CN116615532A - 用于冷冻保存工程化Treg的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及将CD62L表达保存在已经冷冻保存的调节性T细胞(Treg)群中的方法，包括在冷冻保存之前将编码FOXP3多肽的多核苷酸引入Treg群中。本发明还涉及将CD62L保存在冷冻保存后的Treg群中的方法，包括将编码FOXP3多肽的多核苷酸引入Treg群中并且冷冻保存所述Treg群。此外，本发明涉及编码FOXP3的外源多核苷酸在用于将CD62L表达保存在冷冻保存后的Treg群中的用途，并且涉及冷冻保存的工程化Treg群、包含冷冻保存的工程化Treg的药物组合物及其治疗用途。

Description

用于冷冻保存工程化Treg的方法

技术领域

本发明涉及冷冻保存调节性T细胞(Treg)的方法。特别地，本发明涉及在冷冻保存之前增加Treg中FOXP3表达的方法，以保留冷冻保存后Treg的抑制功能。本发明还涉及冷冻保存的工程化Treg、包含该冷冻保存的工程化Treg的药物组合物及其治疗用途。

背景技术

近年来，人们对在过继细胞治疗(ACT)的临床环境中使用调节性T细胞(Treg)来治疗一系列不同的病症越来越感兴趣。已经提出Treg基于其免疫抑制功能被用于控制不希望的免疫应答。例如，Treg已经用于治疗自身免疫性疾病或过敏性疾病，用于移植中的免疫调节，并且用于改善和/或预防炎性病症中的免疫介导的器官损伤。另外，已经对Treg进行了基因工程改造以表达具有新特异性的T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)，从而提供了提供靶向免疫抑制的优点。各种I期试验已经显示Treg治疗是安全和有效的，并且目前正在进行若干II期试验。

用于治疗用途的Treg的主要来源是来自患者自身的血液(直接从血管抽取或作为白细胞分离的产物抽取)或者来自脐带血。来自这些来源的Treg的数目是低的，并且需要大量数量来有效抑制免疫系统。因此，必须进行离体扩增以获得足够数量的Treg用于输注到患者体内。遵循良好生产规范(GMP)指南的典型的分离和扩增方案需要从大约九天直到二十一天。如果这些细胞可以以足够的量加工和冷冻，在需要时准备用于患者，并且避免可能对Treg质量有不利影响的延长的加工，则将是非常有利的。这种方法将允许在计划治疗方面和输注时间方面具有更大的灵活性，并且将允许随后的Treg输注并允许在药物治疗之前收集细胞。因此，冷冻保存Treg的能力是至关重要的。

冷冻和解冻对Treg细胞群的影响尚未明确。几个研究小组已经报道了冷冻保存可能对Treg具有有害影响并且可能降低Treg存活率，引起异常的细胞因子分泌，并且改变合适的Treg抑制功能和迁移所必需的表面标志物的表达。

特别地，Florek等(Florek等,PLoS One,2015,DOI:10.137/journal.pone.0145763)已经显示Treg的冷冻-解冻导致CD62L(L-选择蛋白)表达的丧失并导致保护免受移植物抗宿主病(GvHD)的能力受损。解冻的Treg显示与CD62L结合配偶体MADCAM1结合的能力降低并且通向次级淋巴器官的归巢受损。其他研究已经显示，在冷冻保存后，T细胞上的CD62L(L-选择蛋白)和CCR5表达丧失(De Boer等,Bone MarrowTransplant,1998,22:1103-10和Hattori等,Exp Hematol,2001,29:114-22)。缺乏CD62L表达的Treg具有降低的运输能力、降低的定位以及因此Treg控制的免疫应答的区室化(Sakaguchi等,Cell,2008,133:775-87)。解冻后CD62L表达的丧失可以通过过夜培养来逆转(De Boer等,1998和Hattori等,2001)。然而，以这种方式静息细胞对于临床应用可能是不切实际的，临床应用中解冻通常在床边进行并且因此进一步培养是不可能的。

Golab等(Golab等,Oncotarget,2018,第9卷,(第11期),第9728-9740页)评价了Treg治疗的两种细胞库策略，即，用于随后的Treg分离/扩增的CD4+细胞的冷冻保存和离体扩增的Treg(CD4⁺CD25^hiCD127^lo/-细胞)的冷冻保存。发现离体扩增的Treg比CD4+细胞对冷冻保存过程更敏感，其解冻后细胞存活率低得多并且Treg标志物表达降低(即，具有表型CD4⁺CD25^hiCD127^-和CD4⁺FoxP3⁺的细胞的频率降低)。通过在随后的离体扩增13天期间再刺激Treg来克服解冻后的差的Treg存活率和受损的表型。类似地，Peters等(Peters等,PLoSOne,2008,3:e3161)显示解冻后Treg抑制能力可以通过刺激和扩增10天来恢复。

然而，如上所述，在临床环境中，这些额外的培养和扩增步骤也是不可行的，原因在于其花费时间，带来增加的风险，并且抵消了使用冷冻保存的Treg与新鲜分离的细胞相比的益处。因此，仍然需要改进的冷冻保存方法，其中冷冻保存的Treg可以在解冻后立即施用于患者，而不需要实验室目前需要的冗长的解冻后拯救步骤。

发明内容

在这方面，发明人惊奇地发现了外源FOXP3表达对冷冻保存后的Treg表型提供保护作用。发明人已经确定用FOXP3转导的Treg在冷冻和解冻后维持CD62L(或L-选择蛋白)表达。由于CD62L表达对于Treg的迁移和归巢功能是必需的，因此CD62L表达对于Treg的免疫抑制功能是重要的。因此，在冷冻保存(例如，作为细胞的必需加工的一部分)之前用FOXP3转导Treg得到Treg，该Treg在解冻后仍维持其免疫调节和抑制功能，从而允许所述细胞在患者中立即使用。因此，发明人提供了一种针对与Treg的冷冻保存相关的问题的解决方案，该解决方案避免了细胞的进一步培养，并且提供了一种产生可有效用于临床的Treg治疗的途径。

因此，本发明提供了一种工程化Treg，该工程化Treg在冷冻保存后保持其免疫抑制特性，并且因此具有增强的临床功效和安全性。冷冻保存的Treg可以用于多种治疗用途，包括诱导受试者对移植物的耐受性或者用于治疗和/或预防移植排斥、移植物抗宿主病、炎症、自身免疫性疾病、过敏性疾病、神经炎性疾病比如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、代谢疾病比如I型糖尿病、或者用于抑制免疫应答。

在第一方面，本发明提供了一种将CD62L表达保存在已经冷冻保存的调节性T细胞(Treg)群或Treg中的方法，包括在冷冻保存之前将编码FOXP3多肽的多核苷酸引入Treg群或Treg中。

所述Treg群或Treg可以在冷冻保存后具有相比于冷冻保存后的对应非工程化Treg群或Treg(即，未用编码FOXP3的多核苷酸转导的Treg群或Treg)更高的CD62L表达。

该方法还可以包括冷冻保存所述Treg群或Treg的步骤，因此，本发明还可以提供一种将CD62L表达保存在用于冷冻保存的调节性T细胞(Treg)群或Treg中的方法，包括以下步骤：(a)将编码FOXP3多肽的多核苷酸引入Treg群或Treg中；和(b)冷冻保存所述Treg群或Treg。

替代性地，本发明可以提供一种用于冷冻保存Treg(或Treg群)的方法，包括：(a)将编码FOXP3的多核苷酸引入Treg或Treg群中；和(b)冷冻保存所述Treg或Treg群，其中所述冷冻保存的Treg或Treg群具有相比于相应的非工程化Treg或Treg群更高的CD62L表达水平。

在另一方面，本发明提供了一种用于产生冷冻保存的Treg或Treg群的方法，所述冷冻保存的Treg或Treg群具有与对应的非冷冻保存的Treg或Treg群相当的CD62L水平，该方法包括：(a)将编码FOXP3的多核苷酸引入Treg或Treg群中；和(b)冷冻保存所述Treg或Treg群。

技术人员将理解的是，本文所描述的方法步骤通常以其动作顺序提供，例如，步骤(a)应当在步骤(b)之前执行。

本发明的方法还可以包括以下任何一个或多个附加步骤：在将编码FOXP3的多核苷酸引入所述Treg或Treg群之前，将Treg或Treg群从样品中分离，解冻所述Treg或Treg群和/或向受试者施用解冻的Treg或Treg群。该方法还可以包括在冷冻保存之前扩增Treg群或Treg的步骤。替代性地，本发明的Treg或Treg群在被扩增之前可以不冷冻保存。本发明的冷冻保存的Treg或Treg群可以立即用作现成的治疗产品，而不需要进一步的扩增、修饰或替代的额外培养步骤。

在这方面，本发明还提供了一种将CD62L表达保存在已经从冷冻保存状态解冻的Treg或Treg群中的方法，包括在冷冻保存和解冻之前将编码FOXP3多肽的多核苷酸引入Treg或Treg群中。

替代性地，本发明提供了一种将CD62L表达保存在从冷冻保存状态解冻后的Treg或Treg群中的方法，包括：(a)将编码FOXP3的多核苷酸引入Treg或Treg群中，(b)冷冻保存所述Treg或Treg群，和(c)解冻所述Treg或Treg群。所述Treg或Treg群可以在解冻后/期间立即使用，而不需要额外的扩增。该方法还可以包括以下步骤：(i)在步骤(a)之前，从怀疑含有Treg的样品中富集Treg，以产生富含Treg的样品，和(ii)在步骤(a)之后但在步骤(b)之前，从富含Treg的样品中扩增Treg或Treg群，以产生工程化的扩增的Treg或Treg群。步骤(i)还可以包括耗竭CD8+细胞。

在另一方面，本发明提供了一种用于产生解冻的Treg或Treg群的方法，所述解冻的Treg或Treg群具有与非冷冻保存的Treg或Treg群相当的CD62L水平，该方法包括：(a)将编码FOXP3的多核苷酸引入Treg或Treg群中，(b)冷冻保存所述Treg或Treg群，和(c)解冻所述Treg或Treg群。所述Treg或Treg群可以在解冻后/期间立即使用，而不需要额外的扩增。该方法还可以包括以下步骤：(i)在步骤(a)之前，从怀疑含有Treg的起始细胞样品中富集Treg，以产生富含Treg的样品，和(ii)在步骤(a)之后但在步骤(b)之前，从富含Treg的样品中扩增Treg或Treg群，以产生工程化的扩增的Treg或Treg群。步骤(i)还可以包括耗竭CD8+细胞。

样品(也称为含有Treg细胞的样品或简称为含有细胞的样品)可以包含全血、脐带血、白细胞锥、血锥、外周血单核细胞(PBMC)或白细胞团(leukopak)，或者可以由全血、脐带血、白细胞锥、血锥、外周血单核细胞(PBMC)或白细胞团组成。通常，样品可以包含白细胞锥或一个或多个白细胞团，或者由白细胞锥或一个或多个白细胞团组成。通常，样品来自人类供体。供体可以是健康的或者可以患有疾病比如神经发生性疾病(比如，ALS)或自身免疫性疾病(例如，I型糖尿病)或者可以是移植患者。

所述Treg群(或Treg)的冷冻保存可以包括以下步骤：(bi)将所述Treg群悬浮在冷冻保存培养基中；(bii)冷冻来自步骤(bi)的Treg群；和(biii)在低于-130℃的温度储存来自步骤(bii)的所述Treg群。合适的冷冻保存培养基可以是本领域已知的任何冷冻保存培养基，如以下详细论述的。优选地，冷冻保存培养基将含有一种或多种冷冻保护剂，合适的冷冻保护剂将在下面论述。优选地，冷冻保存培养基和冷冻保护剂将符合良好生产规范(GMP)标准。

本发明的方法还可以包括以下任何一个或多个步骤：在冷冻保存(步骤(b))之前，将所述Treg群(或Treg)，和/或在任何冷冻保存步骤中待使用的任何一种或多种(并且优选地所有)试剂或装置进行预冷却；以约-1℃/分钟的受控冷冻速率来冷冻(根据步骤(b))的所述Treg群(或Treg)；和/或在步骤(biii)之前将Treg群(或Treg)在-80℃下储存长达24小时。“试剂”可以包括例如冷冻保存培养基，“装置”可以包括例如保持受控冷冻速率的任何冷冻装置。合适的试剂和装置可以是本领域已知的用于冷冻保存的任何试剂或装置。优选地，这样的试剂和装置将符合GMP标准。

步骤(biii)可以包括将所述Treg群储存在液氮中。液氮的温度可以是约-196℃。

解冻所述Treg群(或Treg)的步骤可以包括将Treg组合物从低于-130℃的温度温热至介于约0至10℃之间的温度，可选地其中温热Treg群包括将Treg组合物置于维持在约37℃的水浴中。

冷冻保存步骤和/或解冻步骤可以根据GMP标准在封闭系统或A级环境中进行。

可以通过选择CD4⁺CD25⁺CD127^-细胞和/或CD4⁺CD25⁺CD127^low细胞或者通过选择CD4⁺CD25^hiCD127-细胞和/或CD4⁺CD25⁺CD127^low细胞将Treg群从样品中分离。可以通过选择CD45RA⁺细胞、优选地CD4⁺CD25⁺CD127^lowCD45RA⁺细胞将Treg群分离。因此，本发明的冷冻保存的Treg群可以包含至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的CD4⁺CD25⁺CD127^-、CD4⁺CD25⁺CD127^low Treg细胞和/或CD4⁺CD25⁺CD127^lowCD45RA⁺Treg细胞。

此外，冷冻保存Treg群可以包含少于20％的CD8+细胞、少于10％的CD8+细胞，优选地少于5％的CD8+细胞，更优选地少于2％的CD8+细胞。在这方面，本发明的方法可以包括在转导步骤之前(即，在上述方法的步骤(a)之前，其包括将编码FOXP3的多核苷酸引入Treg或Treg群中)耗竭CD8+细胞的步骤。

在第二方面，本发明提供了一种编码FOXP3的外源多核苷酸在将CD62L表达保存在已经冷冻保存或用于冷冻保存的Treg群或Treg中的用途。特别地，如上所讨论的，外源多核苷酸被引入Treg群或Treg中，并且其表达对Treg群或Treg内的CD62L表达水平提供保护作用。

本发明的第三方面提供了一种冷冻保存的工程化Treg群或Treg，其包含编码FOXP3多肽的外源多核苷酸，其中所述工程化Treg群或Treg在冷冻保存后具有相比于冷冻保存后的对应的非工程化Treg群或Treg更高的CD62L表达水平。

本发明还提供了一种通过本发明的方法可获得的或获得的Treg群或Treg(例如冷冻保存或解冻的细胞)。替代性地，本发明提供了一种解冻的Treg或Treg群，其包含编码FOXP3多肽的外源多核苷酸，其中工程化Treg或Treg群在解冻后具有相比于解冻后的相应非工程化Treg或Treg群更高的CD62L表达水平。

FOXP3多肽可以包含与SEQ ID NO.1或其功能片段具有至少80％同一性的氨基酸序列。编码FOXP3的多核苷酸可以在表达载体内。

该方法还可以包括将编码外源T细胞受体(TCR)的多核苷酸或者编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸引入Treg群或Treg中，或者冷冻保存的工程化Treg群或Treg可以包含编码外源T细胞受体(TCR)的多核苷酸或者编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。编码FOXP3多肽的多核苷酸和编码外源TCR或CAR的多核苷酸可以由单一表达载体提供。

TCR或CAR可以针对任何所需的靶分子，尤其针对在靶细胞上表达的靶分子。合适的TCR和CAR在下面论述。在一个实施方式中，CAR针对HLA抗原例如HLA-A2。

载体可以包含编码FOXP3多肽的第一多核苷酸和编码外源TCR或CAR的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸可操作地连接至相同的启动子，并且其中所述第一多核苷酸在所述第二多核苷酸的上游。在编码FOXP3的多核苷酸与编码外源TCR或CAR的多核苷酸之间可以存在内部自剪切序列。合适的启动子和自剪切序列在下面论述。

本发明的方法还可以包括将编码包含自杀部分的安全开关的多核苷酸引入Treg群或Treg中，或者本发明的冷冻保存的工程化Treg群或Treg可以包含含有自杀部分的安全开关。因此，在一个实施方式中，编码FOXP3和可选的CAR/TCR的多核苷酸/核酸分子也可以编码包含自杀部分的安全开关。特别地，核酸分子和构建体可以被设计成在单个核酸分子或构建体中编码单独的组分(例如，三种组分(例如，FOXP3、外源TCR或CAR、和安全开关))，使得这些组分可以在细胞中作为单独的组分，即作为离散实体(即，彼此不连接并且在物理上不同)产生。因此，由核酸分子编码的表达组分可以作为单独的和不同的或离散的功能多肽而分别位于细胞中或细胞上。这是通过在核酸分子中编码剪切序列、特别是在编码各自组分的核苷酸序列之间的自剪切序列来实现的。

本文公开的多核苷酸(例如，编码FOXP3和/或外源TCR或CAR和/或安全开关)可以通过病毒转导、优选逆转录病毒或慢病毒转导，而引入Treg群或Treg中。

在第四方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的冷冻保存的工程化Treg群或Treg，或解冻的Treg或Treg群。

在第五方面，本发明提供了一种如本文所述的冷冻保存的工程化Treg群或Treg，如本文所述的解冻的Treg或Treg群或如本文所述的药物组合物，用于预防和/或治疗疾病。

在第六方面，本发明提供了一种如本文所述的冷冻保存的工程化Treg群或Treg、如本文所述的解冻的Treg或Treg群或如本文所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途。

在第七方面，本发明提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，包括向受试者施用如本文所述的冷冻保存的工程化Treg群或Treg、如本文所述的解冻的Treg或Treg群或如本文所述的药物组合物。

所述疾病可以是自身免疫性疾病、过敏性疾病、移植排斥、移植物抗宿主病、炎症、神经炎性疾病(例如，肌萎缩性侧索硬化症(ALS))或代谢疾病(例如，糖尿病(例如，I型糖尿病))。本发明还涉及如本文所述的冷冻保存的工程化Treg群或Treg或如本文所述的药物组合物用于抑制免疫应答，或如本文所述的冷冻保存的工程化Treg群或Treg或药物组合物在抑制免疫应答中的用途。

在一个实施方式中，提供了一种与冷冻保存后的对应的非工程化Treg或Treg群相比提高冷冻保存后Treg或Treg群对次级淋巴器官的归巢能力的方法，包括在冷冻保存前将编码FOXP3多肽的多核苷酸引入Treg或Treg群的步骤。

在另一实施方式中，提供了一种用于删除如本文所定义的冷冻保存的Treg或Treg群的方法，所述冷冻保存的Treg或Treg群包含核酸分子/多核苷酸、表达构建体或编码FOXP3的载体，以及安全开关，该方法包括将冷冻保存的Treg或Treg群暴露于单独的细胞删除剂(比如，抗体)的步骤，所述细胞删除剂识别所述安全开关内的自杀部分。通过与自杀部分结合，细胞删除剂可以靶向待删除的细胞。该方法可以是体外方法。

本发明还可以提供一种提高在冷冻保存后Treg或Treg群的稳定性和/或抑制功能的方法，包括在冷冻保存前将本文提供的核酸分子/多核苷酸、表达构建体或载体引入细胞的步骤。

本发明的方法提供了一种离体扩增的冷冻保存的治疗Treg或Treg群，其在解冻后并且无需进一步扩增，保持了在冷冻保存前扩增的工程化Treg或Treg群中所见的高存活率、纯度和效力。因此，本发明的细胞可以用作现成的治疗剂。

本发明要求的保护由权利要求书限定。

附图说明

图1-存活率

图1显示了用表达FOXP3(C1)的构建体转导的新鲜Treg(即，非冷冻Treg)和冷冻Treg的存活率与非转导的(即，非遗传修饰的(非GMO))新鲜Treg和冷冻Treg的存活率的比较。在转导Treg和非转导Treg中，大约75％的细胞在冷冻后仍然存活。

图2-转导

图2显示了用C1转导的新鲜Treg和冷冻Treg都表达FOXP3。

图3-CD62L的细胞表面表达

图3显示了用表达FOXP3的构建体(C1)转导的新鲜Treg(即，非冷冻Treg)和冷冻Treg中CD62L的细胞表面表达和非转导的(非GMO)新鲜Treg和冷冻Treg中CD62L的细胞表面表达。与冷冻的非转导Treg相比，冷冻的转导Treg中CD62L的百分比表达显著增加。

图4-在不同冷冻保存溶液中的存活率

图4显示了新鲜Treg(即，非冷冻Treg)(“预冷冻”柱)和冷冻Treg的存活率，新鲜Treg和冷冻Treg这两者或者用表达FOXP3的构建体(C1)转导或者非转导(非GMO)(非转导Treg不表达外源FOXP3)。冷冻Treg在三种不同的冷冻保存溶液溶液1、溶液2和溶液3中冷冻，每种溶液具有五种不同的细胞密度。在所有条件下存活率接近100％。

图5-在不同冷冻保存溶液中的转导

图5显示了用表达FOXP3的构建体(C1)转导或者非转导(非GMO)的新鲜Treg中的转导(“预冷冻”柱)，以及用C1转导或者非转导(非GMO)且然后以每种溶液五种不同的细胞密度而冷冻在冷冻保存溶液1、冷冻保存溶液2或冷冻保存溶液3中的Treg中的转导。在新鲜条件和冷冻条件下，用C1转导的Treg表达高水平的FOXP3。在所有三种不同的冷冻保存溶液1、冷冻保存溶液2或冷冻保存溶液3中以及在所有五种不同的细胞密度中，在冷冻Treg中维持了这种高表达水平。

图6-CD62L在不同冷冻保存溶液中的细胞表面表达

图6显示了用表达FOXP3的构建体(C1)转导或者非转导(非GMO)的新鲜Treg中CD62L的细胞表面表达(“预冷冻”柱)，以及用C1转导或者非转导(非GMO)且然后以每种溶液五种不同的细胞密度而冷冻在冷冻保存溶液1、冷冻保存溶液2或冷冻保存溶液3中的Treg中CD62L的细胞表面表达。与非转导Treg相比，CD62L的百分比表达在用C1转导的Treg中增加，并且在所有三种冷冻保存溶液和所有五种不同的细胞密度中都是相当的。

具体实施方式

发明人惊奇地发现了用外源FOXP3转导调节细胞将其CD62L的表达保持在允许在冷冻保存后维持调节功能的水平。因此，本发明提供了一种将CD62L表达保存在已经冷冻保存的调节性T细胞(Treg)群(或Treg)中的方法，包括在冷冻保存前将编码FOXP3多肽的多核苷酸引入Treg群中。替代性地，本发明提供了一种用于产生冷冻保存的Treg或Treg群的方法，所述冷冻保存的Treg或Treg群具有与相应的非冷冻保存的Treg或Treg群相当的CD62L水平，该方法包括：(a)将编码FOXP3的多核苷酸引入Treg或Treg群中；和(b)冷冻保存所述Treg或Treg群。本发明还提供了一种冷冻保存的工程化Treg群(或Treg)，其包含编码FOXP3多肽的外源多核苷酸，其中所述工程化Treg群在冷冻保存后具有比冷冻保存后相应的非工程化Treg群更高的CD62L表达(或者替代性地，与对应的非冷冻保存的Treg或Treg群相当水平的CD62L表达)。

调节性T细胞

“调节性T细胞(Treg)或T调节性细胞”是具有免疫抑制功能的免疫细胞，其控制细胞病变免疫应答并且对于维持免疫耐受性是必需的。如本文所用，术语Treg是指具有免疫抑制功能的T细胞。

本文所用的T细胞是包括任何类型的T细胞(比如αβT细胞(例如，CD8或CD4+)、γδT细胞、记忆T细胞或Treg细胞)的淋巴细胞。

适当地，免疫抑制功能和术语“免疫应答”可以指Treg减少或抑制免疫系统响应于诸如病原体、同种抗原或自身抗原之类的刺激而促进的多种生理和细胞效应中的一种或多种效应的能力。此类效应的实例包括增加的常规T细胞(Tconv)的增殖和促炎细胞因子的分泌。任何这样的效应都可以用作免疫应答强度的指标。在Treg存在下Tconv引起的相对较弱的免疫应答将表明Treg抑制免疫应答的能力。例如，细胞因子分泌的相对减少将指示较弱的免疫应答，并且因此指示Treg抑制免疫应答的能力。Treg还可以通过调节共刺激分子在抗原呈递细胞(APC)比如B细胞、树突细胞和巨噬细胞上的表达来抑制免疫应答。CD80和CD86的表达水平可以用于评估活化Treg在共培养后在体外的抑制效力。

本领域已知用于测量免疫应答强度的指标从而测量Treg的抑制能力的测定。特别地，抗原特异性Tconv细胞可以与Treg共培养，并且对应抗原的肽被添加至共培养物中以刺激来自Tconv细胞的应答。Tconv细胞的增殖程度和/或它们响应于肽的添加而分泌的细胞因子IL-2的量可以用作共培养的Treg的抑制能力的指标。

与如本文所公开的Treg(或Treg群)共培养的抗原特异性Tconv细胞比在不存在Treg的情况下培养的相同Tconv细胞可以少增殖5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％、95％或99％。例如，与本发明冷冻保存的Treg共培养的抗原特异性Tconv细胞比在存在非工程化的冷冻保存的Treg的情况下培养的相同Tconv细胞可以少增殖5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。

与本文的Treg共培养的抗原特异性Tconv细胞比在不存在Treg的情况下(例如，在存在非工程化的冷冻保存的Treg的情况下)培养的对应Tconv细胞可以表达少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的效应细胞因子。效应细胞因子可以选自IL-2、IL-17、TNFα、GM-CSF、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13。适当地，效应细胞因子可以选自IL-2、IL-17、TNFα、GM-CSF和IFN-γ。

已经鉴定了几种不同的Treg亚群，其可以表达不同或不同水平的特定标志物。Treg通常是表达标志物CD4、CD25和FOXP3(CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺)的T细胞。Treg也可表达CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关分子-4)或GITR(糖皮质激素诱导的TNF受体)。

Treg细胞存在于外周血、淋巴结和组织中，并且用于本文的Treg包括胸腺衍生的天然Treg(nTreg)细胞、外周产生的Treg和诱导的Treg(iTreg)细胞。

可以在不存在表面蛋白CD127或者与表面蛋白CD127的低水平表达组合的情况下(CD4⁺CD25^+/hiCD127^-或CD4⁺CD25⁺CD127^low)通过使用细胞表面标志物CD4和CD25来鉴定Treg。使用此类标志物来鉴定Treg是本领域已知的，并且例如在Liu等(JEM；2006；203；7(10)；1701-1711)进行了描述。

Treg可以是CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺T细胞、CD4⁺CD25⁺CD127^-T细胞或CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺CD127^-/low T细胞。

适当地，Treg可以是天然Treg(nTreg)。如本文所用，术语“天然Treg”是指胸腺衍生的Treg。天然Treg是CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Helios⁺神经纤毛蛋白1⁺。与iTreg相比，nTreg具有PD-1(程序性细胞死亡-1，pdcd1)、神经纤毛蛋白1(Nrp1)、Helios(Ikzf2)和CD73的更高表达。基于Helios蛋白或神经纤毛蛋白1(Nrp1)的单独表达可以将nTreg与iTreg区分开。

Treg可以具有脱甲基化的Treg特异性脱甲基化区域(TSDR)。TSDR是调控Foxp3表达的重要甲基化敏感元件(Polansky,J.K.,等,2008.European journal of immunology,38(6),第1654-1663页)。

其他合适的Treg包括但不限于Tr1细胞(其不表达Foxp3，并且具有高IL-10产生)、CD8⁺FOXP3⁺T细胞和γδFOXP3⁺T细胞。

已知存在不同的Treg亚群，包括初始Treg(CD45RA⁺FoxP3^low)，效应物/记忆Treg(CD45RA^-FoxP3^high)和产生细胞因子的Treg(CD45RA^-FoxP3^low)。“记忆Treg”是表达CD45RO并且被认为是CD45RO⁺的Treg。这些细胞与初始Treg相比具有增加水平的CD45RO(例如，高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的CD45RO)，并且这些细胞与初始Treg相比优选地不表达或具有低水平的CD45RA(mRNA和/或蛋白质)(例如，与初始Treg相比低至少80％、90％或95％的CD45RA)。“产生细胞因子的Treg”是这样的Treg：与初始Treg相比不表达CD45RA(mRNA和/或蛋白质)或者具有非常低水平的CD45RA(mRNA和/或蛋白质)的Treg(例如与初始Treg相比少至少80％、90％或95％的CD45RA)，并且与记忆Treg相比具有低水平的FOXP3，例如与记忆Treg相比小于50％、60％、70％、80％或90％的FOXP3。产生细胞因子的Treg可以产生干扰素γ，并且与初始Treg相比可以在体外具有较低的抑制性(例如，与初始Treg相比小于50％、60％、70％、80％或90％的抑制性)。

本文中提及的表达水平可以指mRNA或蛋白质表达。特别地，对于细胞表面标志物比如CD45RA、CD25、CD4、CD45RO、CD62L等，表达可以指细胞表面表达，即，在细胞表面上表达的标志物蛋白的量或相对量。表达水平可以通过任何本领域已知的方法测定。例如，mRNA表达水平可以通过Northern印迹/阵列分析测定，蛋白表达可以通过蛋白质印迹测定或者优选地通过使用用于细胞表面表达的抗体染色的FACS测定。

特别地，Treg可以是初始Treg。如本文可互换使用的“初始调节性T细胞、初始T调节性细胞或初始Treg”是指表达CD45RA的Treg细胞(特别是在细胞表面上表达CD45RA的Treg细胞)。因此，初始Treg被描述为CD45RA⁺。初始Treg通常代表没有通过其内源TCR被肽/MHC激活的Treg，然而效应/记忆Treg涉及通过其内源TCR的刺激而被激活的Treg。通常，初始Treg可以表达相比于非初始的Treg细胞(例如记忆Treg细胞)多至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的CD45RA。替代性地，初始Treg细胞与非初始的Treg细胞(例如，记忆Treg细胞)相比可以表达至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、或100倍的CD45RA量。CD45RA的表达水平可以通过本领域的方法例如通过使用市售抗体的流式细胞术而容易地确定。通常，非初始Treg细胞不表达CD45RA或表达低水平的CD45RA。

特别地，初始Treg可能不表达CD45RO，并且可以被认为是CD45RO^-。因此，初始Treg可以表达与记忆Treg相比少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的CD45RO，或者替代性地，与记忆Treg细胞相比的至少少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍或100倍的CD45RO。

如上所述，尽管初始Treg表达CD25，但CD25表达水平可能低于记忆Treg中的表达水平，这取决于初始Treg的来源。例如，对于从外周血分离的初始Treg，CD25的表达水平可以比记忆Treg低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。这种初始Treg可以被认为表达中等水平至低水平的CD25。然而，本领域技术人员将理解的是，从脐带血分离的初始Treg可能不显示这种差异。

通常，本文定义的初始Treg可以是CD4⁺、CD25⁺、FOXP3⁺、CD127^low、CD45RA⁺。

如本文所用的CD127的低表达是指与来自相同受试者或供体的CD4⁺非调节性或Tcon细胞相比CD127的较低表达水平。特别地，与来自相同受试者或供体的CD4⁺非调节性细胞或Tcon细胞相比，初始Treg可以表达少于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的CD127。CD127的水平可以通过本领域标准的方法来评估，包括通过用抗CD127抗体染色的细胞的流式细胞术来评估。

通常，初始Treg不表达或表达低水平的CCR4、HLA-DR、CXCR3和/或CCR6。特别地，初始Treg可以表达相比于记忆Treg更低水平的CCR4、HLA-DR、CXCR3和CCR6，例如低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的的表达水平。

初始Treg还可以表达另外的标志物，包括CCR7⁺和CD31⁺。分离的初始Treg可以通过本领域已知的方法鉴定，包括通过测定在分离的细胞的细胞表面上存在或不存在一组上述的任何一种或多种标志物。例如，CD45RA、CD4、CD25和CD127 low可以用于确定细胞是否是初始Treg。确定分离的细胞是否为初始Treg或者是否具有所需表型的方法可以如下文关于可以进行的其他步骤所论述的那样进行，用于确定细胞标志物的存在和/或表达水平的方法是本领域公知的并且该方法包括例如使用市售抗体的流式细胞术。

适当地，Treg或Treg群从样品中分离，其中样品包含获自受试者的全血、脐带血、白细胞锥、血锥、外周血单核细胞(PBMC)或一个或多个白细胞团(leukopak)，或者由获自受试者的全血、脐带血、白细胞锥、血锥、外周血单核细胞(PBMC)或一个或多个白细胞团组成。Treg可以从获自受试者的PBMC中分离。Treg可以从获自受试者的白细胞锥中分离。Treg可以从获自受试者的一个或多个白细胞团分离。适当地，从其获得样品的受试者是哺乳动物，优选人类。通常，样品可以通过抽血或通过单采来获得。

适当地，Treg是匹配的(例如，HLA匹配的)或者与待施用工程化Treg的受试者是自体同源。适当地，待治疗的受试者(即，工程细胞将被施用至其的受试者)是哺乳动物，优选人类。可以使用同种异体Treg，例如细胞已经经过基因编辑技术以防止排斥或GvHD。因此，Treg细胞可以从患者自己的外周血(第一方)离体产生或者在造血干细胞移植的环境中从供体外周血(第二方)产生或者从无关供体的外周血(第三方)产生。

适当地，Treg是细胞群的一部分。适当地，Treg群包含至少60％的Treg，比如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的Treg。在一个实施方式中，Treg群可以仅包含Treg。这样的群可以被称为“Treg群”或“富集的Treg群”。术语“Treg群(Treg population)”和“Treg的群(a population of Tregs)”在本文中可互换使用。下面讨论从样品中获得或分离Treg群的方法。本领域技术人员将理解的是，Treg群可以包含不具有调节表型的其他细胞类型。此外，由于引入编码FOXP3的多核苷酸，因此在本发明的方法期间Treg群中Treg的百分比可能增加。Treg群可以包含不同的Treg亚群或者可以包含单一的Treg亚群例如初始Treg。

在一些实施方式中，为了提供高纯度的Treg群，本发明的方法的分离步骤/富集步骤涉及CD8+细胞的耗竭。表达CD8的细胞的耗竭涉及降低群中这种细胞的百分比或数量，但是可能不会导致所有表达CD8的细胞的完全去除。在一些实施方式中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的CD8细胞可以从Treg群中耗竭。使用符合标准方案的CD8珠可以实现CD8耗竭。

在一些方面，Treg可以衍生自可诱导祖细胞(例如iPSC)或胚胎祖细胞向Treg的离体分化(例如如下所述直接分化成Treg或者通过分化成Tcon细胞和转化成Treg而间接分化成Treg)。本文所述的核酸分子或载体可以在分化成Treg之前或之后引入诱导祖细胞或胚胎祖细胞中。合适的分化方法是本领域已知的并且包括在Haque等,J Vis Exp.,2016,117,54720(通过引用并入本文)中公开的方法。

如本文所用，术语“常规T细胞”或Tcon或Tconv(本文可互换使用)意指表达αβT细胞受体(TCR)以及共受体的T淋巴细胞，所述共受体可以是分化簇4(CD4)或分化簇8(CD8)并且不具有免疫抑制功能。常规T细胞存在于外周血、淋巴结和组织中。适当地，可以通过引入包括编码FOXP3的序列的核酸而从Tcon产生工程化Treg。替代性地，可以通过在IL-2和TGF-β存在下体外培养CD4+CD25-FOXP3-细胞从Tcon产生工程化Treg。

本发明提供包含本文定义或描述的Treg的Treg或Treg群。本文所用的“Treg”也可称为“细胞”或“Treg细胞”，并且本文所用的“Treg群”也可以称为“细胞群”或“Treg细胞群”。应当理解的是，Treg群可以包含本发明的包含如本文所定义的核酸分子/多核苷酸分子、多肽分子、表达构建体或载体的Treg细胞，以及不包含如本文所述的核酸分子/多核苷酸分子、多肽分子、表达构建体或载体的Treg细胞，例如未转导或未转染的细胞。尽管在优选实施方式中，群中的所有Treg细胞可以包含本文所述的核酸分子/多核苷酸分子、多肽分子、表达构建体或载体，但是提供了具有至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的包含本发明的核酸分子/多核苷酸分子、多肽分子、表达构建体或载体的细胞的细胞群。

自然杀伤(NK)细胞是已报道具有调节作用的免疫细胞。特别地，CD56bright的NK细胞可以表现出调节特征。在这方面，本发明提供NK细胞或NK细胞群在本发明的任何方法中的用途(即，用NK细胞或NK群替代Treg细胞或Treg群)。还提供了NK细胞或群，其包含编码FOXP3多肽的外源多核苷酸，其中NK细胞或群在冷冻保存之后具有相比于冷冻保存后的对应的非工程化NK细胞或群更高的CD62L表达。

叉头框P3蛋白(FOXP3)

在本发明中，通过将编码FOXP3多肽的多核苷酸(在本文中有时称为第一多核苷酸)引入细胞中，从而在Treg中增加FOXP3表达。

“FOXP3”是叉头框P3蛋白的缩写名称。FOXP3是转录因子的FOX蛋白家族的成员，并且在调节性T细胞的发育和功能中作为调节途径的主要调节物发挥作用。本文所用的“FOXP3”包括FOXP3的变体、同种型和功能片段。

细胞(或细胞群)中FOXP3 mRNA和/或蛋白质的水平与未被修饰的对应细胞(或细胞群)相比可以增加。例如，根据本发明修饰的细胞(或这种细胞群)中FOXP3 mRNA和/或蛋白的水平可以增加至比未根据本发明修饰的对应细胞(或这种细胞群)中的水平高至少1.5倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍。细胞是Treg或者细胞群是Treg群。

适当地，根据本发明修饰的细胞(或此类细胞群)中FOXP3 mRNA和/或蛋白质的水平可以增加至比未根据本发明修饰的对应细胞(或此类细胞群)中的水平高至少1.5倍、2倍或5倍。细胞是Treg或者细胞群是Treg群。

用于测量特定mRNA和蛋白质水平的技术是本领域公知的。细胞群比如Treg群中的mRNA水平可以通过诸如Affymetrix ebioscience prime flowRNA测定、Northern印迹、基因表达的系列分析(SAGE)或定量聚合酶链式反应(qPCR)之类的技术来测量。细胞群中的蛋白质水平可以通过诸如流式细胞术、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC/MS)、蛋白质印迹或酶联免疫吸附测定(ELISA)之类的技术来测量。

“FOXP3多肽”是具有FOXP3活性的多肽，即，能够结合FOXP3靶DNA并作为调节Treg发育和功能的转录因子起作用的多肽。特别地，FOXP3多肽可以具有与野生型FOXP3(SEQ IDNO.1)相同或相似的活性。1)，例如可以具有野生型FOXP3多肽的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％或150％的活性。用于测量转录因子活性的技术是本领域公知的。例如，转录因子DNA结合活性可以通过ChIP测量。转录因子的转录调节活性可以通过定量其调节的基因的表达水平来测量。基因表达可以通过使用诸如Northern印迹、SAGE、qPCR、HPLC、LC/MS、Western印迹或ELISA之类的技术来测量从基因产生的mRNA和/或蛋白质的水平来定量。由FOXP3调节的基因包括细胞因子比如IL-2、IL-4和IFN-γ(Siegler等.Annu.Rev.Immunol.2006,24:209-2，通过引用并入本文)。如下面详细论述的，FOXP3或FOXP3多肽包括其功能片段、变体和同种型，例如SEQ ID NO.1的功能片段、变体和同种型。

“FOXP3的功能片段”可以指FOXP3多肽或编码FOXP3多肽的多核苷酸的部分或区域，其具有与全长FOXP3多肽或多核苷酸相同或相似活性。功能片段可以具有全长FOXP3多肽或多核苷酸的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的活性。本领域技术人员能够基于FOXP3的已知结构和功能特征而产生功能片段。这些片段例如在Song,X.,等,2012.Cell reports,1(6),第665-675页；Lopes,J.E.,等,2006.The Journal of Immunology,177(5),第3133-3142页；和Lozano,T.,等,2013.Frontiers in oncology,3,第294页中进行了描述。此外，在WO2019/241549(通过引用并入本文)中对N和C末端截短的FOXP3片段进行了描述，该N和C末端截短的FOXP3片段具有序列SEQ ID NO.5，如下所述。

“FOXP3变体”可以包括与FOXP3多肽或编码FOXP3多肽的多核苷酸至少50％、至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％相同，优选至少95％或至少97％或至少99％相同的氨基酸序列或核苷酸序列。FOXP3变体可以具有与野生型FOXP3多肽或多核苷酸相同或相似的活性，例如可以具有野生型FOXP3多肽或多核苷酸的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％或150％的活性。本领域技术人员能够基于FOXP3的已知结构和功能特征和/或使用保守取代来产生FOXP3变体。与野生型FOXP3相比，FOXP3变体可以具有在Treg细胞内相似或相同的周转时间(或降解速率)，例如具有在Treg中野生型FOXP3的周转时间(或降解速率)的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。一些FOXP3变体可以具有相比于野生型FOXP3减少的周转时间(或降解速率)，例如在SEQ ID NO.1的氨基酸418和/或氨基酸422具有氨基酸取代的FOXP3变体，例如S418E和/或S422A，如在WO2019/241549(通过引用并入本文)中所描述的那样，并且如SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.4所示，其分别代表aa418突变体、aa422突变体以及aa418和aa422突变体。

适当地，由本文所述的核酸分子、构建体或载体编码的FOXP3多肽可以包含人FOXP3的多肽序列，比如UniProtKB登录Q9BZS1(SEQ ID NO:1)或其功能片段或变体。

在本发明的一些实施方式中，FOXP3多肽包含与SEQ ID NO.1或其功能片段至少70％相同的氨基酸序列。适当地，FOXP3多肽包含与SEQ ID NO.1或其功能片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，FOXP3多肽包含SEQ ID NO.1或其功能片段或者由SEQ ID NO.1或其功能片段组成。

在一些实施方式中，如上所述，FOXP3多肽可以包含SEQ ID NO.1的残基418和/或残基422处的突变，如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一些实施方式中，FOXP3多肽可以在N末端和/或C末端被截短，导致产生功能片段。特别地，FOXP3的N和C末端截短的功能片段可以包含SEQ ID NO.5或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的其功能变体的氨基酸序列或者由SEQ ID NO.5或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的其功能变体的氨基酸序列组成。

适当地，FOXP3多肽可以是SEQ ID NO.1的变体，例如天然变体。适当地，FOXP3多肽是SEQ ID NO.1的同种型。例如，FOXP3多肽可以包含相对于SEQ ID NO.1的氨基酸位置72-106的缺失。替代性地，FOXP3多肽可以包含相对于SEQ ID NO.1的氨基酸位置246-272的缺失。

适当地，FOXP3多肽包含SEQ ID NO.6或其功能片段。SEQ ID NO.6代表说明性的FOXP3多肽。

适当地，FOXP3多肽包含与SEQ ID NO.6或其功能片段至少70％相同的氨基酸序列或者由与SEQ ID NO.6或其功能片段至少70％相同的氨基酸序列组成。适当地，FOXP3多肽包含与SEQ ID NO.6或其功能片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，FOXP3多肽包含SEQ ID NO.6或其功能片段或者由SEQ ID NO.6或其功能片段组成。

适当地，FOXP3多肽可以是SEQ ID NO.6的变体，例如天然变体。适当地，FOXP3多肽是SEQ ID NO.6或其功能片段的同种型。例如，FOXP3多肽可以包含相对于SEQ ID NO.6的氨基酸位置72-106的缺失。替代性地，FOXP3多肽可以包含相对于SEQ ID NO.6的氨基酸位置246-272的缺失。

适当地，编码FOXP3多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列或者由SEQ ID NO.7所示的多核苷酸序列组成，其代表说明性的FOXP3核苷酸序列。

在本发明的一些实施方式中，编码FOXP3多肽或变体的多核苷酸包含与编码功能性FOXP3多肽的SEQ ID NO.7或其片段至少70％相同的多核苷酸序列。适当地，编码FOXP3多肽或变体的多核苷酸包含与SEQ ID NO.7或其功能片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的多核苷酸序列。在本发明的一些实施方式中，编码FOXP3多肽或变体的多核苷酸包含编码功能性FOXP3多肽的SEQ ID NO.7或其片段或者由编码功能性FOXP3多肽的SEQ ID NO.7或其片段组成。

适当地，编码FOXP3多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列或者由SEQ ID NO.8所示的多核苷酸序列组成，其代表另一说明性的FOXP3核苷酸。

在本发明的一些实施方式中，编码FOXP3多肽或变体的多核苷酸包含与编码功能性FOXP3多肽的SEQ ID NO.8或其片段至少70％相同的多核苷酸序列。适当地，编码FOXP3多肽或变体的多核苷酸包含与编码功能性FOXP3多肽的SEQ ID NO.8或其功能片段至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的多核苷酸序列。在本发明的一些实施方式中，编码FOXP3多肽或变体的多核苷酸包含编码功能性FOXP3多肽的SEQ IDNO.8或其片段或者由编码功能性FOXP3多肽的SEQ ID NO.8或其片段组成。

适当地，编码FOXP3多肽或其功能片段或变体的多核苷酸可以是密码子优化的。适当地，编码FOXP3多肽或其功能片段或变体的多核苷酸可以被密码子优化以在人细胞中表达。

本文所用的术语“变体”包括对序列中的一个(或多个)氨基酸残基的任何取代、变异、修饰、置换、缺失和/或添加，只要所得的蛋白质或多肽保留所需的功能即可。替代性地，本文所指的变体或衍生物是功能性变体或衍生物。

通常，可以进行氨基酸取代，例如从1个、2个或3个至10个或20个取代，只要修饰的序列保留所需的活性或能力即可。氨基酸取代可以包括使用非天然存在的类似物。

蛋白质或肽也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默变化并导致功能上等同的蛋白质。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留内源功能即可。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸，并且具有相似亲水性值的不带电的极性头基团的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。

可以例如根据下面的表1进行保守取代。

表1

可以通过肉眼进行同一性比较，或者更通常地借助于容易获得的序列比较程序进行同一性比较。这些市售的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的同一性百分比。

可以在连续序列上计算百分比序列同一性，即一个序列与另一序列比对，并且一个序列中的每个氨基酸与另一序列中的对应氨基酸直接比较，一次一个残基。这被称为“无空位”比对。通常，这种无空位比对仅在相对较短数量的残基上进行。

尽管这是一种非常简单和一致的方法，但它没有考虑到，例如在其他方面相同的序列对中，核苷酸序列中的一个插入或缺失可能导致以下密码子未对准，因此当进行全局比对时潜在地导致百分比同源性的大幅降低。因此，大多数序列比较方法被设计为产生最佳比对，其考虑到可能的插入和缺失而不会过度惩罚总同源性得分。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。

然而，这些更复杂的方法将“空位罚分”分配给比对中出现的每个空位，使得对于相同数量的相同氨基酸而言，具有尽可能少的空位的序列比对——反映两个比较序列之间更高的相关性——将获得比具有许多空位的序列比对更高的得分。通常使用“仿射空位成本”，其对于空位的存在收取相对高的成本，并且对于空位中的每个后续残基收取较小的罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然将产生具有较少空位的优化比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当使用这样的软件进行序列比较时，优选地使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位罚分对于空位为-12并且对于每个延伸为-4。

因此，考虑到空位罚分，最大的百分比同源性/序列同一性的计算首先需要产生最佳比对。用于进行这种比对的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(威斯康辛大学,美国；Devereux等.(1984)Nucleic Acids Res.12:387)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST包(参见Ausubel等.(1999)同上–第18章),FASTA(Atschul等.(1990)J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA均可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等.(1999)同上,第7-58至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。另一种称为BLAST 2序列的工具也可以用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol.Lett.(1999)174:247-50；FEMS Microbiol.Lett.(1999)177:187-8)。

尽管最终的百分比同源性可以根据同一性来测量，但是比对过程本身通常不基于全有或全无的配对比较。相反，通常使用缩放的相似性得分矩阵，其基于化学相似性或进化距离为每个成对比较分配赋分。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵—BLAST程序套件的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或定制符号比较表(如果提供的话)(更多细节参见用户手册)。对于一些应用，优选的是使用GCG包的公共默认值，或者在其他软件的情况下，使用默认矩阵例如BLOSUM62。适当地，在整个参考序列和/或查询序列上确定同一性百分比。一旦软件产生了最佳比对，就可以计算百分比同源性，优选百分比序列同一性。软件通常将其作为序列比较的一部分并产生数值结果。

可以使用标准重组DNA技术比如定点诱变来制备变体和片段。在要进行插入的地方，可以制备编码插入以及与插入位点任一侧的天然存在序列相对应的5'侧翼区和3'侧翼区的合成DNA。侧翼区将含有与天然存在序列中的位点相对应的方便的限制性位点，使得可以用合适的酶切割序列并将合成DNA连接到切口中。然后根据本发明表达DNA以制备编码的蛋白质。这些方法仅是本领域已知的用于操作DNA序列的许多标准技术的说明，也可以使用其他已知技术。

本领域技术人员将理解的是，可以通过将编码增加FOXP3的转录和/或翻译或者增加FOXP3的半衰期(例如，增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或者增加FOXP3的功能(例如，通过转导的Treg的抑制能力确定，如先前所论述的那样测量)的蛋白质的多核苷酸引入细胞中来间接增加Treg内的FOXP3表达。例如，可以将多核苷酸引入Treg，其通过与内源FOXP3启动子或在编码区上游发现的非编码序列(CNS，例如CNS1、CNS2或CNS3)相互作用来增加内源FOXP3的转录。特别地，通过引入编码c-Rel、p65、Smad3或CREB中的任何一者或多者的多核苷酸可以在Treg内增加FOXP3表达。

在这一方面，本发明还提供了一种将CD62L表达保存在已经冷冻保存的调节性T细胞(Treg)群中的方法，该方法包括引入编码增加FOXP3的转录和/或翻译或增加FOXP3的半衰期或功能的蛋白质的多核苷酸。

替代性地，本发明还提供了一种将CD62L表达保存在用于冷冻保存的调节性T细胞(Treg)群或Treg中的方法，包括步骤(a)将编码增加FOXP3转录和/或翻译或增加FOXP3半衰期或功能的蛋白质的多核苷酸引入Treg群或Treg中和步骤(b)冷冻保存所述Treg群或Treg。

替代性地，本发明可以提供一种用于冷冻保存Treg(或Treg群)的方法，包括(a)将编码增加FOXP3的转录和/或翻译或增加FOXP3的半衰期或功能的蛋白质的多核苷酸引入Treg或Treg群中和(b)冷冻保存所述Treg或Treg群，其中所述冷冻保存的Treg或Treg群具有相比于对应的非工程化Treg或Treg群更高的CD62L表达水平。

在另一方面，本发明提供了一种用于产生冷冻保存的Treg或Treg群的方法，所述冷冻保存的Treg或Treg群具有与非冷冻保存的Treg或Treg群体相当的CD62L水平，该方法包括(a)将编码增加FOXP3的转录和/或翻译或增加FOXP3的半衰期或功能的蛋白质的多核苷酸引入Treg或Treg群和(b)冷冻保存所述Treg或Treg群。

本领域技术人员还将理解的是，将直接编码CD62L的多核苷酸引入如本文所论述的细胞(例如，Treg)中可以在冷冻保存后保持功能(例如，抑制功能)或稳定性。在这方面，本发明还提供了一种在冷冻保存期间/之后保持Treg或Treg群(或其他细胞，例如NK细胞)的功能或稳定性的方法，包括在冷冻保存之前将编码CD62L的多核苷酸引入细胞或细胞群中的步骤。本发明还提供了一种冷冻保存的细胞(特别是Treg)，其包含编码外源CD62L的多核苷酸，其中所述细胞具有与对应的非冷冻保存的细胞相当的功能或稳定性。多核苷酸可以编码包含SEQ ID NO.9或其功能片段或其功能变体的氨基酸序列的CD62L(即，保留SEQID NO.9的CD62L的功能的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的片段或变体)。变体可以与SEQ ID NO.9具有至少60％、70％、80％、90％或95％的同一性。

表型标志物表达

也称为L-选择蛋白的CD62L是存在于某些T淋巴细胞(例如，Treg)和某些其他免疫细胞(例如，嗜中性粒细胞)的细胞外表面上的归巢受体或细胞表面粘附分子。它属于蛋白质的选择蛋白家族，其识别唾液酸化的碳水化合物基团。它被ADAM17裂解。

CD62L在淋巴细胞-内皮细胞相互作用中起重要作用，并且CD62L表达与Treg扩增后更具抑制性的群有关。CD62L充当Treg的“归巢受体”以通过高内皮小静脉进入次级淋巴组织。存在于内皮细胞上的配体将与表达CD62L的Treg结合，从而减缓Treg通过血液的运输并且促进在该点进入次级淋巴器官。

如本文所用的术语“归巢”或“归属”意指行进到包含靶标例如结合靶标的位点或位置。在表达CD62L的Treg细胞的上下文中，这可能意味着行进到表达CD62L结合配偶体MADCAM1的位置。

CD62L是细胞表面标志物，并且CD62L以及其他标志物的存在指示扩增的细胞已经保留Treg表型。保留Treg表型的细胞也可能保留其通常的抑制功能。

CD62L通常具有以下氨基酸序列：

MIFPWKCQSTQRDLWNIFKLWGWTMLCCDFLAHHGTDCWT YHYSEKPMNWQRARRFCRDNYTDLVAIQNKAEIEYLEKTLPFSRSYYWIGIRKIGGIWTW VGTNKSLTEEAENWGDGEPNNKKNKEDCVEIYIKRNKDAGKWNDDACHKLKAALCYTASCQPWSCSGHGECVEIINNYTCNCDVGYYGPQCQFVIQCEPLEAPELGTMDCTHPLGNFSFSSQCAFSCSEG TNLTGIEETTCGPFGNWSSPEPTCQVIQCE PLSAPDLGIM NCSHPLASFSFTSACTFICSEGTELIGKKKTICESSGIWS NPSPICQKLD KSFSMIKEGD YNPLFIPVAVMVTAFSGLAF IIWLARRLKKGKKSKRSMND PY(SEQ ID NO.9)

与不含外源FOXP3的冷冻保存的Treg相比，如本文所述的冷冻保存的工程化Treg(或Treg群)可以具有保存的细胞表面标志物表达，特别是保存的CD62L细胞表面表达。本文所用的“保存的(preserved)”、“保存(preserving)”或“保存(preservation)”意指细胞表面标志物表达(例如，CD62L)的量保持与对应的新鲜(即，非冷冻保存或非冷冻)Treg上的细胞表面标志物表达的量相似或相当，即，细胞表面标志物表达可以与新鲜Treg上的细胞表面标志物表达的量相同(即，没有显著不同)，或者它可以比新鲜Treg上的表达仅低1％，最多低30％。优选地，其将小于不超过5％、小于不超过10％、小于不超过15％、小于不超过20％或小于不超过25％。应当理解的是，通常，用于比较细胞表面标志物(通常为CD62L)的表达水平的冷冻保存的Treg细胞和新鲜Treg细胞将是相同的细胞类型，或者衍生自相同的细胞类型。例如，应当将冷冻的初始CD45RA+Treg中的CD62L水平与新鲜或非冷冻的初始CD56RA+Treg中的CD62L水平进行比较。通常，对应的非冷冻保存的细胞(Treg)将以与本发明的细胞或本发明中使用的细胞相同的方式加工或处理，并且相同的多核苷酸序列将被引入对应的非冷冻保存的细胞中。然而，冷冻保存步骤(和任何解冻步骤)将不进行。因此，对应的非冷冻保存的细胞通常是对应的工程化的非冷冻保存的细胞。

替代性地，如本文所用的“保存的(preserved)”、“保存(preserving)”或“保存(preservation)”意指如本文所述的冷冻保存的工程化Treg上的细胞表面标志物的量高于(特别地，显著高于)对应的非转导的冷冻保存的Treg上的细胞表面标志物的量。优选地，细胞表面标志物表达的量将比非转导的冷冻保存的Treg上的细胞表面标志物表达高至少10％、高至少15％、高至少20％、高至少25％、高至少30％、高至少35％、高至少40％、高至少45％、高至少50％、高至少55％、高至少60％、高至少65％、高至少70％或高至少80％。如本文所用的术语“保存的(preserved)”或“保存(preserving)”可以与术语“维持的(maintained)”或“维持(maintaining)”互换。

如本文所用的术语“较高的CD62L表达”意指与没有外源FOXP3的冷冻保存的Treg相比，如本文所述的冷冻保存的工程化Treg具有增加的(或升高的)CD62L表达水平。因此，本文提及对应的非工程化细胞或Treg通常是指已经或将要经历与本发明或本发明中使用的细胞或Treg相同的冷冻保存步骤(和任何解冻步骤)的细胞或Treg，但编码FOXP3的外源多核苷酸不会被引入细胞。

包含如本文所定义的多核苷酸、多肽、表达构建体或载体的冷冻保存的Treg或Treg群(并且因此其具有如本文所定义的保存的和/或更高水平的CD62L表达)与如本文所定义的非工程化的冷冻保存的Treg或Treg群相比可以具有增加的抑制活性(例如，至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的增加的抑制活性)。

CD62L的表达可以通过本领域任何公知的方法确定，包括通过流式细胞术确定。用于CD62L检测和表达水平测定的抗体是市售的，例如Thermofisher CD62L(L-选择蛋白)单克隆抗体(MEL-14或DREG-56)。

如本文所述，编码FOXP3多肽的多核苷酸在冷冻保存之前被引入Treg中。术语“在冷冻保存之前”意指在Treg冷冻保存之前(即，在Treg冷冻之前)。因此，在引入编码FOXP3多肽的多核苷酸之前，不对如本文所述的Treg进行冷冻保存步骤。通常，在分离之后和扩增之前(这两者都可以在冷冻保存之前进行)将多核苷酸引入Treg中。

冷冻保存

如本文所用的术语“冷冻保存(cryopreservation)”或“冷冻保存(cryopreserving)”意指在细胞保持存活的条件下(例如，在冷冻期间和在任何随后的解冻步骤之后)冷冻Treg或Treg群。细胞的存活率可以通过本领域任何公知的方法来测量，例如使用活/死染色(例如，活/死^TM可固定近红外死细胞染色剂(Thermofisher)的流式细胞术来测量。通常，至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞将在冷冻保存期间和之后保持存活。因此，存活率是指活细胞。本领域技术人员将理解的是，冷冻保存可以允许细胞保持存活，这是由于应用了一种或多种可以有效地阻止细胞死亡并且可以维持细胞结构的条件(例如，使用特定温度、冷冻/解冻速率和/或冷冻保存剂)。这些条件是本领域已知的并且在下面进行论述。

“冷冻保存的Treg”或“冷冻保存的Treg群”是指在如上定义的细胞保持存活的条件下经历冷冻保存并且被冷冻保存(例如，在冷冻保存或冷冻状态下)的Treg或Treg群体。如前所述，“冷冻保存的Treg”包含外源FOXP3。这也可以称为“冷冻保存的治疗性Treg或Treg群”或“冷冻保存的工程化Treg或Treg群”。

“已经冷冻保存的Treg或Treg群”是指已经处于如上冷冻保存下并且可以冷冻保存(例如，处于冷冻保存状态)或者可以不再冷冻保存的Treg或Treg群，即，其包括处于解冻状态(即，先前冷冻保存)的Treg或Treg群。

如本文所用的“冷冻保存后”意指已经进行冷冻保存过程。冷冻保存后的Treg或Treg群可以处于冷冻保存状态(例如，在储存中)或者可以解冻或进行解冻。

“非冷冻保存的Treg”或“非冷冻保存的Treg群”是指尚未冷冻保存，即，从未冷冻保存或冷冻的Treg或Treg群。这样的细胞也可以被称为新鲜细胞。

“冷冻(freezing)”、“冷冻(frozen)”或“冷冻状态”具有其在本领域中的通常含义，并且是其中液体变为固体的过程或是该过程的结果。冷冻Treg或Treg群意味着将所述Treg或群的温度降低至其颗粒不再具有足够的能量以克服它们之间的吸引力的温度。

通常，冷冻保存的工程化Treg或Treg群将储存在-196℃。然而，冷冻保存的工程化Treg或Treg群可以储存在低于冰点(即，低于0℃的任何温度)的任何温度下，其中细胞(或一部分细胞)如上所述在下述温度保持存活：例如-50℃至-196℃、-80℃至-196℃的任何温度，或者低于-55℃、低于-60℃、低于-65℃、低于-70℃、低于-75℃、低于-80℃、低于-85℃、低于-90℃、低于-95℃、低于-100℃、低于-105℃、低于-110℃、低于-115℃、低于-120℃、低于-125℃、低于-130℃、低于-135℃、低于-140℃、低于-145℃、低于-150℃、低于-155℃、低于-160℃、低于-165℃、低于-170℃的任何温度。冷冻保存的Treg或Treg群可以在低于冷冻至-196℃的任何温度下储存，比如低于-175℃、低于-180℃、低于-185℃、或低于-190℃。优选地，冷冻保存的Treg或Treg群可以在-80℃、在低于-130℃的温度或者在约-196℃的液氮的气相下储存。更优选地，冷冻保存的Treg或Treg群可以储存在液氮中。

在本发明的冷冻保存步骤中，待使用的Treg或Treg群、任何一种或多种(例如，所有)试剂(例如，冷冻保存培养基)和装置(例如，受控速率装置和冷冻器，其中许多是本领域已知的，例如CryoMed、ThermoFisher)可以在冷冻保存过程开始时预冷冻(或预冷却)。如本文所用，“预冷冻(Pre-chilled)”或“预冷(pre-chilling)”意指将温度降低至约4℃至8℃之间。这确保了对细胞的温度冲击最小化。预冷步骤可以是例如约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟或30分钟长。

在冷冻保存期间，通常通过与包含如本文所述的一种或多种冷冻保护剂的冷冻保存培养基(也称为冷冻保存溶液)接触来保护Treg群。这通常在将Treg或Treg群的温度降低至冷冻保存温度，即，降低至Treg或Treg群将被保存的温度之前进行。Treg群可以被离心以形成细胞沉淀，并且在降低温度之前被重新悬浮于冷冻保存培养基中。

冷冻保存培养基通常包含完全生长培养基，其可以特别优化以在解冻时提供活细胞以及冷冻保护剂，如上所述。许多不同类型的冷冻保存培养基是市售的，例如ImmunoCult-XF T细胞培养基(StemCell)。优选地，冷冻保存培养基可以是符合GMP标准的任何培养基。冷冻保护剂是用于保护生物组织免受由冰晶形成引起的冷冻损伤的物质。冷冻保护剂分为两大类；可以穿过细胞膜的渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，其中任何一种都可以根据本发明的方法的冷冻保存步骤使用。渗透性冷冻保护剂的实例包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、甘油、蔗糖和1,2-丙二醇。非渗透性冷冻保护剂的实例包括但不限于羟乙基淀粉、白蛋白和聚乙烯吡咯烷酮。最常用的渗透性冷冻保护剂是DMSO，其通常与非渗透性试剂如自体血浆、血清白蛋白和/或羟乙基淀粉组合使用。本领域已知的任何冷冻保护剂可以用于本发明的方法中。优选地，本发明的方法中使用的冷冻保护剂可以是符合良好生产规范(GMP)标准的任何冷冻保护剂。

本领域技术人员将理解的是，可以重悬于冷冻保存培养基(即，含有一种或多种冷冻保护剂的培养基)中的Treg的数量可以取决于待提供给受试者的剂量，其将在Treg产品和待治疗的疾病或病症之间变化。Treg群可以以任何期望的细胞密度冷冻保存。

冷冻Treg或Treg群的最佳速率可以通过几个因素来确定，包括Treg细胞膜对水的渗透性、细胞表面与体积的比率以及所用冷冻保护剂的类型和浓度。Treg或Treg群可以在约4℃至-80℃之间连续冷却，并且特别地，可以使用受控的冷冻速率(例如，约-1℃/分钟)。替代性地，受控的冷冻速率可以是例如约-2℃/分钟、-3℃/分钟、-4℃/分钟或-5℃/分钟。为了实现受控速率冷冻，可以使用本领域已知的任何合适的受控速率冷冻装置。本领域技术人员将理解的是，冰成核(即，通过细胞外液中的冰晶形成诱导群冷冻)可以通过任何合适的方式在约-5℃下引发。一旦温度达到约-80℃，就可以将Treg或群直接转移到液氮(-196℃)中进行储存。

Treg或Treg群可以在-80℃下储存任何期望的时间长度，例如从约4小时至48小时的任何时间，优选地4小时至16小时或最多24小时，然后可以转移至在低于-130℃的温度下的液氮储存。替代性地，一旦Treg或Treg群达到-80℃，就可以将其立即转移到低于-130℃的温度下的液氮储存中。在液氮中的储存可以持续任何期望的时间量。储存可以持续任何数量的天或周。通常，储存可以是长期的，即持续任何月数、持续一年或持续任何年数，例如2年、5年、10年、20年、50年或100年。

替代性地，Treg或Treg群可以通过玻璃化冷冻保存。玻璃化是一种非常快速的冷冻保存方法，其中Treg或Treg群可以在短时间内(通常在1秒内)从约37℃转变为-196℃，导致极快的冷却速率。

Treg或Treg群可以在冷冻保存后解冻。“解冻(thawing)”、“解冻的(thawed)”或“解冻状态”具有其在本领域中的通常含义，并且是其中固体变为液体的过程或是该过程的结果。解冻Treg或Treg群意味着将所述Treg或群的温度升高至其颗粒具有足够能量以克服它们之间的吸引力的温度。因此，为了解冻Treg或Treg群，通常采用加热。通常，解冻的细胞将能够扩增和/或作为Treg起作用(例如将能够引发其免疫抑制功能)。因此，解冻的Treg或Treg群是指已经经历冷冻保存和解冻过程的Treg或群。本领域技术人员将理解的是，解冻的Treg群或解冻过程可能不会导致群的完全解冻，并且群内的一部分细胞可以保持冷冻。例如，解冻的Treg群可以包含至少10％、20％、30％、40％或50％冷冻或冷冻保存的细胞。替代性地，解冻的Treg群可以包含不超过50％、40％、30％、20％或10％冷冻或冷冻保存的细胞。

最佳解冻速率根据所用的冷冻保存条件而变化。通常，可以对冷冻保存的Treg细胞应用快速加热，这可以通过在约37℃的温度下的水浴中放置或搅拌(例如，通过摇动)组合物来实现。Treg或Treg群可以被温热至冷冻温度(约0℃-10℃)直至保留小冰晶，或者可以被温热至约37℃的人体温度例如用于直接施用于患者。

在一个实施方式中，冷冻保存的Treg或Treg群可以被温热至其从固体变为液体的温度并且直接施用于患者。

本发明的Treg或Treg群可以肠胃外施用，例如静脉内施用或者通过输注技术施用。如本文所用的肠胃外施用意指除肠内和局部施用之外的通常通过注射的施用方式，并且包括静脉内注射和输注、肌内注射和输注、动脉内注射和输注、鞘内注射和输注、囊内注射和输注、眶内注射和输注、心内注射和输注、关节内注射和输注、经气管注射和输注、皮内注射和输注、腹膜内注射和输注、皮下注射和输注、表皮下注射和输注、囊下注射和输注、蛛网膜下注射和输注、脊柱内注射和输注和胸骨内注射和输注。

T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)

适当地，本发明的Treg或Treg群还可以包含外源TCR或CAR。

TCR是结合抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原片段作为指导免疫应答的一部分的细胞表面分子。适当地，TCR可以是重组蛋白，换句话说，TCR可以是本发明的Treg不能天然表达的外源蛋白。

本文所用的术语“TCR”和“CAR(嵌合抗原受体)”是指可以赋予Treg细胞(例如，Treg)抗原特异性的工程化受体。

CAR也称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。CAR通常包含细胞外结构域、跨膜结构域以及胞内结构域，其中细胞外结构域包含本文称为抗原结合结构域的抗原特异性靶向区域，胞内结构域可选地包含一个或多个共刺激结构域和细胞内信号传导结构域。抗原结合结构域通常通过铰链结构域与跨膜结构域连接。CAR的设计以及它们可能包含的各种结构域在本领域中是公知的。

CAR的抗原结合结构域可以衍生自或获自结合(即，对其具有亲和力)所需靶抗原或更一般地所需靶分子的任何蛋白质或多肽。这可以是例如配体或受体、或者靶分子的生理结合蛋白、或者其一部分、或者合成的或衍生的蛋白。靶分子通常可以在细胞例如靶细胞的表面上表达，或者在靶细胞附近的细胞上表达(对于旁观者效应)，但不是必需的。根据抗原结合结构域的性质和特异性，CAR可以识别可溶性分子，例如其中抗原结合结构域基于或衍生自细胞受体。

抗原结合结构域最常衍生自抗体可变链(例如，它通常采用scFv的形式)，但也可以从T细胞受体可变结构域或如上所述的其他分子比如配体的受体或其他结合分子而产生。

CAR通常表达为还包含信号序列(也称为前导序列)的多肽，特别是将CAR靶向细胞质膜的信号序列。这通常位于抗原结合结构域旁边或附近，通常位于抗原结合结构域的上游。因此，CAR的细胞外结构域或胞外结构域可以包含信号序列和抗原结合结构域。

抗原结合结构域为CAR提供了结合预定目标抗原的能力。抗原结合结构域优选地靶向临床感兴趣的抗原或疾病部位的抗原。

如上所述，抗原结合结构域可以是具有特异性识别和结合生物分子(例如，细胞表面受体或其组分)的能力的任何蛋白质或肽。抗原结合结构域包括感兴趣的生物分子的任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的结合配偶体。说明性的抗原特异性靶向结构域包括抗体或抗体片段或衍生物、受体的细胞外结构域、细胞表面分子/受体的配体、或其受体结合结构域以及肿瘤结合蛋白。尽管如下所述，抗原特异性靶向结构域可以优选地为抗体或衍生自抗体，但是也包括其他抗原特异性靶向结构域，例如由抗原肽/MHC或HLA组合形成的抗原特异性靶向结构域，该抗原肽/MHC或HLA组合能够结合移植、炎症或疾病部位具有活性的Tcon细胞的TCR。

抗原结合结构域可以是抗体或者衍生自抗体。抗体衍生的结合结构域可以是抗体的片段或抗体的一个或多个片段的基因工程产物，该片段参与与抗原的结合。实例包括可变区(Fv)、互补决定区(CDR)、Fab或F(ab’)₂，或者轻链可变区和重链可变区可以在单链(例如，作为ScFv)中并且以任一取向(例如，V_L-V_H或V_H-V_L)连接在一起。V_L序列和/或V_H序列可以被修饰。特别地，框架区可以被修饰(例如，被取代，例如以使抗原结合结构域人源化)。其他实例包括重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、骆驼抗体(VHH)和单结构域抗体(SAB)。

通常，结合结构域是单链抗体(scFv)。scFv可以是鼠、人或人源化scFv。

关于抗体或其抗原结合片段的“互补决定区”或“CDR”是指抗体的重链或轻链的可变区中的高度可变环。CDR可以与抗原构象相互作用并且在很大程度上决定与抗原的结合(尽管已知一些框架区参与结合)。重链可变区和轻链可变区各自含有3个CDR。“重链可变区”或“VH”是指抗体的重链片段，其含有插置在称为框架区的侧翼区段之间的三个CDR，其比CDR更高度保守并且形成支架以支持CDR。“轻链可变区”或“VL”是指抗体的轻链片段，其含有插置在框架区之间的三个CDR。“Fv”是指具有完整抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由与单个重链的可变区结合的单个轻链的可变区组成。“单链Fv抗体”或“scFv”是指由直接或通过肽接头序列以任一取向彼此连接的轻链可变区和重链可变区组成的工程化抗体。可以使用本领域公知的方法制备特异性结合预定抗原的抗体。此类方法包括噬菌体展示、产生人或人源化抗体的方法或使用经工程化以产生人抗体的转基因动物或植物的方法。部分或完全合成的抗体的噬菌体展示文库是可获得的，并且可以筛选能够结合靶分子的抗体或其片段。人抗体的噬菌体展示文库也是可获得的。一旦鉴定，就可以分离和/或确定编码抗体的氨基酸序列或多核苷酸序列。

CAR可以针对任何期望的靶抗原或分子。这可以根据预期的治疗和期望治疗的病症来选择。例如，它可以是与特定病症相关的抗原或分子，或者是与期望靶向治疗该病症的细胞相关的抗原或分子。通常，抗原或分子是细胞表面抗原或分子。

术语“针对”与“特异于”或“抗”是同义的。换句话说，CAR识别靶分子。因此，这意味着CAR能够特异性结合指定或给定的抗原或靶标。特别地，CAR的抗原结合结构域能够特异性结合靶分子或抗原(更特别地，当CAR在细胞特别是免疫效应细胞的表面上表达时)。特异性结合可以区别于与非靶分子或抗原的非特异性结合。因此，表达CAR的细胞被定向或重定向以特异性结合表达靶分子或抗原的靶细胞，特别是在其细胞表面上表达靶抗原或分子的靶细胞。

可以由CAR靶向的抗原包括但不限于在与移植器官、自身免疫性疾病、过敏性疾病、代谢疾病(例如，糖尿病)和炎性疾病(例如，神经退行性疾病)相关的细胞上表达的抗原。

与器官移植物相关的抗原和/或与移植的器官相关的细胞包括但不限于存在于移植器官中但不存在于患者中的HLA抗原、或者在移植排斥期间表达上调的抗原比如CCL19、MMP9、SLC1A3、MMP7、HMMR、TOP2A、GPNMB、PLA2G7、CXCL9、FABP5、GBP2、CD74、CXCL10、UBD、CD27、CD48、CXCL11。

在一个实施方式中，CAR针对HLA抗原，特别是HLA-A2抗原。

针对此类抗原的抗体是本领域已知的，并且可以基于已知或可获得的抗体方便地获得或产生scFv。在这方面，例如在WO 2020/044055中，VH序列和VL序列以及CDR序列可公开获得，以帮助制备这种抗体结合结构域，其公开通过引用并入本文。可以使用WO 2020/044055中公开的任何抗原结合结构域或CDR序列、VH序列和/或VL序列。

在一个实施方式中，抗原结合结构域包含分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列以及分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示的VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列。

当CDR确实含有氨基酸序列修饰时，这可以是如上述SEQ ID NOs中所示的CDR序列的氨基酸残基的缺失、添加或取代。更具体地，修饰可以是氨基酸取代例如保守氨基酸取代，例如如上所述。较长的CDR可以耐受更多的氨基酸残基修饰。在CDR为5个或7个氨基酸残基长的情况下，修饰可以是1个或2个残基，例如1个残基。通常，可以存在对任何特定CDR序列的0个、1个、2个或3个修饰。此外，在一个实施方式中，CDR1和CDR2可以被修饰，并且CDR3可以不被修饰。在另一实施方式中，所有3个CDR都可以被修饰。在另一实施方式中，CDR不被修饰。

抗原结合结构域可以呈scFv的形式，其以任一顺序包含如上所述的VH结构域序列和VL结构域序列，例如VH-VL。VH序列和VL序列可以通过接头序列连接。

合适的接头可以容易地选择并且可以具有任何合适的长度，比如从1个氨基酸(例如，Gly)至30个氨基酸，例如从2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任一者至12个、15个、18个、20个、21个、25个、30个氨基酸中的任一者，例如5-30个氨基酸、5-25个氨基酸、6-25个氨基酸、10-15个氨基酸、12-25个氨基酸、15至25个氨基酸等。

CAR还优选地包含用以支持细胞外结构域(特别是抗原结合结构域)的铰链结构域远离细胞表面，并且CAR包含跨膜结构域。铰链和跨膜结构域可以包含来自具有铰链结构域和/或跨膜结构域的任何蛋白的铰链和跨膜序列，跨膜结构域包括I型跨膜蛋白、II型跨膜蛋白或III型跨膜蛋白中的任一者。

CAR的跨膜结构域还可以包含人工疏水序列。可以选择CAR的跨膜结构域以使其不发生二聚化。另外的跨膜结构域对于本领域技术人员将是明显的。CAR构建体中使用的跨膜(TM)区的实例是：1)CD28 TM区(Pule等,Mol Ther,2005,11月；12(5):933-41；Brentjens等,CCR,2007,9月15日；13(18Pt 1):5426-35；Casucci等,Blood,2013,11月14日；122(20):3461-72.)；2)OX40 TM区(Pule等,Mol Ther,2005,11月；12(5):933-41)；3)41BB TM区(Brentjens等,CCR,2007,9月15日；13(18Pt 1):5426-35)；4)CD3ζTM区(Pule等,Mol Ther,2005,11月；12(5):933-41；Savoldo B,Blood,2009,6月18日；113(25):6392-402.)；5)CD8aTM区(Maher等,Nat Biotechnol,2002,1月；20(1):70-5.；Imai C,Leukemia,2004,4月；18(4):676-84；Brentjens等,CCR,2007,9月15日；13(18Pt 1):5426-35；Milone等,Mol Ther,2009,8月；17(8):1453-64.)。可以使用的其他跨膜结构域包括来自CD4、CD45、CD9、CD16、CD22、CD33、CD64、CD80、CD86或CD154的那些。

铰链结构域可以方便地从与跨膜结构域相同的蛋白质获得，尽管这不是必需的。

替代性地，CAR可以包含衍生自CD8α跨膜结构域的结构域。

如本文所述的CAR的胞内结构域包含转导效应子功能信号并指导表达CAR的细胞在抗原结合时执行其特化功能所必需的基序。特别地，胞内结构域可以包含一个或多个(例如，两个或三个)免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，通常包含YXXL/I的氨基酸序列，其中X可以是任何氨基酸。细胞内信号传导结构域的实例包括但不限于T细胞受体的ζ链胞内结构域或其任何同系物(例如，η链、FcεR1γ和β链、MB1(Igα)链、B29(Igβ)链等)、CD3多肽结构域(Δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)以及其他参与T细胞转导的分子比如CD2、CD5和CD28。细胞内信号传导结构域可以包含人CD3ζ链胞内结构域、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的胞质尾、具有细胞质受体的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，或其组合。

可以使用的其他信号传导结构域包括CD28或CD27或其变体的信号传导结构域。另外的细胞内信号传导结构域对于本领域技术人员将是明显的，并且可以与本发明的替代实施方式结合使用。

CAR可以包含复合胞内结构域，复合胞内结构域包含T细胞共刺激分子的细胞内部分与例如CD3ζ的细胞内部分的融合物。这种复合胞内结构域可以称为第二代CAR，其可以在抗原识别后同时传递激活和共刺激信号。最常用的共刺激结构域是CD28的共刺激结构域。这提供了最有效的共刺激信号，即，免疫信号2，该免疫信号2触发T细胞增殖。CAR胞内结构域还可以包含一个或多个TNF受体家族信号传导结构域，比如OX40、4-1BB、ICOS或TNFRSF25的信号传导结构域。

安全开关

安全开关多肽为其在其中或其上表达的细胞提供自杀部分。这可用作安全机制，其允许在需要时，或实际上更一般地根据期望或需要，例如一旦细胞已经执行或完成其治疗效果时，就删除已经施用于受试者的冷冻保存的细胞。如上所述，本发明的Treg或本发明中使用的Treg可以另外包含安全开关多肽。

自杀部分具有导致细胞死亡或更一般地导致细胞消除或删除的诱导能力。自杀部分的实例是由自杀基因编码的自杀蛋白，其可以在如本文所述的Treg中或Treg上表达。本文的自杀部分是自杀多肽，即，在允许条件下，即诱导或开启的条件下，能够引起细胞删除的多肽。

自杀部分可以是多肽或氨基酸序列，其可以被施用给受试者的活化剂活化以执行细胞删除活性，或者在可以施用给受试者的底物存在下具有活性以执行细胞删除活性。在特定实施方式中，自杀部分可以代表施用于受试者的单独的细胞删除剂的靶标。通过与自杀部分结合，细胞删除剂可以靶向待删除的细胞。特别地，自杀部分可以被抗体识别，并且当在细胞表面上表达时，抗体与安全开关多肽的结合导致细胞被消除或删除。

自杀部分可以是HSV-TK或iCasp9。然而，自杀部分优选地是或包含被细胞删除抗体或其他能够引发细胞删除的结合分子识别的表位。在这样的实施方式中，安全开关多肽在细胞表面上表达。

特别地，自杀部分可以是被抗体利妥昔单抗识别的CD20表位。因此，在安全开关多肽中，自杀部分可以包含基于由抗体利妥昔单抗识别的来自CD20的表位的最小表位。可以使用抗体利妥昔单抗或具有利妥昔单抗的结合特异性的抗体来选择性地杀死表达包含该序列的安全开关多肽的冷冻保存的细胞。安全开关多肽在细胞表面上表达，并且当表达的多肽暴露于利妥昔单抗或具有相同结合特异性的抗体或者与利妥昔单抗或具有相同结合特异性的抗体接触时，细胞死亡随之发生。

例如，WO2013/153391的自杀构建体(通过引用并入本文)可以用于本文所述的Treg或Treg群。

多核苷酸

如本文所定义和在本文中可互换使用的核酸分子和多核苷酸/核酸序列可以包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。技术人员将理解的是，由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸分子/多核苷酸可以编码相同的多肽。

核酸分子/多核苷酸可以用本领域已知的任何方法修饰。可以进行这种修饰以增强本文定义的核酸分子/多核苷酸的体内活性或寿命。

核酸分子/多核苷酸/核苷酸序列(比如DNA核酸分子/多核苷酸/序列)可以重组、合成或者通过本领域技术人员可获得的任何方法产生。它们也可以通过标准技术克隆。

通常使用重组方法例如使用聚合酶链式反应(PCR)克隆技术来产生更长的核酸分子/多核苷酸/核苷酸序列。这将涉及制备一对引物(例如，约15个至30个核苷酸)，其位于期望克隆的靶序列的侧翼，从而使引物与从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA相接触，在引起期望区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(例如，通过用琼脂糖凝胶纯化反应混合物)并且回收扩增的DNA。引物可以被设计成含有合适的限制性内切酶识别位点，使得可以将扩增的DNA克隆到合适的载体中。

本文所述的核酸分子/多核苷酸还可以包含编码可选择标记的核酸序列。合适的可选择标记是本领域公知的，并且包括但不限于荧光蛋白比如GFP。合适地，可选择标记可以是荧光蛋白例如GFP、YFP、RFP、tdTomato、dsRed或其变体。在一些实施方式中，荧光蛋白是GFP或GFP变体。编码可选择标记的核酸序列可以以核酸构建体的形式与本文的核酸分子组合提供。这样的核酸构建体可以在载体中提供。

适当地，可选择标记/报告子结构域可以是基于荧光素酶的报告子、PET报告子(例如，钠碘同向转运体(NIS))或膜蛋白(例如，CD34、低亲和力神经生长因子受体(LNGFR))。

编码FOXP3和一种或多种其他多肽(例如CAR、安全开关和/或可选择标记)的核酸序列在包含在单一构建体内时可以通过一个或多个共表达位点彼此分开，所述共表达位点使得每个多肽能够作为离散实体表达。合适的共表达位点是本领域已知的，并且包括例如内部核糖体进入位点(IRES)和自剪切位点，比如本发明核酸分子中所包括的那些，如下所定义。在一个实施方式中，这可以是2A剪切位点，如下所述。

合适的自剪切结构域包括P2A序列、T2A序列、E2A序列和F2A序列。

使用可选择标记是有利的，这是因为它允许使用常规方法例如流式细胞术从起始细胞群中选择和分离已经成功引入核酸分子、构建体或载体(使得编码的FOXP3多肽和可能的CAR和安全开关多肽被表达)的细胞(例如，Treg)。

如本文所述的(例如编码FOXP3的)多核苷酸的表达通常由启动子控制。“启动子”是导致基因转录起始的DNA区域。启动子位于基因的转录起始位点附近且位于DNA上游(朝向有义链的5’区域)。可以使用任何合适的启动子，任何合适的启动子的选择可以由技术人员容易地进行。启动子可以来自任何来源，并且可以是病毒启动子或真核启动子，包括哺乳动物启动子或人启动子(即，生理启动子)。在一个实施方式中，启动子是病毒启动子。特定的启动子包括LTR启动子、EFS(或其功能性截短)、SFFV、PGK和CMV。在一个实施方式中，启动子是SFFV或病毒LTR启动子。“可操作地连接至相同的启动子”意指多核苷酸序列的转录可以从相同的启动子开始(例如第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列的转录从相同的启动子开始)，并且核苷酸序列被定位和定向用于从启动子开始转录。与启动子可操作地连接的多核苷酸在启动子的转录调节下。

载体

在本发明的一些实施方式中，多核苷酸在表达载体内。本文所用的术语“表达载体”意指能够表达FOXP3多肽(或另一种导致CD62L水平保持的多肽)的构建体。

载体是允许或促进实体从一个环境转移到另一环境的工具。如本文所用，并且作为例子，在重组核酸技术中使用的一些载体允许实体比如核酸区段(比方说，异源DNA区段，例如异源cDNA区段)转移到靶细胞中。

载体可以是非病毒的或病毒的。用于重组核酸技术的载体的实例包括但不限于质粒、mRNA分子(例如，体外转录的mRNA)、染色体、人工染色体和病毒。载体也可以是例如裸核酸(例如DNA)。在其最简单的形式中，载体本身可以是感兴趣的核苷酸。

本文使用的载体可以是例如质粒、mRNA或病毒载体，并且可以包括用于表达核酸分子/多核苷酸的启动子(如下所述)和可选的启动子的调节子。如本文所用的术语“核酸分子”包括多核苷酸。

在一个实施方式中，载体是病毒载体，比如逆转录病毒，如慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。

载体还可以包含另外的启动子，例如，在一个实施方式中，启动子可以是LTR例如逆转录病毒LTR或慢病毒LTR。长末端重复序列(LTR)是在逆转录转座子或通过逆转录病毒RNA的逆转录形成的原病毒DNA的任一端发现的重复数百或数千次的相同DNA序列。它们被病毒用于将它们的遗传物质插入宿主基因组中。在LTR中发现基因表达的信号：增强子、启动子(可以具有转录增强子或调控元件两者)、转录起始(比如，加帽)、转录终止子和聚腺苷酸化信号。合适地，载体可以包括5’LTR和3’LTR。

载体可以包含一个或多个另外的调节序列，所述一个或多个另外的调节序列可以在转录前或转录后起作用。“调节序列”是促进多肽表达的任何序列，例如用以增加转录物的表达或用以增强mRNA稳定性。合适的调节序列包括例如增强子元件、转录后调节元件和聚腺苷酸化位点。适当地，另外的调节序列可以存在于LTR中。合适地，载体可以包含例如与启动子可操作地连接的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。

可以使用本领域已知的多种技术比如转化和转导将包含如本文所述的核酸分子/多核苷酸的载体引入细胞中。几种技术是本领域已知的，比如用重组病毒载体感染以及核酸的直接注射和基因枪转化，其中所述重组病毒载体比如为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体和单纯疱疹病毒载体。

非病毒递送系统包括但不限于DNA转染方法。这里，转染包括使用非病毒载体将基因递送至靶细胞的过程。非病毒递送系统可以包括(优选地与核酸分子或构建体复合的)脂质体或两亲性细胞穿透肽。

典型的转染方法包括电穿孔、DNA基因枪、脂质介导的转染、压缩DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂质转染、阳离子剂介导的转染、阳离子表面两亲物(CFA)(Nat.Biotechnol.(1996)14:556)及其组合。

工程化Treg细胞可以通过引入如本文所定义的核酸分子、构建体或载体并且通过许多方法之一来产生，所述许多方法包括用病毒载体转导和用DNA或RNA转染。

如本文所定义的Treg细胞可以通过以下方式制备：将如本文所定义的核酸分子/多核苷酸、构建体或载体引入细胞(例如通过转导或转染)。

上文进一步论述了合适的细胞，但是该细胞可以来自从受试者分离的样品。受试者可以是供体受试者或者是用于治疗的受试者(即，细胞可以是自体细胞或者是用于引入至另一受体的供体细胞例如同种异体细胞)。

细胞可以通过包括以下步骤的方法产生：

(i)从受试者分离含有Treg细胞的样品或者提供含有Treg细胞的样品；以及

(ii)将如本文所定义的核酸分子、构建体或载体引入(例如，通过转导或转染)含有Treg细胞的样品中，以提供工程化Treg细胞群。

可以在该方法的步骤(ii)之前和/或之后从含有细胞的样品中分离、富集和/或产生富含靶Treg细胞的样品。例如，可以在步骤(ii)之前和/或之后进行Treg(或其他靶细胞)的分离、富集和/或产生，以分离、富集或产生富含Treg的样品。从含有细胞的样品中分离和/或富集可以在步骤(ii)之后进行，以富集包含如本文所述的编码FOXP3的核酸分子/多核苷酸、构建体和/或载体的Treg(或其他靶细胞)。

富含Treg的样品可以通过本领域技术人员已知的任何方法来分离或富集，例如通过FACS和/或磁珠分选来分离或富集。富含Treg的样品可以通过本领域技术人员已知的任何方法从含有细胞的样品中产生，例如通过引入编码FOXP3的DNA或RNA从Tcon细胞中产生和/或从诱导型祖细胞或胚胎祖细胞的离体分化中产生。用于分离和/或富集其他靶细胞的方法是本领域已知的。

适当地，工程化靶细胞可以通过包括以下步骤的方法产生：

(i)从受试者分离富含靶细胞的样品或者提供富含靶细胞的样品；以及

(ii)将如本文所定义的核酸、构建体或载体引入(例如，通过转导或转染)富含靶细胞的样品中，以提供工程化靶细胞群。

靶细胞可以是Treg细胞，或其前体或祖细胞。Treg细胞的分离可以包括以下步骤：

(i)分离CD4+T细胞；以及

(ii)从CD4+T细胞分离Treg。

分离可以包括使用免疫磁珠或荧光激活细胞分选(FACS)来选择所述T细胞或Treg细胞。

“工程化细胞”、“工程化Treg”或“工程化Treg群”意指已经被修饰以包含或表达非天然存在于细胞内的多核苷酸的细胞或细胞群。本领域技术人员将理解的是，尽管Treg表达FOXP3，但如本文所述的工程化细胞将包含编码FOXP3的非天然存在的多核苷酸序列(例如，包含非天然存在的启动子、调节序列、CAR、TCR等)。用于工程化细胞的方法是本领域已知的并且包括但不限于细胞的遗传修饰，例如通过转导(例如逆转录病毒或慢病毒转导)或转染(比如基于DNA或RNA的瞬时转染)，转染包括脂质转染、聚乙二醇、磷酸钙和电穿孔，如上所述。可以使用任何合适的方法将核酸序列引入细胞中。非病毒技术比如两亲性细胞穿透肽可以用于引入核酸。

非工程化Treg或细胞是不含有编码FOXP3的外源多核苷酸/核酸分子的Treg或细胞。因此，非工程化Treg或细胞可以包含其他外源多核苷酸(即，除FOXP3之外)。在一个实施方式中，非工程化Treg或细胞不含有任何外源多核苷酸/核酸分子。

适当地，工程化细胞是已经例如通过转导或通过转染被修饰的细胞。适当地，工程化细胞是例如通过转导或通过转染已经被修饰或其基因组已经被修饰的细胞。适当地，工程化细胞是已经通过逆转录病毒转导被修饰或其基因组已经被修饰的细胞。适当地，工程化细胞是已经通过慢病毒转导被修饰或其基因组已经被修饰的细胞。

如本文所用，术语“引入”是指用于将外源核酸例如DNA或RNA插入细胞中的方法。如本文所用，术语引入包括转导方法和转染方法。转染是通过非病毒方法将核酸引入细胞的过程。转导是通过病毒载体将外源DNA或RNA引入细胞的过程。可以通过许多手段之一引入如本文所述的核酸来产生工程化细胞，所述手段包括用病毒载体转导、用DNA或RNA转染。

细胞可以在引入如本文所述的核酸/多核苷酸之前或之后例如通过用抗CD3单克隆抗体或者用抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体两者处理来活化和/或扩增。还可以在抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体与IL-2的组合存在下扩增细胞。合适地，IL-2可以用IL-15取代。可以用于细胞(例如，Treg)扩增方案的其他组分包括但不限于雷帕霉素、全反式视黄酸(ATRA)和TGFβ。如本文所用，“活化”意指细胞已被刺激，从而导致细胞增殖。如本文所用，“扩增”意指细胞或细胞群已被诱导增殖。可以例如通过计数群中存在的细胞数量来测量细胞群的扩增。细胞的表型可以通过本领域已知的方法比如流式细胞术来确定。

组合物

药物组合物是包含治疗有效量的药物活性剂(即，Treg或Treg群)或者由治疗有效量的药物活性剂组成的组合物。它优选地包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是制药领域公知的，并且在例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑.1985)中描述。药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的施用途径和标准药学实践来选择。药物组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂或除载体、赋形剂或稀释剂之外的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂或增溶剂。应当理解的是，本发明的药物组合物可以是冷冻保存的药物组合物。

“药学上可接受的”包括制剂是无菌和无热原的。载体、稀释剂和/或赋形剂在与细胞或载体相容并且对其受体无害的意义上必须是“可接受的”。通常，载体、稀释剂和赋形剂将是无菌和无热原的盐水或输注介质，然而，也可以使用其他可接受的载体、稀释剂和赋形剂。

药学上可接受的载体的实例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

本文所述的Treg、Treg群或药物组合物可以以适于治疗和/或预防所需疾病或病症的方式施用，并且本文讨论了合适的施用途径。施用的量和频率将由诸如受试者的状况以及受试者的疾病或状况的类型和严重程度等因素决定，尽管合适的剂量可以通过临床试验确定。药物组合物可以相应地配制。

如本文所述的Treg、Treg群或药物组合物可以肠胃外施用例如静脉内施用，或者它们可以通过输注技术施用。Treg、Treg群或药物组合物可以以无菌水溶液的形式施用，所述无菌水溶液可以含有其他物质，例如足够的盐或葡萄糖，以使溶液与血液等渗。水溶液可以适当地缓冲(优选地，至3至9的pH)。药物组合物可以相应地配制。在无菌条件下制备合适的肠胃外制剂可通过本领域技术人员公知的标准制药技术容易地完成。

药物组合物可以包含输注介质(例如无菌等渗溶液)中的细胞。药物组合物可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

Treg、Treg群或药物组合物可以以单剂量或多剂量施用。特别地，Treg、Treg群或药物组合物可以以单次一次性剂量施用。药物组合物可以相应地配制。

药物组合物还可以包含一种或多种活性剂。药物组合物还可以包含一种或多种其他治疗剂比如淋巴消耗剂(例如，胸腺球蛋白、campath-1H、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、环磷酰胺、氟达拉滨)、mTOR的抑制剂(例如，西罗莫司、依维莫司)、抑制共刺激途径的药物(例如，抗CD40/CD40L、CTAL4Ig)和/或抑制特定细胞因子(IL6、IL-17、TNFα、IL18)的药物。

取决于待治疗的疾病/病症和受试者以及施用途径，Treg、Treg群或药物组合物可以以不同剂量施用(例如，以细胞/kg或者细胞/受试者测量)。在任何情况下，医师将确定最适合于任何个体受试者的实际剂量，并且其将随特定受试者的年龄、体重和反应而变化。然而，通常，对于本文的细胞，可以给予每个受试者5x10⁷至3x10⁹个细胞或1x10⁸至2x10⁹个细胞的剂量。

本文的Treg、Treg群和药物组合物可以用于治疗或预防疾病或病症。细胞和含有它们的组合物用于过继细胞治疗(ACT)。可以通过施用Treg细胞例如表达TCR或CAR的Treg细胞来治疗各种病症。如上所述，这些病症可以是对免疫抑制，特别是Treg细胞的免疫抑制作用有响应的病症。因此，本文所述的细胞、细胞群和药物组合物可以用于在受试者中诱导或实现免疫抑制。可以通过表达TCR或CAR来靶向在体内施用或修饰的Treg细胞。适合于这种治疗的病症包括感染性疾病、神经退行性疾病、炎性疾病或代谢性疾病或者更广泛地与任何不期望的或不想要的或有害的免疫应答相关的病症。

特别地，Treg细胞和Treg群以及组合物提供了用于诱导对移植物的耐受性的手段；治疗和/或预防细胞和/或体液移植排斥的手段；治疗和/或预防移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性疾病或过敏性疾病、诸如淀粉样侧索硬化症(ALS)的神经退行性疾病、诸如I型糖尿病的代谢疾病的手段；或者促进组织修复和/或组织再生的手段；或者改善炎症/抑制免疫应答的手段。细胞、细胞群和组合物可以用于包括向受试者施用如本文所述的细胞、细胞群或组合物的步骤的方法中。

如本文所用，“诱导对移植物的耐受性”是指在受体中诱导对移植器官的耐受性。换句话说，诱导对移植物的耐受性意指降低受体对供体移植器官的免疫应答的水平。诱导对移植器官的耐受性可以减少移植受体所需的免疫抑制药物的量，或者可以使得能够中断免疫抑制药物。在这方面，本发明还提供了一种用于诱导受试者对移植器官耐受性的方法，包括对受试者施用如本文所讨论的Treg、群或组合物。

例如，可以将Treg施用于患有疾病的受试者，以减轻、减少或改善疾病的至少一种症状，比如黄疸、尿黑、瘙痒、腹部肿胀或压痛、疲劳、恶心或呕吐、和/或食欲不振。至少一种症状可以减轻、减少或改善至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，或者至少一种症状可以完全减轻。

Treg可以施用于患有疾病的受试者，以减缓、减少或阻断疾病的进展。与未施用工程化细胞的受试者相比，疾病的进展可以减慢、减少或阻断至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，或者疾病的进展可以完全停止。

在一个实施方式中，受试者是经历免疫抑制治疗的移植受体。

适当地，受试者是哺乳动物。适当地，受试者是人。

移植物可以选自肝、肾、心脏、肺、胰腺、肠、胃、骨髓、血管化复合组织移植物以及皮肤移植物。

本发明的Treg、Treg群或药物组合物可以在解冻后/期间立即向患者施用，而无需进一步扩增。Treg、Treg群或药物组合物可以在解冻的约5分钟、10分钟、15分钟或30分钟，或者约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时内施用于患者。

用于治疗疾病或病症的方法涉及本文的细胞的治疗用途。在这方面，可以将细胞施用于患有现有疾病或病症的受试者，以减轻、减少或改善与疾病或病症相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断疾病的进展。适当地，治疗和/或预防细胞和/或体液移植排斥可以指施用有效量的细胞(例如，Treg)，使得移植受体需要的免疫抑制药物的量减少，或者可以使得能够中断免疫抑制药物。

预防疾病或病症涉及本文细胞的预防用途。在这方面，可以将细胞施用于尚未感染或发展疾病或病症和/或未显示疾病或病症的任何症状的受试者，以预防疾病或病症或者以减少或预防与疾病或病症相关的至少一种症状的发展。受试者可能具有发展疾病或病症的倾向或者被认为有发展疾病或病症的风险。

自身免疫性疾病或过敏性疾病可以选自：包括银屑病和皮炎(例如特应性皮炎)的炎性皮肤疾病；与炎性肠病(比如，克罗恩病和溃疡性结肠炎)相关联的反应；皮炎；诸如食物过敏、湿疹和哮喘之类的过敏性疾病；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)(包括狼疮性肾炎、皮肤狼疮)；糖尿病(例如，1型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化；诸如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的神经退行性疾病；慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)和青少年型糖尿病。

在一些实施方式中，待治疗的疾病或病症是神经/神经退行性疾病或病症/病状。在一些实施方式中，神经/神经退行性疾病或病症与炎症相关。因此，在一些实施方案中，本发明可以用于治疗或预防神经炎症或相关疾病或病症(例如降低其风险)。神经炎症可以是慢性的或急性的，优选慢性的。神经炎症可以是中枢或外周神经系统的神经炎症，优选中枢神经系统的神经炎症。

在一些实施方式中，神经疾病、病症或损伤选自肌萎缩性侧索硬化(ALS)、痴呆、额颞痴呆、阿尔茨海默病、血管性痴呆、混合型痴呆、克雅氏病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、亨廷顿病、tau蛋白病、Nasu-Hakola病、中枢神经系统狼疮、帕金森病、路易体痴呆、多系统萎缩(Shy-Drager综合征)、进行性核上性麻痹、皮质基底神经节变性、急性播散性脑脊髓炎、癫痫发作、脊髓损伤、创伤性脑损伤(例如，缺血和创伤性脑损伤)、抑郁症、自闭症谱系障碍和多发性硬化。在一些实施方案中，神经疾病、障碍或损伤是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、缺血和创伤性脑损伤、抑郁症和自闭症谱系障碍。

肌萎缩性侧索硬化症(ALS)(也称为运动神经元病或路格瑞氏症)是指具有各种病因的衰弱性疾病，其特征在于快速进行性虚弱、肌肉萎缩和肌束震颤、肌肉痉挛、说话困难(构音障碍)、吞咽困难(咽下困难)和呼吸困难(呼吸困难)。

因此，本发明提供了用于治疗的如本文所定义的Treg、Treg群或药物组合物(例如冷冻保存的、解冻的或通过本发明的方法可获得的Treg群)。

适当地，Treg可以是自体的。适当地，Treg可以是同种异体的。

适当地，Treg(例如工程化Treg)可以与一种或多种其他治疗剂(例如淋巴消耗剂(例如如上所述))组合施用。

Treg可以与一种或多种其他治疗剂同时或相继施用(即，在一种或多种其他治疗剂之前或之后)。

Treg可以在引入如本文所述的核酸分子之前或之后例如通过用抗CD3单克隆抗体或者用抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体两者处理来活化和/或扩增。上文讨论了扩增方案。优选地，活化和/或扩增过程发生在冷冻保存之前。优选地，解冻后不需要进一步活化和/或扩增。

可以在该方法的每个步骤之后、特别是在扩增之后洗涤Treg。

Treg细胞群可以通过本领域技术人员已知的任何方法(例如通过FACS或磁珠分选)而被进一步富集。

生产方法和冷冻保存的步骤可以在封闭且无菌的细胞培养系统中进行。

如前所述，本发明还提供了一种提高Treg或Treg群在冷冻保存后相比于对应的非工程化Treg或Treg群在冷冻保存后对次级淋巴器官的归巢能力的方法，包括在冷冻保存前将编码FOXP3多肽的多核苷酸引入Treg或Treg群中的步骤。

Treg或Treg群的“提高归巢能力”是指与不包含编码FOXP3的外源多核苷酸的Treg或Treg群相比，在体内施用后归巢或定位于次级淋巴器官的能力增加(例如增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。归巢能力可以通过任何已知的成像技术来测量。

此外，本发明提供了一种提高Treg或Treg群在冷冻保存后的稳定性和/或抑制功能的方法，包括在冷冻保存前将本文提供的核酸分子/多核苷酸、表达构建体或载体引入细胞中的步骤。增加稳定性是指稳定性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如，与对应的冷冻保存的非工程化Treg相比)。稳定性可以通过使用本领域已知的方法测量随时间存在的Treg数量来确定。增加Treg的抑制功能是指抑制功能增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如，与对应的冷冻保存的非工程化Treg相比)。抑制功能可以通过任何公知的测定法来确定，包括本文所述的测定法。替代性地，本发明提供了一种用于在冷冻保存后保存Treg或Treg群的稳定性和/或抑制功能的方法，包括在冷冻保存前将本文提供的核酸分子/多核苷酸、表达构建体或载体引入细胞中的步骤，其中该稳定性和/或抑制功能与对应的非冷冻保存的工程化Treg相当。可比较的功能/稳定性是指功能或稳定性可以与对应的非冷冻保存的工程化Treg相似或相同，例如具有至少70％、80％或90％的稳定性或功能。

本公开不限于本文公开的示例性方法和材料，并且与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于本公开的实施方式的实践或测试。数字范围包括定义该范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列以5’至3’取向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的取向从左到右书写。正确的核酸和氨基酸序列直接来自发明人。

在提供数值范围的情况下，应当理解的是，除非上下文另有明确规定，否则还具体公开了该范围的上限与下限之间的每个中间值至下限的单位的十分之一。在所述范围内的任何所述值或中间值与所述范围内的任何其他所述值或中间值之间的每个较小范围都包含在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围之外，并且其中任一限值、没有限值或两个限值都包括在较小范围内的每个范围也包括在本公开内，其受制于所述范围内的任何具体排除的限值。在所述范围包括限值中的一个限值或两个限值的情况下，排除那些所包括的限值中的任一个限值或两个限值的范围也包括在本公开中。

必须注意的是，除非上下文另有明确规定，否则本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指代物。

本文所用的术语“包括(comprising)”、“包括(comprises)”和“由……组成(comprised of)”与“包括(including)”、“包括(includes)”和“含有(contains)”是同义的，并且是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的构件、元件或方法步骤。术语“包括(comprising)”、“包括(comprises)”和“由……组成(comprised of)”也包括术语“由……组成(consisting of)”。

本文所讨论的出版物仅提供其在本申请的申请日之前的公开，并且通过引用并入本文。本文中的任何内容都不应被解释为承认这些出版物构成所附权利要求的现有技术。

在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的公开的方法、细胞、组合物和用途的各种修改和变化对于技术人员将是明显的。尽管已经结合具体的优选实施方案公开了本发明，但是应当理解的是，所要求保护的本发明不应完全限于这些具体实施方式。实际上，对技术人员明显的用于实施本发明的所公开模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。

现在将通过实施例对本发明进行进一步描述，这些实施例旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明，而并非旨在以任何方式限制本发明的范围。

实施例

材料和方法

克隆：

在内部设计构建体1(C1)，并且对整个序列进行密码子优化，以便在人细胞中表达并生产。将构建体克隆到pMP71骨架中，并且用质粒转化D5a高效细菌，并与选择剂氨苄青霉素一起生长。使用Miniprep试剂盒(Qiagen)提取DNA。通过PCR克隆将插入物转移到慢病毒骨架中。构建体1(C1)代表如本文所要求保护的本公开的构建体。

PBMC的收集：

白细胞锥由NHS血液和移植提供，并且白细胞团获自BioIVT。使用密度离心方案从锥分离PBMC。简言之，用1xPBS以1:1稀释血液，并且在Ficoll-Paque(GE Healthcare)上分层。将样品离心，取出白细胞层并在PBS中洗涤。

Treg分离方案：

使用RosetteSep^TM人CD4+T细胞富集混合液通过阴性选择对血细胞锥和白细胞团进行CD4富集。随后，使用密度离心分离CD4+细胞。然后使用CD25微珠II(Miltenyi)通过阳性选择来分离CD4+CD25+T细胞。在FACS分选之前，用流式细胞术抗体CD4 FITC(OKT4,Biolegend)、CD25 PE-Cy7(BC96,Biolegend)、CD127 BV421(A019D5,Biolegend)、CD45RABV510(HI100,Biolegend)和活/死^TM可固定近红外死细胞染色剂(Thermofisher)对CD4+CD25+级分进行染色。分选并使用CD4+CD25+CD127low CD45RA+(CD45RA+Treg)。

Treg培养基和扩增：

用人T活化剂CD3/CD28 Dynabeads^TM(Gibco)活化人调节性T细胞，并且在补充有IL-2和5％人血清(Sigma-Aldrich)的XVIVO(Lonza)中培养。每2天至3天用Treg培养基再喂养细胞。用Dynabeads^TM进行第二轮刺激以促进Treg细胞的进一步扩增。

转染和病毒颗粒生产：

慢病毒：

将HEK293T细胞接种并在DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)+10％胎牛血清(FBS)中培养24小时。使转染试剂达到室温并与感兴趣的DNA构建体/质粒、包装质粒(pD8.91)和病毒包膜(pVSV-G)混合。将PEI加入到稀释的DNA中并混合并加入到HEK293T中。转染后48小时收获上清液，将上清液过滤并浓缩病毒。

转导T细胞

用抗CD3和抗CD28 Dynabeads(Gibco)来活化Treg细胞，并且将Treg细胞重悬于T细胞培养基中。通过用Retronectin(Takahara-bio–Otsu，日本)包被制备非组织培养物处理的24孔板，并且将细胞悬浮液与慢病毒上清液一起加入。孵育细胞并隔天进行培养基交换。转导后12天将细胞用于实验。

流式细胞术染色以测定转导和FOXP3表达

从培养物中取出Treg细胞，然后洗涤，并且首先用在PBS中的活/死^TM可固定近红外死细胞染色剂(Thermofisher)染色，然后用在FACS染色缓冲液中的抗-CD4 AF700(RPA-T4,BD)、抗-CD34 FITC(QBEND/10,Thermofisher)和抗-CD3 PE-Cy7染色。对于FOXP3的细胞内染色，将细胞固定并透化并用抗-Foxp3 PE(150D/E4,Thermofisher)抗体染色。在AttuneNxT流式细胞仪上分析细胞。

转导细胞的流式细胞术表型

将Treg细胞从培养物中取出，并使用如上文所述的dextramer和活/死^TM可固定近红外死细胞染色剂对活细胞进行染色。使用抗CD62L BV650(Biolegend)进行细胞的表面染色。将细胞透化并用抗-Foxp3 PE(150D/E4,Thermofisher)染色。

人Treg细胞的冷冻保存和解冻

在体外扩增14天后，从Treg细胞中磁性取出Dynabead，并在含有1％人血清的细胞培养基中以1x10^6/mL的密度使细胞静息。第二天，将一半细胞冷冻保存，另一半新鲜细胞用于表型分析。通过将静息的Treg细胞再悬浮在冷冻保存培养基中以获得0.5-10x10⁶细胞/mL细胞悬浮液来进行冷冻保存。然后使用无菌巴斯德移液管将细胞转移到冷冻管中，并且使冷冻管在预冷冻的冷冻容器内在-80℃冷冻4小时至6小时。冷冻管最终转移到液氮罐中。通过在37℃下将冷冻管浸入水浴2分钟至3分钟来进行Treg细胞的解冻。然后将解冻的细胞悬浮液轻轻地倒入包含含有20％胎牛血清(FBS)的细胞培养基的锥形管中，并将细胞在300xg下离心10分钟。离心后，对细胞计数并用于表型分析。

用于测试不同冷冻保存溶液和细胞密度的方法

使用标准方案设计和制造内部构建体，构建体1(C1)。该构建体代表本文要求保护的本公开的构建体。

从白细胞团中分离初始Treg并且根据标准方案进行分选。用CD3/CD28珠激活分离的细胞，并在补充有IL-2和人血清的XVIVO(Lonza)中培养。细胞每2天至3天用培养基再次补料。在培养期间用CD3/CD28珠进行第二轮刺激以促进Treg细胞的进一步扩增。

Treg细胞在用慢病毒载体(慢病毒载体根据标准方案产生)与C1一起培养期间是非转导的或转导的。将载体和IL-2直接加入培养的Treg细胞中。

扩增后，取一部分细胞进行计数和流式细胞仪分析(“预冷冻”)。将剩余的细胞等分到5个不同的细胞体积中。将细胞离心并将细胞沉淀重悬于1ml冷冻保存溶液1、冷冻保存溶液2或冷冻保存溶液3中，得到5种不同的细胞密度/冷冻保存溶液(范围从原始细胞密度的1倍至100倍)。然后将细胞等分到冷冻管中并置于-80℃持续24小时，并且然后转移到液氮中。通过将冷冻管置于37℃水浴中直至剩余小冰晶体来进行Treg的解冻。

然后通过流式细胞术分析细胞以评估转导、FOXP3表达和表型。这是使用内部“健康”流式细胞仪组和内部“成熟”流式细胞仪组完成的。简言之，健康小组测量活/死的CD4/CD25、FOXP3、RQR8(使用抗-CD34抗体-指示转导)和凋亡标记。成熟组测量活/死的CD4、CD45RA(初始/SCM)、CD45RA-CCR7+(中央记忆),CD45RA-CCR7-(效应子记忆)和CD62L。结果示于图4至6中。

数据分析

使用流式细胞术分析软件FlowJo(Flowjo,LLC)来对流式细胞术数据进行分析。使用Graphpad Prism V.8(Graphpad,软件)进行所有统计分析。

实施例1-存活率评估

如上所述，收集新鲜和冷冻的非转导Treg，即，不含外源FOXP3的非遗传修饰Treg(非GMO)，并收集用表达FOXP3的构建体(C1(构建体1))转导的新鲜和冷冻的Treg，并用可固定的活力染料进行染色以用于流式细胞术分析。评估来自八个单独供体的细胞。构建体1(C1)是包含FOXP3、安全开关和CD34可选择标记的构建体。使用抗CD34抗体(比如，QBEND)检测CD34可选择标记，使得能够鉴定转导的细胞。C1代表如本文所要求保护的本公开的构建体。

图1显示了冷冻转导Treg的百分比存活率与冷冻非转导Treg的百分比存活率相当，在约75％。

实施例2-转导和FOXP3表达

如上所述，对用表达FOXP3(C1)的构建体转导的新鲜Treg和冷冻Treg的转导效率进行评估。使用抗CD34抗体选择转导细胞。评估来自6个单独供体的细胞。

图2显示了用C1转导的新鲜Treg和冷冻Treg都表达FOXP3。

实施例3-表型评估(CD62L的细胞表面表达)

如上所述，收集新鲜和冷冻的非转导Treg(非GMO)，即不含外源FOXP3的Treg，并收集用表达FOXP3的实验构建体(C1(构建体1))转导的新鲜和冷冻的Treg，并用与荧光团缀合的抗CD62L抗体进行染色以用于流式细胞术分析。评估来自八个单独供体的细胞。

图2显示了当这些细胞未被冷冻时，用FOXP3转导的Treg和非转导的Treg中的CD62L表达水平保持接近100％。冷冻保存后转导细胞和非转导细胞中CD62L表达水平均降低。然而，与非转导的Treg相比，用FOXP3转导的Treg在冷冻和解冻后保持显著更高水平的CD62L表达。

实施例4-在不同的冷冻保存溶液中的存活率评估

Treg用表达FOXP3的构建体(C1(构建体1))转导或者非转导，即不含外源FOXP3的非遗传修饰Treg(非GMO)。将这些Treg中的一些Treg新鲜用于存活率分析(图4中的“预冷冻”柱)，并且将其他Treg在三种不同的冷冻保存溶液，即，溶液1、溶液2和溶液3中以每种溶液五种不同的细胞密度进行冷冻。如上所述，收集新鲜和冷冻Treg并用活力染料染色以用于流式细胞术分析。使用抗CD34抗体选择用C1转导的细胞。评估来自5个单独供体的细胞。

图4显示了冷冻转导的和非转导的Treg的百分比存活与新鲜转导的和非转导的Treg的相当，几乎100％，并且在转导的和非转导的细胞中，在三种不同的冷冻保存溶液1、2和3中以及在所有五种细胞密度中，百分比存活几乎没有变化。

实施例5-在不同冷冻保存溶液中的转导和FOXP3表达

如上所述，在用表达FOXP3的构建体(C1)转导或非转导(即，不含外源FOXP3的非遗传修饰Treg(非GMO))的新鲜Treg(参见图5中的“预冷冻”柱)中，并且在用C1转导或者非转导并且已经在冷冻保存溶液1、2或3中以每种溶液五种不同的细胞密度冷冻的冷冻Treg中，对转导效率进行评估。使用抗CD34抗体来选择用C1转导的细胞。评估来自5个单独供体的细胞。

图5显示了用C1转导的新鲜和冷冻Treg表达高水平的FOXP3，并且在所有五种细胞密度下，所有3种冷冻保存溶液中FOXP3表达的百分比是一致的。

实施例6-在不同的冷冻保存溶液中的表型评估(CD62L的细胞表面表达)

Treg用表达FOXP3的构建体(C1(构建体1))转导或者非转导(即，不含外源FOXP3的非遗传修饰Treg(非GMO))。将这些Treg中的一些Treg新鲜用于表型分析(图6中的“预冷冻”柱)，并且将其他Treg在三种不同的冷冻保存溶液：溶液1，溶液2或溶液3中以每种溶液五种不同的细胞密度进行冷冻。如上所述，收集新鲜和冷冻Treg并用与荧光团缀合的抗CD62L抗体进行染色以用于流式细胞术分析。评估来自5个单独供体的细胞。

图6显示了在所有三种冷冻保存溶液1、2和3中以及在五种细胞密度下用FOXP3(C1)转导的Treg中的CD62L表达水平保持接近90％，而在所有条件下非转导Treg中的CD62L表达低得多。

序列表

<110> 圭尔医疗有限公司

<120> 用于冷冻保存工程化Treg的方法

<130> FSP1V230872ZX

<150> GB 2017678.0

<151> 2020-11-09

<150> GB 2107418.2

<151> 2021-05-25

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 431

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

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<223> FOXP3, aa 418和422 突变体

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1 5 10 15

Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala Pro Ser Gly

20 25 30

Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu Gln Asp Arg

35 40 45

Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His Ala Arg Thr

50 55 60

Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met Ile Ser Leu

65 70 75 80

Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys Ala Arg Pro

85 90 95

Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp Val Ser Arg

100 105 110

Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala Pro Arg Lys

115 120 125

Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro Leu Leu Ala

130 135 140

Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe Glu Glu Pro

145 150 155 160

Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp His Leu Leu Asp Glu Lys

165 170 175

Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln Ser Leu Glu

180 185 190

Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met Gln Ala His

195 200 205

Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val Ala Ser Ser

210 215 220

Asp Lys Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln Gly Pro Val

225 230 235 240

Val Pro Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser Leu Phe Ala

245 250 255

Val Arg Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr Phe Pro Glu

260 265 270

Phe Leu His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met Arg Pro Pro

275 280 285

Phe Thr Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu Ala Pro Glu

290 295 300

Lys Gln Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr Arg Met Phe

305 310 315 320

Ala Phe Phe Arg Asn His Pro Ala Thr Trp Lys Asn Ala Ile Arg His

325 330 335

Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser Glu Lys Gly

340 345 350

Ala Val Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe

355 360

<210> 6

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> FOXP3, 说明性变体

<400> 6

Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala

20 25 30

Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg

35 40 45

Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met

50 55 60

Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala

65 70 75 80

Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu

85 90 95

Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His

100 105 110

Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met

115 120 125

Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys

130 135 140

Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp

145 150 155 160

Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala

165 170 175

Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro

180 185 190

Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe

195 200 205

Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp His Leu Leu

210 215 220

Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln

225 230 235 240

Ser Leu Glu Gln Val Glu Glu Leu Ser Ala Met Gln Ala His Leu Ala

245 250 255

Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val Ala Ser Ser Asp Lys

260 265 270

Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln Gly Pro Val Val Pro

275 280 285

Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser Leu Phe Ala Val Arg

290 295 300

Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr Phe Pro Glu Phe Leu

305 310 315 320

His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met Arg Pro Pro Phe Thr

325 330 335

Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu Ala Pro Glu Lys Gln

340 345 350

Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr Arg Met Phe Ala Phe

355 360 365

Phe Arg Asn His Pro Ala Thr Trp Lys Asn Ala Ile Arg His Asn Leu

370 375 380

Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser Glu Lys Gly Ala Val

385 390 395 400

Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe Arg Lys Lys Arg Ser Gln Arg Pro

405 410 415

Ser Arg Cys Ser Asn Pro Thr Pro Gly Pro Glu Gly Arg Gly Ser Leu

420 425 430

Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn

435 440

<210> 7

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> FOXP3，说明性FOXP3多核苷酸

<400> 7

atgcccaacc ccaggcctgg caagccctcg gccccttcct tggcccttgg cccatcccca 60

ggagcctcgc ccagctggag ggctgcaccc aaagcctcag acctgctggg ggcccggggc 120

ccagggggaa ccttccaggg ccgagatctt cgaggcgggg cccatgcctc ctcttcttcc 180

ttgaacccca tgccaccatc gcagctgcag ctgcccacac tgcccctagt catggtggca 240

ccctccgggg cacggctggg ccccttgccc cacttacagg cactcctcca ggacaggcca 300

catttcatgc accagctctc aacggtggat gcccacgccc ggacccctgt gctgcaggtg 360

caccccctgg agagcccagc catgatcagc ctcacaccac ccaccaccgc cactggggtc 420

ttctccctca aggcccggcc tggcctccca cctgggatca acgtggccag cctggaatgg 480

gtgtccaggg agccggcact gctctgcacc ttcccaaatc ccagtgcacc caggaaggac 540

agcacccttt cggctgtgcc ccagagctcc tacccactgc tggcaaatgg tgtctgcaag 600

tggcccggat gtgagaaggt cttcgaagag ccagaggact tcctcaagca ctgccaggcg 660

gaccatcttc tggatgagaa gggcagggca caatgtctcc tccagagaga gatggtacag 720

tctctggagc agcagctggt gctggagaag gagaagctga gtgccatgca ggcccacctg 780

gctgggaaaa tggcactgac caaggcttca tctgtggcat catccgacaa gggctcctgc 840

tgcatcgtag ctgctggcag ccaaggccct gtcgtcccag cctggtctgg cccccgggag 900

gcccctgaca gcctgtttgc tgtccggagg cacctgtggg gtagccatgg aaacagcaca 960

ttcccagagt tcctccacaa catggactac ttcaagttcc acaacatgcg accccctttc 1020

acctacgcca cgctcatccg ctgggccatc ctggaggctc cagagaagca gcggacactc 1080

aatgagatct accactggtt cacacgcatg tttgccttct tcagaaacca tcctgccacc 1140

tggaagaacg ccatccgcca caacctgagt ctgcacaagt gctttgtgcg ggtggagagc 1200

gagaaggggg ctgtgtggac cgtggatgag ctggagttcc gcaagaaacg gagccagagg 1260

cccagcaggt gttccaaccc tacacctggc ccctga 1296

<210> 8

<211> 1352

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> FOXP3，说明性FOXP3多核苷酸

<400> 8

gaattcgtcg acatgcccaa ccccagaccc ggcaagcctt ctgccccttc tctggccctg 60

ggaccatctc ctggcgcctc cccatcttgg agagccgccc ctaaagccag cgatctgctg 120

ggagctagag gccctggcgg cacattccag ggcagagatc tgagaggcgg agcccacgcc 180

tctagcagca gcctgaatcc catgccccct agccagctgc agctgcctac actgcctctc 240

gtgatggtgg cccctagcgg agctagactg ggccctctgc ctcatctgca ggctctgctg 300

caggaccggc cccactttat gcaccagctg agcaccgtgg acgcccacgc cagaacacct 360

gtgctgcagg tgcaccccct ggaaagccct gccatgatca gcctgacccc tccaaccaca 420

gccaccggcg tgttcagcct gaaggccaga cctggactgc cccctggcat caatgtggcc 480

agcctggaat gggtgtcccg cgaacctgcc ctgctgtgca ccttccccaa tcctagcgcc 540

cccagaaagg acagcacact gtctgccgtg ccccagagca gctatcccct gctggctaac 600

ggcgtgtgca agtggcctgg ctgcgagaag gtgttcgagg aacccgagga cttcctgaag 660

cactgccagg ccgaccatct gctggacgag aaaggcagag cccagtgcct gctgcagcgc 720

gagatggtgc agtccctgga acagcagctg gtgctggaaa aagaaaagct gagcgccatg 780

caggcccacc tggccggaaa gatggccctg acaaaagcca gcagcgtggc cagctccgac 840

aagggcagct gttgtatcgt ggccgctggc agccagggac ctgtggtgcc tgcttggagc 900

ggacctagag aggcccccga tagcctgttt gccgtgcgga gacacctgtg gggcagccac 960

ggcaactcta ccttccccga gttcctgcac aacatggact acttcaagtt ccacaacatg 1020

aggcccccct tcacctacgc caccctgatc agatgggcca ttctggaagc ccccgagaag 1080

cagcggaccc tgaacgagat ctaccactgg tttacccgga tgttcgcctt cttccggaac 1140

caccccgcca cctggaagaa cgccatccgg cacaatctga gcctgcacaa gtgcttcgtg 1200

cgggtggaaa gcgagaaggg cgccgtgtgg acagtggacg agctggaatt tcggaagaag 1260

cggtcccaga ggcccagccg gtgtagcaat cctacacctg gccctgaggg cagaggaagt 1320

ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat cc 1352

<210> 9

<211> 372

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CD62L

<400> 9

Met Ile Phe Pro Trp Lys Cys Gln Ser Thr Gln Arg Asp Leu Trp Asn

1 5 10 15

Ile Phe Lys Leu Trp Gly Trp Thr Met Leu Cys Cys Asp Phe Leu Ala

20 25 30

His His Gly Thr Asp Cys Trp Thr Tyr His Tyr Ser Glu Lys Pro Met

35 40 45

Asn Trp Gln Arg Ala Arg Arg Phe Cys Arg Asp Asn Tyr Thr Asp Leu

50 55 60

Val Ala Ile Gln Asn Lys Ala Glu Ile Glu Tyr Leu Glu Lys Thr Leu

65 70 75 80

Pro Phe Ser Arg Ser Tyr Tyr Trp Ile Gly Ile Arg Lys Ile Gly Gly

85 90 95

Ile Trp Thr Trp Val Gly Thr Asn Lys Ser Leu Thr Glu Glu Ala Glu

100 105 110

Asn Trp Gly Asp Gly Glu Pro Asn Asn Lys Lys Asn Lys Glu Asp Cys

115 120 125

Val Glu Ile Tyr Ile Lys Arg Asn Lys Asp Ala Gly Lys Trp Asn Asp

130 135 140

Asp Ala Cys His Lys Leu Lys Ala Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ser Cys

145 150 155 160

Gln Pro Trp Ser Cys Ser Gly His Gly Glu Cys Val Glu Ile Ile Asn

165 170 175

Asn Tyr Thr Cys Asn Cys Asp Val Gly Tyr Tyr Gly Pro Gln Cys Gln

180 185 190

Phe Val Ile Gln Cys Glu Pro Leu Glu Ala Pro Glu Leu Gly Thr Met

195 200 205

Asp Cys Thr His Pro Leu Gly Asn Phe Ser Phe Ser Ser Gln Cys Ala

210 215 220

Phe Ser Cys Ser Glu Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ile Glu Glu Thr Thr

225 230 235 240

Cys Gly Pro Phe Gly Asn Trp Ser Ser Pro Glu Pro Thr Cys Gln Val

245 250 255

Ile Gln Cys Glu Pro Leu Ser Ala Pro Asp Leu Gly Ile Met Asn Cys

260 265 270

Ser His Pro Leu Ala Ser Phe Ser Phe Thr Ser Ala Cys Thr Phe Ile

275 280 285

Cys Ser Glu Gly Thr Glu Leu Ile Gly Lys Lys Lys Thr Ile Cys Glu

290 295 300

Ser Ser Gly Ile Trp Ser Asn Pro Ser Pro Ile Cys Gln Lys Leu Asp

305 310 315 320

Lys Ser Phe Ser Met Ile Lys Glu Gly Asp Tyr Asn Pro Leu Phe Ile

325 330 335

Pro Val Ala Val Met Val Thr Ala Phe Ser Gly Leu Ala Phe Ile Ile

340 345 350

Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Lys Gly Lys Lys Ser Lys Arg Ser Met

355 360 365

Asn Asp Pro Tyr

370

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 3PB2 VH CDR1

<400> 10

Asp Tyr Gly Met His

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 3PB2 VH CDR2

<400> 11

Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 3PB2 VH CDR3

<400> 12

Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 3PB2 VL CDR1

<400> 13

Gln Ser Ser Leu Asp Ile Ser His Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 3PB2 VL CDR2

<400> 14

Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 3PB2 VL CDR3

<400> 15

Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr

1 5

Claims (36)

1.一种将CD62L表达保存在已经冷冻保存的调节性T细胞(Treg)群中的方法，包括在冷冻保存之前将编码FOXP3多肽的多核苷酸引入所述Treg群中。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Treg群在冷冻保存后具有相比于冷冻保存后的相对应的非工程化Treg群更高的CD62L表达。

3.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述FOXP3多肽包含与SEQ ID NO.1或其功能片段至少80％相同的氨基酸序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中编码FOXP3的多核苷酸在表达载体内。

5.根据任一前述权利要求所述的方法，还包括将编码外源T细胞受体(TCR)的多核苷酸或者编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸引入所述Treg群中。

6.根据权利要求5所述的方法，其中编码所述FOXP3多肽的多核苷酸和编码所述外源TCR或CAR的多核苷酸由单一表达载体提供。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述载体包含编码所述FOXP3多肽的第一多核苷酸和编码所述外源TCR或CAR的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸可操作地连接至相同的启动子，并且其中所述第一多核苷酸在所述第二多核苷酸的上游。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中在编码FOXP3的多核苷酸与编码所述外源TCR或CAR的多核苷酸之间存在内部自剪切序列。

9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中通过病毒转导、优选逆转录病毒或慢病毒转导，将编码FOXP3的多核苷酸和/或编码外源TCR或CAR的多核苷酸引入所述Treg群中。

10.一种将CD62L表达保存在冷冻保存后的Treg群中的方法，包括步骤(a)将编码FOXP3多肽的多核苷酸引入Treg群中和步骤(b)冷冻保存所述Treg群。

11.根据权利要求10所述的方法，还包括以下步骤：

在将编码FOXP3多肽的所述多核苷酸引入Treg群中之前，将所述Treg群从样品中分离；和/或

解冻冷冻保存后的所述Treg群。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述样品由全血、脐带血、白细胞锥、血锥、外周血单核细胞(PBMC)或一个或多个白细胞团组成。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述步骤(b)包括以下步骤：

(bi)将所述Treg群悬浮在冷冻保存培养基中；

(bii)冷冻(bi)的所述Treg群；以及

(biii)在低于-130℃的温度储存(bii)的所述Treg群。

14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：

在步骤(b)之前，将所述Treg群和/或在所述冷冻保存步骤中待使用的任何一个或多个试剂和装置进行预冷却；

以约-1℃/分钟的受控冷冻速率来冷冻保存根据步骤(b)的所述Treg群；和/或

在步骤(biii)之前将所述Treg群在-80℃下储存长达24小时。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中解冻所述Treg群包括将所述Treg群从低于-130℃的温度温热至介于约0℃-10℃之间的温度，可选地其中温热所述Treg群包括将所述Treg群置于维持在约37℃的水浴中。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的方法，其中通过选择下述各项来分离所述Treg群：

(i)CD4⁺CD25⁺CD127^-和/或CD4⁺CD25⁺CD127^low细胞；或

(ii)CD4⁺CD25^hiCD127^-和/或CD4⁺CD25⁺CD127^low细胞。

17.根据权利要求11至16中任一项所述的方法，其中通过选择CD45RA⁺细胞、优选CD4⁺CD25⁺CD127^lowCD45RA⁺细胞，来分离所述Treg群。

18.一种编码FOXP3的外源多核苷酸在用于将CD62L表达保存在冷冻保存后的Treg群中的用途。

19.一种冷冻保存的工程化Treg群，其包含编码FOXP3多肽的外源多核苷酸，其中所述工程化Treg群在冷冻保存后具有相比于冷冻保存后的相对应的非工程化Treg群更高的CD62L表达。

20.根据权利要求19所述的冷冻保存的工程化Treg群，其中所述FOXP3多肽包含与SEQID NO.1或其功能片段至少80％相同的氨基酸序列。

21.根据权利要求19或20所述的冷冻保存的工程化Treg群，其中编码FOXP3的外源多核苷酸在表达载体内。

22.根据权利要求19至21中任一项所述的冷冻保存的工程化Treg群，还包括编码外源T细胞受体(TCR)的多核苷酸或者编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。

23.根据权利要求22所述的冷冻保存的工程化Treg群，其中编码所述FOXP3多肽的多核苷酸和编码所述外源TCR或所述CAR的多核苷酸由单一表达载体提供。

24.根据权利要求23所述的冷冻保存的工程化Treg群，其中所述载体包含编码所述FOXP3多肽的第一多核苷酸和编码所述外源TCR或CAR的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸可操作地连接至相同的启动子，并且其中所述第一多核苷酸在所述第二多核苷酸的上游。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的冷冻保存的工程化Treg群，其中在编码FOXP3的多核苷酸与编码所述外源TCR或CAR的多核苷酸之间存在内部自剪切序列。

26.一种能够根据权利要求1至17中任一项所述的方法获得的Treg群。

27.一种药物组合物，其包含根据权利要求19至26中任一项所述的Treg群。

28.一种根据权利要求19至26中任一项所述的Treg群或根据权利要求27所述的药物组合物，用于预防和/或治疗疾病。

29.一种根据权利要求19至26中任一项所述的Treg群或根据权利要求27所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途。

30.一种预防和/或治疗疾病的方法，包括向受试者施用根据权利要求19至26中任一项所述的Treg群或根据权利要求27所述的药物组合物。

31.根据权利要求28所述用途的Treg群或药物组合物、根据权利要求29所述的Treg群的用途或者根据权利要求30所述的方法，其中所述疾病是自身免疫性疾病或过敏性疾病。

32.根据权利要求28所述用途的Treg群或药物组合物、根据权利要求29所述的Treg群的用途或者根据权利要求30所述的方法，其中所述疾病是移植排斥或移植物抗宿主病。

33.根据权利要求28所述用途的Treg群或药物组合物或者根据权利要求29所述的Treg群的用途，是在抑制免疫应答中的用途。

34.根据权利要求28所述用途的Treg群或药物组合物、根据权利要求29所述的Treg群的用途或者根据权利要求30所述的方法，其中所述疾病是神经退行性疾病，可选地其中所述疾病是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。

35.根据权利要求28所述用途的Treg群或药物组合物、根据权利要求29所述的Treg群的用途或者根据权利要求30所述的方法，其中所述疾病是糖尿病，可选地其中所述疾病是I型糖尿病。

36.一种用于产生冷冻保存的Treg或Treg群的方法，所述冷冻保存的Treg或Treg群具有与相对应的非冷冻保存的Treg或Treg群相当的CD62L水平，所述方法包括(a)将编码FOXP3的多核苷酸引入Treg或Treg群中和(b)冷冻保存所述Treg或Treg群。