CN104072615B - 一种能阻断Tim-3信号通路的人Tim-3融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能阻断Tim‑3信号通路的人Tim‑3‑Ig融合蛋白，所述的融合蛋白包括Tim‑3蛋白、人免疫球蛋白Ig片段及二者的连接序列。本发明通过人工合成方法获得人的Tim‑3‑Ig基因，构建了含Tim‑3‑Ig基因的表达载体，并对得到的融合蛋白进行了表达验证实验、结合活性实验、不同细胞系内的阻断活性实验及小鼠体内实验。本发明制备的人Tim‑3‑Ig融合蛋白可用于治疗由Tim‑3高表达所导致的免疫疾病。

Description

一种能阻断Tim-3信号通路的人Tim-3融合蛋白
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白，具体涉及一种人Tim-3-Ig融合蛋白及含有人Tim-3-Ig融合蛋白的制剂，本发明还涉及人Tim-3-Ig融合蛋白在治疗免疫疾病的用途。
背景技术
Tim-3在结构上属于T细胞免疫球蛋白及粘蛋白(T cell Immunoglobulin domainand Mucin domain protein，Tim)家族成员。由于Tim家族广泛参与了机体的免疫调节过程，其功能正日益受到人们的重视。Tim-3特异性表达于活化的Th1、Th17效应细胞表面，而不表达于Th2细胞。现已知半乳糖结合蛋白-9(Galectin-9，Gal-9)为Tim-3的天然配体，该分子广泛表达于外周免疫系统，免疫调控分子Tim-3与其配体(Gal-9)结合后能通过一系列信号通路抑制免疫细胞，包括T细胞、天然免疫细胞如巨噬细胞等的活化，研究表明Tim-3在免疫细胞上的高表达与肿瘤、慢性病毒感染患者的免疫失能密切相关。研究还表明，任何阻断Tim-3／Gal-9结合的因素均可以使Th1、Th17细胞避开死亡，增强T效应细胞的活性，恢复免疫功能。
一方面，在一些自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘等疾病中，由于Gal-9或Tim-3表达的升高，导致Th1细胞的功能受到抑制，进而打破体内的免疫平衡，引起病理性的Th2细胞的活性增强，导致疾病的发病。在这种情况下，任何阻断Tim-3／Gal-9结合的因素均能有利于体内免疫平衡的恢复，缓解疾病的进程。另一方面，在一些自身免疫病如炎性肠病以及I型糖尿病模型中，研究发现阻断Tim-3的活性增强了体内Th1效应细胞的功能，进一步加重了自身免疫损伤，该结果再次证明Tim-3在体内免疫平衡的维持中发挥重要作用。
上述研究资料表明，Tim-3通路具有重要的免疫调节功能，Tim-3表达的异常与多种疾病的发生、发展有密切关系。但是，目前并没有效果较好的Tim-3信号通路阻断剂。因此，提供一种特异性强、阻断效果好的Tim-3信号通路阻断剂，对某些疾病的发病机理研究、疾病诊断和治疗具有重要的意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种TIM-3-Ig融合蛋白，所述融合蛋白具有良好的阻断效果。
在对Tim-3做修饰的分子，其分子量越大，越可能影响Tim-3和其配体的正确结合，从而影响其生物学活性。本发明创造性地提供一种Tim-3-Ig融合蛋白，所述Tim-3片段是从Tim-3全长序列中优选出来的一段，所述Ig部分是从IgG的Fc序列中优选出来的一段，提高了Tim-3-Ig融合蛋白生物活性，同时降低成本，具有更高的实际应用价值。
本发明涉及用基因工程技术构建和生产能阻断Tim-3信号通路的蛋白质药物，制备方法以及这类药物在免疫疾病治疗上的应用。
本发明所述的TIM-3-Ig融合蛋白为取人Tim-3的片段与人免疫球蛋白Ig片段融合后表达获得。
本发明所述的人免疫球蛋白Ig片段选自人IgG，IgM，IgE，IgA的Fc段或Fc段的部分序列，每种免疫球蛋白类型包括各亚型，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，优选IgG1。
进一步，本发明优选人Tim-3的部分氨基酸片段与人免疫球蛋白IgG1部分氨基酸片段融合。更优选，人Tim-3的部分氨基酸片段与人免疫球蛋白IgG1的部分氨基酸片段融合。
本发明提供人Tim-3的片段与人免疫球蛋白Ig片段融合后得到的具有阻断Tim-3抑制活性的融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
另外，如本领域技术人员所能预见到的，本发明的“人免疫球蛋白Ig部分”和“人Tim-3”还涵盖了具有相同或相似生物活性的所述多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：相对于所述多肽的氨基酸序列有若干个(较佳地1-10个，更佳为1-5个，最佳为1-3个)氨基酸的缺失、插入和／或取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可发生在C末端和／或N末端(通常有20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加)。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸：脂族：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另外，该术语还包括了T细胞免疫球蛋白粘蛋白的片段或衍生物，较佳的是该片段或衍生物保留了所需的蛋白生物活性。
Tim-3片段与Ig片段之间经连接序列融合。
本发明所述的Tim-3-Ig融合蛋白的Ig序列是通过接头(即连接肽)和Tim-3片段连接。所述接头可选择多种氨基酸，例如丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)或其它氨基酸的组合，例如可选择一系列的甘氨酸和丝氨酸的组合，长度约为10-15个氨基酸残基。最佳的连接肽长度和氨基酸组成取决于日常的实验情况。
本发明所述的Tim-3-Ig融合蛋白的DNA序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
应当理解，本领域技术人员可以根据密码子的兼并性以及在不同物种中的表达偏好，合成相应的核酸序列。这些变化也涵盖在本发明的范围之内。
融合蛋白质的构建技术基于分子克隆方法，具体实验方法可参考《分子克隆》第二版和第三版等实验手册。
用PCR合成的方法将编码有上述融合蛋白的DNA克隆到载体中。表达该融合蛋白的载体可以是分子生物学所常用的质粒。融合蛋白的氨基末端前可加上信号肽序列以保证蛋白质从细胞中分泌出来。载体序列中包括用于驱动基因表达的启动子，蛋白质翻译起始和终止信号，以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。载体中有抗菌素抗性基因以利于质粒在细菌中所繁殖。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因用于稳定转染细胞株的选择。
在完成质粒的构建以后，融合蛋白的DNA序列经测序证实。然后用质粒DNA转染细胞，表达相应的蛋白质。能够用于表达这些融合蛋白的表达系统有多种，它们包括，但不限于，哺乳动物细胞，细菌，酵母，昆虫细胞等等。
从哺乳动物细胞所表达的蛋白质具有糖基修饰，是表达Tim-3-Ig融合蛋白的最佳细胞。可用于蛋白质大规模表达的哺乳动物细胞有多种，包括但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、乳仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。
编码多肽的质粒可经转染(transfection)进入细胞。转染细胞的方法有多种，其中包括(但不限于)：电钻孔(electroporation)，脂质体(liposome)介导，钙介导等等。
除了哺乳动物细胞，其他表达系统也能用于这些融合蛋白的表达，例如细菌，酵母，昆虫细胞，等等，它们也包括在本发明所能使用的细胞范围。这些表达系统的蛋白质产量有可能比哺乳动物细胞为高，但这类表达系统所生产的蛋白质通常缺乏糖基化或者所形成的糖链与哺乳动物细胞不同。
蛋白质表达后，可用酶联免疫吸附试验(ELISA)或其他方法测定细胞培养液中融合蛋白质的浓度。由于这些融合蛋白质具有免疫球蛋白Ig片段，因此可用A蛋白或G蛋白亲和层析法初步提取所表达的融合蛋白质。
本发明的Tim-3-Ig融合蛋白质的基本作用是竞争性的阻断Tim-3与其配体(Gal-9)结合，从而使得免疫细胞，包括T细胞、天然免疫细胞如巨噬细胞等的处于活化状态。Tim-3-Ig融合蛋白可以作为提纯的重组蛋白质注射到病人体内。也可以将编码融合蛋白的DNA序列插入到适当的载体中，用基因治疗或细胞治疗的方法在病人体内表达。所以，本发明所涉及的融合蛋白质的使用方法有多种形色，不仅包括蛋白质本身，也包括编码融合蛋白的DNA。
本发明还包括融合蛋白的药物组合物。组合物中可以含有药物可接受的载体。药物组合物可以以任何形式的药物制剂形式存在，优选的是注射剂，包括水剂和冷冻干燥注射剂。该药物组合物可以按照制剂学常规技术制备，包括将药物活性成分，本发明的多肽与药物载体混合，按照制剂技术制成所需要的剂型。
本发明公开了一种含TIM-3-Ig融合蛋白的制剂，由TIM-3-Ig融合蛋白、保护剂、缓冲剂、表面活性剂和等渗调节剂组成。
本发明公开的上述TIM-3-Ig融合蛋白制剂，其中各组分的含量为TIM-3-Ig融合蛋白10～40mg／ml，保护剂10～100mg／ml，缓冲剂3～10mmol，表面活性剂0.05～0.2mg／ml，等渗调节剂2～9mg／ml。
本发明公开的上述的TIM-3-Ig融合蛋白制剂，其中保护剂是双糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸。
本发明公开的上述的TIM-3-Ig融合蛋白制剂，其中缓冲剂为磷酸钠。
本发明公开的上述的TIM-3-Ig融合蛋白制剂，其中表面活性剂为吐温-20。
本发明公开的上述的TIM-3-Ig融合蛋白制剂，其中等渗调节剂为氯化钠。
本发明公开的上述的TIM-3-Ig融合蛋白制剂，其中TIM-3-Ig融合蛋白的含量为20mg／ml，保护剂的含量为37mg／ml，缓冲剂的含量为4.55mmol，表面活性剂0.1mg／ml，等渗调节剂的含量为4mg／ml。
附图说明
图1.人Tim-3-Ig融合蛋白的表达验证(Western Blot)；
图2.人Tim-3-Ig融合蛋白对人单核细胞系THP-1的阻断活性；
图3.人Tim-3-Ig融合蛋白对人巨噬细胞系U937的阻断活性；
图4.人Tim-3-Ig融合蛋白对人外周血的阻断活性；
图5.人Tim-3-Ig融合蛋白与小鼠细胞的交叉作用；
图6.人Tim-3-Ig融合蛋白对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用；
图7.人Tim-3-Ig融合蛋白对荷瘤小鼠体内免疫功能的影响。
具体实施方式
下面的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
实施例1含融合蛋白片段的表达载体的构建
实验材料：T4DNA连接酶；载体pcDNA3.1；感受态细菌JM109；质粒提取试剂；PCR试剂。
方法与结果：根据基因库中搜索到的人的Tim-3基因序列、人IgG1基因序列中的部分序列，选择合适的连接序列，通过人工合成方法获得人的Tim-3-Ig基因；随后在T4DNA连接酶缓冲液中按适当比例与载体混合，加入0.5U的T4DNA连接酶于16℃连接过夜；取连接液10μL，加于200μL感受态细菌JM109中并轻柔混匀，冰浴30min，42℃水浴热休克90秒，迅速转入冰浴2min，加800μL LB培养基，转入37℃恒温摇床，以150r／min的速度摇动45min，4000r／min离心1min，弃去800μL上清，取沉淀涂布于含Amp(终浓度为100μg／mL)的固体LB平板，将平板倒置于37℃孵箱12～18h；在所得上述平板中挑取单个克隆，接种于含氨卞青霉素(100g／mL)的LB培养基中。37℃恒温摇床170r／min，震荡培养过夜。分别取3mL菌液加入1.5mL Eppendorf管中，10000r／min离心1min，弃上清。采用质粒提取试剂盒，将沉淀菌体重悬于100μL溶液I中，加新鲜配制的溶液II200μL，轻缓地上下颠倒数次，至液体变清澈为止。随后，再加入150μL溶液III，轻柔地上下颠倒数次使液体混匀，此时出现大量白色絮状沉淀。4℃，12000r／min离心5min，取上清加至另一Eppendorf管中，加入等体积的Tris-HCl饱和酚，剧烈震荡后，12000r／min离心5min，将上层水相移至一新管中。再加入500μL氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上层水相，移至一新管中，加2倍体积的无水乙醇混匀，于-20℃放置3h。4℃，12000r／min离心10min，弃上清，用70％乙醇洗沉淀2次，室温干燥20min，以40μL无菌双蒸水溶解，进行PCR鉴定及DNA测序分析。结果显示，Tim-3-Ig片段成功克隆到表达载体pcDNA3.1中，含有目的基因的载体质粒命名pcDNA3.1-Tim-3-Ig。(Tim-3-Ig基因序列见序列表SEQ ID NO.2)
实施例2融合蛋白的表达及Western Blot检测
1、实验材料
蛋白裂解液；SDS-PAGE试剂；Tim-3抗体购自Abcam公司，NC膜，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，Protein A Sepharose CL4B柱蛋白柱：北京本元正阳生物技术有限公司产品，20％胎牛血清：北京元亨圣马生物技术研究所产品；无血清RPMI1640：Gibco公司产品。
2、方法与结果：
1)融合蛋白的表达：将实施例制备的重组质粒pcDNA3.1-Tim-3-Ig，转染至CHO细胞中，培养数天，收集表达上清，加入1mL pH8.0、0.1mol／L磷酸缓冲液并用1mol／L TRIS-HCL调整pH至9.0。把细胞上清加入已经用pH8.0、0.1mol／L磷酸缓冲液平衡好的ProteinASepharose CL4B蛋白柱中，用上述缓冲液洗柱子，直到流出液中检测不到杂蛋白为止。用pH3.0的柠檬酸缓冲液洗脱，收集流出液，并立即用1mol／L pH8.5TRIS-HCL缓冲液中和，用pH7.2，0.01mol／L的PBS透析72h。取样在紫外分光光度计上测OD260、OD280，计算蛋白质含量，冻干后于-20℃保存。
2)融合蛋白的Western Blot检测，收集Tim-3-Ig融合蛋白样品，测定蛋白浓度，配制SDS-PAGE凝胶，电泳，转膜，封闭，用抗人Tim-3抗体进行一抗孵育，二抗孵育，蛋白检测。实验对照蛋白为Ig。
结果如图1所示，Tim-3-Ig融合蛋白能特异性地被抗人Tim-3抗体识别。
实施例3ELISA检测融合蛋白结合活性
实验对照：阴性对照(仅含有本发明Ig部分)、对照1蛋白(简称D1蛋白，其序列为SEQ ID NO.3)、对照2蛋白(简称D2蛋白，其序列为SEQ ID NO.4)、对照3蛋白(简称D3蛋白，其序列为SEQ ID NO.5)、对照4蛋白(简称D4蛋白，其序列为SEQ ID NO.6)。
方法与结果：在得到融合蛋白的后，本发明用结合试验测定了Tim-3-Ig融合蛋白与Gal-9的结合活性。同时设置有阴性对照、对照1、对照2、对照3和对照4。具体步骤：1)Gal-9蛋白包被，用缓冲液浓度为1～10μg／ml的Gal-9蛋白包被PVC微量滴定板的孔，用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜，弃去包被液，并洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μl PBS。在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去溶液或洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴。2)封闭和加样，每孔添加200μl封闭缓冲液(5％脱脂奶粉／PBS)，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点，用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育至少1～2小时，将100μl适当稀释的Tim-3-Ig融合蛋白或其对照蛋白添加到每个孔，在37℃下孵育90分钟。3)用检测抗体Tim-3孵育，将100μl稀释的检测抗体Tim-3抗体添加到每个孔，用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育2小时，用PBS洗涤微量滴定板四次，添加100μl偶联二抗，其在使用前便已在封闭缓冲液中稀释成最佳浓度，用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育1～2小时，用PBS洗涤微量滴定板四次。4)检测，每个孔中加100μl底物，显色30min并立即在405～410nm读数。
ELISA结果显示与对照相比，本发明的Tim-3-Ig融合蛋白与Gal-9蛋白结合效果最好。
实施例4人Tim-3-Ig融合蛋白对人单核细胞系THP-1的阻断活性
本发明将浓度分别为5μg／ml和20μg／ml的Tim-3-Ig融合蛋白或其阴性对照蛋白Ig(浓度分别为5μg／ml和20μg／ml)与人单核细胞THP-1共培养，48小时后检测各组上清中IL-8的分泌水平，结果如图2所示，Tim-3-Ig融合蛋白能剂量依赖性地上调IL-8的表达水平。
实施例5人Tim-3-Ig融合蛋白对人巨噬细胞系U937的阻断活性
本发明将浓度分别为5μg／ml和20μg／ml的Tim-3-Ig融合蛋白或其阴性对照蛋白Ig(浓度分别为5μg/ml和20μg/ml)与人巨噬细胞U937共培养，48小时后检测上清中IL-8的分泌水平，结果如图3所示，Tim-3-Ig融合蛋白能剂量依赖性地上调IL-8的表达水平。
实施例6人Tim-3-Ig融合蛋白对人外周血的阻断活性
本发明将分离的人外周血(PBMC)与浓度分别为10μg／ml和20μg／ml的Tim-3-Ig、阴性对照蛋白Ig(浓度分别为10μg／ml和20μg／ml)及空白对照共培养，同时用CD3，CD28刺激细胞增殖，48小时后收集上清测细胞因子IL-6的表达。结果如图4所示，Tim-3-Ig融合蛋白能显著增强PBMC中IL-6的表达。
本发明还检测了人Tim-3-Ig融合蛋也能作用于小鼠细胞的细胞，结果如图5所示。
实施例7人Tim-3-Ig融合蛋白对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响
本发明首先用CT-26肿瘤细胞接种到Balb／C小鼠背部，同时接种不同剂量(200μg和500μg)的Tim-3-Ig蛋白或其对照蛋白Ig(200μg)。两周后开始监测肿瘤的大小变化，分别在14、16、18、20、22、24、26、28、30、32天测量肿瘤的大小。结果如图6所示，与对照相比Tim3-Ig融合蛋白能显著抑制肿瘤的生长，并且Tim3-Ig融合蛋白对肿瘤抑制效果有剂量依赖性。
实施例8人Tim-3-Ig融合蛋白对荷瘤小鼠体内免疫功能的影响
在上述实施例7中，Tim-3-Ig干预荷瘤小鼠38天后我们获取了小鼠的脾细胞，用PCR的方法分别检测了各组中细胞因子IFN-r及TNF-a的表达，结果如图7所示，与对照相比Tim-3-Ig融合蛋白干预能显著升高免疫细胞因子的表达，并且Tim3-Ig融合蛋白的干预有剂量依赖性。
实施例9
本发明进一步提供了含Tim-3-Ig融合蛋白的制剂。
配方：Tim-3-Ig融合蛋白20mg／ml；蔗糖37mg/ml；磷酸钠0.35mg／ml；吐温-200.1mg／ml；氯化钠4mg／ml。
获得Tim-3-Ig融合蛋白的原液，原液中Tim-3-Ig融合蛋白的浓度应大于20mg／ml。配制制剂：根据原液的体积计算所需的蔗糖及吐温-20的用量(终浓度分别为37mg／ml及0.1mg／ml)，并加入原液中；调整溶液中所有组分的浓度如配方所示，获得半成品；将半成品无菌分装入西林瓶中，加盖橡胶塞，冷冻干燥，加盖铝塑盖，获得成品。
上述实施例显示，体外的实验结果表明Tim-3-Ig融合蛋白能增强人单核巨噬细胞(U937，THP-1)，人外周血单核细胞(PBMC)的活化；体内的研究表明该融合蛋白能通过阻断Tim-3的免疫抑制功能增强荷瘤小鼠的体内免疫反应，以剂量依赖的方式抑制肿瘤的生长。

Claims (9)

1.一种Ig融合蛋白，其特征在于，所述的Ig融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。
2.一种Ig融合蛋白，其特征在于，所述编码Ig融合蛋白的DNA序列如序列表中SEQ IDNO：2所示。
3.一种含有权利要求2中DNA分子的载体。
4.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3所述的载体。
5.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-2中任意一项所述的Ig融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由权利要求1-2中任意一项所述的Ig融合蛋白、保护剂、缓冲剂、表面活性剂和等渗调节剂组成。
7.权利要求1-2任意一项所述的融合蛋白在制备抑制结肠癌肿瘤的生长药物中的应用。
8.权利要求1-2任意一项所述的融合蛋白在制备提高结肠癌患者免疫细胞因子IFN-γ及TNF-α的表达的药物中的应用。
9.权利要求1-2任意一项所述的融合蛋白、权利要求3所述的载体在制备由Tim-3高表达所导致结肠癌的药物中的应用。
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