vector para la expresión de anticuerpo con injerto de RDC humana

Puede construirse un vector para la expresión de anticuerpo con injerto de RDC humana mediante la clonación de cada ADNc codificante de VH o VL de un anticuerpo recombinante construido cadena arriba de cada gen codificante de CH o CL del anticuerpo humano en el vector para la expresión de anticuerpo recombinante tal como se indica en (1).

Por ejemplo, al introducir secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción apropiados en el extremo 5'terminal de ADN sintéticos situados en ambos extremos entre los ADN sintéticos utilizados en la construcción de VH o VL del anticuerpo con injerto de RDC humano en (4) o (5), puede llevarse a cabo la clonación de manera que se expresan en una forma apropiada cadena arriba de cada gen codificante de CH o CL del anticuerpo humano en el vector de expresión de anticuerpo con injerto de RDC humano tal como se indica en (1).

(7) Expresión transitoria de anticuerpo recombinante

Con el fin de evaluar eficientemente la actividad de unión a antígeno de diversos anticuerpos con injerto de RDC humano producidos, los anticuerpos recombinantes pueden expresarse transitoriamente utilizando el vector para la expresión de anticuerpo tal como se indica en (3) y (6) o el vector de expresión modificado del mismo.

Puede utilizarse cualquier célula como célula hospedadora, con la condición de que la célula hospedadora pueda expresar un anticuerpo recombinante. Por ejemplo, se utilizan células COS-7 (ATCC nº CRL1651) en vista de su elevado nivel de expresión [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press 283, 1991].

Entre los ejemplos de método de introducción del vector de expresión en células CO-7 se incluye un método de DEAE-dextrano [Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283, 1991], un método de lipofección [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987] y similares.

Tras la introducción del vector de expresión, puede determinarse el nivel de expresión y la actividad de unión a antígeno del anticuerpo recombinante en el sobrenadante de cultivo mediante inmunoensayo enzimático [Monoclonal Antiboides -Principles and Practice, tercera edición, Academic Press, 1996; Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific, 1987] y similares.

(8) Obtención de transformantes que expresan establemente anticuerpos recombinantes y preparación de anticuerpos recombinantes

Puede obtenerse un transformante que exprese establemente un anticuerpo recombinante mediante la introducción del vector de expresión de anticuerpo recombinante indicado en (3) y (6) en una célula hospedadora apropiada.

Entre los ejemplos del método de introducción del vector de expresión en una célula hospedadora se incluye la electroporación [solicitud de patente japonesa no examinada publicada nº 257891/90, Cytotechnology 3:133, 1990] y similares.

Como célula hospedadora en la que se introduce un vector de expresión de un anticuerpo recombinante, puede utilizarse cualquier célula, con la condición de que sea una célula hospedadora que pueda producir el anticuerpo recombinante. Entre los ejemplos se incluye CHO-K1 (ATCC nº CCL-61), DUkXB11 (ATCC nº CCL-9096), Pro-5 (ATCC nº CCL-1781), CHO-S (Life Technologies, nº de cat. 11619), célula de mieloma de rata YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (también denominada YB2/0), célula de mieloma de ratón NS0, célula de mieloma de ratón SP2/0-Ag14 (ATC nº CRL1581), célula P3X63-Ag8653 de ratón (ATCC nº CRL1580), célula CHO en la que un gen de dihidrofolato reductasa (en adelante denominado "dhfr") es defectuoso [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980], Lec13 con resistencia adquirida a lectina [Somatic Cell and Molecular Genetics 12:55, 1986], célula CHO en la que el gen α1,6-fucosiltransfeasa es defectuoso (documentos nº WO 2005/35586 y nº WO 02/31140), célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (ATCC nº CRL1662) y similares.

Además, también pueden utilizarse células hospedadoras en las que una actividad de una proteína, tal como un enzima relacionado con la síntesis de un nucleótido-azúcar intracelular, la GDP-fucosa, una proteína, tal como un enzima relacionado con la modificación de una cadena sacárida en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra

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unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en una cadena sacárida unida mediante N-glucósido de tipo complejo, o una proteína relacionada con el transporte reducido o anulado de un azúcar-nucleótido intracelular, la GDP-fucosa, al cuerpo de Golgi, preferentemente una célula CHO en la que el gen de α-1,6-fucosiltransferasa es defectuoso tal como se indica en el documento nº WO2005/35586, nº WO02/31140 o similar.

Tras la introducción del vector de expresión, se seleccionan transformantes que expresan un anticuerpo recombinante establemente mediante el cultivo en un medio para el cultivo de células animales que contiene un agente, tal como sulfato de G418 (en adelante denominado "G418") o similar (solicitud de patente japonesa publicada no examinada nº 257891/90).

Entre los ejemplos de medio para el cultivo de células animales se incluye el medio RPMI1640 (fabricado por Invitrogen), el medio GIT (fabricado por Nihon Pharmaceutical), el medio EX-CELL301 (fabricado por JRH), el medio IMDM (fabricado por Invitrogen), el medio de hibridoma-SFM (fabricado por Invitrogen), medios obtenidos mediante la adición de diversos aditivos, tales como FBS, a dichos medios, y similares.

El anticuerpo recombinante puede producirse y acumularse en un sobrenadante de cultivo mediante el cultivo de los transformantes obtenidos en un medio. La cantidad de expresión y la actividad de unión a antígeno del anticuerpo recombinante en el sobrenadante de cultivo pueden medirse mediante ELISA o similar. Además, en el transformante, puede incrementarse la cantidad expresada del anticuerpo recombinante mediante la utilización del sistema de amplificación de DHFR o similar según el método dado a conocer en la solicitud de patente publicada no examinada nº 257891/90.

La proteína recombinante puede purificarse a partir del sobrenadante de cultivo del transformante mediante la utilización de una columna de proteína A [Monoclonal Antibodies. Principles and Practice, tercera edición, Academic Press, 1996; Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. Además, el anticuerpo recombinante puede purificarse mediante una combinación de los métodos de purificación, tales como la filtración en gel, la cromatografía de intercambio iónico, la ultrafiltración y similares.

El peso molecular de la cadena H o de la cadena L del anticuerpo recombinante purificado o la molécula de anticuerpo en su conjunto se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (en adelante denominada "SDS-PAGE") [Nature 227:680, 1970], transferencia western [Monoclonal Antibodies. Principles and Practice, tercera edición, Academic Press, 1996; Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] y similares.

3. Evaluación de la actividad del anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo.

La actividad del anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo purificado de la presente invención puede evaluarse de la manera siguiente.

Se evaluó la actividad de unión a la célula que expresa TIM-3 mediante el ensayo de unión indicado en 1-(6a), anteriormente, y un método de resonancia del plasmón superficial utilizando, por ejemplo, el sistema Biacore indicado en (6b), anteriormente. Además, puede medirse mediante una técnica de anticuerpos fluorescentes [Cancer Immunol. Immunother. 36:373, 1993] y similares.

Se evaluó la citotoxicidad dependiente del complemento (en adelante denominada "actividad de CDC") o actividad de ADCC contra una línea celular positiva para antígeno mediante un método conocido [Cancer Immunol. Immunother. 36:373, 1993].

4. Método de control de la actividad efectora de un anticuerpo

Como método para el control de la actividad efectora del anticuerpo monoclonal de la presente invención, es conocido un método de control de la cantidad de fucosa (en adelante denominada también "fucosa nuclear") que se une en enlace α-1,6 a la N-acetilglucosamina (GlcNAc) presente en un extremo reductor de una cadena sacárida unida mediante N de tipo complejo que se une a la asparagina (Asn) en la posición 297 de una región Fc de un anticuerpo (documentos nº WO2005/035586, nº WO2002/31140 y nº WO00/61739), un método de control de una actividad efectora de un anticuerpo monoclonal mediante la modificación de uno o más aminoácidos de una región Fc del anticuerpo, y similares. La actividad efectora del anticuerpo monoclonal anti-TIM-3 de la presente invención puede controlarse mediante la utilización de cualquiera de los métodos.

La "actividad efectora" se refiere a una actividad dependiente de anticuerpos que se induce mediante una región Fc de un anticuerpo. Como actividad efectora, se conoce la actividad de ADCC, la actividad de CDC y la fagocitosis dependiente de anticuerpos (actividad de ADP) por fagocitos, tales como macrófagos o células dendríticas.

Mediante el control del contenido de fucosa nuclear de la cadena sacárida unida mediante N de tipo complejo de

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El producto de PCR amplificado se insertó en el vector pTracer-CMV-FLAG-Fc humano [vector modificado en el que FLAG y el dominio Fc de IgG1 humana se insertaron en el vector pTracer-CMV (fabricado por Invitrogen) entre el sitio XbaI y el sitio ApaI]. Tras introducir el plásmido en células competentes en TOP10 One Shot (fabricado por Invitrogen) para la amplificación, se extrajo el ADN plasmídico (TIM-3_s-FLAG-Fc/pTracerCMV) mediante el método de miniprep.

Mediante el análisis de la secuencia de ADN utilizando T7 (SEC ID nº 35) y TIM-3_h Fw1 (SEC ID nº 36) como cebador, se confirmó que TIM-3_s-FLAG-Fc/pTracerCMV presentaba la misma secuencia de nucleótidos que la región correspondiente en GenBank número de acceso NM_032782. La secuencia de nucleótidos (entre el sitio de reconocimiento EcoRI y el sitio de reconocimiento ApaI) era idéntica a la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 37.

[Ejemplo 3]

(Preparación de vector de expresión de TIM-3 humana extracelular soluble)

Se amplificó el ADNc codificante de la región extracelular de TIM-3 humana mediante PCR utilizando ExTaq (fabricado por Takara Bio Inc.) y TIM-3_h-FLAG-Fc/pTracerCMV establecido en el Ejemplo 2, a modo de molde. Como cebadores se utilizaron TIM-3 Fw2 (SEC ID nº 31) y TIM3ED-FLAG4aa (SEC ID nº 39).

A continuación, se ligó el epítopo FLAG mediante el método de PCR utilizando ExTaq (fabricado por Takara Bio Inc.), TIM-3 Fw2 (SEC ID nº 31) y C-FLAG-NotR2 (SEC ID nº 40) como cebadores y el producto de PCR obtenido como molde. Se insertó el producto de PCR en el vector pGEM-T Easy (fabricado por Promega Corp.). Tras introducir el plásmido en células competentes en TOP10 One Shot (fabricado por Invitrogen) para la amplificación, se extrajo el ADN plasmídico (TIM-3_s-FLAG/pEF6Myc_HisC) mediante el método de miniprep.

Mediante el análisis de la secuencia de ADN utilizando T7 (SEC ID nº 35) y BGH-R (SEC ID nº 41) como cebador, se confirmó que TIM-3_s-FLAG-Fc/pEF6 Myc_HisC purificado presentaba la misma secuencia de nucleótidos que la región correspondiente en GenBank número de acceso NM_032782.

[Ejemplo 4]

(Preparación de la proteína de fusión de TIM-3 humana extracelular soluble-Fc humana y TIM-3 humana extracelular soluble)

El ADN plasmídico de TIM-3_s-FLAG-Fc/pTracerCMV y de TIM-3_s-FLAG-Fc/pEF6 Myc_HisC obtenidos en los Ejemplos 2 y 3, respectivamente, se introdujeron en células HEK293F (preparadas por Invitrogen) y se expresaron transitoriamente. Seis días después, se recuperó cada uno de los sobrenadantes celulares y se utilizaron para la purificación de proteínas.

El sobrenadante de cultivo que contenía la proteína de fusión de TIM-3 humana extracelular soluble-Fc humana

o que contenía TIM-3 humana extracelular soluble se recuperó mediante centrifugación seis días después de la transfección. Las proteínas de fusión se purificaron con una columna anti-FLAG preparada utilizando un gel de afinidad de agarosa anti-FLAG M2 (fabricado por Sigma-Aldrich Co., LLC) y péptidos FLAG (fabricados por Sigma-Aldrich Co., LLC) siguiendo los protocolos del fabricante.

Las muestras eluidas se fraccionaron y después cada fracción se analizó mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y después se llevó a cabo la tinción con plata y una transferencia western. Para la transferencia western, se utilizó un anticuerpo anti-FLAG M2 (fabricado por Sigma-Aldrich Co., LLC) y un anticuerpo de conejo antiinmunoglobulina de ratón marcado con fosfatasa alcalina (fabricado por Dako). La fracción que contenía la proteína diana se concentró utilizando Amicon Ultra 4 10K (fabricado por Millipore) y se aplicó para la cromatografía de filtración en gel utilizando una columna Superdex 200 gp (fabricada por GE Healthcare).

Tras el fraccionamiento, se aplicó cada fracción a SDS-PAGE bajo condiciones reductoras, se tiñó con plata y después se realizó una transferencia western. Se concentró la fracción en la que se encontró la proteína diana y se lavó con 0,5 ml de PBS. La proteína de fusión de TIM-3 humana extracelular soluble-Fc humana o la TIM-3 humana extracelular soluble se recolectaron después de la filtración a través de un filtro esterilizante MILLEX-GV (fabricado por Millipore) que presentaba un diámetro de poro de 0,22 µm. Se midió la pureza de proteína mediante el kit Limulus ES-II Wako (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), que es un kit para detectar endotoxinas, y se confirmó que la fracción había sido suficientemente purificada.

[Ejemplo 5]

(Preparación de ratón expresante del anticuerpo humano)

Los ratones utilizados para la inmunización presentaban un fondo genético en el que tanto el locus endógeno de

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la cadena pesada de Ig como el locus de la cadena ligera κ se habían alterado homocigóticamente y se mantuvo un fragmento del cromosoma 14 (SC20) que comprendía un transcromosoma de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena Igκ humana (KCo5) simultáneamente. Se estableció dicha cepa de ratón mediante el cruce de la cepa A de ratón que presentaba loci de cadena pesada de la Ig humana y la cepa B de ratón que mantenía el transgén de la cadena Igκ humana.

La cepa A de ratón es un homocigoto en el que el locus endógeno de cadena pesada de Ig y el locus de la cadena ligera κ han sido alterados homocigóticamente, y mantiene un fragmento de cromosoma 14 (SC20) que puede transmitirse a la progenie y que se encuentra descrito, por ejemplo, en Tomizuka et al. (Tomizuka K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727, 2000).

La cepa B de ratón es una cepa de ratón (ratón transgénico) en la que se han alterado homocigóticamente tanto el locus endógeno de la cadena pesada de Ig como el locus de la cadena ligera κ, y mantiene un transgén de la cadena ligera Igκ humana (KCo5) y se describe, por ejemplo, en Fishwild et al. (1996) [Nature Biotechnology 14:845-851].

El animal individual se obtuvo mediante cruce de un ratón macho de la cepa A y un ratón hembra de la cepa B, o de un ratón hembra de la cepa A y un ratón macho de la cepa B, y era un ratón en el que podían detectarse simultáneamente en el suero la cadena pesada de Ig humana y la cadena ligera Igκ [Ishida y Lonberg, IBC'S 11th Antibody Engineering, resumen nº 2000] y se utilizó posteriormente para experimentos inmunológicos. A título de información, el ratón expresante de anticuerpo humano (en adelante denominado "ratón KM") puede obtenerse de Kyowa Hakko Kirin mediante la obtención de una licencia.

[Ejemplo 6]

(Preparación de anticuerpo monoclonal anti-TIM-3 humana)

La preparación del anticuerpo monoclonal en el presente Ejemplo se llevó a cabo siguiendo métodos generales, tales como los publicados en Monoclonal Antibody Experiment Manual (Yasuhigashi Tamie et al., Kodansha, 1991). Como inmunógeno TIM-3 se utilizó la célula L929 expresante de TIM-3 preparada en el Ejemplo 1 o la proteína de fusión de TIM-3 humana extracelular soluble-Fc humana preparada en el Ejemplo 4. El animal inmunizado fue el ratón KM, descrito anteriormente.

Se inyectaron células L929 que expresan TIM-3 en los ratones a una dosis de 1x107 células/animal. Tras la primera inmunización, se administró adicionalmente la misma célula tres veces adicionales o más. Tres días antes de obtener el bazo, se administró la proteína de fusión de TIM-3 humana extracelular soluble-Fc humana preparada en el Ejemplo 4 en la vena caudal a una dosis de 20 µg/ratón. Se extirpó quirúrgicamente el bazo de los ratones inmunizados, se introdujo en 4 ml de PBS y se trituró en una malla (filtro celular fabricado por Falcon) utilizando una jeringa de émbolo.

Las células se precipitaron mediante centrifugación de la suspensión celular que había sido pasada a través de la malla y las células se resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (fabricado por Sigma-Aldrich Co., LLC). Tras incubar durante 5 min a temperatura ambiente, se añadieron 10 ml de medio DMEM libre de suero (fabricado por Invitrogen) (en adelante denominado "medio DMEM libre de suero") que contenía 50 unidades/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina y las células se precipitaron mediante centrifugación.

Los sedimentos celulares se resuspendieron en medio DMEM libre de suero. Por otra parte, se cultivó la línea celular de mieloma SP2/0 (ATCC nº CRL-1581) en medio DMEM que contenía FBS al 10%, 50 unidades/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina (en adelante denominado "medio DMEM que contiene suero") y se incubó a 37ºC bajo 5% de CO2 a fin de no exceder una densidad celular de 1x106 células/ml.

Las células SP2/0 se lavaron con 10 ml de medio DMEM libre de suero y se suspendieron en medio DMEM libre de suero, tal como en el caso de las células derivadas del bazo. Dicha suspensión de células derivadas de bazo y la suspensión de células de mieloma se mezclaron en una proporción de 5:1, se centrifugaron y se eliminó por completo el sobrenadante. Para fusionar las células, se añadió lentamente 1 ml de polietilenglicol al 50% (p/v) (fabricado por Boehringer Mannheim Corp.) bajo agitación simultánea del sedimento con la punta de pipeta y después se añadió 1 ml de medio DMEM libre de suero precalentado a 37ºC. Lentamente se añadieron 5 ml y 10 ml de DMEM libre de suero seguido de 5 min de incubación a 37ºC bajo 5% de CO2.

Tras la centrifugación y eliminación del sobrenadante, las células fusionadas se resuspendieron en 50 ml de medio DMEM que contenía FBS al 10% (fabricado por Invitrogen), penicilina-estreptomicina-glutamina (fabricados por Invitrogen, dilución de 100 veces del nº de catálogo 10378-016), IL-6 (5 ng/ml) y 2mercaptoetanol (fabricado por Invitrogen, dilución de 1.000 veces de nº de catálogo 21985-023) (en adelante denominado "medio DMEM que contiene IL-6") y se incubó a 37ºC bajo 5% de CO2.

Al día siguiente, se recogieron las células mediante pipeteado, se centrifugaron y el sedimento se resuspendió en

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10 ml de medio DMEM que contenía IL-6. Al día siguiente, se añadió hipoxantina-aminopterina-timidina (en adelante denominado "HAT", fabricado por Sigma-Aldrich Co., LLC). Tras incubar durante aproximadamente 7 a 10 días, se recolectó el sobrenadante de cultivo para el cribado de hibridoma.

[Ejemplo 7]

(Preparación de anticuerpo monoclonal de ratón anti-TIM-3 humano)

La preparación del anticuerpo monoclonal en el presente Ejemplo se llevó a cabo según los métodos generales publicados en Introduction to Monoclonal Antibody Experiment (Yasuhigashi Tamie et al., Kodansha, 1991). Como inmunógeno TIM-3 se utilizaron las células L929 expresantes de TIM-3 preparadas en el Ejemplo 1 o la TIM-3 humana extracelular soluble preparada en el Ejemplo 4. Los animales inmunizados fueron ratones Balb/c (obtenidos de Nihon Charles River).

En primer lugar, se inmunizó un ratón Balb/c mediante la inyección de células L929 que expresaban TIM-3, por vía intraperitoneal a una dosis de 1x107 células/animal. Después de la primera inmunización, se administraron adicionalmente las mismas células tres veces adicionales o más. Tres días antes de extraer el bazo, se administró la proteína TIM-3 humana extracelular soluble preparada en el Ejemplo 4, en la vena caudal a una dosis de 20 µg/ratón. Se extirpó quirúrgicamente el bazo del ratón inmunizado, se introdujo en 4 ml de PBS y se trituró en una malla (filtro celular fabricado por Falcon) utilizando una jeringa de émbolo.

Las células se precipitaron mediante centrifugación de la suspensión celular, que se pasó por la malla, y las células se resuspendieron en 1 ml de tampón de lisis para glóbulos rojos (fabricado por Sigma-Aldrich Co., LLC). Tras incubar durante 5 min a temperatura ambiente, se añadieron 10 ml de medio DMEM libre de suero y después se precipitaron las células mediante centrifugación. Los sedimentos se resuspendieron en medio DMEM libre de suero. Por otra parte, la línea celular de mieloma SP2/0 (ATCC nº CRL-1581) se cultivó en medio DMEM mediante incubación a 37ºC bajo 5% de CO2 hasta una densidad celular de 1x106 células/ml o inferior.

De manera similar a las células derivadas de bazo, se lavaron células SP2/0 con 10 ml de medio DMEM libre de suero y se suspendieron en medio DMEM libre de suero. La suspensión de células de bazo y la suspensión de células de mieloma se mezclaron en una proporción de 5:1. Tras la centrifugación, se eliminó el sobrenadante. A dicho sedimento se añadió lentamente 1 ml de polietilenglicol al 50% (p/v) (fabricado por Boehringer Mannheim Corp.), bajo agitación del sedimento con la punta de pipeta y después se añadió 1 ml de medio DMEM libre de suero precalentado a 37ºC.

A dicha suspensión se añadieron lentamente 5 ml de medio DMEM. Tras añadir adicionalmente 10 ml de DMEM libre de suero, la suspensión se incubó durante 5 min a 37ºC bajo 5% de CO2. Tras centrifugar la suspensión, los sedimentos celulares se resuspendieron en 50 ml de medio DMEM que contenía IL-6 y se cultivaron a 37ºC bajo 5% de CO2. Tras incubar durante un día, se recolectaron las células con una pipeta. Tras la centrifugación, el sedimento se resuspendió en 10 ml de medio DMEM que contenía IL-6. Al día siguiente se añadió medio HAT (fabricado por Sigma-Aldrich Co., LLC). Tras la incubación durante aproximadamente 7 a 10 días, se recuperó el sobrenadante de cultivo y se utilizó para el cribado del hibridoma.

[Ejemplo 8]

(Cribado de hibridoma productor de un anticuerpo monoclonal humano o de ratón que se une a TIM-3 humana)

Se cribó el hibridoma utilizando el sobrenadante celular preparado en los Ejemplos 6 y 7. El método utilizado fue un método de citometría de flujo con las líneas celulares expresantes de TIM-3 humana. En primer lugar, la célula Jurkat o EoL-1 expresante de TIM-3 humana preparada en el Ejemplo 1 se lavó con medio de tinción (PBS que contenía FBS al 2% y azida sódica al 0,05%) y después se resuspendió en 1 ml de medio de tinción, proporcionando una densidad celular de 1x106 células/ml. La suspensión celular se dispensó a razón de 10 µl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos.

A continuación, se añadieron 50 µl del sobrenadante del hibridoma y se incubaron durante 30 min a 4ºC. Después de lavar dos veces las células con el medio de tinción, 50 µl de anticuerpo marcado que había sido diluido 200 veces con medio de tinción se añadieron a cada pocillo y se incubaron durante 30 min a 4ºC. Respecto a los anticuerpos marcados, se utilizó F(ab')2 de cabra anti-IgG humana (específico de cadena γ)-R-PE (fabricado por Southern Biotech) para el anticuerpo monoclonal humano y se utilizó F(ab')2 de cabra anti-IgG(H+L) de ratón-R-PE (fabricado por Southern Biotech) para el anticuerpo monoclonal de ratón.

Tras lavar dos veces con medio de tinción, las células se analizaron utilizando un instrumento FACSCalibur (fabricado por BD Biosciences) como cribado primario. Tras recolectar y expandir los clones positivos, las células e hibridoma fueron separadas según clon mediante FACSAria (fabricado por BD Biosciences) y cultivadas durante siete días en medio DMEM que contenía IL-6 que contenía además hipoxantina-timidina (en adelante denominado "HT", fabricado por Sigma-Aldrich Co., LLC).

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Se cribaron los sobrenadantes recolectados del mismo modo que en el método de cribado primario para la clonación de hibridomas que expresaban anticuerpo monoclonal humano anti-TIM-3 humana y que los hibridomas que expresaban anticuerpo monoclonal de ratón anti-TIM-3 humana y el clon de hibridoma seleccionado se utilizó para la purificación del anticuerpo monoclonal.

[Ejemplo 9]

(Purificación de anticuerpo monoclonal derivado de hibridoma)

Se purificó un anticuerpo monoclonal humano o de ratón anti-TIM-3 a partir del hibridoma expresante de anticuerpo monoclonal humano o e ratón anti-TIM-3 humana preparado en el Ejemplo 8. Brevemente, se preparó el sobrenadante del hibridoma que contenía una elevad concentración del anticuerpo anti-TIM-3 utilizando un sistema de producción de anticuerpos CELLine (fabricado por BD Biosciences) y se purificó el anticuerpo monoclonal anti-TIM-3 humana a partir del sobrenadante. En primer lugar, para adaptar el hibridoma clonado al medio libre de suero, se cultivaron los hibridomas durante varios días en un medio en que se había mezclado medio DMEM que contenía HT e IL-6 y medio libre de suero BD Cell MAb (fabricado por BD Biosciences) en una proporción 1:1 y después se cultivaron durante varios días en un medio con una proporción de mezcla de 1:2.

A continuación, se cultivaron los hibridomas en un medio libre de suero BD Cell MAb (fabricado por BD Biosciences) y se adaptaron los hibridomas al medio libre de suero. Las células de hibridoma adaptadas al medio libre de suero se cultivaron en matraces CL-1000 siguiendo las instrucciones del fabricante y se recolectó el sobrenadante del hibridoma que contenía una concentración elevada del anticuerpo anti-TIM-3 a partir de los matraces. El anticuerpo del sobrenadante del hibridoma se purificó siguiendo procedimientos estándares utilizando proteína A.

Específicamente, se empaquetó MabSelect (fabricado por GE Healthcare) en una columna abierta y el sobrenadante se diluyó 2 veces cargando PBS y después se eluyó con glicina-HCl 0,1 moles/l (pH 2,7), seguido de la concentración con un Amicon Ultra (fabricado por Millipore). A continuación, mediante la utilización de una columna NAP-5 (fabricada por GE Healthcare), se equilibró la solución obtenida con tampón de PBS y después se esterilizó mediante filtración, obteniendo 4 clones de los anticuerpos monoclonales humanos anti-TIM-3 humano (anticuerpos 512, 644, 4545 y 4177) y un clon (anticuerpo 8213) del anticuerpo monoclonal de ratón anti-TIM-3 humano.

[Ejemplo 10]

(Identificación de isotipo del anticuerpo monoclonal anti-TIM-3 humano)

Cada uno de los isotipos de anticuerpo monoclonal anti-TIM-3 humana que se había preparado en el Ejemplo 9 se determinó mediante un ELISA en fase sólida y citometría de flujo.

Específicamente, respecto al ELISA en fase sólida, la TIM-3 humana extracelular soluble obtenida en el Ejemplo 4 se diluyó con un tampón de carbonato-bicarbonato (fabricado por Sigma-Aldrich Co., LLC), proporcionando una concentración de 1 µg/ml y se dispensó a razón de 50 µl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos (Maxisorp, fabricada por Nunc). La TIM-3 humana extracelular soluble se adsorbió a la microplaca mediante incubación durante la noche a 4ºC.

Tras descartar el sobrenadante, se añadió a la placa tampón de bloqueo SuperBlock en TBS (fabricado por Pierce) y después se incubó durante 10 min a temperatura ambiente y se añadieron 50 µl del sobrenadante de cultivo del hibridoma y después se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Tras lavar cada pocillo con solución salina tamponada con Tris que contenía Tween-20 al 0,1% (TBS-T), se diluyó cada uno de los anticuerpos anti-IgG1 humana, anti-IgG2 humana, anti-IgG3 humana y anti-IgG4 humana, 2.000, 2.000, 2.000 y

4.000 veces, respectivamente, con TBST que contenía tampón de bloqueo SuperBlock al 10% (fabricado por SouthernBiotech) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Tras lavar cada pocillo con TBS-T, se añadieron 50 µl de tampón de sustrato (TMB, fabricado por Dako) y después se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 µl de ácido sulfúrico 0,5 moles/l (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Se midió la absorbancia a una longitud de onda de 45 nm (longitud de onda de referencia: 570 nm) en un lector de microplacas (VersaMax, fabricado por Molecular Devices, LLC).

Además, en el método de citometría de flujo, se lavaron con medio de tinción las células Jurkat que expresaban TIM-3 humana preparadas en el Ejemplo 1 y después se añadieron 50 µl del sobrenadante del hibridoma y se incubaron durante 30 min a 4ºC. Tras el lavado, se añadieron 50 µl de cada uno de los anticuerpos siguientes: anticuerpo de ratón anti-IgG1 humana-PE, anticuerpo de ratón anti-IgG2 humana-PE, anticuerpo de ratón anti-IgG3 humana (bisagra)-PE y anticuerpo de ratón anti-IgG4(Fc) humana-PE (fabricado por SouthernBiotech) que

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