ES2695151T3

ES2695151T3 - Agentes de ligación a TLR3

Info

Publication number: ES2695151T3
Application number: ES13727110T
Authority: ES
Inventors: Cécile Bonnafous; Laurent Gauthier; Yannis Morel; Carine Paturel; Ivan Perrot
Original assignee: Innate Pharma SA
Current assignee: Innate Pharma SA
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2013-05-30
Publication date: 2019-01-02
Anticipated expiration: 2033-05-30
Also published as: US20150140000A1; AU2013269652B2; MX2014014443A; EP2855527A1; WO2013178736A1; DK2855527T3; US9944712B2; MX361773B; JP6356120B2; AU2013269652A1; JP2015519355A; CN104379603B; CN104379603A; CA2874918A1; EP2855527B1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que inhibe la señalización mediada por TLR3 en una célula que expresa TLR3, en donde el anticuerpo se liga a la superficie lateral sin glicano de la porción N-terminal del polipéptido TLR3, en donde dicho anticuerpo tiene una ligación reducida en más de un 40% a un polipéptido TLR3 mutante que comprende una mutación en los residuos 137 a 139 del polipéptido TLR3 de SEQ ID NO: 1, respecto a la ligación entre el anticuerpo y un polipéptido TLR3 de tipo natural de SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCION

Agentes de ligacion a TLR3

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales), fragmentos de anticuerpos, y derivados de los mismos que se ligan e inhiben la senalizacion TLR3. La invencion tambien se refiere a celulas que producen tales anticuerpos; metodos para fabricar tales anticuerpos; fragmentos, variantes, y derivados de los anticuerpos; composiciones farmaceuticas que comprenden los mismos; metodos para utilizar los anticuerpos para diagnosticar, tratar o prevenir enfermedades, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias y similares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Las protemas toll de Drosophila controlan el patron dorsal-ventral y se cree que representan un mecanismo de defensa hospedero antiguo. En humanos, los TLRs se cree que son un componente importante de inmunidad innata. Las secuencias de protemas Toll humanas y de Drosophila muestran homologfa sobre la longitud completa de las cadenas de protemas. La familia de receptores similar a Toll humanos esta comprendida de diez protemas receptoras sumamente conservadas, TLR1-TLR10. Similar a toll de Drosophila, los TLRs humanos son protemas transmembrana tipo I con un dominio extracelular que consiste en un dominio de repeticion rico en leucina (LRR) que reconoce los patrones moleculares asociados a patogenos (PAMPs), y un dominio citoplasmico que es homologo al dominio citoplasmico del receptor de interleucina-1 (IL-1) humano. Similar a las rutas de senalizacion para el toll de Drosophila como el receptor IL-1, los receptores similares a Toll humanos senalizan a traves de la ruta NF-kB.

Aunque los diferentes TLRs de mairnfero comparten muchas caractensticas y mecanismos de transduccion de senal, sus funciones biologicas son muy diferentes. Esto es debido en parte al hecho de que cuatro moleculas adaptadoras diferentes (MyD88, TIRAP, TRIF y TRAF) se asocian en varias combinaciones con los TLRs y median diferentes rutas de senalizacion. Ademas, diferentes ligandos para un TLR pueden activar de manera preferente diferentes rutas de transduccion de senal. Adicionalmente, los TLRs se expresan de manera diferente en varias celulas hematopoyeticas y no hematopoyeticas. Por consiguiente, la respuesta a un ligando TLR depende no solo en la ruta de senal activada por el TLR, sino tambien en la naturaleza de las celulas en las cuales se expresa el TLR individual.

El receptor similar a toll 3 (TLR3) ha recibido atencion considerable como un objetivo terapeutico ya que la senalizacion TLR3 se ha implicado en afecciones inflamatorias y autoinmunitarias. La solicitud de patente WO98/50547 proporciona la secuencia de aminoacidos y acidos nucleicos de la protema hTLR3. De Bouteiller y colaboradores (2005) J. Biol. Chem. 280(46): 38133-38145) describen el uso de un anticuerpo anti-TLR3 que liga el TLR3 de superficie celular. El anticuerpo C1130 se establece que es activador hacia TLR3 y se ha descrito en WO 2007/051164. Los anticuerpos policlonales que inhiben TLR3 se describieron por Cavassani y colaboradores (2008) J. Exp. Med. 205: 2609-2621. WO 03/106499 y Matsumoto y colaboradores (2003) J. Immunol. 171:3154-3162 describen un anticuerpo que corresponde a un clon de anticuerpo TLR3.7 (eBioScience Inc., San Diego) reportado por ligarse e inhibir el TLR3 de superficie celular pero no el TLR3 de compartimiento celular o el DC mieloide-linaje. WO 06/060513 describe un anticuerpo C1068 que se reporta que inhibe la produccion de citoquinas en las celulas epiteliales, que se reportan por expresar TLR3 sobre la superficie celular. La solicitud de patente de PCT WO2010/051470 proporciona anticuerpos anti-TLR3 adicionales. Otros anticuerpos anti-TLR3 para el uso de investigacion incluyen anticuerpos anti-TLR3 policlonales de R&D Systems Corp., el anticuerpo 40C1285 de Abcam y los anticuerpos 619F7, 713^e4, 716G10, IMG-5631 y -IMG-5348, todos de Imgenex Corp.

Sin embargo, entre los anticuerpos anti-TLR3 actualmente disponibles, no son adecuados optimamente para el uso como agentes terapeuticos, por ejemplo, para modular TLR3 in vivo. Por ejemplo, muchos sufren de falta de eficacia o afinidad a sus epftopos. Por lo tanto, existe una necesidad por proporcionar anticuerpos mejorados dirigidos a TLR3.

SUMARIO DE LA INVENCION

El alcance de la presente invencion esta definido por las reivindicaciones, y cualquier informacion que no esta dentro de las reivindicaciones se proporciona solo para uso informativo.

La presente divulgacion surge del descubrimiento de descomposiciones novedosas que comprenden, y metodos para utilizar anticuerpos monoclonales, que incluyen, pero no se limitan a fragmentos de anticuerpos, y derivados que se ligan espedficamente a e inhiben la funcion de TLR3 humano.

La presente divulgacion proporciona anticuerpos con nuevas propiedades utiles para ligar como objetivo el TLR3 in vivo. Puesto que el TLR3 liga su ligando natural (ARNds) y se senala exclusivamente en la endosoma en macrofagos y celulas dendnticas (DCs) (en pH acido), los anticuerpos se han seleccionado previamente basados en la alta afinidad en el pH endosomico donde se presenta la senalizacion. Sin embargo, poco se sabe acerca del mecanismo por el cual los anticuerpos anti-TLR3 entran a la celula. La presente invencion proporciona anticuerpos que tienen ligacion potente a TLR3 expuesto en la superficie celular y un medio ambiente neutro de pH y que muestran potencia mejorada en la inhibicion de TLR3. La optimizacion de la ligacion del TLR3 expresado en la superficie celular por lo tanto puede ser un criterio importante para la captacion celular (endosomica) por una celula que puede acondicionar la actividad biologica cadena abajo (o general). Los presentes anticuerpos muestran ligacion potente a TLR3 de superficie celular humana, como se observa en un ensayo donde TLR3 se expresa exclusivamente en la superficie celular en condiciones de pH neutro. De esta manera, los anticuerpos que tienen ligacion de superficie celular mejorada se seleccionaron. La actividad inhibidora de los anticuerpos anti-TLR3 por lo tanto se puede regular por el ciclado de nuevo a la superficie celular de los polipeptidos TLR3 endosomicos implicados en la endocitosis una vez que los receptores se separaron de sus ligandos.

En un aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo que inhibe la senalizacion mediada por TLR3 en una celula que expresa TLR3, en donde el anticuerpo se liga espedficamente a un polipeptido TLR3 humano expresado solamente en la superficie de una celula, opcionalmente en pH neutro. Opcionalmente, el anticuerpo tiene una EC50 de no mas de 0.3 pg/ml, opcionalmente no mas de 0.2 pg/ml, opcionalmente no mas de 0.1 pg/ml, para ligacion a las celulas que expresan TLR3 solamente en la superficie celular.

En un aspecto, la invencion proporciona anticuerpos que se ligan a la porcion N-terminal de la protema TLR3 por lo menos parcialmente (o principal o exclusivamente) en la superficie lateral sin glicano del polipeptido TLR3 (la cara ligada por el ARNds), y opcionalmente ademas por lo menos parcialmente dentro del sitio de ligacion de ARNds N-terminal de un polipeptido TLR3 humano. Opcionalmente, el anticuerpo liga adicionalmente TLR3 por lo menos parcialmente dentro de la cadena principal de la porcion N-terminal del polipeptido TLR3.

Mientras que algunos epftopos previos en TLR3 han mostrado que son utiles para la inhibicion eficaz de TLR3, los epftopos no han estado necesariamente presentes en los primates no humanos. En un aspecto, la invencion proporciona anticuerpos que inhiben la actividad del polipeptido TLR3 al ligarse a la porcion N-terminal de una protema TLR3 humana, y que tambien se ligan al TLR3 de primate no humano. En un aspecto, la invencion proporciona anticuerpos que se ligan a la porcion N-terminal de la protema TLR3 y que no compiten con el ARNds para ligarse al TLR3 humano, en donde los anticuerpos tambien se ligan a un polipeptido TLR3 de primate no humano (en una celula que expresa TLR3 de primate no humano). En un aspecto, la invencion proporciona anticuerpos que se ligan a la porcion N-terminal de la protema TLR3 y que compite con el ARNds para ligarse al sitio de ligacion de ARNds de N-terminal de un polipeptido TLR3 humano, en donde los anticuerpos tambien se ligan a un polipeptido TLR3 de primate no humano (en una celula que expresa TLR3 de primate no humano). En una modalidad, los anticuerpos por lo menos parcialmente (o principal o exclusivamente) en la superficie lateral sin glicano del polipeptido TLR3 (la cara ligada por el ARNds). En una modalidad, los anticuerpos se ligan a TLR3 por lo menos parcialmente dentro del sitio de ligacion a ARNds N-terminal de un polipeptido TLR3 humano. En una modalidad, el primate no humano es macaca fascicularis. En una modalidad, el polipeptido TLR3 de primate no humano comprende una secuencia de aminoacidos mostradas en el numero de acceso NCBI BAG55033 (SEQ ID NO: 2).

En un aspecto, la invencion proporciona anticuerpos que se ligan a la porcion N-terminal de una protema TLR3 humana, notablemente dentro de los residuos 41 a 251, opcionalmente por lo menos parcialmente dentro de los residuos 41 a 139, 41 a 120 o residuos 41 a 89, del TLR3 humano de SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, la invencion proporciona anticuerpos que se ligan a la porcion N-terminal de una protema TLR3 humana, en donde el anticuerpo tiene ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en su porcion N-terminal en el segmento que corresponde a los residuos 41-139 de SEQ ID NO: 1, relativa con la ligacion entre el anticuerpo y un polipeptido TLR3 de tipo natural de SEQ ID NO: 1.

Opcionalmente, los anticuerpos de la invencion interfieren con la ligacion de ARNds al sitio de ligacion a ARNds N-terminal de un polipeptido TLR3 humano. Opcionalmente, los anticuerpos ligan uno o mas residuos de aminoacidos dentro de la superficie lateral sin glicano del polipeptido TLR3 que se implica en la ligacion del polipeptido TLR3 a ARNds, y/o residuos adyacentes a los mismos.

Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende los residuos 64 y/o residuo 65 de SEQ ID NO: 1, y/o tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 64 y/o residuo 65 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende los residuos 86 y/o residuo 89 de SEQ ID NO: 1, y/o tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 86 y/o residuo 89 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende residuos 117 y/o residuo 120 de SEQ ID NO: 1, y/o tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 117 y/o residuo 120 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende residuos 137 y/o residuo 139 de SEQ ID NO: 1, y/o tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 137 y/o residuo 139 de s Eq ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epttopo que comprende residuos 112, 113 y/o 115 de SEQ ID NO: 1, y/o tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 112, 113 y/o 115 de SEQ ID NO: 1.

En una modalidad, los anticuerpos tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 117 y/o residuo 120 de SEQ ID NO: 1, y ligacion reducida a un polipeptido ^tLR3 que tiene una mutacion en los residuos 137 y/o residuo 139 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 117 y/o residuo 120 de SEQ ID NO: 1, y no tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 137 y/o residuo 139 de SEQ ID NO: 1. En una modalidad, los anticuerpos tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 64 y/o residuo 65 de SEQ ID NO: 1, y ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 137 y/o residuo 139 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 86 y/o residuo 89 de SEQ ID NO: 1, y ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 137 y/o residuo 139 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos no tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 117 y/o residuo 120 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos no tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 112, 113 y/o 115 de SEQ ID NO: 1.

Opcionalmente, los anticuerpos tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 64 y/o residuo 65 de SEQ ID NO: 1, un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 86 y/o residuo 89 de SEQ ID NO: 1 y un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 137 y residuo 139 de SEQ ID NO: 1. Como es evidenciado por la ligacion a los mutantes TLR3, los anticuerpos difieren en su epftopo de los anticuerpos previamente descritos.

En una modalidad, los anticuerpos tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 112, 113 y/o 115 de SEQ ID NO: 1, y ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 137 y/o residuo 139 de SEQ ID NO: 1. En una modalidad, los anticuerpos tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 112, 113 y/o 115 de SEQ ID NO: 1, y ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 117 y/o residuo 120 de SEQ ID NO: 1. En una modalidad, los anticuerpos tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 112, 113 y/o 115 de SEQ ID NO: 1, ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 117 y/o residuo 120 de SEQ ID NO: 1, y ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 137 y/o residuo 139 de SEQ ID NO: 1. En una modalidad, los anticuerpos tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 112 y/o 113 de SEQ ID NO: 1, y ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en el residuo 137 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos no tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 86 y/o residuo 89 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos no tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 64 y/o residuo 65 de SEQ ID NO: 1.

Opcionalmente, en cualquiera de las modalidades en la presente, los anticuerpos mantienen la ligacion (no tienen ligacion reducida) a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 116, 145, 182, 196 y/o residuo 171 de SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, la invencion proporciona anticuerpos que interfieren con la ligacion de ARNds a un polipeptido TLR3 humano. En un aspecto, la invencion proporciona anticuerpos que interfieren con la ligacion de ARNds al sitio de ligacion a ARNds N-terminal de un polipeptido TLR3 humano. Opcionalmente, los anticuerpos compiten con ARNds para ligarse al polipeptido TLR3 humano, por ejemplo, al sitio de ligacion a ARNds N-terminal de un polipeptido TLR3 humano. La competicion se puede evaluar utilizando metodos estandares, por ejemplo, ensayos Biacore para evaluar si los anticuerpos se ligan a TLR3 inmovilizado en presencia de ARNds, y/o si el ARNds se liga al TLR3 inmovilizado en presencia de anticuerpos, bajo condiciones acidas.

Opcionalmente, los anticuerpos compiten con ARNds para ligarse al polipeptido TLR3 humano en un ensayo in vitro que comprende las etapas de: (i) poner en contacto un anticuerpo anti-TLR3 con un polipeptido TLR3 para obtener anticuerpos ligados al polipeptido TLR3, y (ii) poner en contacto el anticuerpo ligado al polipeptido TLR3 de la etapa (i) con ARNds y evaluar si el ARNds disminuye la ligacion del polipeptido TLR3 (al anticuerpo, en donde una disminucion de la ligacion indica competicion con el ARNds para el polipeptido TLR3 humano. Opcionalmente, los anticuerpos compiten con el ARNds para ligarse con polipeptido TLR3 humano en un ensayo in vitro que comprende las etapas de: (i) poner en contacto un polipeptido TLR3 con el ARNds para obtener el ARNds ligado al polipeptido TLR3, y (ii) poner en contacto el ARNds ligado al polipeptido TLR3 de la etapa (i) con un anticuerpo anti-TLR3 y evaluar si el polipeptido TLR3 se liga al complejo de ARNds-polipeptido TLR3, en donde la falta de ligacion sustancial indica la competicion con ARNds para el polipeptido TLR3 humano. Opcionalmente, los anticuerpos compiten con el ARNds para ligar al polipeptido TLR3 humano en un ensayo in vitro que comprende las etapas de: (i) unir un anticuerpo anti-TLR3 a un soporte solido (por ejemplo, a traves de un dominio constante), (ii) poner en contacto dicho anticuerpo con un polipeptido TLR3 para obtener anticuerpos ligados al polipeptido TLR3, y (iii) poner en contacto el anticuerpo ligado al polipeptido TLR3 de la etapa (ii) con el ARNds y evaluar si el ARNds disminuye la ligacion del polipeptido TLR3 al anticuerpo, donde una disminucion de la ligacion indica competicion con el ARNds para el polipeptido TLR3 humano.

En un aspecto de cualquiera de las modalidades de la invencion, el anticuerpo se liga a un polipeptido TLR3 humano expresado en la superficie de una celula, opcionalmente como es evaluado en una celula que expresa TLR3 exclusivamente en la superficie celular bajo pH neutro, se internaliza en una celula que expresa TLR3, e inhibe la senalizacion TLR3 en una celula (por ejemplo, una celula dendntica humana que expresa TLR3).

En un aspecto, los anticuerpos se ligan a polipeptidos TLR3 humanos bajo condiciones neutras, y en particular bajo condiciones representativas de aquellas encontradas en citosol de la celula. Tales condiciones neutras se caracterizan generalmente por un pH entre 6.6 y 7.4, por ejemplo, un pH ligeramente alcalino de 7.2 encontrado en el citosol de la celula. Opcionalmente, el anticuerpo tiene una Kd de no mas de 10-9M, opcionalmente menor que 10 10M, opcionalmente menor que 10-11M para la ligacion a un polipeptido TLR3 en pH neutro. Opcionalmente, la ligacion en condiciones neutras es de mejor afinidad que bajo condiciones acidas, por ejemplo, donde la Kd para la ligacion a TLR3 en condiciones neutras comparadas a acidas es mas baja por al menos 0.5-, 1.0-, 1.5- o 2.0- logio. La presente invencion proporciona ademas anticuerpos espedficos que tienen actividad incrementada sobre los anticuerpos previamente reportados. En un aspecto de cualquiera de las modalidades de la invencion, el anticuerpo compite para la ligacion a un polipeptido TLR3 (por ejemplo, un polipeptido TLR3 humano que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1) con cualquiera de una o cualquier combinacion del anticuerpo monoclonal 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7, opcionalmente bajo condiciones acidas y/o neutras. En una modalidad, un anticuerpo de la invencion compite para la ligacion a un polipeptido TLR3, opcionalmente bajo condiciones acidas y/o neutras, con un anticuerpo que tiene respectivamente una region VH y VL de SEQ ID NOS: 3 y 4 (11E1), una region VH y VL de SEQ ID NOS: 14 y 15 (31F6), una region VH y VL de SEQ ID NOS: 25 y 26 (32C4), una region VH y VL de SEQ ID NOS: 36 y 37 (37B7) o una region VH y VL de SEQ ID NOS: 47 y 48 (7G11). En un aspecto de cualquiera de las modalidades de la invencion, el anticuerpo puede tener una cadena pesada y/o ligera que tiene una, dos o tres CDRs del anticuerpo 11E1, 7G11, 31F6, 32c4 o 37B7.

En un aspecto, el anticuerpo que se liga espedficamente a TLR3 tiene una o mas (incluyendo cualquier combinacion de las mismas, o todas de) de las siguientes propiedades:

a. se liga a un polipeptido TLR3 que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 y/o 2;

b. se liga espedficamente a un polipeptido TLR3 humano expresado solamente en la superficie de una celula, en donde el anticuerpo tiene una EC50 de no mas de 0.3 pg/ml, opcionalmente no mas de 0.2 pg/ml, opcionalmente no mas de 0.1 pg/ml, para la ligacion a las celulas que expresan TLR3 solamente en la superficie celular;

c. se internaliza en una celula que expresa TLR3 sobre su superficie;

d. tiene una afinidad subnanomolar para un polipeptido TLR3 en un pH neutro, por ejemplo, un pH de aproximadamente pH 7.2;

e. tiene una afinidad subnanomolar para un polipeptido TLR3 en un pH acido, por ejemplo, un pH menor que aproximadamente 6.5, o entre aproximadamente 4.5 a 6.5 o aproximadamente pH 5.6;

f. inhibe la senalizacion de TLR3 en presencia de un ligando TLR3;

g. inhibe la senalizacion TLR3 en un fondo inflamatorio, por ejemplo, en presencia de citoquinas inflamatorias tales como IFNa;

h. compite para la ligacion a un polipeptido TLR3 con el anticuerpo 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7;

i. compite con el ARNds para la ligacion a la porcion N-terminal del polipeptido TLR3;

j. tiene ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 64 y/o residuo 65 de SEQ ID NO: 1, y/o ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 86 y/o residuo 89 de SEQ ID NO: 1;

k. tiene ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 117 y/o residuo 120 de SEQ ID NO: 1, y/o tiene ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 137 y/o residuo 139 de SEQ ID NO: 1, y/o tiene ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 112, 113 y/o 115 de SEQ ID NO: 1; y/o

l. se liga a por lo menos, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o mas residuos en el segmento que corresponde a los residuos 41-251,41-89, 41-120 o 41-139 del polipeptido TLR3 de SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo monoclonal que se liga espedficamente al por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o mas residuos en el segmento que corresponde a los residuos 1-251, opcionalmente 41-251,41-89, 41-120 o 41-139 del polipeptido TLR3 de SeQ ID NO: 1. Opcionalmente, el anticuerpo inhibe la senalizacion por el polipeptido TLR3. Opcionalmente, el anticuerpo no se liga al residuo 116, residuo 145 y/o residuo 182 del polipeptido TLR3 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, el anticuerpo no se liga al residuo 171, y/o residuo 196 del polipeptido TLR3 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, la ligacion del anticuerpo a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos 116, 145, 182196 y/o residuo 171 del polipeptido TLR3 de SeQ ID NO: 1 se mantiene (es decir, no se reduce sustancialmente), en comparacion con la ligacion a un polipeptido TLR3 de tipo natural de SEQ ID NO: 1; de manera preferente dicha mutacion es una mutacion K145E, D116R, K182E, N196A y/o E171A. Tales anticuerpos pueden tener opcionalmente ademas cualquiera de las propiedades descritas en la presente, por ejemplo, afinidad subnanomolar para un polipeptido TLR3 en un pH acido, inhibe la senalizacion TLR3 en presencia de un ligando TLR3 o en un fondo inflamatorio (por ejemplo, en presencia de citoquinas inflamatorias tal como IFNa), compite para la ligacion a un polipeptido TLR3 con 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7; no compite con el ARNds para la ligacion a la porcion C-terminal del polipeptido TLR3; o inhibe la secrecion IP-10 en la DC (por ejemplo, en la DC mieloide humana). Tales anticuerpos se pueden utilizar adicionalmente en cualquiera de los metodos de la invencion.

En una modalidad, la invencion proporciona un anticuerpo que se liga a un polipeptido TLR3, en donde el anticuerpo comprende (i) las secuencias de aminoacidos CDR 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NO: 5, 6 o 7 (HCDR1), 8 o 9 (HCDR2) y 10 (HCDR3), y (ii) las secuencias de aminoacido CDR 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCD^r3) como se muestra en ^sEQ ID NO: 11, 12 y 13, respectivamente; en donde uno, dos, tres, cuatro, o cinco o mas de los aminoacidos en cualquiera de dichas secuencias se puede sustituir por un aminoacido diferente. En una modalidad, el anticuerpo comprende (i) las secuencias de aminoacidos CDR 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en s Eq ID NO: 16, 17 o 18 (HCDR1), 19 o 20 (HCDR2) y 21 (HCDR3), y (ii) las secuencias de aminoacidos CDR 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NO: 22, 23 y 24, respectivamente; en donde uno, dos, tres, cuatro o cinco o mas de los aminoacidos en cualquiera de dichas secuencias se puede sustituir por un aminoacido diferente. En una modalidad, el anticuerpo comprende (i) las secuencias de aminoacidos CDR 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NO: 27, 28 o 29 (HCDR1), 30 o 31(HCDR2) y 32 (HCDR3), y (ii) las secuencias de aminoacidos CDR 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NO: 33, 34 y 35, respectivamente; en donde uno, dos, tres, cuatro o cinco o mas de los aminoacidos en cualquiera de dichas secuencias se puede sustituir por un aminoacido diferente. En una modalidad, el anticuerpo comprende (i) las secuencias de aminoacidos CDR 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en S^eQ ID NO: 38, 39 o 40 (HCDR1), 41 o 42 (H^cDR2) y 43 (HCDR3), y (ii) las secuencias de aminoacidos CDR 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, L^cDR3) como se muestra en SEQ ID NO: 44, 45 y 46, respectivamente; en donde uno, dos, tres, cuatro o cinco o mas de los aminoacidos en cualquiera de dichas secuencias se puede sustituir por un aminoacido diferente. En una modalidad, el anticuerpo comprende (i) las secuencias de aminoacidos CDR 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NO: 49, 50 o 51 (HCDR1), 52 o 53 (HCDR2) y 54 (HCDR3), y (ii) las secuencias de aminoacidos CDR 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NO: 55, 56 y 57, respectivamente; en donde uno, dos, tres, cuatro o cinco o mas de los aminoacidos en cualquiera de dichas secuencias se puede sustituir por un aminoacido diferente.

En otra modalidad, el anticuerpo de cualquiera de las modalidades en la presente es capaz de ser internalizado por una celula que expresa el polipeptido TLR3 sobre su superficie.

En una modalidad, el anticuerpo es quimerico, por ejemplo, contiene una region constante no de murino, opcionalmente humana. En una modalidad, el anticuerpo es humano o humanizado. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de raton o rata (por ejemplo, comprende CDRs derivadas de una rata o un gen de rata o un segmento de gen de sitio Ig de rata). En otra modalidad, el anticuerpo no se liga sustancialmente a otros TLRs humanos (por ejemplo, TLR4).

En un aspecto de cualquiera de las modalidades de la invencion, el isotipo del anticuerpo es IgG, opcionalmente IgG1 o IgG3. En una modalidad el anticuerpo comprende un dominio Fc o es de un isotipo que se liga por FcyR.

En un aspecto de cualquiera de las modalidades de la invencion, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo seleccionado de Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, diacuerpos, fragmento de anticuerpo de cadena individual, o un anticuerpo multiespedfico que comprende multiples fragmentos de anticuerpos diferentes. En un aspecto de cualquiera de las modalidades de la invencion, el anticuerpo no comprende un dominio Fc o es de un isotipo que no se liga sustancialmente por FcyR (por ejemplo, CD16 humana). En una modalidad, el anticuerpo es de isotipo IgG4 o IgG2 humano. Los isotipos IgG4 humanos u otros isotipos de IgG modificados para reducir su ligacion a FcyR se pueden utilizar para sus propiedades farmacologicas ventajosas, tal como vida media en suero, mientras que modulan la senalizacion de TLR3, en por ejemplo, una DC, sin inducir la muerte de la celula. En un aspecto de cualquiera de las modalidades de la invencion, el anticuerpo anti-TLR3 inhibe la senalizacion TLR3 y comprende una region constante de isotipo IgG4 o IgG2 humano. En un aspecto, de cualquiera de las modalidades de la invencion, el anticuerpo anti-TLR3 inhibe la senalizacion TLR3 y comprende una region constante (region constante de cadena pesada) que no se liga sustancialmente a FoyRMIa.

En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-TLR3 comprende una cadena pesada de isotipo IgG4 humano. En una modalidad, el anticuerpo anti-TLR3 comprende una region constante de cadena pesada IgG4 humana y que comprende una mutacion de serina a prolina en el residuo 241, que corresponde a la posicion 228 de acuerdo con el mdice de EU (Kabat y colaboradores, “Sequences of proteins of immunological interest”, 5^sedicion, NIH, Bethesda, ML, 1991). Las composiciones que comprenden tales anticuerpos se pueden caracterizar por tener menor que aproximadamente 15%, tal como menor que aproximadamente 10% (por ejemplo, aproximadamente 5% o menor, aproximadamente 4% o menor, aproximadamente 3% o menor, o aun aproximadamente 1% o menor) de “semianticuerpos” IgG4 (que comprenden un par de cadena pesada/cadena ligera individual). Tales subproductos de “semi-anticuerpo” IgG4 se forman debido a la heterogeneidad de los puentes disulfuro de cadena inter-pesada en la region bisagra en una proporcion de la IgG4 humana secretada (ver Angal y colaboradores, Molecular Immunology, 30 (1): 105-108, 1993 para una descripcion de “semi-anticuerpos” IgG4, mutacion S241P y principios relacionados). Este efecto es tfpicamente solo detectable bajo condiciones de desnaturalizacion, no reductoras.

En otra modalidad, el anticuerpo se conjuga o se liga covalentemente a un resto detectable o toxico.

En un aspecto, los anticuerpos inhiben opcionalmente la senalizacion TLR3 sin bloquear la union de un ligando de ARNds TLR3 al sitio de ligacion a ARNds principal (es decir, C-terminal) del polipeptido TLR3.

En un aspecto, los anticuerpos tambien se ligan a TLR3 humano bajo condiciones acidas, y en particular bajo condiciones representativas de aquellas encontradas en un compartimiento subcelular acidificado de una celula (por ejemplo, compartimentos de la ruta endocftica endosomica, lisosomica). Tales condiciones acidas se caracterizan generalmente por un pH menor que aproximadamente pH 6.5, o entre aproximadamente pH 4.5 a 6.5, o aproximadamente pH 5.6.

En un aspecto de cualquiera de las modalidades en la presente, los anticuerpos modulan, opcionalmente inhiben, la senalizacion TLR3 en un compartimiento subcelular acidificado de una celula (por ejemplo, compartimentos de la ruta endocftica endosomica, lisosomica).

En un aspecto de cualquiera de las modalidades en la presente, los anticuerpos modulan, opcionalmente inhiben, la senalizacion TLR3 en una celula dendntica (DC) (por ejemplo, una DC mieloide, DC derivada de monocitos).

En otros aspectos de cualquiera de las modalidades en la presente, la afinidad de ligacion bivalente de los anticuerpos para TLR3 bajo condiciones neutras y/o acidas se puede caracterizar opcionalmente por una K^dmedia de no mas de aproximadamente (es decir, mejor afinidad que) 100, 50, 10, 5, o 1 nanomolar, de manera preferente sub-nanomolar u opcionalmente no mas que aproximadamente 500, 200, 100 o 10 picomolar.

En otros aspectos de cualquiera de las modalidades en la presente, los anticuerpos inhiben la senalizacion TLR3 por al menos parcialmente (o completamente) bloquear la ligacion de un ligando TLR3 a un polipeptido TLR3. El ligando TLR3 sera generalmente un ligando diferente a un anticuerpo anti-TLR3 y puede ser un ligando TLR3 de origen natural o no de origen natural, opcionalmente un ligando basado en ARNds tal como poliAU (acido poliademlico: acido poliuridflico) o polilC (acido poliinosmico:policitidflico).

En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para identificar, clasificar y/o producir un anticuerpo que se liga e inhibe espedficamente un polipeptido TLR3 en un sujeto mamffero, dicho metodo que comprende las etapas de: a) proporcionar una pluralidad de anticuerpos que ligan el polipeptido TLR3 humano, opcionalmente por un metodo que comprende inmunizar un marnffero no humano con un inmunogeno que comprende un polipeptido TLR3, y (b) evaluar la afinidad de ligacion de dichos anticuerpos para el polipeptido TLR3 en una celula que expresa TLR3 humano solamente en la superficie celular. Opcionalmente, el metodo comprende ademas seleccionar un anticuerpo de dicha pluralidad que tiene una EC⁵⁰de no mas que 0.3 pg/ml, opcionalmente no mas que 0.2 pg/ml, opcionalmente no mas que 0.1 pg/ml, para ligarse a las celulas que expresan TLR3 humano solamente en la superficie celular.

Cualquiera de los metodos de la invencion se puede caracterizar adicionalmente ya que comprenden cualquier etapa descrita en la solicitud, incluyendo notablemente, en la “Descripcion Detallada de la Invencion”). La invencion se refiere adicionalmente a un anticuerpo obtenible por cualquiera de los metodos presentes. La invencion se refiere adicionalmente a formulaciones farmaceuticas o de diagnostico de los anticuerpos de la presente invencion. La invencion se refiere adicionalmente a metodos para utilizar anticuerpos en los metodos de tratamiento o diagnosis, opcionalmente en combinacion con un segundo agente terapeutico (por ejemplo, un corticoide, un DMARD, una anticitoquina o un agente receptor anticitoquinas, un agente anti-TNFalfa, etc).

Estos aspectos y caractensticas adicionales ventajosos de la invencion se pueden describir adicionalmente en cualquier lugar en la presente.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Las Figuras 1A, 1B, 1C y 1D muestran el efecto de la dosis in vitro para la ligacion a las celulas HEK293T transfectadas transcientemente con un constructo TLR3 ECD y que expresa TLR3 solamente en su superficie para los anticuerpos 11E1, 7G11, 32C4 y 31F6, respectivamente. Cada anticuerpo se compara con el anticuerpo de referencia 31C3; la ligacion al TLR3 de superficie celular se mejora para los anticuerpos l1 E1, 7G11, 32C4 y 31F6. Las Figuras 2A, 2B, 2C, y 2D muestran la inhibicion dependiente de dosis de la senalizacion TLR3 utilizando un ensayo de luciferasa TLR3-293T-humano con los anticuerpos anti-TLR3 humanos. Cada anticuerpo se compara con el anticuerpo de referencia 31C3; la inhibicion de la senalizacion TLR3 inducida por ARNds se mejora para los anticuerpos 11E1, 7G11, 32C4, 31F6 y 37B7.

Las Figuras 2F, 2G, y 2H muestran la vista del extremo N-terminal del polipeptido TLR3, que muestra los residuos de aminoacidos mutados indicados en negro y los residuos adyacentes a los residuos que forman parte de los epttopos principales en gris. La Figura 2F muestra una vista de la superficie lateral sin glicano del polipeptido TLR3, con el extremo N-terminal del polipeptido TLR3 en el lado derecho de la imagen); la Figura 2G muestra una vista de la superficie lateral que contiene glicano del polipeptido TLR3 y la cadena principal, con el extremo N-terminal del polipeptido TLR3 en el primer plano (a la izquierda de la imagen). La Figura 2H muestra una vista de la superficie lateral sin glicano del polipeptido TLR3 y la cadena principal, con el extremo N-terminal del polipeptido ^tLR3 en primer plano (a la derecha de la imagen).

La Figura 3 muestra resultados de modelos de raton de artritis reumatoide. La Figura 3A muestra los resultados de un modelo de raton de artritis reumatoide preventiva. La Figura 3B muestra los resultados de un modelo de raton de artritis reumatoide curativa. La Figura 3C muestra los resultados de un modelo de raton de artritis reumatoide curativa cuando los ratones se tratan con PBS, un anticuerpo de control, 28G7 y un anticuerpo anti-TNFy (HumiraMR).

La Figura 4 muestra los resultados del modelo de colitis de raton. La Figura 4A muestra las mediciones del espesor de la pared para los ratones tratados con solucion salina (puntos negros), con TNBS solamente (cuadrados negros) con un anticuerpo anti-TNFy y TNBS (triangulos negros), con 28G7 y TNBS (puntos abiertos), y con un Ab de control y TNBS (cuadrados abiertos). La Figura 4B muestra el registro del dano macroscopico para los ratones tratados con solucion salina (puntos negros), con TNBS solamente (cuadrados negros) con un anticuerpo anti-TNFa y TNBS (triangulos negros), con 28G7 y TNBS (puntos abiertos), y con un Ab de control y TNBS (cuadrados abiertos). El anticuerpo anti-TLR3 de acuerdo con la invencion mejora el desarrollo de la enfermedad, bajo condiciones rigurosas. (*p<0.05, **p<0.01 vs solucion salina).

La Figura 5 muestra los resultados de un modelo de raton COPD. La Figura 5A muestra conteos de celulas diferenciales BAL para macrofagos, eosinofilos, neutrofilos y linfocitos. Los anticuerpos anti-TLR3 disminuyeron en gran medida la infiltracion de neutrofilos en las vfas aereas, mientras no afectan sustancialmente los macrofagos eosinofilos o linfocitos. La Figura 5B muestra el oxfgeno saturado de sangre venosa (en por ciento) para cada uno de LPS/elastasa sola y LPS/elastasa en combinacion con los anticuerpos anti-TLR3 o roflumilast. La Figura 5C muestra la IL17A al fluido BAL (BALF), donde los anticuerpos anti-TLR3 disminuyeron IL17A (pg/ml) sustancialmente, y tanto como el roflumilast. La Figura 5D muestra la IP-10 en BALF, donde los anticuerpos -TLR3 disminuyeron la lP-10 (pg/ml) sustancialmente. La Figura 5E muestra los conteos de celulas diferenciales BAL para macrofagos, neutrofilos y linfocitos para un segundo estudio que compara los anticuerpos anti-TLR3 (28G7), roflumilast (Rofu) y la combinacion de roflumilast y anticuerpos anti-TLR3 (combo).

La Figura 6 muestra los resultados de un modelo de raton CLP (ligacion y puncion cecal - sepsis). En este modelo agudo, los ratones experimentaron una infeccion aguda, imitando el choque septico.

Las Figuras 7A y 7B muestran los resultados de las combinaciones de farmacos con los TLR3 mAbs anti-humanos (etiquetados IPH33.1) en combinacion con dexametasona o HumiraMR respectivamente. Los anticuerpos redujeron cada uno sustancialmente la produccion de IP-10 in vitro por PBMC en respuesta al polilC adicionalmente cuando se combinaron con la dexametasona o HumiraMR.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Introduccion

La presente invencion se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de anticuerpos monoclonales de alta afinidad que inhiben espedfica y eficientemente la ruta de senalizacion TLR3. Los inventores tambien proporcionan nuevos epftopos presentes en el TLR3 humano, incluyendo el epftopo reconocido por el anticuerpo 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 y/o 37B7, que son particularmente eficientes en inhibir la senalizacion TLR3, e inhibir la liberacion de citoquinas en respuesta a la estimulacion con un ligando TLR3.

Los anticuerpos se pueden utilizar para tratar una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria en un sujeto en necesidad de los mismos. La presente invencion tambien proporciona metodos para tratar reincidencias, ataques, o fases agudas, que se presentan durante el curso de una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria en un sujeto en necesidad de los mismos utilizando un anticuerpo anti-TLR3 que inhibe la senalizacion TLR3. La presente invencion tambien proporciona metodos novedosos para tratar enfermedades inflamatorias o autoinmunitarias establecidas en un sujeto en necesidad de los mismos utilizando un anticuerpo anti-TLR3 que inhibe la senalizacion TLR3. La invencion tambien proporciona regfmenes de tratamiento y combinaciones de tratamiento que se pueden utilizar para el tratamiento de enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria en un sujeto en necesidad de las mismas utilizando un anticuerpo anti-TLR3 que inhibe la senalizacion TLR3.

Los anticuerpos de la presente invencion que se ligan a TLR3 bajo condiciones acidas y neutras, se ligaran generalmente tanto TLR3 de superficie celular como TLR3 endosomico en alta afinidad, tal que los anticuerpos seran utiles en cualquier situacion (por ejemplo, tratamiento o prevencion de la enfermedad), donde la orientacion (por ejemplo, modulacion) a TLR3 es util. El TLR3 se ha descubierto en algunos casos de inflamacion, la superficie de los macrofagos y el bloqueo de TLR3 en la neutralizacion de la cloroquina de la acidificacion endosomica sin embargo mostro alguna actividad anti-inflamatoria (Cavassani y colaboradores, 2008, supra). Sin embargo, los anticuerpos de la invencion tendran la ventaja mas grande sobre otros anticuerpos en el tratamiento o prevencion de enfermedades donde la modulacion (por ejemplo, inhibicion) de la senalizacion por TLR3 en los compartimentos citosolicos (por ejemplo, endosomicos) es util o requerida, y la importancia relativa para modular la senalizacion de tales compartimentos TLR3 puede depender de la enfermedad. Un ejemplo de tal enfermedad es artritis reumatoide; el TLR3 expresado en compartimiento endosomico se cree que desempena una funcion importante en la artritis reumatoide, puesto que el tratamiento con cloroquina, un inhibidor de la acidificacion endosomica, inhibe la senalizacion TLR3 e inhibe la produccion de citoquinas inflamatorias de los cultivos sinoviales de pacientes que tienen artritis reumatoide (Sacre y colaboradores, (2008) J. Immunol. 181:8002-8009). El TLR3 expresado en el compartimiento endosomico se cree que desempena una funcion importante en un numero de otras enfermedades donde la DC (por ejemplo, DC mieloide) se implica en la exacerbacion de la enfermedad, ya que la mDC tiene una capacidad bien documentada para captar antfgenos de celulas apoptoticas o necroticas incluyendo durante la necrosis de tejido durante la inflamacion aguda.

Puesto que los presentes anticuerpos son espedficos para TLR3, tambien se pueden utilizar para otros propositos, incluyendo purificacion de TLR3 o celulas que expresan TLR3, modulacion (por ejemplo, activacion o inhibicion) de los receptores TLR3 in vitro, ex vivo, o in vivo, orientacion de las celulas que expresan TLR3 para destruccion in vivo, o espedficamente etiquetado/ligacion a TLR3 in vivo, ex vivo, o in vitro, incluyendo, para metodos tales como inmunotincion, analisis de IHC, es decir, en biopsias congeladas, analisis FACS, e inmunoprecipitacion.

Definiciones

Como se utiliza en la presente, “ligando TLR3” se refiere a cualquier compuesto que pueda ligarse espedficamente a, y alterar la actividad de TLR3 in vitro, ex vivo o in vivo. El compuesto puede ser un ligando de origen natural, por ejemplo, generalmente ARNds o ARNds viral, o un ligando sintetico tal como polilC o poliAU. El compuesto puede ser cualquier tipo de molecula, incluyendo compuestos o elementos inorganicos u organicos, incluyendo protemas (tales como anticuerpos), acidos nucleicos, carbohidratos, lfpidos, o cualquier otra entidad molecular. Ademas, tales compuestos pueden modular los receptores TLR3 en cualquier forma, incluyendo activacion o inhibicion, y mediante cualquier mecanismo, incluyendo por la ligacion al receptor y accionando o desactivando la actividad de una manera similar a un ligando de origen natural, o al ligarse al receptor y bloquear el acceso a otros ligandos. De manera preferente, el ligando activa el receptor, y como tal se puede utilizar para inducir la produccion de citoquinas por las celulas que expresan TLR3.

El termino “anticuerpo”, como se utiliza en la presente, se refiere a anticuerpos policlonales y monoclonales. Dependiendo del tipo del dominio constante en las cadenas pesadas, los anticuerpos se asignan a una de cinco clases mayores: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Varias de estas se dividen adicionalmente en subclases o isotipos, tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, y similares. Una unidad estructural de inmunoglobulina ejemplar (anticuerpo) comprende un tetramero. Cada tetramero se compone de dos pares identicos de cadenas de polipeptido, teniendo cada par una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” (aproximadamente 50-70 kDa). La N-terminal de cada cadena define una region variable de aproximadamente 100 a 1l0 o mas aminoacidos que son principalmente responsables por el reconocimiento del antfgeno. Los terminos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas respectivamente. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son llamados “alfa”, “delta”, “epsilon”, “gamma” y “mu”, respectivamente. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. IgG e/o IgM son las clases preferidas de anticuerpos empleados en esta invencion, con IgG que se prefiere particularmente debido a que son los anticuerpos mas comunes en la situacion fisiologica y debido a que se fabrican mas facilmente en una instalacion de laboratorio. De manera preferente, el anticuerpo de esta invencion es un anticuerpo monoclonal. Particularmente preferidos son los anticuerpos adecuados humanizados, quimericos, humanos, o de otra manera humanos. “Anticuerpos” tambien incluye cualquier fragmento o derivado de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente.

El termino “se liga especfticamente a” significa que un anticuerpo se puede ligar de manera preferente en un ensayo de ligacion competitivo al socio de ligacion, por ejemplo, TLR3, como es evaluado utilizando ya sea formas recombinantes de las protemas, epftopos en la presente, o protemas nativas presentes sobre la superficie de las celulas objetivo aisladas. Los ensayos de ligacion competitivos y otros metodos para determinar la ligacion espedfica se describen adicionalmente a continuacion y son bien conocidos en la tecnica.

Cuando un anticuerpo se dice que “compite con” un anticuerpo monoclonal particular (por ejemplo, 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7) u otro ligando TLR3 (por ejemplo, ARNds, significa que el anticuerpo compite con el anticuerpo monoclonal (u otro ligando TLR3) en un ensayo de ligacion utilizando ya sea moleculas TLR3 recombinantes o moleculas TLR3 expresadas superficiales. Por ejemplo, si un anticuerpo de prueba reduce la ligacion de 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7 a un polipeptido TLR3 o celula que expresa TLR3 en un ensayo de ligacion, el anticuerpo se dice que “compite”, respectivamente, con 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7.

El termino “afinidad”, como se utiliza en la presente, significa la resistencia de la ligacion de un anticuerpo a un epftopo. La afinidad de un anticuerpo se da por la constante de disociacion Kd, definida como [Ab] x [Ag]/[Ab-Ag], donde [Ab-Ag] es la concentracion molar del complejo de anticuerpo-antfgeno, [Ab] es la concentracion molar del anticuerpo no ligado y [Ag] es la concentracion molar del anftgeno no ligado. La constante de afinidad Ka se define por 1/Kd. Los metodos preferidos para determinar la afinidad de los mAb se pueden encontrar en Harlow, y colaboradores, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988), Coligan y colaboradores, eds, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, NY, (1992, 1993), y Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983), las referencias que se incorporan completamente en la presente a manera de referencia. Un metodo preferido y estandar bien conocido en el campo para determinar la afinidad de los mAb es el uso de los instrumentos Biacore.

Dentro del contexto de esta invencion, un “determinante” designa un sitio de interaccion o ligacion en un polipeptido. El termino “epftopo” se define como un determinante antigenico, y es el area o region o un anftgeno al cual un anticuerpo se liga. Un epftopo de protema puede comprender residuos de aminoacidos implicados directamente en la ligacion, asf como residuos de aminoacidos que se bloquean efectivamente por el anticuerpo o peptido de ligacion a antfgeno especftico, es decir, residuos de aminoacidos dentro de la “huella” del anticuerpo. Es la forma mas simple o area estructural mas pequena en una molecula de antfgeno compleja que puede combinarse con, por ejemplo, un anticuerpo o un receptor. Los epftopos pueden ser lineales o conformacionales/estructural. El termino “epftopo lineal” se define como un epftopo compuesto de residuos de aminoacidos que estan contiguos en la secuencia lineal de aminoacidos (estructura primaria). El termino “epftopo conformacional o estructural” se define como un epftopo compuesto de residuos de aminoacidos que no todos estan contiguos y de esta manera representan partes separadas de la secuencia lineal de los aminoacidos que se llevan en proximidad uno al otro por el plegamiento de la molecula (estructuras secundarias, terciarias y/o cuaternarias). Un epftopo conformacional es dependiente de la estructura 3-dimensional. El termino “conformacional” por lo tanto se utiliza frecuentemente de manera intercambiable con “estructural”.

Por “fragmento inmunogenico”, se propone en la presente cualquier fragmento polipepftdico o pepftdico que sea capaz de inducir una respuesta inmunitaria tal como (i) la generacion de anticuerpos que se ligan a dicho fragmento y/o que se ligan a cualquier forma de la molecula que comprende dicho fragmento, incluyendo el receptor ligado a membrana y mutantes derivados del mismo, (ii) la estimulacion de una respuesta de celulas T que implican celulas T que reaccionan al complejo bi-molecular que comprende cualquier molecula MHC y un peptido derivado de dicho fragmento, (iii) la ligacion de vehmulos transfectados tales como bacteriofagos o bacterias que expresan genes que codifican inmunoglobulinas de mamftero. Alternativamente, un fragmento inmunogenico tambien se refiere a cualquier construccion capaz de inducir una respuesta inmunitaria como se define anteriormente, tal como un fragmento pepftdico conjugado a una protema portadora por acoplamiento covalente, un constructo de polipeptido recombinante quimerico que comprende dicho fragmento pepftdico en su secuencia de aminoacidos, y especfticamente incluye celulas transfectadas con un ADNc de la cual la secuencia comprende una porcion que codifica dicho fragmento.

Un anticuerpo “adecuado humano” se refiere a cualquier anticuerpo, anticuerpo derivatizado o fragmento de anticuerpo que se puede utilizar con seguridad en humanos, por ejemplo, en metodos terapeuticos descritos en la presente. Los anticuerpos humanos adecuados incluyen todos los tipos de anticuerpos humanizados, quimericos o completamente humanos, o cualquiera de los anticuerpos en los cuales por lo menos una porcion de los anticuerpos se deriva de humanos o de otra manera se modifican para evitar la respuesta inmunitaria que es provocada generalmente cuando se utilizan anticuerpos no humanos nativos.

Para los propositos de la presente invencion, un anticuerpo “humanizado” o “humano” se refiere a un anticuerpo en el cual la region de estructura constante y variable de una o mas inmunoglobulinas humanas se fusionan con la region de ligacion, por ejemplo, la CDR, de una inmunoglobulina animal. Tales anticuerpos se disenan para mantener la especificidad de ligacion del anticuerpo no humano del cual las regiones de ligacion se derivan, pero evitan una reaccion inmune contra el anticuerpo no humano. Tales anticuerpos se pueden obtener de ratones transgenicos u otros animales que se han “disenado” para producir anticuerpos humanos especfticos en respuesta a la estimulacion antigenica (ver, por ejemplo, Green y colaboradores (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg y colaboradores (1994) Nature 368:856; Taylor y colaboradores (1994) Int Immun 6:579, las ensenanzas totales de las cuales se incorporan en la presente a manera de referencia). Un anticuerpo completamente humano tambien se puede construir por metodos de transfeccion geneticos o cromosomicos, as^ como tecnolog^a de expresion en fago, todos de los cuales son conocidos en el campo (ver, por ejemplo, McCafferty y colaboradores (1990) Nature 348:552-553). Los anticuerpos humanos tambien se pueden generar por celulas B activadas in vitro (ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 5,567,610 y 5,229,275, que se incorporan en su totalidad a manera de referencia). Un “anticuerpo quimerico” es una molecula de anticuerpo en la cual (a) la region constante, o una porcion de la misma, se altera, se reemplaza o se intercambia de modo que el sitio de ligacion a antigeno (region variable) se liga a una region constante de una clase diferente o alterada, funcion efectora y/o especie, o una molecula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimerico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, farmaco, etc.; o (b) la region variable, o una porcion de la misma se altera, se reemplaza o se intercambia con una region variable que tiene una especificidad de antfgeno diferente o alterada. Los terminos “dominio Fc”, “porcion Fc” y “region Fc” se refieren a un fragmento C-terminal de una cadena pesada de anticuerpo, por ejemplo, de aproximadamente 230 aminoacidos (aa) a aproximadamente 450 aa de cadena pesada y humana (gamma) o su secuencia contraparte en otros tipos de cadenas pesadas de anticuerpo (por ejemplo, a, 8, £ y p para anticuerpos humanos), o alotipo de origen natural de las mismas. A menos que se especifique de otra manera, la numeracion de aminoacidos de Kabat comunmente aceptada para inmunoglobulina se utiliza por toda esta descripcion (ver Kabat y colaboradores (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5a ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD).

Los terminos “aislado”, “purificado” o “biologicamente puro” se refieren a un material que es sustancialmente o esencialmente libre de componentes que lo acompanan normalmente como es encontrado en su estado nativo. Pureza y homogeneidad se determinan tfpicamente utilizando tecnicas de qrnmica analftica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatograffa lfquida de alto desempeno. Una protema que es la especie predominante presente en una preparacion es sustancialmente purificada.

Los terminos “polipeptido”, “peptido” y “protema” se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un polfmero de residuos de aminoacidos. Los terminos se aplican a los polfmeros de aminoacidos en los cuales uno o mas residuos de aminoacido, es un mimetico qrnmico artificial de un aminoacido de origen natural correspondiente, asf como a polfmeros de aminoacidos de origen natural y polfmero de aminoacido no de origen natural.

El termino “recombinante” cuando se utiliza con referencia, por ejemplo, una celula, o acido nucleico, protema, o vector, indica que la celula, acido nucleico, protema o vector, se ha modificado por la introduccion de un acido nucleico heterologo o protema o la alteracion de un acido nucleico nativo o protema, o que la celula se deriva de una celula modificada de esta manera. De esa manera, por ejemplo, las celulas recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la celula o expresan genes nativos que de otra manera se expresan anormalmente, subexpresado o no expresado en lo absoluto.

Dentro del contexto de esta invencion, el termino anticuerpo que “se liga” a un determinante comun designa un anticuerpo que se liga a dicho determinante con especificidad y/o afinidad.

Produccion de Anticuerpos Anti-TLR3

Los anticuerpos adecuados para el metodo de la invencion se ligan espedficamente a TLR3. Los anticuerpos de la invencion se ligan adicionalmente a TLR3 con alta afinidad en condiciones que corresponden a aquellas encontradas en la superficie celular. Los anticuerpos de la invencion son adicionalmente capaces de inhibir la ruta de senalizacion de TLR3. La capacidad de los anticuerpos inhibidores para inhibir espedficamente la ruta de senalizacion TLR3 los hacen utiles para numerosas aplicaciones, en particular para tratar o prevenir enfermedades en donde la inhibicion de la ruta de senalizacion TLR3 es deseable, es decir evita la secrecion de citoquinas y quimiocinas adicionales asf como la activacion celular, como se describe en la presente.

En una modalidad, la invencion proporciona metodos que utilizan un anticuerpo que se liga a TLR3 humano y compite para ligarse al TLR3 humano con el anticuerpo monoclonal 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7.

“TLR3”, “polipeptido TLR3” y “receptor TLR3”, usados intercambiablemente, se utilizan en la presente para referirse al Receptor 3, similar a Toll un miembro en la familia de receptor similar a Toll (TLRs). La secuencia de aminoacidos del TLR3 se muestra en SEQ ID NO: 1 (numero de acceso NCBI NP_003256, la divulgacion de la cual se incorpora en la presente a manera de referencia). La secuencia de ARNm de TLR3 humano se describe en el numero de acceso NCBI NM_003265. Las secuencias TLR3 humano tambien se describen en la publicacion de patente de PCT no. WO 98/50547, la divulgacion de la cual se incorpora en la presente a manera de referencia. Una secuencia de aminoacidos de TLR3 de primate no humano (macaca fascicularis) se muestra en el numero de acceso NCBI BAG55033 (SEQ ID NO: 2).

En un aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo que compite con el anticuerpo monoclonal 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7 y reconoce, se liga a, o tiene inmunoespecificidad para sustancialmente o esencialmente el mismo, o el mismo, epftopo o “sitio epitopico” en una molecula TLR3 como el anticuerpo monoclonal 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7. En otras modalidades, el anticuerpo monoclonal consiste en, o es un derivado o un fragmento de, el anticuerpo 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7.

Cualquier fragmento de TLR3, de manera preferente pero no exclusivamente TLR3 humano, o cualquier combinacion de fragmentos TLR3, se pueden utilizar como inmunogenos para producir anticuerpos, y los anticuerpos de la invencion pueden reconocer epftopos en cualquier ubicacion dentro del polipeptido TLR3, siempre y cuando lo puedan hacer en las celulas que expresan TLR3 tales como MdDC o MoDC como se describe en la presente. En una modalidad, los epftopos reconocidos estan presentes en la superficie celular, es decir son accesibles a los anticuerpos presentes fuera de la celula. De manera mas preferente, el epftopo es el epftopo reconocido espedficamente por el anticuerpo 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7. Ademas, los anticuerpos que reconocen distintos epftopos dentro del TLR3 se pueden utilizar en combinacion, por ejemplo, para ligarse a los polipeptidos TLR3 con eficacia y amplitud maxima entre diferentes individuos.

Los anticuerpos de esta invencion se pueden producir por una variedad de tecnicas conocidas en el campo. Tfpicamente, se producen por inmunizacion de un animal no humano, de manera preferente un raton, con un inmunogeno que comprende un polipeptido TLR3, de manera preferente un polipeptido TLR3 humano. El polipeptido TLR3 puede comprender la secuencia de longitud completa de un polipeptido TLR3 humano, o un fragmento o derivado del mismo, tfpicamente un fragmento inmunogenico, es decir, una porcion del polipeptido que comprende un epftopo expuesto sobre la superficie de las celulas que expresan un polipeptido TLR3, de manera preferente el epftopo reconocido por el anticuerpo 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7. Tales fragmentos contienen tfpicamente por lo menos aproximadamente 7 aminoacidos consecutivos de la secuencia del polipeptido madura, aun de manera mas preferente por lo menos aproximadamente 10 aminoacidos consecutivos de los mismos. Los fragmentos tfpicamente se derivan esencialmente del dominio extracelular del receptor. En una modalidad preferida, el inmunogeno comprende un polipeptido TLR3 humano de tipo natural en una membrana lipfdica, tfpicamente en la superficie de una celula. En una modalidad espedfica, el inmunogeno comprende celulas intactas, particularmente celulas humanas intactas, opcionalmente tratadas o lisadas. En otra modalidad preferida, el polipeptido es un polipeptido TLR3 recombinante.

La etapa de inmunizar un mairftfero no humano con un antfgeno se puede llevar a cabo en cualquier manera bien conocida en el campo para estimular la produccion de anticuerpos en un raton (ver, por ejemplo, E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988), la divulgacion completa de la cual se incorpora en la presente a manera de referencia). El inmunogeno se suspende o se disuelve en una solucion amortiguadora, opcionalmente con un adyuvante, tal como adyuvante de Freund completo o incompleto. Los metodos para determinar la cantidad de inmunogeno, tipos de soluciones amortiguadoras y cantidades de adyuvantes son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo y no son limitantes de ninguna manera en la presente invencion. Estos parametros pueden ser diferentes para diferentes inmunogenos, pero son facilmente elucidados.

Similarmente, la ubicacion y frecuencia de inmunizacion suficiente para estimular la produccion de anticuerpos tambien es bien conocida en el campo. En un protocolo de inmunizacion tfpico, los animales no humanos se inyectan intraperitonealmente con un antfgeno en el dfa 1 y nuevamente alrededor de una semana despues. Esto es seguido por regfmenes de recuerdo del antfgeno a aproximadamente el dfa 20, opcionalmente con un adyuvante tal como adyuvante de Freund incompleto. Las inyecciones de recuerdo se llevan a cabo intravenosamente y se pueden repetir durante varios dfas consecutivos. Esto es seguido por una inyeccion de refuerzo en el dfa 40, ya sea intravenosa o intraperitonealmente, tfpicamente sin adyuvante. Este protocolo da por resultado la produccion de celulas B productoras de anticuerpo espedficas a antfgeno despues de aproximadamente 40 dfas. Otros protocolos tambien se pueden utilizar siempre y cuando den por resultado la produccion de celulas B que expresan un anticuerpo dirigido al antfgeno utilizado en la inmunizacion.

Para la preparacion de anticuerpo policlonales, el suero se obtiene de un animal no humano inmunizado y los anticuerpos presentes en el mismo se afslan por tecnicas bien conocidas. El suero se puede purificar por afinidad utilizando cualquiera de los inmunogenos expuestos en lo anterior ligados a un soporte solido para obtener los anticuerpos que reaccionan con los polipeptidos TLR3.

En una modalidad alterna, los linfocitos de un mairftfero no humano no inmunizado se afslan, se desarrollan in vitro, y luego se exponen al inmunogeno en el cultivo de celulas. Los linfocitos luego se recolectan y la etapa de fusion descrita posteriormente se lleva a cabo.

Para los anticuerpos monoclonales preferidos, la siguiente etapa es el aislamiento de esplenocitos del mamftero no humano inmunizado y la fusion subsecuente de aquellos esplenocitos con una celula inmortalizada a fin de formar un hibridoma productor de anticuerpos. El aislamiento de los esplenocitos de un mamftero no humano es bien conocido en el campo e implica tfpicamente la remocion del bazo de un mamftero no humano anestesiado, cortarlo en piezas pequenas y comprimir los esplenocitos de la capsula esplenica a traves de una malla de nylon de filtro de celulas en una solucion amortiguadora apropiada para producir una suspension celular individual. Las celulas se lavan, se centrifugan y se vuelven a suspender de una solucion amortiguadora que lisa cualquiera de los globulos rojos. La solucion se centrifuga nuevamente y los linfocitos restantes en la pelotilla se vuelven a suspender finalmente en solucion amortiguadora reciente.

Una vez aislados y presentes en la suspension celula individual, los linfocitos se pueden fusionar a una lmea de celulas inmortales. Esto es tipicamente una lmea de celulas de mieloma de raton, aunque muchas otras lmeas de celulas inmortales utiles para crear hibridomas son conocidas en el campo. Las lmeas de mieloma de murino preferidas incluyen, pero no se limitan a, aquellas derivadas de tumores de raton MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, U. S. A., celulas X63 Ag8653 y SP-2 disponibles de the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U. S. A. La fusion se lleva a cabo utilizando polietilenglicol o similar. Los hibridomas resultantes luego se desarrollan en un medio selectivo que contiene una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las celulas de mieloma parentales, no fusionadas. Por ejemplo, si las celulas de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluiran tfpicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), sustancias que previenen el crecimiento de celulas deficientes de HGPRT.

Los hibridomas se desarrollan tfpicamente en una capa alimentadora de macrofagos. Los macrofagos son de manera preferente de companeros de camada de mairnfero no humano utilizado para aislar esplenocitos y se ceban tfpicamente con adyuvante de Freund incompleto o similar a varios dfas antes de colocar en placas los hibridomas. Los metodos de fusion se describen en Goding, “Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,” pp. 59-103 (Academic Press, 1986), la divulgacion de la cual se incorpora en la presente a manera de referencia.

Las celulas se dejan desarrollar en el medio de seleccion durante un tiempo suficiente para la formacion de colonias y la produccion de anticuerpos. Este es usualmente entre aproximadamente 7 y aproximadamente 14 dfas.

Las colonias de hibridomas luego se someten a ensayo para la produccion de anticuerpos que se ligan espedficamente a los productos genicos de polipeptido TLR3, opcionalmente el epftopo espedficamente reconocido por el anticuerpo 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7. El ensayo es tfpicamente un ensayo de tipo ELISA colorimetrico, aunque se puede emplear cualquier ensayo que pueda ser adaptado a los pocillos en los que se desarrollan los hibridomas. Otros ensayos incluyen radioinmunoensayos o clasificacion de celulas activadas por fluorescencia. Los pocillos positivos para la produccion de anticuerpos deseados se examinan para determinar si una o mas de distintas colonias estan presentes. Si mas de una colonia esta presente, las celulas se pueden volver a clonar y desarrollar para asegurar que solamente una celula individual haya dado origen a la colonia que produzca el anticuerpo deseado. Tfpicamente, los anticuerpos tambien se someteran a prueba para la capacidad de ligarse a los polipeptidos TLR3, por ejemplo, celulas que expresan TLR3, en secciones de tejido incrustadas en parafina, como se describe a continuacion.

Los hibridomas que se confirman para producir un anticuerpo monoclonal de esta invencion se pueden desarrollar en grandes cantidades en un medio apropiado, tal como DMEM o RPMI-1640. Alternativamente, las celulas de hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores de ascitis en un animal.

Despues de suficiente crecimiento para producir el anticuerpo monoclonal deseado, el medio de crecimiento que contiene el anticuerpo monoclonal (o el fluido de ascitis) se separa de las celulas y el anticuerpo monoclonal presente en las mismas se purifica. La purificacion se logra tfpicamente por electroforesis en gel, dialisis, cromatograffa utilizando protema A o protema G-Sepharose, o una Ig anti-raton ligada a un soporte solido tal como agarosa o cuentas de Sepharose (todas descritas, por ejemplo, en the Antibody Purification Handbook, Biosciences, publicacion No. 18-1037-46, Edicion AC, la divulgacion de la cual se incorpora en la presente a manera de referencia). El anticuerpo ligado se eluye tfpicamente de las columnas de protema A/protema G al utilizar soluciones amortiguadoras con pH bajo (soluciones amortiguadoras de glicina o acetato de pH 3.0 o menos) con neutralizacion inmediata de fracciones que contienen anticuerpos. Estas fracciones se acumulan, se dializan, y se concentran como sea necesario.

Los pocillos positivos con una colonia evidente individual se vuelven a clonar tfpicamente y se vuelven a someter a ensayo para asegurar solo que un anticuerpo monoclonal esta siendo detectado y producido.

Los anticuerpos tambien se pueden producir por seleccion de bibliotecas de combinacion de inmunoglobulinas, como se divulga por ejemplo, en (Ward y colaboradores Nature, 341 (1989) p. 544, la divulgacion completa de la cual se incorpora en la presente a manera de referencia).

La identificacion de uno o mas anticuerpos que liga(n) a TLR3, particularmente de manera sustancial o esencialmente el mismo epftopo como el anticuerpo monoclonal 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7 se pueda determinar facilmente utilizando cualquiera de una variedad de ensayos de clasificacion inmunologicos en los cuales se puede someter a ensayo la competicion del anticuerpo. Muchos de tales ensayos se practican rutinariamente y son bien conocidos en el campo (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,660,827, expedida el 26 de agosto de 1997, que se incorpora espedficamente en la presente a manera de referencia). Se entendera que determinar actualmente el epftopo al cual un anticuerpo descrito en la presente se liga no es de ninguna forma requerido para identificar un anticuerpo que se liga al mismo o sustancialmente al mismo epftopo como el anticuerpo monoclonal descrito en la presente.

Por ejemplo, donde los anticuerpos de prueba que se examinan se obtienen de diferentes animales de origen, o aun de un diferente isotipo Ig, se puede emplear un ensayo de competicion simple en el cual los anticuerpos de control (11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7, por ejemplo) y de prueba se mezclan (o pre-adsorben) y se aplican a una muestra que contiene polipeptidos TLR3. Los protocolos basados en el analisis de western blotting y el uso de un analisis BIACORE son adecuados para el uso en tales estudios de competicion.

En ciertas modalidades, se pre-mezclan los anticuerpos de control (11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7, por ejemplo) con cantidades variantes de los anticuerpos de prueba (por ejemplo, aproximadamente 1:10 o aproximadamente 1:100) durante un penodo de tiempo antes de aplicar a la muestra de antigeno TLR3. En otras modalidades, las cantidades de control y variantes de los anticuerpos de prueba se pueden mezclar simplemente durante la exposicion a la muestra de antfgeno TLR3. Siempre y cuando se pueda distinguir la ligacion de los anticuerpos libres (por ejemplo, al utilizar las tecnicas de separacion o lavado para eliminar los anticuerpos no ligados) y 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7 de los anticuerpos de prueba (por ejemplo, al utilizar anticuerpos secundarios espedficos de especie o espedficos de isotipo o al etiquetar espedficamente 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7 con una etiqueta detectable) se puede determinar si los anticuerpos de prueba reducen la ligacion de 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7 a los antfgenos, indicando que el anticuerpo de prueba reconoce sustancialmente el mismo epftopo como 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7. La ligacion de los anticuerpos de control (etiquetados) en ausencia de un anticuerpo completamente irrelevante puede servir como el valor alto de control. El valor bajo de control se puede obtener al incubar los anticuerpos etiquetados (11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7) con anticuerpos no etiquetados de exactamente el mismo tipo (11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7), donde la competicion se presentara y reducira la ligacion de los anticuerpos etiquetados. En un ensayo de prueba, una reduccion significativa en la reactividad del anticuerpo etiquetado en presencia de un anticuerpo de prueba es indicativo de un anticuerpo de prueba que reconoce sustancialmente el mismo epftopo, es decir, uno que “reacciona de manera cruzada” o compite con el anticuerpo etiquetado (11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7). Cualquier anticuerpo de prueba que reduce la ligacion de 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7 a los antfgenos TLR3 por lo menos aproximadamente 50%, tal como por lo menos aproximadamente 60%, o de manera mas preferente por lo menos aproximadamente 80% o 90% (por ejemplo, aproximadamente 65-100%), en cualquier relacion de 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7: anticuerpo de prueba entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 1:100 se considera que es un anticuerpo que se liga a sustancialmente al mismo epftopo o determinante como 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7. De manera preferente, tal anticuerpo de prueba reducira la ligacion de 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7 al antfgeno TLR3 por al menos aproximadamente 90% (por ejemplo, aproximadamente 95%).

La competicion tambien se puede evaluar por, por ejemplo, una prueba de citometna de flujo. En tal prueba, las celulas que llevan un polipeptido TLR3 dado se pueden incubar primero con 11E1, por ejemplo, y luego con el anticuerpo de prueba etiquetado con fluorocromo o biotina. El anticuerpo se dice que compite con 11E1 si la ligacion obtenida en la pre-incubacion con una cantidad de saturacion de 11E1 es aproximadamente 80%, de manera preferente de aproximadamente 50%, aproximadamente 40% o menos (por ejemplo, aproximadamente 30%, 20% o 10%) de la ligacion (como es medida por medio de fluorescencia) obtenida por el anticuerpo sin pre-incubacion con 11E1. Alternativamente, un anticuerpo se dice que compite con 11E1 si la ligacion obtenida con un anticuerpo 11E1 etiquetado (por un fluorocromo o biotina) en las celulas pre-incubadas con una cantidad de saturacion del anticuerpo de prueba es de aproximadamente 80%, de manera preferente aproximadamente 50%, aproximadamente 40%, o menos (por ejemplo, aproximadamente 30%, 20% o 10%) de la ligacion obtenida sin pre-incubacion con el anticuerpo de prueba.

Un ensayo de competicion simple en el cual un anticuerpo de prueba se pre-adsorbe y se aplica en una concentracion de saturacion a una superficie en la cual un antigeno TLR3 se inmoviliza tambien se puede emplear. La superficie en el ensayo de competicion simple es de manera preferente un chip BIACORE (u otro medio adecuado para el analisis de resonancia de plasmones superficiales). El anticuerpo de control (por ejemplo, 11E1) luego se pone en contacto con la superficie en una concentracion de saturacion TLR3 y la ligacion de TLR3 y superficie del anticuerpo de control se mide. Esta ligacion del anticuerpo de control se compara con la ligacion del anticuerpo de control a la superficie que contiene TLR3 en ausencia del anticuerpo de prueba. En un ensayo de prueba, una reduccion significativa en la ligacion de la superficie que contiene TLR3 por el anticuerpo de control en presencia de un anticuerpo de prueba indica que el anticuerpo de prueba reconoce sustancialmente el mismo epftopo como el anticuerpo de control tal que el anticuerpo de prueba “reacciona de manera cruzada” con el anticuerpo de control. Cualquier anticuerpo de prueba que reduzca la reduccion del anticuerpo de control (tal como 11E1) a un antfgeno TLR3 por al menos aproximadamente 30% o mas, de manera preferente aproximadamente 40%, se puede considerar que es un anticuerpo que se liga sustancialmente al mismo epftopo o determinante como un control (por ejemplo, 11E1). De manera preferente, tal anticuerpo de prueba reducira la ligacion del anticuerpo de control (por ejemplo, 11E1) al antfgeno TLR3 por al menos aproximadamente 50% (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, o mas). Se apreciara que el orden de los anticuerpos de control y prueba se pueden revertir: es decir, el anticuerpo de control se puede primero ligar a la superficie y el anticuerpo de prueba se pone en contacto con la superficie despues de un ensayo de competicion. De manera preferente, el anticuerpo que tiene afinidad mas alta para el antigeno TLR3 se liga a la superficie primero, ya que se esperara que disminuya en la ligacion observada para el segundo anticuerpo (asumiendo que los anticuerpos son de reaccion cruzada) sera de mayor magnitud. Ejemplos adicionales de tales ensayos se proporcionan en, por ejemplo, Saunal (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41, la divulgacion de la cual se incorpora en la presente a manera de referencia.

La determinacion de si un anticuerpo se liga dentro de una region de epftopo se puede llevar a cabo en formas conocidas por la persona experta en el campo. Como un ejemplo de tales metodos de mapeo/caracterizacion, una region de epftopo para un anticuerpo anti-TLR3 se puede determinar por la “huella” del epftopo utilizando modificacion qmmica de las aminas/carboxilo expuestos en la protema TLR3. Un ejemplo espedfico de tal tecnica de huella es el uso de HXMS (intercambio de hidrogeno-deuterio detectado por la espectrometna de masas) en donde se presenta un intercambio de hidrogeno/deuterio del receptor y los protones de amida de protema de ligando, ligacion, e intercambio posterior, en donde los grupos amida de cadena principal que participan en la ligacion de la protema se protegen del intercambio posterior y por lo tanto permaneceran deuterados. Las regiones relevantes se pueden identificar en este punto por proteolisis peptica, separacion por cromatograffa ftquida de alto desempeno de microboro rapida, y/o espectrometna de masas de ionizacion de electrorodo. Ver, por ejemplo, Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999) Engen, J. R. and Smith, D. L. (2001) Anal. Chem.

73, 256A-265A. Otro ejemplo de una tecnica de identificacion de epftopo adecuada es el mapeo de epftopo de resonancia magnetica nuclear (RMN), donde tfpicamente la posicion de las senales en los espectros RMN bidimensionales del antfgeno libre y el antfgeno formado en complejo con el peptido de ligacion a antfgeno, tal como un anticuerpo, se comparan. El antfgeno tfpicamente se etiqueta de manera selectiva isotopicamente con 15N de modo que solo las senales que corresponden al antfgeno y no senales del peptido de ligacion a antfgeno se observan en el espectro RMN. Las senales de antfgeno que se originan de los aminoacidos implicados en la interaccion con el peptido de ligacion a antfgeno cambaran tfpicamente la posicion en el espectro del complejo comparado con el espectro del antfgeno libre, y los aminoacidos implicados en la ligacion se pueden identificar de esa manera. Ver, por ejemplo, Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang y colaboradores, Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); y Saito y Patterson, Methods. 1996 Jun; 9 (3): 516-24.

El mapeo/caracterizacion de epftopos tambien se puede llevar a cabo utilizando metodos de espectrometna de masas. Ver, por ejemplo, Downard, J Mass Spectrom. (2000) 35 (4): 493-503 y Kiselar and Downard, Anal Chem. (1999) 71 (9): 1792-801. Las tecnicas de digestion de proteasa tambien pueden ser utiles en el contexto del mapeo e identificacion de epftopos. Las regiones/secuencias determinantes-relevantes antigenicas se pueden determinar por la digestion de proteasa, por ejemplo, al utilizar tripsina en una relacion de aproximadamente 1:50 a TLR3 o digestion o/n en un pH 7-8, seguido por el analisis de espectrometna de masas (MS) para la identificacion del peptido. Los peptidos protegidos de la escision de tripsina por el ligador anti-TLR3 se puede identificar subsecuentemente por la comparacion de las muestras sujetas a la digestion de tripsina y las muestras incubadas con anticuerpos y luego sometidas a la digestion, por ejemplo, tripsina (revelando de esta manera una huella para el ligador). Otras enzimas como quimiotripsina, pepsina, etc., tambien, o alternativamente se pueden utilizar en metodos de caracterizacion de epftopos similares. Por otra parte, la digestion enzimatica puede proporcionar un metodo rapido para analizar si una secuencia determinante antigenica potencial esta dentro de una region del polipeptido TLR3 que no se expone en la superficie y, por consiguiente, de manera probable no es relevante en terminos de inmunogenicidad/antigenicidad. Ver, por ejemplo, Manca, Ann 1st Super Sanita. 1991; 27: 15-9 para un planteamiento de tecnicas similares.

La mutagenesis dirigida al sitio es otra tecnica util para la elucidacion de un epftopo de ligacion. Por ejemplo, en “escaneo de alanina”, cada residuo dentro de un segmento de protemas se reemplaza con un residuo de alanina, y se miden las consecuencias para la afinidad de ligacion. Si la mutacion conduce a una reduccion significativa en la afinidad de ligacion, se implica de manera mas probable en la ligacion. Los anticuerpos monoclonales espedficos para los epftopos estructurales (es decir, anticuerpos que no se ligan a la protema no plegada) se pueden utilizar para verificar que el reemplazo de alanina no influya sobre todo el plegamiento de la protema. Ver, por ejemplo, Clackson and Wells, Science 1995; 267:383-386; y Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:1-6.

La microscopfa electronica tambien se puede utilizar para la “obtencion de huellas” del epftopo. Por ejemplo, Wang y colaboradores, Nature 1992; 355:275-278 utilizo la aplicacion coordinada de microscopfa de crioelectrones, la reconstruccion de imagenes tridimensionales, y cristalograffa de rayos X para determinar la huella ffsica de un fragmento Fab en la superficie de la capside del virus de mosaico del fnjol pinto nativo.

Otras formas de ensayo “sin etiqueta” para la evaluacion del epftopo incluyen resonancia de plasmones superficiales (SPR, BIACORE) y espectroscopia de interferencia reflectometrica (RifS). Ver, por ejemplo, Fagerstam y colaboradores, Journal Of Molecular Recognition 1990;3:208-14; Nice y colaboradores, J. Chromatogr. 1993; 646:159-168; Leipert y colaboradores, Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308-3311; Kroger y colaboradores, Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944.

Cabe destacar que un anticuerpo que se liga al mismo o sustancialmente el mismo epftopo como un anticuerpo de la invencion se puede identificar en uno o mas de los ensayos de competicion ejemplares descritos en la presente.

Una vez que se identifican los anticuerpos que son capaces de ligarse a TLR3 y/o que tienen otras propiedades deseadas, tambien se evaluaran tipicamente como utilizando metodos estandares incluyendo aquellos descritos en la presente, por su capacidad de ligarse a otro polipeptido, incluyendo polipeptidos no relacionados y otros miembros de la familia TLR (por ejemplo, TLR1, 2, o 4-10 humano). Idealmente, los anticuerpos solo se ligan con afinidad sustancial a TLR3, por ejemplo, TLR3 humano, y no se ligan en un nivel significativo a los polipeptidos no relacionados o a otros miembros de la familia TLR (por ejemplo, TLR2 o TLR4; la secuencia de aminoacidos del TLR4 precursor humano incluyendo un peptido senal en los residuos de aminoacidos 1-23 se encuentra en el numero de acceso NCBI NP_612564, la divulgacion de la cual se incorpora en la presente a manera de referencia). Sin embargo, se apreciara que, siempre y cuando la afinidad de TLR3 sea sustancialmente mayor (por ejemplo, 5x, 10x, 50x, 100x, 500x, 1000x, 10,000x, o mas) que para los otros miembros de la familia TLR (u otros polipeptidos no relacionados), entonces los anticuerpos son adecuados para el uso en los presente metodos.

La ligacion de los anticuerpos a las celulas que expresan TLR3 tambien se puede evaluar en los primates no humanos, por ejemplo, monos rhesus o cynomolgus, u otros mairnferos tales como ratones. La invencion por lo tanto proporciona un anticuerpo, asf como fragmentos y derivados del mismo, en donde dicho anticuerpo, fragmento o derivado se liga espedficamente a TLR3, y que ademas se liga a TLR3 de los primates no humanos, por ejemplo, monos rhesus o cynomolgus, un polipeptido TLR3 de SEQ ID NO: 2. Opcionalmente, la captacion o localizacion celular, opcionalmente localizacion en un compartimiento subcelular tal como la ruta endodtica, se evalua a fin de seleccionar un anticuerpo que sea facilmente captado en la celula y/o en el compartimiento celular donde TLR3 se expresa. La captacion o localizacion celular sera generalmente medida en las celulas en las cuales el anticuerpo se busca o se cree que ejerce su actividad, tal como en DC. La captacion o localizacion celular se puede evaluar por metodos estandares, tal como por tincion confocal utilizando un anticuerpo marcado con un resto detectable (por ejemplo, un resto fluorescente).

En la inmunizacion y produccion de anticuerpos en un vertebrado o celula, se puede llevar a cabo etapas de seleccion particular para aislar los anticuerpos como es reclamado. En este aspecto, en una modalidad espedfica, la invencion tambien se refiere a metodos para producir anticuerpos que inhiben la senalizacion TLR3, que comprenden: (a) proporcionar una pluralidad de anticuerpos; y (b) seleccionar anticuerpos de la etapa (a) que son capaces de ligarse con alta afinidad a un polipeptido TLR3 expresado solamente en la superficie celular. Los anticuerpos se pueden someter a prueba para ligarse a TLR3 bajo condiciones neutras. En una modalidad, la etapa (a) comprende (i) inmunizar un m ai^ero no humano con un inmunogeno que comprende un polipeptido TLR3; y (ii) preparar anticuerpos de dicho animal inmunizado. En una modalidad, la etapa (a) comprende generar bibliotecas de secuencias de anticuerpos (por ejemplo, utilizando la expresion en fago).

La afinidad de ligacion bivalente de los anticuerpos para el TLR3 humano bajo condiciones acidas se puede determinar. Los anticuerpos se pueden caracterizar, por ejemplo, por una KD media de no mas de aproximadamente (es decir mejor afinidad que) l0o, 60, 10, 5, o 1 nanomolar, de manera preferente sub-nanomolar u opcionalmente no mas de aproximadamente 300, 200, 100 o 10 picomolar. La K^dse puede determinar, por ejemplo, por ejemplo, al inmovilizar protemas TLR3 humanas recombinantemente producidas sobre una superficie de chip, seguida por la aplicacion del anticuerpo que se somete a prueba en solucion, por ejemplo, como se muestra en los presente ejemplos. Para seleccionar los anticuerpos que retienen ligacion similar bajo condiciones acidas y neutras, se puede minimizar la diferencia observada entre la ligacion entre pH neutro (por ejemplo, 7.2) y pH acido (por ejemplo, un pH en el intervalo de 4.5-6-5), por ejemplo, donde la afinidad de ligacion en el pH acido no es sustancialmente mas baja, por ejemplo, donde la K^dpara la ligacion a TLR3 disminuye por no mas de 0.2-, 0.3-, 0.5-, 1.0-, o 1.5- log10, que aquella observada en pH no acido. En una modalidad, el metodo comprende ademas una etapa (d), seleccionar anticuerpos de (b) que son capaces de competir para la ligacion a TLR3 con el anticuerpo 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7, o que son capaces de (o no capaces de) competir para la ligacion a TLR3 con el ARNds (por ejemplo, poliAU).

En un aspecto de cualquiera de las modalidades, los anticuerpos preparados de acuerdo con los presentes metodos son anticuerpos monoclonales. En otro aspecto, el animal no humano utilizado para producir anticuerpos de acuerdo con los metodos de la invencion es un marnffero, tal como un roedor (por ejemplo, rata), bovino, porcino, ave de corral, caballo, conejo, cabra u oveja. Los anticuerpos de la presente invencion abarcan 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7. Sin embargo, se apreciara que otros anticuerpos se pueden obtener utilizando los metodos descritos en la presente, y de esta manera los anticuerpos de la invencion pueden ser anticuerpos diferentes a 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7. Adicionalmente, los anticuerpos de la invencion se pueden especificar opcionalmente para ser anticuerpos diferentes a cualquiera de los anticuerpos 31C3, 29H3, 23C8, 28F11 o 34A3 divulgados en WO2011/004028 o como se depositan en Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 rue de Docteur Roux, F-75724 Paris el 3 de Julio de 2009, bajo el numero CNCM I-4187 (29H3.7) y CNCM I-4186 (31C3.1), anticuerpo TLR3.7 (eBioScience Inc., San Diego), anticuerpo C1068 de WO 06/060513, anticuerpo C1130 de Wo 2007/051164, cualquiera de los anticuerpos descritos en WO2010/051470, por ejemplo, anticuerpos 1-19 y F17-F19, y sus variantes tales como 15EVQ y 12QVQ/QSV, anticuerpo 40C1285 (Abcam), o anticuerpos 619F7, 713E4, 716G10, IMG-5631, IMG-315 o IMG-5348 (todos de Imgenex. Corp.) o derivados de los anteriores, por ejemplo, que comprenden la region de ligacion a antfgeno en totalidad o en parte. Cada una de las divulgaciones anteriores se incorpora en la presente a manera de referencia.

De acuerdo con una modalidad alterna, el ADN que codifica un anticuerpo que se liga a un epttopo presente en los polipeptidos TLR3 se afsla del hibridoma de esta invencion y se coloca en un vector de expresion apropiado para la transfeccion en un hospedero apropiado. El hospedero luego se utiliza para la produccion recombinante del anticuerpo, o variantes del mismo, tal como una version humanizada de ese anticuerpo monoclonal, fragmentos activos del anticuerpo, anticuerpos quimericos que comprenden la porcion de reconocimiento a antigeno del anticuerpo, o versiones que comprenden un resto detectable.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invencion se puede aislar y secuenciar facilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas de oligonucleotidos que son capaces de ligarse espedficamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos de murino). Una vez aislado, el ADN se puede colocar en los vectores de expresion, que luego se transfectan en las celulas hospederas tales como celulas de E. coli, celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO), o celulas de mieloma que de otra manera no producen protema de inmunoglobulina, para obtener la smtesis de los anticuerpos monoclonales en las celulas hospederas recombinantes. Como se describe en cualquier lugar en la presente solicitud, tales secuencias de ADN se pueden modificar por cualquiera de una gran variedad de propositos, por ejemplo, para humanizar anticuerpos, producir fragmentos o derivados, o para modificar la secuencia del anticuerpo, por ejemplo, en el sitio de ligacion a antfgeno a fin de optimizar la especificidad de ligacion del anticuerpo.

La expresion recombinante en las bacterias del ADN que codifica el anticuerpo es bien conocida en el campo (ver, por ejemplo, Skerra y colaboradores, Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993); y Pluckthun, Immunol. 130, p. 151 (1992).

Evaluacion de la capacidad de los anticuerpos para modular la senalizacion TLR3

En ciertas modalidades, los anticuerpos de esta invencion son capaces de modular, por ejemplo, inhibir la senalizacion por, polipeptidos TLR3, y en consecuencia para modular la actividad o comportamiento de las celulas que expresan TLR3. Por ejemplo, los anticuerpos pueden inhibir la activacion de las celulas que expresan TLR3, por ejemplo, pueden inhibir la ruta de senalizacion TLR3, opcionalmente al bloquear la ligacion a TLR3 de los ligandos naturales o endogenos tal como ARNds; opcionalmente pueden bloquear la capacidad de la protema TLR3 para formar homodfmeros en presencia de un ligando TLR3, bloqueando de esta manera el inicio de una cascada de senalizacion. Se hace referencia a estos anticuerpos de esta manera como anticuerpos “neutralizantes” o “inhibidores” o “de bloqueo”. Tales anticuerpos son utiles, inter alia, para disminuir la actividad de las celulas inmunes que expresan TLR3, por ejemplo, para el tratamiento o prevencion de afecciones que implican la actividad de celulas que expresan TLR3 en exceso o numero, o en donde la actividad de las celulas que expresan TLR3 disminuida puede mejorar, prevenir, eliminar, o de cualquiera manera mejorar la afeccion o cualquier smtoma del mismo.

Un intervalo de ensayos celulares se puede utilizar para evaluar la capacidad de los anticuerpos para modular la senalizacion TLR3. Cualquiera de una gran variedad de ensayos, incluyendo modelos moleculares, basados en celulas, y basados en animales se puede utilizar para evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-TLR3 para modular la actividad de celulas que expresan TLR3. Por ejemplo, se pueden utilizar en ensayos basados en celulas en las cuales las celulas que expresan TLR3 se exponen al ARNds, ARNds viral, polilC, o poliAU, u otro ligando TLR3 y la capacidad del anticuerpo para alterar la ligacion del ligando o la estimulacion del receptor (como se determina, por ejemplo, al examinar cualquiera de las actividades de celulas TLR3 tratadas en la presente, tal como la expresion del interferon, actividad NFkB, activacion de celulas NK, etc.) es evaluada. El ligando TLR3 utilizado en los ensayos puede estar en cualquier forma adecuada, incluyendo, pero no limitado a como una composicion de ligando purificada, en una mezcla con ligandos no TLR3, en una composicion de origen natural, en una celula o sobre la superficie de una celula, o secretada por una celula (por ejemplo, una celula que produce ligando se utiliza en el ensayo), en solucion o sobre un soporte solido.

La actividad de las celulas que expresan TLR3 tambien se puede evaluar en ausencia de un ligando, al exponer las celulas al propio anticuerpo y al evaluar su efecto en cualquier aspecto de la actividad o comportamiento de las celulas. En tales ensayos, un nivel de lmea base de actividad (por ejemplo, produccion de citoquinas, proliferacion, ver posteriormente) de las celulas que expresan TLR3 se obtiene en la ausencia de un ligando, y la capacidad del anticuerpo o compuesto para alterar el nivel de actividad de lmea base se detecta. En una modalidad de este tipo, se utiliza un procedimiento de clasificacion de alto rendimiento para identificar los compuestos capaces de afectar la activacion del receptor.

Cualquier cambio fisiologico adecuado que refleja la actividad TLR3 se puede utilizar para evaluar los anticuerpos de prueba o derivados de anticuerpo. Por ejemplo, se puede medir una variedad de efectos, tales como cambios en la expresion genica (por ejemplo, genes que responden a NFkB), secrecion de protemas (por ejemplo, interferon), crecimiento celular, proliferacion celular, pH, segundos mensajeros intracelulares, por ejemplo, Ca2+, IP3, cGMP, o cAMP, o actividad tal como capacidad para activar las celulas NK. En una modalidad, la actividad del receptor se evalua al detectar la produccion de citoquinas, por ejemplo, citoquinas sensibles a TLR3, citoquinas proinflamatorias.

La modulacion TLR3 se puede evaluar utilizando cualquiera de una variedad de sistemas de lectura posibles, la mayona basado en una ruta de transduccion de senal ^tL^r/IL-IR, que implican, por ejemplo, la ruta de transduccion de senal independiente MyD88/dependiente TRIF, que implica, por ejemplo, IRF3, IRF7, IKKg y/o TBK1 (Akira and Takeda (2004) Nature Review Immunol. 4:499-511). Estas rutas activan las cinasas incluyendo el complejo de cinasa KB. La activacion TLR3 se puede evaluar al examinar cualquier aspecto de la senalizacion TLR. Por ejemplo, la activacion de la senalizacion TLR desencadena alteraciones en las asociaciones de protema-protema (por ejemplo, TRIF con TBK y/o IKKg), en la localizacion intracelular de las protemas (tal como el movimiento de NK-kB en el nucleo), y en la expresion genica (por ejemplo, en la expresion de genes sensibles a NK-kB), y la produccion de citoquinas (por ejemplo, la produccion y secrecion de IFN-gamma, IL-6, IP10, MCP-1). Cualquiera de tal alteracion se puede detectar y utilizar para detectar la activacion TLR3. En una modalidad, la estimulacion TLR3 se detecta al recolectar sobrenadantes despues de 18-20 hr de cultivo y medir los niveles de IFN-gamma, IL-6, IP-10 y/o MCP-1 por el ELISA de intercalacion. En otra modalidad, la estimulacion TLR3 se detecta al recolectar sobrenadantes despues de 18-20 hr de cultivo y al medir los niveles de IFN-gamma, IL-6, IP-10 y/o MCP-1 por el ELISA de intercalacion.

En una modalidad, las celulas que expresan naturalmente TLR3 son utilizadas, tal como DC (por ejemplo, DC mieloide o DC derivada de monocitos). En otra modalidad, se utilizan celulas que contienen un constructo reportero que provoca la expresion de un producto genico detectable en la estimulacion TLR3 y la activacion subsecuente de la ruta de transduccion de senal. Los genes reporteros y los constructos de genes reporteros utiles particularmente para los ensayos incluyen, por ejemplo, un gen reportero ligado operativamente a un promotor sensible a NF-kB o a una senalizacion mediada por, particularmente TRIF, IRF3, IRF7, IKKg, TBK1. Ejemplos de tales promotores incluyen, sin limitacion, aquellos para IL-1alfa, IL-6, IL-8, IL-12 p40, IP-10, CD80, CD86, y TNF-alfa. El gen reportero ligado operativamente al promotor sensible a TLR puede incluir, sin limitacion, una enzima (por ejemplo, luciferasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), etc.), un marcador de bioluminiscencia (por ejemplo, protema fluorescente verde (GFP, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,491,084), protema fluorescente azul (BFP, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 6,486,382), etc.), una molecula expresada sobre la superficie (por ejemplo, CD25, c D80, CD86), y una molecula secretada (por ejemplo, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 p40, TNF-alfa). Ver, por ejemplo, Hcker H y colaboradores (1999) EMBO J. 18:6973-82; Murphy TL y colaboradores (1995) Mol Cell Biol 15:5258-67, las divulgaciones de las cuales se incorporan en la presente a manera de referencia. Los plasmidos reporteros adecuados para el uso son comercialmente disponibles (InvivoGen, San Diego, CA). En una modalidad, el ensayo incluye determinar, en una celula hospedera preparada para expresar un polipeptido TLR3 humano, si una composicion de prueba induce la expresion de luciferasa (u otro reportero) bajo el control de un promotor sensible a la senalizacion TLR3 (por ejemplo, ISRE, elemento de respuesta estimulada por IFN).

En los ensayos que dependen de la lectura de la actividad enzimatica, el substrato se puede suministrar como parte del ensayo, y la deteccion puede implicar la medicion de la quimioluminiscencia fluorescencia, desarrollo de color, incorporacion de la etiqueta radiactiva, resistencia a farmacos, densidad optica, u otro marcador de actividad enzimatica. Para los ensayos que dependen de la expresion superficial de una molecula, la deteccion se puede lograr utilizando analisis de citometna de flujo (FACS) o ensayos funcionales. Las moleculas secretadas se pueden evaluar utilizando un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) o bioensayos. Muchos de estos y otros sistemas de lectura adecuados son bien conocidos en el campo y son comercialmente disponibles. De manera preferente, el sistema reportero, cualquiera que se utilice, es cuantificable.

En otra modalidad, el efecto de los anticuerpos en las celulas que expresan TLR3 se evalua en los primates no humanos in vivo. Por ejemplo, se administra una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo anti-TLR3 de la presente invencion a un primate no humano que es ya sea sano o afectado por una afeccion, por ejemplo, una enfermedad o inflamacion autoinmunitaria y se evalua el efecto de la administracion en, por ejemplo, el numero o actividad de celulas que expresan TLR3 en el primate, la presencia y/o niveles de citoquinas, o en la progresion de la afeccion. Cualquier anticuerpo o derivado de anticuerpo o fragmento que lleve a cabo un cambio detectable en cualquiera de estos parametros relacionados a TLR3 es candidato para el uso en los metodos descritos en la presente.

En cualquiera de los ensayos descritos en la presente, un incremento o disminucion de 5%, 10%, 20%, de manera preferente 30%, 40%, 50%, de manera mucho mas preferente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o mayor en cualquier medicion detectable de actividad estimulada por TLR3 en las celulas indica que el anticuerpo de prueba es adecuado para el uso en los presentes metodos.

Cuando se evaluan los anticuerpos anti-TLR3 inhibidores, los anticuerpos se pueden seleccionar ventajosamente para modificar cualquier parametro asociado con inflamacion o autoinmunidad. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden seleccionar para reducir la activacion, particularmente la produccion de citoquinas pro-inflamatorias, en las celulas. Las celulas pueden ser, por ejemplo, celulas obtenidas de un individuo que padece de un trastorno inflamatorio o autoinmunitario.

Anticuerpos

Los anticuerpos de la presente invencion se ligan a los polipeptidos TLR3 humanos. En una modalidad, los anticuerpos son anticuerpos TLR3 antagonistas. En otra modalidad, los anticuerpos bloquean la senalizacion inducida a traves del TLR3 humano.

Los anticuerpos tienen opcionalmente afinidad (Kd) en un pH acido, es decir un pH de aproximadamente 5.6, de menor que 10-9 M, de manera preferente menor que 10-10M. En otra modalidad, los anticuerpos tienen una afinidad (K^d) en un pH neutro, es decir un pH de aproximadamente 7.2, de menor que 10-9 M, de manera preferente menor que 10-10M. En otra modalidad, los anticuerpos tienen una afinidad (K^d) en un pH acido, es decir un pH de aproximadamente 5.6, y en un pH neutro, es decir un pH de aproximadamente 7.2, de menor que 10-9 M, de manera preferente menor que 10-10M. La afinidad puede ser, por ejemplo, monovalente o bivalente que se liga a TLR3.

En otra modalidad, los anticuerpos son capaces de inhibir la senalizacion TLR3 en presencia de un ligando TLR3, es decir ARNds (poliAU, polilC). En otra modalidad, los anticuerpos son capaces de inhibir la senalizacion TLR3 cuando se administran despues de un ligando TLR3. En otra modalidad, los anticuerpos son capaces de inhibir la senalizacion TLR3 cuando se administran antes de un ligando TLR3. En otra modalidad, los anticuerpos son capaces de inhibir la senalizacion TLR3 cuando se administran simultaneamente con un ligando TLR3.

En otra modalidad, los anticuerpos compiten para la ligacion con ARNds al sitio de ligacion a ARNds N-terminal del polipeptido TLR3. En otra modalidad, los anticuerpos no compiten para la ligacion con ARNds al sitio de ligacion a ARNds C-terminal del polipeptido TLR3.

Epftopos de Anticuerpo

En otra modalidad, los anticuerpos se ligan sustancialmente al mismo epftopo como el anticuerpo 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7. En una modalidad, todos los residuos claves de los epftopos estan en un segmento que corresponde a los residuos 1 a 251 del polipeptido TLR3 de SEQ ID NO: 1. En una modalidad, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o mas residuos en el segmento que corresponde a los residuos 1 a 251 (o 41-139, 41-115, 41-120 o 41-251) del polipeptido TLR3 de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, los anticuerpos se ligan a uno o mas aminoacidos presentes sobre la superficie del polipeptido TLR3 dentro de los epftopos ligados por los anticuerpos anti-TLR3 de la invencion, opcionalmente, los anticuerpos se ligan 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o mas residuos seleccionados del grupo que consiste en: 41, 43, 60, 61, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 86, 88, 89, 91, 92, 93, 96, 97, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 117, 120, 121, 132, 134, 137 y residuo 139 de SEQ ID NO: 1.

Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a por lo menos parcialmente (o principalmente) en la superficie lateral sin glicano de la porcion N-terminal del polipeptido TLR3 humano. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan por lo menos parcialmente (o principalmente) sobre la cadena principal de la porcion N-terminal del polipeptido TLR3 humano. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan por lo menos parcialmente (o principalmente) sobre la superficie lateral sin glicano de la porcion N-terminal del polipeptido TLR3 humano y parcialmente sobre la cadena principal de la porcion N-terminal del polipeptido TLR3 humano. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a uno o mas residuos de aminoacidos dentro de la superficie lateral sin glicano del polipeptido TLR3 que se implica en la ligacion del polipeptido TLR3 a ARNds, y/o residuos adyacentes a los mismos. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende residuos 41 y/o residuo 43 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de residuos 60, 61, 62, 64, 65, 67 y/o residuo 68 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende 1, 2 o 3 de residuos 86, 88 y/o residuo 89 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de residuos 91, 92, 93, 96, 97 y/o residuo 121 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o mas de residuos 108, 110, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 120. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende 1, 2, 3 o 4, de residuos 132, 134, 137 y/o residuo 139 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende 1, 2, 3 o, 4 de los residuos 112, 113, 115, 117, 120, 137 y 139. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende residuo 117 y residuos 137 y/o 139. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende residuo 120 y residuos 137 y/o 139. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende residuo 117 y/o 120 pero no los residuos 137 y/o 139. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de los residuos R64, R65, T86 y K89, K137 y K139. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende residuo 64 y residuos 137 y/o 139. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende residuo 65 y residuos 137 y/o 139. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende residuo 86 y residuos 137 y/o 139. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende residuo 89 y residuos 137 y/o 139. En una modalidad, los residuos de aminoacidos dentro de la superficie lateral sin glicano del polipeptido TLR3 que se implica en la ligacion del polipeptido TLR3 a ARNds, y/o residuos adyacentes a los mismos, se seleccionan del grupo que consiste en los residuos 41, 43, 60, 61, 62, 64, 65, 67, 68, 86, 88, 89, 108, 110, 112, 113, 114, 132, 134, 137 y residuo 139 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos se ligan a un epftopo que comprende 1, 2, 3 o, 4 de los residuos 112, 113 y 137 de SEQ ID NO: 1. En una modalidad, los residuos de aminoacidos dentro de la cadena principal de la porcion N-terminal del polipeptido TLR3 humano se seleccionan del grupo que consiste en los residuos 91, 92, 93, 96, 97, 117, 120 y 121 de SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos no se ligan, o no se ligan principalmente, en la superficie lateral que contiene glicano de la porcion N-terminal del polipeptido TLR3 humano.

Opcionalmente, en cualquier modalidad, los anticuerpos se pueden caracterizar opcionalmente ademas por no ligarse sustancialmente a uno, dos, tres, o mas residuos en el segmento que corresponde a los residuos 174 a 191 residuos 465-619, o a los residuos 116, 145 y/o 182, del polipeptido maduro TLR3 de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, los anticuerpos se ligan a, u opcionalmente no se ligan a, un epftopo que comprende uno o mas residuos en el segmento que corresponde a los residuos 177 a 191,224 a 243, 280 a 286, 295 a 374, 379 a 391, 428 a 459, 461 a 487, 524 a 529, 533 a 542, 546 a 569, 575 a 581, 583 a 605, 607 a 623, 641 a 657 y/o 670 a 705 del polipeptido TLR3 de SEQ ID NO: 1.

La seccion de Ejemplos en la presente describe la construccion de una serie de polipeptido TLR3 mutantes humanos. La ligacion del anticuerpo anti-TLR3 a las celulas transfectadas con los mutantes TLR3 se midio y se comparo con la capacidad del anticuerpo anti-TLR3 para ligarse al polipeptido TLR3 de tipo natural (SEQ ID nO:1). Una reduccion en la ligacion entre un anticuerpo anti-TLR3 y un polipeptido TLR3 mutante como se utiliza en la presente significa que existe una reduccion en la afinidad de ligacion (por ejemplo, como es medida por los metodos conocidos tales como la prueba FACS de las celulas que expresan un mutante particular, o por la prueba Biacore para la ligacion a los polipeptidos mutantes) y/o una reduccion en la capacidad de ligacion total del anticuerpo anti-TLR3 (por ejemplo, como es evidenciado por una disminucion en Bmax en una grafica de concentracion de anticuerpos anti-TLR3 versus concentracion de polipeptido). Una reduccion significativa en la ligacion indica que el residuo mutado se implica directamente en la ligacion al anticuerpo anti-TLR3 o esta en proximidad cercana a la protema de ligacion cuando el anticuerpo anti-TLR3 se liga a TLR3. Un epftopo de anticuerpo incluira de manera preferente de esta manera tal residuo y puede incluir residuos adicionales adyacentes a tal residuo.

En algunas modalidades, una reduccion significativa en la ligacion significa que la afinidad de ligacion y/o capacidad entre un anticuerpo TLR3 y un polipeptido TLR3 mutante se reduce por mayor que 40%, mayor que 50%, mayor que 55%, mayor que 60%, mayor que 65%, mayor que 70%, mayor que 75%, mayor que 80%, mayor que 85%, mayor que 90% o mayor que 95% relativo con la ligacion entre el anticuerpo y un polipeptido TLR3 de tipo natural (por ejemplo, el polipeptido mostrado en SEQ ID NO:1). En ciertas modalidades, la ligacion se reduce por debajo de los ftmites detectables. En algunas modalidades, una reduccion significativa en la ligacion es evidenciada cuando la ligacion de un anticuerpo anti-TLR3 a un polipeptido TLR3 mutante es menor que 50% (por ejemplo, menor que 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% o 10%) de la ligacion observada entre el anticuerpo anti-TLR3 y un polipeptido TLR3 de tipo natural (por ejemplo, el dominio extracelular mostrado en SEQ ID NO:1). Tales mediciones de ligacion se pueden hacer utilizando una variedad de ensayos de ligacion conocidos en el campo. Un ejemplo espedfico de uno de tal ensayo se describe en la seccion de ejemplos.

En algunas modalidades, se proporcionan anticuerpos anti-TLR3 que muestran significativamente menor ligacion para un polipeptido TLR3 mutante en el cual un residuo en el polipeptido TLR3 de tipo natural (por ejemplo, SEQ ID NO:1) se sustituye. En la anotacion abreviada utilizada en la presente, el formato es: residuo de tipo natural: Posicion en el polipeptido: residuo mutante, con la numeracion de los residuos como se indica en SEQ ID NO: 1. Opcionalmente, los anticuerpos tienen ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una sustitucion en los residuos 41, 43, 60, 61, 62, 64, 65, 67, 68, 86, 88, 89, 91, 92, 93, 96, 97, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 117, 120, 121, 132, 134, 137 y/o residuo 139 de SEQ ID NO: 1.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-TLR3 se liga a un polipeptido TLR3 de tipo natural que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1 pero tiene ligacion disminuida a un polipeptido TLR3 mutante que tiene cualquiera de una o mas (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) de las siguientes mutaciones: R64Q, R65Q, T86S, K89Q, K117Q, A120V, K137S y/o K139A (con referencia a SEQ ID NO:1). De manera preferente la ligacion al TLR3 mutante se reduce significativamente comparada con la ligacion al TLR3 de tipo natural.

En otra modalidad, los anticuerpos son capaces de inhibir la secrecion de citoquinas (por ejemplo, IP-10) en las celulas dendrfticas mieloides (MdDC). En otra modalidad, los anticuerpos son capaces de internalizarse en una celula que expresa TLR3 rapida y eficientemente. En otra modalidad, los anticuerpos son capaces de internalizarse sin inducir o requerir la modulacion por decremento de hTLR3.

Secuencias CDR de Anticuerpo

En un aspecto de cualquiera de las modalidades de la invencion, un anticuerpo puede comprender una cadena pesada y/o ligera que tiene secuencias CDR1, 2 y/o 3 de acuerdo con la formula respectiva seleccionada de las Formulas (I) a (VII). En cualquier modalidad en la presente, una LCDR1 particular o -2 o HCDR-1 o 2 se pueden especificar por tener una secuencia de las Formulas (I) a (VII). En cualquier modalidad en la presente, una HCDR1-3 o LCDR1-3 particular se puede especificar por tener una secuencia de Formulas (I) a (VII). En una modalidad preferida, el anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende las tres LCDRs y una cadena pesada que comprende las tres HCDRs. Opcionalmente, se proporciona un anticuerpo donde cualquiera de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada se fusionan a una region constante de inmunoglobulina del tipo IgG, opcionalmente una region constante humana, opcionalmente un isotipo IgG1 o IgG4.

En una modalidad, LCDR1 comprende una secuencia de la Formula (I):

Xaaⁱ-A-S-E- Xaa²-I- Xaa^a- Xaa⁴-Xaa⁵-L-A (I) (SEQ ID NO: 58),

en donde Xaaⁱa Xaa⁵puede ser una sustitucion conservadora o no conservadora o una supresion o insercion, de manera preferente, en donde Xaaⁱpuede ser Leu o Gln, y/o Xaa²puede ser Asp o Gly, y/o Xaa³puede ser Ser o Tyr, y/o Xaa⁴puede ser Asn o Ser, y/o Xaa⁵puede ser Asp, Tyr o Gly.

En una modalidad, LCDR2 comprende una secuencia de la Formula (II):

A-A- Xaa6-R-L- Xaa⁷-D (II) (SEQ ID NO: 59),

en donde Xaa6 a Xaa⁷puede ser una sustitucion conservadora o no conservadora o una supresion o insercion, de manera preferente, en donde Xaa6 puede ser Ser o Asn y/o Xaa⁷puede ser Glu o Gln.

En una modalidad, LCDR3 comprende una secuencia de la Formula (III):

Xaaa-Q-Xaag-Xaaio-Xaaii-Xaai2-P-Xaai3-T (III) (SEQ ID NO: 60),

en donde Xaa^aa Xaaⁱ³puede ser una sustitucion conservadora o no conservadora o una supresion o insercion, de manera preferente, en donde Xaa^apuede ser Leu o Gln, y/o Xaa^gpuede ser Ser, Asn o Gly, y/o Xaaⁱ⁰puede ser Tyr, Ser o Val, y/o Xaa^{i i}puede ser Lys o Glu, y/o Xaa^{i 2}puede ser Phe o Tyr, y/o Xaaⁱ³puede ser Asn, Tyr, Leu o Val. En una modalidad, HCDRi comprende una secuencia de la Formula (IV):

Xaa^{i 4}- Xaaⁱ⁵-Y- Xaa^{i 6}- Xaa^{i 7}(IV) (SEQ ID NO: 6i),

en donde Xaaⁱ⁴a Xaa^{i 7}puede ser una sustitucion conservadora o no conservadora o una supresion o insercion, de manera preferente, en donde Xaaⁱ⁴puede ser Tyr o Ser, y/o Xaaⁱ⁵puede ser Thr o Asn, y/o Xaa^{i 6}puede ser Met o Ile, y/o Xaa^{i 7}puede ser Tyr o His.

En una modalidad, HCDRi comprende una secuencia de la Formula (V):

G-Y-Xaa^ia-Xaa^ig-Xaa²⁰-Xaa^{2 i}(V) (SEQ ID NO: 62),

en donde Xaa^iaa Xaa^{2 i}puede ser una sustitucion conservadora o no conservadora o una supresion o insercion, de manera preferente, en donde Xaa^iapuede ser Thr o Asn, y/o Xaa^igpuede ser Phe o Ile, y/o Xaa²⁰puede ser Arg, Trp o Thr; y/o Xaa^{2 i}puede ser Tyr o Ser.

En una modalidad, HCDR2 comprende una secuencia de la Formula (VI):

Xaa²²-I- Xaa²³-P- Xaa²⁴- Xaa²⁵-G (VI) (SEQ ID NO: 63),

en donde Xaa²²a Xaa²⁵puede ser una sustitucion conservadora o no conservadora o una supresion o insercion, de manera preferente, en donde Xaa²²puede ser Arg o Trp, y/o Xaa²³puede ser Asp o Phe, y/o Xaa²⁴puede ser Ala o Gly, y/o Xaa²⁵puede ser Asn o Asp. Opcionalmente HCD^rde la Formula VI comprende ademas una secuencia-Xaa²⁶-Xaa²⁷-Xaa²⁸, en donde Xaa²⁶a Xaa^2apuede ser una sustitucion conservadora o no conservadora o una supresion o insercion, de manera preferente, en donde Xaa²⁶puede ser Asp o Asn, y/o Xaa²⁷puede ser Thr o Ser, y/o Xaa²⁸puede ser Asn o Ile.

En una modalidad, HCDR3 comprende una secuencia de SEQ ID NO: 2 i, 32, 43 o 54, o de la Formula (VII):

G-Xaa²⁹-Xaa³⁰-Xaa^{3 i}-Y-F-D (VII) (SEQ ID NO: 64),

en donde Xaa²⁹a Xaa^{3 i}puede ser una sustitucion conservadora o no conservadora o una supresion o insercion, de manera preferente, en donde Xaa²⁹puede ser una supresion o Glu, y/o Xaa³⁰puede ser Phe o Asp, y/o Xaa^{3 i}puede ser Asp o Trp.

En una modalidad, un anticuerpo de la invencion puede comprender una cadena ligera que comprende:

a. una secuencia de aminoacidos CDRi de cadena ligera (LCDRi) seleccionada de SEQ ID NOS: 22, 33, 44, 55 y 58; y/o

2i

b. una secuencia de aminoacidos CDR2 de cadena ligera (LCDR2) seleccionada de SEQ ID NOS: 23, 34, 45, 56 y 59; y/o

c. una secuencia de aminoacidos CDR3 de cadena ligera (LCDR3) seleccionada de SEQ ID NOS: 24, 35, 46, 57 y 60.

En una modalidad, un anticuerpo de la invencion puede comprender una cadena pesada que comprende:

a. una secuencia de aminoacidos CDR1 de cadena pesada (HCDR1) seleccionada de SEQ ID NOS: 16-18, 27-29, 38-40, 49-51 y 61-62; y/o

b. una secuencia de aminoacidos CDR2 de cadena pesada (HCDR2) seleccionada de SEQ ID NOS: 19, 20, 31, 31, 41, 42, 52, 53 y 63; y/o

c. una secuencia de aminoacidos CDR3 de cadena pesada (HCDR3) seleccionada de SEQ ID NOS: 21, 32, 43, 54, y 64.

Anticuerpo 11E1

La secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada de 11E1 se lista como SEQ ID NO:3, la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera se lista como SEQ ID NO: 4. En una modalidad espedfica, la invencion proporciona un anticuerpo que se liga esencialmente al mismo epttopo o determinante como los anticuerpos monoclonales 11E1; opcionalmente el anticuerpo comprende una region de ligacion a antigeno del anticuerpo 11E1. En cualquiera de las modalidades en la presente, el anticuerpo 11E1 se puede caracterizar por su secuencia de aminoacidos y/o secuencia de acidos nucleicos que lo codifican. En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal comprende la porcion Fab o F(ab')2 de 11E1. Tambien se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende la region variable de cadena pesada de 11E1. De acuerdo con una modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende las tres CDRs de la region variable de cadena pesada de 11E1. Tambien se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende ademas la region variable de cadena ligera variable de 11E1 o una, dos o tres de las CDRs de la region variable de cadena ligera de 11E1. Opcionalmente cualquiera de una o mas de las CDRs de cadena ligera o pesada puede contener una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones de aminoacidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o supresiones). Opcionalmente, se proporciona un anticuerpo donde cualquiera de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada que comprenden en parte o todo de la region de ligacion a antfgeno del anticuerpo 11E1 se fusiona a una region constante de inmunoglobulina del tipo IgG, opcionalmente una region constante humana, opcionalmente un isotipo IgG1 o IgG4 humano. En otra modalidad preferida el anticuerpo es 11E1.

En otro aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo o un polinucleotido purificado que codifica un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende: una region VHCDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 5, 6 o 7, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VHCDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 8 o 9, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VHCDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 10, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 11, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO:12, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 13, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente.

En otro aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo que se liga a TLR3 humano, que comprende:

a. la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 3, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

b. la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 4, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

c. la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 3, en donde uno, dos, tres o mas de aminoacidos se puede sustituir por un aminoacido diferente; y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 4, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

d. las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 5-10, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

e. las secuencias de aminoacido CDRs 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 11-13, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

f. las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 5-10, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; y las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 11-13, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

g. la region variable de cadena pesada que tiene las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que son cada uno por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% identicas a las CDRs 1, 2 y 3 de la region variable que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

h. la region variable de cadena ligera que tiene secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que son cada uno por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% identicas a las CDRs 1, 2 y 3 de la region variable que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente.

En otro aspecto de cualquiera de las modalidades en la presente, cualquiera de las CDRs 1, 2 y 3 de las cadenas pesadas y ligeras se puede caracterizar por tener una secuencia de aminoacidos que comparte por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con la CDR particular o conjunto de CDRs listadas en la SEQ ID NO correspondiente.

En otro aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo que compite para la ligacion a TLR3 con un anticuerpo monoclonal de (a) a (h), en lo anterior.

Anticuerpo 31F6

La secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada de 31F6 se lista como SEQ ID NO: 14, la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera se lista como SEQ ID NO: 15. En una modalidad espedfica, la invencion proporciona un anticuerpo que se liga esencialmente al mismo epttopo o determinante como los anticuerpos monoclonales 31F6; opcionalmente el anticuerpo comprende una region de ligacion a antfgeno del anticuerpo 31F6. En cualquiera de las modalidades en la presente, el anticuerpo 31F6 se puede caracterizar por su secuencia de aminoacidos y/o secuencia de acidos nucleicos que lo codifican. En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal comprende la porcion Fab o F(ab')2 de 31F6. Tambien se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende la region variable de cadena pesada de 31F6. De acuerdo con una modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende las tres CDRs de la region variable de cadena pesada de 31F6. Tambien se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende ademas la region variable de cadena ligera variable de 31F6 o una, dos o tres de las CDRs de la region variable de cadena ligera de 31F6. Opcionalmente cualquiera de una o mas de las CDRs de cadena ligera o pesada puede contener una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones de aminoacidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o supresiones). Opcionalmente, se proporciona un anticuerpo donde cualquiera de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada que comprende en parte o todo de la region de ligacion a antfgeno del anticuerpo 31F6 se fusionan a una region constante de inmunoglobulina del tipo IgG, opcionalmente una region constante humana, opcionalmente un isotipo IgG1 o IgG4 humano. En otra modalidad preferida, el anticuerpo es 31F6.

En otro aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo o un polinucleotido purificado que codifica un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende: una region VHCDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 16, 17 o 18, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VHCDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 19 o 20, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; un region VHCDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 21, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 22, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 23, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 24, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente.

a. la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

b. la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 15, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

c. la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14, en donde uno, dos, tres o mas de aminoacidos se puede sustituir por un aminoacido diferente; y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 15, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

d. las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 16-21, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

e. las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 22-24, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

f. las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 16-21, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; y las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 22-24, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas de aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

g. la region variable de cadena pesada que tiene las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que son cada uno por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% identicas a las CDRs 1, 2 y 3 de la region variable que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 14, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

h. la region variable de cadena ligera que tiene las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que son cada uno por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% identicas a las CDRs 1, 2 y 3 de la region variable que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 15, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas de estos aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente.

Anticuerpo 32C4

La secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada de 32C4 se lista como SEQ ID NO: 25, la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera se lista como SEQ ID NO: 26. En una modalidad espedfica, la invencion proporciona un anticuerpo que se liga esencialmente al mismo epftopo o determinante como los anticuerpos monoclonales 32C4; opcionalmente el anticuerpo comprende una region de ligacion a antfgeno del anticuerpo 32C4. En cualquiera de las modalidades en la presente, el anticuerpo 32C4 se puede caracterizar por su secuencia de aminoacidos y/o secuencia de acidos nucleicos que lo codifican. En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal comprende la porcion Fab o F(ab')2 de 32C4. Tambien se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende la region variable de cadena pesada de 32C4. De acuerdo con una modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende las tres CDRs de la region variable de cadena pesada de 32C4. Tambien se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende ademas la region variable de cadena ligera variable de 32C4 o una, dos o tres de las CDRs de la region variable de cadena ligera de 32C4. Opcionalmente cualquiera de una o mas de dichas CDRs de cadena ligera o pesada puede contener una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones de aminoacidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o supresiones). Opcionalmente, se proporciona un anticuerpo donde cualquiera de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada que comprende parte o todo de una region de ligacion a antfgeno del anticuerpo 32C4 se fusionan a una region constante de inmunoglobulina del tipo IgG, opcionalmente una region constante humana, opcionalmente un isotipo IgG1 o IgG4 humano. En otra modalidad preferida el anticuerpo es 32C4.

En otro aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo o un polinucleotido purificado que codifica un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende: una region VHCDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 27, 28 o 29, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VHCDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 30 o 31, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VHCDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 32, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 33, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 34, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 35, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente.

a. la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 25, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

b. la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 26, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

c. la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 25, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 26, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

d. las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 27-32, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

e. las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 33-35, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

f. las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 27-32, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; y las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 33-35, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

g. la region variable de cadena pesada que tiene las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que son cada uno por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% identicas a las CDRs 1, 2 y 3 de la region variable que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 25, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

h. la region variable de cadena ligera que tiene las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que son cada uno por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% identicas a las CDRs 1, 2 y 3 de la region variable que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 26, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente.

Anticuerpo 37B7

La secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada de 37B7 se lista como SEQ ID NO:36, la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera se lista como SEQ ID NO: 37. En una modalidad espedfica, la invencion proporciona un anticuerpo que se liga esencialmente al mismo epttopo o determinante que los anticuerpos monoclonales 37B7; opcionalmente el anticuerpo comprende una region de ligacion a antfgeno del anticuerpo 37B7. En cualquiera de las modalidades en la presente, anticuerpo 37B7 se puede caracterizar por su secuencia de aminoacidos y/o secuencia de acidos nucleicos que lo codifican. En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal comprende la porcion Fab o F(ab')2 de 37B7. Tambien se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende la region variable de cadena pesada de 37B7. De acuerdo con una modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende las tres CDRs de la region variable de cadena pesada de 37B7. Tambien se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende ademas la region variable de cadena ligera variable de 37B7 o una, dos o tres de las CDRs de la region variable de cadena ligera de 37B7. Opcionalmente cualquiera de una o mas de dichas CDRs de cadena ligera o pesada puede contener una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones de aminoacidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o supresiones). Opcionalmente, se proporciona un anticuerpo donde cualquiera de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada que comprende parte o todo de una region de ligacion a antigeno del anticuerpo 37B7 se fusionan a una region constante de inmunoglobulina del tipo IgG, opcionalmente una region constante humana, opcionalmente un isotipo IgG1 o IgG4 humano. En otra modalidad preferida el anticuerpo es 37B7.

En otro aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo o un polinucleotido purificado que codifica un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende: una region VHCDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 38, 39 o 40, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VHCDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 41 o 42, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VHCDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 43, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 44, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 45, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 46, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente.

a. la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

b. la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 37, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

c. la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 37, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

d. las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 38-43, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

e. las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 44-46, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

f. las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 38-43, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; y las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 44-46, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

g. la region variable de cadena pesada que tiene las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que son cada uno por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% identicas a las CDRs 1, 2 y 3 de la region variable que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 36, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

h. la region variable de cadena ligera que tiene las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que son cada uno por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% identicas a las CDRs 1, 2 y 3 de la region variable que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 37, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente.

Anticuerpo 7G11

La secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena pesada de 7G11 se lista como SEQ ID NO: 47, la secuencia de aminoacidos de la region variable de cadena ligera se lista como SEQ ID NO: 48. En una modalidad espedfica, la invencion proporciona un anticuerpo que se liga esencialmente al mismo epftopo o determinante como los anticuerpos monoclonales 7G11; opcionalmente el anticuerpo comprende una region de ligacion a antigeno del anticuerpo 7G11. En cualquiera de las modalidades en la presente, anticuerpo 7G11 se puede caracterizar por su secuencia de aminoacidos y/o secuencia de acidos nucleicos que lo codifican. En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal comprende la porcion Fab o F(ab')2 de 7G11. Tambien se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende la region variable de cadena pesada de 7G11. De acuerdo con una modalidad, el anticuerpo monoclonal comprende las tres CDRs de la region variable de cadena pesada de 7G11. Tambien se proporciona un anticuerpo monoclonal que comprende ademas la region variable de cadena ligera variable de 7G11 o una, dos o tres de las CDRs de la region variable de cadena ligera de 7G11. Opcionalmente cualquiera de una o mas de las CDRs de cadena ligera o pesada puede contener una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones de aminoacidos (por ejemplo, sustituciones, inserciones o supresiones). Opcionalmente, se proporciona un anticuerpo donde cualquiera de las regiones variables de cadena ligera y/o pesada que comprende parte o todo de una region de ligacion a antfgeno del anticuerpo 7G11 se fusionan a una region constante de inmunoglobulina del tipo IgG, opcionalmente una region constante humana, opcionalmente un isotipo IgG1 o IgG4 humano. En otra modalidad preferida el anticuerpo es 7G11.

En otro aspecto, la invencion proporciona un anticuerpo o un polinucleotido purificado que codifica un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende: una region VHCDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 49, 50 o 51, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VHCDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 52 o 53, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VHCDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 54, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR1 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 55, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR2 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 56, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; una region VLCDR3 que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en SEQ ID NO: 57, en donde uno o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente.

a. la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 47, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

b. la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 48, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

c. la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 47, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; y la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 48, en donde uno, dos, tres o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

d. las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 49-54, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

e. las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 55-57, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

f. las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 49-54, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; y las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 de cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como se muestra en SEQ ID NOS: 55-57, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

g. la region variable de cadena pesada que tiene las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que son cada uno por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% identicas a las CDRs 1, 2 y 3 de la region variable que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 47, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente; o

h. la region variable de cadena ligera que tiene las secuencias de aminoacidos CDRs 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que son cada uno por lo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% identicas a las CDRs 1, 2 y 3 de la region variable que tiene una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 48, en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas aminoacidos se pueden sustituir por un aminoacido diferente.

En otro aspecto de cualquiera de las modalidades en la presente, cualquiera de las CDRs 1, 2 y 3 de las cadenas pesadas y ligeras puede ser caracterizada por tener una secuencia de aminoacidos que comparte por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con la CDR particular o conjunto de CDRs listadas en la SEQ ID NO correspondiente.

Las secuencias CDR para los anticuerpos 7G11 y 32C4 se derivan de las redisposiciones de genes VL y VH de los genes IGKV12s30*01 y IGHV1s6*01 de rata para las cadenas pesadas y ligeras, respectivamente. Las secuencias CDR para la cadena pesada del anticuerpo 31F6 tambien se derivan de una redisposicion de gen VH del gen IGHVls6*01 de rata mientras que la secuencia CDR de cadena ligera se deriva de una redisposicion de gen VL del gen IGKV12s8*0 de rata. En un aspecto de la invencion, la cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con la presente invencion se obtiene o se codifica por una secuencia de acidos nucleicos derivada de una redisposicion del gen VL seleccionado de IGKV12s30*01 y IGKV12s8*0 para el gen V. En un aspecto de la invencion, la cadena pesada de un anticuerpo de acuerdo con la presente invencion se obtiene o se codifica por una secuencia de acidos nucleicos derivada de una redisposicion del gen VH seleccionado de IGHV1s6*01 para el gen V.

En cualquiera de los anticuerpos de la invencion, por ejemplo, 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7, la region variable especificada y las secuencias CDR pueden comprender modificaciones de secuencia conservadoras. Modificaciones de secuencia conservadora se refiere a modificaciones de aminoacidos que no afectan o alteran significativamente las caractensticas de ligacion del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoacidos. Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y supresiones de aminoacidos. Las modificaciones se pueden introducir en un anticuerpo de la invencion por tecnicas estandares conocidas en el campo, tales como mutagenesis dirigida al sitio y mutagenesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoacidos conservadoras son aquellas tfpicamente en las cuales un residuo de aminoacido se reemplaza con un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral con similares propiedades fisicoqmmicas. La region variable especificada y las secuencias CDR pueden comprender una, dos, tres, cuatro o mas inserciones, supresiones, o sustituciones de aminoacidos. Donde se hacen sustituciones, las sustituciones preferidas seran modificaciones conservadoras. Las familias de los residuos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la tecnica. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistema, triptofano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). De esta manera, uno o mas residuos de aminoacidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invencion se puede reemplazar con otros residuos de aminoacidos para la misma familia de cadena lateral y el anticuerpo alterado se puede someter a prueba para funcion retenida (es dear, las propiedades expuestas en la presente) utilizando los ensayos descritos en la presente.

El termino “identidad” o “identico”, cuando se utilizan en una relacion entre las secuencias de dos o mas polipeptidos, se refiere al grado de relacion de secuencia entre los polipeptidos, como es determinado por el numero de coincidencias entre las cadenas de dos o mas residuos de aminoacidos. “Identidad” mide el porcentaje de las conciencias identicas entre la mas pequena de las dos o mas secuencias con las alineaciones de espacio (si las hay) tratadas por un modelo matematico particular o programa de computadora (es decir, “algoritmos”). La identidad de los polipeptidos relacionados se puede calcular facilmente por metodos conocidos. Tales metodos incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo y colaboradores, SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).

Los metodos preferidos para determinar la identidad se disenan para proporcionar la coincidencia mas larga entre las secuencias sometidas a prueba. Los metodos para determinar la identidad se describen en los programas de computadora publicamente disponibles. Los metodos de programa de computadora preferidos para determinar la identidad entre las dos secuencias incluyen el paquete de programa GCG, incluyendo GAP (Devereux y colaboradores, Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). El programa BLASTX es publicamente disponible de National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul y colaboradores NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul y colaboradores, supra). El algoritmo de Smith Waterman bien conocido tambien se puede utilizar para determinar la identidad.

Las secuencias de las CDRs de los anticuerpos de acuerdo con la invencion, de acuerdo con AbM (definicion de software de Modelacion de anticuerpo AbM de Oxford Molecular), los sistemas de definiciones de Kabat y Chothia, se han resumido en las Tablas 1 y 2 a continuacion. Las secuencias de aminoacidos descritas en la presente se numeran de acuerdo con los sistemas de numeracion Abm, Kabat y Chothia. Mientras que cualquier sistema de numeracion adecuado se puede utilizar para designar las regiones CDR, en ausencia de cualquiera de otra indicacion, se puede utilizar la numeracion Abm. Tal numeracion se ha establecido utilizando las siguientes indicaciones: CDR-L1: Inicio: aproximadamente 24 residuos, antes del residuo: siempre un Cys, despues del residuo: siempre un Trp (tipicamente Trp-Tyr-Gln, pero tambien, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu), longitud: 10 a 17 residuos; CDR-L2: Inicio: siempre 16 residuos despues del extremo de L1, Antes de los residuos: generalmente Ile-Tyr (pero tambien, Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe), Longitud: siempre 7 residuos; CDR-L3, Inicio: siempre 33 residuos despues del extremo de L2, Antes del residuo: siempre Cys, Despues de los residuos: siempre Phe-Gly-Xaa-Gly, Longitud: 7 a 11 residuos; CDR-H1, Inicio: aproximadamente 26 residuos (siempre 4 despues de un Cys) (definicion de Chothia / AbM, la definicion de Kabat comienza 5 residuos despues), Antes de los residuos: siempre Cys-Xaa-Xaa-Xaa, Despues de los residuos: siempre un Trp (tfpicamente Trp-Val, pero tambien, Trp-Ile, Trp-Ala), Longitud: 10 a 12 residuos (definicion de AbM, definicion de Chothia excluye los ultimos 4 residuos); CDR-H2, Inicio: siempre 15 residuos despues del extremo de la definicion de Kabat / AbM de CDR-H1, Antes de los residuos: tfpicamente Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (pero un numero de variaciones, despues de los residuos Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala), Longitud: definicion de Kabat 16 a 19 residuos; definicion de AbM (y Chothia) termina 7 residuos antes; CDR-H3, Inicio: siempre 33 residuos despues del extremo CDR-H2 (siempre 2 despues de un Cys), Antes de los residuos: siempre Cys-Xaa-Xaa (tfpicamente Cys-Ala-Arg), Despues de los residuos: siempre Trp-Gly-Xaa-Gly, Longitud: 3 a 25 residuos.

En una modalidad, los anticuerpos de la invencion son del isotipo IgG1 humano o raton. En otra modalidad, los anticuerpos de la invencion son del isotipo IgG4 humano. En una modalidad, los anticuerpos de la invencion son fragmentos de anticuerpos que retienen sus propiedades de ligacion y/o funcionales.

Fragmentos y Derivados de los presentes Anticuerpos Monoclonales

Los fragmentos y derivados de los anticuerpos de esta invencion (que son abarcados por el termino “anticuerpo” o “anticuerpos” como se utiliza en esta solicitud, a menos que se establezca de otra manera o se contradiga claramente por el contexto), de manera preferente un anticuerpo similar a 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7, se pueden producir por tecnicas que son bien conocidas en el campo. “Fragmentos” comprenden una porcion del anticuerpo intacto, generalmente el sitio de ligacion a antigeno o region variable. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2, y Fv; diacuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que sea un polipeptido que tiene una estructura primaria que consiste en una secuencia no interrumpida de residuos de aminoacidos contiguos (referido en la presente como un “fragmento de anticuerpo de cadena individual” o “polipeptido de cadena individual”), incluyendo sin limitacion (1) moleculas Fv de cadena individual, (2) polipeptidos de cadena individual que contienen solo un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento del mismo que contiene las tres CDRs del dominio variable de cadena ligera, sin un resto de cadena pesada asociado y (3) polipeptidos de cadena individual que contienen solo una region variable de cadena pesada, o un fragmento de la misma que contiene las tres CDRs de la region variable de cadena pesada, sin un resto de cadena ligera asociado; y anticuerpos multiespedficos formados de fragmentos de anticuerpos. Se incluyen, inter alia, un nanocuerpo, anticuerpo de dominio, anticuerpo de dominio individual o un “dAb”.

Los fragmentos de los presentes anticuerpos se pueden obtener utilizando metodos estandares. Por ejemplo, los fragmentos Fab o F (ab') 2 se pueden producir por la digestion de proteasa de los anticuerpos aislados, de acuerdo con las tecnicas convencionales. Se apreciara que los fragmentos inmunoreactivos se pueden modificar utilizando metodos conocidos, por ejemplo, para eliminacion lenta in vivo y obtener un perfil farmacocinetico mas deseable el fragmento se puede modificar con polietilenglicol (PEG). Los metodos para acoplar y conjugar espedficamente en el sitio el PEG a un fragmento Fab' se describen en, por ejemplo, Leong y colaboradores, 16 (3): 106-119 (2001) y Delgado y colaboradores, Br. J. Cancer 73 (2): 175-182 (1996), las divulgaciones de las cuales se incorporan en la presente a manera de referencia.

Alternativamente, el ADN de un hibridoma que produce un anticuerpo de la invencion, de manera preferente un anticuerpo similar a 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7, se puede modificar para codificar un fragmento de la invencion. El ADN modificado luego se inserta en un vector de expresion y se utiliza para transformar o transfectar una celula apropiada, que luego expresa el fragmento deseado.

En ciertas modalidades, el ADN de un hibridoma que produce un anticuerpo de esta invencion, de manera preferente un anticuerpo similar a 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7 se puede modificar antes de la insercion en un vector de expresion, por ejemplo, al sustituir la secuencia de codificacion para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias no humanas homologas (por ejemplo, Morrison y colaboradores, PNAS pp. 6851 (1984)), o al unir covalentemente a la secuencia de codificacion de inmunoglobulina todo o parte de la secuencia de codificacion para un polipeptido no de inmunoglobulina. De esa manera, se preparan anticuerpos “quimericos” o “tnbridos” que tienen la especificidad de ligacion del anticuerpo original. Tfpicamente, tales polipeptidos no de inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo de la invencion.

De esta manera, de acuerdo con otra modalidad, el anticuerpo de esta invencion, de manera preferente un anticuerpo similar a 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7, se humaniza. Las formas “humanizadas” de los anticuerpos de acuerdo con esta invencion son inmunoglobulinas quimericas espedficas, cadenas de inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F (ab') 2, u otras subsecuencias de ligacion antfgenos de los anticuerpos) que contienen una secuencia minima derivada de la inmunoglobulina de murino o rata. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en el cual los residuos de una region de determinacion complementaria (CDR) de recipiente se reemplazan por los residuos de una CDR del anticuerpo original (anticuerpo donador) mientras que mantiene la especificidad deseada, afinidad, y capacidad del anticuerpo original.

En algunos casos, los residuos de la estructura Fv de la inmunoglobulina humana se pueden reemplazar por residuos no humanos correspondientes. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en ya sea el anticuerpo recipiente o en las secuencias CDR o de estructura importadas. Estas modificaciones se hacen para definir adicionalmente y optimizar el desempeno del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todo de por lo menos uno, y tfpicamente dos dominios variables, en los cuales todo o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas del anticuerpo original y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado optimamente tambien comprendera por lo menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), tfpicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales ver Jones y colaboradores, Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann y colaboradores, Nature, 332, pp. 323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992); Verhoeyen et Science, 239, pp. 1534; y la Patente de E.U.A. No. 4,816,567, las divulgaciones completas de las cuales se incorporan en la presente a manera de referencia). Los metodos para humanizar los anticuerpos de esta invencion son bien conocidos en el campo.

La eleccion de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se utilizan en la preparacion de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el asf llamado metodo “mejor adaptado”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de esta invencion se clasifica contra la biblioteca completa de las secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que es mas cercana a aquella de raton luego se acepta como la estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims y colaboradores, J. Immunol. 151, pp. 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. 196, 1987, pp. 901). Otro metodo utiliza una estructura particular de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura se puede utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter y colaboradores, PNAS 89, pp. 4285 (1992); Presta y colaboradores, J. Immunol., 151, p. 2623 (1993)).

Ademas, es importante que los anticuerpos se humanicen con retencion de alta afinidad para los receptores TLR3 y otras propiedades biologicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un metodo preferido, los anticuerpos humanizados se preparan por un proceso de analisis de las secuencias parenterales y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parenterales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales son comunmente disponibles y estan familiarizados con aquellas personas expertas en el campo. Estan disponibles programas de computadora que ilustran y muestran estructuras tridimensionales probables de las secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspeccion de estas visualizaciones permite el analisis de la probable funcion de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir, el analisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidato al ligarse a su antfgeno. De esta manera, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar de las secuencias consenso y de importacion de modo que la caractenstica del anticuerpo deseado, tal como afinidad incrementada para el antfgeno(s) objetivo, se logra. En general, los residuos CDR se implican directamente y mas sustancialmente en influir la ligacion del antfgeno.

Otro metodo para preparar anticuerpos monoclonales “humanos” es utilizar un XenoMouse (Abgenix, Fremont, CA) como el raton utilizado para la inmunizacion. Un XenoMouse es un hospedero de murino de acuerdo con esta invencion que ha tenido sus genes de inmunoglobulina reemplazados por los genes de inmunoglobulina humanos funcionales. De esta manera, los anticuerpos producidos por este raton o en los hibridomas preparados de las celulas B de este raton, son humanos (o ya humanizados). El XenoMouse se describe en la Patente de E.U.A. No.

6,162,963, que se incorpora en la presente en su totalidad a manera de referencia.

Los anticuerpos humanos tambien se pueden producir de acuerdo con varias otras tecnicas, tal como al utilizar, para inmunizacion, otros animales transgenicos que se han disenado para expresar un repertorio de anticuerpos humanos (Jakobovitz et Nature 362 (1993) 255), o por la seleccion de repertorios de anticuerpos que utilizan metodos de expresion en fago. Tales tecnicas son conocidas por la persona experta y se pueden implementar comenzando desde los anticuerpos monoclonales como se describen en la presente solicitud.

Los anticuerpos de la presente invencion, de manera preferente un anticuerpo similar a 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 o 37B7, tambien pueden estar derivatizados a anticuerpos “quimericos” (inmunoglobulinas) en la cual una porcion de la cadena(s) pesada/ligera es identica con u homologa a las secuencias correspondientes en el anticuerpo original, mientras que el resto de la cadena(s) es identica con u homologa a las secuencias correspondientes a los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, asf como fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando muestren la actividad biologica deseada y la especificidad de ligacion (Cabilly y colaboradores, supra; Morrison y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., pp. 6851 (1984)).

Regfmenes de dosificacion

Basado en los datos de eficacia recolectados durante los experimentos in vivo utilizando anticuerpos anti-TLR3, los inventores han establecido que una dosis tan baja como 100jg/raton produce un efecto terapeutico. Tales dosificaciones son equivalentes a 4 mg/kg en el raton y por lo tanto 0.5 mg/kg en un sujeto humano. Por lo tanto, en los metodos de la invencion, el anticuerpo anti-TLR3 se puede administrar en una dosificacion comprendida entre 0.05 y 20 mg/kg en un humano, de manera preferente 0.1 y 10 mg/kg, ademas de manera preferente entre 0.5 y 5 mg/kg (por ejemplo, una dosis unitaria de entre aproximadamente 25 mg y 500 mg).

Un regimen de tratamiento ejemplar incluye la administracion dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 2 a 3 meses, o una vez cada 3 a 6 meses. Los regfmenes de dosificacion ejemplares para un anticuerpo anti-TLR3 incluye entre 0.05 y 20 mg/kg (de manera preferente 0.1 y 10 mg/kg, ademas de manera preferente entre 0.5 y 5 mg/kg) de peso corporal a traves de la administracion intravenosa o inyeccion subcutanea, con el anticuerpo que se administra utilizando uno de los siguientes programas de dosificacion: (i) dosis de carga de aproximadamente cada 1, 2, 3 de 4 semanas (por ejemplo, para 2-4 dosificaciones), luego cada uno a tres meses; (ii) una vez al mes o una vez por penodo de dos meses; (iii) cada una a dos semanas, o cualquier otra dosificacion optima.

El anticuerpo anti-TLR3 se administra opcionalmente en una dosis que es adecuada para inducir sustancialmente la saturacion del receptor TLR3 completa (90%, opcionalmente 95% de saturacion del receptor), por ejemplo, saturacion del polipeptido TLR3 expresado en las celulas objetivo. Ya que el receptor TLR3 se cree que dimeriza antes de la senalizacion, una inhibicion menor que la saturacion completa en al menos 20%, 30%, 40%, 50% de saturacion del receptor puede ser util en el tratamiento de una enfermedad. En una modalidad, una dosis de anticuerpo anti-TLR3 que da por resultado por lo menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 90% o 95% de saturacion del receptor se administra de aproximadamente 2 veces a la semana a aproximadamente una vez al mes, o de aproximadamente una vez al mes a aproximadamente una vez cada 2 meses. La dosis puede ser por ejemplo, administrada en por lo menos 3 veces, por lo menos 6 veces, o mas. Por ejemplo, el metodo puede comprender administrar un anticuerpo anti-TLR3 en una dosis y una frecuencia de dosificacion logrando por lo menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 90% o 95% de saturacion del receptor TLR3 en las celulas objetivo durante por lo menos aproximadamente dos semanas, un mes, 6 meses, 9 meses o 12 meses. En una modalidad preferida, un regimen da por resultado una saturacion del receptor sustancialmente completa sostenida. Una dosis de anticuerpo anti-TLR3 que da por resultado la saturacion del receptor sustancialmente completa durante un penodo de por lo menos aproximadamente 1 semana, 2 semanas o 1 mes es administrada.

La ocupacion del receptor se puede evaluar en las muestras humanas donde las celulas objetivo estan presentes (por ejemplo, sangre entera, cualquier tejido que sea el sitio de una inflamacion, fluido sinovial). El porcentaje de saturacion del receptor TLR3 se puede medir por el analisis FACS utilizando metodos conocido en el campo, a traves de tincion intracelular puesto que el receptor TLR3 esta presente en las celulas. Alternativamente, el porcentaje de saturacion se puede determinar utilizando una prueba de perfil de secrecion de inhibicion de citoquinas en respuesta a un ligando TLR3 tal como ARNds (es decir poliAU) en las celulas mononucleares (PBMCs preferibles) obtenidas de un paciente. Una inhibicion de citoquinas eficientes se correlaciona con un efecto terapeutico eficiente y la dosificacion luego se puede adaptar para cada paciente. Las citoquinas que se pueden medir en este ensayo son por ejemplo, IP-10 o lL-6. En otra modalidad, la saturacion del receptor se evalua como la ocupacion del receptor, por ejemplo, al conducir ensayos de sitio libre y de sitio ligado. Resumiendo, los niveles del receptor TLR3 libres y ligados se evaluan en las celulas objetivo de una muestra biologica obtenida de un individuo tratado con el anticuerpo anti-TLR3, donde un ensayo de sitio libre evalua el TLR3 no ligado por la tincion con la forma conjugada con PE del anticuerpo anti-TLR3 administrado a un individuo. Un ensayo de sitio ligado evalua los polipeptidos TLR3 ocupados por el anticuerpo anti-TLR3 por la tincion con un anticuerpo monoclonal IgG4 antihumano de raton conjugado con PE (cuando el anticuerpo anti-TLR3 es de isotipo IgG4 humano) que reconoce el anticuerpo anti-TLR3 ligado a los polipeptidos TLR3. En una modalidad, la invencion proporciona ademas un metodo para tratar un individuo que comprende: (a) administrar un anticuerpo anti-TLR3 a un individuo y (b) determinar la saturacion del receptor TLR3 en el individuo, opcionalmente determinar adicionalmente una dosificacion del anticuerpo anti-TLR3 que se administra al individuo.

Formas de dosificacion

Las formulaciones terapeuticas de los antagonistas utilizados de acuerdo con la presente invencion se preparan para almacenamiento mediante el mezclado del antagonista que tiene el grado deseado de pureza con los portadores, excipientes o estabilizantes farmaceuticamente aceptables opcionales en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Para informacion general con respecto a las formulaciones, ver, por ejemplo, Gilman y colaboradores (eds.), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a Ed. (Pergamon Press, 1990); Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edition (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990); Avis y colaboradores (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications (Dekker, Nueva York, 1993); Lieberman y colaboradores (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (Dekker, Nueva York, 1990); Lieberman y colaboradores (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems (Dekker, Nueva York, 1990); y Walters (ed.), Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119 (Dekker, Nueva York, 2002).

Los portadores, excipientes, o estabilizantes aceptables no son toxicos a los recipientes en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato, y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina; conservadores (tal como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butflico o bendlico; alquil parabenos tal como metil o propil parabeno; catecol, resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipeptidos de peso molecular bajo (menores que aproximadamente 10 residuos); protemas tales como albumina de suero; gelatina o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofflicos tal como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacaridos, disacaridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como acido etilenediaminetetraacetico (EDTA); azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa, o sorbitol; contra-iones formadores de sal tal como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-protemas); y/o surfactantes no ionicos tales como TWEENMR, PLURONICSMR, o PEG.

Las formulaciones de anticuerpos ejemplares se describen, por ejemplo, en WO 1998/56418, que describe una formulacion de multiples dosis lfquida para un anticuerpo anti-CD20, que comprende 40 mg/mL de rituximab, acetato 25 mM, trehalosa 150 mM, 0.9% de alcohol bendlico y 0.02% de polysorbate20MR en pH 5.0 que tiene una vida de anaquel minima de dos anos de almacenamiento a 2-8°C. Otra formulacion anti-CD20 de interes comprende 10 mg/mL de rituximab en 9.0 mg/mL de cloruro de sodio, 7.35 mg/mL de dihidrato de citrato de sodio, 0.7 mg/mL de polysorbate80MR, y Agua Esteril para Inyeccion, pH 6.5.

Las formulaciones liofilizadas adaptadas para la administracion subcutanea se describen, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 6,267,958 (Andya y colaboradores). Tales formulaciones liofilizadas se pueden reconstituir con un diluyente adecuado a una concentracion de protema alta y la formulacion reconstituida se puede administrar subcutaneamente al mairnfero que se trata en la presente.

Las formas cristalizadas del antagonista tambien se contemplan. Ver, por ejemplo, US 2002/0136719A1 (Shenoy y colaboradores).

La formulacion en la presente tambien puede contener mas de un compuesto activo (un segundo medicamento como es indicado en lo anterior), de manera preferente a aquellos con actividades complementarias que no afectan adversamente entre sf. El tipo y las cantidades efectivas de tales medicamentos dependen, por ejemplo, de la cantidad y tipo de antagonista de celulas B presente en la formulacion, y los parametros clfnicos de los sujetos. Los segundos de tales medicamentos preferidos se indican en lo anterior.

Los ingredientes activos tambien se pueden atrapar en microcapsulas preparadas, por ejemplo, por tecnicas de coacervacion o por polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administracion de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartfculas, y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Tales tecnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, por ejemplo.

Se pueden preparar formulaciones de liberacion sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semi-permeables de polfmeros hidrofobicos solidos que contienen el antagonista, las matrices que estan en la forma de artfculos formados, por ejemplo, pelfculas y microcapsulas. Ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles, (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(alcohol vimlico)), polilacturos (Patente de E.U.A. No. 3,773,919), copolfmeros de acido L-glutamico y y etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolfmeros de acido lactico-acido glicolico degradables tal como Lupron DepotMR (microesferas inyectables compuestas de copolfmero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprorelina), y acido poli-D-(-)-3-hidroxibutmco.

Las formulaciones que se utilizan para la administracion in vivo deben ser esteriles. Esto se logra facilmente por filtracion a traves de las membranas de filtracion esteriles. Los portadores farmaceuticamente aceptables que se pueden utilizar en estas composiciones incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alumina, estearato de aluminio, lecitina, protemas de suero, tales albumina de suero humano, sustancias amortiguadoras tales como fosfatos, glicina, acido sorbico, sorbato de potasio, mezcla de gliceridos parciales de acidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, fosfato de hidrogeno de disodio, fosfato de hidrogeno de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sflice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sodica, poliacrilatos, ceras, polfmeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana. Los anticuerpos de esta invencion se pueden emplear en un metodo para modular, por ejemplo, inhibir la actividad de las celulas que expresan TLR3 en un paciente. Este metodo comprende la etapa de poner en contacto un paciente con dicha composicion (por ejemplo, administrar dicha composicion al paciente). Tal metodo sera util para tanto profilaxis como propositos terapeuticos. Las formulaciones se pueden adaptar a las vfas nasales o de inhalacion. Una formulacion puede comprender un portador nasal farmaceuticamente aceptable. Para la administracion nasal, cualquiera de los metodos de suministro bien conocidos tales como gotas, un rodo nasal, un lfquido nasal o un aerosol en polvo, una capsula o un inserto nasal se puede utilizar. Para administracion de aerosol, cualquiera de los metodos de suministro bien conocidos tales como nebulizadores, inhaladores, atomizadores, formadores de aerosoles, productor de neblina, inhalador de polvo seco, inhalador de dosis medida, rociador de dosis medida, productor de neblina de dosis medida, atomizador de dosis medida u otro dispositivo de administracion adecuados se puede utilizar.

Los aspectos y ventajas adicionales de esta invencion se divulgaran en las siguientes secciones experimentales, que se debe considerar como ilustrativa y no limitante del alcance de esta solicitud.

Tratamiento de la enfermedad

La presente invencion proporciona metodos para el tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, que comprende administrar al individuo un anticuerpo anti-TLR3 de la invencion. El anticuerpo puede estar comprendido en una composicion que comprende ademas un portador farmaceuticamente aceptable. Tales composiciones tambien son referidas como “composiciones de anticuerpos” de la invencion. En una modalidad, las composiciones de anticuerpo de esta invencion comprenden un anticuerpo divulgado en las modalidades de anticuerpos en lo anterior.

La invencion proporciona ademas un metodo para modular la actividad de celulas que expresan TLR3 en un paciente en necesidad del mismo, que comprende la etapa de administrar a dicho paciente una composicion de acuerdo con la invencion. El metodo se dirige mas espedficamente a disminuir la actividad de celulas TLR3 en pacientes que tienen una enfermedad en la cual la actividad de celulas TLR3 disminuida es benefica (por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias, enfermedad infecciosa, infeccion viral), o que es provocada o caracterizada por la actividad de celulas TLR3 excesiva. En una modalidad, la actividad de celulas que expresan TLR3 se inhibe, en donde el paciente tiene una enfermedad o trastorno en donde tal inhibicion puede promover, mejorar, y/o reducir un efecto terapeutico (o promueve, mejora, y/o reduce tal efecto en por lo menos una proporcion sustancial de pacientes con la enfermedad o trastorno y las caractensticas sustancialmente similares en cuanto al paciente, como se puede determinar, por ejemplo, mediante ensayos clmicos).

Las enfermedades y afecciones en las cuales los presentes metodos se pueden utilizar incluyen todas las enfermedades donde la modulacion de TLR3 puede ser benefica, incluyendo por ejemplo, enfermedades mediadas o exacerbadas total o parcialmente por la senalizacion TLR3 o por citoquinas producidas tras dicha senalizacion TLR3. En particular, cuando se utilizan los anticuerpos que inhiben la senalizacion TLR3, tales trastornos incluyen cualquiera de los trastornos mediados o exacerbados parcial o totalmente por la senalizacion TLR3 o por las citoquinas producidas tras dicha senalizacion TLR3, incluyendo, inter alia trastornos inmunitarios tales como enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias. Mas espedficamente, los metodos de la presente invencion se utilizan para el tratamiento de una variedad de trastornos inmunitarios y otras enfermedades incluyendo, pero no limitado a autoinmunidad, inflamacion, alergia, asma, infecciones (por ejemplo, infeccion cronica, infeccion viral) y sepsis. Ejemplos de enfermedades que se pueden tratar con los anticuerpos que inhiben la senalizacion TLR3 incluyen, pero no se limitan a artritis, lupus eritematoso sistemico, sepsis, asma, osteoporosis, autoinmunidad a antfgenos del sistema nervioso central, diabetes autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal, carditis autoinmune y hepatitis autoinmune.

En una modalidad adicional, un anticuerpo anti-TLR3 de la invencion que inhibe la senalizacion por un polipeptido TLR3 se utiliza para el tratamiento o prevencion de enfermedad de injerto versus hospedero (GvHD), por ejemplo, en trasplantes o transfusiones. Particularmente, despues del trasplante de medula osea, las celulas T se presentan en el injerto, ya sea como contaminantes o introducidos intencionalmente en el hospedero, atacan los tejidos del recipiente del trasplante despues de percibir tejidos hospederos como antigenicamente extranos. Las celulas T producen un exceso de citoquinas, incluyendo TNF-a e interferon-gama (IFNy). Los anticuerpos anti-TLR3 se pueden administrar antes, durante o despues de un trasplante o transfusion, por ejemplo, trasplante de medula osea alogenica, particularmente en el tratamiento de cancer, por ejemplo, leucemias. El anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-TLR3 que inhibe la senalizacion de un polipeptido TLR3. Puesto que el GvHD se cree que se conduce en gran medida por las celulas que presentan antigenos, anticuerpos anti-TLR3 que inhiben la senalizacion TLR3 en la DC se creen que son particularmente utiles.

Otros trastornos inmunitarios tratables utilizando los anticuerpos que inhiben la senalizacion TLR3 de acuerdo con la invencion incluyen, inter alia, trastornos autoinmunitarios y trastornos inflamatorios, incluyendo, pero no limitado a, enfermedad de Crohn, enfermedad Celiaca, colitis ulcerativa, smdrome del intestino irritable, encefalomielitis diseminada aguda (ADEM), enfermedad de Addison, smdrome de anticuerpos antifosfoffpidos (APS), anemia aplasica, hepatitis autoinmune, Diabetes mellitus, smdrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, smdrome de Guillain-Barre (GBS), enfermedad de Hashimoto, lupus eritematoso, afecciones desmielinizantes, esclerosis Multiple, Myasthenia gravis, smdrome de opsoclonus mioclonus (OMS), neuritis optica, tiroiditis de Ord, penfigo, cirrosis, psoriasis, artritis reumatoide, smdrome de Reiter, arteritis de Takayasu, arteritis temporal, anemia hemofftica autoinmune caliente, granulomatosis de Wegener, apendicitis, arteritis, artritis, blefaritis, bronquiolitis, bronquitis, bursitis, cervicitis, colangitis, colecistitis, corioamnionitis, colitis, conjuntivitis, cistitis, dacrioadenitis, dermatitis, dermatomiositis, encefalitis, endocarditis, endometritis, enteritis, enterocolitis, epicondilitis, epididimitis, fascitis, fibrositis, gastritis, gastroenteritis, gingivitis, hepatitis, hidradenitis supurante, ileitis, iritis, laringitis, mastitis, meningitis, mielitis, miocarditis, miositis, nefritis, omfalitis, omforitis, orquitis, osteitis, otitis, pancreatitis, parotitis, pericarditis, peritonitis, faringitis, pleuritis, flebitis, pneumonitis, proctitis, prostatitis, poliolonefritis, rinitis, salpingitis, sinusitis, estomatitis, sinovitis, tendonitis, tonsilitis, uveitis, vaginitis, vasculitis, y vulvitis.

Un aspecto de la invencion es proporcionar una composicion que sea capaz de tratar una SIRS, una sepsis, una sepsis grave o un choque septico. Otro aspecto de la invencion es proporcionar un metodo para el tratamiento profilactico de pacientes quienes estan en riesgo de desarrollar una sepsis. Por ejemplo, los pacientes que se les ha removido su bazo quirurgicamente, los pacientes con un sistema inmune deteriorado (es decir, tratamiento de quimioterapia, inmunodepresion) pero tambien otras causas tales como medicacion de esteroides a largo plazo, diabetes, SlDA, o cirrosis, quemaduras grandes o lesiones graves, infecciones tales como neumoma, meningitis, peritonitis, apendicitis, celulitis, infeccion del tracto urinario o infecciones que se presentan despues de un acto quirurgico mayor.

En una modalidad, el individuo tiene una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria que se ha declarado por un penodo de tiempo prolongado (por ejemplo, mas de un ano), tiene signos de inflamacion en curso o activa, tiene signos ffsicos de enfermedad (por ejemplo, hinchamiento de articulaciones, lesiones, smtomas neurologicos, etc.), tiene enfermedad cronica, tiene enfermedad grave (como es evaluada por criterios aplicables, por ejemplo, criterios de DAS o ACR en artritis reumatoide) o tiene enfermedad en progresion.

En una modalidad, la presente invencion proporciona metodos para el tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria establecida, que comprende administrar al individuo un anticuerpo anti-TLR3. En una modalidad, la presente invencion proporciona metodos para el tratamiento de fases agudas, o de un ataque, crisis, exacerbacion o recrudecimiento, de enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias que utilizan un anticuerpo TLR3 (o composiciones relacionadas), en donde de manera preferente el anticuerpo se administra a un individuo durante una fase aguda o durante un ataque, crisis, exacerbacion o recrudecimiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria. En una modalidad, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, artritis idiopatica Juvenil, esclerosis multiple, enfermedad de Crohn o rectocolitis, Lupus eritematoso, hepatitis, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD) o asma, espondilitis anquilosante y enfermedades relacionadas. En una modalidad, la enfermedad se caracteriza por la presencia de un ligando TLR3 (por ejemplo, ARNds extracelular). En una modalidad, la enfermedad se caracteriza por la presencia de niveles detectables de una enzima proteofftica, un mediador inflamatorio, un marcador de inflamacion en curso o una citoquina pro-inflamatoria (por ejemplo, TNF-a y/o interleucina-1 (IL-1)). De manera preferente el anticuerpo inhibe la senalizacion por el polipeptido TLR3, opcionalmente ademas en condiciones acidas y con alta afinidad de ligacion, opcionalmente en una celula dendntica humana.

El tratamiento implica generalmente la administracion de una cantidad efectiva de una composicion que comprende un anticuerpo anti-TLR3 con el proposito de prevenir cualquiera de los smtomas o estado de enfermedad que se desarrolla o empeora, o con el proposito de prevenir (por ejemplo, prevenir o posponer la progresion), facilitar, mejorar, o erradicar (curar) tales smtomas o estados de enfermedad ya desarrollados. La diagnosis de la enfermedad, evolucion y clasificacion (o estadificacion) se puede definir por criterios medicos estandares para el tipo particular de la enfermedad a fin de determinar si un individuo tiene la enfermedad que se establece, esta en una fase aguda, esta progresando, es cronica, tiene smtomas ffsicos, o es de un cierto nivel de gravedad. Del mismo modo, ataque, crisis, exacerbacion o recrudecimientos se pueden identificar por cualquiera de los criterios medicos adecuados.

En una modalidad, la invencion comprendera una etapa para conducir una etapa de evaluacion o de prueba para evaluar la presencia, etapa, evolucion o clasificacion de la enfermedad. De esta manera, en un aspecto, la invencion proporciona un metodo para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria en un paciente, que comprende: (a) conducir una evaluacion de la enfermedad en el paciente; y (b) si dicho paciente tiene una enfermedad adecuada para el tratamiento con un anticuerpo anti-TLR3 de la invencion, administrar a dicho paciente una dosis efectiva del anticuerpo anti-TLR3. Opcionalmente tal etapa de evaluacion puede implicar obtener una muestra biologica de un paciente sospechoso de tener una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria. Los metodos para evaluar la enfermedad (por ejemplo, diagnosis, estadificacion, etc.) se puede lograr mediante cualquier tecnica adecuada conocida en el campo, por ejemplo, al llevar a cabo una prueba basada en laboratorio. Ejemplos de tecnicas adecuadas incluyen conducir un ensayo basado en PCR o RT-PCR (por ejemplo, para detectar los acidos nucleicos o genes asociados a la enfermedad, frecuentemente referidos como “marcadores” o “biomarcadores”), biopsia, endoscopia, estudios de heces, cualquiera de las pruebas de laboratorio no invasivas (por ejemplo, anemia e infeccion, pruebas de funcion de tugado para clasificar el tugado y los problemas del conducto biliar, pruebas para infecciones bacterianas, virales y parasfticas), ultrasonido, CT, MRE, MRI y otras tecnicas de formacion de imagenes, analisis cromosomicos, tecnicas de deteccion de inmunoensayo/inmunocitoqmmicas (por ejemplo, presencia de autoanticuerpos), ensayos histologicos y/o histopatologicos, electroforesis de protemas en suero, citometna de flujo (por ejemplo, deteccion de celulas inmunes, celulas T, etc.) analisis de gas de sangre arterial (ABG) (en asma o COPD), y tecnicas de examinacion ffsica (por ejemplo, para smtomas ffsicos, numeros de articulaciones con sinovitis, etc.). En una modalidad, los metodos comprenden detectar la presencia de autoanticuerpos, por ejemplo, detectar el factor reumatoide (RhF), anticuerpos de peptidos citrulinados anti-dclicos, anti-ARNss, anti-ARNds, anti-Smith, anti-fosfoKpido, anticuerpos anti-nucleares y/o anti-actina. En una modalidad, los metodos comprenden evaluar los niveles de una enzima proteolttica, un mediador inflamatorio, un marcador de inflamacion en curso o una citoquina pro-inflamatoria. En una modalidad, los metodos comprenden determinar el nivel de protema c-reactiva (CRP) y/o velocidades de sedimentacion de eritrocitos. Una determinacion que un individuo tiene resultados anormales (indicativo de la enfermedad, exacerbacion, inflamacion en curso, etc.), por ejemplo, niveles anormales de ABG, autoanticuerpos, CRP, cualquier enzima proteolttica, mediador inflamatorio o marcador de inflamacion en curso indica que el individuo es adecuado para el tratamiento con un anticuerpo anti-TLR3.

La administracion de los anticuerpos anti-TLR3 a un sujeto (ya sea por administracion directa o expresion de un acido nucleico en la misma, tal como de un vector de transferencia de gen viral pox que comprende la secuencia(s) de acidos nucleicos que codifican el anticuerpo anti-TLR3)) y practicar los otros metodos de la invencion se pueden utilizar para reducir, tratar, prevenir, o de otra manera mejorar cualquier aspecto adecuado de enfermedad o progresion de la enfermedad. Los metodos de la invencion pueden ser particularmente utiles en la reduccion y/o mejora de la inflamacion y/o dano el tejido, y cualquier parametro o smtoma asociado con el mismo (por ejemplo, la presencia de un marcador de inflamacion, numero de celulas pro-inflamatorias en la circulacion o en un tejido particular).

Los anticuerpos anti-TLR3 se pueden utilizar ventajosamente para tratar la enfermedad establecida. “Enfermedad establecida” se refiere a una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria que se ha declarado durante un penodo de tiempo prolongado, por ejemplo, por mas de un ano. Dependiendo de la enfermedad espedfica, la enfermedad establecida tambien significa una enfermedad que no se controla, por ejemplo, que esta aun progresando o por la cual el paciente no experimenta remision, en presencia o en ausencia de un tratamiento. En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria en un paciente, que comprende: (a) determinar si dicho paciente tiene una enfermedad establecida; y (b) si dicho paciente tiene enfermedades establecidas, administrar a dicho paciente una dosis efectiva del anticuerpo anti-TLR3.

Los anticuerpos anti-TLR3 tambien se pueden utilizar ventajosamente para tratar una enfermedad cronica. “Enfermedad cronica” se refiere a una enfermedad que persiste durante un penodo de tiempo prolongado. Por ejemplo, una enfermedad cronica puede ser una enfermedad que dura 3 meses o mas, como se define por U.S. National Center for Health Statistics. En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria en un paciente que comprende: (a) determinar si dicho paciente tiene una enfermedad cronica; y (b) si dicho paciente tiene enfermedades cronicas, administrar a dicho paciente una dosis efectiva del anticuerpo anti-TLR3.

Los anticuerpos anti-TLR3 tambien se pueden utilizar ventajosamente para tratar individuos que tienen un ataque, crisis, exacerbacion o recrudecimiento. Los terminos “ataque”, “crisis”, “exacerbacion” y “recrudecimiento”, designan una evolucion mas rapida en nuevos smtomas o empeoramiento de smtomas antiguos relacionados con una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria. Tales fases duran mas de un penodo de horas o dfas, como es opuesto a una progresion lenta de la enfermedad que se presenta durante meses y anos. Durante tales ataques, el paciente experimenta fiebre, dolor, smdrome inflamatorio (smdrome similar a gripe). En RA, las articulaciones del paciente se hinchan y son dolorosas. El paciente puede experimentar smdromes similares a gripe. Una crisis puede durar de algunas horas a muchas semanas. En esclerosis multiple, los recrudecimientos pueden caracterizar un nuevo smtoma o el empeoramiento de un smtoma existente, pero debe durar por lo menos 24 horas para ser considerado una exacerbacion real, un recrudecimiento indica nuevas lesiones que se forman en el cerebro o medula espinal que alteran la transmision neural. La mayona de recrudecimientos duran algunos dfas o semanas, pero pueden durar durante varios meses. Los efectos, por ejemplo, pueden ser: dificultades de movimiento o espasmos, desequilibrio y problemas de coordinacion; problemas de vision, movimiento de los ojos no coordinados, vision borrosa o vision doble, ceguera parcial durante un recrudecimiento; smtomas de la vejiga e intestinos; problemas sexuales, cambios en la funcion mental: perdida de memoria, poca atencion o juicio deficiente o depresion. En COPD, una exacerbacion se puede definir como “un evento en el curso natural de la enfermedad caracterizado por un cambio en la disnea de lmea base del paciente, tos, y/o esputo que esta mas alla de las variaciones diarias normales, es agudo en el inicio y puede justificar un cambio en la medicacion en un paciente con COPD subyacente”. El paciente que experimenta una exacerbacion tiene uno de los siguientes smtomas: tos y produccion de esputo incrementada, cambio en el color y/o espesor del esputo, jadeo, opresion en el pecho, fiebre. La enfermedad de Crohn o rectocolitis, un recrudecimiento es principalmente la exacerbacion de smtomas de la enfermedad de Crohn usuales: diarrea, dolor abdominal con calambres, perdida de apetito. En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria en un paciente que comprende: (a) determinar si dicho paciente esta experimentando un ataque, crisis, exacerbacion o recrudecimiento; (b) si dicho paciente experimenta un ataque, crisis, exacerbacion o recrudecimiento, administrar a dicho paciente una dosis efectiva de anticuerpo anti-TLR3.

Los anticuerpos anti-TLR3 tambien se pueden utilizar ventajosamente para tratar individuos que tienen una recafda. El termino “recafda” se refiere a la mejora o estabilizacion en los smtomas de un paciente. Una enfermedad es recidivante cuando la salud o afeccion del paciente mejora. En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria en un paciente que comprende: (a) determinar si dicho paciente esta experimentando una recafda, crisis, exacerbacion o recrudecimiento; (b) si dicho paciente experimenta una recafda, administrar a dicho paciente una dosis efectiva de anticuerpo anti-TLR3.

Opcionalmente, una etapa de evaluacion se puede llevar a cabo, que comprende evaluar la expresion de un polipeptido TLR3 en las celulas (por ejemplo, celulas pro-inflamatorias, celulas dendnticas, celulas T, etc.) de un paciente antes del tratamiento con un anticuerpo anti-TLR3. Generalmente, en esta etapa, una muestra de celulas se toma de un paciente, tipicamente como una biopsia, y se somete a prueba, por ejemplo, utilizando inmunoensayos para determinar la expresion y prominencia opcionalmente relativa del polipeptido TLR3 en las celulas. En un aspecto, una determinacion de que un paciente tiene celulas que expresan prominentemente el polipeptido TLR3 indica que el anticuerpo anti-TLR3 (y opcionalmente cualquier agente terapeutico adicional) es adecuado para dicho paciente. En una etapa adicional, el paciente luego se puede tratar con el anticuerpo anti-TLR3.

Opcionalmente, en una modalidad, una etapa de deteccion de ligando TLR3 se puede llevar a cabo, que comprende detectar la presencia de un ligando TLR3 en un paciente, antes del tratamiento con un anticuerpo anti-TLR3. Generalmente, en esta etapa, la muestra biologica se toma de un paciente, por ejemplo, una muestra de fluido sinovial, por ejemplo, en un paciente que tiene artritis reumatoide. La muestra biologica se evalua para la presencia de un ligando TLR3, tal como la presencia de ARNds extracelular. Si la muestra biologica es positiva para la presencia de un ligando TLR3, el paciente luego se puede tratar ventajosamente con el anticuerpo anti-TLR3, de manera preferente con un anticuerpo que inhibe la senalizacion TLR3 en una celula que expresa t LR3 en presencia de un ligando ARNds TLR3.

El anticuerpo anti-TLR3 administrado a un individuo que tiene una enfermedad puede ser cualquier anticuerpo monoclonal, que liga espedficamente un polipeptido TLR3, de manera preferente cualquier anticuerpo inhibe la senalizacion por el polipeptido TLR3, como se describe en la presente. Por ejemplo, el anticuerpo anti-TLR3 es un anticuerpo que liga espedficamente TLR3, en donde el anticuerpo tiene una Kd para ligarse a un polipeptido TLR3 humano de menor que 10-9M bajo condiciones acidas, y opcionalmente ademas tambien una K^dde menor que 10-9M bajo condiciones neutras.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TLR3 se utiliza como monoterapia (el unico agente terapeutico).

De acuerdo con otra modalidad, los metodos del tratamiento de esta invencion pueden comprender ademas el tratamiento de un individuo con un anticuerpo anti-TLR3 y un segundo agente terapeutico, incluyendo agentes normalmente utilizados para el proposito terapeutico particular por el cual el anticuerpo esta siendo administrado. El anticuerpo anti-TLR3 y el segundo agente terapeutico se pueden administrar separadamente, juntos o secuencialmente, o en un coctel. El segundo agente terapeutico normalmente se administrara en cantidades tfpicamente utilizadas para ese agente en una monoterapia para la enfermedad o afeccion particular que se trata. En una modalidad, el segundo agente terapeutico se administra en una dosis menor que la dosis eficaz generalmente aceptada; por ejemplo, en varias modalidades, la composicion comprende una dosificacion que es menor que aproximadamente 10% a 75% de la dosis eficaz generalmente aceptada que se administra. En una modalidad, el segundo agente terapeutico es un corticosteroide, por ejemplo, un corticosteroide seleccionado del grupo que consiste en dexametasona, hidrocortisona (Cortisol), acetato de cortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, deflazacort, betametasona, triamcinolona, beclometasona, parametasona, fluticasona, acetato de fludrocortisona, acetato de desoxicorticosterona (DOCA), fluprednisolona, propionato de fluticasona, budesonido, dipropionato de beclometasona, flunisolido y acetonido de triamcinolona. De manera preferente, el segundo agente terapeutico es un agente que reduce las enzimas proteoltticas, un mediador inflamatorio, o una citoquina proinflamatoria tal como TNF-a y/o interleucina-1 (IL-1). De manera preferente, el segundo agente terapeutico es DMARD o un DMD, opcionalmente ademas en donde el segundo agente terapeutico es metotrexato (RheumatrexMR, TrexallMR), hidroxicloroquina (PlaquenilMR), sulfasalazina (AzulfidineMR), leflunomida (AravaMR), un inhibidor del factor de necrosis tumoral (por ejemplo, etanercept (EnbrelMR, adalimumab (HumiraMR), e infliximab (RemicadeMR)), un agente de bloqueo co-estimulador de celulas T (por ejemplo, abatacept (OrenciaMR)), un agente de agotamiento de celulas B (por ejemplo, rituximab (RituxanMR)), una terapia de antagonista de interleucina-4 (IL-4) (por ejemplo, anticuerpos anti-IL4 o anticuerpos receptores anti-IL4), una terapia antagonista de interleucina-5 (IL-5) (por ejemplo, anticuerpos anti-IL5 o anticuerpos receptores anti-IL5), una terapia antagonista de interleucina-6 (IL-6) (por ejemplo, anticuerpos anti-IL6 o anticuerpos receptores anti-IL6), una terapia de antagonista de receptor de interleucina-1 (IL1) (anakinra (KineretMR)), un anticuerpo anti-BlyS (BenlystaMR), oro intramuscular, u otro agente inmunomodulador o citotoxico (por ejemplo, azatioprina (ImuranMR), ciclofosfamida, o ciclosporina A (NeoralMR, SandimmuneMR)). En una modalidad, cuando se trata la enfermedad respiratoria el segundo agente terapeutico es un inhibidor de PDE-4. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TLR3 se administra antes de la administracion del segundo agente terapeutico. Por ejemplo, un anticuerpo anti-TLR3 se puede administrar aproximadamente de 0 a 30 dfas antes de la administracion del segundo agente terapeutico. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-TLR3 se administra de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2 semanas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 semana, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas, de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 6 horas, de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 8 horas, de aproximadamente 8 horas a 1 dfa, o de aproximadamente 1 a 5 dfas antes de la administracion del segundo agente terapeutico. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TLR3 se administra concurrentemente con la administracion de los agentes terapeuticos. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TLR3 se administra despues de la administracion del segundo agente terapeutico. Por ejemplo, un anticuerpo anti-TLR3 se puede administrar aproximadamente de 0 a 30 dfas despues de la administracion del segundo agente terapeutico. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-TLR3 se administra de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2 semanas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 1 semana, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas, de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 6 horas, de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 8 horas, de aproximadamente 8 horas a 1 dfa, o de aproximadamente 1 a 5 dfas despues de la administracion del segundo agente terapeutico.

Para el uso en la administracion a un paciente, la composicion se formulara para la administracion al paciente. Las composiciones de la presente invencion se pueden administrar oralmente, parenteralmente, por rodo de inhalacion, topica, rectal, nasal, bucal, vaginalmente o a traves de un deposito implantado. Lo utilizado en la presente incluye inyeccion subcutanea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepatica, intralesional e intracraneal o tecnicas de infusion.

Los presentes anticuerpos se pueden incluir en kits. Los kits pueden contener opcionalmente ademas cualquier numero de anticuerpos y/u otros compuestos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o cualquier otro numero de anticuerpos terapeuticos y/o compuestos (por ejemplo, segundo agente(s) terapeutico). Se apreciara que esta descripcion de los contenidos de los kits no es limitante de ninguna manera. Por ejemplo, el kit puede contener otros tipos de compuestos terapeuticos. De manera preferente, los kits tambien incluyen instrucciones para utilizar los anticuerpos, por ejemplo, detallar los metodos descritos en la presente.

Aspectos y ventajas adicionales de esta invencion se divulgaran en la siguiente seccion experimental, que se debe considerar como ilustrativa y no limitante del alcance de esta solicitud.

Ejemplos

Materiales y Metodos

Materiales

Celulas de Rinon Embrionicas Humanas 293T (#CRL-1573) se adquirieron de ATCC. Anticuerpos (antfgeno, proveedor, referencia): IgG Anti-Raton de Cabra de Fragmento F(ab')2 acoplado a AP (H+L), Jackson Immunoresearch, ref. 115-056-003, IgG Fc anti-raton de cabra acoplado a PE, Beckman Coulter, IM0551 Instrumentation: citometro de flujo FACSCanto IIMR (BD Biosciences). Ligandos TLR3 (nombre, proveedor, referencia): poly(IC) HMW, InvivoGen, ref. tlrl-pic. PoliAU, tambien referido como IPH3102, es una molecula por lo menos parcialmente de doble hebra fabricada de acido(s) poliadenilico y acido(s) poliuridflico, preparado como se describe en WO2009/130616 (Innate Pharma), la divulgacion de la cual se incorpora en la presente a manera de referencia. El PoliAU fue un poliAU de peso molecular alto que tiene un Mn (tambien referido como “peso molecular promedio en numero” o “peso molecular medio”) superior a 2000 kD, un PI de 1.4 - 1.6, y estabilidad termica: 62.3-63.2°C, hipercromicidad de 53-60%. El anticuerpo 31C3 se describe en la solicitud de PCT No. WO2011/004028, la divulgacion de la cual se incorpora en la presente a manera de referencia.

Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR)

Los procedimientos General Biacore T100. Las mediciones SPR se llevaron a cabo en un aparato Biacore T100 (Biacore GE Healthcare) a 25°C. En todos los experimentos Biacore la solucion amortiguadora de HBS-EP+ o HBS-P (Biacore GE Healthcare) sirvio como solucion amortiguadora de corrida y los sensogramas se analizaron con el software de Evaluacion Biaevaluation 4.1 y Biacore T100.

Para la medicion de afinidad bivalente, a menos que se indique de otra manera, la protema TLR3-His se inmovilizo sobre un Sensor Chip CM5 (capa de dextrano carboximetilado) por acoplamiento de aminas. Los anticuerpos anti-TLR3 se diluyeron a una serie de concentraciones (0.01 to 100 nM) en la solucion amortiguadora de corrida HBSEP+ (para afinidad en pH neutro) o acetato 10mM pH5.6, NaCI 150 mM (para afinidad en pH acido), se inyecto sobre el antigeno inmovilizado durante dos minutos en una velocidad de flujo de 40 pl/min y se dejo desasociar durante 3 minutos antes de la regeneracion por una inyeccion de 5 a 30s de NaCl de 0.5m , solucion amortiguadora de NaOH de 10mM. Los sensogramas resultantes se analizaron por ajuste global utilizando el modelo apropiado.

Ensayo de reporteros de Luciferasa

Un ensayo del gen reportero que utiliza como promotor ISRE (elemento de respuesta estimulado por IFN) y como gen reportero y ajusto a la luciferasa de protema. Una lmea de celulas 293T (ATCC, #CRL-1573) se transfecto establemente con plasmido pISRE-luc (#219089 - Stratagene), seleccionado adicionalmente mediante clonacion como ya que induce la respuesta optima a la estimulacion de IFN-alfa y es referido como un 293T-ISRE de control. Esta lmea de celulas se transfecto establemente ademas con el plasmido pUNO-humanoTLR3 (#puno-htlr3 -InVivogen) y es referido como 293T-TLR3-ISRE.

El ensayo de eficacia se llevo a cabo como se describe: en el dfa 0, las celulas se sembraron a 4x105 celulas/mL en medio de cultivo completo en una placa de cultivo de 96 pocillos (100pl/pocillo). Las celulas primero se incubaron a 37°C durante 20 horas, luego 50 pL del medio se descarto y las celulas se activaron con 25 pl/pocillo final de cantidades fijas de poliAU junto con concentraciones de incremento de anticuerpos anti-TLR3. Las celulas incubadas con medios resientes se utilizaron como la actividad de luciferasa de fondo (50pl/pocillo). Las celulas se incubaron a 37°C durante 6 horas. 100 pL de Steady Glo recientemente descongelado (Promega) se agregaron a cada pocillo, las placas se incubaron 10 min a RT en la oscuridad y la luz emitida en cada pocillo se cuantifico como Count Per Second (CPS) en un aparato contador gama (TopCount).

Generacion de constructos TLR3 mutantes K145E, D116R, K182E, N196A y E171A

La generacion de los mutantes TLR3 K145E, D116R, K182E, N196A y E171A se llevo a cabo utilizando el kit de mutagenesis dirigida al sitio QuikChangeMR de Stratagene de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los oligonucleotidos utilizados se listan en la Tabla 4A. La mutagenesis se llevo a cabo en el TLR3 humano de tipo natural insertado en un vector pcADN3.1. Despues de la secuenciacion, los vectores que contienen las secuencias mutadas se prepararon como Maxiprep utilizando el Sistema Maxiprep de Plasmidos Promega PureYieldMR. Los vectores luego se utilizaron para la transfeccion de celulas HEK-293T utilizando Lipofectamina 2000 de Invitrogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Generacion de los constructos TLR3 mutantes N-terminal 1-19

La generacion de los mutantes TLR3 (constructos V5-TLR3-CD32) se generaron por PCR (ver Tabla 4B a continuacion). Todos los cebadores Mx-R se utilizaron con el siguiente cebador 5' ACCCAAGCTGGCTAGCATGAGACAGACTTTGCCTTG (SEQ ID NO: 121). Todos los cebadores Mx-F se utilizaron con el siguiente cebador 3' AGCACAGTGGCGGCCGCTTAGTTATTACTGTTGACATGG (SEQ ID NO: 122). Las secuencias amplificadas se ejecutaron en un gel de agarosa luego se purificaron utilizando el kit de Extraccion del Gel Qiagen. Los dos productos de PCR generados para cada mutante luego se ligaron en un vector pcADN3.1, se digirieron con la enzima de restriccion Nhel y Notl, con el sistema InFusion (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Despues de la secuenciacion, los vectores que contienen las secuencias mutadas se prepararon como Maxiprep utilizando el Sistema Maxiprep de Plasmido Promega PureYieldMR Los vectores luego se utilizaron para la transfeccion de celulas HEK-293T utilizando Lipofectamina 2000 de Invitrogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Generacion de constructos de superficie celular TLR3

La secuencia TLR3 de tipo natural o mutante madura se fusiono a la transmembrana CD32 y los dominios intracelulares como se describe por De Bouteiller y colaboradores (2005) J. Biol. Chem. 280(46): 38133-38145. Una primera ronda de PCR se llevo a cabo para introducir una etiqueta V5 en la posicion N-terminal de la protema de fusion TLR3-CD32 y una segunda ronda - utilizando la primera PCR como una plantilla - para introducir el peptido lfder TLR3 en el constructo. Los cebadores usados para estas etapas se resumieron en la siguiente tabla (Tabla 5). El producto de PCR se clono en TA en el vector pGEMTeasy para secuenciacion y se clono finalmente en el vector pcADN3.1 utilizando los sitios de restriccion Nhel y Notl.

Titulacion en las celulas que expresan TLR3+ en su superficie

La lmea de celulas HEK293T se transfecto transitoriamente con el constructo TLR3 ECD-CD32 de tipo natural o mutante utilizando lipofectamina 2000 y se tineron durante 30 minutos a 4°C con un intervalo de dosis de 11E1 o 31C3 Los mAbs ligados se revelaron por la adicion de un anticuerpo IgG Fc anti-raton de cabra acoplado con PE durante 20 minutos adicionales a 4°C. Despues de dos ciclos de lavado, la celula MFI se analizo en un citometro FACS Canto II. Con el objetivo de estudiar el efecto del pH en la afinidad del mAb, la tincion se llevo a cabo en solucion amortiguadora de tincion (0.2% de BSA, EDTA 2mM, 0.02% de Azoture de Sodio) pH7.4 o en solucion amortiguadora de tincion de acido cftrico-acidificada pH 5.6.

EJEMPLO 1 - GENERACION DE ANTICUERPOS ANTI-HUMANOS DE RATON Y RATA MONOCLONALES ESPECfFICOS DE TLR3

Se llevo a cabo una serie de inmunizaciones a fin de generar diferentes anticuerpos que bloquean el TLR3 humano con eficacia mejorada sobre los anticuerpos previos. Las clasificaciones primarias y secundarias fueron como sigue. Inmunizacion #1.

Clasificacion primaria. Para obtener anticuerpos TLR3 anti-humanos, ratones Balb/c (3 animales) se inmunizaron con una protema recombinante de dominio extracelular TLR3 etiquetada con His humana recombinante (R&D systems, #1487-TR-050). Los ratones se inmunizaron, las celulas del bazo se fusionaron y se cultivaron en presencia de celulas de bazo irradiadas. Los ratones recibieron una primo-inmunizacion con una emulsion de 50 |jg de protema TLR3 y Adyuvante de Freund Completo, intraperitonealmente, una 2nda inmunizacion con una emulsion de 50 jg de protema TLR3 y Adyuvante de Freund Incompleto, intraperitonealmente, y un refuerzo con 10 jg de protema TLR3, intravenosamente. Los hibridomas se colocaron en placas en placas de cultivo y los sobrenadantes (SN) se evaluaron en una primera clasificacion para la ligacion de TLR3 utilizando un ELISA desarrollado para la deteccion de la ligacion a TLR3. Brevemente, la protema TLR3 recombinante etiquetada con His (R&D systems, #1487-TR) se recubrio en placas ELISA MaxisorpMR (Nunc). El sobrenadante de las placas de cultivo de hibridoma se recolectaron y se incubaron sobre placas de ELISA en presencia de un anticuerpo anti-TLR3 que inhibe TLR3 y se liga dentro de la porcion C-terminal, y la presencia de la Ig de ligacion a TLR3 se revelo con IgG Anti-Raton de Cabra de fragmento F(ab')2 acoplado a AP (H+L). 358 hibridomas de 3840 se seleccionaron para clasificacion secundaria.

Clasificacion secundaria; seleccion de hibridomas de interes. 358 sobrenadantes se retuvieron y se sometieron a prueba en una clasificacion adicional por tincion de FACS utilizando un TLR3 mutado con D116R que expresan transcientemente la lmea de celulas 293T para identificar los anticuerpos que no pierden la ligacion al TLR3 mutante en la posicion de aminoacidos 116. 151 hibridomas en 358 no perdieron la ligacion a D116R. La actividad antagonista de los hibridomas tambien se sometio a prueba en un ensayo reportero de gen de ISRE-luciferasa en celulas 293T-huTLR3. Los pocillos de los sobrenadantes que tienen un efecto inhibidor superior a 60% se seleccionaron para clonacion adicional. 28 hibridomas tuvieron actividad antagonista y 25 clones tuvieron tanto actividad antagonista como ligacion a D116R.

Clonacion de hibridomas de interes potencial. Los hibridomas potencialmente de interes de la clasificacion inicial se clonaron al limitar las tecnicas de dilucion en placas de 96 pocillos, y los clones se sometieron a prueba en la misma serie de clasificaciones secundarias como para los hibridomas. Los clones de 13 hibridomas tuvieron tanto actividad antagonista como ligacion a D116R.

Con el objetivo de comparar estos 13 hibridomas a los mAbs anti-TLR3 de referencia de los inventores (notablemente 31C3), los 13 hibridomas se amplificaron y sus sobrenadantes se purificaron. Los mAbs purificados se sometieron a prueba en un ensayo de gen-reportero. Los hibridomas se seleccionaron para caracterizacion adicional basado en la eficiencia del bloqueo de la senalizacion TLR3 en comparacion con los mAbs anti-TLR3 de referencia.

2 hibridomas se evaluaron adicionalmente para la ligacion de epftopos al TLR3 K145E y K182E mutantes (ver tambien Ejemplo 6). Ambos anticuerpos no mostraron ninguna perdida de ligacion a la variante K145E de TLR3 pero uno de ellos mostro perdida en la ligacion al mutante K182E. Clon 11E1 se ligo a TLR3 aun en presencia de la mutacion K145E o K182E.

Inmunizacion #2.

Ratas LOU/c se inmunizaron con TLR3 humano etiquetado con His recombinante, protema recombinante de dominio extracelular sin portador (R&D systems, #1487-TR). Las ratas recibieron, en el dfa 0, una primo-inmunizacion con una emulsion de 50 |jg de TLR3 humano diluido en PBS y Adyuvante de Freund Completo, intraperitonealmente, una 2nda inmunizacion en el dfa 14 con una emulsion de 50 jg de TLR3 humano diluido en PBS y Adyuvante de Freund Incompleto, intraperitonealmente, y un refuerzo con 25 jg de TLR3 humano diluido en PBS, intravenosamente. Celulas del bazo inmunes se fusionaron con celulas B inmortalizadas X63.Ag8.653, y se cultivaron en presencia de celulas del bazo irradiadas.

La clasificacion secundaria se llevo a cabo como en la inmunizacion #1, en lo anterior. Los hibridomas potencialmente de interes se clonaron mediante tecnicas de dilucion limitante en placas de 96 pocillos, y los clones se sometieron a prueba en la misma serie de clasificaciones secundarias como para los hibridomas. Con el objetivo de comparar los hibridomas a los mAbs anti-TLR3 de referencia de los inventores, los hibridomas se amplificaron y sus sobrenadantes se purificaron. Los mAbs purificados se sometieron a prueba en un ensayo de gen-reportero. Los hibridomas se seleccionaron para caracterizacion adicional basado en la eficiencia del bloqueo de la senalizacion TLR3 en comparacion con los mAbs anti-TLR3 de referencia 31C3. Los hibridomas se evaluaron adicionalmente para la ligacion al epftopo a los polipeptidos TLR3 mutantes que tienen K145E y K182E. Los clones 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7 se ligaron a TLR3 aun en presencia de la mutacion K145E o K182E.

EJEMPLO 2 - GENERACION DE ANTICUERPOS ANTI-RATON DE RATA MONOCLONAL ESPEdFICOS DE TLR3

Clasificacion primaria. Para obtener los anticuerpos anti-TLR3, ratas LOU/c se inmunizaron con un TLR3 de raton etiquetado con His recombinante, protema recombinante de dominio extracelular sin portador (R&D systems, #3005-TR) y TLR3 humano etiquetado con His recombinante, protema recombinante de dominio extracelular sin portador (R&D systems, #1487-TR). Las ratas recibieron, en el dfa 0, una primo-inmunizacion con una emulsion de 50 jg de TLR3 de raton 50 jg de TLR3 humano diluido en PBS y Adyuvante de Freund Completo, intraperitonealmente, una 2nda inmunizacion en el dfa 14 con una emulsion de 50 jg de TLR3 de raton 50 jg de TLR3 humano diluido en PBS y Adyuvante de Freund Incompleto, intraperitonealmente, y un refuerzo con 25 jg de TLR3 de raton 25 jg de TLR3 humano diluido en PBS, intravenosamente. Las celulas del bazo inmunes se fusionaron con celulas B inmortalizadas X63.Ag8.653, y se cultivaron en presencia de celulas del bazo irradiadas.

40 placas de cultivo se obtuvieron y se evaluaron en una primera clasificacion para la ligacion a TLR3 de raton utilizando un ELISA desarrollado para la deteccion de la ligacion a TLR3. Brevemente, la protema TLR3 de raton recombinante etiquetada con His (R&D systems, #1487-TR-050) se recubrio en placas de 96 pocillos Ni-NTA (Qiagen). El sobrenadante (SN) de las placas de cultivo de hibridoma se incubaron en las placas TLR3, y la presencia de Ig de ligacion a TLR3 se revelo con la IgG-HRP F(ab) anti-raton de cabra.

Clasificacion secundaria: seleccion de hibridomas de interes. 181 sobrenadantes se retuvieron y se sometieron a prueba en una clasificacion adicional en una prueba de inhibicion en celulas 293T-mTLR3. Los pocillos de los sobrenadantes que tienen un efecto inhibidor superior a 95% se seleccionaron para clonacion adicional al limitar la dilucion.

La clonacion de hibridomas de interes potencial. 27 hibridomas potencialmente interesantes seleccionados de la clasificacion inicial se clonaron al limitar las tecnicas de dilucion en placas de 96 pocillos, y 370 subclones se evaluaron en una clasificacion para la ligacion a TLR3 de raton utilizando un ELISA como lo anterior. Los 178 clones positivos se sometieron a prueba en una clasificacion adicional en una prueba de inhibicion en las celulas 293T-TLR3 como en lo anterior. Entre ellas estuvo el sobrenadante del pocillo G7 de la placa 28 (28G7).

EJEMPLO 3 - LIGACION AL TLR3 DE SUPERFICIE CELULAR

Para investigar la posibilidad de que el TLR3 se cicla a la superficie celular y que el TLR3 de superficie celular contribuye a la internalizacion y eficacia de los anticuerpos anti-TLR3 inhibidores, la ligacion al TLR3 de superficie celular se sometio a prueba, en comparacion con el anticuerpo de referencia 31C3. Adicionalmente, la ligacion (por ejemplo, afinidad) al TLR3 de superficie celular en pH neutro puede diferir de aquel del TLR3 endosomicamente expresado en pH acido. Los anticuerpos se sometieron a prueba para la ligacion a las celulas que expresan TLR3 humano solamente en la superficie celular (celulas 293T que expresan TLR3/CD32), en condiciones de pH neutros puestos que el pH podna afectar potencialmente la conformacion de TLR3. Los resultados para el pH neutro se muestran en las Figuras 1A, 1B, 1C y 1D para los anticuerpos 11E1, 7G11, 32C4 y 31F6, respectivamente. Los valores EC50 se muestran en la Tabla 6. Los anticuerpos 11E1, 7G11, 31F6 y 32C4 tuvieron cada uno ligacion potente al TLR3 humano expresado sobre la superficie en pH neutro. La afinidad de los anticuerpos para TLR3 fue mas potente que el anticuerpo de referencia 31C3 en pH neutro.

EJEMPLO 4 - AFINIDAD BIVALENTE EN PH ENDOSOMICO Y NEUTRO

Las propiedades de ligacion del anticuerpo 11E1 se determinaron utilizando los metodos descritos para SPR, artfculo c). La ligacion a TLR3 en condiciones neutras (pH 7.2) y acidas (pH 5.6), y valores Kd se calcularon. En pH neutro, 11E1 mostro afinidad bivalente potente (K^d) para el TLR3 humano recombinante (K^dmedia (M) en pH 7.2 de 8.75 * 10-11). La afinidad de ligacion en pH 5.6 de alguna manera fue menor para el anticuerpo 11E1 que la afinidad en pH 7.2, ay que la K^dmedia (M) en pH 5.6 fue 1 * 10-9).

Similarmente, la ligacion de los anticuerpos TLR3 anti-raton al TLR3 de raton se determino en condiciones neutras (pH 7.2) y acidas (pH 5.6), y los valores Kd se calcularon. En pH neutro y acido, pH, mAb 32D4, 28G7 y 13D1 mostraron afinidad bivalente potente y similar (K^d) para TLR3 de raton recombinante mejor que 500 picomolar. La afinidad (media de 2 o 3 experimentos) de mAb 28G7 fue 7.05 * 10-13 en pH neutro (K^dmedia (M) en pH 7.2) y 1.26 * 10-13 en pH acido (K^dmedia (M) en pH 5.6).

EJEMPLO 5 - ENSAYO REPORTERO HUMANO

Los anticuerpos se sometieron a prueba para la inhibicion de la senalizacion TLR3 en una actividad de gen reportero basado en luciferasa (293T-TLR3-ISRE). El acoplamiento del receptor TLR3 utilizando agonistas TLR3 tal como poli (I:C) se ha reportado para activar la ruta de tipo IFN que incluye el promotor ISRE (Wietek y colaboradores J. Biol. Chem., 278 (51), p50923, 2003). Brevemente, los agonistas ARNds TLR3 se utilizaron para inducir la senalizacion TLR3 en el ensayo reportero en presencia de anticuerpos anti-TLR3, y la senalizacion TLR3 se evaluo. Los anticuerpos 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7 fueron mas potentes en este ensayo que el anticuerpo 31C3. Los resultados mostrados en las Figuras 2A, 2B, 2C, 2D y 2E para los anticuerpos 11E1, 7G11, 32C4, 31F6 y 37B7, respectivamente, que muestran inhibicion dependiente de dosis de la senalizacion TLR3 utilizando un ensayo de luciferasa TLR3 humano 293T con los anticuerpos anti-TLR3 humanos. Cada anticuerpo se compara con el anticuerpo de referencia 31C3.

Similarmente, los anticuerpos TLR3 anti-raton de rata se evaluaron similarmente en experimentos separados por su capacidad de inhibir la senalizacion TLR3 en una actividad de gen reportero basado en luciferasa TLR3 de murino (293T-mTLR3-ISRE). El anticuerpo 28G7 mostro inhibicion dependiente de dosis de la senalizacion TLR3 con una IC50 de 2.6 pg/ml.

EJEMPLO 6 - MAPEO DE EPfTOPOS

El mapeo de epftopos en pH. Los ensayos de competicion se condujeron por el ensayo FACS en celulas HEK293T-WT t Lr3 ECD /c D32. Los anticuerpos 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7 compitieron con el anticuerpo previamente obtenido 31C3 para la ligacion a TLR3 puesto que la ligacion por un anticuerpo deterioro la ligacion a TLR3 del otro anticuerpo. El anticuerpo 31C3 se liga por lo menos en parte a una region de TLR3 que corresponde a los residuos 102 a 204 del polipeptido TLR3 maduro (particularmente residuos 174 a 191 y residuo 182) y compiten entre sf para la ligacion al TLR3 humano. Los anticuerpos 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7 compitieron cada uno con 31C3, pero el grado de competicion vano, sugiriendo que los epftopos de 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7 estuvieron en la misma region, pero teniendo diferencias entre sf El anticuerpo 11E1 compitio con cada uno de los anticuerpos 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7. Basado en los perfiles de competicion entre los anticuerpos 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7 y el anticuerpo 31C3, por lo menos tres contenedores de epftopos diferentes se determinaron puesto que por lo menos 11E1, 37B7 parecieron diferir entre sf y de 7G11, 31F6, 32C4.

EJEMPLO 7 - MAPEO DE EPfTOPOS POR LIGACION A LOS MUTANTES TLR3

Los anticuerpos 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7 compiten para la ligacion a TLR3 con el anticuerpo 31C3. El 31C3 se ha determinado que se liga dentro del extremo N-terminal del TLR3 humano, teniendo un epftopo principal del anticuerpo que incluye el residuo 182 pero no los residuos K145, D116, K182, E171 o N196. Los anticuerpos 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7 se sometieron a prueba por lo tanto para la ligacion a los mutantes TLR3. Los polipeptidos mutantes TLR3 que tienen mutaciones K145E, D116R, K182E, N196A y E171A (referencia a SEQ ID NO: 1) se prepararon como se describe en la presente en los Materiales y Metodos y la tincion del anticuerpo anti-TLR3 a las celulas que expresan polipeptidos mutantes TLR3 se evaluaron por FACS. Los anticuerpos 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7 no mostraron ninguna perdida de ligacion al TLR3 de tipo natural (WT) no mutado ni a cualquiera de K145E, D116R, E171A, K182E o N196A. El epftopo principal de los anticuerpos 11E1, 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7 mientras se situo en la region N-terminal por lo tanto no incluyo los residuos K145, D116, K182, E171 o N196.

Los anticuerpos despues se sometieron a prueba para la ligacion al conjunto adicional de mutantes en la porcion N-terminal de TLR3 para identificar nuevos epftopos. Los anticuerpos por lo tanto se sometieron a prueba para determinar la ligacion a los mutantes TLR3. Los polipeptidos mutantes TLR3 que tienen mutaciones en las posiciones Q44H y V45I, R64Q y R65Q, T86S y K89Q, K97I y M100L, K117Q y A120V, Q136H, N140S, V144K y K145N, K147A, K163A, Q167G, Q184L y K187R, Q184L y K187Q, D192E yA195G, Q208P y I209L, H218Q, A219T, G234N y S236H, L243W y A246S, S112A, Q113S, y S115A, y K137S y K139A (referencia a SEQ ID NO: 1) se prepararon como se describe en la presente en los Materiales y Metodos y la tincion del anticuerpo anti-TLR3 a las celulas que expresan polipeptidos mutantes TLR3 se evaluo por FACS. El anticuerpo 11E1 mostro perdida de ligacion a los mutantes que tienen las sustituciones R64Q y R65Q, y a menor grado posiblemente los mutantes adyacentes T86S y K89Q. Los anticuerpos 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7 mostraron perdida de ligacion a los mutantes que tienen las sustituciones K117Q y A120V pero no a cualquiera de los otros mutantes. Los anticuerpos 11E1 y 37B7 mostraron perdida completa de ligacion a los mutantes que tienen las sustituciones K137S y K139A, mientras que los anticuerpos 7G11, 31F6 y 32C4 mostraron perdida parcial de ligacion a los mutantes que tienen las sustituciones K137S y K139A. Adicionalmente, todos los anticuerpos 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7 mostraron perdida completa de ligacion a los mutantes que tienen las sustituciones S112, Q113 y S115. Los anticuerpos 11E1 y 31C3 no mostraron perdida de ligacion a los mutantes que tienen las sustituciones S112, Q113, y S115. El epftopo principal del anticuerpo 11E1 incluye por lo tanto los residuos R64 y R65 y posiblemente (a menor grado) los residuos adyacentes T86 y K89, asf como los residuos K137 y K139. El epftopo principal de los anticuerpos 7G11, 31F6, 32C4 y 37B7 incluye por lo tanto los residuos K117 y/o A120, asf como S112, Q113 y/o S115. Adicionalmente, para el anticuerpo 37B7 el epftopo principal incluye ademas los residuos K137 y K139 mientras que para los anticuerpos 7G11, 31F6 y 32C4 los residuos K137 y K139 tambien pueden estar dentro del epftopo. Los residuos R64Q y R65Q en particular estan dentro de la region de ligacion a ARNds N-terminal en la superficie lateral sin glicano de TLR3 y los residuos K117 y A120 aunque parcialmente en la cadena principal de la molecula TLR3, estan adyacentes a la region de ligacion a ARNds N-terminal. Los residuos expuestos en la superficie adyacentes a estos residuos mutados pueden tambien contribuir a los epftopos de los anticuerpos, incluyendo por ejemplo, residuos 41, 43, 60, 61, 62, 64, 65, 67, 68, 88, 91, 92, 93, 96, 97, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 121, 132, 134, 137 y/o 139 (referencia a SEQ ID NO: 1) situados en la superficie de TLR3 en la region de la region de ligacion a ARNds N-terminal. Los anticuerpos pueden como tales competir con la ligacion de ARNds a TLR3. Los anticuerpos pueden ligarse dentro y/o adyacentes al sitio de ligacion a ARNds N-terminal, incluyendo los residuos de expansion opcionalmente adicionales en la cadena principal de la protema TLR3.

Las Figuras 2F, 2G, y 2H muestran la vista del extremo N-terminal del polipeptido TLR3, que muestra los residuos de aminoacidos mutados indicados en negro (Q44, V45, R64, R65, T86, k89, K97, M100, K117, A120, Q136, N140, V144, K145, K147, K163, Q167, Q184, K187, Q184, K187, D192, A195, Q208, I209, H218, A219, G234 y S236, L243 y A246). Tambien se muestran en gris los residuos adyacentes a los residuos 86, 89, 117 y 120 (residuos 41, 43, 60, 61, 62, 67, 68, 88, 91, 92, 93, 96, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 121, 132, 134, 137 y 139); tales residuos adyacentes tambien se pueden ligar por los anticuerpos indicados. La Figura 2F muestra una vista de la superficie lateral sin glicano del polipeptido TLR3; la Figura 2G muestra una vista de la superficie lateral que contiene glicano del polipeptido TLR3 y la cadena principal, con el extremo N-terminal del polipeptido TLR3 en el primer plano (a la izquierda de la imagen). La Figura 2H muestra una vista de la superficie lateral sin glicano del polipeptido TLR3 y la cadena principal, con el extremo N-terminal del polipeptido TLR3 en primer plano (a la derecha de la imagen).

EJEMPLO 8 - MODELO DE EFICACIA IN VIVO PARA EL TRATAMIENTO DEL AJUSTE PREVENTIVO RA Brevemente, 20 ratones se inmunizaron en el dfa 0 con 100|jg de colageno emulsionado en CFA complementado con Mycocbater tuberculosis (2mg/ml) y se inyectaron intradermicamente (ID) en la base de la cola. En el dfa 17, los animales se clasificaron (signos clmicos a menudo aparecen antes del refuerzo), se eligieron al azar en 2 grupos de 8 o 9 ratones de acuerdo con la suma del registro clmico de las 4 extremidades y se trataron. En los dfas 21, la inmunizacion de colageno se reforzo por la administracion ID de colagenos solo (1o0jg en 50jl).

Se constituyeron los siguientes grupos:

-grupo 1 (PBS, n=9): tratados con 200jl dos veces / semana IP

-grupo 2 (28G7, n=8): tratados con 500jg/ratones dos veces / semana IP

El registro de las cuatro extremidades del animal se evaluo tres veces a la semana durante 3 a 4 semanas. El registro se evaluo de acuerdo con la Tabla 7.

Los resultados se reportan en la Figura 3A. El presente experimento indica que los anticuerpos anti-TLR3 son estadfsticamente eficaces (* p>0.05, ** p>0.005, en la prueba de Dunnett) en el tratamiento curativo de Artritis Reumatoide (RA) en comparacion con PBS.

EJEMPLO 9 - MODELO DE EFICACIA IN VIVO PARA EL TRATAMIENTO DEL AJUSTE CURATIVO RA Experimento #1: 28G7, PBS, MTX

Brevemente, 30 ratones se inmunizaron en el dfa 0 con inyeccion intradermica de 100jg de colageno emulsionado en CFA complementado con Mycobater tuberculosis (2mg/ml) en la base de la cola. 21 dfas despues, la inmunizacion de colageno se reforzo por la administracion ID de colageno solo (100jg en 50jl/raton). En el dfa 24, los animales se eligieron al azar en 3 grupos de 10 ratones de acuerdo con la suma del registro clmico de las 4 extremidades y el tratamiento comenzo.

Grupo 1 (PBS, n=10): tratado con 200jl dos veces / semana IP.

Grupo 2 (Metotrexato - MTX, n=10): tratado con 2.5 mg/kg dos veces / semana IP.

Grupo 3 (28G7, n=10): tratado con 500jg/raton dos veces / semana IP.

El registro de las cuatro extremidades de los animales se evaluo tres veces a la semana durante 3 a 4 semanas. El registro se evaluo de acuerdo con la Tabla 7.

Los resultados se reportan en la Figura 3B. El presente experimento indica que los anticuerpos anti-TLR3 son estadfsticamente efectivos en el tratamiento de una Artritis Reumatoide establecida (RA) en comparacion con PBS y Metotrexato (* p>0.05, en la prueba de Dunnett). MTS que tiene un mecanismo diferente de accion que el anticuerpo anti-TLR3, una combinacion de los dos farmacos podna ser benefica.

Experimento #2: 28G7, PBS, anti-TNFa HumiraMR

Brevemente, 35 ratones se inmunizaron en el d^ a 0 con inyeccion intradermica de 100jg de colageno emulsionado en CFA complementado con Mycobater tuberculosis (2mg/ml) en la base de la cola. 21 dfas despues, la inmunizacion de colageno se reforzo por la administracion ID de colageno solo (100|jg en 50jl/raton). En el dfa 24, los animales se eligieron al azar en 4 grupos de acuerdo con la suma del registro clmico de las 4 extremidades y el tratamiento comenzo.

Grupo 1 (PBS, n=9): tratado con 200jl dos veces / semana IP.

Grupo 2 (control Ig anticuerpo, n=9): tratado con 500jl dos veces / semana IP.

Grupo 3 (28G7, n=9): tratado con 500jg/raton dos veces / semana IP.

Grupo 4 (HumiraMR, n=6): tratado con 100jl dos veces / semana IP.

Los resultados se reportan en la Figura 3C. El presente experimento indica que los anticuerpos anti-TLR3 son eficaces en el tratamiento de una Artritis Reumatoide establecida (RA) en comparacion con PBS y el anticuerpo anti-TNFa HumiraMR. El anti-TNFa que tiene un mecanismo diferente de accion que el anticuerpo anti-TLR3, una combinacion de los dos farmacos podna ser benefico.

EJEMPLO 10 - MODELO DE EFICACIA IN VIVO PARA EL TRATAMIENTO DE COLITIS

Cuatro grupos de 10 ratones machos (Balb/c) se utilizaron para el modelo de colitis inducida por TNBS y un grupo extra de 8 ratones sin colitis se evaluo como control (sin dosificacion, instilacion intracolonica de solucion salina). Los grupos tratados se dividieron como sigue:

Grupo 1: 10 ratones recibieron anticuerpo 28G7 (ip, 500jg/raton).

Grupo 2: 10 ratones recibieron una administracion de anticuerpo relevante de TLR3 (ip, 500jg/raton).

Grupo 3: 10 ratones recibieron el anticuerpo TNF anti-raton de rata (ip, 15mg/kg, HumiramR).

Grupo 4: 10 ratones recibieron un PBS (ip, 200jg/raton).

Una hora despues en las inyecciones, la colitis se indujo por instilacion intracolonica de acido 2, 4, 6-trinitrobenzensulfonico (TNBS) (2 mg/raton en 40% de etanol de TNBS) en ratones Balb/C machos (de 5 a 6 semanas de edad). En los grupos 1, 2 y 3, otra inyeccion de ya sea 28G7 o anticuerpo no de TLR3 relevante o el anticuerpo anti-TNF se repitio 72 horas despues de la primera inyeccion de anticuerpos.

Para todos los grupos, varios parametros de la progresion de la enfermedad se evaluaron diariamente: peso corporal, presencia de sangre en las heces, presencia y gravedad de diarrea. Todos los animales se sacrificaron para la recoleccion de tejidos siete dfas despues de la induccion de colitis. El registro del dano macroscopico, espesor de pared y actividad de mieloperoxidasa (mdice de infiltracion de granulocitos), se midieron en los tejidos colonicos. El registro del dano macroscopico se evalua al observar la sangre fecal, diarrea, hemorragia, lesion, mucosidad, eritema, edema, ulcera y constriccion.

La Figura 4 muestra los resultados del experimento. La Figura 4A muestra las mediciones del espesor de la pared para los ratones tratados con solucion salina (puntos negros), con TNBS solamente (cuadros negros) con un anticuerpo anti-TNFa y TNBS (triangulos negros), con 28G7 y TNBS (puntos abiertos), y con un Ab de control y TNBS (cuadros abiertos). La Figura 4B muestra el registro de dano macroscopico para los ratones tratados con solucion salina (puntos negros), con TNBS solamente (cuadros negros) con un anticuerpo anti-TNFa y TNBS (triangulos negros), con 28G7 y TNBS (puntos abiertos), y con un Ab de control y TNBS (cuadros abiertos).

EJEMPLO 11 - MODELO DE EFICACIA IN VIVO PARA EL TRATAMIENTO DE COPD (ENFERMEDAD PULMONAR OBSTRUCTIVA CRONICA)

A. Estudio de un solo agente

Tres grupos de 10 ratones macho se trataron como sigue:

-1 grupo de 10 ratones con un vehfculo.

-1 grupo de 10 ratones con la administracion del anticuerpo TLR328G7 anti-raton (i.p., 500|jg/por raton) en los d^as 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24.

- 1 grupo de 10 ratones con roflumilast de control positivo (aprobado como DaxasMR; antagonista de PDE-4) (oral, 15mg/kg, cinco veces a la semana).

Todos los ratones se trataron en los dfas 0, 7, 14 y 21 con Elastina y LPS (i.n.), para inducir COPD. En el dfa 28 los ratones se sacrificaron para analisis.

Los infiltrados celulares en las vfas areas se midieron por el analisis del fluido del lavado broncoalveolar (BAL) por el conteo de celulas diferenciales en el dfa 28. La oxigenacion de la sangre venosa se midio por gasometna en el dfa 28. El nivel de los mediadores inflamatorios en BALF, a traves del analisis para los niveles de protemas de TNF-alfa, IL-6, IL-17A e IP-10 se llevo a cabo por ensayos multiplex. Los resultados se muestran en la Figura 5. Las Figuras muestran que los anticuerpos anti-TLR3 fueron sumamente efectivos en tratar COPD, incluyendo en la diminucion de la infiltracion de la via area de neutrofilos, saturacion de oxfgeno de sangre venosa y citoquinas pro-inflamatorias. El analisis estadfstico se llevo a cabo en todos los datos utilizando una prueba t de Student: '*' p<0.05; '**' p<0.005; '***'p<0.0005.

La Figura 5A muestra los conteos de celulas diferenciales BAL para macrofagos, eosinofilos, neutrofilos y linfocitos. Los anticuerpos anti-TLR3 disminuyeron en gran medida la infiltracion de los neutrofilos en las vfas aereas, mientras que no afectan sustancialmente los macrofagos eosinofilos o linfocitos. COPD es mediado principalmente por los neutrofilos antes que los macrofagos o eosinofilos (ni linfocitos, utilizados en la presente como un control).

La Figura 5B muestra el oxfgeno saturado de sangre venosa (en porciento) para cada una de LPS/elastasa sola y LPS/elastasa en combinacion con anticuerpos anti-TLR3 o roflumilast. El porcentaje de saturacion del oxfgeno en la sangre arterial se disminuye en los pacientes con COPD comparados con los individuos sanos, mientras que la saturacion de sangre venosa en el oxfgeno se incrementa en los pacientes con COPD comparados con los individuos sanos. Una disminucion en el porcentaje de O2 en la sangre venosa por lo tanto es un indicador importante de una respuesta favorable en el tratamiento de la enfermedad (ver O'Connor y colaboradores Respiration 2011; 81:18-25). Se puede observar que los anticuerpos anti-TLR3 disminuyeron el porcentaje de O2 sustancialmente en sangre venosa, aunque tanto como el roflumilast. Los anticuerpos anti-TLR3 por lo tanto son efectivos en tratar COPD. En la practica medica, el analisis de gas de sangre arterial (ABG) se utiliza tanto en el ajuste agudo y para evaluar el estado del intercambio de gas del paciente durante penodos de estabilidad clmica. El analisis de gas de sangre, incluyendo el analisis ABG por lo tanto puede ser una herramienta particularmente util para evaluar si los pacientes son adecuados para el tratamiento con anticuerpos anti-TLR3 y para evaluar o monitorear si el tratamiento con los anticuerpos anti-TLR3 es efectivo, durante una fase aguda o una fase de estabilidad clmica.

La Figura 5C muestra la IL17A en el fluido BAL (BALF). Los anticuerpos anti-TLR3 disminuyeron IL17A (pg/ml) sustancialmente, y tanto como el roflumilast. La Figura 5D muestra lP-10 en BALF. Los anticuerpos anti-TLR3 disminuyeron IP-10 (pg/ml) sustancialmente.

B. Estudio de combinacion de farmaco

Cuatro grupos de ratones se trataron como sigue:

-1 grupo de ratones con un vetnculo (PBS, i.p., dos veces a la semana).

-1 grupo de ratones con la administracion del anticuerpo TLR328G7 anti-raton (i.p., 500jg/por raton, dos veces a la semana).

-1 grupo de ratones con el roflumilast de control positivo (aprobado como DaxasMR; antagonista de PDE-4) (3 mg/kg, oral, cinco veces a la semana).

- 1 grupo de ratones con tanto roflumilast como el anticuerpo 28G7, cada agente de acuerdo con el programa utilizado como un solo agente.

Todos los ratones se trataron con Elastina y LPS (i.n.), para inducir COPD y se sacrificaron como en el Estudio A. Los infiltrados celulares en las vfas aereas se midieron por el analisis del fluido del lavado broncoalveolar (BAL) por el conteo de celulas diferenciales en el estudio A.

La Figura 5E muestra los conteos de celulas diferenciales BAL para macrofagos, neutrofilos y linfocitos. Los anticuerpos anti-TLR3 disminuyen en gran medida la infiltracion de neutrofilos en las vfas aereas, y se observo tambien disminucion en los macrofagos y linfocitos. El COPD es mediado principalmente por neutrofilos antes que macrofagos o eosinofilos (ni linfocitos, utilizados en la presente como control). El roflumilast tambien provoco infiltracion disminuida de neutrofilos en las vfas aereas, junto con disminuciones en los macrofagos. De manera interesante, la combinacion de anticuerpos anti-TLR3 y roflumilast provoco infiltracion disminuida de neutrofilos en las vfas aereas sustancialmente a nivel observado en los ratones de tipo silvestre, una disminucion muy por aquella que se observo por cualquier agente solo.

EJEMPLO 12 - MODELO DE EFICACIA IN VIVO PARA EL TRATAMIENTO DE SEPSIS - LIGADURA Y PUNCION CECAL (CLP) - AJUSTE CURATIVO

Brevemente, 30 ratones se operaron: la cirugfa consiste en ligadura y puncion cecal. Por esta via el contenido del lumen cecal se extrae de la cavidad abdominal conduciendola a la peritonitis y en consecuencia a un choque septico. El CLP es de grado leve, por ejemplo, la ligadura se lleva a cabo aproximadamente en la mitad del ciego. Los ratones se trataron con 28G7 (100jg/raton, ip), un anticuerpo de control sin especificidad TLR3 (“control”, 100jg/raton, ip) o el PBS (300jl/raton, ip) 6 horas y 24 horas despues de la operacion. La supervivencia se evaluo en las horas 24, 28, 32, 48, 52, 56, 72, 76, 80, 96, 100, 104, 120, 124, 128, 144, 148, 152, 168, 172, 176, 192, 196, 200, 216, 220, 224, 240, 244, 248, 264, 270, 274, 288, 292, 296, 312, 316, 320 y 336. Despues de 336 horas, los ratones que habfan sobrevivido habfan eliminado la infeccion de fase aguda. El experimento se detuvo y los ratones se sacrificaron.

La Figura 6 muestra los resultados del experimento. El grupo tratado con 28G7 tuvo un 80% de supervivencia mientras que el grupo no tratado experimento un 40% de supervivencia. Estos resultados muestran que los anticuerpos TLR3 son eficientes para el tratamiento de ratones en un modelo de raton CLP. En este modelo agudo, los ratones experimentan infeccion aguda, imitando el choque septico. Los ratones que sobreviven han eliminado eficientemente la infeccion aguda. Por lo tanto, los anticuerpos anti-TLR3 son agentes adecuados para tratar a un paciente que experimenta una infeccion aguda grave tal como una SIRS, una sepsis, una sepsis grave, o choque septico.

EJEMPLO 13 - PRODUCCION DE IP-10 IN VITRO POR LA PBMCS DONADORES EN RESPUESTA A COMBINACIONES DE ARNDS Y FARMACOS

La produccion de IP-10 se evaluo en donadores humanos en respuesta a pIC. PBMC reciente se aislo de sangre entera de donadores y se incubo en presencia de 0, 10 o 50 jg/ml de mAbs TLR3 anti-humano y un intervalo de dosis de dexametasona (0.2, 2 y 20 jg/ml) o HumiraMR (1, 0.1, 0.01 jg/ml). Las celulas se incubaron 30 minutos a 37°C antes de la adicion de 30 jg/ml poli(I:C). Las celulas se incubaron durante 24 horas adicionales a 37°C. El sobrenadante luego se recolecto para cuantificar la produccion IP10 por el ELISA.

Los resultados de las combinaciones de farmacos con mAbs TLR3 anti-humano en combinacion con dexametasona o HumiraMR se muestran en las Figuras 7A y 7B respectivamente. Los anticuerpos reducen cada uno sustancialmente la produccion de IP-10 en respuesta a poliIC y los anticuerpos reducen IP-10 aun mas cuando se combina con dexametasona o HumiraMR. Los anticuerpos anti-TLR3 por lo tanto pueden proporcionar un efecto adicional cuando se utilizan en combinacion con dexametasona o Humira. En particular, en respuesta a PoliIC los anticuerpos potencian los efectos de la dexametasona, el tratamiento de referencia en la artritis reumatoide. Adicionalmente, los anticuerpos anti-TLR3 parecieron que potenciar los efectos de1Humira a 0.1 y 1 jg/ml de concentraciones. Los anticuerpos anti-TLR3 pueden operar o modular una ruta de senalizacion que es complementaria a aquellas moduladas por la dexametasona o HumiraMR, sin efectos antagomsticos, y por lo tanto se pueden utilizar ventajosamente en combinacion con tales farmacos.

Todos los encabezados y subencabezados se utilizan en la presente a efectos de conveniencia unicamente y no se debe interpretar que limitan la invencion de ninguna manera. Cualquier combinacion de los elementos descritos anteriormente en todas sus posibles variaciones esta englobada por la invencion a menos que se indique lo contrario en la presente o el contexto lo contradiga claramente. Se pretende que la enumeracion de intervalos de valores en la presente sirva meramente como un metodo abreviado para referirse individualmente a cada valor separado comprendido en el intervalo, a menos que se indique lo contrario en la presente, y cada valor separado se incorpora en la presente divulgacion como si se hubiera enumerado individualmente en la presente. A menos que se afirme lo contrario, todos los valores exactos que se proporcionan en la presente son representativos de valores aproximados correspondientes (por ejemplo, todos los valores ilustrativos exactos que se proporcionan en la presente con respecto a un factor o medicion particular se pueden considerar que tambien proporcionan una medicion aproximada correspondiente, modificada por “aproximadamente” cuando sea apropiado).

Todos los metodos descritos en la presente se pueden llevar a cabo en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en la presente o el contexto lo contradiga claramente.

El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, “tal como”) proporcionado en la presente se pretende meramente que aclare en mayor medida la invencion y no impone una limitacion al alcance de la invencion a menos que se indique lo contrario. Ningun lenguaje de la presente solicitud se debe interpretar que indica que cualquiera de los elementos es esencial para llevar a la practica la invencion a menos que esto se afirme de manera expKcita.

La citacion e incorporacion de documentos de tipo patente a la presente solicitud se realiza unicamente a efectos de conveniencia y no refleja ninguna opinion sobre la validez, patentabilidad y/o aplicabilidad de tales documentos de tipo patente. La descripcion en la presente de cualquier aspecto o modalidad de la invencion utilizando terminos tales como referencia a un elemento o elementos se pretende que proporcione apoyo para un aspecto o modalidad similar de la invencion que “consiste en”, “consiste esencialmente en” o “comprende sustancialmente” ese elemento o elementos particulares, a menos que se afirme lo contrario o el contexto lo contradiga claramente (por ejemplo, una composicion que se describe en la presente que comprende ese elemento particular se debena sobreentender que tambien describe una composicion que consiste en ese elemento, a menos que se afirme lo contrario o el contexto lo contradiga claramente).

La invencion incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia recitada en los aspectos o reivindicaciones presentados en la presente hasta el alcance maximo permitido por la ley pertinente.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en la presente solicitud se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad de la misma manera que si se indicara individual y espedficamente que cada publicacion o solicitud de patente individual se incorpora a modo de referencia.

Aunque la invencion anterior se ha descrito con cierto detalle a modo ilustrativo y de ejemplo para conseguir su esclarecimiento, sera evidente facilmente para un experto en la tecnica tras la lectura de esta invencion que se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones a ella sin alejarse de la naturaleza o alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal que inhibe la senalizacion mediada por TLR3 en una celula que expresa TLR3, en donde el anticuerpo se liga a la superficie lateral sin glicano de la porcion N-terminal del polipeptido TLR3, en donde dicho anticuerpo tiene una ligacion reducida en mas de un 40% a un polipeptido TLR3 mutante que comprende una mutacion en los residuos 137 a 139 del polipeptido TLR3 de SEQ ID NO: 1, respecto a la ligacion entre el anticuerpo y un polipeptido TLR3 de tipo natural de SEQ ID NO: 1.

2. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo tiene una ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en el residuo 117 y 120 del polipeptido TLR3 de SEQ ID NO: 1, respecto a la ligacion entre el anticuerpo y un polipeptido TLR3 de tipo natural de SEQ ID NO: 1.

3. El anticuerpo de la reivindicacion 2, en donde el anticuerpo tiene una ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en el residuo 112, 113 y 115 del polipeptido TLR3 de SEQ ID NO: 1, respecto a la ligacion entre el anticuerpo y un polipeptido TLR3 de tipo natural de SEQ ID NO: 1.

4. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo tiene una ligacion reducida a un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en el residuo 64 y 65 del polipeptido TLR3 de SEQ ID NO: 1, respecto a la ligacion entre el anticuerpo y un polipeptido TLR3 de tipo natural de s Eq ID NO: 1.

5. El anticuerpo de la reivindicacion 4, en donde el anticuerpo compite con ARNds por la ligacion a la porcion N-terminal de un polipeptido TLR3 humano.

6. El anticuerpo de las reivindicaciones 1-6, en donde el anticuerpo no se liga sustancialmente a la superficie lateral que contiene glicano de la porcion N-terminal del polipeptido TLR3.

7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo mantiene sustancialmente la ligacion a (no tiene una reduccion significativa en la ligacion a) un polipeptido TLR3 que tiene una mutacion en los residuos D116 y K145 del polipeptido TLR3 de SEQ ID NO: 1, respecto a la ligacion entre el anticuerpo y un polipeptido TLR3 de tipo natural de SEQ ID NO: 1.

8. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera las reivindicaciones anteriores, que se liga espedficamente a un polipeptido TLR3 humano e inhibe la senalizacion por el polipeptido TLR3 humano, en donde el anticuerpo comprende:

(i) una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoacidos CDR1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) de una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 3; y (b) una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoacidos CDR 1, 2 y 3 (L^cD^r1, LCDR2, LCDR3) de una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 4, en donde uno, dos, tres, cuatro o cinco de los aminoacidos en cualquiera de una o mas de dichas CDR se pueden sustituir opcionalmente por un aminoacido diferente;

(ii) una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoacidos CDR1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) de una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14; y (b) una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoacidos CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) de una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 15, en donde uno, dos, tres, cuatro o cinco de los aminoacidos en cualquiera de una o mas de dichas CDR se pueden sustituir opcionalmente por un aminoacido diferente;

(iii) una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoacidos CDR1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) de una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 25; y (b) una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoacidos CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) de una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 26, en donde uno, dos, tres, cuatro o cinco de los aminoacidos en cualquiera de una o mas de dichas CDR se pueden sustituir opcionalmente por un aminoacido diferente;

(iv) una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoacidos CDR1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) de una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 36; y (b) una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoacidos CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) de una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 37, en donde uno, dos, tres, cuatro o cinco de los aminoacidos en cualquiera de una o mas de dichas CDR se pueden sustituir opcionalmente por un aminoacido diferente; o

(v) una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoacidos CDR1, 2 y 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) de una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 47; y (b) una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoacidos CDR 1, 2 y 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) de una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 48, en donde uno, dos, tres, cuatro o cinco de los aminoacidos en cualquiera de una o mas de dichas CDR se pueden sustituir opcionalmente por un aminoacido diferente,

definiendose las CDR segun Kabat.

9. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo compite para la ligacion a un polipeptido TLR3 humano con el anticuerpo 11E1 que tiene una region variable de cadena pesada con SEQ.ID.NO.3 y una region variable de cadena ligera con SEQ.ID.NO.4, 31F6 que tiene una region variable cadena pesada con SEQ.ID.NO.14 y una region variable de cadena ligera con SEQ.lD.NO.15, 32C4 que tiene una region variable de cadena pesada con SEQ.ID.NO.25 y una region variable de cadena ligera con SEQ.ID.NO.26, 37B7 que tiene una region variable de cadena pesada con SEQ.ID.NO.36 y una region variable de cadena ligera con SEQ.ID.NO.37 o 7G11 que tiene una region variable de cadena pesada con SEQ.ID.NO.47 y una region variable de cadena ligera con SEQ.ID.48.

10. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho anticuerpo es capaz de ser internalizado por una celula que expresa TLR3.

11. El anticuerpo de cualquiera las reivindicaciones anteriores, donde dicho anticuerpo se conjuga o liga covalentemente a un resto toxico.

12. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio o autoinmunitario.

13. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un portador farmaceuticamente aceptable.

14. La composicion de la reivindicacion 13, en donde el anticuerpo esta presente en una cantidad de entre aproximadamente 25 mg y 500 mg.