CN117683136A - 嵌合抗原受体、慢病毒、修饰nk细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种嵌合抗原受体、慢病毒、修饰NK细胞及其应用，本发明属于生物医药技术领域。本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含CD5结合结构域和非抗原结合结构域。所述非抗原结合结构域包括CD28胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体，其增强子为IL‑15或其受体或功能变体或它们的组合。本发明还涉及包含所述嵌合抗原受体的5D CAR‑NK细胞，该细胞能够有效靶向肿瘤，对多种肿瘤细胞具有显著的特异性杀伤作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及靶嵌合抗原受体、慢病毒、修饰NK细胞及其应用。
背景技术
T细胞恶性肿瘤是一组广泛存在的异质性疾病，每一种类型都表现为不同发育阶段功能失调的T细胞克隆性增生，通常预后较差。T细胞恶性肿瘤包括T细胞急性淋巴细胞白血病(T ALL)、皮肤和外周T细胞淋巴瘤(CTCL和PTCL)以及成人T细胞白血病(ATL)。T细胞恶性肿瘤进展很快，可以在短期内快速浸润到淋巴结、肝、脾、中枢神经系统等组织器官，目前缺乏有效的治疗方法。
嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)通过基因工程方式使得如T细胞在内的免疫细胞定向识别和杀伤靶细胞。目前，嵌合抗原受体T细胞(CAR T)疗法已经在复发/难治性淋巴瘤等血液肿瘤的治疗中显示积极疗效。尽管CART疗法取得了一定成功，随着CART在临床应用越来越广泛，也显现出一定弊端，其中最主要的就是细胞因子释放综合征和神经毒性，这也极大的影响了CART的治疗效果。此外自体细胞获取给临床应用CART细胞带来了挑战，一方面一些病人由于疾病影响无法获得足够的高质量T细胞；另一方面制备细胞需要一定的时间，使得一些病人无法及时得到治疗。以上缺点限制了该创新疗法的临床可及性和疗效。
自然杀伤(natural killer，NK)细胞可通过抗体依赖的细胞毒作用(antibodydependent cellular cytotoxicity，ADCC)、Fas/FasL等多个途径诱导靶细胞凋亡，分泌颗粒酶、穿孔素等细胞毒颗粒直接引起靶细胞凋亡，还可分泌细胞因子、趋化因子及生长因子等直接激活靶细胞或者进一步激活其他免疫细胞发挥免疫效应，使其成为一个过继性免疫细胞治疗的理想效应细胞。重要的是，NK细胞缺乏与T细胞共享的抗原，有效避免了自我靶向的问题。此外，相比CAR-T细胞，CAR-NK细胞不依赖于主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex,MHC)，CRS风险低。NK细胞表面不携带细胞受体(T cellreceptor，TCR)，异体输注时GVHD风险低，并保留了NK细胞天然识别和靶向肿瘤细胞的能力，因此大大降低了脱靶的可能性，使得CAR-NK成为极具潜力的通用型异体免疫疗法。国内学者Xu等人于2019年应用不同的共刺激分子(2B4、4-1BB)构建靶向CD5分子的scFv CAR-NK-92细胞，结果显示，不同胞内域均能有效杀伤CD5+恶性肿瘤细胞，且能延长T-ALL小鼠模型的生存期。以上研究提示了CD5分子作为T细胞恶性肿瘤治疗靶点及CAR-NK细胞作为通用型免疫疗法的可行性。NK细胞使用的CAR结构，需要特殊的设计。目前仍需要新的CARNK疗法来满足患者的需求。
[1]Laskowski TJ,A,Rezvani K.Natural killer cells inantitumour adoptive cell immunotherapy[J].Nat Rev Cancer.2022Oct；22(10):557-575.
[2]Xu Y,Liu Q,Zhong M,et al.2B4 costimulatory domain enhancingcytotoxic ability of anti-CD5 chimeric antigen receptor engineered naturalkiller cells against Tcell malignancies[J].Hematol Oncol.2019May 16；12(1):49.
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种嵌合抗原受体、慢病毒、修饰NK细胞及其应用。本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含CD5结合结构域和非抗原结合结构域。所述非抗原结合结构域包括CD28胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体，其增强子为IL-15或其受体或功能变体或它们的组合。本发明还涉及包含所述嵌合抗原受体的5D CAR-NK细胞，该细胞能够有效靶向肿瘤，对多种肿瘤细胞具有显著的特异性杀伤作用。
术语：
本发明中，术语“氨基酸”包含天然氨基酸、合成氨基酸、以及以类似于天然氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本文中可以由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名法委员会所推荐的单字母符号来提及。
本发明中，术语“核苷酸序列”是指DNA或RNA中碱基的排列顺序，即在DNA中为A、T、G、C的排列顺序，或者在mRNA中A、U、G、C的排列顺序，也包括rRNA、tRNA、mRNA中碱基的排列顺序。
本发明中，重链指抗体中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(H链)；轻链指抗体中2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(L链)。
本发明中，可变区指免疫球蛋白轻链和重链靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区。
本发明中，术语“互补决定区”或“CDR”通常是指在抗原结合片段可变区内的互补性决定区。在本发明中，所述重链可变区存在3个CDRs，所述CDRs对于每个可变区命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本发明中，术语“FR”通常是指抗体可变结构域的更高度保守的部分，其被称为框架区。
本发明中，术语“单域抗体”或“VHH”是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体。
本发明中，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”通常是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常有两种，其当在免疫效应细胞中时，提供细胞对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性，并产生细胞内信号。在一些实施方案中，CAR包含至少一个细胞外抗原结合结构域(如VHH、scFv或其部分)，跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号传导结构域”)，其包含衍生自如下所定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。
本发明中，术语“人天然噬菌体展示抗体库筛选”，是以靶蛋白或过表达细胞株作为抗原，进行人天然噬菌体展示抗体库海选。根据海选结果，挑取足够数量单克隆进行初筛，挑取阳性克隆进行测序，并进行序列多样性分析，挑选出序列特异性的抗体克隆，之后进行抗体样品制备。本说明书中“人天然噬菌体展示抗体库”和“人天然库”可互换使用。
本发明中，术语“功能性变体”通常是指包括与其具有基本上相同的功能且与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
本发明中，术语“自然杀伤细胞”或“NK细胞”通常是指免疫系统的一种细胞毒性淋巴细胞。
本发明中，术语“表达”通常是指特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
本发明中，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“人源化”抗体是指抗体的恒定区部分(即CH和CL区)或抗体所有全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体等几类。应该理解，本领域技术人员根据实际需要能够制备出本发明单域抗体的合适的人源化形式，这在本发明涵盖的范围之内。
本发明的技术方案包括：
一方面，本发明提供了一种特异性结合CD5的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1、CDR2和CDR3包含选自SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列。
具体地，所述CDR1包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列，所述CDR2包含与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列，且所述CDR3包含与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。
具体地，所述抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列至少约50％同一性的氨基酸序列。
具体地，所述抗体或抗原结合片段包括单域抗体
优选地，单域抗体为人源化单域抗体。
另一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含上述的抗体或抗原结合片段。
具体地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。
进一步具体地，所述信号肽包括CD3ζ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD153分子信号肽。
优选地，所述信号肽为CD8分子信号肽。
优选地，所述信号肽包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列至少约50％同一性的氨基酸序列。
具体地，所述嵌合抗原受体还包括非抗原结合结构域；所述非抗原结合结构域包括胞外区、跨膜区和胞内共刺激信号结构区。
优选地，所述胞外区、跨膜区和胞内共刺激信号结构区为CD28的胞外区、跨膜区和胞内共刺激信号结构区，包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列至少约50％同一性的氨基酸序列。
具体地，所述非抗原结合结构域还包括胞内信号传导结构域。
优选地，所述胞内信号传导结构域包括CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ。
优选地，所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；或与SEQID NO：7所示的氨基酸序列至少约50％同一性的氨基酸序列。
优选地，所述非抗原结合结构域包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；或与SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列至少约50％同一性的氨基酸序列。
具体地，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列至少约50％同一性的氨基酸序列。
又一方面，本发明提供了一种多肽，所述多肽包含上述的嵌合抗原受体和能够增强免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子。
具体地，所述增强子包括IL-15或其功能变体，或包含IL-15受体的嵌合细胞因子受体。
优选地，所述增强子包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列至少约50％同一性的氨基酸序列。
具体地，所述嵌合抗原受体和所述增强子通过接头连接；所述接头包括可切割的接头。
进一步具体地，所述接头包括自切割肽。
优选地，所述自切割肽包括P2A，F2A，E2A或T2A。
进一步优选地，所述自切割肽为T2A；所述嵌合抗原受体的C端与所述增强子的N端可以通过T2A连接，并具有如下结构CD8SP-anti-CD5 sdAb-CD28(Hinge/TM/Intracellular)-CD3ζ-T2A-IL 15。
具体地，所述融合多肽包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列至少约50％同一性的氨基酸序列。
又一方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求上述的多肽。
具体地，所述核酸分子包含如SEQ ID NO：12所示的序列；或与SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列至少约50％同一性的氨基酸序列。
具体地，所述核酸分子包括编码嵌合抗原受体的第一核酸序列。
进一步具体地，所述嵌合抗原受体包括抗体或抗原结合片段、信号肽和非抗原结合结构域。
优选地，所述第一核酸序列包含如SEQ ID NO：13所示的序列；或与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列至少约50％同一性的氨基酸序列。
具体地，所述核酸分子包括编码增强子的第二核酸序列。
进一步具体地，所述第二核酸序列包含如SEQ ID NO：14所示的序列；或与SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列至少约50％同一性的氨基酸序列。
又一方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包含上述的核酸分子。
优选地，所述慢病毒载体为Pre-Lenti-EF1-5D-CAR V2 WPmut。
又一方面，本发明提供了一种经工程改造的宿主细胞，所述宿主细胞包含包含上述的慢病毒载体。
具体地，所述宿主细胞包括经工程改造的免疫细胞。
进一步具体地，所述经工程改造的免疫细胞包含T细胞、NK细胞、CTL细胞、单核细胞、巨噬细胞、NKT细胞树突状细胞或其任意组合。
优选地，所述工程改造的免疫细胞为CAR-NK细胞。
又一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述抗体或抗原结合片段，或上述嵌合抗原受体，或上述多肽，或上述核酸分子，或上述慢病毒载体或上述宿主细胞。
具体地，所述试剂盒用于检测CD5蛋白。
又一方面，本发明提供了一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-2任一项中所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求3-13任一项中所述的嵌合抗原受体，或权利要求14-17任一项中所述的多肽，或权利要求18-21任一项中所述的核酸分子，或权利要求22中所述的慢病毒载体，或权利要求23-25任一项中所述的宿主细胞。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含CD5结合结构域和非抗原结合结构域。所述非抗原结合结构域包括CD28胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体，其增强子为IL-15或其受体或功能变体或它们的组合。本发明还涉及包含所述嵌合抗原受体的5D CAR-NK细胞，该细胞能够有效靶向肿瘤，对多种肿瘤细胞具有显著的特异性杀伤作用。
附图说明
图1为5D CAR-NK结构示意图；其中CD8 SP代表CD8分子的信号肽；5D sdAb代表靶向CD5的单域抗体序列；CD28 Hinge+TM+Intracellular代表CD28分子的胞外区、跨膜区和胞浆区序列；CD3ζ代表CD3ζ分子的胞浆区序列；T2A代表自剪切序列；IL-15代表IL-15序列。
图2为穿梭质粒Pre-Lenti-EF1-CAR V2 Wpmut的图谱
图3为包装质粒pMDLg-pRRE-K的图谱。
图4为包装质粒pRsv-rev-kana-V2的图谱。
图5为细胞因子扩增活化制备的5D CAR-NK细胞阳性率。
图6为细胞因子扩增活化制备的5D CAR-NK细胞对CD5阳性急性淋巴白血病细胞的体外杀伤及细胞因子IFN-γ分泌情况。
图7为K562-mb IL-21饲养细胞扩增活化制备的5D CAR-NK阳性率。
图8为K562-mb IL-21饲养细胞扩增活化制备的5D CAR-NK细胞对CD5阳性急性淋巴白血病细胞的体外杀伤能力。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本发明要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本发明做出多种改变和修饰，而其也应当属于本发明要求保护的范围之中。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
下面结合具体实施例，对本发明进行说明，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明，以使本发明技术方案更易于理解掌握。下属实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明均可从商业途径获得。
实施例1嵌合抗原受体构建
本实施例构建了靶向CD5的CAR慢病毒载体，结构如图1所示，以5D单域抗体为抗原识别区，结合胞外铰链区、跨膜区和胞浆区使用CD28分子的胞外区、跨膜区和胞浆区，连接CD3ζ的胞内域，通过T2A连接野生型IL-15细胞因子的结构，构建了能用于NK细胞的靶向CD5的CAR结构；命名为5DCAR。酶切慢病毒Pre-Lenti-EF1-CAR V2 Wpmut载体和5D CAR基因，连接，转化，挑克隆，提质粒，测序，得到序列正确慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-5D-CAR V2Wpmut。
慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-CAR V2 Wpmut(穿梭质粒)的制备方法如下：
(1)穿梭质粒pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(http://n2t.net/addgene:12252)的5'LTR为RSV启动子，将5'LTR的启动子从RSV换为CMV，有助于高效转录病毒基因组序列；3'LTR原质粒已经剔除了U3区(3'LTR△U3)，已经为自失活(self-inactivating,SIN)设计，3'LTR序列不变。
(2)将驱动外源转基因表达的hPGK启动子换为EF1启动子，EGFP基因替换为多克隆序列(SEQ ID NO：15)；
(3)氨苄抗性基因替换为pUC57-Kan(GenBank:LT671993.1)质粒来源的卡那抗性基因；
(4)对pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE的WPRE元件进行改动，使不表达截短的X蛋白。具体为：在WPRE野生型元件的序列内，将驱动X蛋白转录的启动子剔除，起始密码ATG的A变为T，新序列命名为WPREmut。
上述改造后的穿梭质粒命名为Pre-Lenti-EF1-CAR V2 Wpmut，序列如SEQ ID NO：16所示。穿梭质粒图谱如图2所示，图谱中注释如下表1所示。
表1穿梭质粒Pre-Lenti-EF1-CAR V2 WPmut各元件注释
实施例2CD5嵌合抗原受体慢病毒制备
1、包装质粒pMDLg-pRRE-K的制备：
包装质粒来源于质粒pMDLg-pRRE，最初由Didier Trono Lab构建，存储于Addgene(www.addgene.org/12251/)，其原序列中质粒为氨苄青霉素抗性，替换为pET-28(a)质粒的卡那抗性基因；上述改造后的包装质粒命名为pMDLg-pRRE-K，序列如SEQ ID NO：17所示。包装质粒pMDLg-pRRE-K的图谱如图3所示，注释如表2所示。
表2
2、包装质粒pRsv-rev-kana-V2的制备：
包装质粒来源于质粒pRSV-rev，最初由Didier Trono Lab构建，存储于Addgene(www.addgene.org/12253/)，其原序列中质粒为氨苄青霉素抗性，替换为pUC57-Kan(GenBank:LT671993.1)质粒的卡那抗性基因；上述改造后的包装质粒命名为pRsv-rev-kana-V2，序列如SEQ ID NO：18所示。包装质粒pRsv-rev-kana-V2的图谱如图4所示，注释如下表3。
表3
| 元件名 | 功能区 |
| RSV promoter | RSV启动子 |
| Rev | 病毒基因表达调控子 |
| Ori | ColE1/pMB1/pBR322高拷贝复制起始点 |
| KanR | 卡那霉素抗性基因 |
3、包膜质粒BaEVRdel的制备：
(1)通过搜索NCBI数据库，获得编码BaEV-gp的氨基酸序列(polyprotein[Baboonendogenous virus strain M7]，NCBI Reference Sequence:YP_009109691.1)，具体序列如SEQ ID NO：19所示。
(2)SEQ ID NO：19所示的序列中“vltqqyqvlrtdeeaqd”为R区的序列，对于假型病毒没有功能，剔除该序列后，将编码BaEV的包膜蛋白命名为BaEVRdel，其氨基酸序列如SEQID NO：20所示。在进行人源细胞表达的密码子优化后，核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示。
4、含有编码CD5 CAR目的基因的慢病毒的制备：
采用三代载体、四质粒系统包装含有编码CD5 CAR目的基因的慢病毒。
将Pre-Lenti-EF1-5D-CAR V2 WPmut CAR穿梭质粒与包装质粒pMDLg-pRRE-K：包膜质粒BaEVRdel：包装质粒pRsv-rev-kana-V2按9:7:7:7的比例混匀，将以上四种质粒的混合物加入含293TS基础培养基的管中。按照质粒：PEIpro＝1:2比例向另一管中加入PEIpro。两管各在室温孵育5min后，将含PEIpro的混合液缓慢加入到含DNA的混合液中，轻轻晃动离心管混合均匀，室温孵育15min左右。将DNA-PEIpro混合液加入待转染细胞中，混匀，37℃、5％CO2震荡培养。6h后补料。48h后，收集含有慢病毒的培养基上清。含病毒培养上清转入50ml离心管内，离心去除293TS细胞，将含病毒上清过滤，浓缩，分装，-80℃保存备用。基于流式细胞术测定慢病毒的转导滴度为8.56×107TU/ml。
实施例3细胞因子扩增活化制备5D CAR-NK
采集健康志愿者外周血，纯化NK细胞(通过CD3磁珠进行阴性选择去除CD3阳性细胞，然后使用CD56磁珠进行阳性选择以富集CD3-CD56+的NK细胞)，使用IL-2和IL-15刺激活化NK细胞，培养48h后使用CD5嵌合抗原受体慢病毒感染NK细胞。通过流式细胞术检测转导效率，结果如图5所示，未转导的NK细胞(non-transduced NK，NT-NK)阳性率为0.22％，5DCAR-NK细胞阳性率为49.9％。
实施例4细胞因子扩增活化制备的5D CAR-NK细胞对CD5阳性急性淋巴白血病细胞(CCRF-CEM)的体外杀伤及细胞因子IFN-γ分泌情况
将实施例3制备的5D CAR-NK细胞、未转导的NK细胞分别按1:2、1:4、1:8的效靶比与CCRF-CEM细胞共孵育16小时，LDH释放实验评估5D CAR-NK细胞的杀伤功能，结果如图6A所示。收集杀伤后的上清液，ELISA法检测5D CAR-NK细胞杀伤CCRF-CEM细胞后IFN-γ分泌情况，结果如图6B所示。
结果显示，与对照组NT-NK相比，在不同效靶比的条件下5D CAR-NK细胞对CCRF-CEM细胞具有显著的特异性杀伤。5D CAR-NK细胞杀伤CCRF-CEM细胞后IFN-γ释放量明显升高。
实施例5K562-mb IL-21饲养细胞扩增活化制备5D CAR-NK
采集健康志愿者的外周血，并通过CD3磁珠进行阴性选择以去除CD3阳性细胞，然后使用CD56磁珠进行阳性选择以富集CD3-CD56+的NK细胞。将NK细胞与符合放行标准的经过辐照的饲养细胞按照1：2的比例混合，培养6天后使用CD5嵌合抗原受体慢病毒感染NK细胞。第14天(D14)使用流式细胞术检测转导效率，结果如图7所示，5D CAR-NK细胞阳性率为24.8％。
实施例6K562-mb IL-21饲养细胞扩增活化制备的5D CAR-NK细胞杀伤多种肿瘤细胞
为了验证饲养细胞扩增活化制备5D CAR-NK细胞体外杀伤功能，使用5DCAR-NK和NT-NK细胞分别杀伤不同的肿瘤细胞系，靶细胞分别为表达CD5分子的T系急性淋巴细胞白血病细胞系CCRF-CEM和Jurkat、T淋巴母细胞淋巴瘤细胞系SUP-T1、套细胞淋巴瘤细胞系Jeko-1。将5D CAR-NK与NT-NK细胞细胞分别按1:2、1:4、1:8的效靶比分别与CCRF-CEM细胞、SUP-T1、Jeko-1细胞共孵育16小时，按1:10、1:20、1:40的效靶比与Jurkat细胞、共孵育16小时，结果如图8所示。
结果显示，与对照组NT-NK相比，在不同效靶比的条件下，饲养细胞扩增活化制备的5D CAR-NK细胞能够特异性有效杀伤CD5+肿瘤细胞。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围。应当指出的是，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附要求为准。
Claims (27)
1.一种特异性结合CD5的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1、CDR2和CDR3包含选自SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
3.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含权利要求1-2任一项所述的抗体或抗原结合片段。
4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。
5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽包括CD3ζ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD153分子信号肽。
6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括非抗原结合结构域；所述非抗原结合结构域包括胞外区、跨膜区和胞内共刺激信号结构区。
8.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外区、跨膜区和胞内共刺激信号结构区为CD28的胞外区、跨膜区和胞内共刺激信号结构区，包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述非抗原结合结构域还包括胞内信号传导结构域。
10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号传导结构域包括CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ。
11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求7所述的的嵌合抗原受体，其特征在于，所述非抗原结合结构域包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含SEQ IDNO：9所示的氨基酸序列。
14.一种多肽，其特征在于，所述多肽包含权利要求3-13任一项中所述的嵌合抗原受体和能够增强免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子。
15.根据权利要求14所述的多肽，其特征在于，所述增强子包括IL-15或其功能变体，或包含IL-15受体的嵌合细胞因子受体。
16.根据权利要求15所述的多肽，其特征在于，所述增强子包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求14所述的多肽，其特征在于，所述多肽包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
18.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求14-17任一项中所述的多肽；所述核酸分子包含如SEQ ID NO：12所示的序列。
19.根据权利要求18所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码嵌合抗原受体的第一核酸序列和编码增强子的第二核酸序列。
20.根据权利要求19所述的核酸分子，其特征在于，所述第一核酸序列包含如SEQ IDNO：13所示的序列。
21.根据权利要求18所述的核酸分子，其特征在于，所述第二核酸序列包含如SEQ IDNO：14所示的序列。
22.一种慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包含权利要求18-21任一项中所述的核酸分子。
23.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求22所述的慢病毒载体。
24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括经工程改造的免疫细胞。
25.根据权利要求24所述的宿主细胞，其特征在于，所述经工程改造的免疫细胞包含T细胞、NK细胞、CTL细胞、单核细胞、巨噬细胞、NKT细胞、树突状细胞或其任意组合。
26.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-2任一项中所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求3-13任一项中所述的嵌合抗原受体，或权利要求14-17任一项中所述的多肽，或权利要求18-21任一项中所述的核酸分子，或权利要求22中所述的慢病毒载体，或权利要求23-25任一项中所述的宿主细胞。
27.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-2任一项中所述的抗体或抗原结合片段，或权利要求3-13任一项中所述的嵌合抗原受体，或权利要求14-17任一项中所述的多肽，或权利要求18-21任一项中所述的核酸分子，或权利要求22中所述的慢病毒载体，或权利要求23-25任一项中所述的宿主细胞。
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