KR101822702B1 - G-csfr에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 과립구-콜로니 자극 인자 수용체에 결합하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질에 관한 것이다.

Description

G-CSFR에 대한 항체 및 이의 용도{ANTIBODIES AGAINST G-CSFR AND USES THEREOF}

본 발명은 과립구-콜로니 자극 인자 수용체(G-CSFR)에 결합하는 항체, 및 예컨대 치료법에서의 이의 용도에 관한 것이다.

관련된 출원

본 출원은 2011년 6월 13일자로 출원된 미국 가출원 제61/496,351호(발명의 명칭: "G-CSFR에 대한 항체 및 이의 용도")를 우선권 주장하고, 이의 전문이 본원에 참고자료로 편입된다.

서열 목록

본 출원은 전자 양식의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록의 전체 내용이 참고자료로 편입된다.

과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)는 과립구 생산의 주요 조절물질이다. G-CSF는 골수 간엽 세포(stromal cell), 내피 세포, 대식세포, 및 섬유아세포에 의해 생산되며, 염증성 자극에 의해 생산이 유도된다. 초기 골수 선조물질, 성숙 호중구, 단핵세포/대식세포, T 및 B 림프구 및 내피 세포에서 발현되는 G-CSF 수용체(G-CSFR)를 통하여 G-CSF가 작용한다. G-CSF 또는 G-CSFR에 결함이 있는 마우스는 현저한 호중구감소증을 나타내는데, 이는 안정적-상태 과립구조혈(granulopoiesis)에서 G-CSF의 중요성을 설명한다. 그러나, G-CSF는 예를 들어, 감염에 반응하여 긴급 과립구조혈에 없어도 되는 것으로 보이는데, G-CSF는 호중구의 생산 및 방출을 증가시키고, 조혈성 줄기 및 선조 세포를 동원시키고, 성숙 호중구의 분화, 수명, 및 작동체(effector) 기능을 조절한다. G-CSF는 또한 단핵세포/대식세포 수의 확장, 식작용 기능의 강화, 및 염증성 사이토킨 및 케모킨 생산의 조절을 포함하는, 대식세포상에서 효과를 발휘한다. G-CSF는 내피 선조 세포를 동원시키고, 신생혈관생성을 유도 또는 촉진시키는 것으로 나타났다.

G-CSF는 치료요법적으로 이용되는데, 예를 들어, 호중구감소증을 치료하고/거나 조혈성 줄기 세포를 집결시키는데 이용되는 반면, 일부 질병들, 예를 들어, 염증성 질환 및/또는 암에서는 부정적 작용들을 또한 가진다. 예를 들어, G-CSF의 투여는 류마티즘성 관절염(RA), 뮤린 콜라겐-유도된 관절염(CIA) 및 쥐들에서 CIA의 수동 전달 모델을 악화시킨다. G-CSF는 RA 환자들의 혈청 및 활액에서 발견되었다. 또한, RA를 앓고 있는 환자들에서 증가된 수준으로 발견되는 인터루킨(IL)-1 및 종양 괴사 인자 α(TNFα)는 인간의 활액을 분비하는 섬유아세포 및 연골세포에 의해 G-CSF의 생산을 유도한다. G-CSF에 결함이 있는 마우스는 급성 및 만성 염증성 관절염의 유도에 저항력이 있다.

G-CSF는 다발성 경화증(MS)에 역할을 하는 것으로 또한 밝혀졌다. 예를 들어, G-CSF는 MS의 자가-반응성 T 세포 계통 모델이 인터페론 γ 및 TNFα와 같이 효과적으로 세포밖 매트릭스에 흡착을 강화시키고, 이는 MS 증상들을 악화시키는 것으로 알려져있다. 더욱이, G-CSF 결함있는 마우스는 실험용 자가면역 뇌척수염(EAE)의 발생에 저항성이 있다.

G-CSF 및 G-CSFR은 화학요법 저항성, 다양한 암의 성장, 생존, 침습성 및 전이에 기여한다는 것을 보여준 연구들에 따르면, 암과 또한 연결되어 있다. 더욱이, G-CSF는 고형 종양들의 발달에서 중요한 과정인, 신생혈관생성을 유도하는 것으로 나타났다.

전술한 내용으로부터 G-CSFR을 통하여 G-CSF의 신호전달을 감소시키는 시약들이 필요하다는 사실은 당업자들에게 자명할 것이다. 예시적인 물질들은 예를 들어, G-CSF-매개된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 치료제로써 사용하기에 적합할 것이다.

본 발명자들은 인간 G-CSFR(hG-CSFR)에 결합하고, 잠재적으로 G-CSF 신호전달을 상쇄시키는, 예를 들어, G-CSF의 투여에 의해 유도된 CD34⁺ 골수 세포로부터 과립구의 형성을 막고/거나 G-CSF에 반응하여 세포 증식을 막고/거나 호중구증가증(neutrophilia)을 감소 또는 막는, 항체 결합 부위(예를 들어, Fab 및 항체)를 포함하는 단백질 부류들을 생산하였다. 본 발명자들에 의해 확인된 단백질들의 부류는 게잡이원숭이(cynomolgus monkey) G-CSFR(cynoG-CSFR)과 교차-반응하는데, 이는 단백질과의 전(pre)-임상 연구들을 용이하게 한다. 본 발명자들에 의해 확인된 단백질들의 부류는 고친화도로 hG-CSFR에 결합한다. 본 발명자들에 의해 확인된 단백질들의 부류는 인간 항체로써 다양한 질병의 치료에 적합하다.

본 개시내용은 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 단백질을 제공하는데, 이때 항원 결합 부위는 hG-CSFR에 결합하고, G-CSF 신호전달을 상쇄시키고, 단백질은 G-CSF 존재하에 성장한 CD34⁺ 골수 세포로부터 콜로니 형성 단위-과립구(CFU-G)의 성장을 약 0.2nM 이상의 IC₅₀으로 억제한다. 예를 들어, IC₅₀은 0.1nM 이하, 예를 들어, 0.09nM 이하, 또는 0.08nM 이하, 또는 0.07nM 이하, 또는 0.06nM 이하 또는 0.05nM 이하이다. 하나의 예에서, IC₅₀은 0.04nM 이하이다. 다른 예에서, IC₅₀은 0.02nM 이하이다. 이러한 분석에서 단백질의 IC₅₀을 평가하는 방법들은 본 명세서에서 기술된다. 예를 들어, IC₅₀은 10ng/mL의 hG-CSF 존재하에 측정된다.

하나의 예에서, IC₅₀은 10ng/mL 줄기 세포 인자와 10ng/mL hG-CSF 존재하에서 CD34⁺ 골수 세포를 배양함으로써, 측정된다. 예를 들어, 이 세포들은 반-고형 세포 배양 배지에서 성장된다. 하나의 예에서, 배양 14일 후, CFU-G를 헤아린다.

본 개시내용은 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 단백질을 추가적으로 또는 대안으로 제공하는데, 이때 항원 결합 부위는 모두 인간 및 게잡이원숭이 G-CSFR에 유사한 친화도로 결합하고, G-CSF 신호전달을 상쇄시킨다. 이러한 단백질들은 인간이외의 포유동물들에서 전-임상 연구를 용이하게 하기 때문에 유익하다.

하나의 예에서, 단백질의 친화도는 바이오센스, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된다. 예를 들어, 리간드 결합 영역 또는 가용성 hG-CSFR 또는 가용성 cynoG-CSFR 또는 hG-CSFR-Fc 또는 cyno-G-CSFR-Fc는 고정되고 본 개시내용의 단백질의 친화도가 측정된다.

본 개시내용은 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 단백질을 추가적으로 제공하는데, 이때 항원 결합 부위는 C1.2(서열번호 2에서 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H)과 서열번호 3에서 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는) 또는 C1.2G(서열번호 4에서 제시된 V_H와 서열번호 5에서 제시된 V_L을 포함하는)에 의해 결합되는 것과 같이 hG-CSFR내 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다.

본 개시내용은 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 단백질을 추가적으로 또는 대안으로 제공하는데, 이때 (i) 단백질은 C1.2(서열번호 2에서 제시된 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 3에서 제시된 서열을 포함하는 V_L을 포함하는) 또는 C1.2G(서열번호 4에서 제시된 V_H와 서열번호 5에서 제시된 V_L을 포함하는)가 hG-CSFR에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하고; (ii) 단백질은 G-CSF 신호전달을 상쇄시키고; (iii) 서열번호 1의 폴리펩티드에서 다음중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 폴리펩티드에 대한 단백질의 결합 수준은 서열번호 1의 폴리펩티드에 대한 단백질의 결합 수준보다 더 낮다:

(a) 서열번호 1의 위치 287에서의 아르기닌;

(b) 서열번호 1의 위치 237에서의 히스티딘;

(c) 서열번호 1의 위치 198에서의 메티오닌;

(d) 서열번호 1의 위치 172에서의 티로신;

(e) 서열번호 1의 위치 171에서의 류신; 및

(f) 서열번호 1의 위치 111에서의 류신.

본 개시내용은 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 단백질을 추가적으로 또는 대안으로 제공하는데, 이때 (i) 단백질은 C1.2(서열번호 2에서 제시된 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 3에서 제시된 서열을 포함하는 V_L을 포함하는) 또는 C1.2G(서열번호 4에서 제시된 V_H와 서열번호 5에서 제시된 V_L을 포함하는)가 hG-CSFR에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하고; (ii) 단백질 G-CSF 신호전달을 상쇄시키고; (iii) 서열번호 1의 폴리펩티드에서 다음 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 폴리펩티드에 대한 결합에 있어서 이의 능력과 비교하여 서열번호 1의 폴리펩티드에 더 선호적으로 결합한다:

(a) 서열번호 1의 위치 287에서의 아르기닌;

(b) 서열번호 1의 위치 237에서의 히스티딘;

(c) 서열번호 1의 위치 198에서의 메티오닌;

(d) 서열번호 1의 위치 172에서의 티로신;

(e) 서열번호 1의 위치 171에서의 류신; 및

(f) 서열번호 1의 위치 111에서의 류신.

본 개시내용은 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 단백질을 추가적으로 또는 대안으로 제공하는데, 이때 (i) 단백질은 hG-CSFR에 결합하고; (ii) 단백질은 G-CSF 신호전달을 상쇄시키고; (iii) 서열번호 1의 폴리펩티드에서 다음중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 폴리펩티드에 대한 단백질의 결합 수준은 서열번호 1의 폴리펩티드에 대한 단백질의 결합 수준보다 더 낮다:

(a) 서열번호 1의 위치 287에서의 아르기닌;

(b) 서열번호 1의 위치 237에서의 히스티딘;

(c) 서열번호 1의 위치 198에서의 메티오닌;

(d) 서열번호 1의 위치 172에서의 티로신;

(e) 서열번호 1의 위치 171에서의 류신; 및

(f) 서열번호 1의 위치 111에서의 류신.

본 개시내용은 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 단백질을 추가적으로 또는 대안으로 제공하는데, 이때 (i) 단백질은 hG-CSFR에 결합하고; (ii) 단백질은 G-CSF 신호전달을 상쇄시키고; (iii) 서열번호 1의 폴리펩티드에서 다음중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 폴리펩티드에 대한 결합에 있어서 이의 능력과 비교하여 서열번호 1의 폴리펩티드에 더 선호적으로 결합한다:

(a) 서열번호 1의 위치 287에서의 아르기닌;

(b) 서열번호 1의 위치 237에서의 히스티딘;

(c) 서열번호 1의 위치 198에서의 메티오닌;

(d) 서열번호 1의 위치 172에서의 티로신;

(e) 서열번호 1의 위치 171에서의 류신; 및

(f) 서열번호 1의 위치 111에서의 류신.

하나의 예에서, 알라닌 치환을 포함하는 폴리펩티드에 대한 단백질의 결합 수준은 서열번호 1의 폴리펩티드에 대한 단백질의 결합과 비교하여 약 10 배 또는 20 배 또는 50 배 또는 100 배 또는 150 배 또는 200 배 이상 감소된다. 바람직하게는, 알라닌 치환을 포함하는 폴리펩티드에 대한 단백질의 결합 수준은 약 50 배 이상 감소된다. 바람직하게는, 알라닌 치환을 포함하는 폴리펩티드에 대한 단백질의 결합 수준은 약 60 배 이상 감소된다.

하나의 예에서, 단백질의 항원 결합 부위는 서열번호 1의 위치 287에서 아르기닌 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 검출가능한 수준으로 결합하지 않는다.

하나의 예에서, 결합 수준은 바이오센스, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명에 의해 평가된다. 예를 들어, 단백질은 고정되고, 서열번호 1의 폴리펩티드 또는 알라닌 치환을 포함하는 폴리펩티드 형태에서 결합 수준이 측정된다.

본 개시내용의 단백질에 의해 결합된 또는 유의적으로 결합되지 않은 또는 검출가능하도록 결합되지 않은, 치환을 가진 또는 치환 없는, 서열번호 1의 아미노산들을 포함하는 폴리펩티드의 또다른 형태들이 본 명세서에서 기술되며, 본 개시내용의 예들에 필요한 변경과 함께 취하여 적용된다.

하나의 예에서, 항원 결합 부위는 다음의 폴리펩티드와 교차-반응한다:

(i) 서열번호 1의 위치 167에서의 리신이 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드; 및/또는

(ii) 서열번호 1의 위치 168에서의 히스티딘이 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드.

하나의 예에서, 항원 결합 부위는 서열번호 1의 위치 169에서의 류신이 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드와 추가로 교차-반응한다.

하나의 예에서, 단백질은 C1.2(서열번호 2에서 제시된 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 3에서 제시된 서열을 포함하는 V_L을 포함하는) 또는 C1.2G(서열번호 4에서 제시된 V_H와 서열번호 5에서 제시된 V_L을 포함하는)가 다음중 하나 이상에 결합을 경쟁적으로 억제한다:

(i) 서열번호 1의 위치 167에서의 리신이 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드; 및/또는

(ii) 서열번호 1의 위치 168에서의 히스티딘이 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드.

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 임의의 예에 따른 단백질은 서열번호 1의 111 내지 115, 170 내지 176, 218 내지 234 및/또는 286 내지 300으로부터 선택된 하나 또는 둘 또는 셋 또는 넷의 영역 안에 잔기들을 포함하는 에피토프에 결합한다.

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 임의의 예에 따른 단백질이 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하고, 단백질분해 효소를 이용하여 절단될 때, 서열번호 1의 아미노산 111 내지 115 또는 서열번호 1의 아미노산 170 내지 176 또는 서열번호 1의 아미노산 218 내지 234 또는 서열번호 1의 아미노산 286 내지 300을 포함하는 또는 구성된 하나 또는 둘 또는 셋 또는 넷의 펩티드들은 결합된 채로 유지된다.

하나의 예에서, 단백질은 형태학적(conformational) 에피토프에 결합한다.

본 개시내용은 hG-CSFR에 결합하고, G-CSF 신호전달을 상쇄시키는, 다음중 하나 이상을 포함하는 단백질을 추가로 또는 대안으로 제공한다:

(i) 서열번호 6에서 제시된 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 7에서 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 8에서 제시된 서열에 약 55% 이상 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 V_H;

(ii) 서열번호 2 및/또는 4에서 제시된 서열에 약 80%, 예를 들어 85% 또는 90% 또는 91% 또는 92% 또는 93% 또는 94% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 V_H;

(iii) 서열번호 9에서 제시된 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 10에서 제시된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 11에서 제시된 서열에 약 33% 이상 동일한 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 V_L;

(iv) 서열번호 3 및/또는 5에서 제시된 서열에 약 80%, 예를 들어 85% 또는 90% 또는 91% 또는 92% 또는 93% 또는 94% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 V_L.

이러한 단백질은 본 명세서에서 기술된 하나 이상의 기능 활성, 예를 들어, 서열번호 1에서 다음중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 폴리펩티드의 결합 수준과 비교하여, 서열번호 1의 폴리펩티드에 선호적으로 결합하는 활성을 포함할 수 있다:

(a) 서열번호 1의 위치 287에서의 아르기닌;

(b) 서열번호 1의 위치 237에서의 히스티딘;

(c) 서열번호 1의 위치 198에서의 메티오닌;

(d) 서열번호 1의 위치 172에서의 티로신;

(e) 서열번호 1의 위치 171에서의 류신; 및

(f) 서열번호 1의 위치 111에서의 류신.

하나의 예에서, (ii)에서 동일성 비율은 약 95% 이상이다.

하나의 예에서, (iv)에서 동일성 비율은 약 94% 이상이다.

하나의 예에서, 언급된 서열과 단백질 간의 차이는 치환이다.

당업자는 본 개시내용의 단백질에 대해 돌연변이 부위를 결정할 수 있는데, 예를 들어, 가변 영역을 포함하는 단백질의 골격 영역내에서 결정할 수 있다. 더욱이, 발명자들은 V_H CDR3과 V_L CDR3에서 본 개시내용의 단백질의 활성을 유지하도록 돌연변이될 수 있는 다양한 부위뿐만 아니라 다수의 돌연변이를 확인하였다. 예를 들어 돌연변이, 예를 들어, 치환은 HCDR3의 4개 C-말단 잔기중 하나 이상(예를 들어, 2 또는 3 또는 4)내에 및/또는 LCDR3의 N-말단 또는 C-말단 잔기의 하나 이상(예를 들어, 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6)내에 있다. 하나의 예에서, V_H CDR3의 N-말단 5개 아미노산은 LGELG이다. 하나의 예에서, V_L CDR3의 N-말단 3개 아미노산은 QQS이고/거나 V_L CDR3의 C-말단 3개의 아미노산은 PLT이다.

하나의 예에서, V_H는 LGELGX₁X₂X₃X₄의 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는데, 이때,

X₁은 트립토판, 글루타민, 메티오닌, 세린, 페닐알라닌, 글루탐산 및 히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택되고/거나 트립토판, 글루타민 또는 메티오닌과 같은 중성 아미노산이며, 예를 들어, 아미노산은 트립토판이고;

X₂는 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 세린, 글리신 및 이소류신으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이며, 예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌 또는 세린이며, 예를 들어, 아미노산은 페닐알라닌이고;

X₃은 아스파르트산, 메티오닌, 글루타민, 세린, 류신, 발린, 아르기닌 및 히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이며, 예를 들어, 프롤린, 글루탐산, 알라닌, 류신, 페닐알라닌 또는 티로신이며, 예를 들어, 아미노산은 아스파르트산이고;

X₄는 임의의 아미노산 또는 프롤린, 글루탐산, 알라닌, 류신, 페닐알라닌, 티로신, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 세린, 글리신, 아르기닌 및 리신으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이며, 예를 들어, 아미노산은 프롤린이다.

하나의 예에서, V_L은 X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉의 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는데, 이때,

X₁은 글루타민, 글루탐산, 히스티딘, 알라닌 및 세린으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이고/거나 친수성 아미노산, 예컨대 글루타민 또는 글루탐산이고, 예를 들어, 아미노산은 글루타민이고;

X₂는 글루타민, 발린, 페닐알라닌, 아스파라긴 및 글루탐산으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이며, 예를 들어, 아미노산은 글루타민이고;

X₃은 세린 및 글리신으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이며, 예를 들어, 아미노산은 세린이고;

X₄는 트립토판, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 이소류신 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이며, 예를 들어, 아미노산은 트립토판 또는 티로신이고;

X₅는 임의의 아미노산 또는 글루탐산, 메티오닌, 글루타민, 트립토판, 세린, 발린, 아스파라긴, 글리신, 알라닌, 아르가닌, 히스티딘, 티로신, 리신 및 트레오닌으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이며, 예를 들어, 아미노산은 세린이고;

X₆은 티로신, 메티오닌, 이소류신 및 트레오닌으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이며, 예를 들어, 아미노산은 메티오닌, 티로신 또는 트레오닌이고;

X₇은 프롤린, 알라닌, 히스티딘, 글리신 및 리신으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이며, 예를 들어 아미노산은 프롤린이고;

X₈은 류신, 글루타민, 메티오닌, 알라닌, 페닐알라닌, 이소류신, 리신, 히스티딘 및 글리신으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이며, 예를 들어, 아미노산은 류신이고;

X₉는 임의의 아미노산 또는 트레오닌, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌, 리신, 세린, 히스티딘, 프롤린, 트립토판, 이소류신, 글루타민, 글리신 및 발린으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이며, 예를 들어, 아미노산은 트레오닌이다.

본 개시내용은 hG-CSFR에 결합하고 G-CSF 신호전달을 상쇄시키는 단백질(예를 들어, 항체)을 제공하는데, 단백질은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 항체의 하나 이상의 가변 영역을 포함한다:

(i) 서열번호 2에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(ii) 서열번호 3에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(iii) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(iv) 서열번호 5에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(v) 서열번호 14에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(vi) 서열번호 15에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(vii) 서열번호 16에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(viii) 서열번호 17에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(ix) 서열번호 18에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(x) 서열번호 19에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xi) 서열번호 20에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xii) 서열번호 21에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xiii) 서열번호 22에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xiv) 서열번호 23에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xv) 서열번호 24에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xvi) 서열번호 25에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xvii) 서열번호 26에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xviii) 서열번호 27에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xix) 서열번호 28에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xx) 서열번호 29에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxi) 서열번호 30에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxii) 서열번호 31에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xxiii) 서열번호 32에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxiv) 서열번호 33에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xxv) 서열번호 34에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxvi) 서열번호 35에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxvii) 서열번호 36에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xxviii) 서열번호 37에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxix) 서열번호 38에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xxx) 서열번호 39에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxxi) 서열번호 40에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xxxii) 서열번호 41에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxxiii) 서열번호 42에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xxxiv) 서열번호 43에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxxv) 서열번호 44에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxxvi) 서열번호 45에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xxxvii) 서열번호 46에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxxviii) 서열번호 47에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxxix) 서열번호 48에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xl) 서열번호 49에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xli) 서열번호 50에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xlii) 서열번호 51에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xliii) 서열번호 52에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xliv) 서열번호 53에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xlv) 서열번호 54에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xlvi) 서열번호 55에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xlvii) 서열번호 56에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xlviii) 서열번호 57에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(xlix) 서열번호 58에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(l) 서열번호 59에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(li) 서열번호 60에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(lii) 서열번호 61에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H;

(liii) 서열번호 62에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L; 및

(liv) 서열번호 63에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L.

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 단백질은 하나 이상의 V_H 및 하나의 V_L을 포함하는데, 이때 V_H 및 V_L은 결합하여 항원 결합 도메인을 포함하는 Fv를 형성한다. 당업자는 항원 결합 도메인이 항체의 결합 부위를 포함한다는 것을 인지할 것이다.

하나의 예에서, V_H 및 V_L은 단일 폴리펩티드 쇄에 있다. 예를 들어, 단백질은 다음과 같다:

(i) 단일 쇄 Fv 단편(scFv);

(ii) 이합체 scFv(di-scFv); 또는

(iii) 항체의 불변 도메인, Fc 또는 중쇄 불변 도메인(C_H) 2 및/또는 C_H3에 연결된 (i) 및/또는 (ii)중 하나 이상.

하나의 예에서, V_H 및 V_L은 별개의 폴리펩티드 쇄에 있다.

예를 들어, 단백질은 다음과 같다:

(i) 다이아바디(diabody);

(ii) 트라이아바디(triabody);

(iii) 테트라바디(tetrabody);

(iv) Fab;

(v) F(ab')₂;

(vi) Fv; 또는

(vii) 항체의 불변 도메인, Fc 또는 중쇄 불변 도메인(C_H) 2 및/또는 C_H3에 연결된 (i) 내지 (vi)중 하나 이상.

전술한 단백질들(앞선 두 가지 목록에서 설명된)은 항체의 항원 결합 도메인으로 또한 지칭될 수 있다.

하나의 예에서, 단백질은 항체다. 하나의 예에서, 항체는 네이키드(naked) 항체다.

하나의 예에서, 단백질은 키메라성의, 탈-면역화된, 인간화된, 인간 또는 영장류화된다.

하나의 예에서, 단백질 또는 항체는 인간이다.

본 개시내용은 hG-CSFR에 결합하고, G-CSF 신호전달을 상쇄시키는 다음을 포함하는 항체를 추가적으로 또는 대안으로 제공한다:

(i) 서열번호 2에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 3에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(ii) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 5에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(iii) 서열번호 15에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 14에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(iv) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 16에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(v) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 17에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(vi) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 18에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(vii) 서열번호 20에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 19에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(viii) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 21에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(ix) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 22에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(x) 서열번호 24에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 23에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xi) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 25에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xii) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 26에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xiii) 서열번호 28에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 27에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xiv) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 29에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xv) 서열번호 31에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 30에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xvi) 서열번호 33에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 32에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xvii) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 34에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xviii) 서열번호 36에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 35에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xix) 서열번호 38에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 37에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xx) 서열번호 40에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 39에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxi) 서열번호 42에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 41에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxii) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 43에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxiii) 서열번호 45에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 44에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxiv) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 46에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxv) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 47에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxvi) 서열번호 49에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 48에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxvii) 서열번호 51에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 50에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxviii) 서열번호 53에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 52에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxix) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 54에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxx) 서열번호 55에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 5에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxxi) 서열번호 57에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 56에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxxii) 서열번호 59에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 58에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxxiii) 서열번호 61에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 60에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxxiv) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 62에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;

(xxxv) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 63에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L; 및

(xxxvi) (i) 내지 (xxxv)중 하나 이상에서 제시된 V_H의 3개의 CDR을 포함하는 V_H와 (i) 내지 (xxxv)중 하나 이상에서 제시된 V_L의 3개의 CDR을 포함하는 V_L.

표 3에서 예시적인 V_H 및 V_L의 서열을 나타내는데, 이때 언급된 V_H 또는 V_L CDR3 서열은 본 명세서에서 기술된 C1.2 또는 C1.2G의 V_H 또는 V_L 서열내 대응하는 서열을 대신한다.

하나의 예에서, 본 개시내용은 hG-CSFR에 결합하고 G-CSF 신호전달을 상쇄시키는, 다음을 포함하는 항체를 제공한다:

(i) 서열번호 2에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 3에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L; 또는

(ii) 서열번호 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H와 서열번호 5에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L.

본 개시내용은 서열번호 64에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 65에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 추가적으로 또는 대안으로 제공한다. 하나의 예에서, 항체는 hG-CSFR에 결합하고, G-CSF 신호전달을 상쇄시킨다.

본 개시내용은 서열번호 68에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 서열번호 65에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 추가적으로 또는 대안으로 제공한다. 하나의 예에서, 항체는 hG-CSFR에 결합하고 G-CSF 신호전달을 상쇄시킨다.

본 개시내용은 서열번호 64에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄와 서열번호 68에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 서열번호 65에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄를 포함하는 항체를 추가적으로 또는 대안으로 제공한다. 하나의 예에서, 항체는 hG-CSFR에 결합하고 G-CSF 신호전달을 상쇄시킨다.

hG-CSFR에 "결합하는" 단백질 또는 항체에 대한 참조는 hG-CSFR에 "특이적으로 결합하는" 단백질 또는 항체에 대한 문헌적 뒷받침을 제공한다.

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 단백질 또는 항체는 마우스 G-CSFR에 특이적으로 결합하지 않고/거나 마우스 G-CSFR에 검출가능한 수준으로 결합하지 않는다.

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 임의의 예에 따른 단백질 또는 항체는 C1.2 및/또는 C1.2G가 hG-CSFR 또는 이를 발현시키는 또는 서열번호 1 또는 가용성 hG-CSFR(예를 들어, 항체의 Fc 영역에 융합된 서열번호 1의 아미노산 1 내지 311을 포함하는)을 발현시키는 세포에 대한 결합을 경쟁적으로 억제한다.

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 단백질 또는 항체는 hG-CSFR의 리간드 결합 영역과 cynoG-CSFR의 리간드 결합 영역에 유사한 친화도로 결합한다. 하나의 예에서, 단백질은 가용성 hG-CSFR 및 가용성 cynoG-CSFR에 유사한 친화도로 결합한다. 하나의 예에서, 단백질은 서열번호 1을 포함하는 폴리펩티드와 서열번호 67을 포함하는 폴리펩티드에 유사한 친화도로 결합한다. 하나의 예에서, 단백질은 본 명세서에서 기술된 것과 같이 유사한 친화도로 hG-CSFR-Fc 및 cynoG-CSFR-Fc에 결합한다. 하나의 예에서, 친화도는 약 2nM 이상, 예를 들어, 약 1.5nM 이상, 예컨대 약 1.2nM, 1.1nM 또는 1nM 이상이다. 하나의 예에서, 0.5nM, 예컨대, 약 0.46nM 또는 0.45nM 또는 0.40nM 또는 0.39nM 이상이다. 다른 예에서, 친화도는 약 0.1nM 이상, 예컨대 약 0.09nM 이상, 예를 들어, 약 0.08nM 이상이다. 하나의 예에서, 결합 수준은 바이오센스, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명을 이용하여 평가된다. 예를 들어, 리간드 결합 영역 또는 가용성 hG-CSFR 또는 가용성 cynoG-CSFR 또는 hG-CSFR-Fc 또는 cyno-G-CSFR-Fc는 고정되고, 본 개시내용의 단백질에 대한 결합 수준이 측정된다.

다른 예에서, 본 개시내용의 단백질은 예를 들어, 바이오센스에 고정되고, 리간드 결합 영역 또는 가용성 hG-CSFR 또는 가용성 cynoG-CSFR 또는 hG-CSFR-Fc 또는 cyno-G-CSFR-Fc의 결합 수준이 측정된다. 예를 들어, hG-CSFR 또는 cynoG-CSFR의 세포밖 도메인에 대한 결합 수준이 측정된다. 이러한 예에 따르면, cynoG-CSFR의 세포밖 도메인에 대한 단백질의 친화도는 약 1nM 이상, 예컨대 약 0.9nM 이상, 예를 들어, 약 0.75nM 이상이다. 예를 들어, 친화도는 약 0.7nM 이상, 예컨대 약 0.6nM 이상, 예를 들어, 약 0.5nM 이상이다. 하나의 예에서, 친화도는 약 0.5nM이다. 대안으로 또는 추가적으로, hG-CSFR의 세포밖 도메인에 대한 단백질의 친화도는 약 7nM 또는 6nM 또는 5nM 이상, 예컨대 약 4nM 이상, 예를 들어, 약 3nM 이상, 예를 들어, 약 2.5nM 이상이다. 예를 들어, 친화도는 약 2.4 또는 2.5nM 이상이다.

본 개시내용은 전술한 항체의 항원 결합 도메인들 또는 항원 결합 단편들을 또한 제공한다.

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 단백질 또는 항체는 IgG4 항체의 불변 영역 또는 IgG4 항체의 안정화된 불변 영역을 포함한다. 하나의 예에서, 단백질 또는 항체는 위치 241(카바트(Kabat)의 번호매김 체계에 따라(문헌[Kabat et al ., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 and/or 1991]))에 프롤린과 함께 IgG4 불변 영역을 포함한다.

본 개시내용의 완전한(whole) 항체의 중쇄 불변 영역의 C-말단 리신은 예를 들어, 항체의 생산 또는 정제 동안, 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산을 재조합적으로 공작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 완전한 항체는 제거된 모든 C-말단 리신 잔기들을 가진 항체 집단들, 제거된 C-말단 리신 잔기들이 없는 항체 집단들, 및 C-말단 리신 잔기를 가지거나 가지지 않은 항체 혼합물을 보유하는 항체 집단을 포함한다. 일부 예들에서, 항체 집단들은 중쇄 불변 영역들중 하나에서 C-말단 리신 잔기가 제거된 항체를 추가적으로 포함할 수 있다. 유사하게, 완전한 항체의 조성물은 C-말단 리신 잔기를 가진 또는 잔기가 없는 항체 집단들의 동일한 또는 유사한 혼합을 포함할 수 있다.

하나의 예에서, 안정화된 불변 영역은 서열번호 64의 위치 119 내지 위치 445의 서열을 포함한다. 하나의 예에서, 안정화된 불변 영역은 서열번호 68의 위치 119 내지 위치 444의 서열을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 하나의 예에서 단백질 또는 항체 또는 본 명세서에서 기술된 단백질 또는 항체는 C-말단 리신 잔기를 가진 또는 없는 완전한 또는 일부 서열들의 혼합물을 포함하는, 안정화된 중쇄 불변 영역이 내포된 중쇄 불변 영역을 포함한다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 항체는 IgG4 불변 영역 또는 안정화된 IgG4 불변 영역(예를 들어, 상기에서 논의된 바와 같은)에 용합된 또는 연결된 V_H와 카파 경쇄 불변 영역에 연계되거나 융합된 V_L을 포함한다.

본 개시내용은 약 6nM 이상의 IC₅₀으로 hG-CSFR을 발현시키는 BaF3 세포의 G-CSF-유도된 증식을 억제하는 단백질 또는 항체를 또한 제공한다. 예를 들어, IC₅₀은 5.9nM 이하이다. 다른 예에서, IC₅₀은 2nM 이하 또는 1nM 이하 또는 0.7nM 이하 또는 0.6nM 이하 또는 0.5nM 이하이다. 하나의 예에서, IC₅₀은 약 0.5ng/mL hG-CSF 존재하에, 예를 들어, 약 48 시간 동안 BaF3 세포(예를 들어 약 2x10⁴ 세포)를 배양함으로써 측정된다. 하나의 예에서, BaF3 세포의 증식은 3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸리움 브롬화물(MTT) 환원을 측정함으로써, 결정된다.

본 개시내용은 약 10μg/mL 이상의 IC₅₀으로 hG-CSFR을 발현시키는 BaF3 세포의 G-CSF-유도된 증식을 억제하는 단백질 또는 항체를 또한 제공한다. 예를 들어, IC₅₀은 5μg/mL 이하이다. 다른 예에서, IC₅₀은 3μg/mL 이하 또는 2μg/mL 이하 또는 1μg/mL 이하이다. 하나의 예에서, IC₅₀은 약 0.8μg/mL이다. 하나의 예에서, IC₅₀은 약 10ng/mL hG-CSF 존재하에, 예를 들어, 약 48 시간 동안 BaF3 세포(예를 들어 약 1x10⁴ 세포)를 배양함으로써 측정된다. 하나의 예에서, BaF3 세포의 증식은 ³H-티미딘 통합을 측정함으로써, 결정된다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질 또는 항체는 항체 Fc 영역(hG-CSFR-Fc)과 함께 융합체(fusion)로서 발현되는 서열번호 1의 아미노산 1 내지 311을 포함하는 가용성 hG-CSFR에 약 1.5nM 이상의 친화도로 결합한다. 예를 들어, 친화도는 약 0.5nM 또는 0.4nM 또는 0.35nM 또는 0.33nM 이상이다. 하나의 예에서, 단백질의 친화도는 바이오센스, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명을 이용하여 측정된다. 예를 들어, hG-CSFR-Fc는 고정되고, 본 개시내용의 단백질의 친화도가 측정된다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질 또는 항체는 세포 표면에서 발현된 hG-CSFR에 약 1nM 이상의 친화도, 예를 들어, 약 0.5nM 이상, 예컨대, 0.4nM 이상, 예를 들어, 0.3nM 이상, 예컨대, 0.2nM 이상의 친화도로 결합된다.

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 임의의 예에 따른 단백질은 게잡이원숭이에 투여된다면 또는 투여될 때, 순환계에서 호중구의 수를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 단백질은 게잡이원숭이에게 0.05m/kg 내지 30mg/kg, 바람직하게는 0.1mg/kg 내지 10mg/kg 사이의 용량, 예를 들어, 0.1mg/kg 또는 1mg/kg 또는 2mg/kg 또는 5 mg/kg 또는 10mg/kg의 용량으로 투여될 때, 또는 투여된다면, 순환계내 호중수의 수를 감소시킨다. 예를 들어, 단백질은 G-CSF 또는 필그라스팀(filgrastim) 또는 이의 페길화된(PEGylated) 형태의 투여 이후 투여될 때 또는 투여된다면, 예를 들어, 단백질이 G-CSF 또는 필그라스팀 또는 이의 페길화된 형태 투여 이후, 약 12시간에 투여될 때 또는 투여된다면, 순환계에서 호중구의 수를 감소시킨다. 하나의 예에서, 이러한 감소는 2 배 또는 3 배 감소이다. 하나의 예에서, 호중구는 투여 이후 약 10 내지 24 시간, 예를 들어, 약 12 시간에 감소된다.

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 단백질 또는 항체는 단리되고/거나 재조합된 것이다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질 또는 항체는 다른 화합물, 예를 들어, 단백질 또는 항체의 반감기를 연장시키는 검출가능한 표지 또는 화합물, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 알부민 결합 단백질에 접합(conjugating)된다.

본 개시내용은 본 개시내용의 단백질 또는 항체를 코딩하는 핵산을 또한 제공한다.

하나의 예에서, 이러한 핵산은 발현 구조체내에 포함되는데, 이때 핵산은 프로모터에 작용가능하도록 연결된다. 이러한 발현 구조체는 벡터내에, 예를 들어, 플라스미드일 수 있다.

단일 폴리펩티드 쇄 단백질에 관계된 본 개시내용의 예들에서, 발현 구조체는 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산에 연결된 프로모터를 포함할 수 있다.

단백질을 형성하는 다중 폴리펩티드 쇄들에 관계된 예들에서, 발현 구조체는 예를 들어, 프로모터에 작동가능하도록 연결된 V_H를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 프로모터에 작동가능하도록 연결된 V_L을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다.

다른 예에서, 발현 구조체는 예를 들어, 5'에서 3'순서로 다음의 작동가능하도록 연결된 성분들을 포함하는, 이중시스트론성(bicistronic) 발현 구조체이다:

(i) 프로모터;

(ii) 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

(iii) 내부 리보좀 진입 부위; 및

(iv) 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산,

이때 제 1 폴리펩티드는 V_H를 포함하고, 제 2 폴리펩티드는 V_L을 포함하거나, 이 역이 성립된다.

본 개시내용은 별개의 발현 구조체들이 고려되는데, 이중 하나는 V_H를 포함하는 제 1 폴리펩티드를 코딩하는 발현 구조체이며, 또다른 하나는 V_L을 포함하는 제 2 폴리펩티드를 코딩하는 발현 구조체이다. 예를 들어, 본 개시내용은 다음을 포함하는 조성물을 또한 제공한다:

(i) 프로모터에 작동가능하도록 연결된 V_H를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 포함된 제 1 발현 구조체; 및

(ii) 프로모터에 작동가능하도록 연결된 V_L을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 포함된 제 2 발현 구조체.

본 개시내용은 본 개시내용의 단백질을 발현시키는 단리된 또는 재조합 세포를 또한 제공한다.

하나의 예에서, 이 세포는 본 개시내용의 발현 구조체 또는 다음을 포함한다:

(i) 프로모터에 작동가능하도록 연결된 V_H를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 포함된 제 1 발현 구조체; 및

(ii) 프로모터에 작동가능하도록 연결된 V_L을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 포함된 제 2 발현 구조체.

본 개시내용의 세포의 예로는 세균 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포가 포함된다.

본 개시내용은 추가적으로 본 개시내용의 단백질 또는 항체를 생산하는 방법들이 제공된다. 예를 들어, 이러한 방법은 단백질이 생산되는데 충분한 조건하에 본 개시내용의 발현 구조체를 유지시키는 것과 관련된다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질 또는 항체를 생산하는 방법은 단백질 또는 항체가 생산되고, 선택적으로 분비되는데 충분한 조건들하에서 본 개시내용의 세포를 배양하는 것을 포함한다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질을 생산하는 방법은 단백질 또는 항체를 단리하고, 선택적으로 단백질 또는 항체를 약학 조성물로 제형화하는 것을 추가적으로 포함한다.

본 개시내용은 추가적으로 본 개시내용의 단백질 또는 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 개시내용은 다음을 포함하는 조성물을 추가적으로 제공한다:

(i) 서열번호 64에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 65에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;

(ii) (a) 서열번호 64에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 65에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및/또는 (b) 서열번호 64에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄와 서열번호 68에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 하나의 중쇄 및 서열번호 65에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄를 포함하는 항체; 및

선택적으로, 약학적으로 허용되는 담체.

본 개시내용은 대상에서 G-CSF-매개된 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은 본 개시내용의 단백질, 항체 또는 조성물을 투여함을 포함한다. 이에 대하여, 단백질, 항체 또는 조성물은 질병의 재발을 막는데 이용될 수 있는데, 이것은 이 질병을 방지하는 것으로 간주된다.

하나의 예에서, G-CSF-매개된 질병은 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 암이다. 예를 들어, 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 관절염, 다발성 경화증, 폐의 염증 또는 만성 폐쇄성 폐 질환이다.

하나의 예에서, 이 방법은 호중구감소증을 유도하지 않고 대상에서 호중구의 수를 감소시키는데 충분한 양의 단백질 또는 항체를 투여함을 포함한다.

본 개시내용은 대안으로 또는 추가적으로 호중구감소증을 유도하지 않고 대상에서 호중구의 수를 감소시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 hG-CSFR에 결합하는(또는 특이적으로 결합하는) 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 단백질을 이 대상에게 투여함을 포함한다. 예시적인 단백질은 항체이거나 이의 항원 결합 도메인(예를 들어, V_H 및/또는 V_L)을 포함하는 또는 이의 항원 결합 단편이다. 예시적인 단백질 및 항체는 본 명세서에서 기술된다.

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 보통의 호중구감소증을 유발하지 않고 대상에서 호중구의 수를 감소시키는데 충분한 양의 단백질 또는 항체를 투여함을 포함한다.

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 심각한 호중구감소증을 유발하지 않고 대상에서 호중구의 수를 감소시키는데 충분한 양의 단백질 또는 항체를 투여함을 포함한다.

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 방법은 약 0.05mg/kg 내지 30mg/kg의 단백질 또는 항체를 투여함을 포함한다. 예를 들어, 이 방법은 0.1mg/kg 내지 10mg/kg 또는 0.2mg/kg 내지 5mg/kg의 단백질 또는 항체를 투여함을 포함한다. 하나의 예에서, 이 방법은 약 0.5 내지 2.0mg/kg의 단백질 또는 항체를 투여함을 포함한다.

본 개시내용은 본 명세서에서 기술된 것과 같이 의학에서 단백질 또는 항체의 용도를 또한 제공한다.

본 개시내용은 G-CSF-매개된 질병을 치료하기 위한 의약의 제조에서 본 명세서에서 기술된 임의의 예에 따른 단백질 또는 항체의 용도를 또한 제공한다.

본 개시내용은 G-CSFR을 발현시키는 세포와 연합된 G-CSF-매개된 질병에 국한시키고/거나 검출하고/거나 진단하고/거나 예측하는 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은 G-CSFR을 발현시키는 세포에 결합된 본 명세서에서 기술된 단백질 또는 항체가 만약 존재한다면, 이들을 생체내에서 검출하고, 이때 단백질 또는 항체는 검출가능한 태그(tag)에 접합된다.

하나의 예에서, 이 방법은 단백질을 이 대상에게 투여하는 것을 추가적으로 포함한다.

본 개시내용은 시료내에 G-CSFR 또는 이를 발현시키는 세포를 검출하는 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은 복합체가 형성되도록 이 시료와 본 명세서에서 기술된 임의의 예에 따른 단백질 또는 항체를 접촉시키고, 이 복합체를 검출하는 것을 포함하는데, 이때 복합체가 검출된다는 것은 이 시료내에 G-CSFR 또는 이를 발현시키는 세포를 나타낸다.

본 개시내용은 G-CSF-매개된 질병을 진단 또는 예측하는 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은 G-CSFR 또는 이를 발현시키는 세포를 검출하기 위하여 본 명세서에서 기술된 임의의 예에 따른 방법을 실행하는 것을 포함하는데, 이때 G-CSFR 또는 이를 발현시키는 세포의 검출은 이 질병의 진단 또는 예측을 나타낸다.

본 개시내용은 본 명세서에서 기술된 임의의 예에 따른 단백질 또는 항체와 본 명세서에서 기술된 방법에 이용하기 위한 지침이 포장된 키트를 또한 제공한다.

서열 목록에 대한 요점

서열번호 1 - 호모 사피엔스(Homo sapiens) G-CSFR(hG-CSFR)의 아미노산 25 내지 335와 C-말단 폴리히스티딘 태그

서열번호 2 - C1.2의 V_H

서열번호 3 - C1.2의 V_L

서열번호 4 - C1.2G의 V_H

서열번호 5 - C1.2G의 V_L

서열번호 6 - C1.2의 HCDR1

서열번호 7 - C1.2의 HCDR2

서열번호 8 - C1.2의 HCDR3

서열번호 9 - C1.2의 LCDR1

서열번호 10 - C1.2의 LCDR2

서열번호 11 - C1.2의 LCDR3

서열번호 12 - C1.2의 HCDR3의 콘센선스 서열

서열번호 13 C1.2의 LCDR3의 콘센선스 서열

서열번호 14 - 항체 987의 V_L

서열번호 15 - 항체 987의 V_H

서열번호 16 - 항체 95의 V_L

서열번호 17 - 항체 79의 V_L

서열번호 18 - 항체 83의 V_L

서열번호 19 - 항체 1003의 V_L

서열번호 20 - 항체 1003의 V_H

서열번호 21 - 항체 44의 V_L

서열번호 22 - 항체 97의 V_L

서열번호 23 - 항체 986의 V_L

서열번호 24 - 항체 986의 V_H

서열번호 25 - 항체 56의 V_L

서열번호 26 - 항체 77의 V_L

서열번호 27 - 항체 54의 V_L

서열번호 28 - 항체 54의 V_H

서열번호 29 - 항체 802의 V_L

서열번호 30 - 항체 967의 V_L

서열번호 31 - 항체 967의 V_H

서열번호 32 - 항체 989의 V_L

서열번호 33 - 항체 989의 V_H

서열번호 34 - 항체 63의 V_L

서열번호 35 - 항체 1002의 V_L

서열번호 36 - 항체 1002의 V_H

서열번호 37 - 항체 994의 V_L

서열번호 38 - 항체 994의 V_H

서열번호 39 - 항체 969의 V_L

서열번호 40 - 항체 969의 V_H

서열번호 41 - 항체 1000의 V_L

서열번호 42 - 항체 1000의 V_H

서열번호 43 - 항체 94의 V_L

서열번호 44 - 항체 975의 V_L

서열번호 45 - 항체 975의 V_H

서열번호 46 - 항체 75의 V_L

서열번호 47 - 항체 814의 V_L

서열번호 48 - 항체 973의 V_L

서열번호 49 - 항체 973의 V_H

서열번호 50 - 항체 977의 V_L

서열번호 51 - 항체 977의 V_H

서열번호 52 - 항체 984의 V_L

서열번호 53 - 항체 984의 V_H

서열번호 54 - 항체 61의 V_L

서열번호 55 - 항체 852의 V_H

서열번호 56 - 항체 996의 V_L

서열번호 57 - 항체 996의 V_H

서열번호 58 - 항체 43의 V_L

서열번호 59 - 항체 43의 V_H

서열번호 60 - 항체 999의 V_L

서열번호 61 - 항체 999의 V_H

서열번호 62 - 항체 870의 V_L

서열번호 63 - 항체 877의 V_L

서열번호 64 - 안정화된 IgG4 불변 영역과 C1.2G의 중쇄

서열번호 65 - 카파 불변 영역과 C1.2G의 경쇄

서열번호 66 - 예시적인 h-GCSFR의 서열

서열번호 67 - C-말단 폴리히스티딘 태그와 함께, 마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis) G-CSFR(cynoG-CSFR)의 Ig와 CRH 도메인을 포함하는 폴리펩티드

서열번호 68 - 안정화된 IgG4 불변 영역과 함께, C-말단 리신이 부족한 C1.2G의 중쇄.

도 1은 다양한 항-G-CSFR 항체의 농도를 증가시킴으로써, BaF3 세포의 G-CSF-매개된 증식 억제를 보여주는 그래프이다. 각 항체에 대한 상대적인 IC₅₀ 값들은 다음과 같다; mAb711의 경우 10.1μg/mL, mAb 774의 경우 37.4μg/mL, C1.2G의 경우 0.8μg/mL이며, mAb 744에 대해서는 측정가능하지 않았다.
도 2a는 서열번호 1에 대한 C1.2G 및 mAb744의 결합과 비교하여, 서열번호 1의 일련의 알라닌 점 돌연변이에 대한 이들의 상대적 결합을 보여주는 그래프이다(점 돌연변이 위치는 서열번호 1을 참고하여 표시된다). 서열번호 1과 비교하여 돌연변이 수용체에 대한 항체의 K_D의 배수 감소를 나타낸다.
도 2b는 서열번호 1에 대한 C1.2G, mAb744 및 mAb774의 결합과 비교하여, 서열번호 1의 일련의 알라닌 점 돌연변이에 대한 이들의 상대적 결합을 보여주는 그래프이다(점 돌연변이 위치는 서열번호 1을 참고하여 표시된다). 서열번호 1과 비교하여 돌연변이 수용체에 대한 항체의 K_D의 배수 감소를 나타낸다.
도 3은 페길화된 G-CSF가 게잡이원숭이들에게 투여되고, 하루 뒤 C1.2가 투여되는 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 혈액 μL 당 호중구 수로 평가되었다.

총괄

본 명세서를 통하여, 다른 명시가 없거나, 전후 문장에서 다른 것을 언급하지 않는 한, 단일 단계, 물질 조성물, 단계의 집단, 물질의 조성물 집단에 대한 언급은 이들 단계, 물질의 조성물들, 단계의 집단 또는 물질의 조성물 집단의 한 가지 및 다수(예컨대, 하나 이상)를 포괄할 것이다.

본 개시내용이 구체적으로 언급된 것들 이외의 변화 및 수정되기 용이함을 당업자는 인지할 것이다. 본 개시내용은 이러한 모든 변화 및 수정을 포함한다는 것을 인지할 것이다. 본 개시내용은 또한 본 명세서에서 언급된 또는 나타낸 단계들, 특징들, 조성물들 및 화합물 및 전술한 단계 및 특징들중 임의의 2개 이상의 조합 또는 모든 조합들은 모두 개별적으로 또는 집합적으로 포함된다.

본 개시내용은 예시를 제공하기 위한 목적으로만 의도된 본 명세서에서 기술된 특정 예에 의해 그 범위가 한정되지 않는다. 기능적으로-등가의 산물들, 조성물들, 및 방법들은 명백하게 본 개시내용의 범위내에 있다.

본 명세서의 본 개시내용의 임의의 예는 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 본 개시내용의 임의의 다른 예에 필요한 변형에 따라 적용될 것이다.

명시적으로 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당업계(예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학) 숙련자들이 공통적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가질 것이다.

다른 언급이 없는 한, 본 개시내용에서 이용된 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학 기술들은 당업계 숙련자들에게 잘 공지된 표준 과정들이다. 이러한 기술들은 출처 문헌들, 예컨대, 문헌[J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons](현재까지 업데이트된 모든 것들을 포함)을 통하여 기술되고 설명된다.

본 명세서에서 가변 영역들 및 이의 부분들, 면역글로블린들, 항체 및 이의 단편들은 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991, Bork et al ., J Mol . Biol . 242, 309-320, 1994, Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196:901 -917, 1987, Chothia et al . Nature 342, 877-883, 1989 and/or Al-Lazikani et al ., J Mol Biol 273, 927-948, 1997]에서 논의에 의해 더 분명해질 것이다.

용어 "및/또는", 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 "X와 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해될 것이며, 이들 두 의미 모두 또는 이들 중 하나를 명백하게 뒷받침하도록 제공될 것이다.

명세서를 통하여, 단어 "포함하다(comprise)", 또는 변형된 형태, 예컨대 "포함하는(comprising)"은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 집단을 포함하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 집단을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "~로부터 유도된"은 명시된 완전체(integer)가 해당 출처로부터 반드시 직접적으로 유도될 필요는 없지만 특정 출처로부터 수득될 수 있다는 것을 나타낸다.

선택된 정의

용어체계만을 목적으로 임의의 제한없이, 인간 G-CSFR의 예시적인 서열은 NCBI 참조 서열: NP_000751.1(및 서열번호 66에서 제시됨)에서 제시된다. 게잡이원숭이 G-CSFR의 서열은 본 명세서에서 제공되는 서열들을 이용하여 결정될 수 있고/거나 공개적으로 이용가능한 데이터베이스 및/또는 표준 기술을 이용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel et al ., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience](1988년 현재까지 모든 업데이트 포함) 또는 문헌[Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]). 인간 G-CSFR에 대한 언급은 hG-CSFR로 줄여서 나타낼 수 있으며, 게잡이원숭이 G-CSFR에 대한 언급은 cynoG-CSFR로 축약시킬 수 있다. 가용성 G-CSFR에 대한 언급은 G-CSFR의 리간드 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. G-CSFR의 Ig 및 CRH 도메인들은 리간드 결합 및 수용체 이합체화(dimerization)에 관련된다(문헌[Layton et al., J. Biol Chem ., 272: 29735-29741, 1997 and Fukunaga et al, EMBO J. 10: 2855-2865, 1991]). 수용체의 이들 부분들을 포함하는 G-CSFR의 가용성 형태들은 다양한 수용체의 다양한 연구들에서 이용되어왔고, 이 수용체의 위치 78, 163, 및 228에서 자유 시스테인의 돌연변이는 리간드 결합에 영향없이 가용성 수용체 폴리펩티드의 발현 및 단리를 지원한다(문헌[Mine et al ., Biochem ., 43: 2458-2464 2004]). 본 연구들에서, hG-CSFR의 아미노산 25 내지 335와 함께 돌연변이 C78A, C163S 및 C228S를 포함하는 수용체의 가용성 형태가 이용되었으며(예를 들어 서열번호 1) 시스테인 돌연변이와 함께 cynoG-CSFR의 대응하는 분절(예를 들어, 서열번호 67)이 게잡이원숭이 수용체에 대한 연구들에 이용되었다. 서열번호 1 및 서열번호 67의 가용성 수용체의 다양한 점 돌연변이들이 또한 이용되었다. hG-CSFR-Fc에 대한 언급은 C-말단 폴리히스티딘 태그가 Fc 서열로 치환된, 서열번호 1의 폴리펩티드(예를 들어, Fc에 융합된 서열번호 1의 아미노산 1 내지 311을 포함하는 폴리펩티드)를 의미한다. cynoG-CSFR의 C-말단에 부착된 Fc 서열과 대응하는 cynoG-CSFR 분절을 의미한다(예를 들어, Fc에 융합된 서열번호 67의 아미노산 1 내지 311을 포함하는 폴리펩티드). 본 발명자들은 항체 및 이의 항원 결합 부위(예를 들어, Fab)를 포함하는 단백질이 야생형 hG-CSF 폴리펩티드 및 이들의 돌연변이 단백질들에 매우 유사한 친화도로 결합한다는 것을 보여주었다. 따라서, 이 돌연변이 단백질들을 이용한 연구는 hG-CSFR 및/또는 cynoG-CSFR을 이용한 연구 모델이다.

본 명세서에서 G-CSF에 대한 언급은 G-CSF의 고유한 형태, 이의 돌연변이 형태들, 예를 들어, 필그라스팀 및 G-CSF 또는 필그라스팀의 페길화된 형태를 포함한다. 이 용어는 또한 G-CSFR(예를 들어, hG-CSFR)에 결합하여, 신호전달을 유도하는 활성을 유지하는 G-CSF의 돌연변이 형태를 또한 포괄한다.

용어 "단리된 단백질" 또는 "단리된 폴리펩티드"는 이의 근원 또는 유도 원천에 의해, 본래 상태에서 이와 수반되는 자연적으로-연합된 성분들이 연합되지 않은 단백질 또는 폴리펩티드로서; 동일한 원천의 다른 단백질은 실질적으로 없다. 단백질은 자연적으로 연합된 성분들이 실질적으로 없이 제공될 수 있거나, 당업계에 잘 공지되어 있는 단백질 정제 기술을 이용하여, 단리에 의해 실질적으로 정제될 수 있다. "실질적으로 정제된"이란 단백질은 오염 물질들이 실질적으로 없는, 예를 들어, 오염 물질들이 약 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 이상 없다는 것을 의미한다.

용어 "재조합"은 인위적인 유전적 재조합 산물을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 항체 항원 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질 문맥에서, 이 용어는 B 세포 성숙 동안 발생하는 천연 재조합의 산물인 대상의 신체내에서 자연적으로 발생되는 항체를 포괄하지 않는다. 그러나, 이러한 항체가 단리된 경우라면, 항체 항원 결합 도메인을 포함하는 단리된 단백질로 고려될 것이다. 유사하게, 단백질을 코딩하는 핵산이 단리되고, 재조합 수단에 의해 발현된다면, 생성된 단백질은 항체 항원 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질이다. 재조합 단백질은 이것이 발현되는 세포, 조직 또는 대상 안에서 인위적 재조합 수단에 의해 발현된 단백질을 또한 포괄한다.

용어 "단백질"은 단일 폴리펩티드 쇄, 예컨대, 펩티드 결합에 의해 연결된 연속 아미노산들 또는 공유적으로 또는 비-공유적으로 서로 연결된 일련의 폴리펩티드(예컨대, 폴리펩티드 복합체)를 포함할 것이다. 예를 들어, 일련의 폴리펩티드는 적절한 화학물 또는 이황화결합을 이용하여 공유적으로 연결될 수 있다. 비-공유 결합의 예로는 수소결합, 이온결합, 반데르발스 힘(Van der Waals force), 및 소수성 상호작용을 포함한다.

용어 "폴리펩티드" 또는 "폴리펩티드 쇄"는 전술한 문장으로부터 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 연속 아미노산을 의미한다는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 부위"는 항원에 결합 또는 특이적으로 결합할 수 있는 단백질에 의해 형성된 구조를 의미한다. 항원 결합 부위는 일련의 연속 아미노산일 필요도 없고, 더욱이 단일 폴리펩티드 쇄내의 아미노산일 필요도 없다. 예를 들어, 두 가지 상이한 폴리펩티드 쇄로부터 생성된 Fv에서 항원 결합 부위는 항원과 상호작용하는 V_L 및 V_H의 일련의 아미노산으로 구성되지만, 일반적으로 각 가변 영역내 하나 이상의 CDR에 있으나, 항상 그런 것은 아니다. 일부 예들에서, 항원 결합 부위는 V_H 또는 V_L 또는 Fv이다.

당업자는 "항체"가 다수의 폴리펩티드 쇄, 예를 들어, V_L을 포함하는 폴리펩티드와 V_H를 포함하는 폴리펩티드로 구성된 가변 영역을 포함하는 단백질로 간주된다는 것을 인지할 것이다. 항체는 또한 일반적으로 불변 도메인들을 포함하는데, 이들중 일부는 불변 영역으로 배열될 수 있고, 중쇄의 경우 불변 단편 또는 결정체를 이룰 수 있는 단편(Fc)을 포함한다. V_H와 V_L은 상호작용하여, 하나의 항원 또는 어느 정도 밀접하게 관련된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 영역을 포함하는 Fv를 형성한다. 일반적으로, 포유동물들의 경쇄는 κ 경쇄 또는 λ 경쇄이며, 포유동물들의 중쇄는 α, δ, ε, γ, 또는 μ이다. 항체는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 분류(예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂) 또는 하위분류(subclass)일 수 있다. 용어 "항체"는 또한 인간화된 항체, 영장류화된 항체, 인간 항체 및 키메라 항체를 포괄한다.

용어 "전장(full-length) 항체", "고유(intact) 항체" 또는 "완전한(whole) 항체"는 항체의 항원 결합 단편과는 반대로, 실질적으로 고유한 형태의 항체를 지칭하는 것으로 호환사용된다. 구체적으로, 완전한 항체는 Fc 영역을 내포하는 중쇄 및 경쇄를 가진 것들이 포함된다. 불변 도메인들은 야생형 서열 불변 도메인들(예를 들어, 인간 야생형 서열 불변 도메인들) 또는 이의 아미노산 서열 변이체들일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "가변 영역"은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 본 명세서에서 정의된 바와 같이 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 부분들을 지칭하며, 상보성 결정 영역들(CDR); 예컨대, CDRl, CDR2, 및 CDR3, 및 골격(framework) 영역들(FR)의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 가변 영역들은 3개의 CDR과 함께 3개 또는 4개 FR(예를 들어, FR1, FR2, FR3 및 선택적으로 FR4)을 포함한다. IgNAR로부터 유도된 단백질의 경우, 단백질은 CDR2가 부족할 수 있다. V_H는 이 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. V_L은 이 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 결정 영역들"(동의의 CDR; 예컨대, CDRl, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합에 필수적인, 항체 가변 영역의 아미노산 잔기들을 지칭한다. 각 가변 영역은 일반적으로 CDRl, CDR2 및 CDR3으로 식별된 3가지 CDR 영역들을 보유한다. CDR 및 FR에 할당된 아미노산 위치들은 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991] 또는 본 개시내용의 실행에 있어서 다른 넘버링 시스템, 예를 들어, 문헌[Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989]의 전형적인 넘버링 시스템; 및/또는 문헌[Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273: 927-948, 1997; Lefranc et al., Devel. And Compar. Immunol., 27: 55-77, 2003]의 IMGT 넘버링 시스템; 또는 문헌[Honnegher and Plukthun J. Mol. Biol., 309: 657-670, 2001]의 AHO 넘버링 시스템에 따라 정의될 수 있다. 예를 들어, 카바트의 넘버링 시스템에 따르면, V_H 골격 영역들(FR) 및 CDR은 다음과 같이 위치된다: 잔기 1 내지 30(FRl), 31 내지 35(CDR1), 36 내지 49(FR2), 50 내지 65(CDR2), 66 내지 94(FR3), 95 내지 102(CDR3) 및 103 내지 113(FR4). 카바트의 넘버링 시스템에 따르면, V_L FR 및 CDR은 다음과 같이 위치된다: 잔기 1 내지 23(FRl), 24 내지 34(CDR1), 35 내지 49(FR2), 50 내지 56(CDR2), 57 내지 88(FR3), 89 내지 97(CDR3) 및 98 내지 107(FR4). 본 개시내용은 카바트 넘버링 시스템에 의해 정의된 것과 같은 FR 및 CDR들에 한정되지 않으며, 상기에서 논의된 것들을 포함하는 모든 넘버링 시스템을 포함한다. 하나의 예에서, 본 명세서에서 CDR(또는 FR)에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 따른 이들 영역에 대한 것들이다.

"골격 영역(FR)"은 CDR 잔기를 제외한 가변 영역 잔기이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "Fv"는 다중 폴리펩티드들 또는 단일 폴리펩티드로 포함된 임의의 단백질에서 V_L과 V_H가 연합되어, 예컨대, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 형성하는, 단백질을 지칭한다. 항원 결합 부위를 형성하는 V_H 및 V_L은 단일 폴리펩티드 쇄내에 있거나 상이한 폴리펩티드 쇄에 있을 수 있다. 또한, 본 개시내용의 Fv(뿐만 아니라 본 개시내용의 임의의 단백질)는 동일한 항원에 결합할 수 있거나 결합할 수 없는 다중 항원 결합 부위를 보유할 수 있다. 이 용어는 항체로부터 직접적으로 유도된 단편들뿐만 아니라 재조합 수단을 이용하여 만든 이러한 단편에 대응하는 단백질을 포괄하는 것으로 이해될 것이다. 일부 예들에서, V_H는 중쇄 불변 도메인(C_H) 1에 연계되지 않고/거나 V_L은 경쇄 불변 도메인(C_L)에 연계되지 않는다. 폴리펩티드들 또는 단백질들을 포함하는 예시적인 Fv는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab') 단편, scFv, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디 또는 더 높은 차원의 복합체, 또는 불변 영역 또는 이의 도메인에 연결된 전술한 것중 임의의 것, 예를 들어, C_H2 또는 C_H3 도메인, 예를 들어, 미니바디(minibody)를 포함한다. "Fab 단편"은 면역글로블린의 단가 항원-결합 단편으로 구성되며, 고유한 경쇄 또는 중쇄의 일부로 형성된 단편을 생성시키기 위하여 효소 파파인으로 완전한 항체를 절단함으로써 생성될 수 있거나, 재조합 수단에 의해 생산될 수 있다. 항체의 "Fab' 단편"은 고유한 경쇄와 V_H 및 단일 불변 도메인을 포함하는 중쇄의 일부분으로 구성된 분자를 생성하기 위하여, 완전한 항체를 펩신으로 처리하고, 환원시켜, 수득될 수 있다. 이러한 방식으로 처리된 항체에서 2개의 Fab' 단편들은 획득된다. Fab' 단편은 재조합 수단에 의해 또한 생성될 수 있다. 항체의 "F(ab')2 단편"은 2개의 이황화결합에 의해 서로 잡고있는 2개의 Fab' 단편들의 이합체로 구성되며, 후속적인 환원없이 효소 펩신으로 완전한 항체 분자를 처리함으로써 획득된다. "Fab₂" 단편은 예를 들어 류신 지퍼(zipper) 또는 C_H3 도메인을 이용하여 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 재조합 단편이다. "단일 쇄 Fv" 또는 "scFv"는 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역이 적합한, 연성 폴리펩티드 연결기에 의해 공유적으로 연결된, 항체의 가변 영역 단편(Fv)을 내포하는 재조합 분자다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단백질 또는 이의 항원 결합 부위가 항원과의 상호작용을 언급할 때 용어 "결합하다"는 상호작용이 항원 상에서 특정 구조(예를 들어, 항원 결정부위 또는 에피토프)에 따라 달라진다는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체는 일반적인 단백질보다는 특정 단백질의 구조를 인지하여 이에 특이적으로 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 결합한다면, 단백질과 표지된 "A"를 함유하는 반응물 내에서, 에피토프 "A"(또는 유리된, 표지되지 않은 "A")를 내포하는 분자의 존재로 항체에 결합된 표지된 "A"의 양이 감소될 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다"는 본 개시내용의 단백질이 대체 항원 또는 세포와의 반응보다, 특정 항원 또는 이를 발현시키는 세포와 더 큰 친화도로, 더 빈번하게, 더 신속하게, 그리고 더 오랫동안 반응 또는 연합한다는 의미다. 예를 들어, 단백질은 다중 반응성 천연 항체(예컨대, 인간에서 자연적으로 발견되는 다양한 항원에 결합하는 것으로 공지된 자연 발생적 항체에 의해)에 의해 통상적으로 인지되는 항원 또는 다른 사이토킨 수용체에 결합하는 것보다는 훨씬 더 큰 친화도(예를 들어, 20 배 또는 40 배 또는 60 배 또는 80 배 내지 100 배 또는 150 배 또는 200 배)로 G-CSFR(예를 들어, hG-GCSFR)에 결합한다. 본 개시내용의 예에서, hG-CSFR의 돌연변이 형태 또는 이의 영역을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, h-GCSFR의 리간드 결합 도메인의 돌연변이 형태) 또는 위치 287의 고유 아르기닌에서 치환된 알라닌을 포함하는 서열번호 1의 돌연변이 형태에 결합하는 것보다 20 배 또는 40 배 또는 60 배 또는 80 배 또는 100 배 또는 150 배 또는 200 배 이상 더 큰 친화도로, 단백질은 hG-CSFR 또는 이의 영역을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, hG-GCSFR의 리간드 결합 도메인) 또는 서열번호 1의 아미노산 1 내지 311을 포함하는 폴리펩티드중 한 가지 형태에 "특이적으로 결합한다". 서열번호 1에 대한 추가 예시적인 변화 및 결합에서 이들의 효과는 본 명세서에서 기술된다. 일반적으로, 그러나, 반드시 그런 것은 아니지만, 결합에 대한 언급은 특이적 결합을 의미하며, 각 용어는 다른 용어에 대한 명백한 뒷받침을 제공하는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "검출가능하게 결합하지 않는"이란, 단백질, 예를 들어, 항체가 배경이상에서 10%, 또는 8% 또는 6% 또는 5% 미만의 수준으로 후보 항원에 결합한다는 의미로 이해될 것이다. 배경은 단백질이 없을 때 검출되고/거나 부정적 대조군 단백질(예를 들어, 아이소타입 대조군 항체)의 존재시에 검출되고/거나 부정적 대조군 항원이 존재할 때 검출되는 결합 수준 신호가 될 것이다. 결합 수준은 단백질이 고정되고, 항원과 접촉되는 바이오센스 분석(예를 들어 바이아코어(Biacore))을 이용하여 검출된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하지 않는다"는 것은 본 개시내용의 단백질이 폴리펩티드에 결합하는 수준이 배경, 예를 들어, 단백질이 없을 때 검출되고/거나 부정적 대조군 단백질(예를 들어, 아이소타입 대조군 항체)의 존재시에 검출되고/거나 부정적 대조군 항원이 존재할 때 검출되는 결합 수준 신호이상으로 통계학적으로 유의적으로 더 높지 않다는 것을 의미한다. 결합 수준은 단백질이 고정되고, 항원과 접촉되는 바이오센스 분석(예를 들어 바이아코어)을 이용하여 검출된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항원과 관련하여 "감소된 결합" 또는 "더 낮은 수준의 결합" 구절의 언급은 항체가 항원(예를 들어, 서열번호 1의 287, 237, 198, 172, 171 또는 111중 임의의 위치에서의 알라닌 점 돌연변이)에 대조군 에피토프 또는 항원(예를 들어 서열번호 1)보다 약 20 배 또는 40 배 또는 60 배 이상 적은 친화도로 결합하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 본 개시내용의 단백질은 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 것보다 20 배 또는 40 배 또는 60 배 적은 수준에서 위치 237의 히스티딘 대신 알라닌이 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 단백질은 20 배 적은, 더 바람직하게는 40 배 적은, 여전히 더 바람직하게는 60 배 적은 수준에서 결합된다.

단백질 또는 항체가 또다른 폴리펩티드에 대한 단백질 또는 항체의 해리상수(K_D) 미만의 K_D로 폴리펩티드에 결합한다면, 폴리펩티드에 "선호적으로 결합한다"는 것으로 간주될 수 있다. 하나의 예에서, 단백질 또는 항체는 또다른 폴리펩티드에 대하여 적어도 약 20 배 또는 40 배 또는 60 배 또는 80 배 또는 100 배 또는 120 배 또는 140 배 또는 160 배 이상의 친화도(예컨대, K_D)로 폴리펩티드에 결합한다면, 폴리펩티드에 "선호적으로 결합한다"는 것으로 간주될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "유사한 친화도"는 본 개시내용의 단백질이 2개의 항원(예를 들어, 인간과 게잡이원숭이로부터 G-CSFR의 리간드 결합 도메인)에 서로 약 5 배 이하, 예를 들어, 서로 약 4, 3, 2, 또는 1 배, 예컨대, 서로 약 0.5 배 이내의 친화도로 결합되면, 또는 예를 들어, 친화도가 2개 항원(예를 들어, 인간과 게잡이원숭이로부터 G-CSFR의 리간드 결합 도메인 또는 세포밖 도메인)을 고정시키고, 고정된 단백질과 본 개시내용의 단백질을 접촉시켜 측정될 때, 결합 수준이 실질적으로 동일하다는 의미로 이해될 것이다.

명료함을 목적으로 본 명세서에서 구체화된 사상에 근거하여 당업자에게 자명한 것과 같이, 본 명세서에서, "친화도"에 대한 언급은 단백질 또는 항체의 K_D에 대한 언급이다.

명료함을 목적으로 본 명세서에서 구체화된 사상에 근거하여 당업자에게 자명한 것과 같이, 본 명세서에서, "약 ~ 이상의 친화도"에 대한 언급은 친화도(또는 K_D)가 언급된 값 이상(즉, 친화도로 언급된 값이 더 낮은), 즉, 2nM의 친화도는 3nM의 친화도보다 더 크다는 것으로 이해될 것이다. 또다른 방식으로 언급된, 이 용어는 "X 이하의 친화도"일 수 있으며, 이때 X는 본 명세서에서 언급된 값이 된다.

"약 ~ 이상의 IC₅₀"은 IC₅₀이 언급된 값 이상(즉, IC₅₀으로 언급된 값이 더 낮은), 즉, 2nM의 IC₅₀는 3nM의 IC₅₀보다 더 크다는 것으로 이해될 것이다. 또다른 방식으로 언급된, 이 용어는 "X 이하의 IC₅₀"일 수 있으며, 이때 X는 본 명세서에서 언급된 값이 된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"(동의어 "항원 결정부위")는 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 단백질이 결합하는 hG-CSFR의 영역을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 이 용어는 단백질이 접촉하는 특정 잔기들 또는 구조에 반드시 한정되지 않는다. 예를 들어, 이 용어는 단백질에 의해 접촉되는 아미노산에 걸친 영역 및/또는 이 영역의 외부 5 내지 10 또는 2 내지 5 또는 1 내지 3개 아미노산들을 포함한다. 일부 예들에서, 이 에피토프는 hG-CSFR이 폴딩(folding)될 때, 서로 위치학적으로 가까운 일련의 불연속 아미노산을 포함하는데 예컨대, "형태학적(conformational) 에피토프"다. 예를 들어, 형태학적 에피토프는 서열번호 1의 111 내지 115, 170 내지 176, 218 내지 234 및/또는 286 내지 300의 하나 이상 또는 둘 이상 또는 모든 영역들에 있는 아미노산을 포함한다. 당업자는 용어 "에피토프"가 펩티드 또는 폴리펩티드들에 국한되지 않는다는 것을 또한 인지할 것이다. 예를 들어, 용어 "에피토프"는 분자의 화학적인 활성 표면 집단들, 예컨대 당 측쇄들, 포스포릴 측쇄들, 또는 술포닐 측쇄들을 포함하며, 특정 예에서, 특이적인 3차원 구조 특징, 및/또는 특이적 하전 특징들을 보유할 수 있다.

용어 "경쟁적으로 억제하는"이란 본 개시내용의 단백질(또는 이의 항원 결합 부위)이 언급된 항체 또는 단백질이 G-CSFR, 예를 들어, hG-CSFR에 결합하는 것을 감소 또는 막는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 이는 동일한 또는 중첩되는 에피토프에서의 단백질(또는 항원 결합 부위) 및 항체 결합 때문일 것이다. 전술한 내용으로부터, 단백질은 항체의 결합을 완벽하게 억제할 필요는 없으며, 오히려 항체의 결합을 통계학적으로 유의적인 양, 예를 들어, 약 10% 또는 20% 또는 30% 또는 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 95% 이상으로 단지 감소시킬 필요가 있다는 것은 자명해질 것이다. 바람직하게는, 단백질은 약 30% 이상, 더 바람직하게는 약 50% 이상, 더 바람직하게는, 약 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 75% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 80% 또는 85% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 90% 이상으로 항체의 결합을 감소시킨다. 결합의 경쟁적 억제를 결정하는 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있고/거나 본 명세서에서 기술된다. 예를 들어, 항체는 단백질의 존부하에 G-CSFR에 노출된다. 단백질이 없을 때보다 단백질이 존재할 때 항체 결합이 적다면, 단백질은 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것으로 간주된다. 하나의 예에서, 경쟁적 억제는 공간적 방해 때문은 아니다.

2개의 에피토프 내용에서 "중첩(overlapping)"은 2개의 에피토프들이 다른 에피토프에 결합하는 단백질(또는 항원 결정 부위)의 결합을 경쟁적으로 억제하기 위하여, 단백질(또는 이의 항원 결정 부위)이 한 에피토프에 결합을 허용하도록 충분한 수의 아미노산 잔기를 공유한다는 의미로 사용된 것이다. 예를 들어, "중첩" 에피토프들은 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 20개 이상의 아미노산을 공유한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "상쇄시키다(neutralize)"는 단백질이 G-CSFR을 통하여 세포내에서 G-CSF-매개된 신호전달을 차단, 감소 또는 막을 수 있다는 의미로 사용될 것이다. 상쇄를 측정하는 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있고/거나 본 명세서에서 기술된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "질병(condition)"은 정상적인 기능이 파괴 또는 간섭된 것을 지칭하는데, 임의의 특정 질병에 한정되지 않고, 질환 또는 장애를 포함할 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "G-CSF-연합된 질병"은 호중구, 과량의 G-CSF 또는 G-CSFR을 발현시키는 세포에 의한 또는 이와 연합된 또는 G-CSF의 투여와 연합된 임의의 질병을 지칭한다. 당업자는 이러한 질병을 용이하게 결정할 것이다. 이에 대하여, 일부 실시예들에서, 이 질병은 염증성 질환, 자가면역 질환 또는 암(전이를 포함)이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 방지하는("preventing", "prevent" 또는 "prevention")은 본 개시내용의 단백질의 투여와, 이로 인하여 한 질병의 하나 이상의 증상의 발달이 중단 또는 방해되는 것을 포함한다. 이 용어는 재발을 방지 또는 방해하기 위하여 완화된 대상의 치료를 또한 포괄한다. 예를 들어, 완화된 다발성 경화증의 재발로 고통을 받는 대상은 완화 단계동안 치료되고, 이에 의해 재발이 방지된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 치료("treating", "treat" 또는 "treatment")는 본 명세서에서 기술된 단백질의 투여와, 이로 인하여 명시된 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상이 감소 또는 제거되는 것을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "호중구감소증"은 약한 호중구감소증(1000 ≤ ANC < 1500), 보통의 호중구감소증(500 ≤ ANC < 1000) 및 심각한 호중구감소증(ANC < 500)(혈액 1μL 당 세포에서 측정된 절대적 호중구 수치(ANC))을 포괄하는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상(subject)"은 인간을 포함하는, 예를 들어, 포유류를 포함하는 임의의 동물을 의미하기 위해 사용된다. 예시적인 대상은 인간 및 인간 이외의 영장류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 대상은 인간이다.

항체

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 임의의 예에 따른 단백질은 항체이다.

항체를 생성하는 방법들은 당업계에 잘 공지되어있고/거나 문헌[Harlow and Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)]에 기술된다. 일반적으로, 이러한 방법들에서, 임의의 적합한 또는 바람직한 담체, 어쥬번트, 또는 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 선택적으로 제형화된 G-CSFR(예를 들어, hG-CSFR) 또는 이의 영역(예를 들어, 세포밖 도메인) 또는 면역원성 단편 또는 이의 에피토프 또는 동일한 것(예컨대, 면역원)을 발현시키고, 전시하는 세포는 인간 이외의 동물, 예를 들어, 마우스, 닭, 쥐, 토끼, 기나아 피그, 개, 말, 소, 염소 또는 돼지에게 투여된다. 면역원은 비강안으로, 근육내, 피부-아래, 정맥, 경피, 복막내, 또는 임의의 공지된 경로를 통하여 투여될 수 있다.

다클론성 항체의 생산은 면역주사후 다양한 시점에서 면역화된 동물의 혈액을 채취하여 모니터링할 수 있다. 바람직한 항체 역가에 도달해야 할 경우, 1회 이상의 추가 면역주사가 제공될 수 있다. 적합한 역가에 도달될 때까지 부스팅(boosting) 및 역가측정 과정이 반복된다. 원하는 수준의 면역원성이 획득되면, 면역화된 동물로부터 채혈하고, 혈청을 단리하고, 보관하고/거나 단클론 항체(mab)를 만드는데 동물이 이용된다.

단클론성 항체는 본 개시내용에 의해 고려되는 하나의 예시적인 항체 형태이다. 용어 "단클론성 항체" 또는 "mAb"는 동일한 항원, 예를 들어, 항원내 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 동질성(homogeneous) 항체 집단을 지칭한다. 이 용어는 항체의 원천 또는 이를 만드는 방식에 대해 제한되지 않는다.

mAb의 생산을 위하여, 다수의 공지된 기술중 어느 하나가 이용될 수 있는데, 예컨대, 예를 들어, 미국 특허 제4196265호 또는 상기 문헌[Harlow and Lane (1988)]에서 예시된 과정이 이용될 수 있다.

예를 들어, 적합한 동물은 항체 생산 세포를 자극하는데 충분한 조건하에서 면역원으로 면역화된다. 설치류 예컨대 토끼, 마우스 및 쥐는 예시적인 동물들이다. 인간 항체를 발현시키도록, 예를 들어, 뮤린 항체를 발현시키지 않는, 유전적으로 조작된 마우스를 또한 이용하여, 본 개시내용의 항체를 생성시킬 수 있다(예를 들어, 제WO2002/066630호에서 설명된 것과 같이).

면역화 이후, 항체를 생산하는 능력을 가진 체세포, 구체적으로 B 림프구(B 세포)는 mAb 생성 프로토콜에 이용하기 위하여 선택된다. 이들 세포는 비장, 편도선 또는 림프절의 생검으로부터 얻을 수 있거나, 말초 혈액 시료로부터 수득할 수 있다. 면역화된 동물의 B 세포는 이 면역원으로 면역화된 동물과 동일한 종으로부터 일반적으로 유도된 불사화 골수 세포의 세포와 융합된다.

하이브리드는 조직 배양 배지에서 다시 새로 합성되는 것을 차단시키는 물질을 포함하는 선택성 배지에서 배양함으로써 증폭된다. 예시적인 물질들은 아미노프레린, 메토트렉세이트, 및 아자세린이다.

증폭된 하이브리도마는 항체 특이성 및/또는 역가, 예컨대, 예를 들어, 유동 세포분석법 및/또는 면역조직화학 및/또는 면역분석(예를 들어 방사능면역분석, 효소 면역분석, 세포독성 분석, 플락 분석, 도트 면역분석, 및 이와 유사한 것들)에 의해 기능적 선별을 받는다.

대안으로, ABL-MYC 기술(문헌[NeoClone, Madison WI 53713, USA])은 MAb를 분비하는 세포계를 생산하는데 이용된다(예를 들어, 문헌[Largaespada et al , J. Immunol. Methods . 197: 85-95, 1996]에서 설명된 것과 같이).

항체는 예를 들어, 제US6300064호 및/또는 제US5885793호에서 설명된 것과 같이, 디스플레이 라이브러리, 예를 들어, 파아지 디스플레이 라이브러리의 선별에 의해 생산되거나 단리될 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 단리된 온전한 인간 항체를 보유한다.

본 명세서에서 기술된 것과 같이, hG-CSFR에 결합하는 본 개시내용의 일부 단백질은 cynoG-CSFR과 교차-반응하고/거나 hG-CSFR의 일부 돌연변이 형태 또는 돌연변이된 hG-CSFR의 영역들을 포함하는 폴리펩티드에 결합하고/거나 다른 것들은 돌연변이되지 않고/거나 hG-CSFR 내에 특정 에피토프에 결합한다. 이들 특징은 이의 결합 부위를 포함하는 항체 또는 단백질의 생성에 이용될 수 있다.

예를 들어, 파아지 디스플레이 라이브러리는 이에 결합하는 단백질을 확인하기 위하여, hG-CSFR의 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드로 선별된다. 단백질이 검출가능할 정도로 결합하지 않은 hG-CSFR의 리간드 결합 도메인의 돌연변이 형태(서열번호 1의 위치 287에서의 알라닌 점 돌연변이)를 이용하여 교차-반응성 단백질들을 제거하고, 단백질이 결합하는 hG-CSFR의 리간드 결합 도메인의 돌연변이 형태(예를 들어, 서열번호 1의 위치 168에서의 알라닌 점 돌연변이)를 이용하여 정확하게 교차-반응하는 단백질들을 단리한다. 인간 이외의 포유동물의 면역화를 위한 선별 과정은 전술한 내용에 근거하여 또한 마련될 수 있다.

다른 예에서, 파아지 디스플레이 라이브러리가 선별되거나 cynoG-CSFR의 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드로 동물이 면역화되고 확인된 단백질 및/또는 항체는 hG-CSFR 및/또는 이의 리간드 결합 도메인과 교차-반응성인 것들을 식별하기 위하여 선별된다.

추가 실시예에서, G-CSFR 또는 이의 리간드 결합 도메인(선택적으로 C1.2 또는 C1.2G가 결합하는 돌연변이 형태)은 C1.2 또는 C1.2G와 접촉된다. 그 다음 파아지 디스플레이 라이브러리를 G-CSFR 또는 리간드 결합 도메인과 접촉시키고, 결합에 대해 C1.2 또는 C1.2G와 경쟁할 수 있는 단백질들을 발현시키는 파아지가 선택된다.

또다른 예에서, 키메라 단백질은 hG-CSFR로부터 관심 에피토프가 대응하는 마우스 서열을 대신하여 치환된, 예를 들어, 마우스 G-CSFR을 포함한다. 이 키메라 단백질은 그 다음 마우스(마우스 단백질에 대항하여 면역 반응을 덜 유도할 것 같은)를 면역화시키고/거나 파아지 디스플레이 라이브러리를 선별하는데 이용된다. 그 다음 생성된 항체/단백질은 hG-CSFR에 결합하지만(특히, 관심 에피토프에서), 마우스 G-CSFR에는 결합하지 않는 것들을 식별하기 위하여 선별된다.

본 개시내용의 항체는 합성 항체일 수 있다. 예를 들어, 항체는 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체 또는 탈-면역화된 항체이다.

키메라 항체

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 항체는 키메라 항체이다. 용어 "키메라 항체"는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종(예를 들어, 뮤린, 예컨대 마우스)으로부터 유도된 항체내 대응하는 서열에 동일하거나 상동성이거나 특정 항체 분류 또는 하위분류에 속하고, 한편으로 이 쇄의 나머지 부분은 또다른 종(예를 들어, 영장류, 예컨대 인간)으로부터 유도된 항체내 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이거나 또다른 항체 분류 또는 하위분류에 속하는, 항체를 지칭한다. 전형적으로 키메라 항체는 주로 인간 도메인들을 가진 항체를 생산하기 위하여, 설치류 또는 토끼 가변 영역들과 인간 불변 영역들을 이용한다. 키메라 항체를 생산하는 방법들은 예를 들어, 제US4816567호 및 제US5807715호에서 기술된다.

인간화된 및 인간 항체

본 개시내용의 항체는 인간화된 또는 인간일 수 있다.

용어 "인간화된 항체"는 인간 이외의 종으로부터의 항체에서 유도된 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 보유하고, 나머지 항체 구조는 인간 항체의 구조 및/또는 서열에 기초된 키메라 항체의 하위분류를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 인간화된 항체에서, 항원-결합 부위는 일반적으로 인간 항체의 가변 영역들과 인간 항체의 나머지 영역들에서 적합한 FR에 접합된 인간 이외의 항체로부터의 상보성 결정 영역들(CDR)을 포함한다. 항원 결합 부위들은 야생형(예컨대, 인간 이외의 항체의 것들과 동일한) 또는 하나 이상 아미노산 치환에 의해 변형된다. 일부 경우들에서, 인간 항체의 FR 잔기들은 대응하는 인간 이외의 잔기들에 의해 치환된다.

인간 이외의 항체 또는 이의 부분들(예를 들어, 가변 영역들)을 인간화시키는 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있다. 인간화는 제US5225539호 또는 제US5585089호의 방법들에 따라 실행될 수 있다. 항체를 인간화하는 다른 방법들이 배제되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "인간 항체"는 가변 영역들(예를 들어 V_H, V_L)과, 선택적으로 인간, 예를 들어 인간 생식계통 또는 체세포에서 발견되는 서열들로부터 유도된 또는 이에 대응하는 서열로부터의 불변 영역들을 보유하는 항체를 지칭한다. "인간" 항체는 인간 서열들에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기들, 예를 들어 시험관에서 임의로 도입된 돌연변이 또는 부위 지향된 돌연변이(특히 항체의 소수 잔기들, 예를 들어 항체의 잔기들중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개, 예를 들어 항체의 CDR에서 하나 이상을 구성하는 잔기들중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개에서 보존성 치환 또는 돌연변이에 관련된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 이들 "인간 항체"는 실제로 인간에 의해 만들어질 필요는 없고, 오히려, 이들은 재조합 수단을 이용하여 만들고/거나 인간 항체 불변 및/또는 가변 영역들(예를 들어, 상기에서 기술된 것과 같이)을 코딩하는 핵산을 포함하는 유전자전이 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리될 수 있다. 인간 항체는 파아지 디스플레이 라이브러리(예를 들어, 제US5885793호에서 설명된 것과 같은)를 포함하는 당업계에 잘 공지되어 있는 다양한 기술들을 이용하여 만들어질 수 있다.

선택된 에피토프를 인지하는 인간 항체는 또한 "유도된 선별(guided selection)"로 불리는 기술을 이용하여 또한 만들어질 수 있다. 이러한 방법에서, 선택된 인간 이외의 단클론성 항체, 예를 들어, 마우스 항체를 이용하여 동일한 에피토프를 인지하는 완전한 인간 항체의 선별을 유도할 수 있다(예를 들어, 제US5565332호에서 기술된 것과 같이).

예시적인 인간 항체는 본 명세서에서 기술되며, C1.2 및 C1.2G 및/또는 이의 가변 영역들을 포함한다. 이들 인간 항체는 인간 이외의 항체와 비교하여 인간에서 감소된 면역원성의 장점을 제공한다.

항체 결합 도메인을 내포하는 단백질

단일-도메인 항체

일부 예들에서, 본 개시내용의 단백질은 단일-도메인 항체이거나 이를 포함한다(이는 용어 "도메인 항체" 또는 "dAb"와 호환된다). 단일-도메인 항체는 이 항체의 중쇄 가변 영역 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄이다. 특정 예들에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(문헌[Domantis, Inc., Waltham, MA]; 예를 들어, 제US6248516호 참고).

다이아바디 , 트라이아바디 , 테트라바디

일부 예들에서, 본 개시내용의 단백질은 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디 또는 고차 단백질 복합체이거나, 이를 포함하는 것으로 예컨대 제WO98/044001호 및/또는 제WO94/007921호에서 설명된 것들이다.

예를 들어, 다이아바디는 2개의 연합된 폴리펩티드 쇄를 포함하는 단백질로서, 각 폴리펩티드 쇄는 V_L-X-V_H 또는 V_H-X-V_L 구조를 포함하고, 이때 V_L은 항체 경쇄 가변 영역이며, V_H는 항체 중쇄 가변 영역이며, X는 단일 폴리펩티드 쇄 안에서 V_H와 V_L이 연합되는 것(또는 Fv를 형성)을 허용하는데 불충분한 잔기들을 포함하는 연결기이거나, 없을 수 있고, 이때 1개의 폴리펩티드 쇄의 V_H는 또다른 폴리펩티드 쇄의 V_L에 결합하여, 항원 결합 부위를 형성하고, 예컨대, 하나 이상 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 Fv 분자를 형성한다. V_L 및 V_H는 각 폴리펩티드 쇄에서 동일할 수 있거나 V_L 및 V_H는 이중특이적 다이아바디(예컨대, 상이한 특이성을 보유하는 2개의 Fv를 포함하는)를 형성하기 위하여 각 폴리펩티드 쇄내에서 상이할 수 있다.

단일 쇄 Fv ( scFv )

scFv는 단일 폴리펩티드 쇄 안에 V_L 및 V_H 영역들과 scFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하도록(예컨대, Fv를 형성하기 위하여 서로 연합되도록 단일 폴리펩티드 쇄의 V_L 및 V_H) 만들 수 있는, V_L 및 V_H 사이의 폴리펩티드 연결기를 포함한다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 예를 들어, 이 연결기는 12개를 초과하는 아미노산 잔기를 포함하며, (Gly₄Ser)₃은 scFv를 위한 더 선호되는 연결기들중 하나이다.

본 개시내용은 이황화물 안정화된 Fv(또는 diFv 또는 dsFv)를 또한 고려하는데, 이때 단일 시스테인 잔기는 V_H의 FR과 V_L의 FR로 도입되며, 시스테인 잔기들은 이황화 결합에 의해 연계되어 안정적인 Fv를 만든다.

대안으로 또는 추가적으로, 본 개시내용은 이합체 scFv, 예컨대, 단백질 비-공유 또는 공유적 연결, 예를 들어, 류신 지퍼 도메인(예를 들어, Fos 또는 Jun으로부터 유도된)에 의해 연결된 2개의 ScFv를 포함하는 단백질을 포괄한다. 대안으로, 예를 들어, 제US20060263367호에서 설명된 것과 같이, 2개의 scFv는 양쪽 scFv 모두가 형성되는 것을 허용하고, 항원에 결합되는 충분한 길이의 펩티드 연결기에 의해 연결된다.

중쇄 항체

중쇄 항체는 이들이 중쇄를 포함하고, 경쇄를 포함하지 않는 한, 많은 다른 형태의 항체들과 구조적으로 상이하다. 따라서, 이들 항체는 "오로지 중쇄 항체"로 또한 불린다. 중쇄 항체는 예를 들어, 카멜리드(camelid) 및 연골 어류(IgNAR로도 불림)에서 발견된다.

자연적으로 발생되는 중쇄 항체에 존재하는 가변 영역들은 전형적인 4-쇄 항체에 존재하는 중쇄 가변 영역들("V_H 도메인"이라고 불리는)과 전형적인 4-쇄 항체에 존재하는 경쇄 가변 영역들("V_L 도메인"이라고 불리는)과 구별하기 위하여, 일반적으로 카멜리드 항체에서 "V_HH 도메인" 및 IgNAR에서 V-NAR로 불린다.

카멜리드의 중쇄 항체 및 이의 가변 영역들에 대한 전반적인 설명과, 이들의 생산 및/또는 단리 및/또는 사용 방법들은 그중에서도 특히 다음의 참고 자료 제WO 94/04678호, 제WO 97/49805호 및 제WO 97/49805호에서 찾아볼 수 있다.

연골 어류의 중쇄 항체 및 이의 가변 영역들에 대한 전반적인 설명과, 이들의 생산 및/또는 단리 및/또는 사용 방법들은 그중에서도 특히 다음의 참고 자료 제WO2005/118629호에서 찾아볼 수 있다.

기타 항체 및 항체 단편

본 개시내용은 다음과 같은 다른 항체 및 항체 단편들을 또한 고려한다:

(i) 제US5,731,168호에서 설명된 것과 같은 "키 앤 홀(key and hole)" 이중특이성 단백질;

(ii) 예를 들어, 제US4,676,980호에서 설명된 것과 같은 이종접합성 단백질;

(iii) 예를 들어, 제US4,676,980호에서 설명된 것과 같은, 화학적 가교-연결기를 이용하여 생성된 이종접합성 단백질; 및

(iv) Fab₃(예를 들어, 제EP19930302894호에서 설명된 것과 같은).

탈-면역화된 항체 및 단백질

본 개시내용은 탈-면역화된 항체 또는 단백질을 또한 고려한다. 탈-면역화된 항체 및 단백질들은 제거된(예컨대, 돌연변이된) 하나 이상 에피토프, 예를 들어, B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 보유하고, 이에 의해 포유동물이 항체 또는 단백질에 대항하여 면역 반응을 일으킬 가능성이 감소된다. 탈-면역화된 항체 및 단백질들을 생산하는 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 제WO00/34317호, 제WO2004/108158호 및 제WO2004/064724호에서 설명된다.

적합한 돌연변이를 도입하는 방법들, 및 생성 단백질을 발현 및 분석하는 방법들은 본 명세서에서 기술된 내용을 근거로 당업자들에게 자명할 것이다.

단백질의 돌연변이

본 개시내용은 본 개시내용의 단백질의 돌연변이 형태를 또한 고려한다. 이에 대하여, 본 명세서에서 제시되는 데이터는 만들 수 있는 예시적인 변화에 추가적으로 변화될 수 있는 본 개시내용의 단백질의 CDR내의 부위를 나타낸다. 당업자는 본 개시내용의 문맥에서 기능의 억제 또는 유의적인 감소없이 가변 영역의 FR을 포함하는 단백질내에서 변화가 추가적으로 또는 대안으로 만들어질 수 있음을 인지할 것이다.

예를 들어, 이러한 돌연변이 단백질은 본 명세서에서 제시하는 서열과 비교하여 하나 이상 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 일부 예들에서, 단백질은 30개 이하 또는 20개 이하 또는 10개 이하, 예를 들어, 9개 또는 8개 또는 7개 또는 6개 또는 5개 또는 4개 또는 3개 또는 2개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. "보존적 아미노산 치환"은 한 아미노산 잔기가 유사한 측쇄 및/또는 수치요법(hydropathicity) 및/또는 화학적 친수성(hydrophilicity)을 가진 아미노산 잔기로 치환된 치환이다.

하나의 예에서, 돌연변이 단백질은 자연적으로 발생되는 단백질과 비교하였을 때, 오직 또는 많아야 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개 또는 5개 또는 6개의 보존적 아미노산 변화를 가진다. 보존적 아미노산 변화의 상세한 내용은 하기에서 제공된다. 예를 들어, 본 개시내용으로부터 당업자가 인지할 수 있는 것과 같이, 이러한 사소한 변화는 단백질의 활성을 변경시키지 않을 것이라고 무리없이 예측될 수 있다.

염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β-분기된 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하는, 유사한 측쇄들을 보유하는 아미노산 잔기들의 패밀리는 당분야에서 정의되고 있다.

본 개시내용은 본 개시내용의 단백질, 예를 들어, CDR, 예컨대 CDR3내에 비-보존적 아미노산 변화(예를 들어, 치환)를 또한 고려한다. 예를 들어, 본 발명자들은 본 개시내용의 단백질의 활성이 유지하면서 만들어질 수 있는 몇 가지 비-보존적 아미노산 치환들을 확인하였다. 하나의 예에서, 단백질은 예를 들어, CDR, 예컨대 CDR3에서 6개 또는 5개 또는 4개 또는 3개 또는 2개 또는 1개보다 적은 비-보존적 아미노산 치환을 포함한다.

본 개시내용은 또한 본 명세서에서 제공하는 서열과 비교하여 하나 이상 삽입 또는 결손을 또한 고려한다. 일부 실시예들에서, 단백질은 10개 이하, 예를 들어, 9개 또는 8개 또는 7개 또는 6개 또는 5개 또는 4개 또는 3개 또는 2개의 삽입 및/또는 결손을 포함한다.

불변 영역

본 개시내용은 항체의 불변 영역을 포함하는 본 명세서에서 기술된 단백질 및/또는 항체를 포괄한다. 이는 Fc에 융합된 항체의 항원 결합 단편들을 포함한다.

본 개시내용의 단백질을 생산하는데 유용한 불변 영역들의 서열은 다수의 상이한 출처로부터 획득될 수 있다. 일부 예들에서, 단백질의 불변 영역 또는 이의 일부는 인간 항체로부터 유도된다. 불변 영역 또는 이의 일부는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 항체 분류, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 항체 아이소타입으로부터 유도될 수 있다. 하나의 예에서, 불변 영역은 인간 아이소타입 IgG4 또는 안정화된 IgG4 불변 영역이다.

하나의 예에서, 불변 영역의 Fc 영역은 예를 들어, 본래 또는 야생형 인간 IgG1 또는 IgG3 Fc 영역과 비교하였을 때, 작동체 기능을 유도하는 능력이 감소되었다. 하나의 예에서, 작동체 기능은 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC) 및/또는 항체-의존적 세포-매개된 식균작용(ADCP) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC)이다. Fc 영역을 내포하는 단백질의 작동체 기능 수준을 평가하는 방법들은 당업계에 잘 공지되어 있고/거나 본 명세서에서 기술된다.

하나의 예에서, Fc 영역은 IgG4 Fc 영역(예컨대, IgG4 불변 영역으로부터), 예를 들어, 인간 IgG4 Fc 영역이다. 적합한 IgG4 Fc 영역들의 서열들은 당업자들에게 자명하고/거나 공개적으로 이용가능한 데이터베이스(예를 들어, 미국 국가생물공학센타(National Center for Biotechnology Information)로부터 이용가능)에서 이용할 수 있다.

하나의 예에서, 불변 영역은 안정화된 IgG4 불변 영역이다. 용어 "안정화된 IgG4 불변 영역"은 Fab 암(arm) 교환을 감소시키거나 Fab 암 교환을 당하는 성향을 감소시키거나 절반(half)-항체의 형성 또는 절반 항체를 형성하는 경향이 감소되도록 변형된 IgG4 불변 영역을 의미하는 것으로 이해될 것이다. "Fab 암 교환"이란 인간 IgG4에 대한 단백질 변형 유형을 지칭하는데, 이때 IgG4 중쇄와 부착된 경쇄 (절반-분자)는 또다른 IgG4 분자의 중쇄-경쇄 쌍에 대해 교환되었다. 따라서, IgG4 분자는 두 가지 별개 항원을 인지하는 두 가지 별개 Fab 암(이로 인하여 이중특이적 분자가 생성됨)을 요구할 수 있다. Fab 암 교환은 생체내에서 자연적으로 발생되며, 정제된 혈액 세포 또는 환원 물질, 예컨대 환원된 글루타티온에 의해 시험관에서 유도될 수 있다. IgG4 항체는 해리되어, 각각 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 내포하는 두 분자를 형성할 때, "절반 항체"가 형성된다.

하나의 예에서, 안정화된 IgG4 불변 영역은 카바트의 시스템(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 and/or 1991])에 따라, 힌지 영역의 위치 241에서 프롤린을 포함한다. 이 위치는 EU 넘버링 시스템(문헌[Kabat et al ., Sequences of Proteins Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 and Edelman et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85, 1969])에 따라 힌지 영역의 위치 228에 대응한다. 인간 IgG4에서, 이 잔기는 일반적으로 세린이다. 프롤린을 세린으로 치환시킨 후, IgG4 힌지 영역은 서열 CPPC를 포함한다. 이에 대하여, 당업자는 "힌지 영역"은 Fc 및 Fab 영역들을 연계하여, 항체의 두 Fab 암에 운동성을 부여하는, 항체 중쇄 불변 영역의 프롤린이 풍부한 영역이라는 것을 인지할 것이다. 힌지 영역은 중쇄간 이황화물 결합에 연관된 시스테인 잔기들을 내포한다. 카바트의 넘버링 시스템에 따르면, 인간 IgG1의 Glu226 내지 Pro243까지 뻗어있는 것으로 일반적으로 특정된다. 다른 IgG 아이소타입의 힌지 영역들은 동일한 위치에 중쇄간 이황화 결합(S-S)이 형성되도록 첫 번째와 마지막 시스테인 잔기를 배치함으로써, IgG1 서열과 배열될 수 있다(예를 들어 제WO2010/080538호 참고).

안정화된 IgG4 항체의 추가 예들은 인간 IgG4의 중쇄 불변 영역내 위치 409(EU 넘버링 시스템에 따라)의 아르기닌이 리신, 트레오닌, 메티오닌, 또는 류신으로 치환된 항체이다(예를 들어, 제WO2006/033386호에서 설명된 것과 같은). 불변 영역의 Fc 영역은 위치 405에 대응하는 위치(EU 넘버링 시스템에 따라)에서 알라닌, 발린, 글리신, 이소류신 및 류신으로 구성된 군으로부터 선택된 잔기를 추가적으로 또는 대안으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 힌지 영역은 위치 241(예컨대, CPPC 서열)(상기에서 설명된 것과 같이)에 프롤린을 포함한다.

다른 예에서, Fc 영역은 작동체 기능이 감소되도록 변형된 영역, 예컨대, "비-면역자극성 Fc 영역"이다. 예를 들어, Fc 영역은 268, 309, 330 및 331로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 치환을 포함하는 IgG1 Fc 영역이다. 다른 예에서, Fc 영역은 다음 변화중 하나 이상을 포함하는 IgG1 Fc 영역이다: 변화 E233P, L234V, L235A 및 G236의 결손 및/또는 변화 A327G, A330S 및 P331S의 하나 이상(문헌[Armour et al., Eur J Immunol. 29:2613-2624, 1999; Shields et al., J Biol Chem . 276(9):6591-604, 2001]). 비-면역자극성 Fc 영역들의 추가 예들은 예를 들어, 문헌[Dall'Acqua et al ., J Immunol . 177: 1129-1138 2006; and/or Hezareh J Virol ;75: 12161-12168, 2001]에서 설명된다.

다른 예에서, Fc 영역은 예를 들어, IgG4 항체로부터 하나 이상의 C_H2 도메인과 IgG1 항체로부터 하나 이상의 C_H3 도메인을 포함하는, 키메라 Fc 영역이며, 이때 Fc 영역은 240, 262, 264, 266, 297, 299, 307, 309, 323, 399, 409 및 427(EU 넘버링)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산에서의 치환을 포함한다(예를 들어, 제WO2010/085682호에서 설명된 것과 같음). 예시적인 치환은 240F, 262L, 264T, 266F, 297Q, 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399S, 및 427F를 포함한다.

추가 변형

본 개시내용은 또한 항체에 추가적인 변형을 고려한다.

예를 들어, 항체는 단백질의 반감기를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 항체는 신생 Fc 영역(FcRn)에 대한 Fc 영역의 친화도를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, Fc 영역은 엔도좀에서 Fc/FcRn 결합을 용이하게 하도록 하기 위하여 더 낮은 pH, 예를 들어, 약 pH 6.0에서 FcRn에 대하여 증가된 친화도를 보유한다. 하나의 예에서, Fc 영역은 약 pH 7.4에서 이의 친화도와 비교하여 약 pH 6에서 FcRn에 대한 증가된 친화도를 보유하는데, 이는 세포 재순환 후 혈액으로 Fc의 재-방출을 용이하게 한다. 이러한 아미노산 치환은 혈액으로부터 제거를 감소시킴으로써, 단백질의 반감기를 연장시키는데 유용하다.

예시적인 아미노산 치환은 EU 넘버링 시스템에 따라, T250Q 및/또는 M428L 또는 T252A, T254S 및 T266F 또는 M252Y, S254T 및 T256E 또는 H433K 및 N434F를 포함한다. 추가적인 또는 대안적인 아미노산 치환들은 예를 들어, 제US20070135620호 또는 제US7083784호에서 설명된다.

단백질 생산

하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 임의의 예에 따른 단백질은 단백질을 생산하기 위한 충분한 조건, 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 것과 같이 및/또는 당업계에 잘 공지되어 있는 조건 하에 하이브리도마를 배양함으로써 만들어진다.

재조합 발현

다른 예에서, 본 명세서에서 기술된 임의의 예에 따른 단백질은 재조합 단백질이다.

재조합 단백질의 경우, 이를 코딩하는 핵산은 발현 구조체 또는 벡터 안으로 클로닝될 수 있고, 이들은 그 다음 이러한 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 대장균(Escherichia coli) 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 포유류 세포, 예컨대 유인원 COS 세포, 중국 헴스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포, 또는 골수종 세포로 형질감염된다. 단백질을 발현시키는데 이용되는 예시적인 세포는 CHO 세포, 골수종 세포 또는 HEK 세포다. 이러한 최종 목적물을 획득하기 위한 분자 클로닝 기술들은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Ausubel et al ., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988)](현재까지 업데이트된 모든 것들을 포함) 또는 문헌[Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에서 설명된다. 다양한 클로닝 및 시험관내 증폭 방법들은 재조합 핵산의 구축에 적합하다. 재조합 항체를 생산하는 방법들은 당업계에 또한 공지되어 있다(예를 들어, 제US4816567호 또는 제US5530101호 참고).

단리 이후, 이 핵산은 발현 구조체내 삽입되어 프로모터에 작동가능하도록 연계되거나 추가 클로닝을 위한 발현 벡터(DNA 증폭) 또는 세포내에서 무세포 시스템에서 발현을 위하여 삽입된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 광범위한 문맥에서 이용되는데, TATA 박스 또는 개시 요소들을 포함하는 게놈 유전자의 전사 조절 서열을 포함하는데, 이들은 발생적 및/또는 외부 자극에 반응하여 또는 조직 특이적인 방식으로 핵산의 발현을 변경시키는 추가 조절 요소들(예를 들어, 상류 활성화 서열, 전사 인자 결합 부위, 인핸서 및 사이렌서(silencer))과 함께 또는 추가 조절 요소들 없이 정확한 전사 개시에 요구된다. 본 내용에서, 용어 "프로모터"는 작용가능하도록 연결된 핵산의 발현을 부여, 활성화 또는 강화시키는 재조합, 합성 또는 융합 핵산 또는 유도체를 설명하는데 또한 이용된다. 예시적인 프로모터들은 전술한 핵산의 발현을 더 강화시키고/거나, 공간적 발현을 변형시키거나 일시적 발현을 변경시키기 위하여 하나 이상의 특이적 조절 요소들의 추가 복사체를 내포할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하도록 연결된"이란 핵산의 발현이 프로모터에 의해 조절되도록 핵산에 대해 프로모터를 배치시킨다는 것을 의미한다.

세포내에서 발현을 위한 많은 벡터들이 이용가능하다. 이 벡터 성분들은 일반적으로 다음중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 신호 서열, 단백질을 코딩하는 서열(예를 들어, 본 명세서에서 제공된 정보로부터 유도된), 인헨서 요소, 프로모터, 및 전사 종료 서열. 당업자는 단백질의 발현을 위한 적합한 서열을 인지할 것이다. 예시적인 신호 서열들은 원핵 분비 신호들(예를 들어, pelB, 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정한 엔테로톡신 II), 효모 분비 신호(예를 들어, 전화효소 리더(leader), α 인자 리더, 또는 산 포스파타제 리더) 또는 포유류 분비 신호(예를 들어, 허피스 심플렉스 gD 신호)를 포함한다.

포유류 세포내에서 활성이 있는 예시적인 프로모터는 사이토메갈로바이러스 즉각 초기 프로모터(CMV-IE), 인간 연장 인자 1-α 프로모터(EF1), 소핵 RNA 프로모터(U1a 및 U1b), α-미오신 중쇄 프로모터, 유인원 바이러스 40 프로모터(SV40), 라우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스 프로모터(RSV), 아데노바이러스 주요 후기(Adenovirus major late) 프로모터, β-악틴 프로모터; CMV 인헨서/β-악틴 프로모터를 포함하는 하이브리드 조절 요소 또는 면역글로블린 프로모터 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 포유류 숙주 세포 계통의 유용한 예로는 SV40에 의해 형질변환된 원숭이 신장 CV1(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 계통(293 세포 또는 진탕 배양에서 성장을 위하여 서브클론된 293 세포; 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 또는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)이다.

효모 세포, 예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로미세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae) 및 사카로미세스 폼베(Saccharomyces pombe)를 포함하는 군으로부터 선택된 효모 세포에서 발현에 적합한 전형적인 프로모터들은 ADH1 프로모터, GAL1 프로모터, GAL4 프로모터, CUP1 프로모터, PHO5 프로모터, nmt 프로모터, RPR1 프로모터, 또는 TEF1 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

동일한 것을 포함하는 단리된 핵산 또는 발현 구조체를 발현을 위하여 세포 안으로 도입시키는 수단은 당업계에 숙련자들에게 공지되어 있다. 주어진 세포에 이용되는 기술은 공지의 성공적인 기술에 의존한다. 재조합 DNA를 세포 안으로 도입시키는 수단은 현미주사(microinjection), DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 리포좀 예컨대 리포펙타민(깁코(Gibco), 미국 메릴랜드주) 및/또는 쎌펙틴(깁코, 미국 메릴랜드주)에 의해 매개된 형질감염, PEG-매개된 DNA 취입(uptake), 전기천공 및 DNA-피복된 텅스턴 또는 금 입자(아그라세투스 인코포레이티드(Agracetus Inc.), 미국 위스콘신주)들을 이용하여 미립자 투하(microparticle bombardment)를 포함한다.

단백질을 생산하는데 이용되는 숙주 세포는 이용되는 세포 유형에 따라 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 Ham의 Fl0(시그마(Sigma)), 최소 필수 배지((MEM), (시그마), RPMl-1640 (시그마), 및 둘베코(Dulbecco)의 변형된 이글 배지((DMEM), 시그마)는 포유류 세포를 배양하는데 적합하다. 본 명세서에서 논의되는 다른 세포 유형들을 위한 배지는 당업계에 공지되어 있다.

단백질의 단리

단백질의 단리를 위한 방법들은 당업계에 공지되어 있고/거나 본 명세서에서 기술된다.

단백질이 배양 배지 안으로 분비될 때, 이러한 발현 시스템으로부터 상청액은 우선 시판되는 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 이용하여 농축될 수 있다. 프로테아제 억제제 예컨대 PMSF는 단백질분해를 억제하기 위하여 전술한 단계중 임의의 단계에 포함될 수 있고, 항생제는 부수적인 오염물질의 성장을 방지하기 위하여 포함될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 예를 들어, 연속 원심분리를 이용하여 상청액은 단백질을 발현하는 세포로부터 여과되거나 분리될 수 있다.

이 세포로부터 준비된 단백질은 예를 들어, 이온 교환, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 친화도 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 친화도 크로마토그래피 또는 단백질 G 크로마토그래피), 또는 전술한 것들의 임의의 조합을 이용하여 정제될 수 있다. 이들 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 제WO99/57134호 또는 문헌[Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)]에서 설명된다.

당업자는 정제 또는 검출을 용이하게 하도록 예를 들어, 폴리-히스티딘 태그, 예를 들어, 헥사-히스티딘 태그, 또는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 태그, 또는 유인원 바이러스 5(V5) 태그, 또는 FLAG 태그, 또는 글루타티온 S-트란스퍼라제(GST) 태그와 같은 태그가 포함되도록 단백질은 변형될 수 있다는 것 또한 인지할 것이다. 그 다음 생성된 단백질은 예컨대, 친화도 정제에 공지된 방법을 이용하여 정제된다. 예를 들어, 헥사-his 태그를 포함하는 단백질은 단백질을 포함하는 시료를 고형 또는 반-고형 지지판 상에 고정된 헥사-태그에 특이적으로 결합하는 니켈-니트로트라이아세트산(Ni-NTA)에 접촉시키고, 시료를 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거하고, 후속적으로 결합된 단백질을 용리시켜 정제된다. 대안으로 또는 추가로, 태그에 결합된 리간드 또는 항체는 친화도 정제 방법에 이용된다.

단백질의 활성 분석

G- CSFR 및 이의 돌연변이에 대한 결합

본 개시내용의 일부 단백질들은 hG-CSFR의 리간드 결합 도메인과 hG-CSFR의 리간드 결합 도메인의 특정 돌연변이 형태(예를 들어, 특정 점 돌연변이를 가진 또는 없는 서열번호 1) 및/또는 인간 및 게잡이원숭이 G-CSFR에 모두 결합한다는 사실은 명세서의 개시내용으로부터 당업자에게 자명할 것이다. 단백질에 결합을 평가하는 방법들은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994)]에서 설명되고 있다. 이러한 방법은 일반적으로 단백질을 표지하고, 고정된 항원에 이를 접촉시키는 것과 관련된다. 비-특이적 결합 단백질을 제거하기 위하여 세척한 다음, 표지의 양과 결과적으로 결합된 단백질이 검출된다. 물론, 단백질은 고정되고, 항원 표지될 수 있다. 패닝(Panning)-유형 분석이 또한 이용될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 표면 플라스몬 공명 분석이 이용될 수 있다.

상기에서 설명된 분석을 또한 이용하여 hG-CSFR 또는 이의 리간드 결합 도메인(예를 들어, 서열번호 1) 또는 이의 돌연변이 형태에 단백질의 결합 수준을 검출할 수 있다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 알라닌이 서열번호 1의 위치 167에서의 리신을 대신하여 치환되고/거나 알라닌이 서열번호 1의 위치 168에서의 히스티딘을 대신하여 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 대해 서열번호 1에 결합하는 것과 실질적으로 동일한 수준(예를 들어, 10% 또는 5% 또는 1% 이내)으로 결합한다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 것보다 약 100 배 또는 150 배 또는 160 배 또는 200 배 이상 더 낮은 수준에서, 서열번호 1의 위치 287에서의 아르기닌 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합한다. 하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 것보다 약 160 배 이상 더 낮은 수준에서, 서열번호 1의 위치 287에서의 아르기닌 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합한다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 수준보다 약 20 배 또는 40 배 또는 50 배 또는 60 배 이상 더 낮은 수준으로 서열번호 1의 위치 237에서의 히스티딘 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합한다. 하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 수준보다 약 50 배 이상 더 낮은 수준으로 서열번호 1의 위치 237에서의 히스티딘 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합한다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 수준보다 약 20 배 또는 40 배 또는 60 배 또는 70 배 이상 더 낮은 수준으로 서열번호 1의 위치 198에서의 메티오닌 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합한다. 하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 수준보다 약 40 배 이상 더 낮은 수준으로 서열번호 1의 위치 198에서의 메티오닌 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합한다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 수준보다 약 20 배 또는 30 배 또는 40 배 이상 더 낮은 수준으로 서열번호 1의 위치 172에서의 티로신 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합한다. 하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 수준보다 약 40 배 이상 더 낮은 수준으로 서열번호 1의 위치 172에서의 티로신 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합한다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 수준보다 약 100 배 또는 120 배 또는 130 배 또는 140 배 이상 더 낮은 수준으로 서열번호 1의 위치 171에서의 류신 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합한다. 하나의 예에서, 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 수준보다 약 140 배 이상 더 낮은 수준으로 서열번호 1의 위치 171에서의 류신 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합한다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 수준보다 약 20 배 또는 40 배 또는 60 배 또는 70 배 이상 더 낮은 수준으로 서열번호 1의 위치 111에서의 류신 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합한다. 하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 수준보다 60 배 이상 더 낮은 수준으로 서열번호 1의 위치 111에서의 류신 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합한다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 수준보다 5 배 또는 4 배 또는 3 배 또는 2 배 또는 1 배 더 낮은 수준으로 서열번호 1의 위치 168에서의 류신 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합한다.

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합하는 수준보다 5 배 또는 4 배 또는 3 배 또는 2 배 또는 1 배 더 낮은 수준으로 서열번호 1의 위치 167에서의 리신 대신 알라닌으로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드에 결합한다.

결합 수준은 바이오센스를 이용하여 통상적으로 측정된다.

본 개시내용은 전술한 특징들의 임의의 조합을 고려한다. 하나의 예에서, 본 명세서에서 기술된 단백질은 선행하는 7개 단락에서 제시된 결합 특징 모두를 보유한다.

에피토프 매핑( Mapping )

다른 예에서, 본 명세서에서 기술된 단백질이 결합된 에피토프가 매핑된다. 에피토프 매핑 방법들은 당업계 숙련자들에게 자명할 것이다. 예를 들어, 관심 에피토프를 포함하는 hG-CSFR 서열 또는 이의 영역에 걸쳐있는 일련의 중첩 펩티드들, 예를 들어, 10 내지 15개의 아미노산들을 포함하는 펩티드들이 만들어진다. 그 다음 단백질은 각 펩티드에 접촉되며, 결합된 펩티드가 결정된다. 이로써 단백질이 결합되는 에피토프를 포함하는 펩티드의 측정을 허용된다. 다수의 비-인접성 펩티드들이 단백질에 의해 결합된다면, 단백질은 형태학적 에피토프에 결합할 수 있다.

대안으로 또는 추가로, hG-CSFR내에 아미노산 잔기들이 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이생성에 의해 돌연변이되고, 단백질 결합을 감소 또는 방해하는 돌연변이들이 결정된다. 단백질의 결합을 감소 또는 방해하는 임의의 돌연변이는 단백질이 결합된 에피토프내에 있을 가능성이 있다.

본 명세서에서 추가 방법들이 구체화되는데, 이는 본 개시내용의 고정된 단백질에 hG-CSFR 또는 이의 영역의 결합과, 생성된 복합체를 프로테아제로 절단하는 것이 관련된다. 고정된 단백질에 결합된 채로 유지되는 펩티드가 단리되고, 예를 들어, 질량분석을 이용하여 분석되어, 이들의 서열이 결정된다.

추가 방법은 hG-CSFR 또는 이의 영역내에 수소를 중양성자(deutron)로 전환시키고, 생성된 단백질을 본 개시내용의 고정된 단백질에 결합시키는 것과 관련된다. 중양성자는 그 다음 수소로 역전되며, hG-CSFR 또는 이의 영역은 단리되고, 효소로 절단되고, 예를 들어, 질량 분석을 이용하여 분석되어, 중양성자를 포함하는 이들 영역들이 확인되는데, 이 영역은 본 명세서에서 기술된 단백질의 결합에 의해 수소로의 전환으로부터 보호될 수 있었다.

선택적으로, hG-CSFR 또는 이의 에피토프에 대한 단백질의 해리 상수(Kd)가 측정된다. hG-CSFR 결합 단백질에 대한 "Kd" 또는 "Kd 값"은 하나의 예에서 방사능표지된 또는 형광-표지된 hG-CSFR 결합 분석에 의해 측정된다. 이 분석은 단백질과 표지되지 않은 hG-CSFR의 일련의 적정 존재하에 표지된 G-CSFR의 최소 농도로 균형을 잡는다. 결합되지 않은 hG-CSFR을 제거하기 위하여 세척한 이후, 표지의 양을 측정하고, 이는 단백질의 Kd를 나타낸다.

또다른 실시예에 따르면, Kd 또는 Kd 값은 고정된 hG-CSFR 또는 이의 영역과 함께 표면 플라스몬 공명 분석, 예를 들어, 바이아코어 표면 플라스몬 공명(바이아코어 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스캐터웨이)을 이용하여 측정된다.

일부 실시예들에서, C1.2 또는 C1.2G와 유사한 Kd 또는 더 높은 Kd를 보유하는 단백질이 선택되는데, 그 이유는 이들이 hG-CSFR에 결합하는데 있어서 경쟁할 가능성이 있기 때문이다.

경쟁적 결합의 측정

단클론성 항체 C1.2 또는 C1.2G의 결합을 경쟁적으로 억제하는 단백질을 측정하는 방법들은 당업자들에게 자명할 것이다. 예를 들어, C1.2 또는 C1.2G는 검출가능한 표지, 예를 들어, 형광 표지 또는 방사능활성 표지에 접합된다. 표지된 항체 및 시험 단백질을 그 다음 혼합하고, hG-CSFR 또는 이의 영역(예를 들어, 서열번호 1을 포함하는 폴리펩티드) 또는 이를 발현시키는 세포와 접촉시킨다. 그 다음 표지된 C1.2 또는 C1.2G의 수준을 측정하고, 표지된 항체가 단백질 없이 hG-CSFR, 영역 또는 세포와 접촉되었을 때 측정된 수준과 비교한다. 표지된 C1.2 또는 C1.2G의 수준이 시험 단백질이 없을 때와 비교하여 시험 단백질이 존재할 때 감소된다면, 단백질은 C1.2 또는 C1.2G가 hG-CSFR에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 것으로 간주된다.

선택적으로, 시험 단백질은 C1.2 또는 C1.2G에 대한 상이한 표지에 접합된다. 이 교차(alternate) 표지는 hG-CSFR 또는 이의 영역 또는 세포에 시험 단백질의 결합 수준의 검출을 허용한다.

다른 예에서, 단백질은 hG-CSFR, 영역 또는 세포가 C1.2 또는 C1.2G와 접촉되기 이전, hG-CSFR 또는 이의 영역(예를 들어, 서열번호 1을 포함하는 폴리펩티드) 또는 이를 발현시키는 세포에 결합하는 것이 허용된다. 단백질이 없을 경우와 비교하여 단백질이 존재할 때, 결합된 C1.2 또는 C1.2G 양의 감소는 단백질이 C1.2 또는 C1.2G가 hG-CSFR에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다는 것을 나타낸다. 상호 분석은 표지된 단백질을 이용하여 실행될 수 있는데, 우선 C1.2 또는 C1.2G가 G-CSFR에 결합하는 것을 허용한다. 이 경우, C1.2 또는 C1.2G가 존재할 때, hG-CSFR에 결합된 표지된 단백질의 양은 C1.2 또는 C1.2G가 없는 경우와 비교하여 감소되는데, 이것은 단백질이 C1.2 또는 C1.2G가 hG-CSFR에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다는 것을 나타낸다.

임의의 전술한 분석은 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 것과 같이, hG-CSFR 및/또는 서열번호 1 및/또는 C1.2 또는 C1.2G가 결합하는 hG-CSFR의 리간드 결합 영역의 돌연변이형태로 실행될 수 있다.

상쇄 측정(Determining Neutralization)

본 개시내용의 일부 들에서, 단백질은 hG-CSFR 신호전달을 상쇄시킬 수 있다.

수용체를 통하여 리간드의 신호전달을 상쇄시키는 단백질의 능력을 평가하기 위한 다양한 분석이 당업계에 공지되어 있다.

하나의 예에서, 단백질은 hG-CSFR에 G-CSF의 결합을 감소 또는 방해한다. 이러한 분석은 표지된 G-CSF 및/또는 표지된 단백질을 이용하여 본 명세서에서 기술된 것과 같이, 경쟁 결합 분석으로 실행될 수 있다.

다른 예에서, 단백질은 CD34⁺ 골수 세포가 G-CSF 존재하에서 배양될 때, CFU-G의 형성을 감소시킨다. 이러한 분석에서, CD34⁺ 골수 세포는 시험 단백질 존부하에, G-CSF 존재하에(예를 들어, 약 10ng/mL 세포 배양 배지) 및, 선택적으로 줄기 세포 인자(예를 들어, 약 10ng/mL 세포 배양 배지)가 있는 반-고형 세포 배양 배지에서 배양된다. 과립구 클론(CFU-G)이 형성되도록 충분한 시간 후, 클론 또는 콜로니의 수를 측정한다. 단백질이 없는 경우와 비교하여, 단백질이 존재할 때 콜로니 수의 감소는 단백질이 G-CSF 신호전달을 상쇄시킨다는 것을 나타낸다. 단백질의 다양한 농도를 시험함으로써, IC₅₀, 예컨대, CFU-G 형성의 최대 억제의 50%가 발생되는 농도가 결정된다. 하나의 예에서, IC₅₀은 0.2nM 이하, 예컨대 0.1nM 이하, 예를 들어, 0.09nM 이하, 또는 0.08nM 이하, 또는 0.07nM 이하, 또는 0.06nM 이하 또는 0.05nM 이하이다. 하나의 예에서, IC₅₀은 0.04nM 이하이다. 다른 예에서, IC₅₀은 0.02nM 이하이다. 전술한 IC₅₀은 본 명세서에서 기술된 임의의 CFU-G 분석과 관련된다.

추가 실시예에서, 단백질은 G-CSF 존재하에 배양될 때, hG-CSFR을 발현시키는 세포(예를 들어, BaF3 세포)의 증식을 감소시킨다. 세포는 G-CSF(예를 들어, 0.5ng/mL)와 시험 단백질 존부하에 배양된다. 세포 증식을 평가하는 방법들은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, MTT 감소 및 티미딘 통합을 포함한다. 단백질이 없을 때 관찰되는 수준과 비교하여 증식 수준을 감소시키는 단백질은 G-CSF 신호전달을 상쇄시키는 것으로 간주된다. 단백질의 다양한 농도를 시험함으로써, IC₅₀, 예컨대, 세포 증식의 최대 억제의 50%가 발생되는 농도가 결정된다. 하나의 예에서, IC₅₀은 6nM 이하, 예컨대 5.9nM 이하이다. 다른 예에서, IC₅₀은 2nM 이하 또는 1nM 이하 또는 0.7nM 또는 세포 또는 0.6nM 이하 또는 0.5nM 이하이다. 전술한 IC₅₀은 본 명세서에서 기술된 임의의 세포 증식 분석과 관련된다.

추가 예에서, 단백질은 G-CSF 투여후, 생체내에서 조혈성 줄기 세포 및/또는 내피 선조 세포의 동원을 감소시키고/거나 예를 들어, G-CSF 투여후 생체내에서 호중구의 수를 감소시킨다(그러나 이것이 본질은 아니다). 예를 들어, 단백질은 선택적으로 G-CSF 또는 이의 변형된 형태(예를 들어, 페길화된 G-CSF 또는 필그라스팀)의 투여 이전, 투여시 또는 투여 이후에 대상에게 투여된다. 조혈성 줄기 세포(예를 들어, CD34 및/또는 Thy1을 발현시킴) 및/또는 내피 선조 세포(예를 들어, CD34 및 VEGFR2를 발현시킴) 및/또는 호중구(형태학적으로 확인되고/거나 예를 들어, CD10, CD14, CD31 및/또는 CD88을 발현시킴)의 수가 평가된다. 단백질이 없을 때 관찰되는 수준과 비교하여 이 세포들의 수준을 감소시키는 단백질은 G-CSF 신호전달을 상쇄시키는 것으로 간주된다. 하나의 예에서, 단백질은 호중구감소증을 유발하지 않고, 호중구의 수를 감소시킨다.

G-CSF 신호전달의 상쇄를 평가하는 다른 방법들이 본 개시내용에 의해 고려된다.

작동체 기능의 측정

본 명세서에서 논의된 것과 같이, 본 개시내용의 일부 단백질은 작동체 기능을 감소시킨다. ADCC 활성을 평가하는 방법들은 당업계에 공지되어 있다.

하나의 예에서, ADCC 활성의 수준은 ⁵¹Cr 방출 분석, 유로피움(europium) 방출 분석 또는 ³⁵S 방출 분석을 이용하여 평가된다. 이들 각 분석에서, G-CSFR을 발현시키는 세포들은 이 세포들에 의해 하나 이상의 언급된 화합물들이 흡수될 수 있는 충분한 시간과 조건하에서 이들 화합물과 함께 배양된다. ³⁵S 방출 분석의 경우, hG-CSFR을 발현시키는 세포는 표지된 아미노산이 새로 합성된 단백질들에게 통합되는데 충분한 시간 동안 ³⁵S-표지된 메티오닌 및/또는 시스테인과 함께 배양될 수 있다. 그 다음 단백질의 존부하에, 및 면역 작동체 세포, 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및/또는 NK 세포 존재하에 세포들이 배양된다. 세포 배양 배지 안에 ⁵¹Cr, 유로피움 및/또는 ³⁵S의 양이 검출되고, 단백질이 없을 때와 비교하여 존재하는 단백질의 양에 변화가 거의 없거나 변화가 없다는 것은(또는 인간 IgG1 Fc를 포함하는 항-hG-CSFR 항체의 존재하에서 관찰된 수준과 비교하여 이 화합물의 감소된 수준) 단백질이 작동체 기능을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 단백질에 의해 유도된 ADCC 수준을 평가하는 분석을 공개하는 예시적인 공개물은 문헌[Hellstrom, et al . Proc . Natl Acad . Sci . USA 83:7059-7063, 1986 and Bruggemann, et al ., J. Exp . Med . 166:1351-1361, 1987]을 포함한다.

단백질에 의해 유도된 ADCC 수준을 평가하는 다른 분석들은 유동 세포분석법을 위한 ACTI(상표) 비방사능활성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주) 또는 CytoTox 96(등록상표) 비-방사능활성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주)을 포함한다.

C1q 결합 분석을 또한 실행하여, 단백질이 C1q에 결합할 수 있는지, 및 CDC를 유도할 수 있는 지를 확인할 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석이 실행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al , J. Immunol . Methods 202: 163, 1996] 참고).

반감기 측정

본 개시내용에 포괄되는 일부 단백질들은 개선된 반감기를 보유하는데, 예를 들어, 단백질들은 변형안된 단백질과 비교하여 이들의 반감기가 연장되도록 변형된다. 개선된 반감기를 가지는 단백질을 측정하는 방법들은 당업계에 자명할 것이다. 예를 들어, 신생 Fc 수용체(FcRn)에 결합하는 단백질의 능력이 평가된다. 이에 대하여, FcRn에 대한 증가된 결합 친화도는 이 분자의 혈청 반감기를 증가시켰다(예를 들어, 문헌[Kim et al ., Eur J Immunol ., 24:2429, 1994] 참고).

본 개시내용의 단백질의 반감기는 예를 들어, 문헌[Kim et al , Eur J of Immunol 24:542, 1994]에서 설명된 방법에 따른, 약동학적 연구에 의해 또한 측정될 수 있다. 이 방법에 따르면, 방사능표지된 단백질을 마우스에게 정맥으로 주사하고, 이의 혈장 농도는 시간에 대한 함수, 주사후 3분 내지 72시간 동안 주기적으로 측정된다. 따라서, 제거 곡선(clearance curve)은 알파 상과 베타 상의 이중상(biphasic)이어야 한다. 단백질의 생체내 반감기 측정을 위하여, 베타-상에서 제거속도가 산출되며, 이는 야생형 또는 변형안된 단백질의 것과 비교된다.

치료 효과의 평가

치료 효과의 평가를 위한 분석은 단백질에 의한 상쇄를 측정하는 것과 관련하에 상기에서 설명된다.

다른 예에서, 질병을 치료하는 단백질의 효과는 생체내 분석을 이용하여 평가된다.

예를 들어, 단백질은 관절염의 동물 모델에서 시험된다. 예시적인 모델은 마우스 SKG 계통(문헌[Sakaguchi et al., Nature, 426: 454-460]), 쥐 유형 II 콜라겐 관절염 모델, 마우스 유형 II 콜라겐 관절염 모델 또는 몇 가지 종에서 항원 유도된 관절염 모델들(문헌[Bendele J Musculoskel Neuron Interact; 1(4):377-385, 2001])을 포함한다. 이들 분석에서, 관절염이 유도되고, 관절염의 하나 이상 증상들, 예를 들어, 관절 염증 및/또는 활액내 염증 표식들을 감소시키는 단백질의 능력이 평가된다. 관절염의 증상을 감소시키는 단백질은 이 질병 또는 G-CSF-매개된 질병(예를 들어, G-CSF-매개된 염증성 질환)을 치료하는데 유용한 것으로 간주된다.

단백질은 인간 이외의 포유동물(예를 들어, 설치류, 예컨대, 마우스)이 담배 연기에 노출된, COPD 모델에서 추가적으로 또는 대안으로 시험될 수 있다. 노출 이후, 이 포유동물에게 단백질이 투여되고, 표준 기술을 이용하여 폐 염증 수준 및/또는 폐에서 호중구의 수가 평가 또는 예측된다. 폐 염증 수준 및/또는 폐에서 호중구의 수를 감소시키는 단백질은 폐 염증 또는 COPD 또는 G-CSF-매개된 질병(예를 들어, G-CSF-매개된 염증성 질환, 예컨대 G-CSF-매개된 염증성 폐 질환)을 치료하는데 유용한 것으로 간주된다.

본 명세서에서 기술된 단백질들은 염증성 신경 질환의 생체내 모델에서 또한 시험될 수 있다. 예시적인 모델은 마우스 또는 쥐를 미엘린 초(sheath) 단백질 또는 이로부터 유도된 펩티드(예를 들어, MOG, MBP 또는 PLP)로 면역화시키고, 단백질에 대하여 면역 반응이 생성되어, MS 모델이 유도되는, EAE 모델을 포함한다. 대안으로, 미엘린 초 단백질에 대해 면역 반응성인 T 세포를 마우스 또는 쥐에 도입시켜 EAE가 유도된다. 예시적인 EAE 모델들은 예를 들어 문헌[Tsunoda and Fujinami, J Neuropathol Exp Neurol .55:673-686, 1996]에서 재검토된다.

MS의 다른 모델들은 미엘린 단백질, 예를 들어, MOG, MBP 또는 PLP에 특이적인 T 세포 수용체들을 발현시키는 유전자전이 동물들을 포함한다. 예시적인 모델들은 예를 들어, 문헌[Bettelli et al., JEM 197:1073-1081, 2003; Illes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 11749-11754, 2004; 또는 Rossi et al., J. Biomolecular Screening, 12: 481-489, 2007]에서 설명되거나; 또는 예를 들어, 잭슨 래보러토리스 유에스에이(Jackson Laboratories USA)(예를 들어 MOG와 반응성인 유전자전이 T 세포 수용체들을 보유하는 마우스 2D2)에서 상업적으로 이용가능하다.

추가 실시예에서, 본 명세서에서 기술된 임의의 예에 따른 단백질은 포도막염 모델에서 시험된다. 포도막염 모델은 인간 이외의 포유동물을 단백질, 예컨대 망막 어레스틴(arrestin), 리커베린(recoverin) 또는 로돕신(rhodopsin)으로 면역화시키거나 눈에 세균 내독소(endotoxin)를 투여하여 유도된 것들을 포함한다. 포도막염의 예시적인 모델들은 예를 들어, 문헌[Caspi, Drug Discovery Today, 3: 3-9, 2006]에서 설명된다.

본 개시내용의 단백질은 신생혈관생성의 모델들, 예를 들어, 이리스 파마 인코포레이티드(Iris Pharma Inc)의 눈의 신생혈관생성 모델, 또는 알긴산염 내포된 종양 세포 모델에서 또한 시험될 수 있고/거나 대상에서 암 세포가 전이되는 능력을 평가함으로써 시험될 수 있다.

치료될 질병

본 개시내용은 대상에서 G-CSF로 인한 또는 이에 의해 악화되는 임의의 질병을 치료 또는 예방하는 것을 고려한다. 하나의 예에서, 이 질병은 자가면역 또는 염증성 병이다.

하나의 예에서, 염증성 또는 자가면역 질환은 염증성 관절 질환, 예컨대, 염증성 관절염, 류마티즘성 관절염 또는 특발성 관절염, 예를 들어, 청소년 특발성 관절염이다. 하나의 예에서, 이 질병은 류마티즘성 관절염이다.

하나의 예에서, 염증성 또는 자가면역 질환은 염증성 눈 질병이다. 예를 들어, 이 질병은 포도막염이다.

하나의 예에서, 염증성 또는 자가면역 질환은 염증성 폐 질병, 예컨대, 호중구 침윤과 연합된 폐 질환, 예를 들어, COPD이다. 하나의 예에서, 이 질병은 COPD이다.

하나의 예에서, 염증성 또는 자가면역 질환은 염증성 신경 질환, 예컨대, 데빅(Devic) 질환, 뇌 또는 다발성 경화증에서 바이러스 침입이다. 하나의 예에서, 이 질병은 만성 진행성 다발성 경화증 또는 재발-완화반복성 다발성 경화증을 포함하는, 다발성 경화증이다.

다른 예에서, 이 질병은 암(이의 신생혈관생성 포함) 또는 이의 전이다.

하나의 예에서, 이 대상은 이 질병을 치료하기 위하여 이용된 다른 화합물에 저항성이 있던가, 적절하게 반응하지 않거나, 적합하지 않다. 예를 들어, 자가면역 또는 염증성 질환을 앓고 있는 대상은 코르티코스테로이드 및/또는 면역억제제 및/또는 사이클로포스파미드 및/또는 메토트렉세이트 및/또는 항-TNF 항체 또는 가용성 TNF 수용체 및/또는 항-CD20 항체 및/또는 항-IL6 항체 및/또는 항-CD22 항체에 저항성이 있던가, 적절하게 반응하지 않거나, 적합하지 않다.

조성물

일부 예들에서, 본 명세서에서 기술된 것과 같은 단백질은 경구, 비경구, 흡입 스프레이, 흡착, 흡수, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 볼로, 질내로, 심실내, 통상적으로 비-독성인 약학적으로-허용되는 담체를 포함하는 투약 제형내 이식된 저장기를 경유하여, 또는 임의의 기타 통상적인 투약형에 의해 투여될 수 있다. 용어 "비경구"는 본 명세서에서 사용된 바와 같이 피하, 정맥내, 근육내, 복막내, 수막강내, 심실내, 흉골내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

단백질을 대상에게 투여용으로 적합한 형태(예를 들어 약학 조성물)로 제조하는 방법들은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990)] 및 문헌[U.S. Pharmacopeia: National Formulary (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1984]에서 설명된 방법들이 포함된다.

본 개시내용의 약학 조성물들은 비경구 투여, 예컨대 정맥 투여 또는 신체 강(cavity) 또는 장기 또는 관절의 관강으로의 투여에 특히 유용하다. 투여용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 수성 담체에 용해된 단백질 용액을 일반적으로 포함할 것이다. 다양한 수성 담체는 예를 들어, 완충된 염수 및 이와 유사한 것들을 이용할 수 있다. 조성물은 대략적인 생리적 상태에 요구되는 약학적으로 허용되는 보조 물질들, 예컨대 pH 조정 및 완충 물질들, 독성 조정 물질들 및 이와 유사한 것들, 예를 들어, 아세테이트 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 젖산 나트륨, 및 이와 유사한 것들을 포함할 수 있다. 이 제형들내 본 개시내용의 단백질들의 농도는 다변할 수 있고, 액체 용적, 점도, 체중 및 선택된 특정 투여 방식 및 환자들의 요구에 따라 이와 유사한 것들에 근거하여 주로 선택될 것이다. 예시적인 담체들은 물, 염수, 링거 용액, 덱스트로즈 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함한다. 비수성 비이클, 예컨대 혼합 오일 및 에틸 올레이트 또한 이용될 수 있다. 리포좀 또한 담체로 이용될 수 있다. 비이클은 등장성 및 화학적 안정성을 강화시키는 소량의 첨가제, 예를 들어, 완충액 및 보존제를 포함할 수 있다.

제형화할 때, 본 개시내용의 단백질은 투약 제형과 필적되는 방식으로, 그리고 치료요법적으로/예방적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제형들은 다양한 투약 형태들, 예컨대 상기에서 설명된 주사가능한 용액들로 용이하게 투여되지만, 다른 약학적으로 허용되는 형태 또한 고려되는데, 예를 들어, 테블릿, 알약, 캡슐 또는 경구 투여용 기타 고형물, 좌약, 질약, 비강 용액 또는 스프레이, 에어로졸, 흡입기, 리포좀 형태 및 이와 유사한 것들이 고려된다. 약학적으로 "서방출" 캡슐 또는 조성물이 또한 이용될 수 있다. 서방출 제형은 일반적으로 연장된 기간에 걸쳐 일정한 약물 수준을 제공하기 위하여 기획되며, 본 개시 내용의 화합물을 운반하는데 이용될 수 있다.

제WO2002/080967호는 예를 들어 천식 치료를 위한 항체를 포함하는, 본 개시내용의 단백질의 투여에 또한 적합한, 에어로졸화된 조성물을 투여하는 방법들 및 조성물을 공개한다.

병용 요법

하나의 예에서, 본 개시내용의 단백질은 본 명세서에서 기술된 질환 또는 질병을 치료하는데 유용한 다른 화합물과 복합된 또는 추가 치료 단계들, 또는 치료 제형의 추가 성분으로 복합되어, 투여된다.

예를 들어, 다른 화합물은 항-염증성 화합물이다. 대안으로 또는 추가적으로, 다른 화합물은 면역억제제다. 대안으로 또는 추가적으로, 다른 화합물은 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손 및/또는 프레드니솔론(prednisolone)이다. 대안으로 또는 추가적으로, 다른 화합물은 메토트렉세이트다. 대안으로 또는 추가적으로, 다른 화합물은 사이클로포스파미드다. 대안으로 또는 추가적으로, 다른 화합물은 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)이다. 대안으로 또는 추가적으로, 다른 화합물은 항-CD20 항체(예를 들어, 리투시마브 또는 오파투무마브)이다. 대안으로 또는 추가적으로, 다른 화합물은 항-CD22 항체(예를 들어, 에프라투주마브(epratuzumab))이다. 대안으로 또는 추가적으로, 다른 화합물은 항-TNF 항체(예를 들어, 인플리시마브(infliximab) 또는 아달리무마브(adalimumab) 또는 고리무마브(golimumab)) 또는 가용성 TNF 수용체(예를 들어, 에타네르셉트(etanercept))이다. 대안으로 또는 추가적으로, 다른 화합물은 CTLA-4 길항제(예를 들어, 아바타셉트(abatacept), CTLA4-Ig)이다. 대안으로 또는 추가적으로, 다른 화합물은 항-IL-6 항체이다. 대안으로 또는 추가적으로, 다른 화합물은 BLys 길항제, 예컨대 항-BLys 항체(예를 들어, 벨리무마브(belimumab))이다.

다른 예에서, 다른 화합물은 화학요법 약물 또는 암 치료에 이용된 다른 약물이다.

다른 예에서, 본 명세서에서 기술된 단백질은 암 치료용 방사능 요법 이전 또는 이후에 투여된다.

투약 및 투여 시기

본 개시내용의 단백질의 적합한 투약량(dosage)은 특정 단백질, 치료될 질병 및/또는 치료되는 대상에 따라 달라질 것이다. 준-최적 투약으로 시작하여, 최적 또는 유용한 투약량을 결정하기 위하여 투약량을 증량 변형시킴으로써 당업자는 적합한 투약량을 결정하는 능력 범위내에 있다. 대안으로, 치료/예약을 위한 적절한 투약량을 결정하기 위하여, 세포 배양 분석 또는 동물 연구의 테이타를 이용하는데, 이때 적합한 용량(dose)은 독성이 없는 또는 거의 없는 활성 화합물의 ED₅₀을 포함하는 순환계 농도 범위내에 있다. 투약량은 이용되는 투약 형태와 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위내에서 변화될 수 있다. 치료요법적으로/예방적으로 효과적인 용량은 세포 배양 분석으로부터 최초 예측된다. 용량은 세포 배양에서 결정된 것과 같이, IC₅₀(예컨대,증상들의 최대-절반 억제를 획득하기 위한 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 얻기 위하여 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 이러한 정보를 이용하여 인간에서 유용한 용량을 좀더 정확하게 결정할 수 있다. 혈장내 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

일부 실시예들에서, 본 개시내용의 방법은 예방적으로 또는 치료요법적으로 효과적인 양의 본 명세서에서 기술된 단백질을 투여함을 포함한다.

용어 "치료요법적으로 효과적인 양"은 치료를 요하는 대상에게 투여되었을 때, 대상의 예후를 개선시키고/거나 대상의 질병을 개선시키고/거나 본 명세서에서 기술된 임상적 질병의 하나 이상 증상들을 이 질병의 임상적 진단 또는 임상적 특징으로 관찰되고 수용되는 수준 이하의 수준으로 감소 또는 억제하는 양이다. 대상에게 투여되는 양은 치료될 질병의 특성, 치료될 질병의 유형 및 상태, 투여 방식, 및 대상의 특징, 예컨대, 전반적인 건강, 기타 질환, 나이, 성별, 유전자형 및 체중에 따라 달라질 것이다. 당업자는 이들 인자 및 다른 인자들에 따라 적절한 투약량을 결정할 수 있다. 따라서, 이 용어는 본 개시내용을 특정 양, 예를 들어, 단백질의 중량 또는 양을 제한하는 것으로 간주되어서는 안되며, 오히려 본 개시내용은 대상에서 언급된 결과를 획득하는데 충분한 단백질의 임의의 양을 포괄한다. 하나의 예에서, 단백질의 치료요법적으로 효과적인 양은 호중구감소증을 유도하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 이 용어 "예방적으로 효과적인 양"은 임상적 질병의 하나 이상 검출가능한 증상들을 방지 또는 억제 또는 지연하기 위하여 단백질의 충분한 양을 의미한다. 당업자는 이러한 양이 예를 들어, 투여되는 특정 단백질 및/또는 특정 대상 및/또는 질병의 유형 또는 질병의 중증도 또는 질병의 수준 상태 및/또는 경향(유전적 또는 기타)에 따라 달라진다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 이 용어는 본 개시내용을 특정 양, 예를 들어, 단백질의 중량 또는 양을 제한하는 것으로 간주되어서는 안되며, 오히려 본 개시내용은 대상에서 언급된 결과를 획득하는데 충분한 단백질의 임의의 양을 포괄한다. 하나의 예에서, 단백질의 예방적으로 효과적인 양은 호중구감소증을 유발하지 않는다.

본 명세서에서 기술된 단백질들의 생체내 투여를 위하여, 정상적인 투약량은 개인의 체중 또는 일일에 기초하여 약 10ng/kg으로부터 최대 약 100mg/kg 또는 그 이상까지 다양할 수 있다. 예시적인 투약량 및 이의 범위는 본 명세서에서 기술된다. 수일 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 반복 투여를 위하여, 치료될 질환 또는 장애의 중증도에 따라, 치료는 원하는 증상들의 억제가 획득될 때까지 지속될 수 있다.

일부 실시예들에서, 단백질은 약 1mg/kg 내지 약 30mg/kg의 초기 용량(또는 로딩), 예컨대 약 1mg/kg 내지 약 10mg/kg, 또는 약 1mg/kg 또는 약 2mg/kg 또는 5mg/kg으로 투여된다. 단백질은 약 0.01mg/kg 내지 약 2mg/kg의 더 낮은 유지 용량, 예컨대 약 0.05mg/kg 내지 약 1mg/kg, 예를 들어, 약 0.1mg/kg 내지 약 1mg/kg, 예컨대 약 0.1mg/kg 또는 0.5mg/kg 또는 1mg/kg으로 투여될 수 있다. 유지 용량은 7 내지 30일 마다, 예컨대, 10 내지 15일 마다, 예를 들어, 10일 또는 11일 또는 12일 또는 13일 또는 14일 또는 15일 마다 투여될 수 있다.

일부 예들에서, 단백질은 약 0.01mg/kg 내지 약 50mg/kg, 예컨대 약 0.05mg/kg 내지 30mg/kg, 예를 들어, 약 0.1mg/kg 내지 20mg/kg, 예를 들어, 약 0.1mg/kg 내지 10mg/kg, 예컨대 약 0.1mg/kg 내지 2mg/kg의 용량으로 투여된다. 예를 들어, 단백질은 약 0.01mg/kg 내지 5mg/kg, 예컨대 약 0.1mg/kg 내지 2mg/kg, 예컨대 약 0.2mg/kg 또는 0.3mg/kg 또는 0.5mg/kg 또는 1mg/kg 또는 1.5mg/kg(예를 들어, 더 높은 로딩 용량 또는 더 낮은 유지 용량 없이)의 용량으로 투여된다. 일부 예들에서, 다수의 용량이 투여되는데, 예를 들어, 7 내지 30일 마다, 예컨대, 10 내지 22일 마다, 예를 들어, 10 내지 15일 마다, 예를 들어, 10일 또는 11일 또는 12일 또는 13일 또는 14일 또는 15일 또는 16일 또는 17일 또는 18일 또는 19일 또는 20일 또는 21일 또는 22일 마다 투여될 수 있다. 예를 들어, 단백질은 7일 또는 14일 또는 21일 마다 투여된다.

일부 실시예들에서, 요법을 개시할 시점에, 포유동물에게 7일 연속 또는 6일 연속 또는 5일 연속 또는 4일 연속 단백질이 투여된다.

치료에 적절하게 반응하지 않는 포유동물의 경우에 일주일내에 다중 용량이 투여될 수 있다. 대안으로 또는 추가로, 증가된 용량이 투여될 수 있다.

다른 예에서, 부작용을 경험하는 포유동물들의 경우에, 초기(또는 로딩) 용량은 1주내에 여러 차례로 또는 몇일 연속하여 나누어질 수 있다.

본 개시내용의 방법에 따른 단백질의 투여는 예를 들어, 수용자의 생리적 상태, 투여 목적이 치료인지 또는 예방인지, 그리고 당업자에게 공지된 기타 요인들에 따라 연속적으로 또는 간헐적으로 이루어질 수 있다. 단백질의 투여는 사전 선택된 시간에 걸쳐 기본적으로 연속적이거나 이 질병이 발생되는 동안 또는 발생 이후 일련의 별도의 용량으로 존재할 수 있다.

비-제한적 실시예

방법

G-CSFR의 Ig 및 CRH 도메인들은 리간드 결합과 수용체 이합체화에 관련된다(문헌[Layton et al ., J. Biol Chem , 272: 29735-29741, 1997 and Fukunaga et al , EMBO J. 10: 2855-2865 1991]). 수용체의 이들 부분들을 포함하는 G-CSFR의 가용성 형태(C-말단 폴리히스티딘 태그 또는 Fc 서열과 함께)는 수용체의 다양한 연구, 및 가용성 수용체 폴리펩티드의 발현 및 단리에서 리간드 결합에 영향 없이, 수용체의 위치 78, 163 및 228에서 자유 시스테인의 돌연변이에 이용되었다(문헌[Mine et al., Biochem ., 43: 2458-2464, 2004]). 본 연구에서, 돌연변이 C78A, C163S 및 C228S와 함께, hG-CSFR의 아미노산 25 내지 335를 포함하는 수용체의 가용성 형태가 일반적으로 이용되며(예를 들어 서열번호 1), 시스테인 돌연변이와 함께 cynoG-CSFR의 대응하는 분절은 게잡이원숭이 수용체의 연구에 일반적으로 이용되었다. 서열번호 1의 가용성 수용체의 다양한 점 돌연변이 또한 이용되었다. hG-CSFR-Fc에 대한 언급은 C-말단 폴리히스티딘 태그가 Fc 서열로 치환된 서열번호 1의 폴리펩티드를 의미한다. cynoG-CSFR-Fc는 Fc 서열이 C-말단에 부착된, cynoG-CSFR의 대응하는 분절을 의미한다. 일부 경우에서, 야생형 수용체의 대응하는 세포밖 도메인들이 이용되었고, 이들 경우, 특별히 기록되었다. 항체 및 이의 항원 결합 부위(예를 들어, Fab)를 포함하는 단백질은 야생형 hG-CSF 폴리펩티드와 매우 유사한 친화도로 돌연변이된 이들 단백질에 결합한다는 것을 발명자들이 보여주었다. 따라서, 이 돌연변이 단백질들을 이용하는 연구는 야생형 hG-CSFR을 이용하는 연구 모델이다.

파아지 디스플레이 라이브러리로부터 Fab 의 식별

파아지 디스플레이 라이브러리는 G-CSF 리간드의 첨가시 용리된 hG-CSFR에 대해 결합하는 클론에 대해 선별되었다. hG-CSFR에 결합하고, G-CSF 결합과 경쟁하고, 게잡이원숭이 G-CSFR 교체-반응성에 대한 이들의 능력에 대해 Fab를 평가하였고, 일부 클론은 IgG4 항체로 재설정되었다. 효능은 hG-CSFR로 안정적으로 형질감염된 BaF3 세포 계통에서 G-CSF 매개된 증식의 상쇄를 통하여 시험되었고(하기에서 기술됨) G-CSF 존재하에 CFU-G 형성을 억제하는 것에 대해 시험되었다.

IgG 발현을 위한 포유류 발현 벡터 구축

포유류 발현 벡터는 선택된 파아지-유도된 Fab 구조체로부터 전체 경쇄(가변 및 불변 도메인들)와 중쇄의 가변 영역을 클로닝함으로써 표준 분자생물학 기술을 이용하여 구축되었다.

세포 배양 및 일시적 형질감염

무-혈청 현탁액 적응된 293-T 세포는 젠초이스 인코포레이티드(Genechoice Inc.)로부터 구하였다. 세포는 페니실린/스트렙토마이신/곰팡이존 시약(인비트로겐(Invitrogen))이 보충된 FreeStyle(상표) 발현 배지(인비트로겐)에서 배양되었다. 형질감염 전, 이 세포들은 8% CO₂의 대기에서 가습화된 배양기내에서 37℃에서 유지되었다.

293-T 세포를 이용한 포유류 발현 벡터의 일시적 형질감염은 제조업자의 지시에 따라 293펙틴(fectin) 형질감염 시약(인비트로겐)을 이용하여 실행되었다. 세포 배양 상청액은 2500 rpm에서 원심분리에 의해 배양 5일 후에 수거하였고, IgG 정제를 위한 표준 방법을 이용하여 정제에 앞서 0.45μM 필터(날젠(Nalgene))를 통과시켰다.

대조군 항체

뮤린 단클론성 항체 711, 744 및 774(문헌[Layton et al., Growth Factors , 14: 117-130, 1997])가 대조군 마우스 항체로 이용되었다.

Fab 의 친화도 측정

G-CSFR 또는 G-CSFR-Fc에 대한 Fab의 친화도를 측정하기 위하여, Fab는 대장균에서 발현되었고, 바이아코어 2000을 이용하여 친화도가 측정되었다.

mAb에 대한 결합 동역학 측정

항-인간(염소 항-인간 IgG(감마) 마우스, 흡착된, 인비트로겐, 카탈로그 번호 H10500) 또는 항 마우스 Fc 특이적 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩스 인코포레이티드(Jackson Immuno Research Labs inc.) 카탈로그 번호 515-005-071)는 아민 커플링 화학반응을 이용하여 CM-5 센서 표면에 화학적으로 고정되었다.

고정된 항체를 이용하여 용액으로부터 항 hG-CSFR mAb를 포획하였다. 가용성 hG-CSFR 단백질들(이 방법 단락에서 설명된 것과 같은)은 다양한 농도에서 포획된 mAb에 걸쳐 주입되었다. mAb는 0.3μg/mL에서 180초 동안 포획되었다. 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 및 40nM(중복으로)에서 가용성 hG-CSFR을 10분간 주사하였고, 30분간 해리가 모니터링되었다. 참조 플로우 세포(reference flow cell)로부터의 반응(mAb는 포집되지 않았지만, 다른 방법으로 동일하게 처리되었다)이 공제되었다. 블랭크 주사로부터 반응은 결과로 발생된 센소그람(sensorgram)으로부터 공제되었다.

최종 정정된 반응은 대량 수송 한계(mass transport limitation)에 대한 조건을 포함하여 1:1 역학을 설명하는 모델에 대해 비-선형 회귀를 이용하여 피팅하였다. 포획된 mAb 수준에서 약간의 편차를 설명하기 위하여, Rmax 값을 국소적으로 피팅하였다. 평형 해리 상수(KD)가 측정되었다.

Fab C1.2, 5D11, 711 및 744의 역학 분석

Fab 단편들은 파파인 절단에 의해 생성되었는데, 3mg의 항체는 파파인 절단 키트(시그마, 미국)를 이용하여, 지시한 바와 같이, 40분간 사전-활성화된 파파인(1:500)으로 절단되었다. 결과로 발생된 Fab는 흡착에 의해, 단백질 A 정제(mAbSelect, GE, 스웨덴)를 이용하여 잔류 Fc와 절단되지 않은 항체로부터 정제되었다.

Fab의 이중 바이오센스 분석은 30μL/분의 유속에서, Fab 항체의 배증 희석액(doubling dilution)(0.1mg/mL BSA내 100nM 내지 0.39nM)으로 바이아코어 2000 (GE, 스웨덴)을 이용하여 실행되었다. 결합(100μL)은 대조군 고정된 블랭크, 고정된 cynoG-CSFR-Fc, 고정된 인간 G-CSFR-Fc 및 고정된 인간 G-CSFR을 포함하는 각 플로우 세포에서 모니터링되었다. 수용체 단백질들(20mM 아세테이트 나트륨 1mL 당 20μg, pH 4.5)은 제조업자의 지시에 따라(바이아코어, GE, 스웨덴), NHS/EDC 커플링 키트를 이용하여 CM5 칩에 미리 고정되었다. 표적 고정 값은 cynoG-CSFR-Fc, hG-CSFR-Fc 및 hG-CSFR에 대한 차례로 700, 700 및 500 공명 단위에 설정되었다. 칩 고정은 50mM 에탄올아민 pH 8.0으로 소거되었다. 표면 결합의 해리는 50mM 인산을 이용하여 남아있는 복합체의 탈리에 앞서 1000초 동안 모니터링되었다. 그 다음 참조 결합은 대조군 채널로부터 공제되었고, 역학은 바이아코어 2000에서 바이아벨류에이션 소프트웨어(biaevaluation software)를 이용하여 생성되었다.

IgG4 포맷에서 항체 c1.2 및 5D11의 이중 바이오센스 분석은 30μL/분의 유속에서, 항체의 배증 희석액(0.1mg/mL BSA내 312nM 내지 2.4nM)으로 바이아코어 2000(GE, 스웨덴)을 이용하여 실행되었다. 결합(100μL)은 대조군 고정된 블랭크, 고정된 cynoG-CSFR-Fc, 고정된 hG-CSFR-Fc 및 고정된 hG-CSFR을 포함하는 각 플로우 세포에서 모니터링되었다. 수용체 단백질들(20mM 아세테이트 나트륨 1mL 당 20μg, pH 4.5)은 제조업자의 지시에 따라(바이아코어 GE, 스웨덴), NHS/EDC 커플링 키트를 이용하여 CM5 칩에 미리 고정되었다. 표적 고정 값은 cynoG-CSFR-Fc, hG-CSFR-Fc 및 hG-CSFR에 대한 차례로 700, 700 및 500 공명 단위에 설정되었다. 칩 고정은 50mM 에탄올아민 pH 8.0으로 소거되었다. 표면 결합의 해리는 50mM 인산을 이용하여 남아있는 복합체의 탈리에 앞서 1000초 동안 모니터링되었다. 그 다음 참조 결합은 대조군 채널로부터 공제되었고, 역학은 바이아코어 2000에서 비아벨류에이션 소프트웨어를 이용하여 생성되었다.

친화도 성숙된 C1.2G 항체의 바이아코어 mAb 역학

항-인간(염소 항-인간 IgG(감마) 마우스, 흡착됨, 인비트로겐, 카탈로그 번호 H10500)은 아민 커플링 화학반응을 이용하여 CM-5 센서 표면에 화학적으로 고정되었고, 그 다음 3분간 1mg/mL에서 C1.2G 친화도 성숙된 항 hG-CSFR mAb를 포획하는데 이용되었다. 가용성 hG-CSFR은 0, 10 및 40nM에서 포획된 mAb에 걸쳐 주입되었다. 가용성 hG-CSFR을 5분간 주사하였고, 30분간 해리가 모니터링되었다. 참조 플로우 세포로부터의 반응(mAb는 포집되지 않았지만, 다른 방법으로 동일하게 처리되었다)이 공제되었다. 블랭크 주사로부터 반응은 결과로 발생된 센소그람으로부터 공제되었다.

최종 정정된 반응은 대량 수송 한계에 대한 조건을 포함하여 1:1 역학을 설명하는 모델에 대해 비-선형 회귀를 이용하여 피팅하였다. 포획된 mAb 수준에서 약간의 편차를 설명하기 위하여, Rmax 값을 국소적으로 피팅하였다. 결합 속도(ka), 해리 속도(kd) 및 평형 해리 상수(K_D)가 측정되었다.

hG-CSFR/BaF3 증식 생물분석 - MTT 감소

hG-CSFR을 발현시키는 BaF3 세포는 루드윅 인스티튜트 멜버른(Ludwig Institute Melbourne)으로부터 구하였다. 항 hG-CSFR 항체에 의한 G-CSF 매개된 증식의 억제를 평가하기 위하여, 항체의 연속 희석물은 96웰 플레이트내에서 5% FCS 및 0.5ng/mL hGCSF와 함께 DME 배지에 있는 2x10⁴ 세포/웰에 첨가하였고, 37℃, 10% CO₂에서 48시간 동안 항온처리되었다. 세포 증식은 MTT 감소에 의해 결정되었고, 490nM에서 흡수도에 의해 측정되었다.

hG - CSFR / BaF3 증식 생물분석 - 3H- 티미딘 통합

인간 G-CSF에 반응하여 증식되는 인간 G-CSFR을 발현시키도록 공작된 BDF/3 세포를 이용하여 G-CSF의 활성을 상쇄시키는 다양한 단클론성 항체의 능력을 측정하였다. 10ng/mL의 인간 G-CSF 존재하에 다양한 항-G-CSFR 단클론성 항체의 농도를 증가시키면서, 37℃에서 48시간 동안 96웰 플레이트에서 RPMI/105FCS에 1x10⁴ 세포에서 세포들이 도말되었다. 유리 섬유 필터상에서 수거되기에 앞서 배양의 최종 6시간 동안 세포는 ³H-티미딘으로 펄싱되었고, DNA 안으로 통합된 방사능활성 티미딘의 수준은 액체 신틸레이션 카운팅으로 측정되었다.

인간 CFU-G 선조 생물분석

CD34⁺ 골수 세포는 10ng/mL 줄기 세포 인자, 10ng/mL hG-CSF 및 시험 항체의 적정(titrating) 농도 존재하에서 반-고형 배지에서 항온처리되었다. 배양 14일 후 CFU-G를 헤아렸다.

에피토프 비교-경쟁 결합

이 실험의 기획은 2개의 항체의 에피토프가 반드시 상이한, 2개의 항체가 단일 분자에 동시에 결합할 수 있다는 전제하에 구축된다.

서열번호 1의 가용성 G-CSFR은 표면 고정된 항체에 의해 용액으로부터 포획되었다. 그 다음 제 2 항체를 이 복합체에 주사하였다. 참조 플로우 세포로부터의 반응(hG-CSFR은 포집되지 않았지만, 다른 방법으로 동일하게 처리되었다)이 공제되었다. 제 2 항체의 결합은 이들 2개 항체의 에피토프가 상이함을 나타낸다.

항체 결합 상의 종료시 측정된 반응은 hG-CSFR 포획 상의 종료시 반응으로 나누어, 포획된 hG-CSFR 양에 대한 항체 결합 수준을 정정하였다. 그 다음 이들 포획 정정된 반응을 이용하여 다른 항체 존재하에 각 항체가 hG-CSFR에 결합하는 것을 비교하였다.

항체 C1.2, 5D11, 711 및 744는 아민 커플링 화학을 이용하여 CM-5 센서 표면에 화학적으로 고정되었다. 가용성 hG-CSFR은 180초 동안 100nM에서 포획되었다. 각 항체는 180초 동안 100nM에서 포획된 hG-CSFR에 대해 이중으로 주사되었다. 완충액만으로 된 블랭크 주사 또한 실행되었다.

C1 .2G, 711, 744 및 774의 에피토프 매핑

서열번호 1의 일련의 알라닌 점 돌연변이를 만들었고, HEK293 세포에서 발현되었고, 그 다음 정제되었다. 항체 C1.2, 744 및 774에 대한 이들 돌연변이의 결합 친화도가 측정되었고, 서열번호 1의 것과 비교되었다. 이 돌연변이가 서열번호 1의 것보다 2 이상의 인자로 친화도를 변화시킨다면, 이 잔기는 결합 상호작용에 기여하는 것으로 간주되며, 따라서 에피토프에 있거나 에피토프 부근에 있을 가능성이 있다. C1.2, 744 및 774와 분리된 및 별개의 에피토프를 가진, 제 3 mAb(711)는 돌연변이에 의해 야기되는 임의의 주요 구조적 변화를 설명하기 위하여 대조군으로 포함되었다.

항-인간(염소 항-인간 IgG(감마) 마우스, 흡착됨, 인비트로겐, 카탈로그 번호 H10500) 또는 항 마우스 Fc 특이적 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩스 인코포레이티드 카탈로그 번호 515-005-071)는 아민 커플링 화학반응을 이용하여 CM-5 센서 표면에 화학적으로 고정되었다. 그 다음 고정된 항체는 용액으로부터 항 hG-CSFR mAb를 포획하는데 이용되었다. 야생형 hG-CSFR 리간드 결합 도메인(서열번호 1) 및 각 알라닌 점 돌연변이는 다양한 농도에서 포획된 mAb에 주사되었다. 참조 플로우 세포로부터의 반응(mAb는 포집되지 않았지만, 다른 방법으로 동일하게 처리되었다)이 공제되었다. 블랭크 주사 반응은 결과로 생긴 센소그램으로부터 공제되었다.

최종 정정된 반응은 대량 수송 한계에 대한 조건을 포함하여 1:1 역학을 설명하는 모델에 대해 비-선형 회귀를 이용하여 피팅하였다. 포획된 mAb 수준에서 약간의 편차를 설명하기 위하여, Rmax 값을 국소적으로 피팅하였다. 결합 속도(ka), 해리 속도(kd) 및 평형 해리 상수(KD)가 측정되었다.

C1.2 생식계통 mAb는 180초 동안 0.3μg/mL에서 포획되었고, 711은 180초 동안 1μg/mL에서, 744 및 774는 180초 동안 5μg/mL에서 포획되었다.

C1.2 및 744 역학의 경우, WT hG-CSFR 및 각 ala 돌연변이체는 300초 동안 0, 2, 10, 50 및 250nM에서 주사되었고, 해리는 추가 1800초 동안 모니터링되었다.

항체 774 역학의 경우, WT hG-CSFR 및 각 ala 돌연변이체는 300초 동안 0, 2, 10, 50 및 250nM에서 주사되었고, 해리는 추가 600초 동안 모니터링되었다.

항체 711 역학의 경우, WT hG-CSFR 및 각 ala 돌연변이체는 180초 동안 0 및 100nM에서 주사되었고, 해리는 추가 180초 동안 모니터링되었다.

실시예 1: 온전한 인간 항- hG - CSFR 항체는 G- CSF 신호전달 잠재적 억제제이다

상기에서 설명된 친화도 측정 및 BaF3 증식 분석을 이용하여, 항체 711 및744는 hG-CSFR에 대한 친화도 및 G-CSF 상쇄 분석에 대하여 평가되었다. 항체 711은 항체 744보다 더 큰 친화도(차례로 K_D는 0.86nM 및 8.7nM)로 hG-CSFR-Fc 융합(이 방법에서 논의된 것과 같이 서열번호 1에 근거하여)에 결합된 것을 발견하였다. 상기에서 기술된 MTT-기반 생물분석을 이용하여, 항체 711은 항체 744보다 더 강력하게 G-CSF-매개된 세포 증식을 억제한다는 것을 발견하였다(IC₅₀(nM G-CSF)은 차례로 8.8nM 및 2.4nM).

³H-티미딘 통합 분석을 이용하여, 항체 711은 10.1μg/mL의 IC₅₀으로 G-CSF-매개된 세포 증식을 억제한다는 것이 발견되었고; 항체 774는 37.4μg/mL의 IC₅₀으로 G-CSF-매개된 세포 증식을 억제한다는 것이 발견되었고 항체 744의 경우 IC₅₀은 측정되지 않았다(도 1 참고).

파아지 디스플레이 라이브러리로부터 단리된 인간 항체(항체 C1.2 및 5D11) 및 마우스 단클론성 항체 711은 상기에서 설명된 생물분석을 이용하여 BaF3 세포의 G-CSF-매개된 증식을 억제하는 이들의 능력에 대하여 평가되었다. 항체 C1.2는 0.5nM의 IC₅₀으로 BaF3 증식을 억제하였고; 항체 5D11은 5.9nM의 IC₅₀으로 증식을 억제하였고; 711은 3.4nM의 IC₅₀으로 증식을 억제하였다는 것을 결과에서 볼 수 있었다.

이 항체들은 상기에서 설명된 G-CSF 존재하에서 CD34⁺ 골수 세포에 의한 CFU-G 형성을 감소 또는 억제하는 이들의 능력에 대하여 또한 평가되었다. 결과에서, 항체 C1.2는 0.016nM의 IC₅₀으로 CFU-G 형성을 억제하였고; 항체 5D11은 0.039nM의 IC₅₀으로 CFU-G 형성을 억제하였고; 711은 0.411nM의 IC₅₀으로 CFU-G 형성을 억제하였다는 것을 보여주었다.

이들 분석에 근거하여, 인간 항체 C1.2 및 5D11은 CFU-G 형성 억제에 있어서 711보다 더 강력하고, C1.2는 두 가지 생물 분석에서 가장 강력한 항체이다.

실시예 2: 인간 G-CSFR 및 게잡이원숭이 G-CSFR에 대한 항체의 친화도

5D11 및 C1.2의 Fab 및 IgG4 형태와 711 및 744의 Fab의 친화도는 hG-CSFR(서열번호 1), hG-CSFR-Fc 및 게잡이원숭이 G-CSFR-Fc(방법들에서 논의된 서열번호 1에 기반된)의 리간드 결합 도메인에 대한 이들의 친화도를 결정하기 위하여 또한 평가되었다. 이들 분석에서, G-CSFR의 영역들은 고정되고, 이 고정된 폴리펩티드에 대하여 표시된 항체 또는 단편의 결합은 일반적인 방법에서 상세하게 설명된 것과 같이 측정되었다("Fab C1.2, 5D11, 711 및 744의 역학 분석" 제목의 단락). 표 1에 결과를 나타낸다.

이들 데이터는 5D11 및 C1.2가 hG-CSFR에 대하여 높은 친화도를 보유하고, 이들의 친화도는 Fab가 완전한 IgG4 항체로 발현되었을 때 개선된다는 것을 보여준다. 더욱이, 5D11 또는 C1.2의 경우 hG-CSFR 및 cynoG-CSFR에 대한 친화도는 유사하다. C1.2는 5D11보다 hG-CSFR에 대해 더 높은 친화도를 보유한다.

항체 711의 Fab는 0.86nM의 hG-CSFR-Fc에 대해 친화도를 보유하고, 1.8μM의 cynoG-CSFR에 대한 친화도를 보유하는 것으로 나타났다. 항체 744의 Fab는 8.7nM의 hG-CSFR-Fc에 대한 친화도를 보유하고, >10μM의 cynoG-CSFR에 대한 친화도를 보유하는 것으로 나타났다. 따라서, 이들 Fab는 hG-CSFR에 대한 친화도보다는 cynoG-CSFR에 대해 훨씬 더 빈약한 친화도를 가진다.

상호 분석을 또한 실행하였다(예컨대, 항체는 고정되고, 고정된 항체에 대해 야생형 h-GCSFR 또는 야생형 cynoG-CSFR의 결합은 전반적인 방법("mAb에 대한 결합 역학의 측정"이라는 제목의 단락)에 따라 측정되었다. 표 2에 대표적인 결과를 나타낸다.

이들 데이터에서 C1.2G 및 5D11은 711, 744 및 774보다는 더 높은 친화도로 야생형 cynoG-CSFR에 결합한다는 것을 보여준다. 더욱이, 야생형 hG-CSFR 및 야생형 cynoG-CSFR에 대한 C1.2G의 친화도는 서로 약 3 배 이내에 있으며, 야생형 hG-CSFR 및 야생형 cynoG-CSFR에 대한 5D11의 친화도는 서로 약 13 배 이내에 있다.

실시예 3: C1.2의 생식계열

잠재적 면역원성을 최소화하기 위하여, C1.2의 가변 영역 골격은 가장 근접한 인간 생식계 골격과 정합되도록 변화시켰다. 이는 중쇄의 골격에 단일 변화와 경쇄에서 5개의 변화를 요구하였고, 서열번호 4에서 제시된 서열을 가진 V_H와 서열번호 5에서 제시된 서열을 가진 V_L이 생성되었다. G-CSFR에 대해 생식계열화된 항체(C1.2G)의 친화도는 C1.2의 것과 유사하였다(k_a 9.5x10⁴ ± 5.5x10³; k_d 1.31x10^-4 ± 2.6x10^-6; K_D 1.37 ± 0.07 (N=8)). BaF3 세포의 세포 표면에서 발현된 hG-CSFR에 대한 C1.2G의 친화도는 257pM이었다.

상기에서 설명된 ³H-티미딘 통합 분석을 이용하여, 항체 C1.2G는 0.8μg/mL의 IC₅₀으로 G-CSF-매개된 세포 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌다(도 1).

이 항체를 안정화된 IgG4로 재구성하면 서열번호 64에서 제시된 서열을 가진 중쇄와 서열번호 65의 서열을 가진 경쇄를 포함하는 항체가 만들어졌다.

CHO 세포에서 발현될 때, 항체의 리신 변이체가 관찰되었는데, 예컨대, 중쇄중 하나 또는 둘 모두 C-말단 리신 잔기가 부족하다(예컨대, 따라서, 서열번호 64에서 제시된 서열을 포함한다).

실시예 4: 에피토프 매핑

경쟁 결합

공개된 데이터에서 mAb711 및 mAb744는 hG-CSFR의 상이한 도메인에 결합한다는 것을 보여주었다. 경쟁 결합 실험에서 mAb744는 아니지만, mAb711은 C1.2 Ab의 결합에 후속적으로 hG-CSFR에 결합할 수 있다는 것을 보여주었는데, C1.2는 mAb711의 것과는 상이한 영역이지만, mAb744와는 수용체의 유사한 영역에 결합한다는 것을 제시한다.

C1.2 결합에 관련된 펩티드를 확인하기 위한 에피토프 삭제

질량 분석후 에피토프 삭제(excision)를 이용하여 C1.2의 결합에 관련되었던 hG-CSFR의 4개 펩티드를 확인하였다. 이 방법에서, hG-CSFR 단백질은 고정된 C1.2 항체에 우선 결합시키고, 그 다음 단백질분해 효소로 절단되었다. 결합된 펩티드는 MALDI 및 전자분사 질량 분석에 의해 확인된다. 이 방법에 의해 확인된 4가지 펩티드들은 hG-CSFR의 위치 111 내지 115, 170 내지 176, 218 내지 234 및/또는 286 내지 300에 매핑하였다(서열번호 1).

hG-CSFR 영역 돌연변이체에 C1.2 및 mAb744의 결합

공개된 데이터(문헌[Tamada et al Proc Natl Acad Sci USA. 103:3135-3140, 2006; Aritomi et al Acta Crystallogr D Biol Crystallogr; 56:751-753 1999])는 hG-CSFR에서 표면 잔기들을 확인하였다. 에피토프 삭제 실험에 의해 확인된 4가지 펩티드내에 위치된 많은 이들 잔기는 알라닌으로 치환되었고, hG-CSFR의 영역의 생성된 돌연변이 형태가 발현되고, 정제되었다. 각 돌연변이체에 C1.2 및 mAb744의 결합이 평가되었고, 결합에 관련된 주요 잔기들이 확인되었다. 결과는 도 2a에 나타낸다. 잔기 K167 및 H168의 알라닌 치환으로 mAb744에 의한 결합은 완전히 상실되었지만, C1.2의 결합은 영향을 받지 않았다. 대조적으로, 잔기 R287의 알라닌 치환은 C1.2에 의한 결합은 완전하게 상실되었지만, mAb744 결합에는 영향이 없었다. C1.2의 결합을 상당히 감소시킨 다른 잔기들은 L111, L171, Y172, M198 및 H237이었다. MAb744는 야생형 수용체의 것과 유사한 친화도로 이들 돌연변이에 결합되었다.

상기 분석은 mAb774/와 동일한 항체로 반복되었다. 도 2b에서 나타낸 것과 같이, 잔기 K167, H168 및 L169의 알라닌 치환은 mAb774에 의한 결합을 완전하게 상실하였지만, C1.2의 결합은 영향을 받지 않았다. mAb 744와 같이, 잔기 L111, Y172, H237 및 R287의 알라닌 치환은 mAb774 결합에 영향이 전혀 없거나 거의 없었다.

실시예 5: C1.2G의 친화도 성숙

친화도 성숙(maturation)은 C1.2G의 HCDR3 및/또는 LCDR3에서 잔기를 돌연변이시키고, hG-CSFR에 결합하는 Fab를 선별함으로써 실행되었다. 돌연변이 항체의 라이브러리는 몇 차례 패닝(panning) 라운드에 걸쳐 동일한 농도 또는 감소된 농도에서 바이오티닐화된 hG-CSFR-Fc 재조합 단백질을 이용하여 패닝되었다.

패닝 종료시, 각 농축된 라이브러리로부터 다수의 파아지 클론이 선택되었고, 서열화되었다. 독특한 클론들이 서열에 기초하여 선택되었고, 바이아코어 ("mAb용 결합 역학의 측정"이라는 제목의 단락에 있는 전반적인 방법에 따라)를 이용한, hG-CSFR에 대한 결합 분석, 및 일부 경우 BaF3 세포의 G-CSF-매개된 증식을 억제하는 능력을 위해 온전한 인간 IgG4/카파 항체로 재설정되었다. 부모 C1.2G mAb와 비교하였을 때, 개선된 친화도를 가진 재설정된 항체는 표 3에 열거한다.

서열 QQS는 서열¹에 선행한다.

서열² 다음에 서열 PLT가 온다.

서열 LGE는 서열³(wt를 제외한)에 선행한다.

wt - C1.2G의 CDR3 서열

ND - 결정되지 않음

실시예 6: 호중구감소증 유발 없이 C1 .2G는 호중구 수준을 감소시킨다

게잡이원숭이에게 페길화된 G-CSF를 투여하고, 12시간 후 C1.2G(10mg/kg)가 투여되었다. 도 3에 나타낸 것과 같이, C1.2는 대조군 동물과 비교하여 호중구의 수준을 유의적으로 감소시켰지만, 호중구감소증을 유도하지 않았다.

게잡이원숭이에게 G-CSF의 투여에 앞서 2시간 전에 0.1 내지 10mg/kg의 C1.2G를 투약하는 유사한 실험들은 대조군 동물과 비교하여 호중구의 수준을 또한 감소시켰지만, 호중구감소증을 유발하지 않았다.

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Arg Gly Asn Cys Gln 130 135 140 Thr Gln Gly Asp Ser Ile Leu Asp Cys Val Pro Lys Asp Gly Gln Ser 145 150 155 160 His Cys Ser Ile Pro Arg Lys His Leu Leu Leu Tyr Gln Asn Met Gly 165 170 175 Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala Leu Gly Thr Ser Met Ser Pro Gln 180 185 190 Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu 195 200 205 Arg Thr Met Asp Pro Ser Pro Glu Ala Ala Pro Pro Gln Ala Gly Cys 210 215 220 Leu Gln Leu Ser Trp Glu Pro Trp Gln Pro Gly Leu His Ile Asn Gln 225 230 235 240 Lys Cys Glu Leu Arg His Lys Pro Gln Arg Gly Glu Ala Ser Trp Ala 245 250 255 Leu Val Gly Pro Leu Pro Leu Glu Ala Leu Gln Tyr Glu Leu Cys Gly 260 265 270 Leu Leu Pro Ala Thr Ala Tyr Thr Leu Gln Ile Arg Cys Ile Arg Trp 275 280 285 Pro Leu Pro Gly His Trp Ser Asp Trp Ser Pro Ser Leu Glu Leu Arg 290 295 300 Thr Thr Glu Arg Ala Pro Thr His His His His His His His His 305 310 315 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VH of C1.2 <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr 20 25 30 Trp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Val Thr Pro Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Met Leu Gly Glu Leu Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL of C1.2 <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Asn Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Val Glu Ile Arg 100 105 <210> 4 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VH of C1.2G <400> 4 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr 20 25 30 Trp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Val Thr Pro Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Gly Glu Leu Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL of C1.2G <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> HCDR1 of C1.2 <400> 6 Leu Tyr Trp Met Gly 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> C1.2 HCDR2 <400> 7 Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Val Thr Pro Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> C1.2 HCDR3 <400> 8 Leu Gly Glu Leu Gly Trp Phe Asp Pro 1 5 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> C1.2 LCDR1 <400> 9 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> C1.2 LCDR2 <400> 10 Ala Ser Asn Leu Gln Asn 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> C1.2 LCDR3 <400> 11 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <220> <223> consensus sequence of HCDR3 of C1.2 <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> X is an amino acid selected from the group consisting of tryptophan, glutamine, methionine, serine, phenylalanine, glutamic acid and histidine <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> X iis an amino acid selected from the group consisting of phenylalanine, tyrosine, methionine, serine, glycine and isoleucine <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> X is an amino acid selected from the group consisting of aspartic acid, methionine, glutamine, serine, leucine, valine, arginine and histidine <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> X is an amino acid selected from the group consisting of proline gltuamic acid, alanine, leucine, phenylalanine, tyronis, threonine, asparagine, aspartic acid, serine , glycine, arginine, lysine <400> 12 Leu Gly Glu Leu Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> consensus sequence of LCDR3 of C1.2 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> X is an amino acid selected from the group consisting of glutamine, glutamic acid, histidine, alanine or serine <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> X is an amino acid selected from the group consisting of glutamine, valine, phenylalanine, asparagine and glutamic acid <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X ian amino acid selected from the group consisting of serine or glycine <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X is an amino acid selected from the group consisting of tryptophan, methionine, phenylalanine, tyrosine, isoleucine and leucine <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> X is an amino acid selected from the group consisting of glutamic acid, methionine, glutamine, tryptophan, serine, valine, asparagine, glycine, alanine, arganine, histidine, tyrosine, lysine or threonine <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> X is an amino acid selected from the group consisting of tyrosine, methionine, isoleucine or threonine <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> X is an amino acid selected from the group consisting of proline, alanine, histidine, glycine and lysine <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> X is an amino acid selected from the group consisting of leucine, glutamine, methionine, alanine, phenylalanine, isoleucine, lysine, histidine and glycine <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> X is an amino acid selected from the group consisting of threonine, phenylalanine, tyrosine, methionine, lysine, serine, histidine, proline, tryptophan, isoleucine, glutamine, glycine and valine <400> 13 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL of antibody 987 <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Gln Tyr Pro Gln 85 90 95 Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VH of antibody 987 <400> 15 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr 20 25 30 Trp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Val Thr Pro Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Gly Glu Leu Gly Gln Ser Ser Ala Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL of antibody 95 <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Glu Tyr Pro Leu 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL of antibody 79 <400> 17 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Val Ser Trp Glu Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL of antibody 83 <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Met Tyr Ala Leu 85 90 95 Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL of antibody 1003 <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp His Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VH of antibody 1003 <400> 20 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr 20 25 30 Trp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Val Thr Pro Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Gly Glu Leu Gly Ser Gly Ser Thr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL of antibody 44 <400> 21 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Gln 85 90 95 Lys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL of antibody 97 <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Met Tyr Pro Leu 85 90 95 Tyr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL of antibody 986 <400> 23 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ala Tyr Pro Gln 85 90 95 Gln Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VH of antibody 986 <400> 24 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr 20 25 30 Trp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Val Thr Pro Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Gly Glu Leu Gly Phe Phe Gln Glu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL of antibody 56 <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Met Tyr Pro Ile 85 90 95 Lys Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL of antibody 77 <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 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Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 65 <211> 214 <212> PRT <213> artificial <220> <223> C1.2G with kappa light chain <400> 65 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 66 <211> 836 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Met Ala Arg Leu Gly Asn Cys Ser Leu Thr Trp Ala Ala Leu Ile Ile 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Gly Ser Leu Glu Glu Cys Gly His Ile Ser Val Ser 20 25 30 Ala Pro Ile Val His Leu Gly Asp Pro Ile Thr Ala Ser Cys Ile Ile 35 40 45 Lys Gln Asn Cys Ser His Leu Asp Pro Glu Pro Gln Ile Leu Trp Arg 50 55 60 Leu Gly Ala Glu Leu Gln Pro Gly Gly Arg Gln Gln Arg Leu Ser Asp 65 70 75 80 Gly Thr Gln Glu Ser Ile Ile Thr Leu Pro His Leu Asn His Thr Gln 85 90 95 Ala Phe Leu Ser Cys Cys Leu Asn Trp Gly Asn Ser Leu Gln Ile Leu 100 105 110 Asp Gln Val Glu Leu Arg Ala Gly Tyr Pro Pro Ala Ile Pro His Asn 115 120 125 Leu Ser Cys Leu Met Asn Leu Thr Thr Ser Ser Leu Ile Cys Gln Trp 130 135 140 Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu Pro Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ser 145 150 155 160 Phe Lys Ser Arg Gly Asn Cys Gln Thr Gln Gly Asp Ser Ile Leu Asp 165 170 175 Cys Val Pro Lys Asp Gly Gln Ser His Cys Cys Ile Pro Arg Lys His 180 185 190 Leu Leu Leu Tyr Gln Asn Met Gly Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala 195 200 205 Leu Gly Thr Ser Met Ser Pro Gln Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val 210 215 220 Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu Arg Thr Met Asp Pro Ser Pro Glu 225 230 235 240 Ala Ala Pro Pro Gln Ala Gly Cys Leu Gln Leu Cys Trp Glu Pro Trp 245 250 255 Gln Pro Gly Leu His Ile Asn Gln Lys Cys Glu Leu Arg His Lys Pro 260 265 270 Gln Arg Gly Glu Ala Ser Trp Ala Leu Val Gly Pro Leu Pro Leu Glu 275 280 285 Ala Leu Gln Tyr Glu Leu Cys Gly Leu Leu Pro Ala Thr Ala Tyr Thr 290 295 300 Leu Gln Ile Arg Cys Ile Arg Trp Pro Leu Pro Gly His Trp Ser Asp 305 310 315 320 Trp Ser Pro Ser Leu Glu Leu Arg Thr Thr Glu Arg Ala Pro Thr Val 325 330 335 Arg Leu Asp Thr Trp Trp Arg Gln Arg Gln Leu Asp Pro Arg Thr Val 340 345 350 Gln Leu Phe Trp Lys Pro Val Pro Leu Glu Glu Asp Ser Gly Arg Ile 355 360 365 Gln Gly Tyr Val Val Ser Trp Arg Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ile 370 375 380 Leu Pro Leu Cys Asn Thr Thr Glu Leu Ser Cys Thr Phe His Leu Pro 385 390 395 400 Ser Glu Ala Gln Glu Val Ala Leu Val Ala Tyr Asn Ser Ala Gly Thr 405 410 415 Ser Arg Pro Thr Pro Val Val Phe Ser Glu Ser Arg Gly Pro Ala Leu 420 425 430 Thr Arg Leu His Ala Met Ala Arg Asp Pro His Ser Leu Trp Val Gly 435 440 445 Trp Glu Pro Pro Asn Pro Trp Pro Gln Gly Tyr Val Ile Glu Trp Gly 450 455 460 Leu Gly Pro Pro Ser Ala Ser Asn Ser Asn Lys Thr Trp Arg Met Glu 465 470 475 480 Gln Asn Gly Arg Ala Thr Gly Phe Leu Leu Lys Glu Asn Ile Arg Pro 485 490 495 Phe Gln Leu Tyr Glu Ile Ile Val Thr Pro Leu Tyr Gln Asp Thr Met 500 505 510 Gly Pro Ser Gln His Val Tyr Ala Tyr Ser Gln Glu Met Ala Pro Ser 515 520 525 His Ala Pro Glu Leu His Leu Lys His Ile Gly Lys Thr Trp Ala Gln 530 535 540 Leu Glu Trp Val Pro Glu Pro Pro Glu Leu Gly Lys Ser Pro Leu Thr 545 550 555 560 His Tyr Thr Ile Phe Trp Thr Asn Ala Gln Asn Gln Ser Phe Ser Ala 565 570 575 Ile Leu Asn Ala Ser Ser Arg Gly Phe Val Leu His Gly Leu Glu Pro 580 585 590 Ala Ser Leu Tyr His Ile His Leu Met Ala Ala Ser Gln Ala Gly Ala 595 600 605 Thr Asn Ser Thr Val Leu Thr Leu Met Thr Leu Thr Pro Glu Gly Ser 610 615 620 Glu Leu His Ile Ile Leu Gly Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Thr 625 630 635 640 Cys Leu Cys Gly Thr Ala Trp Leu Cys Cys Ser Pro Asn Arg Lys Asn 645 650 655 Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala His Ser Ser Leu Gly Ser 660 665 670 Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Asp Ala Phe Gln Leu Pro Gly Leu 675 680 685 Gly Thr Pro Pro Ile Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Glu Asp Glu Lys 690 695 700 Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His Asn Ser Ser Glu Thr Cys Gly Leu 705 710 715 720 Pro Thr Leu Val Gln Thr Tyr Val Leu Gln Gly Asp Pro Arg Ala Val 725 730 735 Ser Thr Gln Pro Gln Ser Gln Ser Gly Thr Ser Asp Gln Val Leu Tyr 740 745 750 Gly Gln Leu Leu Gly Ser Pro Thr Ser Pro Gly Pro Gly His Tyr Leu 755 760 765 Arg Cys Asp Ser Thr Gln Pro Leu Leu Ala Gly Leu Thr Pro Ser Pro 770 775 780 Lys Ser Tyr Glu Asn Leu Trp Phe Gln Ala Ser Pro Leu Gly Thr Leu 785 790 795 800 Val Thr Pro Ala Pro Ser Gln Glu Asp Asp Cys Val Phe Gly Pro Leu 805 810 815 Leu Asn Phe Pro Leu Leu Gln Gly Ile Arg Val His Gly Met Glu Ala 820 825 830 Leu Gly Ser Phe 835 <210> 67 <211> 319 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Ig and CRH domains of Macaca fascicularis G-CSFR (cynoG-CSFR) with a C-terminal polyhistidine tag <400> 67 Glu Cys Gly His Ile Ser Val Ser Ala Pro Ile Val His Leu Gly Asp 1 5 10 15 Pro Ile Thr Ala Ser Cys Ile Ile Lys Gln Asn Cys Ser His Leu Asp 20 25 30 Leu Glu Pro Gln Ile Leu Trp Arg Leu Gly Ala Glu Leu Gln Pro Gly 35 40 45 Gly Arg Gln Gln Arg Leu Ser Asp Gly Ser Gln Gln Ser Thr Ile Thr 50 55 60 Leu Pro His Leu Asn His Thr Arg Ala Phe Leu Ser Cys Ala Leu Asn 65 70 75 80 Trp Gly Asn Ser Leu Gln Ile Leu Asp Gln Val Glu Leu Arg Ala Gly 85 90 95 Tyr Pro Pro Ala Val Pro Arg Asn Leu Ser Cys Leu Met Asn Leu Thr 100 105 110 Thr Ser Ser Leu Ile Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu 115 120 125 Pro Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ser Phe Lys Ser Arg Gly Asn Cys Gln 130 135 140 Thr Gln Gly Asp Ser Ile Met Asp Cys Val Pro Glu Asp Gly Gln Ser 145 150 155 160 His Cys Ser Ile Pro Arg Arg His Leu Leu Leu Tyr Gln Asn Met Gly 165 170 175 Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala Leu Gly Thr Ser Met Ser Pro Gln 180 185 190 Leu Cys Leu Glu Pro Met Asp Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu 195 200 205 Arg Thr Met Asp Pro Ser Pro Glu Ala Ala Pro Pro Gln Ala Gly Cys 210 215 220 Leu Gln Leu Ser Trp Glu Pro Trp Gln Pro Ala Leu His Ile Asn Gln 225 230 235 240 Lys Cys Glu Leu Arg His Lys Pro Gln Ser Gly Glu Ala Ser Trp Ala 245 250 255 Leu Val Gly Pro Leu Pro Leu Glu Ala Leu Arg Tyr Glu Leu Cys Gly 260 265 270 Leu Leu Pro Ala Thr Ala Tyr Thr Leu Gln Ile Arg Cys Ile Arg Trp 275 280 285 Pro Leu Pro Gly His Trp Ser Asn Trp Ser Pro Ser Leu Glu Leu Arg 290 295 300 Thr Thr Glu Arg Ala Pro Thr His His His His His His His His 305 310 315 <210> 68 <211> 444 <212> PRT <213> artificial <220> <223> C1.2G heavy chain IgG4 with S241P mutation and lacking C-terminal lysine residue <400> 68 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Tyr 20 25 30 Trp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Val Thr Pro Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Gly Glu Leu Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440

Claims (36)

1. 인간 과립구-콜로니 자극 인자 수용체(hG-CSFR)에 결합하고 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 신호전달을 상쇄시키는 항체로서,
   (i) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (ii) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (iii) 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (iv) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (v) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (vi) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (vii) 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (viii) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (ix) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (x) 서열번호 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xi) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xii) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xiii) 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xiv) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xv) 서열번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xvi) 서열번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xvii) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xviii) 서열번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xix) 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xx) 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xxi) 서열번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xxii) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xxiii) 서열번호 45에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 44에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xxiv) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 46에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xxv) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xxvi) 서열번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xxvii) 서열번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xxviii) 서열번호 53에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xxix) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 54에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xxx) 서열번호 55에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xxxi) 서열번호 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xxxii) 서열번호 59에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xxxiii) 서열번호 61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 60에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L;
   (xxxiv) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L; 또는
   (xxxv) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L
   을 포함하는, 항체.
2. 인간 과립구-콜로니 자극 인자 수용체(hG-CSFR)에 결합하고 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 신호전달을 상쇄시키는 항체로서,
   (i) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (ii) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (iii) 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (iv) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (v) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (vi) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (vii) 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (viii) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (ix) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (x) 서열번호 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xi) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xii) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xiii) 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xiv) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xv) 서열번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xvi) 서열번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xvii) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xviii) 서열번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xix) 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xx) 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xxi) 서열번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xxii) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xxiii) 서열번호 45에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 44에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xxiv) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 46에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xxv) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xxvi) 서열번호 49에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xxvii) 서열번호 51에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xxviii) 서열번호 53에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xxix) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 54에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xxx) 서열번호 55에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xxxi) 서열번호 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xxxii) 서열번호 59에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xxxiii) 서열번호 61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 60에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L;
   (xxxiv) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L; 또는
   (xxxv) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 63에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L
   을 포함하는, 항체.
3. 인간 과립구-콜로니 자극 인자 수용체(hG-CSFR)에 결합하고 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 신호전달을 상쇄시키는 항체로서,
   서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는, 항체.
4. 인간 과립구-콜로니 자극 인자 수용체(hG-CSFR)에 결합하고 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 신호전달을 상쇄시키는 항체로서,
   서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L을 포함하는, 항체.
5. 인간 과립구-콜로니 자극 인자 수용체(hG-CSFR)에 결합하고 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 신호전달을 상쇄시키는 항체로서,
   서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L을 포함하는, 항체.
6. 인간 과립구-콜로니 자극 인자 수용체(hG-CSFR)에 결합하고 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 신호전달을 상쇄시키는 항체로서,
   서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H의 3 개의 CDR을 포함하는 V_H 및 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_L의 3 개의 CDR을 포함하는 V_L을 포함하는, 항체.
7. (i) 서열번호 64 또는 68에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는
   (ii) 서열번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 1 개의 중쇄와 서열번호 68에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 1 개의 중쇄 및 서열번호 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2 개의 경쇄
   를 포함하는, 항체.
8. 대상에서 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)-매개된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 조성물로서, 상기 G-CSF-매개된 질병은 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 암이고,
   상기 조성물은 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 조성물.
9. 대상에서 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)-매개된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 조성물로서, 상기 G-CSF-매개된 질병은 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 암이고, 상기 조성물은
   (i) 서열번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 또는
   (ii) (a) 서열번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체, 및
   (b) 서열번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 1 개의 중쇄와 서열번호 68에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 1 개의 중쇄 및 서열번호 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2 개의 경쇄를 포함하는 항체;
   를 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하거나 포함하지 않는,
   조성물.
10. 대상에서 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)-매개된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약제로서, 상기 G-CSF-매개된 질병은 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 암이고,
    상기 약제는 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 약제.
11. 제 10 항에 있어서,
    상기 자가면역 질환 또는 염증성 질환은, 관절염, 다발성 경화증, 폐의 염증 또는 만성 폐쇄성 폐 질환인, 약제.
12. 제 10 항에 있어서,
    호중구감소증을 유도하지 않고 대상에서 호중구의 수를 감소시키기에 충분한 양의 항체를 포함하는, 약제.
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 항체의 양이 0.05 mg/kg 내지 30 mg/kg인, 약제.
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