TW202146431A

TW202146431A - 用於經工程化細胞之嵌合受體

Info

Publication number: TW202146431A
Application number: TW110106561A
Authority: TW
Inventors: 勞德拉馬克瑪蒂尼斯; 伊麗莎彼得里斯; 費雷羅瑪莉亞阿隆索
Original assignee: 英商圭爾醫療有限公司
Priority date: 2020-02-25
Filing date: 2021-02-24
Publication date: 2021-12-16
Also published as: GB2609103A; WO2021170666A1; EP4110801A1; GB202213861D0; CN115427440A; US20230138428A1

Abstract

本發明提供包含編碼嵌合受體、尤其嵌合抗原受體(CAR)之多核苷酸序列之核酸分子，其中該嵌合受體包含內域，該內域包含(i) STAT5聯合基序(association motif)，及JAK1及/或JAK2結合基序(binding motif)，及(ii) JAK3結合基序，其中(i)及(ii)由連接子或鉸鏈連接。

Description

用於經工程化細胞之嵌合受體

本發明係關於經工程化細胞，尤其經工程化T細胞(例如，調節T細胞)及此等細胞之治療用途。特定言之，本發明係關於經工程化細胞，尤其經工程化T細胞(例如，調節T細胞)，其等不易受IL-2可用度有限之微環境影響且具有穩定之細胞(例如，Treg)表型。該等細胞經工程化以表現嵌合受體且本文提供編碼嵌合受體，尤其嵌合抗原受體(CAR)之核酸。

調節T細胞(Treg)係具有抑制功能之免疫細胞，其等控制細胞病變免疫反應且對於維持免疫耐受性必不可少。可在治療上利用Treg之抑制性質(例如)以改善及/或預防發炎性疾病、自體免疫性疾病及移植中免疫介導之器官損傷。Treg免疫療法通常涉及分離、培養及擴增Treg，接著輸注病患體內。作為此方法之一部分，Treg可用細胞介素、藥物、其他細胞或抗原培養以改善其等存活率及功能及/或賦予其等增強之抗特異性抗原之反應性。此等相同目標可(例如)經由嵌合抗原受體(CAR)，藉由基因工程化Treg以靶向預定抗原達成。

生長因子介白素-2 (IL-2)對於Treg之穩態(產生、增殖、存活)，及對於其等抑制功能及表型穩定性必不可少。經活化習知T細胞(Tcon)係活體內IL-2之主要來源。相反，Treg無法產生IL-2且依賴於旁分泌獲取由微環境中存在之Tcon產生之IL-2。

IL-2之可用度對活體外擴增並轉移至病患體內之Treg之治療效應具有至關重要之影響。此由於下列原因：1)活體外擴增方案通常需高濃度之IL-2，其使得Treg高度依賴於此細胞介素；2)由於投與免疫抑制藥物，病患中IL-2之濃度通常減小；及3)發炎組織微環境內獲取IL-2之途徑通常受限。鑒於已知發炎肝中之IL-2含量降低，肝移植構成尤其具有挑戰性之適應症，藉由例行性使用鈣調磷酸酶抑制劑進一步加劇該適應症，此大幅降低Tcon產生IL-2之能力。投與低劑量外源性IL-2恢復由鈣調磷酸酶抑制劑誘導之Treg功能異常並促進Treg在肝中累積。然而，低劑量Treg之治療用途涉及之問題係同時活化Tcon之風險，其可增強組織損傷。

WO 2017/218850描述組成性表現STAT5以提供生產IL-2信號之工程化Treg。然而，使用此方法可預測數種挑戰。組成性STAT5表現提供一種風險，即經工程化Treg可發揮非特異性強有力之免疫抑制，且由於其等高增殖率，因此其等可使內源性Treg池過度生長並減少其等TCR庫，此可導致自體免疫性。最後，考慮到已知STAT5上之突變促進T-細胞前淋巴球白血病，且在許多癌症中組成性活化STAT5，因此此等經工程化Treg可造成轉化之風險。

調節T細胞表現FOXP3，且習知T細胞可藉由在彼等細胞中表現FOXP3向調節表型離體分化。FOXP3表現之損失與調節T細胞中抑制功能之損失及返回至效應物表型之可能性相關聯。

因此，仍需產生不易受IL-2可用度有限之微環境影響之經工程化Treg之方法及改善經工程化Treg在已投與免疫抑制藥物之個體中增殖、存活及功能之有效性之方法。

發明人已研發Treg一旦結合至預定抗原即可提供生產IL-2信號且具有穩定之調節表型之經工程化調節T細胞(Treg)。因此，本發明之經工程化Treg解決與經過繼轉移之Treg之高IL-2依賴性相關聯之問題而無需投與外源性IL-2，且以抗原特異性方式提供生產IL-2信號，同時維持表型及功能。特定言之，該生產IL-2信號可通過在細胞內表現之嵌合受體之內域中包括特定基序(即STAT5聯合基序、JAK1及/或JAK2結合基序及JAK3結合基序)來提供。特定言之，發明人已鑑別於嵌合受體(例如，CAR)之內域中在特定基序之間使用連接子可提供增強之IL-2信號，其導致經工程化細胞之存活增加。特定言之，在包含STAT5及JAK1及/或JAK2基序之內域中在子域或序列之間及在包含JAK3結合基序之內域中在子域或序列之間可存在連接子。

本發明另外特別提供通過外源性FOXP3及具有包含STAT5聯合基序、JAK1及/或JAK2結合基序及JAK3結合基序之內域之CAR之共表現而具有穩定表型及IL2傳訊能力之Treg細胞。

因此，本發明提供包含編碼嵌合受體，尤其嵌合抗原受體(CAR)之多核苷酸序列之核酸分子，其中該嵌合受體(尤其該CAR)包含內域，該內域包含(i) STAT5聯合基序，及JAK1及/或JAK2結合基序及(ii) JAK3結合基序，其中(i)及(ii)由連接子或鉸鏈連接。

在另一態樣中，核酸分子可另外編碼FOXP3，且因此，本發明提供包含以下之核酸：(a)編碼FOXP3之第一多核苷酸序列，及(b)編碼嵌合受體(尤其嵌合抗原受體(CAR))之第二多核苷酸序列，其中該嵌合受體包含內域，該內域包含(i) STAT5聯合基序，及JAK1及/或JAK2結合基序及(ii) JAK3結合基序，其中(i)及(ii)由連接子或鉸鏈連接。

儘管該第一多核苷酸序列可相對於核酸分子內之第二多核苷酸位於5’或3’，但特定言之，該第一多核苷酸序列相對於該第二多核苷酸序列位於5’ (即上游)。熟習此項技術者應知曉共表現序列可便利地位於該核酸分子內之該第一與該第二多核苷酸序列之間。

在第二態樣中，本發明提供包含本發明之核酸分子之載體。

在第三態樣中，本發明提供包含本發明之核酸分子或本發明之載體之經工程化細胞(尤其T細胞，例如，Treg或NK細胞)。

在第四態樣中，本發明提供包含本發明之經工程化細胞(例如，Treg細胞)之醫藥組合物。

在第五態樣中，本發明提供本發明之經工程化細胞(例如，Treg細胞)或本發明之醫藥組合物，其用於療法中。

在另一態樣中，本發明提供一種經工程化細胞(例如，Treg細胞)，其用於誘導對移植物之耐受性；治療及/或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫或過敏疾病；用於促進組織修復及/或組織再生；或用於改善或治療發炎(例如，代謝失調繼發之慢性發炎)；其中該經工程化細胞(例如，Treg細胞)包含本發明之核酸分子或本發明之載體。

在另一態樣中，本發明提供包含本發明之經工程化細胞(例如，Treg)之醫藥組合物，其用於誘導對移植物之耐受性；治療及/或預防GvHD、自體免疫或過敏疾病；用於促進組織修復及/或組織再生；或用於改善或治療發炎(例如，代謝失調繼發之慢性發炎)。

本發明進一步係關於一種誘導對移植物之耐受性；治療及/或預防GvHD、自體免疫或過敏疾病；或用於促進組織修復及/或組織再生；或用於改善或治療發炎(例如，代謝失調繼發之慢性發炎)之方法，其包括向個體投與根據本發明之經工程化細胞(例如，Treg)或醫藥組合物之步驟。

本發明亦提供根據本發明之經工程化細胞(例如，Treg)之用途，其用於於製造用於誘導對移植物之耐受性；治療及/或預防細胞及/或體液移植排斥；治療及/或預防GvHD、自體免疫或過敏疾病；或用於促進組織修復及/或組織再生；或用於改善或治療炎症(例如，代謝失調繼發之慢性炎症)之藥劑。

更一般而言，在此等各種態樣中，經工程化細胞可用於治療或預防癌症，或傳染性、神經變性、發炎性、自體免疫或過敏疾病或與非所需或有害之免疫反應相關聯之任何病症。特定言之，其中該細胞係Treg或其他免疫抑制細胞，該細胞可用於誘導免疫抑制(即用於抑制非所需或有害之免疫反應)，例如用於改善及/或預防發炎性疾病、自體免疫或過敏疾病或病症中及移植中免疫介導之器官損傷。

特定言之，本發明之細胞可用於治療肌萎縮性側索硬化(ALS)。

適當地，個體(尤其人類個體)可為移植接受體，且本發明係關於誘導對移植物(例如經移植器官)之耐受性。特定言之，該個體可為經受免疫抑制療法之移植接受體。

本發明進一步提供一種用於產生本發明之經工程化細胞(例如，Treg細胞)之方法，其包括將本發明之核酸分子或本發明之載體引入細胞(例如，多能細胞，尤其iPSC、Tcon細胞或Treg細胞)，及可自該方法獲得之細胞內。

更一般而言，本發明提供一種用於產生經工程化細胞(例如Treg細胞)之方法，其包括將以下引入細胞(例如，Treg細胞)內：(a)編碼FOXP3之第一多核苷酸序列及(b)編碼嵌合受體(例如，嵌合抗原受體(CAR))之第二多核苷酸序列，其中該嵌合受體(例如，CAR)包含內域，該內域包含(i) STAT5聯合基序，及JAK1及/或JAK2結合基序及(ii) JAK3結合基序，其中(i)及(ii)由連接子或鉸鏈連接，且其中該第一及第二多核苷酸序列包含於相同或不同之核酸分子中。

細胞亦可為多能細胞，諸如iPSC或Tcon。引入編碼FOXP3之核酸可容許分化或轉化為Treg細胞。另外藥劑可由本發明之核酸進一步編碼，或在單獨核酸上編碼以進一步幫助任何必需之分化步驟(特定言之，另外之轉錄因子)。或者或另外，可向培養物添加其他藥劑(例如TGFβ)以幫助分化。

特定言之，Treg可由CD25之表現及免疫抑制活性定義。

第一及第二多核苷酸序列可於相同或不同載體中。

本發明進一步提供一種用於增加Treg細胞之抑制活性及/或持久性之方法，其包括將本發明之核酸分子或本發明之載體引入Tcon細胞或Treg細胞內，或包括將一或多種(例如一種)包含以下之核酸分子引入Tcon或Treg細胞內：(i)編碼FOXP3之第一多核苷酸序列及(ii)編碼嵌合受體(例如，嵌合抗原受體(CAR))之第二多核苷酸序列，其中該嵌合受體(例如，CAR)包含內域，該內域包含(i) STAT5聯合基序，及JAK1及/或JAK2結合基序及(ii) JAK3結合基序，其中(i)及(ii)由連接子或鉸鏈連接。

因此，本發明提供包含編碼嵌合受體(例如，CAR)之核酸分子或載體之經工程化細胞(例如，Treg)，該嵌合受體(例如，CAR)僅在嵌合受體結合至其同源配體(例如，CAR結合至其同源抗原)時，向細胞(例如，Treg)提供STAT5介導之促存活信號，且視需要編碼FOXP3，其賦予經工程化細胞(尤其Treg)穩定之T調節表型。特定言之，在配體(例如，抗原)識別後，本發明之嵌合受體(例如，CAR)可聚集，且經由嵌合受體(例如，CAR)之細胞內傳訊域(內域)，將信號傳遞至該經工程化細胞(例如，Treg)。因為本發明之嵌合受體(例如，CAR)含有包含STAT5聯合基序、JAK1及/或JAK2結合基序，及JAK3結合基序之內域，所以該本發明之嵌合受體(例如，CAR)之聚集導致STAT5、JAK1及/或JAK2及JAK3募集及活化；且因此提供以配體特異性(例如，抗原特異性)方式增強經工程化細胞(例如，Treg)之功能及存活而不依賴於微環境中IL-2之可用度之信號。無論內源性FOXP3表現之狀態如何，外源性FOXP3之可選表現均容許Treg細胞維持其等調節功能。

相較於個體之一般T細胞群體，在配體/抗原識別後，本發明之經工程化細胞(例如，Treg)可特別有效向經工程化細胞(例如，CAR-Treg)提供存活優勢。特定言之，在(例如)使用降低IL-2之可用度之免疫抑制藥物移植之內文中，本發明之嵌合受體Treg (例如，CAR-Treg)之STAT5傳訊在原本不利之微環境中，對本發明之細胞提供另外之存活及功能效應。本發明提供之傳訊係特別藉由於嵌合受體(例如CAR)內包括JAK3結合基序與STAT5聯合基序及JAK1及/或JAK2結合基序之組合，及在域之間包括連接子或鉸鏈來增強。

在一另外態樣中，本發明提供包含以下之核酸分子：(i)編碼FOXP3之第一多核苷酸序列及(ii)編碼嵌合受體(例如，嵌合抗原受體(CAR))之第二多核苷酸序列，其中該嵌合受體(例如該CAR)包含內域，該內域包含STAT5聯合基序、JAK1及/或JAK2結合基序及JAK3結合基序，其中該第一及第二多核苷酸序列可操作地連接至相同啟動子。

儘管該第一多核苷酸序列可相對於核酸分子內之第二多核苷酸位於5’或3’，但特定言之，該第一多核苷酸序列相對於該第二多核苷酸序列位於5’ (即上游)。熟習此項技術者應知曉共表現序列可便利地位於該核酸分子內之該第一與該第二多核苷酸序列之間。本發明進一步涵蓋包含編碼嵌合受體(例如，CAR)之核酸之載體、包含該核酸、載體或嵌合受體(例如，CAR)之細胞，及製造細胞之方法，及該細胞之治療用途。

經工程化細胞(例如，調節T細胞(TREG)) 如本文使用之「經工程化細胞」意謂以下細胞：已經修飾以包含或表現非由該細胞天然編碼或(換而言之)非天然存在於該細胞中之多核苷酸，或其中該多核苷酸之表現產物非由該細胞天然編碼。用於工程化細胞之方法為此項技術中已知且包括(但不限於)細胞之基因修飾，例如藉由轉導(諸如反轉錄病毒或慢病毒轉導)、轉染(諸如基於DNA或RNA之瞬態轉染) (包括脂質轉染)、聚乙二醇、磷酸鈣及電穿孔。可使用任何合適之方法以將核酸序列引入細胞內。可使用非病毒技術(諸如兩親性細胞穿透肽)以引入根據本發明之核酸。

因此，編碼如本文描述之嵌合受體(例如，CAR)之多核苷酸非由相應之未修飾細胞天然表現。適當地，經工程化細胞係以下細胞：已經修飾以(例如)藉由轉導或藉由轉染將多核苷酸引入該細胞內。適當地，經工程化細胞係已經(例如)藉由轉導或藉由轉染修飾或基因體已經(例如)藉由轉導或藉由轉染修飾之細胞。適當地，經工程化細胞係已經藉由反轉錄病毒轉導修飾或基因體已經藉由反轉錄病毒轉導修飾之細胞。適當地，經工程化細胞係已經藉由慢病毒轉導修飾或基因體已經藉由慢病毒轉導修飾之細胞。

如本文使用，術語「引入」係指用於將外源DNA或RNA插入細胞內之方法。如本文使用，術語引入包括轉導及轉染方法兩者。轉染係藉由非病毒方法將核酸引入細胞內之方法。轉導係經由病毒載體將外源DNA或RNA引入細胞內之方法。根據本發明之經工程化細胞可藉由許多方式中之一者(包括用病毒載體轉導、用DNA或RNA轉染)引入編碼如本文描述之嵌合受體(例如，CAR)之DNA或RNA加以產生。細胞可在引入編碼如本文描述之嵌合受體(例如，CAR)之多核苷酸之前或之後，例如藉由用抗CD3單株抗體或抗CD3及抗CD28單株抗體兩者處理加以活化及/或擴增。Treg亦可在抗CD3及抗CD28單株抗體與IL-2之組合之存在下擴增。適當地，IL-2可用IL-15取代。可用於Treg擴增方案中之其他組分包括(但不限於)雷帕黴素(rapamycin)、全反式維甲酸(ATRA)及TGFβ。如本文使用，「活化」意謂細胞已受刺激，導致該細胞增殖。如本文使用，「擴增」意謂已誘導細胞或細胞群體增殖。細胞群體之擴增可例如藉由計數群體中存在之細胞之數量加以量測。細胞之表型可藉由此項技術中已知之方法(諸如流式細胞分析技術)加以確定。

本發明之經工程化細胞可為任何細胞，但特別可為免疫細胞，諸如T細胞或NK細胞。特定言之，該細胞可為Tcon或Treg。該細胞可為Tcon或Treg之前體。

或者，經工程化細胞可為多能細胞(諸如iPSC)。熟習此項技術者應知曉此等經工程化多能細胞可分化為任何細胞類型，且特別可分化為免疫細胞，諸如T細胞(例如Treg)或NK細胞。分化可通過中間細胞群發生，例如，多能細胞可分化為Tcon，該Tcon可轉化為Treg。此等經工程化多能細胞可用作同種異體產品策略之一部分。iPSC在商業上可廣泛使用，且可來源於體纖維母細胞、CD34+造血幹細胞等。

本發明之經工程化細胞可為細胞群體之一部分。適當地，經工程化細胞之群體包含至少70%經工程化細胞，諸如至少75、85、90、95、97、98或99%經工程化細胞。或者考慮，當細胞為免疫細胞時，細胞群體可包含至少70%免疫細胞，諸如至少75、80、85、90、95、97、98或99%免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)。

調節T細胞(Treg)係具有免疫抑制功能之免疫細胞，其等控制細胞病變免疫反應且對於維持免疫耐受性必不可少。

如本文使用，術語Treg係指具有免疫抑制功能之T細胞。如本文使用之T細胞係淋巴球，包括任何類型之T細胞，諸如α β T細胞(例如CD8或CD4+)、γ δ T細胞、記憶T細胞、Treg細胞等。

適當地，免疫抑制功能可係指Treg減少或抑制藉由免疫系統應刺激物(諸如病原體、同種抗原或自體抗原)促進之許多生理及細胞效應中之一或多者之能力。此等效應之實例包括習知T細胞(Tconv)之增殖增加及促炎細胞介素之分泌。任何此等效應均可用作免疫反應之強度之指標。在Treg之存在下，Tconv相對較弱之免疫反應將指示該Treg抑制免疫反應之能力。例如，細胞介素分泌之相對減少將指示較弱之免疫反應，並因此指示Treg抑制免疫反應之能力。Treg亦可藉由調節共刺激分子於抗原呈遞細胞(APC)，諸如B細胞、樹突狀細胞及巨噬細胞上之表現抑制免疫反應。可使用CD80及CD86之表現含量以評定共培養後活體外經活化Treg之抑制效能。

此項技術中已知用於量測免疫反應強度之指標，並藉此量測Treg之抑制能力之分析。特定言之，抗原特異性Tconv細胞可與Treg共培養，並向該共培養物添加相應抗原之肽以刺激來自該等Tconv細胞之反應。可使用應肽添加之Tconv細胞增殖程度及/或其等分泌之細胞介素IL-2之量可作為經共培養Treg之抑制能力之指標。

與本發明之Treg共培養之抗原特異性Tconv細胞可比在缺乏本發明之Treg之情況下培養之相同Tconv細胞少增殖5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、90%、95%或99%。例如，與本發明之Treg共培養之抗原特異性Tconv細胞可比在存在非工程化Treg之情況下培養之相同Tconv細胞少增殖5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、90%、95%或99%。如相較於非工程化Treg或相較於缺乏外源性FOXP3但經工程化以包含相同嵌合受體(例如，CAR)但內域中缺乏STAT5聯合基序、JAK1及/或JAK2結合基序及JAK3結合基序之Treg，本發明之Treg可具有增加之抑制活性(例如抑制活性增加至少5、10、20、30、40、50、60、70、80或90%)。

與本發明之Treg共培養之抗原特異性Tconv細胞可比在缺乏本發明之Treg之情況下(例如在存在非工程化Treg，或缺乏外源性FOXP3但經工程化以包含相同嵌合受體(例如，CAR)但內域中缺乏STAT5聯合基序、JAK1及/或JAK2結合基序及JAK3結合基序之Treg之情況下)培養之相應Tconv細胞表現少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%或至少60%之效應細胞介素。

效應細胞介素可選自IL-2、IL-17、TNFα、GM-CSF、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10及IL-13。

適當地，效應細胞介素可選自IL-2、IL-17、TNFα、GM-CSF及IFN-γ。

適當地，Treg係表現標誌物CD4、CD25及FOXP3 (CD4⁺ CD25⁺ FOXP3⁺ )之T細胞。「FOXP3」係叉頭框P3蛋白之縮寫名稱。FOXP3係轉錄因子之FOX蛋白家族之成員並在調節T細胞之發育及功能中充當調節途徑之主要調節劑。

Treg亦可表現CTLA-4 (細胞毒性T-淋巴球相關分子-4)或GITR (糖皮質激素誘導之TNF受體)。Treg細胞存在於外周血、淋巴結及組織中，且包括胸腺來源之天然Treg (nTreg)細胞及外周產生之誘導型Treg (iTreg)細胞。

適當地，Treg可在缺乏表面蛋白CD127 (CD4⁺ CD25⁺ CD127⁻ 或CD4⁺ CD25⁺ CD127^low )之低含量表現或與其組合之情況下，使用細胞表面標誌物CD4及CD25加以識別。使用此等標誌物識別Treg為此項技術中已知且(例如)描述於Liu等人，(JEM；2006；203；7(10)；1701-1711)中。

Treg可為CD4⁺ CD25⁺ FOXP3⁺ T細胞。

Treg可為CD4⁺ CD25⁺ CD127⁻ T細胞。

Treg可為CD4⁺ CD25⁺ FOXP3⁺ CD127^−/low T細胞。

Treg可為天然或胸腺來源、適應性或外周來源，或活體外誘導之(Abbas, A.K.等人，2013. Nature immunology, 14(4)，第307至308頁)。

適當地，Treg可為天然Treg (nTreg)。如本文使用，術語「天然T reg」意謂胸腺來源之Treg。天然T reg係CD4⁺ CD25⁺ FOXP3⁺ Helios⁺ 神經纖毛蛋白1⁺ 。相較於iTreg，nTreg具有PD-1 (程序性細胞死亡-1，pdcd1)、神經纖毛蛋白1 (Nrp1)、Helio(Ikzf2)及CD73之更高表現。基於Helios蛋白或神經纖毛蛋白1 (Nrp1)個別表現，nTreg可區別於iTreg。

Treg可具有脫甲基化Treg特異性脫甲基化區(TSDR)。該TSDR係調節Foxp3表現之重要甲基化敏感元件(Polansky, J.K.等人，2008. European journal of immunology, 38(6)，第1654至1663頁)。

其他合適之Treg包括(但不限於) Tr1細胞(其等不表現Foxp3，且具有高IL-10產生)；CD8⁺ FOXP3⁺ T細胞；及γδ FOXP3⁺ T細胞。

用於確定細胞標誌物之存在之方法為此項技術中熟知，且包括(例如)流式細胞分析技術。

適當地，細胞(諸如Treg)係自個體獲得之外周血單核細胞(PBMC)分子。適當地，獲得該等PBMC之個體係哺乳動物，較佳人類。適當地，該細胞係與待投與經工程化Treg之個體匹配(例如HLA匹配)或自體。適當地，待治療之個體係哺乳動物，較佳人類。該細胞可自病患自身外周血(第1方)離體產生，或在來自供體外周血(第2方)之造血幹細胞移植之設定中，或來自無關聯供體之外周血(第3方)。適當地，該細胞係與待投與經工程化Treg之個體自體。

適當地，Treg係自個體獲得之外周血單核細胞(PBMC)分離。在一較佳實施例中，該Treg係自個體獲得之外周血單核細胞(PBMC)分離並與待治療之個體匹配或自體。

或者，Treg可自臍帶血或胸腺(例如，小兒胸腺)分離。

適當地，Treg係自待治療之個體分離。

適當地，Treg係Treg群體之一部分。適當地，該Treg群體包含至少70% Treg，諸如至少75、85、90、95、97、98或99% Treg。此群體可稱為「富含Treg群體」。

在一些態樣中，Treg可來源於可誘導祖細胞(例如iPSC)或胚胎祖細胞向Treg之離體分化。本發明之核酸分子或載體可在分化為Treg之前或之後引入該等可誘導祖細胞或胚胎祖細胞內。適用於分化之方法為此項技術中已知，且包括Haque等人，J Vis Exp., 2016, 117, 54720 (以引用之方式併入本文中)中揭示之方法。

如本文使用，術語「習知T細胞」或Tcon或Tconv (本文中可互換使用)意謂表現αβ T細胞受體(TCR)及可為分化簇4(CD4)或分化簇8(CD8)且無免疫抑制功能之共受體之T淋巴球細胞。習知T細胞存在於外周血、淋巴結及組織中。適當地，經工程化Treg可藉由許多方式中之一者(包括用病毒載體轉導，或用相同或不同載體上之DNA或RNA轉染)，藉由引入編碼FOXP3之DNA或RNA及編碼如本文描述之嵌合受體(例如，CAR)之DNA或RNA自Tcon產生。或者，經工程化Treg可藉由在IL-2及TGF-β之存在下，活體外培養CD4+ CD25-FOXP3-細胞自Tcon產生。

如相較於無外源性FOXP3但經工程化以表現相同嵌合受體(例如，CAR)但內域中缺乏STAT5聯合基序、JAK1及/或JAK2結合基序及JAK3結合基序之Treg細胞，本發明之Treg可具有增加之持久性。如本文使用之「持久性」定義Treg在特定環境中，例如活體內(例如在人類病患或動物模型中)可存活之時間長度。如相較於經嵌合受體(例如，CAR)工程化但內域中缺乏STAT5聯合基序、JAK1結合基序及/或JAK2結合基序及JAK3結合基序且無外源性FOXP3之Treg，本發明之Treg可具有增加至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%之持久性。

FOXP3 在本發明中，FOXP3表現係視需要藉由將如本文描述之編碼FOXP3多肽之核酸分子或載體引入細胞(例如Treg)中而在該等細胞中增加。因此，本發明亦提供一種用於在細胞中(例如在Treg或CD4+細胞中)增加FOXP3之方法。

「FOXP3」係叉頭框P3蛋白之縮寫名稱。FOXP3係轉錄因子之FOX蛋白家族之成員並在調節T細胞之發生及功能中用作調節途徑之主要調節劑。本文中使用之「FOXP3」包含FOXP3之變體、同功型及功能片段。

「增加FOXP3表現」意謂相較於未經修飾之相應細胞(或細胞群體)，增加細胞(或細胞群體)中FOXP3 mRNA及/或蛋白質之含量。例如，在根據本發明修飾之細胞(或此等細胞之群體)中FOXP3 mRNA及/或蛋白質之含量可增加至比未根據本發明修飾之相應細胞(或此等細胞之群體)中之含量高至少1.5倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍。較佳地，該細胞係Treg或該細胞群體係Treg群體。適當地，在根據本發明修飾之細胞(或此等細胞之群體)中FOXP3 mRNA及/或蛋白質之含量可增加至比未根據本發明修飾之相應細胞(或此等細胞之群體)中之含量高至少1.5倍、2倍或5倍。較佳地，該細胞係Treg或該細胞群體係Treg群體。

用於量測特定mRNA及蛋白質之含量之技術為此項技術中熟知。細胞(諸如Treg)群體中之mRNA含量可藉由諸如Affymetrix ebioscience prime flow RNA分析、北方印漬術、基因表現系列分析(SAGE)或定量聚合酶鏈反應(qPCR)之技術量測。細胞群體中之蛋白質含量可藉由諸如流式細胞分析技術、高效液相層析術(HPLC)、液相層析術-質譜術(LC/MS)、西方印漬術或酶聯免疫吸附分析(ELISA)之技術量測。「FOXP3多肽」係具有FOXP3活性之多肽，即可結合FOXP3靶DNA並充當調節Treg之發育及功能之轉錄因子之多肽。特定言之，FOXP3多肽可具有與野生型FOXP3 (SEQ ID NO.52)相同或相似之活性，例如可具有該野生型FOXP3多肽之活性之至少40、50、60、70、80、90、95、100、110、120、130、140或150%。因此，相較於野生型FOXP3，由本文描述之核酸或載體編碼之FOXP3多肽可具有增加或減小之活性。用於量測轉錄因子活性之技術為此項技術中熟知。例如，轉錄因子DNA-結合活性可由ChIP量測。轉錄因子之轉錄調節活性可藉由定量該轉錄因子調節之基因之表現含量量測。基因表現可藉由使用諸如北方印漬術、SAGE、qPCR、HPLC、LC/MS、西方印漬術或ELISA之技術，量測自該基因產生之mRNA及/或蛋白質之含量定量。由FOXP3調節之基因包括細胞介素，諸如IL-2、IL-4及IFN-γ (Siegler等人，Annu. Rev. Immunol. 2006, 24: 209-26，以引用之方式併入本文中)。如下文詳細討論，FOXP3或FOXP3多肽包括其(例如SEQ ID NO: 52)功能片段、變體及同功型。

「FOXP3之功能片段」可係指與全長FOXP3多肽或多核苷酸具有相同或相似活性之FOXP3多肽或編碼FOXP3多肽之多核苷酸之部分或區域。該功能片段可具有該全長FOXP3多肽或多核苷酸之活性之至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。熟習此項技術者將可基於FOXP3之已知結構及功能特徵產生功能片段。此等描述於例如Song, X.等人，2012. Cell reports, 1(6)，第665至675頁；Lopes, J.E.等人，2006. The Journal of immunology, 177(5)，第3133至3142頁；及Lozano, T.等人，2013. Frontiers in oncology, 3，第294頁中。此外，例如，具有如下文討論之序列SEQ ID NO: 150之經N及C末端截短FOXP3片段描述於WO2019/241549 (以引用之方式併入本文中)中。

「FOXP3變體」可包括可與FOXP3多肽或編碼FOXP3多肽之多核苷酸，例如與SEQ ID NO: 52具有至少50%、至少55%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%，較佳至少95%或至少97%或至少99%一致性之胺基酸序列或核苷酸序列。FOXP3變體可與野生型FOXP3多肽或多核苷酸具有相同或相似活性，例如可具有野生型FOXP3多肽或多核苷酸之活性之至少40、50、60、70、80、90、95、100、110、120、130、140或150%。熟習此項技術者將可基於FOXP3之已知結構及功能特徵及/或使用保守取代產生FOXP3變體。如相較於野生型FOXP3，FOXP3變體可於Treg細胞內具有相似或相同周轉時間(或降解速率)，例如Treg中野生型FOXP3之周轉時間(或降解速率)之至少40、50、60、70、80、90、95、99或100%。如WO2019/241549 (以引用之方式併入本文中)中描述，如相較於野生型FOXP3，一些FOXP3變體可具有減少之周轉時間(或降解速率)，例如，於SEQ ID NO: 52之胺基酸418及/或422處具有胺基酸取代 (例如S418E及/或S422A)之FOXP3變體。

FOXP3多肽序列適當地，由如本文描述之核酸分子或載體編碼之FOXP3多肽可包含人類FOXP3之多肽序列，諸如UniProtKB登錄Q9BZS1 (SEQ ID NO: 52)，或其功能片段或變體，或由其構成： FOXP3，UniProtKB登錄Q9BZS1 (SEQ ID NO: 52)：

在本發明之一些實施例中，FOXP3多肽包含與SEQ ID NO: 52或其功能片段具有至少70%一致性之胺基酸序列或由其構成。適當地，該FOXP3多肽包含與SEQ ID NO: 52或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列或由其構成。在一些實施例中，該FOXP3多肽包含SEQ ID NO: 52或其功能片段或由其構成。

在一些實施例中，如上文討論，FOXP3多肽可於SEQ ID NO: 52之殘基418及/或422處包含突變，如下：

在本發明之一些實施例中，FOXP3多肽可於N及/或C末端處截短，導致功能片段之產生。特定言之，FOXP3之N及C末端截短功能片段可包含與其具有至少80、85、90、95或99%一致性之胺基酸序列或其功能變體或由其構成：

適當地，FOXP3多肽可為SEQ ID NO: 52之變體，例如天然變體。適當地，該FOXP3多肽係SEQ ID NO: 52之同功型。例如，相對於SEQ ID NO: 52，該FOXP3多肽可包含胺基酸位置72至106之刪除。或者，相對於SEQ ID NO: 52，該FOXP3多肽可包含胺基酸位置246至272之刪除。

適當地，FOXP3多肽包含SEQ ID NO: 151或其功能片段：說明性FOXP3多肽(SEQ ID NO: 151)：

適當地，FOXP3多肽包含與SEQ ID NO: 151或其功能片段具有至少70%一致性之胺基酸序列或由其構成。適當地，該FOXP3多肽包含與SEQ ID NO: 151或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，該FOXP3多肽包含SEQ ID NO: 151或其功能片段或由其構成。

適當地，FOXP3多肽可為SEQ ID NO: 151之變體，例如天然變體。適當地，該FOXP3多肽係SEQ ID NO: 151之同功型或其功能片段。例如，相對於SEQ ID NO: 151，該FOXP3多肽可包含胺基酸位置72至106之刪除。或者，相對於SEQ ID NO: 151，該FOXP3多肽可包含胺基酸位置246至272之刪除。

FOXP3多核苷酸序列適當地，編碼FOXP3多肽之多核苷酸包含SEQ ID NO: 152中闡述之多核苷酸序列或由其構成：說明性FOXP3多核苷酸(SEQ ID NO: 152)：

在本發明之一些實施例中，編碼FOXP3多肽或變體之多核苷酸包含與SEQ ID NO: 152或其功能片段具有至少70%一致性之多核苷酸序列。適當地，編碼FOXP3多肽或變體之多核苷酸包含與SEQ ID NO: 152或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之多核苷酸序列。在本發明之一些實施例中，編碼FOXP3多肽或變體之多核苷酸包含SEQ ID NO: 152或其功能片段或由其構成。

適當地，編碼FOXP3多肽之多核苷酸包含SEQ ID NO: 153中闡述之多核苷酸序列或由其構成：說明性FOXP3多核苷酸(SEQ ID NO: 153)：

在本發明之一些實施例中，編碼FOXP3多肽或變體之多核苷酸包含與SEQ ID NO: 153或其功能片段具有至少70%一致性之多核苷酸序列。適當地，編碼FOXP3多肽或變體之多核苷酸包含與SEQ ID NO: 153或其功能片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之多核苷酸序列。在本發明之一些實施例中，編碼FOXP3多肽或變體之多核苷酸包含SEQ ID NO: 153或其功能片段或由其構成。

適當地，編碼FOXP3多肽或其功能片段或變體之多核苷酸可經密碼子最佳化。適當地，編碼FOXP3多肽或其功能片段或變體之多核苷酸可經密碼子最佳化以在人類細胞中表現。

嵌合受體(CR) 如本文使用之「嵌合受體」或「CR」係指可賦予細胞結合特異性之經工程化受體。嵌合受體可結合至配體(通常生物分子)，特別結合至抗原或結合至另一生物分子(例如，結合至細胞介素或任何其他可溶性分子)。因此，通常，本發明之嵌合受體可包含配體結合域(特定言之，配體結合外域)，其可結合至配體。

如本文提及之嵌合受體，尤其包括可向如下文詳細討論之細胞賦予抗原特異性之CAR。

本發明之嵌合受體可結合至任何生物分子且因此配體結合域可包括任何天然生成、合成、半合成或重組產生之受關注之生物分子之結合配偶體(例如，其結合至配體諸如抗原、生物受體、抗體(例如，利妥昔單抗(Rituximab)、抗CD34抗體)、細胞介素(例如，IL10、IL7、IL15、IL33)、趨化介素(例如，CXC 12、CCL2、CCL4、CCL5及CCL22)、分泌因子(例如，腫瘤分泌因子，例如，前列腺特異性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、血管內皮生長因子(VEGF)及CA125)等)。

嵌合受體之配體結合域已經文獻充分記錄且實例可(例如)參見WO2012/138858、WO2017/029512等，其等係以引用之方式併入本文中。配體結合域之進一步討論及實例可參見下文之嵌合抗原受體(包括基於抗體，及基於受體之配體結合域)之詳細討論。

在一特定實施例中，本文定義之嵌合受體不包含第一及第二異二聚化域。該第一及第二異二聚化域(分別為Ht1及HT2)容許同一對嵌合受體在二聚化之化學誘導物(CID)之存在下相互作用，使得來自一個嵌合受體之Ht1與來自另一嵌合受體之Ht2異二聚化，引起兩個傳訊域之二聚化，特別使得一經發生該二聚化，誘導STAT5介導之傳訊。因此，本發明之嵌合受體可不包含一對同源可異二聚化域。

通常，本發明之嵌合受體包含細胞外配體結合域、跨膜域，視需要，一或多個共刺激域，及細胞內傳訊域(亦稱為內域)。特定言之，如下文詳細討論，本發明之嵌合受體之內域包含JAK3結合基序，及STAT5聯合基序及JAK1及/或JAK2結合基序，容許一經配體結合，即將IL2持續信號遞送至細胞內。本發明之嵌合受體特別作為單一連續鏈提供。

編碼嵌合受體之多核苷酸可使用(例如)反轉錄病毒載體轉移至細胞，藉此產生用於療法之大量經工程化細胞。當該嵌合受體結合至其配體時，將持續/存活信號傳遞至表現其之細胞。因此，本發明之嵌合受體容許向細胞提供持續信號。

細胞內傳訊域 ( 內域 ) 本發明嵌合受體(例如，CAR)包含內域，該內域包含STAT5聯合基序、JAK1及/或JAK2結合基序，及JAK3結合基序。

「信號轉導子及轉錄活化子5」 (STAT5)係涉及IL-2傳訊途徑之轉錄因子，其藉由促進基因(諸如FOXP3、IL2RA及BCLXL)之表現，在Treg功能、穩定性及存活中發揮關鍵作用。為發揮作用並易位至細胞核內，STAT5需經磷酸化。IL-2連接藉由經由IL-2Rβ及IL-2Rγ鏈中分別存在之特定傳訊域活化Jak1/Jak2及Jak3激酶，導致STAT5磷酸化。儘管Jak1 (或Jak2)可磷酸化STAT5而無需Jak3，但STAT5活性藉由Jak1/Jak2及Jak3兩者之轉磷酸化增加，從而穩定其等活性。

如本文使用之「STAT5聯合基序」係指包含酪胺酸且可結合STAT5多肽之胺基酸基序。可使用此項技術中已知用於確定蛋白質:蛋白質相互作用之任何方法以確定聯合基序是否可結合至STAT5。例如，共免疫沈澱，接著西方墨點法。

適當地，嵌合受體(例如，CAR)內域可包含兩個(例如至少兩個)或更多個如本文定義之STAT5聯合基序。例如，該嵌合受體(例如，CAR)內域可包含二、三、四、五或更多個如本文定義之STAT5聯合基序。較佳地，該嵌合受體(例如，CAR)內域可包含二或三個如本文定義之STAT5聯合基序。

適當地，STAT5聯合基序可內源地存在於跨膜蛋白之細胞質域中。例如，該STAT5聯合基序可來自介白素受體(IL)受體內域或激素受體。

嵌合受體(例如，CAR)內域可包含選自其中STAT5係下游組分之介白素受體之任何鏈之胺基酸序列，例如，可使用包含以下之細胞質域：IL-2受體β鏈之胺基酸編號266至551 (NCBI REFSEQ: NP_000869.1，SEQ ID NO: 1)、IL-7R α鏈之胺基酸編號265至459 (NCBI REFSEQ: NP_002176.2，SEQ ID NO: 2)、IL-9R鏈之胺基酸編號292至521 (NCBI REFSEQ: NP_002177.2，SEQ ID NO: 3)、IL-4R α鏈之胺基酸編號257至825 (NCBI REFSEQ: NPJD00409.1，SEQ ID NO: 4)、IL-3R β鏈之胺基酸編號461至897 (NCBI REFSEQ: NP_000386.1，SEQ ID NO: 5)及/或IL-17R β鏈之胺基酸編號314至502 (NCBI REFSEQ: NP_061195.2，SEQ ID NO: 6)。熟習此項技術者應知曉可使用此等序列中之任一者或多者。可使用介白素受體鏈之細胞質域之整個區域。SEQ ID NO: 2 - IL7RA (NP_002176.2之AA 265至459)

SEQ ID NO: 7 - IL7RA 2Y 經截短 ：

SEQ ID NO: 3 - IL9R (NP_002177.2之AA 292至521)

SEQ ID NO: 4 - IL4RA (NPJD00409.1之AA 257至825)

SEQ ID NO: 5 - IL3RB (NP_000386.1之AA 461至897)

SEQ ID NO: 6 - IL17RB (NP_061195.2之AA 314至502)

嵌合受體(例如，CAR)內域可包含一或多個STAT5聯合基序，其等包含如SEQ ID NO: 1至7顯示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 1至7具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%一致性之變體。例如，該變體可結合STAT5至如SEQ ID NO: 1至7中任一者顯示之胺基酸序列之含量之至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。該變體或衍生物可結合STAT5至與SEQ ID NO: 1至7中任一者相似或相同含量或可結合STAT5至比如SEQ ID NO: 1至7中任一者顯示之胺基酸序列更高之含量(例如增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。

例如，STAT5聯合基序可來自IL2Rβ、IL7Rα、IL-3Rβ (CSF2RB)、IL-9R、IL-17Rβ、紅血球生成素受體、血小板生成素受體、生長激素受體及泌乳素受體中之任一者或多者。嵌合受體(例如，CAR)可(例如)包含來自IL2Rβ及IL7Rα兩者之STAT聯合基序。

STAT5聯合基序可包含胺基酸基序YXXF/L (SEQ ID NO: 8)；其中X係任何胺基酸。

適當地，STAT5聯合基序可包含胺基酸基序YCTF (SEQ ID NO: 9)、YFFF (SEQ ID NO: 10)、YLSL (SEQ ID NO: 11)或YLSLQ (SEQ ID NO: 12)。

適當地，STAT5聯合基序可包含胺基酸基序YLSLQ (SEQ ID NO: 12)。

嵌合受體(例如，CAR)內域可包含一或多個STAT5聯合基序，該基序包含胺基酸基序YCTF (SEQ ID NO: 9)、YFFF (SEQ ID NO: 10)、YLSL (SEQ ID NO: 11)及/或YLSLQ (SEQ ID NO: 12)。

嵌合受體(例如，CAR)內域可含有包含胺基酸基序YLSLQ (SEQ ID NO: 12)之第一STAT5聯合基序，及包含胺基酸基序YCTF (SEQ ID NO: 9)或YFFF (SEQ ID NO: 10)之第二STAT5聯合基序。

嵌合受體(例如，CAR)內域可包含下列STAT5聯合基序：YLSLQ (SEQ ID NO: 12)、YCTF (SEQ ID NO: 9)及YFFF (SEQ ID NO: 10)。

如本文使用之「JAK1及/或JAK2結合基序」係指容許酪胺酸激酶JAK1及/或JAK2結合之BOX基序。合適之JAK1及JAK2結合基序(例如)由Ferrao及Lupardu描述(Frontiers in Endocrinology；2017；8(71)；其係以引用之方式併入本文中)。

JAK1及/或JAK2結合基序可內源地存在於跨膜蛋白之細胞質域中。

例如，JAK1及/或JAK2結合基序可來自干擾素λ受體1 (IFNLR1)、干擾素α受體1 (IFNAR)、干擾素γ受體1 (IFNGR1)、IL10RA、IL20RA、IL22RA、干擾素γ受體2 (IFNGR2)或IL10RB。

JAK1結合基序可包含如SEQ ID NO: 13至19顯示之胺基酸基序或因此可結合JAK1之變體或由其構成。

相較於SEQ ID NO: 13至19中任一者，SEQ ID NO: 13至19之變體可包含一、二或三個胺基酸差異且保留結合JAK1之能力。

變體可與SEQ ID NO: 13至19中任一者具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%一致性且保留結合JAK1之能力。

在一較佳實施例中，JAK1結合域包含SEQ ID NO: 13或其可結合JAK1之變體或由其構成。

例如，變體可結合JAK1至相應參考序列之含量之至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。該變體或衍生物可結合JAK1至與相應參考序列相似或相同含量，或可結合JAK1至比相應參考序列更高之含量(例如增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。

JAK2結合基序可包含如SEQ ID NO: 20至22顯示之胺基酸基序或因此可結合JAK2之變體或由其構成。

相較於SEQ ID NO: 20至22中任一者，SEQ ID NO: 21至22之變體可包含一、二或三個胺基酸差異且保留結合JAK2之能力。

例如，變體可結合JAK2至相應參考序列之含量之至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。該變體或衍生物可結合JAK2至與相應參考序列相似或相同含量，或可結合JAK2至比相應參考序列更高之含量(例如增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。

可使用此項技術中已知用於確定蛋白質:蛋白質相互作用之任何方法以確定JAK1或JAK2結合基序是否可結合至JAK1或JAK2。例如，共免疫沈澱，接著西方墨點法。

適當地，嵌合受體(例如，CAR)內域可包含如SEQ ID NO: 1顯示之IL2Rβ內域；或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列一致性之變體。SEQ ID NO: 1

變體可與SEQ ID NO: 1具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%一致性。

適當地，嵌合受體(例如，CAR)內域可包含如SEQ ID NO: 23或24中任一者顯示之經截短IL2Rβ內域；或SEQ ID NO: 23或24中任一者之與其具有至少80%序列一致性之變體。SEQ ID NO: 23 (IL2RB 經截短 - Y510)

SEQ ID NO: 24 (IL2RB 經截短 - Y510 及 Y392)

變體可與SEQ ID NO: 23或24具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%一致性。

STAT5活性係藉由Jak1/2及Jak3兩者之轉磷酸化增加，因為此穩定其等活性。適當地，如本文描述之嵌合受體(例如，CAR)內域進一步包含JAK3結合基序。如本文使用之「JAK3結合基序」係指容許酪胺酸激酶JAK3之BOX基序。合適之JAK3結合基序(例如)由Ferrao及Lupardu描述(Frontiers in Endocrinology；2017；8(71)；其係以引用之方式併入本文中)。

可使用此項技術中已知用於確定蛋白質:蛋白質相互作用之任何方法以確定基序是否可結合至JAK3。例如，共免疫沈澱，接著西方墨點法。

JAK3結合基序可內源地存在於跨膜蛋白之細胞質域中。

例如，JAK3結合基序可來自IL-2Rγ多肽。經功能截短或變體IL2Rγ多肽可用於本文描述之嵌合受體(例如，CAR)之內域中，其中經功能截短或變體IL2Rγ多肽保留JAK3結合活性(例如IL2Rγ之結合活性之至少20、30、40、50、60、70、80、90或95%)。特定言之，包含JAK3結合基序之經截短IL2Rγ及包含STAT5聯合基序，及JAK1及/或JAK2結合基序之經截短IL2Rβ包含於如本文定義之嵌合受體(例如，CAR)之內域中。功能截短可提供減小用於表現之構築體尺寸之優勢。

JAK3結合基序可包含如SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26顯示之胺基酸基序或因此可結合JAK3之變體(例如與SEQ ID NO 25或26具有至少80、85、90、95或99%一致性之功能變體或片段)或由其構成。SEQ ID NO: 25

SEQ ID NO: 26

變體可與SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%一致性。

在一較佳實施例中，嵌合受體(例如，CAR)內域包含一或多個JAK1結合域及至少一個JAK3結合域/基序(例如至少2或3個JAK3結合域/基序)。

熟習此項技術者應知曉編碼JAK3結合域之多核苷酸序列可位於編碼STAT5聯合基序及JAK1及/或JAK2結合基序之多核苷酸序列之上游或下游(5’或3’)。特定言之，編碼JAK3結合域之多核苷酸可位於編碼STAT5聯合基序及JAK1及/或JAK2結合基序之多核苷酸之上游(5’)。因此，或者考慮，在如本文描述之嵌合受體(例如，CAR)中，JAK3結合域可為STAT5聯合基序及JAK1及/或JAK2結合域之N或C末端。在一項實施例中，該JAK3結合域及該STAT5聯合基序/JAK1及/或JAK2結合域彼此直接相鄰放置(即未由序列在遠端分開)。

此外，熟習此項技術者應知曉JAK3結合域及STAT5聯合基序及JAK1及/或JAK2結合域可位於嵌合受體(例如，CAR)之細胞質域或內域中之任何位置，例如靠近細胞膜，或由另外序列，例如由一或多個共刺激域與細胞膜分開。在一項實施例中，該等域可能延伸至跨膜區內。

嵌合受體之各種域，及該等域之個別部分(例如傳訊域中之基序)可由連接子彼此連接。因此，嵌合受體可含有一或多個連接子。通常，該嵌合受體將含有至少一個連接子。如本文涉及之連接子係將蛋白質之一個域或部分彼此連接之胺基酸序列。該連接子序列可為發揮作用以將兩個域或其部分連接或連結在一起，使得該等兩個域或其部分可進行其等功能之任何胺基酸序列。因此，連接子可將連接之元素隔開。

在一特定實施例中，連接子或鉸鏈可存在於JAK3結合基序與STAT5聯合基序/JAK1及/或JAK2結合基序之間。實際上，發明人已鑑別如相較於表現具有包含JAK3結合基序及STAT5聯合基序/JAK1及/或JAK2結合基序而無連接子之內域之嵌合受體之細胞，在嵌合受體之內域中JAK3結合基序與STAT5聯合基序/JAK1及/或JAK2結合基序之間存在連接子導致表現嵌合受體之細胞中存活增加。存活之增加可為至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%之增加，且可藉由在培養特定時間週期(尤其在低IL-2條件下培養)後，測定經轉導活細胞之數量量測。

就連接子之胺基酸組成及/或胺基酸之序列而言，該連接子之性質可變化且不受限制。然而，該連接子可為可撓性連接子。因此，連接子可包含已知賦予該連接子可撓性特性(相對於剛性連接子)之胺基酸或由其等構成。

可撓性連接子係此項技術中熟知並描述之連接子序列之類別。連接子序列一般稱為可用於將蛋白質或蛋白質域連接或結合在一起，以產生(例如)融合蛋白或嵌合蛋白，或多功能蛋白或多肽之序列。該等連接子可具有不同特性，且(例如)可為可撓性、剛性或可裂解。蛋白質連接子回顧例如Chen等人，2013, Advanced Drug Delivery Reviews 65, 1357-1369，其比較可撓性連接子之類別與剛性及可裂解連接子之類別。可撓性連接子亦描述於Klein等人，2014, Protein Engineering Design及Selection, 27(10), 325-330；van Rosmalen等人，2017, Biochemistry, 56,6565-6574；及Chichili等人，2013, Protein Science, 22, 153-167中。

可撓性連接子係在連接之域或組分之間容許一定程度之移動之連接子。該等連接子一般包含小非極性(例如Gly)或極性(例如Ser或Thr)胺基酸殘基。胺基酸之小尺寸提供可撓性且容許連接部分(域或組分)移動。併入極性胺基酸可藉由與水分子形成氫鍵維持該連接子於水性環境中之穩定性。

最常用可撓性連接子具有主要包含Ser及Gly殘基之序列(所謂之「GS連接子」)。然而，亦已描述許多其他可撓性連接子(例如，參見Chen等人，2013，同上)，該等可撓性連接子可含有可改善可溶性之另外胺基酸(諸如Thr及/或Ala，及/或Lys及/或Glu)。可使用此項技術中已知並報導之任何可撓性連接子。

GS連接子或更特定言之連接子中之GS (「Gly-Ser」)域之使用可容許藉由改變GS域重複體之數量容易地改變該連接子之長度，且因此此等連接子表示一種合適之連接子類別。然而，可撓性連接子不限於彼等基於「GS」重複體，且包括在Chen等人，同上中，已報導包含分散於整個連接子序列中之Ser及Gly殘基之其他連接子。

在一項實施例中，連接子序列包含至少一個僅包含Ser及Gly殘基之Gly-Ser域。在此實施例中，該連接子可含有不超過15個其他胺基酸殘基，例如不超過14、13、12、11、10、9、8、6、7、5或4個其他胺基酸殘基。 Gly-Ser域可具有下式： (S)q-[(G)m-(S)m]n-(G)p 其中q係0或1；m係1至8之整數；n係至少1 (例如1至8，或更特定言之1至6)之整數；及p係0或1至3之整數。

更特定言之，Gly-Ser域可具有下式： (i) S-[(G)m-S]n； (ii) [(G)m-S]n；或 (iii) [(G)m-S]n-(G)p 其中m係2至8 (例如3至4)之整數；n係至少1 (例如1至8，或更特定言之1至6)之整數；及p係0或1至3之整數。

在一代表性實例中，Gly-Ser域可具有下式： S-[G-G-G-G-S]n 其中n係至少一(較佳1至8，或1至6、1至5、1至4，或1至3)之整數(其中[G-G-G-G-S]係SEQ ID NO: 156)。

GS連接子或更特定言之連接子中之GS(「Gly-Ser」)域之使用可容許藉由改變GS域重複體之數量，容易改變該連接子之長度，且因此此等連接子表示使用之有利類型之連接子。然而，可撓性連接子不限於彼等基於「GS」重複體，且已報導(包括於Chen等人，同上中)包含分散在整個連接子序列中之Ser及Gly殘基之其他連接子。

連接子序列可僅包含一或多個如上文描述或上文定義之Gly-Ser域，或可由其等構成。然而，如上文指示，該連接子序列可包含一或多個Gly-Ser域，及另外胺基酸。該等另外胺基酸可於Gly-Ser域之一端或兩端，或於一段重複之Gly-Ser域之一端或兩端。因此，另外胺基酸(其可為其他胺基酸)可位於連接子序列之一端或兩端，例如其等可側接Gly-Ser域。在其他實施例中，該等另外胺基酸可位於Gly-Ser域之間。例如，兩個Gly-Ser域可側接連接子序列中之一段其他胺基酸。此外，亦如上文指示，在其他連接子中，GS域無需重複，及G及/或S殘基，或短域(諸如GS)可僅沿長度或序列分佈。

下文列舉典型例示性連接子序列： ETSGGGGSRL (SEQ ID NO: 161) SGGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO: 162) S(GGGGS)_1-5 (其中GGGGS係SEQ ID NO: 156) (GGGGS)_1-5 (其中GGGGS係SEQ ID NO: 156) S(GGGS)_1-5 (其中GGGS係SEQ ID NO: 163) (GGGS)_1-5 (其中GGGS係SEQ ID NO: 163) S(GGGGGS)_1-5 (其中GGGGGS係SEQ ID NO: 164) (GGGGGS)_1-5 (其中GGGGGS係SEQ ID NO: 164) S(GGGGGGS)_1-5 (其中GGGGGGS係SEQ ID NO: 165) (GGGGGGS)_1-5 (其中GGGGGGS係SEQ ID NO: 165) G₆ (SEQ ID NO: 159) G₈ (SEQ ID NO: 160) KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 166) EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 167) GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 168) SGGGGSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 169) SGGGLLLLLLLLGGG(SEQ ID NO: 170) SGGGAAAAAAAAGGG(SEQ ID NO: 171) SGGGAAAAAAAAAAAAAAAAGGG(SEQ ID NO: 172) SGALGGLALAGLLLAGLGLGAAG(SEQ ID NO: 173) SLSLSPGGGGGPAR (SEQ ID NO: 174) SLSLSPGGGGGPARSLSLSPGGGGG (SEQ ID NO: 175) GSSGS(SEQ ID NO: 176) GSSSSS(SEQ ID NO: 177) GGSSS(SEQ ID NO: 178) GSSSS(SEQ ID NO: 179) SGGGG(SEQ ID NO: 180)。連接子或鉸鏈可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30個胺基酸或由其等構成，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個甘胺酸殘基。在一最特定實施例中，本文描述之嵌合受體(例如，CAR)包含內域，該內域包含來源於包含JAK3結合域(例如SEQ ID NO 25或26)之IL2Rγ之第一胺基酸序列及來源於包含STAT5聯合基序及JAK1及/或JAK2結合基序(例如SEQ ID NO 23或24)之IL2Rβ之第二胺基酸序列，其中該第一及第二胺基酸序列由連接子或鉸鏈連接或相連。例如，嵌合受體(例如，CAR)可包含內域，該內域包含SEQ ID NO: 25及SEQ ID NO: 23，其中SEQ ID NO 25及23由連接子或鉸鏈連接。典型嵌合受體(例如，CAR)內域序列可包含SEQ ID NO: 54中顯示之序列，或其功能變體或由其等構成。

可用於由本發明之核酸編碼之嵌合受體中之連接子包括： GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO: 155) GGGG(SEQ ID NO: 156) GGGGSGGGG(SEQ ID NO: 157) GGGGSGGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO: 158) GGGGGG (SEQ ID NO: 159) GGGGGGGG (SEQ ID NO: 160) 可使用之其他連接子包括： KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 166) EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 167) GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 168) 如圖15中顯示之例示性構築體包含下列連接子：構築體4 (SEQ ID NO: 186): SEQ ID NO: 155連接子構築體5 (SEQ ID NO: 187): SEQ ID NO: 158連接子構築體6 (SEQ ID NO: 188): SEQ ID NO: 159連接子構築體7 (SEQ ID NO: 189): SEQ ID NO: 160連接子構築體8 (SEQ ID NO: 190): SEQ ID NO: 166連接子構築體9 (SEQ ID NO: 191): SEQ ID NO: 167連接子構築體10 (SEQ ID NO: 192): SEQ ID NO: 168連接子此等連接子中之任一者可用於具有不同內域STAT5及JAK1/2，及JAK3基序序列之其他相似構築體之情境中。此等連接子可(例如)用於包含以下之構築體中：SEQ ID NO.25之JAK3結合基序序列或其變體，任何前述連接子序列，SEQ ID NO: 23之STAT5聯合基序/JAK1及/或JAK2結合基序序列或其變體。

因此，特定言之，由本發明之核酸編碼之嵌合受體(例如，CAR)可包含內域，該內域包含下列域/連接子： JAK3結合基序-SEQ ID NO: 155連接子-STAT5聯合基序/JAK1及/或JAK2結合基序 JAK3結合基序-SEQ ID NO: 158連接子-STAT5聯合基序/JAK1及/或JAK2結合基序 JAK3結合基序-SEQ ID NO: 159連接子-STAT5聯合基序/JAK1及/或JAK2結合基序。

更特定言之，由本發明之核酸編碼之嵌合受體(例如，CAR)可包含內域，該內域包含下列域/連接子： SEQ ID NO: 25 - SEQ ID NO: 155 - SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 25 - SEQ ID NO: 158 - SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 25 - SEQ ID NO: 159 - SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 26 - SEQ ID NO: 155 - SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 26 - SEQ ID NO: 158 - SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 26 - SEQ ID NO: 159 - SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 25 - SEQ ID NO: 155 - SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 - SEQ ID NO: 158 - SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 - SEQ ID NO: 159 - SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 26 - SEQ ID NO: 155 - SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 26 - SEQ ID NO: 158 - SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 26 - SEQ ID NO: 159 - SEQ ID NO: 24 因此，如上文描述，本發明提供包含編碼嵌合受體(例如，嵌合抗原受體(CAR))之多核苷酸序列之核酸分子，其中該嵌合受體(例如CAR)包含內域，該內域包含(i) STAT5聯合基序，及JAK1及/或JAK2結合基序及(ii) JAK3結合基序，其中(i)及(ii)由連接子或鉸鏈連接。進一步提供包含該核酸分子之載體，例如慢病毒或反轉錄病毒載體。

本發明亦提供包含內域之嵌合受體(例如，CAR)，該內域包含(i) STAT5聯合基序，及JAK1及/或JAK2結合基序及(ii) JAK3結合基序，其中(i)及(ii)由連接子或鉸鏈連接。如本文描述，(i)可來源於IL2Rβ，例如SEQ ID NO: 23或24，及(ii)可來源於IL2Rγ (例如SEQ ID NO: 25或26)。

本發明亦提供包含以下之細胞，例如T細胞(尤其Treg細胞)或NK (天然殺手)細胞：編碼嵌合受體(例如，嵌合抗原受體(CAR))之多核苷酸序列，其中該嵌合受體(例如，CAR)包含內域，該內域包含(i) STAT5聯合基序，及JAK1及/或JAK2結合基序及(ii) JAK3結合基序，其中(i)及(ii)由連接子或鉸鏈連接；包含該多核苷酸序列之載體；及/或包含內域之嵌合受體(例如，CAR)，該內域包含(i) STAT5聯合基序，及JAK1及/或JAK2結合基序及(ii) JAK3結合基序，其中(i)及(ii)由連接子或鉸鏈連接，並在療法中使用該細胞(例如T細胞或NK細胞)，尤其用於本文描述之治療用途。本發明亦提供包含該細胞之醫藥組合物。應知曉，NK及Tconv細胞及包含該等細胞之醫藥組合物將亦可治療癌症，例如肺癌、肝癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌及血癌，諸如白血病及淋巴瘤。

本文進一步提供一種用於產生本發明之細胞之方法，該方法包括將編碼嵌合受體(例如，嵌合抗原受體(CAR))之多核苷酸序列引入細胞內，其中該嵌合受體(例如CAR)包含內域，該內域包含(i) STAT5聯合基序，及JAK1及/或JAK2結合基序及(ii) JAK3結合基序，其中(i)及(ii)由連接子或鉸鏈連接。本發明包含可由該方法獲得之細胞。

如本文描述之嵌合受體(例如，CAR)之內域亦可包含轉導效應功能信號並引導細胞(例如，Treg)以在抗原結合時發揮其專門功能必需之基序。細胞內傳訊域之實例包括(但不限於) T細胞受體之ζ鏈內域或其同源物中之任一者(例如，η鏈、FcεR1γ及β鏈、MB1 (Igα)鏈、B29 (Igβ)鏈等)、CD3多肽域(∆、δ及ε)、syk家族酪胺酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪胺酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)及參與T-細胞轉導之其他分子(諸如CD2、CD5及CD28)。該細胞內傳訊域可包含人類CD3 ζ鏈內域、FcyRIII、FcsRI、Fc受體之細胞質尾、攜載細胞質受體之基於免疫受體酪胺酸之活化基序(ITAM)或其組合。

較佳地，細胞內傳訊域包含人類CD3 ζ鏈之細胞內傳訊域。

在一項實施例中，人類CD3 ζ鏈之細胞內傳訊域包含下列序列或由其等構成： UNIPROT：P20963，CD3Z_人類，位置31至143

在一項實施例中，細胞內傳訊域包含與SEQ ID NO: 27具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

嵌合受體(例如，CAR)之細胞內傳訊域可包含下列CD28傳訊域：

在一項實施例中，細胞內傳訊域包含與SEQ ID NO: 28具有至少85、90、95、97、98或99%一致性之傳訊基序。

嵌合受體(例如，CAR)之細胞內傳訊域可包含下列CD27傳訊域：

。在一項實施例中，細胞內傳訊域包含與SEQ ID NO: 29具有至少85、90、95、97、98或99%一致性之傳訊基序。

另外之細胞內傳訊域對熟習此項技術者而言將為顯而易見之且可結合本發明之替代實施例一起使用。

本發明嵌合受體(例如，CAR)可包含化合物內域，其包含T-細胞共刺激分子之細胞內部分與(例如) CD3ζ之細胞內部分之融合物。此化合物內域可稱為第二代嵌合受體(例如，CAR)，其可在抗原識別後同時傳輸活化及共刺激信號。最常用之共刺激域係CD28之共刺激域。此供應最有效之共刺激信號，即免疫邏輯信號2，其觸發T-細胞增殖。該嵌合受體(例如，CAR)內域亦可包含一或多個TNF受體家族傳訊域，諸如OX40、4-1BB、ICOS或TNFRSF25之傳訊域。

OX40、4-1BB、ICOS及TNFRSF25傳訊域之說明性序列係經下文顯示為SEQ ID NO: 30至33。嵌合受體(例如，CAR)內域亦可包含SEQ ID NO: 30至33中之一或多者或SEQ ID NO: 30至33之變體。 OX40傳訊域(SEQ ID NO: 30)：

41BB傳訊域(SEQ ID NO: 31)：

ICOS傳訊域(SEQ ID NO: 32)：

TNFRSF25傳訊域(SEQ ID NO: 33)：

除上文指示之共刺激及傳訊域外，內域可包含其他序列，例如CD8及/或CD28內域之部分。可包括另外序列以促進嵌合受體序列之選殖，例如自編碼序列添加或移除限制裂解位點，並促進嵌合受體或其編碼序列之構築。

嵌合受體(例如，CAR)內域可包含SEQ ID NO: 30至33中之一或多者之變體，該變體與SEQ ID NO: 30至33中任一者具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

適當地，嵌合受體(例如，CAR)內域可包含SEQ ID NO: 45或與SEQ ID NO: 45具有至少85、90、95、97、98或99%一致性之變體或由其等構成。SEQ ID NO: 45 ( 包含 CD28 、 IL2RG-T52 、 IL2RB-Y510 、 CD3 ζ 傳訊域之說明性內域序列 )

適當地，嵌合受體(例如，CAR)內域可包含SEQ ID NO: 53或與SEQ ID NO: 53具有至少85、90、95、97、98或99%一致性之變體或由其等構成。SEQ ID NO: 53 ( 包含 CD28 、 IL2RG-T52 、 IL7RA-2Y 、 CD3 ζ 傳訊域之說明性內域序列 )

適當地，嵌合受體 ( 例如， CAR) 內域可包含 SEQ ID NO:154 或與 SEQ ID NO: 154 具有至少 85 、 90 、 95 、 97 、 98 或 99% 一致性之變體或由其等構成。 SEQ ID NO: 154 ( 包含 CD28 、 IL2RG-T52 、連接子、 IL2RB-Y510 、 CD3 ζ 傳訊域之說明性內域序列 )

其他說明性內域包括內域，該等內域包含CD28細胞內域(包括CD28共刺激域或由其構成)、SEQ ID NO: 25之JAK3結合基序域IL2RG-T52序列、連接子序列、SEQ ID NO.23之STAT5聯合基序/JAK1及/或JAK2結合基序域序列及CD3 ζ傳訊域。此等內域序列包含在(例如)如圖15中繪示及下文實例10中描述之構築體CIV-CX中。

圖15/實例10之構築體CIV至CX中任一者之內域可基於根據本發明之任何態樣之嵌合受體使用。因此，該內域可包含如SEQ ID NO: 198至204中分別顯示之構築體CIV至CX中任一者之內域序列，或與SEQ ID NO: 198至204中任一者具有至少85、90、95、97、98或99%一致性之變體，或由其等構成。此等內域及其可能之修飾係於下文實例10中進一步討論。

任何此內域可與CD8 TM及/或鉸鏈域(例如上文指示之CD8 TM及/或鉸鏈域)組合於嵌合受體中。

變體、衍生物及片段 除本文提及之特定蛋白質、肽及核苷酸外，本發明亦包含其衍生物及片段之用途。

本文中可互換使用之關於本發明之蛋白質或多肽之術語「衍生物」或「變體」包括來自該序列或對該序列之任何取代、變化、修飾、替換、刪除及/或添加一個(或更多個)胺基酸殘基，條件為所得蛋白質或多肽仍保留所需功能，例如，其中該衍生物或變體係抗原結合域，該所需功能可為抗原結合域結合其靶抗原之能力，或其中該衍生物或變體係傳訊域，該所需功能可為該域傳訊之能力(例如活化或不活化下游分子)。例如，相較於相應參考序列，變體或衍生物可具有至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%，或至少90%功能。如相較於相應參考序列，該變體或衍生物可具有相似或相同之功能水平，或可具有增加之功能水平(例如增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。

通常，胺基酸取代可例如自1、2或3至10或20個取代，條件為經修飾之序列仍保留所需活性或能力。胺基酸取代可包括使用非天然生成之類似物。例如，相較於相應參考序列，變體或衍生物可具有至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%，或至少90%活性或能力。如相較於相應參考序列，該變體或衍生物可具有相似或相同水平之活性或能力，或可具有增加之活性或能力水平(例如增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。

本發明中使用之蛋白質或肽亦可具有胺基酸殘基之刪除、插入或取代，其等產生沉默變化及導致功能上等效之蛋白質。只要保留內源性功能，則經審慎考慮之胺基酸取代可基於殘基極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩親性質之相似性進行。例如，帶負電之胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸；帶正電之胺基酸包括離胺酸及精胺酸；及具有相似親水性值之不帶電之極性頭基之胺基酸包括天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及酪胺酸。

保守取代可(例如)根據下表進行。第二列之相同嵌段中且較佳第三列之相同行中之胺基酸可彼此取代：

脂族	非極性	G A P
		I L V
	極性-不帶電	C S T M
		N Q
	極性-帶電	D E
		K R H
芳族		F W Y

衍生物可為同源物。如本文使用之術語「同源物」意謂與野生型胺基酸序列及野生型核苷酸序列具有一定同源性之實體。術語「同源性」可與「一致性」視為等效。

同源或變體序列可包括可與主體序列具有至少50%、55%、65%、75%、85%或90%一致性，較佳具有至少95%或97%或99%一致性之胺基酸序列。通常，該等同源物將包含與該主體胺基酸序列相同之活性位點等。儘管亦可根據相似性考慮同源性(即具有相似化學性質/功能之胺基酸殘基)，但在本發明之內文中，較佳根據序列一致性表現同源性。

同源性比較可由眼，更通常，在可容易獲得之序列比較程式之幫助下進行。此等可購買獲得之電腦程式可計算兩個或更多個序列之間之同源性或一致性百分率。

同源性百分率可在連續序列上計算，即一個序列與其他序列比對，且一個序列中之各胺基酸與另一序列中之相應胺基酸直接比較，一次比較一個殘基。此稱為「無空位」比對。通常，此等無空位比對僅在相對較短數量之殘基上進行。

儘管此為非常簡單且一致之方法，但其未考慮，例如，在另外同一對序列中，核苷酸序列中之一個插入或刪除可引起後續密碼子比對失敗，因此可能導致當進行全域比對時，同源性百分率將極大降低。因此，大多數序列比較方法係經設計以產生最佳化比對，該等比對考慮可能之插入及刪除而不過度懲罰整體同源性分數。此藉由在序列比對中插入「空位」以嘗試最大化局部同源性達成。

然而，此等更複雜之方法將「空位罰值」分配至比對中出現之各空位，使得針對相同數量之相同胺基酸，以盡可能少之空位進行序列比對，反映兩個比較序列之間更高之相關性，此將達成比具有許多空位者更高之分數。通常使用「仿射空位成本」，其等針對空位之存在收取相對較高之成本，並針對該空位中之各後續殘基進行較小懲罰。此為最常用之空位評分系統。當然，高空位罰值將以更少之空位產生最佳化比對。大多數比對程式容許修飾空位罰值。然而，當使用此軟體進行序列比較時，較佳使用默認值。例如當使用GCG Wisconsin Bestfit軟體包時，胺基酸序列之默認空位罰值針對空位係-12，且針對各延伸位係-4。

因此，最大同源性百分率之間計算首先需在考慮空位罰值之情況下，產生最佳化比對。適用於進行此比對之電腦程式係GCG Wisconsin Bestfit軟體包(University of Wisconsin, U.S.A.；Devereux等人，(1984) Nucleic Acids Res. 12: 387)。可進行序列比較之其他軟體之實例包括(但不限於) BLAST軟體包(參見Ausubel等人，(1999)同上，第18章)、FASTA (Atschul等人，(1990) J. Mol. Biol. 403-410)及比較工具之GENEWORKS套組。BLAST及FASTA兩者均可用於脫機及在線搜索(參見Ausubel等人，(1999)同上，第7至58至7至60頁)。然而，針對一些應用，較佳使用GCG Bestfit程式。稱為BLAST 2序列之另一工具亦可用於比較蛋白質及核苷酸序列(參見FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8)。

儘管可根據一致性來量測最終之同源性百分率，但比對過程本身通常非基於全有或全無對比較。相反，一般使用縮放之相似性分數矩陣，該矩陣基於化學相似性或進化距離為各成對比較分配分數。常用之此矩陣之一實例係BLOSUM62矩陣-BLAST程式套件之默認矩陣。GCG Wisconsin程式一般使用公共默認值或自定義符號比較表(若提供) (參見用戶手冊以獲取更多細節)。針對一些應用，較佳使用GCG包之公共默認值，或在其他軟體之情況下，使用默認矩陣，諸如BLOSUM62。適當地，在整個參考及/或查詢序列中確定一致性百分率。

軟體一經產生最佳比對，則可能計算同源性百分率，較佳序列一致性百分率。該軟體通常將此作為序列比較之部分進行，並產生數值結果。

「片段」通常係指功能上受關注之多肽或多核苷酸之選定區域。因此，「片段」係指作為全長多肽或多核苷酸之一部分之胺基酸或核酸序列。

此等變體、衍生物及片段可使用標準重組DNA技術(諸如定點誘變)製備。在進行插入之情況下，可製備編碼插入之合成DNA及與插入位點任一側之天然生成之序列相對應之5'及3'側翼區域。該等側翼區域將含有與天然生成之序列中之位點相對應之便利限制位點，使得可用適當之酶切割該序列，並將合成DNA連接至該切割內。然後根據本發明表現DNA以製備編碼之蛋白質。此等方法僅說明此項技術中已知用於操作DNA序列之許多標準技術，且亦可使用其他已知技術。

跨膜域 嵌合受體(例如，CAR)亦可包含跨膜域。該跨膜域可包含來自具有跨膜域之任何蛋白質之跨膜序列，該等蛋白質包括I型、II型或III型跨膜蛋白中之任一者。嵌合受體(例如，CAR)之跨膜域亦可包含人造疏水性序列。可選擇嵌合受體(例如，CAR)之跨膜域以便於未二聚化。熟習此項技術者將顯而易見另外之跨膜域。嵌合受體(例如，CAR)構築體中使用之跨膜(TM)區之實例係：1) CD28 TM區(Pule等人，Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41；Brentjens等人，CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35；Casucci等人，Blood, 2013, Nov 14;122(20):3461-72.)；2) OX40 TM區(Pule等人，Mol Ther, 2005, Nov；12(5):933-41)；3) 41BB TM區(Brentjens等人，CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35)；4) CD3 ζ TM區(Pule等人，Mol Ther, 2005, Nov;12(5):933-41; Savoldo B, Blood, 2009, Jun 18;113(25):6392-402.)；5) CD8a TM區(Maher等人，Nat Biotechnol, 2002, Jan;20(1):70-5.; Imai C, Leukemia, 2004, Apr;18(4):676-84；Brentjens等人，CCR, 2007, Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35；Milone等人，Mol Ther, 2009, Aug;17(8):1453-64.)。

在一替代實施例中，可選擇跨膜域以包含二聚化域，視需要容許嵌合受體二聚化。例示性二聚化域揭示於WO2019/169290中，該案以引用之方式併入本文中。

適當地，跨膜域可包含如SEQ ID NO: 35顯示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 35具有至少80%一致性之變體。

SEQ ID NO: 35 ： CD28 跨膜

適當地，變體可與SEQ ID NO: 35具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

適當地，嵌合受體(例如，CAR)可包含CD8α跨膜域。適當地，該跨膜域可包含如SEQ ID NO: 87顯示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 87具有至少80%一致性之變體。

說明性CD8α TM域(AA 183至203) (SEQ ID NO: 87)：

替代CD8 TM域序列顯示於SEQ ID NO: 195中。

適當地，跨膜域可包含如SEQ ID NO: 195顯示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 195具有至少80%一致性之變體。

適當地，變體可與SEQ ID NO: 87或SEQ ID NO: 195具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

適當地，嵌合受體(例如，CAR)可包含CD28鉸鏈及跨膜序列。適當地，該鉸鏈及跨膜域可包含如SEQ ID NO: 36顯示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 36具有至少80%一致性之變體。

SEQ ID NO: 36 - CD28 跨膜

適當地，變體可與SEQ ID NO: 36具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

在一項實施例中，跨膜及細胞內傳訊域兩者均來源於CD28。在一項實施例中，該跨膜及細胞內傳訊域包含下文序列：人類CD28之跨膜及細胞內部分(UNIPROT：P10747，CD28_人類，位置153至220)

在一項實施例中，跨膜及細胞內傳訊域包含與SEQ ID NO: 37具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

在一項實施例中，CD28之跨膜域包含序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 38)。

如先前討論，跨膜域可包含來自IL2Rβ或IL2Rγ之跨膜區之一部分或所有。

適當地，嵌合受體(例如，CAR)可編碼標籤，諸如c-Myc標籤(EQKLISEEDL，SEQ ID NO: 39)。適當地，可將該標籤併入嵌合受體(例如，CAR)之細胞外域，例如該細胞外域之鉸鏈區內。具有整合之c-Myc標籤之說明性CD28鉸鏈/跨膜域顯示為SEQ ID NO: 40。

適當地，嵌合受體(例如，CAR)可包含CD8α鉸鏈域，及/或CD8α跨膜域。此外，嵌合受體(例如，CAR)可包含CD8α鉸鏈域及CD28跨膜域。適當地，該鉸鏈及跨膜域可包含如SEQ ID NO: 88顯示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 88具有至少80%一致性之變體。說明性CD8α鉸鏈域及CD28跨膜域(SEQ ID NO: 88)： TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV 適當地，變體可與SEQ ID NO: 88具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。 CD8α鉸鏈-TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 181)

CD8α 鉸鏈 ( 亦稱為 CD8 細胞外域 )

在一些實施例中，嵌合受體(例如CAR)可包含CD8，尤其CD8α，鉸鏈序列。鉸鏈域可包含如SEQ ID NO: 181或194中顯示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 181或194具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 181或194具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

適當地，嵌合受體(例如，CAR)可包含CD28鉸鏈域及CD8α跨膜域。適當地，該鉸鏈及跨膜域可包含如SEQ ID NO: 89顯示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 89具有至少80%一致性之變體。

說明性CD28鉸鏈域及CD8α跨膜域(SEQ ID NO: 89)：

適當地，變體可與SEQ ID NO: 89具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

嵌合受體(例如，CAR)可進一步包含將其靶向內質網途徑以在細胞表面上表現之前導序列。說明性前導序列為MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 41)。此係人類CD8前導序列。

本發明中使用之說明性CAR顯示為SEQ ID NO: 42至44。

SEQ ID NO: 42 (含有HLA-A2 scFv、c-Myc標籤、CD28、IL2RB-Y510、CD3 ζ內域之CAR)

SEQ ID NO: 43 (含有HLA-A2 scFv、c-Myc標籤、CD28、IL2RG-T52、IL2RB-Y510、CD3 ζ內域之CAR)

SEQ ID NO: 44 (含有HLA-A2 scFv、c-Myc標籤、CD28、IL2RG-T52、IL7RA-2Y、CD3 ζ內域之CAR)

CAR可包含與SEQ ID NO: 42至44中任一者具有至少85、90、95、97、98或99%一致性之序列。

嵌合抗原受體(CAR) 如本文使用之「嵌合抗原受體」或「CAR」或「CARs」係指可賦予細胞(例如Treg)抗原特異性之經工程化受體。CAR亦稱為人造T細胞受體、嵌合T細胞受體或嵌合免疫受體。較佳地，如本文定義之CAR包含細胞外抗原特異性靶向區、跨膜域、視需要一或多個共刺激域，及細胞內傳訊域(亦稱為內域)。

編碼CAR之多核苷酸可使用(例如)反轉錄病毒載體轉移至Treg。以此方式，可產生大量抗原特異性T細胞用於過繼性細胞轉移。當該CAR結合靶抗原時，此導致將活化信號傳輸至表現該活化信號之Treg。因此，該CAR引導經工程化Treg對表現該經靶向抗原之細胞之特異性。

抗原特異性靶向域 抗原特異性靶向域為CAR提供結合受關注之預定抗原之能力。該抗原特異性靶向域較佳靶向臨床上受關注之抗原。

抗原特異性靶向域可為具有特異性識別並結合至生物分子(例如，細胞表面受體或其組分)之能力之任何蛋白質或肽。該抗原特異性靶向域包括受關注之生物分子之任何天然生成、合成、半合成或重組產生之結合配偶體。說明性抗原特異性靶向域包括抗體或抗體片段或衍生物、受體之細胞外域、細胞表面分子/受體之配體，或其受體結合域，及腫瘤結合蛋白。儘管如下文討論，但該抗原特異性靶向域可較佳係抗體或來源於抗體，包含其他抗原特異性靶向域，例如自抗原肽/MHC或HLA組合形成之抗原特異性靶向域，其可結合至於移植、發炎或疾病之位點處具有活性之Tcon細胞之TCR。此等抗原結合域已報導(例如)於Mekala等人，Blood, 2005，第105卷，第2090至2092頁中。

在一較佳實施例中，抗原特異性靶向域係抗體，或來源於抗體。來源於抗體之靶向域可為抗體之片段或該抗體之一或多個片段之經基因工程化產品，該片段參與結合抗原。實例包括可變區(Fv)、互補決定區(CDR)、Fab、單鏈抗體(scFv)、重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)駱駝化抗體(VHH)及單域抗體(sAb)。

在一較佳實施例中，結合域係單鏈抗體(scFv)。該scFv可為鼠科、人類或人類化scFv。

關於抗體或其抗原結合片段之「互補決定區」或「CDR」係指抗體之重鏈或輕鏈之可變區中之高度可變環。CDR可與抗原構形相互作用並在很大程度上決定對該抗原之結合(儘管已知一些框架區參與結合)。該重鏈可變區及該輕鏈可變區各含有3個CDR。「重鏈可變區」或「VH」係指抗體之重鏈之片段，其含有三個CDR摻入於稱為框架區之側翼延伸之間，該等框架區比CDR更高度保守，並形成支架以支持該CDR。「輕鏈可變區」或「VL」係指抗體之輕鏈之片段，其含有三個CDR插入框架區之間。

「Fv」係指攜載完整抗原結合位點之抗體之最小片段。Fv片段由單一輕鏈之可變區結合至單一重鏈之可變區構成。「單鏈Fv抗體」或「scFv」係指由直接或經由肽連接子序列彼此連接之輕鏈可變區及重鏈可變區構成之工程化抗體。

特異性結合預定抗原之抗體可使用此項技術中熟知之方法製備。此等方法包括噬菌體顯示、用於產生人類或人類化抗體之方法，或使用經工程化以產生人類抗體之轉基因動物或植物之方法。部分或完全合成之抗體之噬菌體顯示庫可用且可經篩選用於可結合至靶分子之抗體或其片段。人類抗體之噬菌體顯示庫亦可用。一經鑑別，即可分離及/或確定編碼抗體之胺基酸序列或多核苷酸序列。

可由本發明之CAR靶向之抗原包括(但不限於)在與移植器官、自體免疫性疾病、過敏疾病及發炎性疾病(例如神經退化疾病)相關聯之細胞上表現之抗原。熟習此項技術者將瞭解由於Treg細胞之旁觀者效應，因此抗原可僅於移植、發炎或疾病之位點處存在及/或表現。

在與神經退化疾病相關聯之細胞上表現之抗原包括彼等呈現於神經膠質細胞(例如MOG)上者。

與器官移植相關聯之抗原及/或與移植器官相關聯之細胞包括(但不限於)存在於移植器官中但不存在於病患中之HLA抗原，或在移植排斥期間表現上調之抗原，諸如CCL19、MMP9、SLC1A3、MMP7、HMMR、TOP2A、GPNMB、PLA2G7、CXCL9、FABP5、GBP2、CD74、CXCL10、UBD、CD27、CD48、CXCL11。

以實例說明之，CAR可包含可結合HLA-A2 (本文中亦可將HLA-A2稱為HLA-A*02、HLA-A02及HLA-A*2)之抗原結合域。HLA-A*02係於HLA-A基因座處之一種特定I類主要組織相容性複合體(MHC)對偶基因組。

抗原識別域可結合(適當地特異性結合)HLA-A2內之一或多個區域或抗原決定基。抗原決定基(亦稱為抗原決定位)係由抗原識別域(例如抗體)識別之抗原之部分。換而言之，該抗原決定基係抗體結合之抗原之特定片段。適當地，該抗原識別域結合至(適當地特異性結合至)HLA-A2內之一個區域或抗原決定基。

抗原識別域可包含至少一個CDR (例如CDR3)，其可自結合至抗原(較佳HLA-A2 (或此經預測之CDR之變體(例如具有一、二或三個胺基酸取代之變體)))之抗體預測。應知曉含有三個或更少CDR區(例如單一CDR或甚至其一部分)之分子可保留衍生該CDR之抗體之抗原結合活性。含有兩個CDR區之分子在此項技術中描述為可結合至靶抗原，例如以微抗體之形式(Vaughan及Sollazzo, 2001, Combinational Chemistry & High Throughput Screening, 4, 417-430)。已描述含有單一CDR之分子，其等可顯示對標靶之強結合活性(Nicaise等人，2004, Protein Science, 13: 1882-91)。

在此方面中，抗原識別域可包含一或多個可變重鏈CDR，例如一、二或三個可變重鏈CDR。或者或另外，該抗原識別域可包含一或多個可變輕鏈CDR，例如一、二或三個可變輕鏈CDR。該抗原識別域可包含三個重鏈CDR及/或三個輕鏈CDR (且更特定言之包含三個CDR之重鏈可變區及/或包含三個CDR之輕鏈可變區)，其中至少一個CDR (較佳所有CDR)可來自結合至抗原(較佳HLA-A2)之抗體，或可選自下文提供之CDR序列中之一者。

抗原識別域可包含可變重鏈及輕鏈CDR之任何組合，例如一個可變重鏈CDR連同一個可變輕鏈CDR一起、兩個可變重鏈CDR連同一個可變輕鏈CDR一起、兩個可變重鏈CDR連同兩個可變輕鏈CDR一起、三個可變重鏈CDR連同一或兩個可變輕鏈CDR一起、一個可變重鏈CDR連同兩個或三個可變輕鏈CDR一起，或三個可變重鏈CDR連同三個可變輕鏈CDR一起。較佳地，該抗原識別域包含三個可變重鏈CDR (CDR1、CDR2及CDR3)或三個可變輕鏈CDR (CDR1、CDR2及CDR3)。

抗原識別域內存在之一或多個CDR可非全部來自相同抗體，只要該域具有上文描述之結合活性即可。因此，一個CDR可自結合至抗原(例如HLA-A2)之抗體之重鏈或輕鏈預測，而存在之另一CDR可自結合至相同抗原(例如HLA-A2)之不同抗體預測。在此情況下，CDR3可較佳自結合至抗原(例如HLA-A2)之抗體預測。然而，尤其當該抗原識別域中存在多於一個CDR時，該等CDR較佳自結合至相同抗原(例如HLA-A2)之抗體預測。CDR之組合可自不同抗體，尤其結合至相同所需區域或抗原決定基之抗體使用。

在一特別佳之實施例中，抗原識別域包含三個自結合至抗原(例如HLA-A2)之抗體之可變重鏈序列預測之CDR及/或三個自結合至抗原(例如HLA-A2)之抗體 (較佳相同抗體)之可變輕鏈序列預測之CDR。

在一些實施例中，抗原識別域係抗體，或來源於抗體(例如係Fab、scFv或sdAb)，其中該抗體包含一或多個選自SEQ ID NO: 90至146之CDR區，或其衍生物。換而言之，在一些實施例中，該抗原識別域包含一或多個選自SEQ ID NO: 90至146之CDR區，或其衍生物。適當地，該抗原識別域包含三個選自SEQ ID NO: 90至146之CDR區，或其衍生物。

名稱	CDR1	CDR2	CDR3
GL VH CDR (SEQ ID NO: 90至92)	DYGMH (SEQ ID NO:90)	FIRNDGSDKYYADSVKG (SEQ ID NO:91)	NGESGPLDYWYFDL (SEQ ID NO:92)
3PB2 VH CDR (SEQ ID NO: 93至95)	DYGMH (SEQ ID NO:93)	FIRNDGSDKYYADSVKG (SEQ ID NO:94)	NGESGPLDYWYLDL (SEQ ID NO:95)
3PC4 VH CDR (SEQ ID NO: 96至98)	DYGMH (SEQ ID NO:96)	FIRNDGSDKYYADSVRG (SEQ ID NO:97)	NGESGPLDYWYFDL (SEQ ID NO:98)
3PF12 VH CDR (SEQ ID NO: 99至101)	DYGMH (SEQ ID NO:99)	FIRNDGSDKYYADSVKG (SEQ ID NO:100)	NGESGPLDYWYFDL (SEQ ID NO:101)
GL VL CDR (SEQ ID NO: 102至104)	QASQDISNYLN (SEQ ID NO:102)	DASNLET (SEQ ID NO:103)	QQYDNLPPT (SEQ ID NO:104)
3PB2 VL CDR (SEQ ID NO: 105至107)	QSSLDISHYLN (SEQ ID NO:105)	DASNLET (SEQ ID NO:106)	QQYDNLPLT (SEQ ID NO:107)
3PC4 VL CDR (SEQ ID NO: 108至110)	RASHGINNYLA (SEQ ID NO:108)	AASTLQS (SEQ ID NO:109)	QQYDSYPPT (SEQ ID NO:110)
3PF12 VL CDR (SEQ ID NO: 111至113)	QASQDISNYLN (SEQ ID NO:111)	DASNLET (SEQ ID NO:112)	QQYSSFPLT (SEQ ID NO:113)
C12 VL CDR (SEQ ID NO: 114至116)	QASQDISNYLN (SEQ ID NO:114)	DETHLDS (SEQ ID NO:115)	QQYDSLPPT (SEQ ID NO:116)
E7 VL CDR (SEQ ID NO: 117至119)	QASQDISNYLN (SEQ ID NO:117)	DASNLET (SEQ ID NO:118)	QQYDNLPIT (SEQ ID NO:119)
H10 VL CDR (SEQ ID NO: 120至122)	QASQDISNYLN (SEQ ID NO:120)	DASNLET (SEQ ID NO:121)	QQYDNLPST (SEQ ID NO:122)
B8 VL CDR (SEQ ID NO: 123至125)	QASQDISNYLN (SEQ ID NO:123)	DASNLET (SEQ ID NO:124)	QQYNTYPLT (SEQ ID NO:125)
D2 VL CDR (SEQ ID NO: 126至128)	QASQDISNYLN (SEQ ID NO:126)	DASNLET (SEQ ID NO:127)	QQYHTYPLT (SEQ ID NO:128)
B10 VL CDR (SEQ ID NO: 129至131)	QASQDISNYLN (SEQ ID NO:129)	DASNLET (SEQ ID NO:130)	QQYDNLPLT (SEQ ID NO:131)
2A9 VL CDR (SEQ ID NO: 132至134)	RTSQGISSALA (SEQ ID NO:132)	DASSLES (SEQ ID NO:133)	QQFNNYPLT (SEQ ID NO:134)
3B12 VL CDR (SEQ ID NO: 135至137)	QASQDISNYLA (SEQ ID NO:135)	AASNLQS (SEQ ID NO:136)	LQDSSYPPT (SEQ ID NO:137)
2D4 VL CDR (SEQ ID NO: 138至140)	RASQSISSWLA (SEQ ID NO:138)	KASNLQS (SEQ ID NO:139)	QQYSNYPLT (SEQ ID NO:140)
3D4 VL CDR (SEQ ID NO: 141至143)	RASHGISNYFA (SEQ ID NO:141)	ATSTLQS (SEQ ID NO:142)	QQYSSYPLT (SEQ ID NO:143)
B3 VL CDR (SEQ ID NO: 144至146)	RASRGSNYLA (SEQ ID NO:144)	ATSTLQS (SEQ ID NO:145)	QQYDSYPPT (SEQ ID NO:146)

較佳地，抗原結合域包含選自相同可變鏈之CDR (CDR1、CDR2及CDR3)，或其衍生物。例如，該抗原結合域可包含SEQ ID NO: 90至92、SEQ ID NO: 93至95、SEQ ID NO: 96至98、SEQ ID NO: 99至101、SEQ ID NO: 102至104、SEQ ID NO: 105至107、SEQ ID NO: 108至110、SEQ ID NO: 111至113、SEQ ID NO: 114至116、SEQ ID NO: 117至119、SEQ ID NO: 120至122、SEQ ID NO: 123至125、SEQ ID NO: 126至128、SEQ ID NO: 129至131、SEQ ID NO: 132至134、SEQ ID NO: 135至137、SEQ ID NO: 138至140、SEQ ID NO: 141至143，及/或SEQ ID NO: 144至146，或其衍生物。

在較佳實施例中，抗原識別域包含一種如下之組合可變重及可變輕CDR： (i) SEQ ID NO: 90至92及SEQ ID NO: 102至104，或其衍生物； (ii) SEQ ID NO: 93至95及SEQ ID NO: 105至107，或其衍生物； (iii) SEQ ID NO: 96至98及SEQ ID NO: 108至110，或其衍生物； (iv) SEQ ID NO: 99至101及SEQ ID NO: 111至113，或其衍生物； (v) SEQ ID NO: 99至101及SEQ ID NO: 114至116，或其衍生物； (vi) SEQ ID NO: 99至101及SEQ ID NO: 117至119，或其衍生物； (vii) SEQ ID NO: 99至101及SEQ ID NO: 120至122，或其衍生物； (viii) SEQ ID NO: 99至101及SEQ ID NO: 123至125，或其衍生物； (ix) SEQ ID NO: 99至101及SEQ ID NO: 126至128，或其衍生物； (x) SEQ ID NO: 99至101及SEQ ID NO: 129至131，或其衍生物； (xi) SEQ ID NO: 99至101及SEQ ID NO: 132至134，或其衍生物； (xii) SEQ ID NO: 99至101及SEQ ID NO: 135至137，或其衍生物； (xiii) SEQ ID NO: 99至101及SEQ ID NO: 138至140，或其衍生物； (xiv) SEQ ID NO: 99至101及SEQ ID NO: 141至143，或其衍生物； (xv) SEQ ID NO: 99至101及SEQ ID NO: 144至146，或其衍生物；較佳地，該抗原識別域包含SEQ ID NO: 93至95及SEQ ID NO: 105至107，或其衍生物。

抗原結合域可包含選自SEQ ID NO: 54、55、56或57之可變重域或與SEQ ID NO: 54、55、56或57具有至少80%一致性之變體。該變體可與SEQ ID NO: 54、55、56或57具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。SEQ ID NO: 54

SEQ ID NO: 55

SEQ ID NO: 56

SEQ ID NO: 57

抗原結合域可包含選自SEQ ID NO: 58至72之可變輕域或與SEQ ID NO: 58至72具有至少80%一致性之變體。該變體可與SEQ ID NO: 58至72具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。SEQ ID NO: 58

SEQ ID NO: 59

SEQ ID NO: 60

SEQ ID NO: 61

SEQ ID NO: 62

SEQ ID NO: 63

SEQ ID NO: 64

SEQ ID NO: 65

SEQ ID NO: 66

SEQ ID NO: 67

SEQ ID NO: 68

SEQ ID NO: 69

SEQ ID NO: 70

SEQ ID NO: 71

SEQ ID NO: 72

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 34，或73至86或與SEQ ID NO: 34，或73至86具有至少80%一致性且可結合至HLA-A2之變體。該變體可與SEQ ID NO: 34，或73至86具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。SEQ ID NO: 73

SEQ ID NO: 34

SEQ ID NO: 74

SEQ ID NO: 75

SEQ ID NO: 76

SEQ ID NO: 77

SEQ ID NO: 78

SEQ ID NO: 79

SEQ ID NO: 80

SEQ ID NO: 81

SEQ ID NO: 82

SEQ ID NO: 83

SEQ ID NO: 84

SEQ ID NO: 85

SEQ ID NO: 86

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 73，或與SEQ ID NO: 73具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 73具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 34，或與SEQ ID NO: 34具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 34具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 74，或與SEQ ID NO: 74具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 74具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 75，或與SEQ ID NO: 75具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 75具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 76，或與SEQ ID NO: 76具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 76具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 77，或與SEQ ID NO: 77具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 77具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 78，或與SEQ ID NO: 78具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 78具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 79，或與SEQ ID NO: 79具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 79具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 80，或與SEQ ID NO: 80具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 80具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 81，或與SEQ ID NO: 81具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 81具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 82，或與SEQ ID NO: 82具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 82具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 83，或與SEQ ID NO: 83具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 83具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 84，或與SEQ ID NO: 84具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 84具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 85，或與SEQ ID NO: 85具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 85具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

抗原結合域可包含SEQ ID NO: 86，或與SEQ ID NO: 86具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 86具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。

在另一實施例中，抗原結合域可包含SEQ ID NO:196或與SEQ ID NO: 196具有至少80%一致性之變體。適當地，該變體可與SEQ ID NO: 196具有至少85、90、95、97、98或99%一致性。SEQ ID NO: 196係在下文實例10中構築體CIV至CIX中使用之scFv序列。 SEQ ID NO: 196

醫藥組合物本文亦提供一種醫藥組合物，其包含本發明之經工程化細胞(例如，Treg)。

醫藥組合物係包含治療有效量之醫藥活性劑，即細胞(例如，T細胞(Treg))或由其構成之組合物。該醫藥組合物較佳包括醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑(包括其組合)。針對治療用途可接受之載劑或稀釋劑為醫藥領域中熟知，且描述(例如)於Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro編，1985)中。醫藥載劑、賦形劑或稀釋劑之選擇可關於預期投與途徑及標準醫藥實務選擇。該等醫藥組合物可包含諸如以下或除以下外：載劑、賦形劑或稀釋劑、任何合適之黏合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑或增溶劑。

「醫藥上可接受」包括無菌且無熱原之調配物。該載劑、稀釋劑及/或賦形劑在可與Treg相容之意義上必須為「可接受」且對其受體無害。通常，該等載劑、稀釋劑及賦形劑將為無菌且無熱原之生理鹽水或輸注介質，然而，可使用其他可接受之載劑、稀釋劑及賦形劑。

醫藥上可接受之載劑之實例包括(例如)水、鹽溶液、醇、聚矽氧、蠟、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂質體、糖、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、表面活性劑、矽酸、黏性石蠟、芳香油、脂肪酸甘油單酸酯及甘油二酸酯、石化脂肪酸酯、羥甲基-纖維素、聚乙烯吡咯啶酮，及類似物。

根據本發明之細胞(例如，Treg)或醫藥組合物可以適用於治療及/或預防本文描述之疾病之方式投與。投與之量及頻率將由諸如以下之因素決定：個體之狀況，及個體之疾病之類型及嚴重性，然而適當之劑量可由臨床試驗確定。因此，可調配該醫藥組合物。

如本文描述之細胞(例如，Treg)或醫藥組合物可非經腸(例如，靜脈內)投與，或其等可藉由輸注技術投與。該細胞(例如，Treg)或醫藥組合物可以無菌水溶液之形式投與，該溶液可含有其他物質，例如，足夠之鹽或葡萄糖以使得該溶液與血液等滲。適當地，可將該水溶液緩衝(較佳緩衝至3至9之pH)。因此，可調配該醫藥組合物。在無菌條件下製備合適之非經腸調配物係由熟習此項技術者熟知之標準醫藥技術容易達成。

醫藥組合物可包含本發明之細胞(例如，Treg)於輸注介質(例如無菌等滲溶液)中。該醫藥組合物可封閉於由玻璃或塑膠製成之安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。

細胞(例如，Treg)或醫藥組合物可以單劑量或多劑量投與。特定言之，該細胞(例如，Treg)或醫藥組合物可以單一、一次性劑量投與。因此，可調配該醫藥組合物。

醫藥組合物可進一步包含一或多種活性劑。

醫藥組合物可進一步包含一或多種其他治療劑，諸如淋巴消耗劑(例如胸腺球蛋白、坎帕斯-1H (campath-1H)、抗CD2抗體、抗CD3抗體、抗CD20抗體、環磷醯胺、氟達拉濱)、mTOR之抑制劑(例如西羅莫司(sirolimus)、依維莫司(everolimus))、藥物抑制之共刺激途徑(例如抗CD40/CD40L、CTAL4Ig)，及/或藥物抑制之特定細胞介素(IL-6、IL-17、TNFα、IL18)。

取決於待治療之疾病及個體，及投與途徑，細胞(例如，Treg)或醫藥組合物可以不同劑量(例如以細胞/kg或細胞/個體量測)投與。在任何事件中，醫師均將決定最適用於任何個別個體之實際劑量，且該劑量將隨特定個體之年齡、重量及反應而變化。通常，然而，對於本發明之細胞(例如，Treg)，每個個體可投與5x10⁷ 至3x10⁹ 個細胞，或10⁸ 至2x10⁹ 個細胞之劑量。

細胞(例如，Treg)可經適當修飾以用於醫藥組合物中。例如，細胞(例如，Treg)可經冷凍保存及在適當之時間下解凍，然後輸注至個體內。

本發明進一步包括使用包含本發明之細胞(例如，Treg)及/或醫藥組合物之套組。較佳地，該等套組用於如本文描述之方法(例如，如本文描述之治療方法)及用途中。較佳地，該等套組包含使用套組組件之說明書。

治療方法本發明提供一種用於誘導對移植物之耐受性；治療及/或預防細胞及/或體液移植排斥；治療及/或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫或過敏疾病；或用於促進組織修復及/或組織再生；或用於改善發炎(例如，代謝失調繼發之慢性發炎)之方法，其包括向個體投與本發明之經工程化細胞(例如，Treg)或醫藥組合物之步驟。

如本文使用，「誘導對移植物之耐受性」係指在受體中誘導對移植器官之耐受性。換而言之，誘導對移植物之耐受性意謂降低受體對供體移植器官之免疫反應之程度。誘導對移植器官之耐受性可減少移植接受體所需之免疫抑制藥物之量，或可停止免疫抑制藥物。

例如，可向患有疾病之個體投與經工程化細胞(例如，Treg)以減輕、減少或改善疾病之至少一種症狀，諸如黃疸、尿赤、瘙癢、腹部腫脹或壓痛、疲勞、噁心或嘔吐，及/或食慾不振。該至少一種症狀可減輕、減少或改善至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%，或該至少一種症狀可完全緩解。

可向患有疾病之個體投與經工程化細胞(例如，Treg)以減緩、減少或阻斷該疾病之進展。相較於未投與經工程化細胞(例如，Treg)之個體，該疾病之進展可減緩、減少或阻斷至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%，或該疾病之進展可完全停止。

在一項實施例中，個體係經受免疫抑制療法之移植接受體。

適當地，個體係哺乳動物。適當地，該個體係人類。

移植可選自肝、腎、心臟、肺、胰臟、腸、胃、骨髓、血管化複合組織移植物，及皮膚移植。

適當地，CAR可包含可特異性結合至存在於移植物(移植)供體中但不存在於移植物(移植)受體中之HLA抗原之抗原結合域。

適當地，移植係肝移植。在其中該移植係肝移植之實施例中，抗原可為存在於移植肝中但不存在於病患中之HLA抗原，肝特異性抗原(諸如NTCP)，或在排斥期間表現上調之抗原，諸如CCL19、MMP9、SLC1A3、MMP7、HMMR、TOP2A、GPNMB、PLA2G7、CXCL9、FABP5、GBP2、CD74、CXCL10、UBD、CD27、CD48、CXCL11。

適當地，抗原可為HLA-A2。

本發明進一步提供一種用於治療及/或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫或過敏疾病；或用於促進組織修復及/或組織再生；或用於改善發炎(例如，代謝失調繼發之慢性發炎)之方法。

一種用於治療疾病之方法係關於本發明之細胞之治療用途。在此方面中，可向患有現有疾病或病症之個體投與該等細胞以減輕、減少或改善至少一種與該疾病相關聯之症狀及/或減緩、減少或阻斷該疾病之進展。

適當地，治療及/或預防細胞及/或體液移植排斥可係指投與有效量之本發明之細胞(例如Treg)，使得移植接受體所需之免疫抑制藥物質量減少，或可停止免疫抑制藥物。

預防疾病係關於本發明之細胞之預防用途。在此方面中，可向尚未感染疾病及/或未顯示疾病之任何症狀之個體投與該等細胞以預防該疾病或減少或防止與該疾病相關聯之至少一種症狀發展。該個體可易患該疾病，或認為其處於發展該疾病之風險下。

自體免疫或過敏疾病可選自發炎性皮膚病，包括牛皮癬及皮膚炎(例如異位性皮膚炎)；與發炎性腸病相關聯之反應(諸如克羅恩氏病(Crohn’s disease)及潰瘍性結腸炎)；皮膚炎；過敏性病症，諸如食物過敏、濕疹及哮喘；類風濕性關節炎；全身性紅斑狼瘡(SLE) (包括狼瘡性腎炎、皮膚狼瘡)；糖尿病(例如1型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病)；多發性硬化症；神經退化疾病，例如，肌萎縮性側索硬化(ALS)；慢性發炎性脫髓鞘性多發性神經病(CIPD)及幼發型糖尿病。特定言之，該自體免疫病症係I型糖尿病。

適當地，本發明之治療方法可包括以下步驟：向個體投與根據本發明之經工程化細胞(例如Treg)，或藉由根據本發明之方法可獲得(例如獲得)之經工程化細胞，或如本文定義之核酸分子/多核苷酸或載體(例如於如上文描述之醫藥組合物中)。

適當地，用於治療及/或預防疾病之本發明方法可包括向個體投與根據本發明之細胞(例如經工程化Treg) (例如於如上文描述之醫藥組合物中)。

該方法可涉及以下步驟： (i)分離含有細胞之樣本或提供含有細胞之樣本； (ii)將如本文定義之核酸分子或載體引入該細胞；及 (iii)向個體投與來自(ii)之細胞。

適當地，細胞係如本文定義之Treg。

適當地，富含Treg之群體可在方法之步驟(ii)之前及/或之後，自含有樣本之細胞分離及/或產生。

例如，分離及/或產生可在步驟(ii)之前及/或之後進行以分離及/或產生富含Treg之樣本。富集可在步驟(ii)之後進行，以富集包含如本文描述之嵌合受體(例如，CAR)、多核苷酸及/或載體之細胞及/或Treg。

適當地，該核酸分子或載體可藉由轉導引入。適當地，該核酸分子或載體可藉由轉染引入。

適當地，細胞可為自體。適當地，該細胞可為同種異體。

適當地，細胞(例如經工程化Treg)可與一或多種其他治療劑諸如淋巴消耗劑(例如胸腺球蛋白、坎帕斯-1H、抗CD2抗體、抗CD3抗體、抗CD20抗體、環磷醯胺、氟達拉濱)、mTOR之抑制劑(例如西羅莫司、依維莫司)、藥物抑制之共刺激途徑(例如抗CD40/CD40L、CTAL4Ig)，及/或藥物抑制之特定細胞介素(IL-6、IL-17、TNFα、IL18)組合投與。經工程化Treg可與一或多種其他治療劑同時或循序(即之前或之後)投與。

適當地，個體係哺乳動物。適當地，該個體係人類。

Treg可在引入編碼如本文描述之CAR之核酸分子之前或之後，例如藉由使用抗CD3單株抗體或抗CD3及抗CD28單株抗體兩者治療加以活化及/或擴增。

Treg亦可在抗CD3及抗CD28單株抗體與IL-2之組合之存在下擴增。適當地，IL-2可用IL-15取代。可用於Treg擴增方案中之其他組分包括(但不限於)雷帕黴素、全反式維甲酸(ATRA)及TGFβ。

如本文使用，「活化」意謂Treg或Treg群體已經刺激，使得該(等)Treg增殖。如本文使用，「擴增」意謂已誘導Treg或Treg群體增殖。Treg群體之擴增可(例如)藉由計數群體中存在之Treg之數量量測。該等Treg之表型可藉由此項技術中已知之方法(諸如流式細胞分析技術)確定。

Treg可在方法之各步驟之後，特定言之在擴增之後加以清洗。

根據本發明之經工程化Treg細胞之群體可藉由熟習此項技術者已知之任何方法，例如藉由FACS或磁珠分選進一步富集。

產生方法之步驟可在密閉及無菌細胞培養系統中進行。

核酸分子/多核苷酸如本文定義之核酸分子及多核苷酸可包含DNA或RNA。其等可為單股或雙股。熟習此項技術者應瞭解由於遺傳密碼之簡併性，許多不同之核酸分子/多核苷酸可編碼相同之多肽。另外，應瞭解熟習此項技術者可使用例行性技術製造不影響由如本文定義之核酸分子/多核苷酸編碼之多肽序列之核苷酸取代，以反映其中待表現本發明之多肽之任何特定宿主生物體之密碼子用法。

核酸分子/多核苷酸可藉由此項技術中可用之任何方法修飾。可進行此等修飾以增強如本文定義之核酸分子/多核苷酸之活體內活性或壽命。

核酸分子/多核苷酸(諸如DNA核酸分子/多核苷酸)可重組、合成或藉由熟習此項技術者可用之任何方式產生。其等亦可藉由標準技術選殖。

較長之核酸分子/多核苷酸一般使用重組方法，例如使用聚合酶鏈反應(PCR)選殖技術產生。此將涉及製造一對側翼具有期望選殖之靶序列之引子(例如約15至30個核苷酸)，使該等引子與自動物或人類細胞獲得之mRNA或cDNA接觸，在引起所需區域擴增之條件下進行聚合酶鏈反應，分離經擴增之片段(例如藉由用瓊脂糖凝膠純化反應混合物)並回收經擴增之DNA。該等引子可經設計以含有合適之限制酶識別位點，使得可將經擴增之DNA選殖至合適之載體內。

本發明核酸分子/多核苷酸可進一步包含編碼可選擇標誌物之核酸序列。適當地，可選擇標誌物為此項技術中熟知且包括(但不限於)螢光蛋白(諸如GFP)。適當地，該可選擇標誌物可為螢光蛋白，例如GFP、YFP、RFP、tdTomato、dsRed，或其變體。在一些實施例中，該螢光蛋白係GFP或GFP變體。編碼可選擇標誌物之核酸序列可與以核酸構築體之形式編碼本發明之嵌合受體(例如，CAR)之核酸序列組合提供。此核酸構築體可提供於載體中。

適當地，可選擇標誌物/報告域可為基於螢光素酶之報告子、PET報告子(例如碘化鈉轉運體(NIS))，或膜蛋白(例如CD34、低親和力神經生長因子受體(LNGFR))。

編碼如本文描述之不同多肽例如嵌合受體(例如，CAR)及FOXP3 (及/或另外或或者，一或多個可選擇標誌物)之核酸序列可由一或多個共表現位點分離，該等位點可使各多肽作為離散實體表現。合適之共表現位點為此項技術中已知且包括(例如)內部核醣體進入位點(IRES)及自裂解肽。特定言之，編碼FOXP3之第一多核苷酸序列及編碼嵌合受體(例如，CAR)之第二多核苷酸序列可由編碼自裂解肽之共表現位點分離。

其他合適之共表現位點/序列包括自裂解或裂解域。此等序列可在蛋白質產生期間自動裂解或可由細胞中存在之常見酶裂解。因此，多肽序列中內含此等自裂解或裂解域使得第一及第二多肽表現為單一多肽，其接著裂解以提供離散、分離之功能多肽。

自裂解序列容許多肽作為分離，或離散之組分表現及/或產生。此意謂，儘管由單一核酸分子編碼多肽，但通過在轉譯期間或之後於經編碼之裂解位點處「裂解」，其等作為各別多肽表現或產生，且因此在細胞中在蛋白質產生方法結束時，其等作為各別實體，或各別多肽鏈存在於細胞中。特定言之，自裂解肽序列包括2A及2A樣肽。儘管描述為「自裂解」，但據信此等肽藉由容許核糖體跳躍發揮作用，使得於2A序列之C末端處未形成(跳躍)肽鍵，導致該2A序列及其下游之下一多肽之分離。因此，如本文使用之術語「裂解」包括肽鍵形成之跳躍。

合適之自裂解或裂解域包括(但不限於)彼等如SEQ ID NO: 46至51顯示者。 (SEQ ID NO: 46) P2A肽-裂解域：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 47) T2A肽-裂解域：GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 48) E2A肽-裂解域：GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 49) F2A肽-裂解域：GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 50)弗林蛋白酶位點-裂解域：RXXR (優先：RRKR - SEQ ID NO: 51) 上文2A序列可經修飾以於N末端處移除三個胺基酸GSG。因此，作為選擇亦包括對應於SEQ ID NO: 46至49但無N末端GSG之序列。

在一實施例中，無N末端GSG之SEQ ID NO: 46之P2A自裂解肽可用於SEQ ID NO: 197 IDGSG之弗林蛋白酶裂解位點之情境中。

使用可選擇標誌物係有利之，因為其容許使用常用方法(例如流式細胞分析技術)自起始細胞群體選擇並分離其中已成功引入本發明之多核苷酸或載體(使得經編碼之嵌合受體(例如，CAR)係經表現)之細胞(例如Treg)。

密碼子最佳化本發明中使用之核酸分子/多核苷酸可經密碼子最佳化。密碼子最佳化先前已描述於WO 1999/41397及WO 2001/79518中。不同細胞在其等使用特定密碼子時有所不同。此密碼子偏向對應於細胞類型中特定tRNA之相對豐度之偏向。藉由改變序列中之密碼子，使得其等適合匹配相應tRNA之相對豐度，可能增加表現。出於同樣之原因，可能藉由故意選擇已知在特定細胞類型中罕見之相應tRNA之密碼子減少表現。因此，可用另外程度之轉譯控制。

啟動子如本文描述之第一多核苷酸序列及第二多核苷酸序列可操作地連接至相同啟動子。「啟動子」係導致基因之轉錄開始之DNA區域。啟動子位於基因之轉錄開始位點附近，DNA上游(朝向正義鏈之5’區)。可使用任何合適之啟動子，熟習此項技術者可容易作出該啟動子之選擇。特定啟動子包括EF(或其功能截短)、SSFV、PGK及CMV。「可操作地連接至相同啟動子」意謂多核苷酸序列之轉錄可自相同啟動子開始(例如第一及第二多核苷酸序列之轉錄係自相同啟動子開始)，且將該等多核苷酸序列定位並定向用於自該啟動子開始轉錄。可操作地連接至啟動子之多核苷酸係在該啟動子之轉錄調節下。

載體載體係容許或促進將實體自一種環境轉移至另一環境之工具。根據本發明，及以實例說明之，重組核酸技術中使用之一些載體容許將實體諸如核酸片段(例如異源性DNA片段，諸如異源性cDNA片段)轉移至靶細胞內。載體可為非病毒或病毒。用於重組核酸技術中之載體之實例包括(但不限於)質體、mRNA分子(例如經活體外轉錄之mRNA)、染色體、人造染色體及病毒。該載體亦可(例如)為裸核酸(例如DNA)。以其最簡單形式，該載體本身可為受關注之核苷酸。

本發明中使用之載體可(例如)為質體、mRNA或病毒載體且可包括啟動子(如上文描述)用於表現核酸分子/多核苷酸及視需要該啟動子之調節劑。

載體可進一步包含另外啟動子，例如，在一項實施例中，該啟動子可為LTR，例如，反轉錄病毒LTR或慢病毒LTR。長末端重複(LTR)係DNA之相同序列，發現該等序列於藉由反轉錄病毒RNA之反轉錄形成之反轉錄轉座子或前病毒DNA之末端處重複數百或數千次。病毒使用載體以將其等遺傳物質插入宿主基因體內。在LTR中發現基因表現之信號：強化子、啟動子(可具有轉錄強化子或調節元件兩者)、轉錄起始(諸如封端)、轉錄終止子及聚腺苷酸化信號。

適當地，本發明之載體可包括5’LTR及3’LTR。

本發明之載體可包含一或多個可在轉錄前或轉錄後發揮作用之另外調節序列。「調節序列」係促進多肽之表現，例如發揮作用以增加轉錄本之表現或增強mRNA穩定性之任何序列。合適之調節序列包括(例如)強化子元件、轉錄後調節元件及聚腺苷酸化位點。適當地，該等另外調節序列可存在於該(等)LTR中。

適當地，載體可包含(例如)可操作地連接至啟動子之土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)。

包含本發明之核酸分子/多核苷酸之載體可使用此項技術中已知之各種技術(諸如轉化及轉導)引入細胞內。數種技術為此項技術中已知，例如經重組病毒載體(諸如反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、桿狀病毒及單純皰疹病毒載體)感染；直接注射核酸及基因槍轉化。

非病毒遞送系統包括(但不限於) DNA轉染方法。此處，轉染包括一種使用非病毒載體將基因遞送至靶細胞之方法。非病毒遞送系統可包括脂質體或兩親性細胞穿透肽，較佳與本發明之多核苷酸複合。

典型之轉染方法包括電穿孔、DNA基因槍、脂質介導之轉染、緊密DNA介導之轉染、脂質體、免疫脂質體、脂質體、陽離子劑介導之轉染、陽離子表面兩親分子(CFA) (Nat. Biotechnol. (1996) 14: 556)及其組合。

可使用例如編碼如本文定義之不同CAR或編碼如本文定義之CAR及另一多肽之多種載體用於轉導/轉染。

製造細胞之方法本發明之經工程化細胞(例如，Treg)可藉由許多方式中之一者(包括用病毒載體轉導，及用DNA或RNA轉染)引入如本文定義之核酸分子或載體產生。

本發明之細胞可藉由以下製得：將如本文定義之核酸分子/多核苷酸或載體(例如藉由轉導或轉染)引入細胞內。

適當地，細胞可來自分離自個體之樣本。

本發明之經工程化細胞(例如，Treg)可藉由一種包括下列步驟之方法產生： (i)自個體分離含有細胞之樣本或提供含有細胞之樣本；及 (ii)用如本文定義之多核苷酸、核酸或載體轉導或轉染含有細胞之樣本，以提供經工程化細胞之群體。

適當地，富含Treg之樣本可在方法之步驟(ii)之前及/或之後，自含有細胞之樣本分離、富集及/或產生。例如，Treg之分離、富集及/或產生可在步驟(ii)之前及/或之後進行，以分離、富集或產生富含Treg之樣本。自含有細胞之樣本分離及/或富集可在步驟(ii)之後進行，以富集包含如本文描述之嵌合受體(例如，CAR)、核酸分子/多核苷酸，及/或載體之細胞及/或Treg。

富含Treg之樣本可藉由熟習此項技術者已知之任何方法，例如藉由FACS及/或磁珠分選分離或富集。富含Treg之樣本可藉由熟習此項技術者已知之任何方法自含有細胞之樣本產生，例如藉由引入編碼FOXP3之DNA或RNA自Tcon細胞產生及/或自可誘導祖細胞或胚胎祖細胞之離體分化產生。

適當地，細胞係如本文定義之Treg。

適當地，本發明之經工程化Treg可藉由一種包括下列步驟之方法產生： (i)自個體分離富含Treg之樣本或提供富含Treg之樣本；及 (ii)用如本文定義之多核苷酸、核酸或載體轉導或轉染富含Treg之樣本，以提供根據本發明之經工程化Treg細胞之群體。

本發明不受本文揭示之例示性方法及材料限制，且與彼等本文描述者類似或等效之任何方法及材料可用於本發明之實施例之實踐或測試中。數值範圍包括定義該範圍之數字。除非另有指示，否則任何核酸序列係由左至右以5'至3'方向書寫；胺基酸序列係分別由左至右以胺基至羧基方向書寫。

在提供一定範圍值之情況下，應瞭解除非內文另有明確指示，否則亦明確揭示在該範圍之上限值與下限值之間之各中間值，至該下限值之單位之十分之一。規定範圍中任何規定值或中間值之間之各較小範圍及該規定範圍中之任何其他規定值或中間值均包含於本發明內。該範圍中可獨立地包括或排除此等較小範圍之上限值及下限值，且較小範圍中包括任一、無或兩個臨限值之各範圍亦包含於本發明內，受限於規定範圍中任何經明確排除之臨限值。在規定範圍包括臨限值中之一者或兩者之情況下，排除彼等包括之臨限值中之任一者或兩者之範圍亦包括於本發明中。

必須注意，除非內文另有明確規定，否則如本文及隨附申請專利範圍中使用，單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數個參考物。

如本文使用之術語「包含(comprising、comprises及comprised of)」與「包括(including、includes)或含有(containing、contains)」同義，且為包含性或開放性，且不排除另外、未列舉之成員、元件或方法步驟。術語「包含(comprising、comprises及comprised of)」亦包括術語「由…構成」。

僅在本發明申請案之申請日期之前提供本文討論之公開案用於其等揭示。本文中之任何內容均不應解釋為承認此等公開案構成該案隨附申請專利範圍之先前技術。

聲明 1. 一種核酸，其包含(i)編碼FOXP3之第一多核苷酸序列及(ii)編碼嵌合受體(例如嵌合抗原受體(CAR))之第二多核苷酸序列，其中該嵌合受體(例如，CAR)包含內域，該內域包含STAT5聯合基序、JAK1及/或JAK2結合基序及JAK3結合基序，其中該第一及第二多核苷酸序列可操作地連接至相同啟動子。

2. 如條款1之核酸，其中該嵌合受體(例如，CAR)內域包含兩個或更多個STAT5聯合基序。

3. 如條款1或2之核酸，其中一或多個STAT5聯合基序係來自介白素受體(IL)受體內域。

4. 如條款1至3中任一項之核酸，其中該一或多個STAT5聯合基序係來自IL2Rβ、IL7Rα、IL-3Rβ (CSF2RB)、IL-9R、IL-17Rβ、紅血球生成素受體、血小板生成素受體、生長激素受體及泌乳素受體。

5. 如條款1至4中任一項之核酸分子，其中該STAT5聯合基序包含胺基酸基序YXXF/L (SEQ ID NO: 8)；其中X係任何胺基酸。

6. 如條款1至5中任一項之核酸分子，其中該STAT5聯合基序包含胺基酸基序YCTF (SEQ ID NO: 9)、YFFF (SEQ ID NO: 10)、YLSL (SEQ ID NO: 11)，及/或YLSLQ (SEQ ID NO: 12)中之一或多者。

7. 如條款6之核酸分子，其中該STAT5聯合基序包含胺基酸基序YLSLQ (SEQ ID NO: 12)。

8. 如條款7之核酸分子，其中該內域含有包含胺基酸基序YLSLQ (SEQ ID NO: 12)之第一STAT5聯合基序及包含胺基酸基序YCTF (SEQ ID NO: 9)或YFFF (SEQ ID NO: 10)之第二STAT5聯合基序。

9. 如條款8之核酸分子，其中該內域包含下列STAT5聯合基序：YLSLQ (SEQ ID NO: 12)、YCTF (SEQ ID NO: 9)及YFFF (SEQ ID NO: 10)。

10. 如條款1至9中任一項之核酸分子，其中該JAK結合基序係JAK1結合基序。

11. 如條款10之核酸分子，其中該JAK1結合基序係來自介白素受體(IL)受體內域。

12. 如條款1至11中任一項之核酸分子，其中該JAK1結合基序包含如SEQ ID NO: 13至19中任一者顯示之胺基酸基序，或與SEQ ID NO: 13至19具有至少80%一致性之變體。

13. 如條款12之核酸分子，其中該JAK1結合基序係如SEQ ID NO: 13顯示之胺基酸基序；或與SEQ ID NO: 13具有至少80%一致性之變體。

14. 如條款1至13中任一項之核酸分子，其中該CAR內域包含如SEQ ID NO: 1顯示之IL2Rβ內域；或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列一致性之變體。

15. 如條款1至14中任一項之核酸分子，其中該嵌合受體(例如，CAR)內域包含如SEQ ID NO: 23或24中任一者顯示之經截短IL2Rβ內域；或與其具有至少80%序列一致性之SEQ ID NO: 23或24之變體。

16. 如條款1至15中任一項之核酸分子，其中該JAK3結合基序包含SEQ ID NO: 25或26或與SEQ ID NO: 25或26具有至少80%序列一致性之變體。

17. 如條款1至16中任一項之核酸分子，其中該嵌合受體(例如，CAR)內域包含SEQ ID NO: 45、53或154；或與SEQ ID NO: 45、53或154具有至少80%序列一致性之變體。

18. 如條款1至17中任一項之核酸分子，其中該JAK3結合基序位於嵌合受體(例如，CAR)內域中STAT5聯合基序及JAK1及/或JAK2結合基序之N末端。

19. 如條款1至18中任一項之核酸分子，其中該JAK3結合基序係通過連接子或鉸鏈連接至STAT5聯合基序及JAK1及/或JAK2結合基序。

20. 如條款1至19中任一項之核酸分子，其中該核酸分子包含在該第一與該第二多核苷酸之間之共表現位點。

21. 一種載體，其包含如條款1至20中任一項之核酸分子。

22. 一種經工程化Treg細胞，其包含如條款1至20中任一項之核酸分子或如條款21之載體。

23. 一種醫藥組合物，其包含如條款22之經工程化Treg細胞。

24. 如條款22之經工程化Treg細胞或如條款23之醫藥組合物，其用於療法中。

25. 如條款22之經工程化Treg細胞，其用於誘導對移植物之耐受性；治療及/或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫或過敏疾病；用於促進組織修復及/或組織再生；或用於改善代謝失調繼發之慢性發炎。

26. 如條款23之醫藥組合物，其用於誘導對移植物之耐受性；治療及/或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫或過敏疾病；用於促進組織修復及/或組織再生；或用於改善代謝失調繼發之慢性發炎。

27. 一種誘導對移植物之耐受性；治療及/或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫或過敏疾病；或用於促進組織修復及/或組織再生；或用於改善代謝失調繼發之慢性炎症之方法，其包括以下步驟：向個體投與如條款22中任一項定義之經工程化Treg或如條款23中定義之包含經工程化Treg之醫藥組合物。

28. 如條款27之方法，其包括下列步驟： (i)自個體分離或提供富含Treg之細胞樣本； (ii)用以下轉導或轉染該等Treg細胞：如條款1至20中任一項之核酸分子；或如條款21之載體；及 (iii)向該個體投與來自(ii)之Treg細胞。

29. 一種如條款22中定義之經工程化Treg之用途，其用於製造用於誘導對移植物之耐受性；治療及/或預防細胞及/或體液移植排斥；治療及/或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫或過敏疾病；或用於促進組織修復及/或組織再生；或用於改善代謝失調繼發之慢性炎症之藥劑。

30. 如條款24至26中任一項使用之經工程化Treg或醫藥組合物；如條款27或28之方法；或如條款29之用途，其中該個體係經免疫抑制療法之移植接受體。

31. 如條款30使用之經工程化Treg或醫藥組合物；如條款30之方法；或如條款30之用途，其中該移植係選自肝、腎、心臟、肺、胰臟、腸、胃、骨髓、血管化複合組織移植物，及皮膚移植。

32. 如條款31使用之經工程化Treg或醫藥組合物；如條款31之方法；或如條款31之用途，其中該移植係肝移植。

33. 如條款32使用之經工程化Treg或醫藥組合物；如條款32之方法或如條款32之用途，其中該CAR包含可特異性結合至選自以下之抗原之抗原結合域：存在於移植肝中但不存在於受體中之HLA抗原、肝特異性抗原(諸如NTCP)，或在排斥或組織發炎期間表現上調之抗原，諸如CCL19、MMP9、SLC1A3、MMP7、HMMR、TOP2A、GPNMB、PLA2G7、CXCL9、FABP5、GBP2、CD74、CXCL10、UBD、CD27、CD48、CXCL11。

34. 如條款33使用之經工程化Treg或醫藥組合物；如條款33之方法或用途，其中該CAR包含可特異性結合至存在於移植物供體中但不存在於移植物受體中之HLA抗原之抗原結合域。

35. 如條款34使用之經工程化Treg或醫藥組合物；如條款34之方法或用途，其中該抗原係HLA-A2。

36. 如條款35使用之經工程化Treg或醫藥組合物；如條款35之方法或用途，其中該CAR含有包含SEQ ID NO: 34或與其具有至少80%一致性之SEQ ID NO: 34之變體之抗原結合域。

37. 如條款24至36使用之經工程化Treg或醫藥組合物；如條款24至36之方法或用途，其中該自體免疫或過敏疾病係選自發炎性皮膚病，包括牛皮癬及皮膚炎(例如異位性皮膚炎)；與發炎性腸病相關聯之反應(諸如克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎)；皮膚炎；過敏性病症，諸如食物過敏、濕疹及哮喘；類風濕性關節炎；全身性紅斑狼瘡(SLE) (包括狼瘡性腎炎、皮膚狼瘡)；糖尿病(例如1型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病)；CIPD、多發性硬化症、神經退化疾病(例如ALS)及幼發型糖尿病。

38. 一種產生經工程化Treg之方法，其包括下列步驟： (i)自個體分離含有細胞之樣本或提供含有細胞之樣本；及 (ii)用一或多個包含以下之核酸分子轉導或轉染含有細胞之樣本：(i)編碼FOXP3之第一多核苷酸序列及(ii)編碼嵌合受體(例如，嵌合抗原受體(CAR))之第二多核苷酸序列，其中該嵌合受體(例如，CAR)包含內域，該內域包含STAT5聯合基序、JAK1及/或JAK2結合基序及JAK3結合基序，或用一或多個包含該(等)核酸分子之載體轉導或轉染該含有細胞之樣本，以提供經工程化細胞之群體；其中該含有細胞之樣本包含Treg及/或在步驟(ii)之前或之後，自該含有細胞之樣本富集及/或產生Treg。

現將藉助於實例進一步描述本發明，該等實例意欲發揮作用以幫助一般技術者進行本發明且無意以任何方式限制本發明之範圍。

實例實例 1 ：抗 HLA.A2 IL2R CAR-Treg 之產生 用抗CD3/CD28珠分離並活化C D4+CD25hiCD127low細胞。活化後三天，用含有HLA.A2-CAR (顯示於圖2中)及GFP報告基因之慢病毒轉導Treg。多株活化後，總Treg之細胞擴增顯示未轉導或轉導之Treg之間無顯著差異(圖3)。

實例 2 ：抗 HLA.A2 IL2R 構築體經時轉導效率之定量 在細胞活化之後，於不同時間點處，對未轉導及經CAR構築體轉導之Treg分析GFP表現。

分析GFP+細胞之頻率以評估不同構築體在Treg擴增期間之轉導效率及表現持久性。含有dCAR、CD28z、構築體1、2及3之Treg在轉導之後顯示類似之表現頻率。在多株細胞擴增期間維持GFP+細胞在整個Treg中之百分率(圖4)。

實例 3 ：抗 HLA.A2 IL2R CAR 構築體於轉導之 Treg 上之細胞表面表現之定量 藉由結合PE之HLA-A*0201/CINGVCWTV 右聚體 (Immudex, Copenhagen, Denmark)分析CAR構築體於未轉導及轉導之Treg上之膜表現。在細胞表面表現CAR蛋白之Treg (HLA-A2右聚體+)之頻率在所有構築體之間類似(圖5)。

實例 4 ： CAR Treg 在多株細胞擴增之後之表型表徵 在抗CD3/CD28活化珠及IL-2之存在下，將Treg培養並擴增15天。藉由FACS分析未轉導及轉導之Treg上之Treg相關標誌物FOXP3、HELIOS、CTLA4及TIGIT以在培養之第15天評定表型譜系穩定性。

未轉導及經CAR轉導顯示在多株擴增之後，與Treg譜係及功能相關聯之蛋白質之類似表現含量(圖6)。

實例 5 ：抗 HLA.A2 IL2R CAR Treg 之抗原 - 特異性之評估 在不同刺激物之存在下，將未轉導及轉導之Treg培養18小時。分析CD69及CD137活化標誌物以評定特異性及非特異性細胞活化。

基於T細胞活化標誌物之表現，經CD28z、構築體1、2及3 CAR轉導之Treg針對HLA-A2分子顯示相似特異性。CD69及CD137之表現在不活化細胞上或在用表現HLA-A1之細胞培養之後未增加。由於缺乏傳訊內域，因此dCAR構築體未顯示活化(圖7)。

實例 6 ：作為 IL2R CAR 傳訊之指標之 STAT5 磷酸化分析 在無IL2之培養基中將轉導之CAR Treg靜置過夜。藉由FACS分析，在用培養基單獨，1000 IU/ml IL-2或在基於HLA.A2-Ig之人造APC之存在下培養10及120分鐘之後，評定Treg之STAT5磷酸化(遵循DOI: 10.3791/2801下描述之方案產生)。

將IL2R內域整合至CAR構築體內顯示在由HLA-A2分子活化CAR之後，STAT5之高效磷酸化。在用HLA-A2珠培養之後，在無IL2R內域之CAR-Treg上，未偵測到pSTAT5之顯著增加(圖8)。

實例 7 ：在缺乏 IL-2 之情況下，在非特異性及 HLA.A2 特異性活化之後， Treg 存活之評估 用抗CD3/28活化珠及K562.A2表現細胞，在缺乏IL-2之情況下，培養具有不同構築體之經CAR轉導之Treg。在活化後7天藉由FACS分析評定細胞存活。

在用HLA-A2表現細胞進行細胞培養之後，相較於參考CD28z，表現含有IL2R內域之CAR構築體之Treg顯示增加之細胞存活率。在Treg之多株活化之後，未觀察到此等差異，證實該效應依賴於CAR傳訊(圖9)。

實例 8 ： Treg 抑制效能測試：藉由分析 B 細胞上之共刺激分子之調節，評估 Treg 之免疫調節功能 在用Treg共培養之後，分析CD80及CD86之B細胞表現以評估Treg減少共刺激分子於抗原呈遞細胞上之表現之能力。

相較於未轉導或表現dCAR之Treg，表現CD28z、構築體1及構築體2 CAR之Treg顯示增加之抑制功能。B細胞上之CD80及CD86表現僅在用通過CAR分子傳訊之Treg培養之後下調(圖10)。

實例 9 ：經編碼 FOXP3 及 HLA-A2 特異性 CAR 之構築體轉導之 Treg 以比僅具 有內源性 FOXP3 之 Treg 顯著更高之 程度 表現兩種基因及表現 FOXP3 藉由CD4+及CD25+富集，自PBMC分離Treg。經富集之細胞針對CD4、CD25、CD127及CD45RA染色並藉由FACS分選。

用四種構築體中之一者轉導經富集之Treg。圖11A顯示使用之構築體之示意圖，構築體F-C：闡述編碼5’-FOXP3-P2A-A2 CAR-3’之構築體；構築體R-C：闡述編碼5’-R-P2A-A2 CAR-3’之構築體，其中R係另一基因；構築體C：闡述僅編碼A2 CAR之構築體；構築體C-R：闡述編碼5’-A2 CAR-P2A-R-3’之構築體，其中R係另一基因。

圖11B顯示轉導方法之示意圖。

使用下列方案擴增經富集及轉導之細胞：第0天，在具有Gibco™ Dynabeads™人類T-活化劑CD3/CD28之TexMACS™中，每ml 0.25x10⁶ 第2天，在TexMACS™中在具有IL-2及病毒之塗佈重組人纖維連接蛋白之盤中，每ml 0.1x10⁶ 第4至9天，在具有IL-2之TexMACS™中在T25燒瓶/6孔盤中，重懸浮至每ml 0.25x10⁶ 第15天，在具有IL-2之TexMACS™中在T25燒瓶中，重懸浮至每ml 0.25x10⁶ 圖12顯示如藉由流式細胞分析技術測定，相較於模擬對照Treg，在經構築體F-C、構築體R-C、構築體C及構築體C-R轉導之Treg中，HLA-A2特異性CAR (A2 CAR)表現含量、FOXP3表現含量及另一基因R之表現含量。

圖12A顯示在經各構築體轉導之Treg表現HLA-A2特異性CAR。該HLA-A2特異性CAR係自其中CAR係下游(構築體R-C)及當該CAR係上游(構築體C-R)時之兩種構築體表現。

圖12B顯示FOXP3表現於所有Treg中，但在構築體F-C中顯著更高，特別當相較於單獨HLA-A2特異性CAR (構築體C)之表現時。

實例 9B ：經編碼 FOXP3 及 HLA-A2 特異性 CAR 之構築體轉導之 Treg 保留 FOXP3 表現圖13顯示如藉由流式細胞分析技術測定，相較於模擬對照Treg，在經構築體F-C、構築體R-C、構築體C及構築體C-R轉導之延長擴增之Treg中，HLA-A2特異性CAR (A2 CAR)表現含量、FOXP3表現含量及另一基因R之表現含量。

圖13A顯示經各構築體轉導之Treg在延長擴增之後仍表現HLA-A2特異性CAR。

圖13B顯示在延長擴增之後，在經構築體R-C、構築體C及構築體C-R轉導之Treg中，FOXP3表現減少。相反，在延長擴增之後，在經Treg轉導之構築體F-C中，FOXP3表現未減少。因此，在延長擴增之後，在構築體F-C中，FOXP3表現大體上更高，特別當相較於單獨HLA-A2特異性CAR (構築體C)之表現時。

實例 10 製造如圖15中闡述之構築體，並如下文描述分離、轉導及活化Treg細胞。對照構築體及構築體CI至CX具有SEQ ID NO: 182至192中分別闡述之序列。應注意，構築體CI-CX在本文中亦可互換稱為構築體1至10，或Con1至Con10。

構築體CI至CX及對照構築體均包含相同之細胞外域，包括細胞外鉸鏈域，及相同之跨膜域。該細胞外域包含SEQ ID NO: 41之hCD8前導序列、SEQ ID NO: 196之抗HLA.A2 scFv序列，及SEQ ID NO: 194之CD8鉸鏈序列。該跨膜域係SEQ ID NO: 195之CD8跨膜域。該等構築體亦均包含CD28共刺激域(包含SEQ ID NO: 28之單個胺基酸加成(次末端A，將其引入以促進選殖))及CD3 ζ傳訊域(如SEQ ID NO: 27中闡述)。構築體之區別在於存在IL2Rβ經截短域(IL2RBY510；SEQ ID NO: 23)及/或IL2Rγ經截短域(ILR2GT52；SEQ ID NO: 25)及ILR2B與ILR2G域之間之連接子序列。

下文呈現構築體CII之序列(SEQ ID NO: 184)：

自N末端開始，此構築體之構成部分可如下標識：前導序列以小寫字母表示；scFv以普通字母表示，及VH與VL之間的scFv連接子序列以淺色字體表示；插入序列加底線；CD8鉸鏈域以粗體表示；CD8 TM域以斜體表示；CD8及CD28細胞內域部分以小寫字母表示；CD28共刺激域以斜體表示(在次末端位置處併入以小楷字母顯示之另外胺基酸A)；ILR2GT52加底線；添加之胺基酸LE以小楷字母顯示；ILRBY510以粗體顯示；以添加之胺基酸CT以小楷字母顯示；CD3 ζ以普通字母表示。添加以小楷字母表示之胺基酸以容許選殖。

構築體CII係一種比較構築體，其包含經截短IL2Rγ (IL2RGT52)及經截短IL2Rβ (IL2RBY510)域，其中該等域彼此直接連接，而其間無連接子序列。

構築體CI及CIII亦為比較構築體。CI與CII之區別在於缺少ILR2GT52及另外胺基酸LE。構築體CIII與CII之區別在於缺乏ILR2RBY510及另外胺基酸CT。

如圖15中繪示，構築體IV至CX表示本發明之構築體，且與CII之區別在於IL2RGT52及ILR2RBY510末端添加之胺基酸「le」之間存在連接子序列，分別對應於SEQ ID NOS: 155、158、159、160、166、167及168之連接子序列。

對照構築體與CII之區別在於缺乏ILR2GT52及另外胺基酸LE，且缺乏ILR2RBY510及另外胺基酸CT。

儘管作為本文之實例呈現，但此等構築體之細胞內內域之設計具有更一般之適用性，且可更廣泛地用於設計及製備根據本發明之其他嵌合受體。因此，如上文描述之構築體CIV至CX中任一者之內域，或其變體可用於本發明之任何嵌合受體，包括與(例如)任何其他細胞外域或抗原結合域，及/或任何其他TM域一起。此外，可修飾內域之設計，例如以添加一或多個其他共刺激域，或其他細胞內特徵。此外，可修飾內域序列以移除CD8及CD28細胞內域部分之所有或部分(NHRPPAWV，SEQ ID NO: 205)。

構築體CIV至CX中之各者之內域分別由SEQ ID NOS: 198至204表示。

細胞之轉導及擴增 自健康供體血液分離CD4⁺ CD25⁺ CD127^- 人類Treg。使用編碼如圖15中顯示之構築體之慢病毒載體轉導Treg。使用用於T細胞擴增及活化之Dynabeads™人類T-活化劑CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA)，及介白素-2 (IL-2；Proleukin®, Clinigen, Burton upon Trent, UK)擴增Treg。每1 ml培養體積補充300國際單位(IU) IL-2。

Treg 之靜置 Treg培養物經由磁性技術耗盡用於T細胞擴增及活化之Dynabeads™人類T活化劑CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific)。清洗細胞並重懸浮於X-VIVO™ 15介質(Lonza)中；未補充IL-2。

HLA-A2-Ig 人造呈遞細胞 (APC) 用無菌硼酸鹽緩衝液(ThermoFisher Scientific)清洗1 mL(等效於約4億個珠)之Dynabeads™ M-450環氧珠。將40 µg HLA-A2-Ig二聚體(BD, New Jersey, USA)及40 µg抗人類CD28 mAB(BioXCell, New Hampshire, USA)添加至硼酸鹽緩衝液中之Dynabeads™ M-450環氧珠，並培養24小時。24小時後，移除硼酸鹽緩衝液，並添加珠清洗緩衝液及0.1 g/L疊氮化鈉(均為ThermoFisher Scientific)。

細胞擴增分析 在FACS中清洗2x10⁵ 個細胞，然後用結合APC之HLA-A*0201/CINGVCWTV右聚體(Immudex, Copenhagen, Denmark)染色。在PBS中清洗細胞，且使用LIVE/DEAD™可固定近紅外(ThermoFisher Scientific)以將死細胞染色。在FACS緩衝液中清洗細胞，然後Fc阻斷並用細胞表面抗體染色：Brilliant Violet 510™抗人類人CD4 (Biolegend, California, USA)、PE/青色素7抗人類CD25 (Biolegend)及CD34單株抗體(QBEND/10)- PE (ThermoFisher Scientific)。然後用Alexa Fluor®488抗人類FoxP3抗體將清洗之細胞染色。在Attune NxT細胞計數器(ThermoFisher Scientific)上獲取細胞。

活化分析 使用前照射HLA-A1及HLA-A2 K562細胞。活化分析共培養物如下建立：Treg:HLA-A1 K562s；Treg:HLA-A2 K562s；Treg:用於T細胞擴增及活化之Dynabeads™人類T活化劑CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific)或僅具有介質之Treg (未刺激)。共培養使用X-VIVO™ 15介質(Lonza)建立，該介質用5%熱滅活之人類血清(Merck Life Science UK Limited)補充。染色前，在37℃及5% CO₂ 下將共培養物培養18小時。18小時後，在PBS中清洗細胞，及使用LIVE/DEAD™可固定近紅外(ThermoFisher Scientific)以將死細胞染色。在FACS緩衝液中清洗細胞，然後Fc阻斷並用細胞表面抗體染色：Brilliant Violet 510™抗人類CD4 (Biolegend)、CD34單株抗體(QBEND/10)- PE (ThermoFisher Scientific)、PE-青色素7抗人類CD69 (Biolegend)及APC抗人類CD137 (4-1BB；Biolegend)。在Attune NxT細胞計數器(ThermoFisher Scientific)上獲取清洗之細胞。

存活分析 使用前先照射HLA-A1及HLA-A2 K562細胞。存活分析共培養物如下建立：Treg:HLA-A1 K562s；Treg:HLA-A2 K562s；Treg:用於T細胞擴增及活化之Dynabeads™人類T活化劑CD3/CD28 (ThermoFisher Scientific)或僅具有介質之Treg (未刺激)。使用10 µg/mL Ultra-LEAF純化之抗人類IL-2及5 µg/mL純化之抗人類CD122 (均為Biolegend)在用5%熱滅活之人類血清(Merck Life Science UK Limited)補充之X-VIVO™ 15介質(Lonza)中建立共培養物。在37℃及5% CO₂ 下將共培養物培養總計6天。在第6天，在FACS緩衝液中清洗共培養物，然後Fc阻斷並用細胞表面抗體染色：Brilliant Violet 510™抗人類CD4 (Biolegend)、PE/青色素7抗人類CD25 (Biolegend)及CD34單株抗體(QBEND/10)- PE (ThermoFisher Scientific)。然後在FACS緩衝液中清洗細胞，並用具有FITC膜聯蛋白V及7AAD溶液之膜聯蛋白V結合緩衝液使用具有7AAD之FITC膜聯蛋白V細胞凋亡偵測套組(Biolegend)重懸浮。培養後，將膜聯蛋白V結合緩衝液添加至製劑。在Attune NxT細胞計數器(ThermoFisher Scientific)上獲取細胞。

pSTAT5 ELISA 及西方墨點法 (WB) 分析 pSTAT5 ELISA及WB分析共培養物如下建立：Treg:HLA-A2 K562s；Treg:HLA-A2-Ig塗佈之珠(A2珠)；具有100 IU/mL IL-2之Treg或僅具有介質之Treg (未刺激)。除添加100 IU/mL IL-2外，所有共培養物均使用10 µg/mL Ultra-LEAF純化之抗人類IL-2及5 µg/mL之純化抗人類CD122 (均為Biolegend)建立。在用5%熱不活化之人類血清(Merck Life Science UK Limited)補充之X-VIVO™ 15介質(Lonza)中建立共培養物，並培養。接著，用PBS將細胞清洗兩次，及然後用放射免疫沈澱分析(RIPA)緩衝液(ThermoFisher Scientific)裂解細胞集結粒。在冰上培養樣本，然後在14,000 g下離心。將細胞裂解物樣本儲存在-80℃下直至使用。

STAT5 A/B (pY694/699) SimpleStep ELISA® 套組分析 將細胞裂解物樣本解凍，並使用Pierce™ BCA蛋白質分析套組(ThermoFisher Scientific)確定STAT5 A/B (pY694/699) SimpleStep ELISA®套組分析(Abcam, Cambridge, UK)中最佳輸入量之蛋白質濃度。根據製造商之指導方針處理樣本。

pSTAT5 西方墨點法分析 將細胞裂解物樣本解凍，並使用Pierce™ BCA蛋白質分析套組(ThermoFisher Scientific)在pSTAT5西方墨點法分析中確定最佳輸入量之蛋白質濃度。每孔上樣等量之蛋白質。在70℃下將樣本處理10 min，然後在冰上培養2 min。然後將樣本裝載於NuPAGE™ 4至12%Bis-Tris蛋白凝膠內，將其放置於具有1X NuPAGE MES SDS運行緩衝液(均為ThermoFisher Scientific)之XCell SureLock微細胞凝膠運行槽中。根據製造商之指導方針，使用iBlot™ 2乾燥印跡系統進行乾燥印跡。隨後，使用Phospho-STAT5 (Tyr694) (Cell Signaling Technology, Massachusetts, USA)將膜阻斷並染色。

結果圖16中之表現分析顯示，所有測試之構築體(參見圖15)均表現於Treg (N為2至16個個體供體)之細胞表面上(圖16A)。儘管構築體之MFI變化，但所有均可導致跨供體之高程度轉導。此外，在Treg樣本中觀測到RQR8 (SEQ ID NO: 193) (來自核酸構築體之與CAR共表現之安全開關)之高且相似程度之轉導。無論CAR構築體如何，所有細胞均具有相似程度之FOXP3。

如由圖17A及B可見，使用之所有CAR構築體均可由抗原(在K562A2細胞上表現之HLA-A2)刺激，圖17A及B顯示兩種Treg活化標誌物(CD69及CD137)之含量。珠亦可通過其等內源性TCR非特異性刺激轉導之Treg。

圖18顯示當用不同之CAR構築體轉導時，來自三個不同供體之Treg之存活%。在JAK3結合基序與STAT5聯合基序/JAK1結合基序之間包含連接子之構築體一般導致經此等構築體轉導之細胞之存活水平增加。特定言之，構築體4 (SEQ ID NO: 186)及5 (SEQ ID NO: 187) (參見圖15)顯示比構築體1 (SEQ ID NO: 183)更高之存活百分率，指示該JAK3結合基序連同彼等連接子一起之存在賦予之潛在優勢。

由於MFI與CAR表現之間存在非線性關係，因此使用CD69而非MFI對圖18中顯示之資料重新標準化，參見圖19中顯示之結果。圖19進一步顯示如相較於具有僅STAT5聯合基序/JAK1結合基序，或無JAK3或STAT5聯合基序/JAK1結合基序之對照構築體，當使用除STAT5聯合基序/JAK1結合基序外亦包含JAK3結合域連同連接子一起之構築體時可見存活增加。

圖20進一步顯示根據ELISA，與包含JAK3結合基序及連接子之構築體相關聯之pSTAT5活性，及圖21顯示當比較構築體4 (SEQ ID NO: 186) (具有JAK3結合基序及連接子)及僅具有STAT5聯合基序/JAK1結合基序之構築體1 (SEQ ID NO: 183)時，pSTAT5活性處於增加之水平下。pSTAT5活性指示細胞正通過轉導之構築體接收之持久性信號之存在。

因此，實例10中顯示之資料顯示當用另外包含JAK3結合基序及連接子之構築體轉導時，在Treg供體上可見存活優勢及增加之pSTAT5活性趨勢。

上文說明書中提及之所有公開案均以引用之方式併入本文中。在不背離本發明之範圍及精神之情況下，熟習此項技術者將顯而易見本發明之本文描述之方法及系統之各種修飾及變化。儘管已結合特定之較佳實施例描述本發明，但應瞭解，如本文主張之本發明不應過度地限制於此等特定實施例。實際上，熟習分子生物學或相關領域之技術者顯而易見，本文描述用於進行本發明之模式之各種修飾旨在落於隨附申請專利範圍之範圍內。

圖1：闡述本發明之CAR構築體之圖

圖2：抗HLA.A2 IL2R CAR構築體之例示性設計包括IL2R內域之不同組合之例示性抗HLA.A2 CAR構築體之示意圖。(A) dCAR構築體：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD28鉸鏈域；CD28 TM及eGFP。(B) CD28z構築體：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD28鉸鏈域；CD28 TM；CD28傳訊域；CD3z傳訊域及eGFP。(C) IL2R構築體1：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD28鉸鏈域；CD28 TM；CD28傳訊域；經截短IL2RB內域；CD3z傳訊域及eGFP。(D) IL2R構築體1：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD28鉸鏈域；CD28 TM；CD28傳訊域；經截短IL2RG；經截短IL2RB內域；CD3z傳訊域及eGFP。(E) IL2R構築體1：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD28鉸鏈域；CD28 TM；CD28傳訊域；經截短IL2RB內域；CD3z傳訊域；FP2A裂解域及eGFP。

圖3：抗HLA.A2 IL2R CAR-Treg之產生顯示抗HLA.A2 IL2R CAR-Treg之產生及擴增之示意圖。(A)分離經分離CD4+CD25hiCD127low細胞並用抗CD3/CD28珠活化。活化後三天，用含有HLA.A2-CAR及GFP報告基因之慢病毒轉導Treg。每2天添加新鮮培養基及1000 IU/ml IL-2。在10天內培養經轉導及未轉導Treg並量測GFP以評定轉導效率。用新鮮抗CD3/CD28珠進一步擴增Treg。(B)活化後第10天，未轉導或經不同CAR構築體轉導之Treg倍數變化擴增。

圖4：抗HLA.A2 IL2R構築體經時轉導效率之定量在細胞活化後之不同時間點，分析未轉導及經CAR構築體轉導之Treg之GFP表現。(A)轉導後7天，來自HLA-A2 IL2R CAR Treg之GFP表現之代表性等高線圖。(B)轉導後7天，定量活CD4+細胞中之GFP⁺ CAR Treg。(C)經時自HLA-A2 IL2R CAR Treg定量GFP表現。

圖5：抗HLA.A2 IL2R CAR構築體在轉導之Treg上之細胞表面表現之定量藉由結合PE之HLA-A*0201/CINGVCWTV右聚體(dextramer) (Immudex, Copenhagen, Denmark)分析CAR構築體在未轉導及轉導之Treg上之膜表現。(A)轉導後7天，GFP +右聚體+ CAR Treg之代表性等高線圖。(B)在轉導後7天，GFP+ Treg中之右聚體+細胞之定量。

圖6：多株細胞擴增後，CAR Treg之表型表徵在抗CD3/CD28活化珠及IL-2之存在下培養Treg，並擴增15天。在培養之第15天，藉由FACS對未轉導及轉導之Treg上之Treg相關標誌物FOXP3、HELIOS、CTLA4及TIGIT進行分析，以評定表型譜系穩定性。

圖7：抗HLA.A2 IL2R CAR Treg之抗原-特異性之評估將未轉導及轉導之Treg在不同刺激物之存在下培養18小時。分析CD69及CD137活化標誌物，以評定特異性及非特異性細胞活化。(A) 顯示應HLA.A1或HLA.A2分子轉導之K562細胞培養之反應之表現CD69之代表性等高線圖。使用GFP信號以選擇轉導之Treg。(B)在僅用介質(未刺激)、抗CD3/CD28珠(非特異性刺激)、K562-HLA.A1及K562-HLA.A2細胞培養18小時後，Treg上之CD69及CD137表現之定量。(C)顯示在用HLA.A1及HLA.A2 B細胞系培養18小時後Treg上CD69表現之代表性直方圖。使用不同之細胞與細胞之比率。

圖8：作為IL2R CAR傳訊之指標之STAT5磷酸化分析將轉導之CAR Treg在無IL2之培養基中靜置過夜。用單獨介質、1000 IU/ml IL-2或在基於HLA.A2-Ig之人造APC之存在下(遵循DOI: 10.3791/2801下描述之方案產生)培養後10及120分鐘，藉由FACS分析評定Treg之STAT5磷酸化。(A)等高線圖顯示在以單獨介質、1:1比率之HLA.A2珠及1000 IU/ml IL-2一起培養10分鐘後，GFP及phosphoSTAT5在轉導之CAR-Treg上之表現。(B)直方圖顯示用HLA.A2珠1:1比率或單獨介質(未刺激)培養120分鐘之Treg之STAT5磷酸化。

圖9：在缺乏IL-2之情況下非特異性及HLA.A2特異性活化後之Treg存活之評定將具有不同構築體之CAR轉導之Treg與抗CD3/28活化珠及K562.A2表現細胞一起培養，但不存在IL-2。活化後7天藉由FACS分析評定細胞存活。(A) CAR-Treg之代表性直方圖顯示在無IL-2之情況下活化後第7天基於存活率染料染色之GFP+細胞之細胞存活。(B)在缺乏IL-2之情況下與抗CD3/28珠及K562-HLA.A2細胞一起培養7天後，GFP+ Treg中活細胞之百分率。

圖10：Treg抑制效能測試：藉由分析B細胞上共刺激分子之調節，評估Treg之免疫調節功能與Treg共培養後，分析CD80及CD86之B細胞表現，以評估Treg減少抗原呈遞細胞上共刺激分子表現之能力。將固定數量之活A2表現B細胞(20K/孔)與滴定數量之Treg產品(A2陰性供體) (200、100、50、25、12.5K)共培養過夜。B細胞上CD86及CD80共刺激標誌物之FACS分析。

圖11A：說明性HLA-A2特異性CAR構築體設計編碼HLA-A2特異性CAR (表示為A2 CAR)之說明性載體之示意圖：構築體F-C：闡述編碼5’-FOXP3-P2A-A2 CAR-3’之構築體；構築體R-C：闡述編碼5’-R-P2A-A2 CAR-3’之構築體，其中R係另一基因；構築體C：闡述僅編碼A2 CAR之構築體；構築體C-R：闡述編碼5’-A2 CAR-P2A-R-3’之構築體，其中R係另一基因。

圖11B：FOXP3/HLA-A2 CAR-Treg之產生示意圖顯示FOXP3/HLA-A2 CAR-Treg之產生及擴增。將穩定表現gag pol之反轉錄病毒包裝系Phoenix-GP (P.gp)細胞以1x10⁶ 個細胞/10 mm細胞培養皿接種。第二天，分離CD4+CD25hiCD127low細胞，並在缺乏IL-2之情況下用抗CD3/CD28珠活化。在同一天，使用Fugene轉染試劑，以包膜及編碼FOXP3/HLA.A2-CAR之構築體轉染P.gp細胞。活化後兩天，用含有並補充IL-2之g-反轉錄病毒轉導Treg。每兩天向細胞補充另外介質及IL-2。在第6天，使用HLA.A2右聚體以評定轉導效用。用新鮮抗CD3/CD28珠進一步擴增Treg。

圖12：轉導之Treg中之HLA-A2特異性CAR及FOXP3表現圖12顯示如藉由流式細胞分析技術測定，相較於模擬對照Treg，在經構築體F-C、構築體R-C、構築體C及構築體C-R轉導之Treg中，HLA-A2特異性CAR (A2 CAR)表現含量、FOXP3表現含量及另一基因R之表現含量。

圖12A顯示模擬Treg及經構築體F-C、構築體R-C、構築體C及構築體C-R轉導之Treg之右聚體(HLA)相對於SSC-A之CD3+CD4+閥控FACS圖。經各構築體轉導之Treg均表現HLA-A2特異性CAR。

圖12B顯示模擬Treg及經構築體F-C、構築體R-C、構築體C及構築體C-R轉導之Treg之FOXP3表現相對於另一基因R之表現之CD3+CD4+右聚體+閥控FACS圖。基因R在經構築體R-C及構築體C-R兩者轉導之Treg中以高含量表現。FOXP3表現於所有Treg中，但在構築體F-C中顯著更高，特別當相較於僅單獨表現HLA-A2特異性CAR (構築體C)時。

圖13：轉導及擴增之Treg中之HLA-A2特異性CAR及FOXP3表現圖13顯示如藉由流式細胞分析技術測定，相較於模擬對照Treg，在經構築體F-C、構築體R-C、構築體C及構築體C-R轉導之經擴增之Treg中，HLA-A2特異性CAR (A2 CAR)表現含量、FOXP3表現含量及另一基因R之表現含量。

圖13A顯示模擬擴增之Treg及經構築體F-C、構築體R-C、構築體C及構築體C-R轉導並隨後擴增之右聚體(HLA)相對於SSC-A之CD3+CD4+閥控FACS圖。在擴增後，經各構築體轉導之Treg仍表現HLA-A2特異性CAR。

圖13B顯示模擬擴增之Treg及經構築體F-C、構築體R-C、構築體C及構築體C-R轉導並隨後擴增之Treg之FOXP3表現相對於另一基因R之表現之CD3+CD4+ 右聚體+閥控FACS圖。FOXP3表現在擴增後在經構築體R-C、構築體C及構築體C-R轉導之Treg中降低。相反，在擴增後，在經構築體F-C轉導之Treg中，FOXP3表現未降低。因此，FOXP3表現在擴增後在構築體F-C中大體上更高，特別當相較於單獨HLA-A2特異性CAR (構築體C)之表現時。

圖14：本發明之CAR之示意圖圖14顯示本發明之CAR之示意圖，其包含由連接子連接之包含經截短IL2Rγ及經截短IL2Rβ域之內域。

圖15：抗HLA.A2 IL2R CAR構築體之例示性設計圖15顯示包括IL2R內域及可撓性連接子序列之不同組合之例示性抗HLA.A2 CAR構築體之示意圖。對照(SEQ ID NO: 182)：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD8鉸鏈域(SEQ ID NO: 194)；CD8跨膜(TM) (SEQ ID NO: 195)；CD28傳訊域；CD3ζ傳訊域。QTX01-CI (SEQ ID NO: 183)：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD8鉸鏈域；CD8 TM；CD28傳訊域；經截短IL2Rβ傳訊域；CD3ζ傳訊域。QTX01-CII (SEQ ID NO: 184)：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD8鉸鏈域；CD8 TM；CD28傳訊域；經截短IL2Rγ傳訊域；經截短IL2Rβ傳訊域；CD3ζ傳訊域。QTX01-CIII (SEQ ID NO: 185)：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD8鉸鏈域；CD8 TM；CD28傳訊域；經截短IL2Rγ傳訊域；CD3ζ傳訊域。QTX01-CIV (SEQ ID NO: 186)：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD8鉸鏈域；CD8 TM；CD28傳訊域；經截短IL2Rγ傳訊域；(GGGGS)₃ 可撓性連接子(SEQ ID NO: 155)；經截短IL2Rβ傳訊域；CD3ζ傳訊域。QTX01-CV (SEQ ID NO: 187)：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD8鉸鏈域；CD8 TM；CD28傳訊域；經截短IL2Rγ傳訊域；(GGGGS)₄ 可撓性連接子(SEQ ID NO: 158)；經截短IL2Rβ傳訊域；CD3ζ傳訊域。QTX01-CVI (SEQ ID NO: 188)：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD8鉸鏈域；CD8 TM；CD28傳訊域；經截短IL2Rγ傳訊域；(Gly)₆ 可撓性連接子(SEQ ID NO: 159)；經截短IL2Rβ傳訊域；CD3ζ傳訊域。QTX01-CVII (SEQ ID NO: 189)：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD8鉸鏈域；CD8 TM；CD28傳訊域；經截短IL2Rγ傳訊域；(Gly)₈ 可撓性連接子(SEQ ID NO: 160)；經截短IL2Rβ傳訊域；CD3ζ傳訊域。QTX01-CVIII (SEQ ID NO: 190)：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD8鉸鏈域；CD8 TM；CD28傳訊域；經截短IL2Rγ傳訊域；KESGSVSSEQLAQFRSLD可撓性連接子(SEQ ID NO: 166)；經截短IL2Rβ傳訊域；CD3ζ傳訊域。QTX01-CIX (SEQ ID NO: 191)：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD8鉸鏈域；CD8 TM；CD28傳訊域；經截短IL2Rγ傳訊域；EGKSSGSGSESKST可撓性連接子(SEQ ID NO: 167)；經截短IL2Rβ傳訊域；CD3ζ傳訊域。QTX01-CX (SEQ ID NO: 192)：HLA.A2 scFv抗原識別域；CD8鉸鏈域；CD8 TM；CD28傳訊域；經截短IL2Rγ傳訊域；GSAGSAAGSGEF可撓性連接子(SEQ ID NO: 168)；經截短IL2Rβ傳訊域；CD3ζ傳訊域。

圖16：抗HLA.A2 IL2R CAR及RQR8之細胞表面表現，及FoxP3於轉導之Treg中之細胞內表現。

圖16顯示(A)在轉導之Treg上表現膜定位之CAR構築體之CD4⁺ CD25⁺ Treg細胞之百分率。(B)各Treg條件之CAR構築體之平均螢光強度(MFI)幾何平均值(Geo平均值)。(C)表現膜定位之報告分子RQR8 (SEQ ID NO：193)之CD4⁺ CD25⁺ Treg細胞之百分率。(D)各Treg條件之RQR8 (SEQ ID NO：193)之QBEND/10 MFI值。(E)在轉導之Treg上表現細胞內FoxP3轉錄因子之CD4⁺ CD25⁺ Treg細胞之百分率。(F)顯示各Treg條件之FoxP3之MFI值。條形圖顯示平均值+標準偏差(SD)。N = 2至16個個別供體。

圖17：抗HLA.A2 IL2R CAR Treg中抗原特異性活化能力之評估圖17顯示之前用HLA-A1⁺ K562 (A1)；HLA-A2⁺ K562 (A2)；抗CD3/CD28塗佈之珠(珠；非特異性刺激)或單獨介質(非刺激性)培養轉導之CAR Treg後，如藉由流式細胞分析技術測定之T細胞活化標誌物(A) CD69及(B) CD137之含量。條形顯示平均值+ SD。N = 2至16個個別供體。

圖18：標準化為相對CAR表現，在缺乏IL-2之情況下非特異性及HLA.A2特異性活化後之Treg存活之評估圖18顯示在缺乏IL2；HLA-A1⁺ K562 (A1)；HLA-A2⁺ K562 (A2)；或單獨介質(未刺激)之情況下在各種刺激物之存在下在共培養後轉導之CAR Treg之存活能力。顯示將活CD4⁺ CD25⁺ QBEND/10⁺ Treg群體之百分率標準化為A2⁺ 右聚體⁺ (CAR)表現之相對MFI。自圖表中顯示之值預減去來源於「單獨介質」之培養物之存活百分率。條形顯示平均值。虛線顯示在HLA-A2⁺ K562之存在下培養之Con 1 Treg之存活之百分率之平均值。TRS-78、TRS-95及TRS-96係個別供體匿名名稱。N = 3。

圖19：標準化為HLA.A2結合後之CD69表現，在缺乏IL-2之情況下，非特異性及HLA.A2特異性活化後之Treg存活之評估。圖19顯示在缺乏IL2；HLA-A1⁺ K562 (A1)；HLA-A2⁺ K562 (A2)；或單獨介質(未刺)之情況下，在各種刺激物之存在下，在共培養後轉導之CAR Treg之存活能力。顯示將活CD4⁺ CD25⁺ QBEND/10⁺ Treg群體之百分率標準化為HLA.A2結合後之CD69表現之相對百分率。自圖表中顯示之值預減去來自於「單獨介質」之培養物之生存之百分率。條形顯示平均值。虛線顯示在HLA-A2⁺ K562之存在下培養之對照Treg之存活百分率之平均值。TRS-95及TRS-96係個別供體匿名名稱。N = 2。

圖20：作為IL2R CAR傳訊之指標之STAT5磷酸化分析(ELISA) 圖20顯示藉由ELISA使用光密度(OD₄₅₀ )量測偵測到與A2珠結合後之pSTAT5之轉導之CAR Treg含量。已自圖表中顯示之值預減去來源於「單獨介質」之培養物之OD₄₅₀ 讀數。TRS-96係個別供體匿名名稱。條形顯示平均值+ SD。此實驗係以技術副本進行。N = 1。

圖21：作為IL2R CAR傳訊之指標之STAT5磷酸化分析(西方墨點法) 圖21顯示藉由西方墨點法之轉導之CAR Treg之pSTAT5蛋白含量。該等圖顯示由體積或陽性偵測之百分率量測之pSTAT5蛋白含量之標準化(相對於上樣對照)光密度分析。自該等圖中顯示之值預減去來源於「單獨介質」之培養物之pSTAT5蛋白背景偵測。TRS-96係個別供體匿名名稱。條形顯示平均值。N = 1。

Claims

一種核酸分子，其包含編碼嵌合受體之多核苷酸序列，其中該嵌合受體包含內域，該內域包含(i) STAT5聯合基序(association motif)，及JAK1及/或JAK2結合基序，及(ii) JAK3結合基序，其中(i)及(ii)由連接子或鉸鏈連接。
如請求項1之核酸，其中該嵌合受體係嵌合抗原受體(CAR)。
如請求項1或2之核酸，其中(i)該內域包含兩個或更多個STAT5聯合基序，及/或該一或多個STAT5聯合基序係來自介白素受體(IL)受體內域。
如請求項1至3中任一項之核酸，其中該一或多個STAT5聯合基序係來自IL2Rβ、IL7Rα、IL-3Rβ (CSF2RB)、IL-9R、IL-17Rβ、紅血球生成素受體、血小板生成素受體、生長激素受體及泌乳素受體。
如請求項1至4中任一項之核酸分子，其中該STAT5聯合基序包含胺基酸基序YXXF/L (SEQ ID NO: 8)；其中X係任何胺基酸。
如請求項1至5中任一項之核酸分子，其中該STAT5聯合基序包含胺基酸基序YCTF (SEQ ID NO: 9)、YFFF (SEQ ID NO: 10)、YLSL (SEQ ID NO: 11)及/或YLSLQ (SEQ ID NO: 12)中之一或多者。
如請求項6之核酸分子，其中該STAT5聯合基序包含胺基酸基序YLSLQ (SEQ ID NO: 12)。
如請求項7之核酸分子，其中該內域含有包含胺基酸基序YLSLQ (SEQ ID NO: 12)之第一STAT5聯合基序及包含胺基酸基序YCTF (SEQ ID NO: 9)或YFFF (SEQ ID NO: 10)之第二STAT5聯合基序。
如請求項8之核酸分子，其中該內域包含下列STAT5聯合基序：YLSLQ (SEQ ID NO: 12)、YCTF (SEQ ID NO: 9)及YFFF (SEQ ID NO: 10)。
如請求項1至9中任一項之核酸分子，其中該JAK結合基序係JAK1結合基序。
如請求項10之核酸分子，其中該JAK1結合基序係來自介白素受體(IL)受體內域。
如請求項1至11中任一項之核酸分子，其中該JAK1結合基序包含如SEQ ID NO: 13至19中任一者顯示之胺基酸基序或與SEQ ID NO: 13至19具有至少80%一致性之變體。
如請求項12之核酸分子，其中該JAK1結合基序係如SEQ ID NO: 13顯示之胺基酸基序；或與SEQ ID NO: 13具有至少80%一致性之變體。
如請求項1至13中任一項之核酸分子，其中該嵌合受體內域包含如SEQ ID NO: 1顯示之IL2Rβ內域；或與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列一致性之變體。
如請求項1至14中任一項之核酸分子，其中該嵌合受體內域包含如SEQ ID NO: 23或24中任一者顯示之經截短IL2Rβ內域；或與SEQ ID NO: 23或24具有至少80%序列一致性之變體。
如請求項1至15中任一項之核酸分子，其中該JAK3結合基序包含SEQ ID NO: 25或26或與SEQ ID NO: 25或26具有至少80%序列一致性之變體。
如請求項1至16中任一項之核酸分子，其中該嵌合受體內域包含SEQ ID NO: 45、53或154；或與SEQ ID NO: 45、53或154具有至少80%序列一致性之變體。
如請求項1至17中任一項之核酸分子，其中該JAK3結合基序位於該嵌合受體內域中STAT5聯合基序及JAK1及/或JAK2結合基序之N端。
如請求項1至18中任一項之核酸分子，其中該連接子或鉸鏈包含SEQ ID NO 155至160中任一者之序列。
如請求項1至19中任一項之核酸分子，其中該連接子或鉸鏈係可撓性連接子或鉸鏈。
如請求項1至20中任一項之核酸分子，其中該內域包含以下中任一者： (i) SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 155及SEQ ID NO: 23， (ii) SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 158及SEQ ID NO: 23，或 (iii) SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 159及SEQ ID NO: 23，或其與(i)、(ii)或(iii)具有至少80%序列一致性之變體。
如請求項1至21中任一項之核酸分子，其中該編碼嵌合受體不包含第一及第二異二聚化域。
一種載體，其包含如請求項1至22中任一項之核酸分子。
一種包含內域之嵌合受體，尤其CAR，該內域包含(i) STAT5聯合基序，及JAK1及/或JAK2結合基序，及(ii) JAK3結合基序，其中(i)及(ii)由連接子或鉸鏈連接。
如請求項24之嵌合受體，其中該嵌合受體不包含第一及第二異二聚化域。
一種嵌合受體，其由如請求項1至22中任一項之核酸編碼。
一種經工程化細胞，尤其T細胞或NK細胞，其包含如請求項1至22中任一項之核酸分子、如請求項23之載體或如請求項24至26中任一項之嵌合受體。
如請求項27之經工程化細胞，其中該細胞係Treg。
一種醫藥組合物，其包含如請求項27或28之經工程化細胞(尤其T細胞或NK細胞)。
如請求項27或28之經工程化細胞或如請求項29之醫藥組合物，其用於療法中。
如請求項28之經工程化Treg細胞，其用於誘導對移植物之耐受性；治療及/或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫或過敏疾病；用於促進組織修復及/或組織再生；或用於改善發炎(尤其代謝失調繼發之慢性發炎)。
如請求項29之醫藥組合物，其用於誘導對移植物之耐受性；治療及/或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫或過敏疾病；用於促進組織修復及/或組織再生；或用於改善發炎(尤其代謝失調繼發之慢性發炎)。
一種誘導對移植物之耐受性、治療及/或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫或過敏疾病、或用於促進組織修復及/或組織再生、或用於改善發炎(尤其代謝失調繼發之慢性發炎)之方法，其包括向個體投與如請求項28之經工程化Treg細胞或如請求項29包含經工程化Treg之醫藥組合物之步驟。
如請求項33之方法，其包括下列步驟： (i)自個體分離或提供富含Treg之細胞樣本； (ii)用如請求項1至22中任一項之核酸分子或如請求項23之載體轉導或轉染Treg細胞；及 (iii)向該個體投與來自(ii)之Treg細胞。
一種如請求項28之經工程化Treg之用途，其用於製造用於誘導對移植物之耐受性；治療及/或預防細胞及/或體液移植排斥；治療及/或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)、自體免疫或過敏疾病；或用於促進組織修復及/或組織再生；或用於改善發炎(尤其代謝失調繼發之慢性發炎)之藥劑。
如請求項30至32中任一項使用之經工程化Treg或醫藥組合物；如請求項33或34之方法；或如請求項35之用途，其中該個體係經免疫抑制療法之移植接受體。
如請求項36使用之經工程化Treg或醫藥組合物、方法或用途，其中該移植係選自肝、腎、心臟、肺、胰臟、腸、胃、骨髓、血管化複合組織移植物及皮膚移植。
如請求項37使用之經工程化Treg或醫藥組合物、方法或用途，其中該移植係肝移植。
如請求項38使用之經工程化Treg或醫藥組合物、方法或用途，其中該CAR包含可特異性結合至選自以下之抗原之抗原結合域：存在於該移植肝中但不存在於該接受體中之HLA抗原、肝特異性抗原(諸如NTCP)，或在排斥或組織發炎期間表現上調之抗原，諸如CCL19、MMP9、SLC1A3、MMP7、HMMR、TOP2A、GPNMB、PLA2G7、CXCL9、FABP5、GBP2、CD74、CXCL10、UBD、CD27、CD48、CXCL11。
如請求項39使用之經工程化Treg或醫藥組合物、方法或用途，其中該CAR包含可特異性結合至存在於該移植物供體中但不存在於該移植物接受體中之HLA抗原之抗原結合域。
如請求項40使用之經工程化Treg或醫藥組合物、方法或用途，其中該抗原係HLA-A2。
如請求項41使用之經工程化Treg或醫藥組合物、方法或用途，其中該CAR含有包含SEQ ID NO: 34或與SEQ ID NO: 34具有至少80%一致性之變體之抗原結合域。
如請求項30至42使用之經工程化Treg或醫藥組合物、方法或用途，其中該自體免疫或過敏疾病係選自發炎性皮膚病，包括牛皮癬及皮膚炎(例如異位性皮膚炎)；與發炎性腸病相關聯之反應(諸如克羅恩氏病(Crohn’s disease)及潰瘍性結腸炎)；皮膚炎；過敏性病症，諸如食物過敏、濕疹及哮喘；類風濕性關節炎；全身性紅斑狼瘡(SLE) (包括狼瘡性腎炎、皮膚狼瘡)；糖尿病(例如1型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病)；CIPD、多發性硬化症、神經退化疾病(例如ALS)及幼發型糖尿病。
一種產生如請求項28之經工程化Treg之方法，其包括下列步驟： (i)自個體分離含有細胞之樣本或提供含有細胞之樣本；及 (ii)用一或多種如請求項1至22中任一項之核酸分子或用一或多種如請求項23之載體轉導或轉染該含有細胞之樣本，以提供經工程化細胞之群體；其中該含有細胞之樣本包含Tregs及/或Tregs係在步驟(ii)之前或之後自該含有細胞之樣本富集及/或產生。