CN104292341B - 一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法和用途。本发明的融合蛋白所述融合蛋白从N端到C端依次含有B区缺失的凝血八因子、连接肽和人IgGFc变体。在本发明中，在B区缺失的凝血八因子和人IgGFc变体之间添加特殊设计的连接肽，可以使Fc区域远离B区缺失的凝血八因子分子的酶活性中心，从而提高融合蛋白的体外生物活性，且人的IgG Fc变体在CH2区域的228、235、445位点含有氨基酸突变，从而降低抗体Fc片段的ADCC效应功能。与现有的同类产品比较，具有类似或更高的体外生物活性、更低的vWF蛋白的结合力、更长的半衰期、更长的给药间隔以及更低的用药剂量。

Description

一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

甲型血友病是一种先天性由凝血第八因子缺乏引起的出血性疾病，亦即是由于X-染色体关联的基因缺陷引起的体内凝血八因子的功能缺失，病人表现为创伤之后凝血功能障碍和反复自发性出血，逐渐导致软组织和关节腔受损而残废，其发病率为每十万分人口15～20。

甲型血友病最有效的治疗方法是输入正常人血浆、血浆来源的浓缩人凝血第八因子制剂或基因重组来源的凝血第八因子制剂，以达到治疗出血或者预防出血的目的。静脉输入基因重组凝血八因子制剂对甲型血友病患者进行预防性治疗的方案需要每周给药3次，每次给药剂量为每公斤体重25国际单位(25IU/kg)，以维持患者体内凝血八因子水平在正常人水平的1％以上。

欧美的发达国家都已经实现了用基因重组八因子对甲型血友病患者进行预防性用药，使这些患者可以免受病痛的困扰，和正常人一样地生活和工作。美国百特(Baxter)和拜耳(Bayer)两大公司最先推出全长的基因重组八因子。随后美国辉瑞(Pfizer)公司随后推出B区缺失的八因子，这种产品的蛋白序列去除了八因子序列中无生物学功能的B区，从而使八因子的分子量降低了38％，这种修饰不影响八因子的凝血功能，但在哺乳动物细胞表达水平上有显著提高。无论全长还是B区缺失的八因子都需要每周3次给药才能达到预防性用药的目的。

2014年美国百健艾代公司推出了第一个长效八因子Eloctate，Eloctate是B区缺失的八因子与抗体Fc片段连接形成的融合蛋白rFVIII-Fc。融合蛋白的半衰期在凝血八因子基因敲除的小鼠模型中为13.7小时，较原型八因子制剂的半衰期提高近一倍。在人体中的半衰期较原型八因子提高了80％，给药周期也从2天一次延长至3-5天给药一次，每次给药剂量为每公斤体重50国际单位(50IU/kg)。第一次实现了甲型血友病预防性治疗的实质性进步。由于修饰后八因子Fc融合蛋白半衰期没有大幅提升，这种治疗方案把甲型血友病患者接受治疗的间隔延长了一倍左右，但是病人的总给药剂量没有改变，患者用药的负担也没有降低。

因此，设计功能更强的FVIII-Fc分子，从而在用于预防性治疗甲型血友病中可以降低给药剂量或者延长给药间隔时间，是本发明要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种凝血八因子融合蛋白及其制备方法和用途。本发明的融合蛋白与现有的同类产品比较，具有类似或更高的体外生物活性、更低的vWF蛋白的结合力、更长的半衰期、更长的给药间隔以及更低的用药剂量。

本发明的第一方面提供了一种凝血八因子融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次含有B区缺失的凝血八因子、连接肽和人IgGFc变体。

优选地，所述融合蛋白中，所述连接肽存在于B区缺失的凝血八因子和人IgGFc变体之间。

更优选地，所述融合蛋白中，含有两个IgG Fc变体，其中一个IgGFc变体的N端与所述B区缺失的凝血八因子的C端通过所述连接肽连接，形成含有B区缺失的凝血八因子的IgGFc变体，所述含有B区缺失的凝血八因子的IgG Fc变体的C端与另外一个IgG Fc变体的N端以二硫键连接。

优选地，所述融合蛋白中，所述B区缺失的凝血八因子是将原型全长凝血八因子(NP_000123.1)743-1635aa的B区序列删除并替换为新的14aa的融合多肽“SFSQNPPVLKRHQR”所得。亦即，所得B区缺失的凝血八因子的轻链与原型全长八因子的轻链相同，为原型全长八因子的1648到2332aa；所得B区缺失的凝血八因子的重链为原型八因子的重链后面加14aa的融合多肽“SFSQNPPVLKRHQR”。

优选地，所述B区缺失的凝血八因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述融合蛋白中，所述人IgGFc变体为IgG1Fc，IgG2Fc，IgG3Fc或IgG4Fc变体。

更优选地，所述人IgGFc变体为IgG4 Fc变体，所述IgG4 Fc变体是非裂解性的，且与天然IgG4 Fc相比含有氨基酸突变。

优选地，所述IgG4 Fc变体含有IgG4铰链区、CH2和CH3区域。其CH2区域在228、235和445位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，从而降低Fc的效应子功能。更优选地，所述氨基酸突变为S228P、L235E和L445P突变。

优选地，所述IgG4 Fc变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述融合蛋白中，所述连接肽含有2～31个氨基酸，且所述的连接肽含有两个或更多选自甘氨酸和丝氨酸的氨基酸。

优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-8所示，具体为：

GSGGGS(SEQ ID NO.3)；

GSGGGSGGGGS(SEQ ID NO.4)；

GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.5)；

GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.6)；

GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.7)；

或GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.8)。

更优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，

具体为：GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.5)。

在本发明中，在B区缺失的凝血八因子和人IgGFc变体之间添加特殊设计的连接肽，可以使Fc区域远离B区缺失的凝血八因子分子的酶活性中心，从而提高融合蛋白的体外生物活性，且人的IgG Fc变体在CH2区域的228、235、445位点含有氨基酸突变，从而降低抗体Fc片段的ADCC效应功能。

优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9-14所示。

优选地，所述融合蛋白在摩尔基础上，具有与B区缺失的凝血八因子类似或更高的体外生物活性、更长的半衰期、更长的给药间隔和更低的给药剂量。

本发明第二方面提供了一种多核苷酸，其编码本发明的第一方面所述融合蛋白。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。

编码所述融合蛋白的多核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等，科学出版社，1995)。包括但不限于重组DNA技术、化学合成等方法。

在本案的较佳实施例中，所述融合蛋白，其核苷酸编码序列如SEQID NO.15-20所示。其对应的蛋白氨基酸序列如SEQID NO.9-14所示。

本发明第三方面提供了一种表达载体，其含有所述多核苷酸。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述载体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码所述融合蛋白的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。

较佳的，所述载体为原核载体或穿梭质粒，如原核载体pIRES-DHFR质粒等。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其被所述载体所转化。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门菌、李斯特细菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO,COS.293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

其中，特别优选CHO细胞，其可良好地表达本发明的融合蛋白，可获得结合性良好、稳定性良好的融合蛋白。

本发明第五方面公开了所述融合蛋白的制备方法，包括下列步骤：

1)获得编码融合蛋白的融合基因序列；

2)将获得的融合基因序列插入到合适的表达载体中，得到相应的核酸构建体；

3)将获得的核酸构建体转染适宜的宿主细胞；

4)在适宜的培养条件下，培养步骤3)的转染细胞，并从中分离纯化所表达的融合蛋白。

优选地，步骤1)中，所述融合基因序列如SEQID NO.15-20所示。

优选地，步骤2)中，所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体，如商业PET系列载体和国内外广泛使用的PBV220载体，pIRES-DHFR质粒。

优选地，步骤3)中，所述宿主细胞为CHO细胞，更优选为CHO-DXB11细胞。

优选地，步骤4)中，分离纯化的方法具体为：先将细胞培养液离心后使用离子交换层析，包括阴离子交换层析或阳离子交换层析捕获大量的融合蛋白，然后通过八因子亲和层析纯化得到纯度超过90％的融合蛋白后，再利用离子交换层析包括阴离子交换层析或阳离子交换层析精细纯化，最后通过凝胶过滤层析进一步精细纯化得到最终产品。

本发明第六方面提供了一种提高前述融合蛋白的表达量的方法，所述方法包括：

1)获得编码融合蛋白的融合基因序列；

2)将获得的融合基因序列插入到合适的表达载体中，得到相应的核酸构建体；

3)将获得的核酸构建体转染适宜的宿主细胞；

4)在适宜的培养条件下，培养步骤3)的转染细胞，并从中分离纯化所表达的融合蛋白。

优选地，步骤1)中，所述融合基因序列如SEQID NO.15-20所示。

优选地，步骤2)中，所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体，如商业PET系列载体和国内外广泛使用的PBV220载体，pIRES-DHFR质粒。

优选地，步骤3)中，所述宿主细胞为CHO细胞，更优选为CHO-DXB11细胞。

优选地，步骤4)中，分离纯化的方法具体为：先将细胞培养液离心后使用离子交换层析，包括阴离子交换层析或阳离子交换层析捕获大量的融合蛋白，然后通过八因子亲和层析纯化得到纯度超过90％的融合蛋白后，再利用离子交换层析包括阴离子交换层析或阳离子交换层析精细纯化，最后通过凝胶过滤层析进一步精细纯化得到最终产品。

本发明第七方面，提供了所述的融合蛋白或其编码基因在制备治疗甲型血友病药物中的用途。

本发明第八方面，提供了一种药物组合物，含有有效剂量的可溶性的所述凝血八因子融合蛋白或其编码基因及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。

本发明所提供的药物组合物可以多种剂型存在，如用于静脉注射等的注射剂，用于皮下注射、表皮外敷等的经皮吸收剂，用于喷鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的喷雾剂，用于滴鼻、眼、耳等的滴剂，用于肛肠等的栓剂、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式，及肺部给药制剂及其他非肠道给药的组合物。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。该药用组合物还可以加入香味剂、甜味剂等。

如上所述的融合蛋白的药物制剂可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以经静脉注射或者口、鼻、皮肤、肺吸入等途径给药。上述药物的优选剂量为50IU/kg体重，每4天给药一次，优选的疗程为40至60天。无论采用何种给药方法，个体人的最佳剂量应根据具体的治疗而定。

本发明的有益效果为：

(1)本发明的融合蛋白的比活与原型B区缺失八因子蛋白相比都有显著差异(P<0.01)，而含有不同长度连接肽的B区缺失的凝血八因子Fc融合蛋白(包括在实验室表达与Eloctate相同序列的融合蛋白)之间比活性没有显著差异。

(2)我们惊奇地发现，本发明应用修饰后的抗体IgG4-Fc片段，并在与B区缺失八因子序列连接的接头部位插入不同长度的富含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的连接肽序列所得到B区缺失八因子Fc融合蛋白(SEQ ID NO.9-14)，与已上市的原型B区缺失八因子对比，与vWF蛋白的结合力进一步降低，半衰期都有显著延长。特别是含有GSGGGSGGGGSGGGGS连接肽的B区缺失八因子融合蛋白(SEQ ID NO.11)ka降低最明显，具有最低的与vWF结合的能力；在其体外和动物体内生物学活性较现有最优的美国百健公司的已推出产品Eloctate都有明显提升。该融合蛋白是较现有最优的长效凝血八因子产品Eloctate功能更强的FVIII-Fc分子，如果应用在人体实验可能进一步延长给药间隔，同时有可能降低给药剂量。

附图说明

图1：本发明的分离纯化后的融合蛋白SDS-PAGE变性电泳鉴定结果，其中1号泳道为亲和层析分离后的八因子融合蛋白，2号泳道为通过精细分离得到的八因子融合蛋白。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本发明设计思路：在本发明中，B区缺失的凝血八因子可以通过不同柔性连接肽与不同的IgGFc变体连接，形成融合蛋白。

首先，所述B区缺失的凝血八因子，是将原型全长凝血八因子(NP_000123.1)743-1635aa的B区序列删除并替换为新的14aa的融合多肽“SFSQNPPVLKRHQR”所得。亦即，所得B区缺失的凝血八因子的轻链与原型全长八因子的轻链相同，为原型全长八因子的1648到2332aa；所得B区缺失的凝血八因子的重链为原型八因子的重链后面加14aa的融合多肽“SFSQNPPVLKRHQR”。所述B区缺失的凝血八因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；B区缺失的凝血八因子简写为：BDD-FVIII。

其次，柔性连接肽序列的氨基酸数目从2个到31个，主要为甘氨酸(G)和丝氨酸(S)相互组合。

含有6个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGS，命名为“L1”(SEQ ID NO.3)；

含有11个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGS，命名为“L2”(SEQ ID NO.4)；

含有16个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGS，命名为“L3”(SEQ IDNO.5)；

含有21个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS，命名为“L4”(SEQID NO.6)；

含有26个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS，命名为“L5”(SEQ ID NO.7)；

含有31个氨基酸的柔性连接肽序列为GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS，命名为“L6”(SEQ ID NO.8)。

再次，IgG4 Fc变体来源于免疫球蛋白IgG4的恒定区，它在消灭病原体的免疫防御中起重要作用。Fc融合主要是为了增加它的体内循环半衰期和降低生产成本，而Fc介导的“抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用”(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，ADCC)功能是不必要的，甚至可能产生有害副作用。为了得到不具ADCC效应子功能的非裂解性Fc，最有效方法是在天然Fc片段中的进行氨基酸突变，以减少或去除ADCC效应子功能。我们优选的人的IgG4的Fc片段对其三个位点进行了修饰，其中第一个修饰是Fc氨基酸序列按照EU编号系统的S228P，此修饰可以稳固链间二硫键的结构从而达到稳定二聚体结构的作用；第二个修饰是EU编号系统的L235E，此修饰彻底消除Fc片段FcγR的结合，从而将ADCC降到最低。第三个修饰是EU编号系统的L445P，这个修饰使IgG4的Fc的C端氨基酸序列与IgG1和IgG2的Fc的C端氨基酸序列相同，从而增加C端氨基酸序列的均一性。我们这个修饰后的Fc序列命名为“IgG4(S228P，L235E，L445P)(SEQ ID NO.2)”，其中IgG4后面括号中的氨基酸根据EU编号。

本发明所采用的对照融合蛋白分别为：美国辉瑞公司的Xyntha和美国百健艾代公司的Eloctate，均可通过购买获得。其中，美国百健艾代公司的Eloctate的基因编码序列如SEQ ID NO.30，氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示，本领域技术人员根据自己的专业知识即可构建获得该融合蛋白。

含有不同长度连接肽序列的B区缺失的凝血八因子Fc融合蛋白的代码结构如下：

实施例1获得编码融合蛋白的融合基因序列

采用如下方法获得本发明的6个融合蛋白F8-L1-Fc、F8-L2-Fc、F8-L3-Fc、F8-L4-Fc、F8-L5-Fc、F8-L6-Fc各自所对应的编码DNA的基因序列：

以B区缺失八因子的cDNA为模板，通过PCR扩增获得B区缺失八因子的基因序列(并将B区缺失八因子基因序列C端的翻译终止密码子变异成为BamHI)，两端酶切位点为XbaI，BamHI。上游引物是tggtgaactctctagaccca(SEQ ID NO.21)，下游引物是tggtgaactctctagaccca(SEQ ID NO.22)。

以IgG4的cDNA为模板，通过PCR扩增获得含有不同连接肽的IgG4Fc基因序列，两端酶切位点为BamHI，MluI。其中，

扩增含有L1的IgG4Fc基因序列的上游引物是：tacggatccggtggcggttcctctaagtacgggccccctt(SEQ ID NO.23)；

扩增含有L2的IgG4Fc基因序列的上游引物是：

tacggatccggtggcggttccggtggaggcggaagctctaagtacgggcccccttg(SEQ IDNO.24)；

扩增含有L3的IgG4Fc基因序列的上游引物是：

tacggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcatctaagtacgggccccc(SEQ ID NO.25)；

扩增含有L4的IgG4Fc基因序列的上游引物是：

ctacggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcaggaggcggtggctcttctaagtacgggccccc(SEQ ID NO.26)；

扩增含有L5的IgG4Fc基因序列的上游引物是：

ctacggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcaggaggcggtggctctggaggtggtggaagttctaagtacgggccccc(SEQ ID NO.27)；

扩增含有L6的IgG4Fc基因序列的上游引物是：

tacggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcaggaggcggtggctctggaggtggtggaagtggtggcggcggttcgtctaagtacgggccccc(SEQ ID NO.28)；

扩增含有L1、L2、L3、L4、L5或L6的IgG4Fc基因序列的下游引物是：

cgcacgcgtctcgagctattatttg(SEQ ID NO.29)。

将PCR获得的上述含有不同连接肽的IgG4Fc基因序列用BamHI和MluI进行酶切，克隆到所得B区缺失八因子基因序列的C端，得到编码各个融合蛋白的融合基因。

采用基因测序方法对获得的融合基因片段进行鉴定，DNA测序结果与预期序列完全相同。

融合蛋白代码	融合基因序列
		F8-L1-Fc	SEQ ID NO.15
F8-L2-Fc	SEQ ID NO.16
		F8-L3-Fc	SEQ ID NO.17
F8-L4-Fc	SEQ ID NO.18
		F8-L5-Fc	SEQ ID NO.19
F8-L6-Fc	SEQ ID NO.20
		Eloctate	SEQ ID NO.30

实施例2 表达载体的构建

本发明采用双质粒共转染的方法，将编码融合蛋白的融合基因导入宿主细胞进行表达。因此，首先构建双质粒表达载体。

具体方法为：将实施例1中所获得的B区缺失八因子Fc融合蛋白编码序列(融合基因)分别同时克隆至两个pIRES-DHFR(简称pID)表达载体中，所用克隆位点分别是NheI和MluI。第一质粒在CMV启动子的驱动下表达简单Fc序列(即不含B区缺失八因子的Fc序列)，即Eloctate的IgG1-Fc或本发明各融合蛋白的IgG4-Fc(S228P，L235E，L445P)序列，构建pID-Fc表达载体；第二个质粒也由CMV启动子的驱动，表达含B区缺失八因子的Fc序列，即Eloctate的BDD-FVIII-IgG1-Fc或本发明各融合蛋白的BDD-FVIII-IgG4-Fc(S228P，L235E，L445P)序列，构建pID-8Fc表达载体。

实施例3 CHO工程细胞株的建立

利用大肠杆菌扩增上述表达载体。抽提质粒后，用脂质体转染的方法将pID-Fc与pID-8Fc两个表达载体共同转入到CHO-DXB11细胞中进行表达。

具体方法为：在6孔板进行，CHO-DXB11空白细胞以1：10传代至6孔板内，由于CHO-DXB11细胞是DHFR基因缺失的，需要用含10％FBS和1xHT的DMEM培养基进行培养。当细胞融合率达到90％时进行转染试验。首先移除细胞培养液，向每个孔里加2毫升新鲜FBS+HT培养液。将2微克pID-Fc质粒与12微克pID-8Fc质粒进行混合，再将获得的14微克混合质粒DNA稀释至150微升DMEM培养基，12微升Lipofectamine试剂稀释至150微升DMEM培养基，将质粒DNA和Lipofectamine试剂混合后室温静置20分钟，然后均匀加入6孔板的细胞培养液中，然后放入37C细胞培养箱进行培养。6小时后移除培养液，换成2毫升新鲜FBS+HT培养基。24小时后，用胰酶消化细胞后用新鲜10％FBS+HT的DMEM培养基悬浮，以1：5稀释到两个T25方瓶中继续培养。培养24小时后用无HT的10％FBS培养基继续培养，每2-3天进行一次换液，大约3周后阳性细胞形成细胞簇，此时进行针对凝血八因子蛋白的Elisa检测，同时用稀释法将细胞传代到96孔板中，2-3周后，单克隆可以从96板中挑选出来，传代到T25中加压培养。首先用含有100nM的MTX的培养液加压培养，大约2周细胞适应100nM的MTX后，细胞冻存，然后继续以250nM，500nm，1000nM的MTX压力继续培养，同时用点印迹，WB和针对凝血八因子蛋白的Elisa方法进行筛选，最终挑选出3-6株细胞进行无血清驯化。应用这些细胞株生产融合蛋白。

实施例4 融合蛋白的表达和纯化

表达不同B区缺失八因子Fc融合蛋白的细胞株能够适应在无血清培养基中悬浮培养后，以2x10⁵密度传代至1L摇瓶中，温度37C，5％的CO₂环境中，120RPM摇床培养至密度达到4x10⁶，将温度降低至32C，每天补充葡萄糖、氨基酸等养料，5-6天后细胞活率降低至80-85％停止培养。将细胞液2000RCF离心取出细胞后，再5000RCF离心取上清进行蛋白纯化。

B区缺失八因子Fc融合蛋白的纯化与原型B区缺失八因子蛋白的纯化步骤基本相同，即细胞培养液离心后首先使用离子交换层析，包括阴离子交换层析或阳离子交换层析捕获大量的B区缺失八因子Fc融合蛋白紧接着通过八因子亲和层析特别是使用GE公司的亲和介质VIIISelect或者是rProteinA或MabSelectSure纯化，亲和层析得到纯度超过90％的八因子后紧接着利用离子交换层析包括阴离子交换层析或阳离子交换层析精细纯化，最后通过凝胶过滤层析进一步精细纯化得到最终产品。

最优的纯化方案为离心过滤后的B区缺失八因子Fc融合蛋白首先利用GE公司的QFF阴离子交换层析粗分离，平衡缓冲液为20mM组氨酸,0.15M NaCl,10mM CaCl2,0.02％Tween80,1M甘氨酸,pH6.8，洗脱缓冲液为20mM组氨酸,0.8M NaCl,10mM CaCl2,0.02％Tween80,pH6.8。收集第一步QFF洗脱液后采用GE公司的VIIISelect亲和层析纯化，50mM组氨酸,0.15M NaCl,5mM CaCl2,0.02％Tween80,0.7M精氨酸,50％丙二醇pH6.8洗脱，洗脱后的样品进一步精细纯化。收集的亲和洗脱样品利用GE公司的Source30Q阴离子交换精细分离，平衡液为20mM组氨酸,,0.15M NaCl,5mM CaCl2,pH6.8，洗脱液为20mM组氨酸,,1MNaCl,5mM CaCl2,pH6.8，最后的产品通过凝胶过滤层析GE公司的S300HR分离，凝胶过滤流动相为20mM组氨酸,,1M NaCl,5mM CaCl2,2％蔗糖，0.02％Tween80pH6.8。

B区缺失八因子Fc融合蛋白的蛋白定量用两种方法完成，相互对照，即lowry法和BCA法，方法为公知的通用实验方法，可参考分子克隆实验指南。

实施例5 融合蛋白的鉴定

将实施例4中纯化后的融合蛋白进行常规SDS-PAGE变性电泳鉴定，染色后扫描测，图1是纯化后融合蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定照片，其中1号泳道为亲和层析分离后的八因子融合蛋白，2号泳道为通过精细分离得到的八因子融合蛋白。如图1所示，融合蛋白含有四条条带，分别为分子量210kDa的非活化八因子融合蛋白条带，110kDa左右的八因子轻链加Fc融合条带，90kDa的八因子重链条带及35kDa左右的游离Fc条带，融合蛋白的总分子量为240kDa。

与此同时，所得融合蛋白的氨基酸序列，如下表所示：

融合蛋白代码	融合基氨基酸序列
		F8-L1-Fc	SEQ ID NO.9
F8-L2-Fc	SEQ ID NO.10
		F8-L3-Fc	SEQ ID NO.11
F8-L4-Fc	SEQ ID NO.12
		F8-L5-Fc	SEQ ID NO.13
F8-L6-Fc	SEQ ID NO.14

Eloctate

SEQ ID NO.31

实施例6 融合蛋白的活性测定：一步法血液凝固实验

一步法血液凝固实验按照试剂盒厂商提供的操作步骤进行，现将凝血八因子标准品利用OK液(试剂盒提供)不稀释和稀释2倍，4倍，8倍，亦即所对应的凝血八因子的浓度具体为分别为1IU/ml,0.5IU/ml,0.25IU/ml,0.125IU/ml，然后添加APTT和氯化钙溶液(试剂盒提供)，利用法国思塔高的半自动凝血仪做出标准曲线，然后将我们所表达的出的B区缺失八因子Fc融合蛋白利用OK液稀释，稀释后的溶液添加APTT和氯化钙溶液，利用法国思塔高的半自动凝血仪检测凝血时间，通过自动拟合的标准曲线定量凝血活性单位。

蛋白代码	比活性(一步法凝血活性/毫克蛋白)
		Xyntha(辉瑞公司产品)	10124±852
F8-L1-Fc	8541±697
		F8-L2-Fc	7970±832
F8-L3-Fc	8632±906
		F8-L4-Fc	8390±799
F8-L5-Fc	8529±825
		F8-L6-Fc	8652±912
Eloctate(实验室表达)	8755±855

原型B区缺失八因子蛋白比活与任何Fc融合蛋白相比都有显著差异(P<0.01)，含有不同长度连接肽的B区缺失八因子Fc融合蛋白(包括在实验室表达与Eloctate相同序列的融合蛋白)之间比活性没有显著差异。

实施例7 表面等离子体共振分析方法测定与vWF蛋白的结合

B区缺失八因子Fc融合蛋白与vWF蛋白的结合力用Biacore T100仪器进行检测。大约500共振单位人血浆中纯化的vWF因子在PH5条件下用氨基偶联法固定于CM5芯片的检测池中。B区缺失八因子或者不同B区缺失八因子Fc融合蛋白分别以单循环动力学模式以每分钟25微升的速率运行240秒，浓度递增为0.13，0.32，0.8，2.0，5.0nM，最后以时长为1200秒的解离步骤结束。结合与解离溶液含有6.7mM的L-组氨酸、5.3mM CaCl₂,205mM NaCl,1.3％蔗糖,and 0.013％聚山梨醇脂，pH 7.0。芯片再生溶液含有0.6M NaCl and 0.35M CaCl₂。

从B区缺失八因子、不同B区缺失八因子Fc融合蛋白与vWF蛋白的结合力数据分析，含有B区缺失八因子序列的蛋白与vWF结合的解离系数(kd)变化不大，而两者的亲和系数(ka)有较大的差别。与原型B区缺失八因子相比，不同B区缺失八因子Fc融合蛋白与vWF蛋白结合的亲和系数(ka)都有显著降低(p<0.01)，表明B区缺失八因子与抗体Fc片段融合后与vWF蛋白结合能力降低。我们惊奇地发现，在融合蛋白序列中B区缺失八因子与抗体Fc片段之间增加连接肽对融合蛋白与vWF蛋白的结合力进一步降低，以含有L3的B区缺失八因子Fc融合蛋白ka降低最明显，说明含有L3的B区缺失八因子Fc融合蛋白具有最低的与vWF结合的能力。

实施例8 融合蛋白在八因子敲除小鼠体内药效学实验

甲型血友病小鼠动物模型(HemA小鼠)(购自上海南方模式生物研究中心)，这种小鼠携带有八因子基因第16外显子敲除。不同含有八因子序列的融合蛋白按照每公斤体重125IU进行静脉给药，给药后5分钟和分别在1,、4、8、16、20、24、32小时从静脉插管中取血液样品，并立即用10％体积的4％枸橼酸钠溶液混合后在干冰上速冻，放置于-80C超低温保存。

所有样品的凝血活性用显色法八因子活性试剂盒说明书提供的方法进行检测，根据给药浓度和在不同时间点血液中凝血八因子的活性计算不同分子的半衰期。具体实验数据结果如下：

从实验数据可以看出，与已上市的原型B区缺失八因子对比，B区缺失八因子Fc融合蛋白的半衰期都有显著延长，而且含有L3连接肽的B区缺失八因子融合蛋白对比不含有连接肽的Eloctate蛋白的半衰期延长更加明显，如果应用在人体实验可能进一步延长给药间隔，同时有可能降低给药剂量。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (7)

1.一种凝血八因子融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次含有B区缺失的凝血八因子、连接肽和人IgGFc变体；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

2.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述融合蛋白。

3.一种表达载体，其含有权利要求2所述多核苷酸。

4.一种宿主细胞，其被权要求3所述载体转化。

5.一种如权利要求1所述融合蛋白的制备方法，包括下列步骤：

1)获得编码融合蛋白的融合基因序列；

2)将获得的融合基因序列插入到合适的表达载体中，得到相应的核酸构建体；

3)将获得的核酸构建体转染适宜的宿主细胞；

4)在适宜的培养条件下，培养步骤3)的转染细胞，并从中分离纯化所表达的融合蛋白。

6.如权利要求1所述融合蛋白或其编码基因在制备治疗甲型血友病药物中的用途。

7.一种药物组合物，含有有效剂量的如权利要求1所述的凝血八因子融合蛋白及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。