JP2018537970A - 養子t細胞療法のための細胞を調製する方法 - Google Patents
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Abstract
キメラ抗原受容体を発現するT細胞集団を調製する改善された方法が記載されている。
Description
本発明は、組換えT細胞受容体を発現するT細胞集団を作製する方法に関し、特に、組換えT細胞受容体をコードするベクターを有するT細胞の集団を提供するステップ、T細胞の集団を増殖させる条件下及び時間の間、増殖培地内でT細胞の集団を培養するステップを含み、増殖培地はAkt活性の阻害剤を含む、方法に関する。
操作されたT細胞を利用する療法を含む、腫瘍特異的T細胞に基づく免疫療法が、抗腫瘍治療について調査されてきた。場合によっては、そのような療法において使用されるT細胞は、十分長い間in vivoで活性のままではない。従って、より長い期間、より強力な抗腫瘍機能を有する腫瘍特異的癌治療が当技術分野において必要とされる。
キメラ抗原受容体(CAR)が操作されたT細胞を利用する養子T細胞療法(ACT)は、抗原的に異なる腫瘍集団を特異的に認識するようにCAR T細胞を操作することができるため、種々の癌を治療する安全且つ効果的な方法を提供し得る(非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3;非特許文献4;非特許文献5)。
Cartellieri et al.2010 J Biomed Biotechnol 2010:956304
Ahmed et al.2010 Clin Cancer Res 16:474
Sampson et al.2014 Clin Cancer Res 20:972
Brown et al.2013 Clin Cancer Res 2012 18:2199
Chow et al.2013 Mol Ther 21:629
Journal of Immunotherapy 2012 35:689
Kabat et al.1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,United States Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda
Edelman et al.1969 Proc Natl Acad Sci USA 63:78−85
従って、より長い期間、より強力な抗腫瘍機能を有する腫瘍特異的癌治療が当技術分野において必要とされる。
本明細書において記載されているのは、種々のタイプのT細胞療法において使用するための改善されたT細胞集団を提供する方法である。当該方法は、例えばAkt阻害剤VIII(CAS No.612847−09−3)等のAkt阻害剤の存在下で、例えばCAR発現T細胞等のT細胞を培養すること及び/又は増殖させることを必要とする。Akt阻害剤の存在下で培養する及び/又は増殖させることができるT細胞のタイプは:CAR T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(“TIL”)、TCRが操作されたT細胞、又はT細胞クローンを含む。T細胞集団は:PBMC、単離されたセントラルメモリーT細胞、単離されたナイーブT細胞、単離されたステムメモリー(stem memory)T細胞及びその組み合わせを含み得る。
以下に記載される研究は、CAR T細胞のex vivoでの増殖の間のAkt阻害剤の存在が、養子移入に続くCAR T細胞の抗腫瘍活性を有意に改善することができるということを実証している。
Akt阻害剤は:Akt阻害剤VIII(1,3−ジヒドロ−1−[1−[[4−(6−フェニル−1H−イミダゾ[4,5−g]キノキサリン−7−イル)フェニル]メチル]−4−ピペリジニル]−2H−ベンズイミダゾール−2−オン)、Akt阻害剤X(2−クロロ−N,N−ジエチル−10H−フェノキサジン−10−ブタナミン,モノヒドロクロリド)、MK−2206(8−(4−(1−アミノシクロブチル)フェニル)−9−フェニル−[1,2,4]トリアゾロ[3,4−f][1,6]ナフチリジン−3(2H)−オン)、アプロセルチブ(uprosertib)(N−((S)−1−アミノ−3−(3,4−ジフルオロフェニル)プロパン−2−イル)−5−クロロ−4−(4−クロロ−1−メチル−1H−ピラゾール−5−イル)フラン−2−カルボキサミド)、イパタセルチブ((S)−2−(4−クロロフェニル)−1−(4−((5R,7R)−7−ヒドロキシ−5−メチル−6,7−ジヒドロ−5H−シクロペンタ[d]ピリミジン−4−イル)ピペラジン−1−イル)−3−(イソプロピルアミノ)プロパン−1−オン)、AZD5363(4−ピペリジンカルボキサミド,4−アミノ−N−[(1S)−1−(4−クロロフェニル)−3−ヒドロキシプロピル]−1−(7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−イル))、ペリフォシン、GSK690693、GDC−0068、トリシルビン、CCT128930、A−674563、PF−04691502、AT7867、ミルテフォシン、PHT−427、ホノキオール、トリシリビンホスファート、及びKP372−1A(10H−インデノ[2,1−e]テトラゾロ[1,5−b][1,2,4]トリアジン−10−オン)、Akt阻害剤IX(CAS98510−80−6)を含む群から選択されるAkt阻害剤を含む。
さらなるAkt阻害剤は:例えばイソキノリン−5−スルホンアミド(例えばH−8、H−89、NL−71−101)、アゼパン誘導体(例えば(−)−バラノール誘導体)、アミノフラザン(例えばGSK690693)、複素環(例えば7−アザインドール、6−フェニルプリン誘導体、ピロロ[2,3−d]ピリミジン誘導体、CCT128930,3−アミノピロリジン、アニリノトリアゾール誘導体、スピロインドリン誘導体、AZD5363、A−674563、A−443654)、フェニルピラゾール誘導体(例えばAT7867、AT13148)、チオフェンカルボキサミド誘導体(例えばアフレセルチブ(GSK2110183)、2−ピリミジル−5−アミドチオフェン誘導体(DC120)、アプロセルチブ(GSK2141795))等のATP競合的阻害剤;例えば2,3−ジフェニルキノキサリン類似体(例えば2,3−ジフェニルキノキサリン誘導体、トリアゾロ[3,4−f][1,6]ナフチリジン−3(2H)−オン誘導体(MK−2206))、アルキルリン脂質(例えばエデルフォシン(1−O−オクタデシル−2−O−メチル−rac−グリセロ−3−ホスホコリン、ET−18−OCH3)、イルモフォシン(BM41.440)、ミルテフォシン(ヘキサデシルホスホコリン、HePC)、ペリフォシン(D−21266)、エルシルホスホコリン(ErPC)、エルフォシン(ErPC3、エルシルホスホホモコリン)、インドール−3−カルビノール類似体(例えばインドール−3−カルビノール、3−クロロアセチルインドール、ジインドリルメタン、ジエチル6−メトキシ−5,7−ジヒドロインドロ[2,3−b]カルバゾール−2,10−ジカルボン酸(SR13668)、OSU−A9)、スルホンアミド誘導体(例えばPH−316、PHT−427)、チオ尿素誘導体(例えばPIT−1、PIT−2、DM−PIT−1、N−[(1−メチル−1H−ピラゾール−4−イル)カルボニル]−N´−(3−ブロモフェニル)−チオ尿素)、プリン誘導体(例えばトリシリビン(TCN、NSC 154020)、トリシリビンモノホスファート活性類似体(TCN−P)、4−アミノ−ピリド[2,3−d]ピリミジン誘導体、API−1、3−フェニル−3H−イミダゾ[4,5−b]ピリジン誘導体、ARQ092)、BAY 1125976、3−メチル−キサンチン、キノリン−4−カルボキサミド、2−[4−(シクロヘキサ−1,3−ジエン−1−イル)−1H−ピラゾール−3−イル]フェノール、3−オキソ−チルカル酸、3α−及び3β−アセトキシ−チルカル酸、アセトキシ−チルカル酸等のアロステリック阻害剤;及び、例えば天然物、抗生物質、ラクトキノマイシン、フレノリシン B、カラフンギン、メデルマイシン、Boc−Phe−ビニルケトン、4−ヒドロキシノネナール(4−HNE)、1,6−ナフチリジノン誘導体、及びイミダゾ−1,2−ピリジン誘導体、及び
等の不可逆的阻害剤;を含む。
PI3K−Akt−mTOR経路は、CD8+T細胞の代謝及び分化の調節において重要な役割を果たす。PI3K−Akt経路は、T細胞受容体のシグナル伝達、共刺激分子及びサイトカイン受容体に応答して活性化される。これは、ラパマイシンの哺乳動物標的(mTOR)複合体−1の活性化、及びフォークヘッドボックスタンパク質O1(Foxo1)の細胞質の隔離をもたらす。常時活性型のAktであるキナーゼは、最終分化を誘導するようである。3つの関連する形態のヒトAkt:Akt1(ヒトRAC−アルファセリン/スレオニン−タンパク質キナーゼ;GenBank(登録商標)参照:NP_001014431)、Akt2(ヒトRAC−ベータセリン/スレオニン−タンパク質キナーゼアイソフォーム2;GenBank(登録商標)参照:NP_001229956)及びAkt3(RAC−ガンマセリン/スレオニン−タンパク質キナーゼアイソフォーム2;GenBank(登録商標)参照:NP_001193658)がある。3つの形態は、プロテインキナーゼBアイソフォームPKBα、β、γとしても知られている。有用なAkt阻害剤は、3つの形態のうち少なくとも1つを、好ましくは1000nM未満のIC50で阻害する。場合によっては、阻害剤は、例えばAkt1及びAkt2等、2つ以上の形態をそれぞれ1000nM未満のIC50で阻害する。
本明細書において記載するように処理することができるT細胞集団は、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARをコードする発現ベクター(例えばウイルス発現ベクター)を有する。細胞外ドメインは、例えばCD19又はHER2などの標的と結合するリガンド、及び任意的に、例えばヒトFcドメインの一部を含むスペーサーで構成されている。膜貫通部分は、CD4膜貫通ドメイン、CD8膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD3膜貫通ドメイン又は4IBB膜貫通ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3複合体のゼータ鎖(CD3ζ)由来のシグナル伝達ドメイン及び1つ又は複数の共刺激ドメイン、例えば4−1BB共刺激ドメインを含む。細胞外ドメインは、CARが、T細胞の表面に発現される場合に、標的を発現する細胞にT細胞活性を向けることを可能にする。細胞内領域にCD3ζと直列に4−1BB(CD137)共刺激ドメイン等の共刺激ドメインを含めることは、T細胞が共刺激シグナルを受け取ることを可能にする。例えば患者特異的自己T細胞等のT細胞は、本明細書において記載されるCARを発現するように操作することができ、操作された細胞を増殖させ且つACTにおいて使用することができる。様々なT細胞サブセットを使用することができる。加えて、CARは、NK細胞等の他の免疫細胞において発現させることができる。患者が本明細書において記載されるCARを発現するT細胞集団で治療される場合、その細胞は自己T細胞又は同種異系T細胞であり得る。場合によっては、使用される細胞は、CD45RO+CD62L+であるCD4+及びCD8+セントラルメモリーT細胞(TCM)であり、そのような細胞の使用は、他のタイプの患者特異的T細胞の使用と比較して、養子移植後の細胞の長期間持続を改善することができる。
共刺激ドメインは、例えば:CD28共刺激ドメイン又は1〜10(例えば1又は2)のアミノ酸修飾を有するその変異体、4−IBB共刺激ドメイン又は1〜10(例えば1又は2)のアミノ酸修飾を有するその変異体、及びOX40共刺激ドメイン又は1〜10(例えば1又は2)のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択することができる。特定の実施形態では、4IBB共刺激ドメイン又は1〜10(例えば、1又は2)のアミノ酸修飾を有するその変異体が存在する。
CARは:CD28共刺激ドメイン又は1〜10(例えば、1又は2)のアミノ酸修飾を有するその変異体、4IBB共刺激ドメイン又は1〜10(例えば、1又は2)のアミノ酸修飾を有するその変異体、及びOX40共刺激ドメイン又は1〜10(例えば、1又は2)のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される2つの異なる共刺激ドメイン;CD28共刺激ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体、4IBB共刺激ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体、及びOX40共刺激ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される2つの異なる共刺激ドメイン;ヒトIL−13又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体;CD4膜貫通ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体、CD8膜貫通ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体、CD28膜貫通ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体、及びCD3ζ膜貫通ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン;共刺激ドメイン;及びCD3ζシグナル伝達ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体;IL−13又はその変異体と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域(例えば、スペーサー領域は、配列番号4、14〜20、50及び52を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む);を含むことができ、スペーサーはIgGヒンジ領域を含み;スペーサー領域は10〜150のアミノ酸を含み;4−1BBシグナル伝達ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含み;CD3ζシグナル伝達ドメインは配列番号7のアミノ酸配列を含み;及び、3から15のアミノ酸のリンカーが、共刺激ドメインとCD3ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する。2つの共刺激ドメインがある特定の実施形態では、一方は4−IBB共刺激ドメインであり、他方はCD28及びCD28ggから選択される共刺激ドメインである。
CAR又はいくつか他のT細胞受容体を発現し、改善された抗腫瘍活性を有するT細胞の集団を調製する方法が記載される。当該方法は、例えば、T細胞受容体発現T細胞集団の培養及び増殖の間に、細胞をAkt阻害剤と接触させることを必要とする。
キメラ抗原(CAR)は、最低でも細胞外認識ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含有する組換え生体分子である。従って、「抗原」という用語は、抗体に結合する分子に限定されず、標的に特異的に結合することができるいかなる分子に限定される。例えば、CARは、細胞表面受容体に特異的に結合するリガンドを含み得る。細胞外認識ドメイン(細胞外ドメイン又は単に細胞外認識ドメインが含有する認識要素とも呼ばれる)は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は、膜内にCARを固定する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3複合体のゼータ鎖由来のシグナル伝達ドメインを含み、任意的に、1つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。CARは、MHCの制限とは無関係に、抗原に結合することも、T細胞活性化を伝達することもできる。従って、CARは、そのHLA遺伝子型に無関係に、抗原陽性腫瘍を有する患者の集団を治療することができる「普遍的な」免疫受容体である。腫瘍特異的CARを発現するTリンパ球を使用した養子免疫療法は、癌の治療のための強力な治療戦略となり得る。
CARをコードする配列は、当技術分野において既知のいかなる手段によっても作製することができるが、好ましくは、組換えDNA技術を使用して作製される。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、簡便な当技術分野において既知の標準的な分子クローニングの技術(ゲノムライブラリースクリーニング、PCR、プライマー支援によるライゲーション、部位特異的変異誘発等)によって完全なコード配列に調製及び構築することができる。結果として生じるコード領域は、好ましくは、発現ベクター内に挿入され、適した発現宿主細胞株、好ましくはTリンパ球細胞株、最も好ましくは自己Tリンパ球細胞株を形質転換するために使用される。
選択されていないPBMC又は濃縮されたCD3のT細胞、又は濃縮されたCD3若しくはメモリーT細胞のサブセットを含む、患者から単離された種々のT細胞サブセットは、CAR発現、又は、いくつか他のT細胞受容体の発現のためのベクターを用いて形質導入し、さらに、本明細書において記載される方法によって培養することができる。セントラルメモリーT細胞は、1つの有用なT細胞のサブセットである。セントラルメモリーT細胞は、例えば、所望の受容体を発現する細胞を免疫磁気的に選択するCliniMACS(登録商標)装置を使用して、CD45RO+/CD62L+細胞を選択することによって末梢血単核球(PBMC)から単離することができる。セントラルメモリーT細胞が豊富な細胞は、抗CD3/CD28を用いて活性化させ、例えばSINレンチウイルスベクターを用いて形質導入することができ、in vivoでの検出に対してもあり得るex vivoでの選択に対しても非免疫原性の表面マーカーであるトランケート型ヒトCD19(CD19t)並びにCAR(例えばCD19又はHER2特異的CAR)の発現を導く。活性化/遺伝子改変されたセントラルメモリーT細胞は、IL−2/IL−15でin vitroで増殖させることができ、次に、凍結保存することができる。
CD19CARの構築及び構造
有用なCD19特異的CARの構造が以下に記載される。構築物であるCD19R(EQ)CD28T2AEGFRtepHIV7が、特許文献1において詳細に記載されている。CAR配列は、CD19を標的とする配列、Fc受容体媒介認識モデルを大いに減少させる2つの突然変異(L235E;N297Q)を含有するIgG4 Fcスペーサー、CD28膜貫通ドメイン、共刺激CD28細胞質シグナル伝達ドメイン、及びCD3ζ細胞質シグナル伝達を含む。T2Aリボソームスキップ配列が、このCD19(EQ)28ζCAR配列を、不活性で非免疫原性の細胞表面検出/選択マーカーであるEGFRtから分離する。このT2A連鎖は、単一の転写物からのCD19(EQ)28ζ及びEGFRt両方の同調的な発現をもたらす。
有用なCD19特異的CARの構造が以下に記載される。構築物であるCD19R(EQ)CD28T2AEGFRtepHIV7が、特許文献1において詳細に記載されている。CAR配列は、CD19を標的とする配列、Fc受容体媒介認識モデルを大いに減少させる2つの突然変異(L235E;N297Q)を含有するIgG4 Fcスペーサー、CD28膜貫通ドメイン、共刺激CD28細胞質シグナル伝達ドメイン、及びCD3ζ細胞質シグナル伝達を含む。T2Aリボソームスキップ配列が、このCD19(EQ)28ζCAR配列を、不活性で非免疫原性の細胞表面検出/選択マーカーであるEGFRtから分離する。このT2A連鎖は、単一の転写物からのCD19(EQ)28ζ及びEGFRt両方の同調的な発現をもたらす。
CD19(EQ)28Z配列を、ヒトGM−CSF受容体アルファリーダーペプチドの、CD19特異的scFv、L235E/N297Q修飾IgG4Fcヒンジ(二重変異がFcR認識を妨害する場所)、CD28膜貫通ドメイン、CD28細胞質シグナル伝達ドメイン及びCD3ζ細胞質シグナル伝達ドメイン配列との融合によって生成した。この配列を、コドン最適化の後に新規に合成した。T2A配列を、T2A含有プラスミドの消化から得た。EGFRt配列を、CD19含有プラスミドの膜貫通成分(すなわち、塩基対1〜972)までのリーダーペプチド配列に及ぶものから得た。全ての3つの断片、1)CD19(EQ)28Z、2)T2A、及び3)EGFRtを、epHIV7レンチウイルスベクターのマルチクローニングサイトにクローニングした。
CD19特異的CARの発現に使用されるepHIV7の構築及び構造
CARの発現に使用されるベクターであるepHIV7を、pHIV7ベクターから作製した。重要なことに、このベクターは、ヒトEF1プロモーターを使用してCARの発現を駆動する。ベクターの5´配列も3´配列も、HXBc2プロウイルスから以前に得たpv653RSNから得た。ポリプリン区域DNAフラップ配列(cPPT)を、NIH AIDS Reagent Repository由来のHIV−1株pNL4−3から得た。ウッドチャック転写後制御要素(WPRE)配列は以前に記載されている。
CARの発現に使用されるベクターであるepHIV7を、pHIV7ベクターから作製した。重要なことに、このベクターは、ヒトEF1プロモーターを使用してCARの発現を駆動する。ベクターの5´配列も3´配列も、HXBc2プロウイルスから以前に得たpv653RSNから得た。ポリプリン区域DNAフラップ配列(cPPT)を、NIH AIDS Reagent Repository由来のHIV−1株pNL4−3から得た。ウッドチャック転写後制御要素(WPRE)配列は以前に記載されている。
手短に言えば、介在性SL3−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(Neo)を有するgag−pol+5´及び3´の末端反復配列(LTRs)由来の653bpを含有するpv653RSNを、以下のようにpBluescriptにサブクローニングした。ステップ1では、5´LTRからRev応答配列(RRE)の配列が、p5´HIV−1 51を作製し、次に、5´LTRを、TATAボックスの上流の配列を除去することによって改変し、第一にCMVエンハンサーに連結させ、次に、複製のSV40開始点に連結させた(p5´HIV−2)。ステップ2では、3´LTRをpBluescriptにクローニングしてp3´HIV−1を作製した後、3´LTRエンハンサー/プロモーターにおける400bpの欠失を行って、HIV U3におけるシス制御要素を除去し、p3´HIV−2を形成した。ステップ3では、p5´HIV−3及びp3´HIV−2から単離したフラグメントを連結させて、pHIV−3を作製した。ステップ4では、p3´HIV−3を生成するために余分な上流のHIV配列を除去することによりp3´HIV−2をさらに改変し、WPREを含有する600bp BamHI−SalIフラグメントをp3´HIV−3に添加して、p3´HIV−4を作製した。ステップ5では、pHIV−3 RREのサイズをPCRによって減らし、pHIV−3由来の5´フラグメント(図示せず)及びp3´HIV−4に連結させて、pHIV−6を作製した。ステップ6では、HIV−1 pNL4−3由来のcPPT DNAフラップ配列を含有する190bp BglII−BamHIフラグメントをpNL4−3から増幅させ、pHIV6におけるRRE配列とWPRE配列の間に配置してpHIV−7を作製した。この親プラスミドpHIV7−GFP(GFP、緑色蛍光タンパク質)を使用して、4−プラスミド系を使用して親ベクターをパッケージングした。
パッケージングシグナルpsi(ψ)は、ベクター内へのウイルスゲノムの効率的なパッケージングに要求される。RRE及びWPREは、RNA転写物の運搬及び導入遺伝子の発現を増強する。フラップ配列は、WPREと組み合わせて、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの形質導入の効率を高めると実証されてきた。
ウイルスベクターの作製に要求されるヘルパー機能は、3つの別々のプラスミドに分けられ、組換えを介した複製可能なレンチウイルスの生成の可能性を減少させる:l)pCgpは、ウイルスベクター構築に要求されるgag/polタンパク質をコードする;2)pCMV−Rev2は、効率的なパッケージングのためにウイルスゲノムの運搬に寄与するRRE配列に作用するRevタンパク質をコードする;及び、3)pCMV−Gは、ウイルスベクターの感染力に要求される水疱性口内炎ウイルス(VSV)の糖タンパク質をコードする。
pHIV7にコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間に最小のDNA配列相同性が存在する。相同性の領域には約600ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域が含まれ、pCgpヘルパープラスミドのgag/pol配列内;3種全てのヘルパープラスミドのCMVプロモーター配列内;及び、ヘルパープラスミドpCgpのRRE配列内;に位置する。これらの領域における相同性のために複製可能な組換えウイルスを生成することができる見込みは、多数の組換え事象を要求するため、極めて低い。加えて、いかなる結果として生じる組換え体も、レンチウイルス複製に要求されるtat配列及び機能的LTRを欠いているであろう。
CMVプロモーターをEF1α−HTLVプロモーター(EF1p)に置き換え、新しいプラスミドをepHIV7と命名した。EF1pは563bpを有し、CMVプロモーターを切除した後、NruI及びNheIを使用してepHIV7内に導入した。
野生型ウイルスの病原性に必要であり、且つ、標的細胞の増殖性感染に要求されるgag/pol及びrevを除くレンチウイルスゲノムは、この系から除かれてきた。加えて、CD19R(EQ)CD28T2AEGFRtepHIV7ベクター構築物は、インタクトな3´LTRプロモーターを含有しないため、結果として生じる標的とされた細胞における発現され且つ逆転写されたDNAプロウイルスゲノムは、不活性LTRを有することになる。この設計の結果として、HIV−I由来配列はプロウイルスから転写されることはなく、治療配列のみがそれぞれのプロモーターから発現されることになる。SINベクターにおけるLTRプロモーター活性の除去は、宿主遺伝子の意図していない活性化の可能性を有意に減らすと予想される。
患者T細胞の形質導入のためのベクターの作製
T細胞集団の形質導入のためのベクターは、以下のように調製することができる。各プラスミド(CD(EQ)BBZ−T2A−CD19t_epHIV7;pCgp;pCMV−G;及びpCMV−Rev2)に対して、種子バンクが生成され、種子バンクは、発酵槽を播種して十分な量のプラスミドDNAを生じるために使用される。プラスミドDNAは、レンチウイルスベクターの作製におけるその使用に先立ち、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験される。
T細胞集団の形質導入のためのベクターは、以下のように調製することができる。各プラスミド(CD(EQ)BBZ−T2A−CD19t_epHIV7;pCgp;pCMV−G;及びpCMV−Rev2)に対して、種子バンクが生成され、種子バンクは、発酵槽を播種して十分な量のプラスミドDNAを生じるために使用される。プラスミドDNAは、レンチウイルスベクターの作製におけるその使用に先立ち、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験される。
手短に言えば、細胞は、無菌性及びウイルス汚染の欠如を確認するために試験された293Tワーキングセル(WCB)から増殖させられる。293T WCB由来の293T細胞のバイアルが解凍させられる。十分な数の細胞が存在して、ベクター作製及び細胞トレイン維持のために適切な数の10層のセルファクトリー(CFs)を蒔くまで、細胞を成長させ、増殖させた。単一の細胞トレインを、作製のために使用することができる。
レンチウイルスベクターは、10CFまでのサブバッチで作製される。2つのサブバッチを同じ週に作製することができ、1週あたり約20Lのレンチウイルス上清を作製することができる。全てのサブバッチから作製された材料は、製品のロットを作製するために、下流の処理段階の間にプールされる。293T細胞は、293T培地(10%FBSを有するDMEM)内のCF中に蒔かれる。ファクトリーは、37℃のインキュベーター内に置かれ、CFの層全てに細胞を均一に分布させるため水平にされる。2日後、Tris:EDTA、2M CaCl2、2X HBS及び4つのDNAプラスミドの混合物を含むCaPO4法を使用して、細胞に上記の4つのレンチウイルスプラスミドが遺伝子導入される。遺伝子導入の3日後、分泌されたレンチウイルスベクターを含有する上清が回収、精製及び濃縮される。上清がCFから除去された後、エンド・オブ・プロダクション細胞が各CFから回収される。細胞は、各ファクトリーからトリプシン処理され、遠心分離によって回収される。細胞は、凍結培地に再懸濁され、凍結保存される。これらの細胞は、後に、複製可能なレンチウイルス(RCL)の試験に使用される。
ベクターを精製し且つ製剤化するために、未精製の上清が、膜ろ過法によって浄化されて細胞片が除去される。宿主細胞のDNA及び残存プラスミドのDNAは、エンドヌクレアーゼによる消化(Benzonase(登録商標))によって分解される。ウイルス上清は、0.45μmのフィルターを使用して細胞片が除去され浄化される。浄化された上清は、予め重さが量られた容器内に回収され、そこにBenzonase(登録商標)が添加される(最終濃度50U/mL)。残存プラスミドのDNA及び宿主ゲノムのDNAに対するエンドヌクレアーゼによる消化が、37℃で6時間行われる。エンドヌクレアーゼ処理された上清の最初のタンジェンシャルフローウルトラフィルトレーション(TFF)濃縮が、ウイルスを20倍まで濃縮しながら、未精製の上清から残存の低分子量成分を除去するために使用される。浄化されたエンドヌクレアーゼ処理されたウイルス上清は、流動速度を最大にしながら、剪断速度を4,000秒−1以下に維持するように設計された流速で500kDのNMWCOを有するホローファイバーカートリッジを循環させられる。ヌクレアーゼで処理された上清のダイアフィルトレーションが、カートリッジの性能を持続させるために濃縮プロセスの間に開始される。80%の透過置換速度(permeate replacement rate)が、ダイアフィルトレーションバッファーとしてPBS中4%ラクトースを使用して確立される。ウイルス上清は、未精製の上清の20倍の濃度を表す目標量までもたらされ、さらに、ダイアフィルトレーションは、100%の透過置換速度で、4つの追加の交換量に対して続けられる。
ウイルス産物のさらなる濃縮を、高速遠心分離技術を使用することによって達成した。レンチウイルスの各サブバッチは、6℃で16〜20時間、6000RPM(6,088RCF)でSorvall RC−26plus遠心機を使用してペレット状にされる。次に、各サブバッチからのウイルスペレットは、PBS中4%ラクトースを有する50mLの量で再構成される。このバッファー中の再構成されたペレットは、ウイルス調製に対する最終製剤を表す。ベクター濃縮プロセス全体によって、約200分の1まで体積が減少する。サブバッチ全ての完了に続いて、材料が−80℃に置かれ、各サブバッチからの試料は、無菌性について試験される。試料の無菌性の確認に続いて、サブバッチは、頻繁に攪拌されながら37℃で急速に解凍される。次に、この材料はプールされ、ウイルスベクタースイートのクラスIIタイプA/B3バイオセイフティーキャビネットに手動で分注される。無菌のUSPクラス6、雄ネジが切られた0リングクライオバイアルにおいて1mLの濃縮されたレンチウイルスの充填構成が使用される。
レンチウイルスベクター調製物の純度を保証するために、残存宿主のDNA混入物及び残存宿主及びプラスミドのDNAの導入が試験される。いくつかある試験の中で特に、正しいベクターが存在していることを確実にするために、ベクター同一性がRT−PCRによって評価される。
ACTにおける使用に適したAkt阻害剤増殖T細胞
Tリンパ球を、白血球フェレーシスによって健康な対象から得て、CD8+T細胞を、AutoMACS(Miltenyi)上で磁気的に単離した。単離の日に、24ウェルプレート内の4×106のCD8+細胞を、3:1(ビーズ:細胞)の比でCD3/CD28ビーズを用いて活性化し、IL−2(50U/ml)及びAkt阻害剤(Akt阻害剤VIII)(1uM/mL)の存在下で、2mMのL−グルタミン、25mMのHEPES、及び10%熱失活FCSを補ったRPMI1640培地(T細胞培地)中MOI1.5で、上記のCD19CARをコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。32℃±3℃の567×gでの30分間のスピノキュレーション(spinoculation)の後、培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日の50U/mL rhIL−2の最終濃度のサイトカイン補給及びAkt阻害剤VIII(1uM/mL)と共に、0.5×106から1×106生細胞/mLの細胞密度を保つために要求される培地を添加しながら培養物を維持した。上記のように、レンチウイルスベクターは、選択及び切除目的でトランケート型ヒト上皮増殖因子受容体(huEGFRt)も発現した。
Tリンパ球を、白血球フェレーシスによって健康な対象から得て、CD8+T細胞を、AutoMACS(Miltenyi)上で磁気的に単離した。単離の日に、24ウェルプレート内の4×106のCD8+細胞を、3:1(ビーズ:細胞)の比でCD3/CD28ビーズを用いて活性化し、IL−2(50U/ml)及びAkt阻害剤(Akt阻害剤VIII)(1uM/mL)の存在下で、2mMのL−グルタミン、25mMのHEPES、及び10%熱失活FCSを補ったRPMI1640培地(T細胞培地)中MOI1.5で、上記のCD19CARをコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。32℃±3℃の567×gでの30分間のスピノキュレーション(spinoculation)の後、培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日の50U/mL rhIL−2の最終濃度のサイトカイン補給及びAkt阻害剤VIII(1uM/mL)と共に、0.5×106から1×106生細胞/mLの細胞密度を保つために要求される培地を添加しながら培養物を維持した。上記のように、レンチウイルスベクターは、選択及び切除目的でトランケート型ヒト上皮増殖因子受容体(huEGFRt)も発現した。
Akt阻害剤処理のない形質導入したCD19CAR T細胞を対照として使用した。活性化/形質導入後8日目に、ビーズを、磁石を用いて培養物から除去し、操作されたCD19CAR T細胞を、in vitro及びin vivoでのアッセイの前に21日間、2mMのL−グルタミン、25mMのHEPES及び10%熱失活FCS(Hyclone)を補ったRPMI(Irvine Scientific)においてin vitroで増殖させた。
増殖の評価は、Akt阻害剤の存在がin vitroでのCD19CAR T細胞増殖及び生存を損なわないことを明らかにした。図1において示されているように、Akt阻害剤の存在下又は非存在下での培養後、同等のCD19CAR T細胞増殖を観察した。エフェクター機能のAkt阻害剤の潜在的影響を検査するために、操作されたCD8+CD19CAR T細胞を、21日間Akt阻害剤の存在下又は非存在下で増殖させた。CD19CAR T細胞とCD19+LCL細胞との一晩の共培養の後、107a脱顆粒アッセイを行った。OKT3発現LCLを陽性対照として使用し、CD19陰性AML細胞KG1aを陰性対照として使用した。この研究の結果は図2において示されており、Akt阻害剤で処理された細胞及び未処理の細胞が、CD19抗原刺激後に同レベルのインターフェロンガンマ産生及びCD107a発現を示すことが分かる。このように、Akt阻害剤は、CD19CAR T細胞のエフェクター機能を弱めるように見えなかった。
CAR T細胞でのCD62L及びCD28の発現等のメモリー様表現型は、in vivoでのより良好な抗腫瘍活性に関連していることが多くある。従って、本発明者等は、ex vivoでの増殖の後でCD19CAR T細胞を特徴付けた。手短に言えば、CD8+T細胞を選択し、CD3/CD28ビーズで活性化し、CD19CARレンチウイルスを用いて形質導入した。形質導入したT細胞を、IL2 50U/mL及びAkt阻害剤VIIIの存在下で維持した。Akt阻害剤無しでの培養物を対照として使用した。CAR発現を、EGFRtに対してErbituxを用いて検出した。この研究の結果は、図3において示されている(%CAR+CD62L+ダブルポジティブ細胞が描かれている)。本発明者等は、Aktにより阻害されたCD19CAR T細胞のうち40%がCD62Lを発現し、CD28を同時発現したことを見出した(図3及び図4)一方、KRLG等の消耗マーカーは、Akt阻害剤で処理された細胞では発現されなかった。対照的に、対照未処理CD19CAR T細胞のわずか10%がCD62Lを発現し、それらはCD28陰性であり、これは、Aktにより阻害されたCD19CAR T細胞が養子移入に続いて優れた抗腫瘍活性を有し得ることを示している。
Akt阻害剤により処理されたCAR T細胞の効力を試験するために、ホタルルシフェラーゼを発現するように操作した0.5×106のCD19+急性リンパ性白血病細胞(SupB15)を、NOD/Scid IL−2RgammaCnull(NSG)マウスに静脈内接種した。腫瘍移植の5日後、2x106CD8+CD19CAR T細胞を、腫瘍を有するマウスに静脈内注入した。対照マウスは、T細胞を受けなかったか、非形質導入T細胞(Mock)を受けたか、又はin vitroでの増殖の間にAkt阻害剤で処理しなかったCD19CAR T細胞を受けた。T細胞注入後の腫瘍シグナルを、バイオフォトニックイメージングによってモニターした。より低く一過性の抗腫瘍活性を示した未処理のCD19CAR T細胞とは対照的に、Aktにより阻害されたCD19CAR T細胞は、全てのマウスにおいてCD19+腫瘍を完全に根絶し(図5)、これは、ex vivoでのプライミング及び増殖の間のAktシグナル伝達の阻害は、優れた抗腫瘍活性を持つCD19CAR T細胞集団を生じさせるということを示唆している。
セントラルメモリーT細胞のAkt阻害剤処理
増殖及び/又は活性化の間のAkt阻害剤を用いたCAR T細胞集団の処理は、CD8+細胞集団だけでなく、例えばCARを発現するように遺伝子改変されたセントラルメモリーT細胞(TCM)集団等、他の細胞集団にも適用することができる。
増殖及び/又は活性化の間のAkt阻害剤を用いたCAR T細胞集団の処理は、CD8+細胞集団だけでなく、例えばCARを発現するように遺伝子改変されたセントラルメモリーT細胞(TCM)集団等、他の細胞集団にも適用することができる。
CARの発現に適したTCMは以下のように調製することができる。同意した研究参加者から得られたアフェレーシス生成物が、フィコール処理され(ficolled)、洗浄され、一晩インキュベートされる。次に、GMPグレードの抗CD14、抗CD25及び抗CD45RA試薬(Miltenyi Biotec)及びCliniMACS(商標)分離装置を使用して、細胞から単球、調節性T細胞及びナイーブT細胞の集団が枯渇される。枯渇に続いて、CliniMACS(商標)分離装置上でDREG56−ビオチン(COH臨床グレード)及び抗ビオチンマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を使用して、陰性画分細胞(negative fraction cells)が、CD62L+TCM細胞に対して濃縮される。
濃縮に続いて、TCM細胞は、完全なX−Vivo15+50IU/mLのIL−2中に配合され、Teflon細胞培養バッグに移され、そこで細胞は、Dynal ClinEx(商標)Vivo CD3/CD28ビーズで刺激される。刺激の日に、細胞は、1.0から0.3の感染多重度(MOI)で、例えばHIV7レンチウイルスベクター等の所望のCARを発現するベクターを用いて形質導入される。培養物は、定期的なAkt阻害剤の添加と共に、細胞増殖に要求される完全なX−Vivo15及びIL−2サイトカインが添加されながら(3x105から2x106生細胞/mLの細胞密度、及び、培養の毎週月曜日、水曜日及び金曜日のサイトカイン補給を保ち)、21日間まで維持される。細胞は、典型的には、21日以内にこれらの条件下で約109の細胞まで増殖する。培養期間の終わりに、細胞は収集され、2回洗浄され、臨床グレードの凍結保存培地(Cryostore CS5、BioLife Solutions)中に配合される。
T細胞注入の日(一日又は複数日)に、凍結保存され放出された生成物が解凍され、洗浄され、再注入のために製剤化される。放出される細胞生成物を含有する凍結保存されたバイアルは、液体窒素貯蔵から取り出され、解凍され、冷却され、PBS/2%ヒト血清アルブミン(HSA)洗浄緩衝液で洗浄される。遠心分離後、上清が除去され、細胞は、防腐剤無添加生理食塩水(PFNS)/2%HSA輸液希釈剤に再懸濁される。試料が、品質管理試験のために取り除かれる。
Akt阻害剤による処理が、異なるT細胞サブセットからのメモリーT細胞の生成を促進する
バルクT細胞、上記のように精製したTCM、及び精製されたナイーブ/メモリーT細胞(非特許文献6)に、上記の第2世代のCD19 CARをコードするレンチウイルスを用いて形質導入を行い、17〜21日間1μMのAkt阻害剤VIIIの存在下及び非存在下で、50U/LのrhIL2を含有する培地において増殖させた。結果として生じるCD19CAR T細胞を、ビオチン化Erbitux(セツキシマブ)で染色し、CAR検出のためのストレプトアビジン−PE及びCD62Lに対する抗体を後に伴った。CD62を発現する細胞は、TCM細胞又はTSCM細胞を表す。エフェクターT細胞はCD62Lを発現しない。図6Aは、この分析の結果を示しており、Akt阻害剤の存在下での培養は、開始T細胞集団がバルクT細胞、TCM細胞又はナイーブ/メモリーT細胞であったかどうかに無関係に、CD62L+発現CAR T細胞の割合を増加させることが分かる。
バルクT細胞、上記のように精製したTCM、及び精製されたナイーブ/メモリーT細胞(非特許文献6)に、上記の第2世代のCD19 CARをコードするレンチウイルスを用いて形質導入を行い、17〜21日間1μMのAkt阻害剤VIIIの存在下及び非存在下で、50U/LのrhIL2を含有する培地において増殖させた。結果として生じるCD19CAR T細胞を、ビオチン化Erbitux(セツキシマブ)で染色し、CAR検出のためのストレプトアビジン−PE及びCD62Lに対する抗体を後に伴った。CD62を発現する細胞は、TCM細胞又はTSCM細胞を表す。エフェクターT細胞はCD62Lを発現しない。図6Aは、この分析の結果を示しており、Akt阻害剤の存在下での培養は、開始T細胞集団がバルクT細胞、TCM細胞又はナイーブ/メモリーT細胞であったかどうかに無関係に、CD62L+発現CAR T細胞の割合を増加させることが分かる。
2人のドナーからの試料を使用して、PBMC、TCM、及びTN/TCM/TSCMの細胞集団を調製した。これら6つの細胞集団のそれぞれに、CD19CARをコードするレンチウイルスを用いて形質導入を行い、次に、17〜21日間、上記のようにAkt阻害剤VIIIの非存在下又は存在下で増殖させた。図6Bにおいて見ることができるように、Akt阻害剤は、CD62L+/CD28+/CAR+T細胞の数を増加させた。
CARの構造
本明細書において記載されるT細胞集団を作製する方法は、CARを発現する細胞を調製するために使用することができ、あらゆる所望のCARと共に使用することができる。CARは、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。細胞外ドメインは、例えばHER2又は腫瘍細胞上で発現されるいくつか他の受容体に結合するscFv等、標的に結合するscFv、又は、例えばCD19等の標的に結合するリガンドであり得る標的ドメイン、及び、任意的に、例えばヒトFcドメインの一部を含むスペーサーで構成される。
本明細書において記載されるT細胞集団を作製する方法は、CARを発現する細胞を調製するために使用することができ、あらゆる所望のCARと共に使用することができる。CARは、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。細胞外ドメインは、例えばHER2又は腫瘍細胞上で発現されるいくつか他の受容体に結合するscFv等、標的に結合するscFv、又は、例えばCD19等の標的に結合するリガンドであり得る標的ドメイン、及び、任意的に、例えばヒトFcドメインの一部を含むスペーサーで構成される。
本明細書において記載されるCARは、標的ドメイン(すなわちscFV又はリガンド)と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含み得る。様々な異なるスペーサーを使用することができる。それらの一部は、ヒトFc領域の少なくとも一部、例えば、ヒトFc領域のヒンジ部分又はCH3ドメイン又はその変異体を含む。以下の表1は、本明細書において記載されるCARに使用することができる種々のスペーサーを提供している。
「アミノ酸修飾」は、タンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入及び/又は欠失を指す。「アミノ酸置換」又は「置換」は、親ペプチド又はタンパク質の配列における特定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸と交換することを指す。置換を行って、結果として生じるタンパク質におけるアミノ酸を、非保存の様式で(すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から別のグループに属するアミノ酸までコドンを変えることによって)、又は、保存的様式で(すなわち、特定のサイズ又は特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、同じグループに属するアミノ酸までコドンを変えることによって)変えることができる。そのような保存的変化は、一般に、結果として生じるタンパク質の構造及び機能における変化をより少なくする。以下は、アミノ酸の種々のグループの例である:1)非極性R基を有するアミノ酸:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン;2)非荷電極性R基を有するアミノ酸:グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン;3)(pH6.0で負に荷電した)荷電極性R基を有するアミノ酸:アスパラギン酸、グルタミン酸;4)(pH6.0で正に荷電した)塩基性アミノ酸:リシン、アルギニン、ヒスチジン(pH6.0)。別のグループは、フェニル基を有するアミノ酸:フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンであり得る。
特定の実施形態では、スペーサーは、未修飾のスペーサーにおいて存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換される1つ又は複数のアミノ酸残基を含むIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4から得られる。1つ又は複数の置換されるアミノ酸残基は、位置220、226、228、229、230、233、234、235、234、237、238、239、243、247、267、268、280、290、292、297、298、299、300、305、309、218、326、330、331、332、333、334、336、339又はその組み合わせの1つ又は複数のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。以下により詳細に記載されるこのナンバリングスキームにおいて、表1のIgGヒンジ配列及びIgG4ヒンジリンカー(HL)配列における最初のアミノ酸のように、表1のIgG4(L235E、N297Q)スペーサーにおける最初のアミノ酸は219であり、表1のIgG4(HL−CH3)スペーサーにおける最初のアミノ酸は219である。
一部の実施形態では、修飾されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換:C220S、C226S、S228P、C229S、P230S、E233P、V234A、L234V、L234F、L234A、L235A、L235E、G236A、G237A、P238S、S239D、F243L、P247I、S267E、H268Q、S280H、K290S、K290E、K290N、R292P、N297A、N297Q、S298A、S298G、S298D、S298V、T299A、Y300L、V305I、V309L、E318A、K326A、K326W、K326E、L328F、A330L、A330S、A331S、P331S、I332E、E333A、E333S、E333S、K334A、A339D、A339Q、P396L又はその組み合わせのうち1つ又は複数の置換を含むがこれらに限定されないIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4から得られる。
特定の実施形態では、修飾されたスペーサーは、未修飾の領域において存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換される1つ又は複数のアミノ酸残基を含むIgG4領域から得られる。1つ又は複数の置換されるアミノ酸残基は、位置220、226、228、229、230、233、234、235、234、237、238、239、243、247、267、268、280、290、292、297、298、299、300、305、309、218、326、330、331、332、333、334、336、339又はその組み合わせの1つ又は複数のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、修飾されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換:220S、226S、228P、229S、230S、233P、234A、234V、234F、234A、235A、235E、236A、237A、238S、239D、243L、247I、267E、268Q、280H、290S、290E、290N、292P、297A、297Q、298A、298G、298D、298V、299A、300L、305I、309L、318A、326A、326W、326E、328F、330L、330S、331S、331S、332E、333A、333S、333S、334A、339D、339Q、396L又はその組み合わせのうち1つ又は複数の置換を含むがこれらに限定されないIgG4領域から得られ、未修飾のスペーサーにおけるアミノ酸は、示された位置にて上記の同定されたアミノ酸で置換される。
本明細書において論じられる免疫グロブリンにおけるアミノ酸の位置に対して、番号付けは、EUインデックス又はEUナンバリングスキームによる(参照により全内容が本願に援用される非特許文献7)。EUインデックス又は非特許文献7に記載のEUインデックス又はEUナンバリングスキームは、EU抗体の番号付けを指す(非特許文献8)。
様々な膜貫通ドメインを、CARにおいて使用することができる。表2は、適した膜貫通ドメインの例を含む。スペーサードメインが存在する場合、膜貫通ドメインは、スペーサードメインに対するカルボキシ末端に位置する。
Claims (21)
- 組換えT細胞受容体を発現するT細胞集団を作製する方法であって、組換えT細胞受容体をコードするベクターを有するT細胞の集団を提供するステップ、前記T細胞の集団を増殖させる条件下及び時間の間、増殖培地内で前記T細胞の集団を培養するステップを含み、前記増殖培地はAkt活性の阻害剤を含む、方法。
- 前記Akt阻害剤は、前記培養するステップの間に前記増殖培地に添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記Akt阻害剤は、Akt1又はAkt2の活性又はその両方を少なくとも25%低下させるのに十分である、請求項1に記載の方法。
- 前記Akt阻害剤は、1000nM未満のIC50でAkt1及びAkt2を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 前記Akt阻害剤は、Akt阻害剤VIII(1,3−ジヒドロ−1−[1−[[4−(6−フェニル−1H−イミダゾ[4,5−g]キノキサリン−7−イル)フェニル]メチル]−4−ピペリジニル]−2H−ベンズイミダゾール−2−オン)、Akt阻害剤X(2−クロロ−N,N−ジエチル−10H−フェノキサジン−10−ブタナミン,モノヒドロクロリド)、MK−2206(8−(4−(1−アミノシクロブチル)フェニル)−9−フェニル−[1,2,4]トリアゾロ[3,4−f][1,6]ナフチリジン−3(2H)−オン)、アプロセルチブ(N−((S)−1−アミノ−3−(3,4−ジフルオロフェニル)プロパン−2−イル)−5−クロロ−4−(4−クロロ−1−メチル−1H−ピラゾール−5−イル)フラン−2−カルボキサミド)、イパタセルチブ((S)−2−(4−クロロフェニル)−1−(4−((5R,7R)−7−ヒドロキシ−5−メチル−6,7−ジヒドロ−5H−シクロペンタ[d]ピリミジン−4−イル)ピペラジン−1−イル)−3−(イソプロピルアミノ)プロパン−1−オン)、AZD5363(4−ピペリジンカルボキサミド,4−アミノ−N−[(1S)−1−(4−クロロフェニル)−3−ヒドロキシプロピル]−1−(7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−イル))、ペリフォシン、GSK690693、GDC−0068、トリシルビン、CCT128930、A−674563、PF−04691502、AT7867、ミルテフォシン、PHT−427、ホノキオール、トリシリビンホスファート、KP372−1A(10H−インデノ[2,1−e]テトラゾロ[1,5−b][1,2,4]トリアジン−10−オン)、H−8、H−89、NL−71−101、7−アザインドール、3−アミノピロリジン、イパタセルチブ、A−443654、AT13148、アフレセルチブ(GSK2110183)、DC120、エデルフォシン(1−O−オクタデシル−2−O−メチル−rac−グリセロ−3−ホスホコリン、ET−18−OCH3)、イルモフォシン(BM41.440)、エルシルホスホコリン(ErPC)、エルフォシン(ErPC3、エルシルホスホホモコリン)、インドール−3−カルビノール、3−クロロアセチルインドール、ジインドリルメタン、SR13668(ジエチル6−メトキシ−5,7−ジヒドロインドロ[2,3−b]カルバゾール−2,10−ジカルボン酸)、OSU−A9、PH−316、PIT−1、PIT−2、DM−PIT−1、N−[(1−メチル−1H−ピラゾール−4−イル)カルボニル]−N´−(3−ブロモフェニル)−チオ尿素)、TCN−P、API−1、ARQ092、BAY1125976、3−メチル−キサンチン、キノリン−4−カルボキサミド、2−[4−(シクロヘキサ−1,3−ジエン−1−イル)−1H−ピラゾール−3−イル]フェノール、3−オキソ−チルカル酸、アセトキシ−チルカル酸、ラクトキノマイシン、フレノリシン B、カラフンギン、メデルマイシン、Boc−Phe−ビニルケトン、及び4−ヒドロキシノネナール(4−HNE)を含む群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記増殖培地は、IL−2を含む、請求項1に記載の方法。
- 組換えT細胞受容体は、操作されたTCR又はキメラ抗原受容体(CAR)である、請求項1に記載の方法。
- 組換えT細胞受容体を発現するT細胞の集団を提供するステップは、
患者からT細胞を得るか、又は患者に対して同種異系のT細胞を得ること、
得られた前記T細胞を処理して、セントラルメモリーT細胞が豊富な細胞の集団を単離すること、及び、
単離された前記細胞の集団の少なくとも一部に、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いて形質導入を行うこと、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 組換えT細胞受容体を発現するT細胞の集団を提供するステップは、
患者からT細胞を得るか、又は患者に対して同種異系のT細胞を得ること、
得られた前記T細胞を処理して、CD8+T細胞が豊富な細胞の集団を単離すること、及び
単離された前記細胞の集団の少なくとも一部に、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いて形質導入を行うこと、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記組換えT細胞受容体はキメラ抗原受容体(CAR)であり、該キメラ抗原受容体は、
標的結合ドメインと、
CD4膜貫通ドメイン又は1〜10のアミノ酸修飾を有するその変異体、CD8膜貫通ドメイン又は1〜10のアミノ酸修飾を有するその変異体、CD28膜貫通ドメイン又は1〜10のアミノ酸修飾を有するその変異体及びCD3ζ膜貫通ドメイン又は1〜10のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される膜貫通ドメインと、
共刺激ドメインと、
CD3ζシグナル伝達ドメイン又は1〜10のアミノ酸修飾を有するその変異体と、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記共刺激ドメインは、CD28共刺激ドメイン又は1〜10のアミノ酸修飾を有するその変異体、4IBB共刺激ドメイン又は1〜10のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、OX40共刺激ドメイン又は1〜10のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記キメラ抗原受容体は、CD28共刺激ドメイン又は1〜10のアミノ酸修飾を有するその変異体、4IBB共刺激ドメイン又は1〜10のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、OX40共刺激ドメイン又は1〜10のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される2つの異なる共刺激ドメインを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記キメラ抗原受容体は、CD28共刺激ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体、4IBB共刺激ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、OX40共刺激ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される2つの異なる共刺激ドメインを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記キメラ抗原受容体は、
CD4膜貫通ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体、CD8膜貫通ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体、CD28膜貫通ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体及びCD3ζ膜貫通ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される膜貫通ドメインと、
共刺激ドメインと、
CD3ζシグナル伝達ドメイン又は1〜2のアミノ酸修飾を有するその変異体と、
を含む、請求項13に記載の方法。 - 前記キメラ抗原受容体は、前記標的結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記標的結合ドメインはscFvである、請求項10に記載の方法。
- 前記scFvは、腫瘍細胞抗原に結合する、請求項16に記載の方法。
- 前記組換えT細胞受容体をコードするベクターを有するT細胞の集団を提供するステップは、T細胞の集団を活性化するステップ、及び、活性化された前記T細胞に、組換えT細胞受容体をコードするベクターを用いて形質導入を行うステップを含み、前記活性化ステップ及び前記形質導入ステップは、Akt阻害剤の存在下で生じる、請求項1に記載の方法。
- 前記T細胞は、αβT細胞、γδT細胞、NK T細胞又はその組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法によって調製されたT細胞の集団。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法によって調製されたT細胞集団を投与するステップを含む、患者における癌を治療する方法。
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