JP7252379B2 - Ｃｓ１標的化キメラ抗原受容体修飾ｔ細胞 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、発明の名称が「多発性骨髄腫を治療するためのセントラルメモリー由来ＣＳ１キメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞の使用」である２０１４年１２月５日に出願された米国非仮出願第６２／０８８，４２３号の利益を主張し、その全体が本明細書に援用される。

腫瘍特異的Ｔ細胞を用いた免疫療法は、遺伝子組換えＴ細胞を用いた療法も含めて、抗腫瘍治療について研究されている。このような治療法で用いられるＴ細胞は、生体内で十分な期間、活性を維持できない場合がある。Ｔ細胞の抗腫瘍活性は比較的低い場合がある。したがって、当業界には、抗腫瘍機能がより長期に及ぶ腫瘍特異的がん治療の要望がある。

キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）の組換えＴ細胞を利用する養子Ｔ細胞療法（ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ，ＡＣＴ）は、様々ながんの再発率を低減するための安全かつ有効な方法を提供することができるが、それは、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＭＨＣ非依存的に抗原特異的腫瘍集団を特異的に認識するように組換えることができるからである。

多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ，ＭＭ）は、形質細胞のクローン増殖を特徴とするＢ細胞悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）である。ＭＭは、全がんの約１％、及び米国における血液悪性腫瘍の１０％強を占めている。米国だけでも、今年、約２万例の新たな症例が診断され、かつ、１１，０００人以上がこの疾患で死亡する。ＭＭの現在の治療法ではしばしば寛解を誘導するが、ほぼすべての患者は最終的に再発して死亡する。
ＣＳ１は、正常な形質細胞及びＭＭ細胞上で高度にかつ選択的に発現されるシグナル伝達リンパ球活性化分子（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＳＬＡＭ）受容体ファミリーの細胞表面糖タンパク質であり、ＮＫ細胞上の発現が低く、かつ、正常組織上でほとんど又は全く発現しない。エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂｃ）（ＨｕＬｕｃ６３）は、再発したＭＭ患者のボルテゾミブと共に投与されたヒト化ＣＳ１モノクローナル抗体で、患者の４８％で≧ＰＲを生じる。ＭＭ細胞上でのＣＳ１の高発現は、正常組織における形質細胞へのその制限と相まって、ＣＳ１をＣＡＲ Ｔ細胞療法の合理的な標的とする（非特許文献１）。

Ｈｓｉ ｅｔ ａｌ． ２００８ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １４：２７７５

本明細書には、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが記載される。細胞外ドメインは、ＣＳ１特異的ｓｃＦｖ領域又はその変異体、及び場合によっては、例えば、ヒトＦｃドメインの一部を含むスペーサーを含む。細胞外ドメインにより、Ｔ細胞の表面上に発現されたＣＡＲがＴ細胞活性を、ＭＭの表面上に発現される受容体であるＣＳ１を発現する細胞に指向させることができる。膜貫通ドメインは、例えば、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、又はＣＤ３膜貫通ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体（ＣＤ３ζ）のゼータ（ζ）鎖由来のシグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。細胞内領域にＣＤ３ζと直列の４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン等の共刺激ドメインを含めることにより、Ｔ細胞は共刺激シグナルを受け取ることができる。Ｔ細胞、例えば患者特異的な自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＡＲを発現するように組換えることができ、かつ、組換え細胞を増殖して、ＡＣＴで用いることができる。アルファベータ（αβ）Ｔ細胞及びガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞をともに含む様々なＴ細胞サブセットを用いることができる。さらに、ＣＡＲは、ＮＫ細胞等の他の免疫細胞において発現されることができる。患者が、本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫細胞で治療される場合、細胞は、自己Ｔ細胞又は同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ，アロジェニック）Ｔ細胞であってよい。用いられる細胞は、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞（ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ，ＴＣＭ）をともに含む細胞集団であって、これらはＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、及びＣＤ４５ＲＡ－である場合がある。細胞集団は他のタイプのＴ細胞も同様に含むことができる。Ｔ細胞、例えば、患者特異的自己Ｔ細胞を組換えて、本明細書に記載されるＣＡＲを発現することができ、当該操作された細胞を増殖させて、ＡＣＴに用いることができる。

本明細書に記載のＣＳ１ ＣＡＲには、ある有利な特徴があり、それらは例えば養子移入後の持続性や抗腫瘍活性が増強されていることである。

ＣＳ１を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＭＭ等のがん、並びにＣＳ１を発現する他のがんの治療に有用でありうる。したがって、本開示は、本明細書に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞を用いたＣＳ１発現がんの治療方法を含む。

本明細書に記載されるのは、ＣＡＲをコードする核酸分子であって、当該核酸分子は、
ＣＳ１ ｓｃＦｖ（例えば、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＤＦＳＲＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤＫＦＩＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＰＤＧＮＹＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＩＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ；配列番号１）又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）された変異体；ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）された変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）された変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）された変異体、及びＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）された変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）された変異体）；又は、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）された変異体；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）された変異体、及び４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）された変異体の両方；並びに、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又は１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）された変異体；を含む。

本開示はまた、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかをコードする核酸分子（例えば、１つのＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクター）及び本明細書に記載のＣＡＲのいずれかを発現する単離されたＴ細胞、である。

本明細書では、キメラ抗原受容体をコードする核酸分子が記載され、ここで当該キメラ抗原受容体は：ＣＳ１ ｓｃＦｖ；スペーサー領域；ＣＤ２８若しくはＣＤ４膜貫通領域、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４－ＩＢＢ共刺激ドメイン、場合によっては、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙリンカー、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；を含む。

一実施形態では、ＣＳ１ ＣＡＲは、配列番号３１，３４，３７，４０，４３、及び４６のいずれかのアミノ酸配列（シグナル配列欠損成熟ＣＡＲ）からなるか若しくはそれを含むか、又はＣＳ１ ＣＡＲは、配列番号３０，３３，３６，３９，４２、及び４５個のいずれかのアミノ酸配列（ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列を有する未成熟ＣＡＲ）からなるか、若しくはそれを含む。ＣＡＲ又はポリペプチドは、シグナル配列、例えば、ヒトＧＭ－ＣＳＦ受容体αシグナル配列（ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＰＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ；配列番号26）を含む形態で発現されることができる。ＣＡＲは、例えばＴ２Ａスキップ配列及び切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＥＧＦＲｔ等、発現をモニタリングするために有用なさらなる配列で発現されることができる。したがって、ＣＡＲは、配列番号２９～４６のいずれかのアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなることができるか、又は、配列番号２９～４６のいずれかと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％が同一であるアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなることができる。ＣＡＲは、１，２，３，４又は５までのアミノ酸が変化（好ましくは、保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸変化）した配列番号２９～４６のいずれかのアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなることができる。

本明細書ではまた、ＣＳ１キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞の集団もまた開示される（例えば、ＣＡＲは、配列番号２９～４６のいずれかのアミノ酸配列、配列番号２９～４６のいずれかと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％が同一であるアミノ酸配列、又は１，２，３，４又は５までのアミノ酸が変化（好ましくは、保存的アミノ酸変化）した配列番号２９～４６のいずれかのアミノ酸配列、を含むか若しくはそれからなる）。

様々な実施形態では、：ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）、例えば、ＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔｃｍである。

「アミノ酸修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、タンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を意味する。「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ペプチド又はタンパク質配列中の特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することをいう。当該置換は、非保存的様式（すなわち、コドンを、ある特定の大きさ又は特性があるアミノ酸群に属するアミノ酸から他の群に属するアミノ酸に変化させる）又は保存的様式（すなわち、コドンを、ある特定の大きさ又は特性があるアミノ酸の群に属するアミノ酸から同じ群に属するアミノ酸に変化させる）で、得られたタンパク質中のアミノ酸を変化させることができる。当該保存的変化では、一般に、結果として生じるタンパク質の構造及び機能の変化がより少なくなる。
以下に、アミノ酸の様々な群分けを例示する：
１）非極性Ｒ基を有するアミノ酸：
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；
２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；
３）荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；
４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ ６．０で正に荷電）。
他の群はフェニル基をもつアミノ酸：
フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンであってよい。

ＣＳ１ ＳｃＦｖドメイン
ＣＳ１ ＳｃＦｖドメインは、ＣＳ１に結合するいかなるＳｃＦｖでありうる。ある場合、ＣＳ１ ＳｃＦｖドメインは、配列番号１と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％が同一である、又は同一である配列を含む。ある場合、ＣＳ１ ｓｃＦｖは、配列番号１と比較して１，２，３，４若しくは５個のアミノ酸が変化（好ましくは、保存的アミノ酸変化）する。ＳｃＦｖはヒト化ＳｃＦｖでありうる。

スペーサー領域
本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＳ１標的ドメイン（すなわち、ＣＳ１ ＳｃＦｖ又はその変異体）と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含むことができる。様々な異なるスペーサーを用いることができる。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも部分、例えば、ヒトＦｃ領域のヒンジ部分、若しくはＣＨ３ドメイン又はその変異体を含む。
以下の表１は、本明細書に記載されるＣＡＲにおいて用いることができる様々なスペーサーを提供する。

表１：スペーサーの例

いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域の全部又は一部、すなわち免疫グロブリンのＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に入る配列、例えばＩｇＧ４ Ｆｃヒンジ又はＣＤ８ヒンジを含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むか又はＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインをともに含む。免疫グロブリン由来の配列は、１つ以上のアミノ酸修飾、例えば１、２、３、４又は５個の置換、例えばオフターゲット結合を減少させる置換を含むことができる。

特定の実施形態では、スペーサーは、修飾されていないヒンジに存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換された１以上のアミノ酸残基を含む、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するヒンジ／リンカーである。１以上の置換されたアミノ酸残基は、位置２２０，２２６，２２８，２２９，２３０，２３３，２３４，２３５，２３４，２３７，２３８，２３９，２４３，２４７，２６７，２６８，２８０，２９０，２９２，２９７，２９８，２９９，３００，３０５，３０９，２１８，３２６，３３０，３３１，３３２，３３３，３３４，３３６，３３９における１以上のアミノ酸残基、又はそれらの組み合わせから選択されるが、それらに限定されない。

ある実施形態では、ヒンジ／リンカーの修飾ヒンジは、以下のアミノ酸残基置換：
Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３０Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｐ２４７Ｉ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｓ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｒ２９２Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ、又はそれらの組み合わせ;
の１以上を含むが、それらに限定されない、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来する。

ある実施形態では、修飾ヒンジは、配列番号１０若しくは１１のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３領域、又は配列番号１０若しくは１１に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％が同一であるアミノ酸配列に由来する。

特定の実施形態では、修飾ヒンジは、修飾されていないヒンジに存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換された１以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ４に由来する。１以上の置換されたアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９、又はそれらの組み合わせにおける１以上のアミノ酸残基から選択されるが、それらに限定されない。

ある実施形態では、修飾ヒンジは、以下のアミノ酸残基置換：
２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３０Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ａ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３６Ａ、２３７Ａ、２３８Ｓ、２３９Ｄ、２４３Ｌ、２４７Ｉ、２６７Ｅ、２６８Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９０Ｅ、２９０Ｎ、２９２Ｐ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９８Ａ、２９８Ｇ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２９９Ａ、３００Ｌ、３０５Ｉ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２６Ａ、３２６Ｗ、３２６Ｅ、３２８Ｆ、３３０Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、３３１Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ａ、３３３Ｓ、３３３Ｓ、３３４Ａ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、３９６Ｌ、又はそれらの組み合わせ；
のうちの１つ以上を含むが、それらに限定されないＩｇＧ４に由来する。ここで、修飾されていないヒンジにおけるアミノ酸は、示された位置で上記の同定されたアミノ酸で置換される。一例では、当該配列は、以下のアミノ酸変化Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＮ２９７Ｑを含む。

本明細書で論じる免疫グロブリン中のアミノ酸位置については、番号付け（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）は、ＥＵ指標又はＥＵ番号付けスキームによる。（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． １９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ、本明細書にその全体が参考として援用される）。ＥＵ指標、又はＫａｂａｔ若しくはＥＵ番号付けスキームにおけるＥＵ指標は、ＥＵ抗体の番号付け（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）をいう（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９６９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８－８５）。

ヒンジ／リンカー領域はまた、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４）又はＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）を有するＩｇＧ４ヒンジ領域を含むことができる。

ヒンジ／リンカー（ｌｉｎｇｅｒ）領域はまた、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）、続いてリンカー配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号２）、続いてＩｇＧ４ ＣＨ３配列：
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１２）を含むことができる。したがって、リンカー／スペーサー領域全体は、以下の配列：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１１）
を含むことができる。ある場合、スペーサーは、配列番号１１と比較して１，２，３，４又は５個の単一のアミノ酸が変化（好ましくは、保存的アミノ酸変化）する。ある場合、ＩｇＧ４ Ｆｃヒンジ／リンカー領域は、２つの位置（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）で変異し、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）による結合を低下させる。

膜貫通領域
本明細書中では、様々な膜貫通ドメインを用いることができる。表２は、適当な膜貫通ドメインの例を含む。スペーサー領域が存在する場合、膜貫通領域はスペーサー領域のカルボキシ末端に位置する。

表２：膜貫通ドメインの例

共刺激ドメイン
共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとして用いるのに適するいかなるドメインであってよい。ある場合、共シグナル伝達ドメインは、ＲＳＫＲＳＲＧＧＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２３；ＬＬからＧＧへのアミノ酸変化に二重下線）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％が同一である、又は同一である配列を含むＣＤ２８共刺激ドメインである。ある場合、ＣＤ２８共シグナル伝達（ｃｏ－ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）ドメインは、配列番号２３と比べて１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸が変化する（好ましくは保存的であり、かつ、好ましくは下線を引かれたＧＧ配列は変化しない）。ある場合、共シグナル伝達ドメインは、
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号２４）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％が同一である、又は同一である配列を含む４－１ＢＢ共シグナル伝達ドメインである。ある場合、４－１ＢＢ共シグナル伝達ドメインは、配列番号２４と比較して１，２，３，４若しくは５個のアミノ酸が変化（好ましくは、保存的アミノ酸変化）する。

共刺激ドメイン（複数可）は、膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間に位置する。表３は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの配列と共に適当な共刺激ドメインの例を含む。

表３：ＣＤ３ζドメイン及び共刺激ドメインの例

様々な実施形態では、：共刺激ドメインは、表３に示される共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸が修飾されたその変異体、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸が修飾されたその変異体、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸が修飾されたその変異体及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸が修飾されたその変異体、からなる群から選択される。特定の実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸が修飾されたその変異体が存在する。ある実施形態では、２つの共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸が修飾されたその変異体及び４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸が修飾された（例えば、置換）その変異体、が存在する。様々な実施形態では、１～５（例えば、１又は２）のアミノ酸の修飾は、置換である。共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに対するアミノ末端であり、かつ、ある場合、２～１０、例えば３つのアミノ酸（例えば、ＧＧＧ）からなる短いリンカーは、共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間に位置する。

ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとして用いるのに適するいかなるドメインでありうる。ある場合、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２１）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％が同一である、又は同一である配列を含む。ある場合、ＣＤ３ζシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）は、配列番号２１と比較して１，２，３，４若しくは５個のアミノ酸が変化（好ましくは、保存的アミノ酸変化）する。

切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＥＧＦＲ
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの後方には、リボソームスキップ配列（例えば、ＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ；配列番号２７）、及び以下の配列：
ＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬＳＩＮＡＴＮＩＫＨＦＫＮＣＴＳＩＳＧＤＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬＤＩＬＫＴＶＫＥＩＴＧＦＬＬＩＱＡＷＰＥＮＲＴＤＬＨＡＦＥＮＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶＶＳＬＮＩＴＳＬＧＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＱＫＴＫＩＩＳＮＲＧＥＮＳＣＫＡＴＧＱＶＣＨＡＬＣＳＰＥＧＣＷＧＰＥＰＲＤＣＶＳＣＲＮＶＳＲＧＲＥＣＶＤＫＣＮＬＬＥＧＥＰＲＥＦＶＥＮＳＥＣＩＱＣＨＰＥＣＬＰＱＡＭＮＩＴＣＴＧＲＧＰＤＮＣＩＱＣＡＨＹＩＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨＶＣＨＬＣＨＰＮＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩＰＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭ（配列番号２８）に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％が同一である、又は同一である配列を備える切断型ＥＧＦＲが続いてよい。ある場合、切断型ＥＧＦＲは、配列番号２８と比較して１，２，３，４若しくは５個のアミノ酸が変化（好ましくは、保存的アミノ酸変化）する。

ＣＳ１ ＣＡＲ
ＣＳ１ ＣＡＲは、図２、図６、図７、図８、図９若しくは図１０に示されたアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％が同一である、又は同一である配列を含むことができる（配列番号２９～４６；ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列の含有型又は欠損型のいずれかであり、かつ、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列及び切断型ＥＧＦＲｔの含有型又は欠損型のいずれかである）。

本明細書に記載のＣＡＲ標的化ＣＳ１のうち、スペーサー領域、膜貫通ドメイン及び各ＣＡＲの共刺激ドメイン（複数可）が示されているものを表４に示す。

表４：ＣＡＲを標的とするＣＳ１の例

＊ 配列番号 ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列、Ｔ２Ａ及びＥＧＦＲｔを含む配列全体／／ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列はあるが、Ｔ２Ａ及びＥＧＦＲｔがない配列／／ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列、Ｔ２Ａ及びＥＧＦＲｔが欠損する配列の配列。

ＣＳ１ ＣＡＲ発現レンチウイルスベクター（ＣＳ１ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ（ＣＯ）－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７）の概略図である。ＣＳ１ ＣＡＲ構築物は、ＧＭＣＳＦシグナル配列、ＣＳ１ ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４ヒンジ領域、リンカー、ＣＨ３ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲ構築物の後方に、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列、及びその後に自殺遺伝子ＥＧＦＲｔコード配列が続く。ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔ分子は、単一の転写産物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）から発現される。 図２は、シグナルペプチド、リボソームスキップ配列及びＥＧＦＲｔを含むＣＳ１ ＣＡＲのアミノ酸配列を示す（配列番号２９）。 図３は、ＣＳ１ ＣＡＲ逆指向型（ｒｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＴｃｍがＭＭ細胞に対して細胞傷害性を示したことを示す研究の結果を示す一対のグラフである。増殖した（ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ）ＣＳ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性を、^５１Ｃｒ標識標的細胞との共培養後、４時間の^５１Ｃｒ放出アッセイを用いて評価した。ＯＫＴ３発現ＬＣＬはすべてのＴＣＲに関与したので、それらを陽性対照として用いて、かつ、ＣＳ１陰性ＡＭＬ細胞（ＫＧ１ａ）は陰性対照として用いた。ＣＳ１ ＣＡＲ、ただし、未処理（ｕｎ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）モック（ｍｏｃｋ）Ｔ細胞は、ＭＭ細胞に対して特異的な細胞毒性を示した。 図４は、ＣＳ１ ＣＡＲ逆指向型Ｔｃｍ細胞がＭＭ細胞の刺激に応答してエフェクター機能を示したことを示す研究の結果を示す。ＣＳ１ ＣＡＲ Ｔ細胞（１０^５）を刺激剤として、ＭＭ．１Ｓ細胞の１０^５と共に９６穴組織培養プレート中で６時間共培養した。１０７ａ脱顆粒及び細胞内ＩＦＮガンマ産生を、フローサイトメトリーで分析した。Ｅｒｂｉｔｕｍによって同定されたＣＡＲ Ｔ細胞の大部分は、ＭＭ細胞との関与の後に脱顆粒するように誘導され、かつ、抗原刺激に応答してＩＦＮガンマ陽性細胞が検出された。 図５は、ＣＳ１ ＣＡＲ逆指向型Ｔｃｍ細胞が生体内で多発性骨髄腫を根絶することを示す研究の結果を示す。ＭＭ．１Ｓ細胞を発現する約２×１０^６個のホタルルシフェラーゼを、脛骨内注射でＮＳＧマウスに接種した。腫瘍接種の７日後、１×１０^６ ＣＳ－１ ＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内注射によって腫瘍があるマウスに注入した。腫瘍を、１週間に１回、Ｘｅｎｏｇｅｎ（登録商標）イメージングでモニターした。未処理細胞が接種されたマウスを対照として用いた。ＣＳ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔ細胞注入の１４日後にＭＭ腫瘍を完全に根絶したが、未処理Ｔ細胞は腫瘍阻害に効果がない。 図６は、ＣＳｌｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）－ＣＤ４ｔｍ－４１ＢＢ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を示す（配列番号３２）。 図７は、ＣＳ１ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）－ＣＤ４ｔｍ－４１ＢＢ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を示す（配列番号３５）。 図８は、ＣＳ１ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を示す（配列番号３８）。 図９は、ＣＳ１ｓｃＦｖ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＣＤ４ｔｍ－４１ＢＢ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を示す（配列番号４１）。 図１０は、ＣＳ１ｓｃＦｖ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔのアミノ酸配列を示す（配列番号４４）。 図１１は、ＣＳ１ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７の完全なヌクレオチド配列である（配列番号４７）。 図１２は、ＣＳ１ ＣＡＲ逆指向型Ｔｃｍ細胞が生体内で多発性骨髄腫を根絶することを示す研究の結果を示す。２×１０^６ ＧＦＰｆｆｌｕｃ＋ＭＭ．１Ｓ細胞を、－７日目にＮＳＧマウスに脛骨内注射で接種させた。１×１０^６のセントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）由来のＣＳ１ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を０日目に腫瘍があるマウスに静脈内注入した。同じドナーからＴ細胞又は非形質導入Ｔｃｍを投与されなかったマウスを、ネガティブコントロールとして用いた。腫瘍シグナルは、生体光イメージングによってモニターした。複数のマウスからのフォントン／秒の平均±ＳＥＭが示されている。ＣＡＲは、図２（ＣＨ２ ＣＤ２８）；図６（ＣＨ２ ４ＩＢＢ）；図８（ＥＱ ＣＤ２８）；図７（ＥＱ ４ＩＢＢ）；図１０（Ｌ ＣＤ２８）及び図９（Ｌ ＣＤ４ ＩＢＢ）；であった。

いくつかのＣＳ１特異的キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，「ＣＡＲ」）の構造、構築及び特徴付けについて以下に記載する。ＣＡＲは、細胞外認識ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含有する組換え生体分子である。したがって、用語「抗原」は、抗体に結合する分子に限定されず、いかなる受容体に特異的に結合することができるいかなる分子である。したがって、「抗原」は、ＣＡＲの認識ドメインをいう。細胞外認識ドメインは（単に細胞外ドメインともいうか、又は単にそれが含有する認識エレメントにより）、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識エレメントを含む。膜貫通領域は膜中のＣＡＲを固定する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のζ鎖由来のシグナル伝達ドメインを含み、かつ、場合によっては、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、ＭＨＣ制限とは無関係に抗原に結合し、かつ、Ｔ細胞活性化を形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）ことができる。従って、ＣＡＲは、それらのＨＬＡ遺伝子型にかかわらず、抗原陽性腫瘍がある患者集団を治療することができる「普遍的な（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」免疫受容体である。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を用いる養子免疫療法は、がんの治療のための強力な治療戦略でありうる。

場合によっては、ＣＳ１ ＣＡＲは、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後方に、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列及び細胞質シグナル伝達尾部が欠損した、切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）が続くベクターを用いて作製することができる。この配置により、ＥＧＦＲｔの同時発現により、遺伝子修飾細胞を正確に測定しうる、不活性で非免疫原性の表面マーカーがもたらされ、かつ、遺伝子修飾細胞のポジティブな選択、並びに、養子移植後の生体内での治療用Ｔ細胞を効率的に、細胞追跡できる。増殖を効率的に制御して、サイトカインストーム及び標的外の（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）毒性を回避することは、Ｔ細胞免疫療法の成功にとって重要なハードルである。ＣＳ１ＣＡＲレンチウイルスベクターに組み込まれたＥＧＦＲｔは、治療関連の毒性がある場合、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を切除するための自殺遺伝子として作用することができる。

本明細書に記載のＣＡＲは、当技術分野で公知のいかなる手段によっても製造することができるが、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて製造される。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当該分野で公知の標準的な分子クローニング技術（ゲノムライブラリースクリーニング、重複ＰＣＲ、プライマー補助連結、部位特異的変異誘発等）によって完全なコード配列に調製し、組み立てることができ、便利である。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、かつ、適当な発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、及び最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株、を形質転換するために用いられる。

患者から単離された様々なＴ細胞サブセットを、ＣＡＲ発現用のベクターで形質導入させることができる。セントラルメモリーＴ細胞は、１つの有用なＴ細胞サブセットである。セントラルメモリーＴ細胞は、所望の受容体を発現する細胞を免疫学的に選択するために、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を用いて、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択することにより末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣ）から単離することができる。セントラルメモリーＴ細胞が濃縮された細胞は、例えば、ＣＳ１ ＣＡＲの発現を指示するレンチウイルスベクター、ならびに生体内検出、アブレーション、及び潜在的な生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）選択用の非免疫原性表面マーカーで形質導入された抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化することができる。活性化／遺伝子修飾されたＣＳ１セントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５で生体外増殖され、及び次いで凍結保存することができる。

ＣＳ１特異的ＣＡＲの発現用ｅｐＨＩＶ７の構築及び構造
ｐＨＩＶ７プラスミドは、ＣＳ１ ＣＡＲを発現する臨床ベクターを誘導することができる親プラスミドである。ＣＡＲの発現に用いたｅｐＨＩＶ７ベクターは、ｐＨＩＶ７ベクターから産生された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｂｌｏｏｄ １１８：１２５５）。重要なことに、このベクターは、ヒトＥＦ１プロモーターを用いてＣＡＲの発現を駆動する。ベクターの５’及び３’配列はともに、以前にＨＸＢｃ２プロウイルスから得られたｐｖ６５３ＲＳＮに由来した。ポリプリントラクトＤＮＡフラップ配列（ｃＰＰＴ）は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙのＨＩＶ－１株ｐＮＬ４－３由来であった。

ｐＨＩＶ７の構築は以下のように行った。簡潔には、介在ＳＬ３－ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）とｇａｇ－ｐｏｌプラス５’及び３’末端の長い反復配列（ＬＴＲ）の６５３ｂｐを含むｐｖ６５３ＲＳＮを以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。工程１では、５’ＬＴＲからｒｅｖ－応答配列（ＲＲＥ）までの配列でｐ５’ＨＩＶ－１５１を作製し、ＴＡＴＡボックスより上流の配列を除去して５’ＬＴＲを修飾し、まずＣＭＶエンハンサーに、次にＳＶ４０複製起点に連結した（ｐ５’ＨＩＶ－２）。工程２では、３’ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングしてｐ３’ＨＩＶ－１とした後、３’ＬＴＲのエンハンサー／プロモーターから４００ｂｐを欠失し、ＨＩＶ Ｕ３のｃｉｓ調節エレメントを除去してｐ３’ＨＩＶ－２とした。工程３では、ｐ５’ＨＩＶ－３及びｐ３’ＨＩＶ－２から単離した断片を連結してｐＨＩＶ－３を作製した。工程４では、ｐ３’ＨＩＶ－２からさらに上流の余分なＨＩＶ配列を除去してｐ３’ＨＩＶ－３とし、ＷＰＲＥを含む６００ｂｐのＢａｍＨＩ－ＳａｌＩ断片をｐ３’ＨＩＶ－３に加えてｐ３’ＨＩＶ－４を作製した。工程５では、ｐＨＩＶ－３ ＲＲＥをＰＣＲで縮小し、ｐＨＩＶ－３の５’断片（図示せず）及びｐ３’ＨＩＶ－４に連結して、ｐＨＩＶ－６を作製した。工程６では、ＨＩＶ－１ ｐＮＬ４－３（５５）由来のｃＰＰＴ ＤＮＡフラップ配列を含有する１９０ｂｐのＢｇｌＩＩ－ＢａｍＨＩ断片をｐＮＬ４－３から増幅し、ｐＨＩＶ６中のＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列との間に配置してｐＨＩＶ－７を作製した。この親プラスミドｐＨＩＶ７－ＧＦＰ（ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）に、４－プラスミド系を用いて親ベクターをパッケージングした。

ウイルスゲノムをベクターに効率的にパッケージングするためには、パッケージングシグナルｐｓｉΨが必要である。ＲＲＥ及びＷＰＲＥは、ＲＮＡ転写物の輸送及び導入遺伝子の発現を高める。フラップ配列は、ＷＰＲＥと併用すると、哺乳動物細胞へのレンチウイルスベクターの形質導入効率を高めることが実証されている。

ウイルスベクターの産生に必要なヘルパー機能を３つのプラスミドに分割し、組換えによる複製能のあるレンチウイルスの生成確率を低下させる：
１）ｐＣｇｐはウイルスベクター構築に必要なｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードする。；
２）ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２は、ＲＲＥ配列に作用して、ウイルスゲノムの輸送に寄与し、効率的なパッケージングを行うＲｅｖタンパク質をコードする。；及び
３）ｐＣＭＶ－Ｇは、ウイルスベクターの感染性に必要な水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌｏ－ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＶＳＶ）の糖タンパク質をコードする。

ｐＨＩＶ７にコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間には最小限のＤＮＡ配列相同性が存在する。相同性のある領域としては、
ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列中に位置する約６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域；
３種全てのヘルパープラスミド中のＣＭＶプロモーター配列；及び
ヘルパープラスミドｐＣｇｐ中のＲＲＥ配列；
があげられる。多数の組換え事象が必要であるため、これらの領域の相同性により、複製能が備わった組換えウイルスが生成される可能性は非常に低い。さらに、得られたいかなる組換え体にも、レンチウイルス複製に必要な機能的ＬＴＲ及びｔａｔ配列が欠失しているであろう。

ＣＭＶプロモーターをＥＦ１α－ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦ１ｐ）に置換して、新しいプラスミドをｅｐＨＩＶ７と命名した。ＥＦ１ｐは５６３ｂｐあり、ＣＭＶプロモーターを切除した後、ＮｒｕＩ及びＮｈｅＩを用いてｅｐＨＩＶ７に導入した。

野生型ウイルスの病原性に必要であり、かつ、標的細胞の生産的感染に必要なｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖが欠失したレンチウイルスゲノムは、この系から除かれている。さらに、ｅｐＨＩＶ７ベクター構築物には完全３’ＬＴＲプロモーターがないため、結果として生じる標的細胞中の、発現され、かつ、逆転写されたＤＮＡプロウイルスゲノムのＬＴＲは不活性となる。この設計の結果、ＨＩＶ－Ｉ由来配列はプロウイルスから転写されず、治療用配列のみが各プロモーターから発現することになる。ＳＩＮベクターからＬＴＲプロモーター活性が除去されることで、宿主遺伝子の意図しない活性がおこる可能性を有意に減少させることが期待される。表５は、ｅｐＨＩＶ７に存在する様々な調節エレメントをまとめたものである。

図１は、ＣＳ１ ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４ヒンジ領域、リンカー、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、からなるＣＡＲ構築物を含むレンチウイルスベクターＣＳ１ ＣＡＲ（ＣＳ１ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ（ＣＯ）－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７）ＣＳ１ ｓｃＦｖの模式図である。ＣＡＲ構築物には、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列、及び次いで自殺遺伝子ＥＧＦＲｔコード配列が続く。ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔ分子は、単一の転写産物から発現される。ベクターの全ヌクレオチド配列を図１１に示し、かつ、ベクターの様々なエレメントの位置を表５に示す。

表５：ＣＳ１ ＣＡＲ＿ｅｐＨＩＶ７の機能的エレメント

患者Ｔ細胞の形質導入用ベクターの作製
各プラスミド（ＣＳ１ ＣＡＲ＿ｅｐＨＩＶ７；ｐＣｇｐ；ｐＣＭＶ－Ｇ；及びｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２）について、シードバンクを生成し、これを用いて発酵槽に接種し、十分な量のプラスミドＤＮＡを産生させる。プラスミドＤＮＡを、レンチウイルスベクターの産生に用いる前に、その同一性、無菌性及びエンドトキシンを試験する。

簡潔には無菌性及びウイルス汚染がないことを確認するために試験された２９３Ｔ作業細胞（ＷＣＢ）から細胞を増殖する。２９３Ｔ ＷＣＢ由来の２９３Ｔ細胞のバイアルを解凍する。ベクター産生及び細胞株の維持のため、適当な数の１０層セルファクトリー（ＣＦ）を播種するのに十分な数の細胞になるまで、細胞を増殖させ継代（ｅｘｐａｎｄｅｄ）する。単一の細胞株を生産に用いることができる。

レンチウイルスベクターを、最大１０ＣＦまでのサブバッチで産生した。同じ週に２つのサブバッチを産生することができるため、約２０Ｌのレンチウイルス上清／週になる。すべてのサブバッチから製造された材料を下流の処理段階でプールして、１ロットの製品を製造した。２９３Ｔ細胞を２９３Ｔ培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）中でＣＦ中に播種した。ＣＦのすべての層上に細胞が均一に分布するように、ファクトリーを３７℃のインキュベーターに水平においた。２日後、Ｔｒｉｓ：ＥＤＴＡ、２Ｍ ＣａＣｌ_２、２Ｘ ＨＢＳ及び４つのＤＮＡプラスミドの混合物を含むＣａＰＯ_４法を用いて、上記の４つのレンチウイルスプラスミドを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後３日目に、分泌されたレンチウイルスベクターを含む上清を回収し、精製し、濃縮した。ＣＦから上清を除去した後、各ＣＦから最終生産細胞（Ｅｎｄ－ｏｆ－Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ）を回収した。各ファクトリー由来の細胞をトリプシン処理し、遠心分離で回収した。これらの細胞を凍結培地に再懸濁して凍結保存した。これらの細胞を、その後、複製能レンチウイルス（ＲＣＬ）試験に用いた。

ベクターを精製及び製剤化する（ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）ため、粗上清を膜濾過により清澄化し、細胞残屑を除去した。宿主細胞ＤＮＡ及び残留プラスミドＤＮＡを、エンドヌクレアーゼ消化（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））により分解した。ウイルス上清の細胞残屑を０．４５μｍのフィルターで清澄化した。清澄化後の上清を予め秤量した容器に採取し、そこにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を加えた（最終濃度５０Ｕ／ｍＬ）。残留プラスミドＤＮＡ及び宿主ゲノムＤＮＡに対するエンドヌクレアーゼ消化を、３７℃で６時間行った。エンドヌクレアーゼ処理後の上清の初期接線流限外濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ＴＦＦ）濃度を用いて、粗上清から残留低分子量成分を除去し、ウイルスを約２０倍濃縮した。清澄化後のエンドヌクレアーゼ処理ウイルス上清を、５００ｋＤのＮＭＷＣＯの中空繊維カートリッジに、剪断速度を約４，０００秒^－１以下に維持しつつ、流速が最大になるように設計された流速で循環させた。カートリッジの性能を維持するため、ヌクレアーゼ処理後上清の透析ろ過を濃縮プロセス中に開始した。透析ろ過緩衝液として４％ラクトース含有ＰＢＳを用いて、８０％透過物置換率を確立した。ウイルス上清を粗上清の２０倍濃縮に相当する目標容量まで持っていき、さらに透析液交換率を１００％として、透析ろ過をさらに４回の交換容量まで続けた。

高速遠心分離技術を用いてウイルス産物をさらに濃縮した。レンチウイルスの各サブバッチを、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ－２６プラス６０００ＲＰＭ（６，０８８ ＲＣＦ）で、６℃、１６～２０時間遠心分離してペレット化した。次いで、各サブバッチのウイルスペレットを４％ラクトース含有ＰＢＳ中の５０ｍＬ容量で再構成した。この緩衝液中の再構成されたペレットは、ウイルス調製用の最終製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を表す。ベクター濃縮プロセス全体で体積減少は約２００倍となった。全てのサブバッチの完了後に材料を－８０℃にして、各サブバッチの試料の無菌性を試験した。試料の無菌性が確認された後、サブバッチを頻繁に攪拌しながら３７℃で急速に解凍した。その後、ウイルスベクタースイート（ｓｕｉｔｅ）クラスＩＩ型Ａ／Ｂ３バイオセーフティキャビネット内で、当該物質をプールして手動で分注した。滅菌ＵＳＰクラス６、外ネジ式Ｏリングクリオバイアル中に濃縮レンチウイルスを１ｍＬ充填した。ＣＯＨ応用技術開発センター（ＣＡＴＤ）の品質システム（ＱＳ）は、すべての材料を、現行の適正製造基準（cGMP）に準拠するＣＢＧ方針と標準作業手順書に従い、放出した。

レンチウイルスベクター調製物の純度を保証するために、残留する宿主ＤＮＡの汚染及び残留する宿主及びプラスミドＤＮＡの移行を試験する。他の試験により、正確なベクターが存在することを確実にするために、ＲＴ－ＰＣＲでベクター同一性を評価する。本研究で用いることを意図するベクターはすべて放出基準を満たしている。

ＡＣＴで用いるのに適するＴｃｍ細胞の調製
Ｔリンパ球を、白血球交換法によって患者から獲得し、適当な同種異系又は自己Ｔ細胞サブセット、例えばセントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）を、ＣＡＲを発現するように遺伝的に修飾し、いかなる臨床上許容される手段により投与して患者に戻すことで、抗がん治療を達成することができる。

ＣＤ８＋であるＴｃｍを、本質的にＷａｎｇ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３５：６８９，２０１２に記載のように単離する。簡潔には、白血球交換当日、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅによる密度勾配遠心分離で単離し、続いてＰＢＳ／ＥＤＴＡで２回洗浄した。ＰＢＭＣをＰＢＳ中で１回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）含有Ｘ Ｖｉｖｏ１５培地に再懸濁し、３００ｃｃのトランスファーバッグに移し、室温（ＲＴ）で一晩３－Ｄローテーター上に保存した。翌日、臨床グレードの抗ＣＤ４（２．５ｍＬ）、抗ＣＤ１４（１．２５ｍＬ）、及び抗ＣＤ４５ＲＡ（２．５ｍＬ）マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を含む３００ｃｃトランスファーバッグ中で、５×１０^９ ＰＢＭＣをインキュベートした１０％ＦＣＳ含有Ｘ Ｖｉｖｏ１５を、３０分間室温でインキュベートした。ＣＤ４＋、ＣＤ１４＋及びＣＤ４５ＲＡ＋細胞は、製造業者の指示（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に従ってＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）枯渇様式を用いて直ちに枯渇させた。遠心分離後、０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）含有ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に細胞の非標識陰性画分を再懸濁し、かつ、臨床等級ビオチン化ＤＲＥＧ５６ ｍＡｂ（ＣＯＨＮＭＣ ＣＢＧ）で０．１ｍｇ／１０^６細胞を室温で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、１００ｍＬの０．５％ＨＳＡ含有ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡの最終容量に再懸濁し、新しい３００ｃｃのトランスファーバッグに移した。１．２５ｍＬの抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）との３０分間のインキュベーション後、ＰＢＭＣ（ＣＤ８＋ ＴＣＭ）のＣＤ６２Ｌ＋画分をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）でのポジティブ選択により製造業者の説明書に従って精製し、かつ、１０％ＦＣＳを含むＸ Ｖｉｖｏ１５に再懸濁した。

ＣＤ８＋／ＣＤ４＋であるＴｃｍは、ＣＤ４＋、ＣＤ１４＋及びＣＤ４５ＲＡ＋選択をＣＤ１４＋及びＣＤ４５ＲＡ＋選択に修正することにより、上記プロセスの修正版を用いて調製される。この方法は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）装置上の２段階プロセスを使用して、まずＣＤ１４＋及びＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させ、次いでＣＤ６２Ｌ＋細胞を陽性選択する。この改良されたプラットフォームにより、１回の白血球交換から５０×１０^６バルクＴｃｍが生成される。

濃縮後、Ｔｃｍ細胞を、完全なＸ－Ｖｉｖｏ１５+５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５中に配合し、かつ、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）細胞培養バッグに移し、Ｄｙｎａｌ ＣｌｉｎＥｘ（登録商標）Ｖｉｖｏ ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激した。刺激後５日目まで、細胞を約３の多重感染度（ＭＯＩ）でＣＳ１ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。細胞増殖に必要な完全なＸ－Ｖｉｖｏ１５及びＩＬ－２及びＩＬ－１５サイトカインを添加して、培養物を最大４２日間維持する（細胞密度を３×１０^５～２×１０^６生存細胞／ｍＬに維持し、サイトカインは、培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日に補充する）。細胞は、通常、２１日以内にこれらの条件下で約１０^９細胞に増殖する。培養期間終期に、細胞を採取し、２回洗浄し、かつ、臨床等級の凍結保存培地で処方する。

Ｔ細胞注入の日（複数可）に、凍結保存され放出された生成物を解凍し、洗浄し、再注入のために製剤化する。放出された細胞産物を含む凍結保存バイアルを液体窒素貯蔵から取り出し、解凍し、冷却し、かつ、ＰＢＳ／２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）洗浄緩衝液で洗浄する。遠心分離後、上清を除去し、かつ、細胞を保存料非含有遊離生理食塩水（ＰＦＮＳ）／２％ＨＳＡ輸液希釈液に再懸濁する。試料を品質管理試験用に取り出される。

ＣＳ１ ＣＡＲ（ＣＳ１ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ）のアミノ酸配列
ＣＳ１ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔの完全アミノ酸配列を図２に示す。完全配列（配列番号２９）には、以下の：２２個のアミノ酸のＧＭＣＳＦシグナルペプチド（配列番号２６）、ＣＳ１ ｓｃＦｖ配列（配列番号１）；ＩｇＧ４ヒンジ配列（配列番号３；アミノ酸の置換Ｓ～Ｐを斜線で示す）；１０個のアミノ酸のリンカー（配列番号２）；ＩｇＧ４ ＣＨ３配列（配列番号１２）；２８個のアミノ酸のＣＤ２８膜貫通ドメイン配列（配列番号１４）；ＣＤ２８ｇｇ共刺激ドメイン配列（配列番号２３；ＬＬからＧＧへのアミノ酸の変化を強調表示する）；３個のアミノ酸のＧｌｙリンカー；１１２個のアミノ酸のＣＤ３ζ配列（配列番号２１）；２４個のアミノ酸のＴ２Ａスキップ配列（配列番号２７）；及びＥＧＦＲｔ配列（配列番号２８）；が含まれる。

ＣＳ１ ＣＡＲの活性
図２に示すＣＡＲを発現する増殖したＣＳ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性を、^５１Ｃｒ標識ＭＭ細胞（ＭＭ．１Ｓ）との共培養から４時間経過後に^５１Ｃｒ放出アッセイを用いて評価した。図３に示すように、組換えＣＳ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＭＭ細胞に対して特異的かつ効率的な殺傷活性を示す一方で、非形質導入のモック（ｍｏｃｋ）Ｔ細胞は、ＭＭ細胞に対して細胞毒性を示さない。ＭＭ細胞と共培養した場合、図４に示すように、１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮガンマによって、組換えＣＳ１ ＣＡＲ Ｔｃｍ介在性の強力エフェクター機能を示した。ＭＭ腫瘍があるＮＳＧマウスに養子移入すると、ＣＳ１特異的Ｔ細胞は、図５に示すように効率的な抗腫瘍活性を呈した。

さらなるＣＳ１ ＣＡＲを用いた別の研究（図２及び図６～１０）では、２×１０^６個のＧＦＰｆｆｌｕｃ＋ＭＭ．１Ｓ細胞を、－７日目にＮＳＧマウスに脛骨内注射で接種させた。１×１０^６のセントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）由来のＣＳ１ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を０日目に腫瘍があるマウスに静脈内注入した。Ｔ細胞を投与しなかったマウス、又は同じドナーから導入したＴｃｍを投与しなかったマウスを陰性対照として用いた。腫瘍シグナルは、生体光イメージングによってモニターした。複数のマウスからのフォントン／秒の平均±ＳＥＭを示す。この分析の結果を図１２に示す。

Claims (21)

1. 配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３８、３９、及び４０のいずれかの１つのアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体。
2. 配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
3. 配列番号３９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
4. 配列番号３８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
5. 配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
6. 配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
7. 配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
8. 配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
9. 配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
10. 配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
11. キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の集団であって、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３８、３９、及び４０のいずれかの１つのアミノ酸配列を含む、Ｔ細胞の集団。
12. Ｔ細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又は８０％がセントラルメモリーＴ細胞である、請求項１１に記載のＴ細胞の集団。
13. セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１０％は、ＣＤ４＋である、請求項１２に記載のＴ細胞の集団。
14. セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１０％は、ＣＤ８＋である、請求項１２に記載のＴ細胞の集団。
15. セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも２０％は、ＣＤ４＋である、請求項１２に記載のＴ細胞の集団。
16. セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも２０％は、ＣＤ８＋である、請求項１２に記載のＴ細胞の集団。
17. セントラルメモリーＴ細胞の少なくとも１０％はＣＤ４＋であり、少なくとも１０％はＣＤ８＋である、請求項１２に記載のＴ細胞の集団。
18. がんを治療するための、請求項１１～１７のいずれか１項に記載のＴ細胞の集団を含む、医薬組成物。
19. Ｔ細胞がヒトＴ細胞であり、前記ヒトＴ細胞の集団が自己由来である、請求項１８に記載の医薬組成物。
20. Ｔ細胞がヒトＴ細胞であり、前記ヒトＴ細胞の集団が同種異系である、請求項１８に記載の医薬組成物。
21. がんが多発性骨髄腫である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

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