BR112013031943B1

BR112013031943B1 - Composição que compreende proteínas e anticorpos contra g-csfr

Info

Publication number: BR112013031943B1
Application number: BR112013031943-7A
Authority: BR
Inventors: Andrew Donald Nash; Arna Elizabeth Andrews; Manuel Baca; Kirsten Mae Edwards; Matthew Philip Hardy; Con Panousis; Felicity Meredith Dunlop
Original assignee: Csl Limited
Priority date: 2011-06-13
Filing date: 2012-06-13
Publication date: 2021-10-13
Also published as: US20210009701A1; CN103649123B; KR20140041717A; CN103649123A; ES2828482T3; US9193793B2; EP2718326A4; RU2605595C2; SG195043A1; WO2012171057A1; MX2013014711A; JP2014519517A; AU2012269720B2; IL229468B; IL229468A0; RU2014100642A; DK2718326T3; EP2718326B1; US20120321630A1; KR101822702B1

Abstract

proteínas e anticorpos contra g-csfr, composição que os compreendem e uso dos mesmos. a presente invenção refere-se a proteínas e anticorpos compreendendo domínios de ligação a antígeno de anticorpos que se ligam a receptor de fator de estimulação de colônia de granulócito humano. a presente invenção também se refere a uma composição compreendendo as referidas proteínas ou anticorpos e ao uso das proteínas ou anticorpos ou da composição na preparação de um medicamento.

Description

PEDIDO CORRELATO

[0001] O presente pedido de patente reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório US 61/496.351 intitulado “Antibodies against G- CSFR and uses thereof” depositado em 13 de Junho de 2011, todo o conteúdo do qual sendo aqui incorporado por referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O presente pedido está depositado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A totalidade do conteúdo da Listagem de Sequências está aqui incorporada por referência.

CAMPO

[0003] A presente divulgação refere-se a anticorpos que se ligam a receptor de fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSFR) e respectivos usos, por exemplo, em terapia.

ANTECEDENTES

[0004] O fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF) é um importante regulador da produção de granulócitos. G-CSF é produzido por células do estroma da medula óssea, células endoteliais, macrófagos e fibroblastos, e a produção é induzida por estímulos inflamatórios. O G-CSF atua através do receptor de G-CSF (G-CSFR), que é expresso em progenitores mieloides iniciais, neutrófilos maduros, monócitos/macrófagos, linfócitos T e B e células endoteliais. Os camundongos deficientes em G-CSF ou G-CSFR apresentam neutropenia marcada, demonstrando a importância do G-CSF em granulopoiese de estado estacionário. No entanto, G-CSF parece ser dispensável para a granulopoiese de emergência, por exemplo, em resposta a uma infecção. G-CSF aumenta a produção e a liberação de neutrófilos, mobiliza o tronco hematopoiético e células progenitoras, e modula a diferenciação, tempo de vida, e funções efetoras de neutrófilos maduros. G-CSF pode também exercer efeitos sobre os macrófagos, incluindo a expansão dos números de monócitos/macrófagos, potencialização da função fagocitária e regulação de citocinas inflamatórias e produção de quimiocinas. G-CSF também tem mostrado mobilizar as células progenitoras endoteliais e induzir ou promover a angiogênese.

[0005] Embora G-CSF seja usado terapeuticamente, por exemplo, para tratar a neutropenia e/ou mobilizar as células-tronco hematopoiéticas, o mesmo também tem ações negativas em algumas condições, por exemplo, condições inflamatórias e/ou câncer. Por exemplo, a administração de G-CSF exacerba a artrite reumatoide (RA), a artrite induzida por colágeno de murino (CIA) e um modelo de transferência passiva de CIA em ratos. O G-CSF foi encontrado no soro e no fluido sinovial de pacientes com RA. Além disso, a interleucina (IL)- 1 e o fator de necrose tumoral (TNFα), que se encontram em níveis aumentados em pacientes que sofrem de RA, induzem a produção de G-CSF por condrócitos e fibroblastos sinoviais humanos. Os camundongos deficientes em G-CSF, são resistentes à indução de artrite inflamatória aguda e crônica.

[0006] O G-CSF também tem mostrado desempenhar um papel na esclerose múltipla (MS). Por exemplo, o G-CSF potencializa a adesão de um modelo de linhagem de células T autorreativas de MS à matriz extracelular de forma tão eficaz como interferon Y e TNFα, os quais são conhecidos por exacerbar os sintomas da MS. Além disso, os camundongos deficientes em G-CSF são resistentes ao desenvolvimento de encefalomielite autoimune experimental (EAE).

[0007] O G-CSF e G-CSFR também foram relacionados ao câncer, com estudos que mostram que esta via de sinalização contribui para a resistência à quimioterapia, crescimento, sobrevivência, capacidade de invasão e metástase de vários tipos de câncer. Além disso, o G-CSF tem mostrado induzir a angiogênese, um processo importante no desenvolvimento de tumores sólidos.

[0008] Será evidente para o versado na técnica a partir do exposto, que existe uma necessidade na técnica para reagentes que reduzem a sinalização de G-CSF através de G-CSFR. Exemplos de agentes serão adequados para uso como agentes terapêuticos, por exemplo, para tratar ou prevenir uma condição mediada por G-CSF.

SUMÁRIO

[0009] Os presentes inventores produziram uma classe de proteínas que compreendem os sítios de ligação de anticorpos (por exemplo, Fabs e anticorpos) que se ligam a G-CSFR humano (hG- CSFR) e potencialmente neutralizam a sinalização de G-CSF, por exemplo, evitam a formação de granulócitos a partir de células da medula óssea CD34+ e/ou evitam a proliferação celular em resposta a G-CSF e/ou reduzem ou impedem a neutrofilia induzida pela administração de G-CSF. Uma classe de proteínas identificadas pelos inventores também reage de forma cruzada com G-CSFR de macaco cinomolgo (cynoG-CSFR), o que facilita os estudos pré-clínicos com as proteínas. Uma classe de proteínas identificada pelos inventores se liga a hG-CSFR com elevada afinidade. Uma classe de proteínas identificada pelos inventores são anticorpos humanos, os quais são adequados para o tratamento de uma variedade de condições.

[00010] A presente divulgação fornece uma proteína que compreende um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo, em que o sítio de ligação a antígeno se liga a hG-CSFR e neutraliza a sinalização de G-CSF, e em que a proteína inibe o crescimento de unidades formadoras de colônias de granulócitos (CFU-G) a partir das células da medula óssea CD34+ crescidas na presença de G-CSF com um IC50 de pelo menos cerca de 0,2 nM. Por exemplo, a IC50 é 0,1 nM ou menos, por exemplo, 0,09 nM ou menos, ou 0,08nM ou menos, ou 0,07nM ou menos, ou 0,06nM ou menos ou 0,05nM ou menos. Em um exemplo, a IC50 é 0,04 nM ou menos. Em outro exemplo, a IC50 é 0,02 nM ou menos. Métodos para avaliar a IC50 de uma proteína em tal ensaio são descritos aqui. Por exemplo, a IC50 é determinada na presença de 10 ng/ml de hG-CSF.

[00011] Em um exemplo, a IC50 é determinada através da cultura de células da medula óssea CD34+ na presença de 10ng/ml do fator de células-tronco e 10ng/ml de hG-CSF. Por exemplo, as células são crescidas em um meio de cultura de células semissólido. Em um exemplo, os CFU-G são enumerados após 14 dias de cultura.

[00012] A presente divulgação fornece adicionalmente ou alternativamente uma proteína que compreende um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo, em que o sítio de ligação a antígeno se liga a G-CSFR tatno de macaco cinomolgo quanto de humano com uma afinidade semelhante e neutraliza sinalização de G-CSF. Tais proteínas são vantajosas uma vez que facilitam os estudos pré-clínicos em mamíferos não humanos.

[00013] Em um exemplo, a afinidade da proteína é determinada usando um biossensor, por exemplo, por ressonância de plásmon de superfície. Por exemplo, a região de ligação ao ligante solúvel ou hG- CSFR solúvel ou cynoG-CSFR solúvel ou hG-CSFR-Fc ou cyno-G- CSFR-Fc é imobilizada e a afinidade da proteína da divulgação é determinada.

[00014] A presente divulgação fornece adicionalmente uma proteína que compreende um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo, em que o sítio de ligação a antígeno se liga especificamente ao mesmo epitopo em hG-CSFR que o ligado por C1.2 (compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3) ou C1.2G (compreendendo uma VH que compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4 e uma VL que compreende uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5).

[00015] A presente divulgação fornece adicionalmente ou alternativamente, uma proteína que compreende um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo, em que (i) a proteína inibe competitivamente a ligação de C1.2 (compreendendo uma VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 em uma VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3) ou C1.2G (compreendendo uma VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5) para hG-CSFR; (ii) a proteína neutraliza sinalização de G-CSF; e (iii) o nível de ligação da proteína a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 no qual uma alanina é substituída por qualquer uma de: (a) a arginina na posição 287 de SEQ ID NO:1; (b) a histidina na posição 237 de SEQ ID NO:1; (c) a metionina na posição 198 de SEQ ID NO:1; (d) a tirosina na posição 172 de SEQ ID NO:1; (e) a leucina na posição 171 de SEQ ID NO:1; ou (f) a leucina na posição 111 de SEQ ID NO:1 é mais baixo que o nível de ligação proteína a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[00016] A presente divulgação adicionalmente ou alternativamente fornece uma proteína compreendendo um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo, em que (i) a proteína inibe competitivamente a ligação de C1.2 (compreendendo uma VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 em uma VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3) ou C1.2G (compreendendo uma VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5) para hG-CSFR; (ii) a proteína neutraliza sinalização de G-CSF; e (iii) preferencialmente liga-se a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em relação a sua capacidade de se ligar a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 no qual uma alanina é substituída por qualquer uma de: (a) a arginina na posição 287 de SEQ ID NO:1; (b) a histidina na posição 237 de SEQ ID NO:1; (c) a metionina na posição 198 de SEQ ID NO:1; (d) a tirosina na posição 172 de SEQ ID NO:1; (e) a leucina na posição 171 de SEQ ID NO:1; ou (f) a leucina na posição 111 de SEQ ID NO:1.

[00017] A presente divulgação adicionalmente ou alternativamente fornece uma proteína compreendendo um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo, em que (i) the protein binds to hG-CSFR; (ii) a proteína neutraliza sinalização de G-CSF; e (iii) o nível de ligação da proteína a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 no qual uma alanina é substituída por qualquer uma de: (a) a arginina na posição 287 de SEQ ID NO:1 (b) a histidina na posição 237 de SEQ ID NO:1; (c) a metionina na posição 198 de SEQ ID NO:1; (d) a tirosina na posição 172 de SEQ ID NO:1; (e) a leucina na posição 171 de SEQ ID NO:1; ou (f) a leucina na posição 111 de SEQ ID NO:1 é mais baixo que o nível de ligação proteína a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[00018] A presente divulgação adicionalmente ou alternativamente fornece uma proteína compreendendo um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo, em que (i) a proteína se liga a hG-CSFR; (ii) a proteína neutraliza sinalização de G-CSF; e (iii) preferencialmente liga-se a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em relação a sua capacidade de se ligar a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 no qual uma alanina é substituída por qualquer uma de: (a) a arginina na posição 287 de SEQ ID NO:1 (b) a histidina na posição 237 de SEQ ID NO:1; (c) a metionina na posição 198 de SEQ ID NO:1; (d) a tirosina na posição 172 de SEQ ID NO:1; (e) a leucina na posição 171 de SEQ ID NO:1; ou (f) a leucina na posição 111 de SEQ ID NO:1.

[00019] Em um exemplo, o nível de ligação da proteína ao polipeptídeo compreendendo a substituição de alanina é reduzido por pelo menos cerca de 10 vezes ou 20 vezes ou 50 vezes ou 100 vezes ou 150 vezes ou 200 vezes em comparação com a ligação da proteína ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Preferencialmente, o nível de ligação da proteína ao polipeptídeo compreendendo a substituição de alanina é reduzido por pelo menos cerca de 50 vezes. Preferencialmente, o nível de ligação da proteína ao polipeptídeo compreendendo a substituição de alanina é reduzido por pelo menos cerca de 60 vezes.

[00020] Em um exemplo, o sítio de ligação a antígeno da proteína não se liga de modo detectável a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída por uma arginina na posição 287 de SEQ ID NO: 1.

[00021] Em um exemplo, o nível de ligação é avaliado usando um biossensor, por exemplo, por ressonância de plásmons de superfície. Por exemplo, a proteína é imobilizada e o nível de ligação a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 ou para uma forma do polipeptídeo compreendendo uma substituição de alanina é determinada.

[00022] Formas adicionais de um polipeptídeo compreendendo os aminoácidos de SEQ ID NO: 1 com ou sem outras substituições ligadas ou não significativamente ligadas ou não ligadas de modo detectável por uma proteína da presente divulgação são aqui descritos e estão sendo tomadas para aplicar-se mutatis mutandis, aos presentes exemplos da divulgação.

[00023] Em um exemplo, o sítio de ligação a antígeno reage de forma cruzada com: (i) um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela lisina na posição 167 de SEQ ID NO: 1; e/ou (ii) um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela histidina na posição 168 de SEQ ID NO: 1.

[00024] Em um exemplo, o sítio de ligação a antígeno adicionalmente reage de forma cruzada com um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída por uma leucina na posição 169 de SEQ ID NO: 1

[00025] Em um exemplo, a proteína inibe competitivamente a ligação de C1.2 (compreendendo uma VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 2 em uma VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3) ou C1.2G (compreendendo uma VH compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5) a um ou mais de: (i) um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela lisina na posição 167 de SEQ ID NO: 1; e/ou (ii) um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela histidina na posição 168 de SEQ ID NO: 1.

[00026] Em um exemplo, uma proteína descrita aqui de acordo com qualquer exemplo se liga a um epitopo compreendendo resíduos dentro de uma ou duas ou três ou quatro regiões selecionadas de 111-115, 170-176, 218-234 e/ou 286-300 de SEQ ID NO: 1.

[00027] Em um exemplo, mediante a ligação de uma proteína descrita aqui de acordo com qualquer exemplo a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 e clivagem usando enzimas proteolíticas permanece ligada a uma ou duas ou três ou quatro peptídeos compreendendo ou consistindo em aminoácidos 111-115 de SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos 170-176 de SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos 218-234 de SEQ ID NO: 1 ou aminoácidos 286-300 de SEQ ID NO: 1.

[00028] Em um exemplo, a proteína se liga a um epitopo conformacional.

[00029] A presente divulgação adicionalmente ou alternativamente fornece uma proteína que se liga a hG-CSFR e neutraliza a sinalização de G-CSF, a proteína compreendendo pelo menos um de: (i) uma VH compreendendo uma região determinante de complementaridade (CDR) 1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6, uma CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 7 e uma CDR3 compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 55% de identidade de sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8; (ii) uma VH compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 80%, tal como 85% ou 90% ou 91% ou 92% ou 93% ou 94% ou 95% ou 96% ou 97% ou 98% ou 99% idêntica a uma sequência estabelecida na SEQ SEQ ID NO: 2 e/ou 4 (iii) uma VL compreendendo uma CDR1 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 9, uma CDR2 compreendendo uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 10 e uma CDR3 compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 33% de identidade de sequência estabelecida na SEQ ID NO: 11; e (iv) uma VL compreendendo uma sequência pelo menos cerca de 80%, tal como 85% ou 90% ou 91% ou 92% ou 93% ou 94% ou 95% ou 96% ou 97% ou 98% ou 99% idêntica a uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 e/ou 5.

[00030] Essa proteína pode compreender qualquer uma ou mais das atividades funcionais descritas aqui, por exemplo, ligação preferencial a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em relação ao nível de ligação de um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 no qual uma alanina é substituída por qualquer uma de: (a) uma arginina na posição 287 de SEQ ID NO:1 (b) uma histidina na posição 237 de SEQ ID NO:1; (c) uma metionina na posição 198 de SEQ ID NO:1; (d) uma tirosina na posição 172 de SEQ ID NO:1; (e) uma leucina na posição 171 de SEQ ID NO:1; ou (f) uma leucina na posição 111 de SEQ ID NO:1.

[00031] Em um exemplo, a porcentagem de identidade a (ii) é pelo menos cerca de 95%.

[00032] Em um exemplo, a porcentagem de identidade a (iv) é pelo menos cerca de 94%.

[00033] Em um exemplo, diferenças entre a sequência referida e a proteína são substituições.

[00034] O versado na técnica será capaz de determinar sítios para mutações a uma proteína da divulgação, por exemplo, dentro de uma região de estrutura de uma região variável contendo proteína. Além disso, os inventores identificaram numerosos sítios em uma VH CDR3 em uma VL CDR3 que podem ser mutadas bem como numerosas mutações para manter atividade de uma proteína da divulgação. Por exemplo, uma mutação, por exemplo, uma substituição está dentro de um ou mais (por exemplo, 2 ou 3 ou 4) dos quatro resíduos C-terminal de HCDR3 e/ou um ou mais (por exemplo, 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6) dos resíduos N-terminal ou C-terminal de LCDR3.Em um exemplo, os cinco aminoácidos N-terminais de VH CDR3 são LGELG. Em um exemplo, os três aminoácidos N-terminais de VL CDR3 are QQS e/ou os três aminoácidos C-terminais de VL CDR3 são PLT.

[00035] Em um exemplo, a VH compreende uma CDR3 compreendendo uma sequência LGELGX1X2X3X4, em que: X1 é selecionado do grupo consistindo em triptofano, glutamina, metionina, serina, fenilalanina, ácido glutâmico e histidina e/ou é um aminoácido natural, tal como triptofano, glutamina ou metionina, por exemplo, o aminoácido é triptofano; X2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em fenilalanina, tirosina, metionina, serina, glicina e isoleucina, por exemplo, é fenilalanina, tirosina, metionina ou serina, por exemplo, o aminoácido é fenilalanina; X3 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em ácido aspártico, metionina, glutamina, serina, leucina, valina, arginina e histidina, por exemplo, é prolina, ácido glutâmico, alanina, leucina, fenilalanina ou tirosina, por exemplo, o aminoácido é ácido aspártico; e X4 é qualquer aminoácido ou um aminoácido selecionado do grupo consistindo em prolina, ácido glutâmico, alanina, leucina, fenilalanina, tirosina, treonina, asparagina, ácido aspártico, serina, glicina, arginina, e lisina, por exemplo, o aminoácido é prolina.

[00036] Em um exemplo, a VL compreende uma CDR3 compreendendo uma sequência X1X2X3X4X5X6X7X8X9, em que: X1 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em glutamina, ácido glutâmico, histidina, alanina e serina e/ou é um aminoácido hidrofílico, tal como glutamina ou ácido glutâmico, por exemplo, o aminoácido é glutamina; X2 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em glutamina, valina, fenilalanina, asparagina e ácido glutâmico, por exemplo, o aminoácido é glutamina; X3 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em serina e glicina, por exemplo, o aminoácido é serina; X4 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em triptofano, metionina, fenilalanina, tirosina, isoleucina e leucina, por exemplo, o aminoácido é triptofano ou tirosina; X5 é qualquer aminoácido ou um aminoácido selecionado do grupo consistindo em ácido glutâmico, metionina, glutamina, triptofano, serina, valina, asparagina, glicina, alanina, arganina, histidina, tirosina, lisina e treonina, por exemplo, o aminoácido é serina; X6 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em tirosina, metionina, isoleucina e treonina, por exemplo, o aminoácido é metionina, tirosina ou treonina; X7 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em prolina, alanina, histidina, glicina e lisina, por exemplo, o aminoácido é prolina; X8 é um aminoácido selecionado do grupo consistindo em leucina, glutamina, metionina, alanina, fenilalanina, isoleucina, lisina, histidina e glicina, por exemplo, o aminoácido é leucina; X9 é qualquer aminoácido ou um aminoácido selecionado do grupo consistindo em treonina, fenilalanina, tirosina, metionina, lisina, serina, histidina, prolina, triptofano, isoleucina, glutamina, glicina e valina, por exemplo, o aminoácido é treonina.

[00037] A presente divulgação adicionalmente ou alternativamente fornece uma proteína (por exemplo, um anticorpo) que se liga a hG- CSFR e neutraliza a sinalização de G-CSF, a proteína compreendendo pelo menos uma região variável de um anticorpo selecionado do grupo consistindo em: (i) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2; (ii) uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; (iii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4; (iv) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 5; uma sequência de (v) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 14; uma sequência de (vi) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 15; uma sequência de (vii) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 16; uma sequência de (viii) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 17; uma sequência de (ix) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 18; uma sequência de (x) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 19; uma sequência de (xi) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 20; uma sequência de (xii) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 21; uma sequência de (xiii) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 22; uma sequência de (xiv) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 23; uma sequência de (xv) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 24; uma sequência de (xvi) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 25; uma sequência de (xvii) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 26; uma sequência de (xviii) uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 27; (xix) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28; uma sequência de (xx) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 29; uma sequência de (xxi) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 30; uma sequência de (xxii) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 31; uma sequência de (xxiii) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 32; uma sequência de (xxiv) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 33; uma sequência de (xxv) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 34; uma sequência de (xxvi) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35; uma sequência de (xxvii) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 36; uma sequência de (xxviii) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 37; uma sequência de (xxix) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 38; uma sequência de (xxx) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 39; uma sequência de (xxxi) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 40; uma sequência de (xxxii) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 41; uma sequência de (xxxiii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 42; (xxxiv) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 43; uma sequência de (xxxv) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 44; uma sequência de (xxxvi) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45; uma sequência de (xxxvii) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 46; uma sequência de (xxxviii) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 47; uma sequência de (xxix) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 48; uma sequência de (xl) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 49; uma sequência de (xli) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 50; uma sequência de (xlii) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 51; uma sequência de (xliii) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 52; uma sequência de (xliv) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 53; uma sequência de (xlv) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 54; uma sequência de (xlvi) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 55; uma sequência de (xlvii) uma VL compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 56; uma sequência de (xlviii) uma VH compreendendo aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57; uma sequência de (xlix) uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58; (I) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 59; (II) uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 60; (III) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 61; (IV) i) uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 62; e (liv) uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63.

[00038] Em um exemplo, uma proteína descrita aqui compreende pelo menos uma VH em uma VL, em que a VH e VL se ligam para formar um Fv compreendendo um domínio de ligação a antígeno. O versado na técnica entenderá que o domínio de ligação a antígeno compreende o sítio de ligação do anticorpo.

[00039] Em um exemplo, a VH e a VL estão em uma cadeia de polipeptídeos simples. Por exemplo, a proteína é: (i) um fragmento Fv de cadeia única (scFv); (ii) um scFv dimérico (di-scFv); ou (iii) pelo menos um de (i) e/ou (ii) ligado a uma região constante de um anticorpo, Fc ou um domínio constante de cadeia pesada (CH) 2 e/ou CH3.

[00040] Em um exemplo, a VL e VH estão em cadeias de polipeptídeos separadas.

[00041] Por exemplo, a proteína é: (i) um diabody; (ii) um triabody; (iii) um tetrabody; (iv) um Fab; (v) um F(ab’)2; (vi) um Fv; ou (vii) um de (i) a (vi) ligado a uma região constante de um anticorpo, Fc ou um domínio constante de cadeia pesada (CH) 2 e/ou CH3.

[00042] As proteínas antecedentes (descritos nas duas listas anteriores) também podem ser referidas como domínios de ligação a antígeno de anticorpos.

[00043] Em um exemplo, a proteína é um anticorpo.Em um exemplo, o anticorpo é um anticorpo nu.

[00044] Em um exemplo, uma proteína é quimérica, desumanizada, humanizada, humana ou primatizada.

[00045] Em um exemplo, a proteína ou anticorpo é humana.

[00046] A presente divulgação adicionalmente ou alternativamente fornece um anticorpo que se liga a hG-CSFR e neutraliza a sinalização de G-CSF, o anticorpo compreendendo: (i) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; (ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 5; (iii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 15 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 14; (iv) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 16; (v) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 17; (vi) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 18; (vii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 20 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 19; (viii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 21; (ix) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 22; (x) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 24 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 23; (xi) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 25; (xii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 26; (xiii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 28 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 27; (xiv) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 29; (xv) i) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 31 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 30; (xvi) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 33 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 32; (xvii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 34; (xviii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 36 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 35; (xix) ) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 38 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 37; (xx) ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 40 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 39; (xxi) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 42 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 41; (xxii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 43; (xxiii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 45 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 44; (xxiv) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 46; (xxv) i) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 47; (xxvi) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 49 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 48; (xxvii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 51 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 50; (xxviii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 53 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 52; (xxix) ) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 54; (xxx) ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 55 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 5; (xxxi) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 57 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 56; (xxxii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 59 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 58; (xxxiii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 61 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 60; (xxxiv) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 62; (xxxv) i) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 63; e (xxxix) uma VH compreendendo três CDRs de uma VH estabelecida em qualquer um ou mais de (i) a (xxxiii) em uma VL compreendendo três CDRs de uma VL estabelecida em qualquer um ou mais de (i) a (xxxiii).

[00047] Sequências de VH e VL exemplares estão descritas na Tabela 3, em que a sequência de CDR3 de VH ou VL recitada é substituída pela sequência correspondente na VH ou VL de C1.2 ou C1.2G como descrito aqui.

[00048] Em um exemplo, a presente divulgação fornece um anticorpo que se liga a hG-CSFR e neutraliza a sinalização de G-CSF, o anticorpo compreendendo: (i) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3; ou (ii) uma VH compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4 em uma VL compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 5.

[00049] A presente divulgação adicionalmente ou alternativamente fornece um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 64 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 65. Em um exemplo, o anticorpo se liga a hG-CSFR e neutraliza a sinalização de G-CSF.

[00050] A presente divulgação adicionalmente ou alternativamente fornece um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 65. Em um exemplo, o anticorpo se liga a hG-CSFR e neutraliza a sinalização de G-CSF.

[00051] A presente divulgação adicionalmente ou alternativamente fornece um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 64 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68 e duas cadeias leves compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 65. Em um exemplo, o anticorpo se liga a hG-CSFR e neutraliza a sinalização de G-CSF.

[00052] A referência aqui a uma proteína ou anticorpo que "se liga a" hG-CSFR fornece suporte literal para uma proteína ou anticorpo que "se liga especificamente a" hG-CSFR.

[00053] Em um exemplo, uma proteína ou anticorpo descrito aqui não se liga significativamente a G-CSFR de camundongo e/ou não se liga de modo detectável a G-CSFR de camundongo.

[00054] Em um exemplo, uma proteína ou anticorpo descrito aqui de acordo com qualquer exemplo inibe competitivamente a ligação de C1.2 e/ou C1.2G a hG-CSFR ou uma célula que expressa o mesmo ou SEQ ID NO: 1 ou um hG-CSFR solúvel (por exemplo, compreendendo aminoácidos 1-311 de SEQ ID NO: 1 fundidos a uma região de Fc de um anticorpo).

[00055] Em um exemplo, uma proteína ou anticorpo descrito aqui se liga a uma região de ligação ao ligante de hG-CSFR e uma região de ligação ao ligante de cynoG-CSFR com afinidade semelhante. Em um exemplo, a proteína se liga a um hG-CSFR solúvel e cynoG-CSFR solúvel com afinidade semelhante. Em um exemplo, a proteína se liga a um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 1 e a um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 67 com afinidade semelhante. Em um exemplo, a proteína se liga a hG-CSFR-Fc e cynoG-CSFR-Fc como descrito aqui com afinidade semelhante. Em um exemplo, a afinidade é pelo menos cerca de 2nM, por exemplo, pelo menos cerca de 1,5nM, tal como pelo menos cerca de 1,2nM, 1,1nM ou 1nM. Em um exemplo, o 0,5nM, tal como, pelo menos cerca de 0,46nM ou 0,45nM ou 0,40nM ou 0,39nM. Em outro exemplo, a afinidade é pelo menos cerca de 0,1nM, tal como pelo menos cerca de 0,09n M, por exemplo, pelo menos cerca de 0,08nM. Em um exemplo, o nível de ligação é avaliado usando um biossensor, por exemplo, por ressonância de plásmons de superfície. Por exemplo, a região de ligação ao ligante ou hG-CSFR solúvel ou cynoG-CSFR solúvel ou hG-CSFR-Fc ou cyno-G-CSFR-Fc é immobilizada e o nível de ligação a uma proteína da divulgação é determinado.

[00056] Em outro exemplo, a proteína da divulgação é imobilizada sobre, por exemplo, um biossensor e o nível de ligação da região de ligação ao ligante ou hG-CSFR solúvel ou cynoG-CSFR solúvel ou hG- CSFR-Fc ou cyno-G-CSFR-Fc é determinado. Por exemplo, o nível de ligação ao domínio extracelular de hG-CSFR ou cynoG-CSFR é determinado. De acordo com este exemplo, a afinidade da proteína para o domínio extracelular de cynoG-CSFR é pelo menos cerca de 1nM, tal como pelo menos cerca de 0,9nM, por exemplo, pelo menos cerca de 0,75nM. Por exemplo, a afinidade é pelo menos cerca de 0,7nM, tal como pelo menos cerca de 0,6nM, por exemplo, pelo menos cerca de 0,5nM. Em um exemplo, a afinidade é cerca de 0,5nM. Alternativamente, ou adicionalmente, a afinidade da proteína para o domínio extracelular de hG-CSFR é pelo menos cerca de 7nM ou 6nM ou 5nM, tal como pelo menos cerca de 4nM, por exemplo, pelo menos cerca de 3nM, por exemplo, pelo menos cerca de 2,5nM. Por exemplo, a afinidade é pelo menos cerca de 2,4 ou 2,5nM.

[00057] A presente divulgação fornece também os domínios de ligação a antígeno ou fragmentos de ligação a antígeno dos anticorpos anteriores.

[00058] Em um exemplo, uma proteína ou anticorpo como descrito aqui compreende uma região constante de um anticorpo de IgG4 ou uma região constante estabilizada de um anticorpo de IgG4. Em um exemplo, a proteína ou anticorpo compreende uma região constante de IgG4 com uma prolina na posição 241 (de acordo com a numeração do sistema de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health e Human Services, 1987 e/ou 1991)).

[00059] A lisina C-terminal da região constante de cadeia pesada de um anticorpo inteiro da divulgação pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou por manipulação de modo recombinante do ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada do anticorpo. Assim, anticorpos inteiros podem compreender populações de anticorpos com todos os resíduos de lisina de C-terminal removidos, as populações de anticorpos com nenhum resíduo de lisina C-terminal removido, e as populações de anticorpos com uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo de lisina C-terminal. Em alguns exemplos, as populações de anticorpo podem compreender, adicionalmente, os anticorpos em que o resíduo de lisina C-terminal é removido de uma das regiões constantes da cadeia pesada. Da mesma forma, uma composição de anticorpos inteiros pode compreender a mesma ou uma mistura semelhante de populações de anticorpo com ou sem o resíduo de lisina C-terminal.

[00060] Em um exemplo, a região constante estabilizada compreende uma sequência da posição 119 para a posição 445 de SEQ ID NO: 64. Em um exemplo, a região constante estabilizada compreende uma sequência da posição 119 para a posição 444 de SEQ ID NO: 68. Em um exemplo, uma proteína ou anticorpo como descrito aqui ou uma composição de uma proteína ou anticorpo como descrito aqui, compreende uma região constante de cadeia pesada, incluindo uma região constante de cadeia pesada estabilizada, compreendendo uma mistura de sequências totalmente ou parcialmente, com ou sem o resíduo de lisina C-terminal.

[00061] Em um exemplo, um anticorpo da divulgação compreende uma VH divulgada aqui ligada ou fundida a uma região constante de IgG4 ou região constante de IgG4 estabilizada (por exemplo, como discutido acima) e uma VL é ligada ou fundida a uma região constante de cadeia leve capa.

[00062] A presente divulgação também fornece uma proteína ou anticorpo que inibe a proliferação induzida por G-CSF de uma célula de BaF3 que expressa hG-CSFR com uma IC50 de pelo menos cerca de 6nM. Por exemplo, a IC50 é de 5,9nM ou menos. Em outro exemplo, a IC50 é de 2nM ou menos ou 1nM ou menos ou 0,7nM ou menos ou 0,6nM ou menos ou 0,5nM ou menos. Em um exemplo, a IC50 é determinada por cultivo de células BaF3 (por exemplo, cerca de células 2x104) na presença de cerca de 0,5ng/ml de hG-CSF, por exemplo, por cerca de 48 horas. Em um exemplo, a proliferação de células BaF3 é determinada por medição de redução de brometo de 3-(4,5- Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT).

[00063] A presente divulgação também fornece uma proteína ou anticorpo que inibe a proliferação induzida por G-CSF de uma célula de BaF3 que expressa hG-CSFR com uma IC50 de pelo menos cerca de 10μg/ml. Por exemplo, a IC50 é 5μg/ml ou menos. Em outro exemplo, a IC50 é 3μg/ml ou menos ou 2μg/ml ou menos ou 1μg/ml ou menos. Em um exemplo, a IC50 é cerca de 0,8μg/ml. Em um exemplo, a IC50 é determinada por cultivo de células BaF3 (por exemplo, cerca de células 1x104) na presença de cerca de 10ng/ml de hG-CSF, por exemplo, por cerca de 48 horas. Em um exemplo, a proliferação de células BaF3 é determinada por medição de incorporação de 3H-timidina.

[00064] Em um exemplo, uma proteína ou anticorpo da divulgação se liga a um hG-CSFR solúvel compreendendo aminoácidos 1-311 de SEQ ID NO: 1 expressos como uma fusão com uma região de Fc de anticorpo (hG-CSFR-Fc) com uma afinidade de pelo menos cerca de 1,5nM. Por exemplo, a afinidade é pelo menos cerca de 0,5nM ou 0,4nM ou 0,35nM ou 0,33nM. Em um exemplo, a afinidade da proteína é determinada usando um biossensor, por exemplo, por ressonância de plásmons de superfície. Por exemplo, o hG-CSFR-Fc é imobilizado e a afinidade da proteína da divulgação é determinada.

[00065] Em um exemplo, uma proteína ou anticorpo da divulgação se liga a hG-CSFR expresso na superfície de uma célula a uma afinidade de pelo menos cerca de 1nM, por exemplo, pelo menos cerca de 0,5nM, tal como, pelo menos 0,4nM, por exemplo, pelo menos 0,3nM, tal como, pelo menos 0,2nM.

[00066] Em um exemplo, uma proteína como descrita aqui de acordo com qualquer exemplo é capaz de reduzir o número de neutrófilos na circulação quando ou se administrada a um macaco cinomolgo. Por exemplo, a proteína reduz o número de neutrófilos na circulação quando ou se administrada a um macaco cinomolgo a uma dose de entre 0,05m/kg-30mg/kg, preferencialmente, entre 0,1mg/kg-10mg/kg, por exemplo, administrada a uma dose de 0,1mg/kg ou 1mg/kg ou 2mg/kg ou 5 mg/kg ou 10mg/kg. Por exemplo, a proteína reduz o número de neutrófilos na circulação quando ou se administrada após a administração de G-CSF ou filgrastim ou uma forma PEGuilada da mesma, por exemplo, quando ou se a proteína é administrada cerca de 12 horas após administração de G-CSF ou filgrastim ou uma forma PEGuilada da mesma. Em um exemplo, a redução é uma redução de 2 vezes ou 3 vezes.Em um exemplo, os neutrófilos são reduzidos cerca de 10-24 horas, por exemplo, cerca de 12 horas após administração.

[00067] Em um exemplo, uma proteína ou anticorpo como descrito aqui é isolada e/ou recombinante.

[00068] Em um exemplo, uma proteína ou anticorpo da divulgação é conjugado a outro composto, por exemplo, uma marcação detectável ou um composto que estende a meia-vida da proteína ou anticorpo, tal como polietileno glicol ou uma albumina que liga a proteína.

[00069] A presente divulgação também fornece um ácido nucleico que codifica a proteína ou anticorpo da presente divulgação.

[00070] Em um exemplo, tal ácido nucleico é incluído em um constructo de expressão no qual o ácido nucleico está operativamente ligado a um promotor. Tal constructo de expressão pode ser um vetor, por exemplo, um plasmídeo.

[00071] Nos exemplos da divulgação dirigida a proteínas de cadeia de polipeptídeos única, o constructo de expressão pode compreender um promotor ligado a um ácido nucleico que codifica essa cadeia de polipeptídeo.

[00072] Nos exemplos dirigidos a várias cadeias de polipeptídeos que formam uma proteína, um constructo de expressão compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende, por exemplo, uma VH operativamente ligada a um promotor e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende, por exemplo, uma VL operativamente ligada a um promotor.

[00073] Em outro exemplo, o constructo de expressão é um constructo de expressão bicistrônico, por exemplo, compreendendo os seguintes componentes operativamente ligados na ordem de 5’ para 3’: (i) um promotor (ii) um ácido nucleico que codifica um primeiro polipeptídeo; (iii) um sítio de entrada de ribossomo interno; e (iv) um ácido nucleico que codifica um segundo polipeptídeo, em que o primeiro polipeptídeo compreende uma VH e o segundo polipeptídeo compreende uma VL, ou vice-versa.

[00074] A presente divulgação também contempla constructos de expressão separada um dos quais codifica um primeiro polipeptídeo compreendendo uma VH e outro dos quais codifica um segundo polipeptídeo compreendendo uma VL. Por exemplo, a presente divulgação também fornece uma composição que compreende: (i) um primeiro constructo de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo uma VH operativamente ligada a um promotor; e (ii) um segundo constructo de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo uma VL operativamente ligada a um promotor.

[00075] A presente divulgação também fornece uma célula recombinante ou isolada que expressa uma proteína da divulgação.

[00076] Em um exemplo, a célula compreende o constructo de expressão da divulgação ou: (i) um primeiro constructo de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo uma VH operativamente ligada a um promotor; e (ii) um segundo constructo de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo compreendendo uma VL operativamente ligada a um promotor.

[00077] Exemplos de células da presente divulgação incluem células bacterianas, células de leveduras, células de insetos ou células de mamíferos.

[00078] A presente descrição fornece adicionalmente métodos para a produção de uma proteína ou anticorpo da divulgação.Por exemplo, esse método envolve a manutenção de constructo(s) de expressão da divulgação em condições suficientes para a proteína a ser produzida.

[00079] Em um exemplo, um método para a produção de uma proteína ou anticorpo da divulgação compreende a cultura da célula da divulgação em condições suficientes para a proteína ou o anticorpo a ser produzido e, opcionalmente, secretada.

[00080] Em um exemplo, o método para a produção de uma proteína da divulgação compreende adicionalmente o isolamento da proteína ou anticorpo e, opcionalmente, a formulação da proteína ou anticorpo em uma composição farmacêutica.

[00081] A presente descrição fornece adicionalmente uma composição compreendendo uma proteína ou anticorpo da divulgação e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00082] A presente divulgação adicionalmente fornece uma composição compreendendo: (i) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 64 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 65; e (ii) (a) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 64 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 65; e/ou (b) um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 64 e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 68 e duas cadeias leves compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 65, e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00083] A presente divulgação também fornece um método para o tratamento ou prevenção de uma condição mediada por G-CSF em um sujeito, o método compreendendo a administração da proteína, anticorpo ou composição da divulgação. A este respeito, uma proteína, anticorpo ou composição pode ser usado para impedir uma recaída de uma condição, e este é considerado como prevenindo a condição.

[00084] Em um exemplo, a condição mediada por G-CSF é uma doença autoimune, uma doença inflamatória ou câncer.Por exemplo, a doença autoimune ou a doença inflamatória é artrite, esclerose múltipla, inflamação pulmonar ou doença pulmonar obstrutiva crônica.

[00085] Em um exemplo, o método compreende a administração de uma quantidade da proteína ou anticorpo suficiente para reduzir o número de neutrófilos em um sujeito sem indução de neutropenia.

[00086] A presente divulgação, em alternativa ou adicionalmente, fornece um método para a redução do número de neutrófilos em um sujeito, sem indução de neutropenia, o método compreendendo a administração de uma proteína que compreende um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo que se liga (ou liga-se especificamente) a hG- CSFR ao sujeito. Uma proteína exemplar é um anticorpo ou compreende um domínio de ligação a antígeno do mesmo (por exemplo, uma VH e/ou VL) ou é um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Exemplos de proteínas e anticorpos são aqui descritos.

[00087] Em um exemplo, um método descrito neste documento compreende a administração de uma quantidade da proteína ou anticorpo suficiente para reduzir o número de neutrófilos em um sujeito, sem indução de neutropenia moderada.

[00088] Em um exemplo, um método descrito neste documento compreende a administração de uma quantidade da proteína ou anticorpo suficiente para reduzir o número de neutrófilos em um sujeito, sem indução de neutropenia grave.

[00089] Em um exemplo, um método descrito neste documento compreende a administração de entre cerca de 0,05mg/kg e 30mg/kg da proteína ou anticorpo. Por exemplo, o método compreendendo a administração de entre 0,1 mg/kg e 10mg/kg ou entre 0,2 mg/kg e 5mg/kg da proteína ou anticorpo. Em um exemplo, o método compreende a administração de cerca de 0,5-2,0mg/kg da proteína ou anticorpo.

[00090] A presente divulgação também fornece o uso de uma proteína ou anticorpo como aqui descrito em qualquer exemplo em medicina.

[00091] A presente divulgação também fornece o uso de uma proteína ou anticorpo como aqui descrito, de acordo com qualquer exemplo na fabricação de um medicamento para tratar uma condição mediada por G-CSF.

[00092] A presente divulgação também fornece um método para a localização e/ou detecção e/ou diagnóstico e/ou prognóstico mediado de uma condição mediada por G-CSF associada com uma célula expressando G-CSFR, o método compreendendo a detecção in vivo de uma proteína ou anticorpo como aqui descrito, ligada à célula expressando G-CSFR, se estiver presente, em que a proteína ou anticorpo é conjugado com uma marcação detectável.

[00093] Em um exemplo, o método compreende adicionalmente a administração da proteína ao sujeito.

[00094] A presente divulgação também fornece um método para a detecção de G-CSFR ou uma célula que expressa o mesmo em uma amostra, o método compreendendo o contato da amostra com uma proteína ou anticorpo como aqui descrito, de acordo com qualquer exemplo de tal modo que um complexo se forma e detecta o complexo, em que a detecção do complexo é indicativa de G-CSFR, ou uma célula que expressa o mesmo na amostra.

[00095] A presente divulgação também fornece um método para o diagnóstico ou prognóstico de uma condição mediada por G-CSF, o método compreendendo a realização de um método tal como aqui descrito de acordo com qualquer exemplo para detectar G-CSFR, ou uma célula que expressa o mesmo, em que a detecção do G-CSFR ou célula expressando o mesmo é um diagnóstico ou prognóstico da condição.

[00096] A presente divulgação também fornece um kit que compreende uma proteína ou anticorpo tal como aqui descrito de acordo com qualquer exemplo embalado com instruções para uso em um método, tal como aqui descrito. LEGENDA PARA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 - aminoácidos 25-335 de Homo sapiens G- CSFR (hG-CSFR) com uma marcação de poli-histidina C-terminal SEQ ID NO: 2 - VH de C1.2 SEQ ID NO: 3 - VL de C1.2 SEQ ID NO: 4 - VH de C1.2G SEQ ID NO: 5 - VL de C1.2G SEQ ID NO: 6-HCDR1 de C1.2 SEQ ID NO: 7-HCDR2 de C1.2 SEQ ID NO: 8-HCDR3 de C1.2 SEQ ID NO: 9-LCDR1 de C1.2 SEQ ID NO: 10-LCDR2 de C1.2 SEQ ID NO: 11-LCDR3 de C1.2 SEQ ID NO: 12 - sequência de consenso de HCDR3 de C1.2 SEQ ID NO: 13 - sequência de consenso de LCDR3 de C1.2 SEQ ID NO: 14 - VL de anticorpo 987 SEQ ID NO: 15 - VH de anticorpo 987 SEQ ID NO: 16 - VL de anticorpo 95 SEQ ID NO: 17 - VL de anticorpo 79 SEQ ID NO: 18 - VL de anticorpo 83 SEQ ID NO: 19 - VL de anticorpo 1003 SEQ ID NO: 20 - VH de anticorpo 1003 SEQ ID NO: 21 - VL de anticorpo 44 SEQ ID NO: 22 - VL de anticorpo 97 SEQ ID NO: 23 - VL de anticorpo 986 SEQ ID NO: 24 - VH de anticorpo 986 SEQ ID NO: 25 - VL de anticorpo 56 SEQ ID NO: 26 - VL de anticorpo 77 SEQ ID NO: 27 - VL de anticorpo 54 SEQ ID NO: 28 - VH de anticorpo 54 SEQ ID NO: 29 - VL de anticorpo 802 SEQ ID NO: 30 - VL de anticorpo 967 SEQ ID NO: 31 - VH de anticorpo 967 SEQ ID NO: 32 - VL de anticorpo 989 SEQ ID NO: 33 - VH de anticorpo 989 SEQ ID NO: 34 - VL de anticorpo 63 SEQ ID NO: 35 - VL de anticorpo 1002 SEQ ID NO: 36 - VH de anticorpo 1002 SEQ ID NO: 37 - VL de anticorpo 994 SEQ ID NO: 38 - VH de anticorpo 994 SEQ ID NO: 39-VL de anticorpo 969 SEQ ID NO: 40 - VH de anticorpo 969 SEQ ID NO: 41 - VL de anticorpo 1000 SEQ ID NO: 42 - VH de anticorpo 1000 SEQ ID NO: 43 - VL de anticorpo 94 SEQ ID NO: 44 - VL de anticorpo 975 SEQ ID NO: 45 - VH de anticorpo 975 SEQ ID NO: 46 - VL de anticorpo 75 SEQ ID NO: 47 - VL de anticorpo 814 SEQ ID NO: 48 - VL de anticorpo 973 SEQ ID NO: 49 - VH de anticorpo 973 SEQ ID NO: 50 - VL de anticorpo 977 SEQ ID NO: 51 - VH de anticorpo 977 SEQ ID NO: 52 - VL de anticorpo 984 SEQ ID NO: 53 - VH de anticorpo 984 SEQ ID NO: 54 - VL de anticorpo 61 SEQ ID NO: 55 - VH de anticorpo 852 SEQ ID NO: 56 - VL de anticorpo 996 SEQ ID NO: 57 - VH de anticorpo 996 SEQ ID NO: 58 - VL de anticorpo 43 SEQ ID NO: 59 - VH de anticorpo 43 SEQ ID NO: 60 - VL de anticorpo 999 SEQ ID NO: 61 - VH de anticorpo 999 SEQ ID NO: 62 - VL de anticorpo 870 SEQ ID NO: 63 - VL de anticorpo 877 SEQ ID NO: 64 - Cadeia pesada de C1.2G com a região constante de IgG4 estabilizada SEQ ID NO: 65 - Cadeia leve de C1.2G com região constante capa SEQ ID NO: 66 - sequência de h-GCSFR exemplar SEQ ID NO: 67 - polipeptídeo compreendendo domínios de Ig e CRH de Macaca fascicularis G-CSFR (cynoG-CSFR) com uma marcação de poli-histidina C-terminal SEQ ID NO: 68 - Cadeia pesada de C1.2G com a região constante de IgG4 estabilizada e sem lisina C-terminal.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00097] A Figura 1 é uma representação gráfica que mostra a inibição da proliferação mediada por G-CSF de células BaF3, aumentando as concentrações de vários anticorpos anti-G-CSFR. Os valores de IC50 relativos para cada um dos anticorpos foram; 10,1μg/mL para mAb711, 37,4μg/ml para o mAb 774, 0,8μg/mL para C1.2G e não foi determinável para o mAb 744.

[00098] A Figura 2A é uma representação gráfica que mostra a ligação relativa de C1.2G e mAb744 a uma série de mutantes pontuais de alanina de SEQ ID NO: 1 em comparação com a sua ligação a SEQ ID NO: 1 (posições das mutações são indicadas com referência a SEQ ID NO: 1). As vezes de diminuição em KD do anticorpo para o receptor mutante em comparação com a SEQ ID NO: 1 é mostrada.

[00099] A Figura 2B é uma representação gráfica que mostra a ligação relativa de C1.2G, mAb744 e mAb774 a uma série de mutantes pontuais de alanina de SEQ ID NO: 1 em comparação com a sua ligação a SEQ ID NO: 1 (posições das mutações são indicadas com referência a SEQ ID NO: 1). As vezes de diminuição em KD do anticorpo para o receptor mutante em comparação com a SEQ ID NO: 1 é mostrada.

[000100] A Figura 3 é uma representação gráfica que mostra resultados de um ensaio em que o G-CSF peguilado foi administrado a macacos cinomolgos e um dia mais tarde, C1.2 foi administrado. O número de neutrófilos por mL de sangue foi avaliado.

DESCRIÇÃO DETALHADA Geral

[000101] Ao longo deste relatório descritivo, a menos que especificamente indicado de outro modo ou que o contexto exija de outra forma, uma referência a uma única etapa, a composição de matéria, grupo de etapas ou grupo de composições de matéria será feita para abranger uma e uma pluralidade (isto é, uma ou mais) daquelas etapas, composições da matéria, grupos de etapas ou grupos de composições da matéria.

[000102] Os versados na técnica irão apreciar que a presente descrição é suscetível a variações e modificações diferentes das especificamente descritas. Deve ser entendido que a divulgação inclui todas essas variações e modificações.A divulgação também inclui todas as etapas, características, composições e compostos referidos ou indicados neste relatório descritivo, individualmente ou coletivamente, e quaisquer e todas as combinações ou qualquer duas ou mais das referidas etapas ou características.

[000103] A presente divulgação não deve ser limitada no seu escopo pelos exemplos específicos aqui descritos, os quais são destinados para fins de exemplificação apenas. Produtos funcionalmente equivalentes, composições e métodos estão claramente dentro do escopo da presente divulgação.

[000104] Qualquer exemplo da presente divulgação aqui deve ser tomado para aplicar, mutatis mutandis, a qualquer outro exemplo de divulgação, a menos que especificamente indicado de outra forma.

[000105] A menos que especificamente definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados devem ser tomados para ter o mesmo significado como vulgarmente entendido por um vulgar versado na técnica (por exemplo, em cultura de células, genética molecular, imunologia, imuno-histoquímica, química das proteínas, e bioquímica).

[000106] A menos que indicado de outra forma, a proteína recombinante, cultura de células, e técnicas imunológicas usadas na presente descrição são os procedimentos padrões, bem conhecidas dos versados na técnica. Tais técnicas são descritas e explicadas em toda a literatura em fontes tais como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 e 2, IRL Press (1991), D.M. Glover e B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), e F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o presente), Ed Harlow e David Lane (editors) Anticorpoies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), e J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até o presente).

[000107] A descrição e as definições de regiões variáveis e partes dos mesmos, imunoglobulinas, anticorpos e fragmentos dos mesmos aqui podem ser melhor esclarecidas pela discussão em Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991, Bork et al., J Mol. Biol. 242, 309-320, 1994, Chothia e Lesk J. Mol Biol. 196:901 -917, 1987, Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989 e/ou Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927948, 1997.

[000108] O termo "e/ou", por exemplo, "X e/ou Y" deve ser entendido como qualquer "X e Y" ou "X ou Y", e devem ser tomados para fornecer suporte explícito para ambos os significados ou para qualquer significado.

[000109] Ao longo deste relatório descritivo, a palavra "compreendem", ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um elemento indicado, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas.

[000110] Tal como aqui usado o termo "derivado de" deve ser usado para indicar que um determinado número inteiro pode ser obtido a partir de uma fonte particular, embora não necessariamente, diretamente a partir dessa fonte.

Definições Selecionadas

[000111] Para os fins de nomenclatura apenas e não limitação de uma sequência exemplar de um G-CSFR humano é estabelecida na sequência de referência NCBI: NP_000751.1 (e estabelecida nas SEQ ID NO: 66). A sequência de G-CSFR de macaco cinomolgos pode ser determinada usando sequências aqui e/ou em bancos de dados publicamente disponíveis e/ou determinadas usando técnicas convencionais (por exemplo, tal como descrito em Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o presente) ou Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). A referência para o G-CSFR humano pode ser abreviado para hG-CSFR e referência a G-CSFR de macaco cinomolgo pode ser abreviada para cynoG-CSFR.Referência à G-CSFR solúvel refere-se a polipeptídeos que compreendem a região de ligação ao ligante de G-CSFR. Os domínios de Ig e CRH de G-CSFR estão envolvidos na ligação ao ligante e dimerização de receptor (Layton et al., J. Biol Chem., 272: 29735-29741, 1997 e Fukunaga et al, EMBO J. 10: 2855-2865, 1991). As formas solúveis de G-CSFR compreendendo estas porções do receptor têm sido usadas em vários estudos do receptor e mutação de cisteína livre nas posições 78, 163, e 228 dos receptores auxiliam na expressão e isolamento do polipeptídeo de receptor solúvel (Mine et al., Biochem., 43: 2458-2464 2004), sem afetar a ligação ao ligante. Nos presentes estudos as formas solúveis do receptor que compreendem os aminoácidos 25-335 de hG-CSFR com mutações C78A, C163S e C228S foram usadas (por exemplo, SEQ ID NO: 1) e foi usado o segmento correspondente de cynoG-CSFR com as mutações de cisteína (por exemplo, SEQ ID NO 67) para estudos sobre o receptor de macaco cinomolgo. Várias mutações pontuais do receptor solúvel de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 67 também foram usadas. Referência a hG-CSFR-Fc significa o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a marcação de poli-histidina C-terminal foi substituída por uma sequência de Fc (por exemplo, um polipeptídeo que compreende os aminoácidos 1-311 de SEQ ID NO: 1 fundidos com um Fc). cynoG-CSFR-Fc significa o segmento correspondente de cynoG-CSFR com uma sequência de Fc ligada ao seu C-terminal (por exemplo, um polipeptídeo que compreende os aminoácidos 1-311 de SEQ ID NO: 67 fundidos a um Fc). Os inventores demonstraram que os anticorpos e as proteínas que compreendem os sítios de ligação a antígeno dos mesmos (por exemplo, Fab) ligam-se aos polipeptídeos de hG-CSF do tipo selvagem e a estas proteínas mutantes com afinidade muito semelhante. Deste modo, os estudos que utilizam as proteínas mutantes são um modelo de estudos usando hG-CSFR e/ou cynoG-CSFR.

[000112] A referência aqui a G-CSF inclui formas nativas de G-CSF, formas mutantes dos mesmos, por exemplo, o filgrastim e formas PEGiladas de G-CSF ou filgrastim.Este termo também abrange as formas mutantes de atividade de retenção de G-CSF para se ligar a G- CSFR (por exemplo, hG-CSFR) e induzir a sinalização.

[000113] O termo "proteína isolada" ou "polipeptídeo isolado" é uma proteína ou polipeptídeo que, em virtude da sua origem ou fonte de derivação não está associado com os componentes naturalmente associados, que o acompanham no seu estado nativo; é substancialmente isento de outras proteínas a partir da mesma fonte. Uma proteína pode ser tornada substancialmente isenta de componentes naturalmente associados ou substancialmente purificada por isolamento, usando técnicas de purificação de proteínas conhecidas na técnica. Por "substancialmente purificado" entende-se a proteína que é substancialmente isenta de agentes contaminantes, por exemplo, pelo menos cerca de 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 96% ou 97% ou 98% ou 99% livre de agentes contaminantes.

[000114] O termo "recombinante" deve ser entendido como o produto de recombinação genética artificial. Por conseguinte, no contexto de uma proteína recombinante que compreende um domínio de ligação a antígeno de anticorpo, este termo não abrange um anticorpo que ocorre naturalmente no interior do corpo de um sujeito que é o produto de recombinação natural que ocorre durante a maturação de células B. No entanto, se tal anticorpo é isolado, o mesmo deve ser considerado uma proteína isolada que compreende um domínio de ligação a antígeno do anticorpo. De modo semelhante, se o ácido nucleico que codifica a proteína é isolado e expresso usando meios recombinantes, a proteína resultante é uma proteína recombinante que compreende um domínio de ligação a antígeno do anticorpo. Uma proteína recombinante também abrange uma proteína expressa por meios recombinantes artificiais, quando estiver dentro de uma célula, tecido ou sujeito, por exemplo, em que é expressa.

[000115] O termo "proteína" deve ser tomado para incluir uma cadeia de polipeptídeos simples, isto é, uma série de aminoácidos contíguos ligados por ligações peptídicas ou uma série de cadeias de polipeptídeos ligadas covalentemente ou não covalentemente umas às outras (isto é, um complexo de polipeptídeo). Por exemplo, a série de cadeias de polipeptídeos pode ser ligada covalentemente usando um produto químico apropriado ou uma ligação de dissulfeto. Exemplos de ligações não covalentes incluem ligações de hidrogênio, ligações iônicas, forças de Van der Waals e interações hidrofóbicas.

[000116] O termo "polipeptídeo" ou "cadeia de polipeptídeo" será compreendido a partir do parágrafo anterior para significar uma série de aminoácidos contíguos ligados por ligações peptídicas.

[000117] Tal como aqui usado, o termo "sítio de ligação a antígeno" é tomado para significar uma estrutura formada por uma proteína que é capaz de se ligar ou especificamente se ligar a antígeno. O sítio de ligação a antígeno não necessita de ser uma série de aminoácidos contíguos, ou mesmo aminoácidos em uma cadeia de polipeptídeos simples. Por exemplo, em um Fv produzido a partir de duas cadeias de polipeptídeos diferentes do sítio de ligação a antígeno é constituído por uma série de aminoácidos de uma VL e VH que interagem com o antígeno e que estão geralmente, no entanto, nem sempre em um ou mais das CDRs em cada região variável. Em alguns exemplos, um sítio de ligação a antígeno é uma VH ou VL ou um Fv.

[000118] O versado na técnica estará ciente de que um "anticorpo" é geralmente considerado como sendo uma proteína que compreende uma região variável constituída por uma pluralidade de cadeias de polipeptídeos, por exemplo, um polipeptídeo que compreende uma VL e um polipeptídeo que compreende uma VH. Um anticorpo também compreende, geralmente, os domínios constantes, alguns dos quais podem ser dispostos em uma região constante, que inclui um fragmento constante ou fragmento cristalizável (Fc), no caso de uma cadeia pesada. Uma VH e uma VL interagem para formar um Fv compreendendo uma região de ligação do antígeno que é capaz de se ligar especificamente a um ou a alguns antígenos estreitamente relacionados. Geralmente, uma cadeia leve a partir de mamíferos é ou uma cadeia leve K ou uma cadeia leve À e uma cadeia pesada de mamíferos é α, δ, ε, Y, ou μ. Os anticorpos podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse. O termo "anticorpo" também engloba os anticorpos humanizados, anticorpos primatizados, anticorpos humanos e anticorpos quiméricos.

[000119] Os termos "anticorpo de comprimento completo", "anticorpo intacto" ou "anticorpo inteiro" são usados indiferentemente para se referir a um anticorpo na sua forma substancialmente intacta, em oposição a um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo. Especificamente, os anticorpos inteiros incluem aqueles com cadeias pesadas e leves, incluindo uma região de Fc. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequências do tipo selvagem (por exemplo, domínios constantes de sequência do tipo selvagem humana) ou variantes de sequência de aminoácido dos mesmos.

[000120] Tal como aqui usado, "região variável" refere-se às porções de cadeias leve e/ou pesada de um anticorpo, tal como aqui definido, que são capazes de se ligar especificamente a um antígeno e incluem sequências de aminoácidos das regiões determinantes de complementaridade (CDRs), isto é, CDR1, CDR2, e CDR3, e regiões de estrutura (FRs). As regiões variáveis exemplares compreendem três ou quatro FRs (por exemplo, FR1, FR2, FR3 e, opcionalmente, FR4), em conjunto com três CDRs. No caso de uma proteína derivada de um IgNAR, a proteína pode não apresentar uma CDR2. VH refere-se à região variável de cadeia pesada.VL refere-se à região variável de cadeia leve.

[000121] Tal como aqui usado, o termo "regiões determinantes de complementaridade" (sin. CDRs; isto é, CDR1, CDR2, e CDR3) refere- se aos resíduos de aminoácidos de uma região variável do anticorpo na presença das quais sendo necessárias para a ligação a antígeno. Cada região variável normalmente tem três regiões CDR identificadas como CDR1, CDR2 e CDR3. As posições de aminoácidos atribuídas às CDRs e FRs podem ser definidas de acordo com Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 e 1991, ou outros sistemas de numeração no desempenho da presente divulgação, por exemplo, o sistema de numeração canónica de Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989; e/ou Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273: 927948, 1997; o sistema de numeração de IMGT de Lefranc et al., Devel. And Compar. Immunol., 27: 55-77, 2003; ou o sistema de numeração AHO de Honnegher and Plükthun J. Mol. Biol., 309: 657-670, 2001. Por exemplo, de acordo com o sistema de numeração de Kabat, as regiões de estrutura VH (FRs) e CDRs estão posicionadas como se segue: resíduos 1-30 (FRl), 31-35 (CDR1), 36-49 (FR2), 50-65 (CDR2), 66-94 (FR3), 95-102 (CDR3) e 103- 113 (FR4). De acordo com o sistema de numeração de Kabat, VL FRs e CDRs são posicionados da seguinte forma: resíduos 1-23 (FRl), 24-34 (CDR1), 35-49 (FR2), 50-56 (CDR2), 57-88 (FR3), 89-97 (CDR3) e 98-107 (FR4). A presente divulgação não se limita a FRs e CDRs, tal como definido pelo sistema de numeração de Kabat, mas inclui todos os sistemas de numeração, incluindo aqueles discutidos acima. Em um exemplo, a referência aqui a uma CDR (ou uma FR) é em relação a essas regiões de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[000122] As "regiões de estrutura" (FRs) são os resíduos da região variável diferentes dos resíduos de CDR.

[000123] Tal como aqui usado, o termo "Fv" deve ser tomado para significar qualquer proteína, quer compreendido por múltiplos polipeptídeos ou um único polipeptídeo, em que uma VL e uma VH se associam e formam um complexo com um sítio de ligação a antígeno, isto é, capaz de se ligar especificamente a um antígeno. A VH e VL, que formam o sítio de ligação a antígeno pode ser uma cadeia de polipeptídeos simples ou em diferentes cadeias de polipeptídeos. Além disso, um Fv da divulgação (bem como qualquer proteína da divulgação) pode ter vários sítios de ligação a antígeno que podem ou não se ligar ao mesmo antígeno. Este termo deve ser entendido para abranger fragmentos diretamente derivados a partir de um anticorpo, bem como as proteínas correspondentes a tal fragmento produzidas usando meios recombinantes. Em alguns exemplos, a VH não está ligada a um domínio constante de cadeia pesada (CH) 1 e/ou uma VL não está ligada a um domínio constante de cadeia leve (CL). Fv exemplar contendo polipeptídeos ou proteínas incluem um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab'), um scFv, um diabody, um triabody, um tetrabody ou complexo de ordem superior, ou qualquer um dos anteriores ligados a uma região constante ou domínio dos mesmos, por exemplo, domínio CH2 ou CH3, por exemplo, um minibody. Um "fragmento Fab" consiste em um fragmento de ligação a antígeno monovalente de uma imunoglobulina, e pode ser produzido por digestão do anticorpo inteiro com a enzima papaína, para originar um fragmento consistindo em uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada ou pode ser produzido através de meios recombinantes. Um "fragmento Fab'" de um anticorpo pode ser obtido por tratamento de um anticorpo inteiro com pepsina, seguido de redução, para produzir uma molécula consistindo em uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada que compreende uma VH e um único domínio constante.Dois fragmentos Fab' são obtidos por anticorpo tratados desta maneira.Um fragmento Fab’ também pode ser produzido por meios recombinantes. Um fragmento "F(ab’)2" de um anticorpo consiste em um dímero de dois fragmentos Fab' mantidos juntos através de duas ligações de dissulfeto, e é obtido por tratamento de uma molécula de anticorpo inteiro com a enzima pepsina, sem redução subsequente. Um fragmento "Fab2" é um fragmento recombinante que compreende dois fragmentos Fab ligados usando, por exemplo, um ziper de leucina ou um domínio CH3. Um "Fv de cadeia simples" ou "scFv" é uma molécula recombinante que contém o fragmento da região variável (Fv) de um anticorpo em que a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada estão covalentemente ligadas por um ligante de polipeptídeo flexível, adequado.

[000124] Tal como aqui usado, o termo "liga-se", em referência à interação de uma proteína ou um sítio de ligação a antígeno, com um antígeno significa que a interação é dependente da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante antigênico ou epitopo) no antígeno. Por exemplo, um anticorpo reconhece e liga-se a uma estrutura de proteína específica, em vez de proteínas em geral. Se um anticorpo liga-se ao epitopo "A", a presença de uma molécula contendo o epitopo "A" (ou "A" livre, não marcado), em uma reação contendo "A" marcado e a proteína, irá reduzir a quantidade de "A" marcado ligada ao anticorpo.

[000125] Tal como aqui usado, o termo "liga-se especificamente" ou "se liga especificamente" deve ser entendido no sentido de que uma proteína da divulgação reage ou se associa mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com um antígeno particular ou célula expressando o mesmo que ele faz com células ou antígenos alternativos. Por exemplo, uma proteína se liga a G-CSFR (por exemplo, o hG-CSFR) com afinidade substancialmente maior (por exemplo, 20 vezes ou 40 vezes ou 60 vezes ou 80 vezes a 100 vezes ou 150 vezes ou 200 vezes) do que a outro receptor de citocina ou a antígenos normalmente reconhecidos por anticorpos naturais polirreativos (isto é, por meio de anticorpos de ocorrência natural conhecidos por se ligarem a uma variedade de antígenos encontrados naturalmente no em humanos). Em um exemplo da presente divulgação, uma proteína que "se liga especificamente" a uma das formas de hG-CSFR ou um polipeptídeo compreendendo uma região do mesmo (por exemplo, o domínio de ligação a ligante de hG- GCSFR) ou um polipeptídeo que compreende os aminoácidos 1-311 de SEQ ID NO: 1 com uma afinidade pelo menos 20 vezes ou 40 vezes ou 60 vezes ou 80 vezes ou 100 vezes ou 150 vezes ou 200 vezes maior do que para uma forma mutante de hG-CSFR ou um polipeptídeo compreendendo uma região do mesmo (por exemplo, uma forma mutante do domínio de ligação a ligante de h-GCSFR) ou uma forma mutante de SEQ ID NO: 1, compreendendo uma alanina substituída pela arginina natural na posição 287. As alterações adicionais exemplares para SEQ ID NO: 1 e os seus efeitos sobre a ligação são descritos aqui. Geralmente, mas não necessariamente, referência à ligação significa ligação específica, e cada termo deve ser entendido para fornecer suporte explícito para o outro termo.

[000126] Tal como aqui usado, o termo "não se liga de forma detectável" deve ser entendido no sentido de que uma proteína, por exemplo, um anticorpo, se liga a um antígeno candidato a um nível inferior a 10%, ou 8% ou 6%, ou 5% acima do fundo. O fundo pode ser o nível de sinal de ligação detectado na ausência de proteína e/ou na presença de uma proteína de controle negativo (por exemplo, um anticorpo de controle de isotipo) e/ou o nível de ligação detectado na presença de um antígeno de controle negativo. O nível de ligação é detectado usando a análise de biossensor (por exemplo, Biacore) em que a proteína é imobilizada e está em contato com um antígeno.

[000127] Tal como aqui usado, o termo "não se liga de forma significativa" deve ser entendido para significar que o nível de ligação de uma proteína da divulgação de um polipeptídeo não é estatisticamente significativamente mais elevado do que o fundo, por exemplo, o nível de sinal de ligação detectado na ausência da proteína e/ou na presença de uma proteína de controle negativo (por exemplo, um anticorpo de controle de isotipo) e/ou o nível de ligação detectado na presença de um polipeptídeo de controle negativo. O nível de ligação é detectado através de análise de biossensores (por exemplo, Biacore) em que a proteína está imobilizada e está em contato com um antígeno.

[000128] Tal como aqui usado, frases relacionadas com "ligação reduzida" ou "ligação estando a um nível mais baixo" em relação a um antígeno serão entendidas para significar que um anticorpo se liga a um antígeno (por exemplo, um mutante pontual de alanina de SEQ ID NO: 1 em qualquer uma das posições 287, 237, 198, 172, 171 ou 111) com uma afinidade pelo menos cerca de 20 vezes ou 40 vezes ou 60 vezes menor do que um epitopo ou antígeno de controle (por exemplo, SEQ ID NO: 1). Por exemplo, uma proteína da presente divulgação pode ligar-se a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela histidina na posição 237 com um nível de 20 vezes ou 40 vezes ou 60 vezes menor do que se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Preferencialmente, a proteína liga-se a um nível de 20 vezes menos, mais preferencialmente, 40 vezes menos, ainda mais preferencialmente, 60 vezes menos.

[000129] Uma proteína ou anticorpo pode ser considerado como "se ligando preferencialmente" a um polipeptídeo se a mesma se liga a esse polipeptídeo com uma constante de dissociação (KD) que é menor do que a KD da proteína ou do anticorpo para o outro polipeptídeo. Em um exemplo, uma proteína ou um anticorpo é considerado como se ligando preferencialmente a um polipeptídeo se a mesma se liga ao polipeptídeo com uma afinidade (isto é, KD), que é pelo menos cerca de 20 vezes ou 40 vezes ou 60 vezes ou 80 vezes ou 100 vezes ou 120 vezes ou 140 vezes ou 160 vezes mais do que a KD da proteína ou do anticorpo para outro polipeptídeo.

[000130] Tal como aqui usado, o termo "afinidade semelhante" será entendido como significando que uma proteína da presente divulgação se liga a dois antígenos (por exemplo, o domínio de ligação a ligante de G-CSFR de humanos e de macacos cinomolgos) com afinidades que estão dentro de cerca 5 vezes ou menos um do outro, por exemplo, dentro de cerca de 4, 3, 2, ou 1 vez um do outro, tal como, dentro de cerca de 0,5 vezes superior um do outro, ou os níveis de ligação são substancialmente idênticos, por exemplo, quando a afinidade é avaliada por meio da imobilização dos dois antígenos (por exemplo, o domínio de ligação a ligante de G-CSFR ou domínios extracelulares de humanos e de macacos cinomolgos) e contato das proteínas imobilizadas com uma proteína da presente divulgação.

[000131] Para fins de esclarecimento e, como será evidente para o versado na técnica com base na matéria em questão aqui exemplificada, a referência à "afinidade" no presente relatório descritivo é uma referência para KD de uma proteína ou um anticorpo.

[000132] Para fins de esclarecimento e, como será evidente para o versado na técnica com base na descrição aqui contida, a referência a uma "afinidade de pelo menos cerca de" será entendida para significar que a afinidade (ou KD) é igual ao valor recitado ou maior (ou seja, o valor recitado como a afinidade é menor), ou seja, uma afinidade de 2 nM é maior do que uma afinidade de 3 nM. Dito de outra maneira, este termo pode ser "uma afinidade de X ou menor", em que X é um valor aqui descrito.

[000133] Uma "IC50 de pelo menos cerca de" será entendida como significando que a IC50 é igual ao valor recitado ou maior (ou seja, o valor recitado como a IC50 é menor), ou seja, uma IC50 de 2 nM é superior a um valor de IC50 de 3nM. Dito de outra maneira, este termo pode ser "uma IC50 de X ou menos", onde X é um valor aqui descrito.

[000134] Tal como aqui usado, o termo "epitopo" (syn. "determinante antigênico") deve ser entendido para significar uma região de hG-CSFR a qual uma proteína que compreende um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo se liga. Este termo não é necessariamente limitado aos resíduos específicos ou estrutura a qual a proteína entra em contato. Por exemplo, este termo inclui a região que abrange os aminoácidos contatados pela proteína e/ou 5-10 ou 2-5 ou 1-3 aminoácidos fora desta região. Em alguns exemplos, o epitopo compreende uma série de aminoácidos descontínuos que são posicionados perto um do outro quando o hG-CSFR é dobrada, isto é, um "epitopo conformacional". Por exemplo, um epitopo conformacional compreende os aminoácidos em uma ou mais ou duas ou mais ou todas as regiões correspondentes a 111-115, 170-176, 218-234 e/ou 286-300 da SEQ ID NO: 1. O versado na técnica irá também estar ciente de que o termo "epitopo" não se limita a peptídeos ou polipeptídeos. Por exemplo, o termo "epitopo" inclui grupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como as cadeias laterais de açúcar, cadeias laterais de fosforil, ou cadeias laterais de sulfonil e, em certos exemplos, pode ter características estruturais tridimensionais específicas, e/ou características de carga específicas.

[000135] O termo "inibe competitivamente" deve ser entendido no sentido de que uma proteína da divulgação (ou um sítio de ligação a antígeno) reduz ou previne a ligação de um anticorpo ou proteína recitado a G-CSFR, por exemplo, a hG-CSFR. Isto pode ser devido à proteína (ou sítio de ligação a antígeno) e a ligação do anticorpo para o mesmo ou um epitopo de sobreposição. Será evidente a partir do que precede que a proteína não precisa inibir completamente a ligação do anticorpo, em vez disso, apenas é necessário reduzir a ligação por um valor estatisticamente significativo, por exemplo, por, pelo menos, cerca de 10% ou 20% ou 30% ou 40% ou 50% ou 60% ou 70% ou 80% ou 90% ou 95%. Preferencialmente, a proteína reduz a ligação do anticorpo em pelo menos cerca de 30%, mais preferencialmente, em pelo menos cerca de 50%, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 70%, ainda mais preferencialmente, pelo menos cerca de 75%, ainda mais preferencialmente, pelo pelo menos cerca de 80% ou 85% e ainda mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90%. Os métodos para a determinação da inibição competitiva de ligação são conhecidos na técnica e/ou aqui descritos. Por exemplo, o anticorpo é exposto a G- CSFR, quer na presença ou na ausência da proteína. Se menos anticorpo se liga na presença da proteína do que na ausência da proteína, a proteína é considerada como inibindo competitivamente a ligação do anticorpo. Em um exemplo, a inibição competitiva não é devido ao impedimento estérico.

[000136] "Sobreposição" no contexto de dois epitopos deve ser tomado para significar que dois epitopos compartilham um número suficiente de resíduos de aminoácidos para permitir que uma proteína (ou sítio de ligação a antígeno da mesma) que se liga a um epitopo iniba competitivamente a ligação de uma proteína (ou sítio de ligação a antígeno) que se liga ao outro epitopo. Por exemplo, os epitopos de "sobreposição" compartilham, pelo menos, 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8 ou 9 ou 20 aminoácidos.

[000137] Tal como aqui usado, o termo "neutralizar" deve ser entendida no sentido de que uma proteína é capaz de bloquear, reduzir ou prevenir a sinalização mediada por G-CSF em uma célula através de G-CSFR. Os métodos para a determinação de neutralização são conhecidos na técnica e/ou aqui descritos.

[000138] Tal como aqui usado, o termo "condição" refere-se a uma perturbação ou interferência com a função normal, e não deve ser limitado a qualquer condição específica, e irá incluir doenças ou distúrbios.

[000139] Tal como aqui usado, uma "condição associada a G-CSF" refere-se a qualquer condição que é causada por, ou associada a neutrófilos, um excesso de G-CSF ou células que expressam G-CSFR, ou com a administração de G-CSF. O versado na técnica será prontamente capaz de determinar estas condições. A esterespeito, em alguns exemplos, a condição é uma condição inflamatória, uma condição autoimune ou câncer (incluindo metástase).

[000140] Tal como aqui usado, os termos "prevenindo", "prevenir" ou "prevenção" inclui a administração de uma proteína da divulgação para, assim, parar ou impedir o desenvolvimento de, pelo menos, um sintoma de uma condiçãoa. Este termo também abrange o tratamento de um sujeito na remissão para prevenir ou dificultar a recaída. Por exemplo, um sujeito que sofre de esclerose múltipla recorrente-remitente é tratado durante a remissão para, assim, evitar uma recaída.

[000141] Tal como aqui usado, os termos "tratando", "tratar" ou "tratamento" incluem a administração de uma proteína aqui descrita para, desse modo, reduzir ou eliminar pelo menos um sintoma de uma doença ou condição especificada.

[000142] Tal como aqui usado, o termo "neutropenia" será entendido para abranger neutropenia suave (1000 <= ANC < 1500), neutropenia moderada (500 <= ANC < 1000) e neutropenia grave (ANC < 500) (contagem absoluta de neutrófilos (ANC) medida em células por microlitro de sangue).

[000143] Tal como aqui usado, o termo "sujeito" deve ser tomado para significar qualquer animal, incluindo os humanos, por exemplo, um mamífero. Sujeitos exemplares incluem, mas não estão limitados a, humanos e primatas não humanos.Por exemplo, o sujeito é um humano.

Anticorpos

[000144] Em um exemplo, uma proteína, tal como descrito aqui de acordo com qualquer exemplo, é um anticorpo.

[000145] Os métodos para a geração de anticorpos são conhecidos na técnica e/ou descritos em Harlow and Lane (editors) Anticorpoies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988). Geralmente, em tais métodos G-CSFR (por exemplo, hG-CSFR) ou uma região do mesmo (por exemplo, um domínio extracelular) ou um fragmento imunogênico ou epitopo do mesmo, ou uma célula que expressa e exibe o mesmo (ou seja, um imunogene), opcionalmente, formulado com qualquer veículo apropriado ou desejado, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente aceitável, é administrado a um animal não humano, por exemplo, um camundongo, galinha, rato, coelho, porquinho da índia, cão, cavalo, vaca, cabra ou porco. O imunogene pode ser administrado por via intranasal, por via intramuscular, subcutânea, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal, ou por outra via conhecida.

[000146] A produção de anticorpos policlonais pode ser monitorada por amostragem do sangue do animal imunizado em vários pontos após a imunização. Uma ou mais outras imunizações podem ser dadas, se necessário, para atingir uma titulação do anticorpo desejado. O processo de reforço e a titulação são repetidos até que uma titulação adequada é atingida. Quando um nível desejado de imunogenicidade é obtido, o animal imunizado é sangrado e o soro isolado e armazenado, e/ou o animal é usado para gerar anticorpos monoclonais (mabs).

[000147] Os anticorpos monoclonais são uma forma exemplar de anticorpos contemplados pela presente divulgação. O termo "anticorpo monoclonal" ou "mAb" refere-se a uma população homogênea de anticorpos capazes de se ligarem ao mesmo antígeno(s), por exemplo, ao mesmo epitopo dentro do antígeno. Este termo não se destina a ser limitado no que diz respeito à fonte do anticorpo ou a forma em que ele é feito.

[000148] Para a produção de mAbs qualquer uma de um número de técnicas conhecidas pode ser usada, tal como, por exemplo, o processo exemplificado em US4196265 ou Harlow e Lane (1988), supra.

[000149] Por exemplo, um animal adequado é imunizado com um imunogene em condições suficientes para estimular as células produtoras de anticorpos. Os roedores, tais como coelhos, camundongos e ratos são animais exemplares. Os camundongos geneticamente modificados para expressar anticorpos humanos e, por exemplo, não expressar anticorpos de murinos, também podem ser usados para gerar um anticorpo da presente descrição (por exemplo, tal como descrito em WO2002/066630).

[000150] Após a imunização, as células somáticas com o potencial para produzir anticorpos, especificamente linfócitos B (células B), são selecionadas para uso no protocolo de geração de mAb. Estas células podem ser obtidas a partir de biópsias de baços, amígdalas ou linfonodos, ou a partir de uma amostra de sangue periférico.As células B a partir do animal imunizado são depois fundidas com células de uma célula de mieloma imortal, geralmente derivada da mesma espécie que o animal que foi imunizado com o imunogene.

[000151] Os híbridos são amplificados por cultura em um meio seletivo compreendendo um agente que bloqueia a síntese de novo de nucleótidos nos meios de cultura de tecidos. Agentes exemplares são a aminopterina, metotrexato e azasserina.

[000152] Os hibridomas amplificados são submetidos a uma seleção funcional para especificidade de anticorpos e/ou titulação, tais como, por exemplo, por citometria e/ou imuno-histoquímica e/ou imunoensaio (por exemplo, radioimunoensaio, imunoensaio enzimático, ensaio de citotoxicidade, ensaio de placa, imunoensaio de ponto, e semelhantes).

[000153] Alternativamente, a tecnologia ABL-MYC (NeoClone, Madison WI 53713, EUA) é usada para produzir linhagens de células que segregam MAbs (por exemplo, tal como descrito em Largaespada et al, J. Immunol. Methods. 197: 85-95, 1996).

[000154] Os anticorpos também podem ser produzidos ou isolados por rastreio de uma biblioteca de exibição, por exemplo, uma biblioteca de exibição de fagos, por exemplo, como descrito no US6300064 e/ou US5885793. Por exemplo, os presentes inventores isolaram anticorpos totalmente humanos a partir de uma biblioteca de exibição de fagos.

[000155] Tal como aqui descrito, algumas proteínas da presente divulgação que se ligam a hG-CSFR reagem de forma cruzada com cynoG-CSFR e/ou se ligam a algumas formas mutantes de hG-CSFR ou polipeptídeos compreendendo regiões de hG-CSFR que foram mutadas e/ou não a outros e/ou se ligam a um epitopo específico dentro de hG-CSFR. Estas características podem ser usadas na geração de um anticorpo ou de uma proteína que compreende um sítio de ligação dos mesmos.

[000156] Por exemplo, uma biblioteca de exibição de fagos é rastreada com um polipeptídeo que compreende o domínio de ligação a ligante de hG-CSFR para identificar proteínas que se ligam ao mesmo. As formas mutantes do domínio de ligação a ligante de hG-CSFR (por exemplo, um mutante pontual de alanina de SEQ ID NO: 1 na posição 287), ao qual a proteína não se liga de modo detectável são depois usadas para remover as proteínas com reatividade cruzada, e as formas mutantes do domínio de ligação ao ligante de hG-CSFR ou regiões dos mesmos (por exemplo, um mutante pontual de alanina de SEQ ID NO: 1 na posição 168), para as quais a proteína deve se ligar são usadas para isolar as proteínas que são corretamente reativas de forma cruzada. Um processo de rastreio para a imunização de um mamífero não humano também pode ser concebido com base no que precede.

[000157] Em outro exemplo, uma biblioteca de exibição de fagos é rastreada ou um animal é imunizado com um polipeptídeo que compreende o domínio de ligação a ligante de cynoG-CSFR e proteínas e/ou anticorpos identificados são rastreados para aqueles que são reativos de forma cruzada com hG-CSFR e/ou domínio de ligação ao ligante do mesmo.

[000158] Em outro exemplo, um G-CSFR, ou um domínio de ligação ao ligante do mesmo (opcionalmente uma forma mutante ao qual C1.2 ou C1.2G se liga) é contatado com C1.2 ou C1.2G. A biblioteca de exibição de fagos é então colocada em contato com o G-CSFR ou o domínio de ligação a ligante e as proteínas que expressam fagos que podem competir com C1.2 ou C1.2G para ligação ao ligante selecionado.

[000159] Em ainda outro exemplo, uma proteína quimérica que compreende, por exemplo, um G-CSFR de camundongo em que um epitopo de interesse de um hG-CSFR é substituído pela sequência de camundongo correspondente.Esta proteína quimérica é então usada para imunizar camundongos (que são menos suscetíveis de induzir uma resposta imune contra a proteína de camundongo) e/ou para rastrear uma biblioteca de exibição de fagos. Os anticorpos/proteínas resultantes são então rastreados para identificar aqueles que se ligam a hG-CSFR (particularmente no epitopo de interesse) e não a G-CSFR de camundongo.

[000160] O anticorpo da presente divulgação pode ser um anticorpo sintético.Por exemplo, o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano ou um anticorpo desimunizado. Anticorpos quiméricos

[000161] Em um exemplo, um anticorpo aqui descrito é um anticorpo quimérico. O termo "anticorpo quimérico" refere-se a anticorpos nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular (por exemplo, de murino, tal como um camundongo) correspondente ou pertencente a uma determinada classe ou subclasse de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies (por exemplo, primatas, tais como, humanos) ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos. Tipicamente, os anticorpos quiméricos utilizam regiões variáveis de coelho ou de roedor e regiões constantes humanas, de modo a produzir um anticorpo com os domínios predominantemente humanos.Os métodos para produzir anticorpos quiméricos estão descritos em, por exemplo, US4816567 e US5807715. Anticorpos Humanos e Humanizados

[000162] Os anticorpos da presente divulgação podem ser humanizados ou humanos.

[000163] O termo "anticorpo humanizado" deve ser entendido para se referir a uma subclasse de anticorpos quiméricos que têm um sítio de ligação a antígeno ou região variável derivada de um anticorpo de uma espécie não humana e da estrutura do anticorpo restante com base na estrutura e/ou sequência de um anticorpo humano. Em um anticorpo humanizado, o sítio de ligação a antígeno compreende, geralmente, as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo não humano enxertado em FRs apropriadas nas regiões variáveis de um anticorpo humano e nas regiões restantes de um anticorpo humano. Os sítios de ligação a antígeno podem ser do tipo selvagem (ou seja, idênticos aos dos anticorpo não humano) ou modificados por uma ou mais substituições de aminoácidos. Em alguns casos, resíduos de FR do anticorpo humano são substituídos pelos correspondentes resíduos não humanos.

[000164] Os métodos para anticorpos não humanos humanizados, ou partes dos mesmos (por exemplo, regiões variáveis) são conhecidos na técnica. A humanização pode ser realizada seguindo o método de US5225539 ou US5585089.Outros métodos para a humanização de um anticorpo não são excluídos.

[000165] O termo "anticorpo humano", tal como aqui usado refere-se a anticorpos tendo regiões variáveis (por exemplo, VH, VL) e, opcionalmente, as regiões constantes derivadas de ou correspondentes às sequências encontradas nos humanos, por exemplo, na linhagem germinativa humana ou células somáticas. Os anticorpos "humanos" podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências humanas, por exemplo, mutações introduzidas por mutações aleatórias ou dirigidas ao sítio in vitro (em particular, as mutações que envolvem substituições ou mutações conservativas em um pequeno número de resíduos de anticorpos, por exemplo, em 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dos resíduos do anticorpo, por exemplo, em 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dos resíduos que formam uma ou mais das CDRs do anticorpo). Estes anticorpos "humanos" na realidade não precisam ser produzidos por um humano, em vez disso, eles podem ser produzidos através de meios recombinantes e/ou isolados a partir de um animal transgênico (por exemplo, camundongo), que compreende o ácido nucleico que codifica as regiões constantes e/ou variáveis de anticorpo humano (por exemplo, tal como descrito acima). Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de exibição em fagos (por exemplo, como descrito em US5885793).

[000166] Os anticorpos humanos que reconhecem um epitopo selecionado podem ser gerados usando uma técnica conhecida como "seleção guiada". Nesta abordagem um anticorpo monoclonal não humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é usado para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epitopo (por exemplo, tal como descrito no US5565332).

[000167] Exemplos de anticorpos humanos são aqui descritos e incluem regiões variáveis e/ou C1.2 e C1.2G.Estes anticorpos humanos fornecem uma vantagem de imunogenicidade reduzida em um humano em comparação com anticorpos não humanos.

Domínio de Ligação a Anticorpos Contendo Proteínas Anticorpos de Domínio Único

[000168] Em alguns exemplos, uma proteína da divulgação é ou compreende um anticorpo de domínio único (que é usado alternadamente com o termo "anticorpo de domínio" ou "dAb"). Um anticorpo de domínio único é uma cadeia de polipeptídeos única compreendendo a totalidade ou uma porção da região variável da cadeia pesada de um anticorpo.Em certos exemplos, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; ver, por exemplo, US6248516). Diabodies, Triabodies, Tetrabodies

[000169] Em alguns exemplos, uma proteína da divulgação é ou compreende um diabody, triabody, tetrabody ou complexo de proteínas de ordem maior tais como aqueles descritos no WO98/044001 e/ou WO94/007921.

[000170] Por exemplo, um diabody é uma proteína compreendendo duas cadeias de polipeptídeos associadas, cada cadeia de polipeptídeos compreendendo a estrutura VL-X-VH ou VH-X-VL, em que VL é uma região variável de cadeia leve de anticorpo, VH é uma região variável da cadeia pesada de anticorpo, X é um ligante que compreende resíduos suficientes para permitir que VH e VL, em uma cadeia de polipeptídeos simples se associem (ou formem um Fv) ou está ausente, e em que a VH de uma cadeia de polipeptídeos se liga a uma VL de outra cadeia de polipeptídeos para formar um sítio de ligação a antígeno, isto é, para formar uma molécula de Fv capaz de se ligar especificamente a um ou mais antígenos. A VL e VH podem ser as mesmas em cada cadeia de polipeptídeo ou a VL e VH podem ser diferentes em cada cadeia de polipeptídeo de modo a formar um diabody biespecífico (por exemplo, compreendendo dois Fvs com especificidade diferente). Fv de cadeia única (scFv)

[000171] O versado na técnica estará ciente de que os scFv compreendem regiões de VH e VL em uma cadeia de polipeptídeos simples e um ligante polipeptídico entre a VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação a antígeno (isto é, para a VH e VL da cadeia de polipeptídeos simples para se associarem um com o outro para formar um Fv). Por exemplo, o ligante compreende, em excesso de 12 resíduos de aminoácidos com (Gly4Ser)3 ser um dos ligantes mais favorecidos para um scFv.

[000172] A presente divulgação também contempla um Fv estabilizado por dissulfeto (ou diFv ou dsFv), em que um único resíduo de cisteína é introduzido uma FR de VH e VL de uma FR e os resíduos de cisteína ligados por uma ligação de dissulfeto para fornecer um Fv estável.

[000173] Em alternativa, ou em adição, a presente divulgação engloba um scFv dimérico, isto é, uma proteína que compreende duas moléculas de scFv ligadas por uma ligação covalente ou não covalente, por exemplo, por um domínio de ziper de leucina (por exemplo, derivados de Fos ou Jun). Alternativamente, dois scFvs estão ligados por um ligante peptídico de comprimento suficiente para permitir que ambos os scFvs se formem e se liguem a um antígeno, por exemplo, como descrito em US20060263367. Anticorpos de Cadeia Pesada

[000174] Os anticorpos de cadeias pesadas diferem estruturalmente de muitas outras formas de anticorpos, na medida em que compreendem uma cadeia pesada, mas não compreendem uma cadeia leve. Deste modo, estes anticorpos também são referidos como "anticorpos de cadeia pesada apenas". Os anticorpos de cadeia pesada são encontrados, por exemplo, camelídeos e peixes cartilaginosos (também chamados IgNAR).

[000175] As regiões variáveis presentes em anticorpos de cadeia pesadas que ocorrem naturalmente são geralmente referidos como "domínios VHH" em anticorpos de camelídeos e V-NAR em IgNAR, de modo a distingui-las das regiões variáveis de cadeia pesada que se encontram presentes em anticorpos de 4 cadeias convencionais (os quais são referidos como "domínios de VH") e a partir das regiões variáveis de cadeia leve que se encontram presentes em anticorpos de 4 cadeias convencionais (que são referidos como "domínios de VL").

[000176] Uma descrição geral de anticorpos de cadeias pesadas de camelídeos e as regiões variáveis dos mesmos e métodos para a sua produção e/ou isolamento e/ou uso encontra-se, inter alia, nas seguintes referências: WO94/04678, WO97/49805 e WO 97/49805.

[000177] Uma descrição geral de anticorpos de cadeia pesada de peixes cartilaginosos e as regiões variáveis dos mesmos e métodos para a sua produção e/ou isolamento e/ou uso é encontrada inter alia no WO2005/118629. Outros Anticorpos e Fragmentos de Anticorpos

[000178] A presente divulgação também contempla outros anticorpos e fragmentos de anticorpos, tais como: (i) proteínas biespecíficas de "chave e buraco", conforme descrito em US 5.731.168; (ii) proteínas heteroconjugadas, por exemplo, como descrito em US 4.676.980; (iii) proteínas heteroconjugadas produzidas usando um agente de reticulação química, por exemplo, como descrito em US 4.676.980; e (iv) Fab3 (por exemplo, tal como descrito em EP19930302894).

Proteínas e Anticorpos Desimunizados

[000179] A presente divulgação também contempla um anticorpo ou proteína desimunizado. Os anticorpos desimunizados e as proteínas têm um ou mais epitopos, por exemplo, epitopos de células B ou epitopos de células T removidos (isto é, mutados) para assim reduzir a probabilidade de que um mamífero irá gerar uma resposta imune contra o anticorpo ou proteína. Métodos para produzir anticorpos e proteínas desimunizados são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em WO00/34317, WO2004/108158 e WO2004/064724. Os métodos para a introdução de mutações adequadas e expressão e ensaio da proteína resultante será evidente para o versado na técnica com base na descrição aqui contida.

Mutações para Proteínas

[000180] A presente divulgação também contempla formas mutantes de uma proteína da divulgação. A este respeito, os dados aqui apresentados indicam sítios dentro de uma CDR de uma proteína da presente divulgação que podem ser alteradas além de alterações exemplares que podem ser feitas. A pessoa versada vai entender que as alterações podem, adicionalmente ou alternativamente, ser feitas dentro de uma FR de uma região variável contendo proteína sem inibir ou reduzir significativamente a sua função no contexto da presente divulgação.

[000181] Por exemplo, tal proteína mutante compreende uma ou mais substituições conservativas de aminoácidos, em comparação com uma sequência aqui estabelecida. Em alguns exemplos, a proteína compreende 30 ou menos ou 20 ou menos ou 10 ou menos, por exemplo, 9 ou 8 ou 7 ou 6 ou 5 ou 4, 3 ou 2 substituições conservativas de aminoácidos. Uma "substituição conservativa de aminoácidos" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante e/ou hidropaticidade e/ou hidrofilicidade.

[000182] Em um exemplo, uma proteína mutante tem apenas, ou não mais do que, um ou dois ou três ou quatro ou cinco ou seis alterações conservativas de aminoácidos quando em comparação com uma proteína que ocorre naturalmente. Os detalhes das alterações conservativas de aminoácidos são fornecidos abaixo. Como o versado na técnica estaria ciente, por exemplo, a partir da descrição aqui feita, tais pequenas alterações podem ser razoavelmente previstas para não alterar a atividade da proteína.

[000183] As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais β-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[000184] A presente divulgação contempla também alterações não conservativas de aminoácidos (por exemplo, substituições) em uma proteína da presente divulgação, por exemplo, em uma CDR, tal como CDR3. Por exemplo, os presentes inventores identificaram várias substituições de aminoácidos não conservativas, que podem ser feitas, mantendo uma atividade de uma proteína da presente divulgação. Em um exemplo, a proteína compreende menos do que 6, 5 ou 4 ou 3, 2 ou 1 substituições não conservativas de aminoácidos, por exemplo, em uma CDR3, tal como em uma CDR3.

[000185] A presente divulgação também contempla uma ou mais inserções ou deleções, em comparação com uma sequência aqui estabelecida. Em alguns exemplos, a proteína compreende 10 ou menos, por exemplo, 9 ou 8 ou 7 ou 6 ou 5 ou 4, 3 ou 2 inserções e/ou deleções.

Regiões Constantes

[000186] A presente divulgação abrange as proteínas e/ou anticorpos aqui descritos, compreendendo uma região constante de um anticorpo. Isto inclui fragmentos de ligação a antígeno de um anticorpo fundido a um Fc.

[000187] As sequências das regiões constantes úteis para a produção das proteínas da presente divulgação podem ser obtidas a partir de um número de fontes diferentes. Em alguns exemplos, a região constante ou uma porção da mesma da proteína é derivada de um anticorpo humano. A região constante ou porções da mesma pode ser derivada a partir de qualquer classe de anticorpos, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo de anticorpo, incluindo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em um exemplo, a região constante é IgG4 de isotipo humano ou uma região constante de IgG4 estabilizada.

[000188] Em um exemplo, a região de Fc da região constante tem uma capacidade reduzida para induzir a função efetora, por exemplo, em comparação com uma região de Fc de IgG3 ou IgG1 humana de tipo selvagem ou nativa. Em um exemplo, a função efetora é citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e/ou fagocitose mediada por célula dependente de anticorpos (ADCP) e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Métodos para avaliar o nível da função efetora de uma região que contém a proteína de Fc são conhecidos na técnica e/ou aqui descritos.

[000189] Em um exemplo, a região de Fc é uma região de Fc de IgG4 (isto é, a partir de uma região constante de IgG4), por exemplo, uma região de Fc de IgG4 humana. As sequências de regiões de Fc de IgG4 adequadas serão evidentes para o versado na técnica e/ou disponíveis em bancos de dados publicamente disponíveis (por exemplo, disponíveis a partir de National Center for Biotechnology Information).

[000190] Em um exemplo, a região constante é uma região constante de IgG4 estabilizada. O termo "região constante de IgG4 estabilizada" será entendido como uma região constante de IgG4 que tenha sido modificada para reduzir a troca de braço de Fab ou a propensão para sofrer a troca de braço de Fab ou a formação de um meio anticorpo ou uma propensão para formar um meio anticorpo. A "troca de braço de Fab" refere-se a um tipo de modificação da proteína para a IgG4 humana, em que uma cadeia pesada de IgG4 e cadeia leve fixa (meia molécula) é trocada por um par de cadeia pesada-leve de uma outra molécula de IgG4. Assim, as moléculas de IgG4 podem adquirir dois braços de Fab distintos reconhecendo dois antígenos diferentes (resultando em moléculas biespecíficas). A troca de braço de Fab ocorre naturalmente in vivo e pode ser induzida in vitro por células de sangue purificadas ou agentes de redução, tais como a glutationa reduzida. Um "meio anticorpo" se forma quando um anticorpo de IgG4 dissocia-se para formar duas moléculas, cada contendo uma cadeia pesada simples e uma cadeia leve simples.

[000191] Em um exemplo, uma região constante de IgG4 estabilizada compreende uma prolina na posição 241 da região de dobradiça de acordo com o sistema de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 e/ou 1991). Esta posição corresponde à posição 228 da região de dobradiça de acordo com o sistema de numeração da UE (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 and Edelman et al., Proc. Natl. Acad. EUA, 63, 78-85, 1969). Na IgG4 humana, este resíduo é geralmente uma serina. Após a substituição da serina por prolina, a região de dobradiça de IgG4 compreende uma sequência de CPPC. A este respeito, o versado na técnica estará ciente de que a "região de dobradiça" é uma porção rica em prolina de um anticorpo de região constante da cadeia pesada, que liga as regiões de Fc e Fab que conferem mobilidade sobre os dois braços de Fab de um anticorpo. A região de dobradiça inclui os resíduos de cisteína que estão envolvidos em ligações intercadeia pesada de dissulfeto. É geralmente definida como se estendendo desde Glu226 a Pro243 da IgG1 humana, de acordo com o sistema de numeração de Kabat. As regiões de dobradiça de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de IgG1 através da colocação do primeiro e último resíduos de cisteína que formam ligações de dissulfeto (S-S) de intercadeia pesada nas mesmas posições (ver, por exemplo, WO2010/080538).

[000192] Exemplos adicionais de anticorpos de IgG4 estabilizadas são os anticorpos em que a arginina na posição 409 em uma região constante de cadeia pesada de IgG4 humana (de acordo com o sistema de numeração da UE) é substituída por lisina, treonina, metionina, ou leucina (por exemplo, tal como descrito em WO2006/033386). A região de Fc da região constante pode adicionalmente ou alternativamente compreender um resíduo selecionado do grupo consistindo em: alanina, valina, glicina, isoleucina e leucina na posição correspondente a 405 (de acordo com o sistema de numeração da UE). Opcionalmente, a região de dobradiça compreende uma prolina na posição 241 (isto é, uma sequência de CPPC) (como descrito acima).

[000193] Em outro exemplo, a região de Fc é uma região modificada para ter uma função efetora reduzida, ou seja, uma "região de Fc não imunoestimulante".Por exemplo, a região de Fc é uma região de Fc de IgG1 compreendendo a substituição de uma ou mais posições selecionadas do grupo consistindo em 268, 309, 330 e 331. Em outro exemplo, a região de Fc é uma região de Fc de IgG1 que compreende uma ou mais das seguintes alterações E233P, L234V, L235A e deleção de G236 e/ou uma ou mais das seguintes alterações A327G,A330S e P331S (Armour et al., Eur J Immunol. 29:2613-2624, 1999; Shields et al., J Biol Chem. 276(9):6591-604, 2001). Exemplos adicionais de regiões de Fc não imunoestimulantes são descritos, por exemplo, em Dall'Acqua et al., J Immunol.177 : 1129-1138 2006; e/ou Hezareh J Virol ;75: 12161-12168, 2001).

[000194] Em outro exemplo, a região de Fc é uma região de Fc quimérica, por exemplo, compreendendo pelo menos um domínio CH2 de um anticorpo IgG4 e pelo menos um domínio CH3 de um anticorpo de IgG1, em que a região de Fc compreende uma substituição em uma ou mais posições de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em 240, 262, 264, 266, 297, 299, 307, 309, 323, 399, 409 e 427 (numeração da UE) (por exemplo, tal como descrito em WO2010/085682). Substituições exemplares incluem 240F, 262L, 264T, 266F, 297Q, 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399S, e 427F.

Modificações Adicionais

[000195] A presente descrição contempla também modificações adicionais a um anticorpo.

[000196] Por exemplo, o anticorpo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentam a meia-vida da proteína. Por exemplo, o anticorpo compreende uma região de Fc compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos que aumentam a afinidade da região de Fc para a região de Fc neonatal (FcRn). Por exemplo, a região de Fc tem maior afinidade para o FcRn a pH mais baixo, por exemplo, cerca de pH 6,0, para facilitar a ligação de Fc/FcRn em um endossoma. Em um exemplo, a região de Fc tem maior afinidade para o FcRn a cerca de pH 6 em comparação com a sua afinidade a cerca de pH 7,4, que facilita a reliberação de Fc no sangue após a reciclagem celular. Estas substituições de aminoácidos são úteis para prolongar a meia-vida de uma proteína, reduzindo a depuração a partir do sangue.

[000197] Exemplos de substituições de aminoácidos incluem T250Q e/ou M428L ou T252A, T254S e T266F ou M252Y, S254T e T256E ou H433K e N434F de acordo com o sistema de numeração da UE. As substituições de aminoácidos adicionais ou alternativos são descritas, por exemplo, em US20070135620 ou US7083784.

Produção de Proteína

[000198] Em um exemplo, uma proteína aqui descrita de acordo com qualquer exemplo é produzida por cultura de um hibridoma sob condições suficientes para produzir a proteína, por exemplo, como aqui descrito e/ou como é conhecido na técnica descrita. Expressão Recombinante

[000199] Em outro exemplo, uma proteína descrita aqui de acordo com qualquer exemplo é recombinante.

[000200] No caso de uma proteína recombinante, o ácido nucleico que codifica a mesma pode ser clonado em constructos ou vetores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras, tais como células de E. coli, células de leveduras, células de insetos ou células de mamíferos, tais como células de COS de símio, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), células de rim embrionário humano (HEK), ou células de mieloma que, de outro modo, não produzem a proteína. Exemplos de células usadas para a expressão de uma proteína são células de CHO, células de mieloma ou células de HEK. Técnicas de clonagem molecular para atingir estes fins são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, em Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley- Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o presente) ou Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Uma ampla variedade de clonagem e métodos de amplificação in vitro, é adequada para a construção de ácidos nucleicos recombinantes. Métodos de produção de anticorpos recombinantes também são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, US4816567 ou US5530101.

[000201] A seguir ao isolamento, o ácido nucleico é inserido operativamente ligado a um promotor no constructo de expressão ou vetor de expressão para clonagem adicional (amplificação do DNA) ou para expressão em um sistema isento de células ou em células.

[000202] Tal como aqui usado, o termo "promotor" deve ser tomado no seu contexto mais amplo e inclui as sequências reguladoras da transcrição de um gene genômico, incluindo TATA box ou elemento iniciador, o qual é necessário para a iniciação da transcrição precisa, com ou sem elementos reguladores adicionais (por exemplo, sequências de ativação à montante, sítios de ligação do fator de transcrição, potencializadores e silenciadores) que alteram a expressão de um ácido nucleico, por exemplo, em resposta a um estímulo do desenvolvimento e/ou externo, ou em uma forma específica do tecido. No presente contexto, o termo "promotor" é também usado para descrever um ácido nucleico recombinante, sintético ou de fusão, ou derivado que confere, ativa ou potencializa a expressão de um ácido nucleico ao qual está ligado operativamente. Exemplos de promotores podem conter cópias adicionais de um ou mais elementos reguladores específicos para potencializar ainda mais a expressão e/ou alterar a expressão espacial e/ou expressão temporal do referido ácido nucleico.

[000203] Tal como aqui usado, o termo "operativamente ligado a" significa o posicionamento de um promotor relativamente a um ácido nucleico de tal modo que a expressão do ácido nucleico é controlada pelo promotor.

[000204] Muitos vetores de expressão em células estão disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma sequência que codifica uma proteína (por exemplo, derivada a partir da informação aqui fornecida), um elemento potencializador, um promotor, e uma sequência de terminação da transcrição. O versado na técnica estará ciente das sequências apropriadas para a expressão de uma proteína. As sequências sinais exemplares incluem sinais de secreção procarióticos (por exemplo, pelB, fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxina II estável ao calor), sinais de secreção de levedura (por exemplo, a invertase líder, o fator α líder, ou fosfatase ácida líder) ou sinais de secreção de mamíferos (por exemplo, o herpes simplex do sinal gD).

[000205] Promotores ativos exemplares em células de mamíferos incluem promotor inicial imediato de citomegalovírus (CMV-IE), o promotor de fator 1-α de alongamento humano (EF1), pequenos promotores de RNA nuclear (U1a e U1b), promotor de cadeia pesada de a-miosina, promotor do vírus Simian 40 (SV40), promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV), promotor tardio principal de Adenovirus, promotor β-actina; elemento de regulação híbrido que compreende um intensificador de CMV/promotor de β-actina ou um promotor de imunoglobulina ou fragmento ativo do mesmo. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero úteis são a linhagem de rim de macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); ou células de ovário de hamster chinês (CHO).

[000206] Os promotores típicos adequados para a expressão em células de levedura, tal como, por exemplo, uma célula de levedura selecionada a partir do grupo que compreende Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae e S. pombe, incluem, mas não estão limitados a, o promotor de ADH1, o promotor GAL1, o promotor GAL4, o promotor de CUP1, o promotor de PHO5, o promotor nmt, o promotor RPR1, ou o promotor TEF1.

[000207] Meios para introduzir o ácido nucleico isolado ou constructo de expressão compreendendo mesmo em uma célula de expressão são conhecidos dos versados na técnica. A técnica usada para uma determinada célula depende das técnicas de sucesso conhecidas. Meios para a introdução de DNA recombinante em células incluem a microinjeção, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipossomas, tais como, usando lipofectamina (Gibco, MD, EUA) e/ou cellfectin (Gibco, MD, EUA), captação de DNA mediada por PEG, eletroporação e bombardeamento de micropartículas, tais como através do uso de partículas de tungstênio ou de ouro revestidas com DNA (Agracetus Inc., WI, EUA), entre outros.

[000208] As células hospedeiras usadas para produzir a proteína podem ser cultivadas em uma variedade de meios, dependendo do tipo de célula usado. Os meios comercialmente disponíveis tais como Fl0 de Ham (Sigma), Meio Mínimo Essencial ((MEM), (Sigma), RPMl-1640 (Sigma), e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultivar células de mamíferos. Meios para a cultura de outros tipos de células aqui descritas são conhecidos na técnica. Isolamento de Proteínas

[000209] Os métodos para o isolamento de uma proteína são conhecidos na técnica e/ou descritos aqui.

[000210] Quando uma proteína é secretada no meio de cultura, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão podem ser primeiro concentrados usando um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de proteases tal como PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas anteriores para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios. Alternativamente, ou adicionalmente, os sobrenadantes podem ser filtrados e/ou separados das células que expressam a proteína, por exemplo, usando centrifugação contínua.

[000211] A proteína preparada a partir das células pode ser purificada usando, por exemplo, a troca iônica, cromatografia de hidroxiapatite, cromatografia de interação hidrofóbica, eletroforese em gel, diálise, cromatografia de afinidade (por exemplo, cromatografia de afinidade de proteína A ou proteína G), ou qualquer combinação dos anteriores. Estes métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em WO99/57134 ou Ed Harlow e David Lane (editors) Anticorpoies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988).

[000212] O versado na técnica irá também estar ciente de que uma proteína pode ser modificada para incluir uma marcação para facilitar a purificação ou detecção, por exemplo, uma marcação de poli-histidina, por exemplo, uma marcação de hexa-histidina, ou uma marcação de hemaglutinina do vírus da gripe (HA), ou de um vírus Simian 5 (V5) ou uma narcação FLAG, ou uma marcação de glutationa S-transferase (GST). A proteína resultante é então purificada usando métodos conhecidos na técnica, tais como, a purificação por afinidade. Por exemplo, uma proteína que compreende uma marcação hexa-his é purificada por contato de uma amostra compreendendo a proteína com ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA) que se liga especificamente a uma marcação hexa-his imobilizada sobre um suporte sólido ou semissólido, lavagem da amostra para remover a proteína não ligada e, posteriormente, eluição da proteína ligada. Alternativamente, ou em adição, um ligante ou um anticorpo que se liga a uma marcação é usado em um método de purificação por afinidade.

Ensaio de Atividade de uma Proteína Ligação a G-CSFR e Mutantes do Mesmo

[000213] Será evidente para o versado na técnica a partir da descrição aqui que algumas proteínas da presente divulgação se ligam ao domínio de ligação a ligante de hG-CSFR e às formas mutantes específicas do domínio de ligação a ligante de hG-CSFR (por exemplo, SEQ ID NO: 1, sem ou com certas mutações pontuais) e/ou ligam-se a ambos G-CSFR de humano e macaco cinomolgos. Os métodos para avaliar a ligação a uma proteína são conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em Scopes (Em: Protein purification: principles and practice, Terceira Edição, Springer Verlag, 1994). Tal método geralmente envolve a marcação da proteína e o contato com o antígeno imobilizado. Após a lavagem para remover a proteína ligada não específica, a quantidade de marcador e, como consequência, a proteína ligada é detectada. Claro que, a proteína pode ser imobilizada e o antígeno marcado.Ensaios tipo panning também podem ser usados.Alternativamente, ou adicionalmente, ensaios de ressonância de plásmons de superfície podem ser usados.

[000214] Os ensaios descritos acima também podem ser usados para detectar o grau de ligação de uma proteína de hG-CSFR ou um domínio de ligação a ligante dos mesmos (por exemplo, SEQ ID NO: 1) ou uma forma mutante do mesmo.

[000215] Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela lisina na posição 167 de SEQ ID NO: 1 e/ou em que uma alanina é substituída por uma histidina na posição 168 de SEQ ID NO: 1 substancialmente no mesmo nível (por exemplo, dentro de 10% ou 5% ou 1%) na medida em que se liga a SEQ ID NO: 1.

[000216] Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída por uma arginina na posição 287 de SEQ ID NO: 1 a um nível de pelo menos cerca de 100 vezes ou 150 vezes ou 160 vezes ou 200 vezes menor do que o mesmo se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída por uma arginina na posição 287 de SEQ ID NO: 1 a um nível de pelo menos cerca de 160 vezes menor do que o mesmo se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[000217] Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída por uma histidina na posição 237 de SEQ ID NO: 1 a um nível de pelo menos cerca de 20 vezes ou 40 vezes ou 50 vezes ou 60 vezes menor do que o mesmo se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída por uma histidina na posição 237 de SEQ ID NO: 1 a um nível de pelo menos cerca de 50 vezes menor do que o mesmo se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[000218] Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída por uma metionina na posição 198 de SEQ ID NO: 1 a um nível de pelo menos cerca de 20 vezes ou 40 vezes ou 60 vezes ou 70 vezes menor do que o mesmo se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída por uma metionina na posição 198 de SEQ ID NO: 1 a um nível de pelo menos cerca de 40 vezes menor do que o mesmo se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[000219] Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída por uma tirosina na posição 172 de SEQ ID NO: 1 a um nível de pelo menos cerca de 20 vezes ou 30 vezes ou 40 vezes menor do que o mesmo se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída por uma tirosina na posição 172 de SEQ ID NO: 1 a um nível de pelo menos cerca de 40 vezes menor do que o mesmo se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[000220] Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída por uma leucina na posição 171 de SEQ ID NO: 1 a um nível de pelo menos cerca de 100 vezes ou 120 vezes ou 130 vezes ou 140 vezes menor do que o mesmo se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída por uma leucina na posição 171 de SEQ ID NO: 1 a um nível de pelo menos cerca de 140 vezes menor do que o mesmo se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[000221] Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela leucina na posição 111 de SEQ ID NO: 1 a um nível de pelo menos cerca de 20 vezes ou 40 vezes ou 60 vezes ou 70 vezes menor do que o mesmo se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1. Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é pela leucina na posição 111 de SEQ ID NO: 1 a um nível de pelo menos cerca de 60 vezes menor do que o mesmo se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[000222] Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída por uma histidina na posição 168 de SEQ ID NO: 1 a um nível de não mais que 5 vezes ou 4 vezes ou 3 vezes ou 2 vezes ou 1 vezes menor do que o mesmo se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[000223] Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela lisina na posição 167 de SEQ ID NO: 1 a um nível de não mais que 5 vezes ou 4 vezes ou 3 vezes ou 2 vezes ou 1 vezes menor do que o mesmo se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[000224] O nível de ligação é convenientemente determinado usando um biossensor.

[000225] A presente divulgação contempla qualquer combinação das seguintes características.Em um exemplo, uma proteína descrita aqui tem todas das características de ligação estabelecidas nos sete parágrafos anteriores. Mapeamento de Epitopo

[000226] Em outro exemplo, o epitopo ligado por uma proteína aqui descrita é mapeado. Métodos de mapeamento de epitopo serão evidentes para o versado na técnica. Por exemplo, uma série de peptídeos sobrepostos abrangendo a sequência de hG-CSFR ou uma região da mesma que compreende um epitopo de interesse, por exemplo, peptídeos compreendendo 10-15 aminoácidos é produzida.A proteína é então contatada para cada peptídeo e o(s) peptídeo(s) ao qual se liga é determinado. Isto permite a determinação do peptídeo(s) que compreende o epitopo ao qual a proteína se liga. Se vários peptídeos não contíguos estão ligados à proteína, a proteína pode se ligar a um epitopo conformacional.

[000227] Em alternativa, ou em adição, os resíduos de aminoácidos dentro de hG-CSFR são mutados, por exemplo, por mutagênese de varrimento de alanina, e as mutações que reduzem ou impede a proteína de ligação são determinadas. Qualquer mutação que reduz ou impede a ligação da proteína é suscetível de estar dentro do epitopo ligado pela proteína.

[000228] Outro método é aqui exemplificado, e envolve a ligação de hG-CSFR ou uma região do mesmo de uma proteína imobilizada da presente divulgação e digere o complexo resultante com proteases. Os peptídeos que permanecem ligados à proteína imobilizada são então isolados e analisados, por exemplo, usando espectrometria de massa, para determinar a sua sequência.

[000229] Um método adicional envolve a conversão de hidrogênios em hG-CSFR ou uma região do mesmo de deutrons e a ligação a proteína resultante para uma proteína imobilizada da presente divulgação. Os deutrons são então convertidos novamente para o hidrogênio, o hG-CSFR, ou a região do mesmo isolada, digeridos com as enzimas e analisados, por exemplo, por espectrometria de massa para identificar essas regiões, compreendendo deutrons, o que teria sido protegido de conversão de hidrogênio através da ligação de uma proteína aqui descrita.

[000230] Opcionalmente, a constante de dissociação (Kd) de uma proteína para hG-CSFR ou um epitopo do mesmo é determinada. A "Kd" ou "valor de Kd" para uma proteína de ligação de hG-CSFR é, em um exemplo, medida por um ensaio de ligação de hG-CSFR radiomarcado ou marcado fluorescentemente. Este ensaio equilibra a proteína com uma concentração mínima de G-CSFR marcado, na presença de uma série de titulações de hG-CSFR não marcado. Após a lavagem para remover hG-CSFR não ligado, a quantidade de marcador é determinada, o que é indicativo do Kd da proteína.

[000231] De acordo com outro exemplo, o valor de Kd ou Kd é medido por meio de ensaios de ressonância de plásmons de superfície, por exemplo, usando ressonância de plásmons de superfície da BIAcore de (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) com hG-CSFR imobilizada ou uma região do mesmo.

[000232] Em alguns exemplos, as proteínas que possuem uma Kd semelhante ou maior do que um Kd C1.2 ou C1.2G são selecionados, uma vez que são susceptíveis de competir para a ligação a hG-CSFR. Determinar Ligação Competitiva

[000233] Os ensaios para a determinação de uma proteína que inibe competitivamente a ligação do anticorpo monoclonal ou C1.2 C1.2G serão evidentes para o versado na técnica. Por exemplo, C1.2 ou C1.2G é conjugado a um marcador detectável, por exemplo, um marcador fluorescente ou um marcador radioativo. O anticorpo marcado e a proteína de teste são então misturados e contatados com hG-CSFR ou uma região do mesmo (por exemplo, um polipeptídeo incluindo SEQ ID NO: 1) ou uma célula que expressa mesmo. O nível de C1.2 ou C1.2G marcado é então determinado e comparado com o nível determinado, quando o anticorpo marcado é colocado em contato com o hG-CSFR, região ou células na ausência da proteína. Se o nível de C1.2 ou C1.2G marcado é reduzido na presença da proteína de teste em comparação com a ausência da proteína, a proteína é considerada inibir competitivamente a ligação de C1.2 ou C1.2G a hG-CSFR.

[000234] Opcionalmente, a proteína de teste é conjugada ao marcador diferente para C1.2 ou C1.2G. Esta marcação alternativa permite a detecção do nível de ligação da proteína de teste de hG-CSFR ou a região da mesma ou célula.

[000235] Em outro exemplo, a proteína é permitida ligar-se a hG- CSFR ou a uma região do mesmo (por exemplo, um polipeptídeo incluindo SEQ ID NO: 1) ou uma célula que expressa mesmo antes do contato o hG-CSFR, a região ou célula com C1.2 ou C1.2G. Uma redução na quantidade de C1.2 ou C1.2G acoplado na presença da proteína em comparação com a ausência da proteína indica que a proteína inibe competitivamente a ligação de C1.2 ou C1.2G a hG- CSFR. Um ensaio recíproco também pode ser realizado usando proteína marcada e primeira permitindo que C1.2 ou C1.2G se ligue a G-CSFR. Neste caso, uma quantidade reduzida de proteína marcada ligada a hG-CSFR na presença de C1.2 ou C1.2G em comparação na ausência de C1.2 ou C1.2G indica que a proteína inibe competitivamente a ligação de C1.2 ou C1.2G a hG-CSFR.

[000236] Qualquer um dos ensaios anteriores pode ser realizado com uma forma mutante de hG-CSFR e/ou SEQ ID NO: 1 e/ou uma região de ligação ao ligante de hG-CSFR a qual C1.2 ou C1.2G se liga, por exemplo, como descrito aqui. Determinação da Neutralização

[000237] Em alguns exemplos da presente divulgação, a proteína é capaz de neutralizar a sinalização de hG-CSFR.

[000238] Vários ensaios são conhecidos na técnica para avaliar a capacidade de uma proteína para neutralizar a sinalização de um ligante por meio de um receptor.

[000239] Em um exemplo, a proteína reduz ou impede a ligação de G- CSF para o hG-CSFR. Estes ensaios podem ser realizados como um ensaio de ligação competitiva, tal como descrito aqui usando G-CSF marcado e/ou proteína marcada.

[000240] Em outro exemplo, a proteína reduz a formação de CFU-G, quando as células da medula óssea CD34+ são cultivadas na presença de G-CSF. Nesses ensaios, as células da medula óssea CD34+ são cultivadas em um meio de cultura de células semissólida, na presença de G-CSF (por exemplo, cerca de 10ng/ml de meio de cultura de células) e, opcionalmente, o fator de células-tronco (por exemplo, cerca de 10ng/ml de meio de cultura de célula) na presença ou ausência de uma proteína de teste. Depois de um tempo suficiente para que os clones de granulócitos (CFU-G) se formem, o número de clones ou de colônias é determinado. Uma redução no número de colônias na presença da proteína em comparação com a ausência da proteína indica que a proteína neutraliza a sinalização de G-CSF. Ao testar múltiplas concentrações de proteína é determinado um valor de IC50, ou seja, uma concentração à qual 50% da inibição máxima de formação de CFU-G ocorre. Em um exemplo, a IC50 é 0,2 nM ou menos, tal como 0,1 nM ou menos, por exemplo, 0,09nM ou menos, ou 0,08nM ou menos, ou 0,07nM ou menos, ou 0,06nM ou menos ou 0,05nM ou menos. Em um exemplo, a IC50 é 0,04nM ou menos. Em outro exemplo, a IC50 é 0,02nM ou menos. Os valores de IC50 anteriores referem-se a qualquer ensaio de CFU-G descrito aqui.

[000241] Em um outro exemplo, a proteína reduz a proliferação de células (por exemplo, células de BaF3) que expressam hG-CSFR que são cultivadas na presença de G-CSF. As células são cultivadas na presença de G-CSF (por exemplo, 0,5ng/ml) e na presença ou ausência de uma proteína de teste. Métodos para a avaliação da proliferação de células são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a redução do MTT e a incorporação de timidina. Uma proteína que reduz o nível de proliferação em comparação com o nível observado na ausência da proteína é considerada para neutralizar a sinalização de G-CSF. Ao testar múltiplas concentrações de proteína é determinado um valor de IC50, ou seja, uma concentração à qual 50% da inibição máxima da proliferação celular ocorrem. Em um exemplo, a IC50 é 6 nM ou menos, tal como 5,9nM ou menos. Em outro exemplo, a IC50 é de 2 nM ou menos, ou de 1 nM ou menos, ou 0,7 nM ou menos ou 0,6 nM ou menos ou 0,5 nM ou menos. Os valores de IC50 anteriores referem-se a qualquer ensaio de proliferação de células aqui descrito.

[000242] Em outro exemplo, a proteína reduz a mobilização de células-tronco hematopoiéticas e/ou células progenitoras endoteliais in vivo após administração de G-CSF e/ou reduz o número de neutrófilos in vivo, por exemplo, após administração de G-CSF (contudo isto não é essencial). Por exemplo, a proteína é administrada a um sujeito, opcionalmente, antes, no momento ou após a administração de G-CSF ou uma forma modificada do mesmo (por exemplo, G-CSF peguilado ou filgrastim). O número de células-tronco hematopoiéticas (por exemplo, expressando CD34 e/ou Thy1) e/ou células progenitoras endoteliais (por exemplo, que expressam CD34 e de VEGFR2) e/ou neutrófilos (identificadas morfologicamente e/ou que expressam, por exemplo, CD10, CD14, CD31 e/ou CD88) é avaliado. Uma proteína que reduz o nível da célula(s) em relação ao nível observado na ausência da proteína é considerada neutralizar a sinalização de G-CSF. Em um exemplo, a proteína reduz o número de neutrófilos, sem indução de neutropenia.

[000243] Outros métodos de avaliação da neutralização de sinalização de G-CSF são contemplados pela presente divulgação. Determinação de Função Efetora

[000244] Tal como aqui discutido, algumas proteínas da presente divulgação reduziram a função efetora. Os métodos para avaliar a atividade de ADCC são conhecidos na técnica.

[000245] Em um exemplo, o nível de atividade de ADCC é avaliado usando um ensaio de liberação de 51Cr, um ensaio de liberação de európio ou um ensaio de liberação 35S. Em cada um destes ensaios, as células que expressam G-CSFR são cultivadas com um ou mais dos compostos recitados durante um tempo e sob condições suficientes para o composto ser absorvido pela célula. No caso de um ensaio de liberação de 35S, as células que expressam de hG-CSFR podem ser cultivadas com metionina e/ou a cisteína marcada com 35S por um tempo suficiente para que os aminoácidos marcados sejam incorporados em proteínas recentemente sintetizadas. As células são então cultivadas na presença ou na ausência de proteína e na presença de células efetoras imunes, por exemplo, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e/ou células NK. A quantidade de európio 51Cr e/ou 35S, em meio de cultura de células é então detectada, e pouca ou nenhuma alteração na presença da proteína em comparação com a ausência de proteína (ou uma redução do nível do composto em comparação com o nível observado na presença de um anticorpo anti- hG-CSFR que compreende uma Fc de IgG1 humana) indica que a proteína teve a função efetora reduzida. Exemplos de publicações que descrevem ensaios para avaliar o grau de ADCC induzido por uma proteína incluem Hellstrom, et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83:70597063, 1986 and Bruggemann, et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987.

[000246] Outros ensaios para a avaliação do nível de ADCC induzido por uma proteína incluem ensaio de citotoxicidade não radioativa ACTI™ por citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. CA, EUA) ou ensaio de citotoxicidade não radioativa CytoTox 96® (Promega, WI, EUA).

[000247] Os ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que a proteína é capaz de se ligar a C1q e pode induzir CDC. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC pode ser realizado (ver, por exemplo, Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163, 1996.). Determinação da Meia-vida

[000248] Algumas proteínas englobadas pela presente divulgação têm uma meia-vida melhorada, por exemplo, são modificadas para aumentar a sua meia-vida, em comparação com proteínas que não são modificadas. Os métodos para a determinação de uma proteína com uma meia-vida melhorada serão evidentes para o versado na técnica. Por exemplo, a capacidade de uma proteína para se ligar a um receptor de Fc neonatal (FcRn) é avaliada. A este respeito, o aumento da afinidade de ligação para o FcRn aumentou a meia-vida no soro da molécula (ver, por exemplo, Kim et al., Eur J Immunol., 24:2429, 1994).

[000249] A meia-vida de uma proteína da divulgação pode também ser medida por estudos farmacocinéticos, por exemplo, de acordo com o método descrito por Kim et al, Eur J of Immunol 24:542, 1994. De acordo com este método a proteína marcada radioativamente é injetada por via intravenosa em camundongos e a sua concentração plasmática é medida periodicamente, como uma função de tempo, por exemplo, de 3 minutos a 72 horas após a injeção. A curva de depuração assim obtida deve ser bifásica, isto é, uma fase alfa e beta fase. Para a determinação in vivo da meia-vida da proteína, a taxa de depuração na fase beta é calculada e comparada com a proteína do tipo selvagem ou não modificada. Avaliação da Eficácia Terapêutica

[000250] Os ensaios para avaliar a eficácia terapêutica estão descritos acima em relação à determinação de neutralização por uma proteína.

[000251] Em outro exemplo, a eficácia de uma proteína para tratar uma condição é avaliada usando um ensaio in vivo.

[000252] Por exemplo, a proteína é testada em um modelo animal de artrite. Modelos exemplares incluem uma cepa de camundongo SKG (Sakaguchi et al, Nature, 426:. 454-460), modelo de artrite de colágeno tipo II de camundongo, modelo de artrite de colágeno tipo II de camundongo induzida por antígeno ou modelos de artrite em várias espécies (Bendele J Musculoskel Neuron Interact, 1 (4):377-385, 2001). Nestes ensaios, a artrite é induzida e a capacidade da proteína para reduzir um ou mais sintomas de artrite, por exemplo, inflamação das articulações e/ou marcadores de inflamação no fluido sinovial é avaliada. Uma proteína que reduz um sintoma de artrite é considerada útil para o tratamento de doença ou de uma condição mediada por G- CSF (por exemplo, uma condição inflamatória mediada por G-CSF).

[000253] A proteína pode também ou alternativamente, ser testada em um modelo de COPD, por exemplo, em que um mamífero não humano (por exemplo, um roedor, tal como, um camundongo) está exposto ao fumo de cigarro. Após a exposição, o mamífero é administrado com uma proteína e o nível de inflamação pulmonar e/ou o número de neutrófilos no pulmão é avaliado ou estimado usando técnicas padrões. Uma proteína que reduz a inflamação do pulmão e/ou o número de neutrófilos é considerada útil para o tratamento de inflamação pulmonar e COPD ou uma condição mediada por G-CSF (por exemplo, uma condição inflamatória mediada por G-CSF, tal como doença pulmonar inflamatória mediada por G-CSF).

[000254] As proteínas aqui descritas podem também ser testadas em modelos in vivo da doença inflamatória neurológica. Modelos exemplares incluem modelos de EAE em que um camundongo ou rato é imunizado com uma proteína de mielina ou peptídeo derivado da mesma (por exemplo, MOG, MBP ou PLP) e uma resposta imune é gerada contra a proteína, induzindo assim um modelo de MS. Alternativamente, as células T que são imunorreativas com uma proteína de mielina são introduzidas em camundongos ou ratos para induzir a EAE. Exemplos de modelos de EAE são revistos em, por exemplo, Tsunoda and Fujinami, J Neuropathol Exp Neurol.55:673-686, 1996.

[000255] Outros modelos de MS incluem animais transgênicos que expressam receptores de células T específicos para a proteína de mielina, por exemplo, MOG, MBP ou PLP. Modelos exemplares estão descritos, por exemplo, em Bettelli et al., JEM 197:1073-1081, 2003; Illés et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 11749-11754, 2004; ou Rossi et al., J. Biomolecular Screening, 12: 481-489, 2007; ou estão comercialmente disponíveis, por exemplo, a partir de Jackson Laboratories EUA (por exemplo, camundongos 2D2 com receptores de células T transgênicas reativos com MOG).

[000256] Em outro exemplo, uma proteína aqui descrita de acordo com qualquer exemplo é testada em um modelo de uveíte. Modelos de uveíte incluem os que são induzidos por imunização de um mamífero não humano com uma proteína, tal como arrestina retiniana, recoverina ou rodopsina ou administração de endotoxina bacteriana no olho. Exemplos de modelos de uveíte são descritos, por exemplo, em Caspi, Drug Discovery Today, 3: 3-9, 2006.

[000257] Uma proteína da presente divulgação pode também ser testada em modelos de angiogênese, por exemplo, modelos de Iris Pharma Inc de angiogênese ocular, ou um modelo de células de tumor de alginato encapsuladas, e/ou por determinação da capacidade de uma célula cancerosa para metástases em um sujeito.

Condições a serem Tratadas

[000258] A presente descrição contempla o tratamento ou prevenção de qualquer condição que é causada por, ou exacerbado por G-CSF em um sujeito.Em um exemplo, a condição é uma condição autoimune ou inflamatória.

[000259] Em um exemplo, a condição inflamatória ou autoimune é uma condição inflamatória das articulações, tais como, artrite inflamatória, artrite reumatoide ou artrite idiopática, por exemplo, artrite juvenil idiopática. Em um exemplo, a condição é artrite reumatoide.

[000260] Em um exemplo, a condição inflamatória ou autoimune é uma condição inflamatória do olho.Por exemplo, a condição é uveíte.

[000261] Em um exemplo, a condição inflamatória ou autoimune é uma condição inflamatória do pulmão, talcomo, doença pulmonar associada com a infiltração de neutrófilos, por exemplo, COPD. Em um exemplo, a condição é a COPD.

[000262] Em um exemplo, a condição inflamatória ou autoimune é uma condição inflamatória neurológica, tal como, doença de Devic, uma infecção viral no cérebro ou a esclerose múltipla. Em um exemplo, a condição é a esclerose múltipla, que inclui a esclerose múltipla progressiva crônica ou esclerose múltipla remitente-recorrente.

[000263] Em outro exemplo, a condição é câncer (incluindo a angiogênese dos mesmos) ou metástases do mesmo.

[000264] Em um exemplo, o sujeito é resistente a, não responde adequadamente a, ou não é adequado para o tratamento com outro composto usado para tratar a condição. Por exemplo, o sujeito que sofre de uma condição autoimune ou inflamatória é resistente a, não responde adequadamente a, ou não é adequado para o tratamento com um corticosteroide e/ou imunossupressor e/ou ciclofosfamida e/ou metotrexato e/ou um anticorpo anti-TNF ou receptor de TNF solúvel e/ou um anticorpo anti-CD20 e/ou um anticorpo anti-IL6 e/ou um anticorpo anti-CD22.

Composições

[000265] Em alguns exemplos, uma proteína, tal como aqui descrita pode ser administrada por via oral, parentérica, por inalação de spray, adsorção, absorção, por via tópica, por via retal, por via nasal, bucal, por via vaginal, por via intraventricular, por meio de um reservatório implantado em formulações de dosagem contendo veículoes farmaceuticamente aceitáveis convencionais não tóxicos, ou por qualquer outra forma de dosagem conveniente. O termo "parentérica", tal como aqui usado, inclui injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal, e as técnicas de injeção ou infusão intracraniana.

[000266] Os métodos para a preparação de uma proteína em uma forma adequada para administração a um sujeito (por exemplo, uma composição farmacêutica) são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, métodos como descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences (18° ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990) and U.S. Pharmacopeia: National Formulary (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1984).

[000267] As composições farmacêuticas da presente divulgação são particularmente úteis para administração parentérica, tais como administração intravenosa ou administração em uma cavidade corporal ou lúmen de um órgão ou articulação. As composições para administração irão geralmente compreender uma solução de proteína dissolvida em um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um veículo aquoso. Uma variedade de veículos aquosos pode ser usada, por exemplo, solução salina tamponada e semelhantes. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para aproximar condições fisiológicas tais como ajuste do pH e agentes tamponantes, agentes de ajuste de toxicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio e semelhantes. A concentração de proteínas da presente divulgação nestas formulações pode variar amplamente, e será selecionada principalmente com base em volumes de fluido, viscosidades, peso corporal e semelhantes, de acordo com o modo de administração particular selecionado e as necessidades do paciente. Veículoes exemplares incluem água, salina, solução de Ringer, solução de dextrose, e 5% de albumina de soro humano. Os veículos não aquosos, tais como óleos misturados e oleato de etila também podem ser usados. Os lipossomas também podem ser usados como veículos. Os veículos podem conter quantidades menores de aditivos, que aumentam a isotonicidade e a estabilidade química, por exemplo, tampões e conservantes.

[000268] Mediante a formulação, as proteínas da presente descrição irão ser administradas de um modo compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade tal que seja terapeuticamente/profilaticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como o tipo de soluções injetáveis descrito acima, mas outras formas, farmaceuticamente aceitáveis, são também contempladas, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas ou outras formas sólidas para administração oral, supositórios, pessários, soluções nasais ou sprays, aerossóis, inalantes, formas lipossomais e semelhantes. Também podem ser usadas cápsulas ou composições farmacêuticas de "liberação lenta".As formulações de liberação lenta são, geralmente, concebidas para dar um nível de fármaco constante ao longo de um período prolongado e podem ser usadas para distribuir os compostos da presente divulgação.

[000269] O WO2002/080967 descreve composições e métodos para administração de composições de aerossol que compreendem anticorpos para o tratamento de, por exemplo, asma, que também são adequados para a administração de uma proteína da presente divulgação.

Terapias de Combinação

[000270] Em um exemplo, uma proteína da presente divulgação é administrada em combinação com um outro composto útil para o tratamento de uma doença ou condição aqui descrita, quer como etapas de tratamento combinadas ou adicionais ou como componentes adicionais de uma formulação terapêutica.

[000271] Por exemplo, o outro composto é um composto anti- inflamatório.Alternativamente ou adicionalmente, o outro composto é um imunossupressor. Alternativamente ou adicionalmente, o outro composto é um corticosteroide, tal como a prednisona e/ou prednisolona. Alternativamente ou adicionalmente, o outro composto é metotrexato.Alternativamente ou adicionalmente, o outro composto é ciclofosfamida.Alternativamente ou adicionalmente, o outro composto é mofetil micofenolato.Alternativamente ou adicionalmente, o outro composto é um anticorpo anti -CD20 (por exemplo, rituximab ou ofatumab).Alternativamente ou adicionalmente, o outro composto é um anticorpo anti-CD22 (por exemplo, epratuzumab). Alternativamente ou adicionalmente, o outro composto é um anticorpo anti-TNF (por exemplo, o infliximab ou adalimumab ou golimumab) ou o receptor de TNF solúvel (por exemplo, o etanercept). Alternativamente ou adicionalmente, o outro composto é um antagonista de CTLA-4 (por exemplo, o abatacept, CTLA4-Ig).Alternativamente ou adicionalmente, o outro composto é um anticorpo anti-IL-6. Alternativamente ou adicionalmente, o outro composto é um antagonista BLys, tal como um anticorpo anti-BLys (por exemplo, belimumab).

[000272] Em outro exemplo, o outro composto é um fármaco de quimioterapia ou outros fármacos usados para o tratamento de câncer.

[000273] Em outro exemplo, a proteína aqui descrita é administrada antes ou após a radioterapia para o tratamento do câncer.

Dosagens e Tempo de Administração

[000274] As dosagens adequadas de proteínas da presente divulgação irão variar dependendo da proteína específica, da condição a ser tratada e/ou do objeto a ser tratado. Está dentro da capacidade de um médico qualificado determinar uma dosagem adequada, por exemplo, por iniciar com uma dosagem subótima e incrementalmente modificar a dose para determinar a dosagem ótima, ou útil. Alternativamente, para determinar uma dosagem apropriada para o tratamento/profilaxia, são usados os dados dos ensaios de cultura de células e estudos com animais, em que uma dose adequada está dentro de uma faixa de concentrações que inclui a ED50 do composto ativo com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração usada.Uma dose terapeuticamente/profilaticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração no plasma em circulação que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto que atinge uma inibição semimáxima dos sintomas) como determinada em cultura celular. Tal informação pode ser usada para determinar com maior precisão as doses úteis em humanos. Níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência.

[000275] Em alguns exemplos, um método da presente divulgação compreende a administração de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de uma proteína aqui descrita.

[000276] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é a quantidade que, quando administrada a um sujeito em necessidade de tratamento, melhora o prognóstico e/ou estado do sujeito e/ou que reduz ou inibe um ou mais sintomas de uma condição clínica aqui descrita para um nível que é inferior ao observado e aceito como característica de diagnóstico clínico ou clinica dessa condição. A quantidade a ser administrada a um paciente irá depender das características específicas do estado a ser tratado, do tipo e estágio da doença a ser tratada, do modo de administração e das características do sujeito, tais como estado geral de saúde, outras doenças, a idade, o sexo, o genótipo e o peso corporal. Um versado na técnica será capaz de determinar as dosagens apropriadas dependendo destes e de outros fatores. Por conseguinte, este termo não deve ser interpretado de forma a limitar a presente divulgação a uma quantidade específica, por exemplo, peso ou quantidade de proteína(s), em vez disso, a presente divulgação engloba qualquer quantidade de proteína(s) suficiente para se atingir o resultado indicado em um sujeito. Em um exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína não induz a neutropenia.

[000277] Tal como aqui usado, o termo "quantidade profilaticamente eficaz" deve ser tomado para significar uma quantidade suficiente de uma proteína para prevenir ou inibir ou retardar o aparecimento de um ou mais sintomas detectáveis de uma condição clínica. O versado na técnica estará ciente de que tal quantidade vai variar dependendo, por exemplo, da(s) proteína específica administrada e/ou o sujeito particular e/ou o tipo ou a gravidade ou o nível de condição e/ou predisposição (genética ou outra) para a condição. Por conseguinte, este termo não deve ser interpretado de forma a limitar a presente divulgação a uma quantidade específica, por exemplo, o peso ou a quantidade de proteína(s), em vez disso, a presente divulgação engloba qualquer quantidade de proteína(s) suficiente para se atingir o resultado indicado em um sujeito. Em um exemplo, uma quantidade profilaticamente eficaz da proteína não induz a neutropenia.

[000278] Para a administração in vivo das proteínas aqui descritas, as quantidades de dosagem normais podem variar de cerca de 10ng/kg até cerca de 100mg/kg de peso do corpo de um sujeito ou mais por dia. Exemplos de dosagens e faixas das mesmas são aqui descritos. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da gravidade da doença ou distúrbio a ser tratado, o tratamento pode ser mantido até uma supressão desejada dos sintomas ser alcançada.

[000279] Em alguns exemplos, a proteína é administrada a uma dose inicial (ou carregamento), de entre cerca de 1mg/kg a cerca de 30mg/kg, tal como de cerca de 1 mg/kg a cerca de 10mg/kg, ou cerca de 1mg/kg ou cerca de 2 mg/kg ou 5mg/kg. A proteína pode então ser administrada em uma dose de manutenção mais baixa, entre cerca de 0,01mg/kg a cerca de 2mg/kg, tals como de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 1 mg/kg, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 1mg/kg, como cerca de 0,1 mg/kg ou 0,5 mg/kg ou 1mg/kg. As doses de manutenção podem ser administradas a cada 7-30 dias, tal como, a cada 10-15 dias, por exemplo, a cada 10 ou 11 ou 12 ou 13 ou 14 ou 15 dias.

[000280] Em alguns exemplos, a proteína é administrada a uma dose de entre cerca de 0,01mg/kg a cerca de 50mg/kg, tal como entre cerca de 0,05 mg/kg g a cerca de 30mg/kg, por exemplo, entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 20mg/kg, por exemplo, entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10mg/kg, tal como entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 2mg/kg. Por exemplo, a proteína é administrada a uma dose de entre cerca de 0,01mg/kg a cerca de 5mg/kg, tais como desde cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 2mg/kg, tal como cerca de 0,2 mg/kg ou 0,3 mg/kg ou 0,5 mg/kg ou 1mg/kg ou 1,5mg/kg (por exemplo, sem uma dose de carga maior ou dose de carga menor). Em alguns exemplos, várias doses são administradas, por exemplo, a cada 7-30 dias, como por exemplo, a cada 10-22 dias, por exemplo, a cada 10-15 dias, por exemplo, a cada 10 ou 11 ou 12 ou 13 ou 14 ou 15 ou 16 ou 17 ou 18 ou 19 ou 20 ou 21 ou 22 dias. Por exemplo, a proteína é administrada a cada 7 dias ou a cada 14 dias ou a cada 21 dias.

[000281] Em alguns exemplos, no momento de iniciar a terapia, o mamífero é administrado com a proteína, em não mais do que 7 dias consecutivos ou 6 dias consecutivos, ou 5 dias consecutivos ou 4 dias consecutivos.

[000282] No caso de um mamífero que não estiver respondendo adequadamente ao tratamento, doses múltiplas em uma semana podem ser administradas. Alternativamente, ou em adição, as doses crescentes podem ser administradas.

[000283] Em outro exemplo, para os mamíferos que experimentam uma reação adversa, a dose inicial (ou carga) pode ser dividida em vários dias em uma semana ou mais numerosos dias consecutivos.

[000284] A administração de uma proteína de acordo com os métodos da presente divulgação pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do receptor, se o efeito da administração é terapêutico ou profilático, e outros fatores conhecidos dos médicos especializados. A administração de uma proteína pode ser essencialmente contínua ao longo de um período de tempo pré- selecionado ou pode ser em uma série de doses espaçadas, por exemplo, durante ou após o desenvolvimento de uma condição.

Exemplos não Limitantes Métodos

[000285] Os domínios de Ig e CRH de G-CSFR estão envolvidos na ligação ao ligante e dimerização de receptor (Layton et al., J. Biol Chem, 272: 29735-29741, 1997 and Fukunaga et al, EMBO J. 10: 2855-2865 1991). As formas solúveis de G-CSFR (com uma marcação de poli- histidina C-terminal, ou uma sequência de Fc) compreendendo essas porções do receptor têm sido usadas em vários estudos do receptor, e mutação dos resíduos de cisteína livre nas posições 78, 163, e 228 dos receptores ajuda na expressão e isolamento do polipeptídeo de receptor solúvel (Mine et al., Biochem., 43: 2458-2464, 2004), sem afetar a ligação ao ligante. Nos presentes estudos foram geralmente usadas formas solúveis do receptor que compreendem os aminoácidos 25-335 de hG-CSFR com mutações C78A, C163S e C228S (por exemplo, SEQ ID NO: 1) e o segmento correspondente de cynoG-CSFR com as mutações de cisteína foi geralmente usado para estudos sobre o receptor de macaco cinomolgo. Várias mutações pontuais do receptor solúvel de SEQ ID NO: 1 também têm sido usadas. A referência a hG- CSFR-Fc significa o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, em que a marcação de poli-histidina C-terminal foi substituída por uma sequência de Fc. O cynoG-CSFR-Fc significa o segmento correspondente da cynoG-CSFR com uma sequência de Fc ligada ao seu C-terminal. Em alguns exemplos, os domínios extracelulares correspondentes do receptor de tipo selvagem foram usados, e nesses casos é especificamente indicado. Os inventores demonstraram que os anticorpos e as proteínas que compreendem os sítios de ligação a antígeno dos mesmos (por exemplo, Fab) ligam-se aos polipeptídeos de hG-CSF do tipo selvagem e estas proteínas mutantes com afinidade muito semelhante. Assim, os estudos que utilizam as proteínas mutantes são um modelo de estudos usando o hG-CSFR do tipo selvagem. Identificação de Fabs a partir de Bibliotecas de Exibição de Fagos

[000286] A biblioteca de exibição de fagos foi rastreada quanto a clones que se ligam a hG-CSFR que eluiram após a adição de ligante de G-CSF. Os Fabs foram avaliados quanto à sua capacidade de se ligar a hG-CSFR, competir com a ligação de G-CSF, e reatividade cruzada de G-CSFR de cinomolgo e alguns clones reformatados como anticorpos de IgG4. A potência foi então testada através de neutralização da proliferação mediada por G-CSF a uma linhagem de células de BaF3 transfectada estavelmente com hG-CSFR (descrita abaixo) e inibição da formação de CFU-G, na presença de G-CSF. Construção do Vetor de Expressão de Mamíferos para a Expressão de IgG

[000287] Os vetores de expressão de mamíferos foram construídos usando técnicas de biologia molecular convencionais por clonagem de toda a cadeia leve (domínios variáveis e constantes) e da região variável da cadeia pesada a partir dos constructos de Fab derivados de fagos selecionados. Cultura Celular e Transfecção Transiente

[000288] As células 293-T adaptadas em suspensão isenta de soro foram obtidas a partir de Genechoice Inc. As células foram cultivadas em meio de Expressão FreeStyle™ (Invitrogen) suplementado com reagente de penicilina/estreptomicina/fungizona (Invitrogen). Antes da transfecção, as células foram mantidas a 37°C em incubadoras umidificadas com uma atmosfera de CO2 a 8%.

[000289] A transfecção transiente de vetores de expressão de mamíferos usando células 293-T foi realizada usando o reagente de transfecção 293fectin (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os sobrenadantes de cultura de células foram colhidos depois de 5 dias de incubação por centrifugação a 2500 rpm e foram, em seguida, passados através de um filtro de 0,45 μM (Nalgene), antes de purificação, usando métodos convencionais para purificação de IgG. Anticorpos de Controle

[000290] Os anticorpos monoclonais de murinos 711, 744 e 774 (Layton et al., Growth Factors, 14: 117-130, 1997) foram usados como anticorpos de controle de camundongos. Medições de Afinidade de Fabs

[000291] Para medir a afinidade de Fab para o G-CSFR ou G-CSFR- Fc, os Fabs foram expressos em E. coli e a afinidade medida usando um Biacore 2000. Medição das Cinéticas de Ligação para mAbs

[000292] O anticorpo anti-humano (IgG de cabra anti-humano (gama) adsorvida em camundongo, Invitrogen, Cat N.° H10500) ou um anticorpo específico de Fc anti camundongo (Jackson Immuno Research Labs inc. Cat N.° 515-005-071) foi quimicamente imobilizado em uma superfície do sensor CM-5 usando química de acoplamento de amina.

[000293] Os anticorpos imobilizados foram então usados para capturar mAbs de anti hG-CSFR a partir da solução. Proteínas de hG- CSFR solúveis (como descrito na secção dos métodos) foram injetadas sobre o mAb capturado em várias concentrações. Os mAbs foram capturados durante 180 segundos em 0,3μg/ml. O hG-CSFR solúvel a 0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 nM (em duplicata) foi injetado durante 10 minutos e a dissociação foi monitorada durante 30 minutos. Respostas de uma célula de fluxo de referência (no qual o mAb não foi capturado, mas de outra forma tratado de forma idêntica), foram subtraídos.As respostas de uma injeção em branco foram então subtraídas dos sensorgramas resultantes.

[000294] As respostas finais corrigidas foram ajustadas por meio de regressão não linear para um modelo que descreve cinéticas de 1:1, incluindo um termo para limitação de transporte de massa. O valor de Rmax foi ajustado no local, para contabilizar ligeiros desvios no nível do mAb capturado. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi determinada. Análise Cinética da Fab C1.2, 5D11, 711 e 744

[000295] Os fragmentos Fab foram gerados pela digestão de papaína onde 3mg de anticorpo foram digeridos (1:500) com papaína pré-ativada durante 40 minutos conforme instruções usando um kit de digestão com papaína (Sigma, EUA). O Fab resultante foi purificado, por adsorção, longe de Fc residual e o anticorpo não digerido usando purificação com proteína A (mAbSelect, GE, Suécia).

[000296] A análise de biossensores em duplicata de Fab foram realizadas usando um Biacore 2000 (GE, Suécia) com uma diluição de duplicação dos anticorpos de Fab (100 nM a 0,39 nM em 0,1 mg/ml de BSA) a uma taxa de fluxo de 30μl/min. A ligação (100μl) foi monitorada para células de fluxo respectivas contendo controle em branco imobilizado, cyno G-CSFR-Fc imobilizado, G-CSFR-Fc humano imobilizado e G-CSFR humana imobilizado. As proteínas receptoras (20μg por ml em 20 mM de Acetato de sódio de pH 4,5) foram previamente imobilizados para um chip CM5 usando um kit de acoplamento de NHS/EDC, conforme as instruções do fabricante (Biacore GE, Suécia). Os valores de imobilização alvo foram fixados em 700, 700 e 500 unidades de ressonância para cyno G-CSFR-Fc, hG- CSFR-Fc e hG-CSFR, respectivamente. A imobilização de chip foi temperada com etanolamina 50 mM, pH 8,0. A dissociação da ligação de superfície foi monitorada durante 1000 segundo antes da desorção do complexo restante usando ácido fosfórico 50 mM. Ligação de referência foi então subtraída a partir do canal de controle e cinética gerada usando o software biaevaluation na Biacore 2000.

[000297] A análise de biossensor em duplicata dos anticorpos c1.2 e 5D11 em IgG4 fomat foram realizadas usando um Biacore 2000 com uma diluição de duplicação dos anticorpos (312nM a 2.4nM em 0,1mg/ml de BSA), a uma taxa de fluxo de 30ul/min. A ligação (100μl) foi monitorada para células de fluxo respectivos contendo controle imobilizado em branco, cyno-G-CSFR-Fc imobilizado, hG-CSFR-Fc imobilizado e hG-CSFR imobilizado. As proteínas receptoras (20 ug por ml em Acetato de sódio 20 mM pH 4,5) foram previamente imobilizadas para um chip CM5 usando um kit de acoplamento de NHS/EDC, conforme as instruções do fabricante (Biacore GE, Suécia). Os valores de imobilização alvo foram fixados em 700, 700 e 500 unidades de ressonância para cyno-G-CSFR-Fc, hG-CSFR-Fc e hG-CSFR, respectivamente. A imobilização de Chip foi temperada com etanolamina 50 mM, pH 8,0. A dissociação da ligação de superfície foi monitorada durante 1000 segundos antes da dessorção do complexo restante usando ácido fosfórico 50 mM. A ligação de referência foi então subtraída a partir do canal de controle e cinética gerada usando o software biaevaluation em Biacore 2000. Cinética de Afinidade de mAb da BIAcore de Anticorpos C1.2G Maturados

[000298] Anticorpo anti-humano (IgG de cabra anti-humano (gama) adsorvido em camundongo, Invitrogen, Cat N.° H10500) foi quimicamente imobilizado em uma superfície de sensor CM-5 usando química de acoplamento de amina e, em seguida, usado para capturar mAbs anti hG-CSFR maduros de afinidade a C1.2G em 1mg/ml por 3 minutos. O hG-CSFR solúvel foi então injetado sobre o mAb capturado em 0, 10 e 40 nM. O hG-CSFR solúvel foi injetado durante 5 minutos e a dissociação foi monitorada durante 30 minutos. As respostas de uma célula de fluxo de referência (na qual o mAb não foi capturado, mas de outra forma, tratado de forma idêntica), foram subtraídas. As respostas de uma injeção em branco foram então subtraídas dos sensorgramas resultantes.

[000299] As respostas finais corrigidas foram ajustadas por meio de regressão não linear para um modelo que descreve cinética de 1:1, incluindo um termo para limitação de transporte de massa. O valor de Rmax foi ajustado no local, para contabilizar ligeiros desvios no nível de mAb capturado. A taxa de association (ka), a taxa de dissociação (kd) e constante de dissociação de equilíbrio (KD) foram determinadas. Bioensaio de Proliferação de hG-CSFR/BaF3 - Redução de MTT

[000300] As células BaF3 que expressam de hG-CSFR foram obtidas a partir do Ludwig Institute Melbourne. Para avaliar a inibição da proliferação mediada por G-CSF por anticorpos anti-hG-CSFR, as diluições em série de anticorpo foram adicionadas a 2 x104 células/poço em meio DME com 5% de FCS e 0,5ng/ml de hGCSF em placas de 96 poços e incubadas durante 48 horas a 37°C, 10% de CO2. A proliferação celular foi determinada pela redução de MTT e medida pela absorção a 490 nM,.

[000301] Incorporação de Bioensaio de Proliferação de hG- CSFR/BaF3 - 3H-timidina Células BAF/3 manipuladas para expressar G-CSFR humana e que proliferam em resposta a G-CSF humano foram usadas para medir a capacidade de vários anticorpos monoclonais para neutralizar a atividade de G-CSF. As células foram plaqueadas a 1 x 104 células em placas de 96 poços em RPMI/105FCS na presença de 10ng/mL de G-CSF humano e concentrações crescentes de diferentes anticorpos monoclonais anti-G-CSFR, durante 48 horas a 37°C. As células foram pulsadas com 3H-timidina durante as últimas 6 horas de cultura, antes de serem colhidas em filtros de fibra de vidro e o nível de timidina radioativa incorporada no DNA foi determinado por contagem de cintilação líquida. Bioensaio de Progenitor CFU-G Humano

[000302] As células da medula óssea CD34+ foram incubadas em meio semissólido, na presença de 10ng/ml de fator das células-tronco, 10ng/ml de hG-CSF e concentrações de titulação de anticorpos do anticorpo de teste. CFU-G foram enumerados após 14 dias de cultura. Comparação de Epitopo - Ligação de Competição

[000303] Este modelo desta experiência é construído sobre a premissa de que para 2 anticorpos a serem capazes de simultaneamente se ligar a uma única molécula, os epitopos dos 2 anticorpos têm que ser diferentes.

[000304] G-CSFR solúvel de SEQ ID NO: 1 foi capturado a partir de uma solução por um anticorpo imobilizado em superfície. Um segundo anticorpo foi então injetado sobre o complexo. As respostas de uma célula de fluxo de referência (na qual hG-CSFR solúvel não foi capturado, mas de outra forma, foi tratado de forma idêntica), foram subtraídas. A ligação do segundo anticorpo indica que os epitopos dos 2 anticorpos diferem.

[000305] As respostas medidas no final da fase de ligação do anticorpo foram divididas pela resposta no final da fase de captura de hG-CSFR, para corrigir nível de ligação do anticorpo para a quantidade de hG-CSFR capturado. Estas respostas de captura corrigida foram então usadas para comparar a ligação de cada anticorpo a hG-CSFR na presença dos outros anticorpos.

[000306] Os anticorpos C1.2, 5D11, 711 e 744 foram quimicamente imobilizados sobre uma superfície de CM-5 sensor usando química de acoplamento de amina. hG-CSFR solúvel foi capturado em 100 nM por 180 segundos. Cada um dos anticorpos foi então injetado em duplicata em um hG-CSFR capturado a 100 nM por 180 segundos.Uma injeção de branco de tampão apenas foi também realizada. Mapeamento de Epitopos de C1.2G, 711, 744 e 774

[000307] Uma série de mutações pontuais de alanina de SEQ ID NO: 1 foi obtida, expressa em células HEK293 e, em seguida, purificada. A afinidade de ligação destes mutantes para anticorpos C1.2, 744 e 774 foi medida e comparada com a de SEQ ID NO: 1. Se uma mutação resultou em uma alteração da afinidade de mais do que um fator de 2 da de SEQ ID NO: 1, o resíduo foi considerado contribuir para a interação de ligação, e, assim, é provável que esteja dentro ou perto do epitopo. Um terceiro mAb (711) com um epitopo separado e distinto para C1.2, 744 e 774, foi incluído como um controle, a fim de ter em conta quaisquer alteraçãos estruturais maiores trazidas pelas mutações.

[000308] Anticorpo anti-humano (IgG de cabra anti-humana (gama) adsorvido em camundongo, Invitrogen, Cat N.° H10500) ou anticorpo específico de Fc anticamundongo (Jackson Immuno Research Labs inc. Cat N.° 515-005-071) foi quimicamente imobilizado em uma superfície do sensor CM-5 usando química de acoplamento de amina. Os anticorpos imobilizados foram então usados para capturar mAbs anti- hG-CSFR a partir da solução. O domínio de ligação a ligante de hG- CSFR do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) e cada mutação pontual de alanina foram então injetados sobre mAbs capturados em várias concentrações. As respostas de uma célula de fluxo de referência (em que o mAb não foi capturado, mas de outra forma, foi tratado de forma idêntica), foram subtraídas.As respostas de uma injeção em branco foram então subtraídas dos sensorgramas resultantes.

[000309] As respostas finais corrigidas foram ajustadas por meio de regressão não linear para um modelo que descreve cinética de 1:1, incluindo um termo para limitação de transporte de massa. O valor de Rmax foi ajustado no local, para contabilizar ligeiros desvios no nível de mAb capturado. A taxa association (ka), a taxa de dissociação (kd) e constante de dissociação de equilíbrio (KD) foram determinadas.

[000310] O mAb de linhagem germinativa de C1.2 foi capturado em 0,3ug/ml por 180s, 711 a 1μg/ml por 180 segundos e 744 e 774 a 5μg/ml por 180s.

[000311] Para a cinética de C1.2 e 744, WT hG-CSFR e cada mutante de ala foram injetados a 0, 2, 10, 50 e 250 nM por 300 segundos e a dissociação monitorada por mais 1800 segundos.

[000312] Para a cinética do anticorpo 774, WT hG-CSFR e cada mutante de ala foram injetados 0, 2, 10, 50 e 250 nM por 300 segundos e a dissociação monitorada por mais de 600 segundos.

[000313] Para a cinética do anticorpo 711, WT hG-CSFR e cada mutante de ala foi injetado a 0 e 100 nM por 180 segundos e a dissociação monitorada durante mais 180 segundos. Exemplo 1: Anticorpos Anti-hG-CSFR Completamente Humanos são Potentes Inibidores de Sinalização de G-CSF

[000314] Usando medições de afinidade e o ensaio de proliferação de BaF3 descrito acima, os anticorpos 711 e 744 foram avaliados para a afinidade a hG-CSFR e ensaios de neutralização de G-CSF. O anticorpo 711 foi verificado se ligar a fusão de hG-CSFR-Fc (com base na SEQ ID NO: 1 tal como discutido nos métodos) com uma afinidade maior do que o anticorpo 744 (KD de 0,86nM e 8,7nM, respectivamente). Usando o bioensaio baseado em MTT descrito acima, o anticorpo 711 foi verificado igualmente inibir de forma mais potente a proliferação de células mediadas por G-CSF do que o anticorpo 744 (IC50 (nM G-CSF) de 8,8nM e 2,4 nM, respectivamente).

[000315] Usando o ensaio de incorporação de 3H-timidina, o anticorpo 711 foi verificado inibir a proliferação celular mediada por G-CSF com uma IC50 de 10,1μg/ml; o anticorpo 774 foi verificado inibir a proliferação celular mediada por G-CSF com uma IC50 de 37,4μg/ml e a IC50 para o anticorpo 744 não foi determinável (ver Figura 1).

[000316] Os anticorpos humanos isolados a partir de uma biblioteca de exibição de fagos (anticorpos C1.2 e 5D11) e o anticorpo monoclonal de camundongo 711 foram avaliados quanto à sua capacidade para inibir a proliferação mediada por G-CSF de células BaF3 usando o bioensaio descrito acima. Os resultados mostraram que o anticorpo C1.2 inibiu a proliferação de BaF3 com um IC50 de 0,5 nM; anticorpo 5D11 inibiu a proliferação de uma IC50 5,9nM; e 711 inibiu a proliferação, com uma IC50 de 3,4nM.

[000317] Os anticorpos também foram avaliados quanto à sua capacidade para reduzir ou inibir a formação de CFU-G, por células da medula óssea CD34+ na presença de G-CSF como acima descrito. Os resultados mostraram que o anticorpo C1.2 inibiu a formação de CFU- G, com uma IC50 de 0,016nM; o anticorpo 5D11 inibiu a formação de CFU-G, com uma IC50 de 0,039nM e 711 inibiu a formação de CFU-G, com uma IC50 de 0,411nM.

[000318] Com base nestes ensaios, os anticorpos humanos C1.2 e 5D11 são mais potentes do que 711 para inibir a formação de CFU-G e C1.2 é o anticorpo mais potente em ambos os bioensaios. Exemplo 2: Afinidade de Anticorpos para G-CSFR Humano e G-CSFR de Macaco Cinomolgos

[000319] As afinidades das formas de Fabs e IgG4 de 5D11 e C1.2 e os Fabs de 711 e 744 também foram avaliadas para determinar as suas afinidades para o domínio de ligação a ligante de hG-CSFR (SEQ ID NO: 1), hG-CSFR-Fc e G-CSFR-Fc de macaco cinomolgo (com base na SEQ ID NO: 1 tal como discutido nos métodos). Nestes ensaios, as regiões de G-CSFR foram imobilizadas e a ligação do fragmento ou anticorpo indicado para o polipeptídeo imobilizado foi determinada tal como descrito em mais detalhe nos métodos gerais (Seção intitulada "Análise cinética de Fab C1.2, 5D11, 711 e 744"). Os resultados são apresentados na Tabela 1.

[000320] Estes dados mostram que 5D11 e C1.2 possuem elevadas afinidades para o hG-CSFR e que estas afinidades são melhoradas quando os Fabs são expressos como anticorpos de lgG4 completos. Além disso, as afinidades de hG-CSFR e cynoG-CSFR para 5D11 ou C1.2 são semelhantes.C1.2 tem maior afinidade para hG-CSFR de 5D11.

[000321] O Fab do anticorpo 711 mostrou ter uma afinidade para hG- CSFR-Fc de 0,86nM e para cynoG- CSFR de 1,8μM. O Fab do anticorpo 744 mostrou ter uma afinidade para hG-CSFR-Fc de 8,7nM e para cynoG-CSFR de > 10 μM. Assim, esses Fabs têm afinidade muito mais pobre para cynoG-CSFR que eles têm para hG-CSFR.

[000322] Os ensaios recíprocos foram também realizados (ou seja, em que os anticorpos foram imobilizados e a ligação de h-GCSFR tipo selvagem ou cynoG-CSFR tipo selvagem com o anticorpo imobilizado foi determinada de acordo com os métodos gerais (seção intitulada "Medição da Cinética de Ligação para mAbs"). Os resultados representativos são mostrados na Tabela 2. Tabela2: Afinidades Representativas de Anticorpoies C1.2G, 5D11, 711, 744 e 774 para hG-CSFR do tipo selvagem ou cynoG-CSFR do tipo selvagem.

[000323] Estes dados mostram que C1.2G e 5D11 se ligam a cynoG- CSFR do tipo selvagem com afinidades mais elevadas do que 711, 744 e 774. Além disso, a afinidade de C1.2G para o hG-CSFR do tipo selvagem e cynoG-CSFR tipo selvagem estão dentro de cerca de 3 vezes uma da outra e a afinidade de 5D11 para o tipo selvagem de hG- CSFR e cynoG-CSFR tipo selvagem estão dentro de cerca de 13 vezes de uma outra. Exemplo 3: Linhagem Germinativa de C1.2

[000324] Para minimizar o potencial de imunogenicidade, a região de estrutura variável de C1.2 foi alterada para coincidir com a estrutura da linhagem germinativa humana mais próxima. Isto exigiu uma única alteração na estrutura da cadeia pesada e cinco alterações na cadeia leve, e resultou em uma VH com uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4 e uma VL, com uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 5. A afinidade do anticorpo de linhagem germinativa (C1.2G) para G-CSFR foi semelhante a C1.2 (ka 9,54 x 104 ± 5,5 x 103; kd 1,31 x 10-4 ± 2,6 x 10-6; KD de 1,37 ± 0,07 (N = 8)). Afinidade de C1.2G para hG-CSFR expressa na superfície celular de células BaF3 mostrou ser 257pM.

[000325] Usando o ensaio de incorporação de 3H-timidina descrito acima, o anticorpo C1.2G foi verificado inibir a proliferação celular mediada por G-CSF com uma IC50 de 0,8 μg/ml (Figura 1).

[000326] A reformatação deste anticorpo em uma IgG4 estabilizada produziu um anticorpo que compreende uma cadeia pesada com uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 64 e uma cadeia leve com uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 65.

[000327] Quando expresso em células de CHO, uma variante de lisina do anticorpo foi observada, isto é, em que uma ou ambas as cadeias pesadas não apresentavam um resíduo de lisina C-terminal (ou seja, compreendendo, assim, uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 64). Exemplo 4: Mapeamento de Epitopo Ligação de Competição

[000328] Os dados publicados mostraram que mAb711 e mAb744 se ligaram a diferentes domínios do hG-CSFR. Os experimentos de ligação de competição mostraram que mAb711 mas não mAb744 era capaz de se ligar ao hG-CSFR subsequente para a ligação de C1.2 Ab sugerindo que C1.2 se liga a uma região semelhante do receptor como mAb744, mas uma região diferente de mAb711. Excisão de Epitopo para Identificar Peptídeos Envolvidos na Ligação de C1.2

[000329] A excisão do epitopo seguida por análise de espectrometria de massa foi usada para identificar os quatro peptídeos do hG-CSFR que estavam envolvidos na ligação de C1.2. Neste método, a proteína de hG-CSFR é primeiro ligada a um anticorpo C1.2 imobilizado e, em seguida, digerida com as enzimas proteolíticas. Os peptídeos ligados são então identificados por MALDI e espectrometria de massa de Eletrospray. Os quatro peptídeos identificados pela presente abordagem foram mapeados para as posições 111-115, 170-176, 218234 e/ou 286-300 de hG-CSFR (SEQ ID NO: 1). Ligação de C1.2 e mAb744 para Mutantes da Região de hG- CSFR

[000330] Os dados publicados (Tamada et al Proc Natl Acad Sci EUA. 103:3135-3140, 2006; Aritomi et al Acta Crystallogr D Biol Crystallogr; 56:751-753 1999) identificaram resíduos de superfície sobre o hG- CSFR.Uma série destes resíduos localizados nos quatro peptídeos identificados por experiências de excisão de epitopo foram substituídos por alanina e as formas mutantes resultantes de uma região de hG- CSFR foram expressas e purificadas. A ligação de C1.2 e mAb744 para cada um destes mutantes foi avaliada e os resíduos chaves envolvidos na ligação foram identificados. Os resultados são mostrados na Figura 2A. A substituição por Alanina de resíduos K167 e H168 resultou em uma perda de ligação completa por mAb744, enquanto a ligação de C1.2 não foi afetada. Em contraste, a substituição por alanina de resíduos R287 resultou em uma perda de ligação completa por C1.2 com nenhum efeito na ligação de mAb744. Outros resíduos que reduziram significativamente a ligação do C1.2 foram L111, L171, Y172, M198 e H237. MAb744 se ligou a estes mutantes com uma afinidade semelhante à do receptor do tipo selvagem.

[000331] O ensaio anterior foi repetido com os mesmos anticorpos, juntamente com mAb774/. Como se mostra na Figura 2B, a substituição por alanina de resíduos K167, H168 e L169 resultou em uma perda de ligação completa por mAb774, enquanto a ligação de C1.2 não foi afetada. Tal como com o mAb 744, a substituição por alanina dos resíduos L111, Y172, H237 e R287 teve pouco ou nenhum efeito na ligação de mAb774. Exemplo 5: Maturação de Afinidade C1.2G

[000332] A maturação de afinidade foi realizada por mutação de resíduos em HCDR3 e/ou LCDR3 de C1.2G e rastreio para os Fabs que se ligaram a hG-CSFR. Bibliotecas de anticorpos mutantes foram osciladas usando proteína recombinante de hG-CSFR-Fc biotinilada, seja em uma concentração constante ao longo de várias rodadas de panning (oscilação) ou com redução das concentrações.

[000333] Após a conclusão da oscilação, uma série de clones de fagos foi selecionada a partir de cada biblioteca enriquecida e sequenciada. Os clones originais foram, então, selecionados com base em sequência e reformatados em anticorpos de IgG4/capa totalmente humanos para análise de ligação de hG-CSFR usando Biacore (seguindo os métodos gerais na seção intitulada "Medição da Cinética de Ligação para mAbs") e, em alguns casos, a capacidade para inibir a proliferação mediada por G-CSF de células BaF3. Os anticorpos reformatados com afinidades melhoradas, em comparação com o mAb C1.2G parental estão listados na Tabela 3. Tabela 3: Características de Afinidade de Anticorpos

1 A sequência é precedida pela sequência QQS 2 A sequência é seguida pela sequência PLT 3 A sequência (diferente de wt) é precedida pela sequência LGE wt - Sequência de CDR3 de C1.2G ND - não determinado Exemplo 6: C1.2G Reduz os Níveis de Neutrófilos sem Induzir Neutropenia

[000334] Macacos Cinomolgos foram administrados com G-CSF peguilado e C1.2G (10mg/kg) foi administrado 12 horas mais tarde. Como mostrado na Figura 3, C1.2 reduziu significativamente o nível de neutrófilos em comparação com os animais de controle, no entanto, não induziram a neutropenia.

[000335] Experimentos semelhantes com dosagem em macacos cinomolgos entre 0,1 e 10 mg/kg de C1.2G 2 horas antes da administração com o G-CSF também reduziu o nível de neutrófilos em comparação com os animais de controle, no entanto, não induziram a neutropenia.

Claims

1.Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína compreendendo um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que: (i) a proteína se liga a receptor de fator de estimulação de colônia de granulócito humano (hG-CSFR) e neutraliza sinalização de fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF); e (ii) a proteína inibe a proliferação induzida por G-CSF de uma célula BaF3 que expressa hG-CSFR com uma IC50 de pelo menos 1nM, em que a IC50 é determinada por cultivo de 2x104 células BaF3 na presença de 0,5 ng/ml de hG-CSF por 48 horas, e em que a proliferação de células BaF3 é determinada por medição de redução de brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT); e (iii) a proteína compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) compreendendo uma CDR1 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 6 e uma CDR2 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 7; e (iv) a proteína compreende uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo uma CDR1 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 9 e uma CDR2 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 10; e (v) a VH compreende uma CDR3 (HCDR3) e a VL compreende uma CDR3 (LCDR3) selecionadas das seguintes opções: (a) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 11; (b) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGQSSA e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSIQYPQM; (c) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSWEYPLV; (d) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência QVSWEYPLT; (e) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSWMYALF; (f) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGSGST e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSWHYPLT; (g) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSYSYPQK; (h) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSFMYPLY; (i) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGFFQE e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSYAYPQQ; (j) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSYMYPIK; (k) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência EQGWNYPLT; (l) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGMFLE e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSMWMPMG; (m) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência HFSMQYPLT; (n) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGMYDL e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSWAYGLS; (o) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGQYMF e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSFYYPFY; (p) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência ANSWGYPLT; (q) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGMYMN e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSWTYGQT; (r) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGQFMD e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSLEYPQM; (s) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGQYQF e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSFQYAQH; (t) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGQMMY e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSWMYAHM; (u) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSWVYPAW; (v) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGQSML e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSWQIKLK; (w) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência EESMNYPLT; (x) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência SQSMEYPLT; (y) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGQMVY e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSFKYPMT; (z) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGEIRE e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSWVYHLP; (aa) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGMMQS e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSIEYPAH; (bb) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência QQGMWMPLT; (cc) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGHSLA e uma LCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 11; (dd) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGQYMG e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSMWMPIF; (ee) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGQFMR e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSIGYPGS; (ff) uma HCDR3 que consiste na sequência LGELGMFHK e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSWEYAMF; (gg) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSWMYHKI; e (hh) uma HCDR3 que consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 8 e uma LCDR3 que consiste na sequência QQSFRYPFY.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: (i) o sítio de ligação a antígeno se liga a ambos receptores de fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSFR) de humanos e de macacos cinomolgos com afinidades que estão dentro de 5 vezes ou menos um do outro; e/ou (ii) a proteína se liga a um polipeptídeo compreendendo aminoácidos 1 a 311 da SEQ ID NO: 1 expressos como uma fusão com uma região de Fc de anticorpo (hG-CSFR-Fc) com uma afinidade de pelo menos 0,5nM, em que a afinidade é determinada em uma ressonância de plásmons de superfície na qual o hG-CSFR-Fc é imobilizado e a proteína é colocada em contato com o hG-CSFR-Fc imobilizado.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a VH e VL se ligam para formar um Fv compreendendo um domínio de ligação a antígeno, por exemplo, em que (i) a VH e a VL estão em uma cadeia de polipeptídeo simples, por exemplo, a proteína é: (a) um fragmento Fv de cadeia simples (scFv); (b) um scFv dimérico (di-scFv); ou (c) pelo menos um de (a) e/ou (b) ligado a uma região constante de um anticorpo, um Fc ou um domínio constante de cadeia pesada (CH) 2 e/ou CH3; ou (ii) a VL e VH estão em cadeias de polipeptídeo separadas, por exemplo, a proteína é: (a) um diacorpo; (b) um triacorpo; (c) um tetracorpo; (d) um Fab; (e) um F(ab’)2; (f) um Fv; (g) um de (a) a (f) ligado a uma região constante de um anticorpo, um Fc ou um domínio constante de cadeia pesada (CH) 2 e/ou CH3; ou (iii) um anticorpo.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é humano ou humanizado.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve (VL) que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 5; (ii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 2 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 3; (iii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 15 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 14; (iv) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 16; (v) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 17; (vi) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 18; (vii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 20 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 19; (viii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 21; (ix) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 22; (x) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 24 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 23; (xi) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 25; (xii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 26; (xiii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 28 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 27; (xiv) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 29; (xv) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 31 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 30; (xvi) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 33 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 32; (xvii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 34; (xviii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 36 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 35; (xix) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 38 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 37; (xx) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 40 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 39; (xxi) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 42 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 41; (xxii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 43; (xxiii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 45 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 44; (xxiv) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 46; (xxv) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 47; (xxvi) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 49 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 48; (xxvii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 51 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 50; (xxviii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 53 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 52; (xxix) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 54; (xxx) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 55 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 5; (xxxi) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 57 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 56; (xxxii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 59 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 58; (xxxiii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 61 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 60; (xxxiv) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 62; ou (xxxv) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 63.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a proteína é um anticorpo compreendendo: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve (VL) que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 5; ou (ii) uma VH que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 2 e uma VL que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 3.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a proteína é um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve (VL) que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 5.

8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a proteína é um anticorpo compreendendo: (i) uma cadeia pesada que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 64 ou 68 e uma cadeia leve que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 65; ou (ii) uma cadeia pesada que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 64 e uma cadeia pesada que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 68 e duas cadeias leves que consiste em uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 65.

9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento ou prevenção de uma condição mediada por fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF) em um sujeito, em que a condição é câncer ou uma doença autoimune ou uma doença inflamatória, tal como artrite, esclerose múltipla, inflamação pulmonar ou doença pulmonar obstrutiva crônica.