CN111378046B

CN111378046B - 一种免疫效应细胞转换受体

Info

Publication number: CN111378046B
Application number: CN201811610560.3A
Authority: CN
Inventors: 钱其军; 刘韬; 张洁; 黄晨; 金华君
Original assignee: Shanghai Cell Therapy Research Institute; Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Cell Therapy Research Institute; Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: CN111378046A

Abstract

本发明提供了一种免疫效应细胞转换受体、其编码核酸、含有其编码核酸的核酸构建体、表达该免疫效应细胞转换受体的免疫效应细胞、含有前述一种或多种的药物组合物和表达该免疫效应细胞转换受体免疫效应细胞的制备方法以及前述中一种或多种在制备抗癌药物中的应用。本发明提供的免疫效应细胞转换受体与其结合蛋白的相互作用能够有效地刺激表达该免疫效应细胞转换受体的细胞，特别是免疫效应细胞，激活了下游胞内的CD3ζ区的信号传导及通过白激素受体链介导的STAT3转录因子与CD3ζ区STAT5结合基序介导的STAT5转录因子信号通路，能够有效地促进该细胞的增殖与持续，为体内和/或体外刺激并扩增该细胞提供了一种新的方法。

Description

一种免疫效应细胞转换受体

技术领域

本发明涉及医学免疫学与分子生物学领域，具体地涉及一种免疫效应细胞转换受体。

背景技术

免疫细胞治疗技术是近年来收到广泛和深度关注的一项新兴的治疗技术，特别是在用于癌症治疗的用途中。过继性细胞转移(adoptive cell transfer,ACT)治疗是目前免疫细胞治疗技术治疗肿瘤的一种重要方法。该方法通常包括将细胞表面受体经过基因工程改造后的免疫效应细胞输入至待治疗的病人体内，表面受体经过改造的免疫效应细胞能够特定地靶向并杀伤肿瘤细胞，从而达到抗肿瘤的效果。输入至人体内的改造后的免疫效应细胞可以是自体的，也可以是同种异体的。过继性细胞转移用于治疗实体瘤时显现出一定的疗效，并且显著地具有高度特异性。对过继性免疫治疗的方法产生响应的较好的临床效果通常与被过继性转移的免疫效应细胞的抗肿瘤功能、瘤内迁移和持续存在性直接相关。最初的常见的可被过继性转移的免疫效应细胞主要为TCR经过改造的T细胞。近年来随着免疫细胞治疗技术的快速发展，尤其是CAR-T细胞治疗在研究和临床应用上的突破，其他多种免疫效应细胞也被显示具有能够被改造并被用于ACT治疗肿瘤的潜力。

CAR-T细胞的制备通常包括以下几步：1)采集受试者的血液、分离T细胞；2)用CAR基因遗传修饰获得的T细胞；3)对修饰后的T细胞进行刺激/扩增；4)选择性地富集CAR-T细胞；6)对阳性T细胞进行大规模离体扩增；7)浓缩细胞、施用或冻存。已有的研究和临床试验都表明，CAR-T的过继性细胞治疗效果与T细胞在体内增殖与存活能力相关(Milone MC,Fish JD,Carpenito C et al.Chimeric receptors containing CD137signaltransduction domains mediate enhanced survival of T cells and increasedantileukemic efficacy in vivo.Mol Ther 2009；17:1453–1464；Robbins PF,DudleyME,Wunderlich J et al.Cutting edge:persistence of transferred lymphocyteclonotypes correlates with cancer regression in patients receiving celltransfer therapy.J Immunol 2004；173:7125–7130.)。目前CAR-T细胞免疫疗法所面临的一个主要问题是T细胞与大多数人体的体细胞一样，复制的生命周期非常有限，即存在着复制性衰老(Effros RB,Pawelec G.Replicative senescence of T cells:does theHayflick Limit lead to immune exhaustion？Immunol Today 1997；18:450–454；ZhouJ,Shen X,Huang J et al.Telomere length of transferred lymphocytes correlateswith in vivo persistence and tumor regression in melanoma patients receivingcell transfer therapy.J Immunol2005；175:7046–7052.)。虽然在某些病人体内CAR-T细胞展现出长时间的应答(Porter DL,Hwang WT,Frey NV,Lacey SF,Shaw PA,Loren AW,etal.Chimeric antigen receptor Tcells persist and induce sustained remissionsin relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.Sci Transl Med(2015)7(303):303ra139)，在其他病人体内其扩增特别是持续只有几周(Schubert ML,Huckelhoven A,Hoffmann JM,Schmitt A,Wuchter P,Sellner L,et al.Chimericantigen receptor T cell therapy targeting CD19-positive leukemia and lymphomain the context of stem cell transplantation.Hum Gene Ther(2016)27(10):758–71；Maus MV,JuneCH.Making better chimeric antigen receptors for adoptive T-celltherapy.Clin Cancer Res(2016)22(8):1875–84)。除复制性衰老外，影响CAR-T细胞体内增殖和持续的因素还有很多，包括在制备过程中离体培养扩增的条件、外源CAR转基因长期表达的缺失和效应功能差等(Kalos M,June CH.Adoptive T cell transfer for cancerimmunotherapy in the era of synthetic biology.Immunity.(2013)39(1):49-60.)。为了克服CAR-T细胞在体内的增殖与持续不足的缺陷，CAR-T细胞在体外扩增的数量上要求也较高，进一步增加了CAR-T细胞制备的成本和难度。

在ACT中使用肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte,TIL)在肿瘤治疗中也被证明是一种非常成功的方法。TIL ACT能够成功主要原因在于两方面：1)对于自体肿瘤表现出的多样性的抗原特异性；2)能够裂解并根除肿瘤的能力。尽管取得了一定的成功，TIL的ACT疗法仍然面临着挑战。要基因工程修饰TIL使其能够大规模用于临床试验，主要的技术困难之一在于目的TIL在适合GMP的环境下能够被大量扩增。尽管靶向某些肿瘤细胞的TIL，如靶向黑色素瘤的TIL已有报道能在只加入IL-2的条件下成功地大量扩增(Dudley ME,Wunderlich JR,Shelton TE,Even J,Rosenberg SA Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy formelanoma patients.J Immunother.(2003)26:332–342),其他组织肿瘤来源的TIL，如肾癌来源的TIL，未能一致地重现类似相同水平的扩增(Malone CC,Schiltz PM,MackintoshAD,Beutel LD,Heinemann FS,Dillman RO.Characterization of human tumor-infiltrating lymphocytes expanded in hollow-fiber bioreactors forimmunotherapy of cancer.Cancer Biother Radiopharm(2001)16:381–390；Markel G,Cohen-Sinai T,Besser MJ,Oved K,Itzhaki O,Seidman R,Fridman E,Treves AJ,Keisari Y,Dotan Z,Ramon J,Schachter J Preclinical evaluation of adoptive celltherapy for patients with metastatic renal cell carcinoma.Anticancer Res(2009)29:145–154.)。肿瘤具有高度异质性，肿瘤中TIL的有无及多寡与肿瘤对不同免疫治疗策略的反应密切相关，肿瘤中有TIL的存在对检查点阻断等免疫疗法常有较好的反应，通过增加TIL数量能有效增加联合免疫治疗的疗效(Sanmamed and Chen,on paradigm shiftof cancer immunotherapy:from enhancerment to normalization,cell(2018)175(2):313-326)。快速有效扩增TIL细胞对于肿瘤免疫治疗具有重要意义。。

T细胞激活与增殖的最佳状态需要多信号，包括TCR接触(第一信号)、共刺激信号(第二信号)与细胞因子接触(第三信号)。目前常见的已经用于临床试验的CAR的结构仅包含CD3ζ结构域(TCR信号传导)和共刺激区，不包含传递第三信号即细胞因子接触引起的信号通路。Yuki Kagoya等报道了一种含有JAK-STAT信号传导结构域的新型嵌合抗原受体。这种新型的嵌合抗原受体包含一段截短的IL-2受体β链胞内区(IL-2Rβ)、CD28共刺激区和CD3ζ信号区，其中CD3ζ信号区包含IL-21受体中存在的激活STAT3的YXXQ基序(Kagoya Y,Tanaka S,Guo T,Anczurowski M1,Wang CH,Saso K,Butler MO,Minden MD,Hirano N.Anovel chimeric antigen receptor containing a JAK-STAT signaling domainmediates superior antitumor effects.Nat Med.2018Mar；24(3):352-359)。IL-2Rβ链胞内区为TCR的普通的γ链，通过结合IL-2或IL-5能够激活STAT5信号通路。IL-21通过结合YXXQ基序偏好性地激活STAT3信号通路。该新型的嵌合抗原受体表现出依赖于抗原的JAK激酶及STAT3与STAT5转录因子信号通路的激活。表达该新型嵌合抗原受体的CAR-T细胞在液体瘤和实体瘤中都表现出了较佳的体内增殖和持续性，也具有较好的抗肿瘤效果。

EGFR(简称为EGFR、ErbB-1或HER1)是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。该家族包括HER1(erbB1，EGFR)、HER2(erbB2，NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。EGFR的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用，胶质细胞癌、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的过表达，因此EGFR是一个很有潜力的肿瘤治疗靶点。目前已有多种以EGFR为靶点的药物。有作用于受体胞内区的小分子络氨酸激酶抑制剂(TKI)，如吉非替尼、erlotinib、EKB-549、PKI-166、GW-2016及CI-1033。作用于受体胞外区的单克隆抗体(Mab)，如西妥昔单抗、ABX-EGF及EMD72000等。以及其它一些免疫导治疗、基因治疗等。

因此，使用TIL和CAR-T细胞的ACT疗法目前有着较为优异的效果，但在临床实践中CAR-T细胞与TIL细胞难以在体外大量扩增并在体内有效增殖并持续，使ACT的治疗效果受到一定影响。因此目前亟需一种能够有效地在体外和/或体内扩增免疫效应细胞的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服目前本领域常规的免疫效应细胞如T细胞或TIL在体内的增殖与持续时间短、效应作用差、对靶细胞杀伤效果不够理想的技术问题，提供了一种免疫效应细胞转换受体。本发明的免疫效应细胞受体包括胞外抗原结构域、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区、白介素受体链和胞内信号传导区，所述白介素受体链含有JAK结合基序与STAT5结合基序，所述胞内信号传导区含有STAT3激活基序。本发明的免疫效应细胞受体通过胞外抗原结构域与其结合蛋白，如肿瘤抗原EGFR与EGF或其抗体西妥昔(Cetuximab)相互作用，激活了下游胞内的CD3ζ区的信号传导及通过白激素受体链介导的STAT3转录因子与CD3ζ区STAT5结合基序基序介导的STAT5转录因子信号通路，能够有效地促进免疫效应细胞的增殖与持续。

本发明一方面提供了一种免疫效应细胞转换受体，包括：1)胞外抗原结构域；2)跨膜结构域；3)胞内共刺激结构域；4)白介素受体链和5)胞内信号传导结构域，其中所述白介素受体链包含内源的或外源的JAK结合基序和STAT5结合基序，所述胞内信号传导结构域包含外源的STAT3结合基序。

在一实施方案中，所述胞外抗原结构域包含肿瘤抗原；优选地，所述肿瘤抗原包含EGFR胞外区；更优选地，所述肿瘤抗原EGFR胞外区的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。

在一实施方案中，所述肿瘤抗原包含EGFR胞外区的III区和/或IV区；优选地，所述EGFR胞外区的III区的序列为SEQ ID NO.11所示；优选地，所述EGFR胞外区的IV区的序列为SEQ ID NO.12所示。

在一实施方案中，所述肿瘤抗原包含EGFR胞外区的III区和IV区，其序列如SEQ IDNO.13所示。

在另一实施方案中，所述跨膜结构域选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的任一种；优选地，选自CD28跨膜区、CD8跨膜区和CD137跨膜区中的任一种；更优选地，为CD8跨膜区。

在另一实施方案中，所述胞内共刺激结构域为共刺激信号分子的胞内结构域，选自CD2、CD4、CD8α、CD8β、CD5、CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、Lck、ICOS和DAP10的胞内结构域肽段；优选地，选自CD137/4-1BB和CD28的胞内结构域肽段；更优选地，为CD28胞内结构域肽段。

在另一实施方案中，所述白介素受体链是或包含白介素受体胞质区片段。

在另一实施方案中，所述白介素受体链是IL-2Rβ或IL-7Rα肽链；优选地，为IL-2Rβ肽链；更优选地，为截短的IL-2Rβ肽链胞内区，序列为SEQ ID NO.4所示。

在另一实施方案中，所述白介素受体链位于所述胞内共刺激结构域和所述胞内信号传导结构域之间。

在另一实施方案中，所述外源STAT3结合基序是YXXQ，其中所述X为任意氨基酸；优选地，所述外源STAT3结合基序是YRHQ。

在另一实施方案中，所述外源STAT3结合基序距离所述免疫效应细胞转换受体的C末端少于100个氨基酸。

在一实施方案中，所述胞内信号传导结构域为免疫受体酪氨酸活化基序，可以是CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域。

在另一个实施方案中，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中所述外源STAT3结合基序为第104-107位氨基酸序列。

在另一个实施方案中，所述免疫效应细胞转换受体任选地还包括铰链区，所述铰链区位于所述胞外抗原结构域和所述跨膜结构域之间。

在另一实施方案中，所述铰链区选自CD8的胞外铰链区、IgG1Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28的胞外铰链区、IgG4Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区中的任一种；优选地，所述铰链区是CD8铰链区或IgG4Fc CH2CH3铰链区；更优选地，所述铰链区是CD8铰链区。

在另一实施方案中，所述免疫效应细胞受体还包含信号肽，所述信号肽任选地位于所述免疫效应细胞受体的N端。

在另一实施方案中，所述信号肽选自CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽和轻链信号肽中的任一种；优选地，所述信号肽选自CD8信号肽和轻链信号肽中的任一种；更优选地，所述信号肽为CD8信号肽，进一步更优选地，所述CD8信号肽的序列为SEQ ID NO.9所示。

在一实施方案中，本发明所述免疫效应细胞转换受体的氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示。

本发明另一方面提供了一种编码前述免疫效应细胞转换受体的分离的核酸。

在另一实施方案中，所述分离的核酸为RNA；优选地，所述RNA含有5’UTR、编码前述免疫效应细胞转换受体的开放阅读框、3’UTR；更优选地，所述RNA含有5’帽子结构、5’UTR、编码前述免疫效应细胞转换受体的开放阅读框、3’UTR和polyA序列。

在另一实施方案中，所述分离的核酸为DNA，优选地，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明另一方面提供了一种核酸构建体，其含有编码前述免疫效应细胞转换受体的分离的核酸。

在一实施方案中，所述核酸构建体为含有前述免疫效应细胞转换受体的分离的核酸的表达框。

在另一实施方案中，所述核酸构建体为含有编码前述免疫效应细胞转换受体的分离的核酸的载体；优选地，为含有编码前述免疫效应细胞转换受体的核酸的表达载体。

在一实施方案中，所述表达载体为非整合载体或整合载体，优选地，为整合载体。

在一实施方案中，所述整合载体为病毒载体，优选地为衍生自I型HIV的慢病毒载体，如pWPT、pWPXL等。

在另一实施方案中，所述整合载体为转座子系统载体，优选地为改造的或未改造的Sleeping Beauty转座子系统载体或PiggyBac转座子系统载体，更优选地为改造的或未改造的PiggyBac转座子系统载体，最优选地为改造的PiggyBac转座子系统载体，如CN105154473A中公开的pNB328转座子系统载体。

在另一实施方案中，所述整合载体为病毒载体或非病毒载体；优选地，所述整合载体为非病毒载体；更优选地，所述非病毒载体为转座子系统载体，例如PiggyBac转座子系统载体、Sleeping Beauty转座子系统载体、Tn3或Tn5转座子系统载体。

本发明另一方面提供了一种免疫效应细胞，其表达前述免疫效应细胞转换受体。

在一实施方案中，所述免疫效应细胞为选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、CIK细胞、CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-巨噬细胞、TCR-T细胞和CAR-CIK细胞中的一种或多种；优选地，所述免疫效应细胞或选自T细胞、TIL、NK细胞和CAR-T细胞中的一种或多种；更优选地，所述免疫效应细胞为T细胞或TIL。

在另一实施方案中，所述免疫效应细胞包含前述核酸构建体。

在另一实施方案中，所述免疫效应细胞包含前述含有编码前述免疫效应细胞转换受体的核酸的载体。

在另一实施方案中，所述免疫效应细胞的基因组中整合了含有编码前述免疫效应细胞转换受体的核酸的表达框。

本发明另一方面提供了一种药物组合物，其包含编码前述免疫效应细胞转换受体的分离的核酸、前述核酸构建体和前述免疫效应细胞中的一种或多种。

在一实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料和/或稀释剂。

本发明另一方面提供了一种前述免疫效应细胞的制备方法，包括以下步骤：1)将前述分离的核酸和/或核酸构建体导入免疫效应细胞，获得表达所述免疫效应细胞转换受体的初始细胞；2)用前述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的结合蛋白与抗CD28抗体接触1)中所述初始细胞、培养。

在一实施方案中，1)中所述导入的方法为选自病毒颗粒感染、电转、脂质体转染、磷酸钙转染和基因枪中的任一种，优选地为选自病毒颗粒感染、电转和脂质体转染中的任一种，更优选地为病毒颗粒感染或电转，最优选地为电转。

在一实施方案中，1)中所述免疫效应细胞为选自T细胞、NK细胞、NK T细胞、巨噬细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、CIK细胞、CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-巨噬细胞、TCR-T细胞和CAR-CIK细胞中的一种或多种；优选地，所述免疫效应细胞或选自T细胞、TIL、NK细胞和CAR-T细胞中的一种或多种；更优选地，所述免疫效应细胞为T细胞或TIL。

在一实施方案中，前述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域为肿瘤抗原或其片段；优选地，所述肿瘤抗原包含EGFR胞外区；更优选地，所述肿瘤抗原EGFR胞外区的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。

在另一实施方案中，所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的结合蛋白为所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的受体、配体或单克隆抗体。

在另一实施方案中，前述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域为EGFR胞外区，所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的结合蛋白为EGF或EGFR单克隆抗体；优选地，所述EGFR单克隆抗体结合所述EGFR胞外区；更优选地，所述EGFR单克隆抗体结合所述EGFR胞外区的III区和/或IV区；进一步更优选地，所述EGFR单克隆抗体为西妥昔(Cetuximab)单抗。

在另一实施方案中，所述抗CD28抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，优选地为单克隆抗体，更优选地为人源化单克隆抗体，进一步更优选地为人源化鼠源或兔源单克隆抗体，最优选地为人源化鼠源单克隆抗体。

在一实施方案中，2)中所述接触为使所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的结合蛋白和所述抗CD28抗体直接存在于含有所述初始细胞的体系中，与所述初始细胞的表面产生直接相互作用。

在另一实施方案中，所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的结合蛋白为溶液形式存在，所述抗CD28抗体为固定化形式存在；优选地，所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的结合蛋白的终浓度为0.1-5μg/mL，更优选地，为0.1-3μg/mL。

在另一实施方案中，所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的结合蛋白和所述抗CD28抗体均为固定化形式存在。

在一实施方案中，所述培养的温度为37℃；和/或，所述培养的CO₂浓度为5％；和/或，所述培养所用的培养基为含有2％胎牛血清的AIM-V培养基；和/或，所述培养的时间为3-17天；优选地，为4-17天；更优选地，为15-17天。

在另一实施方案中，所述培养所用的培养基中还含有细胞因子；优选地，所述细胞因子为IL-2，终浓度为500IU/mL；和/或，所述细胞因子在所述培养进行0-6小时时加入所述培养基；优选地，所述细胞因子在所述培养进行4小时时加入所述培养基。

本发明另一方面提供了前述免疫效应细胞转换受体、前述编码前述免疫效应细胞转换受体的分离的核酸、前述核酸构建体、前述免疫效应细胞和前述药物组合物中的一种或多种在制备抗癌症药物中的用途。

在一实施方案中，所述癌症为其癌细胞表面异常表达EGFR的癌症，优选地，所述癌症选自肝癌、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、非小细胞癌、胆囊癌、食管癌、黑色素瘤、胰腺癌、尿路上皮癌、头颈癌或前列腺癌中的一种或多种。

本发明的有益效果在于，本发明提供的免疫效应细胞转换受体与其结合蛋白的相互作用能够有效地刺激表达该免疫效应细胞转换受体的细胞，特别是免疫效应细胞，激活了下游胞内的CD3ζ区的信号传导及通过白激素受体链介导的STAT3转录因子与CD3ζ区STAT5结合基序介导的STAT5转录因子信号通路，能够有效地促进该细胞、特别是免疫效应细胞的增殖与持续，为体内和/或体外刺激并扩增该细胞、特别是扩增免疫效应细胞如T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞提供了一种新的方法。

附图说明

图1：EGFR转换受体及其对照受体结构示意图。

图2：EGFR-TR-T、EGFR-TR-T-EGF与EGFR-TR-T-Cetux细胞在培养到第15天时在荧光与明视野下的图像。

图3：EGFR-TR-T、EGFR-TR-T-CRL、EGFR-TR-T-EGF、EGFR-TR-T-CRL-EGF、EGFR-TR-T-Cetux、EGFR-TR-T-CRL-Cetux与EGFR-TR-T-fCetux细胞在培养到第15-17天时的EGFP阳性细胞所占的比例。

图4：EGFR-TR-T、EGFR-TR-T-CRL、EGFR-TR-T-EGF、EGFR-TR-T-CRL-EGF、EGFR-TR-T-Cetux、EGFR-TR-T-CRL-Cetux与EGFR-TR-T-fCetux细胞在培养到第15-17天时的EGFP阳性细胞的数量。

图5：EGFR-TR-T-Cetux与EGFR-TR-T-fCetux细胞流式检测EGFP整合结果。

图6：EGFR-TR-T-Cetux细胞与EGFR-TR-T-fCetux细胞

图7：流式检测EGFR-TR-T-Cetux细胞与EGFR-TR-T-fCetux细胞活化指标CD25、CD69、CD107a结果。

图8：流式检测EGFR-TR-T-Cetux细胞与EGFR-TR-T-fCetux细胞CD4+与CD8+细胞的比例。

具体实施方式

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

下面对本发明涉及的部分术语进行定义。

除非另有注释，本申请依照常规用法使用技术术语。分子生物学中的常用术语的定义可以在Benjamin Lewin,Genes X,published by Jones&Bartlett Publishers,2009；和Meyers et al.(eds.),The Encyclopedia of Cell Biology and MolecularMedicine,published by Wiley-VCH in 16volumes,2008和其它类似参考文献中找到。

在本发明中，术语“抗原”是指在引入体内时，被免疫系统识别的任何物质。例如蛋白、蛋白的片段或结构域，如细胞跨膜蛋白的胞外结构域。

术语“肿瘤抗原”表达具有免疫源性的生物分子，其异常表达被认为与细胞的恶性癌变相关。肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原与肿瘤相关抗原。肿瘤特异性抗原仅存在于肿瘤细胞表面而在正常细胞表面不表达；肿瘤相关抗原不仅在肿瘤细胞中表达，也存在于其他器官、组织或异源的及异体的正常细胞中，或在发育和/或分化阶段表达。

术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子，可为源于自然来源或源于重组来源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab、F(ab)’2、scFv、人源化抗体、重链抗体和单域抗体。

术语“人源化抗体”是指序列经过修饰后与其天然的人类的抗体序列相比相似度提高的非人源抗体。其中至少一个抗体结合位点(互补决定区，CDR)(例如CDR3，优选全部六个CDR)被来自具有期望特异性的人抗体的CDR取代，和/或其至少一个FR区被人抗体的FR区取代，任选地，其非人源的恒定区被人抗体的恒定区取代。

术语“单克隆抗体”是指表现单一结合特异性的抗体，仅结合单一的抗原表位。其包括传统意义上的由相同的免疫细胞产生的包含重链-轻链四聚体的抗体，该免疫细胞来源于唯一的一个亲本细胞的克隆。其也包括能够结合单一抗原表位的Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、人源化抗体、重链抗体和单域抗体。

术语“多克隆抗体”是指含有多种由体内不同B细胞谱系分泌产生的抗体的抗体混合物。其中的每一种B细胞谱系分泌的抗体都针对相同的特定抗原，但每种抗体所针对的该特定抗原上的表位各不相同。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

术语“受试者”或者“患者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

术语“编码序列”是指核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。

术语“核酸”是指由天然产生的碱基、糖和糖间(骨架)的键组成的核苷或核苷酸序列。该术语还包括经修饰或替代的、含有非天然产生的单体的序列或其中的部分。本发明中的所述核酸可以是DNA或RNA，可以包括天然产生的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。本发明的所述核酸还可以含有经过修饰的碱基，例如包括但不限于以下修饰：含氮杂和脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，磷酸二酯键骨架的锁核酸(LNA)修饰，核糖环的2’-氧烷基修饰和2’-F修饰及碱基的4-硫脲嘧啶修饰、2-硫脲嘧啶修饰和C-连接的伪尿嘧啶修饰。

术语“核酸构建体”是指可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段。典型地包括DNA构建体，指已被亚克隆进载体中的编码目的蛋白质的核苷酸序列的DNA插入。

术语“载体”是指用于将一个或多个核酸或一个或多个多核苷酸引入或转移到靶细胞或组织中的核酸构建体或多核苷酸构建体。典型地，载体用于将外源DNA引入另一个细胞或组织中。载体可以包含用于在细菌中生长的细菌抗性基因和用于在生物体中表达目的蛋白质的启动子。DNA可以通过PCR或任何其他本领域技术人员已知的一种或多种合适的技术在体外产生。

术语“表达载体”是指重组或合成产生的用于在靶细胞中表达目蛋白的核酸、核酸构建体或载体(例如外源核酸或转基因)。典型地，目的核酸表达目的蛋白。

术语“整合载体”能够将外源核酸整合到宿主细胞基因组中的核酸、核酸构建体或载体。整合载体可以在宿主细胞基因组中定点整合或随机整合外源核酸。

术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列、PolyA加尾信号序列。优选地还包括增强子元件。

术语“固定化”是指将生物分子如蛋白以共价或非共价的方式与基质相连接，所述所述基质可以是固定的基质，如固体的孔板、培养皿、玻片等，也可以是悬浮的基质，如磁珠、纳米颗粒等。

术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所靶向的抗原之间或受体与其针对特定的配体之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。“特异性识别”或“靶向”具有类似的含义。

术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

术语“可操作地连接”是指核酸序列与核苷酸的调节序列(例如启动子、增强子、转录和翻译终止位点以及其他信号序列)的功能关系并且表明两个或更多个DNA片段结合在一起，使得它们为了预期的目的而一致起作用。例如，核酸序列(通常为DNA)与调节序列或启动子区域的有效连接是指DNA与调节序列或启动子之间的物理和功能关系，使得通过特异性识别、结合和转录该DNA的RNA聚合酶从调节序列或启动子启动这种DNA的转录。为了优化表达和/或体外转录，可能需要修饰其所表达的细胞类型中核酸或DNA表达的调节序列。对这种修饰的期望或需要可以根据经验确定。

术语“STAT3”(信号传导及转录激活因子3)是指一种属于STAT蛋白家族的转录因子，其也被称为“急性期应答因子”(acute-phase response factor)、“APRF”、“APRF转录因子”、“DNA结合蛋白APRF”、“FLJ20882”、“假定蛋白MGC16063”、“IL-6应答因子”、“LIF应答因子”或“STAT3_HUMAN”。STAT3蛋白涉及调控细胞生长与分裂、细胞运动与细胞凋亡。在免疫系统中，STAT3是免疫系统细胞如T细胞核B细胞成熟的信号传导因子，并且STAT3在人T细胞记忆的发育和维持中发挥重要作用。

术语“STAT3结合基序”是指氨基酸序列YXXQ或根据上下游序列背景编码所述氨基酸序列的多核苷酸序列，其结合STAT3(例如在长度更长的多肽/蛋白质的上下游序列背景下)。所述STAT3结合基序存在于信号分子中，如IL-6与IL-10。所述STAT3结合基序也可以被引入到内源不含有该基序的信号结构域中(即“外源STAT3结合基序”)。术语“外源STAT3结合基序”是指以重组的方式被引入某个结构域中的STAT3结合基序，而在该结构域中或在被引入的位点STAT3结合基序并不存在。例如，YXXQ外源STAT3结合基序可被引入到CD3ζ。外源STAT3结合基序如YRHQ可通过本领域所知晓的惯用技术引入到CD3ζ。X可为任何常见的氨基酸。

术语“STAT5结合基序”是指包含酪氨酸残基并结合STAT5的氨基酸序列。例如，IL-2Rβ链中的所述STAT5结合基序包含有酪氨酸残基(该酪氨酸残基指NCBI RefSeq:NP_000869.1的第536位)。例如，所述STAT5结合基序包含氨基酸残基YXXL。例如，所述STAT5结合基序包含氨基酸残基YLSL。X可为任何常见的氨基酸。

术语“白介素受体”是指针对白介素的细胞因子受体。白介素受体包括两个家族：I型和2型细胞因子受体。I型白介素受体包括IL-2受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、IL-7受体、IL-9受体、IL-11受体、IL-12受体、IL-13受体、IL-15受体、IL-21受体、IL-23受体和IL-27受体。II型受体包括IL-10受体、IL-20受体、IL-22受体和IL-28受体.白介素受体含有多条多肽链。例如在本申请说明书中，IL-2Rβ链胞内区有时缩写位IL2Rb或IL-2Rb。

术语“外源结合基序”是指任何以重组的方式被导入到一结构域，例如胞内信号传导结构域中的结合基序，所述胞内信号传导结构域可以是白介素受体链的胞质结构域、胞质中的共刺激结构域或CD3ζ的胞内信号传导结构域。但所述结合基序并不天然地存在于所述结构域或引入的所述结构域的位点。例如，外源JAK结合基序可悲插入至胞内信号传导结构域，例如白介素受体链的胞质结构域。

术语CD3ζ是指所有哺乳动物，优选地人的CD3T细胞共受体。在哺乳动物中，CD3包含一条CD3ζ链、一条CD3δ链与两条CD3ε链。所述CD3ζ链(例如NCBI RefSeq:NP_932170.1)包含胞内信号传导结构域，能够被用于构建本发明的免疫效应细胞转换受体。

术语“JAK结合基序”是指能够允许酪氨酸激酶JAK结合的BOX-1基序，例如JAK1。所述JAK结合基序可以是NCBI RefSeq:NP_000869.1的第278-286位氨基酸。

进一步地，在本申请中，某一特定部分的实施方案和术语定义也意在对其他合适的实施方案和术语定义同样适用，只要本领域技术人员能够理解。例如，在下文中，将对本发明的各个不同方面进行更为详尽的描述。所描述的每一方面都可以与任何其他的一个或多个方面进行组合，除非有明确相反的指示。特别地，任何指示为优选的或更有优势的技术特征都可以与其他同样被指示为优选的或更有优势的技术特征相互组合。

(1)免疫效应细胞转换受体

本发明公开了一种免疫效应细胞转换受体，其包括：1)胞外抗原结构域；2)跨膜结构域；3)胞内共刺激结构域；4)白介素受体链和5)胞内信号传导结构域，其中所述白介素受体链包含内源的或外源的JAK结合基序和STAT5结合基序，所述胞内信号传导结构域包含外源的STAT3结合基序。

在一些实施方案中，所述胞外抗原结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域、白介素受体链和胞内信号传导结构域按从N端到C端的顺序直接或间接地相连接。

在一些实施方案中，所述胞内共刺激结构域、白介素受体链和胞内信号传导结构域按从C端到N端的顺序直接或间接地相连接。

在一些实施方案中，所述白介素受体紧邻所述跨膜结构域，位于所述胞内共刺激结构域和所述胞内信号传导结构域的N端。

本发明还公开了一种表达所述免疫效应细胞转换受体的细胞。所述细胞与不表达所述免疫效应细胞转换受体的细胞相比可以，例如，具有更高的增值率和/或存活率，可以产生更大量的细胞因子，和/或能够具有更高的针对靶细胞，如肿瘤细胞的细胞毒性。

(a)胞外抗原结构域

本发明公开的免疫效应细胞受体的胞外抗原结构域可以包含能够被免疫系统识别的任何蛋白、蛋白的片段或结构域，例如在肿瘤细胞表面高表达或特异性表达的蛋白的全长或其胞外部分。所述胞外抗原结构域能结合其自身的抗体或配体，进而激活胞内的信号传导结构域，提高下游的细胞激活与增殖的水平。所述胞外抗原结构域包含肿瘤抗原。所述肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原与肿瘤相关抗原，所述肿瘤相关抗原可以是，例如，EGFR全长或其胞外片段。

在一些实施方案中，所述胞外抗原结构域为EGFR胞外区，其能结合EGFR的抗体或配体。

优选地，EGFR胞外区的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述EGFR的抗体为选自靶向EGFR胞外区的单克隆抗体、Fab’、F(ab’)₂、单链抗体、重链抗体和单域抗体中的一种；更优选地，所述EGFR的抗体为单克隆抗体，如西妥昔(Cetuximab)单抗，或包含西妥昔单抗的重链CDR1-3序列和/或轻链CDR1-3序列的Fab’、F(ab’)₂、单链抗体、重链抗体和单域抗体中的一种或多种。

优选地，所述EGFR的抗体为人源化抗体。

优选地，所述EGFR的配体为表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)。

在一些实施方案中，所述胞外抗原结构域可以只结合一个抗体或配体

在一些实施方案中，所述胞外抗原结构域可以结合两个或多个抗体或配体。

在一些实施方案中，所述胞外抗原结构域包含单个肿瘤抗原。

在一些实施方案中，所述胞外抗原结构域包含两个或两个以上肿瘤抗原；优选地，其中一个为EGFR胞外区。

(b)跨膜结构域

本发明公开的免疫效应细胞转换受体包含跨膜结构域。所述跨膜结构域可衍生自天然多肽，或可以人工设计。衍生自天然多肽的所述跨膜结构域可获取自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，可获取自以下蛋白的跨膜结构域：T细胞受体alpha或beta链，CD3zeta链，CD28，CD3epsilon，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，ICOS，CD154或GITR。人工设计的所述跨膜结构域为主要包含疏水氨基酸，如Leu和Val的多肽，例如Phe、Trp和Val的三肽可在合成的跨膜结构域的每个末端被发现。任选地，一段寡聚短肽接头或多肽接头，例如长度在2-10个氨基酸的接头可以被安置于所述跨膜结构域和胞内结构域之间。特别地，可以使用具有连续的GS序列作为接头。

例如，具有氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的CD8的跨膜区可以被用作本发明免疫效应细胞转换受体的跨膜结构域。

在一些实施方案中，还可以在本发明所述免疫效应细胞转换受体的所述胞外抗原结构域与所述跨膜结构域之间插入铰链区。所述铰链区可以是任何能够起到连接所述胞外抗原结构域与所述跨膜结构域的作用的寡肽或多肽。所述铰链区可以包含多达300-400个氨基酸，例如，包含10-100个氨基酸，或包含大约25-50个氨基酸。

所述铰链区优选地具有能够促进所述免疫效应细胞转换受体与其结合蛋白，如与其胞外抗原结构域相结合的抗体或受体相结合的序列。例如，预期能够提高结合的氨基酸包括有半胱氨酸、带电荷的氨基酸及存在于潜在的糖基化位点的丝氨酸和苏氨酸，并且这些氨基酸能够被用于构成所述铰链区。

在一些实施方案中，所述铰链区可以包括或可以是，例如，CD8a的118-178位氨基酸(NCBI RefSeq:NP_001759.3，其为CD8alpha的铰链区)、或CD8beta的135-195位氨基酸(GenBank:AAA35664.1)、CD4的315-396位氨基酸(NCBI RefSeq:NP_000607.1)、序列如SEQID NO.7所示的CD8铰链区、CD28的114-152位氨基酸(NCBI RefSeq:NP_006130.1)、序列如SEQ ID NO.8所示的IgG4Fc CH2CH3铰链区序列，或上述序列中的一部分。进一步，所述铰链区可以是人工合成的序列。

本发明所述免疫效应细胞转换受体可通过设计形成多聚体，特别地，形成而具体。例如，可在所述铰链区和/或所述跨膜结构域中插入半胱氨酸，使所述免疫效应细胞转换受体例如通过二硫键多聚化，如二聚化。

进一步地，在本发明所述免疫效应细胞转换受体中，可在N端连接有信号肽。信号肽存在于多种分泌性蛋白和膜蛋白的N末端，长度为15-30个氨基酸。本发明中提到的多种具有胞内结构域的蛋白为膜蛋白，其都具有信号肽序列。衍生于这些分泌性蛋白和膜蛋白的信号肽可以被用作本发明免疫效应细胞转换受体的信号肽。任意的信号肽都可使用。例如，可以使用CD8信号肽或轻链信号肽。

(2)编码免疫效应细胞转换受体的核酸

本发明提供了编码上述免疫效应细胞转换受体的核酸。所述编码上述免疫效应细胞转换受体的核酸可以根据免疫效应细胞转换受体的特定的氨基酸序列通过常规方法制备。编码上述免疫效应细胞转换受体的各结构域氨基酸序列的核酸序列可以获取自前述NCBI RefSeq IDs或GenBank号，并且本发明的所述核酸序列可以通过标准的分子生物学和/或化学合成方法制备。例如，可以根据核苷酸序列合成核酸，或将获取自cDNA文库的DNA片段通过PCR结合在一起制得本发明的核酸。

本发明所述编码上述免疫效应细胞转换受体的核酸可以与另一核酸相连接以通过适当的启动子控制表达。例如，可以包括组成型提高基因表达水平的启动子或可操作地相连接的构建体与可通过小分子药物(如四环素及其类似物或阿霉素)诱导基因表达的启动子或可操作地连接的构建体。为使本发明所述核酸达到高效转录，所述核酸也可以与其他配合启动子或转录起始位点的调控序列如含有增强子或终止子的序列相连接。除本发明所述核酸外，还可以包括验证所述核酸是否表达的标志物基因，如药物抗性基因、编码报告酶的基因或编码荧光蛋白的基因。

在一实施方案中，所述核酸对于在特定宿主内的表达进行了密码子优化。

本发明还提供了一种含有本发明所述核酸作为活性组分的组合物，该组合物还包括药学可接受的载体。适合的药学可接受的载体为本领域常规的载体。例如，包括PBS缓冲液，含有矿物酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐的溶液，盐溶液，乙二醇或乙醇溶液或有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或安息香酸盐。也可以使用佐剂如润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。作为药学可接受的载体，记载于《雷明登药学全书》(Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Pub.Co.,N.J.1991)的载体都可以适当地使用。本发明所提供的组合物可以被制成任何适合进行自体施用的剂型，例如，用于注射或灌输。进一步地，本发明所提供的组合物可以包含添加剂，如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂，以及在储存期内延长有效性的维持剂。所述组合物可以为干粉形式，施用前用适合的灭菌液体进行重配。对于精细颗粒介导的施用，可以用DNA包被显微尺寸的颗粒，如金颗粒。

当本发明所述核酸被离体引入到细胞时，除上述药学可接受的载体外，其还可以与促进其转移到细胞内的物质组合使用，如核酸导入试剂例如脂质体或阳离子脂。可选地，可以使用包含本发明所述核酸的载体，如后文所述。特别地，适于对活体施用形式的、包含本发明所述核酸的适合的载体的组合物可以用于体内基因治疗。

包含本发明所述核酸作为活性组分的组合物可被施用以治疗，例如，肝癌、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、非小细胞癌、胆囊癌、食管癌、黑色素瘤、胰腺癌、尿路上皮癌、头颈癌或前列腺癌中的一种或多种。包含本发明所述核酸作为活性组分的组合物可通过皮内、肌肉内、皮下、腹膜内、鼻内、动脉内、静脉内、瘤内，或通过注射到传入向的淋巴管进行施用或配制成适于施用的剂型，所述施用可以是自体施用，例如，通过注射或灌输，所述施用的途径并非特别限定。

(3)表达免疫效应细胞转受体细胞的制备方法

表达本发明所述免疫效应细胞转换受体的细胞的制备方法包括将本发明所述编码免疫效应受体的核酸导入到细胞内的步骤。该步骤可以在离体进行。例如，细胞可以在离体被转导病毒载体或非病毒载体制备表达本发明所述免疫效应细胞受体的细胞，所述病毒载体或非病毒载体含有本发明所述核酸。

在本发明所述制备方法中，可以使用来自哺乳动物的细胞，例如来源于人的细胞，或来源于非人源的哺乳动物的细胞，如猴、小鼠、大鼠、猪、马、牛、羊或狗的细胞。

在一实施方案中，所述哺乳动物是人。

本发明所述制备方法中所用到的细胞不受特定的限制，任何细胞都可以使用。例如，收集、分离或纯化自体液、组织或器官的细胞，所述体液、组织或器官包括诸如血液(外周血、脐带血等)或骨髓，或通过分化或重编程前述细胞所获得的诱导多能干细胞(iPSC)也可被使用。同样也可使用外周血单个核细胞(PBMC)、免疫细胞(包括但不限于T细胞、树突状细胞、B细胞、造血干细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞、NK T细胞、造血细胞(如嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、脐带血单个核细胞、成纤维细胞、前体脂肪细胞、肝细胞、皮肤角化细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、各类癌症细胞株或神经干细胞。例如，可以使用NK细胞或T细胞、T细胞的前体细胞(造血干细胞、淋巴细胞前体细胞等)或包含上述细胞的细胞群。例如，T细胞包括CD8阳性T细胞、CD4阳性T细胞、调控T细胞、细胞毒性T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte)。含有T细胞和T细胞前体细胞的细胞群包含PBMC。前述细胞可收集自活体、获取自收集自活体细胞的扩大培养或作为细胞系被构建。当需要向体内移植表达所述免疫效应细胞转换受体的细胞或分化自表达所述免疫效应细胞转换受体细胞的细胞时，可将所述核酸导入收集自所述活体自身或与所述活体同种的细胞中。

本发明编码所述免疫效应细胞转换受体的核酸可插入到载体中，所述载体可被导入细胞。例如，可以使用诸如逆转录病毒载体(包括癌逆转录病毒载体、慢病毒载体和假病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体、猴空泡病毒载体、牛痘病毒载体或仙台病毒载体、EB病毒载体、疱疹病毒载体(HSV)。例如，可以使用缺少复制能力以使其无法自身在被感染的细胞内复制的病毒载体。

此外，本发明还可使用非病毒载体，所述非病毒载体可以与脂质体或凝集试剂如阳离子脂连用。本发明所述核酸还可以通过磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷、电穿孔或离子轰击。

例如，当使用逆转录病毒载体时，本发明所述制备方法可以通过选取基于LTR序列和载体具有包装信号序列的、适当的包装细胞系进行，用所述包装细胞系制备逆转录病毒颗粒。也可以使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞制备所述逆转录病毒颗粒。多种基于逆转录病毒和包装细胞系的逆转录病毒载体都可以通过广泛的商业途径获取。

本发明还可以使用转座子体系。所述转座子系统可以是本领域常规使用的转座子，包括但不限于含有piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。这类转座载体含有相应转座子的5’反向末端重复序列(5’LTR)和相应转座子的3’反向末端重复序列(3’LTR)。转座酶可以是来自piggybac、sleeping beauty、frogprince、Tn5或Ty转座系统的转座酶。当使用来自不同转座系统的转座酶时，所述载体中的5’LTR和3’LTR的序列也相应改变为与该转座系统适配的序列，这可由本领域技术人员容易地确定。在某些实施方案中，在5’LTR和3’LTR之间是本发明的免疫效应细胞转换受体的表达框，包括相应的启动子序列、所述免疫效应细胞转换受体的编码序列以及polyA加尾信号序列。

在某些实施方案中，转座酶是来自piggybac转座系统的转座酶。因此，在这些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列分别为piggybac转座子的5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列如CN 201510638974.7(本文将其内容以引用的方式纳入本文)的SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，转座子3’反向末端重复序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，piggybac转座酶为含c-myc核定位信号编码序列的转座酶。在某些实施方案中，piggybac转座酶的编码序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:5所示。

转座酶编码序列的启动子可以是本领域已知的用于控制转座酶编码序列表达的各种启动子。在某些实施方案中，使用CMV启动子控制转座酶编码序列的表达。CMV启动子的序列可如CN 201510638974.7SEQ ID NO:6所示。

本发明另一方面为制备本文所述细胞的方法，包括：1)从哺乳动物中分离免疫细胞；2)向分离的所述免疫细胞中，任选地，向所述分离的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中，转染或转导编码本发明所述免疫效应细胞转换受体的核酸或含有所述核酸的载体；3)任选地，分离和/或扩增表达所述免疫效应细胞转换受体的细胞，任选地扩增表达所述免疫效应细胞转换受体的TIL。

在一实施方案中，所述分离的免疫细胞为分离的TIL。

在一实施方案中，所述分离的细胞为CD3+，任选地在转染或转导前被抗CD3抗体刺激，任选地，所述抗CD3抗体为溶液形式或膜结合形式，例如为OKT3或mOKT3，和/或在抗原呈递细胞(APC)表面。在一实施方案中，所述APC为人工APC(aAPC)。在另一实施方案中，所述aAPC表达膜形式的抗CD3单克隆抗体。

在一实施方案中，所述转染或转导步骤重复进行。例如，所述转染或转导步骤可以进行2次、3次或4次，或只到达到适当的表达水平。例如，所述转染或转导步骤可以进行5次。

在一实施方案中，所述细胞被转染或转导超过连续一天。例如，所述细胞连续转染或转导2天、3天或4天。

(4)表达免疫效应细胞受体的细胞及其应用

本发明表达免疫效应细胞受体的细胞是通过本发明所提供的方法向细胞中导入编码所述免疫效应细胞转换受体的核酸并表达所述核酸的细胞。

本发明所述细胞表面的免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域结合到特定的抗体或配体，以此将信号传递至胞内，并激活细胞。表达免疫效应细胞转换受体的细胞的激活根据宿主细胞的类型和所述免疫效应细胞转换受体的胞内结构域的不同而各不相同。所述激活可以通过基于，例如，细胞因子的释放、细胞增殖率的提高、细胞表面分子的改变或类似的参数作为指标得以证实。例如，细胞毒性细胞因子(肿瘤坏死因子、淋巴毒素等)从激活的细胞中释放导致靶细胞的杀伤。此外，细胞因子的释放或细胞表面分子的改变会刺激其他免疫细胞，如B细胞、树突状细胞、NK细胞或巨噬细胞。

本发明一方面提供了所述免疫效应细胞转换受体、其编码核酸、包含所述编码核酸的载体、细胞或包含其中一种或多种的组合物在治疗疾病中的应用。

本发明另一方面还提供了在哺乳动物体内提供抗肿瘤免疫的方法，包括对需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的本发明所述的细胞或组合物。

本发明进一方面提供了在不如动物体内治疗或预防疾病的方法，包括对需要治疗的哺乳动物施用有效剂量的本发明所述的细胞或组合物。

所述治疗试剂包括表达所述免疫效应细胞转换受体的细胞作为活性成分，并且还可以包含合适的佐剂。佐剂可以是例如存在于前述包含本发明所述核酸作为活性组分的组合物中的前述的药学上可接受的辅料，各类细胞培养基和等渗压氯化钠。

表达本发明所述免疫效应细胞受体的细胞可以用作疾病治疗的试剂。所述疾病包括癌症，如癌细胞表面异常表达EGFR的癌症。所述癌症可以是血液癌症、如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。所述癌症还可以是实体瘤，如肝癌、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、非小细胞癌、胆囊癌、食管癌、黑色素瘤、胰腺癌、尿路上皮癌、头颈癌和前列腺癌中的一种或多种。

在一实施方案中，所述疾病是炎症性疾病/自身免疫疾病、肝炎或传染性疾病如结核病、MRSA、VRE和深部真菌病，病因是病毒如流感病毒和HIV、细菌、真菌。

表达本发明所述免疫效应细胞转换受体的细胞结合至细胞所具有的抗原，在治疗前述疾病时这些细胞的数量被期望上升或下降。这些抗原可以是肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或类似的抗原。可以对这些疾病施用表达本发明所述免疫效应细胞转换受体的细胞。

本发明所述的表达免疫效应细胞转换受体的细胞可被用于预防以下手术后感染性疾病的发生：骨髓移植或化疗、为缓解复发性白血病进行的供体淋巴细胞回输等。

包含本发明所述含有免疫效应细胞转换受体的细胞作为活性组分的组合物可以通过皮内、肌肉内、皮下、腹膜内、鼻内、动脉内、静脉内、瘤内，或通过注射到传入向的淋巴管进行施用或配制成适于施用的剂型，所述施用可以是自体施用，例如，通过注射或灌输，所述施用的途径并非特别限定。

在一实施方案中，受试者被怀疑患有或确定患有癌症。

在一实施方案中，受试者被怀疑患有或确定患有炎症性疾病。

进一步，所述术语定义和记载于各特定部分的实施方案也意图应用于在其他的本文记载的实施方案中，只要本领域技术人员认为合适即可。例如，在下文中，本发明的不同方面将进行更为具体地描述。如此定义的每一方面均可与其他一方面或多方面组合，除非有明确相反的说明。特别地，任何被指示为优选的活具有优势的技术特征也可以与任何其他一个或多个被指示为优选的或具有优势的技术特征相互组合。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

实施例1表达EGFR转换受体的表达载体的构建

1、委托上海捷瑞生物公司合成EGFP胞外区基因，在其上游引入多克隆酶切位点(BglII-XbaI-EcoRI-BamHI)，在其下游插入酶切位点(SalI-NheI-HindIII-SpeI)，将其装入用EcoR1+SalI双酶切的pNB328载体中(pNB328的结构及序列参见CN 201510638974.7，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文)，获得pNB328-EGFP载体

2、委托上海捷瑞生物公司合成EGFR转换受体基因，依次包含CD8信号肽、EGFR胞外区、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD28共刺激区、截短的IL-2Rβ链胞内区和含有YRHQ基序的CD3ζ信号区，其结构示意图如图1所示，序列如SEQ ID NO:1所示，在其上游引入多克隆酶切位点(BglII-XbaI-EcoRI-BamHI)，在其下游插入酶切位点(SalI-NheI-HindIII-SpeI)，将其装入用EcoR1+SalI双酶切的pS328-EF1α载体中，获得pS328-EGFRTR。

3、委托上海生物公司合成EGFR转换受体对照基因，依次包含CD8信号肽、EGFR胞外区、CD8铰链区和CD8跨膜区，其结构示意图如图1所示，序列如SEQ ID NO:2所示，在其上游引入多克隆酶切位点(BglII-XbaI-EcoRI-BamHI)，在其下游插入酶切位点(SalI-NheI-HindIII-SpeI)，将其装入用EcoR1+SalI双酶切的pS328-EF1α载体中，获得pS328-EGFRTR-CRL。

与pNB328相比，pS328缺少PB转座酶编码序列，其他部分相同。

实施例2使用西妥昔单抗与CD28单抗刺激制备表达EGFR转换受体的T细胞

1)利用Ficoll分离法从供体受试者血液中分离获得外周血单核细胞(PBMCs)。将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤。

2)取2个1.5ml离心管，编号a和b，每管加入5×10⁶个步骤1)获得的初始T细胞，1200rpm离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤；

3)用含有5μg/mL的西妥昔单抗(购自Merck)和5μg/mL的抗CD28抗体(购自MerckMillipore，货号：CBL517)的包被液包被六孔板室温2-4小时，吸去包被液后用生理盐水洗涤孔板1-3次，加入含2％ FBS AIM-V培养基待用；

4)a、b两个离心管按比例加入Lonza电转试剂，每管共100μL，向a管中加入pNB328-EGFP和pS328-EGFRTR质粒，向b管中加入pNB328-EGFP和pS328-EGFRTR-CRL质粒，每种4μg，混合，将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，按说明书选取所需程序进行电击；

5)使用试剂盒中的微量吸管将a、b管中电转好的细胞悬液转移到加好培液的经西妥昔单抗和抗CD28抗体包被好的六孔板中(含2％ FBS的AIM-V培液)，混匀，置于37℃、5％CO₂培养箱培养，4小时后加入刺激因子IL-2至终浓度50IU/mL，37℃、5％CO₂培养3-4天，观察细胞的生长情况，获得的细胞分别命名为EGFR-TR-T-Cetux与EGFR-TR-T-CRL-Cetux，其中EGFR-TR-T-CRL-Cetux为对照细胞。

pNB328-EGFP同时表达EGFP与PB转座酶，EGFP表达框两端存在5’ITR与3’ITR，能够被整合到宿主细胞基因组中；pS328-EGFRTR与pS328-EGFRTR-CRL表达EGFR转换受体及其对照受体，与pNB328类似，pS328载体的表达框两端也存在5’ITR与3’ITR，在有PB转座酶存在的条件下也能够被整合到宿主细胞基因组中。在细胞培养至15-17天时，未被整合的质粒已基本不存在，所能观察到的表达EGFP的细胞绝大多数为整合表达的细胞，因此EGFP的表达水平也能够反应出EGFR转换受体的整合表达水平。

实施例3使用EGF与CD28单抗刺激制备表达EGFR转换受体的T细胞

制备方法见实施例2，区别在于将实施例2)步骤3)中的西妥昔单抗替换成EGF抗原(购自Gibco)，其他与实施例2相同。

所获得的细胞分别命名为EGFR-TR-T-EGF与EGFR-TR-T-CRL-EGF，其中EGFR-TR-T-CRL-EGF为对照细胞。

实施例4仅使用CD28单抗刺激制备表达EGFR转换受体的

制备方法见实施例2，区别在于实施例2)步骤3)中仅加入CD28单抗，不加入西妥昔单抗或EGF抗原，其他与实施例2相同。

所获得的细胞分别命名为EGFR-TR-T与EGFR-TR-T-CRL，其中EGFR-TR-T-CRL为对照细胞。

实施例5悬浮添加西妥昔单抗与CD28单抗包被刺激制备表达EGFR转换受体的T细胞

2)取1个1.5ml离心管，加入5×10⁶个步骤1)获得的初始T细胞，1200rpm离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤；

3)用含有5μg/mL的抗CD28抗体(购自Merck Millipore，货号：CBL517)的包被液包被六孔板室温2-4小时，吸去包被液后用生理盐水洗涤孔板1-3次，加入含2％ FBS AIM-V培养基待用；

4)向步骤2)离心管中按比例加入Lonza电转试剂，每管共100μL，再加入pNB328-EGFP和pS328-EGFRTR质粒，每种4μg，混合，将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，按说明书选取所需程序进行电击；

5)使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培液的经抗CD28抗体包被好的六孔板中(含2％FBS的AIM-V培液)，添加西妥昔单抗至终浓度1μg/mL，混匀，置于37℃、5％CO₂培养箱培养，4小时后加入刺激因子IL-2至终浓度50IU/mL，37℃、5％CO₂培养3-4天，观察细胞的生长情况，获得的细胞分别命名为EGFR-TR-T-fCetux。

实施例6表达EGFR转换受体T细胞的增殖水平检测

将前述实施例中获得的EGFR-TR-T、EGFR-TR-T-CRL、EGFR-TR-T-EGF、EGFR-TR-T-CRL-EGF、EGFR-TR-T-Cetux、EGFR-TR-T-CRL-Cetux与EGFR-TR-T-fCetux在孔板中持续培养15-17天，观察EGFP整合表达的情况，通过流式细胞仪检测EGFP整合表达的细胞的阳性率与阳性细胞数。

结果如图2-图5所示。图2显示EGFR-TR-T、EGFR-TR-T-EGF与EGFR-TR-T-Cetux在培养到第15天时EGFP细胞发光的水平，其中EGFR-TR-T-Cetux细胞中表达EGFP的细胞数量较另两种细胞明显更高。图3与图4分别显示以上6种细胞在培养到第15-17天时的EGFP阳性细胞所占的比例与EGFP阳性细胞的数量。结果显示，与其他5种细胞相比，EGFR-TR-T-Cetux的EGFP细胞的阳性率与阳性细胞数均明显更高，且呈上升趋势，其他5种细胞均呈下降趋势。图5显示将西妥昔单抗包被孔板刺激制得的EGFR-TR-T-Cetux细胞比西妥昔单抗以溶液形式添加进行刺激制得的EGFR-TR-T-fCetux细胞的EGFP阳性率更高，并且EGFR-TR-T-Cetux细胞的EGFP荧光强度也明显高于EGFR-TR-T-fCetux细胞

根据图2-图4的结果，用西妥昔单抗与抗CD28单抗包被后共同刺激制得的整合表达EGFR转换受体完整基因的T细胞EGFR-TR-T-Cetux能够有效地增殖，而用EGF抗原与抗CD28单抗包被后共同刺激制得的同样整合表达EGFR转换受体完整基因的T细胞EGFR-TR-T-EGF几乎不能有效增殖。根据图5的结果，使用包被西妥昔单抗刺激整合有EGFR转换受体的T细胞，表达整合在基因组中的EGFP(以及由此推测EGFR)的细胞数量与悬浮添加西妥昔单抗刺激制得细胞相比更多，并且表达强度也明显更高。

实施例7表达EGFR转换受体T细胞的耗竭表型检测

取EGFR-TR-T-Cetux细胞计数后分别加入3个1.5ml的EP管中，每管1×10⁶个细胞，PBS洗涤两次，1200rpm离心5min，弃上清；向3管中分别加入检测T细胞衰竭表型的流式抗体anti-PD-1-PE(购自BD公司)、anti-TIM3-PE(购自Biolegend公司)与anti-LAG3-APC(购自Biolegend公司)，轻弹沉淀使其混合均匀；室温避光孵育30min后，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μL的生理盐水，将细胞转移至流式管中，上流式细胞仪检测。

结果如图6所示，EGFR-TR-T-Cetux细胞中的三个耗竭表型标志物LAG3、TIM3或PD-1阳性细胞的比例分别为57.42％、78.87％和15.24％，表明EGFR-TR-T-Cetux细胞被西妥昔抗体有效激活。

实施例8表达EGFR转换受体T细胞的活化表型检测

取EGFR-TR-T-Cetux细胞与EGFR-TR-T-fCetux细胞，计数后每种细胞各分别加入4个1.5mL的EP管中，每管1×10⁶个细胞，PBS洗涤两次，1200rpm离心5min，弃上清；向每种细胞对应的4管的3管中分别加入检测T细胞活化表型的流式抗体anti-CD25-PE-Cy5(购自Biolegend)、anti-CD69-PC5(购自Biolegend)与anti-CD107a-APC(购自Invitrogen)，剩余1管为不加入荧光标记抗体的空白对照，轻弹沉淀使其混合均匀；室温避光孵育30min后，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μL的生理盐水，将细胞转移至流式管中，上流式细胞仪检测。

结果如图7所示，与EGFR-TR-T-fCetux细胞相比，EGFR-TR-T-Cetux细胞中的3个活化表型相关标志CD25、CD69和CD107a表达阳性的细胞数明显更多，表明EGFR-TR-T-Cetux细胞与EGFR-TR-T-fCetux细胞相比活化水平明显更高。

实施例9表达EGFR转换受体T细胞的CD4+与CD8+细胞的比例检测

取EGFR-TR-T-Cetux细胞与EGFR-TR-T-fCetux细胞，计数后分别加入2个1.5ml的EP管中，每管1×10⁶个细胞，PBS洗涤两次，1200rpm离心5min，弃上清；向每种细胞对应EP管中加入检测CD4+T细胞的流式抗体anti-CD4-FITC(购自BD公司)与检测CD8+T细胞的流式抗体anti-CD8-PE(购自BD公司)，轻弹沉淀使其混合均匀；室温避光孵育30min后，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μL的生理盐水，将细胞转移至流式管中，上流式细胞仪检测。

结果如图8所示，EGFR-TR-T-Cetux细胞与EGFR-TR-T-fCetux细胞中的CD8+T细胞所占的比例均超过50％，其中EGFR-TR-T-Cetux细胞中的CD8+T细胞的比例为54.72％，略高于EGFR-TR-T-fCetux细胞中的51.21％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的前述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海细胞治疗集团有限公司

上海细胞治疗研究院

<120> 一种免疫效应细胞转换受体

<130> 18A737

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2877

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgagcctgg aggaaaagaa agtttgccaa ggcacgagta acaagctcac gcagttgggc 120

acttttgaag atcattttct cagcctccag aggatgttca ataactgtga ggtggtcctt 180

gggaatttgg aaattaccta tgtgcagagg aattatgatc tttccttctt aaagaccatc 240

caggaggtgg ctggttatgt cctcattgcc ctcaacacag tggagcgaat tcctttggaa 300

aacctgcaga tcatcagagg aaatatgtac tacgaaaatt cctatgcctt agcagtctta 360

tctaactatg atgcaaataa aaccggactg aaggagctgc ccatgagaaa tttacaggaa 420

atcctgcatg gcgccgtgcg gttcagcaac aaccctgccc tgtgcaacgt ggagagcatc 480

cagtggcggg acatagtcag cagtgacttt ctcagcaaca tgtcgatgga cttccagaac 540

cacctgggca gctgccaaaa gtgtgatcca agctgtccca atgggagctg ctggggtgca 600

ggagaggaga actgccagaa actgaccaaa atcatctgtg cccagcagtg ctccgggcgc 660

tgccgtggca agtcccccag tgactgctgc cacaaccagt gtgctgcagg ctgcacaggc 720

ccccgggaga gcgactgcct ggtctgccgc aaattccgag acgaagccac gtgcaaggac 780

acctgccccc cactcatgct ctacaacccc accacgtacc agatggatgt gaaccccgag 840

ggcaaataca gctttggtgc cacctgcgtg aagaagtgtc cccgtaatta tgtggtgaca 900

gatcacggct cgtgcgtccg agcctgtggg gccgacagct atgagatgga ggaagacggc 960

gtccgcaagt gtaagaagtg cgaagggcct tgccgcaaag tgtgtaacgg aataggtatt 1020

ggtgaattta aagactcact ctccataaat gctacgaata ttaaacactt caaaaactgc 1080

acctccatca gtggcgatct ccacatcctg ccggtggcat ttaggggtga ctccttcaca 1140

catactcctc ctctggatcc acaggaactg gatattctga aaaccgtaaa ggaaatcaca 1200

gggtttttgc tgattcaggc ttggcctgaa aacaggacgg acctccatgc ctttgagaac 1260

ctagaaatca tacgcggcag gaccaagcaa catggtcagt tttctcttgc agtcgtcagc 1320

ctgaacataa catccttggg attacgctcc ctcaaggaga taagtgatgg agatgtgata 1380

atttcaggaa acaaaaattt gtgctatgca aatacaataa actggaaaaa actgtttggg 1440

acctccggtc agaaaaccaa aattataagc aacagaggtg aaaacagctg caaggccaca 1500

ggccaggtct gccatgcctt gtgctccccc gagggctgct ggggcccgga gcccagggac 1560

tgcgtctctt gccggaatgt cagccgaggc agggaatgcg tggacaagtg caaccttctg 1620

gagggtgagc caagggagtt tgtggagaac tctgagtgca tacagtgcca cccagagtgc 1680

ctgcctcagg ccatgaacat cacctgcaca ggacggggac cagacaactg tatccagtgt 1740

gcccactaca ttgacggccc ccactgcgtc aagacctgcc cggcaggagt catgggagaa 1800

aacaacaccc tggtctggaa gtacgcagac gccggccatg tgtgccacct gtgccatcca 1860

aactgcacct acggatgcac tgggccaggt cttgaaggct gtccaacgaa tgggcctaag 1920

atcccgacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 1980

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 2040

gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgcccc tggccgggac ttgtggggtc 2100

cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaggagta agaggagcag gctcctgcac 2160

agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc 2220

tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctccaact gcaggaacac cgggccatgg 2280

ctgaagaagg tcctgaagtg taacacccca gacccctcga agttcttttc ccagctgagc 2340

tcagagcatg gaggagacgt ccagaagtgg ctctcttcgc ccttcccctc atcgtccttc 2400

agccctggcg gcctggcacc tgagatctcg ccactagaag tgctggagag ggacaaggtg 2460

acgcagctgc tccccctgaa cactgatgcc tacttgtccc tccaagaact ccagggtcag 2520

gacccaactc acttggtgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 2580

cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 2640

ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 2700

caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 2760

gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 2820

acagccacca aggacaccta cgacgcctat aggcaccagg ccctgccccc tcgctga 2877

<210> 2

<211> 2136

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgagcctgg aggaaaagaa agtttgccaa ggcacgagta acaagctcac gcagttgggc 120

acttttgaag atcattttct cagcctccag aggatgttca ataactgtga ggtggtcctt 180

gggaatttgg aaattaccta tgtgcagagg aattatgatc tttccttctt aaagaccatc 240

caggaggtgg ctggttatgt cctcattgcc ctcaacacag tggagcgaat tcctttggaa 300

aacctgcaga tcatcagagg aaatatgtac tacgaaaatt cctatgcctt agcagtctta 360

tctaactatg atgcaaataa aaccggactg aaggagctgc ccatgagaaa tttacaggaa 420

atcctgcatg gcgccgtgcg gttcagcaac aaccctgccc tgtgcaacgt ggagagcatc 480

cagtggcggg acatagtcag cagtgacttt ctcagcaaca tgtcgatgga cttccagaac 540

cacctgggca gctgccaaaa gtgtgatcca agctgtccca atgggagctg ctggggtgca 600

ggagaggaga actgccagaa actgaccaaa atcatctgtg cccagcagtg ctccgggcgc 660

tgccgtggca agtcccccag tgactgctgc cacaaccagt gtgctgcagg ctgcacaggc 720

ccccgggaga gcgactgcct ggtctgccgc aaattccgag acgaagccac gtgcaaggac 780

acctgccccc cactcatgct ctacaacccc accacgtacc agatggatgt gaaccccgag 840

ggcaaataca gctttggtgc cacctgcgtg aagaagtgtc cccgtaatta tgtggtgaca 900

gatcacggct cgtgcgtccg agcctgtggg gccgacagct atgagatgga ggaagacggc 960

gtccgcaagt gtaagaagtg cgaagggcct tgccgcaaag tgtgtaacgg aataggtatt 1020

ggtgaattta aagactcact ctccataaat gctacgaata ttaaacactt caaaaactgc 1080

acctccatca gtggcgatct ccacatcctg ccggtggcat ttaggggtga ctccttcaca 1140

catactcctc ctctggatcc acaggaactg gatattctga aaaccgtaaa ggaaatcaca 1200

gggtttttgc tgattcaggc ttggcctgaa aacaggacgg acctccatgc ctttgagaac 1260

ctagaaatca tacgcggcag gaccaagcaa catggtcagt tttctcttgc agtcgtcagc 1320

ctgaacataa catccttggg attacgctcc ctcaaggaga taagtgatgg agatgtgata 1380

atttcaggaa acaaaaattt gtgctatgca aatacaataa actggaaaaa actgtttggg 1440

acctccggtc agaaaaccaa aattataagc aacagaggtg aaaacagctg caaggccaca 1500

ggccaggtct gccatgcctt gtgctccccc gagggctgct ggggcccgga gcccagggac 1560

tgcgtctctt gccggaatgt cagccgaggc agggaatgcg tggacaagtg caaccttctg 1620

gagggtgagc caagggagtt tgtggagaac tctgagtgca tacagtgcca cccagagtgc 1680

ctgcctcagg ccatgaacat cacctgcaca ggacggggac cagacaactg tatccagtgt 1740

gcccactaca ttgacggccc ccactgcgtc aagacctgcc cggcaggagt catgggagaa 1800

aacaacaccc tggtctggaa gtacgcagac gccggccatg tgtgccacct gtgccatcca 1860

aactgcacct acggatgcac tgggccaggt cttgaaggct gtccaacgaa tgggcctaag 1920

atcccgacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 1980

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 2040

gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgcccc tggccgggac ttgtggggtc 2100

cttctcctgt cactggttat caccctttac tgctga 2136

<210> 3

<211> 620

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln

1 5 10 15

Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn

20 25 30

Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg

35 40 45

Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr

50 55 60

Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu

65 70 75 80

Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala

85 90 95

Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro

100 105 110

Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn

115 120 125

Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val

130 135 140

Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu

145 150 155 160

Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp

165 170 175

Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala

180 185 190

Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys

195 200 205

His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys

210 215 220

Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys

225 230 235 240

Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn

245 250 255

Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro

260 265 270

Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly

275 280 285

Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys

290 295 300

Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu

305 310 315 320

Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys

325 330 335

Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe

340 345 350

Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu

355 360 365

Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln

370 375 380

Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu

385 390 395 400

Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val

405 410 415

Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile

420 425 430

Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala

435 440 445

Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr

450 455 460

Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln

465 470 475 480

Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro

485 490 495

Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val

500 505 510

Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn

515 520 525

Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn

530 535 540

Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His

545 550 555 560

Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met

565 570 575

Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val

580 585 590

Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly

595 600 605

Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro

610 615 620

<210> 4

<211> 286

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn

1 5 10 15

Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly

20 25 30

Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe

35 40 45

Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu

50 55 60

Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu

65 70 75 80

Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn

85 90 95

Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala

100 105 110

Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp

115 120 125

Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln

130 135 140

Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp

145 150 155 160

Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro

165 170 175

Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro

180 185 190

Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly

195 200 205

Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro

210 215 220

Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro

225 230 235 240

Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu

245 250 255

Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu

260 265 270

Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val

275 280 285

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Tyr Arg His Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 6

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

35 40 45

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys

65

<210> 7

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 8

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

35 40 45

<210> 9

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser

20

<210> 10

<211> 958

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr

20 25 30

Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser

35 40 45

Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu

50 55 60

Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr Ile

65 70 75 80

Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg

85 90 95

Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu

100 105 110

Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr

115 120 125

Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu His Gly

130 135 140

Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser Ile

145 150 155 160

Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met

165 170 175

Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys

180 185 190

Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu

195 200 205

Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys

210 215 220

Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly

225 230 235 240

Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala

245 250 255

Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr

260 265 270

Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr

275 280 285

Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser

290 295 300

Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly

305 310 315 320

Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn

325 330 335

Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr

340 345 350

Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His

355 360 365

Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro

370 375 380

Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr

385 390 395 400

Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His

405 410 415

Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly

420 425 430

Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu

435 440 445

Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn

450 455 460

Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly

465 470 475 480

Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser

485 490 495

Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly

500 505 510

Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser

515 520 525

Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro

530 535 540

Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys

545 550 555 560

Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn

565 570 575

Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr

580 585 590

Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr

595 600 605

Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr

610 615 620

Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys

625 630 635 640

Ile Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

645 650 655

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

660 665 670

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

675 680 685

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

690 695 700

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His

705 710 715 720

Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys

725 730 735

His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

740 745 750

Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn

755 760 765

Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly

770 775 780

Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe

785 790 795 800

Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu

805 810 815

Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu

820 825 830

Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val Arg Val

835 840 845

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

850 855 860

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

865 870 875 880

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

885 890 895

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

900 905 910

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

915 920 925

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

930 935 940

Asp Thr Tyr Asp Ala Tyr Arg His Gln Ala Leu Pro Pro Arg

945 950 955

<210> 11

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly

1 5 10 15

Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn

20 25 30

Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile

35 40 45

Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu

50 55 60

Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly

65 70 75 80

Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala

85 90 95

Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln

100 105 110

Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg

115 120 125

Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys

130 135 140

Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe

145 150 155

<210> 12

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro

1 5 10 15

Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val

20 25 30

Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn

35 40 45

Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn

50 55 60

Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His

65 70 75 80

Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met

85 90 95

Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val

100 105 110

Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly

115 120 125

Leu Glu Gly Cys Pro

130

<210> 13

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly

1 5 10 15

Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn

20 25 30

Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile

35 40 45

Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu

50 55 60

Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly

65 70 75 80

Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala

85 90 95

Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln

100 105 110

Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg

115 120 125

Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys

130 135 140

Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys

165 170 175

Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys

180 185 190

Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg

195 200 205

Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg

210 215 220

Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu

225 230 235 240

Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys

245 250 255

Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys

260 265 270

Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala

275 280 285

Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly

290 295 300

Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile

305 310 315 320

Pro

Claims

1.一种免疫效应细胞转换受体，其特征在于，其从N端至C端包括：1）胞外抗原结构域；2）跨膜结构域；3）胞内共刺激结构域；4）白介素受体链和5）胞内信号传导结构域，其中

所述免疫效应细胞转换受体还包括位于所述胞外抗原结构域和所述跨膜结构域之间的CD8铰链区，

所述胞外抗原结构域如SEQ ID NO. 3所示，

所述白介素受体链序列如SEQ ID NO. 4所示，

所述跨膜结构域为CD8跨膜区，

所述胞内共刺激结构域为CD28胞内结构域肽段，

所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号域。

2.根据权利要求1所述免疫效应细胞转换受体，其特征在于，所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求1所述免疫效应细胞转换受体，其特征在于，所述免疫效应细胞转换受体还包含信号肽。

4.根据权利要求3所述免疫效应细胞转换受体，其特征在于，所述信号肽位于所述免疫效应细胞受体的N端。

5.根据权利要求3所述免疫效应细胞转换受体，其特征在于，所述信号肽选自CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽和轻链信号肽中的任一种。

6.根据权利要求5所述免疫效应细胞转换受体，其特征在于，所述信号肽为CD8信号肽或轻链信号肽。

7.根据权利要求6所述免疫效应细胞转换受体，其特征在于，所述CD8信号肽的序列为SEQ ID NO.9所示。

8.根据权利要求1-7中任一项所述免疫效应细胞转换受体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

9.一种分离的核酸，其特征在于，其编码根据权利要求1-8中任一项所述免疫效应细胞转换受体。

10.根据权利要求9所述分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸为RNA；或，所述分离的核酸为DNA。

11.根据权利要求10所述分离的核酸，其特征在于，所述RNA含有5’UTR、编码前述免疫效应细胞转换受体的开放阅读框、3’UTR。

12.根据权利要求11所述分离的核酸，其特征在于，所述RNA含有5’帽子结构、5’UTR、编码根据权利要求1-8中任一项所述免疫效应细胞转换受体的开放阅读框、3’UTR和polyA序列。

13.根据权利要求10所述分离的核酸，其特征在于，所述DNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

14.一种核酸构建体，其特征在于，其含有根据权利要求9-13中任一项所述分离的核酸。

15.根据权利要求14所述核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体为含有根据权利要求9-13中任一项所述分离的核酸的载体。

16.根据权利要求15所述核酸构建体，其特征在于，所述载体为表达载体。

17.根据权利要求16所述核酸构建体，其特征在于，所述表达载体为整合载体。

18.根据权利要求16所述核酸构建体，其特征在于，所述载体为病毒载体或非病毒载体。

19.根据权利要求18所述核酸构建体，其特征在于，所述非病毒载体为转座子系统载体。

20.根据权利要求19所述核酸构建体，其特征在于，所述转座子系统载体为PiggyBac转座子系统载体、Sleeping Beauty转座子系统载体、Tn3或Tn5转座子系统载体。

21.一种免疫效应细胞，其特征在于，其表达根据权利要求1-8中任一项所述免疫效应细胞转换受体。

22.根据权利要求21所述免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞为选自T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、CIK细胞中的一种或多种；和/或，

所述免疫效应细胞包含根据权利要求14-20中任一项所述核酸构建体。

23.根据权利要求22所述免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞或选自T细胞和NK细胞中的一种或多种。

24.根据权利要求23所述免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞为T细胞。

25.根据权利要求21所述免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞为肿瘤浸润淋巴细胞。

26.根据权利要求21所述免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞为CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-巨噬细胞、TCR-T细胞和CAR-CIK细胞中的一种或多种。

27.根据权利要求26所述免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞是为CAR-T细胞。

28.一种药物组合物，其特征在于，其包含根据权利要求9-13中任一项所述分离的核酸、根据权利要求14-20中任一项所述核酸构建体和根据权利要求21-27中任一项所述免疫效应细胞中的一种或多种。

29.根据权利要求28所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料和/或稀释剂。

30.一种根据权利要求21-27中任一项所述免疫效应细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将根据权利要求9-13中任一项所述分离的核酸和/或根据权利要求14-20中任一项所述核酸构建体导入免疫效应细胞，获得表达根据权利要求1-8中任一项所述免疫效应细胞转换受体的初始细胞；

2）用根据权利要求1-8中任一项所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的结合蛋白和抗CD28抗体接触1）中所述初始细胞、培养。

31.根据权利要求30所述制备方法，其特征在于，1）中所述导入的方法为选自病毒颗粒感染、电转、脂质体转染、磷酸钙转染和基因枪中的任一种；和/或，

1）中所述免疫效应细胞为选自T细胞、NK细胞、NK T细胞、巨噬细胞、CIK细胞中的一种或多种；和/或，

所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的结合蛋白为所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的受体、配体或单克隆抗体；和/或，

所述抗CD28抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；和/或，

所述2）中所述接触为使所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的结合蛋白和所述抗CD28抗体直接存在于含有所述初始细胞的体系中，与所述初始细胞的表面产生直接相互作用；和/或，

所述培养的温度为37℃；和/或，

所述培养的CO₂浓度为5%；和/或，

所述培养所用的培养基为含有2%胎牛血清的AIM-V培养基；和/或，

所述培养的时间为3-17天。

32.根据权利要求30所述制备方法，其特征在于，1）中所述导入的方法选自病毒颗粒感染、电转和脂质体转染中的任一种。

33.根据权利要求32所述制备方法，其特征在于，1）中所述导入的方法为为病毒颗粒感染或电转。

34.根据权利要求30所述制备方法，其特征在于，1）中所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞中的一种或多种。

35.根据权利要求34所述制备方法，其特征在于，1）中所述免疫效应细胞为T细胞。

36.根据权利要求30所述制备方法，其特征在于，1）中所述免疫效应细胞为肿瘤浸润淋巴细胞。

37.根据权利要求30所述制备方法，其特征在于，1）中所述免疫效应细胞为CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-巨噬细胞、TCR-T细胞和CAR-CIK细胞中的一种或多种。

38.根据权利要求37所述制备方法，其特征在于，1）中所述免疫效应细胞是为CAR-T细胞。

39.根据权利要求30所述制备方法，其特征在于，所述抗CD28抗体为人源化单克隆抗体。

40.根据权利要求39所述制备方法，其特征在于，所述抗CD28抗体为人源化鼠源或兔源单克隆抗体。

41.根据权利要求30所述制备方法，其特征在于，所述培养的时间为4-17天。

42.根据权利要求41所述制备方法，其特征在于，所述培养的时间为15-17天。

43.根据权利要求30所述制备方法，其特征在于，所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的结合蛋白为溶液形式存在，所述抗CD28抗体为固定化形式存在。

44.根据权利要求43所述制备方法，其特征在于，所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的结合蛋白的终浓度为0.1-5μg/mL。

45.根据权利要求44所述制备方法，其特征在于，所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的结合蛋白的终浓度为0.1-3μg/mL。

46.根据权利要求30所述制备方法，其特征在于，所述免疫效应细胞转换受体的胞外抗原结构域的结合蛋白和所述抗CD28抗体均为固定化形式存在。

47.根据权利要求30-46中任一项所述制备方法，其特征在于，所述培养所用的培养基中还含有细胞因子。

48.根据权利要求47所述制备方法，其特征在于，所述细胞因子为IL-2，终浓度为500IU/mL。

49.根据权利要求47所述制备方法，其特征在于，所述细胞因子在所述培养进行0-6小时时加入所述培养基。

50.根据权利要求47所述制备方法，其特征在于，所述细胞因子在所述培养进行4小时时加入所述培养基。

51.根据权利要求1-8中任一项免疫效应细胞转换受体、根据权利要求9-13中任一项所述分离的核酸、根据权利要求14-20中任一项所述核酸构建体、根据权利要求21-27中任一项所述免疫效应细胞和根据权利要求28或29所述药物组合物中的一种或多种在制备抗癌症药物中的用途，所述癌症选自肝癌、肺癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、黑色素瘤、胰腺癌、头颈癌或前列腺癌中的一种或多种。

52.根据权利要求1-8中任一项免疫效应细胞转换受体、根据权利要求9-13中任一项所述分离的核酸、根据权利要求14-20中任一项所述核酸构建体、根据权利要求21-27中任一项所述免疫效应细胞和根据权利要求28或29所述药物组合物中的一种或多种在制备抗癌症药物中的用途，所述癌症选自腺癌、结肠癌和尿路上皮癌中的一种或多种。