CN114901684A - 粒细胞集落刺激因子受体(g-csfr)的经修饰胞外结构域和结合其的细胞因子 - Google Patents

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M.福勒
M.J.布朗格
S.B.迪克西特
B.纳尔逊
M.桑奇
B.洛夫莱斯
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Abstract

本文描述了用于使用变体细胞因子受体和细胞因子对来选择性活化细胞的方法和组合物，其中所述细胞因子受体包含粒细胞集落刺激因子受体(G‑CSFR)的胞外结构域(ECD)。在某些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用于专门活化用于过继细胞转移疗法的细胞。因此，本文包括产生表达变体受体的细胞的方法，所述变体受体由不结合其天然受体的细胞因子选择性活化。本文还公开了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达包含G‑CSFR的胞外结构域的变体受体的细胞以及共同施用活化所述变体受体的变体细胞因子。

Description

粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的经修饰胞外结构域和结 合其的细胞因子
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年10月8日提交的美国临时申请号62/912,318的优先权，所述申请据此以引用的方式整体并入。
序列表
本申请含有已通过EFS-Web提交并且据此以引用的方式整体并入的序列表。所述ASCII副本在2020年10月7日创建，被命名为IKE-068WO_US_SL.txt，并且大小为85,109字节。
背景技术
技术领域
本发明涉及用于使用变体细胞因子受体和细胞因子对来选择性活化细胞的方法和组合物，其中所述细胞因子受体包含粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的变体胞外结构域(ECD)。本文还公开了通过过继细胞转移治疗受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达变体受体的细胞并施用变体细胞因子以向表达变体受体的细胞发送信号。本公开包括用于产生表达变体细胞因子和受体的细胞的核酸、表达载体和试剂盒，以及还提供用于结合变体受体的细胞因子的试剂盒。
相关技术描述
过去二十年，在通过过继细胞疗法(ACT)治疗癌症方面取得了很大进展。用天然存在的肿瘤浸润T细胞(TIL)进行的ACT现在为可重现的，在晚期黑色素瘤中产生>50％的客观临床反应率。用被工程化以识别B谱系白血病(使用CD19-定向嵌合抗原受体或CD19 CAR)的T细胞进行的ACT产生高达90％的完全反应率，大多数患者实现持久反应。受这些显著结果的推动，几家公司正在将TIL和CD19 CAR T细胞方法商业化。
用于ACT的T细胞的移植、扩增和持久性是临床安全性和有效性的重要决定因素。这通常通过在ACT转移后施用全身IL-2以及在转移前在体外将T细胞用IL-2扩增来解决。除了预期的免疫刺激作用外，全身IL-2治疗还可能导致需要严格控制以确保患者安全的严重毒性，例如血管渗漏综合征。为了管理这些风险，患者通常需要住院2-3周，并作为预防措施进入ICU。此外，IL-2诱导效应和调节(抑制性)T细胞的增殖(5)；因此，给予患者IL-2类似于同时按压油门踏板和制动踏板。CAR T细胞带来了相反的问题，即T细胞扩增和持久性可能超过安全水平。此外，它们普遍根除正常B细胞(也表达CD19)，使患者部分具有终身免疫缺陷。理想地，人们希望对过继转移后的肿瘤反应性T细胞的数量进行精确控制，包括一旦癌症被根除就消除转移的细胞的能力。其他基于细胞的疗法(例如干细胞疗法)也将受益于对输注细胞的扩增、分化和持久性的改善的控制。
人G-CSF是一种批准的治疗方法(
Figure BDA0003673999830000021
Filgrastim)，用于治疗癌症患者的中性粒细胞减少症。G-CSF是四螺旋束(Hill,CP等人Proc Natl Acad Sci U S A.1993年6月1日；90(11):5167-71)，并且G-CSF与其受体G-CSFR复合物的结构得到了很好的表征(Tamada,T等人Proc Natl Acad Sci U S A.2006年2月28日；103(9):3135-40)。G-CSF:G-CSFR复合物是2:2的异二聚体。G-CSF与G-CSFR有两个结合界面。一个界面称为位点II；它是G-CSF与G-CSFR的细胞因子受体同源(CRH)结构域之间的较大界面。第二界面称为位点III；它是G-CSF与G-CSFR的N端Ig样结构域之间的较小界面。
发明内容
在某些实施方案中，本文公开了一种受体，其包含粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的变体胞外结构域(ECD)，其中G-CSFR的变体ECD包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或其组合。在某些方面，位点II界面区中的至少一个突变位于选自由以下组成的组的G-CSFR ECD的氨基酸位置：SEQ ID NO.2的氨基酸位置141、167、168、171、172、173、174、197、199、200、202和288。在某些方面，位点II界面区中的至少一个突变选自由以下组成的G-CSFR ECD的突变的组：R141E、R167D、K168D、K168E、L171E、L172E、Y173K、Q174E、D197K、D197R、M199D、D200K、D200R、V202D、R288D和R288E。在某些方面，位点III界面区中的至少一个突变选自G-CSFR ECD的突变的组，所述G-CSFR ECD的突变的组选自由以下组成的组：SEQ ID NO.2的氨基酸位置30、41、73、75、79、86、87、88、89、91和93。在某些方面，位点III界面区中的至少一个突变选自由以下组成的G-CSFR ECD的突变的组：S30D、R41E、Q73W、F75KF、S79D、L86D、Q87D、I88E、L89A、Q91D、Q91K和E93K。在某些方面，G-CSFR ECD包含具有表6中设计编号的突变的组合；其中所述突变对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置。在某些方面，G-CSFR ECD包含以下突变：R41E、R141E和R167D。
在某些方面，本文公开的受体是嵌合受体。在某些方面，受体在细胞上表达。在某些方面，受体在免疫细胞上表达。在某些方面，所述免疫细胞任选地是T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。
在某些方面，变体G-CSF对受体的活化引起选自由以下组成的组的细胞反应：表达受体的细胞的增殖、活力和活性增强。
在某些实施方案中，本文公开了一种编码本文公开的任何受体的核酸。在某些方面，本文描述了一种包含所述核酸的表达载体。在某些实施方案中，本文描述了一种被工程化以表达本文公开的受体的细胞。在某些方面，细胞是免疫细胞。在某些实施方案中，所述免疫细胞任选地是T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。
在某些实施方案中，本文公开了一种变体粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其中变体G-CSF包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或其组合。在某些方面，变体G-CSF的位点II界面区中的至少一个突变位于选自由以下组成的组的氨基酸位置：SEQ ID NO.1的氨基酸位置12、16、19、20、104、108、109、112、115、116、118、119、122和123。在某些方面，变体G-CSF的位点II界面区中的至少一个突变选自由以下组成的突变的组：S12E、S12K、S12R、K16D、L18F、E19K、Q20E、D104K、D104R、L108K、L108R、D109R、D112R、D112K、T115E、T115K、T116D、Q119E、Q119R、E122K、E122R和E123R。在某些方面，变体G-CSF的位点III界面区中的至少一个突变选自突变的组，所述突变的组选自由以下组成的组：SEQ ID NO.1的氨基酸位置38、39、40、41、46、47、48、49和147。在某些方面，变体G-CSF的位点III界面区中的至少一个突变选自由以下组成的突变的组：T38R、Y39E、K40D、K40F、L41D、L41E、L41K、E46R、L47D、V48K、V48R、L49K和R147E。在某些方面，变体G-CSF包含具有表6中设计编号的突变的组合；其中所述突变对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置。在某些方面，变体G-CSF包含以下突变：E46R、L108K和D112R。在某些方面，变体G-CSF选择性地结合本文公开的受体。在某些方面，受体在细胞上表达。在某些方面，细胞是免疫细胞。在某些方面，所述免疫细胞任选地是T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。在某些方面，变体G-CSF与受体的选择性结合引起选自由以下组成的组的细胞反应：免疫细胞的增殖、活力和活性增强。
在某些实施方案中，本文公开了一种编码变体G-CSF的核酸。在某些方面，本文公开了一种包含所述核酸的表达载体。在某些实施方案中，本文公开了一种被工程化以表达变体G-CSF的细胞。在某些方面，细胞是免疫细胞。
在某些实施方案中，本文公开了一种用于选择性活化在细胞表面上表达的受体的系统，所述系统包含受体和变体G-CSF，其中所述受体包含位点II界面区、位点III界面区或其组合中的至少一个突变，并且变体G-CSF包含在G-CSF的结合受体的位点II界面区、受体的位点III界面区或其组合的氨基酸序列中的至少一个突变；并且其中所述变体G-CSF相较于野生型G-CSFR ECD优先结合所述受体，并且所述受体相较于野生型G-CSF优先结合所述变体G-CSF。在某些方面，受体和变体G-CSF包含具有表2的设计编号的位点II界面的突变的组合；其中所述受体突变对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置并且所述变体G-CSF突变对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置。在某些方面，受体和变体G-CSF包含具有表4的设计编号的位点III界面的突变的组合；其中所述受体突变对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置并且所述变体G-CSF突变对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置。在某些方面，受体和变体G-CSF包含具有表6的设计编号的位点II界面和位点III界面的突变的组合；其中所述受体突变对应于SEQ IDNO.2的氨基酸位置并且所述变体G-CSF突变对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号106的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R和D104K突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E和K168D突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号117的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、E122R和E123R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E和R141E突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号130的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E和R167D突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号134的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K、D112R、E122R和E123R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R141E和R167D突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号135的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、T115K、E122R和E123R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ IDNO.2的氨基酸位置的R41E、R141E、L171E和Q174E突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号137的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R141E和R167D突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号300的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的K40D、L41D、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的F75K、Q91K和R167D突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号301的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的T38R、E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、Q73E和R167D突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号302的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、L86D和R167D突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号303的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ IDNO.1的氨基酸位置的L108K、D112R和R147E突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ IDNO.2的氨基酸位置的E93K和R167D突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号304的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K、D112R和R147E突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、E93K和R167D突变。在某些方面，组合包括设计编号305的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ IDNO.1的氨基酸位置的E19K、E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ IDNO.2的氨基酸位置的R41E、R167D和R288E突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号307的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的S12E、K16D、E19K和E46R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、D197K、D200K和R288E突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号308的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19R、E46R、D112K突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R167D、V202D和R288E突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号400的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19K、E46R、D109R和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R167D、M199D和R288D突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号401的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19K、E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R167D和R288D突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号402的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19K、E46R、D112K和T115K突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R167E、Q174E和R288E突变。在某些方面，突变的组合包含具有设计编号403的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19R、E46R和D112K突变。；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R167D和R288E突变。
在某些实施方案中，本文公开了一种选择性活化在细胞表面上表达的受体的方法，所述方法包括使受体与变体G-CSF接触。在某些方面，受体在细胞上表达。在某些方面，受体在免疫细胞上表达。在某些方面，受体在T细胞或NK细胞上表达。在某些方面，免疫细胞的选择性活化引起选自由以下组成的组的细胞反应：免疫细胞的增殖、活力和活性增强。
在某些实施方案中，本文公开了一种产生表达本文公开的受体的细胞的方法，所述方法包括向细胞中引入本文公开的核酸或表达载体。
在某些实施方案中，本文公开了一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向受试者输注本文公开的细胞(例如，免疫细胞)。在某些方面，所述方法还包括向所述受试者施用变体G-CSF。
在某些实施方案中，本文公开了一种用于产生用于选择性活化在细胞表面上表达的受体的系统的试剂盒，所述试剂盒包括本文公开的核酸或表达载体；本文公开的变体G-CSF以及使用说明书。
在某些实施方案中，本文描述了嵌合受体，其包含：(a)可操作地连接至第二结构域的G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)的胞外结构域(ECD)；所述第二结构域包含(b)选自由以下组成的组的多亚基细胞因子受体的胞内结构域(ICD)的至少一部分：IL-2R(白介素-2受体)、IL-7R(白介素-7受体)、IL-12R(白介素-12受体)和IL-21R(白介素-21受体)，并且任选地，所述IL-2R选自由IL-2Rβ和IL-2Rγc组成的组，并且任选地，所述第二结构域包含IL-2Rβ、IL-7Rα、IL-12Rβ2或IL-21R的C端区的至少一部分；其中所述细胞因子受体的ICD的至少一部分包含来自细胞因子受体的胞内结构域的至少一个信号传导分子结合位点，并且任选地，所述至少一个信号传导分子结合位点选自由以下组成的组：G-CSFR的STAT3结合位点；gp130的STAT3结合位点；gp130的SHP-2结合位点；IL-2Rβ的SHC结合位点；IL-2Rβ的STAT5结合位点；IL-2Rβ的STAT3结合位点；IL-2Rβ的STAT1结合位点；IL-7Rα的STAT5结合位点；IL-7Rα的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)结合位点；IL-12Rβ2的STAT4结合位点；IL-12Rβ2的STAT5结合位点；IL-12Rβ2的STAT3结合位点；IL-21R的STAT5结合位点；IL-21R的STAT3结合位点；和IL-21R的STAT1结合位点；并且任选地，所述ICD包含选自由G-CSFR和gp130组成的组的蛋白质的框1区和框2区；并且任选地，嵌合受体包含第三结构域，所述第三结构域包含选自由G-CSFR、gp130(糖蛋白130)和IL-2Rβ组成的组的蛋白质的跨膜结构域的至少一部分，并且任选地，所述跨膜结构域是野生型跨膜结构域。
在某些方面，本文描述了嵌合受体，其包含：可操作地连接至第二结构域的G-CSFR的ECD；所述第二结构域包含:
(i)
(a)gp130的跨膜结构域；
(b)gp130的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ的C端区；或者
(ii)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ的C端区；或者
(iii)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-12Rβ2的C端区；或者
(iv)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-21R的C端区；或者
(v)
(a)IL-2Rβ+γc的跨膜结构域；
(b)IL-2Rβ+γc的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ+γc的C端区；或者
(vi)
(a)G-CSFR的跨膜结构域
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-7Rα的C端区。
在某些实施方案中，活化的嵌合受体形成同二聚体，并且任选地，嵌合受体的活化引起选自由以下组成的组的细胞反应：表达所述嵌合受体的细胞的增殖、活力和活性增强，并且任选地，嵌合受体在与G-CSF接触时活化，并且任选地，G-CSF是野生型G-CSF，并且任选地，G-CSFR的胞外结构域是野生型胞外结构域。在某些实施方案中，活化的嵌合受体形成同二聚体，并且任选地，嵌合受体的活化引起选自由以下组成的组的细胞反应：表达所述嵌合受体的细胞的增殖、活力和活性增强，并且任选地，嵌合受体在与G-CSF接触时活化，并且任选地，G-CSF是野生型G-CSF，并且任选地，G-CSFR的胞外结构域是野生型胞外结构域。
在某些实施方案中，嵌合受体在细胞中表达，并且任选地是免疫细胞，并且任选地是T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。
在某些实施方案中，所述ICD包含：(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO.16、19、21、29、31、33、35、37或39的IL-2Rβ的ICD的至少一部分；或者(b)具有氨基酸序列SEQ ID NO.41的IL-7Rα的ICD的至少一部分；或者(c)具有氨基酸序列SEQ ID NO.25或27的IL-21R的ICD的至少一部分；或者(d)具有氨基酸序列SEQ ID NO.23、32或26的IL-12Rβ2的ICD的至少一部分；或者(e)具有氨基酸序列SEQ ID NO.20、22、24、26、28、30、34、40或42的G-CSFR的ICD的至少一部分；或者(f)具有氨基酸序列SEQ ID NO.18或38的gp130的ICD的至少一部分；或者(g)具有氨基酸序列SEQ ID NO.43的IL-7R的ICD的至少一部分；或者(h)具有氨基酸序列SEQ ID NO.17的IL-2RG的ICD的至少一部分。
在某些实施方案中，所述跨膜结构域包含由以下示出的序列：
(a)SEQ ID NO.8；或者(b)SEQ ID NO.9；或者(c)SEQ ID NO.10；或者(d)SEQ IDNO.11。
在某些方面，本文描述了一种编码嵌合受体的核酸；其中所述嵌合受体包含：(a)可操作地连接至第二结构域的G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)的胞外结构域(ECD)；所述第二结构域包含(b)选自由以下组成的组的多亚基细胞因子受体的胞内结构域(ICD)的至少一部分：IL-2R(白介素-2受体)、IL-7R(白介素-7受体)、IL-12R(白介素-12受体)和IL-21R(白介素-21受体)，并且任选地，所述IL-2R选自由IL-2Rβ和IL-2Rγc组成的组，并且任选地，所述第二结构域包含IL-2Rβ、IL-7Rα、IL-12Rβ2或IL-21R的C端区的至少一部分；其中所述细胞因子受体的ICD的至少一部分包含来自细胞因子受体的胞内结构域的至少一个信号传导分子结合位点，并且任选地，所述ICD包含选自由以下组成的组的至少一个信号传导分子结合位点：G-CSFR的STAT3结合位点；gp130的STAT3结合位点；gp130的SHP-2结合位点；IL-2Rβ的SHC结合位点；IL-2Rβ的STAT5结合位点；IL-2Rβ的STAT3结合位点；IL-2Rβ的STAT1结合位点；IL-7Rα的STAT5结合位点；IL-7Rα的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)结合位点；IL-12Rβ2的STAT4结合位点；IL-12Rβ2的STAT5结合位点；IL-12Rβ2的STAT3结合位点；IL-21R的STAT5结合位点；IL-21R的STAT3结合位点；和IL-21R的STAT1结合位点；并且任选地，所述ICD包含选自由G-CSFR和gp130组成的组的蛋白质的框1区和框2区；并且任选地，嵌合受体包含第三结构域，所述第三结构域包含选自由G-CSFR、gp130(糖蛋白130)和IL-2Rβ组成的组的蛋白质的跨膜结构域的至少一部分，并且任选地，所述跨膜结构域是野生型跨膜结构域。在某些实施方案中，G-CSFR的ECD由SEQ ID NO.5或6示出的核酸序列编码。在某些实施方案中，所述核酸包含:
(a)编码具有氨基序列SEQ ID NO.16、19、21、29、31、33、35、37或39的IL-2Rβ的ICD的至少一部分的序列；或者
(b)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.41的IL-7Rα的ICD的至少一部分的序列；或者
(c)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.25或27的IL-21R的ICD的至少一部分的序列；或者
(d)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.23、32或26的IL-12Rβ2的ICD的至少一部分的序列；或者
(e)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.20、22、24、26、28、30、34、40或42的G-CSFR的ICD的至少一部分的序列；或者
(f)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.18或38的gp130的ICD的至少一部分的序列；或者
(g)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.43的IL-7Rα的ICD的至少一部分的序列；或者
(h)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.17的IL-2Rγc的ICD的至少一部分的序列。
在某些实施方案中，本公开描述了一种包含编码本文所述的嵌合受体的核酸的表达载体。在某些实施方案中，所述载体选自由以下组成的组：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和质粒。
在某些方面，本文描述了一种编码嵌合受体的核酸；其中所述嵌合受体包含：可操作地连接至第二结构域的G-CSFR的ECD；所述第二结构域包含:
(i)
(a)gp130的跨膜结构域；
(b)gp130的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ的C端区；或者
(ii)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ的C端区；或者
(iii)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-12Rβ2的C端区；或者
(iv)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-21R的C端区；或者
(v)
(a)IL-2Rβ+γc的跨膜结构域；
(b)IL-2Rβ+γc的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ+γc的C端区；或者
(vi)
(a)G-CSFR的跨膜结构域
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-7Rα的C端区。
在某些实施方案中，G-CSFR的ECD由SEQ ID NO.5或6示出的核酸序列编码。在某些实施方案中，所述核酸包含:
(a)编码具有氨基序列SEQ ID NO.16、19、21、29、31、33、35、37或39的IL-2Rβ的ICD的至少一部分的序列；或者
(b)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.41的IL-7Rα的ICD的至少一部分的序列；或者
(c)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.25或27的IL-21R的ICD的至少一部分的序列；或者
(d)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.23、32或26的IL-12Rβ2的ICD的至少一部分的序列；或者
(e)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.20、22、24、26、28、30、34、40或42的G-CSFR的ICD的至少一部分的序列；或者
(f)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.18或38的gp130的ICD的至少一部分的序列；或者
(g)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.43的IL-7Rα的ICD的至少一部分的序列；或者
(h)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.17的IL-2Rγc的ICD的至少一部分的序列。
在某些方面，本文描述了一种包含本文所述的核酸的表达载体。在某些实施方案中，所述载体选自由以下组成的组：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和质粒。
在某些方面，本文描述了一种包含编码嵌合受体的核酸的细胞；其中所述嵌合受体包含：(a)可操作地连接至第二结构域的G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)可操作地连接的受体)的胞外结构域(ECD)；所述第二结构域包含(b)选自由以下组成的组的多亚基细胞因子受体的胞内结构域(ICD)的至少一部分：IL-2R(白介素-2受体)、IL-7R(白介素-7受体)、IL-12R(白介素-12受体)和IL-21R(白介素-21受体)，并且任选地，所述IL-2R选自由IL-2Rβ和IL-2Rγc组成的组，并且任选地，所述第二结构域包含IL-2Rβ、IL-7Rα、IL-12Rβ2或IL-21R的C端区的至少一部分；其中所述细胞因子受体的ICD的至少一部分包含来自细胞因子受体的胞内结构域的至少一个信号传导分子结合位点，并且任选地，所述ICD包含选自由以下组成的组的至少一个信号传导分子结合位点：G-CSFR的STAT3结合位点；gp130的STAT3结合位点；gp130的SHP-2结合位点；IL-2Rβ的SHC结合位点；IL-2Rβ的STAT5结合位点；IL-2Rβ的STAT3结合位点；IL-2Rβ的STAT1结合位点；IL-7Rα的STAT5结合位点；IL-7Rα的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)结合位点；IL-12Rβ2的STAT4结合位点；IL-12Rβ2的STAT5结合位点；IL-12Rβ2的STAT3结合位点；IL-21R的STAT5结合位点；IL-21R的STAT3结合位点；和IL-21R的STAT1结合位点；并且任选地，所述ICD包含选自由G-CSFR和gp130组成的组的蛋白质的框1区和框2区；并且任选地，嵌合受体包含第三结构域，所述第三结构域包含选自由G-CSFR、gp130(糖蛋白130)和IL-2Rβ组成的组的蛋白质的跨膜结构域的至少一部分，并且任选地，所述跨膜结构域是野生型跨膜结构域；并且任选地，
所述细胞任选地是免疫细胞，并且任选地是T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。
在某些方面，本文描述了一种包含编码嵌合受体的核酸的细胞；其中所述嵌合受体包含：可操作地连接至第二结构域的G-CSFR的ECD；所述第二结构域包含:
(i)
(a)gp130的跨膜结构域；
(b)gp130的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ的C端区；或者
(ii)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ的C端区；或者
(iii)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-12Rβ2的C端区；或者
(iv)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-21R的C端区；或者
(v)
(a)IL-2Rβ+γc的跨膜结构域；
(b)IL-2Rβ+γc的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ+γc的C端区；或者
(vi)
(a)G-CSFR的跨膜结构域
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-7Rα的C端区；并且任选地，
所述细胞是免疫细胞；并且任选地是T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。
在某些实施方案中，G-CSFR的ECD由细胞中包含的具有SEQ ID NO.5或6示出的序列的核酸编码。在某些实施方案中，细胞包含的核酸包含：
(a)编码具有氨基序列SEQ ID NO.16、19、21、29、31、33、35、37或39的IL-2Rβ的ICD的至少一部分的序列；或者
(b)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.41的IL-7Rα的ICD的至少一部分的序列；或者
(c)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.25或27的IL-21R的ICD的至少一部分的序列；或者
(d)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.23、32或26的IL-12Rβ2的ICD的至少一部分的序列；或者
(e)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.20、22、24、26、28、30、34、40或42的G-CSFR的ICD的至少一部分的序列；或者
(f)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.18或38的gp130的ICD的至少一部分的序列；或者
(g)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.43的IL-7R的ICD的至少一部分的序列；或者
(h)编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.17的IL-2Rγc的ICD的至少一部分的序列。
在某些方面，本文描述了一种包含本文描述的表达载体的细胞，并且任选地，所述细胞是免疫细胞，并且任选地是T细胞或NK细胞。在某些方面，本文描述了一种包含如权利要求1所述的嵌合受体的细胞，并且任选地是免疫细胞中的细胞，并且任选地是T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。
在某些方面，本文描述了包含本文所述的嵌合受体的细胞，并且任选地是免疫细胞中的细胞，并且任选地是T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。
在某些方面，本文描述了一种选择性活化在细胞表面上表达的嵌合受体的方法，其包括：使嵌合受体与选择性活化嵌合受体的G-CSF接触；其中所述嵌合受体包含：(a)可操作地连接至第二结构域的G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)的胞外结构域(ECD)；所述第二结构域包含(b)选自由以下组成的组的多亚基细胞因子受体的胞内结构域(ICD)的至少一部分：IL-2R(白介素-2受体)、IL-7R(白介素-7受体)、IL-12R(白介素-12受体)和IL-21R(白介素-21受体)，并且任选地，所述IL-2R选自由IL-2Rβ和IL-2Rγc组成的组，并且任选地，所述第二结构域包含IL-2Rβ、IL-7Rα、IL-12Rβ2或IL-21R的C端区的至少一部分；其中所述细胞因子受体的ICD的至少一部分包含来自细胞因子受体的胞内结构域的至少一个信号传导分子结合位点，并且任选地，所述至少一个信号传导分子结合位点选自由以下组成的组：G-CSFR的STAT3结合位点；gp130的STAT3结合位点；gp130的SHP-2结合位点；IL-2Rβ的SHC结合位点；IL-2Rβ的STAT5结合位点；IL-2Rβ的STAT3结合位点；IL-2Rβ的STAT1结合位点；IL-7Rα的STAT5结合位点；IL-7Rα的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)结合位点；IL-12Rβ2的STAT4结合位点；IL-12Rβ2的STAT5结合位点；IL-12Rβ2的STAT3结合位点；IL-21R的STAT5结合位点；IL-21R的STAT3结合位点；和IL-21R的STAT1结合位点，并且任选地，所述ICD包含选自由G-CSFR和gp130组成的组的蛋白质的框1区和框2区；并且任选地，嵌合受体包含第三结构域，所述第三结构域包含选自由G-CSFR、gp130(糖蛋白130)和IL-2Rβ组成的组的蛋白质的跨膜结构域的至少一部分，并且任选地，所述跨膜结构域是野生型跨膜结构域。
在某些方面，本文描述了一种选择性活化在细胞表面上表达的嵌合受体的方法，其包括：使嵌合受体与选择性活化嵌合受体的G-CSF接触；其中所述嵌合受体包含可操作地连接至第二结构域的G-CSFR的ECD；所述第二结构域包含:
(i)
(a)gp130的跨膜结构域；
(b)gp130的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ的C端区；或者
(ii)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ的C端区；或者
(iii)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-12Rβ2的C端区；或者
(iv)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-21R的C端区；或者
(v)
(a)IL-2Rβ+γc的跨膜结构域；
(b)IL-2Rβ+γc的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ+γc的C端区；或者
(vi)
(a)G-CSFR的跨膜结构域
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-7Rα的C端区。
在本文所述的方法的某些实施方案中，活化的嵌合受体形成同二聚体，并且任选地，嵌合受体的活化引起选自由以下组成的组的细胞反应：表达所述嵌合受体的细胞的增殖、活力和活性增强；并且任选地，所述嵌合受体在与G-CSF接触时被活化，并且任选地，所述G-CSF是野生型G-CSF，并且任选地，所述G-CSFR的胞外结构域是野生型胞外结构域；其中嵌合受体在细胞中表达，并且任选地是免疫细胞，并且任选地是T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。
在本文所述的方法的某些实施方案中，所述嵌合受体包含
(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO.16、19、21、29、31、33、35、37或39的IL-2Rβ的ICD的至少一部分；或者
(b)具有氨基酸序列SEQ ID NO.41的IL-7Rα的ICD的至少一部分；或者
(c)具有氨基酸序列SEQ ID NO.25或27的IL-21R的ICD的至少一部分；或者
(d)具有氨基酸序列SEQ ID NO.23、32或26的IL-12Rβ2的ICD的至少一部分；或者
(e)具有氨基酸序列SEQ ID NO.20、22、24、26、28、30、34、40或42的G-CSFR的ICD的至少一部分；或者
(f)具有氨基酸序列SEQ ID NO.18或38的gp130的ICD的至少一部分；或者
(g)具有氨基酸序列SEQ ID NO.43的IL-7Rα的ICD的至少一部分；或者
(h)具有氨基酸序列SEQ ID NO.17的IL-2Rγc的ICD的至少一部分；并且其中跨膜结构域包含由以下示出的序列：(a)SEQ ID NO.8；或者
(b)SEQ ID NO.9；或者(c)SEQ ID NO.10；或者(d)SEQ ID NO.11。
在某些方面，本文描述了一种在细胞中产生嵌合受体的方法，其包括：将如权利要求13-16或19-22中任一项所述的核酸或如权利要求17、18、23或24中任一项所述的表达载体引入到细胞中；并且任选地，所述方法包括基因编辑；并且任选地，所述细胞是免疫细胞，并且任选地是T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。
在某些实施方案中，本文描述了一种治疗有需要的受试者的方法，其包括：向所述受试者输注表达嵌合受体的细胞，并施用结合所述嵌合受体的细胞因子；其中所述嵌合受体包含：(a)可操作地连接至第二结构域的G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)的胞外结构域(ECD)；所述第二结构域包含(b)选自由以下组成的组的多亚基细胞因子受体的胞内结构域(ICD)的至少一部分：IL-2R(白介素-2受体)、IL-7R(白介素-7受体)、IL-12R(白介素-12受体)和IL-21R(白介素-21受体)；并且任选地，所述IL-2R选自由IL-2Rβ和IL-2Rγc组成的组；并且任选地，所述第二结构域包含IL-2Rβ、IL-7Rα、IL-12Rβ2或IL-21R的C端区的至少一部分；其中所述细胞因子受体的ICD的至少一部分包含来自细胞因子受体的胞内结构域的至少一个信号传导分子结合位点；并且任选地，所述ICD包含选自由以下组成的组中的至少一个信号传导分子结合位点：G-CSFR的STAT3结合位点；gp130的STAT3结合位点；gp130的SHP-2结合位点；IL-2Rβ的SHC结合位点；IL-2Rβ的STAT5结合位点；IL-2Rβ的STAT3结合位点；IL-2Rβ的STAT1结合位点；IL-7Rα的STAT5结合位点；IL-7Rα的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)结合位点；IL-12Rβ2的STAT4结合位点；IL-12Rβ2的STAT5结合位点；IL-12Rβ2的STAT3结合位点；IL-21R的STAT5结合位点；IL-21R的STAT3结合位点；和IL-21R的STAT1结合位点；并且任选地，所述ICD包含选自由G-CSFR和gp130组成的组的蛋白质的框1区和框2区；并且任选地，嵌合受体包含包含第三结构域，所述第三结构域包含选自由G-CSFR、gp130(糖蛋白130)和IL-2Rβ组成的组的蛋白质的跨膜结构域的至少一部分，并且任选地，所述跨膜结构域是野生型跨膜结构域。
在某些方面，本文描述了一种治疗有需要的受试者的方法，其包括：向所述受试者输注表达嵌合受体的细胞，并施用结合所述嵌合受体的细胞因子；其中所述嵌合受体包含：可操作地连接至第二结构域的G-CSFR的ECD；所述第二结构域包含:
(i)
(a)gp130的跨膜结构域；
(b)gp130的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ的C端区；或者
(ii)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ的C端区；或者
(iii)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-12Rβ2的C端区；或者
(iv)
(a)G-CSFR的跨膜结构域；
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-21R的C端区；或者
(v)
(a)IL-2Rβ+γc的跨膜结构域；
(b)IL-2Rβ+γc的框1区和框2区；和
(c)IL-2Rβ+γc的C端区；或者
(vi)
(a)G-CSFR的跨膜结构域
(b)G-CSFR的框1区和框2区；和
(c)IL-7Rα的C端区。
在所述方法的某些实施方案中，活化的嵌合受体形成同二聚体；并且任选地，所述嵌合受体的活化引起选自由以下组成的组的细胞反应：表达所述嵌合受体的细胞的增殖、活力和活性增强；并且任选地，嵌合受体在与G-CSF接触时被活化；并且任选地，G-CSF为野生型G-CSF；并且任选地，G-CSFR的胞外结构域是野生型胞外结构域；其中嵌合受体在细胞中表达；并且任选地，所述细胞是免疫细胞，并且任选地是T细胞，并且任选地是NK细胞，并且任选地是NKT细胞，并且任选地是B细胞，并且任选地是浆细胞，并且任选地是巨噬细胞，并且任选地是树突细胞，并且任选地，所述细胞是干细胞，并且任选地，所述细胞是原代细胞，并且任选地，所述细胞是人细胞。在某些实施方案中，嵌合受体任选地包含：
(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO.16、19、21、29、31、33、35、37或39的IL-2Rβ的ICD的至少一部分；或者
(b)具有氨基酸序列SEQ ID NO.41的IL-7Rα的ICD的至少一部分；或者
(c)具有氨基酸序列SEQ ID NO.25或27的IL-21R的ICD的至少一部分；或者
(d)具有氨基酸序列SEQ ID NO.23、32或26的IL-12Rβ2的ICD的至少一部分；或者
(e)具有氨基酸序列SEQ ID NO.20、22、24、26、28、30、34、40或42的G-CSFR的ICD的至少一部分；或者
(f)具有氨基酸序列SEQ ID NO.18或38的gp130的ICD的至少一部分；或者
(g)具有氨基酸序列SEQ ID NO.43的IL-7Rα的ICD的至少一部分；或者
(h)具有氨基酸序列SEQ ID NO.17的IL-2Rγc的ICD的至少一部分；并且其中跨膜结构域包含由以下示出的序列：(a)SEQ ID NO.8；或者(b)SEQ ID NO.9；或者(c)SEQ IDNO.10；或者(d)SEQ ID NO.11。
在某些实施方案中，本文所述的方法用于治疗癌症。在某些实施方案中，所述方法用于治疗自身免疫性疾病。在某些实施方案中，所述方法用于治疗炎症性病症。在某些实施方案中，所述方法用于预防和治疗移植排斥。在某些实施方案中，所述方法用于治疗传染病。在某些实施方案中，所述方法还包括施用至少一种另外的活性剂；并且任选地，另外的活性剂是另外的细胞因子。
在某些实施方案中，本文所述的方法包括：i)分离含有免疫细胞的样品；(ii)用编码嵌合细胞因子受体的核酸序列转导或转染免疫细胞；(iii)向所述受试者施用或输注来自(ii)的所述免疫细胞；以及(iv)使免疫细胞与结合嵌合受体的细胞因子接触。在某些实施方案中，在向受试者施用或输注所述细胞之前，受试者已经历免疫耗竭治疗。在某些实施方案中，所述含有免疫细胞的样品分离自将施用或输注所述细胞的受试者。在某些实施方案中，在向受试者施用或输注所述细胞之前，使所述免疫细胞与细胞因子体外接触。在某些实施方案中，使免疫细胞与结合嵌合受体的细胞因子接触足够的时间以活化来自嵌合受体的信号传导。
本文描述了一种用于治疗有需要的受试者的试剂盒，其包括：编码本文描述的嵌合受体的细胞，并且任选地，所述细胞是免疫细胞；和使用说明书；并且任选地，所述试剂盒包括结合嵌合受体的细胞因子。本文描述了一种用于产生在细胞上表达的嵌合受体的试剂盒，其包括：编码本文所述的嵌合受体的表达载体和使用说明书；并且任选地，所述试剂盒包括结合嵌合受体的细胞因子。
本文描述了一种用于产生在细胞上表达的嵌合受体的试剂盒，其包括：包含编码本文所述的嵌合受体的表达载体的细胞，并且任选地，所述细胞是细菌细胞；以及使用说明书；并且任选地，所述试剂盒包括结合嵌合受体的细胞因子。
附图说明
参考以下描述和附图将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点，其中：
图1是示出2:2G-CSF:G-CSFR异二聚体复合物的位点II和III界面的结构的图。
图2是概述用于G-CSF:G-CSFR界面设计的策略的图。
图3是示出位点II界面相互作用的能量分量的图表。
图4是示出位点II界面的结构以及G-CSFR(CRH)的Arg167(左)和Arg141(右)与位点II界面处的G-CSF残基的相互作用的图。
图5是示出位点II处的野生型G-CSF(左)和位点II设计#35的一式三份ZymeCADTM均值场包的相同区域的叠加(右)的图。
图6是SDS-PAGE的图像，示出了G-CSF设计#6、7、8、9、15、17、30、34、35和36(上图)以及共表达和纯化的位点II设计复合物#6、7、8、9、15、17、30、34、35和36(下图)、第一泳道WT G-CSF对照、第二泳道WT G-CSF:G-CSFR(CRH)对照的G-CSF下拉测定(pulldown assay)结果。
图7是SDS-PAGE的图像，示出了与WT-G-CSFR共表达的G-CSF设计#6、7、8、9、15、17、30、34、35和36的G-CSF下拉测定(上图)和与G-CSFR设计#6、7、8、9、15、17、30、34、35和36共表达的WT G-CSF的G-CSF下拉测定(下图、第一泳道WT:WT G-CSF:G-CSFR下拉对照的结果。
图8是示出位点III界面相互作用的能量分量的图表。
图9是示出位点III界面的结构以及G-CSFR(Ig)的R41(左)和E93(右)与位点III界面处的G-CSF残基的相互作用的图。
图10是SDS-PAGE的图像，示出了设计#401和402(上图)和共表达和纯化的位点II/III设计复合物#401和402以及WT G-CSFR的G-CSF下拉测定和与设计#401和402G-CSFR(下图)共表达的WT G-CSF、第一泳道WT G-CSF对照、第二泳道WT G-CSF:G-CSFR(Ig-CRH)对照的的下拉的结果。
图11：是示出在TEV裂解后WT(SX75)G-CSF和设计130(SX75)、303(SX200)和401(SX200)G-CSFE突变体的尺寸排阻色谱图谱的图表。
图12：是示出在TEV裂解后纯化的WT(SX75)和纯化的设计401(SX200)和402(SX200)G-CSFR(Ig-CRH)E突变体的尺寸排阻色谱图谱的图表。
图13：是示出WT、设计#130、#401、#402G-CSF与它们的同源或错误配对G-CSFR(Ig-CRH)结合的结合SPR传感图的图表。每个G-CSF与G-CSFR对都标记在每个图的底部。用于推导设计#401和#402的同源对的KD的代表性稳态拟合示出在它们各自的传感图下。
图14：是示出以下的图表：左上图：WT G-CSF、设计#130和#134G-CSFE的DSC热分析图；右上图：WT G-CSFR(Ig-CRH)、设计#130和#134G-CSFR(Ig-CRH)E的DSC热分析图；左下图：设计#401和#402G-CSFE的DSC热分析图；右下图：设计#300、#303、#304和#307G-CSFE的DSC热分析图。
图15：是示出溴脱氧尿苷(BrdU)测定的结果的图表，示出表达以下的增殖32D-IL-2RβIL2Rb细胞：A)G-CSFRWT-ICDIL-2Rb(同二聚体)或B)G-CSFRWT-ICDIL-2Rb+G-CSFRWT-ICDgc(异二聚体)。未用细胞因子刺激细胞、用IL-2(300IU/ml)或G-CSFWT(A中100ng/ml或B中30ng/ml)刺激细胞。
图16：是示出BrdU测定结果的图表，示出表达以下的32D-IL-2Rβ细胞的增殖：A)G-CSFR137-ICDgp130-IL-2Rb(同二聚体)；或B)G-CSFR137-ICDIL-2Rb+G-CSFR137-ICDgc(异二聚体)。未用细胞因子刺激细胞、用IL-2(300IUIUIU/ml)、G-CSFWT(30ngngng/ml)或G-CSFR137(30ng/ml)刺激细胞。
图17：是示出BrdU测定结果的图表，示出表达以下的32D-IL-Rβ细胞的增殖：A)G-CSFRWT-ICDgp130-IL-2Rb(同二聚体)；或B)G-CSFRWT-ICDIL-2Rb+G-CSFRWT-ICDgc(异二聚体)。未用细胞因子刺激细胞、用IL-2(300IU/ml)、G-CSFWT(30ng/ml)或G-CSFR137(30ng/ml)刺激细胞。
图18：是蛋白质印迹，示出表达以下的32D-IL-2Rβ细胞的信号传导：G-CSFRWT-ICDgp130-IL-2Rb(同二聚体)、G-CSFR137-ICDgp130-IL-2Rb(同二聚体)、G-CSFRWT-ICDIL-2Rb+G-CSFRWT-ICDgc(异二聚体)或G-CSFR137-ICDIL-2Rb+G-CSFR137-ICDgc(异二聚体)。未用细胞因子刺激细胞、用IL-2(300IU/ml)、G-CSFWT(30ng/ml)或G-CSFR137(30ng/ml)刺激细胞。
图19呈现示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估响应于未用细胞因子刺激、用IL-2或WT、130、304或307细胞因子的刺激而表达所指示嵌合受体的原代鼠T细胞(或未转导细胞)的细胞周期进展。A和B表示实验重复。
图20是天然IL-2Rβ、IL-2Rγc和G-CSFR亚基以及G2R-1受体亚基设计的示意图。
图21呈现了示出了32D-IL-2Rβ细胞(其是稳定表达人IL-2Rβ亚基的32D细胞系)的扩增(细胞数量的倍数变化)的图表，所述细胞表达所指示的G-CSFR嵌合受体亚基并且用WTG-CSF、IL-2刺激或未用细胞因子刺激。将G/γc在其N端用Myc表位标记(Myc/G/γc)，并且将G/IL-2Rβ在其N端用Flag表位标记(Flag/G/IL-2Rβ)；这些表位标签有助于通过流式细胞术进行检测，并且不会影响受体的功能。此外，B-D中的下图示出了在每种培养条件下表达G-CSFR ECD(％G-CSFR+)的细胞的百分比。正方形表示用IL-2刺激的细胞。三角形表示用G-CSF刺激的细胞。圆圈表示未用细胞因子刺激的细胞。
图22呈现了示出表达仅Flag-标记的G/IL-2Rβ亚基、仅Myc-标记的G/γc亚基或全长G-CSFR的人T细胞的扩增(细胞数量的倍数变化)的图表。A-D)PBMC来源的T细胞；E-H)肿瘤相关淋巴细胞(TAL)。正方形表示用IL-2刺激的细胞。三角形表示用G-CSF刺激的细胞。圆圈表示未用细胞因子刺激的细胞。
图23是天然受体和嵌合受体的示意图，其示出JAK、STAT、Shc、SHP-2和PI3K结合位点。阴影方案包括来自图1的受体。
图24是嵌合受体的示意图，其示出Jak、STAT、Shc、SHP-2和PI3K结合位点。阴影方案包括来自图1和4的受体。
图25是含有G2R-2cDNA插入物的慢病毒质粒的图。
图26呈现示出用G2R-2转导的细胞中通过流式细胞术评估的G-CSFR ECD表达的图表。A)32D-IL-2Rβ细胞系；B)PBMC来源的人T细胞和人肿瘤相关淋巴细胞(TAL)。
图27呈现示出与未转导细胞相比表达G2R-2的细胞的扩增(细胞数量的倍数变化)的图表。A)人PBMC来源的T细胞；B、C)来自两次独立实验的人肿瘤相关淋巴细胞(TAL)。正方形表示用IL-2刺激的细胞。三角形表示用G-CSF刺激的细胞。圆圈表示未用细胞因子刺激的细胞。
图28呈现示出与未转导细胞相比表达G2R-2的CD4-或CD8-选择的人肿瘤相关淋巴细胞的扩增(细胞数量的倍数变化)的图表。A)未转导的CD4-选择的细胞；B)未转导的CD8-选择的细胞；C)用G2R-2转导的CD4-选择的细胞；D)用G2R-2转导的CD8-选择的细胞。灰色虚线表示用IL-2刺激的细胞。黑色实线表示用G-CSF刺激的细胞。灰色虚线表示未用细胞因子刺激的细胞。
图29呈现示出表达G2R-2的CD4+或CD8+肿瘤相关淋巴细胞的扩增(细胞数量的倍数变化)的图表。正如所示，使细胞最初在G-CSF或IL-2中扩增。然后将细胞铺板在IL-2、G-CSF或仅培养基中。灰色实线表示用IL-2刺激的细胞。灰色实线表示用IL-2刺激的细胞。黑色实线表示用G-CSF刺激的细胞。浅灰色虚线表示在IL-2中扩增并然后仅用培养基刺激的细胞。深灰色虚线表示在G-CSF中扩增并然后仅用培养基刺激的细胞。
图30呈现示出在G-CSF或IL-2中扩增后表达G2R-2嵌合受体构建体的CD4-或CD8-选择的肿瘤相关淋巴细胞(TAL)相对于未转导细胞的免疫表型(通过流式细胞术)的图表。A)示出CD4+、CD8+或CD3-CD56+细胞表面表型的活细胞的百分比。B)示出基于CD45RA和CCR7表达的所指示细胞表面表型的活细胞的百分比。
图31呈现示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估表达G2R-2的原代人T细胞相对于未转导细胞的增殖。正如所示，在测定之前，通过在IL-2或G-CSF中培养来选择T细胞。A)肿瘤相关淋巴细胞；B)PBMC来源的T细胞。
图32呈现示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估表达G2R-2或单链G/IL-2Rβ(G2R-1的组分)的原代鼠T细胞相对于模拟(mock)转导细胞的增殖。A)转导效率，如通过在所指示细胞因子中培养后表达G-CSFR ECD的细胞百分比(通过流式细胞术)所反映；B)所有活细胞中响应于所指示细胞因子的BrdU掺入百分比；C)表达G-CSFR ECD的细胞(G-CSFR+细胞)的BrdU掺入百分比。在测定之前，将所有细胞在IL-2中扩增3天。正方形表示用IL-2刺激的细胞。三角形表示用G-CSF刺激的细胞。圆圈表示未用细胞因子刺激的细胞。
图33呈现蛋白质印迹，以检测表达G2R-2的人原代T细胞相对于未转导细胞中的所指示细胞因子信号传导事件。β-肌动蛋白、总Akt和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。A、B)肿瘤相关淋巴细胞(TAL)；C)PBMC来源的T细胞。
图34呈现蛋白质印迹，以检测表达G2R-2或单链G/IL-2Rβ(来自G2R-1)的原代鼠T细胞相对于模拟转导细胞中的所指示细胞因子信号传导事件。箭头指示特定的磷酸-Jak2条带，其他较大条带被推测是第一抗磷酸-Jak2抗体与磷酸-Jak1交叉反应的结果。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。
图35是示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估表达所指示嵌合受体的32D-IL-2Rβ细胞(或未转导细胞)响应于未用细胞因子刺激、用IL-2(300IU/mL)、WT G-CSF(30ng/mL)或130G-CSF(30ng/mL)的刺激的细胞周期进展。
图36呈现示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估响应于未用细胞因子刺激、用IL-2或WT、130、304或307细胞因子的刺激而表达所指示嵌合受体的原代鼠T细胞(或未转导细胞)的细胞周期进展。A和B表示实验重复。
图37呈现蛋白质印迹，以检测表达所指示嵌合受体亚基的32D-IL-2Rβ细胞(或未转导细胞)响应于未用细胞因子刺激、用IL-2、WT G-CSF或130G-CSF的刺激的所指示细胞因子信号传导事件。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。
图38呈现A)蛋白质印迹，以检测表达所指示嵌合受体亚基的原代鼠T细胞响应于未用细胞因子刺激、用IL-2、WT G-CSF、130G-CSF或304G-CSF的刺激的所指示细胞因子信号传导事件。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。B)图A中所用的细胞的转导效率，如通过流式细胞术用对人G-CSF受体的胞外结构域具有特异性的抗体所评估。
图39呈现示出通过流式细胞术在用所指示嵌合受体构建体转导的原代人肿瘤相关淋巴细胞(TAL)中得到的G-CSFR ECD表达的图。对活的CD3+、CD56-细胞针对CD8或CD4设门，并示出每个群体的G-CSFR ECD表达。
图40呈现示出表达G2R-3的原代人肿瘤相关淋巴细胞(TAL)相对于未转导细胞的扩增、增殖和信号传导的图表和图像。A)示出T细胞扩增测定结果的图表，其中细胞用G2R-3编码慢病毒转导，洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。每3-4天对活细胞进行计数。正方形表示用IL-2刺激的细胞。三角形表示用G-CSF刺激的细胞。圆圈表示未用细胞因子刺激的细胞。B)蛋白质印迹，评估细胞内信号传导事件。从扩增测定中收获细胞，并用IL-2(300IU/ml)或野生型G-CSF(100ng/ml)刺激。箭头指示在125kDa处的特定磷酸-Jak2条带；较大条带被推测是第一抗磷酸-Jak2抗体与磷酸-Jak1交叉反应的结果。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。C)示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估T细胞增殖。从扩增测定中收获细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。
图41呈现示出表达具有WT ECD的G2R-3的原代人PBMC来源的T细胞相对于未转导细胞的倍数扩增和G-CSFR ECD表达的图表。A)示出T细胞扩增测定结果的图表，其中细胞用编码G2R-3的慢病毒转导。在第1天，向培养物中添加WT G-CSF(100ng/ml)或不添加细胞因子(仅培养基)。此后，至第21天，用含有WT G-CSF或无细胞因子的培养基补充细胞。在扩增第21天，将细胞洗涤并重新铺板在WT G-CSF(100ng/mL)、IL-7(20ng/mL)和IL-15(20ng/mL)或无细胞因子中。每2-4天对活细胞进行计数。正方形表示用G-CSF刺激的细胞。三角形表示用G-CSF刺激，并在第21天重新铺板在IL-7和IL-15中的细胞。圆圈表示未用细胞因子刺激的细胞。菱形表示用G-CSF刺激，并且在第21天重新铺板在仅培养基中的细胞。B)示出G-CSFR ECD的表达的图表，如在扩增第21天或第42天通过流式细胞术所测定。
图42呈现示出表达G2R-3的原代人PBMC来源的T细胞相对于未转导细胞的细胞内信号传导和免疫表型的图表。A)蛋白质印迹，以评估细胞内信号传导事件。从扩增测定中收获细胞，并用IL-2(300IU/ml)或野生型G-CSF(100ng/ml)刺激。β-肌动蛋白充当蛋白质负载对照。B、C)代表性流式细胞术图和图表，其示出在扩增第42天通过流式细胞术评估的表达G2R-3的细胞相对于未转导细胞的免疫表型。
图43呈现示出表达具有304或307 ECD的G2R-3的原代人PBMC来源的T细胞相对于未转导细胞的扩增倍数的图表。A)示出T细胞扩增测定结果的图表，其中细胞用编码G2R-3304 ECD的慢病毒转导。B)示出T细胞扩增测定结果的图表，其中细胞用编码G2R-3307 ECD的慢病毒转导。C)示出未转导细胞的T细胞扩增测定结果的图表。正如所示，在第2天向培养物中添加IL-2(300IU/mL)、304G-CSF(100ng/ml)、307 G-CSF(100ng/mL)或不添加细胞因子(仅培养基)，且此后每两天补充一次。每3-4天对活细胞进行计数。菱形表示用304G-CSF刺激的细胞。正方形表示用307 G-CSF刺激的细胞。三角形表示用IL-2刺激的细胞。倒三角形表示未用细胞因子刺激的细胞。
图44呈现示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估表达具有304或307 ECD的G2R-3的原代人PBMC来源的T细胞相对于未转导细胞的增殖。用编码G2R-3 304 ECD或307 ECD的慢病毒转导细胞，并在304或307 G-CSF(100ng/mL)中扩增。使未转导细胞在IL-2(300IU/mL)中扩增。在扩增第12天洗涤细胞，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、130G-CSF(100ng/ml)、304G-CSF(100ng/ml)、307 G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。
图45呈现示出通过流式细胞术在用所指示嵌合受体构建体转导的原代鼠T细胞中得到的G-CSFR ECD表达的图表。
图46示出在表达G21R-1或G21R-2的原代PBMC来源的人T细胞中G-CSF诱导的STAT3磷酸化(通过流式细胞术检测)。将细胞细分(即设门)为G-CSFR阳性(上图)或G-CSFR阴性(下图)群体。
图47呈现示出在表达G21R-1或G12R-1的原代鼠T细胞中G-CSF诱导的生化信号传导事件的图表和图像。A)示出用G21R-1转导并未用细胞因子刺激、用IL-21或G-CSF刺激的CD4+或CD8+细胞中STAT3(通过流式细胞术检测)的磷酸化的图表。B)示出在没有用细胞因子(黑色圆圈)、用IL-21(正方形)或WT G-CSF(灰色圆圈)刺激后磷酸-STAT3染色呈阳性的细胞百分比的图表。对活细胞针对CD8或CD4设门，并示出每个群体的磷酸-STAT3-阳性细胞百分比。C)蛋白质印迹，以评估表达G21R-1或G12R-1并用IL-21、IL-12或WT G-CSF刺激的细胞中的所指示细胞因子信号传导事件。β肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。
图48呈现示出表达G2R-2、G2R-3、G7R-1、G21/7R-1和G27/2R-1的原代鼠T细胞或模拟转导T细胞中的增殖、G-CSFR ECD表达和WT G-CSF诱导的细胞内信号传导事件的图表和图像。A、B)示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估T细胞增殖。收获细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。图A和B是实验重复。C)示出通过流式细胞术在用所指示嵌合受体构建体转导的原代鼠T细胞中得到的G-CSFR ECD表达的图表。D)蛋白质印迹，以评估表达G2R-2、G2R-3、G7R-1、G21/7R-1和G27/2R-1的细胞或模拟转导T细胞中的所指示细胞因子信号传导事件。用IL-2(300IU/mL)、IL-7(10ng/mL)、IL-21(10ng/mL)、IL-27(50ng/mL)或G-CSF(100ng/mL)刺激细胞。β肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。
图49呈现示出表达G21/2R-1、G12/2R-1和21/12/2R-1的原代鼠T细胞或模拟转导T细胞的增殖、G-CSFR ECD表达和G-CSF诱导的生化信号传导事件的图表和图像。A、B)示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估T细胞增殖。收获细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。图A和B是实验重复。C)示出通过流式细胞术在用所指示嵌合受体构建体转导的原代鼠T细胞中得到的G-CSFR ECD表达的图表。D)蛋白质印迹，以评估表达G21/2R-1、G12/2R-1和21/12/2R-1的细胞或模拟转导T细胞中的所指示细胞因子信号传导事件。用IL-2(300IU/mL)、IL-21(10ng/mL)、IL-12(10ng/mL)或G-CSF(100ng/mL)刺激细胞。β肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。
图50呈现示出表达具有134 ECD的G12/2R-1的原代人PBMC来源的T细胞相对于未转导细胞的扩增倍数和G-CSFR ECD表达的图表。A)示出T细胞扩增测定结果的图表，其中用编码G12/2R-1_134-ECD的慢病毒转导细胞并在IL-2(300IU/mL)、130G-CSF(100ng/ml)或培养基中扩增。每4-5天对活细胞进行计数。正方形表示未用细胞因子刺激的细胞。三角形表示用130G-CSF刺激的细胞。菱形表示用IL-2刺激的细胞。B)示出T细胞扩增测定结果的图表，其中细胞如在图A中被转导。在扩增第19天，洗涤细胞，在IL-2、130G-CSF或仅培养基中重新铺板。每4-5天对活细胞进行计数。正方形表示未用细胞因子刺激的细胞。浅灰色菱形表示用130G-CSF刺激的细胞。深灰色菱形表示用IL-2刺激的细胞。浅灰色倒置三角形表示最初用IL-2刺激且然后在第19天重新铺板在仅培养基中的细胞。深灰色三角形表示最初用130G-CSF刺激且然后在第19天重新铺板在仅培养基中的细胞。C)示出G-CSFR ECD的表达的图表，如在扩增第4天或第16天通过流式细胞术所测定。
图51呈现示出表达具有134 ECD的G12/2R-1的原代人PBMC来源的T细胞相对于未转导细胞的增殖和免疫表型的图表。A)示出BrdU掺入测定结果的图表，以评估T细胞增殖。将细胞收获、洗涤并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、IL-2+IL-12(分别为300IU/ml和10ng/mL)、130G-CSF(300ng/ml)或仅培养基中。B、C)代表性流式细胞术图和图表，其示出在扩增第16天通过流式细胞术评估的表达具有134 ECD的G12/2R-1的细胞相对于未转导细胞的免疫表型。
图52呈现示出表达具有304 ECD的G12/2R-1的原代人PBMC来源的T细胞相对于未转导细胞的扩增倍数和增殖的图表。A)示出T细胞扩增测定结果的图表，其中用编码G12/2R-1_134-ECD的慢病毒转导细胞，并在IL-2(300IU/mL)、130G-CSF(100ng/ml)、304G-CSF(100ng/ml)或仅培养基中扩增。在IL-2、130G-CSF、304G-CSF或仅培养基中培养未转导细胞。每3-4天对活细胞进行计数。倒三角形表示未用细胞因子刺激的细胞。三角形表示用IL-2刺激的细胞。圆圈表示用130G-CSF刺激的细胞。菱形表示用304G-CSF刺激的细胞。B)在第12天从扩增测定中收获细胞，并洗涤并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、130G-CSF(300ng/ml)、304G-CSF(100ng/ml)、307G-CSF(100ng/ml)或仅培养基中。
图53呈现蛋白质印迹，以检测在表达具有304 ECD的G2R-3、具有304 ECD的G12/2R-1的原代PBMC来源的T细胞或未转导T细胞中的所指示细胞因子信号传导事件。从扩增测定中收获细胞，并如所示用304G-CSF(100ng/mL)、IL-2(300IU/mL)、IL-2和IL-12(10ng/mL)或仅培养基刺激。黑色箭头和右侧出露图指示在来自蛋白质阶梯的115kDa和140kDa处的分子量标记。β-肌动蛋白和组蛋白H3充当蛋白质负载对照。
具体实施方式
简言之，并如下文更详细描述，本文描述用于使用变体细胞因子受体和细胞因子对来选择性活化细胞的方法和组合物，其中所述细胞因子受体包含粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的变体胞外结构域(ECD)。在某些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用于专门活化用于过继细胞转移疗法的细胞。因此，本文包括用于产生表达变体受体的细胞的方法，所述变体受体由不结合其天然受体的细胞因子选择性活化。本文还公开了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达包含G-CSFR的变体ECD的受体的细胞，以及共同施用与G-CSFR的变体ECD结合的G-CSF的变体。在某些方面，本文所述的组合物和方法解决了对用于过继细胞转移方法的细胞的选择性活化的迫切需要，并且可以减少或消除对在过继细胞转移之前受试者的免疫耗竭或施用宽作用的刺激性细胞因子诸如IL-2的需要。
定义
除非另有规定，否则如下文所阐述的对权利要求书和说明书中使用的术语进行定义。
术语“治疗”是指在治疗疾病状态(例如癌症疾病状态)时的任何治疗方面有益的结果，包括其预防、其严重性或进展减轻、其缓解或其治愈。
术语“体内”是指在活生物体中发生的过程。
如本文所用，术语“哺乳动物”包括人和非人，并且包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠类、牛、马和猪。
术语“足够的量”是指足以产生所需效果的量，例如足以选择性地活化在细胞上表达的受体的量。
术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。
术语“可操作地连接”是指核酸或氨基酸序列被置于分别与另一种核酸或氨基酸序列的功能性关系中。通常，“可操作地连接”意指所连接的核酸序列或氨基酸序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且处于阅读相中。
如本文所用，术语“胞外结构域”(ECD)是指当在细胞表面上表达时位于质膜外部的受体(例如，G-CSFR)的结构域。在某些实施方案中，G-CSFR的ECD包含SEQ ID NO.2或SEQID NO.7的至少一部分。
如本文所用，术语“胞内结构域”(ICD)是指当受体在细胞表面上表达时位于细胞内的受体的结构域。
如本文所用，术语“跨膜结构域”(TMD或TM)是指当受体在细胞表面上表达时位于质膜内的细胞表面受体的结构域或区。
术语“细胞因子”是指与细胞因子受体结合并且在与细胞上表达的细胞因子受体结合并活化后可诱导细胞信号传导的小蛋白质(约5-20kDa)。细胞因子的实例包括但不限于：白介素、淋巴因子、集落刺激因子和趋化因子。
术语“细胞因子受体”是指与细胞因子结合的受体，包括1型和2型细胞因子受体。细胞因子受体包括但不限于G-CSFR、IL-2R(白介素-2受体)、IL-7R(白介素-7受体)、IL-12R(白介素-12受体)和IL-21R(白介素-21受体)。
如本文所用，术语“嵌合受体”是指经工程化以具有至少一个结构域(例如，ECD、ICD、TMD或C端区)的至少一部分的跨膜受体，所述至少一个结构域源自一种或多种不同跨膜蛋白或受体的序列。
如本文所用，术语“位点II界面”、“位点II区”、“位点II界面区”或“位点II”是指G-CSF与G-CSFR的G-CSF:G-CSFR 2:2异二聚体结合界面中的较大者，位于G-CSF与G-CSFR的细胞因子受体同源(CRH)结构域之间的界面处。
如本文所用，术语“位点III界面”、“位点III区”、“位点III界面区”或“位点III”是指G-CSF与G-CSFR的G-CSF:G-CSFR 2:2异二聚体结合界面中的较小者，并且位于G-CSF与G-CSFR的N端Ig样结构域之间的界面。
如本文所用，术语“至少一部分”或“一部分”在某些方面是指本文所述SEQ ID NO的连续核酸碱基或氨基酸长度的大于75％、大于80％、大于90％、大于95％、大于99％。在某些方面，本文所述的结构域或结合位点(例如，ECD、ICD、跨膜、C端区或信号传导分子结合位点)的至少一部分可以与本文所述的SEQ ID NO.具有大于75％、大于80％、大于90％、大于95％、大于99％同一性。
术语“野生型”是指多肽的天然氨基酸序列或编码本文所述多肽的基因的天然核酸序列。蛋白质或基因的野生型序列是该蛋白质或基因的物种的多肽或基因的最常见序列。
术语“变体细胞因子-受体对”、“变体细胞因子和受体对”、“变体细胞因子和受体设计”、“变体细胞因子-受体开关”或“正交细胞因子-受体对”是指通过氨基酸改变来修饰以(a)缺乏与天然细胞因子或同源受体的结合；并(b)特异性结合对应工程化(变体)配体或受体的基因工程化蛋白质对。
如本文所用，术语“变体受体”或“正交受体”是指变体细胞因子-受体对的基因工程化受体，并且包括嵌合受体。
如本文所用，术语“变体ECD”是指变体细胞因子-受体对的受体(例如，G-CSFR)的基因工程化胞外结构域。
如本文所用，术语“变体细胞因子”、“变体G-CSF”或“正交细胞因子”是指变体细胞因子-受体对的基因工程化细胞因子。
如本文所用，“不结合(do not bind)”、“不结合(does not bind)”或“不能结合”是指没有可检测的结合或结合不明显，即具有远低于天然配体的结合亲和力。
如本文所用，术语“选择性活化(selectively activates)”或“选择性活化(selective activation)”当提及细胞因子和变体受体时是指优先与变体受体结合的细胞因子，并且所述受体在细胞因子与变体受体结合后被活化。在某些方面，细胞因子选择性地活化已经共同演化以特异性结合细胞因子的嵌合受体。在某些方面，细胞因子是野生型细胞因子，并且它选择性地活化在细胞上表达的嵌合受体，而细胞因子的天然野生型受体不在细胞中表达。
如本文所用，术语“活性增强”是指在细胞上表达的变体受体在用变体细胞因子刺激时活性增加，其中所述活性是在用天然细胞因子刺激时对于天然受体观察到的活性。
术语“免疫细胞”是指已知起到支持生物体的免疫系统(包括先天免疫反应和适应性免疫反应)的功能的任何细胞，并且包括但不限于淋巴细胞(例如，B细胞、浆细胞和T细胞)、自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、中性粒细胞和粒细胞。免疫细胞包括干细胞、未成熟免疫细胞和分化细胞。免疫细胞还包括任何细胞亚群，无论在生物体中多么罕见或丰富。在某些实施方案中，通过携带免疫细胞类型和亚群体的已知标志物(例如，细胞表面标志物)来鉴定免疫细胞。
术语“T细胞”是指哺乳动物免疫效应细胞，其特征可以在于CD3和/或T细胞抗原受体的表达，所述细胞可以被工程化以表达直系同源细胞因子受体。在一些实施方案中，所述T细胞选自原初CD8+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、原初CD4+T细胞、辅助性T细胞，例如TH2、TH9、TH11、TH22、TFH；调节性T细胞，例如TR1、天然TReg、诱导型TReg；记忆T细胞，例如中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、NKT细胞和γδT细胞。
术语“G-CSFR”是指粒细胞集落刺激因子受体。G-CSFR也可以称为：GCSFR、G-CSF受体、集落刺激因子3受体、CSF3R、CD114抗原或SCN7。人G-CSFR由Ensembl识别号为ENSG00000119535的基因编码。人G-CSFR由与GeneBank登录号NM_156039.3相对应的cDNA序列编码。
术语“G-CSF”是指粒细胞集落刺激因子。G-CSF也可以称为集落刺激因子3和CSF3。人G-CSF由Ensembl识别号为ENSG00000108342的基因编码。人G-CSF由与GeneBank登录号KP271008.1相对应的cDNA序列编码。
“JAK”也可以称为Janus激酶。JAK是通过Jak-STAT途径转导细胞因子介导的信号的细胞内非受体酪氨酸激酶家族，并且包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。人JAK1由Ensembl识别号为ENSG00000162434的基因编码。人JAK1由与GeneBank登录号NM_002227相对应的cDNA序列编码。人JAK2由Ensembl识别号为ENSG00000096968的基因编码。人JAK2由与GeneBank登录号NM_001322194相对应的cDNA序列编码。人JAK3由Ensembl识别号为ENSG00000105639的基因编码。人JAK3由与GeneBank登录号NM_000215相对应的cDNA序列编码。人_TYK2由Ensembl识别号为ENSG00000105397的基因编码。人TYK2由与GeneBank登录号NM_001385197相对应的cDNA序列编码。
STAT也可以称为信号转导及转录活化蛋白。STAT是7个STAT蛋白STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6的家族。人STAT1由Ensembl识别号为ENSG00000115415的基因编码。人STAT1由与GeneBank登录号NM_007315相对应的cDNA序列编码。人_STAT2由Ensembl识别号为ENSG00000170581的基因编码。人STAT2由与GeneBank登录号NM_005419相对应的cDNA序列编码。人_STAT3由Ensembl识别号为ENSG00000168610的基因编码。人STAT3由与GeneBank登录号NM_139276相对应的cDNA序列编码。人STAT4由Ensembl识别号为ENSG00000138378的基因编码。人STAT4由与GeneBank登录号NM_003151相对应的cDNA序列编码。人STAT5A由Ensembl识别号为ENSG00000126561的基因编码。人STAT5A由与GeneBank登录号NM_003152相对应的cDNA序列编码。人STAT5B由Ensembl识别号为ENSG00000173757的基因编码。人STAT5B由与GeneBank登录号_NM_012448相对应的cDNA序列编码。人STAT6由Ensembl识别号为ENSG00000166888的基因编码。人STAT6由与GeneBank登录号NM_003153相对应的cDNA序列编码。
SHC也可以称为含有转化蛋白的Src同源2结构域。Shc是三个同种型的家族，并且包括p66Shc、p52Shc和p46Shc、SHC1、SHC2和SHC3。人SHC1由Ensembl识别号为ENSG00000160691的基因编码。人SHC1由与GeneBank登录号NM_183001相对应的cDNA序列编码。人SHC2由Ensembl识别号为ENSG00000129946的基因编码。人SHC2由与GeneBank登录号NM_012435相对应的cDNA序列编码。人SHC3由Ensembl识别号为ENSG00000148082的基因编码。人SHC3由与GeneBank登录号NM_016848相对应的cDNA序列编码。
SHP-2也可以称为蛋白酪氨酸磷酸酶非受体类型11(PTPN11)和蛋白酪氨酸磷酸酶1D(PTP-1D)。人SHP-2由Ensembl识别号为ENSG00000179295的基因编码。人SHP-2由与GeneBank登录号NM_001330437相对应的cDNA序列编码。
PI3K也可以称为磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶。PI3K的催化亚基可以称为PIK3CA。人PIK3CA由Ensembl识别号为ENSG00000121879的基因编码。人PIK3CA由与GeneBank登录号NM_006218相对应的cDNA序列编码。
本申请中使用的缩写包括以下：ECD(胞外结构域)、ICD(胞内结构域)、G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、IL-2R(白介素-2受体)、IL-12R(白细胞介素12受体)、IL-21R(白介素-21受体)和IL-7R(白介素-7受体)。IL-2Rγ在本文中也可以被称为：IL-2RG、IL-2Rgc、γc或IL-2Rγc。对于选择的嵌合细胞因子受体设计：“G-CSFRwt-ICDIL-2Rb”在本文中也称为“G/IL-2Rb”；“G-CSFRwt-ICDgc”在本文中也称为“G/gc”；“G-CSFR137-ICDgp130-IL-2Rb”在本文中也称为“具有137ECD的G2R-2”；并且“G-CSFR137-ICDIL-2Rb GCSFR137-ICDgc”在本文中也称为“具有137ECD的G2R-1”。IL-2Rγ(即，IL-2RG、IL-2Rgc、γc或IL-2Rγc)。
必须注意的是，除非上下文另外明确规定，否则如说明书和随附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。
在提供数值范围的情况下，应理解，还明确公开了该范围的上下限之间的各中间值，其中除非上下文另外明确地规定，下限精确到十分位。所述范围中的任何所述值或中间值与该所述范围中的任何其它所述值或中间值之间的每个较小的范围都涵盖在本发明内。这些较小范围的上限或下限可独立地包括或不包括在该范围内，并且任一个限值、没有限值或两个限值都包括在该较小范围内的每个范围也涵盖在本发明内，并受限于所述范围中的任何明确排除的限值。当所明示范围包括所述极限中的一个或两个时，排除那些所包括的极限中的一个或两个的范围也包含于本发明中。
变体细胞因子和受体设计
本文描述了用于选择性活化变体受体的变体细胞因子和受体对。本公开的变体受体包含G-CSFR的胞外结构域；并且变体细胞因子包含G-CSF(粒细胞集落刺激因子)，其结合并活化变体受体。在某些实施方案中，所述变体受体是嵌合受体，其包含G-CSFR的ECD和与G-CSFR不同的受体的ICD的至少一部分。
变体G-CSF和变体G-CSFR ECD对
在某些方面，本文所述的变体G-CSF和受体设计包含至少一个位点II界面区突变、至少一个位点III界面区突变及其组合。在某些方面，本文所述的变体G-CSF和受体设计包含表2、4或6中列出的至少一个位点II或位点III界面区突变。
在某些方面，位点II界面区中的变体受体上的至少一个突变位于G-CSFR胞外结构域的选自由以下氨基酸位置组成的组的氨基酸位置：G-CSFR胞外结构域(SEQ ID NO.2)的141、167、168、171、172、173、174、197、199、200、202和288。
在某些方面，变体G-CSF位点II界面区上的至少一个突变位于G-CSF的选自由以下氨基酸位置组成的组的氨基酸位置：G-CSF(SEQ ID NO.1)的12、16、19、20、104、108、109、112、115、116、118、119、122和123。
在某些方面，变体受体位点II界面区上的至少一个突变选自由以下组成的G-CSFR胞外结构域的突变的组：R141E、R167D、K168D、K168E、L171E、L172E、Y173K、Q174E、D197K、D197R、M199D、D200K、D200R、V202D、R288D和R288E。
在某些方面，变体G-CSF位点II界面区上的至少一个突变选自由以下组成的G-CSF的突变的组：K16D、R、S12E、S12K、S12R、K16D、L18F、E19K、E19R、Q20E、D104K、D104R、L108K、L108R、D109R、D112R、D112K、T115E、T115K、T116D、Q119E、Q119R、E122K、E122R和E123R。
在某些方面，变体位点III界面区上的至少一个突变选自由以下氨基酸位置组成的组的G-CSFR胞外结构域的突变的组：SEQ ID NO.2的30、41、73、75、79、86、87、88、89、91和93。
在某些方面，变体位点III界面区上的至少一个突变选自由以下氨基酸位置组成的组的G-CSF的突变的组：SEQ ID NO.1的38、39、40、41、46、47、48、49和147。
在某些方面，变体受体位点III界面区上的至少一个突变选自由以下组成的G-CSFR胞外结构域的突变的组：S30D、R41E、Q73W、F75K、S79D、L86D、Q87D、I88E、L89A、Q91D、Q91K和E93K。
在某些方面，变体G-CSF位点III界面区上的至少一个突变选自由以下组成的G-CSF的突变的组：T38R、Y39E、K40D、K40F、L41D、L41E、L41K、E46R、L47D、V48K、V48R、L49K和R147E。
本文所述的变体细胞因子和受体对可包含仅位点II区、仅位点III区或位点II区和位点III区两者中的突变。
本文所述的变体细胞因子和受体对可具有任何数量的本文所述的位点II突变和/或位点III突变。在某些方面，变体G-CSF和受体具有表6中列出的突变。在某些方面，变体受体和/或变体G-CSF可具有本文所述的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变。
在某些方面，本文所述的变体受体包含与本文所述的G-CSFR ECD SEQ ID NO.共享至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性的G-CSFR ECD结构域。在某些方面，嵌合受体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.2、3、6或8的G-CSFR的ECD。
在某些方面，本文所述的变体G-CSF包含与G-CSFR ECD SEQ ID NO.1共享至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性的氨基酸序列。
在某些方面，G-CSFR的ECD包含至少一种选自由R41E、R141E和R167D组成的组的氨基酸取代。
变体细胞因子和/或受体不仅可以直接重组产生，而且可以作为与异源多肽(例如信号序列或在成熟蛋白或多肽的N端具有特定切割位点的其他多肽)的融合多肽产生。通常，信号序列可以是载体的组分，或者它也可以是插入到载体中的编码序列的一部分。所选异源信号序列优选地为由宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切割)的序列。在哺乳动物细胞表达中，可以使用天然信号序列，或者其他哺乳动物信号序列可以是合适的，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列以及病毒分泌前导序列。在某些实施方案中，所述信号序列是G-CSFR或GM-CSFR的信号序列。在某些实施方案中，所述信号序列是SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。
在某些方面，变体受体和/或变体G-CSF被天然或合成地修饰(例如，糖基、PEG)以增强稳定性。例如，在某些实施方案中，将变体细胞因子与IgG、白蛋白或其他分子的Fc结构域融合以延长其半衰期，例如通过本领域已知的聚乙二醇化、糖基化等。Fc-融合还可以促进体内替代性Fc受体介导的特性。“Fc区”可以是天然存在的或合成的多肽，其与通过用木瓜蛋白酶消化IgG而产生的IgG C端结构域同源。IgG Fc的分子量为约50kDa。变体细胞因子可以包含整个Fc区或保留延长其为一部分的嵌合多肽的循环半衰期的能力的较小部分。此外，全长或片段化Fc区可以是野生型分子的变体。
在所述变体细胞因子与所述变体受体结合后，所述变体受体活化通过天然细胞元件转导的信号传导，以提供模拟该天然反应的生物活性，但其对经工程化以表达所述变体受体的细胞是特异性的。在某些方面，变体受体和G-CSF对不结合其天然的野生型G-CSF或天然的野生型G-CSFR。因此，在某些实施方案中，所述变体受体不结合内源性对应物细胞因子，包括所述变体细胞因子的天然对应物，而所述变体细胞因子不结合任何内源性受体，包括所述变体受体的天然对应物。在某些实施方案中，与天然细胞因子与天然细胞因子受体的结合相比，变体细胞因子以显着降低的亲和力结合天然受体。在某些实施方案中，变体细胞因子对天然受体的亲和力是天然细胞因子对天然细胞因子受体的亲和力的小于10倍、小于100倍、小于1,000倍或小于10,000倍。在某些实施方案中，变体细胞因子以以下KD结合天然受体：大于1X10-4 M、1X10-5 M、大于1X10-6M；大于1X10-7M、大于1X10-8M或大于1X10-9M。在某些实施方案中，与天然细胞因子受体与天然细胞因子的结合相比，变体细胞因子受体以显著降低的亲和力结合天然细胞因子。在某些实施方案中，变体细胞因子受体与天然细胞因子受体的结合为天然细胞因子与天然细胞因子受体的结合的小于10倍、小于100倍、小于1,000倍或小于10,000倍。在某些实施方案中，变体细胞因子受体以以下KD结合天然细胞因子：大于1X10-4 M、1X10-5 M、大于1X10-6M；或大于1x10-7 M、大于1x10-8 M、或大于1x10-9 M。在一些实施方案中，变体细胞因子对变体受体的亲和力可与天然细胞因子对天然受体的亲和力相当，例如具有的亲和力为天然细胞因子受体对亲和力的至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约100％，并且可以更高，例如天然细胞因子对天然受体的亲和力的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍。亲和力可以通过本领域技术人员熟知的任何数量的测定来确定。例如，可以通过竞争性结合实验来确定亲和力，所述竞争性结合实验在存在各种浓度的未标记配体的情况下使用单一浓度的标记配体来测量受体的结合。通常，未标记配体的浓度在至少六个数量级上变化。通过竞争结合实验，可以确定IC50。如本文所用，“IC50”是指受体和标记配体之间的缔合受到50％抑制所需的未标记配体的浓度。IC50是配体-受体结合亲和力的指标。低IC50表示高亲和力，而高IC50表示低亲和力。
变体细胞因子与细胞表面上表达的变体细胞因子受体的结合，可能会或可能不会影响变体细胞因子受体的功能(与天然细胞因子受体活性相比)；天然活性并非在所有情况下都需要或期望。在某些实施方案中，变体细胞因子与变体细胞因子受体的结合将诱导天然细胞因子信号传导的一个或多个方面。在某些实施方案中，变体细胞因子与在细胞表面上表达的变体细胞因子受体的结合引起选自由以下组成的组的细胞反应：增殖、活力和活性增强。
表1：人WT G-CSF和人WT G-CSFR Ig-CRH结构域的序列
Figure BDA0003673999830000491
Figure BDA0003673999830000501
表2：具有G-CSFE和G-CSFRE突变的位点II设计。
Figure BDA0003673999830000502
Figure BDA0003673999830000511
表4：位点III设计。
设计# 突变G-CSF<sub>E</sub> 突变G-CSFR<sub>E</sub>
51 E46R_L49K S30D_R41E
52 K40D_L41D F75K_Q91K
53 L41K_E46R R41E_Q91D
54 L41E_L47D I88K
55 T38R_E46R R41E_Q73E
56 K40D_R147E F75K_E93K
57 E46R_V48R R41E_Q87E
58 E46R R41E_L86D
59 K40D_E46R R41E_F75K
60 E46R R41E_I88D
61 E46R_L49F R41E_L89A
62 L41D Q91K
63 T38R Q73E
64 Y39E_K40D F75K
65 L41K I88E_Q91D
66 E46R R41E
67 E46R R41E_S79D
68 K40D F75K
69 V48K Q87D
70 R147E E93K
71 L41K Q91D
72 K40F F75K
表6：位点II和III设计的组合产生的设计实例。
Figure BDA0003673999830000521
Figure BDA0003673999830000531
嵌合受体
在某些方面，本文所述的变体受体是嵌合受体。嵌合受体可包含本文所述的任何变体G-CSFR ECD结构域。在某些方面，嵌合受体还包含不同细胞因子受体的胞内结构域(ICD)的至少一部分。不同细胞因子受体的胞内结构域可以选自由以下组成的组：gp130(糖蛋白130)、IL-2Rβ或IL-2Rb(白介素-2受体β)、IL-2Rγ或γc或IL-2RG(白介素-2受体γ)、IL-7Rα(白介素-7受体α)、IL-12Rβ2(白介素-12受体β2)和IL-21R(白介素-21受体)。在某些方面，胞内结构域的至少一部分包含与本文所述的细胞因子受体ICD的氨基酸序列共享至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％氨基酸同一性的氨基酸序列。在某些方面，细胞因子受体ICD的至少一部分与SEQ IDNO.4、7或9共享至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性。
在某些实施方案中，本文描述了嵌合细胞因子受体，其包含可操作地连接至第二结构域的G-CSFR(粒细胞集落刺激因子受体)的胞外结构域(ECD)；所述第二结构域包含多亚基细胞因子受体(例如IL-2R)的胞内结构域(ICD)的至少一部分。在某些方面，嵌合细胞因子受体包含来自表15A和表15B的ICD的一部分。在某些方面，嵌合细胞因子受体包含选自表15A和表15B的跨膜结构域。在某些方面，嵌合细胞因子受体ICD包含来自表15A、表15B和表16中的框1区和框2区。在某些方面，嵌合细胞因子受体包含来自表15A、表15B和表16的至少一个信号传导分子结合位点。
在某些方面，本文所述的嵌合受体包含表17-20中每一个所公开的序列的N端至C端顺序的氨基酸序列。在某些方面，本文所述的嵌合受体的序列包含表17-20中每一个所公开的序列的5'至3'顺序的核酸序列。在某些方面，嵌合细胞因子受体与表17-20中每一个所公开的氨基酸序列的N端至C端顺序的氨基酸序列共享至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸同一性。在某些方面，嵌合细胞因子受体与表17-20中每一个所公开的核酸序列的5'至3'顺序的核酸序列共享至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％核酸同一性。
在某些方面，本文所述的嵌合受体包含与本文所述的ICD SEQ ID NO.共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％氨基酸或核酸序列同一性的细胞因子受体的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.26、29、31、39、41、43、45、47或49的IL-2Rβ的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有核酸序列SEQ ID NO.54、57、59、67、69、71、73、75或77的IL-2Rβ即IL-2Rb的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.51或核酸序列SEQ ID NO.79的IL-7Rα的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.53或核酸序列SEQ ID NO.81的IL-7R的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.45或55的IL-21R的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有核酸序列SEQ ID NO.35或37的IL-21R的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.33、42或46的IL-12Rβ2的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有核酸序列SEQ ID NO.61、70或74的IL-12Rβ2的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.30、32、34、36、38、40、44、50或52的G-CSFR的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有核酸序列SEQ ID NO.58、60、62、64、66、68、72、78或80的G-CSFR的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.28或48的gp130的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有核酸序列SEQ ID NO.56或76的gp130的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO.27的IL-2Rγ(即，IL-2RG、IL-2Rgc、γc或IL-2Rγc)的ICD的至少一部分。在某些方面，嵌合受体包含具有核酸序列SEQ ID NO.55的IL-2Rγ(即，IL-2RG、IL-2Rgc、γc或IL-2Rγc)的ICD的至少一部分。
在某些方面，本文所述的ICD的至少一部分包含至少一个信号传导分子结合位点。在某些方面，至少一个信号传导分子结合位点是G-CSFR的STAT3结合位点；gp130的STAT3结合位点；gp130的SHP-2结合位点；IL-2Rβ的Shc结合位点；IL-2Rβ的STAT5结合位点；IL-2Rβ的STAT3结合位点；IL-2Rβ的STAT1结合位点；IL-7Rα的STAT5结合位点；IL-7Rα的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)结合位点；IL-12Rβ2的STAT5结合位点；IL-12Rβ2的STAT4结合位点；IL-12Rβ2的STAT3结合位点；IL-21R的STAT5结合位点；IL-21R的STAT3结合位点；和IL-21R的STAT1结合位点。在某些方面，至少一个信号传导分子结合位点包含还含有表16中列出的氨基酸的序列。
在某些方面，本文所述的ICD的至少一部分包含gp130或G-CSFR的框1区和框区。在某些方面，框1区包含表2中列出的氨基酸序列。在某些方面，框1区包含与表16中列出的框1序列具有大于50％同一性的氨基酸序列。
在某些方面，不同细胞因子受体的胞内结构域是野生型胞内结构域。
在某些方面，本文所述的嵌合变体受体还包含不同细胞因子受体的跨膜结构域(TMD)的至少一部分。不同细胞因子受体的TMD可以选自由以下组成的组：gp130(糖蛋白130)、IL-2Rβ(白介素-2受体β)、IL-2Rγ或γc(IL-2受体γ)、IL-7Rα(白介素-7受体α)、IL-12Rβ2(白介素-12受体β2)和IL-21R(白介素-21受体)。在某些方面，TMD的至少一部分包含与本文所述的细胞因子受体TMD的氨基酸序列共享至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％氨基酸同一性的氨基酸序列。在某些方面，细胞因子受体TMD的至少一部分与SEQ ID NO.4、5、7或9共享至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性。
在某些方面，如在图20、23和24的嵌合受体设计中所示，本文所述的嵌合受体包含G-CSFR ECD结构域、跨膜结构域(TMD)和以N端至C端顺序排列的一个ICD的至少一部分。
在某些方面，嵌合受体包含SEQ ID NO.3的G-CSFR ECD、SEQ ID NO.4的gp130 TMD和ICD的一部分和SEQ ID NO.5的IL-2RβICD的一部分。在某些方面，嵌合受体包含SEQ IDNO.6的G-CSFR ECD和SEQ ID NO.7的IL-2RβICD的一部分。在某些方面，嵌合受体包含SEQID NO.8的G-CSFR ECD和SEQ ID NO.9的IL-2RγICD的一部分。
变体或野生型细胞因子与细胞表面上表达的嵌合细胞因子受体的结合，可能会或可能不会影响变体细胞因子受体的功能(与天然细胞因子受体活性相比)；天然活性并非在所有情况下都需要或期望。在某些实施方案中，变体细胞因子与嵌合细胞因子受体的结合将诱导天然细胞因子信号传导的一个或多个方面。在某些实施方案中，变体细胞因子与在细胞表面上表达的嵌合细胞因子受体的结合引起选自由以下组成的组的细胞反应：增殖、活力和活性增强。
编码变体细胞因子和受体的核酸
本公开中包括编码本文所述的受体和变体G-CSF中的任一个的核酸。
变体受体或变体G-CSF不仅可以直接重组产生，而且可以作为与异源多肽(例如，信号序列或在成熟蛋白或多肽的N端具有特定切割位点的其他多肽)的融合多肽产生。通常，信号序列可以是载体的组分，或者它也可以是插入到载体中的编码序列的一部分。所选异源信号序列优选地为由宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切割)的序列。在哺乳动物细胞表达中，可以使用天然信号序列，或者其他哺乳动物信号序列可以是合适的，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列以及病毒分泌前导序列。在某些方面，信号序列可以是在SEQ ID NO.2、3、6或8的N端区处包含信号序列的氨基酸序列。在某些方面，信号序列可以是氨基酸序列MARLGNCSLTWAALIILLLPGSLE(SEQ ID NO.11)。
编码变体细胞因子或受体的表达载体
本文还描述了表达载体以及表达载体的试剂盒，其包含编码本文所述的变体受体或变体G-CSF中的一种或多种的一种或多种核酸序列。
在某些实施方案中，将编码变体受体或变体G-CSF的核酸插入到可复制载体中用于表达。这种载体可用于将核酸序列引入到宿主细胞中，使得其表达本文所述的变体受体或细胞因子。许多此类载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。载体包括病毒载体、质粒载体、整合载体等。载体可以是例如质粒或病毒载体，例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或基于转座子的载体或合成mRNA。载体可能够转染或转导细胞(例如，T细胞、NK细胞或其他细胞)。
表达载体通常包含选择基因，也称为可选择标记。该基因编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞将无法在培养基中存活。典型的选择基因编码如下蛋白，所述蛋白(a)赋予对抗生素或其它毒素，例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素的抗性，(b)弥补营养缺陷，或(c)提供从复合培养基中无法获得的关键营养物质。
在某些方面，表达载体含有被宿主生物体识别并可操作地连接至变体蛋白编码序列的启动子。启动子是位于结构基因的起始密码子上游(5')的非翻译序列(通常在约100至1000bp内)，其控制它们可操作地连接的特定核酸序列的转录和翻译。此类启动子通常分为诱导型和组成型两类。诱导型启动子是在其控制下响应于培养条件的某些变化(例如，营养物的存在或不存在或温度变化)来启动由DNA转录的水平升高的启动子。由多种潜在宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。
可以例如通过启动子对哺乳动物宿主细胞中载体的转录进行控制，条件是此类启动子与宿主细胞系统相容，所述启动子获自病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒(例如鼠类干细胞病毒)、乙型肝炎病毒，并且最优选猿猴病毒40(SV40)的基因组；来自异源哺乳动物的启动子，例如肌动蛋白启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子；来自热休克启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子可以还包含SV40病毒复制起始点的SV40限制性片段的形式方便地获得。
通常通过将增强子序列插入载体中来增加由高等真核细胞进行的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，其作用于启动子以增加其转录。增强子是相对定向且位置独立的，在内含子内以及编码序列本身中发现在转录单元的5'和3'处。已知许多来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括位于复制起始点后侧(late side)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起始点后侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子。增强子可剪接入表达载体中编码序列的5'位或3'位，但是优选位于启动子的5'位点。
真核宿主细胞中使用的表达载体还将含有终止转录和稳定mRNA所需的序列。此类序列通常可得自真核或病毒DNA或cDNA的5'(有时为3')非翻译区。包含上文列出的组分中的一个或多个的合适载体的构建采用标准技术。
在某些方面，本文公开了编码本文公开的嵌合受体的慢病毒载体。在某些方面，慢病毒载体包含HIV-1 5’LT和3’LTR。在某些方面，慢病毒载体包含EF1a启动子。在某些方面，慢病毒载体包含SV40聚a终止子序列。在某些方面，载体是psPAX2、
Figure BDA0003673999830000601
12260、pCMV-VSV-G或
Figure BDA0003673999830000602
8454。
在一些实施方案中，还描述了与本文所述序列具有高序列同一性(例如95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性)的核酸和多肽序列。在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语序列“同一性”百分比是指具有指定百分比的当针对最大对应而进行比较和比对时为相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列，如使用下文描述的序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或其他技术人员可用的算法)或通过视觉检查来测量。根据应用，“同一性”百分比可以存在于所比较的序列的区上，例如，存在于功能结构域上，或者可替代地存在于待比较的两个序列的全长上。
对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。序列比较算法然后基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
例如，用于比较的最佳序列比对可以通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法；通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法；通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Package,Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或通过目视检查(一般参见Ausubel等人,下文)来进行。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例是Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中描述的BLAST算法。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。
表达变体受体和变体细胞因子的细胞
本文还描述了表达变体受体的细胞。宿主细胞(包括工程化免疫细胞)可以用上述表达载体转染或转导以用于变体细胞因子或受体表达。
在某些实施方案中，本公开提供了一种细胞，其包含本文所述的变体受体或变体细胞因子中的一种或多种。细胞可包含编码本文所述的变体受体或变体细胞因子的核酸或载体。本公开还提供了产生表达变体受体的细胞的方法。在某些方面，通过将本文所述的核酸或表达载体引入到细胞中来产生细胞。可以通过任何方法将核酸或表达载体引入到细胞中，所述方法包括但不限于病毒载体的转染、转导、转座或基因编辑。可以使用本领域已知的任何基因编辑技术，包括但不限于包括聚集的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR-Cas)系统、锌指核酸酶、基于转录活化因子样效应子的核酸酶和大范围核酸酶的技术。
宿主细胞可以是体内的任何细胞。在某些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，细胞是T细胞，包括但不限于原初CD8+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、原初CD4 T细胞、辅助性T细胞，例如TH1、TH2、TH9、TH11、TH22、TFH；调节性T细胞，例如TR1、天然TReg、诱导型TReg；记忆T细胞，例如中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、NKT细胞、γδT细胞；等。在某些实施方案中，细胞是B细胞，包括但不限于原初B细胞、生发中心B细胞、记忆B细胞、细胞毒性B细胞、产生细胞因子的B细胞、调节性B细胞(Breg)、中心母细胞、中心细胞、抗体分泌细胞、浆细胞等。在某些实施方案中，细胞是先天性淋巴样细胞，包括但不限于NK细胞等。在某些实施方案中，细胞是髓样细胞，包括但不限于巨噬细胞、树突细胞、髓样来源的抑制细胞等。
在某些实施方案中，细胞是干细胞，包括但不限于造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞等。
在一些实施方案中，在转移到受试者中之前，细胞在离体程序中被遗传修饰。细胞可以单位剂量提供以用于治疗，并且可以相对于预期的接受者是同种异体的、自体的等。
T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中起核心作用的一种类型的淋巴细胞。通过在细胞表面上存在T细胞受体(TCR)，可以将它们与其他淋巴细胞(例如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞))区分开。T细胞有多种类型，如下所汇总。
辅助T辅助细胞(Th细胞)在免疫过程中协助其他白细胞，包括使B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞以及活化细胞毒性T细胞和巨噬细胞。Th细胞在其表面上表达CD4。当Th细胞被抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC II类分子呈递肽抗原时，它们会被活化。这些细胞可以分化为几种亚型之一，包括Th1、Th2、Th3、Th17、Th9或Tfh，它们分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫反应。
溶细胞性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并也参与移植排斥。大多数CTL在其表面上表达CD8。这些细胞通过与同存在于所有有核细胞表面上的MHC I类缔合的抗原结合来识别其靶标。
记忆T细胞是在感染消退后长期存在的一小组抗原特异性T细胞。它们在重新暴露于其同源抗原后迅速扩增为大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包括三种亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。
调节性T细胞(Treg细胞)以前称为抑制性T细胞，对于维持免疫耐受性至关重要。它们的主要作用是在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫，并抑制逃避胸腺中阴性选择过程的自身反应性T细胞。已经描述了两个主要类别的CD4+Treg细胞，即天然存在的Treg细胞和适应性Treg细胞。
天然存在的Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)出现在胸腺中，并与发育中的T细胞和已被TSLP活化的髓样(CD1 1c+)和浆细胞样(CD123+)树突细胞之间的相互作用有关。Treg细胞可以通过存在称为FoxP3的细胞内分子来与其他T细胞区分开。
适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可起源于正常的免疫反应。细胞可以是自然杀伤细胞(或NK细胞)。NK细胞形成先天免疫系统的一部分。NK细胞以MHC独立性方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速反应。
在某些方面，表达本文所述的变体受体或变体细胞因子的细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或肿瘤相关淋巴细胞(TAL)。在某些方面，TIL或TAL包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞及其组合。
在某些实施方案中，本文所述的T细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，其已被基因工程化以产生用于免疫疗法的人工T细胞受体。在某些方面，CAR-T细胞来源于患者自身血液中的T细胞(即自体)。在某些方面，CAR-T来源于另一健康供体的T细胞(即同种异体)。
在某些实施方案中，本文所述的T细胞是工程化T细胞受体(eTCR-T细胞)，其已经被基因工程化以产生用于免疫疗法的特定T细胞受体。在某些方面，eTCR-T细胞来源于患者自身血液中的T细胞(即自体)。在某些方面，eTCR-T细胞来源于供体的T细胞(即同种异体)。
NK细胞(属于先天淋巴样细胞组)被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并构成第三种由产生B淋巴细胞和T淋巴细胞的普通淋巴祖细胞分化的细胞。已知NK细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化并成熟，然后进入循环。
在某些方面，本文所述的表达嵌合细胞因子受体的细胞是B细胞。B细胞包括但不限于原初B细胞、生发中心B细胞、记忆B细胞、细胞毒性B细胞、产生细胞因子的B细胞、调节性B细胞(Breg)、中心母细胞、中心细胞、抗体分泌细胞、浆细胞等。
在某些方面，本文所述的表达嵌合细胞因子受体的细胞是髓样细胞，包括但不限于巨噬细胞、树突细胞、髓样抑制细胞等。
本文所述的表达变体受体或变体细胞因子的细胞可以是任何细胞类型。在某些方面，本文所述的表达变体受体或变体细胞因子的细胞是造血系统的细胞。根据本发明的免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)可以由患者本身的外周血(第1方)离体产生，或者在从供体外周血(第2方)进行造血干细胞移植的情况下产生，或由来自未联系的供体(第3方)的外周血产生。或者，本文所述的免疫细胞可以来源于诱导型祖细胞或胚胎祖细胞向免疫细胞的离体分化。或者，可以使用保留其效应功能并可用作治疗剂的永生化免疫细胞系(例如，保持其裂解功能的T细胞或NK细胞系；保留其抗体产生功能的血浆细胞系，或保留其吞噬和抗原呈递功能的树突细胞系或巨噬细胞)。在所有这些实施方案中，表达变体受体的细胞是通过多种方式之一引入编码每个变体受体的DNA或RNA来产生的，所述多种方式包括用病毒载体转导或用DNA或RNA转染。
本文所述的细胞可以是来源于受试者的被离体工程化以表达变体受体和/或变体细胞因子的免疫细胞。免疫细胞可以来自外周血单核细胞(PBMC)样品或肿瘤样品。免疫细胞可以在用编码提供根据本发明第一方面的变体受体或变体细胞因子的分子的核酸转导之前被活化和/或扩增，例如通过用抗-CD3单克隆抗体和/或IL-2处理。本发明的免疫细胞可以通过以下方式制备：(i)从受试者或上文列出的其他来源分离含免疫细胞的样品；和(ii)用编码变体受体或变体细胞因子的一种或多种核酸序列转导或转染免疫细胞。
可以在常规营养培养基中培养细胞，这些培养基在适当时改变以诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因。哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售的培养基，例如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM),(Sigma))、RPMI 1640(Sigma)以及达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM),Sigma)，适于培养宿主细胞。这些培养基中的任何一种可根据需要用激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁及磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷(例如腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷)、抗生素、微量元素以及葡萄糖或等量的能量源进行补充。还可以包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其他必要的补充剂。培养条件，诸如温度、pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员而言将是显而易见的。
然后，免疫细胞可以通过纯化，例如基于抗原结合多肽的抗原结合结构域的表达来选择。在某些实施方案中，通过表达可选择标记(例如，蛋白质、荧光标记或表位标签)或通过本领域已知用于选择、分离和/或纯化细胞的任何方法来选择细胞。
试剂盒
本公开还描述了用于产生表达本文所述的任何变体受体或变体G-CSF中的至少一种的细胞的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包括编码至少一种变体受体的至少一种表达载体和使用说明书。在某些方面，试剂盒还包括药物制剂中的至少一种变体细胞因子或编码与本文所述变体受体中的至少一种结合的变体G-CSF的表达载体。在某些实施方案中，试剂盒包括如下细胞，所述细胞包含编码本文所述的变体受体的表达载体。
在某些实施方案中，试剂盒包括如下细胞，所述细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)/T细胞受体(TCR)等的表达载体。(CAR)/工程化T细胞受体(eTCR)等(例如，工程化非天然TCR受体)。在某些实施方案中，试剂盒包括编码嵌合抗原受体(CAR)/工程化T细胞受体(eTCR)等的表达载体。在某些实施方案中，试剂盒包括编码本文所述的变体受体和嵌合抗原受体(CAR)/工程化T细胞受体(eTCR)等的表达载体。
在某些方面，本文所述的试剂盒还包括变体细胞因子。在某些实施方案中，试剂盒还包括至少一种另外的变体细胞因子。在某些方面，试剂盒还包括药物制剂中的至少一种变体细胞因子。在某些实施方案中，组分以剂型、液体或固体形式以任何方便包装提供。
可以提供另外的试剂用于如本文所述提供的细胞或产生的细胞的生长、选择和制备。例如，试剂盒可以包括用于细胞培养的组分、生长因子、分化剂、用于转染或转导的试剂等。
在某些实施方案中，除了上述组分之外，试剂盒还可以包括使用说明书。说明书可以以任何方便的形式提供。例如，说明书可以作为印刷信息、在试剂盒的包装中、在包装插页中等提供。说明书还可以作为其上记录有信息的计算机可读介质提供。此外，可以在可用于访问信息的网站地址上提供说明书。
选择性活化变体受体的方法
本公开提供了用于选择性活化在细胞表面上表达的变体受体的方法，所述方法包括使本文所述的变体受体与选择性活化嵌合受体的细胞因子接触。在某些方面，选择性活化嵌合受体的细胞因子是变体G-CSF。G-CSF可以是野生型G-CSF或包含与天然(野生型)细胞因子受体相比赋予G-CSF与变体受体的优先结合和活化的一个或多个突变的G-CSF。.
在某些方面，通过细胞因子与变体受体结合而选择性活化变体受体导致同二聚化、异二聚化或其组合。
在某些方面，变体受体的活化导致下游信号传导分子的活化。在某些方面，变体受体活化了通过天然细胞信号传导分子转导的信号传导分子或途径，以提供模拟该天然反应的生物活性，但其对经工程化以表达变体受体的细胞是特异性的。在某些方面，下游信号传导分子的活化包括活化刺激细胞周期进程、增殖、活力和/或增强活性的细胞信号传导途径。在某些方面，活化的信号传导途径或分子是但不限于Jak1、Jak2、Jak3、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、Shc、ERK1/2和Akt。在某些方面，在施用结合受体的细胞因子后，变体受体的活化导致细胞增殖增加。在某些方面，增殖程度是当细胞被IL-2刺激时观察到的增殖的0.1-10倍之间。
过继细胞转移方法
本发明提供了一种用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括向受试者施用表达本文所述的变体受体和/或变体细胞因子的细胞(例如在如下所述的药物组合物中)的步骤。
用于治疗疾病的方法涉及本文所述的细胞，例如T细胞、NK细胞或表达变体受体的任何其他免疫或非免疫细胞的治疗用途。可以向患有现有疾病或病症的受试者施用细胞，以减轻、减少或改善与所述疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断所述疾病的进展。预防疾病的方法涉及本公开的细胞的预防性使用。此类细胞可以施用于尚未感染疾病和/或未表现出疾病的任何症状的受试者，以预防或损害疾病的原因或减少或防止与疾病相关的至少一种症状的发展。受试者可能有所述疾病的易感性，或被认为有发展所述疾病的风险。
在一些实施方案中，本发明的组合物、方法和试剂盒用于增强免疫反应。在一些实施方案中，免疫反应针对期望通过全身施用细胞因子(例如肌内、腹膜内、静脉内等)来消耗或调节靶细胞(例如癌细胞、感染细胞、参与自身免疫性疾病的免疫细胞等)的病症。
方法可包括以下步骤：(i)分离含免疫细胞的样品；(ii)用核酸序列或载体(例如表达变体受体)转导或转染此类细胞；(iii)向受试者施用(即，输注)来自(ii)的细胞，以及(iv)施用刺激输注细胞的变体细胞因子。在某些方面，在向受试者施用所述细胞之前，受试者已经经历了免疫耗竭治疗。在某些方面，在向受试者施用所述细胞之前，受试者未经历免疫耗竭治疗。在某些方面，在向受试者施用所述细胞之前，受试者已经经历了在不使用本文所述的变体受体的情况下必需的严重性、剂量和/或持续时间减少的免疫耗竭治疗。
含免疫细胞的样品可以从受试者或其他来源分离，例如如上所述。免疫细胞可以从受试者本身的外周血(第1方)中分离，或者在从供体外周血(第2方)进行造血干细胞移植的情况下产生，或由来自未联系的供体(第3方)的外周血产生。免疫细胞也可以来源于体外方法，例如从干细胞或其他形式的前体细胞诱导分化。
在一些实施方案中，使免疫细胞与变体细胞因子体内接触，即，其中免疫细胞被转移至接受者，并且向接受者施用有效剂量的变体细胞因子并且允许所述变体细胞因子在其天然位置(例如在淋巴结等)接触所述免疫细胞。在一些实施方案中，所述接触在体外进行。当细胞在体外与变体细胞因子接触时，将细胞因子以足以活化来自受体的信号传导的剂量和时间段添加至细胞，所述信号传导可以利用天然细胞机制的方面，例如辅助蛋白、共受体等。活化的细胞可用于任何目的，包括但不限于与抗原特异性测定、细胞因子谱分析和体内递送有关的实验目的。
在某些方面，向受试者施用治疗有效数量的细胞。在某些方面，在多个不同的情形下向受试者施用或输注表达变体受体的细胞。在某些实施方案中，施用至少1x106个细胞/kg、至少1x107个细胞/kg、至少1x108个细胞/kg、至少1x109个细胞/kg、至少1x1010个细胞/kg或更多，有时受限于在收集过程中获得的细胞，例如转染的T细胞的数量。转染的细胞可以任何生理上可接受的介质(通常是血管内)输注至受试者，尽管它们也可以引入任何其他方便的位点，在所述位点细胞可以找到适合生长的位点。
在某些方面，向受试者施用治疗有效量的变体细胞因子。在某些方面，在多个不同的情形下向受试者施用变体细胞因子。在某些方面，施用的变体细胞因子的量是足以实现治疗上期望的结果(例如，减轻受试者的疾病症状)的量。在某些方面，施用的变体细胞因子的量是足以刺激本文所述的表达变体细胞因子受体的细胞的细胞周期进程、增殖、活力和/或功能活性的量。在某些方面，变体细胞因子以实现治疗上期望的结果所必需的剂量和/或持续时间施用。在某些方面，变体细胞因子以足以刺激本文所述的表达变体细胞因子受体的细胞的细胞周期进展、增殖、活力和/或功能活性的剂量和/或持续时间施用。剂量和频率可能因剂；施用模式；细胞因子的性质；等而变化。本领域技术人员将理解，此类准则将针对个情况进行调整。对于局部施用(例如鼻内、吸入等)、对于全身给药(例如肌内、腹膜内、血管内等)，也可以改变剂量。
过继细胞转移的适应症
本发明提供了一种表达本文所述的变体受体的细胞，其用于治疗和/或预防疾病。本发明还涉及表达本文所述的变体受体的细胞在制造用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
通过本发明的方法治疗和/或预防的疾病可以是癌性疾病，例如但不限于胆管癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、血液系统恶性肿瘤、肾癌(肾细胞)、白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤和甲状腺癌。
待治疗和/或预防的疾病可以是自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的特征是T淋巴细胞和B淋巴细胞异常靶向自身蛋白、多肽、肽和/或其他自身分子，从而导致体内器官、组织或细胞类型(例如，胰腺、脑、甲状腺或胃肠道)损伤和或障碍，以引起疾病的临床表现。自身免疫性疾病包括影响特定组织的疾病以及可以影响多个组织的疾病，这可部分取决于反应是针对局限于特定组织的抗原还是针对广泛分布在体内的抗原。自身免疫性疾病包括但不限于1型糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、自身免疫性甲状腺疾病和格雷夫斯病(Graves’disease)。
待治疗和/或预防的疾病可以是炎症性病症，例如心脏纤维化。通常，炎症性病症或疾患通常会导致免疫系统攻击人体自身的细胞或组织，并可能导致异常炎症，从而导致慢性疼痛、发红、肿胀、僵硬和对正常组织的损害。炎症性病症的特征在于炎症或由炎症引起，并且包括但不限于乳糜泻、血管炎、狼疮、慢性阻塞性肺病(COPD)、肠易激性疾病、动脉粥样硬化、关节炎、肌炎、硬皮病、痛风、干燥综合征(Sjorgren’s syndrome)、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征和牛皮癣。
在某些实施方案中，所述方法用于治疗传染病。
在某些实施方案中，待治疗的病症是预防和治疗移植物排斥。在某些实施方案中，待治疗和/或预防的病症是同种异体移植物排斥。在某些方面，同种异体移植排斥是急性同种异体移植物排斥。
待治疗和/或预防的疾病可涉及将细胞、组织、器官或其他解剖结构移植到受影响的个体。细胞、组织、器官或其他解剖结构可以来自同一个体(自体或“自体”移植)或来自不同个体(同种异体或“异体”移植)。细胞、组织、器官或其他解剖结构也可以使用体外方法产生，包括细胞克隆、诱导细胞分化或用合成生物材料制造。
本发明提供了一种用于治疗和/或预防疾病的方法，其包括向受试者施用本文所述的变体细胞因子和/或细胞(例如在如上所述的药物组合物中)的一个或多个步骤。
用于治疗和/或预防疾病的方法涉及本公开的细胞的治疗用途。在本文中，可以向患有现有疾病或病症的受试者施用细胞，以减轻、减少或改善与所述疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断所述疾病的进展。预防疾病的方法涉及本公开的细胞的预防性使用。此类细胞可以施用于尚未感染疾病和/或未表现出疾病的任何症状的受试者，以预防或损害疾病的原因或减少或防止与疾病相关的至少一种症状的发展。受试者可能有所述疾病的易感性，或被认为有发展所述疾病的风险。方法可包括以下步骤：(i)分离含免疫细胞的样品；(ii)用本发明提供的核酸序列或载体转导或转染此类细胞；(iii)向受试者施用来自(ii)的细胞，以及(iv)施用刺激输注细胞的变体细胞因子。含免疫细胞的样品可分离自受试者或其他来源，例如如上所述。免疫细胞可以从受试者本身的外周血(第1方)中分离，或者在从供体外周血(第2方)进行造血干细胞移植的情况下产生，或由来自未联系的供体(第3方)的外周血产生。
治疗可以与其他活性剂组合，所述其他活性剂例如但不限于抗生素、抗癌剂、抗病毒剂和其他免疫调节剂(例如，针对程序性细胞死亡蛋白-1[PD-1]途径的抗体或针对CTLA-4的抗体)。还可以包括其他细胞因子(例如，干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白介素12等)。
使用表达变体细胞因子受体的干细胞的方法
本发明提供了一种治疗和/或预防病症或疾病的方法，其包括施用表达本文所述的变体受体和/或变体细胞因子的干细胞的步骤。在某些实施方案中，表达本文所述的变体细胞因子受体和/或变体细胞因子的干细胞用于再生医学、细胞/组织/器官移植、组织重建或组织修复。
本发明的药物组合物
本公开还涉及一种药物组合物，其包含表达本文所述的变体受体和/或本文所述的细胞因子的多个细胞。本发明还涉及一种药物组合物，其含有本文所述的变体细胞因子。本发明的细胞可以配制成药物组合物。除表达本文所述的变体受体的细胞中的一种或多种之外，这些组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂、稳定剂或为本领域技术人员所熟知的其他物质。所述物质应是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的药物活性多肽和/或化合物。这种制剂可以是例如适用于静脉内输注的形式。
对于根据本发明的待给予个体的表达本文所述的变体受体和变体细胞因子的细胞，优选的是以足以显示对个体有益的“治疗有效量”进行施用。当足以显示对个体有益时，也可以施用“预防有效量”。细胞因子的实际量或施用的细胞数量以及施用的速率和时间过程将取决于所治疗疾病的性质和严重性。对治疗的指定例如关于剂量的决定等在普通从业者和其他医师的职责范围内，并且通常考虑待治疗的疾患、单个患者的状况、递送部位、施用方法以及为从业者所知的其他因素。以上提及的技术和方案的实例可见于Remington'sPharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.(编),1980中。
视待治疗的病症而定，药物组合物可单独施用，或与其他治疗进行组合，同时或依序施用。
实施例
以下是用于进行本发明的特定实施方案的实施例。实施例仅出于说明性目的而提供，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。已努力确保关于所用数值(例如数量、温度等)的准确性，但当然应允许一些实验误差和偏差。
除非另外指明，否则本发明的实施将利用本领域的技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术、细胞培养、过继细胞转移和药理学的常规方法。此类技术在文献中充分说明。参见，例如T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,本期新增)；Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版。(Plenum Press)第A和B卷(1992)。
实施例1：G-CSF:G-CSFR(CRH)的专用位点II界面的合理设计
野生型(WT)G-CSFWT:G-CSFRWT复合物是2:2异二聚体。G-CSF与G-CSFR的胞外结构域(ECD)具有两个结合界面。G-CSF与G-CSFR的细胞外细胞因子受体同源(CRH)结构域之间的较大界面被称为位点II。G-CSF与G-CSFR的N端Ig样(Ig)胞外结构域之间的较小界面被称为位点III(参见图1)。
为了设计共同演化的、工程化的(E)G-CSFE:G-CSFRE细胞因子:受体对，将WT G-CSF和G-CSFR的Ig-CRH胞外结构域之间的2:2复合物(蛋白质数据库ID 2D9Q，Tamada等人PNAS2006)分离成包含位点II和位点III界面的两个不同的亚复合物，其分别由G-CSF:G-CSFR(CRH)和G-CSF:G-CSFR(Ig)(参见图1)组成，序列参见表1。
方法
为了创建共同演化的专用G-CSFE:G-CSFRE突变体对(设计)，采用了计算设计工作流程(参见图2)。首先，在位点II处创建了专用设计。
对G-CSFWT:G-CSFR(CRH)WT的位点II界面相互作用的计算机结构分析表明大多数分子相互作用由带电荷残基产生，所述相互作用有助于位点II处的总吸引AMBER能量为109.64kcal/mol(参见图3)。深入检查主要揭示了静电和氢键相互作用，例如G-CSFR(CRH)的R167与G-CSF的D112/D109之间的相互作用，这贡献了位点II处28％的总吸引AMBER能量。另一个重要的静电相互作用存在于G-CSFR(CRH)的R141与G-CSF的E122/E123之间(参见图4)，这贡献了位点II处21.4％的总吸引AMBER能量(参见图3)。同样地，细胞因子的E19和受体CRH结构域的R288之间的盐桥贡献了17.3％，通过与受体CRH结构域的D200的静电和氢键相互作用来使精氨酸进一步稳定。
位点II的每个设计都由G-CSFE和G-CSFR(CRH)E的突变体对组成。首先，例如通过反转电荷，通过在结合配偶体上将碱性残基突变为酸性残基并且反之亦然，在位点II处创建积极设计，同时在必要时通过另外的突变来保持堆积和疏水相互作用。将突变体对G-CSFE:G-CSFR(CRH)E通过ZymeCADTM的平均场包装工作流程来包装。目视检查了设计的在位点II上包装的计算机模型的结构完整性，并通过ZymeCADTM度量对其进行了评估。具体来说，旨在设计G-CSFE突变体，以具有对其相应G-CSFR(CRH)E突变体的<10kcal/mol的ZymeCADTM计算机dAMBER结合亲和力(配对相互作用)。此度量将Lennard Jones亲和力和静电亲和力的总和即AMBER亲和力与WT:WT细胞因子受体对的AMBER亲和力进行比较。排除dAMBER_折叠>80kcal/mol的设计。dAMBER折叠度量对Lennard Jones键合折叠和突变后静电折叠之和的变化进行评分。还排除了dDDRW载脂蛋白稳定性(apostability)得分高于400kcal/mol的设计。该度量描述了蛋白质从其载脂蛋白形式突变后，基于知识的潜在稳定性的变化。
接下来，用ZymeCADTM将每种设计的G-CSFE突变体包装在与WT G-CSFR的复合物中(并且反之亦然G-CSFRE与G-CSFWT)，以评估当形成以下两种复合物时在错配条件下每种阳性设计的度量：G-C SFWT:G-CSFR(CRH)E和G-CSFE:G-CSFR(CRH)WT。用ZymeCADTM计算机计算错配取向的ddAMBER度量(DdAMBER_亲和力_Awt_Bmut是配对的工程化复合物的AMBER亲和力减去错配的复合物G-CSFW T:G-CSFR(CRH)E的AMBER亲和力，ddAMBER_亲和力_Amut_Bwt是配对的工程化复合物的AMBER亲和力减去错配的复合物G-CSFE:G-CSFR(CRH)WT的AMBER亲和力。使错配ddAMBER亲和力度量最小化的设计被认为对其配对结合配偶体的选择性大于与野生型细胞因子或受体结合的结合。
对所有位点II设计进行聚类，并且G-CSFE:G-CSFR(CRH)E、G-CSFWT:G-CSFR(CRH)E、G-CSFE:G-CSFR(CRH)WT的包装度量被认为是评估配对的强度(阳性设计)和对与WT G-CSF和G-CSFR(CRH)的错配的选择性(阴性设计)和排名设计。
结果
表2中列出的设计在ZymeCADTM中具有包装度量，所述度量有利于在计算机中G-CSFE:G-CSFR(CRH)E的配对(参见表3)，并在视觉检查中在计算机中显示出令人满意的相互作用，例如盐桥、氢键的存在和严重冲突的不存在(参见图5)。这些设计还显示出针对与WTG-CSF或G-CSFR(CRH)错配的高选择性(参见表3)。
因此，预测表2中所示的相同变体G-CSF和受体设计的位点II突变表现出分别相对于野生型G-CSFR和G-CSF的优先结合。
表3：具有使用ZymeCADTm的来自一式三份计算机平均场包装的以kcal/mol计的AMBER度量的位点II设计。
Figure BDA0003673999830000751
Figure BDA0003673999830000761
实施例2：位点II设计的体外筛选
在下拉实验中以G-CSFE:G-CSFR(CRH)E格式筛选所选的位点II设计，以确保它们在基于杆状病毒的昆虫细胞系统中共表达时形成位点II复合物的能力。还评估了设计是否可以通过将每个设计G-CSFE突变体与G-CSFR(CRH)WT共表达来与WT受体或细胞因子形成错配的复合物，并且反之亦然，每个设计G-CSFR(CRH)E突变体与GCSFWT共表达。通过细胞因子突变体的单次感染来验证了仅G-CSFE的表达。
方法
简言之，将位点II G-CSF设计和相应的配对G-CSFR(CRH)突变体分别克隆到昆虫细胞转染载体中。将G-CSF WT(残基1-173，表1)和突变体在框中克隆到经修饰的pAcGP67b转移载体(Pharmingen)中，连同N端分泌信号和C端TEV可切割的Twin Strep标签，其序列为AAAENLYFQ/GSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQF EK(SEQ ID NO.82)。在受体胞外结构域中，仅将具有位点II设计突变的CRH结构域(残基98-308，表1)在框中克隆到经修饰的pAcGP67b转移载体中，连同N端分泌信号和TEV可切割六聚组氨酸(SE Q ID NO.89)标签，序列为HHHHHHSSGRENLYFQ/GSMG(SEQ ID NO.83)。合成了所有构建体，并针对昆虫细胞表达进行了密码子优化(Genscript)。转移载体DNA通过Midi-prep(ThermoScientific，目录K0481)制备，不含内毒素，并且A260/280吸光度比为1.8-2.0。如制造商(Expression Systems，California)所述，通过使用贴壁方法将重组线性化杆状病毒DNA与载体DNA共转染在草地贪夜蛾(Spodopter a frugiperda)9(Sf9)细胞中来实现重组病毒产生。转染前约1h，6孔组织培养板(Greiner，目录657-160)每孔以0.46x 106个细胞ml-1接种2mL健康的对数期Sf9细胞。如下制备转染混合物：将100μl转染培养基(Expression Systems，California，目录95-020-100)分别放入两个无菌1.5ml微量离心管A和B中的每一个中。向管A中添加0.4μg重组BestBac 2.0Δv-cath/chiA线性化DNA(Expression Syste ms，California，目录91-002)和2μg载体DNA。向管B中添加1.2μl的5X Express2TR转染试剂(Expres2ION，目录S2-55A-001)。将溶液A和B在约24℃下孵育5分钟，然后合并并孵育30分钟。孵育后，将800μl转染培养基添加到每个转染反应中以增加体积至1ml。从孔中移除旧的ESF 921培养基，并用逐滴施用以便不干扰细胞单层的1mL转染混合物置换。将板前后和左右轻轻摇动以均匀分布转染混合物，并在27℃下孵育4小时。4小时后，将转染混合物从共转染板中移除并逐滴添加含有10μg/ml庆大霉素(目录15750-060)的2m L新鲜ESF 921昆虫细胞培养基(ExpressionSystems，California，目录96-001-01)。为防止蒸发，将板包裹在莎伦包装膜(saran wrap)中，放置在无菌塑料盒中，并在27℃下孵育4-5天。在转染后第4天或第5天，收集P1上清液，并通过在5000rpm下离心5分钟来澄清，并转移到新的无菌管中，并在4℃下储存，避光。
将如上所述产生的重组P1原液进一步扩增成高效价的低传代P2原液，以用于蛋白质表达研究。以下工作流程使用从共转染收获的病毒的P1种子原液作为接种物来产生50-100mL病毒。将50mL对数期Sf9细胞以1.5x 106个细胞ml-1接种到250mL摇瓶中(FisherScientific，目录PBV 250)，并添加0.5mL P1病毒原液。在27℃下孵育细胞，以135rpm振摇，并监测感染。感染后5-7天收获P2病毒上清液，并通过以4000rpm离心10分钟来澄清。为了使效价损失最小化，添加10％热灭活FBS(VWR，目录97068-085)，并在黑暗中在4℃下储存P2病毒。
对P2病毒原液进行了小规模的蛋白质表达测试。在12孔板中在粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(Tni)细胞中使用P2病毒共感染G-CSFE突变体与其相应G-CSFRE突变体。使用G-CSFWT和GCSFR(CRH)WT的P2原液对每个设计突变体进行单独的共感染并且对于仅G-CSFE突变体进行感染。对于每个反应，用20μl P2病毒以2x 106个细胞ml-1接种2mL健康对数相Tni。将板在27℃下孵育约70h，伴以135rpm振摇。通过以5000rpm离心3分钟来澄清上清液，并以分批模式使用streptactin-XT工作流平台(IBA Lifesciences，目录2-4010-010)通过G-CSFE突变体和G-CSFWT上的双链霉标签(TST)来下拉分泌的蛋白质。简言之，向每1.8mL反应上清液中添加0.2mL 10倍HEPES缓冲盐水(HBS：20mM HEPES pH8、150mM NaCl)至1倍，添加20μl床体积(b.v)的纯化珠，并在24℃下在倾覆混合的情况下将反应物孵育30分钟。另外添加20μl b.v纯化珠，然后第二次孵育30分钟。通过以2200rpm离心3分钟使珠粒沉淀，除去上清液，并用1X HBS缓冲液洗涤珠粒。用30μl BXT洗脱缓冲液(100mM Tris-CLpH8、150mM NaCl、1mM EDTA、50mM生物素(IBA Lifesciences，目录2-1042-025))洗脱蛋白质，用SDS-PAGE样品缓冲液煮沸，并在200V下在还原条件下运行12％Bolt Bis-Tris plus,12孔凝胶(Thermo Fisher Scientific，目录NW00122BOX)上分析30分钟。
结果
位点II设计#6、7、8、9、15、17、30、34、35、36示出了仅G-CSFE的表达，并形成了足够稳定的配对G-CSFE:G-CSFRE复合物，这些复合物通过G-CSFE上的Twin Strep标签被下拉(参见图6)。例如，工程化复合物的位点II设计#6下拉后在SDS-PAGE上显示了在约22kDa处的G-CSFE突变体以及在约33kDa处的相应的共表达G-CSFR(CRH)E突变体的条带(参见图6)。
在共表达测定中，位点II设计#8、9、15和34也针对与WT G-CSF和WT G-CSFR的错配具有选择性(参见图7)，因为它们没有被WT G-CSF下拉(参见图7下图)，并且WT受体没有被G-CSFE突变体下拉(参见图7上图)。位点II G-CSFRE设计30和35在共表达测定中针对与WTG-CSF的错配具有选择性，因为它们没有被WT G-CSF下拉(参见图7下图)，但是在共表达测定中，反向G-CSFE设计针对与WT G-CSFR的错配不具有选择性，因为WT G-CSFR被下拉(参见图7上图)。在共表达测定中，位点II设计6、7、17和36针对与WT G-CSF或WT G-CSFR的错配没有选择性(参见图7)，因为它们下拉了WT G-CSFR并被WT G-CSF下拉。
在残基R288处具有突变的位点II受体突变体在没有Ig结构域的G-CSFR(CRH)受体链形式中不表达。通过SPR与Ig结构域上的位点III设计的组合来评估含有R288的设计的配对复合物形成(参见实施例6)。因此，鉴别了几种位点II设计，它们形成了足够稳定的配对G-CSFE:G-CSFRE复合物，所述复合物也针对与WT G-CSF和WT G-CSFR的错配具有选择性。
因此，表2中所示的相同变体G-CSF和受体设计的各种位点II突变表现出分别相较于野生型G-CSFR和G-CSF的优先结合。
实施例3：G-CSF:G-CSFR(Ig)的专用位点III界面的合理设计
位点III受体Ig结构域与G-CSF结合的亲合力效应有助于形成2:2异二聚体化学计量的G-CSF:G-CSFR(Ig-CRH)复合物(参见图1)。仅在具有WT位点III界面的位点II上存在的选择性设计似乎不足以创建完全专用的2:2G-CSFE:G-CSFR(Ig-CRH)E复合物。为了有利于使配对的、共同演化的设计的结合相较于与WT细胞因子或受体的错配结合具有选择性，将实施例1中描述的计算机设计工作流应用于位点III界面，以创建选择性位点III设计(参见图2)。
方法
首先，对位点III界面相互作用进行了结构分析。位点III界面为G-CSF:G-CSFR复合物贡献了55.64kcal/mol AMBER能量，并且与界面面积为
Figure BDA0003673999830000801
的位点II相比，其整体界面面积较小，为
Figure BDA0003673999830000802
与位点II界面相比，对位点III界面的深入检查揭示了更少的静电和氢键相互作用(参见图8)。位点III的关键相互作用例如是G-CSF的E46与受体Ig结构域的R41之间的盐桥，此外，G-CSF的R147与受体Ig结构域的E93之间的盐桥(参见图9)。两种相互作用分别为位点III的总吸引AMBER能量贡献15.9％和15.4％。例如，通过受体Ig结构域的Q87进行进一步的相互作用，所述结构域与G-CSF位点III的主链的侧链酰胺形成氢键相互作用，并与细胞因子的周围侧链例如E46和L49具有Lennard Jones相互作用。这种相互作用构成了位点III处总吸引AMBER能量的12.3％。
接下来，在位点III创建了阳性设计，其中G-CSFE突变体对其共同演化的G-CSFR(Ig)E突变体在计算机上具有良好的AMBER结合亲和力(配对相互作用)。例如，这是通过反转电荷或改变形状互补性，同时保持有利的Lennard Jones和氢键相互作用来完成的。将突变体对G-CSFE:G-CSFR(Ig)E通过ZymeCADTM的平均场包装工作流程来包装。目视检查了设计在位点III上包装的计算机模型的结构完整性，并通过ZymeCADTM度量对其进行了评估，如实施例1中所述。接下来，用ZymeCADTM将每种设计的G-CSFE突变体与WT G-CSFR(Ig)包装(反之亦然，G-CSFR(Ig)E与G-CSFWT)，以评估在与WT细胞因子和受体错配的条件下的度量。使用如之前在实施例1中对于位点II所述的ZymeCADTM(参见表5)计算位点III设计的ddAMBER亲和力度量(G-CSFWT:G-CSFR(Ig)E、G-CSFE:G-CSFR(Ig)WT)。
对位点III设计进行聚类，并将所有三个计算机复合物G-CSFE:G-CSFR(Ig)E、G-CSFWT:G-CSFR(Ig)E、G-CSFE:G-CSFR(Ig)WT的包装度量与目视检查一起考虑，以评估配对的强度和针对与WT的错配的选择性，以便对设计进行排名。
结果
表4中列出的设计在ZymeCADTM中具有计算机包装度量，有利于G-CSFE:G-CSFR(Ig)E的配对，相较于与WT G-CSF或G-CSFR(Ig)的配对具有高选择性。
因此，预测表4中所示的相同变体G-CSF和受体设计的各种位点III突变表现出分别相较于野生型G-CSFR和G-CSF的优先结合。
表5：具有在ZymeCADTm中以kcal/mol计的来自一式三份计算机平均场包装的AMBER度量的位点III设计。
Figure BDA0003673999830000821
实施例4：位点II和位点III的创建变体的共同演化的细胞因子-受体开关的组合
为了开发一种完全选择性的设计对G-CSFE:G-CSF(Ig-CRH)E，它能够通过2:2异二聚体工程化复合物进行结合和信号传导，并且与野生型细胞因子或受体具有低的或完全消除的交叉反应性，将来自实施例1和3的所选位点II和III设计组合(参见表6)并在体外进行测试。
以相同的方式，将表6中的设计组合，实施例1的位点II设计(表2)与实施例3的位点III设计(表4)的任何其他组合可产生可实现变体信号传导的组合的完全选择性G-CSFE:G-CSFR(Ig-CRH)E设计。在实施例2所述的共表达测定中测试组合设计401和402形成工程化G:CSFE:G-CSFR(Ig-CRH)E复合物的能力以及它们结合WT细胞因子或受体的能力。
方法
如以上实施例2所述进行通过细胞因子TST标签的下拉共表达测定，不同之处在于受体构建体含有称为G-CSFR(Ig-CRH)的Ig和CRH结构域(残基2-308，表1)。
结果
组合设计401和402在共表达测定中具有完全选择性，因为设计细胞因子下拉了其共同演化的工程化受体，而非WT受体，并且反之亦然，WT G-CSF不会下拉工程化受体(参见图10)。
这些结果表明，将选择位点II和位点III突变组合的变体G-CSF和包含变体G-CSFRECD设计的受体能够特异性结合工程化细胞因子受体对，并且分别不结合野生型受体或细胞因子。
实施例5：产生G-CSF和G-CSFR野生型和突变体
为了产生野生型和工程化细胞因子和受体变体并比较它们的生物物理特性，从昆虫细胞中表达并纯化了重组蛋白。
方法
如上所述克隆G-CSFE和G-CSFWT。在2-4L健康的对数期Tni细胞中如下进行重组蛋白质的制备规模生产：用每2ml细胞20μl细胞因子变体P2病毒接种800mL的2x 106个细胞ml-1的Tni，并且将其在27℃下在以135rpm振摇下孵育70h。孵育后，通过以5500rpm离心15分钟来使细胞沉淀，并将上清液过滤两次，首先通过1μm的A/E型玻璃纤维过滤器(PALL，目录61631)过滤，随后通过0.45μm PVDF膜过滤器(Sigma Aldrich，目录HVLP04700)过滤。添加蛋白酶抑制剂混合物III(Sigma Aldrich，目录加539134)并将上清液缓冲液交换到HBS(20mM HEPES pH8、150mM NaCl)中并在切向流上浓缩至300mL。用3x 3mL b.vStreptactin-XT工作流平台以分批模式纯化蛋白质，并在搅拌下孵育2x 1h，并在4℃下孵育1x过夜。在洗脱之前，用10 CV HBS缓冲液洗涤树脂。在4x 5mL BXT洗脱缓冲液中洗脱蛋白质。通过nanodrop A280和还原SDS-PAGE分析洗脱液，将其浓缩至约2mL，并通过与TEV以1:80的TEV:蛋白质比率在18℃下孵育过夜并进行倾覆混合，从而裂解TST纯化标签。在装载到SX7516/600或SX200 16/600尺寸排阻柱(GE Healthcare，目录28-9893-33或28-9893-35)上之前，通过SDS-PAGE确认切割蛋白，所述柱在20mM BisTris pH 6.5、150mM NaCl中平衡(参见图11)。通过还原SDS-PAGE分析含有蛋白质的级分，将其合并，并通过nanodropA280测量来测量浓度。
对于受体变体的蛋白质纯化，如上所述克隆野生型和G-CSFR(Ig-CRH)E突变体，用于纯化的受体构建体除CRH结构域外还包含Ig结构域(Uniprot ID Q99062的残基3-308，表1)。如上所述，制备了病毒原液并将其用于2-4L规模的感染。将澄清的上清液缓冲液交换到Ni-NTA结合缓冲液(20mM HEPES pH8、1M NaCl、30mM咪唑)中，并如上所述浓缩至300mM。用3x 3mL b.v Ni-NTA工作流平台以分批结合模式纯化蛋白质，并在搅拌下孵育2x 1h，并在4℃下孵育1x过夜。在洗脱之前，用10 CV结合缓冲液洗涤树脂。在4x5mL Ni-NTA洗脱缓冲液(20mM HEPES pH8、1M NaCl、250mM咪唑)中洗脱蛋白质。分析洗脱液，将其缓冲液交换到20mM Bis-Tris pH6.5、150mM NaCl中，浓缩并如上所述裂解过夜。随后将切割蛋白装载到SX 75 16/600或SX200 16/600尺寸排阻柱(GE Healthcare)上，所述柱在20mM BisTris pH6.5、150mM NaCl中平衡(参见图12)。通过还原SDS-PAGE分析含有蛋白质的级分，将其合并，并通过nanodrop A280测量来测量浓度。
结果
野生型、G-CSFE和G-CSFRE突变体在SEC后为>90％纯的，如通过还原SDS-PAGE判断(参见图11和12)。设计401和402G-CSFE的每1L培养物在SEC后的产率分别为2.7mg和1.6mg。设计401和402G-CSFRE的每1L产物在SEC后的产率分别为1.7mg和1.5mg。将WT G-CSF以每1L培养物在SEC后2.1mg的产率纯化，将WT G-CSFR以每1L培养物在SEC后3.1mg的产率纯化。
这些结果证实，用于纯化变体G-CSF和受体的方法可有效地产生纯化的蛋白质，以用于体外分析生物物理特性。
实施例6：通过SPR确定设计对其配对和错配的结合配偶体的亲和力
为了确定设计细胞因子对其共同演化的受体突变体的亲和力，测量了G-CSFE对G-CSFRE的亲和力。还通过SPR(错配)确定设计子集的G-CSFE对G-CSFRWT的亲和力和G-CSFWT对G-CSFRE的亲和力。
方法
使用PBS-T(PBS+0.05％(v/v)Tween 20)运行缓冲液在25℃温度下在BiacoreT200仪器(GE Healthcare，Mississauga，ON，Canada)上进行SPR结合测定。CM5系列S传感器芯片、Biacore胺偶联试剂盒(NHS、EDC和1m乙醇胺)以及10mM乙酸钠缓冲液全部都购自GEHealthcare。具有0.05％Tween20(PBS-T)的PBS运行缓冲液购自Teknova Inc.(Hollister,CA)。在三种不同的固定取向上评估了设计。
为了确定G-CSFE与G-CSFRE的结合亲和力，如制造商(GE LifeSciences)所述，通过标准胺偶联捕获G-CSFRE突变体。简言之，在EDC/NHS活化后，立即以5μL/min的流速注射G-CSFRE于10mM NaOAc pH 5.0中的5μg/mL溶液，直到达到约700-900RU的受体密度。通过以10μL/min 420s注射1M乙醇胺盐酸盐-NaOH pH 8.5来淬灭剩余的活性基团。使用单循环动力学，将使用空白缓冲液对照以200nM开始的两倍连续稀释的相应G-CSFE突变体的六个浓度以25μL/min依次注射300s，并存在1800s解离阶段，产生一组具有缓冲液空白参考的传感图。也对没有捕获变体的参考细胞进行相同的样品滴定。通过以30μL/min持续30s进行10mM甘氨酸/HCl pH 2.0的一个脉冲来再生芯片，以准备下一个注射循环。
为了评估G-CSFWT与G-CSFRE的结合亲和力，如上所述，将G-CSFE以约700-900RU的密度捕获在芯片上。使用单循环动力学，将使用用空白缓冲液对照以200nM开始的两倍连续稀释的每个G-CSFRWT的六个浓度以25μL/min依次注射300s，并存在1800s总解离时间，产生一组具有缓冲液空白参考的传感图。也对没有捕获变体的参考细胞进行相同的样品滴定，并且如上所述再生芯片。
为了评估G-CSFE与G-CSFRWT的结合亲和力，如上文在本实施例中所述，捕获如实施例5中所述纯化的重组G-CSFRWT。使用单循环动力学，如上所述，依次注射使用空白缓冲液对照以200mM开始的两倍连续稀释的每个G-CSFE突变体的六个浓度。也对没有捕获变体的参考细胞进行相同的样品滴定。如上所述再生G-CSFRWT表面。
作为对照，在每个实验中评估WT G-CSF与WT G-CSFR(Ig-CRH)的结合，并将其用于计算每个独立测量中的KD倍数变化。
使用BiacoreTM T200评估软件v3.0分析来自一式两份或一式三份重复注射的双参考传感图，并拟合至1:1Langmuir结合模型。
结果
动力学推导的亲和常数(KD)，其中通过拟合曲线的缔合相和离解相获得。WT G-CSF对WT G-CSFR(Ig-CRH)的KD的范围在1.8-2.5E-9之间。对于动力学参数无法拟合的情况，尝试推导出稳态亲和常数。在这些情况下，由WT G-CSF:WT G-CSFR(Ig-CRH)对的稳态推导出的KD计算KD倍数变化，并在表7中指示。
设计9、130、134、137、307、401和402显示出对其共同演化的结合配偶体的亲和力不大于WT:WT KD的2倍(参见表7和图13)。
设计9、30和34G-CSFR(Ig-CRH)E突变体显示出对WT G-CSF的亲和力与WT G-CSFR(Ig-CRH)相比弱超过700倍。设计#35G-CSFR(Ig-CRH)E针对与WT细胞因子的错配的选择性较低，其对WT G-CSF的亲和力与WT:WT亲和力相比降低了约19倍。设计130、134、401、402、300、3003、304和307 G-CSFR(Ig-CRH)E突变体针对与WT G-CSF的错配的选择性最强，并且在滴定的浓度下未显示出与WT G-CSF的明显结合(参见表8、图13)。
设计124、130、401、402、300、303、304和307 G-CSFE突变体在滴定的浓度下未显示出与WT G-CSFR(Ig-CRH)的明显结合。设计9、30和34G-CSFE突变体显示对WT G-CSFR(Ig-CRH)的KD与WT:WT KD相比弱至少约20倍。设计#134G-CSFE显示出对WT G-CSFR(Ig-CRH)的亲和力弱约500倍(参见表9、图13)。设计35和117G-CSFE突变体显示与WT G-CSFR(Ig-CRH)的结合类似于WT:WT KD。
这些结果表明，所选变体G-CSF设计不结合野生型G-CSFR ECD或与野生型G-CSFRECD的亲和力显着降低(弱至少约20倍的KD)。
表7：通过SPR确定的G-CSFE突变体对其相应G-CSFR(Ig-CRH)E突变体的结合亲和力(KD)与WT:WT结合亲和力相比的变化
Figure BDA0003673999830000881
ss表示稳态推导的亲和常数。
表8：通过SPR确定的WT G-CSF与设计G-CSFR(Ig-CRH)E的结合亲和力与WT:WT结合亲和力相比的变化
Figure BDA0003673999830000882
Figure BDA0003673999830000891
ss表示稳态推导的亲和常数
表9：通过SPR确定的G-CSFE与野生型G-CSFR(Ig-CRH)的结合亲和力与WT:WT结合亲和力相比的变化
Figure BDA0003673999830000892
实施例7：设计G-CSFE突变体热稳定性的测定
为了测定G-CSFE和G-CSFRE突变体与WT细胞因子和受体相比的热稳定性，进行了差示扫描量热法(DSC)。
方法
通过差示扫描量热法(DSC)如下评估变体的热稳定性：将950mL浓度为1-2mg/mL的纯化样品用于使用Nano DSC(TA instruments,New Castle,DE)进行的DSC分析。在每次运行开始时，进行缓冲液空白注射以稳定基线。在60psi氮气压力下，以60℃/h的速率从25℃至95℃扫描每个样品。参考所得的热分析图并使用NanoAnalyze软件进行分析，以确定作为热稳定性指标的熔解温度(Tm)。
结果
将工程化变体的热稳定性报告为在相同条件和实验设置下测得的工程化分子与等效野生型分子的最显着转变(最高焓)之间的差异。在独立实验中，测量的WT GCSF Tm在52.2℃和55.4℃之间变化，而WT G-CSFR显示出Tm为50.5℃。除设计#15和34外，测试的G-CSFE突变体显示出小于5℃的Tm，与WT G-CSF的Tm不同(参见表10和图14)。所有测试的受体突变体显示出与WT受体相同的热稳定性(参见表10和图14)。
这些结果表明，变体G-CSF和具有变体G-CSFR ECD设计的受体与野生型G-CSF和G-CSFR具有相似的热稳定性；并且位点II和/或位点III突变不会破坏G-CSF或G-CSFR ECD的热稳定性。
表10：通过DSC测定的设计细胞因子和受体突变体的熔解温度(Tm)与野生型相比的变化。
Figure BDA0003673999830000901
Figure BDA0003673999830000911
*在150mM NaCl,20mM BisTris pH 6.5中测定
实施例8：通过UPLC-SEC测定G-CSFE突变体的单分散性
为了测定G-CSFE突变体与WT G-CSF相比的单分散性，通过UPLC-SEC分析了突变体。
方法
使用Acquity BEH125 SEC柱(4.6x 150mm，不锈钢，1.7μm颗粒)(Waters LTD，Mississauga，ON)对SEC纯化的蛋白质样品进行UPLC-SEC，所述柱设置为30℃并安装在具有PDA检测器的Agilent Technologies 1260infinity II系统上。运行时间由7分钟组成，其中运行缓冲液为150mM NaCl、20mM HEPES pH 8.0或150mM NaCl、20mM BisTris pH 6.5，流速为0.4mL/min。通过在210-500nm范围内的UV吸光度监测洗脱，并在280nm处提取色谱图。使用OpenLABTMCDS ChemStationTM软件进行峰值积分。
结果
WT G-CSF和设计34、35和130G-CSFE突变体为100％单分散(参见表11)。突变体8、9、15、117、135显示出在65.3-79.5％之间的较低单分散性。设计#134细胞因子在pH 8.0下显示出57.3％单分散性，在pH 6.5下改善至86.6％单分散性。流动相在较低pH下的单分散性的改善可能是由于pI的偏移，例如从针对WT G-CSF的计算的5.41的pI偏移到针对设计#134G-CSFE的计算的8.35的pI。
这些结果表明，某些变体G-CSF设计与野生型G-CSF具有100％单分散性。表明位点II和/或位点III突变的子集不会破坏G-CSF的单分散性；而其他变体G-CSF设计导致单分散性降低，在较低pH值下增加。
表11：通过UPLC-SEC测定的G-CSFE设计突变体的单分散性。
Figure BDA0003673999830000921
Figure BDA0003673999830000931
*在150mM NaCl、BisTris pH 6.5中
实施例9：构建具有细胞内IL-2受体信号传导结构域的嵌合G-CSF受体
为了研究设计G-CSFE细胞因子突变体是否能够通过设计G-CSFR(Ig-CRH)E受体突变体发出信号并引起免疫细胞增殖，使用融合到gp130跨膜(TM)结构域和细胞内信号传导结构域(ICD)的G-CSFR ECD以及IL-2Rβ细胞内信号传导结构域(G-CSFRWT-ICDgp130-IL-2Rβ)来构建单链嵌合G-CSF受体。还利用了由两个亚基组成的嵌合G-CSFR，所述亚基被设计以共表达为异二聚体受体：1)G-CSFRWT-ICDIL-2Rβ亚基由融合到IL-2RβTM和ICD的G-CSFR ECD组成；并且2)G-CSFRWT-ICDγc亚基由融合到共同γ链(γc,IL-2Rγ2Rγ)TM和ICD的G-CSFR ECD组成。
方法
单链嵌合受体构建体被设计为包含G-CSFR信号肽和ECD，随后是gp130 TM和部分ICD以及IL-2Rβ部分ICD(表12)。异二聚体嵌合受体构建体被设计为包含：1)G-CSFR信号肽和ECD，随后是IL-2RβTM和ICD(表13)；和2)G-CSFR信号肽和ECD，随后是γc TM和ICD(表14)。将嵌合受体构建体克隆到慢病毒转移质粒中，并通过桑格测序(Sanger sequencing)验证构建体序列。如下将转移质粒和慢病毒包装质粒(psPAX2、pVSVG)共转染到慢病毒包装细胞系HEK293T/17细胞(ATCC)中：将细胞铺板在含有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM中过夜，并在转染前2-4小时更换培养基。将质粒DNA和水在聚丙烯管中混合，并逐滴添加CaCl2(0.25M)。孵育2至5分钟后，通过与2x HEPES缓冲盐水(0.28M NaCl、1.5mM Na2HPO4、0.1M HEPES)1:1混合来沉淀DNA。将沉淀的DNA混合物添加到细胞上，将其在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天更换HEK293T/17培养基，并将细胞再孵育24小时。第二天早上，从板上收集细胞上清液，短暂离心以除去碎片，并通过0.45μm过滤器过滤。在Beckman Optima L-XP超速离心机中使用SW-32Ti转子以25,000rpm将上清液旋转90分钟。除去上清液，并将沉淀重悬浮在合适体积的Opti-MEM培养基中。通过将病毒连续稀释液添加到BAF3细胞(生长RPMI含有10％胎牛血清、青霉素、链霉素和100IU/ml hIL-2)上来测定病毒效价。转导后48-72小时，将细胞与抗人G-CSFR APC缀合抗体(1:50稀释)和eBioscienceTM FixableViability Dye eFluorTM 450(1:1000稀释)一起在4℃下孵育15分钟，洗涤并在CytekAurora或BD FACS Calibur流式细胞仪上分析。使用通过该方法测确定的估计效价，以MOI为0.5用编码嵌合受体构建体的慢病毒上清液转导32D-IL-2Rβ细胞系(在含有10％胎牛血清、青霉素、链霉素和300IU/ml hIL-2的RPMI中生长)。通过向细胞中添加相关量的病毒上清液、孵育24小时并置换细胞培养基来进行转导。转导后3-4天，如上所述，通过流式细胞术来验证人G-CSFR的表达。在进行BrdU测定之前，将细胞在G-CSFWT中扩增约14-28天。
将如上所述在G-CSFWT中扩增的32D-IL-2Rβ细胞在PBS中洗涤三次，并重新铺板在含有相关测定细胞因子的新鲜培养基中(没有细胞因子、hIL-2(300IU/ml)、G-CSFWT(30ng/ml)或G-CSFE(30ng/ml)持续48小时。BrdU测定程序遵循BD PharmingenTM APC BrdU Flow试剂盒(557892)的说明手册，并添加以下内容：将细胞与BrdU和eBioscienceTM FixableViability Dye eFluorTM 450(1:5000)共同孵育30分钟。使用Cytek Aurora仪器进行分析流式细胞术。
结果
在BrdU测定中，与hIL-2(300IU/ml)相比，用单链嵌合受体构建体G-CSFRWT-ICDgp130-IL-2Rβ或异二聚体受体构建体G-CSFRWT-ICDIL-2Rβ加上G-CSFRWT-ICDγc转染的细胞响应于G-CSFWT(30ng/ml)而表现出相似或优异的增殖。细胞在没有细胞因子的情况下不增殖(参见图15)。
这些结果表明，在G-CSF刺激下，单链和异二聚体嵌合受体构建体可以被活化以诱导细胞增殖。
实施例10：通过BrdU检查的用设计137G-CSFRE-ICDIL-2转导并用野生型或设计G- CSF137处理的32D-IL-2Rβ细胞的增殖
体外测试如通过SPR或共表达测定判断的具有足够选择性的位点II/III组合设计诱导32D-IL-2Rβ细胞增殖的能力。
方法
将设计137的点突变引入到表12-14中所述的构建体中。G-CSFR137-ICDgp130-IL-2Rβ(同源二聚体)或G-CSFR137-ICDIL-2Rβ加上G-CSFR137-ICDγc(异二聚体)构建体的克隆和表达遵循与上文所述相同的程序。在进行BrdU测定之前，将细胞在G-CSF137中扩增约14-28天。
使用上述BrdU测定程序测定在G-CSF137中扩增的32D-IL-2Rβ细胞在G-CSF137(30ng/ml)、G-CSFWT(30ng/ml)、hIL-2(300IU/ml)或无细胞因子中的增殖。
结果
在BrdU测定中，与hIL-2(300IU/ml)相比，用单链嵌合受体构建体G-CSFR137-ICDgp130-IL-2Rβ或异二聚体受体构建体G-CSFR137-ICDIL-2Rβ加上G-CSFR137-ICDγc转染的细胞在G-CSF137(30ng/ml)中表现出相似或优异的增殖。细胞在没有细胞因子的情况下不增殖，并且在G-CSFWT(30ng/ml)中表现出较差的增殖(参见图16)。
这些结果表明，变体G-CSF特异性活化工程化受体；并且相反，工程化受体被变体G-CSF活化，但明显少于野生型G-CSF。因此，变体G-CSF可以特异性活化具有变体G-CSFRECD的嵌合受体，从而特异性诱导表达嵌合受体的细胞的增殖。
实施例11：通过BrdU检查的用野生型G-CSFR-ICDIL-2转导并用的野生型或设计G- CSFE处理的32D-IL-2Rβ细胞的增殖
随后测试了能够在32D-IL-2R2Rβ细胞中恢复配对信号传导的位点II/III组合设计诱导用单链嵌合受体构建体G-CSFRWT-ICDgp130-IL-2Rβ或异二聚体受体构建体G-CSFRWT-ICDIL-2Rβ加上G-CSFRWT-ICDγc转导的32D-IL-2R2Rβ细胞的增殖的能力。
方法
G-CSFRWT-ICDgp130-IL-2Rβ(同源二聚体)或G-CSFRWT-ICDIL-2Rβ加上G-CSFRWT-ICDγc(异二聚体)构建体的克隆和表达遵循与上文所述相同的程序。在进行BrdU测定之前，将细胞在G-CSFWT中扩增约14-28天。
使用上述BrdU测定程序测定在G-CSFWT中扩增的32D-IL-2Rβ细胞在G-CSF137(30ng/ml)、G-CSFWT(30ng/ml)、hIL-2(300IU/ml)或无细胞因子中的增殖。
结果
在BrdU测定中，与G-CSFWT(30ng/ml)相比，用单链嵌合受体构建体G-CSFRWT-ICDgp130-IL-2Rβ或异二聚体受体构建体G-CSFRWT-ICDIL-2Rβ和G-CSFRWT-ICDγc转导的细胞在G-CSF137(30ng/ml)中表现出较差的增殖。细胞在没有细胞因子的情况下不增殖(参见图17)。
这些结果表明，变体G-CSF不能有效地结合野生型G-CSFR，并且变体G-CSF特异性活化工程化受体，而不是野生型G-CSFR，以诱导细胞增殖。
实施例12：通过蛋白质印迹法分析的在用WT或设计137G-CSFRE-ICDIL-2转导并用野 生型或设计G-CSF137处理的32D-IL-2Rβ细胞中的信号传导
位点II/III组合设计能够通过32D-IL-2Rβ细胞中的工程化细胞因子-受体复合物恢复增殖信号传导并且通过结合G-CSFWT或WT-GCSFR-ICD-IL2不会显著传导信号，通过蛋白质印迹评估所述组合设计响应于G-CSFWT或G-CSF137而活化下游信号传导分子的能力。
方法
G-CSFRWT-ICDgp130-IL-2Rβ(同源二聚体)或G-CSFRWT-ICDIL-2Rβ加上G-CSFRWT-ICDγc(异二聚体)构建体的克隆和表达遵循与上文所述相同的程序。在进行蛋白质印迹测定之前，将细胞在G-CSF137或G-CSFWT中扩增约14-28天。将未转导细胞保持在IL-2中。
为了进行蛋白质印迹，将细胞在PBS中洗涤三次，并在不含细胞因子的培养基中放置16-20小时。未用细胞因子刺激细胞、用IL-2(300IU/ml)、G-CSF137(30ng/ml)或G-CSFWT(30ng/ml)在37℃下刺激细胞20分钟。在含有10mM HEPES pH 777.9、1mM MgCl2、0.05mMEGTA、0.5mM EDTA pH 8.0、1mM DTT和1x Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制剂小型片剂(A32961)的洗涤缓冲液中将细胞洗涤一次。将细胞在上述洗涤缓冲液中裂解，其中添加0.2％IgepalCA630(Sigma)，在冰上裂解10分钟，并在4℃下以13,000rpm离心10分钟，之后收集上清液(细胞质部分)。将沉淀重悬浮并溶解在上述洗涤缓冲液中，添加0.42M NaCl和20％甘油。将细胞在冰上裂解30分钟，频繁涡旋，并在4℃下以13,000rpm离心20分钟，之后收集核部分(上清液)。将细胞质和核级分还原(70℃)10分钟，并在NuPAGETM 4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶上运行。将凝胶转移到硝酸纤维素膜上(在20V下在
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SD Semi-Dry TransferCell中60min)，干燥并在TBS中的
Figure BDA0003673999830000982
封闭缓冲液(927-50000)中封闭1h。在4℃下在含有0.1％Tween20的TBS中的
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封闭缓冲液中将印迹与一抗(1:1,000)一起孵育过夜。所用的一抗获自Cell Signaling Technologies：磷酸-Shc(Tyr239/240)抗体#2434、磷酸-Akt(Ser473)(D9E)
Figure BDA0003673999830000984
兔mAb#4060、磷酸-S6核糖体蛋白(Ser235/236)抗体#2211、磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体#9101、β-肌动蛋白(13E5)兔mAb#4970、磷酸-Stat3(Tyr705)(D3A7)
Figure BDA0003673999830000985
兔mAb#9145、磷酸-Stat5(Tyr694)(C11C5)兔mAb#9359和组蛋白H3(96C10)小鼠mAb#3638。将印迹在含有0.1％Tween20的TBS中洗涤三次，并在室温下将其与二抗(1:10,000)在含有0.1％Tween20的TBS缓冲液中孵育30-60分钟。二抗获自CellSignaling Technologies：抗小鼠IgG(H+L)(DyLightTM800 4X PEG缀合物)#5257和抗兔IgG(H+L)(DyLightTM 800 4X PEG缀合物)#5151。将印迹洗涤并暴露在LI-COR Odyssey成像仪上。
结果
在未转导的32D-IL-2Rβ细胞中，仅检测到响应于用IL-2刺激的活化的IL-2R相关信号传导分子。在表达G-CSFRWT-ICDgp130-IL-2Rβ或G-CSFRWT-ICDIL-2Rβ加上G-CSFRWT-ICDγc的32D-IL-2Rβ细胞中观察到响应于IL-2或G-CSFWT的活化的信号传导分子的相似模式。没有观察到IL-2R相关信号传导分子响应于表达G-CSFRWT-ICDgp130-IL-2Rβ的32D-IL-2Rβ细胞或表达G-CSFRWT-ICDIL-2Rβ加上G-CSFRWT-ICDγc的细胞的G-CSF137刺激的活化。在表达G-CSFR137-ICDgp130-IL-2Rβ或G-CSFR137-ICDIL-2Rβ加上G-CSFR137-ICDγc的32D-IL-2Rβ细胞中观察到响应于IL-2或G-CSF137的活化的信号传导分子的相似模式。没有观察到在表达G-CSFR137-ICDgp130-IL-2Rβ的32D-IL-2Rβ细胞或表达G-CSFR137-ICDIL-2Rβ加上G-CSFR137-ICDγc的细胞中响应于G-CSFWT刺激的IL-2R2R2R相关信号传导分子的活化(参见图18)。
这些结果表明，变体G-CSF能够活化表达变体G-CSFR ECD的嵌合受体，从而在表达嵌合受体的细胞中诱导天然细胞因子信号传导的方面。
实施例13-30的方法
原代细胞和细胞系：在含有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM中培养慢病毒包装细胞系HEK293T/17(ATCC)。先前通过将人IL-2Rβ亚基稳定转染到BAF3细胞系中来产生BAF3-IL-2Rβ细胞，并且使所述细胞在含有10％胎牛血清、青霉素、链霉素和100IU/ml人IL-2(hIL-2)(
Figure BDA0003673999830000991
Novartis Pharmaceuticals Canada)的RPMI-1640中生长。先前通过将人IL-2Rβ亚基稳定转染到32D细胞系中来产生32D-IL-2Rβ细胞，并且使所述细胞在含有10％胎牛血清、青霉素、链霉素和300IU/ml hIL-2或所示其他细胞因子的RPMI-1640中生长。使人PBMC来源的T细胞(Hemacare)在含有3％人AB血清(Sigma-Aldrich,H4522)和300IU/ml hIL-2或所示其他细胞因子的TexMACSTM培养基(Milenyi Biotec,130-097-196)中生长。通过在T细胞培养基中培养原发性腹水样品14天来产生人肿瘤相关淋巴细胞(TAL)，所述T细胞培养基是以下各项的50:50混合物：1)含有10％胎牛血清、50uMβ-巯基乙醇、10mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素的RPMI-1640；和2)含有最终浓度为3000IU/ml hIL-2的AIM VTM培养基(ThermoFisher,12055083)。在这种高剂量IL-2扩增之后，将TAL在含有300IU/ml hIL-2或所示其他细胞因子的T细胞培养基中培养。将逆转录病毒包装细胞系Platinum-E(Cell Biolabs，RV-101)在含有10％FBS、青霉素/链霉素、嘌呤霉素(1mcg/ml)和杀稻瘟菌素(10mcg/ml)的DMEM中培养。
慢病毒产生和32D-IL-2Rβ细胞的转导：将嵌合受体构建体克隆到慢病毒转移质粒中，并通过桑格测序(Sanger sequencing)验证所得序列。使用磷酸钙转染方法如下将转移质粒和慢病毒包装质粒共转染到HEK293T/17细胞中：将细胞铺板过夜，并在转染前2-4小时更换培养基。将质粒DNA和水在聚丙烯管中混合，并逐滴添加CaCl2(0.25M)。孵育2至5分钟后，通过与2x HEPES缓冲盐水(0.28M NaCl、1.5mM Na2HPO4、0.1M HEPES)1:1混合来沉淀DNA。将沉淀的DNA混合物添加到细胞上，将其在37℃、5％CO2下孵育过夜。第二天更换HEK293T/17培养基，并将细胞再孵育24小时。第二天早上，从板上收集细胞上清液，短暂离心以除去碎片，并通过0.45微米过滤器过滤上清液。在Beckman Optima L-XP超速离心机中使用SW-32Ti转子以25000rpm将上清液旋转90分钟。除去上清液并将沉淀重悬浮在合适体积的Opti-MEM培养基中。通过将病毒连续稀释液添加到BAF3-IL-2Rβ细胞上来确定病毒效价。在转导后48-72小时，将细胞与抗人G-CSFR APC缀合抗体(1:50；Miltenyi Biotec，130-097-308)和Fixable Viability Dye eFluorTM 450(1:1000,eBioscienceTM,65-0863-14)一起在4℃下孵育15分钟，洗涤，并在Cytek Aurora或BD FACS Calibur流式细胞仪上进行分析。使用通过该方法确定的估计效价，以感染复数(MOI)为0.5用编码嵌合受体构建体的慢病毒上清液转导32D-IL-2Rβ细胞系。通过向细胞中添加相关量的病毒上清液、孵育24小时并随后替换培养基来进行转导。转导后3-4天，如上所述通过流式细胞术测定人G-CSFR的表达。
人原代T细胞的慢病毒转导：为了转导PBMC来源的T细胞和TAL，根据制造商的指南，将细胞解冻并在人T细胞TransActTM(Miltenyi Biotec,130-111-160)存在下铺板。活化后24小时，以MOI为0.125-0.5添加慢病毒上清液。活化48小时后，将细胞分到新鲜培养基，去除残留的病毒和活化试剂。转导后两至四天，如上所述通过流式细胞术测定转导效率。对于其中分别测定CD4+和CD8+级分的转导效率的实验，利用针对人G-CSFR、CD4(1:50，Alexa
Figure BDA0003673999830001001
700缀合物，BioLegend,300526)、CD8(1:50,PerCP缀合物，BioLegend,301030)、CD3(1:50，Brilliant Violet 510TM缀合物，BioLegend,300448)和CD56(1:50,BrilliantViolet 711TM缀合物，BioLegend,318336)的抗体以及Fixable Viability DyeeFluorTM450(1:1000)。
人T细胞和32D-IL-2Rβ扩增测定：将表达上文产生的所示嵌合受体构建体的人原代T细胞或32-IL-2Rβ细胞在PBS中洗涤三次，并在新鲜培养基中重新铺板，或使其培养基逐渐更换，正如所示。将完全培养基更换为含有野生型人G-CSF(内部产生或
Figure BDA0003673999830001011
Amgen Canada)、突变G-CSF(内部产生)、hIL-2或无细胞因子。每3-5天，通过台盼蓝排除测定细胞活力和密度，并相对于起始细胞数计算扩增倍数。如上所述，通过流式细胞术评估G-CSFR表达。
CD4+和CD8+人TAL扩增测定：为了检查TAL的CD4+和CD8+级分的扩增，将离体腹水样品解冻，并使用人CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，130-096-533)和人CD8+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，130-096-495)来富集CD4+和CD8+级分。在含细胞因子的培养基中扩增后，通过流式细胞术使用以下各者来评估细胞的免疫表型：针对人G-CSFR、CD4(1:50，Alexa
Figure BDA0003673999830001012
700缀合物，BioLegend,300526)、CD8(1:50,PerCP缀合物，BioLegend,301030)、CD3(1:50，Brilliant Violet 510TM缀合物，BioLegend,300448)和CD56(1:50,Brilliant Violet 711TM缀合物，BioLegend,318336)的抗体以及FixableViability Dye eFluorTM 450(1:1000)。
原代人T细胞免疫表型测定：在含细胞因子的培养基中扩增后，通过流式细胞术利用以下各者评估T细胞的免疫表型：针对G-CSFR、CD4(1:100，Alexa
Figure BDA0003673999830001013
700缀合物，BioLegend，300526；或PE缀合物，eBioscienceTM，12-0048-42；或Brilliant Violet 570TM缀合物，Biolegend，317445)、CD8(1:100，PerCP缀合物，BioLegend，301030)、CD3(1:100，Brilliant Violet 510TM或Brilliant Violet 750TM缀合物，BioLegend，300448或344845)、CD56(1:100，Brilliant Violet 711TM缀合物，BioLegend，318336)、CCR7(1:50，APC/FireTM 750缀合物，Biolegend，353246)、CD62L(1:33，PE/DazzleTM 594缀合物，Biolegend，304842)、CD45RA(1:33，FITC缀合物，Biolegend，304148)、CD45RO(1:25，
Figure BDA0003673999830001014
710缀合物，eBioscienceTM，46-0457-42)、CD95(1:33，PE-Cyanine7缀合物，eBioscienceTM,25-0959-42)的抗体以及Fixable Viability Dye eFluorTM 450或5106(1:1000)。
逆转录病毒转导：通过限制性内切核酸酶克隆来改变pMIG转移质粒(质粒#9044，Addgene)以去除IRES-GFP(BglII至PacI位点)，并引入编码定制多克隆位点的退火引物。将嵌合受体构建体克隆到定制转移质粒中，并通过桑格测序(Sanger sequencing)验证所得序列。如上所述，使用磷酸钙转染方法将转移质粒转染到Platinum-E细胞中。转染后24小时，将培养基更换为5ml新鲜的完全培养基。转染后48小时，从板中收集细胞上清液，并通过0.45微米过滤器过滤。向上清液中添加溴化己二甲铵(1.6mcg/ml，Sigma-Aldrich)和鼠IL-2(2ng/ml，Peprotech)。如下所述，使用该纯化的逆转录病毒上清液来转导鼠淋巴细胞。
在收集逆转录病毒上清液前48小时，将24孔粘附板用未缀合的抗鼠CD3(5mcg/ml，BD Biosciences，553058)和抗鼠CD28(1mcg/ml，BD Biosciences，553294)抗体包被，在PBS中稀释，并储存在4摄氏度下。在收集逆转录病毒上清液前24小时，根据维多利亚大学动物护理委员会(University of Victoria Animal Care Committee)批准的动物使用方案对C57Bl/6J小鼠(内部产生)实施安乐死。如下收获脾脏并分离鼠T细胞：手动分离脾脏并通过100微米过滤器过滤。通过在室温下在ACK裂解缓冲液(Gibco，A1049201)中孵育五分钟，然后在含血清的培养基中洗涤一次来将红细胞裂解。使用特定的基于珠粒的分离试剂盒(Miltenyi Biotec，分别为130-104-075或130-095-130)分离CD8a-阳性或Pan-T细胞。将细胞添加到用抗CD3和抗CD28抗体包被的板中的鼠T细胞扩增培养基(含有10％FBS、青霉素/链霉素、0.05mMβ-巯基乙醇和2ng/ml鼠IL-2(Peprotech，212-12))或300IU/mL人IL-2(Proleukin的RPMI-1640))中并在37摄氏度、5％CO2下孵育24小时。在转导当天，用上文产生的逆转录病毒上清液替换大约一半的培养基。将细胞用逆转录病毒上清液在30摄氏度下以1000g旋转转染(spinfected)90分钟。将板返回到培养箱中0-4小时，然后用新鲜的T细胞扩增培养基替换大约一半的培养基。如上所述，在24小时后重复逆转录病毒转导，总共进行两次转导。最终转导后24小时，将T细胞分到6孔板，并从抗体刺激中去除。
转导后48-72小时，通过流式细胞术评估转导效率，以如上所述检测人G-CSFR，CD4(Alexa Fluor 532缀合物，eBioscienceTM，58-0042-82)、CD8a(PerCP-eFluor 710缀合物，eBioscienceTM，46-0081-82)和Fixable Viability Dye eFluorTM 450(1:1000稀释)。
BrdU掺入测定：将如上所述产生的人原代T细胞、32D-IL-2Rβ细胞或鼠原代T细胞在PBS中洗涤三次，并在含有以下相关测定细胞因子的新鲜培养基中重新铺板48小时：无细胞因子、hIL-2(300IU/ml)、野生型或工程化G-CSF(以在单个实验中指示的浓度)。BrdU测定程序遵循BD PharmingenTM APC BrdU Flow试剂盒(BD Biosciences,557892)的说明书手册，并添加以下内容：将细胞与BrdU和Fixable Viability Dye eFluorTM 450(1:5000)在37摄氏度下共同孵育30分钟至4小时。使用Cytek Aurora仪器进行流式细胞术。为了特异性评估表达嵌合受体的鼠T细胞的增殖，在固定之前，在冰上对人G-CSFR(1:20稀释)，CD4(1:50稀释)和CD8(1:50稀释)进行15分钟额外染色。
蛋白质印迹：将如上所述产生的人原代T细胞、32D-IL-2Rβ细胞或鼠原代T细胞在PBS中洗涤三次，并在不含细胞因子的培养基中放置16-20小时。在37摄氏度下，未用细胞因子刺激细胞、用IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(以在单个实验中指示的浓度)或G-CSF137(30ng/ml)刺激细胞20分钟。将细胞在含有10mM HEPES pH7.9、1mM MgCl2、0.05mM EGTA、0.5mM EDTA pH 8.0、1mM DTT和1x Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制剂小型片剂(A32961)的缓冲液中洗涤一次。将细胞在冰上在上述洗涤缓冲液中裂解10分钟，其中添加0.2％NP-40(Sigma)。将裂解物在4摄氏度下以13000rpm离心10分钟，并收集上清液(细胞质级分)。将沉淀(含有核蛋白)重悬浮于上述洗涤缓冲液中，其中添加0.42M NaCl和20％甘油。将核在冰上孵育30分钟，频繁涡旋，并在4摄氏度下以13,000rpm离心20分钟后收集上清液(核部分)。将细胞质和核级分还原(70摄氏度)10分钟，并在NuPAGETM 4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶上运行。将凝胶转移到硝酸纤维素膜上(在20V下在
Figure BDA0003673999830001041
SD Semi-Dry Transfer Cell中60min)，干燥并在TBS中的
Figure BDA0003673999830001042
封闭缓冲液(927-50000)中封闭1h。在4摄氏度下在含有0.1％Tween20的TBS中的
Figure BDA0003673999830001043
封闭缓冲液中将印迹与一抗(1:1000)一起孵育过夜。所用的一抗获自Cell Signaling Technologies：磷酸-Jak1(Tyr1034/1035)(D7N4Z)兔mAb#74129、磷酸-Jak2(Tyr1007/1008)#3771、磷酸-Jak3(Tyr980/981)(D44E3)兔mAb#5031、磷酸-p70 S6激酶(Thr421/Ser424)抗体#9204、磷酸-Shc(Tyr239/240)抗体#2434、磷酸-Akt(Ser473)(D9E)
Figure BDA0003673999830001044
兔mAb#4060、磷酸-S6核糖体蛋白(Ser235/236)抗体#2211、磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)抗体#9101、β-肌动蛋白(13E5)兔mAb#4970、磷酸-STAT1(Tyr701)(58D6)兔mAb#9167、磷酸-STAT3(Tyr705)(D3A7)
Figure BDA0003673999830001045
兔mAb#9145、磷酸-STAT4(Tyr693)抗体#5267、磷酸-STAT5(Tyr694)(C11C5)兔mAb#9359和组蛋白H3(96C10)小鼠mAb#3638。将印迹在含有0.1％Tween20的TBS中洗涤三次，并在室温下将其与二抗(1:10,000)在含有0.1％Tween20的TBS缓冲液中孵育30-60分钟。从Cell SignalingTechnologies获得的二抗是抗小鼠IgG(H+L)(DyLightTM 800 4X PEG缀合物)#5257和抗兔IgG(H+L)(DyLightTM 800 4X PEG缀合物)#5151。将印迹洗涤并暴露在LI-COR Odyssey成像仪上。
检测磷酸化蛋白质的流式细胞术：将如上所述产生的人原代T细胞、32D-IL-2Rβ细胞或鼠原代T细胞在PBS中洗涤三次，并在不含细胞因子的培养基中放置16-20小时。在Fixable Viability Dye eFluorTM 450(1:1000)和所示抗G-CSFR(1:20)、抗CD4(1:50)和抗CD8a(1:50)存在下，在37摄氏度下，未用细胞因子刺激细胞、用IL-2(300IU/ml)或野生型G-CSF(100ng/ml)刺激细胞20分钟。使细胞沉淀并在室温下用BD PhosflowTM固定缓冲液I(BDBiosciences,557870)固定15分钟。洗涤细胞，然后在冰上用BD PhosflowTM透化缓冲液III(BD Biosciences,558050)透化15分钟。将细胞洗涤两次，并重新悬浮于含有20ul BDPhosflowTM PE小鼠抗-Stat3(pY705)(BD Biosciences,612569)或PE小鼠IgG2aκ同型对照(BD Biosciences,558595)的缓冲液中。洗涤细胞，并使用Cytek Aurora仪器进行流式细胞术。
实施例13：表达G2R-1、仅G-CSFR/IL-2RΒ亚基、仅MYC标记的G-CSFR/γ-C亚基或全 长G-CSFR的人T细胞的扩增。
用编码图1所示嵌合受体构建体的慢病毒转导PBMC来源的T细胞或肿瘤相关淋巴细胞(TAL)，并将细胞洗涤并重新铺板在所指示的细胞因子中。每3-4天计数细胞。将G/γc在其N端用Myc表位标记(Myc/G/γc)，并且将G/IL-2Rβ在其N端用Flag表位标记(Flag/G/IL-2Rβ)；这些表位标签有助于通过流式细胞术进行检测，并且不会影响受体的功能。正如预期，所有T细胞培养物均显示出响应于阳性对照细胞因子IL-2(300IU/ml)的增殖。用G-CSF(100ng/ml)刺激后，仅观察到PMBC来源的T细胞和表达G2R-1嵌合细胞因子受体的TAL的增殖(图22)。注意，慢病毒转导效率小于100％，使得小于100％的T细胞表达所指示的嵌合细胞因子受体，这可能解释了由G2R-1介导的增殖速率相对于IL-2更低的原因。类似地，在表达G-CSFR嵌合受体亚基G2R-1和G2R-2并用G-CSF刺激的32D-IL-2Rβ细胞(稳定表达人IL-2Rβ亚基)中观察到增殖增加(图21)。与T细胞相反，仅表达G/IL-2Rβ嵌合受体亚基的32D-IL-2Rβ细胞在响应G-CSF时增殖(图2)；在仅表达G/γc嵌合受体亚基的32D-IL-2Rβ细胞中未见G-CSF诱导的增殖(图2)。
这些结果表明G-CSF能够刺激PMBC来源的T细胞和表达G2R-1嵌合受体的TAL以及表达G/IL-2Rβ、G2R-1和G2R-2嵌合受体的32D-IL-2Rβ细胞的增殖和活力。
实施例14：G-CSFRECD在用G/IL-2Rβ、G2R-1和G2R-2转导的细胞的表面上表达。
在用编码G2R-2嵌合细胞因子受体的慢病毒载体转导后，对32D-IL-2Rβ细胞系、PBMC来源的人T细胞和人肿瘤相关淋巴细胞进行流式细胞术(在图23和25中示意性示出)，以确定细胞是否在细胞表面表达G-CSFR ECD。在所有转导的细胞类型中均检测到G-CSFR阳性细胞(图26)。在单独的实验中，通过流式细胞术测得，表达G/IL-2Rβ、G2R-1和G2R-2嵌合受体的32D-IL-2Rβ细胞对G-CSFR ECD呈阳性(图21B-21D中的下图)。
这些结果表明G/IL-2Rβ、G2R-1和G2R-2嵌合受体在细胞表面上表达。
实施例15：与未转导细胞相比，表达G2R-2的细胞的扩增
将人PBMC来源的T细胞和人肿瘤相关淋巴细胞用G2R-2受体构建体进行慢病毒转导(图4和6)，洗涤，并与所指示的细胞因子重新铺板。在某些实验中，也通过用TransAct刺激而定期重新活化T细胞。每3-4天对活细胞进行计数。用G-CSF(100ng/ml)刺激之后在表达G2R-2嵌合受体的细胞中但不在未转导细胞中，观察到PMBC来源的T细胞(图27A)和肿瘤相关淋巴细胞(图27B、27C中的两次独立实验)的增殖。
这些结果表明G-CSF诱导的G2R-2嵌合受体的活化足以诱导免疫细胞的增殖和活力。
实施例16：与未转导细胞相比，表达G2R-2的CD4选择或CD8选择的人肿瘤相关淋巴 细胞的扩增和免疫表型
将CD4选择的和CD8选择的人T细胞用编码G2R-2的慢病毒载体转导(图25)，或如所指示保持未转导。将细胞洗涤并用指示的细胞因子重新铺板并每3-4天计数一次。在用G-CSF(100ng/ml)或IL-2(300IU/ml)刺激后观察到表达G2R-2的CD4选择或CD8选择的TAL的增殖，但在不存在添加的细胞因子(仅培养基)的情况下未观察到(图28和29)。在图28中，每条线表示来自5个患者样品之一的结果。
通过流式细胞术进行的免疫表型分析表明，在G-CSF或IL-2中培养的T细胞保留其CD4+或CD8+同一性(图30A)，缺乏NK细胞表型(CD3-CD56+)(图30A)，并且在这些培养条件下表现出CD45RA-CCR7-T效应记忆(TEM)表型(图30B)。
进行BrdU测定以确认在用G-CSF刺激后表达G2R-2的T细胞的细胞周期进程增加(图31)。正如所示，在测定之前，通过在IL-2或G-CSF中培养来选择T细胞。评估了肿瘤相关淋巴细胞(图31A)和PBMC来源的T细胞(图31B)。
这些结果表明，G-CSF可以通过活化嵌合细胞因子受体G2R-2来选择性地活化细胞周期进程和原代人TAL的长期扩增。这些结果还表明，通过形成同二聚体活化G2R-2嵌合受体足以活化TAL中的细胞因子样信号传导和增殖。此外，表达G2R-2的TAL仍依赖于细胞因子，因为它们在撤除G-CSF时经历细胞死亡，类似于对IL-2撤除的反应。在G-CSF中培养的TAL与在IL-2中培养的TAL保持相似的免疫表型。
实施例17：表达G2R-2的原代鼠T细胞响应于G-CSF而增殖。
进行BrdU掺入测定以评估在用G-CSF刺激时表达G2R-2或单链G/IL-2Rβ(G2R-1的组分)的原代鼠T细胞相对于模拟转导细胞的增殖。在测定之前，将所有细胞在IL-2中扩增3天。通过流式细胞术证实G2R-2或G/IL-2Rβ的细胞表面表达(图32A)。正如所示，然后将细胞铺板在IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。在表达G2R-2的细胞中观察到在用G-CSF刺激后增加的细胞周期进程高于未转导细胞或表达单链G/IL-2Rβ的细胞中(图32B、32C)。图B和图C分别示出了所有活细胞或G-CSFR+细胞的结果。
这些结果表明，响应于G-CSF诱导的同二聚化，G2R-2嵌合受体比单链G/IL-2Rβ受体更有效地活化鼠T细胞中的细胞因子样信号传导和增殖。
实施例18：在表达G2R-2的人原代T细胞中响应于G-CSF或IL-2而活化细胞因子相 关的细胞内信号传导事件
为了证实与IL-2相似，嵌合细胞因子受体确实能够活化细胞因子信号传导，评估了细胞因子受体活化各种信号传导分子的能力。使表达G2R-2的肿瘤相关淋巴细胞和PBMC来源的T细胞先前在G-CSF中扩增，而未转导细胞先前在IL-2中扩增。将细胞洗涤，然后用IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子刺激，并且使用针对所指示的信号传导分子的抗体对细胞裂解物进行蛋白质印迹(图33)。图A和图B示出了TAL的结果，并且图C示出了PBMC来源的T细胞的结果。表达G2R-2的T细胞在用G-CSF刺激时活化IL-2相关信号传导分子，其程度与IL-2刺激未转导细胞或转导细胞后可见的活化相似，但预期的例外是G-CSF诱导Jak2磷酸化，而IL-2诱导Jak3磷酸化。
这些结果证实，G2R-2嵌合受体能够在用G-CSF刺激时活化IL-2受体样细胞因子受体信号传导。
实施例19：在表达G2R-2的鼠原代T细胞中响应于G-CSF而活化细胞因子信号传导。
为了评估嵌合细胞因子受体G2R-2或单链G/IL-2Rβ(来自G2R-1)是否能够活化细胞因子信号传导，通过对表达G2R-2或G/IL-2Rβ的鼠原代T细胞相对于模拟转导细胞的细胞裂解物进行蛋白质印迹来评估这些细胞因子受体活化各种信号传导分子的能力。在测定之前，将所有细胞在IL-2中扩增3天。然后洗涤细胞并用IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子刺激细胞。表达G2R-2的细胞在用G-CSF刺激时活化IL-2相关信号传导分子，其程度与IL-2刺激未转导细胞或转导细胞后可见的活化相似，但预期的例外是G-CSF诱导Jak2磷酸化，而IL-2诱导Jak3磷酸化(图34)。相反，G/IL-2Rβ在暴露于G-CSF时不会活化细胞因子信号传导。
这些结果在原代鼠T细胞中证实，在G-CSF刺激后，G2R-2嵌合受体能够通过同二聚化活化IL-2受体样细胞因子受体信号传导，而单独的单链G/IL-2Rβ不能通过响应于G-CSF的同二聚化来活化细胞因子信号传导。
实施例20：嵌合受体的表达在用正交G-CSF刺激后导致32D-IL-2Rβ细胞和原代鼠T 细胞的增殖。
为了确定表达嵌合细胞因子受体的细胞是否可以响应于正交版本的G-CSF而被选择性活化，用包含野生型G-CSFR ECD(G2R-1WT ECD、G2R-2WT ECD)的嵌合受体G2R-1和G2R-2以及包含携带氨基酸取代R41E、R141E和R167D的G-CSFR ECD(G2R-1 134 ECD、G2R-2 134ECD)的嵌合受体G2R-1和G2R-2转导32D-IL-2Rβ细胞或原代鼠T细胞。用IL-2、野生型G-CSF或正交G-CSF(130G-CSF)刺激细胞，所述正交G-CSF能够结合G2R-1 134 ECD和G2R-2134ECD，但与野生型G-CSFR的结合显著降低。进行BrdU掺入测定以评估细胞在细胞因子刺激下促进细胞周期进程的能力(图3)。表达G2R-2 134 ECD的32D-IL-2Rβ细胞在用130G-CSF(包含氨基酸取代E46R、L108K和D112R；30ng/ml)刺激后显示出细胞周期进程，但在用野生型G-CSF(30ng/ml)刺激后未经历细胞周期进程。通过在“十字形(criss-cross)”增殖测定中刺激原代鼠T细胞，进一步证明了工程化细胞因子:受体ECD对的正交性质，其中将表达具有WT、130、134、304或307 ECD的G2R-3的细胞(图23)用WT、130、304或307细胞因子(100ng/ml)刺激(图36)。130ECD具有氨基酸取代：R41E和R167D。304 ECD具有氨基酸取代：R41E、E93K和R167D；而304细胞因子具有氨基酸取代：E46R、L108K、D112R和R147E。307 ECD具有氨基酸取代：R41E、D197K、D200K和R288E；而307细胞因子具有氨基酸取代：S12E、K16D、E19K和E46R。图36中的图A和图B表示实验重复。
这些结果表明，表达正交嵌合细胞因子受体的细胞能够在用正交G-CSF CSF刺激后选择性活化和细胞周期进程。
实施例21：在表达正交嵌合细胞因子受体的32D-IL2Rβ细胞和原代人T细胞中活化 细胞内信号传导，并用正交G-CSF刺激。
为了确定表达嵌合细胞因子受体的细胞是否可以响应于正交版本的G-CSF而选择性活化细胞内细胞因子信号传导事件，用包含野生型G-CSFR ECD(G2R-1 WT ECD和G2R-2WTECD)的嵌合受体G2R-1和G2R-2以及包含携带氨基酸取代R41E、R141E和R167D的G-CSFR ECD(G2R-1 134 ECD、G2R-2 134 ECD)的嵌合受体G2R-1和G2R-2转导32D-IL-2Rβ细胞。用IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(30ng/ml)或正交G-CSF(130G-CSF-E46R_L108K_D112R；30ng/ml)刺激细胞，所述正交G-CSF能够结合G2R-1 134 ECD、G2R-2 134ECD，但与野生型G-CSFR的结合显著降低。对细胞裂解物进行蛋白质印迹，以评估细胞在暴露于细胞因子后活化细胞因子信号传导的能力(图37)。表达G2R-2 134 ECD的细胞在用130 G-CSF而不是野生型G-CSF刺激后显示出细胞因子信号传导的证据。此外，表达G2R-2WT ECD的细胞在用130 G-CSF刺激后不能活化细胞因子信号传导。
通过对原代鼠T细胞进行蛋白质印迹分析，进一步证明了工程化细胞因子:受体对的正交性质，其中将表达具有WT、134或304 ECD(R41E_E93K_R167D)的G2R-3的细胞用WT、130或304G-CSF(E46R_L108K_D112R_R147E；100ng/ml)刺激并测量所指示的信号传导事件(图38A)。IL-2(300IU/ml)和IL-12(10ng/ml)用作对照细胞因子。表达G2R-3 WT ECD的细胞在用IL-2、IL-12或WT G-CSF刺激后显示出细胞因子信号传导的证据。表达G2R-3 134 ECD的细胞在用IL-2、IL-12或130 G-CSF刺激后显示出细胞因子信号传导的证据。表达G2R-3304 ECD的细胞在用IL-2、IL-12或304 G-CSF刺激后显示出细胞因子信号传导的证据。
G2R-3的三种ECD变体的细胞表面表达通过流式细胞术证实(图38B)。
这些结果表明，表达正交嵌合细胞因子受体的细胞能够在用正交G-CSF刺激后选择性活化细胞内细胞因子信号传导事件。
实施例22：G2R-3的表达导致原代人T细胞的扩增、细胞周期进程和细胞因子相关 的细胞内信号传导和免疫表型
为了确定G2R-3嵌合受体在原代人T细胞中用G-CSF刺激后是否可以促进细胞因子信号相关事件，用编码G2R-3的慢病毒载体转导TAL。进行T细胞扩增测定以测试在用IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子刺激时细胞的增殖。每3-4天对活细胞进行计数。与其未转导对应物相反，表达G2R-3的原代TAL在培养物中响应于G-CSF而扩增(图40A)。为了确定在用G-CSF刺激后细胞因子信号传导事件是否被活化，对细胞裂解物进行蛋白质印迹以评估细胞内信号传导。从扩增测定中收获细胞，将其洗涤，并用IL-2(300IU/ml)或野生型G-CSF(100ng/ml)刺激。表达G2R-3的原代TAL表现出响应于G-CSF的IL-2相关性信号传导事件，但预期的例外是G-CSF诱导Jak2磷酸化，而IL-2诱导Jak3磷酸化(图40B)。
进行BrdU掺入测定以评估用G-CSF刺激后的细胞周期进程。从扩增测定中收获细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。表达G2R-3的原代TAL显示出响应于G-CSF的细胞周期进展(图40C)。
使用原代PBMC来源的人T细胞也证明了G-CSF诱导的表达G2R-3的细胞的扩增(图41)。表达G2R-3 WT ECD的细胞响应于WT G-CSF而扩增，而不是仅培养基(图41A)。为了证明细胞对外源性细胞因子的持续依赖性，在培养第21天，将来自G-CSF扩增条件的细胞洗涤并重新铺板在WT G-CSF(100ng/mL)、IL-7(20ng/mL)+IL-15(20ng/mL)或仅培养基中。仅在G-CSF或IL-7+IL-15存在下重新铺板的细胞随时间保持存活。
如通过流式细胞术评估的，G-CSFR ECD的表达在扩增第21-42天之间在CD4+和CD8+T细胞上均保持稳定(图41B)。
通过蛋白质印迹证实，表达G2R-3的原代PBMC来源的T细胞显示出响应于G-CSF的IL-2相关信号传导事件(图42A)。对在WT G-CSF相对于IL-7+IL-15中扩增42天的原代PBMC来源的T细胞进行基于流式细胞术的免疫表型分析。表达G2R-3 WT ECD并在G-CSF中培养的细胞保留与在IL-7+IL-15中培养的未转导细胞相似的表型，主要具有CD62L+、CD45RO+表型，这指示干细胞样记忆T细胞表型(TSCM)(图42B、42C)。同样，中央记忆(TCM)、效应记忆(TEM)和终末分化(TTE)T细胞的分数也相似。
这些结果证实，G2R-3嵌合细胞因子受体能够活化细胞因子信号传导事件并促进原代细胞中的细胞周期进展和扩增。表达G2R-3并在G-CSF中长期扩增的T细胞的免疫表型与在IL-7+IL-15中扩增的未转导细胞相似。
实施例23：正交G-CSF诱导在表达具有正交ECD的G2R-3的原代人T细胞中的扩增和 增殖
评估了具有304(R41E_E93K_R167D)或307(R41E_D197K_D200K_R288E)ECD的嵌合细胞因子受体G2R-3是否能够诱导响应于用正交配体130、304或307 G-CSF的刺激的增殖和扩增，用编码G R-3 304 ECD或G2R-3 307(R41E_D197K_D200K_R288E)ECD的慢病毒载体转导原代PBMC来源的人T细胞。进行T细胞生长测定，以评估当用IL-2(300IU/ml)、304G-CSF(100ng/ml)、307 G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子培养时细胞的扩增倍数。每3-4天对活细胞进行计数。表达G2R-3 304 ECD的T细胞在培养物中响应于IL-2或304G-CSF而扩增(图43A)。表达G2R-3 307 ECD的T细胞在培养物中响应于IL-2或307 G-CSF而扩增(图43B)。未转导的T细胞仅响应于IL-2而扩增(图43C)。
进行BrdU掺入测定以评估在十字形设计中用130、304和307G-CSF刺激后的细胞周期进程。从扩增测定中收获细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、130G-CSF(100ng/ml)、304G-CSF(100ng/ml)、307 G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。表达G2R-3 304ECD的原代人T细胞表现出响应于130或304G-CSF，而不是响应于307G-CSF的细胞周期进程(图44)。表达G2R-3 307 ECD的T细胞表现出响应于307 G-CSF，而不是响应于130或304G-CSF的细胞周期进程。所有T细胞均显示出响应于IL-2的细胞周期进程。
结果表明，嵌合受体G2R-3 304 ECD和G2R-3 307 ECD能够分别在用正交304或307G-CSF刺激后诱导原代人CD4+和CD8+T细胞的选择性细胞周期进程和扩增。此外，130G-CSF可以刺激表达G2R-3 304 ECD，而不是G2R-3 307 ECD的细胞增殖。
实施例24：G-CSFR ECD在用G21R-1、G21R-2、G12R-1和G2R-3嵌合受体构建体转导 的原代人肿瘤相关淋巴细胞(TAL)表面上表达
为了评估嵌合细胞因子受体构建体是否可以在原代人肿瘤相关淋巴细胞(TAL)的表面上表达，用编码G21R-1、G21R-2、G12R-1和G2R-3嵌合受体的慢病毒载体转导TAL，并且通过流式细胞术测试细胞在细胞表面上的G-CSFR ECD表达(图39)。对于所有四种嵌合细胞因子受体设计，均检测到G-CSFR ECD阳性细胞。
这些结果表明，G21R-1、G21R-2、G12R-1和G2R-3嵌合受体能够在原代细胞表面上表达。这些结果还表明G-CSFR ECD嵌合受体设计在原代细胞表面上表达。
实施例25：G-CSFR ECD在用G12R-1和G21R-1嵌合受体构建体转导的原代鼠T细胞 表面上表达
为了确定G12R-1和G21R-1嵌合受体是否能够在原代T细胞的表面上表达，用编码G12R-1和G21R-1嵌合受体的逆转录病毒载体转导原代鼠T细胞，并通过流式细胞术分析(图45)。
结果表明，G-CSFR ECD在用编码G12R-1和G21R-1的逆转录病毒载体转导的原代鼠CD4+和CD8+T细胞表面上表达。
实施例26：G-CSF在表达G21R-1或G21R-2的原代PBMC来源的人T细胞中诱导细胞因 子信号传导事件
为了确定G21R-1和G21R-2构建体是否能够在原代细胞中诱导细胞因子信号传导事件，用编码G21R-1或G21R-2嵌合细胞因子受体的慢病毒载体转导原代PBMC来源的人T细胞。用磷酸-STAT3(p-STAT3)特异性抗体对细胞进行细胞内染色，并通过流式细胞术评估以确定STAT3磷酸化的程度，即STAT3活化的量度(图46)。在用G-CSF(100ng/ml)刺激后，在用G21R-1或G21R-2转导的G-CSFR阳性细胞亚群中表达磷酸化STAT3的细胞数量增加。相反，G-CSFR阴性(即不表达)细胞在用G-CSF刺激后不表现出磷酸化STAT3的增加，但在用IL-21刺激后表现出增加。
这些结果表明，G21R-1和G21R-2嵌合受体能够在原代人T细胞中用G-CSF刺激后活化IL-21相关细胞因子信号传导事件。
实施例27：G-CSF在表达G21R-1或G-12R-1的原代鼠T细胞中诱导细胞内信号传导 事件
为了确定嵌合细胞因子受体G21R-1是否能够活化细胞因子信号传导事件，用编码G21R-1的逆转录病毒载体转导原代鼠T细胞，并通过流式细胞术评估，以在用G-CSF刺激后检测磷酸化STAT3。对活细胞针对CD8或CD4设门，并测定CD8和CD4细胞群在未用细胞因子刺激、用IL-21(1ng/ml)或G-CSF(100ng/ml)刺激后磷酸-STAT3染色呈阳性的细胞百分比。在用G-CSF刺激后，表达G21R-1的细胞(但未转导细胞)显示出磷酸化STAT3的量增加(图47A和47B)。进行蛋白质印迹，以评估表达G21R-1或G12R-1的细胞在用G-CSF刺激后的细胞内细胞因子信号传导。正如预期，表达G21R-1并用G-CSF刺激的细胞显示STAT3的磷酸化增加，其中磷酸-STAT4和磷酸-STAT5略有增加(图47C)。也正如预期，在表达G12R-1的细胞中，发现响应于G-CSF的STAT4的强磷酸化。G-CSF在模拟转导细胞中未诱导任何信号传导事件。(应注意，在G12R-1组中，阳性对照(hIL-12 10ng/ml)似乎未诱导任何信号传导事件；这可能是由于人IL-12与鼠IL-12R的结合较差。)
结果表明，在用G-CSF刺激后，G21R-1和G12R-1能够在原代鼠T细胞中诱导细胞因子信号传导事件。
实施例28：G-CSF诱导表达G2R-2、G2R-3、G7R-1、G21/7R-1、G27/2R-1、G21/2R-1、 G12/2R-1或G21/12/2R-1的原代鼠T细胞的增殖和细胞内信号传导事件
为了评估由嵌合细胞因子受体介导的细胞因子信号传导事件和细胞增殖，用编码G2R-2、G2R-3、G7R-1、G21/7R-1、G27/2R-1、G21/2R-1、G12/2R-1或G21/12/2R-1的逆转录病毒载体转导原代鼠T细胞。进行BrdU掺入测定以评估用G-CSF刺激后的细胞周期进程。收获细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、野生型G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子中。在表达G2R-2、G2R-3、G7R-1、G21/7R-1或G27/2R-1(图48A、图48B)或G21/2R-1、G12/2R-1或G21/12/2R-1(图49A、图49B)的原代鼠T细胞中观察到G-CSF诱导的细胞周期进程。G-CSFRECD的表达也可通过流式细胞术检测到(图48C，图49C)。
通过蛋白质印迹，在表达所指示的嵌合细胞因子受体的细胞中，而非在模拟转导的细胞中，观察到响应于G-CSF(100ng/ml)的多个细胞因子信号传导事件(图48D、图49D)。通常，观察到的细胞因子信号传导事件是基于掺入到各种ICD设计中的信号传导结构域所预期的(图23和图24)。作为一个实例，G7R-1嵌合受体诱导STAT5的磷酸化(图48D)，这预期是由于来自IL-7Rα的STAT5结合位点的掺入(图23)。作为第二实例，G21/2R-1嵌合受体诱导STAT3的磷酸化(图49D)，这预期是由于来自G-CSFR的STAT3结合位点的掺入(图24)。作为第三实例，G12/2R-1嵌合受体诱导STAT4的磷酸化，这预期是由于来自IL-12Rβ2的STAT4结合位点的掺入(图24)。其他嵌合细胞因子受体显示出其他不同模式的细胞内信号传导事件。
结果表明，G2R-2、G2R-3、G7R-1、G21/7R-1、G27/2R-1、G21/2R-1、G12/2R-1和G21/12/2R-1能够在用G-CSF刺激后诱导原代鼠T细胞的细胞因子信号传导事件和增殖。此外，可以通过将不同的信号传导结构域并入到嵌合受体的ICD中来产生不同模式的细胞内信号传导事件。v
实施例29：正交G-CSF诱导表达具有正交ECD的G12/2R-1的原代人T细胞的扩增、增 殖、细胞因子相关细胞内信号传导和免疫表型
为了确定具有134 ECD的嵌合细胞因子受体G12/2R-1是否能够响应于用正交配体130G-CSF的刺激而诱导增殖和扩增，用编码G12/2R-1 134 ECD的慢病毒载体转导原代PBMC来源的人T细胞。当用IL-2(300IU/ml)、130G-CSF(100ng/ml)或无细胞因子培养时，进行T细胞生长测定，以评估细胞的扩增倍数。每4-5天对活细胞进行计数。表达G12/2R-1 134 ECD的原代人T细胞在培养物中响应于IL-2或130G-CSF而扩增(图50A)，但在仅培养基中表现出有限的瞬时扩增。
在该实验的第19天，将已在130G-CSF或IL-2中扩增的T细胞洗涤三次，重新铺板在IL-2、130G-CSF或仅培养基中。在仅培养基中，T细胞显示出活力降低和数量下降(图50B)。相反，重新铺板在IL-2或G-CSF 130中的T细胞显示出持续的活力和稳定的数量。
通过流式细胞术使用针对G-CSF受体的抗体检测到的G12/2R-1134 ECD的表达在第4天至第16天之间在通过用130G-CSF刺激而扩增的CD4+和CD8+T细胞上增加(图50C)。进行BrdU掺入测定以评估用130G-CSF刺激后的细胞周期进程。
为了通过BrdU测定评估细胞周期进程，从扩增测定中收获细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、IL-2和IL-12(10ng/mL)、130G-CSF(300ng/ml)或无细胞因子中。表达G12/2R-1 134 ECD的原代人T细胞显示出响应于130G-CSF、IL-2或IL-2+IL-12的细胞周期进程，而未转导细胞仅响应于IL-2或IL-2+IL-12(图51A)。
在16天培养期之后，通过流式细胞术使用针对CD62L和CD45RO的抗体进行免疫表型分析，以比较在130G-CSF中扩增的表达G12/2R-1 134 ECD的T细胞与在IL-2中扩增的未转导细胞。这两个T细胞群显示出相似比例的干细胞样记忆(TSCM)、中央记忆(TCM)、效应记忆(TEM)和终末分化(TTE)表型(图51B、图51C)。
用具有304 ECD(与134 ECD相对)的嵌合细胞因子受体G12/2R-1进行类似的实验。用编码G12/2R-1 304 ECD的慢病毒载体转导原代PBMC来源的人T细胞。进行T细胞生长测定，以评估当用IL-2(300IU/ml)、130G-CSF(100ng/ml)、304G-CSF(100ng/mL)或仅培养基培养时细胞的扩增倍数。每4-5天对活细胞进行计数。表达具有304 ECD的G12/2R-1的T细胞可以在IL-2、130G-CSF或304G-CSF的存在下扩增，但在仅培养基中不扩增，而未转导细胞仅可响应于IL-2而扩增(图52A)。
为了通过BrdU测定评估细胞周期进程，从扩增测定中收获表达G12/2R-1 304 ECD的先前在130G-CSF或304G-CSF中扩增的T细胞，将其洗涤，并重新铺板在IL-2(300IU/ml)、130G-CSF(100ng/ml)、304G-CSF(100ng/mL)、307 G-CSF(100ng/mL)或仅培养基中。表达G12/2R-1 304 ECD的T细胞表现出响应于130或304G-CSF，但不响应于307 G-CSF或仅培养基的细胞周期进程(图52B)。
结果表明，G12/2R-1 134 ECD能够在用正交130G-CSF刺激后诱导原代人CD4+和CD8+T细胞的细胞周期进程和扩增。表达G12/2R-1 134 ECD并用130G-CSF扩增的细胞的T细胞记忆表型类似于用IL-2扩增的未转导细胞。此外，G12/2R-1 304 ECD能够在用130或304G-CSF刺激后但不响应于307 G-CSF而诱导T细胞的选择性细胞周期进程和扩增。
实施例30：正交G-CSF在表达具有正交ECD的G2R-3或G12/2R-1的原代人T细胞中诱 导不同的细胞内信号传导事件
为了评估细胞内信号传导事件，用编码G2R-3 304 ECD或G12/2R-1 304 ECD的慢病毒载体转导原代PBMC来源的人T细胞。进行蛋白质印迹，以评估在用304G-CSF(100ng/mL)、IL-2(300IU/mL)、IL-2和IL-12(10ng/mL)或仅培养基刺激后表达G2R-3 304ECD或G12/2R-1 304 ECD的细胞或未转导细胞中的细胞内细胞因子信号传导。在转导和未转导T细胞中，响应于用IL-2+IL-12或仅IL-2的刺激，检测到STAT5的强磷酸化(图53)。响应于用IL-2+IL-12两者的刺激，检测到STAT4的强磷酸化，但响应于用仅IL-2刺激，仅检测到STAT4的弱磷酸化。在表达G2R-3 304 ECD的细胞中，响应于用304G-CSF的刺激，检测到STAT4的弱磷酸化和STAT5的强磷酸化，这类似于响应于仅IL-2所观察到的模式。在表达G12/2R-1 304ECD的细胞中，响应于用304G-CSF的刺激，检测到STAT4和STAT5的强磷酸化，这类似于响应于IL-2+IL-12所观察到的模式。未转导T细胞显示对304G-CSF无反应。
结果表明，具有304 ECD的G12/2R-1能够诱导细胞因子信号传导事件，包括响应于用304G-CSF的刺激的STAT4和STAT5的强磷酸化。用304G-CSF刺激后，在表达G2R-3 304 ECD的细胞中观察到不同的信号传导事件模式，包括STAT5而非STAT4的强磷酸化。
尽管本发明已参考优选实施方案和各种替代性实施方案进行特定显示和描述，但相关领域技术人员将了解可在不脱离本发明的精神和范围下在其中进行各种形式和细节变化。
在本说明书的主体内引用的所有参考文献、授权专利和专利申请都据此出于所有目的以引用的方式整体在此并入。
表12：G-CSFRWT-ICDgp130-IL-2Rβ的序列
Figure BDA0003673999830001191
Figure BDA0003673999830001201
表13：G-CSFRWT-ICDIL-2Rβ的序列
Figure BDA0003673999830001211
Figure BDA0003673999830001221
表14：G-CSFRWT-ICDγc的序列
Figure BDA0003673999830001222
Figure BDA0003673999830001231
表15A：嵌合细胞因子受体
Figure BDA0003673999830001232
表15B：嵌合细胞因子受体
Figure BDA0003673999830001241
表16
Figure BDA0003673999830001242
Figure BDA0003673999830001251
表17：信号肽。信号肽由以下之一组成：
Figure BDA0003673999830001252
表18：野生型G-CSFR胞外结构域(ECD)：G-CSFR ECD由以下之一组成：
Figure BDA0003673999830001261
Figure BDA0003673999830001271
Figure BDA0003673999830001281
Figure BDA0003673999830001291
Figure BDA0003673999830001301
表19：跨膜结构域(TM)。TM由以下之一组成：
Figure BDA0003673999830001302
表20：胞内结构域(ICD)。ICD由以下之一组成：
Figure BDA0003673999830001311
Figure BDA0003673999830001321
Figure BDA0003673999830001331
Figure BDA0003673999830001341
Figure BDA0003673999830001351
Figure BDA0003673999830001361
Figure BDA0003673999830001371
Figure BDA0003673999830001381
Figure BDA0003673999830001391
Figure BDA0003673999830001401
Figure BDA0003673999830001411
Figure BDA0003673999830001421
Figure BDA0003673999830001431
序列表
<110> 酵活有限公司
省卫生服务机构
维多利亚大学工业合作股份有限公司
<120> 粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的经修饰胞外结构域和结合其的细胞因子
<130> IKE-068WO
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<141>
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<151> 2019-10-08
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Thr Asn Ser Thr Val Leu Thr Leu Met Thr Leu Thr Pro Glu Gly Ser
610 615 620
Glu Leu His
625
<210> 7
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Ala Ile Val Val Pro Val Cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu Leu
1 5 10 15
Gly Val Leu Phe Cys Phe Asn Lys Arg Asp Leu Ile Lys Lys His Ile
20 25 30
Trp Pro Asn Val Pro Asp Pro Ser Lys Ser His Ile Ala Gln Trp Ser
35 40 45
Pro His Thr Pro Pro Arg His Asn Phe Asn Ser Lys Asp Gln Met Tyr
50 55 60
Ser Asp Gly Asn Phe Thr Asp Val Ser Val Val Glu Ile Glu Ala Asn
65 70 75 80
Asp Lys Lys Pro Phe Pro Glu Asp Leu Lys Ser Leu Asp Leu Phe Lys
85 90 95
Lys Glu Lys Ile Asn Thr Glu Gly His Ser Ser Gly Ile Gly Gly Ser
100 105 110
Ser Cys Met Ser Ser Ser Arg Pro Ser Ile Ser Ala Ser Leu Ser Ser
115 120 125
Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe
130 135 140
His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val Tyr Phe Thr
145 150 155 160
Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala
165 170 175
Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp
180 185 190
Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser
195 200 205
Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val
225 230 235 240
Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val
245 250 255
Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu
260 265 270
Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe
275 280 285
Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala
290 295 300
Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln
305 310 315 320
Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
325
<210> 8
<211> 627
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Met Ala Arg Leu Gly Asn Cys Ser Leu Thr Trp Ala Ala Leu Ile Ile
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Gly Ser Leu Glu Glu Cys Gly His Ile Ser Val Ser
20 25 30
Ala Pro Ile Val His Leu Gly Asp Pro Ile Thr Ala Ser Cys Ile Ile
35 40 45
Lys Gln Asn Cys Ser His Leu Asp Pro Glu Pro Gln Ile Leu Trp Arg
50 55 60
Leu Gly Ala Glu Leu Gln Pro Gly Gly Arg Gln Gln Arg Leu Ser Asp
65 70 75 80
Gly Thr Gln Glu Ser Ile Ile Thr Leu Pro His Leu Asn His Thr Gln
85 90 95
Ala Phe Leu Ser Cys Cys Leu Asn Trp Gly Asn Ser Leu Gln Ile Leu
100 105 110
Asp Gln Val Glu Leu Arg Ala Gly Tyr Pro Pro Ala Ile Pro His Asn
115 120 125
Leu Ser Cys Leu Met Asn Leu Thr Thr Ser Ser Leu Ile Cys Gln Trp
130 135 140
Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu Pro Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ser
145 150 155 160
Phe Lys Ser Arg Gly Asn Cys Gln Thr Gln Gly Asp Ser Ile Leu Asp
165 170 175
Cys Val Pro Lys Asp Gly Gln Ser His Cys Cys Ile Pro Arg Lys His
180 185 190
Leu Leu Leu Tyr Gln Asn Met Gly Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala
195 200 205
Leu Gly Thr Ser Met Ser Pro Gln Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val
210 215 220
Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu Arg Thr Met Asp Pro Ser Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Pro Pro Gln Ala Gly Cys Leu Gln Leu Cys Trp Glu Pro Trp
245 250 255
Gln Pro Gly Leu His Ile Asn Gln Lys Cys Glu Leu Arg His Lys Pro
260 265 270
Gln Arg Gly Glu Ala Ser Trp Ala Leu Val Gly Pro Leu Pro Leu Glu
275 280 285
Ala Leu Gln Tyr Glu Leu Cys Gly Leu Leu Pro Ala Thr Ala Tyr Thr
290 295 300
Leu Gln Ile Arg Cys Ile Arg Trp Pro Leu Pro Gly His Trp Ser Asp
305 310 315 320
Trp Ser Pro Ser Leu Glu Leu Arg Thr Thr Glu Arg Ala Pro Thr Val
325 330 335
Arg Leu Asp Thr Trp Trp Arg Gln Arg Gln Leu Asp Pro Arg Thr Val
340 345 350
Gln Leu Phe Trp Lys Pro Val Pro Leu Glu Glu Asp Ser Gly Arg Ile
355 360 365
Gln Gly Tyr Val Val Ser Trp Arg Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ile
370 375 380
Leu Pro Leu Cys Asn Thr Thr Glu Leu Ser Cys Thr Phe His Leu Pro
385 390 395 400
Ser Glu Ala Gln Glu Val Ala Leu Val Ala Tyr Asn Ser Ala Gly Thr
405 410 415
Ser Arg Pro Thr Pro Val Val Phe Ser Glu Ser Arg Gly Pro Ala Leu
420 425 430
Thr Arg Leu His Ala Met Ala Arg Asp Pro His Ser Leu Trp Val Gly
435 440 445
Trp Glu Pro Pro Asn Pro Trp Pro Gln Gly Tyr Val Ile Glu Trp Gly
450 455 460
Leu Gly Pro Pro Ser Ala Ser Asn Ser Asn Lys Thr Trp Arg Met Glu
465 470 475 480
Gln Asn Gly Arg Ala Thr Gly Phe Leu Leu Lys Glu Asn Ile Arg Pro
485 490 495
Phe Gln Leu Tyr Glu Ile Ile Val Thr Pro Leu Tyr Gln Asp Thr Met
500 505 510
Gly Pro Ser Gln His Val Tyr Ala Tyr Ser Gln Glu Met Ala Pro Ser
515 520 525
His Ala Pro Glu Leu His Leu Lys His Ile Gly Lys Thr Trp Ala Gln
530 535 540
Leu Glu Trp Val Pro Glu Pro Pro Glu Leu Gly Lys Ser Pro Leu Thr
545 550 555 560
His Tyr Thr Ile Phe Trp Thr Asn Ala Gln Asn Gln Ser Phe Ser Ala
565 570 575
Ile Leu Asn Ala Ser Ser Arg Gly Phe Val Leu His Gly Leu Glu Pro
580 585 590
Ala Ser Leu Tyr His Ile His Leu Met Ala Ala Ser Gln Ala Gly Ala
595 600 605
Thr Asn Ser Thr Val Leu Thr Leu Met Thr Leu Thr Pro Glu Gly Ser
610 615 620
Glu Leu His
625
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys
1 5 10 15
Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys
20 25 30
Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp
35 40 45
Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser
50 55 60
Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu
65 70 75 80
Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp
85 90 95
Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr
100 105
<210> 10
<400> 10
000
<210> 11
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Met Ala Arg Leu Gly Asn Cys Ser Leu Thr Trp Ala Ala Leu Ile Ile
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Gly Ser Leu Glu
20
<210> 12
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 13
<211> 72
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
atggcaaggc tgggaaactg cagcctgact tgggctgccc tgatcatcct gctgctcccc 60
ggaagtctgg ag 72
<210> 14
<211> 66
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 14
atgctgctgc tagtgacctc cctgctgctc tgtgagctgc ctcacccggc gttcctgctg 60
attcct 66
<210> 15
<211> 603
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
Glu Cys Gly His Ile Ser Val Ser Ala Pro Ile Val His Leu Gly Asp
1 5 10 15
Pro Ile Thr Ala Ser Cys Ile Ile Lys Gln Asn Cys Ser His Leu Asp
20 25 30
Pro Glu Pro Gln Ile Leu Trp Arg Leu Gly Ala Glu Leu Gln Pro Gly
35 40 45
Gly Arg Gln Gln Arg Leu Ser Asp Gly Thr Gln Glu Ser Ile Ile Thr
50 55 60
Leu Pro His Leu Asn His Thr Gln Ala Phe Leu Ser Cys Cys Leu Asn
65 70 75 80
Trp Gly Asn Ser Leu Gln Ile Leu Asp Gln Val Glu Leu Arg Ala Gly
85 90 95
Tyr Pro Pro Ala Ile Pro His Asn Leu Ser Cys Leu Met Asn Leu Thr
100 105 110
Thr Ser Ser Leu Ile Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu
115 120 125
Pro Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ser Phe Lys Ser Arg Gly Asn Cys Gln
130 135 140
Thr Gln Gly Asp Ser Ile Leu Asp Cys Val Pro Lys Asp Gly Gln Ser
145 150 155 160
His Cys Cys Ile Pro Arg Lys His Leu Leu Leu Tyr Gln Asn Met Gly
165 170 175
Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala Leu Gly Thr Ser Met Ser Pro Gln
180 185 190
Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu
195 200 205
Arg Thr Met Asp Pro Ser Pro Glu Ala Ala Pro Pro Gln Ala Gly Cys
210 215 220
Leu Gln Leu Cys Trp Glu Pro Trp Gln Pro Gly Leu His Ile Asn Gln
225 230 235 240
Lys Cys Glu Leu Arg His Lys Pro Gln Arg Gly Glu Ala Ser Trp Ala
245 250 255
Leu Val Gly Pro Leu Pro Leu Glu Ala Leu Gln Tyr Glu Leu Cys Gly
260 265 270
Leu Leu Pro Ala Thr Ala Tyr Thr Leu Gln Ile Arg Cys Ile Arg Trp
275 280 285
Pro Leu Pro Gly His Trp Ser Asp Trp Ser Pro Ser Leu Glu Leu Arg
290 295 300
Thr Thr Glu Arg Ala Pro Thr Val Arg Leu Asp Thr Trp Trp Arg Gln
305 310 315 320
Arg Gln Leu Asp Pro Arg Thr Val Gln Leu Phe Trp Lys Pro Val Pro
325 330 335
Leu Glu Glu Asp Ser Gly Arg Ile Gln Gly Tyr Val Val Ser Trp Arg
340 345 350
Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ile Leu Pro Leu Cys Asn Thr Thr Glu
355 360 365
Leu Ser Cys Thr Phe His Leu Pro Ser Glu Ala Gln Glu Val Ala Leu
370 375 380
Val Ala Tyr Asn Ser Ala Gly Thr Ser Arg Pro Thr Pro Val Val Phe
385 390 395 400
Ser Glu Ser Arg Gly Pro Ala Leu Thr Arg Leu His Ala Met Ala Arg
405 410 415
Asp Pro His Ser Leu Trp Val Gly Trp Glu Pro Pro Asn Pro Trp Pro
420 425 430
Gln Gly Tyr Val Ile Glu Trp Gly Leu Gly Pro Pro Ser Ala Ser Asn
435 440 445
Ser Asn Lys Thr Trp Arg Met Glu Gln Asn Gly Arg Ala Thr Gly Phe
450 455 460
Leu Leu Lys Glu Asn Ile Arg Pro Phe Gln Leu Tyr Glu Ile Ile Val
465 470 475 480
Thr Pro Leu Tyr Gln Asp Thr Met Gly Pro Ser Gln His Val Tyr Ala
485 490 495
Tyr Ser Gln Glu Met Ala Pro Ser His Ala Pro Glu Leu His Leu Lys
500 505 510
His Ile Gly Lys Thr Trp Ala Gln Leu Glu Trp Val Pro Glu Pro Pro
515 520 525
Glu Leu Gly Lys Ser Pro Leu Thr His Tyr Thr Ile Phe Trp Thr Asn
530 535 540
Ala Gln Asn Gln Ser Phe Ser Ala Ile Leu Asn Ala Ser Ser Arg Gly
545 550 555 560
Phe Val Leu His Gly Leu Glu Pro Ala Ser Leu Tyr His Ile His Leu
565 570 575
Met Ala Ala Ser Gln Ala Gly Ala Thr Asn Ser Thr Val Leu Thr Leu
580 585 590
Met Thr Leu Thr Pro Glu Gly Ser Glu Leu His
595 600
<210> 16
<211> 1809
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
gagtgcgggc acatcagtgt ctcagccccc atcgtccacc tgggggatcc catcacagcc 60
tcctgcatca tcaagcagaa ctgcagccat ctggacccgg agccacagat tctgtggaga 120
ctgggagcag agcttcagcc cgggggcagg cagcagcgtc tgtctgatgg gacccaggaa 180
tctatcatca ccctgcccca cctcaaccac actcaggcct ttctctcctg ctgcctgaac 240
tggggcaaca gcctgcagat cctggaccag gttgagctgc gcgcaggcta ccctccagcc 300
ataccccaca acctctcctg cctcatgaac ctcacaacca gcagcctcat ctgccagtgg 360
gagccaggac ctgagaccca cctacccacc agcttcactc tgaagagttt caagagccgg 420
ggcaactgtc agacccaagg ggactccatc ctggactgcg tgcccaagga cgggcagagc 480
cactgctgca tcccacgcaa acacctgctg ttgtaccaga atatgggcat ctgggtgcag 540
gcagagaatg cgctggggac cagcatgtcc ccacaactgt gtcttgatcc catggatgtt 600
gtgaaactgg agccccccat gctgcggacc atggacccca gccctgaagc ggcccctccc 660
caggcaggct gcctacagct gtgctgggag ccatggcagc caggcctgca cataaatcag 720
aagtgtgagc tgcgccacaa gccgcagcgt ggagaagcca gctgggcact ggtgggcccc 780
ctccccttgg aggcccttca gtatgagctc tgcgggctcc tcccagccac ggcctacacc 840
ctgcagatac gctgcatccg ctggcccctg cctggccact ggagcgactg gagccccagc 900
ctggagctga gaactaccga acgggccccc actgtcagac tggacacatg gtggcggcag 960
aggcagctgg accccaggac agtgcagctg ttctggaagc cagtgcccct ggaggaagac 1020
agcggacgga tccaaggtta tgtggtttct tggagaccct caggccaggc tggggccatc 1080
ctgcccctct gcaacaccac agagctcagc tgcaccttcc acctgccttc agaagcccag 1140
gaggtggccc ttgtggccta taactcagcc gggacctctc gtcccactcc ggtggtcttc 1200
tcagaaagca gaggcccagc tctgaccaga ctccatgcca tggcccgaga ccctcacagc 1260
ctctgggtag gctgggagcc ccccaatcca tggcctcagg gctatgtgat tgagtggggc 1320
ctgggccccc ccagcgcgag caatagcaac aagacctgga ggatggaaca gaatgggaga 1380
gccacggggt ttctgctgaa ggagaacatc aggccctttc agctctatga gatcatcgtg 1440
actcccttgt accaggacac catgggaccc tcccagcatg tctatgccta ctctcaagaa 1500
atggctccct cccatgcccc agagctgcat ctaaagcaca ttggcaagac ctgggcacag 1560
ctggagtggg tgcctgagcc ccctgagctg gggaagagcc cccttaccca ctacaccatc 1620
ttctggacca acgctcagaa ccagtccttc tccgccatcc tgaatgcctc ctcccgtggc 1680
tttgtcctcc atggcctgga gcccgccagt ctgtatcaca tccacctcat ggctgccagc 1740
caggctgggg ccaccaacag tacagtcctc accctgatga ccttgacccc agaggggtcg 1800
gagctacac 1809
<210> 17
<211> 1809
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 17
gagtgcgggc acatcagtgt ctcagccccc atcgtccacc tgggggatcc catcacagcc 60
tcctgcatca tcaagcagaa ctgcagccat ctggacccgg agccacagat tctgtggaga 120
ctgggagcag agcttcagcc cgggggcagg cagcagcgtc tgtctgatgg gacccaggaa 180
tctatcatca ccctgcccca cctcaaccac actcaggcct ttctctcctg ctgcctgaac 240
tggggcaaca gcctgcagat cctggaccag gttgagctgc gcgcaggcta ccctccagcc 300
ataccccaca acctctcctg cctcatgaac ctcacaacca gcagcctcat ctgccagtgg 360
gagccaggac ctgagaccca cctacccacc agcttcactc tgaagagttt caagagccgg 420
ggcaactgtc agacccaagg ggactccatc ctggactgcg tgcccaagga cgggcagagc 480
cactgctgca tcccacgcaa acacctgctg ttgtaccaga atatgggcat ctgggtgcag 540
gcagagaatg cgctggggac cagcatgtcc ccacaactgt gtcttgatcc catggatgtt 600
gtgaaactgg agccccccat gctgcggacc atggacccca gccctgaagc ggcccctccc 660
caggcaggct gcctacagct gtgctgggag ccatggcagc caggcctgca cataaatcag 720
aagtgtgagc tgcgccacaa gccgcagcgt ggagaagcca gctgggcact ggtgggcccc 780
ctccccttgg aggcccttca gtatgagctc tgcgggctcc tcccagccac ggcctacacc 840
ctgcagatac gctgcatccg ctggcccctg cctggccact ggagcgactg gagccccagc 900
ctggagctga gaactaccga acgggccccc actgtcagac tggacacatg gtggcggcag 960
aggcagctgg accccaggac agtgcagctg ttctggaagc cagtgcccct ggaggaagac 1020
agcggacgca tccaaggtta tgtggtttct tggagaccct caggccaggc tggggccatc 1080
ctgcccctct gcaacaccac agagctcagc tgcaccttcc acctgccttc agaagcccag 1140
gaggtggccc ttgtggccta taactcagcc gggacctctc gccccacccc ggtggtcttc 1200
tcagaaagca gaggcccagc tctgaccaga ctccatgcca tggcccgaga ccctcacagc 1260
ctctgggtag gctgggagcc ccccaatcca tggcctcagg gctatgtgat tgagtggggc 1320
ctgggccccc ccagcgcgag caatagcaac aagacctgga ggatggaaca gaatgggaga 1380
gccacggggt ttctgctgaa ggagaacatc aggccctttc agctctatga gatcatcgtg 1440
actcccttgt accaggacac catgggaccc tcccagcatg tctatgccta ctctcaagaa 1500
atggctccct cccatgcccc agagctgcat ctaaagcaca ttggcaagac ctgggcacag 1560
ctggagtggg tgcctgagcc ccctgagctg gggaagagcc cccttaccca ctacaccatc 1620
ttctggacca acgctcagaa ccagtccttc tccgccatcc tgaatgcatc ctcccgtggc 1680
tttgtcctcc atggcctgga gcccgccagt ctgtatcaca tccacctcat ggctgccagc 1740
caggctgggg ccaccaacag tacagtcctc accctgatga ccttgacccc agaggggtcg 1800
gagctacac 1809
<210> 18
<211> 23
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Ile Ile Leu Gly Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Leu Thr Cys Leu Cys
1 5 10 15
Gly Thr Ala Trp Leu Cys Cys
20
<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Ala Ile Val Val Pro Val Cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu Leu
1 5 10 15
Gly Val Leu Phe Cys Phe
20
<210> 20
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile
20 25
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys
1 5 10 15
Val Tyr Phe Trp Leu
20
<210> 22
<211> 69
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
atcatcctgg gcctgttcgg cctcctgctg ttgctcacct gcctctgtgg aactgcctgg 60
ctctgttgc 69
<210> 23
<211> 66
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
gccatagtcg tgcctgtttg cttagcattc ctattgacaa ctcttctggg agtgctgttc 60
tgcttt 66
<210> 24
<211> 75
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
attccgtggc tcggccacct cctcgtgggt ctcagcgggg cttttggctt catcatctta 60
gtgtacttgc tgatc 75
<210> 25
<211> 63
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
gtggttatct ctgttggctc catgggattg attatcagcc ttctctgtgt gtatttctgg 60
ctg 63
<210> 26
<211> 286
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu
65 70 75 80
Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn
85 90 95
Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala
100 105 110
Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp
115 120 125
Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln
130 135 140
Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp
145 150 155 160
Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro
165 170 175
Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro
180 185 190
Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly
195 200 205
Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro
210 215 220
Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro
225 230 235 240
Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu
245 250 255
Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
260 265 270
Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
275 280 285
<210> 27
<211> 86
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu
1 5 10 15
Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys
20 25 30
Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu
35 40 45
Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly
50 55 60
Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr
65 70 75 80
Thr Leu Lys Pro Glu Thr
85
<210> 28
<211> 101
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Asn Lys Arg Asp Leu Ile Lys Lys His Ile Trp Pro Asn Val Pro Asp
1 5 10 15
Pro Ser Lys Ser His Ile Ala Gln Trp Ser Pro His Thr Pro Pro Arg
20 25 30
His Asn Phe Asn Ser Lys Asp Gln Met Tyr Ser Asp Gly Asn Phe Thr
35 40 45
Asp Val Ser Val Val Glu Ile Glu Ala Asn Asp Lys Lys Pro Phe Pro
50 55 60
Glu Asp Leu Lys Ser Leu Asp Leu Phe Lys Lys Glu Lys Ile Asn Thr
65 70 75 80
Glu Gly His Ser Ser Gly Ile Gly Gly Ser Ser Cys Met Ser Ser Ser
85 90 95
Arg Pro Ser Ile Ser
100
<210> 29
<211> 205
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln
1 5 10 15
Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys
20 25 30
Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu
35 40 45
Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro
50 55 60
Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp
65 70 75 80
Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser
85 90 95
Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser
100 105 110
Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro
115 120 125
Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu
130 135 140
Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg
145 150 155 160
Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe
165 170 175
Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser
180 185 190
Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
195 200 205
<210> 30
<211> 62
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
Ser Pro Asn Arg Lys Asn Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala
1 5 10 15
His Ser Ser Leu Gly Ser Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Asp Ala
20 25 30
Phe Gln Leu Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile Thr Lys Leu Thr Val
35 40 45
Leu Glu Glu Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His
50 55 60
<210> 31
<211> 202
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe
1 5 10 15
Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val Tyr
20 25 30
Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly Val Ala
35 40 45
Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly
50 55 60
Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu
65 70 75 80
Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu
100 105 110
Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro
115 120 125
Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu
130 135 140
Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly Val
145 150 155 160
Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu
165 170 175
Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu
180 185 190
Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
195 200
<210> 32
<211> 67
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
Ser Pro Asn Arg Lys Asn Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala
1 5 10 15
His Ser Ser Leu Gly Ser Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Asp Ala
20 25 30
Phe Gln Leu Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile Thr Lys Leu Thr Val
35 40 45
Leu Glu Glu Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His Asn Ser
50 55 60
Ser Glu Thr
65
<210> 33
<211> 72
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
Ala Gly Asp Leu Pro Thr His Asp Gly Tyr Leu Pro Ser Asn Ile Asp
1 5 10 15
Asp Leu Pro Ser His Glu Ala Pro Leu Ala Asp Ser Leu Glu Glu Leu
20 25 30
Glu Pro Gln His Ile Ser Leu Ser Val Phe Pro Ser Ser Ser Leu His
35 40 45
Pro Leu Thr Phe Ser Cys Gly Asp Lys Leu Thr Leu Asp Gln Leu Lys
50 55 60
Met Arg Cys Asp Ser Leu Met Leu
65 70
<210> 34
<211> 67
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
Ser Pro Asn Arg Lys Asn Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala
1 5 10 15
His Ser Ser Leu Gly Ser Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Asp Ala
20 25 30
Phe Gln Leu Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile Thr Lys Leu Thr Val
35 40 45
Leu Glu Glu Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His Asn Ser
50 55 60
Ser Glu Thr
65
<210> 35
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
Ser Pro Gly Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val
1 5 10 15
Val Ile Pro Pro Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser
20 25 30
<210> 36
<211> 63
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
Ser Pro Asn Arg Lys Asn Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala
1 5 10 15
His Ser Ser Leu Gly Ser Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Asp Ala
20 25 30
Phe Gln Leu Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile Thr Lys Leu Thr Val
35 40 45
Leu Glu Glu Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His Asn
50 55 60
<210> 37
<211> 183
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro Tyr
1 5 10 15
Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala Glu Gly Pro
20 25 30
Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Leu Asp
35 40 45
Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp Pro Leu Leu
50 55 60
Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Ala Gly Ser
65 70 75 80
Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Lys Pro
85 90 95
Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro Trp Gly Gly
100 105 110
Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Leu Ala
115 120 125
Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly Ser Asp Cys
130 135 140
Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp Glu Gly Pro
145 150 155 160
Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro Pro Leu Ser
165 170 175
Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser
180
<210> 38
<211> 93
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
Ser Pro Asn Arg Lys Asn Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala
1 5 10 15
His Ser Ser Leu Gly Ser Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Asp Ala
20 25 30
Phe Gln Leu Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile Thr Lys Leu Thr Val
35 40 45
Leu Glu Glu Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His Asn Ser
50 55 60
Ser Glu Thr Cys Gly Leu Pro Thr Leu Val Gln Thr Tyr Val Leu Gln
65 70 75 80
Gly Asp Pro Arg Ala Val Ser Thr Gln Pro Gln Ser Gln
85 90
<210> 39
<211> 202
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe
1 5 10 15
Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val Tyr
20 25 30
Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly Val Ala
35 40 45
Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly
50 55 60
Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu
65 70 75 80
Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu
100 105 110
Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro
115 120 125
Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu
130 135 140
Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly Val
145 150 155 160
Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu
165 170 175
Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu
180 185 190
Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
195 200
<210> 40
<211> 62
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
Ser Pro Asn Arg Lys Asn Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala
1 5 10 15
His Ser Ser Leu Gly Ser Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Asp Ala
20 25 30
Phe Gln Leu Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile Thr Lys Leu Thr Val
35 40 45
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50 55 60
<210> 41
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe
1 5 10 15
Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val Tyr
20 25 30
Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro
35 40
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
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1 5 10 15
Asp Leu Pro Ser
20
<210> 43
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly
1 5 10 15
Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115
<210> 44
<211> 93
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Ser Pro Asn Arg Lys Asn Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala
1 5 10 15
His Ser Ser Leu Gly Ser Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Asp Ala
20 25 30
Phe Gln Leu Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile Thr Lys Leu Thr Val
35 40 45
Leu Glu Glu Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His Asn Ser
50 55 60
Ser Glu Thr Cys Gly Leu Pro Thr Leu Val Gln Thr Tyr Val Leu Gln
65 70 75 80
Gly Asp Pro Arg Ala Val Ser Thr Gln Pro Gln Ser Gln
85 90
<210> 45
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe
1 5 10 15
Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val Tyr
20 25 30
Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro
35 40
<210> 46
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
Ala Gly Asp Leu Pro Thr His Asp Gly Tyr Leu Pro Ser Asn Ile Asp
1 5 10 15
Asp Leu Pro Ser
20
<210> 47
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly
1 5 10 15
Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp
20 25 30
Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val
35 40 45
Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu
50 55 60
Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu
85 90 95
Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro
100 105 110
Thr His Leu Val
115
<210> 48
<211> 138
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
Asn Lys Arg Asp Leu Ile Lys Lys His Ile Trp Pro Asn Val Pro Asp
1 5 10 15
Pro Ser Lys Ser His Ile Ala Gln Trp Ser Pro His Thr Pro Pro Arg
20 25 30
His Asn Phe Asn Ser Lys Asp Gln Met Tyr Ser Asp Gly Asn Phe Thr
35 40 45
Asp Val Ser Val Val Glu Ile Glu Ala Asn Asp Lys Lys Pro Phe Pro
50 55 60
Glu Asp Leu Lys Ser Leu Asp Leu Phe Lys Lys Glu Lys Ile Asn Thr
65 70 75 80
Glu Gly His Ser Ser Gly Ile Gly Gly Ser Ser Cys Met Ser Ser Ser
85 90 95
Arg Pro Ser Ile Ser Ser Ser Asp Glu Asn Glu Ser Ser Gln Asn Thr
100 105 110
Ser Ser Thr Val Gln Tyr Ser Thr Val Val His Ser Gly Tyr Arg His
115 120 125
Gln Val Pro Ser Val Gln Val Phe Ser Arg
130 135
<210> 49
<211> 205
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln
1 5 10 15
Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala Cys
20 25 30
Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp Glu
35 40 45
Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln Pro
50 55 60
Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp
65 70 75 80
Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ser
85 90 95
Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro Ser
100 105 110
Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro
115 120 125
Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu
130 135 140
Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg
145 150 155 160
Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe
165 170 175
Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser
180 185 190
Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
195 200 205
<210> 50
<211> 62
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
Ser Pro Asn Arg Lys Asn Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala
1 5 10 15
His Ser Ser Leu Gly Ser Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Asp Ala
20 25 30
Phe Gln Leu Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile Thr Lys Leu Thr Val
35 40 45
Leu Glu Glu Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His
50 55 60
<210> 51
<211> 67
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly
20 25 30
Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser
35 40 45
Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr
50 55 60
Gln Asn Gln
65
<210> 52
<211> 93
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
Ser Pro Asn Arg Lys Asn Pro Leu Trp Pro Ser Val Pro Asp Pro Ala
1 5 10 15
His Ser Ser Leu Gly Ser Trp Val Pro Thr Ile Met Glu Glu Asp Ala
20 25 30
Phe Gln Leu Pro Gly Leu Gly Thr Pro Pro Ile Thr Lys Leu Thr Val
35 40 45
Leu Glu Glu Asp Glu Lys Lys Pro Val Pro Trp Glu Ser His Asn Ser
50 55 60
Ser Glu Thr Cys Gly Leu Pro Thr Leu Val Gln Thr Tyr Val Leu Gln
65 70 75 80
Gly Asp Pro Arg Ala Val Ser Thr Gln Pro Gln Ser Gln
85 90
<210> 53
<211> 77
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro
1 5 10 15
His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr
20 25 30
Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro
35 40 45
Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu
50 55 60
Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
65 70 75
<210> 54
<211> 861
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
aactgcagga acaccgggcc atggctgaag aaggtcctga agtgtaacac cccagacccc 60
tcgaagttct tttcccagct gagctcagag catggaggag acgtccagaa gtggctctct 120
tcgcccttcc cctcatcgtc cttcagccct ggcggcctgg cacctgagat ctcgccacta 180
gaagtgctgg agagggacaa ggtgacgcag ctgctcctgc agcaggacaa ggtgcctgag 240
cccgcatcct taagcagcaa ccactcgctg accagctgct tcaccaacca gggttacttc 300
ttcttccacc tcccggatgc cttggagata gaggcctgcc aggtgtactt tacttacgac 360
ccctactcag aggaagaccc tgatgagggt gtggccgggg cacccacagg gtcttccccc 420
caacccctgc agcctctgtc aggggaggac gacgcctact gcaccttccc ctccagggat 480
gacctgctgc tcttctcccc cagtctcctc ggtggcccca gccccccaag cactgcccct 540
gggggcagtg gggccggtga agagaggatg cccccttctt tgcaagaaag agtccccaga 600
gactgggacc cccagcccct ggggcctccc accccaggag tcccagacct ggtggatttt 660
cagccacccc ctgagctggt gctgcgagag gctggggagg aggtccctga cgctggcccc 720
agggagggag tcagtttccc ctggtccagg cctcctgggc agggggagtt cagggccctt 780
aatgctcgcc tgcccctgaa cactgatgcc tacttgtccc tccaagaact ccagggtcag 840
gacccaactc acttggtgta g 861
<210> 55
<211> 261
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
gaacggacga tgccccgaat tcccaccctg aagaacctag aggatcttgt tactgaatac 60
cacgggaact tttcggcctg gagtggtgtg tctaagggac tggctgagag tctgcagcca 120
gactacagtg aacgactctg cctcgtcagt gagattcccc caaaaggagg ggcccttggg 180
gaggggcctg gggcctcccc atgcaaccag catagcccct actgggcccc cccatgttac 240
accctaaagc ctgaaacctg a 261
<210> 56
<211> 303
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
aataagcgag acctaattaa aaaacacatc tggcctaatg ttccagatcc ttcaaagagt 60
catattgccc agtggtcacc tcacactcct ccaaggcaca attttaattc aaaagatcaa 120
atgtattcag atggcaattt cactgatgta agtgttgtgg aaatagaagc aaatgacaaa 180
aagccttttc cagaagatct gaaatcattg gacctgttca aaaaggaaaa aattaatact 240
gaaggacaca gcagtggtat tggggggtct tcatgtatgt catcttctag gccaagcatt 300
tct 303
<210> 57
<211> 618
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
gcatccttaa gcagcaacca ctcgctgacc agctgcttca ccaaccaggg ttacttcttc 60
ttccacctcc cggatgcctt ggagatagag gcctgccagg tgtactttac ttacgacccc 120
tactcagagg aagaccctga tgagggtgtg gccggggcac ccacagggtc ttccccccaa 180
cccctgcagc ctctgtcagg ggaggacgac gcctactgca ccttcccctc cagggatgac 240
ctgctgctct tctcccccag tctcctcggt ggccccagcc ccccaagcac tgcccctggg 300
ggcagtgggg ccggtgaaga gaggatgccc ccttctttgc aagaaagagt ccccagagac 360
tgggaccccc agcccctggg gcctcccacc ccaggagtcc cagacctggt ggattttcag 420
ccaccccctg agctggtgct gcgagaggct ggggaggagg tccctgacgc tggccccagg 480
gagggagtca gtttcccctg gtccaggcct cctgggcagg gggagttcag ggcccttaat 540
gctcgcctgc ccctgaacac tgatgcctac ttgtccctcc aagaactcca gggtcaggac 600
ccaactcact tggtgtag 618
<210> 58
<211> 186
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
agccccaaca ggaagaatcc cctctggcca agtgtcccag acccagctca cagcagcctg 60
ggctcctggg tgcccacaat catggaggag gatgccttcc agctgcccgg ccttggcacg 120
ccacccatca ccaagctcac agtgctggag gaggatgaaa agaagccggt gccctgggag 180
tcccat 186
<210> 59
<211> 609
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
agcagcaacc actcgctgac cagctgcttc accaaccagg gttacttctt cttccacctc 60
ccggatgcct tggagataga ggcctgccag gtgtacttta cttacgaccc ctactcagag 120
gaagaccctg atgagggtgt ggccggggca cccacagggt cttcccccca acccctgcag 180
cctctgtcag gggaggacga cgcctactgc accttcccct ccagggatga cctgctgctc 240
ttctccccca gtctcctcgg tggccccagc cccccaagca ctgcccctgg gggcagtggg 300
gccggtgaag agaggatgcc cccttctttg caagaaagag tccccagaga ctgggacccc 360
cagcccctgg ggcctcccac cccaggagtc ccagacctgg tggattttca gccaccccct 420
gagctggtgc tgcgagaggc tggggaggag gtccctgacg ctggccccag ggagggagtc 480
agtttcccct ggtccaggcc tcctgggcag ggggagttca gggcccttaa tgctcgcctg 540
cccctgaaca ctgatgccta cttgtccctc caagaactcc agggtcagga cccaactcac 600
ttggtgtag 609
<210> 60
<211> 201
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 60
agccccaaca ggaagaatcc cctctggcca agtgtcccag acccagctca cagcagcctg 60
ggctcctggg tgcccacaat catggaggag gatgccttcc agctgcccgg ccttggcacg 120
ccacccatca ccaagctcac agtgctggag gaggatgaaa agaagccggt gccctgggag 180
tcccataaca gctcagagac c 201
<210> 61
<211> 219
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 61
gcaggtgacc ttcccaccca tgatggctac ttaccctcca acatagatga cctcccctca 60
catgaggcac ctctcgctga ctctctggaa gaactggagc ctcagcacat ctccctttct 120
gttttcccct caagttctct tcacccactc accttctcct gtggtgataa gctgactctg 180
gatcagttaa agatgaggtg tgactccctc atgctctga 219
<210> 62
<211> 201
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
agccccaaca ggaagaatcc cctctggcca agtgtcccag acccagctca cagcagcctg 60
ggctcctggg tgcccacaat catggaggag gatgccttcc agctgcccgg ccttggcacg 120
ccacccatca ccaagctcac agtgctggag gaggatgaaa agaagccggt gccctgggag 180
tcccataaca gctcagagac c 201
<210> 63
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成寡核苷酸
<400> 63
agccctgggg acgaaggacc cccccggagc tacctccgcc agtgggtggt cattcctccg 60
ccactttcga gccctggacc ccaggccagc taa 93
<210> 64
<211> 189
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 64
agccccaaca ggaagaatcc cctctggcca agtgtcccag acccagctca cagcagcctg 60
ggctcctggg tgcccacaat catggaggag gatgccttcc agctgcccgg ccttggcacg 120
ccacccatca ccaagctcac agtgctggag gaggatgaaa agaagccggt gccctgggag 180
tcccataac 189
<210> 65
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 65
cagaactcgg ggggctcagc ttacagtgag gagagggatc ggccatacgg cctggtgtcc 60
attgacacag tgactgtgct agatgcagag gggccatgca cctggccctg cagctgtgag 120
gatgacggct acccagccct ggacctggat gctggcctgg agcccagccc aggcctagag 180
gacccactct tggatgcagg gaccacagtc ctgtcctgtg gctgtgtctc agctggcagc 240
cctgggctag gagggcccct gggaagcctc ctggacagac taaagccacc ccttgcagat 300
ggggaggact gggctggggg actgccctgg ggtggccggt cacctggagg ggtctcagag 360
agtgaggcgg gctcacccct ggccggcctg gatatggaca cgtttgacag tggctttgtg 420
ggctctgact gcagcagccc tgtggagtgt gacttcacca gccctgggga cgaaggaccc 480
ccccggagct acctccgcca gtgggtggtc attcctccgc cactttcgag ccctggaccc 540
caggccagc 549
<210> 66
<211> 279
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 66
agccccaaca ggaagaatcc cctctggcca agtgtcccag acccagctca cagcagcctg 60
ggctcctggg tgcccacaat catggaggag gatgccttcc agctgcccgg ccttggcacg 120
ccacccatca ccaagctcac agtgctggag gaggatgaaa agaagccggt gccctgggag 180
tcccataaca gctcagagac ctgtggcctc cccactctgg tccagaccta tgtgctccag 240
ggggacccaa gagcagtttc cacccagccc caatcccag 279
<210> 67
<211> 609
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 67
agcagcaacc actcgctgac cagctgcttc accaaccagg gttacttctt cttccacctc 60
ccggatgcct tggagataga ggcctgccag gtgtacttta cttacgaccc ctactcagag 120
gaagaccctg atgagggtgt ggccggggca cccacagggt cttcccccca acccctgcag 180
cctctgtcag gggaggacga cgcctactgc accttcccct ccagggatga cctgctgctc 240
ttctccccca gtctcctcgg tggccccagc cccccaagca ctgcccctgg gggcagtggg 300
gccggtgaag agaggatgcc cccttctttg caagaaagag tccccagaga ctgggacccc 360
cagcccctgg ggcctcccac cccaggagtc ccagacctgg tggattttca gccaccccct 420
gagctggtgc tgcgagaggc tggggaggag gtccctgacg ctggccccag ggagggagtc 480
agtttcccct ggtccaggcc tcctgggcag ggggagttca gggcccttaa tgctcgcctg 540
cccctgaaca ctgatgccta cttgtccctc caagaactcc agggtcagga cccaactcac 600
ttggtgtag 609
<210> 68
<211> 186
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 68
agccccaaca ggaagaatcc cctctggcca agtgtcccag acccagctca cagcagcctg 60
ggctcctggg tgcccacaat catggaggag gatgccttcc agctgcccgg ccttggcacg 120
ccacccatca ccaagctcac agtgctggag gaggatgaaa agaagccggt gccctgggag 180
tcccat 186
<210> 69
<211> 129
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 69
agcagcaacc actcgctgac cagctgcttc accaaccagg gttacttctt cttccacctc 60
ccggatgcct tggagataga ggcctgccag gtgtacttta cttacgaccc ctactcagag 120
gaagaccct 129
<210> 70
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 70
gcaggtgacc ttcccaccca tgatggctac ttaccctcca acatagatga cctcccctca 60
<210> 71
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 71
ggtggcccca gccccccaag cactgcccct gggggcagtg gggccggtga agagaggatg 60
cccccttctt tgcaagaaag agtccccaga gactgggacc cccagcccct ggggcctccc 120
accccaggag tcccagacct ggtggatttt cagccacccc ctgagctggt gctgcgagag 180
gctggggagg aggtccctga cgctggcccc agggagggag tcagtttccc ctggtccagg 240
cctcctgggc agggggagtt cagggccctt aatgctcgcc tgcccctgaa cactgatgcc 300
tacttgtccc tccaagaact ccagggtcag gacccaactc acttggtgta g 351
<210> 72
<211> 279
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 72
agccccaaca ggaagaatcc cctctggcca agtgtcccag acccagctca cagcagcctg 60
ggctcctggg tgcccacaat catggaggag gatgccttcc agctgcccgg ccttggcacg 120
ccacccatca ccaagctcac agtgctggag gaggatgaaa agaagccggt gccctgggag 180
tcccataaca gctcagagac ctgtggcctc cccactctgg tccagaccta tgtgctccag 240
ggggacccaa gagcagtttc cacccagccc caatcccag 279
<210> 73
<211> 129
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 73
agcagcaacc actcgctgac cagctgcttc accaaccagg gttacttctt cttccacctc 60
ccggatgcct tggagataga ggcctgccag gtgtacttta cttacgaccc ctactcagag 120
gaagaccct 129
<210> 74
<211> 60
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 74
gcaggtgacc ttcccaccca tgatggctac ttaccctcca acatagatga cctcccctca 60
<210> 75
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 75
ggtggcccca gccccccaag cactgcccct gggggcagtg gggccggtga agagaggatg 60
cccccttctt tgcaagaaag agtccccaga gactgggacc cccagcccct ggggcctccc 120
accccaggag tcccagacct ggtggatttt cagccacccc ctgagctggt gctgcgagag 180
gctggggagg aggtccctga cgctggcccc agggagggag tcagtttccc ctggtccagg 240
cctcctgggc agggggagtt cagggccctt aatgctcgcc tgcccctgaa cactgatgcc 300
tacttgtccc tccaagaact ccagggtcag gacccaactc acttggtgta g 351
<210> 76
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 76
aataagcgag acctaattaa aaaacacatc tggcctaatg ttccagatcc ttcaaagagt 60
catattgccc agtggtcacc tcacactcct ccaaggcaca atttcaattc aaaggatcaa 120
atgtattcag atggcaattt cactgatgta agtgttgtgg aaatagaagc aaatgacaaa 180
aagccttttc cagaagatct gaaatcattg gacctgttca aaaaggaaaa aattaatact 240
gaaggacaca gcagtggtat tggggggtct tcatgtatgt catcttctag gccaagcatt 300
tctagcagtg atgaaaatga atcttcacaa aacacttcga gcactgtcca gtattctacc 360
gtggtacaca gtggctacag acaccaagtt ccgtcagtcc aagtcttctc aaga 414
<210> 77
<211> 618
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 77
gcatccttaa gcagcaacca ctcgctgacc agctgcttca ccaaccaggg ttacttcttc 60
ttccacctcc cggatgcctt ggagatagag gcctgccagg tgtactttac ttacgacccc 120
tactcagagg aagaccctga tgagggtgtg gccggggcac ccacagggtc ttccccccaa 180
cccctgcagc ctctgtcagg ggaggacgac gcctactgca ccttcccctc cagggatgac 240
ctgctgctct tctcccccag tctcctcggt ggccccagcc ccccaagcac tgcccctggg 300
ggcagtgggg ccggtgaaga gaggatgccc ccttctttgc aagaaagagt ccccagagac 360
tgggaccccc agcccctggg gcctcccacc ccaggagtcc cagacctggt ggattttcag 420
ccaccccctg agctggtgct gcgagaggct ggggaggagg tccctgacgc tggccccagg 480
gagggagtca gtttcccctg gtccaggcct cctgggcagg gggagttcag ggcccttaat 540
gctcgcctgc ccctgaacac tgatgcctac ttgtccctcc aagaactcca gggtcaggac 600
ccaactcact tggtgtag 618
<210> 78
<211> 186
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 78
agccccaaca ggaagaatcc cctctggcca agtgtcccag acccagctca cagcagcctg 60
ggctcctggg tgcccacaat catggaggag gatgccttcc agctgcccgg ccttggcacg 120
ccacccatca ccaagctcac agtgctggag gaggatgaaa agaagccggt gccctgggag 180
tcccat 186
<210> 79
<211> 204
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 79
agtggcaaga atgggcctca tgtgtaccag gacctcctgc ttagccttgg gactacaaac 60
agcacgctgc cccctccatt ttctctccaa tctggaatcc tgacattgaa cccagttgct 120
cagggtcagc ccattcttac ttccctggga tcaaatcaag aagaagcata tgtcaccatg 180
tccagcttct accaaaacca gtga 204
<210> 80
<211> 279
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 80
agccccaaca ggaagaatcc cctctggcca agtgtcccag acccagctca cagcagcctg 60
ggctcctggg tgcccacaat catggaggag gatgccttcc agctgcccgg ccttggcacg 120
ccacccatca ccaagctcac agtgctggag gaggatgaaa agaagccggt gccctgggag 180
tcccataaca gctcagagac ctgtggcctc cccactctgg tccagaccta tgtgctccag 240
ggggacccaa gagcagtttc cacccagccc caatcccag 279
<210> 81
<211> 234
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 81
tcctcttcca ggtccctaga ctgcagggag agtggcaaga atgggcctca tgtgtaccag 60
gacctcctgc ttagccttgg gactacaaac agcacgctgc cccctccatt ttctctccaa 120
tctggaatcc tgacattgaa cccagttgct cagggtcagc ccattcttac ttccctggga 180
tcaaatcaag aagaagcata tgtcaccatg tccagcttct accaaaacca gtga 234
<210> 82
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 82
Ala Ala Ala Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Ala Trp Ser His Pro
1 5 10 15
Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala
20 25 30
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
35 40
<210> 83
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 83
His His His His His His Ser Ser Gly Arg Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
1 5 10 15
Gly Ser Met Gly
20
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 84
Ile Trp Pro Asn Val Pro Asp Pro Ser
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 85
Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 86
Lys Ile Trp Ala Val Pro Ser Pro Glu
1 5
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 87
Cys Ser Arg Glu Ile Pro Asp Pro Ala
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 88
Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys
1 5
<210> 89
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成6xHis标签
<400> 89
His His His His His His
1 5
<210> 90
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 90
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
20 25 30
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
35 40 45
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
50 55 60
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
65 70 75 80
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
85 90 95
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala
100 105 110
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala
115 120 125
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
130 135 140
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
145 150 155 160
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
165 170 175
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种受体，其包含:
粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的变体胞外结构域(ECD)，其中
所述G-CSFR的变体ECD包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或其组合。
2.如权利要求1所述的受体，其中
所述位点II界面区中的所述至少一个突变位于所述G-CSFR ECD的选自由以下组成的组的氨基酸位置：SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置141、167、168、171、172、173、174、197、199、200、202和288。
3.如权利要求2所述的受体，其中所述位点II界面区中的所述至少一个突变选自由以下组成的所述G-CSFR ECD的突变的组：R141E、R167D、K168D、K168E、L171E、L172E、Y173K、Q174E、D197K、D197R、M199D、D200K、D200R、V202D、R288D和R288E。
4.如以上权利要求中任一项所述的受体，其中
所述位点III界面区中的所述至少一个突变选自所述G-CSFR ECD的突变的组，所述所述G-CSFR ECD的突变的组选自由以下组成的组：SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置30、41、73、75、79、86、87、88、89、91和93。
5.如权利要求4所述的受体，其中
所述位点III界面区中的所述至少一个突变选自由以下组成的所述G-CSFR ECD的突变的组：S30D、R41E、Q73W、F75KF、S79D、L86D、Q87D、I88E、L89A、Q91D、Q91K和E93K。
6.如以上权利要求中任一项所述的受体，其中所述G-CSFR ECD包含具有表6中设计编号的突变的组合；其中所述突变对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置。
7.如以上权利要求中任一项所述的受体，其中
所述G-CSFR ECD包含突变：R41E、R141E和R167D。
8.如以上权利要求中任一项所述的受体，其中
所述受体是嵌合受体。
9.如以上权利要求中任一项所述的受体，其中
所述受体在细胞上表达。
10.如权利要求9所述的受体，其中所述细胞是免疫细胞，并且任选地，
T细胞，并且任选地，
NK细胞，并且任选地，
NKT细胞，并且任选地，
B细胞，并且任选地，
浆细胞，并且任选地，
巨噬细胞，并且任选地，
树突细胞，并且任选地，
所述细胞是干细胞，并且任选地，
所述细胞是原代细胞，并且任选地，
所述细胞是人细胞。
11.如以上权利要求中任一项所述的受体，其中
变体G-CSF对所述受体的活化引起选自由以下组成的组的细胞反应：表达所述受体的细胞的增殖、活力和活性增强。
12.一种核酸，其编码权利要求1-11中任一项所述的受体。
13.一种表达载体，其包含权利要求12所述的核酸。
14.一种细胞，其被工程化以表达权利要求1-11中任一项所述的受体。
15.如权利要求14所述的细胞，其中所述细胞是T细胞或NK细胞。
16.一种变体粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其中
所述变体G-CSF包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或其组合。
17.如权利要求16所述的变体G-CSF，其中所述位点II界面区中的所述至少一个突变位于选自由以下组成的组的氨基酸位置：SEQ ID NO.1的氨基酸位置12、16、19、20、104、108、109、112、115、116、118、119、122和123。
18.如权利要求17所述的变体G-CSF，其中
所述位点II界面区中的所述至少一个突变选自由以下组成的突变的组：S12E、S12K、S12R、K16D、L18F、E19K、Q20E、D104K、D104R、L108K、L108R、D109R、D112R、D112K、T115E、T115K、T116D、Q119E、Q119R、E122K、E122R和E123R。
19.如权利要求16-18中任一项所述的变体G-CSF，其中
所述位点III界面区中的所述至少一个突变选自突变的组，所述突变的组选自由以下组成的组：SEQ ID NO.1的氨基酸位置38、39、40、41、46、47、48、49和147。
20.如权利要求19所述的变体G-CSF，其中
所述位点III界面区中的所述至少一个突变选自由以下组成的突变的组：T38R、Y39E、K40D、K40F、L41D、L41E、L41K、E46R、L47D、V48K、V48R、L49K和R147E。
21.如权利要求16-20中任一项所述的变体G-CSF，其中
所述变体G-CSF包含具有表6中设计编号的突变的组合；其中所述突变对应于SEQ IDNO.1的氨基酸位置。
22.如权利要求21所述的变体G-CSF，其中
所述变体G-CSF包含突变：E46R、L108K和D112R。
23.如权利要求16-22中任一项所述的变体G-CSF，其中
所述变体G-CSF选择性地结合如权利要求1-11中任一项所述的受体。
24.如权利要求23所述的变体G-CSF，其中所述受体在细胞上表达。
25.如权利要求24所述的变体G-CSF，其中所述细胞是免疫细胞。
26.如权利要求25所述的变体G-CSF，其中所述免疫细胞是
T细胞，并且任选地，
NK细胞，并且任选地，
NKT细胞，并且任选地，
B细胞，并且任选地，
浆细胞，并且任选地，
巨噬细胞，并且任选地，
树突细胞，并且任选地，
所述细胞是干细胞，并且任选地，
所述细胞是原代细胞，并且任选地，
所述细胞是人细胞。
27.如权利要求26所述的变体G-CSF，其中
所述变体G-CSF与所述受体的选择性结合引起选自由以下组成的组的细胞反应：所述T细胞或NK细胞的增殖、活力和活性增强。
28.一种核酸，其编码权利要求16-27中任一项所述的变体G-CSF。
29.一种表达载体，其包含如权利要求28所述的核酸。
30.一种细胞，其被工程化以表达权利要求16-27中任一项所述的变体G-CSF。
31.如权利要求30所述的细胞，其中所述细胞为免疫细胞。
32.一种用于选择性活化在细胞表面上表达的受体的系统，所述系统包含：
(a)如权利要求1-11中任一项所述的受体；和
(b)如权利要求16-27中任一项所述的变体G-CSF；其中
所述受体包含位点II界面区、位点III界面区或其组合中的至少一个突变，并且所述变体G-CSF包含在G-CSF的结合所述受体的所述位点II界面区，所述受体的所述位点III界面区或其组合的氨基酸序列中的至少一个突变；并且其中
所述变体G-CSF相较于野生型G-CSFR ECD优先结合所述受体，并且所述受体相较于野生型G-CSF优先结合所述变体G-CSF。
33.如权利要求32所述的系统，其中所述受体和所述变体G-CSF包含具有表2的设计编号的位点II界面的突变的组合；其中所述受体突变对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置并且所述变体G-CSF突变对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置。
34.如权利要求32所述的系统，其中所述受体和所述变体G-CSF包含具有表4的设计编号的位点III界面的突变的组合；其中所述受体突变对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置并且所述变体G-CSF突变对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置。
35.如权利要求32所述的系统，其中所述受体和所述变体G-CSF包含具有表6的设计编号的位点II界面和位点III界面的突变的组合；其中所述受体突变对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置并且所述变体G-CSF突变对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置。
36.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号106的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R和D104K突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E和K168D突变。
37.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号117的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、E122R和E123R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E和R141E突变。
38.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号130的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E和R167D突变。
39.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号134的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K、D112R、E122R和E123R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E、R141E和R167D突变。
40.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号135的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、T115K、E122R和E123R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E、R141E、L171E和Q174E突变。
41.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号137的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E、R141E和R167D突变。
42.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号300的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的K40D、L41D、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的F75K、Q91K和R167D突变。
43.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号301的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的T38R、E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E、Q73E和R167D突变。
44.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号302的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E、L86D和R167D突变。
45.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号303的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的L108K、D112R和R147E突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的E93K和R167D突变。
46.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号304的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K、D112R和R147E突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E、E93K和R167D突变。
47.如权利要求35所述的系统，其中所述组合包含具有设计编号305的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19K、E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E、R167D和R288E突变。
48.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号307的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的S12E、K16D、E19K和E46R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E、D197K、D200K和R288E突变。
49.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号308的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19R、E46R、D112K突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E、R167D、V202D和R288E突变。
50.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号400的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19K、E46R、D109R和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E、R167D、M199D和R288D突变。
51.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号401的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19K、E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E、R167D和R288D突变。
52.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号402的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19K、E46R、D112K和T115K突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E、R167E、Q174E和R288E突变。
53.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号403的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19R、E46R和D112K突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸2-308的氨基酸位置的R41E、R167D和R288E突变。
54.一种选择性活化在细胞表面上表达的受体的方法，其包括:
使权利要求1-11中任一项所述的受体与权利要求16-27所述的变体G-CSF接触。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述受体在免疫细胞上表达，并且所述细胞是任选地，
T细胞，并且任选地，
NK细胞，并且任选地，
NKT细胞，并且任选地，
B细胞，并且任选地，
浆细胞，并且任选地，
巨噬细胞，并且任选地，
树突细胞，并且任选地，
所述细胞是干细胞，并且任选地，
所述细胞是原代细胞，并且任选地，
所述细胞是人细胞。
56.如权利要求54所述的方法，其中所述免疫细胞的所述选择性活化引起选自由以下组成的组的细胞反应：所述免疫细胞的增殖、活力和活性增强。
57.一种产生表达如权利要求1-11中任一项所述的受体的免疫细胞的方法，所述方法包括向所述细胞中引入权利要求12所述的核酸或权利要求13所述的表达载体。
58.一种治疗有需要的受试者的方法，其包括：
向所述受试者输注权利要求14所述的细胞。
59.如权利要求58所述的方法，其还包括向所述受试者施用如权利要求16-27中任一项所述的变体G-CSF。
60.如权利要求58或59所述的方法，其中所述方法用于治疗癌症。
61.如权利要求58或59所述的方法，其中所述方法用于治疗炎症性病症。
62.如权利要求58或59所述的方法，其中所述方法用于治疗移植物排斥。
63.如权利要求58或59所述的方法，其中所述方法用于治疗传染病。
64.如权利要求58或59所述的方法；其还包括施用至少一种另外的活性剂；任选地其中所述另外的活性剂是另外的细胞因子。
65.一种治疗有需要的受试者的方法，其中所述方法包括:
i)分离含有免疫细胞的样品；(ii)用编码权利要求1-11所述的变体细胞因子受体的核酸序列转导或转染所述免疫细胞；(iii)向所述受试者施用或输注来自(ii)的所述免疫细胞；以及(iv)使所述免疫细胞与结合所述变体受体的权利要求16-27所述的变体G-CSF接触。
66.如权利要求65所述的方法，其中在向所述受试者施用或输注所述细胞之前，所述受试者已经历免疫耗竭治疗。
67.如权利要求65所述的方法，其中所述含有免疫细胞的样品分离自将施用或输注所述细胞的所述受试者。
68.如权利要求65所述的方法，其中在向所述受试者施用或输注所述细胞之前，使所述免疫细胞与所述细胞因子体外接触。
69.如权利要求65所述的方法，其中使所述免疫细胞与结合所述嵌合受体的所述细胞因子接触足够的时间以活化来自所述嵌合受体的信号传导。
70.一种用于治疗有需要的受试者的试剂盒，其包括：编码权利要求1-11中任一项所述的变体受体的细胞和使用说明书；任选地其中所述试剂盒包括结合所述变体受体的权利要求16-27所述的变体G-CSF；并且任选地其中所述细胞是免疫细胞。
71.一种用于产生用于选择性活化在细胞表面上表达的受体的系统的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)权利要求12所述的核酸或权利要求13所述的表达载体；
(b)权利要求16-27中任一项所述的变体G-CSF、权利要求28所述的核酸或权利要求29所述的表达载体；和
(c)使用说明书。
72.一种用于产生在细胞上表达的嵌合受体的试剂盒，其包括：
包含编码权利要求1-11中任一项所述的变体受体的表达载体的细胞和使用说明书；任选地其中所述细胞是细菌细胞；并且任选地其中所述试剂盒包括结合所述变体受体的变体G-CSF。

Claims (71)

1.一种受体，其包含:
粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)的变体胞外结构域(ECD)，其中
所述G-CSFR的变体ECD包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或其组合。
2.如权利要求1所述的受体，其中
所述位点II界面区中的所述至少一个突变位于所述G-CSFR ECD的选自由以下组成的组的氨基酸位置：SEQ ID NO.2的氨基酸位置141、167、168、171、172、173、174、197、199、200、202和288。
3.如权利要求2所述的受体，其中所述位点II界面区中的所述至少一个突变选自由以下组成的所述G-CSFR ECD的突变的组：R141E、R167D、K168D、K168E、L171E、L172E、Y173K、Q174E、D197K、D197R、M199D、D200K、D200R、V202D、R288D和R288E。
4.如以上权利要求中任一项所述的受体，其中
所述位点III界面区中的所述至少一个突变选自所述G-CSFR ECD的突变的组，所述所述G-CSFR ECD的突变的组选自由以下组成的组：SEQ ID NO.2的氨基酸位置30、41、73、75、79、86、87、88、89、91和93。
5.如权利要求4所述的受体，其中
所述位点III界面区中的所述至少一个突变选自由以下组成的所述G-CSFR ECD的突变的组：S30D、R41E、Q73W、F75KF、S79D、L86D、Q87D、I88E、L89A、Q91D、Q91K和E93K。
6.如以上权利要求中任一项所述的受体，其中所述G-CSFR ECD包含具有表6中设计编号的突变的组合；其中所述突变对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置。
7.如以上权利要求中任一项所述的受体，其中
所述G-CSFR ECD包含突变：R41E、R141E和R167D。
8.如以上权利要求中任一项所述的受体，其中
所述受体是嵌合受体。
9.如以上权利要求中任一项所述的受体，其中
所述受体在细胞上表达。
10.如权利要求9所述的受体，其中所述细胞是免疫细胞，并且任选地，
T细胞，并且任选地，
NK细胞，并且任选地，
NKT细胞，并且任选地，
B细胞，并且任选地，
浆细胞，并且任选地，
巨噬细胞，并且任选地，
树突细胞，并且任选地，
所述细胞是干细胞，并且任选地，
所述细胞是原代细胞，并且任选地，
所述细胞是人细胞。
11.如以上权利要求中任一项所述的受体，其中
变体G-CSF对所述受体的活化引起选自由以下组成的组的细胞反应：表达所述受体的细胞的增殖、活力和活性增强。
12.一种核酸，其编码权利要求1-11中任一项所述的受体。
13.一种表达载体，其包含权利要求12所述的核酸。
14.一种细胞，其被工程化以表达权利要求1-11中任一项所述的受体。
15.如权利要求14所述的细胞，其中所述细胞是T细胞或NK细胞。
16.一种变体粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其中
所述变体G-CSF包含位点II界面区中的至少一个突变、位点III界面区中的至少一个突变或其组合。
17.如权利要求16所述的变体G-CSF，其中所述位点II界面区中的所述至少一个突变位于选自由以下组成的组的氨基酸位置：SEQ ID NO.1的氨基酸位置12、16、19、20、104、108、109、112、115、116、118、119、122和123。
18.如权利要求17所述的变体G-CSF，其中
所述位点II界面区中的所述至少一个突变选自由以下组成的突变的组：S12E、S12K、S12R、K16D、L18F、E19K、Q20E、D104K、D104R、L108K、L108R、D109R、D112R、D112K、T115E、T115K、T116D、Q119E、Q119R、E122K、E122R和E123R。
19.如权利要求16-18中任一项所述的变体G-CSF，其中
所述位点III界面区中的所述至少一个突变选自突变的组，所述突变的组选自由以下组成的组：SEQ ID NO.1的氨基酸位置38、39、40、41、46、47、48、49和147。
20.如权利要求19所述的变体G-CSF，其中
所述位点III界面区中的所述至少一个突变选自由以下组成的突变的组：T38R、Y39E、K40D、K40F、L41D、L41E、L41K、E46R、L47D、V48K、V48R、L49K和R147E。
21.如权利要求16-20中任一项所述的变体G-CSF，其中
所述变体G-CSF包含具有表6中设计编号的突变的组合；其中所述突变对应于SEQ IDNO.1的氨基酸位置。
22.如权利要求21所述的变体G-CSF，其中
所述变体G-CSF包含突变：E46R、L108K和D112R。
23.如权利要求16-22中任一项所述的变体G-CSF，其中
所述变体G-CSF选择性地结合如权利要求1-11中任一项所述的受体。
24.如权利要求23所述的变体G-CSF，其中所述受体在细胞上表达。
25.如权利要求24所述的变体G-CSF，其中所述细胞是免疫细胞。
26.如权利要求25所述的变体G-CSF，其中所述免疫细胞是
T细胞，并且任选地，
NK细胞，并且任选地，
NKT细胞，并且任选地，
B细胞，并且任选地，
浆细胞，并且任选地，
巨噬细胞，并且任选地，
树突细胞，并且任选地，
所述细胞是干细胞，并且任选地，
所述细胞是原代细胞，并且任选地，
所述细胞是人细胞。
27.如权利要求26所述的变体G-CSF，其中
所述变体G-CSF与所述受体的选择性结合引起选自由以下组成的组的细胞反应：所述T细胞或NK细胞的增殖、活力和活性增强。
28.一种核酸，其编码权利要求16-27中任一项所述的变体G-CSF。
29.一种表达载体，其包含如权利要求28所述的核酸。
30.一种细胞，其被工程化以表达权利要求16-27中任一项所述的变体G-CSF。
31.如权利要求30所述的细胞，其中所述细胞为免疫细胞。
32.一种用于选择性活化在细胞表面上表达的受体的系统，所述系统包含：
(a)如权利要求1-22中任一项所述的受体；和
(b)如权利要求16-27中任一项所述的变体G-CSF；其中
所述受体包含位点II界面区、位点III界面区或其组合中的至少一个突变，并且所述变体G-CSF包含在G-CSF的结合所述受体的所述位点II界面区，所述受体的所述位点III界面区或其组合的氨基酸序列中的至少一个突变；并且其中
所述变体G-CSF相较于野生型G-CSFR ECD优先结合所述受体，并且所述受体相较于野生型G-CSF优先结合所述变体G-CSF。
33.如权利要求32所述的系统，其中所述受体和所述变体G-CSF包含具有表2的设计编号的位点II界面的突变的组合；其中所述受体突变对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置并且所述变体G-CSF突变对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置。
34.如权利要求32所述的系统，其中所述受体和所述变体G-CSF包含具有表4的设计编号的位点III界面的突变的组合；其中所述受体突变对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置并且所述变体G-CSF突变对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置。
35.如权利要求32所述的系统，其中所述受体和所述变体G-CSF包含具有表6的设计编号的位点II界面和位点III界面的突变的组合；其中所述受体突变对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置并且所述变体G-CSF突变对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置。
36.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号106的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R和D104K突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E和K168D突变。
37.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号117的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、E122R和E123R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E和R141E突变。
38.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号130的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E和R167D突变。
39.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号134的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K、D112R、E122R和E123R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R141E和R167D突变。
40.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号135的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、T115K、E122R和E123R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R141E、L171E和Q174E突变。
41.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号137的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R141E和R167D突变。
42.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号300的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的K40D、L41D、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的F75K、Q91K和R167D突变。
43.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号301的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的T38R、E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、Q73E和R167D突变。
44.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号302的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、L86D和R167D突变。
45.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号303的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的L108K、D112R和R147E突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的E93K和R167D突变。
46.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号304的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E46R、L108K、D112R和R147E突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、E93K和R167D突变。
47.如权利要求35所述的系统，其中所述组合包含具有设计编号305的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19K、E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R167D和R288E突变。
48.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号307的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的S12E、K16D、E19K和E46R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、D197K、D200K和R288E突变。
49.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号308的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19R、E46R、D112K突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R167D、V202D和R288E突变。
50.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号400的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19K、E46R、D109R和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R167D、M199D和R288D突变。
51.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号401的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19K、E46R、L108K和D112R突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R167D和R288D突变。
52.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号402的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19K、E46R、D112K和T115K突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R167E、Q174E和R288E突变。
53.如权利要求35所述的系统，其中所述突变的组合包含具有设计编号403的突变；其中所述变体G-CSF包含对应于SEQ ID NO.1的氨基酸位置的E19R、E46R和D112K突变；并且其中所述受体包含对应于SEQ ID NO.2的氨基酸位置的R41E、R167D和R288E突变。
54.一种选择性活化在细胞表面上表达的受体的方法，其包括:
使权利要求1-11中任一项所述的受体与权利要求16-27所述的变体G-CSF接触。
如权利要求54所述的方法，其中所述受体在免疫细胞上表达，并且所述细胞是任选地，
T细胞，并且任选地，
NK细胞，并且任选地，
NKT细胞，并且任选地，
B细胞，并且任选地，
浆细胞，并且任选地，
巨噬细胞，并且任选地，
树突细胞，并且任选地，
所述细胞是干细胞，并且任选地，
所述细胞是原代细胞，并且任选地，
所述细胞是人细胞。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述免疫细胞的所述选择性活化引起选自由以下组成的组的细胞反应：所述免疫细胞的增殖、活力和活性增强。
56.一种产生表达如权利要求1-11中任一项所述的受体的免疫细胞的方法，所述方法包括向所述细胞中引入权利要求12所述的核酸或权利要求13所述的表达载体。
57.一种治疗有需要的受试者的方法，其包括：
向所述受试者输注权利要求14所述的细胞。
58.如权利要求57所述的方法，其还包括向所述受试者施用如权利要求16-27中任一项所述的变体G-CSF。
59.如权利要求57或58所述的方法，其中所述方法用于治疗癌症。
60.如权利要求57或58所述的方法，其中所述方法用于治疗炎症性病症。
61.如权利要求57或58所述的方法，其中所述方法用于治疗移植物排斥。
62.如权利要求57或58所述的方法，其中所述方法用于治疗传染病。
63.如权利要求57或58所述的方法；其还包括施用至少一种另外的活性剂；任选地其中所述另外的活性剂是另外的细胞因子。
64.一种治疗有需要的受试者的方法，其中所述方法包括:
i)分离含有免疫细胞的样品；(ii)用编码权利要求1-11所述的变体细胞因子受体的核酸序列转导或转染所述免疫细胞；(iii)向所述受试者施用或输注来自(ii)的所述免疫细胞；以及(iv)使所述免疫细胞与结合所述变体受体的权利要求16-27所述的变体G-CSF接触。
65.如权利要求64所述的方法，其中在向所述受试者施用或输注所述细胞之前，所述受试者已经历免疫耗竭治疗。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述含有免疫细胞的样品分离自将施用或输注所述细胞的所述受试者。
67.如权利要求64所述的方法，其中在向所述受试者施用或输注所述细胞之前，使所述免疫细胞与所述细胞因子体外接触。
68.如权利要求64所述的方法，其中使所述免疫细胞与结合所述嵌合受体的所述细胞因子接触足够的时间以活化来自所述嵌合受体的信号传导。
69.一种用于治疗有需要的受试者的试剂盒，其包括：编码权利要求1-11中任一项所述的变体受体的细胞和使用说明书；任选地其中所述试剂盒包括结合所述变体受体的权利要求16-27所述的变体G-CSF；并且任选地其中所述细胞是免疫细胞。
70.一种用于产生用于选择性活化在细胞表面上表达的受体的系统的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)权利要求12所述的核酸或权利要求13所述的表达载体；
(b)权利要求16-27中任一项所述的变体G-CSF、权利要求12所述的核酸或权利要求29所述的表达载体；和
(c)使用说明书。
71.一种用于产生在细胞上表达的嵌合受体的试剂盒，其包括：
包含编码权利要求1-11中任一项所述的变体受体的表达载体的细胞和使用说明书；任选地其中所述细胞是细菌细胞；并且任选地其中所述试剂盒包括结合所述变体受体的变体G-CSF。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
AU770131B2 (en) * 1999-01-06 2004-02-12 Xencor, Inc. Nucleic acids and proteins corresponding to mutants of G-CSF with granulopoietic activity
AU782580B2 (en) * 2000-01-10 2005-08-11 Maxygen, Inc. G-CSF conjugates
MX2011003014A (es) * 2008-09-19 2011-05-24 Maxygen Inc Uso de una variante del factor estimulador de colonias de granulocitos multi-pegilado en el tratamiento de neutropenia inducida por radiacion.
DK2718326T3 (da) * 2011-06-13 2020-10-26 Csl Ltd Antistoffer mod g-csfr og anvendelser deraf

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