CN103649123B - 抗g‑csfr抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供包含与人粒细胞集落刺激因子受体结合的抗体的抗原结合结构域的蛋白。

Description

抗G-CSFR抗体及其用途
相关申请
本申请要求2011年6月13日提交的名称为“抗G-CSFR抗体及其用途（Antibodiesagainst G-CSFR and uses therof）”的美国临时申请第61/496,351号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请与电子形式的序列表一起提交。序列表的全部内容通过引用并入本文。
领域
本公开内容涉及与粒细胞集落刺激因子受体（G-CSFR）受体结合的抗体及其用途，例如在治疗中的用途。
发明背景
粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是粒细胞产生的主要调节因子。G-CSF由骨髓基质细胞、上皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞产生并且生产受到炎性刺激的诱导。G-CSF通过G-CSF受体（G-CSFR）起作用，其在早期髓样前体细胞、成熟嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、T和B淋巴细胞和上皮细胞上表达。G-CSF或G-CSFR缺陷小鼠表现出显著的嗜中性粒细胞减少症，证明G-CSF在稳态粒细胞生成中的重要性。然而，G-CSF似乎对于紧急的粒细胞生成来说是非必需的，例如在对感染的响应中。G-CSF增加嗜中性粒细胞的产生和释放，驱动造血干细胞和先祖细胞并且调节成熟嗜中性粒细胞的分化、寿命和效应子功能。G-CSF同样可以对巨噬细胞施加影响，包括单核细胞/巨噬细胞数目的扩张、吞噬作用的增强和对炎性细胞因子和趋化因子产生的调节。G-CSF同样已经显示驱动内皮先祖细胞并诱导或促进血管发生。
当G-CSF被治疗性用于例如治疗嗜中性粒细胞减少症和/或驱动造血干细胞时，其在一些病状中，例如炎性病状和/或癌症，也具有消极作用。例如，G-CSF的施用加重了类风湿性关节炎（RA）、小鼠胶原诱导的关节炎（CIA）和大鼠中CIA的被动转移模型。已经在RA患者的血清和滑液中发现G-CSF。而且，白介素（IL）-1和肿瘤坏死因子α（TNFα），其以升高水平存在于患有RA的患者中，通过人类滑液成纤维细胞和软骨细胞诱导了G-CSF的产生。G-CSF缺陷小鼠对急性和慢性炎性关节炎有抗性。
G-CSF已经显示在多发性硬化（MS）中起作用。例如，G-CSF与干扰素γ和TNFα同样有效地增强MS的自体反应T细胞系模型对细胞外基质的粘附，其已知加剧了MS症状。而且，G-CSF缺陷小鼠对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的发展有抗性。
G-CSF和G-CSFR同样已经与癌症相关，研究显示这一信号通路有利于不同癌症的化疗抗性、生长、存活、侵染和转移。而且，G-CSF已经显示诱导血管发生，实体瘤发展中的一个重要过程。
从前面所述的本领域技术人员清楚在本领域内有对通过G-CSFR减少G-CSF的信号传递的试剂的需要。示例性的剂将适于用作治疗剂，例如治疗或预防G-CSF介导的病状。
概述
本发明人已经生产了包含与人类G-CSFR（hG-CSFR）结合并且强有力地中和G-CSF信号例如防止粒细胞从CD34+骨髓细胞形成和/或预防响应于G-CSF的细胞增殖和/或减少或预防由施用G-CSF诱导的嗜中性粒细胞增多症的抗体结合位点（例如Fad和抗体）的一类蛋白。本发明人鉴定的一类蛋白同样与短尾猴（cynomolgus monkey）G-CSFR（cynoG-CSFR）交叉反应，其有利于采用所述蛋白的临床前研究。本发明人鉴定的一类蛋白以高亲和性与hG-CSFR结合。本发明人鉴定的一类蛋白是人类抗体，其适于各种病状的治疗。
本公开内容提供包含抗体的抗原结合位点的蛋白，其中所述抗原结合位点与hG-CSFR结合并且中和G-CSF信号并且其中所述蛋白以至少约0.2nM的IC50抑制集落形成单位-粒细胞（CFU-G）从G-CSF存在时生长的CD34+骨髓细胞生长。例如，IC50是0.1nM或更少，例如，0.09nM或更少，或者0.08nM或更少，或者0.07nM或更少，或者0.06nM或更少或者0.05nM或更少。在一个实施例中，IC50是0.04nM或更少。在另一个实施例中，IC50是0.02nM或更少。本文描述了评估这样的测定中蛋白的IC50的方法。例如，IC50是在10ng/ml的hG-CSF存在时测定的。
在一个实施例中，IC50是通过在10ng/ml干细胞因子和10ng/ml hG-CSF存在时培养CD34+骨髓细胞来确定的。例如，细胞在半固体细胞培养基中生长。在一个实施例中，14天培养后将CFU-G计数。
本公开内容另外地或可选择地提供包含抗体的抗原结合位点的蛋白，其中所述抗原结合位点以相似的亲和性与人类G-CSFR和短尾猴G-CSFR两者结合并且中和G-CSF信号。这些蛋白是有利的，因为它们有利于非人类哺乳动物中的临床前研究。
在一个实施例中，使用生物传感器，例如通过表面等离子共振确定蛋白的亲和性。例如，配体结合区或可溶的hG-CSFR或可溶的cynoG-CSFR或hG-CSFR-Fc或cyno-G-CSFR-Fc被固定并且确定本公开内容的蛋白的亲和性。
本公开内容另外地提供包含抗体的抗原结合位点的蛋白，其中抗原结合位点与hG-CSFR中与C1.2（包含包含SEQ ID NO:2中所展示的序列的重链可变区（VH）和包含SEQ IDNO:3中所展示的序列的轻链可变区（VL））或C1.2G（包含包含SEQ ID NO:4中所展示的序列的VH和包含SEQ ID NO:5中所展示的序列的VL）所结合的相同的表位特异性结合。
本公开内容另外地或可选择地提供包含抗体的抗原结合位点的蛋白，其中（i）所述蛋白竞争性抑制C1.2（包含包含SEQ ID NO:2中所展示的序列的VH和包含SEQ ID NO:3中所展示的序列的VL）或C1.2G（包含包含SEQ ID NO:4中所展示的序列的VH和包含SEQ ID NO:5中所展示的序列的VL）对hG-CSFR的结合；（ii）所述蛋白中和G-CSF信号；并且（iii）所述蛋白与其中丙氨酸取代下列中任一个的SEQ ID NO:1的多肽的结合水平低于所述蛋白与SEQID NO:1的多肽的结合水平：
（a）位于SEQ ID NO:1的位点287的精氨酸;
（b）位于SEQ ID NO:1的位点237的组氨酸；
（c）位于SEQ ID NO:1的位点198的甲硫氨酸；
（d）位于SEQ ID NO:1的位点172的酪氨酸；
（e）位于SEQ ID NO:1的位点171的亮氨酸；或
（f）位于SEQ ID NO:1的位点111的亮氨酸。
本公开内容另外地或可选择地提供包含抗体的抗原结合位点的蛋白，其中（i）所述蛋白竞争性抑制C1.2（包含包含SEQ ID NO:2中所展示的序列的VH和包含SEQ ID NO:3中所展示的序列的VL）或C1.2G（包含包含SEQ ID NO:4中所展示的序列的VH和包含SEQID NO:5中所展示的序列的VL）对hG-CSFR的结合；（ii）所述蛋白中和G-CSF信号；并且（iii）相对于其与其中丙氨酸取代下列中任一个的SEQ ID NO:1的多肽结合的能力优先与SEQ ID NO:1的多肽结合：
（a）位于SEQ ID NO:1的位点287的精氨酸;
（b）位于SEQ ID NO:1的位点237的组氨酸；
（c）位于SEQ ID NO:1的位点198的甲硫氨酸；
（d）位于SEQ ID NO:1的位点172的酪氨酸；
（e）位于SEQ ID NO:1的位点171的亮氨酸；或
（f）位于SEQ ID NO:1的位点111的亮氨酸。
本公开内容另外地或可选择地提供包含抗体的抗原结合位点的蛋白，其中（i）所述蛋白与hG-CSFR结合；（ii）所述蛋白中和G-CSF信号；并且（iii）所述蛋白与其中丙氨酸取代下列中任一个的SEQ ID NO:1的多肽的结合水平低于所述蛋白与SEQ ID NO:1的多肽的结合水平：
（a）位于SEQ ID NO:1的位点287的精氨酸
（b）位于SEQ ID NO:1的位点237的组氨酸；
（c）位于SEQ ID NO:1的位点198的甲硫氨酸；
（d）位于SEQ ID NO:1的位点172的酪氨酸；
（e）位于SEQ ID NO:1的位点171的亮氨酸；或
（f）位于SEQ ID NO:1的位点111的亮氨酸。
本公开内容另外地或可选择地提供包含抗体的抗原结合位点的蛋白，其中（i）所述蛋白与hG-CSFR结合；（ii）所述蛋白中和G-CSF信号；并且（iii）相对于其与其中丙氨酸取代下列中任一个的SEQ ID NO:1的多肽结合的能力优先与SEQ ID NO:1的多肽结合：
（a）位于SEQ ID NO:1的位点287的精氨酸
（b）位于SEQ ID NO:1的位点237的组氨酸；
（c）位于SEQ ID NO:1的位点198的甲硫氨酸；
（d）位于SEQ ID NO:1的位点172的酪氨酸；
（e）位于SEQ ID NO:1的位点171的亮氨酸；或
（f）位于SEQ ID NO:1的位点111的亮氨酸。
在一个实施例中，所述蛋白与包含丙氨酸取代的所述多肽的结合水平与所述蛋白与SEQ ID NO:1的多肽的结合相比减少至少约10倍或20倍或50倍或100倍或150倍或200倍。优选地，所述蛋白与包含丙氨酸取代的所述多肽的结合水平减少至少约50倍。优选地，所述蛋白与包含丙氨酸取代的所述多肽的结合水平减少至少约60倍。
在一个实施例中，所述蛋白的抗原结合位点未可检测地结合其中丙氨酸取代位于SEQ ID NO:1的位点287的精氨酸的SEQ ID NO:1的多肽。
在一个实施例中，使用生物传感器，例如通过表面等离子共振确定结合的水平。例如，所述蛋白被固定并且确定与SEQ ID NO：1的多肽或与包含丙氨酸取代的多肽形式的结合水平。
本公开内容的蛋白结合或非显著结合或未可检测地结合的包含SEQ ID NO：1的氨基酸有或没有其他取代的多肽的另外的形式描述于本文并且被采用对本公开内容的实施例做细节上的必要修改。
在一个实施例中，抗原结合位点与下列交叉反应：
（i）SEQ ID NO:1的多肽，其中丙氨酸取代位于SEQ ID NO:1的位点167的赖氨酸；和/或
（ii）SEQ ID NO:1的多肽，其中丙氨酸取代位于SEQ ID NO:1的位点168的组氨酸。
在一个实施例中，所述抗原结合位点另外地与SEQ ID NO:1的多肽交叉反应，其中丙氨酸取代位于SEQ ID NO:1的位点169的亮氨酸。
在一个实施例中，所述蛋白竞争性抑制C1.2（包含包含SEQ ID NO:2中所展示的序列的VH和包含SEQ ID NO:3中所展示的序列的VL）或C1.2G（包含包含SEQ ID NO:4中所展示的序列的VH和包含SEQ ID NO:5中所展示的序列的VL）对下列中的一个或多个的结合：
（i）SEQ ID NO:1的多肽，其中丙氨酸取代位于SEQ ID NO:1的位点167的赖氨酸；和/或
（ii）SEQ ID NO:1的多肽，其中丙氨酸取代位于SEQ ID NO:1的位点168的组氨酸。
在一个实施例中，本文根据任一个实施例描述的蛋白与包含选自SEQ ID NO:1的111-115、170-176、218-234和/或286-300的一个或两个或三个或四个区域内的残基的表位结合。
在一个实施例中，当本文根据任一个实施例描述的蛋白与SEQ ID NO:1的多肽结合并且使用蛋白水解酶的裂解依旧与包含SEQ ID NO:1的氨基酸111-115或SEQ ID NO:1的氨基酸170-176或SEQ ID NO:1的氨基酸218-234或SEQ ID NO:1的氨基酸286-300组成的一个或两个或三个或四个肽结合。
在一个实施例中，所述蛋白与构象表位结合。
本公开内容另外地或可选择地提供与hG-CSFR结合并且中和G-CSF信号的蛋白，所述蛋白包含下列中的至少一个：
（i）包含包含SEQ ID NO:6中所展示的序列的互补决定区（CDR）1、包含SEQ ID NO:7中所展示的序列的CDR2和包含与SEQ ID NO:8中所展示的序列具有至少约55%同一性的序列的CDR3的VH；
（ii）包含与SEQ ID NO:2和/或4中展示的序列具有至少约80%，例如85%或90%或91%或92%或93%或94%或95%或96%或97%或98%或99%同一性的序列的VH；
（iii）包含包含SEQ ID NO:9中所展示的序列的CDR1、包含SEQ ID NO:10中所展示的CDR2和包含与SEQ ID NO:11中所展示的序列具有至少约33%同一性的序列的CDR3的VL；和
（iv）包含与SEQ ID NO:3和/或5中展示的序列具有至少约80%，例如85%或90%或91%或92%或93%或94%或95%或96%或97%或98%或99%同一性的序列的VL。
这样的蛋白可包含本文所描述的功能活性中的任一个或多个，例如相对于与其中丙氨酸取代下列中的任一个的SEQ ID NO:1的多肽的结合水平优先与SEQ ID NO:1的多肽结合：
（a）位于SEQ ID NO:1的位点287的精氨酸
（b）位于SEQ ID NO:1的位点237的组氨酸；
（c）位于SEQ ID NO:1的位点198的甲硫氨酸；
（d）位于SEQ ID NO:1的位点172的酪氨酸；
（e）位于SEQ ID NO:1的位点171的亮氨酸；或
（f）位于SEQ ID NO:1的位点111的亮氨酸。
在一个实施例中，（ii）的百分比同一性是至少约95%。
在一个实施例中，（iv）的百分比同一性是至少约94%。
在一个实施例中，所引用的序列和所述蛋白之间的差异是取代。
本领域技术人员能够确定本公开内容的蛋白的突变位点，例如在包含蛋白的可变区的框架区内。而且，发明人已经鉴定了VH CDR3和VL CDR3中可以被突变的多个位点以及保持本公开内容的蛋白的活性的多个突变。例如，突变诸如取代在HCDR3的四个C末端残基的一个或多个（例如2或3或4个）中和/或LCDR3的N末端或C末端残基的一个或多个（例如2或3或4个或5个或6个）中。在一个实施例中，VH CDR3的N末端的五个氨基酸是LGELG。在一个实施例中，VL CDR3的三个N末端氨基酸是QQS和/或VL CDR3的三个C末端氨基酸是PLT。
在一个实施例中，所述VH包含包含序列LGELGX1X2X3X4的CDR3，其中：
X1选自由色氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和组氨酸组成的组和/或是中性氨基酸，例如色氨酸、谷氨酰胺或甲硫氨酸，例如，所述氨基酸是色氨酸；
X2是选自由苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、甘氨酸和异亮氨酸组成的组的氨基酸，例如是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或丝氨酸，例如，所述氨基酸是苯丙氨酸；
X3是选自由天冬氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、亮氨酸、缬氨酸、精氨酸和组氨酸组成的组的氨基酸，例如是脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸，例如，所述氨基酸是天冬氨酸；且
X4是任意氨基酸或选自由脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸和赖氨酸组成的组的氨基酸，例如，所述氨基酸是脯氨酸。
在一个实施例中，所述VL包含包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9的CDR3，其中：
X1是选自由谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成的组的氨基酸和/或是亲水性氨基酸，诸如谷氨酰胺或谷氨酸，例如，所述氨基酸是谷氨酰胺；
X2是选自由谷氨酰胺、缬氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酸组成的组的氨基酸，例如，所述氨基酸是谷氨酰胺；
X3是选自由丝氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸，例如，所述氨基酸是丝氨酸；
X4是选自由色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和亮氨酸组成的组的氨基酸，例如，所述氨基酸是色氨酸或酪氨酸；
X5是任意氨基酸或选自由谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、丝氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸（arganine）、组氨酸、酪氨酸、赖氨酸和苏氨酸组成的组的氨基酸，例如，所述氨基酸是丝氨酸；
X6是选自由酪氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸和苏氨酸组成的组的氨基酸，例如，所述氨基酸是甲硫氨酸、酪氨酸或苏氨酸；
X7是选自由脯氨酸、丙氨酸、组氨酸、甘氨酸和赖氨酸组成的组的氨基酸，例如所述氨基酸是脯氨酸；
X8是选自由亮氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、组氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸，例如，所述氨基酸是亮氨酸；
X9是任意氨基酸或选自由苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、丝氨酸、组氨酸、脯氨酸、色氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和缬氨酸组成的组的氨基酸，例如，所述氨基酸是苏氨酸.
本公开内容另外地或可选择地提供与hG-CSFR结合并且中和G-CSF信号的蛋白（例如抗体），所述蛋白包含选自由下列组成的组的至少一个抗体的可变区：
（i）包含SEQIDNO:2中所展示的氨基酸序列的VH；
（ii）包含SEQIDNO:3中所展示的氨基酸序列的VL；
（iii）包含SEQIDNO:4中所展示的氨基酸序列的VH；
（iv）包含SEQIDNO:5中所展示的氨基酸序列的VL；
（v）包含SEQIDNO:14中所展示的氨基酸序列的VL；
（vi）包含SEQIDNO:15中所展示的氨基酸序列的VH；
（vii）包含SEQIDNO:16中所展示的氨基酸序列的VL；
（viii）包含SEQIDNO:17中所展示的氨基酸序列的VL；
（ix）包含SEQIDNO:18中所展示的氨基酸序列的VL；
（x）包含SEQIDNO:19中所展示的氨基酸序列的VL；
（xi）包含SEQIDNO:20中所展示的氨基酸序列的VH；
（xii）包含SEQIDNO:21中所展示的氨基酸序列的VL；
（xiii）包含SEQIDNO:22中所展示的氨基酸序列的VL；
（xiv）包含SEQIDNO:23中所展示的氨基酸序列的VL；
（xv）包含SEQIDNO:24中所展示的氨基酸序列的VH；
（xvi）包含SEQIDNO:25中所展示的氨基酸序列的VL；
（xvii）包含SEQIDNO:26中所展示的氨基酸序列的VL；
（xviii）包含SEQIDNO:27中所展示的氨基酸序列的VL；
（xix）包含SEQIDNO:28中所展示的氨基酸序列的VH；
（xx）包含SEQIDNO:29中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxi）包含SEQIDNO:30中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxii）包含SEQIDNO:31中所展示的氨基酸序列的VH；
（xxiii）包含SEQIDNO:32中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxiv）包含SEQIDNO:33中所展示的氨基酸序列的VH；
（xxv）包含SEQIDNO:34中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxvi）包含SEQIDNO:35中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxvii）包含SEQIDNO:36中所展示的氨基酸序列的VH；
（xxviii）包含SEQIDNO:37中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxix）包含SEQIDNO:38中所展示的氨基酸序列的VH；
（xxx）包含SEQIDNO:39中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxxi）包含SEQIDNO:40中所展示的氨基酸序列的VH；
（xxxii）包含SEQIDNO:41中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxxiii）包含SEQIDNO:42中所展示的氨基酸序列的VH；
（xxxiv）包含SEQIDNO:43中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxxv）包含SEQIDNO:44中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxxvi）包含SEQIDNO:45中所展示的氨基酸序列的VH；
（xxxvii）包含SEQIDNO:46中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxxviii）包含SEQIDNO:47中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxix）包含SEQIDNO:48中所展示的氨基酸序列的VL；
（xl）包含SEQIDNO:49中所展示的氨基酸序列的VH；
（xli）包含SEQIDNO:50中所展示的氨基酸序列的VL；
（xlii）包含SEQIDNO:51中所展示的氨基酸序列的VH；
（xliii）包含SEQIDNO:52中所展示的氨基酸序列的VL；
（xliv）包含SEQIDNO:53中所展示的氨基酸序列的VH；
（xlv）包含SEQIDNO:54中所展示的氨基酸序列的VL；
（xlvi）包含SEQIDNO:55中所展示的氨基酸序列的VH；
（xlvii）包含SEQIDNO:56中所展示的氨基酸序列的VL；
（xlviii）包含SEQIDNO:57中所展示的氨基酸序列的VH；
（xlix）包含SEQIDNO:58中所展示的氨基酸序列的VL；
（l）包含SEQIDNO:59中所展示的氨基酸序列的VH；
（li）包含SEQIDNO:60中所展示的氨基酸序列的VL；
（lii）包含SEQIDNO:61中所展示的氨基酸序列的VH；
（liii）包含SEQIDNO:62中所展示的氨基酸序列的VL；和
（liv）包含SEQIDNO:63中所展示的氨基酸序列的VL。
在一个实施例中，本文描述的蛋白包含至少VH和VL，其中VH和VL结合形成包含抗原结合结构域的Fv。本领域技术人员应当理解的是所述抗原结合结构域包含所述抗体的结合位点。
在一个实施例中，VH和VL存在于单个多肽链中。例如，所述蛋白是：
（i）单链Fv片段（scFv）；
（ii）二聚的scFv（di-scFv）；或
（iii）与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域（CH）2和/或CH3连接的（i）和/或（ii）中的至少一个。
在一个实施例中，VL和VH存在于不同多肽链中。
例如，所述蛋白是：
（i）双抗体；
（ii）三抗体；
（iii）四抗体；
（iv）Fab；
（v）F(ab’)2；
（vi）Fv；或
（vii）与抗体的恒定区、Fc或重链恒定结构域(CH)2和/或CH3连接的（i）至（vi）中的一个。
上述蛋白（在之前的两个列表中描述的）也可以被称为抗体的抗原结合结构域。
在一个实施例中，所述蛋白是抗体。在一个实施例中，所述抗体是裸抗体。
在一个实施例中，蛋白是嵌合的、去免疫的、人源化的、人类的或灵长目源化的。
在一个实施例中，所述蛋白或抗体是人类的。
本公开内容另外地或可选择地提供与hG-CSFR结合并且中和G-CSF信号的抗体，所述抗体包含：
（i）包含SEQ ID NO:2中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:3中所展示的氨基酸序列的VL；
（ii）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:5中所展示的氨基酸序列的VL；
（iii）包含SEQ ID NO:15中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:14中所展示的氨基酸序列的VL；
（iv）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:16中所展示的氨基酸序列的VL；
（v）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:17中所展示的氨基酸序列的VL；
（vi）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:18中所展示的氨基酸序列的VL；
（vii）包含SEQ ID NO:20中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:19中所展示的氨基酸序列的VL；
（viii）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:21中所展示的氨基酸序列的VL；
（ix）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:22中所展示的氨基酸序列的VL；
（x）包含SEQ ID NO:24中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:23中所展示的氨基酸序列的VL；
（ix）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:25中所展示的氨基酸序列的VL；
（x）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:26中所展示的氨基酸序列的VL；
（xi）包含SEQ ID NO:28中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:27中所展示的氨基酸序列的VL；
（xii）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:29中所展示的氨基酸序列的VL；
（xiii）包含SEQ ID NO:31中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:30中所展示的氨基酸序列的VL；
（xiv）包含SEQ ID NO:33中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:32中所展示的氨基酸序列的VL；
（xv）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:34中所展示的氨基酸序列的VL；
（xvi）包含SEQ ID NO:36中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:35中所展示的氨基酸序列的VL；
（xvii）包含SEQ ID NO:38中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:37中所展示的氨基酸序列的VL；
（xviii）包含SEQ ID NO:40中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:39中所展示的氨基酸序列的VL；
（xix）包含SEQ ID NO:42中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:41中所展示的氨基酸序列的VL；
（xx）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:43中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxi）包含SEQ ID NO:45中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:44中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxii）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:46中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxiii）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:47中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxiv）包含SEQ ID NO:49中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:48中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxv）包含SEQ ID NO:51中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:50中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxvi）包含SEQ ID NO:53中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:52中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxvii）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:54中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxviii）包含SEQ ID NO:55中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:5中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxix）包含SEQ ID NO:57中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:56中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxx）包含SEQ ID NO:59中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:58中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxxi）包含SEQ ID NO:61中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:60中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxxii）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:62中所展示的氨基酸序列的VL；
（xxxiii）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:63中所展示的氨基酸序列的VL；和
（xxxix）包含（i）至（xxxiii）中任一个或多个中所展示的VH的三个CDR的VH和包含（i）至（xxxiii）中任一个或多个中所展示的VL的三个CDR的VL。
示例性VH和VL的序列描述于表3中，其中所列举的VH或VLCDR3序列如本文中所描述的取代C1.2或C1.2G的VH或VL中的相应序列。
在一个实施例中，本公开内容提供与hG-CSFR结合并且中和G-CSF信号的抗体，所述抗体包含：
（i）包含SEQ ID NO:2中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:3中所展示的氨基酸序列的VL；或
（ii）包含SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:5中所展示的氨基酸序列的VL。
本公开内容另外地或可选择地提供包含包含SEQ ID NO:64中所展示的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:65中所展示的氨基酸序列的轻链的抗体。在一个实施例中，所述抗体与hG-CSFR结合并且中和G-CSF信号。
本公开内容另外地或可选择地提供包含包含SEQ ID NO:68中所展示的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:65中所展示的氨基酸序列的轻链的抗体。在一个实施例中，所述抗体与hG-CSFR结合并且中和G-CSF信号。
本公开内容另外地或可选择地提供包含包含SEQ ID NO:64中所展示的氨基酸序列的一条重链和包含SEQ ID NO:68中所展示的氨基酸序列的一条重链和包含SEQ ID NO:65中所展示的氨基酸序列的两条轻链的抗体。在一个实施例中，所述抗体与hG-CSFR结合并且中和G-CSF信号。
本文对与hG-CSFR“结合”的蛋白或抗体的引用提供对与hG-CSFR“特异性结合”的蛋白或抗体的文字支持。
在一个实施例中，本文描述的蛋白或抗体不与小鼠G-CSFR显著结合和/或不与小鼠G-CSFR可检测地结合。
在一个实施例中，本文描述的根据任一实施例的蛋白或抗体竞争性地抑制C1.2和/或C1.2G与hG-CSFR或表达其的细胞或SEQ ID NO:1或可溶的hG-CSFR（例如，包含与抗体的Fc区融合的SEQ ID NO:1的氨基酸1-311）的结合。
在一个实施例中，本文描述的蛋白或抗体与hG-CSFR的配体结合区和cynoG-CSFR的配体结合区以相似的亲和性结合。在一个实施例中，所述蛋白与可溶hG-CSFR和可溶cynoG-CSFR以相似的亲和性结合。在一个实施例中，所述蛋白与包含SEQ ID NO:1的多肽和包含SEQ ID NO:67的多肽以相似的亲和性结合。在一个实施例中，所述蛋白与本文描述的hG-CSFR-Fc和cynoG-CSFR-Fc以相似的亲和性结合。在一个实施例中，所述亲和性是至少约2nM，例如至少约1.5nM，诸如至少约1.2nM、1.1nM或1nM。在一个实施例中，0.5nM，诸如至少约0.46nM或0.45nM或0.40nM或0.39nM。在另一个实施例中，所述亲和性是至少约0.1nM，诸如至少约0.09nM，例如至少约0.08nM。在一个实施例中，结合的水平使用生物传感器例如表面等离子体共振来评估。例如，配体结合区或可溶的hG-CSFR或可溶的cynoG-CSFR或hG-CSFR-Fc或cyno-G-CSFR-Fc被固定并且确定与本公开内容的蛋白的结合水平。
在另一个实施例中，本公开内容的蛋白被固定在例如生物传感器上，并且确定对配体结合区或可溶的hG-CSFR或可溶的cynoG-CSFR或hG-CSFR-Fc或cyno-G-CSFR-Fc的结合水平。例如，确定与hG-CSFR或cynoG-CSFR的细胞外结构域的结合水平。根据这一实施例，蛋白对cynoG-CSFR的细胞外结构域的亲和性为至少约1nM，例如至少约0.9nM，诸如至少约0.75nM。例如，亲和性是至少约0.7nM，诸如至少约0.6nM，例如至少约0.5nM。在一个实施例中，亲和性是约0.5nM。可选择地或另外地，所述蛋白对hG-CSFR的细胞外结构域的亲和性是至少约7nM或6nM或5nM，诸如至少约4nM，例如至少约3nM，诸如至少约2.5nM。例如，亲和性是至少约2.4或2.5nM。
本公开内容还提供上述抗体的抗原结合结构域或抗原结合片段。
在一个实施例中，本文描述的蛋白或抗体包含IgG4抗体的恒定区或IgG4抗体的稳定化的恒定区。在一个实施例中，所述蛋白或抗体包含具有位于位点241的脯氨酸的IgG4恒定区（根据Kabat的编号系统（Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest Washington DC United States Department of Health and Human Services,1987和/或1991））。
本公开内容的完整抗体的重链恒定区的C末端赖氨酸可被去除。例如，在抗体的生产或纯化期间，或通过将编码所述抗体重链的核酸重组工程化。因此，完整抗体可包括所有C末端赖氨酸残基都被去除的抗体群、没有C末端赖氨酸残基被去除的抗体群和具有有和没有C末端赖氨酸残基的抗体的混合物的抗体群。在一些实施例中，抗体群可另外地包括其中在重链恒定区中的一个中C末端赖氨酸被去除的抗体。相似地，完整抗体的组合物可包括有或没有C末端赖氨酸残基的抗体群的相同或相似的混合物。
在一个实施例中，稳定化的恒定区包含SEQ ID NO:64的位点119至位点445的序列。在一个实施例中，稳定化的恒定区包含SEQ ID NO:68的位点119至位点444的序列。在一个实施例中，如本文描述的蛋白或抗体或如本文描述的蛋白或抗体的组合物包含重链恒定区，其包括稳定化的重链恒定区，包含完全或部分有或没有C末端赖氨酸残基的序列的混合物。
在一个实施例中，本公开内容的抗体包含与IgG4恒定区或稳定的IgG4恒定区（例如如上文讨论的）连接或融合的如本文共开的VH并且VL与κ轻链恒定区连接或融合。
本公开内容同样提供以至少约6nM的IC50抑制G-CSF诱导的表达hG-CSFR的BaF3细胞增殖的蛋白或抗体。例如，IC50为5.9nM或更少。在另一个实施例中，IC50为2nM或更少或1nM或更少或0.7nM或更少或0.6nM或更少或0.5nM或更少。在一个实施例中，IC50通过在约0.5ng/ml hG-CSF存在时培养BaF3细胞（例如约2×104个细胞）例如约48小时来确定。在一个实施例中，BaF3细胞的增殖通过测量3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四甲基偶氮唑蓝（MTT）还原来确定。
本公开内容同样提供以至少约10μg/ml的IC50抑制G-CSF诱导的表达hG-CSFR的BaF3细胞增殖的蛋白或抗体。例如，IC50为5μg/ml或更少。在另一个实施例中，IC50为3μg/ml或更少或2μg/ml或更少或1μg/ml或更少。在一个实施例中，IC50为约0.8μg/ml。在一个实施例中，IC50通过在约10ng/ml hG-CSF存在时培养BaF3细胞（例如约1×104个细胞）例如约48小时来确定。在一个实施例中，BaF3细胞的增殖通过测量3H胸腺嘧啶核苷掺入来确定。
在一个实施例中，本公开内容的蛋白以至少约1.5nM的亲和性与包含表达为与抗体Fc区的融合物（hG-CSFR-Fc）的SEQ ID NO:1的氨基酸1-311的可溶hG-CSFR结合。例如亲和性是至少约0.5nM或0.4nM或0.35nM或0.33nM。在一个实施例中，所述蛋白的亲和性使用生物传感器例如表面等离子体共振来确定。例如，hG-CSFR-Fc被固定并且确定本公开内容的蛋白的亲和性。
在一个实施例中，本公开内容的蛋白或抗体以至少约1nM，例如至少约0.5nM，诸如至少0.4nM,例如至少0.3nM，诸如至少0.2nM的亲和性与表达在细胞表面上的hG-CSFR结合。
在一个实施例中，当或如果被施用于短尾猴中时，本文描述的根据任一实施例的蛋白能够减少循环中嗜中性粒细胞的数目。例如，当或如果以0.05m/kg-30mg/kg之间，优选地0.1mg/kg-10mg/kg之间的剂量，例如以0.1mg/kg或1mg/kg或2mg/kg或5mg/kg或10mg/kg的剂量施用于短尾猴中时，所述蛋白减少循环中嗜中性粒细胞的数目。例如，当或如果在施用G-CSF或非格司亭或其PEG化的形式之后施用时，例如，当或如果所述蛋白在施用G-CSF或非格司亭或其PEG化的形式之后约12小时施用时，所述蛋白减少循环中嗜中性粒细胞的数目。在一个实施例中，所述减少是2倍或3倍减少。在一个实施例中，嗜中性粒细胞在施用后约10-24小时，例如约12小时减少。
在一个实施例中，本文描述的蛋白或抗体是分离和/或重组的。
在一个实施例中，本公开内容的蛋白或抗体与另一种化合物轭合，例如可检测的标记或延长所述蛋白或抗体的半衰期的化合物，诸如聚乙二醇或白蛋白结合蛋白。
本公开内容同样提供编码本公开内容的蛋白或抗体的核酸。
在一个实施例中，这样的核酸包括在表达构建体中，其中所述核酸与启动子可操作地连接。这样的表达构建是可以是载体，例如质粒。
在关于单个多肽链蛋白的本公开内容的实例中，表达载体可以包含与编码所述多肽链的核酸连接的启动子。
在关于形成蛋白的多个多肽链的实施例中，表达构建体包含与启动子可操作地连接的编码包含例如VH的多肽的核酸和与启动子可操作地连接的编码包含例如VL的多肽的核酸。
在另一个实例中，表达构建体是双顺反子表达构建体，例如以5’至3’的顺序包含下列可操作地连接的组分：
（i）启动子
（ii）编码第一多肽的核酸；
（iii）内核糖体进入位点；和
（iv）编码第二多肽的核酸，
其中所述第一多肽包含VH而所述第二多肽包含VL，或反之亦然。
本公开内容同样涵盖单独的表达构建体，其中的一个编码包含VH的第一多肽而其中的另一个编码包含VL的第二多肽。例如，本公开内容同样提供包含下列的组合物：
（i）包含与启动子可操作地连接的编码包含VH的多肽的核酸第一表达构建体；和
（ii）包含与启动子可操作地连接的编码包含VL的多肽的核酸第二表达构建体。
本公开内容同样提供表达本公开内容蛋白的分离或重组的细胞。
在一个实施方案中，所述细胞包含本公开内容的表达构建体或：
（i）包含与启动子可操作地连接的编码包含VH的多肽的核酸的第一表达构建体；和
（ii）包含与启动子可操作地连接的编码包含VL的多肽的核酸的第二表达构建体。
本公开内容的细胞的实例包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本公开内容另外地提供产生本公开内容的蛋白或抗体的方法。例如这样的方法包括在对有待生产的蛋白来说充分的条件下保持本公开内容的表达构建体。
在一个实施例中，产生本公开内容的蛋白或抗体的方法包括在对有待生产的蛋白或抗体来说充分的条件下培养本公开内容的细胞并且任选地分泌。
在一个实施例中，产生本公开内容的蛋白的方法另外包括分离所述蛋白或抗体并且任选地将所述蛋白或抗体配制在药物组合物中。
本公开内容另外地提供包含本公开内容的蛋白或抗体和药学上可接受的载体的组合物。
本公开内容另外地提供组合物，其包含：
（i）包含包含SEQ ID NO:64中所展示的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:65中所展示的氨基酸序列的轻链的抗体；和
（ii）（a）包含SEQ ID NO:64中所展示的氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:65中所展示的氨基酸序列的轻链的抗体；和/或
（b）包含包含SEQ ID NO:64中所展示的氨基酸序列的一条重链和包含SEQ ID NO:68中所展示的氨基酸序列的一条重链和包含SEQ ID NO:65中所展示的氨基酸序列的两条轻链的抗体，
以及任选地药学上可接受的载体。
本公开内容同样提供治疗或预防受试者中G-CSF介导的病状的方法，所述方法包括施用本公开内容的蛋白、抗体或组合物。就此而言，蛋白、抗体或组合物可被用于预防病状的复发并且这被认为是预防所述病状。
在一个实施例中，G-CSF介导的病状是自身免疫性疾病、炎性疾病或癌症。例如，自身免疫性疾病或炎性疾病是关节炎、多发性硬化、肺部炎症或慢性阻塞性肺疾病。
在一个实施例中，所述方法包括在受试者中施用足以减少嗜中性粒细胞的数目的量的蛋白或抗体而不诱导嗜中性粒细胞减少症。
本公开内容可选择地或另外地提供减少受试者中嗜中性粒细胞的数目而不诱导嗜中性粒细胞减少症的方法，所述方法包括向受试者施用包含与hG-CSFR结合（或者特异性结合）的抗体的抗原结合位点的蛋白。示例性的蛋白是抗体或者包含其抗原结合位点（例如VH和/或VL）或者是其抗原结合位点。示例性蛋白和抗体描述于本文。
在一个实施例中，本文描述的方法包括在受试者中使用足以减少嗜中性粒细胞的数目的一定量的所述蛋白或抗体而不诱导中度嗜中性粒细胞减少症。
在一个实施例中，本文描述的方法包括在受试者中施用足以减少嗜中性粒细胞的数目的一定量的所述蛋白或抗体而不诱导严重嗜中性粒细胞减少症。
在一个实施例中，本文描述的方法包括施用约0.05mg/kg和30mg/kg之间的所述蛋白或抗体。例如，所述方法包括施用0.1mg/kg和10mg/kg之间或0.2mg/kg和5mg/kg之间的所述蛋白或抗体。在一个实施例中，所述方法包括施用约0.5-2.0mg/kg的所述蛋白或抗体。
本公开内容同样提供了本文描述的蛋白或抗体在医药的任何实例中的用途。
本公开内容同样提供本文描述的根据任一实施例的蛋白或抗体在用于治疗G-CSF介导的病状的药物的制造中的用途。
本公开内容同样提供了定位和/或检测和/或诊断和/或预测与表达G-CSFR的细胞有关的G-CSF介导的病状的方法，所述方法包括体内检测与表达G-CSFR的细胞结合的如本文描述的蛋白或抗体，如果存在的话，其中所述蛋白或抗体与可检测的标志轭合。
在一个实施例中，所述方法另外地包括向所述受试者施用所述蛋白。
本公开内容同样提供在样品中检测G-CSFR或表达其的细胞的方法，所述方法包括将所述样品与本文描述的根据任一实施例的蛋白或抗体接触以使得复合物形成并且检测所述复合物，其中对所述复合物的检测指示所述样品中的G-CSFR或表达其的细胞。
本公开内容同样提供诊断或预测G-CSF介导的病状的方法，所述方法包括进行本文所描述的根据任一实施例的方法以检测G-CSFR或表达其的细胞，其中对G-CSFR或表达其的细胞的检测是对所述病状的诊断或预测。
本公开内容同样提供了包含与在如本文所描述的方法中使用的说明书包装在一起的本文描述的根据任一实施例的蛋白或抗体的试剂盒。
序列表的关键点
SEQ ID NO:1–具有C末端聚组氨酸标记的人类G-CSFR（hG-CSFR）的氨基酸25-335
SEQ ID NO:2–C1.2的VH
SEQ ID NO:3–C1.2的VL
SEQ ID NO:4–C1.2G的VH
SEQ ID NO:5–C1.2G的VL
SEQ ID NO:6-C1.2的HCDR1
SEQ ID NO:7-C1.2的HCDR2
SEQ ID NO:8-C1.2的HCDR3
SEQ ID NO:9-C1.2的LCDR1
SEQ ID NO:10-C1.2的LCDR2
SEQ ID NO:11-C1.2的LCDR3
SEQ ID NO:12–C1.2的HCDR3的共有序列
SEQ ID NO:13–C1.2的LCDR3的共有序列
SEQ ID NO:14–抗体987的VL
SEQ ID NO:15–抗体987的VH
SEQ ID NO:16–抗体95的VL
SEQ ID NO:17–抗体79的VL
SEQ ID NO:18–抗体83的VL
SEQ ID NO:19–抗体1003的VL
SEQ ID NO:20–抗体1003的VH
SEQ ID NO:21–抗体44的VL
SEQ ID NO:22–抗体97的VL
SEQ ID NO:23–抗体986的VL
SEQ ID NO:24–抗体986的VH
SEQ ID NO:25–抗体56的VL
SEQ ID NO:26–抗体77的VL
SEQ ID NO:27–抗体54的VL
SEQ ID NO:28–抗体54的VH
SEQ ID NO:29–抗体802的VL
SEQ ID NO:30–抗体967的VL
SEQ ID NO:31–抗体967的VH
SEQ ID NO:32–抗体989的VL
SEQ ID NO:33–抗体989的VH
SEQ ID NO:34–抗体63的VL
SEQ ID NO:35–抗体1002的VL
SEQ ID NO:36–抗体1002的VH
SEQ ID NO:37–抗体994的VL
SEQ ID NO:38–抗体994的VH
SEQ ID NO:39-抗体969的VL
SEQ ID NO:40–抗体969的VH
SEQ ID NO:41–抗体1000的VL
SEQ ID NO:42–抗体1000的VH
SEQ ID NO:43–抗体94的VL
SEQ ID NO:44–抗体975的VL
SEQ ID NO:45–抗体975的VH
SEQ ID NO:46–抗体75的VL
SEQ ID NO:47–抗体814的VL
SEQ ID NO:48–抗体973的VL
SEQ ID NO:49–抗体973的VH
SEQ ID NO:50–抗体977的VL
SEQ ID NO:51–抗体977的VH
SEQ ID NO:52–抗体984的VL
SEQ ID NO:53–抗体984的VH
SEQ ID NO:54–抗体61的VL
SEQ ID NO:55–抗体852的VH
SEQ ID NO:56–抗体996的VL
SEQ ID NO:57–抗体996的VH
SEQ ID NO:58–抗体43的VL
SEQ ID NO:59–抗体43的VH
SEQ ID NO:60–抗体999的VL
SEQ ID NO:61–抗体999的VH
SEQ ID NO:62–抗体870的VL
SEQ ID NO:63–抗体877的VL
SEQ ID NO:64–具有稳定化的IgG4恒定区的C1.2G的重链
SEQ ID NO:65–具有κ恒定区的C1.2G的轻链
SEQ ID NO:66–示例性的h-GCSFR的序列
SEQ ID NO:67–包含具有C末端聚组氨酸标记的食蟹猴（Macaca fascicularis）G-CSFR（cynoG-CSFR）的Ig和CRH结构域的多肽
SEQ ID NO:68–具有稳定化的IgG4恒定区并缺少C末端赖氨酸的C1.2G的重链。
附图简述
图1是显示通过增加不同抗G-CSFR抗体的浓度抑制G-CSF介导的BaF3细胞的增殖的图解表示。每种抗体的相对IC50值为：mAb711的10.1μg/mL、mAb774的37.4μg/ml、C1.2G的0.8μg/mL并且对于mAb744来说不可测定。
图2A是显示C1.2G和mAb744对SEQ ID NO:1的一系列丙氨酸点突变与它们对SEQID NO:1的结合相比较的相对结合的图解表示（突变位点参照SEQ ID NO:1标示）。描述了与对SEQ ID NO:1相比所述抗体对突变受体的KD的成倍降低。
图2B是显示C1.2G、mAb744和mAb774对SEQ ID NO:1的一系列丙氨酸点突变与它们对SEQ ID NO:1的结合相比较的相对结合的图解表示（突变位点参照SEQ ID NO:1标示）。描述了与对SEQ ID NO:1相比所述抗体对突变受体的KD的成倍降低。
图3是显示其中聚乙二醇化的G-CSF被施用于猕猴并且一天后测定C1.2的测定中的结果的图解表示。测定每μL血液的嗜中性粒细胞的数目。
发明详述
总述
在整个说明书中，除非特别陈述并非如此或上下文规定并非如此，提及一个步骤、物质组成、步骤组或物质组合物组应当被认为涵盖一个和复数的（即一个或多个）步骤、物质组成、步骤组或物质组成组。
本领域技术人员应当理解的是本公开内容容易受到除了所具体描述的那些之外的变化和修改的影响。应当理解的是本公开内容包括所有这些变化和修改。本公开内容还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个步骤或特征的任何和所有组合。
本公开内容并非限制于本文描述的具体实例的范围，这些实例仅预期用于示例性目的。功能等同的产物、组合物和方法明确处于本公开内容的范围内。
本公开内容的任何实例应当被认为是对本公开内容的任何其他实例加以必要的变更，除非本公开内容明确陈述并非如此。
除非明确限定并非如此，本文所用的所有技术和科学术语应当被认为具有与本领域（例如，细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白化学和生物化学）中技术人员所通常理解的相同的含义。
除非指出并非如此，本公开内容中所用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准方法。这些技术在以下来源的文献中有描述和解释，诸如J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons（1984）；J.Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory Press（1989）；T.A.Brown（编辑），Essential Molecular Biology:APractical Approach，1和2卷，IRL Press（1991）；D.M.Glover和B.D.Hames（编辑），DNACloning:A Practical Approach,1-4卷，IRL Press（1995和1996）和F.M.Ausubel等人，（编辑），Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience（1988,包括迄今为止所有修订）；Ed Harlow和David Lane（编辑）Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，（1988）和J.E.Coligan等人，（编辑）Current Protocols in Immunology，John Wiley &Sons（包括迄今为止所有修订）。
通过Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.，1987和1991；Bork等人J Mol.Biol.242，309-320，1994；Chothia和Lesk J.Mol Biol.196:901-917，1987；Chothia等人，Nature342，877-883，1989和/或Al-Lazikani等人，J Mol Biol273,927-948,1997中的论述可以进一步阐明本文关于可变区及其一部分、免疫球蛋白、抗体及其片段的描述和定义。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应被理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应当被认为为两种含义或任一种含义提供了明确的支持。
在整个说明书中，词语“包含（comprise）”或变型例如“包含（comprises）”或“包含（comprising）”应被理解为暗指包括所陈述的元件、整体或步骤或者元件、整体或步骤的组，但是不排除任何其他元件、整体或步骤或者元件、整体或步骤的组。
如本文所用的，术语“来源于”用来表示指定的整体可以从特定的来源获得，尽管并不必须直接来自该来源。
选择的定义
仅为了命名的目的而非限制性的，人类G-CSFR的示例性序列展示于NCBI参考序列：NP_000751.1（并且展示于SEQ ID NO:66）中。猕猴G-CSFR的序列可使用本文提供的序列确定和/或在公众可获得的数据库中和/或使用标准技术测定（例如，如Ausubel等人（编辑）,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience（1988，包括迄今为止的所有修订）或Sambrook等人Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））。对人类G-CSFR的引用可被缩写为hG-CSFR而对短尾猴G-CSFR的引用可缩写为cynoG-CSFR。对可溶G-CSFR的引用是指包含G-CSFR的配体结合区的多肽。G-CSFR的Ig和CRH结构域参与配体结合和受体二聚化（Layton等人，J.Biol Chem.,272:29735-29741,1997和Fukunaga等人，EMBO J.10:2855-2865,1991）。包含所述受体的这些部分的G-CSFR的可溶形式已经被用于对所述受体的不同研究并且所述抗体的位点78、163和228的无半胱氨酸突变有助于所述可溶受体多肽的表达和分离（Mine等人，Biochem.,43:2458-24642004）而不影响配体结合。在本研究中，使用包含hG-CSFR的氨基酸25-335的具有突变C78A、C163S和C228S的受体的可溶形式（例如SEQ ID NO:1）并且将具有半胱氨酸突变的cynoG-CSFR的相应区段（例如SEQ ID NO67）用于对猕猴受体的研究。已经利用了SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:67的可溶受体的各种点突变。对hG-CSFR-Fc的引用意指SEQ ID NO:1的多肽，其中C末端聚组氨酸标记已经被Fc序列取代（例如包含与Fc融合的SEQ ID NO:1的氨基酸1-311的多肽）cynoG-CSFR-Fc意指具有与其C末端连接的Fc序列的cynoG-CSFR的相应区段（例如包含与Fc融合的SEQ ID NO:67的氨基酸1-311的多肽）。本发明人已经展示包含其抗原结合位点（例如Fab）的抗体和蛋白以高度相似的亲和性与野生型hG-CSF多肽和这些突变蛋白结合。因此，使用突变蛋白的研究是使用hG-CSFR和/或cynoG-CSFR的研究的模型。
本文对G-CSF引用包括G-CSF的天然形式、其突变形式例如非格司亭和G-CSF或非格司亭的聚乙二醇化形式。这一术语同样涵盖保留与G-CSFR（例如hG-CSFR）结合的活性的G-CSF的突变形式并且诱导信号传导。
术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”为根据其根源或衍生来源未与在其天然状态伴随其的天然相关组分相关；基本上不含来自同一来源的其它蛋白的蛋白或多肽。蛋白可通过使用本领域已知的蛋白纯化技术分离而使得基本上不含天然相关组分或是基本上纯化的。“基本上纯化的”是指蛋白质基本上不含污染剂，例如至少约70%或75%或80%或85%或90%或95%或96%或97%或98%或99%的不含污染剂。
术语“重组体”应理解为意指人工遗传重组的产物。因此，在包含抗体抗原结合域的重组蛋白的上下文中，所述术语不涵盖作为在B细胞成熟期间发生的天然重组的产物而在受试者体内天然存在的抗体。然而，如果这种抗体被分离，那么其被认为是包含抗体抗原结合结构域的分离的蛋白。类似地，如果编码所述蛋白的核酸被分离并使用重组方法表达，则所获得的蛋白为包含抗体抗原结合域的重组蛋白。重组蛋白还涵盖当所述蛋白在细胞、组织或受试者内时，例如所述蛋白在其中表达，通过人工重组方法表达的蛋白。
术语“蛋白”将用以包括单一多肽链，即通过肽键连接的一系列连续氨基酸或彼此共价或非共价连接的一系列多肽链（即，多肽复合物）。例如，所述系列多肽链可使用合适的化学键或二硫键共价连接。非共价键的实例包括氢键、离子键、范德华力和疏水性相互作用。
术语“多肽”或“多肽链”应从上文段落理解为意指由肽键连接的一系列连续氨基酸。
如在本文中使用，术语“抗原结合域”应被认为意指由能够结合或特异性结合抗原的蛋白形成的结构。抗原结合位点不需要一系列连续的氨基酸或者甚至不需要在单个多肽链内的氨基酸。例如，在从两个不同多肽链产生的Fv中，抗原结合位点由与抗原相互作用并且通常然而并不总是在每个可变区的CDR中的一个或多个中的VL和VH的一系列氨基酸构成。在一些实施例中，抗原结合位点是VH或VL或Fv。
本领域技术人员应当知道“抗体”通常被认为是包含由多条多肽链构成的可变区的蛋白，例如包含VL的多肽和包含VH的多肽。抗体通常还包含恒定结构域，其中的一些在重链的情况下可以排列成恒定区，其包括恒定片段或可结晶的片段(Fc)。VH和VL相互作用形成包含能够与一种或几种密切相关的抗原特异性结合的抗原结合区的Fv。通常，来自哺乳动物的轻链是κ轻链或λ轻链，来自哺乳动物的重链是α、δ、ε、γ或μ。抗体可以为任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、种类（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类。术语“抗体”还包括人源化抗体、灵长目源化抗体、人抗体和嵌合抗体。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可交换使用，与抗体的抗原结合片段相反，是指处于其基本完整形式的抗体。具体地，全抗体包括具有包含Fc区的重链和轻链的那些。恒定结构域可以是野生型序列的恒定结构域（例如，人野生型序列的恒定结构域）或其氨基酸序列变体。
如本文所用，“可变区”是指如本文所定义的抗体的轻链和/或重链中能够特异性结合抗原的部分并且例如包括互补决定区（CDR）的氨基酸序列；即CDR1、CDR2和CDR3，和框架区（FR）。示例性的可变区包含三个或四个FR（例如FR1、FR2、FR3和任选地FR4）以及三个CDR。在来源于IgNAR的蛋白的实例中，蛋白可以缺乏CDR2。VH是指重链的可变区。VL是指轻链的可变区。
如在本文中使用，术语“互补决定区”（同义词：CDR，即CDR1、CDR2和CDR3）是指其存在对于抗原结合来说是必须的抗体可变区的如下氨基酸残基。每个可变区通常具有三个确定为CDR1、CDR2和CDR3的CDR区域。分配给CDR和FR的氨基酸位点根据Kabat Sequences ofProteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991或者本公开内容的实行中其他编号系统来定义，例如Chothia和LeskJ.Mol Biol.196:901-917,1987；Chothia等人，Nature342,877-883,1989；和/或Al-Lazikani等人，J Mol Biol273:927-948,1997的canonical编码系统；Lefranc等人，Devel.And Compar.Immunol.,27:55-77,2003的IMGT编号系统；或者Honnegher和PlükthunJ.Mol.Biol.,309:657-670,2001的AHO编号系统。例如，根据Kabat的编号系统，VH框架区（FR）和CDR如下安置:残基1-30(FR1)、31-35(CDR1)、36-49(FR2)、50-65(CDR2)、66-94(FR3)、95-102(CDR3)和103-113(FR4)。根据Kabat的编号系统，VLFR和CDR如下安置:残基1-23(FR1)、24-34(CDR1)、35-49(FR2)、50-56(CDR2)、57-88(FR3)、89-97(CDR3)和98-107(FR4)。本公开内容不限于如由Kabat编号系统定义的FR和CDR，而是包括所有编号系统，包括上文讨论的那些。在一个实施例中，本文对CDR（或FR）的引用是关于根据Kabat编号系统的那些区的。
“框架区”（FR）是除了CDR残基之外的那些可变区残基。
如本文中使用，术语“Fv”应被认为意指任何蛋白，不管由多个多肽构成还是由单一多肽构成，其中VL和VH相关联并且形成具有抗原结合位点，即能够特异地结合抗原的复合物。形成抗原结合位点的VH和VL可在单一多肽链中或在不同的多肽链中。另外，本公开内容的Fv（以及本公开内容的任何蛋白）可具有可能或可能不结合相同抗原的多个抗原结合位点。所述术语应理解为涵盖直接来源于抗体的片段以及使用重组方法产生的相应于这样的片段的蛋白。在一些实施例中，VH不与重链恒定结构域（CH）1连接和/或VL不与轻链恒定结构域（CL）连接。含有Fv的示例性多肽或蛋白质包括Fab片段、Fab’片段、F(ab’)片段、scFv、双抗体、三抗体、四抗体或高次复合物，或与其恒定区或结构域，例如CH2或CH3结构域，连接的上述者中的任何一个，例如微抗体。“Fab片段”由免疫球蛋白的单价抗原结合片段组成，且可通过用酶木瓜蛋白酶消化全抗体以产生由完整轻链和一部分重链组成的片段来产生或可使用重组方法产生。抗体的“Fab’片段”可通过用胃蛋白酶处理全抗体，接着还原以产生由完整轻链和包含VH和单一恒定域的一部分重链组成的分子来获得。两个Fab’片段通过以此方式处理每个抗体来获得。Fab’片段也可通过重组方法产生。抗体的“F(ab’)2片段”由通过两个二硫键固持在一起的两个Fab’片段的二聚体组成，并且通过用酶胃蛋白酶处理全抗体分子而不进行随后的还原来获得。“Fab2”片段为包含使用例如亮氨酸拉链或CH3结构域连接的两个Fab片段的重组片段。“单链Fv”或“scFv”为含有抗体的可变区片段（Fv）的重组分子，其中轻链可变区和重链可变区通过适合的柔性多肽连接体共价连接。
如本文所用的，术语“结合”就蛋白或其抗原结合位点与抗原之间的相互作用而言意指取决于抗原上特定结构（例如抗原决定基或表位）的存在的相互作用。例如抗体识别并且结合特定的蛋白结构而不是一般的蛋白。如果抗体结合表位“A”，那么在包含标记的“A”和蛋白的反应中，含有表位“A”的分子（或游离的、未标记的“A”）的存在将减少与抗体结合的标记的“A”的量。
如在本文中使用，术语“特异地结合”或“特异性地结合”应被认为意指本公开内容的蛋白以比其与替换的抗原或细胞进行的更久的持续时间和/或更大的亲和性与特定抗原或表达其的细胞更频繁更迅速地反应或相关联。例如，蛋白以比其与其他细胞因子受体或通常被多反应性天然抗体（例如被已知结合在人类中天然发现的多种抗原的天然存在的抗体）识别的抗原所进行的大得多的亲和性（例如20倍或40倍或60倍或80倍至100倍或150倍或200倍）结合G-CSFR（例如hG-CSFR）。在本公开内容的一个实施例中，蛋白以比其与hG-CSFR的突变形式或包含其区的多肽（例如hG-GCSFR的配体结合结构域的突变形式）或包含取代位点287的天然精氨酸的丙氨酸的SEQ ID NO:1的突变形式所进行的大至少20倍或40倍或60倍或80倍或100倍或150倍或200倍的亲和性与hG-CSFR的一种形式或包含其区的多肽或包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-311“特异地结合”。对SEQ ID NO:1的另外的示例性的变化和它们对结合的影响描述于本文。通常，但不是必须的，对结合的引用是指特定的结合，并且每个术语应当被理解为提供对其他术语的文字支持。
如在本文中使用，术语“不可检测地结合”应当被理解为意指本蛋白，例如抗体，以低于背景以上10%或8%或6%或5%的水平与候选抗原结合。背景可以是在所述蛋白不存在时和/或阴性对照蛋白（例如同种型对照抗体）存在时所检测的结合信号水平和/或在阴性对照多肽存在时检测的结合的水平。结合水平是使用生物传感器分析（例如Biacore）检测的，其中所述蛋白被固定并且与抗原接触。
如在本文中使用，术语“不显著地结合”应当被理解为意指本公开内容的蛋白与多肽的结合并不统计学上显著地高于背景，例如在蛋白不存在时和/或阴性对照蛋白（例如同种型对照抗体）存在时所检测的结合信号水平和/或在阴性对照多肽存在时检测的结合的水平。结合水平是使用生物传感器分析（例如Biacore）检测的，其中所述蛋白被固定并且与抗原接触。
如本文所用的，提及与抗原相关的“减少的结合”或“以较低水平的结合”的短语应当理解为抗体以比对照表位或抗原（例如SEQ ID NO:1）少至少约20倍或40倍或60倍的亲和性与抗原（例如位点287、237、198、172、171或111中的任一处的SEQ ID NO:1丙氨酸点突变）结合。例如，本公开内容的蛋白可以低于其与SEQ ID NO:1的多肽的结合20倍或40倍或60倍的水平与其中丙氨酸取代位点237的组氨酸SEQ ID NO:1的多肽结合。优选地，所述蛋白以低于20倍，更优选地低于40倍，还要更优选地低于60倍的水平结合。
蛋白或抗体如果以比所述蛋白或抗体对另一种多肽的解离常数（KD）少的KD结合多肽那么可被认为与所述多肽“优先结合”。在一个实施例中，蛋白或抗体如果以比所述蛋白或抗体对另一种多肽的KD多至少约20倍或40倍或60倍或80倍或100倍或120倍或140倍或160倍的亲和性（即KD）结合多肽那么可被认为与所述多肽优先结合。
如本文所用的，术语“相似的亲和性”应当理解为本公开内容的蛋白以互相在约5倍或更少之内的例如互相在约4、3、2或1倍之内例如互相在0.5倍之内的亲和性与两个抗原（例如来自人和来自猕猴的G-CSFR的配体结合结构域）结合或者结合的水平是基本上相同的，例如当通过将两个抗原（例如来自人和来自猕猴的G-CSFR或细胞外结构域的配体结合结构域）固定并且将固定的蛋白与本公开内容的蛋白接触来测定时。
为了清楚的目的并且在本文示例性主题的基础上对于本领域技术人员来说应当是显而易见的，在本说明书中提及“亲和性”是指蛋白或抗体的KD。
为了清楚的目的并且在本说明书的基础上对于本领域技术人员来说应当是显而易见的，提及“至少约……的亲和性”应当被理解为意指亲和性（或KD）等于所列举的值或更高（即作为亲和性列举的值较低），即2nM的亲和性高于3nM的亲和性。除非另外表明，所述术语应当为“X或更低的亲和性”其中X为本文列举的值。
“至少约……的IC50”应当被理解为意指IC50等于所列举的值或更高（即作为IC50列举的值较低），即2nM的IC50高于3nM的IC50。除非另外表明，所述术语应当为“X或更低的IC50”其中X为本文列举的值。
在本文中使用，术语“表位”（同义词“抗原决定基”）应当被理解为意指包含抗体的抗原结合域的蛋白与其结合的hG-CSFR的区域。所述术语并非必须限定于蛋白与其接触的特定残基或结构。例如，所述术语包括包含由蛋白接触的氨基酸的区域和在所述区域外的5-10个或2-5个或1-3个氨基酸。在一些实施例中，所述表位包含在hG-CSFR折叠时彼此接近的位置的一系列不连续的氨基酸，即“构象表位”。例如，构象表位在相应于SEQ ID NO:1的111-115、170-176、218-234和/或286-300的区中的一个或多个或者两个或多个或者全部中的氨基酸。本领域技术人员还应知道术语“表位”不限于肽或多肽。例如术语“表位”包括包括分子例如糖侧链、磷酰基侧链或磺酰基侧链的化学活性表面集合，并且，在某些实施方案中，可具有特定的三维结构表征和/或特定的电荷表征。
术语“竞争性抑制”应当被理解为意指本公开内容的蛋白（或者其抗原结合位点）降低或阻碍所列举的抗体或蛋白与G-CSFR，例如hG-CSFR的结合。这可归因于所述蛋白（或抗原结合位点）或抗体与相同或重叠表位的结合。从上文显而易见的是，所述蛋白不需要完全抑制抗体的结合，而是其仅需要将结合降低统计学显著的量，例如，降低至少约10%或20%或30%或40%或50%或60%或70%或80%或90%或95%。优选地，所述蛋白减少所述抗体的结合至少约30%，或优选地至少约50%，更优选地至少约70%，还要更优选地至少约75%，甚至更优选地至少约80%或85%并且甚至更优选地至少约90%。测定结合的竞争性抑制的方法是本领域内已知的和/或如本文所述的。例如，在存在或不存在所述蛋白的情况下，将抗体暴露于G-CSFR。如果在存在所述蛋白的情况下比在不存在所述蛋白的情况下结合的抗体更少，则认为所述蛋白竞争性抑制抗体的结合。在一个实施例中，竞争性抑制并不归因于位阻现象。
两个表位上下文中的“重叠”应当被认为意指两个表位共享足够数目的氨基酸残基以允许结合一个表位的蛋白竞争性抑制结合其他表位的蛋白的结合。例如，“重叠”表位共享至少1或2或3或4或5或6或7或8或9或20个氨基酸。
如本文中所用的，术语“中和”应当被认为意指蛋白能够通过G-CSFR封闭、减少或妨碍细胞中G-CSF介导的信号转导。测定中和的方法是本领域中已知的和/或如本文所述的。
如在本文中所用的，“病状”是指破坏或干扰正常功能并且不限于任何特定病状并且将包括疾病或病征。
如在本文中所用的，“G-CSF相关的病状”是指由嗜中性粒细胞、过量的G-CSF或表达G-CSFR的细胞或者G-CSF的施用导致的或与嗜中性粒细胞、过量的G-CSF或表达G-CSFR的细胞或者G-CSF的施用有关的病状。本领域技术人员将能够容易地确定这些病状。就此而言，在一些实施例中，所述病状是炎性病状、自身免疫性病状或癌症（包括转移）。
如本文中所用的，术语“预防（preventing）”、“预防（prevent）”或“预防（prevention）”包括施用本公开内容的蛋白以由此停止或阻止疾病的至少一种症状的发展。所述术语还涵盖对缓解中的受试者的治疗以预防或阻止复发。例如，在缓解期间治疗患有缓解-复发型多发性硬化症的患者由此预防复发。
如在本文中所用的，术语“治疗（treating）”、“治疗（treat）”或“治疗（treatment）”包括施用本文所述的蛋白以由此减少或消除特定疾病或病状的至少一种症状。
如本文所用的，术语“嗜中性粒细胞减少症”英被理解为涵盖轻微的嗜中性粒细胞减少症（1000<=ANC<1500）、中度嗜中性粒细胞减少症（500<=ANC<1000）和严重的嗜中性粒细胞减少症（ANC<500）（在每微升血液的细胞中测量的绝对嗜中性粒细胞计数（ANC））
如本文所用的，术语“受试者”应当被认为意指任何动物，包括人，例如哺乳动物。示例性的受试者包括但不限于人和非人灵长目动物。例如受试者是人。
抗体
在一个实施例中，如本文所述的根绝任一实施例的蛋白是抗体。
生成抗体的方法在本领域内是已知的和/或描述于Harlow和Lane（编辑）Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，(1988)。通常，在这类方法中，将G-CSFR（例如hG-CSFR）或其区（例如细胞外结构域）或免疫原性片段或其表位或表达并展示其的细胞（即免疫原），任选地与任何适合的或期望的载体、佐剂或药学上可接受的赋形剂一起配制，并适用于非人动物，例如小鼠、鸡、大鼠、兔、豚鼠、狗、马、牛、山羊或猪。可以通过鼻内、肌肉内、皮下、静脉内、皮内、腹膜内途径或通过其他已知的途径施用免疫原。
可以通过对免疫后不同时间点的免疫动物采集血液来监测多克隆抗体的产生。如果需要达到期望的抗体滴度，可以给予一次或多次另外的免疫。重复增强和滴定的过程直到达到适合的滴度。当获得期望的免疫原性水平时，对免疫动物取血，分离血清并储存，和/或使用动物来产生单克隆抗体（mab）。
单克隆抗体是本公开所考虑的一种示例性的抗体形式。术语“单克隆抗体”或“mAb”是指能够与相同的抗原，例如抗原内相同的表位，结合的同质抗体群。该术语并非意图限制抗体的来源或产生抗体的方式。
为了产生mAb，可以使用多种已知技术中的任何一种，诸如例如，US4196265或Harlow和Lane（1988）同上中示例的程序。
例如，在足以刺激抗体生产细胞的条件下，用免疫原免疫适合的动物。啮齿动物诸如兔、小鼠和大鼠是示例性动物。经遗传改造以表达人抗体并且例如不表达小鼠抗体的小鼠，也可以用于产生本公开内容的抗体（例如，如WO2002/066630中所描述）。
免疫后，选择具有产生抗体潜能的体细胞，尤其是B淋巴细胞（B细胞），用于产生mAb的方案中。这些细胞可以获得自脾、扁桃体或淋巴结的活检组织，或获得自外周血样品。之后将来自免疫动物的B细胞与永生的骨髓瘤细胞融合，所述骨髓瘤细胞通常来源于与免疫原所免疫的动物相同的物种。
通过在包含能在组织培养基中阻断核苷酸重新合成的试剂的选择培养基中培养来扩增杂合体。示例性的试剂氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。
将扩增的杂交瘤经历抗体特异性和/或滴度的功能选择，例如，通过流式细胞术和/或免疫组化和/或免疫测定（例如放射性免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、空斑测定、斑点免疫测定以及类似测定）。
可选择地，ABL-MYC技术（NeoClone，Madison WI53713，USA)用于产生分泌MAb的细胞系(例如，如Largaespada等人，J.Immunol.Methods.197:85-95，1996中所描述的）。
还可以通过筛选展示文库，例如噬菌体展示文库，来产生和分离抗体，例如如US6300064和/或US5885793中所描述的。例如，本发明人已经从噬菌体展示文库完全分离了人抗体。
如本文所用的，结合hG-CSFR的本公开内容的一些蛋白与cynoG-CSFR交叉反应和/或与hG-CSFR的一些突变形式或者包含已经被突变的hG-CSFR的区和/或不是其他的多肽结合和/或与hG-CSFR中的特定表位结合。这些表征可被用于抗体或包含其结合位点的蛋白的生成。
例如，用包含hG-CSFR的配体结合结构域的多肽筛选噬菌体展示文库以鉴定与其结合的蛋白。所述蛋白未与其可检测地结合的hG-CSFR的配体结合结构域的突变形式（例如SEQ ID NO:1的位点287的丙氨酸突变）之后被用于除去交叉反应的蛋白而所述蛋白与其结合的hG-CSFR的配体结合结构域的突变形式或其区（例如SEQ ID NO:1的位点168的丙氨酸突变）被用于分离正确交叉反应的蛋白。同样可基于上文设计对免疫非人哺乳动物的筛选过程。
在另一个实施例中，筛选噬菌体展示文库或者用包含cynoG-CSFR的配体结合结构域的多肽免疫动物并且筛选所鉴定的蛋白和/或抗体以鉴定与hG-CSFR和/或其配体结合结构域交叉反应的那些。
在另外的实施例中，G-CSFR或其配体结合结构域（任选地与C1.2或C1.2G结合的突变形式）与C1.2或C1.2G接触。之后将噬菌体展示文库与G-CSFR或配体结合结构域和表达可为了所选择的结合与C1.2或C1.2G竞争的噬菌体接触。
在还有另外的实施例中，嵌合抗体包含例如其中来自hG-CSFR的感兴趣的表位被取代为相应的小鼠序列的小鼠G-CSFR。嵌合蛋白之后被用于免疫小鼠（其不太可能诱导抗所述小鼠蛋白的免疫响应）和/或筛选噬菌体文库。所获得的抗体/蛋白之后被删选以鉴定与hG-CSFR（尤其是在感兴趣的表位处）结合而不与小鼠G-CSFR结合的那些。
本公开内容的抗体可以是合成抗体。例如抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或去免疫化抗体。
嵌合抗体
在一个实施例中，本文描述的抗体是嵌合抗体。术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种（例如，鼠科，如小鼠）或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源而所述链的其余部分与来源于另一物种(如，灵长目动物，诸如人)的或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的抗体。通常，嵌合抗体使用啮齿目或兔可变区和人恒定区以便产生具有绝对优势的人结构域的抗体。生产嵌合抗体的方法描述于例如US4816567和US5807715中。
人源化抗体和人抗体
本公开内容的抗体可以是人源化的或人的。
术语“人源化抗体”应被理解为是指一种嵌合抗体亚类，其具有来源于来自非人物种的抗体的抗原结合位点或可变区和基于人抗体的结构和/或序列的其余的抗体结构。在人源化抗体中，抗原结合位点通常包含来自非人抗体的移植到人抗体可变区的适当FR上的互补性决定区（CDR)和来自人抗体的其余区。抗原结合位点可以是野生型的（即与非人抗体的相同）或被一个或多个氨基酸取代修饰。在某些情况下，人抗体的FR残基由相应的非人残基取代。
非人抗体或或其一部分（例如，可变区）人源化的方法是本领域内已知的。可以按照US5225539或US5585089的方法进行人源化。不排除抗体人源化的其他方法。
如本文所用的，术语“人抗体”是指具有来源于或相应于人（例如人种系细胞或体细胞）中所存在的序列的可变区（例如VH、VL）以及任选地恒定区的抗体。“人抗体”可以包括不是人序列所编码的氨基酸残基，例如通过体外随机或定点突变所引入的突变（尤其是涉及少量的抗体残基，例如抗体的1、2、3、4、5或6个残基，例如构成抗体CDR中的一个或多个的1、2、3、4、5或6个残基中的保守型取代或突变）。这些“人抗体”实际上并非必需由人产生，而是，它们可以使用重组方法产生和/或可以从包含编码人抗体恒定区和/或可变区的核酸的转基因动物（例如，小鼠）分离（例如，如上文所述）。人抗体可以使用本领域内已知的多种技术来产生，包括噬菌体展示文库（例如，如US5885793中所描述的)。
识别所选表位的人抗体还可以使用称为“定向选择（guided selection)”的技术来生成。在该方法中，所选的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择（例如，如US5565332中所描述的）。
示例性的人抗体描述于本文并且包括C1.2和C1.2G和/或其可变区。这些人抗体与非人抗体相比提供在人中减少的免疫原性的益处。
包含蛋白的抗体结合结构域
单结构域抗体
在一些实施例中，本公开内容的蛋白是或包含单结构域抗体（其与术语“结构域抗体”或“dAb”可交换使用）。单结构域抗体是包含抗体的所有或一部分重链可变区的单条多肽链。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体（Domantis,Inc.,Waltham,MA;参见例如US6248516）。
双抗体、三抗体、四抗体
在一些实例中，本公开内容的蛋白是或包含双抗体、三抗体、四抗体或更高次的蛋白复合物诸如WO98/044001和/或WO94/007921中所描述的。
例如，双抗体是包含两条相关多肽链的蛋白，每条多肽链都包含结构VL-X-VH或VH-X-VL，其中VL是抗体轻链可变区，VH是抗体重链可变区，X是包含不足以允许单条多肽链中的VH和VL连接（或形成Fv）的残基的连接体或不存在，并且其中一条多肽链的VH与其他多肽链的VL结合形成抗原结合位点，即形成能够特异性结合一种或多种抗原的Fv分子。VL和VH在每条多肽链中可以是相同的，或者VL和VH在每条多肽链中可以是不同的以便形成双特异性双抗体（即，包含具有不同特异性的两个Fv）。
单链Fv（scFv）
本领域技术人员应当知道，scFv包含处于单条多肽链中的VH和VL区以及VH和VL间的多肽连接体，所述多肽连接体使得scFv能够形成期望的用于抗原结合的结构（即，用于单条多肽链的VH和VL彼此连接形成Fv)。例如，连接体包含超过12个氨基酸残基，(Gly4Ser)3是scFv的多个优选连接体中的一个。
本公开内容还考虑二硫化物稳定的Fv(或diFv或dsFv)，其中将一个半胱氨酸残基引入VH的FR和VL的FR，并且半胱氨酸残基通过二硫键连接产生稳定的Fv。
可选择地或另外地，本公开内容包括二聚scFv，即包含通过非共价或共价键合例如通过亮氨酸拉链结构域（例如，来源于Fos或Jun)而连接的两个scFv分子的蛋白。可选择地，两个scFv通过长度足以允许两个scFv形成并能够结合抗原的肽连接体连接，如在US20060263367中所描述的
重链抗体
就重链抗体包含重链但不包含轻链而言，重链抗体在结构上与很多其他形式的抗体的不同。因此，这些抗体也被称为“只有重链的抗体”。重链抗体见于例如，骆驼和软骨鱼（也称为IgNAR)中。
在骆驼抗体以及IgNAR的V-NAR中，天然存在的重链抗体中存在的可变区通常被称为“VHH结构域”，以便将它们与常规4链抗体中所存在的重链可变区（其被称为“VH结构域”）和常规4链抗体中所存在的轻链可变区（其被称为VL结构域”）区别开来。
对来自骆驼的重链抗体及其可变区以及用于它们的生产和/或分离和/或使用的方法的一般描述参见（除了其他的之外）以下参考文献：WO94/04678、WO97/49805和WO97/49805。
来自软骨鱼的重链免疫球蛋白及其可变区以及用于它们的生产和/或分离和/或使用的方法的一般描述参见（除了其他的之外）WO2005/118629。
其他抗体和抗体片段
本公开内容还考虑其他抗体和抗体片段，例如：
(i)US5,731,168中所描述的“钥孔（key and hole）”双特异性蛋白；
(ii)异源轭合蛋白，例如US4,676,980中所描述的；
(iii)使用化学交联连接体产生的异源轭合蛋白，例如如US4,676,980中所描述的；以及
(iv)Fab3（例如，如EP19930302894中所描述的）。
去免疫化抗体和蛋白
本公开内容还考虑去免疫化抗体或蛋白。去免疫化抗体和蛋白被移除了一个或多个表位例如B细胞表位或T细胞表位（即，突变），以由此降低哺乳动物将激发对所述抗体或蛋白的免疫应答的可能性。产生去免疫化抗体和蛋白的方法是本领域内已知的，且描述于例如WO00/34317、WO2004/108158和WO2004/064724中。
基于本文的描述，引入适合的突变并表达和测定所产生的蛋白的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。
对蛋白的突变
本公开内容同样考虑本公开内容的蛋白的突变形式。就此而言，本文所示的数据表明本公开内容的蛋白的CDR中的位点，其除了可被进行的示例性改变之外还可被改变。本领域技术人员应当理解的是在本公开内容的上下文中改变可另外地或可选择地在包含蛋白的可变区的FR中进行而不抑制或显著减少其功能。
例如，与本文中所展示的序列相比，这样的突变蛋白包含一个或多个保守氨基酸取代。在一些实施例中，所述蛋白包含30或更少或20或更少或10或或更少例如9或8或7或6或5或4或3或2个保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链和/或亲水性和/或亲水性的氨基酸取代的取代。
在一个实施例中，突变蛋白当与天然存在的蛋白相比时仅具有或不超过一个或两个或三个或四个或五个或六个保守的氨基酸改变。保守氨基酸改变的细节提供于下文。如本领域技术人员应当知道的，例如从本文的公开内容，这样的小改变可被合理预测而不改变所述蛋白的活性。
本领域中已经定义具有相似侧链的氨基酸残基的家族，包括碱性侧链（例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸），酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸），不带电的极性侧链（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸），非极性侧链（例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸），β-分支的侧链（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。
本公开内容同样考虑本公开内容的蛋白中，例如在CDR例如CDR3中，的非保守的氨基酸改变（例如取代）。例如，本申请人已经鉴定可以进行同时维持本公开内容的蛋白的活性的几个非保守的氨基酸取代。在一个实施例中，所述蛋白包含少于6或5或4或3或2或1个的非保守的氨基酸取代，例如在CDR3中，诸如在CDR3中。
本公开内容同样考虑与本文所展示的序列相比的一个或多个插入或缺失。在一些实施例中，所述蛋白包含10或者更少例如例如9或8或7或6或5或4或3或2个插入和/或缺失。
保守区
本公开内容涵盖包含抗体恒定区的本文描述的蛋白和/或抗体。这包括与Fc融合的抗体的抗原结合片段。
对产生本公开内容的蛋白有用的恒定区的序列可从许多不同来源获得。在一些实施例中，所述蛋白的恒定区或其部分来源于人抗体。恒定区或其部分可来源于任何抗体类型的抗体，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何抗体同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一个实施例中，恒定区是人同种型IgG4或稳定化的IgG4恒定区。
在一个实施例中，恒定区的Fc区具有减少的诱导效应子功能的能力，例如与天然或野生型人IgG1或IgG3Fc区相比。在一个实施例中，效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和/或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）和/或补体依赖性细胞毒性（CDC）。评估包括蛋白的Fc区的效应子功能的水平是本领域中已知的和/或描述于本文。
在一个实施例中，Fc区是IgG4Fc区（即来自IgG4恒定区），例如人IgG4Fc区。适合的IgG4Fc区的序列对本领域技术人员来说是显而易见的和/或在公众可获得的数据库中可获得的（例如，可从National Center for Biotechnology Information获得）。
在一个实施例中，恒定区是稳定的IgG4恒定区。术语“稳定的IgG4恒定区”应被理解为意指已经被修饰以减少Fab臂交换或经历Fab臂交换或形成半抗体的倾向或形成半抗体的倾向的IgG4恒定区。“Fab臂交换”是指对人IgG4的一类蛋白质修饰，其中IgG4重链和连接的轻链(半分子)交换成来自另一IgG4分子的重-轻链对。因此，IgG4分子可获得识别两种不同的抗原的两个不同的Fab臂(产生双特异性分子)。Fab臂交换在体内天然存在且可由纯化的血液细胞或还原剂例如还原的谷胱甘肽体外诱导。“半抗体”在IgG4抗体分解以形成各自含有单个重链和单个轻链的两个分子时形成。
在一个实施例中，稳定的IgG4恒定区包含根据Kabat的系统（Kabat等人，Sequencesof of Proteins of Immunological Interest Washington DC United StatesDepartment of Health and Human Services,1987和/或1991）在铰链区的位点241处的脯氨酸。所述位点相应于根据EU编号系统(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest Washington DC United States Department of Health andHuman Services，2001和Edelman等人，Proc.Natl.Acad.USA，63，78-85，1969)的铰链区的位点228。在人IgG4中，所述残基通常为丝氨酸。在丝氨酸取代脯氨酸之后，IgG4绞链区包含序列CPPC。就此而言，技术人员应当知道“铰链区”为赋予抗体的两个Fab臂移动性的连接Fc和Fab区的抗体重链恒定区的富脯氨酸部分。所述铰链区包括半胱氨酸残基，其参与重链间二硫键。根据Kabat的编号系统，其通常被定义为自人IgG1的Glu226至Pro243的一段。其它IgG同种型的绞链区可通过将形成重链间二硫(S-S)键的第一半胱氨酸残基和最后的半胱氨酸残基放置在相同位置来与IgGl序列比对(参见，例如WO2010/080538)。
稳定的IgG4抗体的另外的实施例是其中人IgG4的重链恒定区中位点409的精氨酸（根据EU编号系统）被赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸取代（例如如WO2006/033386中所描述的）。恒定区的Fc区可另外地或可选择地包含选自由下列组成的组的残基：相应于405的位点（根据EU编号系统）处的丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。任选地，铰链区包含位点241处的脯氨酸（即CPPC序列）（如上文所描述的）。
在另一个实施例中，Fc区是被修饰具有减少的效应子功能的Fc区，即“非免疫刺激的Fc区”。例如，Fc区是包含选自由268、309、330和331所组成的组的一个或多个位点处的取代的IgG1Fc区。在另一个实施例中，Fc区是包含下列变化E233P、L234V、L235A中的一个或多个和G236的缺失和/或下列变化A327G、A330S和P331S中的一个或多个的IgG1Fc区（（Armour等人，Eur J Immunol.29:2613-2624,1999；Shields等人，J Biol Chem.276（9）:6591-604,2001））。非免疫刺激的Fc区的另外的实例被描述于例如Dall'Acqua等人，J Immunol.177:1129-11382006；和/或Hezareh J Virol；75:12161-12168,2001）中。
在另一个实施例中，Fc区是嵌合的Fc区，例如包含来自IgG4抗体的至少一个CH2结构域和来自IgG1抗体的至少一个CH3结构域，其中Fc区包含选自由240、262、264、266、297、299、307、309、323、399、409和427（EU编号）组成的组的一个或多个氨基酸位点处的取代（例如WO2010/085682中所描述的）。示例性的取代包括240F、262L、264T、266F、297Q、299A、299K、307P、309K、309M、309P、323F、399S和427F。
另外的修饰
本公开内容还考虑了对抗体的另外的修饰。
例如，抗体包含能增加抗体的半衰期的一个或多个氨基酸取代。例如，抗体包含包含能提高Fc区对新生Fc区（FcRn)的亲和性的一个或多个氨基酸取代的Fc区。例如，Fc区在较低的pH（例如约pH6.0）时对FcRn具有提高的亲和性，以促进内涵体中的Fc/FcRn结合。在一个实施例中，与Fc区在约pH7.4时的亲和力相比，其在约pH6时具有对FcRn增加的亲和性，这促进了Fc在细胞再循环之后重新释放入血液中。这些氨基酸取代通过降低从血液的清除率对延长蛋白的半衰期有用。
示例性的氨基酸取代包括按照EU编号系统的T250Q和/或M428L或T252A、T254S和T266F或M252Y、S254T和T256E或H433K和N434F。例如，在US20070135620或US7083784中描述了另外的或可选择的氨基酸取代。
蛋白生产
在一个实施例中，根据任一实施例的本文描述的蛋白通过在足以产生所述蛋白的条件下培养杂交瘤来产生，例如如本文所描述和/或本领域内已知的。
重组表达
在另一个实施例中，根据任一实施例的本文所述的蛋白是重组的。
在重组蛋白的情况下，可以将编码其的核酸克隆入表达构建体或载体中，其之后可被到宿主细胞例如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、人胚胎肾（HEK）细胞或除此之外不产生所述蛋白的骨髓瘤细胞中。用于表达蛋白的示例性细胞是CHO细胞、骨髓瘤细胞或HEK细胞。实现这些目标的分子克隆技术是本领域内已知的并且描述于例如Ausubel等人（编辑），Current Protocols inMolecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience（1988，包括迄今为止的所有修订）或Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press（1989）中。大量的克隆和体外扩增方法适用于重组核酸的构建。产生重组抗体的方法在本领域内是已知的。参见US4816567或US5530101。
分离后，将插入的核酸与表达构建体或表达载体中的启动子可操作地连接用于进一步的克隆（DNA的扩增）或用于在无细胞系统或细胞中表达。
如本文所用的，术语“启动子”应在其最宽泛的背景下来理解并且包括基因组基因的转录调控序列，包括精确转录起始所需的TATA盒或起始子元件，具有或不具有改变核酸表达，例如以响应于发育和/或外部刺激的方式或以组织特异性方式，的其他调控元件（例如，上游激活序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子。在本背景下，术语“启动子”还被用于描述重组的、合成的或融合核酸或者赋予、激活或增强与其可操作地连接的核酸的表达的衍生物。示例性的启动子可以含有一个或多个特异性调控元件的另外的拷贝以进一步增强所述核酸的表达和/或改变所述核酸的空间表达和/或时间表达。
如本文所用的，术语“与……可操作地连接”表示将启动子相对于核酸定位以使得所述核酸的表达受到所述启动子的控制。
用于在细胞中表达的很多载体是可获得的。载体组分通常包括但不限于下列中的一个或多个：信号序列、编码蛋白的序列（例如，来源于本文提供的信息）、增强子元件、启动子和转录终止序列。本领域技术人员应当知道用于表达蛋白的适合的序列。示例性的信号序列包括原核分泌信号（例如，pelB、碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或耐热肠毒素II）、酵母分泌信号（例如，转化酶前导序列、α因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列）或哺乳动物分泌信号（例如，单纯疱疹gD信号）。
在哺乳动物细胞中有活性的示例性启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子（CMV-IE）、人延伸因子1-α启动子（EF1）、小核RNA启动子（U1a和U1b）、α-肌凝蛋白重链启动子、猿猴病毒40启动子（SV40）、劳氏肉瘤病毒启动子（RSV)、腺病毒主要晚期启动子、β-肌动蛋白启动子；包含CMV增强子/β-肌动蛋白启动子的杂合体调控元件或免疫球蛋白启动子或其活性片段。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1系（COS-7，ATCCCRL1651）；人胚胎肾系（293或经亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293细胞）；幼仓鼠肾细胞（BHK，ATCC CCL10）或中国仓鼠卵巢细胞（CHO）。
适于在酵母细胞例如诸如选自包括毕赤酵母（Pichia pastoris）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和裂殖酵母（S.pombe）的组的酵母细胞中表达的典型的启动子包括但不限于ADH1启动子、GAL1启动子、GAL4启动子、CUP1启动子、PHO5启动子、nmt启动子、RPR1启动子或TEF1启动子。
将分离的核酸或包含其的表达构建体引入细胞用于表达的方法是本领域技术人员已知的。用于给定细胞的技术取决于已知的成功技术。将重组DNA引入细胞中的方法包括，除了其他的之外，显微注射、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染例如通过使用lipofectamine（Gibco，MD，USA）和/或cellfectin（Gibco，MD，USA）、PEG介导的DNA摄取、电穿孔和微粒轰击诸如通过使用包被DNA的钨或金颗粒（Agracetus Inc.，WI，USA）。
用于产生所述蛋白的宿主细胞可以在多种培养基中培养，这取决于所用的细胞类型。商业上可获得的培养基诸如Ham的Fl0（Sigma）、最小必需培养基（（MEM），Sigma）、RPM1-1640（Sigma）和Dulbecco改良的Eagle培养基（（DMEM)，Sigma）适合培养哺乳动物细胞。培养本文讨论的其他细胞类型的培养基是本领域内已知的。
蛋白的分离
分离蛋白的方法是本领域中已知的和/或描述于本文。
如果蛋白被分泌到培养基中，首先可使用商业上可获得的蛋白浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元，来自这些表达系统的上清液。可以在上述步骤的任一步中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解并且可以包括抗生素以防止外来污染物生长。可选择地或另外地，上清液可从表达所述蛋白的细胞过滤和/或分离，例如使用连续的离心。
例如，可以使用离子交换、羟基磷灰石层析、疏水作用层析、凝胶电泳、透析、亲和层析（例如，蛋白A亲和层析或蛋白G层析）或上述的任意组合纯化从细胞制备的蛋白。这些方法是本领域内已知的并且描述于例如WO99/57134或Ed Harlow和David Lane（编辑）Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)中。
本领域技术人员还应当知道蛋白可以被修饰以包括能够促进纯化或检测的标记，例如多组氨酸标记，诸如六组氨酸标记，或流感病毒血凝素（HA）标记或猿猴病毒5（V5）标记或FLAG标记或谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记。然后，使用本领域内已知的方法例如亲和纯化来纯化所获得的蛋白。例如，通过将包含蛋白的样品与能特异性结合固定于固体或半固体支持物上的六组氨酸标记的镍-氨基三乙酸（Ni-NTA)接触，清洗样品以去除未结合的蛋白以及随后洗脱所结合的蛋白来纯化包含六组氨酸标签的蛋白。可选择地或另外地，与标记结合的配体或抗体用于亲和纯化方法中。
测定蛋白的活性
与G-CSFR及其突变体的结合
从本文公开内容看来对本领域技术人员而言是显而易见的本公开内容的一些蛋白与hG-CSFR的配体结合结构域并且与hG-CSFR的配体结合结构域的特定突变形式结合（例如没有或有某些点突变的SEQ ID NO:1）和/或与人和猕猴G-CSFR结合。测定与蛋白结合的方法是本领域中已知的，例如如Scopes（于Protein purification:principles andpractice，第三版，Springer Verlag，1994中）中所描述的。这样的方法通常包括标记所述蛋白并且将其与固定的抗原接触。清洗以除去非特异性结合的蛋白之后，检测标记以及，作为结果，被结合的蛋白的量。当然，所述蛋白可被固定而所述抗原被标记。他偶像按类型的测定也可被使用。可选择地或另外地，表面等离子共振测定可被使用。
上文描述的测定同样被用于检测蛋白与hG-CSFR或其配体结合结构域（例如SEQID NO:1）或其突变形式结合的水平。
在一个实施例中，本公开内容的蛋白以其与SEQ ID NO:1结合基本上相同的水平（例如在10%或5%或1%内）与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点167的赖氨酸和/或其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点168的组氨酸的SEQ ID NO:1的多肽结合。
在一个实施例中，本公开内容的蛋白以低于其与SEQ ID NO:1结合的至少约100倍或150倍或160倍或200倍的水平与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点287的精氨酸的SEQ IDNO:1的多肽结合。在一个实施例中，本公开内容的蛋白以低于其与SEQ ID NO:1结合的至少约160倍的水平与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点287的精氨酸的SEQ ID NO:1的多肽结合。
在一个实施例中，本公开内容的蛋白以低于其与SEQ ID NO:1结合的至少约20倍或40倍或50倍或60倍的水平与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点237的组氨酸的SEQ IDNO:1的多肽结合。在一个实施例中，本公开内容的蛋白以低于其与SEQ ID NO:1结合的至少约50倍的水平与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点237的组氨酸的SEQ ID NO:1的多肽结合。
在一个实施例中，本公开内容的蛋白以低于其与SEQ ID NO:1结合的至少约20倍或40倍或60倍或70倍的水平与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点198的甲硫氨酸的SEQ IDNO:1的多肽结合。在一个实施例中，本公开内容的蛋白以低于其与SEQ ID NO:1结合的至少约40倍的水平与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点198的甲硫氨酸的SEQ ID NO:1的多肽结合。
在一个实施例中，本公开内容的蛋白以低于其与SEQ ID NO:1结合的至少约20倍或30倍或40倍的水平与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点172的酪氨酸的SEQ ID NO:1的多肽结合。在一个实施例中，本公开内容的蛋白以低于其与SEQ ID NO:1结合的至少约40倍的水平与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点172的酪氨酸的SEQ ID NO:1的多肽结合。
在一个实施例中，本公开内容的蛋白以低于其与SEQ ID NO:1结合的至少约100倍或120倍或130倍或140倍的水平与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点171的亮氨酸的SEQ IDNO:1的多肽结合。在一个实施例中，本公开内容的蛋白以低于其与SEQ ID NO:1结合的至少约140倍的水平与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点171的亮氨酸的SEQ ID NO:1的多肽结合。
在一个实施例中，本公开内容的蛋白以低于其与SEQ ID NO:1结合的至少约20倍或40倍或60倍或70倍的水平与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点111的亮氨酸的SEQ IDNO:1的多肽结合。在一个实施例中，本公开内容的蛋白以低于其与SEQ ID NO:1结合的至少约60倍的水平与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点111的亮氨酸的SEQ ID NO:1的多肽结合。
在一个实施例中，本公开内容的蛋白以低于其与SEQ ID NO:1结合的不超过5倍或4倍或3倍或2倍或1倍的水平与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点168的组氨酸的SEQ IDNO:1的多肽结合。
在一个实施例中，本公开内容的蛋白以低于其与SEQ ID NO:1结合的不超过5倍或4倍或3倍或2倍或1倍的水平与其中丙氨酸取代SEQ ID NO:1位点167的赖氨酸的SEQ IDNO:1的多肽结合。
结合的水平使用生物传感器常规测定。
本公开内容涵盖上文表征的任意组合。在一个实施例中，本文描述的蛋白具有上述七个段落中展示的所有结合表征。
表位做图
在另一个实施例中，将由本文所述的蛋白结合的表位做图。表位做图方法对于本领域的技术人员将是显而易见的。例如，生产一系列跨越hG-CSFR序列或其包含感兴趣的表位的区的重叠肽，例如，包含10-15个氨基酸的肽。之后使所述蛋白与各种肽接触并且测定与其结合的肽。这容许测定包含所述蛋白结合的表位的肽。如果多个非邻近肽被所述蛋白结合，则所述蛋白可结合构象表位。
可选择地或另外地，将hG-CSFR内的氨基酸残基突变，例如通过丙氨酸扫描诱变，并且测定减少或阻碍蛋白结合的突变。减少或阻碍所述蛋白的结合的任何突变很可能在所述蛋白结合的表位内。
另外的方法本文是示例性的，并且包括将hG-CSFR或其区域与本公开内容的固定的蛋白结合并且用蛋白酶消化所获得的复合物。之后分离并分析保持与固定的蛋白结合的肽，例如使用质谱，以测定它们的序列。
另外的方法包括将在hG-CSFR或其区中的氢转化成氘原子并且将所获得的蛋白与本公开内容的固定的蛋白结合。之后使氘原子变回氢，将hG-CSFR或其区分离，用酶消化并且分析，使用例如质谱，以鉴别包含氘的那些区，其可能已经因本文所述的蛋白的结合被保护而没有转化成氢。
任选地，测定蛋白对hG-CSFR或其表位的解离常数（Kd）。hG-CSFR结合蛋白的“Kd”或“Kd值”是通过通过放射性标记或荧光标记的hG-CSFR结合测定所测量的一个实例。所述测定使得在存在滴定系列的未标记的hG-CSFR的情况下所述蛋白与极低浓度的标记的G-CSFR平衡。在洗涤以除去未结合的hG-CSFR之后，测定标记物的量，其表示所述蛋白的Kd。
根据另一个实施例，所述Kd或Kd值通过使用表面等离子共振测定来测量，例如使用具有固定的hG-CSFR或其区的BIAcore表面等离子共振（BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ）
在一些实施例中，选择具有相似Kd或高于C1.2或C1.2G的Kd的蛋白，因为它们有可能竞争结合hG-CSFR
确定竞争性结合
用于测定竞争性抑制单克隆抗体C1.2或C1.2G的结合的蛋白的测定对于本领域的技术人员是显而易见的。例如，使C1.2或C1.2G与可检测的标记物例如荧光标记物或放射性标记物的轭合。随后将所述标记的抗体与测试蛋白混合并且与hG-CSFR或其区（例如包含SEQ ID NO:1的多肽）或表达其的细胞接触。随后测定标记的C1.2或C1.2G的水平且将其与当所述标记的抗体在所述蛋白不存在时与所述hG-CSFR、区或细胞接触时测定的水平相比较。如果与所述蛋白不存在时相比，标记的C1.2或C1.2G的水平在所述测试蛋白存在时降低，那么所述蛋白被认为竞争性抑制C1.2或C1.2G与hG-CSFR的结合。
任选地，测试蛋白与对C1.2或C1.2G的不同的标记物轭合。这一交替的标记允许检测测试蛋白与hG-CSFR或其区或所述细胞结合的水平。
在另一个实施例中，容许蛋白结合hG-CSFR或其区（例如包含SEQ ID NO:1的多肽）或表达其的细胞，在将所述hG-CSFR、区或细胞与C1.2或C1.2G接触之前。与所述蛋白不存在时相比，所述蛋白存在时结合的C1.2或C1.2G的量减少表明所述蛋白竞争性抑制C1.2或C1.2G与hG-CSFR的结合。交互测定还可使用标记的蛋白并且首先允许C1.2或C1.2G与G-CSFR结合来进行。在这种情况下，与在C1.2或C1.2G不存在时相比，在C1.2或C1.2G存在时与hG-CSFR结合的标记的蛋白的减少的量表明所述蛋白竞争性抑制所述C1.2或C1.2G与hG-CSFR的结合。
上述测定中的任一个可用hG-CSFR的突变形式和/或SEQ ID NO:1和/或与C1.2或C1.2G结合的hG-CSFR的配体结合区进行，例如如本文描述的。
确定中和
在本公开内容的一些实施例中，蛋白能够中和hG-CSFR信号。
用于评价蛋白通过受体中和配体信号的能力的各种测定是本领域内已知的。
在一个实施例中，所述蛋白降低或阻碍G-CSF与hG-CSFR的结合。这些测定可以作为竞争结合测定使用标记的G-CSF和/或标记的蛋白如本文所描述的进行。
在另一个实施例中，所述蛋白降低当在G-CSF存在的情况下培养CD34+骨髓细胞时CFU-G的形成。在这样的测定中，在测试蛋白存在或不存在的情况下，CD34+骨髓细胞在G-CSF（例如约10ng/ml细胞培养基）以及任选地干细胞因子（例如约10ng/ml细胞培养基）存在的情况下在半固体细胞培养基中培养。在对粒细胞克隆（CFU-G）形成来说足够的时间之后，确定克隆或集落的数目。所述蛋白存在时与所述蛋白不存在时相比集落数目的减少表明所述蛋白中和G-CSF信号。通过测试多种浓度的蛋白，确定IC50，即在CFU-G形成的50%最大抑制发生时的浓度。在一个实施例中，IC50是0.2nM或更少，例如0.1nM或更少，例如0.09nM或更少，或者0.08nM或更少，或者0.07nM或更少，或者0.06nM或更少或者0.05nM或更少。在一个实施例中，IC50是0.04nM或更少。在另一个实施例中，IC50是0.02nM或更少。上述IC50与本文描述的任一CFU-G测定相关。
在另外的实施例中，所述蛋白减少在G-CSF存在是培养的表达hG-CSFR的细胞的增殖（例如BaF3细胞）。将细胞在G-CSF存在（例如0.5ng/ml）和测试蛋白存在或不存在的情况下培养。评价细胞增殖的方法是本领域中已知的并且包括例如MTT还原和胸腺嘧啶核苷掺入。与在所述蛋白不存在时观察到的水平相比减少增殖水平的蛋白被认为中和G-CSF信号。通过测试多种浓度的蛋白，确定IC50，即在细胞增殖的50%最大抑制发生时的浓度。在一个实施例中，IC50是6nM或更少，例如5.9nM或更少。在另一个实施例中，IC50是2nM或更少或1nM或更少或0.7nM或细胞或0.6nM或更少或0.5nM或更少。上述IC50与本文描述的任一细胞增殖测定相关。
在另外的实施例中，所述蛋白在G-CSF施用之后减少造血干细胞和/或内皮先祖细胞的体内驱动和/或减少体内嗜中性粒细胞的数目，例如在G-CSF施用之后（然而这不是必需的）。例如，将所述蛋白在任选地施用G-CSF或其修改的形式（例如聚乙二醇化的G-CSF或非格司亭）之前、之时或之后施用于受试者。测定造血干细胞（例如表达CD34和/或Thy1）和/或内皮先祖细胞（例如表达CD34和VEGFR2）和/或嗜中性粒细胞（形态学鉴定的和/或表达例如CD10、CD14、CD31和/或CD88的）的数目。与在所述蛋白不存在时观察到的水平相比减少所述细胞水平的蛋白被认为中和G-CSF细胞。在一个实施例中，所述蛋白减少嗜中性粒细胞的数目而不诱导嗜中性粒细胞减少症。
本公开内容还考虑了评价G-CSF信号中和的其他方法。
确定效应子功能
如本文所讨论的，本公开内容的一些蛋白具有减少的效应子功能。评价ADCC活性的方法是本领域中已知的。
在一个实施例中，使用51Cr释放测定、铕释放测定或35S释放测定评价ADCC活性的水平。在这些测定的每一种中，将表达G-CSFR的细胞与一种或多种所述化合物在足以使化合物被细胞摄取的条件下培养一段时间。在35S释放测定的情况下，可以将表达hG-CSFR的细胞与35S标记的甲硫氨酸和/或半胱氨酸培养足以使标记的氨基酸被掺入新合成的蛋白中的时间。然后，在存在或不存在所述蛋白以及存在免疫效应细胞如外周血单核细胞（PBMC)和/或NK细胞的情况下培养细胞。然后检测细胞培养基中51Cr、铕和/或35S的量，并且与蛋白不存在时相比，所述蛋白存在是几乎没有或没有变化（或与在包含人IgG1Fc的抗hG-CSFR抗体存在时观察到的水平相比所述化合物的减少的水平）表明蛋白具有减少的效应子功能。公开了评价蛋白所诱导的ADCC水平的示例性出版物包括Hellstrom等人，Proc.NatlAcad.Sci.USA83:7059-7063，1986以及Bruggemann等人，J.Exp.Med.166:1351-1361，1987。
评价蛋白所诱导的ADCC水平的其他测定包括流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定（CellTechnology，Inc.CA,USA）或非放射性细胞毒性测定（Promega,WI,USA）。
还可以进行C1q结合测定以证实蛋白能结合C1q并可以诱导CDC。为了评价补体活化，可以进行CDC测定（参见例如，Gazzano-Santoro等人，J.1mmunol.Methods202:163，1996)。
半衰期测定
由本公开内容涵盖的一些蛋白具有改善的半衰期，例如被修饰以与未被修饰的蛋白质相比较延长其半衰期。用于测定具有改善的半衰期的蛋白质的方法对于技术人员是显而易见的。例如，评定蛋白结合新生Fc受体(FcRn)的能力。在这方面，对于FcRn的结合亲和力增加使得分子的血清半衰期增加（参见，例如Kim等人，Eur J Immunol.,24:2429,1994）。
本公开内容的蛋白的半衰期还可以通过药物动力学研究来测量，例如根据Kim等人，Eur J of Immunol24:542,1994描述的方法。根据所述方法，将放射性标记的蛋白静脉内注射到小鼠中且将其血浆浓度测量为注射之后时间的函数，例如在3分钟至72小时。这样得到的清除曲线应该为双相性的，即α相和β相。对于蛋白的体内半衰期的测定，计算在β相中的清除率且将其与野生型或未修饰的蛋白的清除率相比较。
评价治疗功效
上文关于测定蛋白的中和描述了评价治疗功效的测定。
在另一个实施例中，使用体内测定评价蛋白治疗病状的功效。
例如，在关节炎的动物模型中测试蛋白。示例性的模型包括小鼠的SKG种系（Sakaguchi等人，Nature,426:454-460），大鼠II型胶原蛋白关节炎模型、小鼠II型胶原蛋白关节炎模型或几个物种中抗原诱导的关节炎模型（Bendele J Musculoskel NeuronInteract；1(4):377-385,2001）。在这些测定中，诱导了关节炎并且测定了蛋白减少关节炎的一种或多种症状例如关节炎性和/或滑膜液中炎性标志物的能力。减少关节炎症状的蛋白被认为对治疗这一病状或G-CSF介导的病状（例如G-CSF介导的炎性病状）有用。
蛋白也可以或可选择地在COPD模型中测试，例如其中非人哺乳动物（诸如啮齿类动物，例如小鼠）暴露于香烟烟气。暴露之后，向哺乳动物施用蛋白并且使用标准技术测定或评估肺部中炎症的水平和/或嗜中性粒细胞的数目。减少肺部炎症和/或嗜中性粒细胞的数目的蛋白被认为对治疗肺部炎症或COPD或G-CSF介导的病状（例如G-CSF介导的炎性病状，诸如G-CSF介导的肺部炎性病状）有用。
本文描述的蛋白也可在炎性神经疾病的体内模型中测试。示例性的模型包括EAE模型，其中小鼠或大鼠用髓鞘蛋白或从其衍生的蛋白（例如MOG、MBP或PLP）免疫并且产生抗所述蛋白的免疫响应由此诱导MS的模型。可选择地，用髓鞘蛋白免疫活化的T细胞被引入小鼠或大鼠中以诱导EAE。示例性的EAE模型综述于例如Tsunoda和Fujinami,J NeuropatholExp Neurol.55:673-686,1996中。
MS的其他模型包括表达对髓鞘蛋白，例如MOG、MBP或PLP，特异性的T细胞受体的转基因动物。示例性的模型描述于例如Bettelli等人，JEM197:1073-1081,2003；Illés等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101:11749-11754,2004；或Rossi等人，J.BiomolecularScreening,12:481-489,2007中或者是可商业获得的，例如来自Jackson LaboratoriesUSA（诸如，具有与MOG反应的转基因T细胞受体的小鼠2D2）
在另外的实施例中，在葡萄膜炎模型中测试本文描述的根据任一实施例的蛋白。葡萄膜炎的模型包括通过用蛋白例如视网膜抑制蛋白、恢复蛋白或视紫红质免疫非人类哺乳动物或向眼部施用细菌内毒素诱导的那些。葡萄膜炎的示例性模型描述于例如Caspi,Drug Discovery Today,3:3-9,2006中。
本公开内容的蛋白同样可在血管发生的模型，例如Iris Pharma Inc的眼部血管发生的模型或藻酸盐包封的肿瘤细胞模型，中测试和/或通过评估癌症细胞在受试者中转移的能力来测试。
有待治疗的病状
本公开内容涵盖对在受试者中由G-CSF导致或加重的任何病状的治疗或预防。在一个实施例中，所述病状是自身免疫型或炎性病状。
在一个实施例中，所述炎性或自身免疫性病状是炎性关节病状，例如炎性关节炎，类风湿性关节炎或特发性关节炎，诸如幼年特发性关节炎。在一个实施例中，所述病状是类风湿性关节炎。
在一个实施例中，所述炎性或自身免疫性病状是炎性眼部病状.例如，所述病状是葡萄膜炎。
在一个实施例中，所述炎性或自身免疫性病状是炎性肺部病状，例如与嗜中性粒细胞浸润有关的肺疾病，诸如COPD。在一个实施例中，所述病状是COPD。
在一个实施例中，所述炎性或自身免疫性病状是炎性神经疾病，例如，德维克病，大脑中的病毒感染或多发性硬化症。在一个实施例中，所述病状是多发性硬化症，包括慢性进行性多发性硬化或复发-缓解型多发性硬化。
在另一实施例中，所述病状是癌症（包括其血管发生）或其转移。
在一个实施例中，所述受试者耐受、未充分响应于或不适于采用用于治疗所述病状的另一种化合物的治疗。例如，患有自身免疫性或炎性病状的患者耐受、未充分响应于或不适于采用糖皮质激素和/或免疫抑制剂和/或环磷酰胺和和/或甲氨蝶呤和/或抗TNF抗体或可溶的TNF受体和/或抗CD20抗体和/或抗IL6抗体和/或CD22抗体。
组合物
在一些实施例中，本文描述的蛋白可以含有常规无毒的药学上可接受的载体的剂量制剂口服地、胃肠外地通过吸入喷雾、吸附、吸收，局部地、经直肠地、经鼻地、经颊地、经阴道、经心室内地，经由植入型药盒施用或经由其他常规剂型施用。如本文所用的，术语“胃肠外的”包括皮下注射的、静脉注射的、肌肉注射的、腹腔注射的、鞘内注射的、心室内的、胸骨内的和颅内注射或输注技术。
制备适于对受试者施用的形式的蛋白（例如药物组合物）的方法是本领域中已知的并且包括（例如）如Remington's Pharmaceutical Sciences（第18版，Mack PublishingCo.,Easton,Pa.,1990）和U.S.Pharmacopeia:National Formulary（Mack PublishingCompany,Easton,Pa.,1984）中所描述的方法。
本公开内容的药物组合物对胃肠外施用特别有用，例如静脉施用或向器官或关节的体腔或内腔施用。用于施用的组合物通常包含溶解于药学上可接受的载体例如水性载体的蛋白的溶液。可使用各种水性载体，例如缓冲盐水和类似物。组合物可包含接近生理学条件所需要的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂和类似物，诸如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钙和类似物。这些制剂中的本公开内容的蛋白的浓度可广泛变化并且基本上根据流体体积、粘性、体重和类似物根据所选择的特定施用方式和患者需要来选择。示例性载体包括水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。非水媒介物例如混合的油和油酸乙酯也可以使用。脂质体也可作为载体。媒介物可能含有提高等渗性和化学稳定性的少量添加剂，例如缓冲和防腐剂。
配制时，本公开内容的蛋白将以与剂量制剂相容的方式并且以治疗上/预防上有效的量施用。制剂容易以各种剂型施用，例如上文描述的可注射的溶液的类型，但是也涵盖其他药学上可接受的形式，例如片剂、丸剂、胶囊剂或口服施用的其他固体，栓剂、阴道栓剂、鼻用溶液或喷雾、气溶胶、吸入剂、脂质体形式和类似形式。药学上“缓慢释放”的胶囊或组合物也可被使用。缓慢释放制剂通常设计在延长的时期内给予恒定的药物水平并且可被用于递送本公开内容的化合物。
WO2002/080967描述包含用于哮喘治疗的抗体的组合物和用于施用雾化的组合物的方法，其同样适于施用本公开内容的蛋白。
组合治疗
在一个实施例中，本公开内容的蛋白与对治疗本文描述的疾病或病状有用的其他化合物组合施用，作为组合的或另外的治疗步骤或作为治疗制剂的另外的组分。
例如，其他化合物是抗炎化合物。可选择地或另外地，其他化合物是免疫抑制剂。可选择地或另外地，其他化合物是皮质类固醇例如泼尼松和/或强的松龙。可选择地或另外地，其他化合物是氨甲蝶呤。可选择地或另外地，其他化合物是环磷酰胺。可选择地或另外地，其他化合物是麦考酚酸莫酯。可选择地或另外地，其他化合物是抗CD20抗体（例如利妥昔单抗或奥法单抗（ofatumumab））。可选择地或另外地，其他化合物是抗CD22抗体（例如依帕珠单抗）。可选择地或另外地，其他化合物是抗TNF抗体（例如英夫利昔单抗或阿达木单抗或戈利木单抗)或可溶的TNF受体（例如依那西普）。可选择地或另外地，其他化合物是CTLA-4拮抗剂（例如阿贝西普、CTLA4-Ig）。可选择地或另外地，其他化合物是抗IL-6抗体。可选择地或另外地，其他化合物是BLy拮抗剂例如抗BLy抗体（诸如贝利单抗）。
在另一个实施例中，其他化合物是用于治疗癌症的化学治疗药物或其他药物。
在另一个实施例中，本文描述的蛋白在用于治疗癌症的放射治疗之前或之后施用。
施用的剂量和时机
本公开内容的蛋白的适合的剂量取决于特定的蛋白、有待治疗的病状和/或被治疗的受试者而变化。确定适合的剂量例如通过以次最佳的剂量开始并且逐渐增加地修改剂量以确定最佳或有用的剂量，在熟练的内科医师的能力范围内。可选择地，为了确定治疗/预防的适合剂量，使用来自细胞培养测定或动物研究的数据，其中适合的剂量在包括具有少量或没有毒性的活性化合物的ED50的循环浓度的范围内。剂量可在这一范围内取决于所使用的剂型和所利用的施用途径而变化。治疗上/预防上有效的剂量最初可从细胞培养测定估计。剂量可以在动物模型中配制以获得包括如细胞培养中所测定的IC50（达到症状的一半最大抑制的化合物浓度）的循环血浆浓度范围。这些信息可被用于更精确地确定在人类中有用的剂量。可测量血浆中的水平，例如通过高效液相色谱。
在一些实施例中，本公开内容的方法包括施用预防或治疗上有效的量的本文描述的蛋白。
术语“治疗上有效的量”是当施用于需要治疗的受试者时改善受试者的预后和/或状态和/或减少或抑制本文所描述的临床病状的一个或多个症状至作为该病状的临床诊断或临床表征所观察并接受的水平以下的质量。有待向受试者施用的量将取决于有待治疗的病状的具体表征、所治疗的病状的类型和阶段、施用的方式和受试者的表征，例如一般健康状况、其他疾病、年龄、性别、遗传型和体重。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素确定适当的剂量。因此，这一术语并不解释为将本公开内容限制于特定质量例如重量或数量的蛋白，而是本公开内容涵盖足以在受试者中所陈述的结果的任意量的蛋白。在一个实施例中，治疗上有效的量的蛋白不诱导嗜中性粒细胞减少症。
如本文所用的，术语“预防上有效的量”应被认为意指足以预防或阻止或延迟临床病状的一种或多种可检测的症状的发作的量。本领域技术人员应当知道这样的量将取决于例如所施用的特定的蛋白和/或具体的受试者和/或病状的类型或严重度或水平和/或对所述病状的遗传缺陷（基因的或其他的）。因此，这一术语并不解释为将本公开内容限制于特定质量例如重量或数量的蛋白，而是本公开内容涵盖足以在受试者中获得所陈述的结果的任意量的蛋白。在一个实施例中，预防上有效的量的蛋白不诱导嗜中性粒细胞减少症。
为了体内施用本文描述的蛋白，正常剂量量可从每天约10ng/kg变化至多达约100mg/kg每天个体体重或更高。其示例性剂量及范围描述于本文。对于历经几天或更久的重复施用，取决于有待治疗的疾病或病症的严重度，可持续治疗直到获得所期望的对症状的抑制。
在一些实施例中，所述蛋白以约1mg/kg至约30mg/kg之间，例如从约1mg/kg至约10mg/kg之间或约1mg/kg或约2mg/kg或5mg/kg的初始（或负荷）剂量施用。之后可以约0.01mg/kg至约2mg/kg之间，例如从约0.05mg/kg至约1mg/kg之间，诸如从约0.1mg/kg至约1mg/kg之间，例如约0.1mg/kg或0.5mg/kg或1mg/kg的较低的维持剂量施用。可每7-30天，例如每10-15天，诸如每10或11或12或13或14或15天，施用维持剂量。
在一些实施例中，所述蛋白以约0.01mg/kg至约50mg/kg之间，例如约0.05mg/kg至约30mg/kg之间，诸如约0.1mg/kg至约20mg/kg之间，例如约0.1mg/kg至约10mg/kg之间，诸如约0.1mg/kg至约2mg/kg之间的剂量施用。例如，所述蛋白以约0.01mg/kg至约5mg/kg之间，例如从约0.1mg/kg至约2mg/kg之间，诸如约0.2mg/kg或0.3mg/kg或0.5mg/kg或1mg/kg或1.5mg/kg的剂量（例如没有较高的负荷剂量或较低的维持剂量）施用。在一些实施例中，施用许多剂量，例如每7-30天，诸如每10-22天，例如每10-15天，诸如每10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或21或22天。例如，每7天、每14天或每21天施用所述蛋白。
在一些实施例中，起始治疗时，向哺乳动物施用所述蛋白不超过7个连续天或6个连续天或5个连续天或4个连续天。
在对治疗没有充分响应的哺乳动物的实例中，可在一周内施用多个剂量。可选择地或另外地，可施用增加的剂量。
在另一个实施例中，对于经历不良反应的哺乳动物来说，初始（或负荷）剂量可被分至一周中的几天或几个连续天。
根据本公开内容的方法施用蛋白可以是连续的或间断的，取决于例如接受者的生理状况，无论施用的目的是治疗还是预防的，以及熟练的开业医生已知的其他因素。蛋白的施用可以是基本上连续的或者经历预先选择的一段时间或者可以是一系列间隔开的剂量，例如在病状发展期间或之后。
非限制性实施例
方法
G-CSFR的Ig和CRH结构域参与配体结合和受体二聚化（Layton等人，J.Biol Chem,272:29735-29741,1997和Fukunaga等人，EMBOJ.10:2855-28651991）。包含受体的这些部分的G-CSFR的可溶形式（具有C末端聚组氨酸标志或Fc序列）已经被用于不同的受体研究并且受体位点78、163,和228处的自由半胱氨酸的突变协助可溶受体多肽的表达和分离（Mine等人，Biochem.,43:2458-2464,2004）而不影响配体结合。在本研究中，通常使用包含具有突变C78A、C163S和C228S的hG-CSFR氨基酸25-335的受体的可溶形式（例如SEQ ID NO:1）和具有半胱氨酸突变的cynoG-CSFR的相应的片段对短尾猴受体继续研究。已经利用了SEQ IDNO:1的可溶受体的不同点突变。提及hG-CSFR-Fc意指其中C末端聚组氨酸标志已经被Fc序列替代的SEQ ID NO:1的多肽。cynoG-CSFR-Fc意指具有与其C末端连接的Fc序列的cynoG-CSFR-Fc的相应片段。在一些情况下，使用了野生型受体的相应的细胞外结构域并且在这些情况下其被特别记录。发明人已经显示抗体和包含其抗原结合位点（例如Fab）的蛋白以高度相似的亲和性与野生型hG-CSF多肽结合和这些突变蛋白结合。因此，使用突变蛋白的研究是使用野生型hG-CSFR的研究的模型。
来自噬菌体展示文库的Fab的鉴定
为了与在添加G-CSF配体时洗脱的hG-CSFR结合的克隆而筛选噬菌体展示文库。评价Fab结合hG-CSFR、竞争G-CSF结合的能力以及短尾猴G-CSFR交叉反应性和重定格式为IgG4抗体的一些克隆。之后通过稳定转染hG-CSFR的BaF3细胞系中G-CSF介导的增殖的中和（下文描述的）和G-CSF存在时抑制CFU-G形成来测试效力。
用于IgG表达的哺乳动物表达载体构建
使用标准分子生物学技术通过从所选择的噬菌体来源的Fab构建体克隆整个轻链（可变和恒定结构域）和重链的可变区构建哺乳动物表达载体。
细胞培养和瞬时转染
从Genechoice Inc.获得无血清悬浮液适应性293-T细胞。在补充霉素/链霉素/两性霉素试剂（Invitrogen）的FreeStyleTM表达培养基（Invitrogen）中培养细胞。在转染之前将细胞采用8%CO2气氛于37℃维持在增湿培养箱中。
使用293fectin转染试剂（Invitrogen）根据制造商说明书使用293-T细胞进行对哺乳动物表达载体的瞬时转染。在5天孵育之后通过于2500rpm离心收集细胞培养上清液并且之后在使用IgG纯化的标准方法之前通过0.45μM过滤器（Nalgene）。
对照抗体
小鼠单克隆抗体711、744和774（Layton等人，Growth Factors,14:117-130,1997）被用作对照小鼠抗体。
Fab的亲和性测量
为了测量G-CSFR或G-CSFR-Fc的Fab的亲和性，将Fab在大肠杆菌中表达并且使用Biacore2000测量亲和性。
mAb的结合动力学的测量
使用胺偶联化学将抗人（小鼠吸收的山羊抗人IgG（γ），Invitrogen,CatNo.H10500）或抗小鼠Fc特异性抗体（Jackson Immuno Research Labs inc.Cat No.515-005-071）化学固定在CM-5感应器表面上。
之后将固定的抗体用于从溶液捕获抗hG-CSFR mAb。可溶的hG-CSFR蛋白（如方法章节中所描述的）之后以不同浓度注射在捕获的mAb上。以0.3μg/ml捕获mAb180秒。0、1.25、2.5、5、10、20和40nM的可溶hG-CSFR（一式两份）注射十分钟并且监测解离30分钟。减去来自参照流动细胞的响应（其中mAb没有被捕获，但是除此之外一样地处理）。之后从所获得的传感图线减去来自空白注射的响应。
使用对描述1:1动力学的模型的非线性回归将最终校正的响应拟合，包括用于传质控制的部分。局部拟合Rmax值，以计算所捕获的mAb水平中的轻微偏移。确定平衡解离常数（KD）。
Fab C1.2、5D11、711和744的动力学分析
通过木瓜蛋白酶消化生成Fab片段，其中根据使用木瓜蛋白酶消化试剂盒的说明书（Sigma,USA）用预活化的木瓜蛋白酶消化3mg抗体（1:500）40分钟。通过吸附，使用蛋白A纯化（mAbSelect,GE,Sweden）将所获得的Fab从残留的Fc和未消化的抗体纯化出来。
使用Biacore2000（GE,Sweden）用加倍稀释的Fab抗体（100nM至0.39nM于0.1mg/mlBSA中）以30μl/min的流速进行Fab的一式两份生物传感器分析。监测与含有对照固定的空白、固定的cyno G-CSFR-Fc、固定的人G-CSFR-Fc和固定的人G-CSFR的各个流动细胞的结合（100μl）。受体蛋白（20μg/ml于20mM乙酸钠中，pH4.5）按照制造者说明书使用NHS/EDC偶联试剂盒（Biacore GE,Sweden）预先固定于CM5芯片上。把cyno G-CSFR-Fc、hG-CSFR-Fc和hG-CSFR的目标固定值分别设定在700、700和500共振单位。用50mM乙醇胺pH8.0结束芯片固定。在使用50mM正磷酸解吸剩余的复合物之前监测表面结合的解离1000秒。之后从使用biaevaluation软件在Biacore2000上生成的对照轨道和动力学减去参照结合。
使用Biacore2000用加倍稀释的抗体（312nM至2.4nM于0.1mg/ml BSA中）以30μl/min的流速进行IgG4形式的抗体c1.2和5D11的一式两份生物传感器分析。监测与含有对照固定的空白、固定的cyno-G-CSFR-Fc、固定的hG-CSFR-Fc和固定的hG-CSFR的各个流动细胞的结合（100μl）。受体蛋白（20ug/ml于20mM乙酸钠中，pH4.5）按照制造者说明书使用NHS/EDC偶联试剂盒（Biacore GE,Sweden）预先固定于CM5芯片上。把cyno-G-CSFR-Fc、hG-CSFR-Fc和hG-CSFR的目标固定值分别设定在700、700和500共振单位。用50mM乙醇胺pH8.0结束芯片固定。在使用50mM正磷酸解吸剩余的复合物之前监测表面结合的解离1000秒。之后从使用biaevaluation软件在Biacore2000上生成的对照轨道和动力学减去参照结合
亲和性成熟的C1.2G抗体的BIAcore mAb动力学
使用胺偶联化学将抗人（小鼠吸收的山羊抗人IgG（γ），Invitrogen,CatNo.H10500）化学固定在CM-5感应器表面上并且之后以1mg/ml用于捕获C1.2G亲和性成熟抗hG-CSFR mAb3分钟。之后将溶解的hG-CSFR以0、10和40nM注射在捕获的mAb上。注射溶解的hG-CSFR5分钟并且监测解离30分钟。减去来自参照流动细胞的响应（其中mAb没有被捕获，但是除此之外一样地处理）。之后从所获得的传感图线减去来自空白注射的响应。
使用对描述1:1动力学的模型的非线性回归将最终校正的响应拟合，包括用于传质控制的部分。局部拟合Rmax值，以计算所捕获的mAb水平中的轻微偏移。确定结合速率（ka）、解离速率（kd）和平衡解离常数（KD）。
hG-CSFR/BaF3增殖生物测定–MTT还原
从Ludwig Institute Melbourne获得表达hG-CSFR的BaF3细胞。为了评估抗hG-CSFR抗体对G-CSF介导的增殖的抑制，将系列稀释的抗体在96孔板中具有5%FCS和0.5ng/mlhGCSF的DME培养基中加至2×104个细胞/孔。并且于37℃，10%CO2孵育48小时。细胞增殖通过MTT还原确定并且通过在490nM的吸光度来测量。
hG-CSFR/BaF3增殖生物测定–3H-胸腺嘧啶核苷掺入
将工程化以表达人G-CSFR并且其增殖响应于人G-CSF的BAF/3细胞用于测量不同单克隆抗体中和G-CSF活性的能力。在10ng/mL人G-CSF和逐渐增加浓度的不同抗G-CSFR单克隆抗体存在时，将细胞于37℃以1×104个细胞/孔铺板在96孔板中的RPMI/105FCS中48小时。在将细胞收集在玻璃纤维过滤器上之前用3H-胸腺嘧啶核苷对细胞进行脉冲至少6小时的培养并且通过液体闪烁计数测定掺入DNA中的放射性胸腺嘧啶核苷的水平。
人CFU-G先祖生物测定
将CD34+骨髓细胞在10ng/ml干细胞因子、10ng/ml hG-CSF和滴定浓度的测试抗体存在时在半固体培养基中孵育。培养14天后将CFU-G计数。
表位对比—竞争抑制
这一实验的设计建立在能够同时结合一个分子的两种抗体来说，这两个抗体的表位必须不同的前提上。
通过表面固定的抗体从溶液捕获SEQ ID NO:1的可溶G-CSFR。之后将第二抗体注射在复合物上。减去来自参照流动细胞的响应（其中可溶hG-CSFR没有被捕获，但是除此之外一样地处理）。第二抗体的结合表明2种抗体的表位不同。
在抗体结合时期结束时测量的响应除以hG-CSFR捕获时期结束时的响应以将抗体结合水平对所捕获的hG-CSFR的量校准。这些校准的捕获响应之后被用于将每种抗体与hG-CSFR在其他抗体存在时的结合相比较。
使用胺偶联化学将抗体C1.2、5D11、711和744化学固定在CM-5感应器表面上。以100nM捕获可溶hG-CSFR180秒。之后将每种抗体以100nM一式两份注射在所捕获的hG-CSFR上180秒。同样进行仅有缓冲液的空白注射。
C1.2G、711、744和774的表位作图
将SEQ ID NO:1的一系列丙氨酸点突变在HEK293细胞中生成，表达并且之后纯化。测量这些突变体对抗体C1.2G、744和774的结合亲和性并且与SEQ ID NO:1的相比较。如果突变产生与SEQ ID NO:1的相比的高于因子2的亲和性变化，那么该残基被认为对结合相互作用有贡献并且因此可能在表位中或靠近表位。作为对照包含具有C1.2、744和774分离并且不同的表位的第三个mAb（711）以便计算大概由突变所带来的任何主要的结构变化。
使用胺偶联化学将抗人（小鼠吸收的山羊抗人IgG（γ），Invitrogen,CatNo.H10500）或抗小鼠Fc特异性抗体（Jackson Immuno Research Labs inc.Cat No.515-005-071）化学固定在CM-5感应器表面上。之后将固定的抗体用于从溶液捕获抗hG-CSFRmAb。野生型hG-CSFR配体结合结构域（SEQ ID NO:1）和每种丙氨酸点突变体之后以不同浓度注射在捕获的mAb上。减去来自参照流动细胞的响应（其中mAb没有被捕获，但是除此之外一样地处理）。之后从所获得的传感图线减去来自空白注射的响应。
使用对描述1:1动力学的模型的非线性回归将最终校正的响应拟合，包括用于传质控制的部分。局部拟合Rmax值，以计算所捕获的mAb水平中的轻微偏移。确定结合速率（ka）、解离速率（kd）和平衡解离常数（KD）。
将C1.2种系mAb在0.3ug/ml捕获180秒，将711在1μg/ml捕180秒，而将744和774在5μg/ml捕获180秒。
对于C1.2和744动力学，WT hG-CSFR和每种ala突变体以0、2、10、50和250nM注射300秒并且监测解离另外1800秒。
对于抗体744动力学，WT hG-CSFR和每种ala突变体以0、2、10、50和250nM注射300秒并且监测解离另外600秒。
对于抗体711动力学，WT hG-CSFR和每种ala突变体以0和100nM注射180秒并且监测解离另外180秒。
实施例1：全人抗hG-CSFR抗体是强有力的G-CSF信号抑制剂
使用本文描述的亲和性测量和BaF3增殖测定，评估抗体711和744对hG-CSFR和G-CSF中和测定的亲和性。发现抗体711以高于抗体744的亲和性与hG-CSFR-Fc融合体（如所述方法中所讨论的基于SEQ ID NO:1）结合（KD分别为0.86nM和8.7nM）。使用本文描述的基于MTT的生物测定，还发现抗体711比抗体744更加强有力地抑制G-CSF介导的细胞增殖（IC50（nM G-CSF）分别为8.8nM和2.4nM）。
使用3H-胸腺嘧啶核苷掺入测定，发现抗体711以10.1μg/ml的IC50抑制G-CSF介导的细胞增殖；发现抗体744以37.4μg/ml的IC50抑制G-CSF介导的细胞增殖而抗体744的IC50for是不可检测的（参见图1）。
使用上文描述的生物测定评价从噬菌体展示文库分离的人抗体（抗体C1.2和5D11）和小鼠单克隆抗体711抑制G-CSF介导的BaF3细胞增殖的能力。结果显示抗体C1.2以0.5nM的IC50抑制BaF3增殖；抗体5D11以5.9nM的IC50抑制增殖；而711以3.4nM的IC50抑制增殖。
同样评估如上文所述的在G-CSF存在时抗体减少或抑制经由CD34+骨髓细胞形成CFU-G的能力。结果显示抗体C1.2以0.016nM的IC50抑制CFU-G形成；抗体5D11以0.039nM的IC50抑制CFU-G形成而711以0.411nM的IC50抑制CFU-G形成。
基于这些测定，人抗体C1.2和5D11在抑制CFU-G形成上比711更有力而C1.2在两个测定中都是最有力的抗体。
实施例2：抗体对人G-CSFR和短尾猴G-CSFR的亲和性
同样评估5D11和C1.2的Fab和IgG4形式和711和744的Fab的亲和性以确定它们对hG-CSFR（SEQ ID NO:1）、hG-CSFR-Fc和短尾猴G-CSFR-Fc（如所述方法中所讨论的基于SEQID NO:1的）的配体结合结构域的亲和性。在这些测定中，G-CSFR的区被固定并且如一般方法（名称为“Kinetic analysis of Fab C1.2,5D11,711and744(Fab C1.2、5D11、711和744的动力学分析)”的章节中）中更详细地描述的确定所指示的抗体或片段与固定的多肽的结合。结果显示于表1中。
表1：5D11和C1.2对人和短尾猴G-CSFR的亲和性
这些数据显示5D11和C1.2对hG-CSFR具有高亲和性并且这些亲和性在Fab表达为完全IgG4抗体时被改进。而且，hG-CSFR和cynoG-CSFR对5D11或C1.2的亲和性是相似的。C1.2对hG-CSFR具有比5D11更高的亲和性。
抗体711的Fab显示具有0.86nM的对hG-CSFR-Fc的亲和性和1.8μM的对cynoG-CSFR的亲和性。抗体744的Fab显示具有8.7nM的对hG-CSFR-Fc的亲和性和>10μM的对cynoG-CSFR亲和性。因此，这些Fab对cynoG-CSFR具有比对hG-CSFR差得多的亲和性。
同样进行互换的测定（即，其中抗体被固定并且根据一般方法（名称为“Measurement of Binding Kinetics for mAbs(测量mAb的结合动力学)”）测定野生型h-GCSFR或野生型cynoG-CSFR对固定的抗体的结合）。代表性结果示于表2中。
表2：抗体C1.2G、5D11、711、744和774对野生型hG-CSFR或野生型cynoG-CSFR的代表性亲和性
这些数据显示C1.2G和5D11以比711、744和774高的亲和性与野生型cynoG-CSFR结合。而且，C1.2G对野生型hG-CSFR和野生型cynoG-CSFR的亲和性在彼此的约3倍内而5D11对野生型hG-CSFR和野生型cynoG-CSFR的亲和性在彼此的约13倍内。
实施例3：C1.2的种系化
为了将可能的免疫原性最小化，C1.2的可变区框架可变化以与最接近的人种系框架的相匹配。这需要重链框架区中的一个变化和轻链中的五个变化并且产生具有SEQ IDNO:4中所展示的序列的VH和具有SEQ ID NO:5中所展示的序列的VL。种系化的抗体（C1.2G）对G-CSFR的亲和性与C1.2类似（ka9.54×104±5.5×103；kd1.31×10-4±2.6×10-6；KD1.37±0.07（N=8））。C1.2G对表达在BaF3细胞的细胞表面上的hG-CSFR结合性显示为257pM。
使用上文描述的3H-胸腺嘧啶核苷掺入测定，发现抗体C1.2G以0.8μg/ml的IC50抑制G-CSF介导的细胞增殖（图1）。
将这一抗体重定格式为稳定化的IgG4产生包含具有SEQ ID NO:64中展示的序列的重链和具有SEQ ID NO:65中展示的序列的轻链的抗体。
当在CHO细胞中表达时，观察到抗体的赖氨酸变体，即，其中重链中的一条或两条缺乏C末端赖氨酸残基（即，因此包含SEQ ID NO:64中展示的序列）。
实施例4：表位作图
竞争结合
所公开的数据显示mAb711和mAb744与hG-CSFR的不同结构域结合。竞争结合实验显示mAb711而不是mAb744能够在结合C1.2Ab之后结合hG-CSFR，表明C1.2结合与mAb744相似的受体区但是与mAb711的不同的区。
表位删除以鉴定参与C1.2结合的肽
表位删除以及之后的质谱分析被用于鉴定参与C1.2结合的hG-CSFR的四个肽。在这一方法中，hG-CSFR蛋白首先与固定的C1.2抗体结合并且之后用蛋白水解酶消化。之后通过MALDI和电喷射质谱鉴定所结合的肽。通过这一方式鉴定的四种肽作图至hG-CSFR（SEQID NO:1）的位点111-115、170-176、218-234和/或286-300
C1.2和mAb744与hG-CSFR区突变体的结合
公开的数据（Tamada等人，Proc Natl Acad Sci USA.103:3135-3140,2006；Aritomi等人，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr；56:751-7531999）已经鉴定了hG-CSFR上的表面残基。已经用丙氨酸取代许多定位在通过表位删除实验鉴定的四个肽中的这些残基并且将所获得hG-CSFR的区的突变形式表达并且纯化。评估C1.2和mAb744与这些突变体中的每一种的结合并且鉴定参与结合的关键残基。结果示于图2A中。残基K167和H168的丙氨酸取代导致对mAb744的结合的彻底丧失而对C1.2的结合未受影响。相反，残基R287的丙氨酸取代导致对C1.2的结合的彻底丧失而对mAb744的结合未受影响。显著降低对C1.2的结合的其他残基是L111、L171、Y172、M198和H237。MAb744以与对野生型受体的亲和性相似的亲和性结合这些突变体。
使用相同的抗体与mAb774一起重复上文测定。如图2B中所示，残基K167、H168和L169的丙氨酸取代导致经由mAb774的结合的完全丧失同时C1.2的结合不受影响。与mAb744一起时，残基L111、Y172、H237和R287的丙氨酸取代对mAb774结合具有很少的影响或几乎没有影响。
实施例5：C1.2G的亲和性成熟
通过突变C1.2G的HCDR3和/或LCDR3中的残基并且筛选与hG-CSFR结合的Fab进行亲和性成熟。使用生物素化的hG-CSFR-Fc重组蛋白淘选突变抗体文库，以在几轮淘选时的恒定浓度或以逐渐减少的浓度。
在淘选结束时，从每个富集的文库选择多个噬菌体克隆并测序。之后基于序列选择唯一的克隆并且重定格式为全人IgG4/κ抗体用于使用Biacore的对hG-CSFR的结合分析（在名称为“Measurement of Binding Kinetics for mAbs(测量mAb的结合动力学)”的章节中的一般方法之后）并且，在一些情况下，抑制G-CSF介导的BaF3细胞增殖的能力。与母本C1.2G mAb相比具有改善的亲和性的重定格式的抗体列于表3中。
表3：亲和性成熟的抗体的表征
1序列在序列QQS之后
2序列在序列PLT之前
3序列（不同于wt）在序列LGE之后
wt–来自C1.2G的CDR3的序列
ND–未确定的
实施例6：C1.2G减少嗜中性粒细胞水平但不诱导嗜中性粒细胞减少症
向短尾猴施用聚乙二醇化的G-CSF和并且12小时后施用C1.2G（10mg/kg）。如图3中所示，与对照动物相比C1.2显著降低嗜中性粒细胞的水平，然而没有诱导嗜中性粒细胞减少症。
在施用G-CSF之前2小时对短尾猴给药0.1至10mg/kg的C1.2G的相似的实验与对照相比同样降低嗜中性粒细胞的水平，然而没有诱导嗜中性粒细胞减少症。

Claims (13)

1.抗体，其与人粒细胞集落刺激因子受体(hG-CSFR)结合并且中和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)信号，所述抗体包含：
(i)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:5中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(ii)由SEQ ID NO:2中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:3中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(iii)由SEQ ID NO:15中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:14中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(iv)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:16中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(v)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:17中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(vi)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:18中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(vii)由SEQ ID NO:20中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:19中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(viii)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:21中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(ix)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:22中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(x)由SEQ ID NO:24中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:23中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xi)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:25中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xii)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:26中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xiii)由SEQ ID NO:28中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:27中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xiv)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:29中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xv)由SEQ ID NO:31中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:30中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xvi)由SEQ ID NO:33中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:32中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xvii)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:34中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xviii)由SEQ ID NO:36中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:35中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xix)由SEQ ID NO:38中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:37中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xx)由SEQ ID NO:40中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:39中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xxi)由SEQ ID NO:42中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:41中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xxii)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:43中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xxiii)由SEQ ID NO:45中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:44中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xxiv)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:46中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xxv)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:47中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xxvi)由SEQ ID NO:49中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:48中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xxvii)由SEQ ID NO:51中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:50中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xxviii)由SEQ ID NO:53中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:52中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xxix)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:54中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xxx)由SEQ ID NO:55中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:5中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xxxi)由SEQ ID NO:57中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:56中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xxxii)由SEQ ID NO:59中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:58中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xxxiii)由SEQ ID NO:61中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:60中所展示的氨基酸序列组成的VL；
(xxxiv)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:62中所展示的氨基酸序列组成的VL；或
(xxxv)由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:63中所展示的氨基酸序列组成的VL。
2.抗体，其与人粒细胞集落刺激因子受体(hG-CSFR)结合并且中和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)信号，所述抗体包含：
(i)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQ IDNO:5中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(ii)包含由SEQ ID NO:2中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:3中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(iii)包含由SEQ ID NO:15中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:14中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(iv)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:16中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(v)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQ IDNO:17中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(vi)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:18中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(vii)包含由SEQ ID NO:20中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:19中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(viii)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:21中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(ix)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:22中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(x)包含由SEQ ID NO:24中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:23中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xi)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:25中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xii)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:26中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xiii)包含由SEQ ID NO:28中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQ ID NO:27中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xiv)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:29中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xv)包含由SEQ ID NO:31中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:30中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xvi)包含由SEQ ID NO:33中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:32中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xvii)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:34中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xviii)包含由SEQ ID NO:36中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQ ID NO:35中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xix)包含由SEQ ID NO:38中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:37中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xx)包含由SEQ ID NO:40中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:39中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xxi)包含由SEQ ID NO:42中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:41中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xxii)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:43中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xxiii)包含由SEQ ID NO:45中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQ ID NO:44中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xxiv)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:46中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xxv)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:47中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xxvi)包含由SEQ ID NO:49中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQ ID NO:48中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xxvii)包含由SEQ ID NO:51中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQ ID NO:50中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xxviii)包含由SEQ ID NO:53中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQ ID NO:52中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xxix)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:54中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xxx)包含由SEQ ID NO:55中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:5中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xxxi)包含由SEQ ID NO:57中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQ ID NO:56中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xxxii)包含由SEQ ID NO:59中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQ ID NO:58中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xxxiii)包含由SEQ ID NO:61中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQ ID NO:60中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；
(xxxiv)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQ ID NO:62中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL；或
(xxxv)包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQID NO:63中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL。
3.抗体，其与人粒细胞集落刺激因子受体(hG-CSFR)结合并且中和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)信号，所述抗体包含：
由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:5中所展示的氨基酸序列组成的VL。
4.抗体，其与人粒细胞集落刺激因子受体(hG-CSFR)结合并且中和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)信号，所述抗体包含：
由SEQ ID NO:2中所展示的氨基酸序列组成的VH和由SEQ ID NO:3中所展示的氨基酸序列组成的VL。
5.抗体，其与人粒细胞集落刺激因子受体(hG-CSFR)结合并且中和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)信号，所述抗体包含：
包含由SEQ ID NO:4中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQ IDNO:5中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL。
6.抗体，其与人粒细胞集落刺激因子受体(hG-CSFR)结合并且中和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)信号，所述抗体包含：
包含由SEQ ID NO:2中所展示的氨基酸序列组成的VH的3个CDR的VH和包含由SEQ IDNO:3中所展示的氨基酸序列组成的VL的3个CDR的VL。
7.一种抗体，其包含：
(i)由SEQ ID NO:64或68中所展示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO:65中所展示的氨基酸序列组成的轻链；或
(ii)由SEQ ID NO:64中所展示的氨基酸序列组成的一条重链和由SEQ ID NO:68中所展示的氨基酸序列组成的一条重链和由SEQ ID NO:65中所展示的氨基酸序列组成的两条轻链。
8.一种组合物，其包含如权利要求1至7中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体；或者
所述组合物包含：
(i)包含由SEQ ID NO:64中所展示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO:65中所展示的氨基酸序列组成的轻链的抗体；或
(ii)(a)包含由SEQ ID NO:64中所展示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO:65中所展示的氨基酸序列组成的轻链的抗体；和
(b)包含由SEQ ID NO:64中所展示的氨基酸序列组成的一条重链和由SEQ ID NO:68中所展示的氨基酸序列组成的一条重链和由SEQ ID NO:65中所展示的氨基酸序列组成的两条轻链的抗体，
以及任选地药学上可接受的载体。
9.权利要求1至7中任一项所述的抗体或者如权利要求8所述的组合物在制备用于治疗或预防受试者由中粒细胞集落刺激因子(G-CSF)导致或加重的病状的药物中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述由G-CSF导致或加重的病状是自身免疫性疾病、炎性疾病或癌症。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述自身免疫性疾病或炎性疾病是关节炎、多发性硬化、肺部炎症或慢性阻塞性肺疾病。
12.如权利要求9至11中任一项所述的用途，所述药物包含的所述抗体的量在受试者中足以减少嗜中性粒细胞的数目而不诱导嗜中性粒细胞减少症。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述药物包含足以向受试者递送0.05mg/kg和30mg/kg之间的量的所述抗体。
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