CN104379603B - Tlr3结合剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗‑TLR3抗体以及制备和使用它们的方法。所述抗体特别适合用于使用抗‑TLR3抗体治疗自身免疫疾病或炎性疾病。

Description

TLR3结合剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年5月31日提交的美国临时申请号61/653,652、2012年7月11日提交的美国临时申请号61/670,289和2012年8月6日提交的美国临时申请号61/679,923的权益；它们都通过引用整体并入本文；包括所有附图。
对序列表的引用
本申请与电子格式的序列表一起提交。所述序列表作为标题为“PCT Seq listTLR3-4_ST25”的文件提供，该文件创建于2013年5月29日，大小为46KB。电子格式的序列表中的信息通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及结合TLR3并抑制TLR3信号传递的抗体(例如单克隆抗体)、抗体片段、及其衍生物。本发明还涉及产生这样的抗体的细胞；制备这样的抗体的方法；所述抗体的片段、变体和衍生物；包含它们的药物组合物；使用所述抗体来诊断、治疗或预防疾病例如自身免疫疾病、炎性疾病等的方法。
背景技术
果蝇toll蛋白控制着背腹模式形成，并且被认为代表一种古老的宿主防御机制。在人类中，TLR被认为是先天性免疫的一种重要组分。人和果蝇Toll蛋白序列显示出在蛋白链的整个长度上的同源性。人Toll-样受体的家族包括10种高度保守的受体蛋白TLR1-TLR10。与果蝇toll类似，人TLR是具有细胞外结构域和细胞质结构域的I型跨膜蛋白，所述细胞外结构域由富亮氨酸重复序列(LRR)结构域组成并识别病原体相关的分子模式(PAMP)，所述细胞质结构域与人白介素-1(IL-1)受体的细胞质结构域同源。类似于果蝇toll和IL-1受体二者的信号传递途径，人Toll-样受体通过NF-κB途径传送信号。
尽管不同哺乳动物的TLR共有许多特征和信号转导机制，但是它们的生物学功能是非常不同的。这部分地归因于以下事实：四种不同衔接分子(MyD88、TIRAP、TRIF和TRAF)以不同的组合与TLR相结合并且介导不同的信号传递途径。另外，同一个TLR的不同配体可能优选地活化不同的信号转导途径。此外，TLR在不同的造血细胞和非造血细胞中差异性地表达。因此，对TLR配体的应答不仅取决于被TLR活化的信号途径，而且取决于在其中表达单独TLR的细胞的性质。
由于Toll-样受体3(TLR3)信号传递已经涉入炎性以及自身免疫性病症，所以TLR3作为治疗靶标已经受到显著关注。专利申请WO98/50547提供了hTLR3蛋白的核酸和氨基酸序列。DeBouteiller等人(2005)J.Biol.Chem.280(46):38133-38145)公开了抗-TLR3抗体结合细胞表面TLR3的用途。抗体C1130据称对TLR3具有活化性，并且已经在WO 2007/051164中进行了描述。在Cavassani等人(2008)J.Exp.Med.205:2609-2621中描述了抑制TLR3的多克隆抗体。WO 03/106499和Matsumoto等人(2003)J.Immunol.171:3154-3162描述了与抗体克隆TLR3.7(eBioScience Inc.,San Diego)对应的抗体，据报道该抗体结合并且抑制细胞表面TLR3，而不结合细胞间隔TLR3或髓系DC中的TLR3。WO 06/060513描述了抗体C1068，该抗体据报道抑制上皮细胞中的细胞因子产生，所述上皮细胞据报道在细胞表面上表达TLR3。PCT专利申请WO2010/051470提供了抗-TLR3抗体。用于研究用途的其它抗-TLR3抗体包括得自R&D Systems Corp.的多克隆抗-TLR3抗体、得自Abcam的抗体40C1285、以及都得自Imgenex Corp.的抗体619F7、713E4、716G10、IMG-5631和-IMG-5348。
但是，在目前可得到的抗-TLR3抗体中，它们并非最佳地适合用作治疗剂，例如用于在体内调节TLR3。例如，许多遭受效力或对它们的表位的亲和力的缺乏。因此需要提供改进的针对TLR3的抗体。
发明内容
本发明源自包含特异性地结合人TLR3并抑制人TLR3的功能的单克隆抗体的新组合物和使用所述单克隆抗体的方法的发现，所述单克隆抗体包括、但不限于抗体片段和衍生物。
本发明提供了具有新性能的抗体，所述新性能可用于在体内靶向TLR3。由于TLR3结合它的天然配体(dsRNA)并排它地在巨噬细胞和树突细胞(DC)内的胞内体中传递信号(在酸性pH)，以前已经基于在发生信号传递时的胞内体pH处的高亲和力而选择抗体。但是，关于抗-TLR3抗体进入细胞中的机制知之甚少。本发明提供了这样的抗体：其在pH中性环境中对暴露于细胞表面的TLR3具有强结合，并且其表现出改善的TLR3抑制效能。因此，优化细胞表面表达的TLR3的结合，可以成为可能调节下游(或总)生物活性的细胞的细胞(胞内体)摄入的重要标准。本发明的抗体表现出对人细胞表面TLR3的强结合，如在这样的测定中所观察到的：在所述测定中，在中性pH条件下排它地在细胞表面处表达TLR3。以此方式，选择具有改善的细胞表面结合的抗体。因此，通过受体从它们的配体分离以后在胞吞作用中涉及的胞内体TLR3多肽向细胞表面的回循环，可以控制抗-TLR3抗体的抑制活性。
在一个方面，本发明提供了一种抗体，其抑制表达TLR3的细胞中TLR3介导的信号传递，其中所述抗体特异性地结合仅在细胞表面处表达的人TLR3多肽，任选地在中性pH。就结合仅在细胞表面处表达TLR3的细胞而言，所述抗体任选地具有不超过0.3μg/ml的EC50，任选地不超过0.2μg/ml，任选地不超过0.1μg/ml。
在一个方面，本发明提供了这样的抗体：其结合TLR3蛋白的N-端部分，该部分至少部分地(或主要地或排它地)在TLR3多肽的无聚糖侧表面(被dsRNA结合的面)上，且任选地此外至少部分地在人TLR3多肽的N-端dsRNA结合位点内。任选地，所述抗体至少部分地在TLR3多肽的N-端部分的主链内进一步结合TLR3。
尽管已经证实TLR3上的一些先前表位可用于TLR3的有效抑制，表位不一定保持存在于非人灵长类动物中。在一个方面，本发明提供了这样的抗体：其通过结合人TLR3蛋白的N-端部分而抑制TLR3多肽活性，并且其也结合非人灵长类动物TLR3。在一个方面，本发明提供了这样的抗体：其结合TLR3蛋白的N-端部分，并且其不与dsRNA竞争对人TLR3的结合，其中所述抗体也结合非人灵长类动物TLR3多肽(在非人灵长类动物-TLR3-表达细胞中)。在一个方面，本发明提供了这样的抗体：其结合TLR3蛋白的N-端部分，并且其与dsRNA竞争对人TLR3多肽的N-端dsRNA结合位点的结合，其中所述抗体也结合非人灵长类动物TLR3多肽(在非人灵长类动物-TLR3-表达细胞中)。在一个实施方案中，所述抗体至少部分地(或主要地或排它地)在TLR3多肽的无聚糖侧表面(被dsRNA结合的面)上。在一个实施方案中，所述抗体至少部分地在人TLR3多肽的N-端dsRNA结合位点内结合TLR3。在一个实施方案中，所述非人灵长类动物是食蟹猴。在一个实施方案中，所述非人灵长类动物TLR3多肽包含在NCBI登录号BAG55033中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
在一个方面，本发明提供了这样的抗体：其结合人TLR3蛋白的N-端部分，特别是在SEQ ID NO:1的人TLR3的残基41-251内，任选地至少部分地在残基41-139、41-120或残基41-89内。
在一个方面，本发明提供了结合人TLR3蛋白的N-端部分的抗体，其中与所述抗体和SEQ ID NO:1的野生型TLR3多肽之间的结合相比，所述抗体具有减小的与在它的N-端部分中具有突变的TLR3多肽的结合，所述N-端部分在与SEQ ID NO:1的残基41-139对应的段中。
任选地，本发明的抗体干扰dsRNA与人TLR3多肽的N-端dsRNA结合位点的结合。任选地，所述抗体结合在TLR3多肽的无聚糖侧表面内的涉入TLR3多肽与dsRNA的结合的一个或多个氨基酸残基和/或与其邻近的残基。
任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含SEQ ID NO:1的残基64和/或残基65，和/或具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基64和/或残基65处的突变的TLR3多肽的结合。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含SEQ ID NO:1的残基86和/或残基89，和/或具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基86和/或残基89处的突变的TLR3多肽的结合。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含SEQ ID NO:1的残基117和/或残基120，和/或具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基117和/或残基120处的突变的TLR3多肽的结合。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含SEQ ID NO:1的残基137和/或残基139，和/或具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基137和/或残基139处的突变的TLR3多肽的结合。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含SEQ ID NO:1的残基112、113和/或115，和/或具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基112、113和/或115处的突变的TLR3多肽的结合。
在一个实施方案中，所述抗体具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基117和/或残基120处的突变的TLR3多肽的结合，和减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基137和/或残基139处的突变的TLR3多肽的结合。任选地，所述抗体具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基117和/或残基120处的突变的TLR3多肽的结合，且不具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基137和/或残基139处的突变的TLR3多肽的结合。
在一个实施方案中，所述抗体具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基64和/或残基65处的突变的TLR3多肽的结合，和减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基137和/或残基139处的突变的TLR3多肽的结合。任选地，所述抗体具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基86和/或残基89处的突变的TLR3多肽的结合，和减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基137和/或残基139处的突变的TLR3多肽的结合。任选地，所述抗体不具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基117和/或残基120处的突变的TLR3多肽的结合。任选地，所述抗体不具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基112、113和/或115处的突变的TLR3多肽的结合。
任选地，所述抗体具有减小的对以下TLR3多肽的结合：含有在SEQ ID NO:1的残基64和/或残基65处的突变的TLR3多肽，含有在SEQ ID NO:1的残基86和/或残基89处的突变的TLR3多肽，和含有在SEQ ID NO:1的残基137和残基139处的突变的TLR3多肽。如通过与TLR3突变体的结合所证实的，所述抗体与以前描述的抗体的差别在于它们的表位。
在一个实施方案中，所述抗体具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基112、113和/或115处的突变的TLR3多肽的结合，和减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基137和/或残基139处的突变的TLR3多肽的结合。在一个实施方案中，所述抗体具有减小的对含有在SEQID NO:1的残基112、113和/或115处的突变的TLR3多肽的结合，和减小的对含有在SEQ IDNO:1的残基117和/或残基120处的突变的TLR3多肽的结合。在一个实施方案中，所述抗体具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基112、113和/或115处的突变的TLR3多肽的结合，减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基117和/或残基120处的突变的TLR3多肽的结合，和减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基137和/或残基139处的突变的TLR3多肽的结合。在一个实施方案中，所述抗体具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基112和/或113处的突变的TLR3多肽的结合，和减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基137处的突变的TLR3多肽的结合。任选地，所述抗体不具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基86和/或残基89处的突变的TLR3多肽的结合。任选地，所述抗体不具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基64和/或残基65处的突变的TLR3多肽的结合。
任选地，在本文中的任意实施方案中，所述抗体维持与含有在SEQ ID NO:1的残基116、145、182、196和/或残基171处的突变的TLR3多肽的结合(不具有减小的与其结合)。
在一个方面，本发明提供了这样的抗体：其干扰dsRNA与人TLR3多肽的结合。在一个方面，本发明提供了这样的抗体：其干扰dsRNA与人TLR3多肽的N-端dsRNA结合位点的结合。任选地，所述抗体与dsRNA竞争对人TLR3多肽的结合，例如，对人TLR3多肽的N-端dsRNA结合位点的结合。可以如下评估竞争：使用标准方法，例如Biacore测定，评估在有dsRNA存在下抗体是否结合固定化的TLR3，和/或在酸性条件下在有抗体存在下dsRNA是否结合固定化的TLR3。
任选地，所述抗体在体外测定中与dsRNA竞争对人TLR3多肽的结合，所述体外测定包括下述步骤：(i)使抗-TLR3抗体与TLR3多肽接触，从而得到与TLR3多肽结合的抗体，和(ii)使步骤(i)的与TLR3多肽结合的抗体与dsRNA接触，并评估dsRNA是否减少TLR3多肽与所述抗体的结合，其中结合的减少指示与dsRNA竞争人TLR3多肽。任选地，所述抗体在体外测定中与dsRNA竞争对人TLR3多肽的结合，所述体外测定包括下述步骤:(i)使TLR3多肽与dsRNA接触，从而得到与TLR3多肽结合的dsRNA，和(ii)使步骤(i)的与TLR3多肽结合的dsRNA与抗-TLR3抗体接触，并评估所述TLR3多肽是否结合dsRNA-TLR3多肽复合物，其中实质结合的缺乏指示与dsRNA竞争人TLR3多肽。任选地，所述抗体在体外测定中与dsRNA竞争对人TLR3多肽的结合，所述体外测定包括下述步骤:(i)将抗-TLR3抗体连接至固体支持物(例如，经由恒定结构域)，(ii)使所述抗体与TLR3多肽接触，从而得到与TLR3多肽结合的抗体，和(iii)使步骤(ii)的与TLR3多肽结合的抗体与dsRNA接触，并评估dsRNA是否减少TLR3多肽与所述抗体的结合，其中结合的减少指示与dsRNA竞争人TLR3多肽。
在本发明的任意实施方案的一个方面，所述抗体结合在细胞表面处表达的人TLR3多肽(任选地如在中性pH下在细胞表面处排它地表达TLR3的细胞中所评估的)，内化进表达TLR3的细胞中，和抑制细胞(例如表达TLR3的人树突细胞)中的TLR3信号传递。
在一个方面，在中性条件下和具体地在细胞胞质溶胶中遇到的代表性条件下，所述抗体结合人TLR3多肽。这样的中性条件通常特征在于6.6-7.4的pH，例如在细胞胞质溶胶中发现的7.2的弱碱性pH。就在中性pH结合TLR3多肽而言，所述抗体任选地具有不超过10-9M的KD，任选地小于10-10M，任选地小于10-11M。任选地，在中性条件的结合具有比在酸性条件下更好的亲和力，例如在中性条件下与TLR3结合的KD比酸性条件降低了至少0.5-、1.0-、1.5-或2.0-log10。
本发明进一步提供了特异性抗体，其具有比以前报道的抗体增加的活性。在本发明的任意实施方案的一个方面，任选地在酸性条件和/或中性条件下，所述抗体与单克隆抗体11E1、7G11、31F6、32C4和37B7中的任一种或任意组合竞争对TLR3多肽(例如包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的人TLR3多肽)的结合。在一个实施方案中，任选地在酸性条件和/或中性条件下，本发明的抗体与特定抗体竞争对TLR3多肽的结合，所述特定抗体分别具有SEQID NO:3和4的VH和VL区域(11E1)、SEQ ID NO:14和15的VH和VL区域(31F6)、SEQ ID NO:25和26的VH和VL区域(32C4)、SEQ ID NO:36和37的VH和VL区域(37B7)、或SEQ ID NO:47和48的VH和VL区域(7G11)。在本发明的任意实施方案的一个方面，所述抗体可以具有含有抗体11E1、7G11、31F6、32C4或37B7的1个、2个或3个CDR的重链和/或轻链。
在一个方面，特异性地结合TLR3的抗体具有下述性能中的一种或多种(包括它们的任意组合或全部)：
a.结合包含SEQ ID NO:1和/或2的氨基酸序列的TLR3多肽；
b.特异性地结合仅在细胞表面处表达的人TLR3多肽，其中就结合仅在细胞表面处表达TLR3的细胞而言，所述抗体具有不超过0.3μg/ml的EC50，任选地不超过0.2μg/ml，任选地不超过0.1μg/ml；
c.内化进在它的表面上表达TLR3的细胞中；
d.在中性pH，例如约pH 7.2的pH，对TLR3多肽具有亚纳摩尔亲和力；
e.在酸性pH，例如小于约6.5的pH，或约4.5-6.5的pH或约pH 5.6，对TLR3多肽具有亚纳摩尔亲和力；
f.在有TLR3配体存在下抑制TLR3信号传递；
g.在炎性背景中，例如在有炎性细胞因子诸如IFNα存在下，抑制TLR3信号传递；
h.与抗体11E1、7G11、31F6、32C4或37B7竞争对TLR3多肽的结合；
i.与dsRNA竞争对TLR3多肽的N-端部分的结合；
j.具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基64和/或残基65处的突变的TLR3多肽的结合，和/或减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基86和/或残基89处的突变的TLR3多肽的结合；
k.具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基117和/或残基120处的突变的TLR3多肽的结合，和/或具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基137和/或残基139处的突变的TLR3多肽的结合，和/或具有减小的对含有在SEQ ID NO:1的残基112、113和/或115处的突变的TLR3多肽的结合；和/或
l.结合与SEQ ID NO:1的TLR3多肽的残基41-251、41-89、41-120或41-139对应的区段中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个残基。
在一个方面，本发明提供了一种单克隆抗体，其特异性地结合与SEQ ID NO:1的TLR3多肽的残基1-251、任选地残基41-251、41-89、41-120或41-139对应的区段中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个残基。任选地，所述抗体抑制通过TLR3多肽的信号传递。任选地，所述抗体不会结合SEQ ID NO:1的TLR3多肽的残基116、残基145和/或残基182。任选地，所述抗体不会结合SEQ ID NO:1的TLR3多肽的残基171和/或残基196。任选地，与对SEQ ID NO:1的野生型TLR3多肽的结合相比，维持(即，基本上不减小)所述抗体与含有在SEQ ID NO:1的TLR3多肽的残基116、145、182196和/或残基171处的突变的TLR3多肽的结合；优选地，所述突变是K145E、D116R、K182E、N196A和/或E171A突变。这样的抗体可以任选地进一步具有本文描述的任何性能，例如在酸性pH对TLR3多肽的亚纳摩尔亲和力，在有TLR3配体存在下或在炎性背景中(例如在有炎性细胞因子诸如IFNα存在下)抑制TLR3信号传递，与11E1、7G11、31F6、32C4或37B7竞争对TLR3多肽的结合；不会与dsRNA竞争对TLR3多肽的C-端部分的结合；或抑制DC上的IP-10分泌(例如在人髓样DC中)。此外，这样的抗体可以用在本发明的任意方法中。
在一个实施方案中，本发明提供了一种结合TLR3多肽的抗体，其中所述抗体分别包含(i)如在SEQ ID NO:5、6或7(HCDR1)、8或9(HCDR2)和10(HCDR3)中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，和(ii)如在SEQ ID NO:11、12和13中所示的轻链CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；其中所述序列中的任一个的1个、2个、3个、4个或5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述抗体分别包含(i)如在SEQ ID NO:16、17或18(HCDR1)、19或20(HCDR2)和21(HCDR3)中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，和(ii)如在SEQ ID NO:22、23和24中所示的的轻链CDR1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；其中所述序列中的任一个的1个、2个、3个、4个或5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述抗体分别包含(i)如在SEQ ID NO:27、28或29(HCDR1)、30或31(HCDR2)和32(HCDR3)中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，和(ii)如在SEQ ID NO:33、34和35中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；其中所述序列中的任一个的1个、2个、3个、4个或5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述抗体分别包含(i)如在SEQ ID NO:38、39或40(HCDR1)、41或42(HCDR2)和43(HCDR3)中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，和(ii)如在SEQ ID NO:44、45和46中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；其中所述序列中的任一个的1个、2个、3个、4个或5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。在一个实施方案中，所述抗体分别包含(i)如在SEQ ID NO:49、50或51(HCDR1)、52或53(HCDR2)和54(HCDR3)中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，和(ii)如在SEQ ID NO:55、56和57中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；其中所述序列中的任一个的1个、2个、3个、4个或5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。
在另一个实施方案中，本文中任意实施方案的抗体能够被在它的表面上表达TLR3多肽的细胞内化。
在一个实施方案中，所述抗体是嵌合抗体，例如含有非鼠的、任选地人类的恒定区。在一个实施方案中，所述抗体是人的或人源化的。在另一个实施方案中，所述抗体是小鼠或大鼠抗体(例如，包含从大鼠或大鼠基因或大鼠Ig基因座基因段衍生出的CDR)。在另一个实施方案中，所述抗体基本上不结合其它人TLR(例如TLR4)。
在本发明的任意实施方案的一个方面，所述抗体的同种型是IgG，任选地是IgG1或IgG3。在一个实施方案中，所述抗体包含Fc结构域或是被FcγR结合的同种型。
在本发明的任意实施方案的一个方面，所述抗体是选自以下的抗体片段：Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、双体、单链抗体片段、或包含多个不同抗体片段的多特异性抗体。在本发明的任意实施方案的一个方面，所述抗体不包含Fc结构域或是基本上不被FcγR结合的同种型(例如人CD16)。在一个实施方案中，所述抗体属于人IgG4或IgG2同种型。经修饰以减小它们的FcγR结合的人IgG4同种型或其它IgG同种型可以利用其有利的药理学性能，例如血清半衰期，同时调节TLR3信号传递(在例如DC中)，而不诱导细胞的死亡。在本发明的任意实施方案的一个方面，所述抗-TLR3抗体抑制TLR3信号传递，并且包含人IgG4或IgG2同种型的恒定区。在本发明的任意实施方案的一个方面，所述抗-TLR3抗体抑制TLR3信号传递并且包含基本上不结合FcγRIIIa的恒定区(重链恒定区)。
在一个优选的实施方案中，所述抗-TLR3抗体包含人IgG4同种型的重链。在一个实施方案中，所述抗-TLR3抗体包含人IgG4重链恒定区，并且包含在残基241中的丝氨酸至脯氨酸突变，所述残基241对应于根据EU-索引(Kabat等人,“Sequences of proteins ofimmunological interest”,第5版,NIH,Bethesda,ML,1991)的位置228。包含这样的抗体的组合物可以表征为，具有小于约15％、诸如小于约10％(例如，约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少或甚至约1％或更少)的IgG4“半抗体”(包含单个重链/轻链对)。这样的IgG4“半抗体”副产物由于一部分分泌型人IgG4的铰链区中的重链间二硫键的异质性而形成(参见Angal等人,Molecular Immunology,30(1):105-108,1993中关于IgG4“半抗体”、S241P突变和有关原理的描述)。该效应通常仅在变性、非还原条件下是可检测的。
在另一个实施方案中，所述抗体与可检测的或毒性的部分缀合或共价结合。
在一个方面，所述抗体任选地抑制TLR3信号传递，而不阻断dsRN TLR3配体与TLR3多肽的主要(即C-端)dsRNA结合位点的结合。
在一个方面，在酸性条件下，且特别是在细胞的酸化亚细胞隔室(例如胞吞途径胞内体、溶酶体的隔室)中所遇到的代表性条件下，所述抗体也结合人TLR3。这样的酸性条件通常特征在于低于约pH 6.5、或在约pH 4.5-6.5之间、或约pH 5.6的pH。
在本文中任意实施方案的一个方面，所述抗体调节、任选地抑制细胞的酸化亚细胞隔室(例如胞吞途径胞内体、溶酶体的隔室)中的TLR3信号传递。
在本文中任意实施方案的一个方面，所述抗体调节、任选地抑制树突细胞(DC)(例如髓样DC、单核细胞衍生出的DC)中的TLR3信号传递。
在本文中任意实施方案的其它方面，所述抗体在中性和/或酸性条件下对TLR3的二价结合亲和力可以任选地以不超过约100、50、10、5或1纳摩尔、优选地亚纳摩尔或任选地不超过约500、200、100或10皮摩尔的平均KD(即更好亲和力)为特征。
在本文中任意实施方案的其它方面，所述抗体通过至少部分地(或完全地)阻断TLR3配体与TLR3多肽的结合而抑制TLR3信号传递。所述TLR3配体通常是除了抗-TLR3抗体以外的配体，并且可以是天然存在的或非天然存在的TLR3配体，任选地是基于dsRNA的配体诸如聚AU(聚腺苷酸:聚尿苷酸)或聚IC(聚肌苷酸:聚胞苷酸)。
在另一个方面，本发明提供了一种鉴别、筛选和/或生产抗体的方法，所述抗体特异性地结合并抑制哺乳动物受试者中的TLR3多肽，所述方法包括下述步骤：a)提供多个结合人TLR3多肽的抗体，任选地通过包括用包含TLR3多肽的免疫原免疫非人哺乳动物的方法，和(b)在仅在细胞表面处表达人TLR3的细胞中评估所述抗体对TLR3多肽的结合亲和力。任选地，所述方法进一步包括：从所述多个抗体中选择就对仅在细胞表面处表达人TLR3的细胞的结合而言具有不超过0.3μg/ml、任选地不超过0.2μg/ml、任选地不超过0.1μg/ml的EC50的抗体。
本发明的任意方法可以进一步表征为包括在本申请中(特别包括在“具体实施方式”中)描述的任意步骤。本发明进一步涉及可通过任何本发明的方法得到的抗体。本发明进一步涉及本发明的抗体的药用或诊断制剂。本发明进一步涉及在治疗或诊断方法中使用抗体的方法，任选地与第二种治疗剂(例如肾上腺皮质激素、DMARD、抗-细胞因子或抗-细胞因子受体剂、抗-TNFα剂等)联用。
可以在本文别处进一步描述本发明的这些和其它有利的方面和特征。
附图说明
图1A、1B、1C和1D显示了抗体11E1、7G11、32C4和31F6分别结合HEK293T细胞的体外剂量效应，所述HEK293T细胞用TLR3ECD构建体瞬时转染且仅在它们的表面处表达TLR3。将每种抗体与参比抗体31C3进行对比；就抗体11E1、7G11、32C4和31F6而言，改善了对细胞表面TLR3的结合。
图2A、2B、2C、2D和2E显示了使用293T-人TLR3萤光素酶测定(用人抗-TLR3抗体)的TLR3信号传递的剂量依赖性抑制。将每种抗体与参比抗体31C3进行对比；就抗体11E1、7G11、32C4、31F6和37B7而言，改善了dsRNA诱导的TLR3信号传递的抑制。
图2F、2G和2H显示了TLR3多肽的N-端末端的视图，用黑色显示突变的氨基酸残基，用灰色显示在形成基本表位的一部分的残基附近的残基。图2F显示了TLR3多肽的无聚糖侧表面的视图，其中TLR3多肽的N-端末端是在图像的右侧；图2G显示了TLR3多肽的含有聚糖的侧表面和主链的视图，其中TLR3多肽的N-端末端是在前景中(在图像的左侧)。图2H显示了TLR3多肽的无聚糖侧表面和主链的视图，其中TLR3多肽的N-端末端是在前景中(在图像的右侧)。
图3显示了类风湿性关节炎小鼠模型的结果。图3A显示了预防的类风湿性关节炎小鼠模型的结果。图3B显示了治愈的类风湿性关节炎小鼠模型的结果。图3C显示了当用PBS、对照抗体、28G7和抗-TNFα抗体(HumiraTM)治疗小鼠时，治愈的类风湿性关节炎小鼠模型的结果。
图4显示了小鼠结肠炎模型的结果。图4A显示了用盐水(黑色点)、仅用TNBS(黑色正方形)、用抗-TNFα抗体和TNBS(黑色三角形)、用28G7和TNBS(空心点)、以及用对照Ab和TNBS(空心正方形)治疗的小鼠的壁厚度测量结果。图4B显示了用盐水(黑色点)、仅用TNBS(黑色正方形)用抗-TNFα抗体和TNBS(黑色三角形)、用28G7和TNBS(空心点)、以及用对照Ab和TNBS(空心正方形)治疗的小鼠的肉眼可见损伤评分。根据本发明的抗-TLR3抗体在严谨条件下改善了疾病的发展(*p<0.05,**p<0.01，相对于盐水)。
图5显示了COPD小鼠模型的结果。图5A显示了巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞的BAL分类性细胞计数。抗-TLR3抗体强烈地减少了嗜中性粒细胞在气道中的渗入，而没有显著影响巨噬细胞、嗜酸性粒细胞或淋巴细胞。图5B显示了单独的LPS/弹性蛋白酶以及与抗-TLR3抗体或罗氟司特组合的LPS/弹性蛋白酶各自的静脉血饱和氧(以百分比计)。图5C显示了BAL流体(BALF)中的IL17A，其中抗-TLR3抗体显著减少了IL17A(pg/ml)，并且像罗氟司特一样多。图5D显示了BALF中的IP-10，其中抗-TLR3抗体显著减少了IP-10(pg/ml)。图5E显示了第二个研究的巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞的BAL分类性细胞计数，所述第二个研究对比了抗-TLR3抗体(28G7)、罗氟司特(Roflu)、以及罗氟司特和抗-TLR3抗体的组合(combo)。
图6显示了CLP(盲肠结扎和穿刺-脓毒症)小鼠模型的结果。在该急性模型中，小鼠经历模仿脓毒性休克的急性感染。
图7A和7B显示了分别与地塞米松或组合的抗-人TLR3mAb(标记的IPH33.1)的药物组合的结果。每种抗体当与地塞米松或组合时响应于聚IC进一步大幅减少PBMC的体外IP-10产生。
具体实施方式
前言
本发明至少部分地基于特异性地且有效地抑制TLR3信号传递途径的高亲和力单克隆抗体的发现。发明人还提供了存在于人TLR3上的新表位，包括被抗体11E1、7G11、31F6、32C4和/或37B7识别的表位，所述抗体特别有效地抑制TLR3信号传递，并响应于TLR3配体刺激而抑制细胞因子释放。
所述抗体可以用于治疗有此需要的受试者中的自身免疫疾病或炎性疾病。本发明也提供了使用抑制TLR3信号传递的抗-TLR3抗体在有此需要的受试者中治疗在炎性疾病或自身免疫疾病的过程中发生的复发、发作或急性期的方法。本发明也提供了使用抑制TLR3信号传递的抗-TLR3抗体在有此需要的受试者中治疗确定的炎性的或自身免疫疾病的新方法。本发明还提供了使用抑制TLR3信号传递的抗-TLR3抗体的治疗方案和治疗组合，其可以用于治疗有此需要的受试者中的炎性疾病或自身免疫疾病。
本发明的在酸性和中性条件下结合TLR3的抗体通常以高亲和性结合细胞表面TLR3和胞内体TLR3，使得所述抗体在其中靶向TLR3(例如调节)为有用的任何情况下(例如，疾病的治疗或预防)将是有用的。在一些炎症病例中已经发现TLR3位于巨噬细胞表面，并且在氯喹中和胞内体酸化后阻断TLR3，尽管如此TLR3仍然表现出一些抗炎活性(Cavassani等人.2008,出处同上)。但是，本发明的抗体在疾病的治疗或预防中与其它抗体相比将具有最大的优点，在所述疾病中，在细胞溶质(例如胞内体)隔室中调节(例如，抑制)TLR3的信号传递是有用的或需要的，并且调节这样的隔室TLR3的信号传递的相对重要程度可以取决于疾病。这样的疾病的一个例子是类风湿性关节炎；据信胞内体隔室表达的TLR3在类风湿性关节炎中起重要作用，因为使用氯喹(一种胞内体酸化的抑制剂)的治疗会抑制TLR3信号传递并且抑制从得自患有类风湿性关节炎的患者的滑液培养物中生成炎性细胞因子(Sacre等人(2008)J.Immunol.181:8002-8009)。据信胞内体隔室表达的TLR3在多种其它疾病中起重要作用，在所述疾病中，DC(例如髓样DC)涉入疾病恶化，因为mDC具有确定记载的从细胞凋亡的或坏死的细胞中吸收抗原的能力(包括在急性炎症中的组织坏死期间)。
因为本发明的抗体对于TLR3是特异性的，它们还可以用于其它目的，包括纯化TLR3或表达TLR3的细胞，在体外、离体或在体内调节(例如，活化或抑制)TLR3受体，靶向表达TLR3的细胞以进行体内破坏，或在体内、离体或在体外地特异性地标记/结合TLR3，包括用于多种方法诸如免疫印迹法、IHC分析(即在冰冻活组织检查上)、FACS分析和免疫沉淀。
定义
本文中使用的“TLR3配体”表示可以在体外、离体或在体内特异性地结合TLR3并且改变TLR3的活性的任何化合物。所述化合物可以是天然存在的配体(例如通常是dsRNA或病毒dsRNA)或合成的配体(例如聚IC或聚AU)。所述化合物可以是任何类型的分子，包括无机或有机的化合物或元素，包括蛋白(诸如抗体)、核酸、碳水化合物、脂质、或任何其它分子实体。另外，这样的化合物可以以任何方式(包括活化或抑制)并且通过任何机制(包括通过以类似于天然存在的配体的方式结合受体并且触发或关闭活性，或通过结合受体并且阻断对其它配体的接近)来调节TLR3受体。优选地，所述配体活化所述受体，并且如此可以用于诱导表达TLR3的细胞产生细胞因子。
本文中使用的术语“抗体”表示多克隆抗体和单克隆抗体。取决于重链中恒定结构域的类型，可以将抗体指定为以下五个大类之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些中的几个被进一步分成亚类或同种型，诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。一种示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每一对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每个链的N端限定约100-110个或更多个氨基酸的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别表示这些轻链和重链。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为“α”、“δ”、“ε”、“γ”和“μ”。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。IgG和/或IgM是在本发明中所采用的优选抗体类别，其中IgG是特别优选的，因为它们是在生理状况下最常见的抗体，并且因为它们在实验室条件下最易于制备。优选地，本发明的抗体是单克隆抗体。特别优选地是人源化的、嵌合的、人类的、或在其它方面人类合适的抗体。“抗体”还包括本文中描述的任何抗体的任何片段或衍生物。
术语“特异地结合”是指，抗体在竞争性结合测定中可以优选地与结合配偶体(例如TLR3)结合，如使用重组体形式的蛋白、其中的表位、或存在于分离的靶细胞的表面上的天然蛋白所评估的。用于确定特异性结合的竞争性结合测定和其它方法在下面进一步描述，并且是本领域众所周知的。
当抗体被描述成与特定单克隆抗体(例如11E1、7G11、31F6、32C4或37B7)或其它TLR3配体(例如，dsRNA)“竞争”时，是指在使用重组TLR3分子或表面表达的TLR3分子的结合测定中，所述抗体与所述单克隆抗体(或其它TLR3配体)竞争。例如，如果试验抗体在结合测定中减少了11E1、7G11、31F6、32C4或37B7与TLR3多肽或表达TLR3的细胞的结合，则所述抗体被描述成分别与11E1、7G11、31F6、32C4或37B7“竞争”。
本文中使用的术语“亲和力”是指抗体与表位的结合的强度。抗体的亲和力由解离常数KD给出，所述解离常数KD被定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，并且[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和常数Ka被定义为1/Kd。用于确定mAb的亲和力的优选方法可以在以下参考文献中找到：Harlow,等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988),Coligan等人,编,Current Protocols inImmunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993),和Muller,Meth.Enzymol.92:589-601(1983)，所述参考文献通过引用整体并入本文。本领域众所周知的用于确定mAb的亲和力的一种优选的并且标准的方法是使用Biacore仪器。
在本发明的上下文中，“决定簇”表示多肽上的相互作用或结合的位点。
术语“表位”被定义为抗原决定簇，并且是抗原上的抗体所结合的地方或区域。蛋白表位可以包含直接涉入结合的氨基酸残基以及被特异性抗原结合抗体或肽有效地阻断的氨基酸残基(即在抗体“足迹”内的氨基酸残基)。复杂抗原分子上的最简单形式或最小结构区域可以与例如抗体或受体结合。表位可以是直链的或构象性的/结构性的。术语“直链表位”被定义为由多个氨基酸残基组成的表位，所述氨基酸残基在氨基酸的直链序列(一级结构)上是邻接的。术语“构象表位或结构表位”被定义为由氨基酸残基构成的表位，所述氨基酸残基不全是邻接的，并且因此代表通过分子折叠(二级、三级和/或四级结构)而彼此邻近的氨基酸的线性序列的分离的部分。构象表位依赖于三维结构。因此，术语“构象性的”经常与“结构性的”互换使用。
“免疫原性片段”在本文中是指能够引起例如以下免疫应答的任何多肽片段或肽片段：(i)结合所述片段的抗体和/或结合任何形式的包含所述片段的分子(包括膜结合的受体以及从其衍生出的突变体)的抗体的产生，(ii)T细胞应答的刺激，所述T细胞应答涉及与包含任何MHC分子以及从所述片段衍生出的肽的双分子复合物反应的T细胞，(iii)转染的媒介物(诸如噬菌体或表达编码哺乳动物免疫球蛋白的基因的细菌)的结合。可替换地，免疫原性片段还表示能够引起如上定义的免疫应答的任何结构，例如通过共价偶联而与载体蛋白连接的肽片段，在它的氨基酸序列中包含所述肽片段的嵌合重组多肽构建体，并且特别包括用cDNA转染的细胞，所述cDNA的序列包含编码所述片段的部分。
“人类合适的”抗体表示可以安全地用在人类中例如用于本文中描述的治疗方法的任何抗体、衍生化抗体或抗体片段。人类合适的抗体包括所有类型的人源化抗体、嵌合抗体或全人抗体，或以下任何抗体：其中所述抗体的至少一部分衍生自人类或通过其它方式进行了修饰，从而避免当使用天然非人抗体时通常引起的免疫应答。
为了本发明的目的，“人源化”或“人”抗体表示这样的抗体：其中将一种或多种人免疫球蛋白的恒定和可变框架区与动物免疫球蛋白的结合区(例如CDR)融合。这样的抗体被设计成保持衍生出所述结合区的非人抗体的结合特异性，但是却避免针对非人抗体的免疫反应。这样的抗体可以从转基因小鼠或其它动物得到，所述转基因小鼠或其它动物已经被“工程化”以产生响应于抗原激发的特异性人抗体(参见，例如，Green等人(1994)NatureGenet 7:13；Lonberg等人(1994)Nature 368:856；Taylor等人(1994)Int Immun 6:579，其全部教导通过引用并入本文)。还可以通过遗传学方法或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建全人抗体，所有这些技术是本领域已知的(参见，例如，McCafferty等人(1990)Nature 348:552-553)。还可以通过体外活化的B细胞来产生人抗体(参见，例如，美国专利号5,567,610和5,229,275，它们通过引用整体并入)。
“嵌合抗体”是这样的抗体分子：其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接到不同或改变类别的效应子功能和/或物质的恒定区、或给嵌合抗体提供新特性的完全不同的分子，例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区来改变、替换或交换。
术语“Fc结构域”、“Fc部分”和“Fc区”表示抗体重链的C-端片段，例如，人γ(γ)重链或它在其它类型的抗体重链中的相应物序列(例如，对于人抗体而言，α、δ、ε和μ)的约氨基酸(aa)230至约氨基酸450，或它的天然存在的同种异型。除非另外指出，否则贯穿本公开内容使用通常接受的针对免疫球蛋白的Kabat氨基酸编号(参见Kabat等人(1991)Sequences of Protein of Immunological Interest,第5版,United States PublicHealth Service,National Institute of Health,Bethesda,MD)。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”表示实质上或基本上不含有如在其天然状态中所发现的通常伴随它的组分的物质。通常使用分析化学技术(诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)来确定纯度和同质性。作为在制剂中存在的优势物质的蛋白是基本上纯化的。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，以表示氨基酸残基的聚合物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物：其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
当涉及例如细胞、或核酸、蛋白、或载体使用时，术语“重组体”指示，所述细胞、核酸、蛋白或载体已经通过引入异源核酸或蛋白，或改变天然核酸或蛋白而进行了修饰，或所述细胞从这样修饰的细胞衍生出。因而，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因，或表达否则异常地表达的、低表达的或根本不表达的天然基因。
在本发明的上下文中，术语“结合”共同决定簇的抗体表示这样的抗体：其以特异性和/或亲和力结合所述决定簇。
生产抗-TLR3抗体
适合用于本发明的方法的抗体特异性地结合TLR3。此外，在对应于在细胞表面处遇到的条件的条件下，本发明的抗体以亲和力结合TLR3。此外，本发明的抗体能够抑制TLR3信号传递途径。抑制性抗体特异性地抑制TLR3信号传递途径的能力使它们可用于多种用途，尤其是用于治疗或预防疾病，在所述疾病中，需要抑制TLR3信号传递途径，即避免如本文中描述的进一步细胞因子和趋化因子分泌以及细胞活化。
在一个实施方案中，本发明提供了使用抗体的方法，所述抗体结合人TLR3，并与单克隆抗体11E1、7G11、31F6、32C4或37B7竞争对人TLR3的结合。
“TLR3”、“TLR3多肽”和“TLR3受体”可互换使用，在本文中用于表示Toll-样受体3，即Toll样受体(TLR)家族的一个成员。人TLR3的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:1(NCBI登录号NP_003256，其公开内容通过引用并入本文)中。在NCBI登录号NM_003265中描述了人TLR3mRNA序列。还在PCT专利公开号WO 98/50547(其公开内容通过引用并入本文)中描述了人TLR3序列。非人灵长类动物(食蟹猴)TLR3氨基酸序列显示在NCBI登录号BAG55033(SEQID NO:2)中。
在一个方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与单克隆抗体11E1、7G11、31F6、32C4或37B7竞争，并且识别与单克隆抗体11E1、7G11、31F6、32C4或37B7实质上或基本上相同的或相同的TLR3分子上的表位或“表位位点”，结合它们，或对它们具有免疫特异性。在其它实施方案中，所述单克隆抗体由抗体11E1、7G11、31F6、32C4或37B7组成或是其衍生物或片段。
TLR3的任意片段(优选地但并非排它地是人TLR3，或TLR3片段的任何组合)可以用作抗原来产生抗体，并且本发明的抗体可以识别在TLR3多肽内的任意位置处的表位，只要它们可以在表达TLR3的细胞(诸如如本文中所述的MdDC或MoDC)上这样起作用即可。在一个实施方案中，所识别的表位存在于细胞表面上，即它们可接近存在于细胞之外的抗体。最优选地，所述表位是被抗体11E1、7G11、31F6、32C4或37B7特异性地识别的表位。另外，识别TLR3内的独特表位的抗体可以联合用于例如以不同个体之间的最大效能和宽度结合TLR3多肽。
可以通过本领域已知的多种技术来生产本发明的抗体。通常如下生产它们：用包含TLR3多肽(优选人TLR3多肽)的免疫原，免疫接种非人动物，优选小鼠。所述TLR3多肽可以包含人TLR3多肽的全长序列，或其片段或衍生物，通常是免疫原性片段，即包含暴露于表达TLR3多肽的细胞的表面上的表位(优选被11E1、7G11、31F6、32C4或37B7抗体识别的表位)的多肽的一部分。这样的片段通常含有成熟多肽序列的至少约7个连续氨基酸，甚至更优选其至少约10个连续氨基酸。片段通常基本上从受体的细胞外结构域衍生出。在一个优选的实施方案中，所述免疫原包含在脂质膜中(通常在细胞表面处)的野生型人TLR3多肽。在一个具体实施方案中，所述免疫原包含完整的细胞，特别是完整的人细胞(任选经过处理或裂解)。在另一个优选实施方案中，所述多肽是重组TLR3多肽。
用抗原来免疫非人哺乳动物的步骤可以以本领域众所周知的、用于在小鼠中刺激抗体产生的任何方式来实现(参见，例如，E.Harlow和D.Lane,Antibodies:A LaboratoryManual.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1988)，其整个公开内容通过引用并入本文)。将所述免疫原悬浮或溶解于缓冲液中，所述缓冲液任选地含有佐剂，诸如完全或不完全弗氏佐剂。用于确定免疫原的量、缓冲液的类型以及佐剂量的方法是本领域技术人员众所周知的，并且不以任何方式限制本发明。这些参数对于不同的免疫原而言可能是不同的，但是易于阐明。
类似地，足以刺激抗体产生的免疫接种的位置和频率也是本领域众所周知的。在一个典型的免疫接种方案中，在第1天用抗原腹膜内注射非人动物，并且在约1周之后再次注射。随后在约第20天进行所述抗原的记忆注射，任选地与佐剂诸如不完全弗氏佐剂一起。记忆注射静脉内地进行，并且可以重复连续几天。随后在第40天静脉内地或腹膜内地进行加强注射，通常不使用佐剂。该方案会导致在约40天后产生抗原特异性抗体的B细胞的产生。还可以使用其它方案，只要它们会导致生成表达抗体的B细胞的产生即可，所述抗体针对在免疫接种中使用的抗原。
对于多克隆抗体制备而言，从经免疫的非人动物得到血清，并且通过众所周知的技术分离存在于其中的抗体。使用与固体支持物连接的上述免疫原中的任一种，可以亲和纯化血清，从而得到与TLR3多肽反应的抗体。
在一个替代实施方案中，从未免疫的非人哺乳动物分离出淋巴细胞，在体外培养，然后暴露于细胞培养物中的免疫原。然后收获所述淋巴细胞，并且执行以下描述的融合步骤。
对于优选的单克隆抗体而言，下一步是从经免疫的非人哺乳动物分离脾细胞，并且随后将那些脾细胞与永生化细胞融合，从而形成产生抗体的杂交瘤。从非人哺乳动物分离脾细胞是本领域众所周知的，并且通常包括：从经麻醉的非人哺乳动物取出脾，将它切成小块，并将脾被膜中的脾细胞挤压穿过细胞过滤网的尼龙孔挤入适当的缓冲液中，从而产生单细胞悬浮液。将这些细胞洗涤、离心并且再悬浮于裂解任何红细胞的缓冲液中。将所述溶液再次离心，并且将沉淀物中的剩余淋巴细胞最终再悬浮于新鲜的缓冲液中。
一旦分离并且存在于单细胞悬浮液中，所述淋巴细胞可以与永生细胞系融合。这通常是小鼠骨髓瘤细胞系，尽管可用于制备杂交瘤的许多其它永生细胞系是本领域已知的。优选的鼠骨髓瘤系包括、但不限于：从MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可得自SalkInstitute Cell Distribution Center,San Diego,U.S.A.)、X63Ag8653和SP-2细胞(可得自American Type Culture Collection,Rockville,Maryland U.S.A.)衍生出的那些。使用聚乙二醇等进行所述融合。然后将得到的杂交瘤在选择性培养基中培养，所述选择性培养基含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质会阻止HGPRT-缺陷型细胞的生长。
通常在巨噬细胞的饲养层上培养杂交瘤。所述巨噬细胞优选地得自用于分离脾细胞的非人哺乳动物的同胞仔，并且通常在将杂交瘤铺板之前用不完全弗氏佐剂等预处理数天。在Goding,“Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,”第59-103页(Academic Press,1986)中描述了融合方法，其公开内容通过引用并入本文。
允许所述细胞在选择性培养基中生长足以形成集落和产生抗体的时间。这通常是在约7天至约14天之间。
然后针对抗体的产生来测定杂交瘤集落，所述抗体特异性地结合TLR3多肽基因产物，任选被抗体11E1、7G11、31F6、32C4或37B7特异性地识别的表位。所述测定通常是比色测量ELISA-型测定，尽管可以使用可适用于杂交瘤在其中生长的孔的任何测定。其它测定包括放射免疫测定或荧光活化细胞分选。检查期望的抗体产生为阳性的孔，以确定是否存在一个或多个独特集落。如果存在超过一个集落，可以将所述细胞再克隆并且培养，以确保仅单个细胞产生生成期望抗体的集落。通常，还可以如以下所述针对结合TLR3多肽(例如，在石蜡包埋的组织切片中的表达TLR3的细胞)的能力试验所述抗体。
被证实产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可以在适当的培养基中(诸如DMEM或RPMI-1640)较大量地生长。可替换地，所述杂交瘤细胞可以作为动物中的腹水肿瘤在体内生长。
在充分生长以产生期望的单克隆抗体之后，将含有单克隆抗体的生长培养基(或腹水液)与细胞分开，并且对其中存在的单克隆抗体进行纯化。通常通过凝胶电泳、透析、使用蛋白A或蛋白G-Sepharose的色谱法、或连接到固体支持物(诸如琼脂糖或Sepharose珠子)上的抗-小鼠Ig(都描述在例如Antibody Purification Handbook,Biosciences,公开号18-1037-46,Edition AC，其公开内容特此通过引用并入)，进行纯化。通常通过使用低pH缓冲液(pH 3.0或更低的甘氨酸或乙酸盐缓冲液)从蛋白A/蛋白G柱洗脱结合的抗体，其中含抗体的级分被立即中和。根据需要将这些级分收集、透析和浓缩。
通常将具有单个清楚集落的阳性孔再克隆并且再测定，以确保仅检测并且产生一个单克隆抗体。
如例如在Ward等人.Nature,341(1989)第544页(其整个公开内容通过引用并入本文)中公开的，还可以通过选择免疫球蛋白的组合文库来产生抗体。
使用多种可以在其中评估抗体竞争的免疫筛选测定中的任一种，可以容易地确定结合TLR3、特别是与单克隆抗体11E1、7G11、31F6、32C4或37B7实质上或基本上相同的表位的一种或多种抗体的身份。许多这样的测定被常规地实践，并且是本领域众所周知的(参见，例如，于1997年8月26日授权的美国专利号5,660,827，其特别地通过引用并入本文)。应该理解，实际上不再以任何方式要求确定本文中描述的抗体所结合的表位，即可鉴别结合与本文中描述的单克隆抗体相同的或基本上相同的表位的抗体。
例如，在待检查的试验抗体得自不同来源动物或甚至具有不同Ig同种型的情况下，可以采用简单竞争测定，其中将对照(例如，11E1、7G11、31F6、32C4或37B7)和试验抗体混合(或预吸附)，并且施加于含有TLR3多肽的样品。基于蛋白质印迹法和使用BIACORE分析的方案适合用在这样的竞争研究中。
在某些实施方案中，在施加于TLR3抗原样品之前，将对照抗体(11E1、7G11、31F6、32C4或37B7，例如)与不同量的试验抗体预混合(例如，约1:10或约1:100)一段时间。在其它实施方案中，可以在暴露于TLR3抗原样品过程中将对照与不同量的试验抗体简单地混合。只要可以将结合的抗体与游离的抗体区别开(例如，通过使用分离技术或洗涤技术来消除未结合的抗体)，并且将11E1、7G11、31F6、32C4或37B7与试验抗体区别开(例如，通过使用物种-特异性的或同种型-特异性的第二抗体，或通过用可检测标记物来特异性地标记11E1、7G11、31F6、32C4或37B7)，可以确定所述试验抗体是否减小了11E1、7G11、31F6、32C4或37B7与抗原的结合，从而指示所述试验抗体识别与11E1、7G11、31F6、32C4或37B7基本上相同的表位。在没有完全不相关的抗体存在下(标记的)对照抗体的结合可以充当对照高值。通过将标记的(11E1、7G11、31F6、32C4或37B7)抗体与完全相同类型(11E1、7G11、31F6、32C4或37B7)的未标记的抗体一起温育，可以得到对照低值，其中竞争会发生并且减小经标记的抗体的结合。在一个试验测定中，在有试验抗体存在下经标记的抗体反应性的显著减小指示识别基本上相同的表位的试验抗体，即所述抗体与(11E1、7G11、31F6、32C4或37B7)抗体“交叉反应”或与其竞争。在约1:10至约1:100之间的11E1、7G11、31F6、32C4或37B7:试验抗体的任何比率，使11E1、7G11、31F6、32C4或37B7与TLR3抗原的结合减小至少约50％、诸如至少约60％或更优选地至少约80％或90％(例如、约65-100％)的任何试验抗体，被认为是结合与11E1、7G11、31F6、32C4或37B7基本上相同的表位或决定簇的抗体。优选地，这样的试验抗体将11E1、7G11、31F6、32C4或37B7与TLR3抗原的结合减小了至少约90％(例如，约95％)。
还可以通过例如流式细胞计量术试验来评估竞争。在这样的试验中，例如，可以将带有给定TLR3多肽的细胞首先与11E1一起温育，然后与用荧光染料或生物素标记的试验抗体一起温育。如果在与饱和量的11E1预温育以后得到的结合是不与11E1一起预温育抗体所得到的结合(如通过荧光所测量的值)的约80％、优选约50％、约40％或更少(例如，约30％、20％或10％)，则说所述抗体与11E1竞争。可替换地，如果用经标记的11E1抗体(通过荧光染料或生物素)在与饱和量的试验抗体预温育的细胞上得到的结合是未与所述试验抗体预温育所得到的结合的约80％、优选约50％、约40％或less(例如，约30％、20％或10％)，则说所述抗体与11E1竞争。
还可以采用简单竞争测定，其中将试验抗体预吸附并且以饱和浓度施用到固定有TLR3抗原的表面上。在所述简单竞争测定中，所述表面优选地是BIACORE芯片(或适合用于表面等离子体共振分析的其它介质)。然后在TLR3饱和浓度下使对照抗体(例如，11E1)与所述表面接触，并且测量对照抗体的TLR3和表面结合。将对照抗体的这种结合与在没有试验抗体存在下对照抗体与含有TLR3的表面的结合进行对比。在一个试验测定中，在有试验抗体存在下对照抗体与含有TLR3的表面的结合的显著减小指示所述试验抗体识别与对照抗体基本上相同的表位，使得所述试验抗体与所述对照抗体“交叉反应”。将对照(诸如11E1)抗体与TLR3抗原的结合减小了至少约30％或更多、优选约40％的任何试验抗体可以被认为是结合与对照(例如，11E1)基本上相同表位或决定簇的抗体。优选地，这样的试验抗体会将对照抗体(例如，11E1)与TLR3抗原的结合减小至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％或或更多)。应当理解，对照和试验抗体的顺序可以颠倒：也就是说，在一个竞争测定中，可以首先使对照抗体与表面结合，并且此后使试验抗体与所述表面接触。优选地，首先使对TLR3抗原具有较高亲和力的抗体与表面结合，正如所预期的，观察到的第二抗体(假设所述抗体是交叉反应的)的结合的减小将具有较大量级。这样的测定的其它例子提供在例如Saunal(1995)J.Immunol.Methods 183:33-41(其公开内容通过引用并入本文)中。
以本领域技术人员已知的方式，可以确定抗体是否结合在表位区域内。作为这样的作图/表征方法的一个例子，使用TLR3蛋白中暴露的胺/羧基的化学修饰，通过表位“足迹法”，可以确定抗-TLR3抗体的表位区。这种足迹法技术的一个具体例子是使用HXMS(通过质谱法检测氢-氘交换)，其中发生受体和配体蛋白酰胺质子的氢/氘交换、结合、以及反向交换，其中保护参与蛋白结合的主链酰胺基团免于反向交换并且因此将保持被氘化。在此时可以通过胃蛋白酶解、快速微孔高效液相色谱分离、和/或电喷射电离质谱法来鉴别相关区域。参见，例如，Ehring H,Analytical Biochemistry,第267卷(2)第252-259页(1999)Engen,J.R.和Smith,D.L.(2001)Anal.Chem.73,256A-265A。合适的表位鉴别技术的另一个例子是核磁共振表位作图(NMR)，其中通常将游离抗原和与抗原结合肽(诸如抗体)形成复合物的抗原的二维NMR谱图中信号的位置进行对比。通常用15N对所述抗原进行选择性同位素标记，使得在NMR谱图中仅可以看到与抗原对应的信号，且没有来自所述抗原结合肽的信号。与游离抗原的谱图相比较，在复合物谱图中由涉入与抗原结合肽相互作用的氨基酸所产生的抗原信号通常会移动位置，并且以此方式可以鉴别涉入所述结合的氨基酸。参见，例如，Ernst Schering Res Found Workshop.2004；(44):149-67；Huang等人,Journal ofMolecular Biology,第281(1)卷第61-67页(1998)；以及Saito和Patterson,Methods.1996年6月；9(3):516-24。
还可以使用质谱法进行表位作图/表征。参见，例如，Downard,J Mass Spectrom.(2000)35(4):493-503和Kiselar和Downard,Anal Chem.(1999)71(9):1792-801。在表位作图和鉴别的上下文中，蛋白酶消化技术也可以是有用的。通过蛋白酶消化(例如通过以相对于TLR3为约1:50的比率使用胰蛋白酶或在pH 7-8消化过夜)，随后进行质谱法(MS)分析以鉴别肽，可以确定抗原决定簇相关的区域/序列。随后可以如下被抗-TLR3结合剂保护而免于胰蛋白酶切割的肽：将经历胰蛋白酶消化的样品与用抗体温育的、并且然后经历例如胰蛋白酶消化的样品进行对比(由此揭示结合剂的足迹)。在类似的表位表征方法中也可以或可替换地使用其它酶如糜蛋白酶、胃蛋白酶等。此外，酶消化可以提供快速方法，其用于分析潜在抗原决定簇序列是否在TLR3多肽的特定区域内，所述区域不是表面暴露的，并且因此就免疫原性/抗原性而言最可能的是不相关的。关于类似技术的讨论，参见，例如，Manca,Ann 1st Super Sanita.1991；27:15-9。
定位诱变是可用于阐明结合表位的另一种技术。例如，在“丙氨酸扫描”中，蛋白片段内的每个残基都用丙氨酸残基替换，并且测量结合亲和力的后果。如果所述突变导致结合亲和力的显著降低，它最可能涉入结合。可以使用对结构表位具有特异性的单克隆抗体(即不结合未折叠蛋白的抗体)来证实所述丙氨酸替换没有影响蛋白的整体折叠。参见，例如，Clackson和Wells,Science 1995；267:383-386；和Wells,Proc Natl Acad Sci USA1996；93:1-6。
还可以将电子显微术用于表位“足迹法”。例如，Wang等人,Nature 1992；355:275-278使用冷冻电子显微镜术、三维图像重建、以及X-射线晶体学的协同应用来确定天然豇豆花叶病毒的衣壳表面上的Fab片段的物理足迹。
用于表位评价的其它形式的“无标记”测定包括表面等离子体共振(SPR、BIACORE)和反射干涉光谱法(RifS)。参见，例如，等人,Journal Of MolecularRecognition 1990；3:208-14；Nice等人,J.Chroma-togr.1993；646:159-168；Leipert等人,Angew.Chem.Int.Ed.1998；37:3308-3311；等人,Biosensors andBioelectronics 2002；17:937-944。
还应当指出，可以在本文中描述的一个或多个示例性竞争测定中鉴别出结合与本发明的抗体相同或基本上相同的表位的抗体。
一旦鉴别出能够结合TLR3和/或具有其它期望性能的抗体，通常还使用标准方法(包括本文描述的那些)评估它们的结合其它多肽(包括不相关的多肽以及其它TLR家族成员(例如，人TLR1、2或4-10))的能力。理想地，所述抗体仅以显著的亲和力结合TLR3(例如，人TLR3)，不以显著水平结合不相关的多肽或其它TLR家族成员(例如，TLR2或TLR4；在NCBI登录号NP_612564中发现包括在氨基酸残基1-23处的信号肽的人前体TLR4的氨基酸序列，其公开内容通过引用并入本文)。但是，应当理解，只要与针对其它TLR家族成员(或其它不相关多肽)的亲和力相比，对TLR3的亲和力显著地更大(例如，5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍或更多)，则所述抗体适合用于本发明的方法中。
还可以在非人灵长类动物(例如恒河猴或食蟹猴，或其它哺乳动物诸如小鼠)中评估抗体对表达TLR3的细胞的结合。因此，本发明提供了一种抗体以及它们的片段和衍生物，其中所述抗体、片段或衍生物特异性地结合TLR3，并且此外它们结合得自非人灵长类动物(例如，恒河猴或食蟹猴)的TLR3、SEQ ID NO:2的TLR3多肽。任选地，评估细胞摄入或定位，任选地定位在亚细胞隔室(诸如胞吞途径)中，以便选择易于摄入细胞中和/或细胞隔室(在其中表达TLR3)中的抗体。通常在细胞中测量细胞摄入或定位，在所述细胞中寻找抗体或认为抗体例如在DC中发挥其活性。通过标准方法(诸如通过使用用可检测部分(例如荧光部分)标记的抗体进行共聚焦染色)，可以评估细胞摄入或定位。
在给脊椎动物或细胞免疫接种并在其中生产抗体以后，可以执行特定选择步骤来分离所要求保护的抗体。在这点上，在一个具体实施方案中，本发明还涉及生产抑制TLR3信号传递的抗体的方法，所述方法包括：(a)提供多个抗体；和(b)从步骤(a)中选择能够以高亲和力结合仅在细胞表面处表达的TLR3多肽的抗体。可以试验所述抗体在中性条件下对TLR3的结合。在一个实施方案中，步骤(a)包括：(i)用包含TLR3多肽的免疫原免疫非人哺乳动物；和(ii)从所述免疫的动物制备抗体。在一个实施方案中，步骤(a)包括制备抗体序列文库(例如使用噬菌体展示)。
可以确定所述抗体在酸性条件下对人TLR3的二价结合亲和力。例如，所述抗体可以以不超过约100、60、10、5或1纳摩尔、优选地亚纳摩尔或任选地不超过约300、200、100或10皮摩尔的平均KD(即更好亲和力)为特征。例如，通过将重组生产的人TLR3蛋白固定在芯片表面上，随后施加在溶液中的待试验的抗体，可以确定KD，例如如在本发明的实施例中所示。为了选择在酸性和中性条件下保持类似结合的抗体，可以需求使在中性pH(例如7.2)和酸性pH(例如在4.5-6.5范围内的pH)下观察到的结合之间的差异最小化，例如其中在酸性pH下的结合亲和力没有显著低于在非酸性pH下观察到的值，例如，其中结合TLR3的KD降低了不超过0.2-、0.3-、0.5-、1.0-、或1.5-log10。在一个实施方案中，所述方法进一步包括步骤(d)，从(b)中选择这样的抗体：其能够与抗体11E1、7G11、31F6、32C4或37B7竞争对TLR3的结合，或其能够(或不能)与dsRNA(例如聚AU)竞争对TLR3的结合。
在任意实施方案的一个方面，根据本发明的方法制备的抗体是单克隆抗体。在另一个方面，根据本发明的方法用于生产抗体的非人动物是哺乳动物，诸如啮齿动物(例如大鼠)、牛、猪、家禽、马、兔、山羊或绵羊。本发明的抗体包括11E1、7G11、31F6、32C4和37B7。但是，应当理解，使用本文所述的方法可以得到其它抗体，并且因而本发明的抗体可以是除了11E1、7G11、31F6、32C4和37B7以外的抗体。另外，可以任选地将本发明的抗体指定为除了以下抗体以外的抗体：在WO2011/004028中公开的抗体31C3、29H3、23C8、28F11或34A3中的任一种，或于2009年7月3日在编号CNCM I-4187(29H3.7)和CNCM I-4186(31C3.1)下保藏于Collection Nationale de Culture de Microorganismes(CNCM),Institut Pasteur,25rue de Docteur Roux,F-75724的抗体，抗体TLR3.7(eBioScience Inc.,San Diego)，WO06/060513的抗体C1068，WO 2007/051164的抗体C1130，WO2010/051470公开的任意抗体，例如，抗体1-19和F17-F19和它们的变体诸如15EVQ和12QVQ/QSV，抗体40C1285(Abcam)，或抗体619F7、713E4、716G10、IMG-5631、IMG-315或IMG-5348(都得自Imgenex.Corp.)或前述抗体的衍生物，例如完全地或部分地包含抗原结合区的衍生物。以上出版物中的每一篇通过引用并入本文。
根据一个替代实施方案，从本发明的杂交瘤中分离出编码结合TLR3多肽上存在的表位的抗体的DNA，并且将其置于适当的表达载体中用于转染进适当的宿主中。然后将所述宿主用于重组生产所述抗体或其变体，诸如该单克隆抗体的人源化形式、所述抗体的活性片段，包含所述抗体的抗原识别部分的嵌合抗体、或包含可检测部分的形式。
使用使用常规规程(例如，通过使用寡核苷酸探针，所述探针能够特异性地结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因)，可以容易地将编码本发明的单克隆抗体的DNA进行分离和测序。分离后，可以将所述DNA置于表达载体中，然后将所述载体转染进否则会产生免疫球蛋白蛋白的宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。如在本说明书的其它地方所描述的，可以出于多个目的中任何一个(例如，用于人源化抗体、生产片段或衍生物、或用于修饰抗体的序列)而修饰这样的DNA序列(例如在抗原结合位点中)，以便优化所述抗体的结合特异性。
在细菌中重组表达编码所述抗体的DNA，是本领域众所周知的(参见，例如，Skerra等人,Curr.Opinion in Immunol.,5,第256页(1993)；和Pluckthun,Immunol.130,第151页(1992)。
评估抗体的调节TLR3信号传递的能力
在某些实施方案中，本发明的抗体能够调节(例如抑制)通过TLR3多肽的信号传递，并且因而调节表达TLR3的细胞的活性或行为。例如，所述抗体可以抑制表达TLR3的细胞的活化(例如，它们可以抑制TLR3信号传递途径)，任选地通过阻断天然的或内源性的配体(诸如dsRNA)对TLR3的结合；任选地，它们可以在有TLR3配体存在下阻断TLR3蛋白的形成同源二聚体的能力，因此阻断信号传递级联的开始。因此，这些抗体被称作“中和性的”或“抑制性的”或“阻断性的”抗体。这样的抗体尤其可用于降低表达TLR3的免疫细胞的活性，例如用于治疗或预防这样的病症：其涉及过度表达TLR3的细胞活性或数量，或在所述病症中，降低表达TLR3的细胞活性可以改善、预防、消除、或以任何方式改善所述病症或其任何征状。
可以使用一系列细胞测定来评估抗体的调节TLR3信号传递的能力。可以使用大量测定中的任一种(包括分子的、基于细胞的、以及基于动物的模型)来评估抗-TLR3抗体的调节表达TLR3的细胞活性的能力。例如，可以使用基于细胞的测定，其中将表达TLR3的细胞暴露于dsRNA、病毒dsRNA、聚IC、或聚AU、或另一种TLR3配体，并且评估所述抗体的破坏配体的结合或受体的刺激的能力(正如例如通过检查本文中提出的TLR3细胞活性中的任一项所确定的，诸如干扰素表达、NFkB活性、NK细胞活化等)。在所述测定中使用的TLR3配体可以呈任意适合形式，包括、但不限于作为纯化的配体组合物、在与非TLR3配体一起的混合物中、在天然存在的组合物中、在细胞中或在细胞表面上、或由细胞(例如，在所述测定中使用产生配体的细胞)分泌、在溶液中或在固体支持物上。
还可以在没有配体存在下如下评估表达TLR3的细胞的活性：将细胞暴露于抗体本身，并且评估它对细胞的活性或行为的任意方面的影响。在这样的测定中，在没有配体存在下得到表达TLR3的细胞的活性的基线水平(例如，细胞因子生产、增殖，参见下文)，并且检测抗体或化合物的改变基线活性水平的能力。在一个这样的实施方案中，使用高通量筛选方案来鉴别能够影响受体活化的化合物。
可以使用反映TLR3活性的任何适当的生理学改变来评价试验抗体或抗体衍生物。例如，可以测量多种作用，例如基因表达(例如，NFkB应答基因)的改变、蛋白质分泌(例如，干扰素)、细胞生长、细胞增殖、pH、细胞内第二信使(例如，Ca2+、IP3、cGMP或cAMP)或活性(诸如活化NK细胞的能力)。在一个实施方案中，通过检测细胞因子(例如TLR3-响应性的细胞因子、促炎性细胞因子)的产生来评估受体的活性。
可以使用多种可能的读出系统中的任一种进行TLR3调节，所述读出系统大部分基于TLR/IL-1R信号转导途径，涉及例如MyD88非依赖性的/TRIF依赖性的信号转导途径，涉及例如IRF3、IRF7、IKKε和/或TBK1(Akira和Takeda(2004)Nature Review Immunol.4:499-511)。这些途径活化激酶，包括KB激酶复合物。通过检查TLR信号传递的任意方面，可以可以TLR3活化。例如，TLR信号传递的活化会触发以下方面的改变：蛋白-蛋白结合(例如，TRIF与TBK和/或IKKε)、蛋白的细胞内定位(例如NK-kB向细胞核中的移动)、以及基因表达(例如NK-kB敏感基因的表达)、以及细胞因子产生(例如，IFN-γ、IL-6、IP10、MCP-1的产生和分泌)。任何这样的改变可以被检测并且用于检测TLR3活化。在一个实施方案中，如下检测TLR3刺激：在培养18-20小时之后收集上清液，并且通过夹心ELISA测量IFN-γ、IL-6、IP-10和/或MCP-1的水平。在另一个实施方案中，如下检测TLR3刺激：在培养18-20小时之后收集上清液，并且通过夹心ELISA测量IFN-γ、IL-6、IP-10和/或MCP-1的水平。
在一个实施方案中，使用天然地表达TLR3的细胞，诸如DC(例如髓样DC或单核细胞衍生出的DC)。在另一个实施方案中，使用包含报道基因构建体的细胞，在TLR3刺激后，所述构建体造成可检测的基因产物的表达以及随后的信号转导途径的活化。对于所述测定而言特别有用的报道基因和报道基因构建体包括：例如，可操作地连接到启动子的报道基因，所述启动子对NF-kB敏感或对具体地由TRIF、IRF3、IRF7、IKKε、TBK1介导的信号传递敏感。这样的启动子的例子包括、但不限于IL-1α、IL-6、IL-8、IL-12p40、IP-10、CD80、CD86和TNF-α的那些启动子。可操作地连接到TLR敏感的启动子的报道基因可以包括、但不限于酶(例如，萤光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)等)、生物发光标志物(例如，绿色荧光蛋白(GFP，例如，美国专利号5,491,084)、蓝色荧光蛋白(BFP，例如，美国专利号6,486,382)等)、表面表达的分子(例如，CD25、CD80、CD86)、以及分泌的分子(例如，IL-1、IL-6、IL-8、IL-12p40、TNF-α)。参见，例如，Hcker H等人(1999)EMBO J.18:6973-82；MurphyTL等人(1995)Mol Cell Biol 15:5258-67，其公开内容通过引用并入本文。适合使用的报道质粒是商购可得的(InvivoGen,San Diego,CA)。在一个实施方案中，所述测定包括：在制备用来表达人TLR3多肽的宿主细胞中，确定试验组合物是否诱导在对TLR3信号传递(例如ISRE，即IFN-刺激的应答元件)做出应答的启动子的控制下的萤光素酶表达(或其它报道基因)。
在依赖于酶活性读出的测定中，底物可以作为所述测定的一部分来供应，并且检测可以涉及以下方面的测量：化学发光、荧光、显色、放射性标记的掺入、抗药性、光密度或酶活性的其它标志物。对于依赖于分子的表面表达的测定而言，可以使用流式细胞计量术(FACS)分析或功能测定来实现检测。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或生物测定，可以测定分泌的分子。这些和其它适当的读出系统中的许多是本领域众所周知的并且是商购可得的。优选地，所述报道系统(无论使用哪个)是可计量的。
在另一个实施方案中，在非人灵长类动物体内评估所述抗体对表达TLR3的细胞的影响。例如，将包含本发明的抗-TLR3抗体的药物组合物施用给非人灵长类动物，所述动物是健康的或患有病症，例如自身免疫病或炎症，并且评估所述施用对例如以下方面的影响：所述灵长类动物中表达TLR3的细胞的数量或活性、细胞因子的存在和/或水平、或病症的进展。实现这些TLR3相关的参数中任一项的可检测变化的任何抗体或抗体衍生物或片段，是用于本文中描述的方法中的候选物。
在本文描述的任意测定中，细胞中TLR3刺激的活性的任何可检测的量度的5％、10％、20％、优选地30％、40％、50％、最优选地60％、70％、80％、90％、95％或更大的增加或降低指示，所述试验抗体适合用在本发明的方法中。
当评估抑制性的抗-TLR3抗体时，可以有利地选择抗体，以改变与炎症或自身免疫相关的任何参数。例如，可以选择抗体来降低细胞中的活化，特别是促炎细胞因子的产生。例如，所述细胞可以是得自患有炎性障碍或自身免疫性障碍的个体的细胞。
抗体
本发明的抗体结合人TLR3多肽。在一个实施方案中，所述抗体是拮抗TLR3抗体。在另一个实施方案中，所述抗体阻断通过人TLR3诱导的信号传递。
所述抗体任选地在酸性pH(即约5.6的pH)具有小于10-9M、优选地小于10-10M的亲和力(KD)。在另一个实施方案中，所述抗体在中性pH(即约7.2的pH)具有小于10-9M、优选地小于10-10M的亲和力(KD)。在另一个实施方案中，所述抗体在酸性pH(即约5.6的pH)和在中性pH(即约7.2的pH)具有小于10-9M、优选地小于10-10M的亲和力(KD)。亲和力可以是例如与TLR3的单价或二价结合。
在另一个实施方案中，在有TLR3配体即dsRNA(聚AU、聚IC)存在下，所述抗体能够抑制TLR3信号传递。在另一个实施方案中，当在TLR3配体以后施用时，所述抗体能够抑制TLR3信号传递。在另一个实施方案中，当在TLR3配体以前施用时，所述抗体能够抑制TLR3信号传递。在另一个实施方案中，当与TLR3配体同时施用时，所述抗体能够抑制TLR3信号传递。
在另一个实施方案中，所述抗体与dsRNA竞争对TLR3多肽的N-端dsRNA结合位点的结合。在另一个实施方案中，所述抗体不与dsRNA竞争对TLR3多肽的C-端dsRNA结合位点的结合。
抗体表位
在另一个实施方案中，所述抗体结合与抗体11E1、7G11、31F6、32C4或37B7基本上相同的表位。在一个实施方案中，所述表位的所有关键残基是在与SEQ ID NO:1的TLR3多肽的残基1-251对应的区段中。在一个实施方案中，所述抗体结合这样的表位：其包含与SEQID NO:1的TLR3多肽的残基1-251(或41-139、41-115、41-120或41-251)对应的区段的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个残基。在另一个实施方案中，所述抗体结合存在于TLR3多肽的表面上的一个或多个氨基酸，所述氨基酸是在本发明的抗-TLR3抗体所结合的表位内，任选地，所述抗体结合1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个选自以下的残基：SEQID NO:1的残基41、43、60、61、62、64、65、66、67、68、86、88、89、91、92、93、96、97、108、110、112、113、114、115、117、120、121、132、134、137和残基139。
任选地，所述抗体至少部分地(或主要地)结合在人TLR3多肽的N-端部分的无聚糖侧表面上。任选地，所述抗体至少部分地(或主要地)结合在人TLR3多肽的N-端部分的主链上。任选地，所述抗体至少部分地(或主要地)结合在人TLR3多肽的N-端部分的无聚糖侧表面上，并部分地结合在人TLR3多肽的N-端部分的主链上。任选地，所述抗体结合TLR3多肽的无聚糖侧表面(其涉入TLR3多肽与dsRNA的结合)内的一个或多个氨基酸残基和/或与其邻近的残基。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含SEQ ID NO:1的残基41和/或残基43。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含SEQ ID NO:1的残基60、61、62、64、65、67和/或残基68中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含SEQID NO:1的残基86、88和/或残基89中的1个、2个或3个。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含SEQ ID NO:1的残基91、92、93、96、97和/或残基121中的1个、2个、3个、4个、5个或6个。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含残基108、110、112、113、114、115、116、117、120中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或更多个。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含SEQ ID NO:1的残基132、134、137和/或残基139中的1个、2个、3个或4个。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含残基112、113、115、117、120、137和139中的1个、2个、3个或4个。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含残基117和残基137和/或139。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含残基120和残基137和/或139。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含残基117和/或120，但是不包含残基137和/或139。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含残基R64、R65、T86和K89、K137和K139中的1个、2个、3个、4个、5个或6个。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含残基64和残基137和/或139。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含残基65和残基137和/或139。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含残基86和残基137和/或139。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含残基89和残基137和/或139。在一个实施方案中，在TLR3多肽的无聚糖侧表面(其涉入TLR3多肽与dsRNA的结合)内的氨基酸残基和/或与其邻近的残基选自SEQ ID NO:1的残基41、43、60、61、62、64、65、67、68、86、88、89、108、110、112、113、114、132、134、137和残基139。任选地，所述抗体结合这样的表位：其包含SEQ ID NO:1的残基112、113和137中的1个、2个、3个或4个。在一个实施方案中，在人TLR3多肽的N-端部分的主链内的氨基酸残基选自：SEQ ID NO:1的残基91、92、93、96、97、117、120和121。任选地，所述抗体不结合、或基本上不结合人TLR3多肽的N-端部分的含有聚糖的侧表面。
任选地，在任意实施方案中，所述抗体可以任选地进一步特征在于，基本上不结合与SEQ ID NO:1的成熟TLR3多肽的残基174-191、残基465-619或残基116、145和/或182对应的区段中的1个、2个、3个或更多个残基。在另一个实施方案中，所述抗体结合、或任选地不结合这样的表位：其包含与SEQ ID NO:1的TLR3多肽的残基177-191、224-243、280-286、295-374、379-391、428-459、461-487、524-529、533-542、546-569、575-581、583-605、607-623、641-657和/或670-705对应的区段中的一个或多个残基。
本文中的实施例部分描述了一系列突变体人TLR3多肽的构建。测量抗-TLR3抗体与用TLR3突变体转染的细胞的结合，并与抗-TLR3抗体的结合野生型TLR3多肽(SEQ ID NO:1)的能力进行对比。本文中使用的抗-TLR3抗体和突变体TLR3多肽之间的结合的减小是指，存在结合亲和力的减小(例如，通过已知方法测量，诸如表达特定突变体的细胞的FACS试验，或通过与突变体多肽的结合的Biacore试验)，和/或抗-TLR3抗体的总结合能力的减小(例如，通过抗-TLR3抗体浓度相对于多肽浓度的图中的Bmax的下降来证实)。结合的显著减小指示，突变的残基直接涉入与抗-TLR3抗体的结合，或当抗-TLR3抗体与TLR3结合时，突变的残基与结合蛋白紧密靠近。抗体表位因而优选地包括这样的残基，并且可以包括邻近这样的残基的额外残基。
在某些实施方案中，结合的显著减小是指，与抗体和野生型TLR3多肽(例如，SEQID NO:1中所示的多肽)之间的结合相比，抗-TLR3抗体和突变体TLR3多肽之间的结合亲和力和/或能力减小了大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。在某些实施方案中，结合减小至检出限度以下。在某些实施方案中，当抗-TLR3抗体与突变体TLR3多肽的结合小于在抗-TLR3抗体和野生型TLR3多肽(例如，SEQ ID NO:1所示的细胞外结构域)之间观察到的结合的50％(例如，小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％)时，证实结合的显著减小。这样的结合测量可以使用本领域已知的多种结合测定来进行。在实施例部分中描述了一种这样的测定的具体例子。
在某些实施方案中，提供了表现出对突变体TLR3多肽显著更低的结合的抗-TLR3抗体，其中野生型TLR3多肽(例如，SEQ ID NO:1)中的残基被置换。在这里使用的速记符号中，格式是：野生型残基:在多肽中的位置:突变体残基，具有如在SEQ ID NO:1中指示的残基的编号。
任选地，所述抗体具有减小的对TLR3多肽的结合，所述TLR3多肽具有在SEQ IDNO:1的残基41、43、60、61、62、64、65、67、68、86、88、89、91、92、93、96、97、108、110、112、113、114、115、117、120、121、132、134、137和/或残基139处的置换。
在某些实施方案中，抗-TLR3抗体结合具有SEQ ID NO:1的序列的野生型TLR3多肽，但是具有减小的对突变体TLR3多肽的结合，所述突变体TLR3多肽具有下述突变中的任意一个或多个(例如，1个、2个、3个或4个)：R64Q、R65Q、T86S、K89Q、K117Q、A120V、K137S和/或K139A(参考SEQ ID NO:1)。优选地，与对野生型TLR3的结合相比，对突变体TLR3的结合显著减小。
在另一个实施方案中，所述抗体能够抑制髓样树突细胞(MdDC)中的细胞因子(例如IP-10)分泌。在另一个实施方案中，所述抗体能够快速地且有效地内化进表达TLR3的细胞中。在另一个实施方案中，所述抗体能够在不诱导或需要hTLR3减量调节的情况下内化。
抗体CDR序列
在本发明的任意实施方案的一个方面，抗体可以包含具有根据选自式(I)至(VII)的各个式的CDR1、2和/或3序列的重链和/或轻链。在本文的任意实施方案中，可以将特定LCDR1或-2或HCDR-1或2指定为具有式(I)至(VII)的序列。在本文的任意实施方案中,可以将特定HCDR1-3或LCDR-1-3指定为具有式(I)至(VII)的序列。在一个优选的实施方案中，所述抗体包含：含有3个LCDR的轻链，和含有3个HCDR的重链。任选地，提供了一种抗体，其中将轻链和/或重链可变区中的任一个与IgG类型的免疫球蛋白恒定区(任选地人恒定区，任选地IgG1或IgG4同种型)融合。
在一个实施方案中，LCDR1包含式(I)的序列：
Xaa1-A-S-E-Xaa2-I-Xaa3-Xaa4-Xaa5-L-A(I)(SEQ ID NO:58),
其中Xaa1至Xaa5可以是保守的或非保守的置换或缺失或插入，优选地，其中Xaa1可以是Leu或Gln，和/或Xaa2可以是Asp或Gly，和/或Xaa3可以是Ser或Tyr，和/或Xaa4可以是Asn或Ser，和/或Xaa5可以是Asp、Tyr或Gly。
在一个实施方案中，LCDR2包含式(II)的序列：
A-A-Xaa6-R-L-Xaa7-D(II)(SEQ ID NO:59)，
其中Xaa6至Xaa7可以是保守的或非保守的置换或缺失或插入，优选地，其中Xaa6可以是Ser或Asn，和/或Xaa7可以是Glu或Gln。
在一个实施方案中，LCDR3包含式(III)的序列：
Xaa8-Q-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-P-Xaa13-T(III)(SEQ ID NO:60)，
其中Xaa8至Xaa13可以是保守的或非保守的置换或缺失或插入，优选地，其中Xaa8可以是Leu或Gln，和/或Xaa9可以是Ser、Asn或Gly，和/或Xaa10可以是Tyr、Ser或Val，和/或Xaa11可以是Lys或Glu，和/或Xaa12可以是Phe或Tyr，和/或Xaa13可以是Asn、Tyr、Leu或Val。
在一个实施方案中，HCDR1包含式(IV)的序列：
Xaa14-Xaa15-Y-Xaa16-Xaa17(IV)(SEQ ID NO:61)，
其中Xaa14至Xaa17可以是保守的或非保守的置换或缺失或插入，优选地，其中Xaa14可以是Tyr或Ser，和/或Xaa15可以是Thr或Asn，和/或Xaa16可以是Met或Ile，和/或Xaa17可以是Tyr或His。
在一个实施方案中，HCDR1包含式(V)的序列：
G-Y-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21(V)(SEQ ID NO:62)，
其中Xaa18至Xaa21可以是保守的或非保守的置换或缺失或插入，优选地，其中Xaa18可以是Thr或Asn，和/或Xaa19可以是Phe或Ile，和/或Xaa20可以是Arg、Trp或Thr；和/或Xaa21可以是Tyr或Ser。
在一个实施方案中，HCDR2包含式(VI)的序列：
Xaa22-I-Xaa23-P-Xaa24-Xaa25-G(VI)(SEQ ID NO:63)，
其中Xaa22至Xaa25可以是保守的或非保守的置换或缺失或插入，优选地，其中Xaa22可以是Arg或Trp，和/或Xaa23可以是Asp或Phe，和/或Xaa24可以是Ala或Gly，和/或Xaa25可以是Asn或Asp。任选地HCDR of式VI进一步包含a序列-Xaa26-Xaa27-Xaa28，其中Xaa26至Xaa28可以是保守的或非保守的置换或缺失或插入，优选地，其中Xaa26可以是Asp或Asn，和/或Xaa27可以是Thr或Ser，和/或Xaa28可以是Asn或Ile。
在一个实施方案中，HCDR3包含SEQ ID NO:21、32、43或54的序列，或式(VII)的序列：
G-Xaa29-Xaa30-Xaa31-Y-F-D(VII)(SEQ ID NO:64)，
其中Xaa29至Xaa31可以是保守的或非保守的置换或缺失或插入，优选地，其中Xaa29可以是缺失或Glu，和/或Xaa30可以是Phe或Asp，和/或Xaa31可以是Asp或Trp。
在一个实施方案中，本发明的抗体可以包含这样的轻链，所述轻链包含：
a选自SEQ ID NO:22、33、44、55和58的轻链CDR1(LCDR1)氨基酸序列；和/或
b选自SEQ ID NO:23、34、45、56和59的轻链CDR2(LCDR2)氨基酸序列；和/或
c选自SEQ ID NO:24、35、46、57和60的轻链CDR3(LCDR3)氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体可以包含这样的重链，所述重链包含：
a.选自SEQ ID NO:16-18、27-29、38-40、49-51和61-62的重链CDR1(HCDR1)氨基酸序列；和/或
b.选自SEQ ID NO:19、20、31、31、41、42、52、53和63的重链CDR2(HCDR2)氨基酸序列；和/或
c.选自SEQ ID NO:21、32、43、54和64的重链CDR3(HCDR3)氨基酸序列。
抗体11E1
11E1的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:3，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:4。在一个具体实施方案中，本发明提供了一种抗体，所述抗体结合与单克隆抗体11E1基本上相同的表位或决定簇；任选地，所述抗体包含抗体11E1的抗原结合区。在本文中的任意实施方案中,抗体11E1可以通过它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体包含11E1的Fab或F(ab′)2部分。还提供了一种单克隆抗体，其包含11E1的重链可变区。根据一个实施方案，所述单克隆抗体包含11E1的重链可变区的3个CDR。还提供了一种单克隆抗体，其进一步包含11E1的可变轻链可变区或11E1的轻链可变区的1个、2个或3个CDR。任选地，所述轻链或重链CDR中的任意一个或多个可以含有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(例如，置换、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包含抗体11E1的抗原结合区的一部分或全部的任意轻链和/或重链可变区与IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选地人恒定区，任选地人IgG1或IgG4同种型)融合。在另一个优选实施方案中，所述抗体是11E1。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体或纯化的编码抗体的多核苷酸，其中所述抗体包含：VHCDR1区域，其包含如在SEQ ID NO:5、6或7中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VHCDR2区域，其包含如在SEQ ID NO:8或9中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VHCDR3区域，其包含如在SEQID NO:10中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR1区域，其包含如在SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR2区域，其包含如在SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR3区域，其包含如在SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。
在另一个方面，本发明提供了一种结合人TLR3的抗体，所述抗体包含：
a.SEQ ID NO:3的重链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
b.SEQ ID NO:4的轻链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
c.SEQ ID NO:3的重链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；和SEQ ID NO:4的轻链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
d.如在SEQ ID NO:5-10中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
e.如在SEQ ID NO:11-13中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
f.如在SEQ ID NO:5-10中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；和如在SEQ IDNO:11-13中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
g.具有CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列各自与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的可变区的CDR 1、2和3具有至少60％、70％、80％、85％、90％或95％同一性，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
h.具有CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列各自与具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变区的CDR 1、2和3具有至少60％、70％、80％、85％、90％或95％同一性，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。
在本文中任意实施方案的另一个方面，可以将重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个表征为具有这样的氨基酸序列：其与在对应的SEQ ID NO中列出的特定CDR或CDR集合具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其与上面的(a)至(h)的单克隆抗体竞争对TLR3的结合。
抗体31F6
31F6的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:14，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:15。在一个具体实施方案中，本发明提供了一种抗体，其结合与单克隆抗体31F6基本上相同的表位或决定簇；任选地，所述抗体包含抗体31F6的抗原结合区。在本文中的任意实施方案中,抗体31F6可以通过它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体包含31F6的Fab或F(ab')2部分。还提供了一种单克隆抗体，其包含31F6的重链可变区。根据一个实施方案，所述单克隆抗体包含31F6的重链可变区的3个CDR。还提供了一种单克隆抗体，其进一步包含31F6的可变轻链可变区或31F6的轻链可变区的1个、2个或3个CDR。任选地，所述轻链或重链CDR中的任意一个或多个可以含有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(例如置换、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包含抗体31F6的抗原结合区的一部分或全部的任意轻链和/或重链可变区与IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选地人恒定区，任选地人IgG1或IgG4同种型)融合。在另一个优选实施方案中，所述抗体是31F6。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体或纯化的编码抗体的多核苷酸，其中所述抗体包含：VHCDR1区域，其包含如在SEQ ID NO:16、17或18中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VHCDR2区域，其包含如在SEQ ID NO:19或20中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VHCDR3区域，其包含如在SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR1区域，其包含如在SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR2区域，其包含如在SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR3区域，其包含如在SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。
在另一个方面，本发明提供了一种结合人TLR3的抗体，所述抗体包含：
a.SEQ ID NO:14的重链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
b.SEQ ID NO:15的轻链可变区，其中1个、2个3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
c.SEQ ID NO:14的重链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；和SEQ ID NO:15的轻链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
d.如在SEQ ID NO:16-21中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
e.如在SEQ ID NO:22-24中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
f.如在SEQ ID NO:16-21中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；和如在SEQ IDNO:22-24中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
g.具有CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列各自与具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变区的CDR 1、2和3具有至少60％、70％、80％、85％、90％或95％同一性，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
h.具有CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列各自与具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变区的CDR 1、2和3具有至少60％、70％、80％、85％、90％或95％同一性，其中这些氨基酸中的1个、2个、3个、4个、5个或更多个可以被不同的氨基酸置换。
在本文中任意实施方案的另一个方面，可以将重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个表征为具有这样的氨基酸序列：其与在对应的SEQ ID NO中列出的特定CDR或CDR集合具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其与上面的(a)至(h)的单克隆抗体竞争对TLR3的结合。
抗体32C4
32C4的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:25，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:26。在一个具体实施方案中，本发明提供了一种抗体，其结合与单克隆抗体32C4基本上相同的表位或决定簇；任选地，所述抗体包含抗体32C4的抗原结合区。在本文中的任意实施方案中,抗体32C4可以通过它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体包含32C4的Fab或F(ab')2部分。还提供了一种单克隆抗体，其包含32C4的重链可变区。根据一个实施方案，所述单克隆抗体包含32C4的重链可变区的3个CDR。还提供了一种单克隆抗体，其进一步包含32C4的可变轻链可变区或32C4的轻链可变区的1个、2个或3个CDR。任选地，所述轻链或重链CDR中的任意一个或多个可以含有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(例如置换、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包含抗体32C4的抗原结合区的一部分或全部的任意轻链和/或重链可变区与IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选地人恒定区，任选地人IgG1或IgG4同种型)融合。在另一个优选的实施方案中，所述抗体是32C4。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体或纯化的编码抗体的多核苷酸，其中所述抗体包含：VHCDR1区域，其包含如在SEQ ID NO:27、28或29中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VHCDR2区域，其包含如在SEQ ID NO:30或31中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VHCDR3区域，其包含如在SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR1区域，其包含如在SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR2区域，其包含如在SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR3区域，其包含如在SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。
在另一个方面，本发明提供了一种结合人TLR3的抗体，所述抗体包含：
a.SEQ ID NO:25的重链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
b.SEQ ID NO:26的轻链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
c.SEQ ID NO:25的重链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；和SEQ ID NO:26的轻链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
d.如在SEQ ID NO:27-32中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
e.如在SEQ ID NO:33-35中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
f.如在SEQ ID NO:27-32中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；和如在SEQ IDNO:33-35中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
g.具有CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列各自与具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的可变区的CDR 1、2和3具有至少60％、70％、80％、85％、90％或95％同一性，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
h.具有CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列各自与具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的可变区的CDR 1、2和3具有至少60％、70％、80％、85％、90％或95％同一性，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。
在本文中任意实施方案的另一个方面，可以将重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个表征为具有这样的氨基酸序列：其与在对应的SEQ ID NO中列出的特定CDR或CDR集合具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其与上面的(a)至(h)的单克隆抗体竞争对TLR3的结合。
抗体37B7
37B7的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:36，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:37。在一个具体实施方案中，本发明提供了一种抗体，其结合与单克隆抗体37B7基本上相同的表位或决定簇；任选地，所述抗体包含抗体37B7的抗原结合区。在本文中的任意实施方案中,抗体37B7可以通过它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体包含37B7的Fab或F(ab')2部分。还提供了一种单克隆抗体，其包含37B7的重链可变区。根据一个实施方案，所述单克隆抗体包含37B7的重链可变区的3个CDR。还提供了一种单克隆抗体，其进一步包含37B7的可变轻链可变区或37B7的轻链可变区的1个、2个或3个CDR。任选地，所述轻链或重链CDR中的任意一个或多个可以含有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(例如置换、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包含抗体37B7的抗原结合区的一部分或全部的任意轻链和/或重链可变区与IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选地人恒定区，任选地人IgG1或IgG4同种型)融合。在另一个优选的实施方案中，所述抗体是37B7。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体或纯化的编码抗体的多核苷酸，其中所述抗体包含：VHCDR1区域，其包含如在SEQ ID NO:38、39或40中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VHCDR2区域，其包含如在SEQ ID NO:41或42中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VHCDR3区域，其包含如在SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR1区域，其包含如在SEQ ID NO:44中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR2区域，其包含如在SEQ ID NO:45中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR3区域，其包含如在SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。
在另一个方面，本发明提供了一种结合人TLR3的抗体，所述抗体包含：
a.SEQ ID NO:36的重链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
b.SEQ ID NO:37的轻链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
c.SEQ ID NO:36的重链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；和SEQ ID NO:37的轻链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
d.如在SEQ ID NO:38-43中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
e.如在SEQ ID NO:44-46中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
f.如在SEQ ID NO:38-43中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；和如在SEQ IDNO:44-46中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
g.具有CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列各自与具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的可变区的CDR 1、2和3具有至少60％、70％、80％、85％、90％或95％同一性，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
h.具有CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列各自与具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的可变区的CDR 1、2和3具有至少60％、70％、80％、85％、90％或95％同一性，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。
在本文中任意实施方案的另一个方面，可以将重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个表征为具有这样的氨基酸序列：其与在对应的SEQ ID NO中列出的特定CDR或CDR集合具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其与上面的(a)至(h)的单克隆抗体竞争对TLR3的结合。
抗体7G11
7G11的重链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:47，轻链可变区的氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:48。在一个具体实施方案中，本发明提供了一种抗体，其结合与单克隆抗体7G11基本上相同的表位或决定簇；任选地，所述抗体包含抗体7G11的抗原结合区。在本文中的任意实施方案中,抗体7G11可以通过它的氨基酸序列和/或编码它的核酸序列来表征。在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体包含7G11的Fab或F(ab')2部分。还提供了一种单克隆抗体，其包含7G11的重链可变区。根据一个实施方案，所述单克隆抗体包含7G11的重链可变区的3个CDR。还提供了一种单克隆抗体，其进一步包含7G11的可变轻链可变区或7G11的轻链可变区的1个、2个或3个CDR。任选地，所述轻链或重链CDR中的任意一个或多个可以含有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(例如置换、插入或缺失)。任选地，提供了一种抗体，其中包含抗体7G11的抗原结合区的一部分或全部的任意轻链和/或重链可变区与IgG型的免疫球蛋白恒定区(任选地人恒定区，任选地人IgG1或IgG4同种型)融合。在另一个优选的实施方案中，所述抗体是7G11。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体或纯化的编码抗体的多核苷酸，其中所述抗体包含：VHCDR1区域，其包含如在SEQ ID NO:49、50或51中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VHCDR2区域，其包含如在SEQ ID NO:52或53中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VHCDR3区域，其包含如在SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR1区域，其包含如在SEQ ID NO:55中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR2区域，其包含如在SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；VLCDR3区域，其包含如在SEQ ID NO:57中所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。
在另一个方面，本发明提供了一种结合人TLR3的抗体，所述抗体包含：
a.SEQ ID NO:47的重链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
b.SEQ ID NO:48的轻链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
c.SEQ ID NO:47的重链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；和SEQ ID NO:48的轻链可变区，其中1个、2个、3个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
d.如在SEQ ID NO:49-54中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
e.如在SEQ ID NO:55-57中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
f.如在SEQ ID NO:49-54中所示的重链CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；和如在SEQ IDNO:55-57中所示的轻链CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
g.具有CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列的重链可变区，所述氨基酸序列各自与具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的可变区的CDR 1、2和3具有至少60％、70％、80％、85％、90％或95％同一性，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换；或
h.具有CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列的轻链可变区，所述氨基酸序列各自与具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的可变区的CDR 1、2和3具有至少60％、70％、80％、85％、90％或95％同一性，其中1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸可以被不同的氨基酸置换。
在本文中任意实施方案的另一个方面，可以将重链和轻链的CDR 1、2和3中的任一个表征为具有这样的氨基酸序列：其与在对应的SEQ ID NO中列出的特定CDR或CDR集合具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性。
在另一个方面，本发明提供了一种抗体，其与上面的(a)至(h)的单克隆抗体竞争对TLR3的结合。
抗体7G11和32C4的CDR序列源自大鼠IGKV12s30*01和IGHV1s6*01基因分别就轻链和重链而言的VL和VH基因重排。抗体31F6的重链的CDR序列也源自大鼠IGHV1s6*01基因的VH基因重排，而轻链CDR序列源自大鼠IGKV12s8*0基因的VL基因重排。在本发明的一个方面，根据本发明的一种抗体的轻链得自特定核酸序列或由其编码，所述特定核酸序列源自选自IGKV12s30*01和IGKV12s8*0关于V基因的VL基因重排。在本发明的一个方面，根据本发明的一种抗体的重链得自特定核酸序列或由其编码，所述特定核酸序列源自选自IGHV1s6*01关于V基因的VH基因重排。
在本发明的任意抗体(例如，11E1、7G11、31F6、32C4或37B7)中，所指定的可变区和CDR序列可以包含保守的序列修饰。保守的序列修饰表示不会显著地影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。通过本领域已知的标准技术(诸如定位诱变和PCR介导的诱变)，可以将修饰引入本发明的抗体中。保守氨基酸置换通常是这样的置换：其中用一个含有具有类似物理化学性能的侧链的氨基酸残基来替换某个氨基酸残基。所指定的可变区和CDR序列可以包含1个、2个、3个、4个或更多个氨基酸插入、缺失或置换。在进行置换的情况下，优选的置换应当是保守修饰。具有类似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明抗体的CDR区域内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替换，并且可以使用本文中描述的测定来试验经改变的抗体所保留的功能(即，本文中阐述的性能)。
术语“同一性”或“相同”当用于两种或更多种多肽的序列之间的关系中时，表示多肽之间的序列关联性程度，正如通过两个或更多个氨基酸残基的链之间的匹配数量所确定的。“同一性”量度具有间隙比对(如果存在的话)的2个或多个序列中较小者之间相同匹配的百分比，所述间隙比对通过特定数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决。通过已知的方法，可以容易地计算相关多肽的同一性。这样的方法包括、但不限于在以下文献中描述的那些方法：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,编,Oxford UniversityPress,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,编,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第1部分,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysisin Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence AnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编,M.Stockton Press,New York,1991；和Carillo等人,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)。
用于确定同一性的优选方法被设计成给出所试验的序列之间的最大匹配。在公众可得到的计算机程序中描述了确定同一性的方法。用于确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，其包括GAP(Devereux等人,Nucl.Acid.Res.12,387(1984)；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人,J.Mol.Biol.215,403-410(1990))。BLASTX程序可以公开地从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST Manual,Altschul等人.NCB/NLM/NIHBethesda,Md.20894；Altschul等人,出处同上)得到。众所周知的Smith Waterman算法也可以用于确定同一性。
根据AbM(Oxford Molecular的AbM抗体建模软件定义)、Kabat和Chothia定义系统，已经将根据本发明的抗体的CDR的序列总结在下面表1和2中。根据Abm、Kabat和Chothia编号系统，将本文中描述的氨基酸序列编号。尽管可以将任意合适的编号系统用于指定的CDR区域，但是在没有任意其它指示存在下，可以使用Abm编号。已经使用以下指示建立了这样的编号：CDR-L1：起始：大约残基24，残基之前：总是Cys，残基之后：总是Trp(通常是Trp-Tyr-Gln，但也可以是Trp-Leu-Gln、Trp-Phe-Gln、Trp-Tyr-Leu)，长度：10至17个残基；CDR-L2：起始：在L1的末端之后总是16个残基，残基之前：通常是Ile-Tyr(但也可以是Val-Tyr、Ile-Lys、Ile-Phe)，长度：总是7个残基；CDR-L3，起始：在L2末端之后总是33个残基，残基之前：总是Cys，残基之后：总是Phe-Gly-Xaa-Gly，长度：7至11个残基；CDR-H1，起始：大约残基26(在Cys之后总是4个)(Chothia/AbM定义，Kabat定义在5个残基之后起始)，残基之前：总是Cys-Xaa-Xaa-Xaa，残基之后：总是Trp(通常是Trp-Val，但也可以是Trp-Ile、Trp-Ala)，长度：10至12个残基(AbM定义，Chothia定义排除了最后4个残基)；CDR-H2，起始：在CDR-H1的Kabat/AbM定义的末端之后总是15个残基，残基之前：通常是Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(但有很多变化，残基之后：Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala)，长度：Kabat定义16至19个残基；AbM(和Chothia)定义在7个残基之前结束；CDR-H3，起始：在CDR-H2末端之后总是33个残基(在Cys之后总是2个)，残基之前：总是Cys-Xaa-Xaa(通常Cys-Ala-Arg)，残基之后：总是Trp-Gly-Xaa-Gly，长度：3-25个残基。
在一个实施方案中，本发明的抗体是人或小鼠IgG1同种型。在另一个实施方案中，本发明的抗体是人IgG4同种型。在一个实施方案中，本发明的抗体是保留它们的结合和/或功能性能的抗体片段。
本发明的单克隆抗体的片段和衍生物
通过本领域已知的技术，可以生产本发明的抗体的片段和衍生物(它们被在本申请中使用的术语“抗体”包括，除非另有说明或与上下文明显矛盾)，优选11E1、7G11、31F6、32C4或37B7-样抗体。“片段”包含完整抗体的一部分，通常是抗原结合位点或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；双体；任何抗体片段，其为具有由一个邻接氨基酸残基的连续序列组成的一级结构的多肽(在本文中被称作“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括、但不限于(1)单链Fv分子，(2)仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽、或其片段，所述片段含有所述轻链可变结构域的3个CDR，而没有相关的重链部分，和(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽、或其片段，所述片段含有重链可变区的3个CDR，而没有相关的轻链部分；和由多个抗体片段形成的多特异性抗体。尤其包括纳米体、结构域抗体、单结构域抗体或“dAb”。
可以使用标准方法得到本发明的抗体的片段。例如，根据常规技术，通过分离抗体的蛋白酶消化，可以产生Fab或F(ab′)2片段。应当理解，可以使用已知的方法来修饰免疫反应片段，例如为了减慢体内清除率和得到更合乎需要的药代动力学分布，可以用聚乙二醇(PEG)来修饰所述片段。在例如Leong等人,16(3):106-119(2001)和Delgado等人,Br.J.Cancer 73(2):175-182(1996)(它们的公开内容通过引用并入本文)中，描述了用于将PEG偶联至Fab'片段并且位点特异性地缀合至Fab'片段的方法。
可替换地，可以修饰生产本发明的抗体(优选11E1、7G11、31F6、32C4或37B7-样抗体)的杂交瘤的DNA，从而编码本发明的片段。然后将经修饰的DNA插入表达载体中，并且用于转化或转染适当的细胞，所述细胞然后表达期望的片段。
在某些实施方案中，在插入表达载体中之前，可以修饰生产本发明的抗体(优选11E1、7G11、31F6、32C4或37B7-样抗体)的杂交瘤的DNA，例如，通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列替代同源非人序列(例如，Morrison等人,PNAS第6851页(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价连接至免疫球蛋白编码序列。以此方式，制备“嵌合的”或“杂交的”抗体，所述抗体具有原始抗体的结合特异性。通常，这样的非免疫球蛋白多肽替换了本发明的抗体的恒定结构域。
因而，根据另一个实施方案，本发明的抗体，优选11E1、7G11、31F6、32C4或37B7-样抗体，是人源化的。根据本发明的抗体的“人源化”形式是特定的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其含有从鼠或大鼠免疫球蛋白衍生出的最小序列。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自所述受体的互补决定区(CDR)的残基被来自原始抗体(供体抗体)的CDR的残基替换，同时保持期望的原始抗体的特异性、亲和力和能力。
在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基可以被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在输入的CDR或框架序列中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、并且通常两个可变结构域，其中所有的或基本上所有的CDR区对应于原始抗体的那些CDR区，并且所有的或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体还最佳地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。关于其它细节，参见Jones等人,Nature,321,第522页(1986)；Reichmann等人,Nature,332,第323页(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2,第593页(1992)；Verhoeyen et Science,239,第1534页；和美国专利号4,816,567，它们的整个公开内容通过引用并入本文。用于将本发明的抗体人源化的方法是本领域众所周知的。
要用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择，对于降低抗原性而言是非常重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个库，筛选本发明的抗体的可变结构域的序列。然后，将最接近小鼠序列的人序列接受为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.151,第2296页(1993)；Chothia和Lesk,J.Mol.196,1987,第901页)。另一种方法使用来自所有人抗体的轻链或重链的特定亚组的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等人,PNAS89,第4285页(1992)；Presta等人,J.Immunol.,151,第2623页(1993))。
进一步重要的是，在保留对TLR3受体的高亲和力和其它有利的生物学特性的情况下，将抗体人源化。为了实现该目的，根据一种优选的方法，使用亲本序列和人源化序列的三维模型，通过分析亲本序列和不同概念的人源化产物的方法，制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是通常可得到的，并且是本领域技术人员熟知的。可以得到阐明并且显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维结构的计算机程序。对这些显示的检查，允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白的结合其抗原的能力的残基。以此方式，可以从共有序列和输入序列中选择并且组合FR残基，从而实现期望的抗体特征，诸如增加的对靶抗原的亲和力。一般而言，CDR残基直接地并且最显著地涉入影响抗原结合。
制备“人”单克隆抗体的另一种方法是使用XenoMouse(Abgenix,Fremont,CA)作为用于免疫接种的小鼠。XenoMouse是根据本发明的鼠宿主，其免疫球蛋白基因被功能性的人免疫球蛋白基因替换。因此，由该小鼠产生的抗体或从该小鼠的B细胞制备的杂交瘤所产生的抗体是人抗体(或已经人源化的抗体)。在美国专利号6,162,963中描述了XenoMouse，它通过引用整体并入本文中。
还可以根据多种其它技术来生产人抗体，诸如通过使用其它转基因动物进行免疫接种，所述转基因动物已经经过工程改造以表达人抗体所有组成成分(Jakobovitz etNature 362(1993)255)，或通过使用噬菌体展示方法选择抗体所有组成成分。这样的技术是技术人员已知的，并且可以从本申请中公开的单克隆抗体开始实施。
本发明的抗体，优选11E1、7G11、31F6、32C4或37B7-样抗体，还可以被衍生成“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链/轻链的一部分与原始抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与从另一个物种衍生出抗体或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列、以及这样的抗体的片段相同或同源，只要它们表现出期望的生物活性和结合特异性(Cabilly等人,出处同上；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第6851页(1984))。
定量施用方案
基于使用抗-TLR3抗体在体内实验中收集的效力数据，发明人已经确定，低至100μg/小鼠的剂量会产生治疗效果。这样的剂量等同于在小鼠中的4mg/kg，并因此等同于在人受试者中的0.5mg/kg。因此，在本发明的方法中，可以以被包含在下述范围内的剂量施用抗TLR3-抗体：在人类中0.05-20mg/kg，优选0.1-10mg/kg，进一步优选0.5-5mg/kg(例如约25mg至500mg的单位剂量)。
一个示例性的治疗方案需要如下施用：每周2次、每周1次、每2周1次、每3周1次、每4周1次、每个月1次、每2-3个月1次、或每3-6个月1次。抗-TLR3抗体的示例性剂量方案包括0.05-20mg/kg体重(优选地0.1-10mg/kg体重，进一步优选地0.5-5mg/kg体重)，经由静脉内施用或皮下注射，其中使用下述定量施用方案之一施用抗体：(i)约每1、2、3或4周1次(例如，共2-4剂)、然后每1-3个月1次的负荷剂量；(ii)每个月1次或每2个月1次的阶段；(iii)每1-2周或任意其它最佳定量剂量。
任选地以这样的剂量施用抗-TLR3抗体：所述剂量适合于诱导基本上完全TLR3受体饱和(90％，任选地95％受体饱和)，例如在靶向的细胞中表达的TLR3多肽的饱和。由于认为TLR3受体在信号传递之前二聚化，至少20％、30％、40％、50％受体饱和对小于完全饱和的抑制可用于治疗疾病。在一个实施方案中，约每周2次至约每个月1次、或约每个月1次至约每2个月1次，施用导致至少约20％、30％、40％、50％、90％或95％受体饱和的抗-TLR3抗体的剂量。例如，可以将所述剂量施用至少3次、至少6次或更多次。例如，所述方法可以包括：以在靶向的细胞上达到至少约20％、30％、40％、50％、90％或95％TLR3受体饱和的剂量和施用频率施用抗-TLR3抗体，持续至少约2周、1个月、6个月、9个月或12个月。在一个优选的实施方案中，方案会导致持续的基本上完全受体饱和。施用导致持续至少约1周、2周或1个月的时段的基本上完全受体饱和的抗-TLR3抗体的剂量。
可以在其中存在靶细胞的人样品(例如全血、为炎症部位的任何组织、滑液)上评价受体占据。使用本领域已知的方法，经由细胞内染色，通过FACS分析，可以测量TLR3受体的饱和百分比，因为TLR3受体存在于细胞中。可替换地，使用响应于TLR3配体(诸如在得自患者的单核细胞(优选PBMC)中的dsRNA(即聚AU))的细胞因子抑制分泌特性试验，可以确定饱和百分比。有效的细胞因子抑制与有效的治疗效果相关联，并且然后可以为每位患者改进剂量。在该测定中可以测量的细胞因子是例如IP-10或IL-6。在另一个实施方案中，将受体饱和评估为受体占据，例如通过进行游离位点和结合位点测定。简而言之，在得自生物样品的靶细胞上评估游离的和结合的TLR3受体水平，所述生物样品得自用抗-TLR3抗体治疗的个体，其中游离位点测定通过用施用给个体的PE-缀合形式的抗-TLR3抗体染色来评估未结合的TLR3。结合位点测定通过用PE-缀合的小鼠抗-人IgG4单克隆抗体(其识别与TLR3多肽结合的抗-TLR3抗体)(当抗-TLR3抗体是人IgG4同种型时)染色来评估被抗-TLR3抗体占据的TLR3多肽。在一个实施方案中，本发明进一步提供了一种治疗个体的方法，所述方法包括：(a)给个体施用抗-TLR3抗体，和(b)确定所述个体中的TLR3受体饱和，任选地进一步确定要施用给所述个体的抗-TLR3抗体的剂量。
剂型
通过以低压冻干制剂或水溶液的形式将具有期望的纯度程度的拮抗剂与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制备根据本发明使用的拮抗剂的治疗制剂进行贮存。关于制剂的一般信息，参见，例如，Gilman等人(编),The Pharmacological Basesof Therapeutics,第8版(Pergamon Press,1990)；Gennaro(编),Remington’sPharmaceutical Sciences,第18版(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990)；Avis等人(编),Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications(Dekker,New York,1993)；Lieberman等人(编),Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets(Dekker,New York,1990)；Lieberman等人(编)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems(Dekker,New York,1990)；和Walters(编),Dermatological and Transdermal Formulations(Drugs and the Pharmaceutical Sciences),第119卷(Dekker,New York,2002)。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度是对受体无毒的，且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；糖诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。
示例性抗体制剂描述在例如WO 1998/56418中，其描述了在pH 5.0的抗-CD20抗体的液体多剂量制剂，该制剂包含40mg/mL利妥昔单抗、25mM乙酸盐、150mM海藻糖、0.9％苯甲醇和0.02％聚山梨酯20TM，其具有在2-8℃贮存最少2年的贮存期限。另一种感兴趣的抗-CD20制剂包含在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨酯80TM和无菌注射用水中的10mg/mL利妥昔单抗，pH 6.5。
适合用于皮下施用的低压冻干制剂描述在例如美国专利号6,267,958(Andya等人)中。这样的低压冻干制剂可以用合适的稀释剂重构至高蛋白浓度，并且可以将重构的制剂皮下地施用给本文中要治疗的哺乳动物。
也预见到结晶形式的拮抗剂。参见，例如，US 2002/0136719A1(Shenoy等人)。
本文中的制剂还可以含有超过一种活性化合物(如上指出的第二种药物)，优选具有互补活性的那些，其不会不利地彼此影响。这样的药物的类型和有效量取决于例如在制剂中存在的B-细胞拮抗剂的量和类型以及受试者的临床参数。上面指出了优选的这样的第二种药物。
还可以将活性成分封装在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备，例如，羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米囊)中或在大乳剂中。这样的技术公开在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,出处同上。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质是呈成形物的形式，例如膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟乙酸共聚物诸如醋酸亮丙瑞林DepotTM(由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
要用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过穿过无菌过滤膜过滤容易地实现。可以用在这些组合物中的药学上可接受的载体包括、但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白(诸如人血清白蛋白)，缓冲物质，诸如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡类，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂。本发明的抗体可以用在调节、例如抑制患者中的表达TLR3的细胞的活性的方法中。该方法包括使患者与所述组合物接触(例如将所述组合物施用给所述患者)的步骤。这样的方法可用于预防和治疗目的。
制剂可以适合于鼻或吸入途径。制剂可以包含药学上可接受的鼻载体。对于鼻递送，可以使用任意众所周知的递送方法诸如滴剂、鼻腔喷雾剂、鼻液体或粉末气雾剂、胶囊剂或鼻插入物。对于气雾剂递送，可以使用任意众所周知的递送方法诸如喷雾器、吸入器、雾化器、气雾器、轻雾器(mister)、干粉吸入器、计量剂量吸入器、计量剂量喷雾器、计量剂量轻雾器、计量剂量雾化器或其它合适的递送装置。
将在下述实验部分中公开本发明的其它方面和优点，其应当视作示例性的，且不是限制本申请的范围。
疾病的治疗
本发明提供了用于治疗具有自身免疫疾病或炎性疾病的个体的方法，所述方法包括：给所述个体施用本发明的抗-TLR3抗体。所述抗体可以包含在进一步包含药学上可接受的载体的组合物中。这样的组合物也被称作本发明的“抗体组合物”。在一个实施方案中，本发明的抗体组合物包含在以上抗体实施方案中公开的抗体。
本发明进一步提供了一种在有此需要的患者中调节表达TLR3的细胞活性的方法，所述方法包括下述步骤：给所述患者施用根据本发明的组合物。所述方法更具体地涉及降低患者中的TLR3细胞活性，所述患者具有这样的疾病：其中降低的TLR3细胞活性是有益的(例如，自身免疫疾病、炎性疾病、传染性疾病、病毒感染)，或其由过度的TLR3细胞活性造成或以过度的TLR3细胞活性为特征。在一个实施方案中，抑制表达TLR3的细胞活性，其中所述患者具有这样的疾病或障碍，其中这样的抑制可以促进、增强和/或诱导治疗效果(或在至少高比例的具有所述疾病或障碍和与所述患者基本上类似的特征的患者中促进、增强和/或诱导这样的效果，如可以通过例如临床试验所确定的)。
可以在其中使用本发明的方法的疾病和病症包括具有以下特征的所有疾病：其中调节TLR3可以是有益的，包括例如由TLR3信号传递或由所述TLR3信号传递以后产生的细胞因子部分地或完全地介导或加重的疾病。具体地，在使用抑制TLR3信号传递的抗体的情况下，这样的障碍包括由TLR3信号传递或由所述TLR3信号传递以后产生的细胞因子部分地或完全地介导或加重的任何障碍，尤其包括免疫障碍诸如炎性疾病和自身免疫疾病。更具体地，将本发明的方法用于治疗多种免疫障碍和其它疾病，包括、但不限于自身免疫、炎症、变态反应、哮喘、感染(例如慢性感染、病毒感染)和脓毒症。用抑制TLR3信号传递的抗体可以治疗的疾病的例子包括、但不限于：关节炎、系统性红斑狼疮、脓毒症、哮喘、骨质疏松症、针对中枢神经系统抗原的自身免疫、自身免疫性糖尿病、炎性肠病、自身免疫性心炎和自身免疫性肝炎。
在另一个实施方案中，本发明的抑制通过TLR3多肽进行的信号传递的抗-TLR3抗体用于治疗或预防移植物抗宿主病(GvHD)，例如在移植或输血中。具体地，在骨髓移植以后，存在于移植物中的T细胞(作为污染物或有意地引入宿主中)在将宿主组织感知为抗原性外来物以后会攻击移植受体的组织。所述T细胞会产生过量的细胞因子，包括TNF-α和干扰素-γ(IFNγ)。可以在移植或输血(例如同种异体骨髓移植)之前、过程中或之后施用抗-TLR3抗体，特别是在癌症(例如白血病)的治疗中。所述抗体可以是抑制TLR3多肽的信号传递的任何抗-TLR3抗体。由于认为GvHD主要由抗原呈递细胞驱动，认为抑制DC中的TLR3信号传递的抗-TLR3抗体是特别有用的。
使用根据本发明的抑制TLR3信号传递的抗体可治疗的其它免疫障碍尤其包括自身免疫性障碍和炎性障碍，包括、但不限于，克罗恩氏病、乳糜泻、溃疡性结肠炎、应激性肠综合征、急性弥散性脑脊髓炎(ADEM)、阿狄森氏病、抗磷脂抗体综合征(APS)、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、糖尿病、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯病、格-巴二氏综合征(GBS)、桥本氏病、红斑狼疮、脱髓鞘病症、多发性硬化、重症肌无力、眼球阵挛肌阵挛综合征(OMS)、视神经炎、Ord氏甲状腺炎、天疱疮、肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、莱特尔综合症、高安动脉炎、颞动脉炎、温型自身免疫性溶血性贫血、韦格纳氏肉芽肿病、阑尾炎、动脉炎、关节炎、睑缘炎、细支气管炎、支气管炎、滑囊炎、宫颈炎、胆管炎、胆囊炎、绒毛膜羊膜炎、结肠炎、结膜炎、膀胱炎、泪腺炎、皮炎、皮肌炎、脑炎、心内膜炎、子宫内膜炎、肠炎、小肠结肠炎、上髁炎、附睾炎、筋膜炎、纤维组织炎、胃炎、胃肠炎、牙龈炎、肝炎、化脓性汗腺炎、回肠炎、虹膜炎、喉炎、乳腺炎、脑膜炎、脊髓炎、心肌炎、肌炎、肾炎、脐炎、卵巢炎、睾丸炎、骨炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽炎、肋膜炎、静脉炎、肺炎、直肠炎、前列腺炎、肾盂肾炎、鼻炎、输卵管炎、鼻窦炎、口炎、滑膜炎、腱炎、扁桃体炎、葡萄膜炎、阴道炎、血管炎和外阴炎。
本发明的一个方面是，提供一种组合物，其能够治疗SIRS、脓毒症、严重的脓毒症或脓毒性休克。本发明的另一个方面是，提供一种用于预防性处理患者的方法，所述患者处于发展脓毒症的风险中。例如，已经通过外科手术切除了他们的脾的患者，具有受损的免疫系统(即化学疗法治疗、免疫抑制)的患者，但是也包括其它原因，诸如长期类固醇药物治疗、糖尿病、AIDS或肝硬化、大烧伤或严重损伤、感染诸如肺炎、脑膜炎、腹膜炎、阑尾炎、蜂窝织炎、泌尿道感染或在重大外科手术操作以后发生的感染。
在一个实施方案中，所述个体具有已经被宣告延长的时间段(例如超过1年)的自身免疫疾病或炎性疾病，具有发生中的或活跃的炎症的征象，具有疾病的物理征象(例如关节肿胀、病变、神经学征状等)，具有慢性疾病，具有严重疾病(如通过适用标准来评估的，例如在类风湿性关节炎中的DAS或ACR标准)，或具有进展中的疾病。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗具有确定的自身免疫疾病或炎性疾病的个体的方法，所述方法包括：给所述个体施用抗-TLR3抗体。在一个实施方案中，本发明提供了使用TLR3抗体(或有关的组合物)治疗自身免疫疾病或炎性疾病的急性期或发作、危机、恶化或爆发的方法，优选地其中将所述抗体施用给处于自身免疫疾病或炎性疾病的急性期中或处于发作、危机、恶化或爆发中的个体。在一个实施方案中，所述疾病选自：类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病或直肠结肠炎、红斑狼疮、肝炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)或哮喘、强直性脊柱炎和有关的疾病。在一个实施方案中，所述疾病的特征在于TLR3配体(例如细胞外的dsRNA)的存在。在一个实施方案中，所述疾病的特征在于可检测水平的蛋白水解酶、炎性介质、进行中的炎症的标志物或促炎性细胞因子(例如TNF-α和/或白介素-1(IL-1))的存在。优选地，所述抗体抑制通过TLR3多肽进行的信号传递，任选地进一步在酸性条件下，且具有高结合亲和力，任选地在人树突细胞中。
治疗通常包括：递送有效量的包含抗-TLR3抗体的组合物，其目的是阻止任何征状或疾病状态发展或恶化，或其目的是预防(例如阻止或推迟进展),缓解、改善或根除(治愈)已经发展的这样的征状或疾病状态。通过特定类型的疾病的标准医学标准，可以定义疾病诊断、演化和分级(或分期)，以便确定个体是否具有确定的疾病，是否处于急性期是否，是否在发展中，是否是慢性的，是否具有身体征状，或是否具有某种水平的严重程度。同样地，通过任意合适的医学标准，可以鉴别发作、危机、恶化或爆发。
在一个实施方案中，本发明将包括以下步骤：进行评价或试验步骤，以评估疾病的存在、阶段、演化或分级。因而，在一个方面，本发明提供了一种治疗患者的自身免疫疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括：(a)进行患者中的疾病的评价；和(b)如果所述患者具有适合用本发明的抗-TLR3抗体治疗的疾病，那么给所述患者施用有效剂量的抗-TLR3抗体。任选地，这样的评价步骤可以包括：从疑似具有自身免疫疾病或炎性疾病的患者得到生物样品。通过本领域已知的任意合适的技术，例如通过执行基于实验室的试验，可以实现评价疾病的方法(例如诊断、分期等)。合适的技术的例子包括：进行基于PCR或RT-PCR的测定(例如，以检测疾病有关的核酸或基因，经常被称作“标志物”或“生物标志物”)、活组织检查、内窥镜检查术、粪便研究、任何非侵袭性实验室试验(例如贫血和感染，用于筛查肝和胆管问题的肝功能试验，针对细菌、病毒和寄生虫感染的试验)、超声、CT、MRE、MRI和其它成像技术、染色体分析、免疫测定/免疫细胞化学检测技术(例如自身抗体的存在)、组织学和/或组织病理学测定、血清蛋白电泳、流式细胞计量术(例如免疫细胞、T细胞等的检测)、动脉血气体(ABG)分析(在哮喘或COPD中)和体格检查技术(例如，针对身体征状、具有滑膜炎的关节的数目等)。在一个实施方案中，所述方法包括检测自身抗体的存在，例如检测类风湿因子(RhF)、抗-环瓜氨酸肽抗体、抗-ssRNA抗体、抗-dsRNA抗体、抗-Smith抗体、抗-磷脂抗体、抗-细胞核抗体和/或抗-肌动蛋白抗体。在一个实施方案中，所述方法包括：评估蛋白水解酶、炎性介质、进行中的炎症的标志物或促炎性细胞因子的水平。在一个实施方案中，所述方法包括：确定c-反应蛋白(CRP)水平和/或红细胞沉降率。个体具有异常结果(其指示疾病、恶化、进行中的炎症等，例如异常的ABG、自身抗体、CRP、任何蛋白水解酶、炎性介质或进行中的炎症的标志物的水平)的确定，指示所述个体适合于使用抗-TLR3抗体的治疗。
将抗-TLR3抗体递送给受试者(通过从其中的核酸直接施用或表达，诸如从包含编码抗-TLR3抗体的核酸序列的痘病毒基因转移载体)和实践本发明的其它方法，可以用于减轻、治疗、预防或以其它方式改善疾病或疾病进展的任意合适的方面。本发明的方法可以特别有用地减轻和/或改善炎症和/或组织损伤以及与其有关的任意参数或征状(例如炎症的标志物的存在、在循环中或在特定组织中的促炎症细胞的数目)。
抗-TLR3抗体可以有利地用于治疗确定的疾病。“确定的疾病”表示已经宣告延长的时间段(例如超过1年)的自身免疫疾病或炎性疾病。取决于具体疾病，确定的疾病也是指这样的疾病：其没有得到控制，例如其仍然在进展中，或在有或没有治疗存在下，患者没有经历所述疾病的减轻。在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患者的自身免疫疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括：(a)确定所述患者是否具有确定的疾病；和(b)如果所述患者具有确定的疾病，那么给所述患者施用有效剂量的抗-TLR3抗体。
抗-TLR3抗体还可以有利地用于治疗慢性疾病。“慢性疾病”表示持续延长的时间段的疾病。例如，慢性疾病可以是持续3个月或更久的疾病，如美国国家卫生统计中心(U.S.National Center for Health Statistics)所定义的。在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患者的自身免疫疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括：(a)确定所述患者是否具有慢性疾病；和(b)如果所述患者具有慢性疾病，那么给所述患者施用有效剂量的抗-TLR3抗体。
抗-TLR3抗体还可以有利地用于治疗具有发作、危机、恶化或爆发的个体。术语“发作”、“危机”、“恶化”和“爆发”是指新征状的更快速发展、或与炎性疾病或自身免疫疾病有关的老征状的恶化。这样的阶段会持续数小时或数天，不同于历时数个月和数年发生的疾病的缓慢进展。在这样的发作过程中，患者经历发热、疼痛、炎性综合征(类流感综合征)。在RA中，患者的关节是肿胀的和疼痛的。患者可以经历类流感综合征。危机可以持续数小时至许多周。在多发性硬化中，爆发可以表征新征状或现有征状的恶化，但是必须持续至少24小时才能视作真正的恶化，爆发表示在脑或脊髓中形成的破坏神经传递的新病变。大多数爆发持续数天或数周，但是可以持续几个月。效果可以是例如：运动困难或痉挛，平衡和协调问题；视力问题，不协调的眼球运动，视力模糊或复视，在爆发过程中的部分失明；膀胱和肠征状；性问题，精神功能的变化；记忆丧失，注意力不集中和判断较差或抑郁症。在COPD中，可以将恶化定义为“在疾病的天然进程中的事件，其特征在于患者的基线呼吸困难、咳嗽和/或痰的变化，其超过正常的天与天之间的变化，是急性发作的，并且可能需要改变具有基础COPD的患者的用药”。经历恶化的患者具有下述征状之一：增加的咳嗽和痰产生，痰的颜色和/或厚度的变化，哮鸣，胸部紧迫感，发热。在克罗恩氏病或直肠结肠炎中，爆发主要是通常克罗恩氏病征状的恶化：腹泻、痉挛性的腹部疼痛、发热、食欲缺乏。在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患者中的自身免疫疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括：(a)确定所述患者是否正在经历发作、危机、恶化或爆发；(b)如果所述患者经历发作、危机、恶化或爆发，那么给所述患者施用有效剂量的抗-TLR3抗体。
抗-TLR3抗体还可以有利地用于治疗具有复发的个体。术语“复发”表示患者征状的改善或稳定。当患者的健康或状况改善时，疾病是复发的。在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患者中的自身免疫疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括：(a)确定所述患者是否正在经历复发、危机、恶化或爆发；(b)如果所述患者经历复发，给所述患者施用有效剂量的抗-TLR3抗体。
任选地，可以进行评估步骤，包括在用抗-TLR3抗体治疗之前评估得自患者的细胞(例如促炎症细胞、树突细胞、T细胞等)上的TLR3多肽的表达。通常，在该步骤中，从患者获取细胞样品，通常作为活组织检查，并进行试验(例如，使用免疫测定)以确定表达，和任选地确定TLR3多肽在细胞上的相对优势。在一个方面，患者具有优势地表达TLR3多肽的细胞的确定指示，抗-TLR3抗体(和任选地任意其它治疗剂)适合用于所述患者。在另一个步骤中，然后可以用抗-TLR3抗体治疗患者。
任选地，在一个实施方案中，可以进行TLR3配体检测步骤，包括在用抗-TLR3抗体治疗之前，检测TLR3配体在患者中的存在。通常，在该步骤中，从患者获取生物样品，例如滑液样品，例如在具有类风湿性关节炎的患者中。针对TLR3配体的存在，诸如细胞外dsRNA的存在，评估所述生物样品。如果所述生物样品就TLR3配体的存在而言是阳性的，那么可以有利地用抗-TLR3抗体治疗患者，优选地用在有dsRN TLR3配体存在下抑制表达TLR3的细胞的TLR3信号传递的抗体。
施用给具有疾病的个体的抗-TLR3抗体可以是特异性地结合TLR3多肽的任意单克隆抗体，优选如本文中所述的抑制通过TLR3多肽进行的信号传递的任何抗体。例如，抗-TLR3抗体是特异性地结合TLR3的抗体，其中所述抗体就结合人TLR3多肽而言在酸性条件下具有小于10-9M的KD，且任选地进一步还在中性条件下具有小于10-9M的KD。
在一个实施方案中，将抗-TLR3抗体用作单一疗法(单一治疗剂)。
根据另一个实施方案，本发明的治疗方法可以进一步包括用抗-TLR3抗体和第二种治疗剂治疗个体，所述第二种治疗剂包括通常用于特定治疗目的(为其施用所述抗体)的药剂。抗-TLR3抗体和第二种治疗剂可以分开地、一起或依次、或混合地施用。通常以第二种治疗剂在单一疗法中常用于待治疗的特定疾病或病症的量，施用所述第二种治疗剂。在一个实施方案中，以小于普遍接受的有效剂量的剂量，施用所述第二种治疗剂；例如，在不同的实施方案中，所述组合物包含这样的剂量：其小于施用的普遍接受的有效剂量的约10％至75％。在一个实施方案中，所述第二种治疗剂是皮质类固醇，例如选自以下的皮质类固醇：地塞米松、氢化可的松(皮质醇)、醋酸可的松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地夫可特、倍他米松、曲安西龙、倍氯米松、帕拉米松、氟替卡松、醋酸氟氢可的松、醋酸脱氧皮质酮(DOCA)、氟泼尼龙、丙酸氟替卡松、布地奈德、二丙酸倍氯米松、氟尼缩松和曲安奈德。优选地，所述第二种治疗剂是减少蛋白水解酶、炎性介质或促炎性细胞因子诸如TNF-α和/或白介素-1(IL-1)的药剂。优选地，所述第二种治疗剂是DMARD或DMD，任选地进一步，其中所述第二种治疗剂是甲氨蝶呤(RheumatrexTM、甲氨蝶呤(Trexall)TM)、羟氯喹(PlaquenilTM)、柳氮磺吡啶()、来氟米特(AravaTM)、肿瘤坏死因子抑制剂(例如依那西普(阿达木单抗(HumiraTM)和英夫利昔单抗(类克TM))、T-细胞共刺激的阻滞剂(例如阿巴他塞(OrenciaTM))、B细胞耗竭剂(例如利妥昔单抗(RituxanTM))、白介素-4(IL-4)拮抗剂疗法(例如，抗-IL4抗体或抗-IL4受体抗体)、白介素-5(IL-5)拮抗剂疗法(例如，抗-IL5抗体或抗-IL5受体抗体)、白介素-6(IL-6)拮抗剂疗法(例如，抗-IL6抗体或抗-IL6受体抗体)、白介素-1(IL-1)受体拮抗剂疗法(阿那白滞素(KineretTM))、抗-BlyS抗体(BenlystaTM)、肌肉内金或另一种免疫调节性剂或细胞毒性剂(例如硫唑嘌呤(依木兰TM)、环磷酰胺或环孢菌素A(NeoralTM、Sandimmune))。在一个实施方案中，当治疗呼吸系统疾病时，所述第二种治疗剂是PDE-4抑制剂。
在某些实施方案中，在施用第二种治疗剂之前，施用抗-TLR3抗体。例如，可以在第二种治疗剂施用之前大约0-30天施用抗-TLR3抗体。在某些实施方案中，在施用第二种治疗剂之前约30分钟至约2周、约30分钟至约1周、约1小时至约2小时、约2小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时-1天或约1-5天，施用抗-TLR3抗体。在某些实施方案中，与治疗剂的施用并行地施用抗-TLR3抗体。在某些实施方案中，在施用第二种治疗剂之后，施用抗-TLR3抗体。例如，可以在施用第二种治疗剂之后大约0-30天施用抗-TLR3抗体。在某些实施方案中，在施用第二种治疗剂之后约30分钟至约2周、约30分钟至约1周、约1小时至约2小时、约2小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至1天或约1-5天，施用抗-TLR3抗体。
就用于施用给患者而言，配制用于施用给患者的组合物。可以口服地、胃肠外地、通过吸入喷雾、局部地、直肠地、鼻地、含服地、经阴道或经由植入的蓄池施用本发明的组合物。本文中使用的施用途径包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。
可以将本发明的抗体包含在试剂盒中。所述试剂盒可以任选地进一步含有任意数目的抗体和/或其它化合物，例如，1种、2种、3种、4种或任意其它数目的治疗性抗体和/或化合物(例如第二种治疗剂)。应当理解，试剂盒的内容物的该描述不是以任何方式进行限制。例如，所述试剂盒可以含有其它类型的治疗性化合物。优选地，所述试剂盒也包括关于使用抗体的说明书，例如，其详述了本文中描述的方法。
将在下述实验部分中公开本发明的其它方面和优点，其应当视作示例性的，且不是限制本申请的范围。
实施例
材料和方法
材料
293T人胚胎肾细胞(#CRL-1573)购自ATCC。抗体(抗原,供应商,索引)：AP偶联的F(ab')2片段山羊抗-小鼠IgG(H+L),Jackson Immunoresearch,索引115-056-003，PE偶联的山羊抗-小鼠IgG Fc,Beckman Coulter,IM0551Instrumentation:FACSCanto流式细胞计(BD Biosciences)。TLR3配体(名称，供应商，索引)：聚(IC)HMW,InvivoGen,索引tlrl-pic。PolyAU，也被称作IPH3102，是由聚腺苷酸和聚尿苷酸制成的至少部分地双链的分子，如在WO2009/130616(Innate Pharma)(其公开内容通过引用并入本文)中所述制备。聚AU是具有高于2000kD的Mn(也被称作“数量平均分子量”或平均分子量”)、1.4-1.6的PI、和62.3-63.2℃的热稳定性、53-60％的增色性的高分子量聚AU。在PCT申请号WO2011/004028(其公开内容通过引用并入本文)中描述了抗体31C3。
表面等离子体共振(SPR)
一般Biacore T100规程。在Biacore T100设备(Biacore GE Healthcare)上在25℃进行SPR测量。在所有Biacore实验中，HBS-EP+或HBS-P缓冲液(Biacore GE Healthcare)充当运行缓冲液，并用Biaevaluation 4.1和Biacore T100Evaluation分析传感图。
就二价亲和力测量而言，除非另外指出，否则通过胺偶联将TLR3-His蛋白固定化在传感器芯片CM5(羧甲基化的葡聚糖层)上。将抗-TLR3抗体在运行缓冲液HBS-EP+(对于在中性pH的亲和力)或10mM乙酸盐pH5.6、150mM NaCl(对于在酸性pH的亲和力)中稀释至浓度系列(0.01-100nM)，以40μl/min的流速注射到固定化的抗原上保持2分钟，并允许解离3分钟，然后通过0.5M NaCl、10mM NaOH缓冲液的5-30s注射进行再生。使用适当的模型，通过总体拟合来分析得到的传感图。
萤光素酶报道基因测定.
建立了报道基因测定，其使用ISRE(IFN-刺激的应答元件)作为启动子和使用蛋白萤光素酶作为报道基因。用pISRE-luc质粒(#219089-Stratagene)稳定地转染293T细胞系(ATCC,#CRL-1573)，通过克隆进一步选择为诱导对IFN-α刺激的最佳应答，并被称作对照293T-ISRE。用pUNO-人TLR3质粒(#puno-htlr3-InVivogen)进一步稳定转染该细胞系，并被称作293T-TLR3-ISRE。
如下所述进行效力测定：在第0天，将细胞以4x105个细胞/mL接种在96-孔培养板内的完全培养基中(100μl/孔)。首先将细胞在37℃温育20小时，然后将50μL培养基抛弃，并且用最终25μl/孔的固定量的聚AU连同递增浓度的抗-TLR3抗体一起来活化细胞。将用新鲜培养基温育的细胞用作背景萤光素酶活性(50μl/孔)。在37℃将细胞温育6小时。将100μL新融化的SteadyGlo(Promega)加入每个孔中，将平板在室温在暗处温育10分钟，并且在γ-计数器(TopCount)设备将每个孔中发出的光定量为每秒计数(Count Per Second，CPS)。
突变体TLR3构建体K145E、D116R、K182E、N196A和E171A的制备
根据生产商的说明书，使用Stratagene的定位诱变试剂盒(Site-Directed Mutagenesis Kit)，进行TLR3突变体K145E、D116R、K182E、N196A和E171A的制备。使用的寡核苷酸列出在表4A中。对插入在pcDNA3.1载体中的野生型人TLR3进行诱变。测序以后，使用PromegaPureYieldTM Plasmid Maxiprep System，将含有突变序列的载体制备为Maxiprep。然后根据生产商的说明书，使用Invitrogen的Lipofectamine 2000，将载体用于HEK-293T细胞转染。
N-端突变体TLR3构建体1-19的制备
通过PCR(参见下面的表4B)，制备TLR3突变体(V5-TLR3-CD32构建体)。将所有Mx-R引物与下述5’引物ACCCAAGCTGGCTAGCATGAGACAGACTTTGCCTTG(SEQ ID NO:121)一起使用。将所有Mx-F引物与下述3’引物AGCACAGTGGCGGCCGCTTAGTTATTACTGTTGACATGG(SEQ IDNO:122)一起使用。将扩增的序列在琼脂糖凝胶上泳动，然后使用Qiagen Gel Extraction试剂盒进行纯化。然后根据生产商的说明书，用InFusion系统(Clontech)，将为每种突变体制备的2种PCR产物连接进用限制性酶NheI和NotI消化的pcDNA3.1载体中。
测序以后，使用Promega PureYieldTM Plasmid Maxiprep System，将含有突变序列的载体制备为Maxiprep。然后根据生产商的说明书，使用Invitrogen的Lipofectamine2000，将载体用于HEK-293T细胞转染。
TLR3细胞表面构建体的制备
如De Bouteiller等人(2005)J.Biol.Chem.280(46):38133-38145所述，将成熟的野生型或突变体TLR3序列与CD32跨膜和细胞内结构域融合。进行第一轮PCR，以将V5标签引入TLR3-CD32融合蛋白的N-末端位置，并进行第二轮(使用第一轮PCR作为模板)以将TLR3前导肽引入构建体中。用于这些步骤的引物总结在下表(表5)中。将PCR产物TA-克隆进pGEMTeasy载体中用于测序，最后使用NheI和NotI限制位点克隆进进pcDNA3.1载体中。
在它们的表面处表达TLR3+的细胞的滴定
使用lipofectamine 2000，用野生型或突变体TLR3ECD-CD32构建体瞬时转染HEK293T细胞系，并用一定剂量范围的11E1或31C3在4℃染色30min。通过加入PE偶联的山羊抗-小鼠IgG Fc抗体在4℃保持另外20min，显示结合的mAb。在2个洗涤循环以后，在FACSCanto II细胞计数器上分析细胞MFI。为了研究pH对mAb亲和力的影响，在染色缓冲液(0.2％BSA,2mM EDTA,0.02％Sodium Azoture)pH7.4中或在柠檬酸酸化的染色缓冲液pH5.6中进行染色。
实施例1-TLR3-特异性的单克隆小鼠和大鼠抗-人抗体的制备
进行一系列免疫接种，以制备与以前抗体相比具有提高的效力的阻断人TLR3的不同抗体。第一次筛选和第二次筛选如下。
免疫接种#1。
初次筛选.为了得到抗-人TLR3抗体，用重组人His-标记的TLR3细胞外结构域重组蛋白(R&D systems,#1487-TR-050)免疫Balb/c小鼠(3只动物)。将小鼠免疫，在有受辐照的脾细胞存在下融合和培养脾细胞。小鼠腹膜内地接受一次使用50μg TLR3蛋白和弗氏完全佐剂的乳剂的激发免疫，并腹膜内地接受使用50μg TLR3蛋白和不完全弗氏佐剂的乳剂的第2次免疫接种，并静脉内地接受使用10μg TLR3蛋白的强化。将杂交瘤铺板在培养板中，并使用为了检测对TLR3的结合而开发的ELISA在第一次筛选中评价上清液(SN)的TLR3结合。简而言之，将His-标记的重组TLR3蛋白(R&D systems,#1487-TR)包被在ELISA平板(Nunc)上。从杂交瘤培养板收获上清液，并在在有抗-TLR3抗体(其抑制TLR3并结合在C-端部分内)存在下在ELISA平板上温育，并用AP偶联的F(ab')2片段山羊抗-小鼠IgG(H+L)显示与Ig结合的TLR3的存在。选择3840个杂交瘤中的358个用于第二次筛选。
第二次筛选：目标杂交瘤的选择。通过使用瞬时表达293T细胞系的D116R-突变的TLR3的FACS染色，在另一个筛选中保留和试验358上清液，以鉴别没有丧失在氨基酸位置116处与突变体TLR3的结合的抗体。358个杂交瘤中的151个没有丧失与D116R的结合。还在293T-huTLR3细胞上在ISRE-萤光素酶基因报道基因测定中试验了杂交瘤的拮抗剂活性。选择得自上清液的具有优于60％的抑制作用的孔，用于进一步克隆。28个杂交瘤具有拮抗剂活性，且25个克隆具有拮抗剂活性和D116R结合。
具有潜在兴趣的杂交瘤的克隆.通过在96-孔平板中的有限稀释技术，克隆得自初次筛选的潜在感兴趣的杂交瘤，并在相同系列的关于杂交瘤的第二次筛选中试验克隆。得自13个杂交瘤的克隆具有拮抗剂活性和D116R结合。
为了将这13个杂交瘤与我们的参比抗-TLR3mAb(特别是31C3)进行对比，将13个杂交瘤扩增，并纯化它们的上清液。在基因报道测定中试验纯化的mAb。基于与参比抗-TLR3mAb相比TLR3信号传递的阻断效率，选择杂交瘤用于进一步表征。
进一步评估了2个杂交瘤对突变体TLR3K145E和K182E的表位结合(也参见实施例6)。2种抗体没有表现出与TLR3的K145E变体的结合的任何损失，但是它们之一表现出与突变体K182E的结合的损失。即使在有突变K145E或K182E存在下，克隆11E1结合TLR3。
免疫接种#2。
用重组His-标记的人TLR3(无细胞外结构域重组蛋白的载体)(R&D systems,#1487-TR)免疫LOU/c大鼠。大鼠在第0天腹膜内地接受使用50μg人TLR3(在PBS中稀释)和弗氏完全佐剂的乳剂的一次激发免疫，在第14天腹膜内地接受使用50μg人TLR3(在PBS中稀释)和不完全弗氏佐剂的乳剂的第二次免疫接种，和静脉内地接受使用25μg人TLR3(在PBS中稀释)的一次强化。将免疫脾细胞与X63.Ag8.653永生化的B细胞融合，并在有受辐照的脾细胞存在下进行培养。
如在上面免疫接种#1中那样，进行第二次筛选。通过在96-孔平板中的有限稀释技术，克隆潜在感兴趣的杂交瘤，并在相同系列的关于杂交瘤的第二次筛选中试验克隆。为了将杂交瘤与我们的参比抗-TLR3mAb进行对比，将所述杂交瘤扩增，并纯化它们的上清液。在基因报道测定中试验纯化的mAb。基于与参比抗-TLR3mAb 31C3相比TLR3信号传递的阻断效率，选择杂交瘤用于进一步表征。进一步评估杂交瘤对具有K145E和K182E的突变体TLR3多肽的表位结合。即使在有突变K145E或K182E存在下，克隆7G11、31F6、32C4和37B7结合TLR3。
实施例2-TLR3-特异性的单克隆大鼠抗-小鼠抗体的制备
初次筛选.为了得到抗-TLR3抗体，用重组His-标记的小鼠TLR3(无细胞外结构域重组蛋白的载体)(R&D systems,#3005-TR)和重组His-标记的人TLR3(无细胞外结构域重组蛋白的载体)(R&D systems,#1487-TR)免疫LOU/c大鼠。大鼠在第0天腹膜内地接受使用50μg小鼠TLR3+50μg人TLR3(在PBS中稀释)和弗氏完全佐剂的乳剂的一次激发免疫，在第14天腹膜内地接受使用50μg小鼠TLR3+50μg人TLR3(在PBS中稀释)和不完全弗氏佐剂的乳剂的第2次免疫接种，和静脉内地接受使用25μg小鼠TLR3+25μg人TLR3(在PBS中稀释)的一次强化。将免疫脾细胞与X63.Ag8.653永生化的B细胞融合，并在有受辐照的脾细胞存在下进行培养。
得到40个培养板，并使用为检测对TLR3的结合而开发的ELISA在第一次筛选中评价小鼠TLR3结合。简而言之，将His-标记的重组小鼠TLR3蛋白(R&D systems,#1487-TR-050)包被在Ni-NTA 96-孔平板(Qiagen)上。从杂交瘤培养板得到上清液(SN)，并在TLR3-平板中温育，并用山羊抗-小鼠F(ab)IgG-HRP显示与Ig结合的TLR3的存在。
第二次筛选：目标杂交瘤的选择.在对293T-mTLR3细胞的抑制试验中，在另一个筛选中保留和试验181上清液。选择得自具有优于95％的抑制作用的上清液的孔，用于通过有限稀释进一步克隆。
具有潜在兴趣的杂交瘤的克隆.通过在96-孔平板中的有限稀释技术，克隆27个选自初次筛选的潜在感兴趣的杂交瘤，并使用如上所述的ELISA在针对小鼠TLR3结合的筛选中评价370个亚克隆。在如上所述的对293T-TLR3细胞的抑制试验中，在另一个筛选中试验178个阳性克隆。在它们中，包括得自平板28的孔G7(28G7)的上清液。
实施例3-与细胞表面TLR3的结合
为了研究TLR3循环至细胞表面和细胞表面TLR3促进抑制性的抗-TLR3抗体的内化和效力的可能性，与参比抗体31C3相比，试验了对细胞表面TLR3的结合。另外，在中性pH对细胞表面TLR3的结合(例如亲和力)可能不同于在酸性pH对胞内体表达的TLR3的结合。在中性pH条件下试验了抗体对仅在细胞表面处表达人TLR3的细胞(表达TLR3/CD32的293T细胞)的结合，因为pH可以潜在地影响TLR3构象。抗体11E1、7G11、32C4和31F6在中性pH的结果分别显示在图1A、1B、1C和1D中。EC50值显示在表6中。抗体11E1、7G11、31F6和32C4各自在中性pH具有对表面表达的人TLR3的强结合。在中性pH，所述抗体对TLR3的亲和力强于参比抗体31C3。
实施例4–在胞内体和中性PH的二价亲和力
使用关于SPR、项目c)描述的方法，确定抗体11E1的结合性能。计算在中性(pH7.2)和酸性(pH 5.6)条件下与TLR3的结合以及KD值。在中性pH，11E1表现出对重组人TLR3的强二价亲和力(KD)(在pH 7.2的平均KD(M)为8.75*10-11)。抗体11E1在pH 5.6的结合亲和力稍微低于在pH 7.2的亲和力(在pH 5.6的平均KD(M)为1*10-9)。
类似地，在中性(pH 7.2)和酸性(pH 5.6)条件下确定抗-小鼠TLR3抗体对小鼠TLR3的结合，并计算KD值。在中性和酸性pH，mAb 32D4、28G7和13D1都表现出对重组小鼠TLR3的优于500皮摩尔的强烈且类似的二价亲和力(KD)。mAb 28G7的亲和力(2或3个实验的平均值)在中性pH为7.05*10-13(在pH 7.2的平均KD(M))，在酸性pH为1.26*10-13(在pH 5.6的平均KD(M))。
实施例5-人报道基因测定
在基于萤光素酶的报道基因活性(293T-TLR3-ISRE)中，试验了抗体对TLR3信号传递的抑制。已经报道，使用TLR3-激动剂诸如聚(I:C)的TLR3受体啮合会活化IFN型途径，包括启动子ISRE(Wietek等人.J.Biol.Chem.,278(51),p50923,2003)。简而言之，在报道基因测定中在有抗-TLR3抗体存在下使用dsRNA TLR3激动剂诱导TLR3信号传递，并评估TLR3信号传递。在该测定中，抗体11E1、7G11、31F6、32C4和37B7都比抗体31C3更有效。抗体11E1、7G11、32C4、31F6和37B7的结果分别显示在图2A、2B、2C、2D和2E中，显示了使用293T-人TLR3萤光素酶测定用人抗-TLR3抗体对TLR3信号传递的剂量依赖性抑制。将每种抗体与参比抗体31C3进行对比。
类似地，在单独实验中类似地评估了大鼠抗-小鼠TLR3抗体在基于鼠TLR3萤光素酶的报道基因活性(293T-mTLR3-ISRE)中抑制TLR3信号传递的能力。抗体28G7表现出TLR3信号传递的剂量依赖性抑制，具有2.6μg/ml的IC50。
实施例6-表位作图
在中性pH的表位作图.通过FACS测定对HEK293T-WT TLR3ECD/CD32细胞进行竞争测定。抗体11E1、7G11、31F6、32C4和37B7与以前得到的抗体31C3竞争对TLR3的结合，因为一种抗体的结合会损害其它抗体对TLR3的结合。抗体31C3至少部分地结合TLR3的与成熟TLR3多肽的残基102-204(特别是残基174-191和残基182)对应的区域，并彼此竞争对人TLR3的结合。抗体11E1、7G11、31F6、32C4和37B7各自与31C3竞争，但是竞争的程度不同，从而提示，11E1、7G11、31F6、32C4和37B7的表位是在相同区域中，但是彼此之间具有差异。抗体11E1与抗体7G11、31F6、32C4和37B7中的每一种竞争。基于抗体11E1、7G11、31F6、32C4和37B7和抗体31C3之间的竞争特性，确定了至少3个不同的表位框，因为至少11E1、37B7似乎彼此不同，且不同于7G11、31F6、32C4。
实施例7-通过与TLR3突变体的结合进行表位作图
抗体11E1、7G11、31F6、32C4和37B7与抗体31C3竞争对TLR3的结合。已经确定31C3结合在人TLR3的N-端末端内，所述末端具有所述抗体的包括残基182、但是不包括残基K145、D116、K182、E171或N196的主要表位。因此，试验了抗体11E1、7G11、31F6、32C4和37B7对TLR3突变体的结合。如本文材料和方法中所述，制备具有突变K145E、D116R、K182E、N196A和E171A(参考SEQ ID NO:1)的TLR3突变体多肽，并通过FACS评估抗-TLR3抗体对表达TLR3突变体多肽的细胞的染色。抗体11E1、7G11、31F6、32C4和37B7没有表现出对未突变野生型(WT)TLR3的结合的任何损失，也没有表现出对K145E、D116R、E171A、K182E或N196A中的任一种的结合的任何损失。抗体11E1、7G11、31F6、32C4和37B7的主要表位位于N-端区域中，因此不包括残基K145、D116、K182、E171或N196。
然后试验了抗体对TLR3的N-端部分中的另一组突变体的结合，以鉴别新表位。因此，试验了抗体对TLR3突变体的结合。如本文材料和方法中所述，制备了TLR3突变体多肽，其具有在位置Q44H和V45I、R64Q和R65Q、T86S和K89Q、K97I和M100L、K117Q和A120V、Q136H、N140S、V144K和K145N、K147A、K163A、Q167G、Q184L和K187R、Q184L和K187Q、D192E和A195G、Q208P和I209L、H218Q、A219T、G234N和S236H、L243W和A246S、S112A、Q113S和S115A、以及K137S和K139A(参考SEQ ID NO:1)中的突变，并通过FACS评估抗-TLR3抗体对表达TLR3突变体多肽的细胞的染色。抗体11E1表现出对具有置换R64Q和R65Q的突变体的结合的损失，和在更低程度上对可能邻近突变体T86S和K89Q的结合的损失。抗体7G11、31F6、32C4和37B7表现出对具有置换K117Q和A120V的突变体的结合的损失，但是没有表现出对任何其它突变体的结合的损失。抗体11E1和37B7表现出对具有置换K137S和K139A的突变体的结合的完全损失，而抗体7G11、31F6和32C4表现出对具有置换K137S和K139A的突变体的结合的部分损失。此外，所有7G11、31F6、32C4和37B7抗体表现出对具有置换S112、Q113和S115的突变体的结合的完全损失。抗体11E1和31C3没有表现出对具有置换S112、Q113和S115的突变体的结合的损失。因此，抗体11E1的主要表位包括残基R64和R65和可能(在更低程度上)邻近的残基T86和K89、以及残基K137和K139。因此，抗体7G11、31F6、32C4和37B7的主要表位包括残基K117和/或A120、以及S112、Q113和/或S115。另外，对于抗体37B7，所述主要表位进一步包括残基K137和K139，而对于抗体7G11、31F6和32C4，残基K137和K139也可以是在表位内。残基R64Q和R65Q具体地是在TLR3的无聚糖侧表面上的N-端dsRNA结合区内，并且残基K117和A120尽管部分地在TLR3分子的主链上，但是邻近N-端dsRNA结合区。与这些突变残基邻近的表面暴露的残基也可以促进抗体的表位，包括例如位于N-端dsRNA结合区的区域中的TLR3表面处的残基41、43、60、61、62、64、65、67、68、88、91、92、93、96、97、108、110、112、113、114、115、121、132、134、137和/或139(参考SEQ ID NO:1)。抗体这样可以与dsRNA竞争对TLR3的结合。所述抗体可以结合在N-端dsRNA结合位点内和/或附近，包括任选地进一步跨TLR3蛋白的主链上的残基。
图2F、2G和2H显示了TLR3多肽的N-端末端的试图，显示了用黑色指示的突变的氨基酸残基(Q44、V45、R64、R65、T86、K89、K97、M100、K117、A120、Q136、N140、V144、K145、K147、K163、Q167、Q184、K187、Q184、K187、D192、A195、Q208、I209、H218、A219、G234和S236、L243和A246)。还用灰色显示了邻近残基86、89、117和120的残基(残基41、43、60、61、62、67、68、88、91、92、93、96、108、110、112、113、114、115、121、132、134、137和139)；这样的邻近残基也可以被指定的抗体结合。图2F显示了TLR3多肽的无聚糖侧表面的视图；图2G显示了TLR3多肽的含有聚糖的侧表面和主链的视图，其中TLR3多肽的N-端末端是在前景中(在图像的左侧)。图2H显示了TLR3多肽的无聚糖侧表面和主链的视图，其中TLR3多肽的N-端末端是在前景中(在图像的右侧)。
实施例8–用于治疗RA的体内效力模型-预防场合
简而言之，将20只小鼠在第0天用100μg胶原(在补充了结核分枝杆菌(2mg/ml)的CFA中乳化)免疫，并在尾巴根部真皮内地(ID)注射。在第17天，对动物评分(临床征象经常在强化之前出现)，根据四肢临床评分的总和随机化到2个8或9只小鼠的组中，并治疗。在第21天，通过单独胶原(100μg，在50μl中)的ID施用，强化胶原免疫接种。
构成下述组：
-组1(PBS,n＝9)：200μl 2次/周IP治疗
-组2(28G7,n＝8)：500μg/小鼠2次/周IP治疗
每周3次地评价动物四肢的评分，持续3-4周。根据表7评价评分。
结果报告在图3A中。本实验证实，与PBS相比，抗-TLR3抗体在类风湿性关节炎(RA)的治愈性治疗中是统计上有效的(*p>0.05,**p>0.005，在Dunnett氏检验中)。
实施例9–用于治疗RA的体内效力模型-治愈场合
实验#1:28G7,PBS,MTX
简而言之，在第0天，给30只小鼠在尾部根部真皮内注射100μg胶原(在补充了结核分枝杆菌(2mg/ml)的CFA中乳化)进行免疫。21天后，通过单独胶原(100μg，50μl/小鼠)的ID施用，强化胶原免疫接种。在第24天，根据四肢临床评分的总和，将动物随机化到3个10只小鼠的组中，并开始治疗。
组1(PBS,n＝10)：200μl 2次/周IP治疗。
组2(甲氨蝶呤-MTX,n＝10)：2.5mg/kg 2次/周IP治疗。
组3(28G7,n＝10)：500μg/小鼠2次/周IP治疗。
每周3次地评价动物四肢的评分，持续3-4周。根据表7评价评分。
结果报告在图3B中。本实验证实，与PBS和甲氨蝶呤相比，抗-TLR3抗体在确定的类风湿性关节炎(RA)的治愈性治疗中是统计上有效的(*p>0.05，在Dunnett氏检验中)。MTS具有不同于抗-TLR3抗体的作用机理，两种药物的组合可以是有益的。
实验#2:28G7,PBS,抗-TNFαHumiraTM
简而言之，在第0天，给35只小鼠在尾部根部真皮内注射100μg胶原(在补充了结核分枝杆菌(2mg/ml)的CFA中乳化)进行免疫。21天后，通过单独胶原(100μg，50μl/小鼠)的ID施用，强化胶原免疫接种。在第24天，根据四肢临床评分的总和，将动物随机化到4个组中，并开始治疗。
组1(PBS,n＝9)：200μl 2次/周IP治疗。
组2(对照Ig抗体,n＝9)：500μl 2次/周IP治疗。
组3(28G7,n＝9)：500μg/小鼠2次/周IP治疗。
组4(HumiraTM,n＝6)：100μl 2次/周IP治疗。
每周3次地评价动物四肢的评分，持续3-4周。根据表7评价评分。
结果报告在图3C中。本实验证实，与PBS和抗-TNFα抗体HumiraTM相比，抗-TLR3抗体在确定的类风湿性关节炎(RA)的治疗中是有效的。MTS具有不同于抗-TLR3抗体的作用机理，两种药物的组合可以是有益的。
实施例10–用于治疗结肠炎的体内效力模型
将4组10只雄性小鼠(Balb/c)用于TNBS诱导的结肠炎的模型，并将一个8只没有结肠炎的小鼠的额外组用作对照(没有剂量，结肠内盐水滴注)。
如下分配治疗组：
组1:10只小鼠接受抗体28G7(ip,500μg/小鼠)。
组2:10只小鼠接受非TLR3有关的抗体施用(ip,500μg/小鼠)。
组3:10只小鼠接受大鼠抗-小鼠TNF抗体(ip,15mg/kg,HumiraTM)。
组4:10只小鼠接受PBS(ip,200μg/小鼠)。
注射以后1小时，通过2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(2mg/小鼠，在40％的乙醇的TNBS溶液中)在雄性Balb/C小鼠(5-6周龄)中的结肠内滴注，诱导结肠炎。在组1、2和3中，在第一次抗体注射以后72小时，重复28G7或非TLR3有关的抗体或抗-TNF抗体的另一次注射。
对于所有组，每天评估疾病进展的几个参数：体重，血液在粪便中的存在，腹泻的存在和严重程度。在结肠炎诱导以后7天，将所有动物处死进行组织收集。测量结肠组织中的肉眼可见的损伤评分、壁厚度和中性粒细胞髓过氧化物酶活性(粒细胞渗入的指标)。通过观察便血、腹泻、出血、粘着、粘液、红斑、水肿、溃疡和狭窄，评价肉眼可见的损伤评分。
图4显示了实验的结果。图4A显示了如下治疗的小鼠的壁厚度测量结果：用盐水(黑色点)，仅用TNBS(黑色正方形)，用抗-TNFα抗体和TNBS(黑色三角形)，用28G7和TNBS(空心点)，以及用对照Ab和TNBS(空心正方形)。图4B显示了如下治疗的小鼠的肉眼可见的损伤评分：用盐水(黑色点)，仅用TNBS(黑色正方形)，用抗-TNFα抗体和TNBS(黑色三角形)，用28G7和TNBS(空心点)，以及用对照Ab和TNBS(空心正方形)。
实施例11–用于治疗COPD(慢性阻塞性肺疾病)的体内效力模型
A.单一药剂研究
如下治疗3个10只雄性小鼠的组：
-用媒介物治疗1个10只小鼠的组。
-在第0、3、7、10、14、17、21和24天，用抗-小鼠TLR328G7抗体施用(腹膜内，500μg/小鼠)治疗1个10只小鼠的组。
-用阳性对照罗氟司特(批准为DaxasTM；PDE-4的拮抗剂)(口服，15mg/kg，每周4次)治疗1个10只小鼠的组。
在第0、7、14和21天用弹性蛋白和LPS(i.n.)处理所有小鼠以诱导COPD。在第28天，将小鼠处死进行分析。
在第28天通过分类性细胞计数来分析支气管肺泡灌洗(BAL)流体，测量细胞向气道中的浸润。在第28天，通过气体分析法，测量静脉血的氧合。通过多路测定，通过分析TNF-α、IL-6、IL-17A和IP-10的蛋白水平，确定BALF中的炎性介质水平。结果显示在图5中。该图表明，抗-TLR3抗体在治疗COPD中是非常有效的，包括降低嗜中性粒细胞气道渗入、静脉血氧饱和和促炎细胞因子。使用Student氏t检验，对所有数据进行统计分析：‘*’p<0.05；‘**’p<0.005；‘***’p<0.0005。
图5A显示了巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞的BAL分类性细胞计数。抗-TLR3抗体强烈地减少了嗜中性粒细胞向气道中的渗入，而没有实质上影响巨噬细胞、嗜酸性粒细胞或淋巴细胞。COPD主要由嗜中性粒细胞介导，而不是由巨噬细胞或嗜酸性粒细胞(也不是淋巴细胞，在这里用作对照)介导。
图5B显示了单独的LPS/弹性蛋白酶和与抗-TLR3抗体或罗氟司特组合的LPS/弹性蛋白酶各自的静脉血饱和氧(以百分比计)。COPD患者的动脉血中的氧饱和百分比与健康个体相比减少，而COPD患者的静脉血中的氧饱和百分比与健康个体相比增加。因此，静脉血中O2百分比的下降是疾病治疗中的有利应答的重要指示(参见O’Connor等人.Respiration2011；81:18-25)。可以看出，抗-TLR3抗体会几乎与罗氟司特一样大幅降低静脉血中O2百分比。因此，抗-TLR3抗体可有效地治疗COPD。在医学实践中，将动脉血气体(ABG)分析用在急性场合中和用于在临床稳定性阶段中评估患者的气体交换状态。因此，血气分析(包括ABG分析)可以是评估患者是否适合于抗-TLR3抗体治疗、以及评估或监测抗-TLR3抗体治疗在急性期或临床稳定性阶段中是否有效的特别有用的工具。
图5C显示了BAL流体(BALF)中的IL17A。抗-TLR3抗体大幅降低IL17A(pg/ml)，并且达到与罗氟司特一样的程度。图5D显示了BALF中的IP-10。抗-TLR3抗体大幅降低IP-10(pg/ml)。
B.药物组合研究
如下治疗4个小鼠组：
-用媒介物治疗1个小鼠组(PBS,i.p.,每周2次)。
-用抗-小鼠TLR328G7抗体施用治疗1个小鼠组(腹膜内，500μg/小鼠,每周2次)。
-用阳性对照罗氟司特(批准为DaxasTM；PDE-4的拮抗剂)治疗1个小鼠组(3mg/kg,口服，每周5次)。
-用罗氟司特和28G7抗体治疗1个小鼠组，每种药剂根据用作单一药剂的计划。
如在研究A中一样，用弹性蛋白和LPS(i.n.)处理所有小鼠以诱导COPD，并处死。
如在研究A中一样，通过分类性细胞计数来分析支气管肺泡灌洗(BAL)流体，从而测量细胞在气道中的浸润。
图5E显示了巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞的BAL分类性细胞计数。抗-TLR3抗体强烈地减少了嗜中性粒细胞向气道中的渗入，也观察到巨噬细胞和淋巴细胞的减少。COPD主要由嗜中性粒细胞介导，而不是由巨噬细胞或嗜酸性粒细胞(也不是淋巴细胞，在这里用作对照)介导。罗氟司特还造成减少的嗜中性粒细胞向气道中的渗入，以及巨噬细胞的减少。令人感兴趣的是，抗-TLR3抗体和罗氟司特的组合会造成减少的嗜中性粒细胞向气道中的渗入，基本上达到与在野生型小鼠中观察到的水平，该下降远远超过用单独任一种药剂观察到的下降。
实施例12–用于治疗脓毒症的体内效力模型-盲肠结扎和穿刺(CLP)-治愈场合
简而言之，操作30只小鼠：外科手术由盲肠结扎和穿刺组成。通过该方式，将盲肠腔的内容物引入腹腔中从而导致腹膜炎，并由此导致脓毒性休克。CLP是中级，例如大约在盲肠的中央进行结扎。
在手术后6小时和24小时，用28G7(100μg/小鼠，腹膜内)、没有TLR3特异性的对照抗体(“对照”,100μg/小鼠，腹膜内)或PBS(300μl/小鼠，腹膜内)治疗小鼠。在第24、28、32、48、52、56、72、76、80、96、100、104、120、124、128、144、148、152、168、172、176、192、196、200、216、220、224、240、244、248、264、270、274、288、292、296、312、316、320和336小时，评估存活。336小时以后，存活的小鼠已经清除了急性期感染。停止实验，并将小鼠处死。
图6显示了实验的结果。28G7治疗组具有80％存活，而未治疗组经历40％存活。这些结果证实，在CLP小鼠模型中，TLR3抗体可有效地治疗小鼠。在该急性模型中，小鼠经历类似于脓毒性休克的急性感染。存活的小鼠已经有效地清除了急性感染。因此，抗-TLR3抗体是适合用于治疗经历严重急性感染(诸如SIRS、脓毒症、严重脓毒症或脓毒性休克)的患者的药剂。
实施例13-供体PBMC响应于DSRNA和药物组合的体外IP-10生产
在人供体中评估了响应于pIC的IP-10生产。将新鲜PBMC从供体的全血分离出，并在有0、10或50μg/ml抗-人TLR3mAb和一定剂量范围的地塞米松(0.2、2和20μg/ml)或(1、0.1、0.01μg/ml)存在下温育。将细胞在37℃温育30分钟，然后加入30μg/ml聚(I:C)。将细胞在37℃温育另外24小时。然后将上清液收获，以通过ELISA定量IP10生产。
抗-人TLR3mAb与地塞米松或的药物组合的结果分别显示在图7A和7B中。每种抗体大幅减少响应于聚IC的IP-10生产，并且所述抗体当与地塞米松或组合时进一步减少IP-10。因此，抗-TLR3抗体当与地塞米松或Humira组合使用时可以提供额外效应。具体地，响应于聚IC，所述抗体增强地塞米松(类风湿性关节炎的参比治疗)的作用。此外，在0.1和1μg/ml浓度的抗-TLR3抗体似乎会增强Humira的作用。抗-TLR3抗体可以通过调节信号传递途径(其与地塞米松或所调节的那些途径互补)而起作用，而没有拮抗作用，并且因此可以有利地与这样的药物联合使用。
所有标题和小标题都在本文中仅仅为了方便而使用，不应当解释为以任何方式限制本发明。在其所有可能的变体中上述要素的任意组合被包括在本发明中，除非在本文中另外指出或以其它方式与上下文明显矛盾。除非在本文中另外指出，否则本文中数值范围的列举仅意图充当个别地提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，且每个单独值如同在本文中个别地阐述一样并入说明书中。除非另有说明，本文提供的所有精确值代表相应的近似值(例如，关于特定因子或测量结果所提供的所有确切示例性数值可以被认为还提供对应的近似测量结果，在适当时用“约”来修饰)。
可以以任意合适的次序执行本文描述的所有方法，除非在本文中另外指出或以其它方式与上下文明显矛盾。
本文中提供的任意或全部实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的应用，仅仅意图更好地阐述本发明，并且不对本发明的范围进行限制，除非另外指出。在本说明书中的语言不应当被解释为指示任何要素是本发明的实践所必需的，除非明确地如此描述。
在本文中对专利文献的引用和并入仅仅为了方便而做出，并且不反映这样的专利文献的有效性、专利性和/或可执行性的任何观点。使用术语诸如“参考一个或多个要素”在本文中对本发明的任意方面或实施方案的描述，意图为本发明的类似方面或实施方案提供支持，即“由所述特定一个或多个要素组成”，“基本上由所述特定一个或多个要素组成”或“基本上包含所述特定一个或多个要素”，除非另有说明或与上下文明显矛盾(例如，本文描述为包括一种特定组分的组合物应当理解为也描述了由所述组分组成的组合物，除非另有说明或与上下文明显矛盾)。
本发明在适用法律允许的最大程度上包括本文提出的方面或权利要求中列出的主题的所有修改和等同方案。
在本说明书中引用的所有出版物和专利申请都通过引用整体并入本文，如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物或专利申请通过引用并入。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过具体说明和实施例对前述发明进行了比较详细的描述，但是本领域普通技术人员在考虑本发明的教导后会容易地明白，可以对其做出某些变化和改进，而不偏离所附权利要求书的精神或范围。

Claims (30)

1.一种单克隆抗体，其特异性地结合人TLR3多肽并抑制通过人TLR3多肽进行的信号传递，其中所述抗体包含：
重链，所述重链包含SEQ ID NO:36的重链可变区的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列；和(b)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:37的轻链可变区的CDR 1、2和3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含不结合人FcγRIIIa多肽的重链恒定区。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中所述抗体包含IgG4重链，所述IgG4重链包含根据EU-索引在残基228处的丝氨酸至脯氨酸突变。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
5.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是选自以下的抗体片段：Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、双体、单链抗体片段、或包含多个不同抗体片段的多特异性抗体。
6.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体能够被表达TLR3的细胞内化。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述抗体与毒性部分缀合或共价地结合。
8.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与可检测部分缀合或共价地结合。
9.一种通过嵌合化或人源化根据权利要求1所述的抗体而得到的抗体。
10.用于治疗炎性障碍或自身免疫障碍的根据权利要求1所述的抗体。
11.用于治疗具有确定的或慢性的自身免疫疾病或炎性疾病的个体中的发作、危机、爆发或恶化的根据权利要求10所述的抗体。
12.用于与选自抗-TNFα剂、甲氨蝶呤和地塞米松的DMARD联合治疗的根据权利要求10所述的抗体。
13.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的抗体和药学上可接受的载体。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述抗体以25mg至500mg之间的量存在。
15.根据权利要求13所述的组合物，其中将所述组合物配制用于施用给鼻或肺组织。
16.根据权利要求13所述的组合物，其中所述载体是药学上可接受的鼻载体。
17.一种试剂盒，其包含根据权利要求1所述的抗体，任选地进一步包含标记的第二抗体，所述第二抗体特异性地识别根据上述权利要求中的任一项所述的抗体。
18.一种制成品，其包含：
(a)容器，所述容器包含根据以上权利要求中的任一项所述的抗-TLR3抗体；和
(b)包装插页，所述包装插页具有用于治疗患者中的癌症的说明书，其中所述说明书指示，以每周1次至每2个月1次的频率，将0.05至20mg/kg之间的剂量的所述抗-TLR3抗体施用给所述患者。
19.一种杂交瘤或重组宿主细胞，其生产根据权利要求1所述的抗体。
20.根据权利要求1所述的抗体在制备用于治疗具有自身免疫疾病或炎性疾病的个体的药物中的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述抗体的有效量是在0.05至20mg/kg之间，以每周1次至每2个月1次的频率施用给所述个体。
22.根据权利要求20所述的用途，其中将所述抗体配制用于施用给鼻或肺组织。
23.根据权利要求20所述的用途，其中通过鼻内或吸入施用来递送所述抗体。
24.权利要求20所述的用途，其中所述个体具有确定的或慢性的自身免疫疾病或炎性疾病。
25.权利要求20所述的用途，其中所述治疗包括：
(a)评价个体中疾病的存在、阶段和/或演化；和
(b)给所述个体施用有效剂量的根据权利要求1所述的抗体或组合物。
26.根据权利要求25所述的用途，其中评价个体中疾病的存在、阶段和/或演化包括：分析自身抗体、CRP或任意蛋白水解酶、炎性介质或进行中的炎症的标志物的水平。
27.根据权利要求25所述的用途，其中评价个体中疾病的存在、阶段和/或演化包括进行血气分析，并且如果所述个体被确定具有COPD，给所述个体施用有效剂量的结合TLR3多肽的抗体。
28.权利要求20所述的用途，其中所述治疗包括：
(a)确定所述个体是否具有确定的疾病；和
(b)如果所述个体具有确定的疾病，那么给所述患者施用有效剂量的根据权利要求1所述的抗体或组合物。
29.(a)有效量的根据权利要求1所述的抗体，和(b)DMARD或皮质类固醇在制备用于治疗具有自身免疫疾病或炎性疾病的个体的药物中的用途。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述DMARD是抗-TNFα抗体和/或甲氨蝶呤。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102471382A (zh) 2009-07-10 2012-05-23 依奈特制药公司 Tlr3 结合剂
ES2695151T3 (es) 2012-05-31 2019-01-02 Innate Pharma Agentes de ligación a TLR3
EP2996715A1 (en) * 2013-05-14 2016-03-23 Innate Pharma Methods for restoring corticosteroid sensitivity
TWI832600B (zh) * 2017-01-20 2024-02-11 美商健臻公司 骨靶向抗體
US10537585B2 (en) 2017-12-18 2020-01-21 Dexcel Pharma Technologies Ltd. Compositions comprising dexamethasone

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5660827A (en) 1992-03-05 1997-08-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibodies that bind to endoglin
US5491084A (en) 1993-09-10 1996-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green-fluorescent protein
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
AR006928A1 (es) 1996-05-01 1999-09-29 Pioneer Hi Bred Int Una molecula de adn aislada que codifica una proteina fluorescente verde como marcador rastreable para la transformacion de plantas, un metodo para laproduccion de plantas transgenicas, un vector de expresion, una planta transgenica y celulas de dichas plantas.
DE69841514D1 (de) 1997-05-07 2010-04-01 Schering Corp Menschliche Toll-Like-Rezeptorproteine, zugehörige Reagenzien und Verfahren
WO1998056418A1 (en) 1997-06-13 1998-12-17 Genentech, Inc. Stabilized antibody formulation
EP1345968A2 (en) 2000-12-28 2003-09-24 Altus Biologics Inc. Crystals of whole antibodies and fragments thereof and methods for making and using them
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
AU2002363939A1 (en) 2001-11-20 2003-06-10 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
CA2480059C (en) 2002-03-22 2015-11-24 Amrad Operations Pty. Ltd. Monoclonal antibody against interleukin-13 receptor alpha 1 (il-13r.alpha.1)
JP2004016021A (ja) 2002-06-12 2004-01-22 Japan Science & Technology Corp 抗体および阻害剤並びにそれを用いた形質転換方法および形質転換キット
WO2004032828A2 (en) 2002-07-31 2004-04-22 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
AR051836A1 (es) * 2004-11-30 2007-02-14 Centocor Inc Antagonistas de receptor 3 simil toll metodos y usos
ES2435775T3 (es) 2005-10-27 2013-12-23 Janssen Biotech, Inc. Moduladores de receptor tipo Toll 3, procedimientos y usos
SG177194A1 (en) 2005-12-08 2012-01-30 Medarex Inc Human monoclonal antibodies to protein tyrosine kinase 7 (ptk7) and methods for using anti-ptk7 antibodies
US8354508B2 (en) 2006-07-21 2013-01-15 Diadexus, Inc. PRO115 antibody compositions and methods of use
CA2667466A1 (en) 2006-10-27 2008-05-02 Ablynx N.V. Intranasal delivery of polypeptides and proteins
EP2155249A4 (en) 2007-05-15 2011-11-16 Oncomed Pharm Inc COMPOSITIONS AND METHOD FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER
US7982007B2 (en) * 2007-12-26 2011-07-19 Centocor, Inc. Cynomolgus toll-like receptor 3
EP2281043B1 (en) 2008-04-25 2013-03-13 Innate Pharma Improved tlr3 agonist compositions
US8460659B2 (en) 2008-10-31 2013-06-11 Janssen Biotech, Inc. Toll-like receptor 3 antagonists for the treatment of metabolic and cardiovascular diseases
NZ603824A (en) 2008-10-31 2013-11-29 Centocor Ortho Biotech Inc Toll-like receptor 3 antagonists
US20130090457A1 (en) 2008-10-31 2013-04-11 Janssen Biotech, Inc. Toll-Like Receptor 3 Antagonists for the Treatment of Metabolic and Cardiovascular Diseases
CA2760525A1 (en) * 2009-04-29 2010-11-04 Mark Cunningham Toll-like receptor 3 antagonists
CN102471382A (zh) 2009-07-10 2012-05-23 依奈特制药公司 Tlr3 结合剂
DK2332986T3 (da) 2009-12-11 2013-12-16 Deutsches Krebsforsch Antistof som binder til H-1 parvovirus
CA2824313A1 (en) 2011-01-12 2012-07-19 Innate Pharma Tlr3 binding agents
ES2695151T3 (es) 2012-05-31 2019-01-02 Innate Pharma Agentes de ligación a TLR3

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MX361773B (es) 2018-12-17
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