CN112055595A - Car t细胞的使用方法 - Google Patents

Car t细胞的使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112055595A
CN112055595A CN201980021107.5A CN201980021107A CN112055595A CN 112055595 A CN112055595 A CN 112055595A CN 201980021107 A CN201980021107 A CN 201980021107A CN 112055595 A CN112055595 A CN 112055595A
Authority
CN
China
Prior art keywords
car
compound
dose
pharmaceutically acceptable
acceptable salt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980021107.5A
Other languages
English (en)
Inventor
P·S·罗
H·朱
Y·J·卢
C·P·利蒙
L·W·惠勒二世
M·C·詹森
J·马特伊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Endoset
Seattle Childrens Hospital
Purdue Research Foundation
Endocyte Inc
Original Assignee
Endoset
Seattle Childrens Hospital
Purdue Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Endoset, Seattle Childrens Hospital, Purdue Research Foundation filed Critical Endoset
Publication of CN112055595A publication Critical patent/CN112055595A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464404—Epidermal growth factor receptors [EGFR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/622—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier non-covalent binding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

本公开涉及通过向患者施用包含CAR T细胞的组合物，并且向所述患者施用通过接头连接至靶向部分的小分子而治疗患有癌症的患者的方法，其中所述CAR T细胞包含CAR且所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。本公开还涉及用于在此类方法中使用的组合物。

Description

CAR T细胞的使用方法
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C. § 119(e)，本申请要求2018年1月22日提交的美国临时申请序号62/620,414，2018年1月23日提交的美国临时申请序号62/620,706，2018年4月11日提交的美国临时申请序号62/656,233，2018年8月29日提交的美国临时申请序号62/724,171，2018年9月24日提交的美国临时申请序号62/735,627和2018年9月26日提交的美国临时申请序号62/736,727的优先权，上述所有申请均以其整体通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及通过向患者施用包含CAR T细胞的组合物，并且向所述患者施用通过接头连接至靶向部分的小分子而治疗患有癌症的患者的方法，其中所述CAR T细胞包含CAR且该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。本公开还涉及用于在此类方法中使用的组合物。
背景技术
基于将淋巴细胞(例如，T细胞)过继转移至患者的免疫疗法是治疗癌症及其他疾病的有价值疗法。在开发基于淋巴细胞的过继转移的免疫疗法中，已取得许多重要进展。在许多不同类型的免疫治疗剂中，正在开发的最有前景的免疫治疗剂之一为表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)。嵌合抗原受体(CAR)为经基因工程改造的受体，其经设计以靶向特异性抗原(例如，肿瘤抗原)。此靶向可导致对肿瘤的细胞毒性，例如使得表达CAR的CAR T细胞可经由特异性肿瘤抗原靶向且杀死肿瘤。
第一代CAR由以下构成：用于识别并结合至由肿瘤表达的抗原的识别区(例如，源自抗体的单链片段可变(scFv)区)、及活化信号结构域(例如，T细胞的CD3ζ链可充当CAR中的T细胞活化信号)。虽然CAR T细胞已显示体外的积极结果，但是其在临床试验中消除疾病(例如，癌症)方面取得的成功有限。一个问题在于不能在体内延长活化并扩增CAR T细胞群体。
为解决此问题，已在第二代CAR中包含共刺激结构域(例如，CD137、CD28或CD134)以实现T细胞在体内的延长活化。共刺激结构域的添加增强含有CAR的T细胞的体内增殖及生存，并且初始临床数据已显示此类构建体是疾病(诸如癌症)治疗中的有前景治疗剂。
虽然已于CAR T细胞疗法中作出改进，但是仍存在若干问题。首先，由于表达由CART细胞所靶向的抗原(例如，肿瘤相关抗原)的正常细胞，可发生“脱靶”毒性。其次，可发现不受调节的CAR T细胞活化，其中通过CAR T细胞快速及不受控消除疾病细胞(例如，癌细胞)诱导一系列被称作肿瘤溶解综合征或细胞因子释放综合征(CRS)的代谢紊乱，所述代谢紊乱对患者会是致命的。由于施用不可容易调节且不可控活化的CAR T细胞，可产生肿瘤溶解综合征及CRS。因此，虽然CAR T细胞显示作为疾病(诸如癌症)治疗中的工具的极大前景，但是需要提供降低的脱靶毒性及CAR T细胞活化的更精确控制的额外CAR T细胞疗法。
发明内容
发明人已发现降低脱靶毒性及更精确控制CAR T细胞活化的方法，所述方法提供CAR T细胞疗法中的重要进展。在本文中所述的各种实施方案中，使用通过接头连接至靶向部分的小分子配体作为癌症与表达CAR的CAR T细胞之间的桥，其中所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。所述桥将表达包含E2抗荧光素抗体片段的CAR的CAR T细胞指向癌症以改善癌症。在一个实施方案中，所述“小分子配体”可以是例如叶酸、DUPA、NK-1R配体、CAIX配体、γ谷氨酰基转肽酶、NKG2D配体或CCK2R配体，其各自为特异性结合癌细胞的小分子配体(即，这些配体的受体相较于正常组织在癌症上过表达)。
在一个实施方案中，所述“小分子配体”连接至与CAR T细胞表达的CAR结合的“靶向部分”。在各个实施方案中，所述“靶向部分”可选自例如荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、NHS-及/或荧光素。
所述“靶向部分”结合至表达E2抗荧光素抗体片段的经基因工程改造的CAR的识别区。因此，CAR的识别区(例如，E2抗荧光素抗体片段的单链可变区(scFv)、Fab、Fv、Fc、(Fab')2片段等)被指向所述“靶向部分”。因此，通过接头连接至靶向部分的小分子配体充当癌症与表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞之间的桥，将所述CAR T细胞指向癌症以改善癌症。
在一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向该患者施用第一剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向靶向部分的CAR且其中所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段，及iii)向该患者施用第二剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向靶向部分的CAR且其中所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，及ii)向该患者施用CAR T细胞组合物，其中该 CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CAR T细胞包含指向靶向部分的CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，且其中该CAR T细胞组合物包含所述CAR T细胞及非转化T细胞的混合物。
在又另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i) 对患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向该患者施用CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CART细胞包含指向靶向部分的CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，及iii)向该患者施用叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制CAR T细胞的活化的药剂。
在仍另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，其中向该患者施用至少第一剂量及第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一剂量与该第二剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约2倍至约15000倍，及ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向靶向部分的CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在另一个说明性实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向该患者施用至少第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低至少约50%；及iii)向该患者施用一个剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向该靶向部分的CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，且其中该化合物或其药学上可接受的盐以约10 nmol/kg患者体重至约2500 nmol/kg患者体重的剂量施用，及ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，且其中所述CAR T细胞的剂量为约1百万个CAR T细胞至约15百万个CAR T细胞。
在仍另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者连续施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，及iii)终止该化合物或其药学上可接受的盐的连续施用以抑制或预防患者的细胞因子释放综合征。
在另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体且其中每周一次向该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐，及ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在仍另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体且其中在施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物之前，向该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐，其中所述CAR T细胞包含指向靶向部分的CAR，ii)然后向该患者施用一个剂量的该CAR T细胞组合物，及iii)然后向该患者施用第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
还通过以下列举条款描述其他的实施方案。还设想下列实施方案中的任一者与本申请的发明内容部分、说明性实施方案的详述部分、实施例部分或权利要求书中所述的任何可适用实施方案组合。
1.一种治疗癌症的方法，该方法包括：
i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体；
ii)向该患者施用第一剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向该靶向部分的CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段；及
iii)向该患者施用第二剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向该靶向部分的CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
2.一种治疗癌症的方法，该方法包括：
i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体，及
ii)向该患者施用CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CAR T细胞包含指向该靶向部分的CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，且其中该CAR T细胞组合物包含所述CAR T细胞及非转化T细胞的混合物。
3.一种治疗癌症的方法，该方法包括：
i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体；
ii)向该患者施用CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CAR T细胞包含指向该靶向部分的CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段；及
iii)向该患者施用叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制CAR T细胞的活化的药剂。
4.如条款3的方法，其中步骤iii包括施用叶酸类化合物。
5.如条款3或4中任一项的方法，其中步骤iii包括施用叶酸或甲酰四氢叶酸。
6.如条款3的方法，其中步骤iii包括施用该包含叶酸类化合物的缀合物。
7.如条款6的方法，其中该包含叶酸类化合物的缀合物包括连接至一个或多个氨基酸的叶酸类化合物。
8.如条款7的方法，其中该包含叶酸类化合物的缀合物具有下式
Figure 220699DEST_PATH_IMAGE001
。
9.如条款3至8中任一项的方法，其中该叶酸类化合物具有下式：
Figure 137840DEST_PATH_IMAGE002
其中X1及Y1各自独立地选自卤素、R2、OR2、SR3及NR4R5；
U、V及W表示二价部分，其各自独立地选自-(R6a)C=、-N=、-(R6a)C(R7a)-及-N(R4a)-；Q选自C及CH；T选自S、O、N及-C=C-；
X2及X3各自独立地选自以下：氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R4b)-、-C(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)O-、-N(R4b)C(Z)N(R5b)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R4a)S(O)2-、-C(R6b)(R7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH2C≡CH)-、C1-C12亚烷基及C1-C12亚烷氧基，其中Z为氧或硫；
R1选自氢、卤素、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基；
R2、R3、R4、R4a、R4b、R5、R5b、R6b及R7b各自独立地选自以下：氢、卤素、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12酰基、C1-C12烯基、C1-C12炔基、(C1-C12烷氧基)羰基及(C1-C12烷基氨基)羰基；
R6及R7各自独立地选自氢、卤素、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基；或R6与R7一起形成羰基；
R6a及R7a各自独立地选自氢、卤素、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基；或R6a与R7a一起形成羰基；
p、r、s及t各自独立地为0或1；且
*表示连接至该缀合物的其余部分的可选共价键。
10.如条款3的方法，其中施用抑制CAR T细胞的活化的药剂且其选自以下：淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、IL-2可诱导T细胞激酶抑制剂、JAK抑制剂、BTK抑制剂、EC2319、及阻断CAR T细胞结合至该化合物或其药学上可接受的盐，但是不结合至该癌症的药剂。
11.如条款10的方法，其中施用抑制CAR T细胞的活化的药剂且该药剂为淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶抑制剂。
12.如条款11的方法，其中该淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶抑制剂为达沙替尼(Dasatinib)。
13.如条款10的方法，其中施用抑制CAR T细胞的活化的药剂且该药剂为PI3激酶抑制剂。
14.如条款13的方法，其中该PI3激酶抑制剂为GDC0980。
15.如条款10的方法，其中施用抑制CAR T细胞的活化的药剂且该药剂为IL-2可诱导T细胞激酶抑制剂。
16.如条款15的方法，其中该IL-2可诱导T细胞激酶抑制剂为BMS-509744。
17.如条款10的方法，其中施用抑制CAR T细胞的活化的药剂且其为阻断CAR T细胞结合至该化合物或其药学上可接受的盐，但是不结合至该癌症的药剂。
18.如条款17的方法，其中该药剂为荧光素胺、FITC或荧光素钠。
19.如条款18的方法，其中该药剂为FITC。
20.如条款18的方法，其中该药剂为荧光素钠。
21.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.01至约300 μmol/kg患者体重的剂量施用。
22.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约100 μmol/kg患者体重的剂量施用。
23.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约90 μmol/kg患者体重的剂量施用。
24.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约80 μmol/kg患者体重的剂量施用。
25.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约70 μmol/kg患者体重的剂量施用。
26.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约60 μmol/kg患者体重的剂量施用。
27.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约50 μmol/kg患者体重的剂量施用。
28.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约40 μmol/kg患者体重的剂量施用。
29.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约30 μmol/kg患者体重的剂量施用。
30.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约20 μmol/kg患者体重的剂量施用。
31.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约10 μmol/kg患者体重的剂量施用。
32.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约8 μmol/kg患者体重的剂量施用。
33.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约6 μmol/kg患者体重的剂量施用。
34.如条款3至33中任一项的方法，其中向该患者施用超过一个剂量的该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂。
35.如条款3至34中任一项的方法，其中在该化合物或其药学上可接受的盐之前及/或之后，向该患者施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂。
36.如条款3至35中任一项的方法，其中该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂的施用造成患者中的细胞因子水平的降低。
37.如条款36的方法，其中在向该患者施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂后约3小时，发生细胞因子水平的降低。
38.如条款36的方法，其中在对该患者施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂后约6小时，发生细胞因子水平的降低。
39.如条款36至38中任一项的方法，其中细胞因子水平的降低为降低至将近未经治疗的患者中的细胞因子水平。
40.如条款3至39中任一项的方法，其中在施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂之前及随后施用该化合物或其药学上可接受的盐。
41.如条款3至40中任一项的方法，其中在施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂后，该患者的血液中CAR T细胞数目增加，即使该患者中的细胞因子水平降低。
42.如条款3至41中任一项的方法，其中在施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂后，相对于未用救援剂治疗的患者，增强或维持CAR T细胞活化，即使经治疗的患者中的细胞因子水平降低。
43.如条款3至42中任一项的方法，其中该癌症包括肿瘤及当向该患者施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂时，该患者中的肿瘤大小不增加。
44.如条款43的方法，其中获得对该肿瘤的完全反应。
45.如条款3至44中任一项的方法，其中当该CRS等级达到1、2、3或4时，向该患者施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂。
46.如条款45的方法，其中当该CRS等级达到3或4时，向该患者施用抑制CAR T细胞的活化的药剂。
47.如条款3至46的方法，其中肺水肿减少。
48.如条款1至47中任一项的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐以约10nmol/kg患者体重至约2500 nmol/kg患者体重的剂量施用；且所述CAR T细胞的剂量为约1百万个CAR T细胞至约15百万个CAR T细胞。
49.如条款48的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐以约10 nmol/kg患者体重至约100 nmol/kg患者体重的剂量施用。
50.如条款48至49中任一项的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐以约10nmol/kg患者体重至约50 nmol/kg患者体重的剂量施用。
51.如条款48至50中任一项的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐以约10nmol/kg患者体重至约20 nmol/kg患者体重的剂量施用。
52.如条款48的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐以约10 nmol/kg患者体重至约600 nmol/kg患者体重的剂量施用。
53.如条款48的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐以约200 nmol/kg患者体重至约600 nmol/kg患者体重的剂量施用。
54.如条款48的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐以约400 nmol/kg患者体重至约600 nmol/kg患者体重的剂量施用。
55.如条款48至54中任一项的方法，其中所述CAR T细胞的剂量为约1百万个CAR T细胞至约12.5百万个CAR T细胞。
56.如条款48至55中任一项的方法，其中所述CAR T细胞的剂量为约1百万个CAR T细胞至约7百万个CAR T细胞。
57.如条款48至56中任一项的方法，其中所述CAR T细胞的剂量为约1百万个CAR T细胞至约5百万个CAR T细胞。
58.如条款48至57中任一项的方法，其中所述CAR T细胞的剂量为约2百万个CAR T细胞至约5百万个CAR T细胞。
59.如条款1至58中任一项的方法，其还包括终止该化合物或其药学上可接受的盐的连续施用以抑制或预防该患者的细胞因子释放综合征的步骤。
60.如条款1至59中任一项的方法，其中向该患者连续施用该化合物或其药学上可接受的盐持续至少一小时。
61.如条款1至59中任一项的方法，其中向该患者连续施用该化合物或其药学上可接受的盐持续至少四小时。
62.如条款1至59中任一项的方法，其中向该患者连续施用该化合物或其药学上可接受的盐持续至少六小时。
63.如条款1至62中任一项的方法，其中每隔一天对该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐。
64.如条款1至62中任一项的方法，其中每周三次对该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐。
65.如条款1至62中任一项的方法，其中每周两次对该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐。
66.如条款1至62中任一项的方法，其中每周一次对该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐。
67.如条款1至62中任一项的方法，其中向该患者施用化合物或其药学上可接受的盐直至发生该患者的体重的不可接受的损失、发烧、血压下降或肺水肿。
68.一种治疗癌症的方法，该方法包括：
i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体，其中向该患者施用至少第一剂量及第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一剂量与该第二剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约2倍至约15000倍；及
ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向该靶向部分的CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
69.如条款68的方法，其中向该患者施用至少第一剂量、第二剂量及第三剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一剂量、该第二剂量与该第三剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约2倍至约750倍，且其中该第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约800倍至约10000倍。
70.如条款68的方法，其中向该患者施用至少第一剂量、第二剂量、第三剂量及第四剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一剂量、该第二剂量、该第三剂量与该第四剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约2倍至约750倍，其中该第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约800倍至约7500倍，且其中该第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约8000倍至约15000倍。
71.如条款70的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约100倍，其中该第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约1000倍，且其中该第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约10000倍。
72.如条款68的方法，其中向该患者施用至少第一剂量及第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一剂量与该第二剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约2倍至约15000倍。
73.一种治疗癌症的方法，该方法包括：
i)向患者施用第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体；
ii)向该患者施用至少第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约50%；及
iii)向该患者施用一个剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向该靶向部分的CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
74.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约60%。
75.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约70%。
76.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约80%。
77.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约90%。
78.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约95%。
79.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约96%。
80.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约97%。
81.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约98%。
82.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约99%。
83.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约99.5%。
84.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约100 nmol/kg患者体重至约1000 nmol/kg患者体重。
85.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约100 nmol/kg患者体重至约900 nmol/kg患者体重。
86.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约100 nmol/kg患者体重至约800 nmol/kg患者体重。
87.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约100 nmol/kg患者体重至约700 nmol/kg患者体重。
88.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约100 nmol/kg患者体重至约600 nmol/kg患者体重。
89.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约200 nmol/kg患者体重至约600 nmol/kg患者体重。
90.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约400 nmol/kg患者体重至约600 nmol/kg患者体重。
91.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约500 nmol/kg患者体重。
92.如条款84的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmol/kg患者体重至约500 nmol/kg患者体重。
93.如条款85的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmol/kg患者体重至约450 nmol/kg患者体重。
94.如条款86的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmol/kg患者体重至约400 nmol/kg患者体重。
95.如条款87的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmol/kg患者体重至约350 nmol/kg患者体重。
96.如条款88的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmol/kg患者体重至约300 nmol/kg患者体重。
97.如条款89的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约1nmol/kg患者体重至约300 nmol/kg患者体重。
98.如条款90的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约2nmol/kg患者体重至约300 nmol/kg患者体重。
99.如条款91的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约2nmol/kg患者体重至约250 nmol/kg患者体重。
100.如条款92至99中任一项的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约5 nmol/kg患者体重至约40 nmol/kg患者体重。
101.如条款92至99中任一项的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约40 nmol/kg患者体重至约150 nmol/kg患者体重。
102.如条款73至101中任一项的方法，其还包括施用第三剂量的该化合物或其药学上可接受的盐的，其中该第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐的与第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐相同。
103.如条款102的方法，其还包括施用第四剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐与第二剂量或其药学上可接受的盐及第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐相同。
104.如条款73至103中任一项的方法，其中在第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐后施用的一个或多个剂量的该化合物或其药学上可接受的盐相对于该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐维持抑制该癌症的生长。
105.如条款73至104中任一项的方法，其中所述CAR T细胞以约1百万个CAR T细胞至约40百万个CAR T细胞的剂量施用。
106.如条款73至105中任一项的方法，其中每周一次施用在第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐后施用的一个或多个剂量的该化合物或其药学上可接受的盐。
107.如条款73至105中任一项的方法，其中每周两次施用所述一个或多个剂量的该化合物或其药学上可接受的盐。
108.如条款1至107中任一项的方法，其中该CAR还包含IgG4铰链结构域、CD3ζ活化结构域及4-1BB共刺激结构域。
109.如条款1至108中任一项的方法，其中该E2抗荧光素抗体片段为scFv片段。
110.如条款1至109中任一项的方法，其中该CAR蛋白质序列具有与SEQ ID NO: 2至少约90%的同一性。
111.如条款1至109中任一项的方法，其中该CAR蛋白质序列具有与SEQ ID NO: 2至少约95%的同一性。
112.如条款1至109中任一项的方法，其中该CAR蛋白质序列具有与SEQ ID NO: 2至少约98%的同一性。
113.如条款1至112中任一项的方法，其中该CAR结合荧光素。
114.如条款1至109中任一项的方法，其中该CAR蛋白质序列具有至多约50个保守氨基酸取代且其中该CAR结合荧光素。
115.如条款1至109中任一项的方法，其中该CAR由具有与SEQ ID NO: 1至少约90%同一性的多核苷酸编码。
116.如条款1至109中任一项的方法，其中该CAR由具有与SEQ ID NO: 1至少约95%同一性的多核苷酸编码。
117.如条款1至109中任一项的方法，其中该CAR由具有与SEQ ID NO: 1至少约98%同一性的多核苷酸编码。
118.如条款115至117中任一项的方法，其中该CAR结合荧光素。
119.如条款1至118中任一项的方法，其中该CAR由在高度严格条件下与具有SEQID NO: 1的多核苷酸杂交的多核苷酸编码且其中该CAR结合荧光素。
120.如条款1至119中任一项的方法，其中该CAR由具有SEQ ID NO: 1的多核苷酸或由SEQ ID NO: 1的简并变体编码。
121.如条款1至120中任一项的方法，其中该配体选自以下：叶酸类化合物、DUPA、NK-1R配体、CAIX配体、γ谷氨酰基转肽酶配体、NKG2D配体、及CCK2R配体。
122.如条款1至121中任一项的方法，其中该靶向部分为荧光素或其药学上可接受的盐。
123.如条款1至122中任一项的方法，其中该接头包括聚乙二醇(PEG)、聚脯氨酸、亲水性氨基酸、糖、非天然肽聚糖、聚乙烯吡咯啶酮、普兰尼克(pluronic) F-127、或其组合。
124.如条款1至123中任一项的方法，其中该接头包括PEG。
125.如条款1至124中任一项的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐具有下式
Figure 979894DEST_PATH_IMAGE003
，
其中B表示小分子配体，L表示接头，且T表示靶向部分，且其中L包括具有下式的结构
Figure 375103DEST_PATH_IMAGE004
其中n为0至200的整数。
126.如条款1至125中任一项的方法，其中该癌症选自以下：肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头癌、颈癌、皮肤黑色素瘤、眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌(endometrialcancer)、直肠癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌(carcinomaof the endometrium)、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、非小细胞肺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、尿道癌、前列腺癌、慢性白血病、急性白血病、急性骨髓细胞性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、骨髓性白血病、骨髓单核细胞性白血病、毛细胞白血病、骨髓单核细胞性白血病、毛细胞白血病、胸膜间皮瘤、膀胱癌、伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤、输尿管癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、及胃食管接合部腺癌。
127.如条款1至126中任一项的方法，其中该癌症为表达叶酸受体的癌症。
128.如条款1至127中任一项的方法，其中该癌症为子宫内膜癌。
129.如条款1至127中任一项的方法，其中该癌症为非小细胞肺癌。
130.如条款1至127中任一项的方法，其中该癌症为卵巢癌。
131.如条款1至127中任一项的方法，其中该癌症为三阴性乳腺癌。
132.如条款1至127中任一项的方法，其中该癌症为急性骨髓细胞性白血病。
133.如条款132的方法，其中该癌症表达该叶酸受体-β。
134.如条款1至133中任一项的方法，其中施用多个剂量的该CAR T细胞组合物。
135.如条款1至134中任一项的方法，其中施用至少两个剂量的该CAR T细胞组合物。
136.如条款1至135中任一项的方法，其中在施用该化合物或其药学上可接受的盐之前，或在施用该CAR T细胞组合物之前，对该患者成像。
137.如条款1至136中任一项的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐不是抗体，且不包含抗体片段。
138.如条款1至137中任一项的方法，其中该靶向部分不包含肽表位。
139.如条款1至138中任一项的方法，其中不发生导致该患者中的脱靶毒性的细胞因子释放且其中发生对该癌症的CAR T细胞毒性。
140.如条款1至138中任一项的方法，其中该患者中不发生脱靶组织毒性且其中发生对该癌症的CAR T细胞毒性。
141.如条款1至138中任一项的方法，其中该癌症包括肿瘤，其中该患者的肿瘤大小减少，且其中不发生脱靶毒性。
142.如条款1至141中任一项的方法，其中降低或预防CRS且该方法导致该患者的肿瘤体积减少。
143.如条款1至142中任一项的方法，其中降低或预防因为CRS所致的体重损失。
144.如条款59至67中任一项的方法，其还包括向该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐。
145.如条款144的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐的随后施用造成该患者中CAR T细胞活化及细胞因子水平的增加。
146.如条款1至145中任一项的方法，其中该癌症包括肿瘤且其中获得对该肿瘤的完全反应。
147.如条款1至146中任一项的方法，其中所述CAR T细胞具有中枢记忆/效应记忆表型。
148.如条款1至147中任一项的方法，其中所述CAR T细胞的该CD8:CD4比率为约1:1。
附图说明
图1图解法显示E2构建体相对于4M5.3构建体且显示E2构建体的图谱。
图2显示EC17固定剂量及剂量递减图。
图3A及3B显示随着EC17剂量递减的E2-CAR-T抗肿瘤活性(30百万个细胞)及体重变化。如所示，在NaFL救援后维持抗肿瘤活性。
图4A及4B显示随着EC17剂量递减的4M5.3-CAR-T抗肿瘤活性(30百万个细胞)及体重变化。如所示，4M5.3-CAR-T的活性低于E2-CAR-T。此外，观察到EC17剂量依赖性抗肿瘤活性及体重损失。
图5A及5B显示在固定EC17给药方案(500 nmol/kg，SIW)下的E2-CAR-T抗肿瘤活性(10及20百万个细胞)及体重变化。如所示，在NaFL救援后维持抗肿瘤活性。
图6A及6B显示在固定EC17给药方案(500 nmol/kg，SIW)下的4M5.3-CAR-T抗肿瘤活性(10及20百万个细胞)及体重变化。如所示，4M5.3-CAR-T的活性低于E2-CAR-T。
图7A及7B显示在输注至NSG小鼠之前E2 CAR T细胞的表型表征。
图8A及8B显示不同制剂中的CAR-T分化表型的比较，所述制剂包含E2-CAR-T细胞及4M5.3-CAR-T细胞，及GFP + 4M5.3 CAR-T细胞。
图9A及9B显示DIG标记的E2-IgG与FITC的结合。
图10A及10B显示FITC标记的KB细胞上的DIG标记的E2抗体的IHC染色。
图11显示正常人类器官组织：肾上腺中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图12显示正常人类器官组织：骨髓中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图13显示正常人类器官组织：乳房中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图14显示正常人类器官组织：小脑组织中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图15显示正常人类器官组织：子宫颈中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图16显示正常人类器官组织：结肠中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图17显示正常人类器官组织：食道中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图18显示正常人类器官组织：眼睛中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图19显示正常人类器官组织：心脏中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图20显示正常人类器官组织：脑垂体中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图21显示正常人类器官组织：肾脏中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图22显示正常人类器官组织：喉中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图23显示正常人类器官组织：脾中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图24显示正常人类器官组织：肝中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图25显示正常人类器官组织：肺中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图26显示正常人类器官组织：淋巴结中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图27显示正常人类器官组织：神经中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图28显示正常人类器官组织：卵巢中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图29显示正常人类器官组织：胰脏中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图30显示正常人类器官组织：前列腺中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图31显示正常人类器官组织：皮肤中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图32显示正常人类器官组织：小肠中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图33显示正常人类器官组织：胃中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图34显示正常人类器官组织：横纹肌中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图35显示正常人类器官组织：睾丸中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图36显示正常人类器官组织：胸腺中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图37显示正常人类器官组织：舌中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图38显示正常人类器官组织：子宫中的结合的DIG-E2抗体的IHC染色。图A：用DIG-E2抗体预培育的测试组织切片；图B：不用DIG-E2抗体预培育的对照组织切片。
图39为显示在与各种靶细胞的一天共培养物中的T-细胞活化的图。将在一天共培养后活化的E2 CAR T细胞的百分比(y轴)对靶细胞在测定时间的FR表达水平(x轴)作图。(▼) OV90细胞；(♦) SKOV3细胞；(▲) IGROV1细胞；(■) HOS-Frα细胞；(●) MDA-MB-231细胞。
图40为显示在三种不同条件下，在与5种不同细胞类型(OV90细胞、SKOV3细胞、IGROV1细胞、HOS-Frα细胞、MDA-MB-231细胞)的2天共培养物中的靶细胞凋亡的图。针对各细胞类型，条件如下：左条单独靶细胞+EC17；中间条CAR T加无EC17预处理的靶细胞共培养物；右条CAR T加具有EC17预处理的经处理的靶细胞。
图41为显示5种不同细胞类型(OV90细胞、SKOV3细胞、IGROV1细胞、HOS-Frα细胞、MDA-MB-231细胞)中的功能叶酸受体表达水平的图。
图42为显示针对荷瘤及初始(naïve)小鼠的实验时间线的草图。
图43 (左图)为显示初始及荷瘤小鼠二者中的细胞因子IFN-Ɣ的水平是EC-17依赖性，且初始小鼠中的IFN-Ɣ的增加相较于荷MDA-MB-231肿瘤的小鼠低许多(低23倍)的图。图43 (右图)为显示荷MDA-MB-231肿瘤的小鼠中的FACS分析CAR-T扩增及在初始小鼠中无可检测的CAR-T细胞扩增的图。
图44 (上图)为显示以下的图：在与阳性对照细胞系K562-OKT3的共培养物中，来自模拟物 T-细胞及抗FLCAR T-细胞的细胞因子(IL-2)产生在数量上相似的水平(左对条，其中模拟物是左条及抗FLCAR T-细胞是右条)；与K562共培养后模拟物或抗FLCAR T-细胞不产生细胞因子(中间)；及抗FLCAR T-细胞是能引起细胞因子IL-2分泌的唯一细胞，但是仅在用EC-17预处理的情况下(右，其中仅抗FLCAR T-细胞显示结果)。图44 (中图)为显示以下的图：在与阳性对照细胞系K562-OKT3共培养物中，来自模拟物 T-细胞及抗FLCAR T-细胞的细胞因子(IFN-Ɣ)产生在数量上相似的水平(左对条，其中模拟物是左条及抗FLCART-细胞是右条)；与K562共培养后模拟物或抗FLCAR T-细胞不产生细胞因子(中间)；及抗FLCAR T-细胞是能引起细胞因子IFN-Ɣ分泌的唯一细胞，但是仅在用EC-17预处理的情况下(右，其中仅抗FLCAR T-细胞显示结果)。图44 (下图)为显示以下的图：在与阳性对照细胞系K562-OKT3共培养物中，来自模拟物 T-细胞及抗FLCAR T-细胞的细胞因子(TNF-α)产生在数量上相似的水平(左对条，其中模拟物是左条及抗FLCAR T-细胞是右条)；与K562共培养后模拟物或抗FLCAR T-细胞不产生细胞因子(中间)；及抗FLCAR T-细胞是能引起细胞因子TNF-α分泌的唯一细胞，但是仅在用EC-17预处理的情况下(右，其中仅抗FLCAR T-细胞显示结果)。
图45 (上左)为显示当CD8+ 模拟物 T细胞及抗FLCAR T-细胞与阴性对照K562细胞以30:1、10:1、3:1或1:1的比率共培养时，裂解百分比的图。图45 (上右)为显示当CD8+模拟物 T细胞及抗FLCAR T-细胞与K562+OKT3靶细胞以30:1、10:1、3:1或1:1的比率共培养时，裂解百分比的图。图45 (下左)为显示当CD8+ 模拟物 T细胞及抗FLCAR T-细胞与未标记的MDA-MB-231细胞以30:1、10:1、3:1或1:1的比率共培养时，裂解百分比的图。图45 (下右)为显示当CD8+ 模拟物 T细胞及抗FLCAR T-细胞与EC17标记的MDA-MB-231细胞以30:1、10:1、3:1或1:1的比率共培养时，裂解百分比的图。在所有图中，(x) CD8+ 模拟物 T细胞；(○)抗FLCAR T-细胞。
图46 (上)显示FITC-叶酸的化学结构。图46 (下)为显示FITC-叶酸的剂量反应曲线的图。
图47 (上)显示FITC-DUPA的化学结构。图47 (下)为显示FITC-DUPA的剂量反应曲线的图。
图48 (上)显示FITC-CA9的化学结构。图48 (下)为显示FITC-CA9的剂量反应曲线的图。
图49 (上)显示FITC-NK1R的化学结构。图49 (下)为显示FITC- NK1R的剂量反应曲线的图。
图50显示桥与体内模型中使用且表达对应于桥的小分子配体的受体的肿瘤细胞的结合(经由FACS分析)。
图51显示EC17诱导的经由CAR T细胞的强效FR依赖性肿瘤细胞杀死。
图52显示CAR T细胞的细胞裂解活性与肿瘤细胞上的功能FR水平的相关性。
图53显示EC17/FR依赖性CAR T细胞活化及耗尽。显示在与无或利用EC17 (100nM，在37℃下，30分钟脉冲)预负载的FR+肿瘤细胞靶共培养(E/T = 1:1)的CAR T细胞上检测到的早期(CD69)、中间(CD137)及晚期(PD1) T细胞活化标记物的表达。前两个开口条表示仅CAR-T及模拟物转导的T细胞而没有靶细胞。对于第二至第四图的图例从上至下 = 从左至右的条。
图54显示EC17/FR依赖性CAR T细胞耗尽谱图。上行：彩色饼状图，其表示在第0至3天，CAR-T细胞在无靶细胞的培养物中的分化状态的变化。下行：四组彩色饼状图，其表示在与无或利用EC17 (0.1或10 nM，在37℃下，30分钟脉冲)预负载的FR+ (MDA-MB-231、THP-1FRβ、HOS-FRα、KB)及FR阴性(THP1-FG12，HOS-143b)肿瘤细胞共培养(E/T = 1:2) 3天后，CAR-T细胞的分化状态。
图55显示由以下构成的全人类CAR构建体：抗FITC scFv (克隆E2)、全长IgG4间隔子(源自Fc的铰链-CH2 (L235D，N297Q)-CH3)、CD28tm跨膜结构域、4-1BB/CD3ζ细胞质活化结构域及非功能性的表皮生长因子受体的缩短的细胞表面多肽(EGFRt)。底部：经由流式细胞术在经EGFRt分选的(左边饼状图) CAR-T细胞制剂及未经分选的“临床传真”(右边饼状图)上进行的CD4/CD8 T细胞表型分析的实例。颜色符号说明如图所示。
图56，图A：在37℃下培育2小时后，由FR+靶细胞的3H-EC17摄取的Kd值(从结合的分子数目/细胞计算而来)。图B：在室温下培育2小时后，由E2-CAR-T细胞(约24% EGFRt+，约95:5 CD8/CD4比率)的3H-EC17摄取的Kd值(从总细胞相关的放射性计算，DPM)。
图57 (图A及B)显示CRS分级量表及适用于荷HOS-FRα瘤小鼠中的荧光素钠救援的实验条件。显示具有及不具有救援的情况下，源自T细胞的细胞因子的变化。经由学生t-测试(Student's t-test)计算p值。
图58显示经由基于3H-FA (叶酸)的结合测定(100 nM，在37℃下1小时)测量的肿瘤细胞上的功能FR水平。
图59显示(图A)以1:1 E/T (效应子/靶标)比率与经EGFRt分选的CAR-T细胞共培养24小时的5种FR (叶酸受体)+肿瘤细胞系的特异性裂解(%)中的全范围EC17剂量反应；(图B)从拟合至100 nM的剂量-反应曲线获得最大裂解(%)及EC50值。
图60显示CAR-T细胞活性与FR水平及肿瘤细胞的天然敏感性的相关性。图A：在10nM EC17的存在下，在16及48小时共培养后，FR+ (MDA-MB-231、KB、THP1-FRβ、OV90、HOS-FRα)及FR阴性(HOS-143b)细胞系中，在不同/T比率下的特异性裂解(%)的动力学。图B：靶细胞的特异性裂解(%)对线性范围的E/T比率作图。高FR+ KB细胞证实在16小时时的早期抗性，而FR阴性HOS-143b无法作出反应。图C：排除KB细胞，在16小时的共培养时的特异性裂解(%)与肿瘤细胞上的功能FR水平之间建立半对数相关性。图D：描绘在10 nM EC17下共培养44小时后，源自CAR-T细胞的Th1细胞因子 (IFNγ、IL-2及TNFα)水平与变化的E/T比率之间的关系的3D图。图E：源自CAR-T细胞的Th1细胞因子水平对FR+靶细胞的FR水平以Log10标度作图。
图61显示(图A)条图，该图显示经由流式细胞术证实且表示为MFI的靶细胞的EC17负载状态(EC17在FR阴性细胞系上是不可检测的)及(图B)如图54中所述的共培养2天后，经由膜联蛋白V染色检测到的靶细胞凋亡(%)。
图62显示CAR-T细胞在体内的药物动力学及肿瘤摄取。图A：实验布局的示意图，以显示荷MDA-MB-231瘤小鼠中与CAR-T细胞注射及每周EC17剂量(500 nmol/kg)相关的动物收集时程表。总共15只小鼠在第0天接受约4.8百万个经EGFRt分选的CAR-T细胞(3只小鼠开始时具有大肿瘤)。图B：左图显示肿瘤体积及体重变化的测量；中图显示在EC17的单剂量7天后，血液中的CAR-T细胞扩增；右条图显示在具有小及较大肿瘤的小鼠中的循环CD4/CD8CAR-T细胞子集的分化谱图。图C：肿瘤体积及体重的变化的测量。图D：上图显示血液中的CAR-T细胞动力学(实线)相对于肿瘤的CAR-T细胞动力学(虚线)。底条图显示血液中的CAR-T细胞表型的变化。图E：肿瘤浸润CAR-T细胞上的活化标记物(4-1BB，PD1)的表面表达的动力学变化。
图63显示饮食叶酸对抗肿瘤活性及CRS毒性的影响。图A：利用大MDA-MB-231肿瘤异种移植及用CAR-T细胞(~10百万“临床传真”)加上EC17 SIW以500 nmol/kg处理同时在整个研究(n = 5)中维持FA充足或FA缺乏饮食的NSG小鼠的肿瘤体积及体重的变化的测量。图B：条图显示在研究结束时，分别在第52天(FA缺乏)及第59天(FA充足)测量的循环CAR-T细胞(人类CD3ε+ EGFRt+)。图C：代表性流式细胞术点图，显示仅用CAR-T细胞(无EC17)处理的FA缺乏小鼠中的循环CAR-T细胞不存在及用CAR-T细胞加上EC17处理的FA缺乏饮食的小鼠中的循环CAR-T细胞数目相较于相同处理但是FA充足饮食的小鼠增加。图D：在第59天自FA充足动物收集的MDA-MB-231肿瘤中有2/3检测到FR表达的损失及经由流式细胞术进行分析(后期经由定量放射性配体结合测定证实，数据未显示)。
定义
如本文中所用，“一(a/an)”可意指一个或多个。如本文中所用，提及数值(包括例如整数、分数及百分比)的“约”一般是指本领域普通技术人员将认为等效于所述值(例如，具有相同功能或结果)的数值范围(例如，所述值的+/- 5%至10%)。
如本文中所用，术语“治疗(treat/treating/treated/treatment)”是指治疗性治疗及预防性(prophylactic/preventative)治疗二者。
如本文中所用，提及癌症的术语“改善(ameliorate/ameliorating/amelioration/ameliorated)”可意指减少癌症的症状，减少肿瘤的大小，完全或部分移除肿瘤(例如，完全或部分反应)，造成稳定疾病，预防癌症的进展(例如，无进展存活)或医师认为是癌症的治疗性、预防性(prophylactic/preventative)治疗的对癌症的任何其他效应。
如本文中所用，术语“施用(administer/administering/administered)”意指将化合物或其药学上可接受的盐或CAR T细胞组合物(其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)引入患者的所有方式，其包括但不限于经口、静脉内、肌肉内、皮下及透皮。
如本文中所用，术语“脱靶毒性”意指为治疗患者的医师不可接受的器官损伤或患者的体重降低，或为治疗患者的医师不可接受的对患者的任何其他效应，例如，B细胞发育不全、发烧、血压下降或肺水肿。
如本文中所用，术语“转导”及“转染”等效使用且所述术语意指经由任何人工方法(包括病毒及非病毒方法)将核酸引入细胞。
具体实施方式
在本文中所述的各种实施方案中，使用经由接头连接至靶向部分的小分子配体作为癌症与CAR T细胞(即，表达嵌合抗原受体的T细胞)之间的桥，其中所述CAR T细胞包含指向靶向部分的经基因工程改造的CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。该桥将CAR T细胞指向癌症以改善癌症。在一个实施方案中，“小分子配体”可为叶酸类化合物、CAIX配体、DUPA、NK-1R配体、γ谷氨酰基转肽酶的配体、NKG2D配体或CCK2R配体，其各自为特异性结合至癌细胞类型的小分子配体(即，这些配体中每一种的受体相较于正常组织在癌症上过表达)。
连接至小分子配体的“靶向部分”结合至由CAR T细胞表达的经基因工程改造的CAR的识别区，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。因此，CAR的识别区(例如，E2抗荧光素抗体的单链片段可变区(scFv))指向“靶向部分”。因此，经由接头连接至靶向部分的小分子配体充当癌症与CAR T细胞之间的桥，其中所述CAR T细胞包含经基因工程改造的CAR，将CAR T细胞指向癌症以改善癌症。
该桥为有机小分子，因此可快速达成自血流清除(例如，约20分钟或更少)。一方面，该CAR T细胞反应(其中所述CAR T细胞包含经基因工程改造的CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)可仅靶向表达“桥”的小分子配体部分的受体的那些癌细胞，从而降低对正常组织的脱靶毒性。此外，此系统可以是“通用的”，因为一种类型的CAR T细胞构建体(其中该CAR T细胞包含E2抗荧光素抗体片段)可用于使用不同“桥”靶向各种癌症。说明性地，被CART细胞识别的靶向部分(其中该CAR T细胞包含经基因工程改造的CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)可维持恒定，使得可使用一种类型的CAR T细胞，同时可改变结合至癌症的小分子配体以允许靶向宽泛种类的癌症。
在本文中所述的各种实施方案中，经由接头连接至靶向部分的小分子配体称作“化合物”。
在各个实施方案中，从句“E2抗荧光素抗体片段”意指包含E2抗荧光素抗体的片段(例如，scFv片段)的CAR。该E2抗荧光素抗体述于例如Vaughan等人，Nature Biotechnol.第14卷(3)，第309至314页，1996中，其通过引用并入本文中。在各个实施方案中，该CAR可进一步包含IgG4铰链结构域、CD3ζ活化结构域、及/或4-1BB共刺激结构域、或任何其他适宜结构域(诸如EGFRt结构域)。在仍其他实施方案中，该CAR可经由具有与SEQ ID NO: 1至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%同一性的多核苷酸编码。在另一说明性实施方案中，该CAR可经由在高度严格条件下与具有SEQ ID NO: 1的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。在仍另一方面，该CAR可经由具有SEQ ID NO: 1的多核苷酸或经由SEQ IDNO: 1的简并变体编码。在其他实施方案中，该CAR蛋白质序列可具有与SEQ ID NO: 2至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在又另一个实施方案中，该CAR蛋白质序列可具有至多约50个保守氨基酸取代。在本文中所述的实施方案中的任一者中，该CAR结合荧光素。
在一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向该患者施用第一剂量的CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CAR T细胞包含CAR，且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，及iii)向该患者施用第二剂量的该CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CAR T细胞包含CAR，且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体，及ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，且其中该CAR T细胞组合物包含所述CAR T细胞及非转化T细胞的混合物。
在又另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i) 对患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向该患者施用CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CART细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，及iii)向该患者施用叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制CAR T细胞的活化的药物。
在另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体，且其中该化合物或其药学上可接受的盐以约10 nmol/kg患者体重至约2500 nmol/kg患者体重的剂量施用，及ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，且其中所述CAR T细胞的剂量为约1百万个CAR T细胞至约15百万个CAR T细胞。
在仍另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者连续施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，及iii)终止该化合物或其药学上可接受的盐的连续施用，以抑制或预防患者的细胞因子释放综合征。
在另一说明性方面，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体，其中对该患者施用至少第一剂量及第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一剂量与该第二剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约2倍至约15000倍，及ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体且其中每周一次向该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐，及ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在又另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向该患者施用至少第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低于该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量至少约50%；及iii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物的剂量，其中所述CAR T细胞包含CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
经由以下列举的条款描述若干实施方案。亦涵盖下列实施方案中的任一者与本专利申请的发明内容部分、具体实施方案部分、实施例部分或本专利申请的权利要求书中所述的任何可适用实施方案组合。
1．一种治疗癌症的方法，该方法包括：
i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体；
ii)向该患者施用第一剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向该靶向部分的CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段；及
iii)向该患者施用第二剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向该靶向部分的CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
2.一种治疗癌症的方法，该方法包括：
i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体；及
ii)向该患者施用CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CAR T细胞包含指向该靶向部分的CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，且其中该CAR T细胞组合物包含所述CAR T细胞及非转化T细胞的混合物。
3.一种治疗癌症的方法，该方法包括：
i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体；
ii)向该患者施用CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CAR T细胞包含指向该靶向部分的CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段；及
iii)向该患者施用叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制CAR T细胞的活化的药剂。
4.如条款3的方法，其中步骤iii包括施用叶酸类化合物。
5.如条款3或4中任一项的方法，其中步骤iii包括施用叶酸或甲酰四氢叶酸。
6.如条款3的方法，其中步骤iii包括施用该包含叶酸类化合物的缀合物。
7.如条款6的方法，其中该包含叶酸类化合物的缀合物包括连接至一个或多个氨基酸的叶酸类化合物。
8.如条款7的方法，其中该包含叶酸类化合物的缀合物具有下式
Figure 189475DEST_PATH_IMAGE005
。
9.如条款3至8中任一项的方法，其中该叶酸类化合物具有下式
Figure 74255DEST_PATH_IMAGE002
其中X1及Y1各自独立地选自卤素、R2、OR2、SR3及NR4R5；
U、V及W表示二价部分，其各自独立地选自-(R6a)C=、-N=、-(R6a)C(R7a)-及-N(R4a)-；Q选自C及CH；T选自S、O、N及-C=C-；
X2及X3各自独立地选自以下：氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R4b)-、-C(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)O-、-N(R4b)C(Z)N(R5b)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R4a)S(O)2-、-C(R6b)(R7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH2C≡CH)-、C1-C12亚烷基及C1-C12亚烷氧基，其中Z为氧或硫；
R1选自氢、卤素、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基；
R2、R3、R4、R4a、R4b、R5、R5b、R6b及R7b各自独立地选自以下：氢、卤素、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12酰基、C1-C12烯基、C1-C12炔基、(C1-C12烷氧基)羰基及(C1-C12烷基氨基)羰基；
R6及R7各自独立地选自氢、卤素、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基；或R6与R7一起形成羰基；
R6a及R7a各自独立地选自氢、卤素、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基；或R6a与R7a一起形成羰基；
p、r、s及t各自独立地为0或1；且
*表示连接至该缀合物的其余部分的可选共价键。
10.如条款3的方法，其中施用抑制CAR T细胞的活化的药剂且其选自以下：淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、IL-2可诱导T细胞激酶抑制剂、JAK抑制剂、BTK抑制剂、EC2319、及阻断CAR T细胞结合至该化合物或其药学上可接受的盐，但是不结合至该癌症的药剂。
11.如条款10的方法，其中施用抑制CAR T细胞的活化的药剂且该药剂为淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶抑制剂。
12.如条款11的方法，其中该淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶抑制剂为达沙替尼。
13.如条款10的方法，其中施用抑制CAR T细胞的活化的药剂且该药剂为PI3激酶抑制剂。
14.如条款13的方法，其中该PI3激酶抑制剂为GDC0980。
15.如条款10的方法，其中施用抑制CAR T细胞的活化的药剂且该药剂为IL-2可诱导T细胞激酶抑制剂。
16.如条款15的方法，其中该IL-2可诱导T细胞激酶抑制剂为BMS-509744。
17.如条款10的方法，其中施用抑制CAR T细胞的活化的药剂且其为阻断CAR T细胞结合至该化合物或其药学上可接受的盐，但是不结合至该癌症的药剂。
18.如条款17的方法，其中该药剂为荧光素胺、FITC或荧光素钠。
19.如条款18的方法，其中该药剂为FITC。
20.如条款18的方法，其中该药剂为荧光素钠。
21.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.01至约300 μmol/kg患者体重的剂量施用。
22.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约100 μmol/kg患者体重的剂量施用。
23.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约90 μmol/kg患者体重的剂量施用。
24.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约80 μmol/kg患者体重的剂量施用。
25.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约70 μmol/kg患者体重的剂量施用。
26.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约60 μmol/kg患者体重的剂量施用。
27.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约50 μmol/kg患者体重的剂量施用。
28.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约40 μmol/kg患者体重的剂量施用。
29.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约30 μmol/kg患者体重的剂量施用。
30.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约20 μmol/kg患者体重的剂量施用。
31.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约10 μmol/kg患者体重的剂量施用。
32.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约8 μmol/kg患者体重的剂量施用。
33.如条款17至20中任一项的方法，其中该抑制CAR T细胞的活化的药剂以约.06至约6 μmol/kg患者体重的剂量施用。
34.如条款3至33中任一项的方法，其中向该患者施用超过一个剂量的该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂。
35.如条款3至34中任一项的方法，其中在该化合物或其药学上可接受的盐之前及/或之后，向该患者施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂。
36.如条款3至35中任一项的方法，其中该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂的施用造成患者中的细胞因子水平的降低。
37.如条款36的方法，其中在向该患者施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂后约3小时，发生该细胞因子水平的降低。
38.如条款36的方法，其中在向该患者施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂后约6小时，发生该细胞因子水平的降低。
39.如条款36至38中任一项的方法，其中细胞因子水平的降低为降低至将近未经治疗的患者中的细胞因子水平。
40.如条款3至39中任一项的方法，其中在施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂之前及随后施用该化合物或其药学上可接受的盐。
41.如条款3至40中任一项的方法，其中在施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂后，该患者的血液中CAR T细胞数目增加，即使该患者中的细胞因子水平降低。
42.如条款3至41中任一项的方法，其中在施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂后，相对于未用救援剂治疗的患者，增强或维持CAR T细胞活化，即使经治疗的患者中的细胞因子水平降低。
43.如条款3至42中任一项的方法，其中该癌症包括肿瘤及当向该患者施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂时，该患者的肿瘤大小不增加。
44.如条款43的方法，其中获得对该肿瘤的完全反应。
45.如条款3至44中任一项的方法，其中当该CRS等级达到1、2、3或4时，向该患者施用该叶酸类化合物、该包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或该抑制CAR T细胞的活化的药剂。
46.如条款45的方法，其中当该CRS等级达到3或4时，向该患者施用抑制CAR T细胞的活化的药剂。
47.如条款3至46的方法，其中肺水肿减少。
48.如条款1至47中任一项的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐以约10nmol/kg患者体重至约2500 nmol/kg患者体重的剂量施用；且所述CAR T细胞的剂量为约1百万个CAR T细胞至约15百万个CAR T细胞。
49.如条款48的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐以约10 nmol/kg患者体重至约100 nmol/kg患者体重的剂量施用。
50.如条款48至49中任一项的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐以约10nmol/kg患者体重至约50 nmol/kg患者体重的剂量施用。
51.如条款48至50中任一项的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐以约10nmol/kg患者体重至约20 nmol/kg患者体重的剂量施用。
52.如条款48的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐以约10 nmol/kg患者体重至约600 nmol/kg患者体重的剂量施用。
53.如条款48的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐以约200 nmol/kg患者体重至约600 nmol/kg患者体重的剂量施用。
54.如条款48的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐以约400 nmol/kg患者体重至约600 nmol/kg患者体重的剂量施用。
55.如条款48至54中任一项的方法，其中所述CAR T细胞的剂量为约1百万个CAR T细胞至约12.5百万个CAR T细胞。
56.如条款48至55中任一项的方法，其中所述CAR T细胞的剂量为约1百万个CAR T细胞至约7百万个CAR T细胞。
57.如条款48至56中任一项的方法，其中所述CAR T细胞的剂量为约1百万个CAR T细胞至约5百万个CAR T细胞。
58.如条款48至57中任一项的方法，其中所述CAR T细胞的剂量为约2百万个CAR T细胞至约5百万个CAR T细胞。
59.如条款1至58中任一项的方法，其还包括终止该化合物或其药学上可接受的盐的连续施用，以抑制或预防该患者的细胞因子释放综合征的步骤。
60.如条款1至59中任一项的方法，其中向该患者连续施用该化合物或其药学上可接受的盐至少一小时。
61.如条款1至59中任一项的方法，其中对该患者连续施用该化合物或其药学上可接受的盐至少四小时。
62.如条款1至59中任一项的方法，其中对该患者连续施用该化合物或其药学上可接受的盐至少六小时。
63.如条款1至62中任一项的方法，其中每隔一天向该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐。
64.如条款1至62中任一项的方法，其中每周三次向该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐。
65.如条款1至62中任一项的方法，其中每周两次向该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐。
66.如条款1至62中任一项的方法，其中每周一次向该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐。
67.如条款1至62中任一项的方法，其中对该患者施用化合物或其药学上可接受的盐直至发生该患者的体重的不可接受的损失、发烧、血压下降或肺水肿。
68.一种治疗癌症的方法，该方法包括：
i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体，其中对该患者施用至少第一剂量及第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一剂量与该第二剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约2倍至约15000倍；及
ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向该靶向部分的CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
69.如条款68的方法，其中向该患者施用至少第一剂量、第二剂量及第三剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一剂量、该第二剂量及该第三剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约2倍至约750倍，且其中该第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约800倍至约10000倍。
70.如条款68的方法，其中对该患者施用至少第一剂量、第二剂量、第三剂量及第四剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一剂量、该第二剂量、该第三剂量及该第四剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约2倍至约750倍，其中该第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约800倍至约7500倍，且其中该第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约8000倍至约15000倍。
71.如条款70的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约100倍，其中该第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约1000倍，且其中该第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约10000倍。
72.如条款68的方法，其中向该患者施用至少第一剂量及第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一剂量与该第二剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约2倍至约15000倍。
73.一种治疗癌症的方法，该方法包括：
i)向患者施用第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体；
ii) 对该患者施用至少第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约50%；及
iii)向该患者施用一个剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向该靶向部分的CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
74.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约60%。
75.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约70%。
76.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约80%。
77.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约90%。
78.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约95%。
79.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约96%。
80.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约97%。
81.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约98%。
82.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约99%。
83.如条款73的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约99.5%。
84.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约100 nmol/kg患者体重至约1000 nmol/kg患者体重。
85.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约100 nmol/kg患者体重至约900 nmol/kg患者体重。
86.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约100 nmol/kg患者体重至约800 nmol/kg患者体重。
87.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约100 nmol/kg患者体重至约700 nmol/kg患者体重。
88.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约100 nmol/kg患者体重至约600 nmol/kg患者体重。
89.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约200 nmol/kg患者体重至约600 nmol/kg患者体重。
90.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约400 nmol/kg患者体重至约600 nmol/kg患者体重。
91.如条款73至83中任一项的方法，其中该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约500 nmol/kg患者体重。
92.如条款84的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmol/kg患者体重至约500 nmol/kg患者体重。
93.如条款85的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmol/kg患者体重至约450 nmol/kg患者体重。
94.如条款86的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmol/kg患者体重至约400 nmol/kg患者体重。
95.如条款87的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmol/kg患者体重至约350 nmol/kg患者体重。
96.如条款88的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约0.5nmol/kg患者体重至约300 nmol/kg患者体重。
97.如条款89的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约1nmol/kg患者体重至约300 nmol/kg患者体重。
98.如条款90的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约2nmol/kg患者体重至约300 nmol/kg患者体重。
99.如条款91的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约2nmol/kg患者体重至约250 nmol/kg患者体重。
100.如条款92至99中任一项的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约5 nmol/kg患者体重至约40 nmol/kg患者体重。
101.如条款92至99中任一项的方法，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐为约40 nmol/kg患者体重至约150 nmol/kg患者体重。
102.如条款73至101中任一项的方法，其还包括施用第三剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐与该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐相同。
103.如条款102的方法，其还包括施用第四剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐与该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐及该第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐相同。
104.如条款73至103中任一项的方法，其中在该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐后施用的一个或多个剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，相对于该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐维持抑制该癌症的生长。
105.如条款73至104中任一项的方法，其中所述CAR T细胞以约1百万个CAR T细胞至约40百万个CAR T细胞的剂量施用。
106.如条款73至105中任一项的方法，其中每周一次施用在该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐后施用的一个或多个剂量的该化合物或其药学上可接受的盐。
107.如条款73至105中任一项的方法，其中每周两次施用所述一个或多个剂量的化合物或其药学上可接受的盐。
108.如条款1至107中任一项的方法，其中该CAR还包含IgG4铰链结构域、CD3ζ活化结构域及4-1BB共刺激结构域。
109.如条款1至108中任一项的方法，其中该E2抗荧光素抗体片段为scFv片段。
110.如条款1至109中任一项的方法，其中该CAR蛋白质序列具有与SEQ ID NO: 2至少约90%同一性。
111.如条款1至109中任一项的方法，其中该CAR蛋白质序列具有与SEQ ID NO: 2至少约95%同一性。
112.如条款1至109中任一项的方法，其中该CAR蛋白质序列具有与SEQ ID NO: 2至少约98%同一性。
113.如条款1至112中任一项的方法，其中该CAR结合荧光素。
114.如条款1至109中任一项的方法，其中该CAR蛋白质序列具有至多约50个保守氨基酸取代且其中该CAR结合荧光素。
115.如条款1至109中任一项的方法，其中该CAR由具有与SEQ ID NO: 1至少约90%同一性的多核苷酸编码。
116.如条款1至109中任一项的方法，其中该CAR由具有与SEQ ID NO: 1至少约95%同一性的多核苷酸编码。
117.如条款1至109中任一项的方法，其中该CAR由具有与SEQ ID NO: 1至少约98%同一性的多核苷酸编码。
118.如条款115至117中任一项的方法，其中该CAR结合荧光素。
119.如条款1至118中任一项的方法，其中该CAR由在高度严格条件下与具有SEQID NO: 1的多核苷酸杂交的多核苷酸编码且其中该CAR结合荧光素。
120.如条款1至119中任一项的方法，其中该CAR由具有SEQ ID NO: 1的多核苷酸或由SEQ ID NO: 1的简并变体编码。
121.如条款1至120中任一项的方法，其中该配体选自以下：叶酸类化合物、DUPA、NK-1R配体、CAIX配体、γ谷氨酰基转肽酶配体、NKG2D配体、及CCK2R配体。
122.如条款1至121中任一项的方法，其中该靶向部分为荧光素或其药学上可接受的盐。
123.如条款1至122中任一项的方法，其中该接头包括聚乙二醇(PEG)、聚脯氨酸、亲水性氨基酸、糖、非天然肽聚糖、聚乙烯吡咯啶酮、普兰尼克F-127、或其组合。
124.如条款1至123中任一项的方法，其中该接头包括PEG。
125.如条款1至124中任一项的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐具有下式
Figure 341288DEST_PATH_IMAGE003
，
其中B表示该小分子配体，L表示该接头，且T表示该靶向部分，且其中L包括具有下式的结构
Figure 540188DEST_PATH_IMAGE004
其中n为0至200的整数。
126.如条款1至125中任一项的方法，其中该癌症选自以下：肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头癌、颈癌、皮肤黑色素瘤、眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌(endometrialcancer)、直肠癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌(carcinomaof the endometrium)、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、非小细胞肺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、尿道癌、前列腺癌、慢性白血病、急性白血病、急性骨髓细胞性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、骨髓性白血病、骨髓单核细胞性白血病、毛细胞白血病、骨髓单核细胞性白血病、毛细胞白血病、胸膜间皮瘤、膀胱癌、伯基特氏淋巴瘤、输尿管癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、及胃食管接合部腺癌。
127.如条款1至126中任一项的方法，其中该癌症为表达叶酸受体的癌症。
128.如条款1至127中任一项的方法，其中该癌症为子宫内膜癌。
129.如条款1至127中任一项的方法，其中该癌症为非小细胞肺癌。
130.如条款1至127中任一项的方法，其中该癌症为卵巢癌。
131.如条款1至127中任一项的方法，其中该癌症为三阴性乳腺癌。
132.如条款1至127中任一项的方法，其中该癌症为急性骨髓细胞性白血病。
133.如条款132的方法，其中该癌症表达该叶酸受体-β。
134.如条款1至133中任一项的方法，其中施用多个剂量的该CAR T细胞组合物。
135.如条款1至134中任一项的方法，其中施用至少两个剂量的该CAR T细胞组合物。
136.如条款1至135中任一项的方法，其中在施用该化合物或其药学上可接受的盐之前，或在施用该CAR T细胞组合物之前，对该患者成像。
137.如条款1至136中任一项的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐不是抗体，且不包含抗体片段。
138.如条款1至137中任一项的方法，其中该靶向部分不包含肽表位。
139.如条款1至138中任一项的方法，其中不发生导致该患者中的脱靶毒性的细胞因子释放且其中发生对该癌症的CAR T细胞毒性。
140.如条款1至138中任一项的方法，其中该患者中不发生脱靶组织毒性且其中发生对该癌症的CAR T细胞毒性。
141.如条款1至138中任一项的方法，其中该癌症包括肿瘤，其中该患者的肿瘤大小减少，且其中不发生脱靶毒性。
142.如条款1至141中任一项的方法，其中降低或预防CRS且该方法导致该患者的肿瘤体积减少。
143.如条款1至142中任一项的方法，其中降低或预防因为CRS所致的体重损失。
144.如条款59至67中任一项的方法，其还包括向该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐。
145.如条款144的方法，其中该化合物或其药学上可接受的盐的随后施用造成该患者中的CAR T细胞活化及细胞因子水平的增加。
146.如条款1至145中任一项的方法，其中该癌症包括肿瘤且其中获得对该肿瘤的完全反应。
147.如条款1至146中任一项的方法，其中所述CAR T细胞具有中枢记忆/效应记忆表型。
148.如条款1至147中任一项的方法，其中所述CAR T细胞的该CD8:CD4比率为约1:1。
因此，在一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i) 向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体；ii)向该患者施用第一剂量的CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CAR T细胞包含CAR，且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段；及iii)向该患者施用第二剂量的该CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CAR T细胞包含CAR，且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体，及ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，且其中该CAR T细胞组合物包含所述CAR T细胞及非转化T细胞的混合物。
在又另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向该患者施用CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CART细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，及iii)向该患者施用叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制CAR T细胞的活化的药物。
在另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体，且其中该化合物或其药学上可接受的盐以约10 nmol/kg患者体重至约2500 nmol/kg患者体重的剂量施用，及ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，且其中所述CAR T细胞剂量为约1百万个CAR T细胞至约15百万个CAR T细胞。
在仍另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者连续施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，及iii)终止该化合物或其药学上可接受的盐的连续施用，以抑制或预防患者的细胞因子释放综合征。
在另一说明性方面，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体，其中对该患者施用至少第一剂量及第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一剂量与该第二剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约2倍至约15000倍，及ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体且其中每周一次对该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐，及ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在又另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向该患者施用至少第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量低于该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量至少约50%；及iii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物的剂量，其中所述CAR T细胞包含CAR且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
因此，在前段及以上列出的条款中提供各种实施方案，及在此“具体实施方式”、发明内容部分、实施例及权利要求书中所述的所有可适用实施方案适用于此类实施方案。
如本文中所述，“患者”可为人类或在兽医应用的情况下，患者可为实验室、农业、家养或野生动物。在各个方面，患者可为实验室动物(诸如龋齿类动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔、猴、黑猩猩)、家养动物(诸如狗、猫或兔)、农业动物(诸如牛、马、猪、绵羊、山羊)或被俘野生动物(诸如熊、熊猫、狮子、老虎、豹、大象、斑马、长颈鹿、大猩猩、海豚或鲸)。
在各个实施方案中，待治疗的癌症可选自癌、肉瘤、骨肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、鼻咽癌、白血病、腺癌或骨髓瘤。在其他实施方案中，癌症可为肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头癌、颈癌、皮肤黑色素瘤、眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、子宫内膜癌(endometrialcancer)、直肠癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、输卵管癌、子宫内膜癌(carcinomaof the endometrium)、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、非小细胞肺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、骨肉瘤、尿道癌、前列腺癌、慢性白血病、急性白血病(包括急性骨髓细胞性白血病)、淋巴细胞性淋巴瘤、骨髓性白血病、骨髓单核细胞性白血病、毛细胞白血病、胸膜间皮瘤、膀胱癌、伯基特氏淋巴瘤、输尿管癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、及胃食管接合部腺癌。
在此类实施方案的一些方面，癌症为表达叶酸受体的癌症。在另一个实施方案中，癌症为表达叶酸受体α的癌症。在又另一个实施方案中，癌症为表达叶酸受体β的癌症。在此类实施方案的一些方面，癌症为子宫内膜癌、非小细胞肺癌、卵巢癌或三阴性乳腺癌。在另一个实施方案中，正在治疗的癌症为肿瘤。在另一个实施方案中，癌症是恶性的。在另一个实施方案中，癌症为急性骨髓细胞性白血病。在又另一个实施方案中，癌症为急性骨髓细胞性白血病且所述癌症表达叶酸受体-β。在仍另一个实施方案中，癌症为急性骨髓细胞性白血病且所述CAR-T细胞具有中枢记忆/效应记忆表型。在又另一个实施方案中，所述CAR T细胞的CD8:CD4比率为约1:1、约1.2:1比率、约1:1.2比率、约1.3:1比率、约1:1.3比率、约1.4:1比率、约1:1.4比率、约1.5:1比率、或约1:1.5比率。在另一个实施方案中，在癌症为急性骨髓细胞性白血病或另一种癌症的情况下，与该肿瘤相关的CAR T细胞可相对于与该肿瘤不相关的CAR T细胞具有增加的CD25表达。
在一个实施方案中，“小分子配体”可为叶酸类化合物、DUPA (经由PSMA-阳性人类前列腺癌细胞及其他癌细胞类型结合的配体)、NK-1R配体(NK-1R (例如，在结肠癌及胰癌上发现的配体)的受体)、CAIX配体(例如，在肾癌、卵巢癌、外阴癌及乳腺癌上发现的CAIX配体的受体)、γ谷氨酰基转肽酶(例如，在卵巢癌、结肠癌、肝癌、星形神经胶质瘤、黑色素瘤及白血病中过表达的转肽酶)的配体、NKG2D配体(例如，在肺癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌及T及B细胞淋巴瘤上发现的NKG2D配体的受体)、或CCK2R配体(尤其在甲状腺癌、肺癌、胰癌、卵巢癌、脑癌、胃癌、胃肠道基质癌及结肠癌上发现的CCK2R配体的受体)，其中每一种为特异性结合至癌细胞类型的小分子配体(即，此类配体中的每一种的受体可相较于正常组织在癌症上过表达)。
在一个实施方案中，该小分子配体可具有以下的质量：小于约10,000道尔顿(Dalton)、小于约9000道尔顿、小于约8,000道尔顿、小于约7000道尔顿、小于约6000道尔顿、小于约5000道尔顿、小于约4500道尔顿、小于约4000道尔顿、小于约3500道尔顿、小于约3000道尔顿、小于约2500道尔顿、小于约2000道尔顿、小于约1500道尔顿、小于约1000道尔顿、或小于约500道尔顿。在另一个实施方案中，该小分子配体可具有以下的质量：约1至约10,000道尔顿、约1至约9000道尔顿、约1至约8,000道尔顿、约1至约7000道尔顿、约1至约6000道尔顿、约1至约5000道尔顿、约1至约4500道尔顿、约1至约4000道尔顿、约1至约3500道尔顿、约1至约3000道尔顿、约1至约2500道尔顿、约1至约2000道尔顿、约1至约1500道尔顿、约1至约1000道尔顿、或约1至约500道尔顿。
在一个实施方案中，DUPA衍生物可为连接至靶向部分的小分子配体的配体，且DUPA衍生物描述于WO 2015/057852中，其通过引用并入本文中。
在一个实施方案中，在“连接至接头的小分子配体”的情况下，该小分子配体为叶酸类化合物。在各个实施方案中，该叶酸类化合物可为叶酸、叶酸类似物或另一结合叶酸受体的分子。在各个实施方案中，可使用的叶酸类似物包括甲酰四氢叶酸、蝶酰基多谷氨酸及结合叶酸受体的喋啶(诸如四氢喋呤、二氢叶酸、四氢叶酸及其去氮及二去氮类似物)。术语“去氮”及“二去氮”类似物是指具有置换天然存在叶酸结构中的一或两个氮原子的碳原子的本领域公认的类似物。例如，去氮类似物包括1-去氮、3-去氮、5-去氮、8-去氮及10-去氮类似物。二去氮类似物包括例如1,5-二去氮、5,10-二去氮、8,10-二去氮及5,8-二去氮类似物。将上述叶酸类似物通常称作“叶酸类化合物”，反映其结合叶酸受体的能力。其他结合叶酸受体的类似物包括氨基喋呤、氨甲喋呤(amethopterin/methotrexate)、N10-甲基叶酸、2-去氨基-羟基叶酸、去氮类似物(诸如1-去氮胺甲喋呤或3-去氮胺甲喋呤)、及3',5'-二氯-4-氨基-4-脱氧-N10-甲基喋酰基谷氨酸(二氯胺甲喋呤)。
在另一个实施方案中，在“连接至接头的小分子配体”的上下文中，该小分子配体可具有下式
Figure 271384DEST_PATH_IMAGE002
其中X1及Y1各自独立地选自卤素、R2、OR2、SR3及NR4R5；
U、V及W表示二价部分，其各自独立地选自-(R6a)C=、-N=、-(R6a)C(R7a)-及-N(R4a)-；Q选自C及CH；T选自S、O、N及-C=C-；
X2及X3各自独立地选自以下：氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R4b)-、-C(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)O-、-N(R4b)C(Z)N(R5b)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R4a)S(O)2-、-C(R6b)(R7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH2C≡CH)-、C1-C12亚烷基及C1-C12亚烷氧基，其中Z为氧或硫；
R1选自氢、卤素、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基；
R2、R3、R4、R4a、R4b、R5、R5b、R6b及R7b各自独立地选自以下：氢、卤素、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12酰基、C1-C12烯基、C1-C12炔基、(C1-C12烷氧基)羰基及(C1-C12烷基氨基)羰基；
R6及R7各自独立地选自氢、卤素、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基；或R6与R7一起形成羰基；
R6a及R7a各自独立地选自氢、卤素、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基；或R6a与R7a一起形成羰基；
p、r、s及t各自独立地为0或1；且
*表示连接至该缀合物的其余部分的可选共价键。
一方面，结合至包含E2抗荧光素抗体片段及由CAR T细胞表达的CAR的“靶向部分”可选自例如荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)及NHS-荧光素。靶向部分的特征仅受限于其应由包含E2抗荧光素抗体片段的CAR识别并结合，优选地特异性地识别并结合，及其具有相对低分子量。在各个方面，示例性靶向部分为半抗原，包括小分子量有机分子。
在一个说明性实施方案中，该靶向部分可具有下列说明性结构：
Figure 264748DEST_PATH_IMAGE006
其中X为氧、氮或硫，且其中X连接至接头L；Y为ORa、NRa 2或NRa 3 +；且Y'为O、NRa或NRa 2 +；其中在各个情况下，各R独立地选自H、氟、磺酸、磺酸盐，及其盐等；且Ra为氢或烷基。
在一个说明性的方面，该接头可包括聚乙二醇(PEG)、聚脯氨酸、亲水性氨基酸、糖、非天然肽聚糖、聚乙烯基吡咯啶酮、普兰尼克F-127、或其组合。
在另一说明性方面，本文中所述的化合物或其药学上可接受的盐的接头可包括直接键连(例如，FITC的异硫氰酸根基团与小分子配体的游离氨基之间的反应)或该键连可通过中间接头。在一个实施方案中，若存在，则中间接头可为本领域中已知的任何生物相容性接头，诸如二价接头。在一个说明性实施方案中，该二价接头可包含约1至约30个碳原子。在另一个说明性实施方案中，该二价接头可包含约2至约20个碳原子。在其他实施方案中，采用更低分子量二价接头(即，具有约30至约300道尔顿的近似分子量的那些)。在另一个实施方案中，适宜接头长度包括但不限于具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40或更多个原子的接头。
在各个实施方案中，连接至靶向部分的小分子配体可具有下式
Figure 19077DEST_PATH_IMAGE003
，
其中B表示该小分子配体，L表示该接头，且T表示该靶向部分，且其中L包括具有下式的结构
Figure 756089DEST_PATH_IMAGE004
其中n为0至200的整数。在另一个实施方案中，n可为以下的整数：0至150、0至110、0至100、0至90、0至80、0至70、0至60、0至50、0至40、0至30、0至20、0至15、0至14、0至13、0至12、0至11、0至10、0至9、0至8、0至7、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、0至1、15至16、15至17、15至18、15至19、15至20、15至21、15至22、15至23、15至24、15至25、15至26、15至27、15至28、15至29、15至30、15至31、15至32、15至33、15至34、15至35、15至36、15至37、15至38、15至39、15至40、15至50、15至60、15至70、15至80、15至90、15至100、15至110、15至120、15至130、15至140、15至150，或n可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、108、110、120、130、140、或150。
在另一个实施方案中，该接头可为可包含一个或多个间隔子的二价接头。说明性间隔子示于下表中。描述下列非限制性、说明性间隔子，其中*指示小分子配体或靶向部分或其他二价接头部分的连接点。
Figure 341791DEST_PATH_IMAGE007
在其他实施方案中，连接至靶向部分的小分子配体(桥)可具有下列结构中的任一者。
Figure 771635DEST_PATH_IMAGE008
Figure 13261DEST_PATH_IMAGE009
Figure 350701DEST_PATH_IMAGE010
Figure 994172DEST_PATH_IMAGE011
。
在其他实施方案中，该化合物或其药学上可接受的盐不是抗体，且不包含抗体片段。在另一个实施方案中，该靶向部分不包含肽表位。
在一个说明性实施方案中，经由接头(桥)连接至靶向部分的小分子配体包括连接至小分子配体的异硫氰酸荧光素(FITC)。一方面，癌症可过表达小分子配体的受体。在另一方面，例如，细胞毒性T细胞或另一类型的T细胞可经转化以表达包含E2抗荧光素抗体片段的CAR。在此方面，该CAR可靶向FITC，作为小分子配体结合至癌症的结果，利用FITC分子装饰癌症。因此，可避免对正常、非靶细胞的毒性。在此实施方案中，当表达E2抗荧光素抗体片段CAR的T细胞结合FITC时，活化所述CAR T细胞并改善该癌症。
涵盖经由接头连接至靶向部分的小分子配体的“药学上可接受的盐”。如本中所用，术语“药学上可接受的盐”是指其抗衡离子可用于医药中的那些盐。在各个实施方案中，此类盐包括但不限于：1)酸加成盐，其可经由母体化合物的游离碱与无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、硫酸及高氯酸等)或与有机酸(诸如乙酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸或类似者)的反应获得，或2)当存在于母体化合物中的酸性质子由金属离子(例如，碱金属离子、碱土离子或铝离子)置换；或利用有机碱(诸如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、三甲胺、N-甲基葡糖胺等)配位时，形成的盐。药学上可接受的盐是本领域技术人员熟知的，且涵盖与本文中所述的实施方案有关的任何此药学上可接受的盐。
在各个实施方案中，适宜酸加成盐自形成无毒盐的酸形成。说明性实例包括乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、糖酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐及三氟乙酸盐。
在各个实施方案中，适宜碱盐自形成无毒盐的碱形成。说明性实例包括精氨酸、苄星(benzathine)、钙盐、胆碱、二乙胺、二乙醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁盐、甲葡胺、乙醇胺、钾盐、钠盐、三乙醇胺及锌盐。亦可形成酸及碱的半盐，例如，半硫酸盐及半钙盐。
在一个说明性的方面，本文中所述的化合物或其医药上的盐可含有一个或多个手性中心，或可另能够呈多个立体异构体存在。因此，各种实施方案可包含纯净立体异构体以及立体异构体的混合物，诸如对映异构体、非对映异构体及对映异构体或非对映异构体富集的混合物。一方面，本文中所述的化合物或其药学上可接受的盐可能呈几何异构体存在。因此，各种实施方案可包含纯净几何异构体或几何异构体的混合物。
在一些方面，本文中所述的化合物或其药学上可接受的盐可呈非溶剂化形式以及溶剂化形式(包括水合形式)存在。一般而言，溶剂化形式等效于非溶剂化形式且涵盖于本发明的范围内。
本文中所述的方法亦利用经工程改造以表达包含E2抗荧光素抗体片段的嵌合抗原受体(CAR)的T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞)，该E2抗荧光素抗体片段识别并结合至桥的靶向部分(例如，荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)及NHS-荧光素)。在一个实施方案中，本文中所述的CAR包含三个结构域，所述结构域包含1)特异性识别并结合至靶向部分的识别区(例如，E2抗荧光素抗体的单链片段可变(scFv)区、Fab片段等)，2)增强T淋巴细胞的增殖及生存的共刺激结构域，及3)产生T淋巴细胞活化信号的活化信号结构域。
在各个方面，作为非限制性实例，可使用结合荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)及NHS-荧光素的抗体的scFv区。在说明性的非限制性实施方案中，所述scFv区可自以下制备：(i)结合靶向部分的本领域中已知的E2抗体，及(iii)自此类抗体的scFv区衍生的序列变体，例如，与衍生出所述scFv区的scFv区氨基酸序列具有至少约80%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或至少约99.5%序列同一性的scFv区。
一方面，共刺激结构域有助于将CAR结合至靶向部分后，增强细胞毒性T淋巴细胞的增殖及生存。适宜共刺激结构域包括但不限于CD28、CD137 (4-1BB)、肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员、CD134 (OX40)、受体的TNFR超家族的成员、CD27、CD30、CD150、DAP10、NKG2D及CD278 (ICOS)、在经活化的T细胞上表达的CD28超家族共刺激分子、或其组合。在一个说明性实施方案中，经工程改造的CAR的共刺激结构域包括CD 28及CD137。技术人员将了解可在无不利影响本发明下，使用此类共刺激结构域的序列变体，其中所述变体具有与改造出该变体的结构域相同或相似活性。在各个实施方案中，此类变体可与衍生出该变体的结构域的氨基酸序列具有至少约80%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或至少约99.5%序列同一性。
在一个说明性实施方案中，活化信号结构域有助于将CAR结合至靶向部分后，活化T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞)。在各个实施方案中，适宜活化信号结构域包括T细胞CD3ζ链、CD3 δ受体蛋白质、mbl受体蛋白质、B29受体蛋白质及Fc受体γ。技术人员将了解，可使用此类活化信号结构域的序列变体，其中所述变体具有与改造出该变体的结构域相同或相似活性。在各个实施方案中，所述变体与衍生出该变体的结构域的氨基酸序列具有至少约80%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或至少约99.5%序列同一性。
一方面，使用基因工程改造技术制备编码包含E2抗荧光素抗体片段的CAR的构建体。此类技术详述于Sambrook等人，“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)，其通过引用并入本文中，及Green及Sambrook，“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”，第4版，Cold Spring HarborLaboratory Press, (2012)，其通过引用并入本文中。
作为实例，可制备编码融合蛋白的质粒或病毒表达载体(例如，慢病毒载体、逆转录病毒载体、睡美人(sleeping beauty)及附挂(piggyback) (包括非病毒介导的CAR基因递送系统的转座子/转座酶系统))，该融合蛋白包含同框且及以5'至3'方向连接的识别区、一个或多个共刺激结构域及活化信号结构域。在其他实施方案中，其他设置是可接受的且包含识别区、活化信号结构域及一个或多个共刺激结构域。在一个实施方案中，融合蛋白中的识别区的定位一般将为使得实现所述区域在细胞外部的展示。在一个实施方案中，包含E2抗荧光素抗体片段的CAR可包含额外组件，诸如确保融合蛋白适当输出至细胞表面的信号肽(例如，CD8α信号肽)、确保维持融合蛋白作为完整膜蛋白的跨膜结构域(例如，CD8α跨膜结构域、CD28跨膜结构域、或CD3ζ跨膜结构域)及赋予识别区的灵活性及允许强结合至靶向部分的铰链结构域(例如，CD8α铰链或IgG4铰链)及任何其他适宜结构域。
示例性CAR构建体(其中表达的CAR包含E2抗荧光素抗体片段)的图示于图1中，其中将该融合蛋白序列并入表达载体中且其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段、IgG4铰链结构域、CD28跨膜结构域，且其中共刺激结构域为CD137 (4-1BB)，且活化信号结构域为CD3ζ。该CAR可包含额外适宜结构域。CAR插入物的一个示例性核酸序列提供为SEQ ID NO: 1及示例性经编码的氨基酸序列提供为SEQ ID NO: 2。如本文中所用，“SEQ ID NO: 1”意指以加下划线“agc”密码子开始及用加下划线“ggc”密码子终止的序列。较长序列的此部分编码插入T细胞膜的CAR。较长序列的其他部分包括不是插入该膜的CAR的部分及作为嵌合抗原受体起作用的信号肽、EGFRt结构域等的编码序列。如本文中所用，“SEQ ID NO: 2”意指以加下划线“S”开始及用加下划线“G”终止的序列。较长序列的此部分为插入T细胞膜的CAR的氨基酸序列。较长序列的其他部分包括不是插入该膜的CAR的部分及作为嵌合抗原受体起作用的信号肽、EGFRt结构域等的氨基酸序列。在另一个实施方案中，SEQ ID NO: 2可包含人源化或人类氨基酸序列或由人源化或人类氨基酸序列组成。SEQ ID NOS:1及2如上所述。将较长核酸序列的起始及终止密码子加下划线及该较长序列为可用于转导T细胞用于如本文中所述方法中的示例性序列。
SEQ ID NO: 1 (E2抗荧光素抗体片段CAR核酸序列(插入物))
Figure 329339DEST_PATH_IMAGE012
SEQ ID NO: 2 (E2抗荧光素抗体片段CAR氨基酸序列(插入物))
Figure 120577DEST_PATH_IMAGE013
在一个实施方案中，表达E2抗荧光素抗体片段的CAR包含识别区且该识别区为E2抗荧光素抗体的单链片段可变(scFv)区，共刺激结构域且该共刺激结构域为CD137 (4-1BB)，及活化信号结构域且该活化信号结构域为T细胞CD3ζ链。在另一个实施方案中，该CAR还可包含任何额外适宜结构域。为技术人员熟知的是抗FITC scFv及抗荧光素scFv是等效的术语。
在各个实施方案中，所述“E2抗荧光素抗体片段”可为包含E2抗荧光素抗体的片段(例如，scFv片段)的CAR。E2抗荧光素抗体描述于例如Vaughan等人，Nature Biotechnol.第14卷(3)，第309至314页，1996中，其通过引用并入本文中。在一个实施方案中，该表达E2抗荧光素抗体片段的CAR可具有约0.7 nM至约0.8 nM、约0.72 nM至约0.8 nM、约0.73 nM至约0.8 nM、约0.72 nM至约7.8 nM、约0.73至约0.77 nM、或约0.75 nM的对荧光素的结合亲和力。
在各个实施方案中，该CAR还可包含IgG4铰链结构域、CD3ζ活化结构域、及/或4-1BB共刺激结构域、及其他适宜结构域。在仍其他实施方案中，该CAR可由具有与SEQ ID NO:1至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%同一性的多核苷酸编码。在另一个说明性实施方案中，该CAR可由在高度严格条件下与具有SEQ ID NO: 1的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。在仍另一方面，该CAR可由具有SEQ ID NO: 1的多核苷酸或由SEQ IDNO: 1的简并变体编码。在其他实施方案中，该CAR蛋白质序列可具有与SEQ ID NO: 2至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%同一性。在又另一个实施方案中，该CAR蛋白质序列可具有至多约50个保守氨基酸取代。在本文所述的任一实施方案中，该CAR结合荧光素。
在一个实施方案中，可将T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞)基因工程改造以表达CAR构建体，其中通过利用编码表达E2抗荧光素抗体片段的CAR构建体的表达载体转染T淋巴细胞群体，而由该CAR构建体表达E2抗荧光素抗体片段。制备表达E2抗荧光素抗体片段的T淋巴细胞的经转导群体的适宜方法为技术人员熟知，且描述于Sambrook等人，“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”，第3版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, (2001)，其通过引用并入本文中，及Green及Sambrook，“Molecular Cloning: ALaboratory Manual”，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012)，其通过引用并入本文中。
在一个实施方案中，可如本文中所述使用包含SEQ ID NO: 1的核酸的CAR T细胞。在另一个实施方案中，可如本文中所述使用包含SEQ ID NO: 2的多肽的CAR T细胞。在另一说明性方面，可使用包含SEQ ID NO: 1且编码嵌合抗原受体的核酸(例如，分离核酸)制备CAR T细胞用于如本文中所述的用途。在又另一个实施方案中，可使用包含SEQ ID NO: 2的嵌合抗原受体多肽制备CAR T细胞用于如本文中所述的用途。在另一个实施方案中，可使用包含SEQ ID NO: 1的载体制备CAR T细胞用于如本文中所述的用途。在另一方面，提供一种包含SEQ ID NO: 1的慢病毒载体，其可用于制备CAR T细胞用于如本文中所述的用途。在又另一个实施方案中，SEQ ID NO: 2可包含人源化或人类氨基酸序列或由人源化或人类氨基酸序列组成。
在此类实施方案中的每一个中，涵盖具有与SEQ ID NO: 1至少约80%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或至少约99.5%序列同一性的变体核酸序列或氨基酸序列。在另一个实施方案中，该核酸序列可为具有与SEQ ID NO: 1至少约80%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或至少约99.5%序列同一性的变体核酸序列，只要该变体序列编码SEQ ID NO: 2的多肽。在另一个实施方案中，该核酸序列或氨基酸序列可为对于SEQ ID NO: 1，沿着200个核酸的一段，或对于SEQ ID NO: 2，沿着200个氨基酸的一段具有至少约80%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或至少约99.5%序列同一性的变体核酸或氨基酸序列。在一个实施方案中，可例如经由使用GAP程序(Genetics Computer Group，软件；现经由Accelrys在http://www.accelrys.com上可得)进行序列之间的同一性百分比或相似性的确定，及可使用例如ClustalW算法(VNTI软件，InforMax Inc.)进行比对。可使用所关注的核酸或氨基酸序列搜索序列数据库。用于数据库搜索的算法通常基于BLAST软件(Altschul等人，1990)。在一些实施方案中，可沿着核酸或氨基酸序列的全长确定同一性百分比。
亦在本发明的范围内，可使用与由SEQ ID NO: 1表示的核酸互补的核酸制备CART细胞用于如本文中所述的用途，及可使用与由SEQ ID NO: 1表示的核酸杂交的那些，或在高度严格条件下，与其互补物杂交的那些。根据本发明，“高度严格条件”意指在65℃下，在5X SSPE及50%甲酰胺中杂交，及在65℃下，在0.5X SSPE中洗涤。高度严格、低度严格及中度严格杂交的条件描述于：Sambrook等人，“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)，其通过引用并入本文中，及Green及Sambrook，“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”，第4版，Cold Spring HarborLaboratory Press, (2012)，其通过引用并入本文中。在一些说明性的方面，杂交沿着全长核酸发生。
在仍其他实施方案中，本文中所述的方法中使用的CAR可经由具有与SEQ ID NO:1至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%同一性的多核苷酸编码。在另一个说明性实施方案中，该CAR可由在高度严格条件下，与具有SEQ ID NO: 1的多核苷酸杂交的多核苷酸编码。在仍另一方面，该CAR可由具有SEQ ID NO: 1的多核苷酸或由SEQ IDNO: 1的简并变体编码。如本文中所用，简并变体是指具有一种以上指定任何特定氨基酸的密码子的遗传密码。指定各氨基酸的简并变体密码子是本领域中熟知的。在另一方面，可作出取代以优化特定原核或真核宿主细胞(即，密码子使用变体)中的多肽产生的水平。
在其他实施方案中，该CAR蛋白质序列可具有与 SEQ ID NO: 2至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。在又另一个实施方案中，该CAR蛋白质序列可具有至多约50个保守氨基酸取代。在一个实施方案中，该表达E2抗荧光素抗体片段的CAR蛋白质序列可具有至多约5个保守氨基酸取代、至多约10个保守氨基酸取代、至多约15个保守氨基酸取代、至多约20个保守氨基酸取代、至多约25个保守氨基酸取代、至多约30个保守氨基酸取代、至多约35个保守氨基酸取代、至多约40个保守氨基酸取代、至多约45个保守氨基酸取代、至多约50个保守氨基酸取代、至多约55个保守氨基酸取代、至多约60个保守氨基酸取代、至多约65个保守氨基酸取代、至多约70个保守氨基酸取代、或至多约75个保守氨基酸取代。如本领域技术人员熟知，经由保守氨基酸取代改变多肽的任何非关键氨基酸不应显著改变该多肽的活性，因为置换氨基酸的侧链应能形成相似键且如已经被置换的氨基酸的侧链那样接触。在本文所述的任一实施方案中，该CAR结合荧光素。
在一个说明性的方面，非保守取代是可能的，只要其不过度影响E2抗荧光素抗体片段多肽的荧光素结合活性。如本领域中熟知的，氨基酸的“保守取代”或多肽的“保守取代变体”是指维持以下的氨基酸取代：1)多肽的二级结构；2)氨基酸的电荷或疏水性；及3)侧链体积或此类特征中的任一者或多者。在一个实施方案中，该保守氨基酸取代可以是利用氨基酸类似物。说明性地，熟知术语“亲水性残基”是指丝氨酸或苏氨酸。“疏水性残基”是指亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸或类似者。“带正电荷残基”是指赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸或组氨酸。“带负电荷残基”是指天冬氨酸或谷氨酸。具有“大体积侧链”的残基是指苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸或类似者。表1中给出保守氨基酸取代的示例性列表。
表1
针对氨基酸 用以下取代
丙氨酸 D-Ala、Gly、Aib、β-Ala、L-Cys、D-Cys
精氨酸 D-Arg、Lys、D-Lys、Orn D-Orn
天冬酰氨酸 D-Asn、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu Gln、D-Gln
天冬氨酸 D-Asp、D-Asn、Asn、Glu、D-Glu、Gln、D-Gln
半胱氨酸 D-Cys、S-Me-Cys、Met、D-Met、Thr、D-Thr
谷氨酰胺 D-Gln、Asn、D-Asn、Glu、D-Glu、Asp、D-Asp
谷氨酸 D-Glu、D-Asp、Asp、Asn、D-Asn、Gln、D-Gln
甘氨酸 Ala、D-Ala、Pro、D-Pro、Aib、β-Ala
异亮氨酸 D-Ile、Val、D-Val、Leu、D-Leu、Met、D-Met
亮氨酸 Val、D-Val、Met、D-Met、D-Ile、D-Leu、Ile
赖氨酸 D-Lys、Arg、D-Arg、Orn、D-Orn
甲硫氨酸 D-Met、S-Me-Cys、Ile、D-Ile、Leu、D-Leu、Val、D-Val
苯丙氨酸 D-Phe、Tyr、D-Tyr、His、D-His、Trp、D-Trp
脯氨酸 D-Pro
丝氨酸 D-Ser、Thr、D-Thr、别-Thr、L-Cys、D-Cys
苏氨酸 D-Thr、Ser、D-Ser、别-Thr、Met、D-Met、 Val、D-Val
酪氨酸 D-Tyr、Phe、D-Phe、His、D-His、Trp、D-Trp
缬氨酸 D-Val、Leu、D-Leu、Ile、D-Ile、Met、D-Met
在一个实施方案中，在本文中所述方法中使用的T淋巴细胞(例如，用于制备表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的细胞毒性T淋巴细胞或非转化T细胞)可为自体细胞，虽然亦可使用异体细胞，诸如当正在治疗的患者已接受高剂量化疗或放射治疗以破坏该患者的免疫系统时。在一个实施方案中，可使用同种异体的细胞。
一方面，T淋巴细胞通过本领域中熟知的方法从患者获得。例如，T细胞(例如，细胞毒性T细胞或非转化T细胞)可经由以下获得：收集来自患者的外周血、使该血经受Ficoll密度梯度离心及然后使用阴性T细胞分离试剂盒(诸如EasySep™ T细胞分离试剂盒)以自外周血分离T细胞群。在一个说明性实施方案中，该T淋巴细胞群体(例如，细胞毒性T细胞或非转化T细胞)不需要是纯的且可含有其他细胞，诸如其他类型的T细胞(例如，在细胞毒性T细胞的情况下)、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、及B细胞。一方面，正在收集的群体可包含至少约90%的所选细胞类型、至少约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%的所选细胞类型。
在一个实施方案中，在获得T淋巴细胞(例如，用于制备表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的细胞毒性T细胞)后，将所述细胞在促进所述细胞的活化的条件下培养。在此实施方案中，培养条件可为使得可对患者施用所述细胞而不关心针对培养基的组分的反应性。例如，培养条件可不包括牛血清产物，诸如牛血清白蛋白。在一个说明性的方面，活化可经由引入已知活化剂至培养基中达成，诸如在细胞毒性T细胞的情况下的抗CD3抗体。其他适宜活化剂包括抗CD28抗体。一方面，可将淋巴细胞群体在促进活化的条件下培养约1至约4天。在一个实施方案中，活化的适宜水平可通过由流式细胞术测定的细胞大小、增殖率或活化标记物确定。
在一个说明性实施方案中，在促进活化的条件下培养T淋巴细胞(例如，用于制备表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的细胞毒性T淋巴细胞)群体后，可将所述细胞用编码包含E2抗荧光素抗体片段的CAR的表达载体转染。以上描述用在各个实施方案中的适宜载体及转染方法。一方面，在转染后，可将所述细胞立即对患者施用或可将所述细胞培养至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或更多天，或约5与约12天之间、约6与约13天之间、约7与约14天之间、或约8与约15天之间，例如，以允许细胞自转染恢复的时间。一方面，适宜培养条件可类似于培养细胞用于活化所在的条件，其中具有或没有用于促进活化的药剂。
因此，如上所述，在一个说明性的方面，本文中所述治疗方法可进一步包括1)获得自体或异体T淋巴细胞(例如，用于制备表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的细胞毒性T淋巴细胞)群体，2)在促进所述细胞的活化的条件下，培养所述T淋巴细胞，及3)利用编码包含E2抗荧光素抗体片段的CAR的表达载体转染所述淋巴细胞以形成表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞。
在一个说明性实施方案中，当所述细胞已经转染且活化时，可制备包含CAR T细胞的组合物，其中所述CAR T细胞包括包含E2抗荧光素抗体片段的CAR，且连同或不连同非转化T细胞，对患者施用。在一个实施方案中，缺失任何动物产品(诸如牛血清)的培养基可用于培养表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞及/或非转化T细胞。在另一个实施方案中，可使用通常由技术人员使用的组织培养条件以避免细菌、真菌及支原体的污染。在一个示例性的实施方案中，在对患者施用之前，将所述细胞(例如，表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞及/或非转化T细胞)沉淀、洗涤及再悬浮于药学上可接受的载体或稀释剂中。包含表达E2抗荧光素抗体片段的表达CAR的T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞)或非转化T细胞的示例性组合物包括在无菌290 mOsm盐水中、在可输注的低温介质(含有血浆-Lyte A、右旋糖、氯化钠注射液、人类血清白蛋白及DMSO)中、0.9% NaCl与2%人类血清白蛋白中、或任何其他无菌290 mOsm可输注物质中包含细胞的组合物。或者，在另一个实施方案中，取决于培养基的特征，可将表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞或非转化T细胞在培养基中作为组合物施用，或在施用之前，浓缩及再悬浮于培养基中。在各个实施方案中，可经由任何适宜方式(诸如胃肠外施用，例如，皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、静脉内或鞘内)向患者施用CAR T细胞组合物(其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)，连同或不连同非转化T细胞。
一方面，对患者施用的组合物中的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的总数目及细胞浓度将取决于包括以下的许多因素而改变：正在使用的T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞)的类型、包含E2抗荧光素抗体片段的CAR的结合特异性、靶向部分与小分子配体的特征、癌症的特征、癌症在患者中的位置、对患者施用组合物所使用的方式、及正在治疗的患者的健康、年龄及体重。在各个实施方案中，包含表达E2抗荧光素抗体片段的经转导的CAR T细胞的适宜组合物包含具有约0.1 ml至约200 ml及约0.1 ml至约125 ml的体积的那些。
在各个实施方案中，对患者施用的经转导的CAR T细胞(其中所述CAR T细胞包含CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)可包含约1 X 105至约1 X 1015或1 X 106至约1 X1015个表达E2抗荧光素抗体片段的经转导的CAR T细胞。在各个实施方案中，可对患者施用约1 X 105至约1 X 1010、约1 X 106至约1 X 1010、约1 X 106至约1 X 109、约1 X 106至约1X 108、约1 X 106至约2 X 107、约1 X 106至约3 X 107、约1 X 106至约1.5 X 107、约1 X 106至约1 X 107、约1 X 106至约9 X 106、约1 X 106至约8 X 106、约1 X 106至约7 X 106、约1X 106至约6 X 106、约1 X 106至约5 X 106、约1 X 106至约4 X 106、约1 X 106至约3 X 106、约1 X 106至约2 X 106、约2 X 106至约6 X 106、约2 X 106至约5 X 106、约3 X 106至约6 X106、约4 X 106至约6 X 106、约4 X 106至约1 X 107、约1 X 106至约1 X 107、约1 X 106至约1.5 X 107、约1 X 106至约2 X 107、约0.2 X 106至约1 X 107、约0.2 X 106至约1.5 X 107、约0.2 X 106至约2 X 107、或约5 X 106个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞。一方面，在本文所述的任何实施方案中，可对患者施用单一剂量或多个剂量的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞。在本段或本文中所述的任一实施方案中，所述CAR T细胞数目可以按患者体重的kg计。在本文所述的任何实施方案中，可在化合物或其药学上可接受的盐之前施用表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞。应了解，除非另有指明，否则针对本文中所述的任何方法的步骤指定i)、ii)及iii)等不指示顺序。
在本文中所述的各种实施方案中，非转化T细胞亦可与表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞施用且可以本文中针对表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞及非转化T细胞所述的量施用。一方面，可施用CAR T细胞(其中所述CAR T细胞包含CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)与非转化T细胞的混合物单次或多次，或可施用表达E2抗荧光素抗体片段的纯CAR T细胞及表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与非转化T细胞的混合物的剂量组合(例如，表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的剂量，接着表达E2抗荧光素抗体片段的CART细胞与非转化T细胞的混合物的一个或多个剂量)。技术人员自本公开内容应清楚，如本文中所述的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与非转化T细胞的“混合物”意指将表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与尚未暴露于用于表达包含E2抗荧光素抗体片段的CAR的构建体的非转化T细胞混合。
在其他实施方案中，对患者施用的CAR T细胞组合物中的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的剂量选自以下：约1百万、约2百万、约3百万、约4百万、约5百万、约6百万、约7百万、约8百万、约9百万、约10百万、约11百万、约12百万、约12.5百万、约13百万、约14百万、及约15百万个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞。
在仍其他说明性实施方案中，包含表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的CAR T细胞组合物经由注射至患者的血流施用，及患者的血流中的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞在注射CAR T细胞组合物后约4周时，占患者的血流中患者的总T细胞的至少5%、至少7%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、或至少15%，在注射CAR T细胞组合物后约3周时，占至少20%、25%、30%、35%、40%或50%，在注射CAR T细胞组合物后约2周时，占至少60%、70%、75%或80%，或在注射CAR T细胞组合物后约1周时，占至少85%、90%或95%。
在本文中所述实施方案中，该CAR T细胞组合物可包含表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞，无任何其他细胞类型，或非转化T细胞可与表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞组合对患者施用。针对施用多个剂量的CAR T细胞组合物的实施方案，任何剂量可包括表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞或表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与非转化T细胞的混合物。在各个实施方案中，非转化T细胞可以本文中针对表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞所述的量施用。
在另一个实施方案中，CAR T细胞组合物的任何剂量可包括选自以下比率的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与非转化T细胞的混合物：约1:5的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞对非转化T细胞、约1:4的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞对非转化T细胞、约1:3的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞对非转化T细胞、约1:2的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞对非转化T细胞、及约1:1的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞对非转化T细胞。
在仍其他实施方案中，CAR T细胞组合物的任何剂量可包括约1:1至约1:5的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞对非转化T细胞的比率的表达E2抗荧光素抗体片段的CART细胞与非转化T细胞的混合物，或该CAR T细胞组合物可包含约10百万个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与约40百万个非转化T细胞、约15百万个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与约35百万个非转化T细胞、约20百万个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与约30百万个非转化T细胞、或约25百万个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞与约25百万个非转化T细胞的混合物。
可使用本领域中已知的任何适宜方法对患者施用本文中所述的化合物或其药学上可接受的盐，或CAR T细胞组合物(其中该组合物包含CAR T细胞，所述CAR T细胞包括包含E2抗荧光素抗体片段的CAR)。如本文中所述，术语“施用(administering/administered”包括将化合物或其药学上可接受的盐，或包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物(所述CAR T细胞具有CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)引入患者的所有方式，包括但不限于经口、静脉内、肌肉内、皮下、透皮等。一方面，本文中所述的化合物或其药学上可接受的盐可呈单位剂型及/或含有常规的无毒的药学上可接受的载剂、佐剂及媒介物的制剂施用。
一方面，可将如本文中所述的化合物或其药学上可接受的盐，或CAR T细胞组合物(其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，该CAR T细胞表达包含E2抗荧光素抗体片段的CAR)直接施用至血流中、至肌肉中、或至内部器官中。在各个实施方案中，此胃肠外施用的适宜途径包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、硬膜上、脑室内、尿道内、胸骨内、颅内、肿瘤内、肌肉内及皮下递送。在一个实施方案中，胃肠外施用的方式包括针(包括微针)注射、无针注射及输注技术。
在一个说明性的方面，胃肠外制剂通常为水性溶液，其可含有载剂或赋形剂，诸如盐、碳水化合物及缓冲剂(优选地在3至9的pH下)，但是可将其更适宜配制成无菌非水溶液或成干燥形式以结合适宜媒剂(诸如无菌、无热原水或无菌盐水)使用。在其他实施方案中，本文中所述的液体制剂中的任一者可适于如本文中所述的胃肠外施用。可使用本领域技术人员熟知的标准医药技术容易实现在无菌条件下经由冻干以产生用于胃肠外制剂的无菌冻干粉末的制备。在一个实施方案中，在胃肠外制剂的制备中使用的化合物或其药学上可接受的盐的溶解度可经由使用适宜配制技术(诸如，并入增强溶解度剂)增加。
待对患者施用的化合物或其药学上可接受的盐的量可取决于正在治疗的癌症、化合物或其药学上可接受的盐的施用途径、及组织分布显著变化。待对患者施用的量可基于身体表面积、质量及医师评估。在各个实施方案中，待施用的量范围可为例如约0.05 mg至约30 mg、0.05 mg至约25.0 mg、约0.05 mg至约20.0 mg、约0.05 mg至约15.0 mg、约0.05mg至约10.0 mg、约0.05 mg至约9.0 mg、约0.05 mg至约8.0 mg、约0.05 mg至约7.0 mg、约0.05 mg至约6.0 mg、约0.05 mg至约5.0 mg、约0.05 mg至约4.0 mg、约0.05 mg至约3.0mg、约0.05 mg至约2.0 mg、约0.05 mg至约1.0 mg、约0.05 mg至约0.5 mg、约0.05 mg至约0.4 mg、约0.05 mg至约0.3 mg、约0.05 mg至约0.2 mg、约0.05 mg至约0.1 mg、约.01 mg至约2 mg、约0.3 mg至约10 mg、约0.1 mg至约20 mg、或约0.8至约3 mg。本领域技术人员将容易理解该剂量可基于以上所指出的因素在以上提供的各种范围内变化及可在医师的裁量下。
在其他实施方案中，该化合物或其药学上可接受的盐的剂量范围可为(例如)约50nmol/kg至约3000 nmol/kg患者体重、约50 nmol/kg至约2000 nmol/kg、约50 nmol/kg至约1000 nmol/kg、约50 nmol/kg至约900 nmol/kg、约50 nmol/kg至约800 nmol/kg、约50nmol/kg至约700 nmol/kg、约50 nmol/kg至约600 nmol/kg、约50 nmol/kg至约500 nmol/kg、约50 nmol/kg至约400 nmol/kg、约50 nmol/kg至约300 nmol/kg、约50 nmol/kg至约200 nmol/kg、约50 nmol/kg至约100 nmol/kg、约100 nmol/kg至约300 nmol/kg、约100nmol/kg至约500 nmol/kg、约100 nmol/kg至约1000 nmol/kg、约100 nmol/kg至约2000nmol/kg患者体重。在其他实施方案中，该剂量可为约1 nmol/kg、约5 nmol/kg、约10 nmol/kg、约20 nmol kg、约25 nmol/kg、约30 nmol/kg、约40 nmol/kg、约50 nmol/kg、约60nmol/kg、约70 nmol/kg、约80 nmol/kg、约90 nmol/kg、约100 nmol/kg、约150 nmol/kg、约200 nmol/kg、约250 nmol/kg、约300 nmol/kg、约350 nmol/kg、约400 nmol/kg、约450nmol/kg、约500 nmol/kg、约600 nmol/kg、约700 nmol/kg、约800 nmol/kg、约900 nmol/kg、约1000 nmol/kg、约2000 nmol/kg、约2500 nmol/kg或约3000 nmol/kg患者体重。
在各种其他实施方案中，该化合物或其药学上可接受的盐的剂量范围可为(例如)约10 nmol/kg至约10000 nmol/kg、约10 nmol/kg至约5000 nmol/kg、约10 nmol/kg至约3000 nmol/kg、约10 nmol/kg至约2500 nmol/kg、约10 nmol/kg至约2000 nmol/kg、约10nmol/kg至约1000 nmol/kg、约10 nmol/kg至约900 nmol/kg、约10 nmol/kg至约800 nmol/kg、约10 nmol/kg至约700 nmol/kg、约10 nmol/kg至约600 nmol/kg、约10 nmol/kg至约500 nmol/kg、约10 nmol/kg至约400 nmol/kg、约10 nmol/kg至约300 nmol/kg、约10nmol/kg至约200 nmol/kg、约10 nmol/kg至约150 nmol/kg、约10 nmol/kg至约100 nmol/kg、约10 nmol/kg至约90 nmol/kg、约10 nmol/kg至约80 nmol/kg、约10 nmol/kg至约70nmol/kg、约10 nmol/kg至约60 nmol/kg、约10 nmol/kg至约50 nmol/kg、约10 nmol/kg至约40 nmol/kg、约10 nmol/kg至约30 nmol/kg、约10 nmol/kg至约20 nmol/kg、约200nmol/kg至约900 nmol/kg、约200 nmol/kg至约800 nmol/kg、约200 nmol/kg至约700nmol/kg、约200 nmol/kg至约600 nmol/kg、约200 nmol/kg至约500 nmol/kg、约250 nmol/kg至约600 nmol/kg、约300 nmol/kg至约600 nmol/kg、约300 nmol/kg至约500 nmol/kg、或约400 nmol/kg至约600 nmol/kg患者体重。在各种其他实施方案中，该化合物或其药学上可接受的盐的剂量范围可为(例如)约1 nmol/kg至约10000 nmol/kg、约1 nmol/kg至约5000 nmol/kg、约1 nmol/kg至约3000 nmol/kg、约1 nmol/kg至约2500 nmol/kg、约1nmol/kg至约2000 nmol/kg、约1 nmol/kg至约1000 nmol/kg、约1 nmol/kg至约900 nmol/kg、约1 nmol/kg至约800 nmol/kg、约1 nmol/kg至约700 nmol/kg、约1 nmol/kg至约600nmol/kg、约1 nmol/kg至约500 nmol/kg、约1 nmol/kg至约400 nmol/kg、约1 nmol/kg至约300 nmol/kg、约1 nmol/kg至约200 nmol/kg、约1 nmol/kg至约150 nmol/kg、约1 nmol/kg至约100 nmol/kg、约1 nmol/kg至约90 nmol/kg、约1 nmol/kg至约80 nmol/kg、约1 nmol/kg至约70 nmol/kg、约1 nmol/kg至约60 nmol/kg、约1 nmol/kg至约50 nmol/kg、约1nmol/kg至约40 nmol/kg、约1 nmol/kg至约30 nmol/kg、或约1 nmol/kg至约20 nmol/kg。在又另一个实施方案中，该剂量可为约0.1 nmol/kg、约0.2 nmol/kg、约0.3 nmol/kg、约0.4 nmol/kg、或约0.5 nmol/kg、约0.1 nmol/kg至约1000 nmol/kg、约0.1 nmol/kg至约900 nmol/kg、约0.1 nmol/kg至约850 nmol/kg、约0.1 nmol/kg至约800 nmol/kg、约0.1nmol/kg至约700 nmol/kg、约0.1 nmol/kg至约600 nmol/kg、约0.1 nmol/kg至约500nmol/kg、约0.1 nmol/kg至约400 nmol/kg、约0.1 nmol/kg至约300 nmol/kg、约0.1 nmol/kg至约200 nmol/kg、约0.1 nmol/kg至约100 nmol/kg、约0.1 nmol/kg至约50 nmol/kg、约0.1 nmol/kg至约10 nmol/kg、或约0.1 nmol/kg至约1 nmol/kg患者体重。在其他实施方案中，该剂量可为约0.3 nmol/kg至约1000 nmol/kg、约0.3 nmol/kg至约900 nmol/kg、约0.3nmol/kg至约850 nmol/kg、约0.3 nmol/kg至约800 nmol/kg、约0.3 nmol/kg至约700nmol/kg、约0.3 nmol/kg至约600 nmol/kg、约0.3 nmol/kg至约500 nmol/kg、约0.3 nmol/kg至约400 nmol/kg、约0.3 nmol/kg至约300 nmol/kg、约0.3 nmol/kg至约200 nmol/kg、约0.3 nmol/kg至约100 nmol/kg、约0.3 nmol/kg至约50 nmol/kg、约0.3 nmol/kg至约10nmol/kg、或约0.3 nmol/kg至约1 nmol/kg患者体重。在此类实施方案中，“kg”为患者体重的千克数。一方面，可对患者施用单一剂量或多个剂量的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，可对患者施用约20 μg/kg患者体重与约3 mg/kg患者体重之间的化合物或其药学上可接受的盐。在另一方面，量可为约0.2 mg/kg患者体重至约0.4mg/kg患者体重，或可为约50 μg/kg患者体重。一方面，可对患者施用单一剂量或多个剂量的化合物或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，可在包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物(其中所述CAR T细胞含有CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)之前，对患者施用连接至靶向部分的小分子配体(化合物)。在另一个实施方案中，连接至靶向部分的小分子配体(桥)可与包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物(其中所述CAR T细胞具有CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)同时对患者施用，但是在不同制剂中，或在相同制剂中。在另一个实施方案中，可在包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物(其中所述CAR T细胞含有CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)之后，对患者施用连接至靶向部分的小分子配体。
在一个说明性的方面，施用CAR T细胞(该CAR T细胞含有CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)与连接至靶向部分的小分子配体(桥)之间的时间间隔可取决于包括以下的因素广泛变化：正在使用的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的类型、含有E2抗荧光素抗体片段的CAR的结合亲和力、靶向部分与小分子配体的特征、癌症的特征、癌症在患者中的定位、用于对患者施用表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞及连接至靶向部分的小分子配体的方式、及患者的健康、年龄及体重。一方面，可在CAR T细胞之前或之后，诸如在约3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、或51小时内，或在约0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天内施用连接至靶向部分的小分子配体。
在一个实施方案中，可使用本领域中已知的任何可适用给药时程表施用化合物或其药学上可接受的盐，或用于CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含含有CAR的CAR T细胞，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。例如，可使用每天一次给药(亦称作qd)、每天两次给药(亦称作bid)、每天三次给药(亦称作tid)、每周两次给药(亦称作BIW)、每周三次给药(亦称作TIW)、每周一次给药等。一方面，针对化合物或其药学上可接受的盐，及CAR T细胞组合物(其中该CAR T细胞组合物包含含有CAR的CAR T细胞，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)选择的给药时程表可考虑化合物或其药学上可接受的盐的浓度，及施用的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的数目以调节CAR T细胞组合物(其中该CAR T细胞组合物包含含有CAR的CAR T细胞，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)的细胞毒性及以控制CRS。
在一个实施方案中，为预防或抑制患者的细胞因子释放综合征(CRS)，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向该患者施用CAR T细胞组合物，其中该CART细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，及iii)向该患者施用叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制CAR T细胞的活化的药物。
在此方法实施方案中，对患者施用叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CART细胞的活化的药物的步骤可用于预防或抑制患者的CRS。在此实施方案中，本文中可将叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的活化的药物中的任一者称作“救援剂”。在一个实施方案中，可施用叶酸类化合物(诸如叶酸)以预防或抑制患者的CRS。在此实施方案中，该叶酸类化合物抑制桥(即，经由接头连接至靶向部分的小分子配体)与肿瘤上的桥的受体的相互作用，抑制肿瘤裂解及预防或抑制患者的CRS。
在另一个实施方案中，该救援剂可快至在施用该救援剂后约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、或约10小时降低CRS。例如，可降低CRS的等级(例如，3级至2级、4级至3级等)。
以下1至6列(为等级0、1、2、3、4及5)显示示例性分级系统：
Figure 199392DEST_PATH_IMAGE015
在一个实施方案中，作为桥与肿瘤的结合的抑制剂施用的叶酸类化合物可为(例如)叶酸、叶酸类似物或另一种结合叶酸受体的分子。在各个实施方案中，可使用的叶酸类似物包括甲酰四氢叶酸、喋酰多谷氨酸及叶酸受体结合喋啶，诸如四氢喋呤、二氢叶酸、四氢叶酸及其去氮及二去氮类似物。术语“去氮”及“二去氮”类似物是指具有置换天然产生的叶酸结构中的一或两个氮原子的碳原子的本领域公认的类似物。例如，去氮类似物包括1-去氮、3-去氮、5-去氮、8-去氮及10-去氮类似物。二去氮类似物包括例如1,5-二去氮、5,10-二去氮、8,10-二去氮及5,8-二去氮类似物。将上述叶酸类似物通常称作“叶酸类化合物”，反映其结合叶酸受体的能力。其他叶酸受体结合类似物包括氨基喋呤、氨甲喋呤、N10-甲基叶酸、2-去氨基-羟基叶酸、去氮类似物(诸如1-去氮胺甲喋呤或3-去氮胺甲喋呤)、及3',5'-二氯-4-氨基-4-脱氧-N10-甲基喋酰基谷氨酸(二氯胺甲喋呤)。
在另一个实施方案中，作为桥与肿瘤的结合的抑制剂施用的叶酸类化合物具有下式
Figure 697369DEST_PATH_IMAGE016
其中X1及Y1各自独立地选自卤素、R2、OR2、SR3及NR4R5；
U、V及W表示二价部分，其各自独立地选自-(R6a)C=、-N=、-(R6a)C(R7a)-及-N(R4a)-；Q选自C及CH；T选自S、O、N及-C=C-；
X2及X3各自独立地选自以下：氧、硫、-C(Z)-、-C(Z)O-、-OC(Z)-、-N(R4b)-、-C(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)-、-OC(Z)N(R4b)-、-N(R4b)C(Z)O-、-N(R4b)C(Z)N(R5b)-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R4a)S(O)2-、-C(R6b)(R7b)-、-N(C≡CH)-、-N(CH2C≡CH)-、C1-C12亚烷基及C1-C12亚烷氧基，其中Z为氧或硫；
R1选自氢、卤素、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基；
R2、R3、R4、R4a、R4b、R5、R5b、R6b及R7b各自独立地选自以下：氢、卤素、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、C1-C12酰基、C1-C12烯基、C1-C12炔基、(C1-C12烷氧基)羰基及(C1-C12烷基氨基)羰基；
R6及R7各自独立地选自氢、卤素、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基；或R6与R7一起形成羰基；
R6a及R7a各自独立地选自氢、卤素、C1-C12烷基及C1-C12烷氧基；或R6a与R7a一起形成羰基；
p、r、s及t各自独立地为0或1；且
*表示连接至该缀合物的其余部分的可选共价键。
在又另一个实施方案中，可施用包含叶酸类化合物的缀合物以预防或抑制患者的细胞因子释放综合征(CRS)。CRS为本领域中熟知的术语且此综合征可对患者造成有害影响，包括但不限于体重损失、高烧、肺水肿及血压危险下降。
在此实施方案中，该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分，及因此，该缀合物抑制桥与肿瘤的相互作用以预防肿瘤裂解及减少患者的CRS。在此实施方案中，该包含叶酸类化合物的缀合物中的叶酸类化合物部分可包括连接至化学部分(不包括靶向部分)的先前段落中所述的叶酸中的任一者。一方面，该包含叶酸类化合物的缀合物可包含连接至一个或多个氨基酸(不包括靶向部分)的叶酸类化合物。说明性地，该包含叶酸类化合物的缀合物具有下式
Figure 469016DEST_PATH_IMAGE017
。
亦可将此化合物称作“EC923”。在此类实施方案中，叶酸类化合物或包含叶酸类化合物的缀合物可以相对于桥(即，通过接头连接至靶向部分的小分子配体)摩尔过量(诸如叶酸类化合物或包含叶酸类化合物的缀合物相对于通过接头连接至靶向部分的小分子配体10倍过量、100倍过量、200倍过量、300倍过量、400倍过量、500倍过量、600倍过量、700倍过量、800倍过量、900倍过量、1000倍过量、或10,000倍过量)的对患者施用。抑制桥与肿瘤的相互作用所需的叶酸类化合物或包含叶酸类化合物的缀合物的量相对于通过接头连接至靶向部分的小分子配体的量可经由技术人员确定。
在另一个实施方案中，可对患者施用抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的活化的救援剂以抑制CAR T细胞活化及以抑制或预防患者的CRS。一方面，该药剂可选自以下：淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶抑制剂(例如，达沙替尼)、PI3激酶抑制剂(例如，GDC0980)、IL-2可诱导T细胞激酶抑制剂(例如，BMS-509744)、JAK抑制剂、BTK抑制剂、托珠单抗(Tociluzumab)、SIP促效剂(例如，辛波莫德(Siponimod)及奥扎莫德(Ozanimod))及阻断CAR T细胞结合至桥，但是不结合至癌症的药剂(例如，荧光素胺、FITC或荧光素钠)。技术人员应了解，FITC (即，荧光素)可在生理条件下呈盐(例如，荧光素钠)形式，或呈其非盐形式，或例如，呈生理pH下的缓冲液。因此，在一个实施方案中，当对患者施用荧光素时，其可处于其盐形式(例如，荧光素钠)及其非盐形式之间的平衡。在另一个实施方案中，抑制CART细胞的活化的救援剂可为下式的化合物
Figure 481971DEST_PATH_IMAGE018
。
在各个实施方案中，该救援剂可以约.001 nM至约100 mM、约.01 nM至约100 mM、约1 nM至约100 mM、约10 nM至约100 mM、约50 nM至约100 mM、或约100 nM至约100 mM的浓度，以任何适宜体积，包括例如，0.1 ml、0.2 ml、0.3 ml、0.4 ml、0.5 ml、0.6 ml、0.7 ml、0.8 ml、0.9 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、10 ml、100 ml、或1000 ml施用。在其他实施方案中，该救援剂可以以下剂量施用：约.01至约300 μmol/kg患者体重、约.06至约100 μmol/kg患者体重、约.06至约90 μmol/kg患者体重、约.06至约80 μmol/kg患者体重、约.06至约70 μmol/kg患者体重、约.06至约60 μmol/kg患者体重、约.06至约50 μmol/kg患者体重、约.06至约40 μmol/kg患者体重、约.06至约30 μmol/kg患者体重、约.06至约20 μmol/kg患者体重、约.06至约10 μmol/kg患者体重、约.06至约8 μmol/kg患者体重、或约.06至约6 μmol/kg患者体重。
在此类实施方案中，该救援剂可以相对于化合物或其药学上可接受的盐(即，通过接头连接至靶向部分的小分子配体)摩尔过量，诸如该救援剂相对于接头连接至靶向部分的小分子配体约10倍过量、约20倍过量、约30倍过量、约40倍过量、约50倍过量、约60倍过量、约70倍过量、约80倍过量、约90倍过量、约100倍过量、约200倍过量、约300倍过量、约400倍过量、约500倍过量、约600倍过量、约700倍过量、约800倍过量、约900倍过量、约1000倍过量、或约10,000倍过量对患者施用。抑制化合物或其药学上可接受的盐与表达E2抗荧光素抗体片段的肿瘤和/或CAR T细胞的相互作用所需的救援剂的量相对于通过接头连接至靶向部分的小分子配体的量可经由技术人员确定。
在另一个实施方案中，可对患者施用超过一个剂量的叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的活化的药剂。
在本文中所述的“救援剂”实施方案中，可在化合物或其药学上可接受的盐之前及/或之后，对患者施用叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的活化的药剂。在另一方面，可在施用叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的活化的药剂之前及随后施用化合物或其药学上可接受的盐。在此实施方案中，化合物或其药学上可接受的盐的随后施用可造成表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的活化及患者中的细胞因子水平的增加。
在另一个实施方案中，叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的活化的药剂的施用可造成患者中的细胞因子水平的降低。在又另一个实施方案中，在对患者施用叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的活化的药剂后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、或约8小时，可发生细胞因子水平的降低。在另一个实施方案中，细胞因子水平的降低为降低至将近未经治疗的患者中的细胞因子水平。
在另一个说明性实施方案中，在施用叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的活化的药剂后，患者血液中的表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的数目可增加，即使患者中的细胞因子水平降低。在另一说明性方面，在施用叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制CAR T细胞的活化的救援剂(其中所述CAR T细胞包括包含E2抗荧光素抗体片段的CAR)后，可相对于未经救援剂治疗的患者，增强或维持表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的活化，即使经治疗的患者中的细胞因子水平降低。在仍另一个实施方案中，癌症包括肿瘤及当对患者施用叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的活化的救援剂时，患者的肿瘤大小不增加。在此实施方案中，可获得对肿瘤的完全反应。
在其他实施方案中，当CRS等级达到1、2、3或4时或当CRS等级达到3或4时，对患者施用抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的活化的救援剂。在另一方面，当施用救援剂时，患者的肺水肿减少。
在本文中所述的一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法，及该方法包括i)向患者连续施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包括包含E2抗荧光素抗体片段的CAR，及iii)终止化合物或其药学上可接受的盐的连续施用，以抑制或预防患者的细胞因子释放综合征。
根据此实施方案，术语“连续”可意指对患者施用化合物或其药学上可接受的盐(例如)至少一小时、至少四小时、至少六小时、至少八小时、至少十小时、至少十二小时、或至少二十四小时，或可意指每日或每周施用的方案，诸如每天一次、每天两次、每天三次、每天、每隔一天、每周一次、每周两次、每周三次，或本领域技术人员认为连续施用的任何其他适宜方案。在另一方面，术语“连续”可意指此段中所述的实施方案的任何组合。
在此方法实施方案中，“终止连续施用”化合物或其药学上可接受的盐以抑制或预防患者的细胞因子释放综合征的步骤可意指例如在施用持续连续时间段(诸如小时或天)后终止施用，或终止治疗方案(诸如上述每日或每周方案)。在另一个实施方案中，“终止连续施用”的步骤可意指例如施用直至发生患者体重的不可接受的损失，或直至发生任何其他不可接受的副作用，诸如高烧、血压下降或肺水肿。在此实施方案中，“终止连续施用”化合物或其药学上可接受的盐的步骤不意指利用化合物或其药学上可接受的盐的单药治疗，无利用化合物或其药学上可接受的盐的随后治疗。在此方法实施方案中，“以抑制或预防”细胞因子释放综合征(CRS)意指消除CRS或减少或改善CRS的症状。
在涉及终止连续施用化合物或其药学上可接受的盐的实施方案的一个实施方案中，该方法还可包括对患者再施用化合物或其药学上可接受的盐的步骤iv)。在一个实施方案中，可(例如)每周一次施用化合物或其药学上可接受的盐及可省略一个剂量。在另一个实施方案中，可隔日(即，每隔一天)施用化合物或其药学上可接受的盐及可省略一个或多个(例如，两个、三个、四个等)剂量。在另一个实施方案中，可每周两次施用化合物或其药学上可接受的盐及可省略一个或多个(例如，两个、三个、四个等)剂量。在另一个实施方案中，可周一、周二及下个周一施用化合物或其药学上可接受的盐及然后可停止给药持续两周及重复该周期。在另一个实施方案中，可使用上述方案实施方案中的任一者及可省略一个或多个(例如，两个、三个、四个等)剂量。在此类实施方案中，省略的剂量可预防或减少患者的CRS。
在另一个说明性的方面，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体，其中对该患者施用至少第一剂量及第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一剂量与该第二剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约2倍至约15000倍，及ii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包括包含E2抗荧光素抗体片段的CAR。
在此实施方案中，可逐步递增化合物或其药学上可接受的盐的剂量以抑制或预防患者的细胞因子释放综合征。例如，可对患者施用化合物或其药学上可接受的盐的至少第一剂量及第二剂量，其中该第一剂量与该第二剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约20倍至约15000倍、约2倍至约15000倍。在其他实施方案中，该第二剂量或后续剂量的量可比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约20倍、约2倍至约30倍、约2倍至约40倍、约2倍至约50倍、约2倍至约60倍、约2倍至约70倍、约2倍至约80倍、约2倍至约90倍、约2倍至约100倍、约2倍至约15000倍、约2倍至约10000倍、约5倍至约9000倍、约5倍至约8000倍、约5倍至约7000倍、约5倍至约6000倍、约5倍至约5000倍、约5倍至约4000倍、约5倍至约3000倍、约5倍至约4000倍、约5倍至约3000倍、约5倍至约2000倍、约5倍至约1000倍、约5倍至约750倍、约2倍至约750倍、约5倍至约500倍、约5倍至约100倍、约800倍至约15000倍、约800倍至约10000倍、约800倍至约9000倍、约800倍至约8000倍、约800倍至约7000倍、约800倍至约6000倍、约800倍至约5000倍、约800倍至约4000倍、约800倍至约3000倍、约800倍至约2000倍、约800倍至约1000倍、约8000倍至约15000倍、约8000倍至约10000倍、约8000倍至约9000倍、约15000倍、约10000倍、约9000倍、约8000倍、约7000倍、约6000倍、约5000倍、约4000倍、约3000倍、约2000倍、约1000倍、约500倍、约400倍、约300倍、约200倍、约100倍、约90倍、约80倍、约70倍、约60倍、约50倍、约40倍、约30倍、约20倍、约10倍、约5倍、或约2倍。
在剂量递增方法的另一个说明性实施方案中，可对患者施用至少第一剂量、第二剂量及第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一剂量、该第二剂量及该第三剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约2倍至约750倍，且其中该化合物或其药学上可接受的盐的该第三剂量的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约800倍至约10000倍。
在剂量递增方法的另一方面，可对患者施用至少第一剂量、第二剂量、第三剂量及第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一剂量、该第二剂量、该第三剂量及该第四剂量是不同的，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约2倍至约750倍，其中该第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约800倍至约7500倍，且其中该第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约8000倍至约15000倍。
在仍另一个实施方案中，该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量可比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约100倍，该第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量可比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量多约1000倍，且该第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量可比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量大约10000倍。在一个示例性的实施方案中，该化合物或其药学上可接受的盐的第一剂量为.05 nmol/kg，第二剂量为5 nmol/kg，第三剂量为50 nmol/kg且第四剂量为500nmol/kg。在本文中所述的剂量递增实施方案中，可多次施用该化合物或其药学上可接受的盐的第一、第二、第三、第四及任何后续剂量(例如，可在施用后续递增剂量之前，施用.05nmol/kg的第一剂量若干次)。
在本文中所述的另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体，ii)向该患者施用至少第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，其中该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约50%，及iii)向该患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物的剂量，其中所述CAR T细胞包括包含E2抗荧光素抗体片段的CAR。
在此剂量递减实施方案的各种实施方案中，该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量可低于该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量至少约60%，低于该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量至少约70%，低于该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量至少约80%，低于该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量至少约90%，低于该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量至少约95%，低于该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量至少约96%，低于该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量至少约97%，低于该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量至少约98%，低于该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量至少约99%，或低于该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量至少约99.5%。
在本文中所述的剂量递减实施方案的各种实施方案中，该第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐可为约100 nmol/kg至约1000 nmol/kg患者体重、约100 nmol/kg至约900 nmol/kg患者体重、约100 nmol/kg至约800 nmol/kg患者体重、约100 nmol/kg至约700nmol/kg患者体重、约100 nmol/kg至约600 nmol/kg患者体重、约200 nmol/kg至约600nmol/kg患者体重、约400 nmol/kg至约600 nmol/kg患者体重、或约500 nmol/kg患者体重。
在本文中所述的剂量递减实施方案的各种实施方案中，该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐可为约0.5 nmol/kg至约500 nmol/kg患者体重、约0.5 nmol/kg至约450nmol/kg患者体重、约0.5 nmol/kg至约400 nmol/kg患者体重、约0.5 nmol/kg至约350nmol/kg患者体重、约0.5 nmol/kg至约300 nmol/kg患者体重、约1 nmol/kg至约300 nmol/kg患者体重、约2 nmol/kg至约300 nmol/kg患者体重、约2 nmol/kg至约250 nmol/kg患者体重、约5 nmol/kg至约40 nmol/kg患者体重、或约40 nmol/kg至约150 nmol/kg患者体重。
在本文中所述的剂量递减实施方案的额外实施方案中，该方法还可包括施用第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中该第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐与该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐相同。在另一个实施方案中，该方法还可包括施用第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中该第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐与该第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐及该第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐相同。在另一个实施方案中，在该化合物或其药学上可接受的盐的第一剂量后施用的该化合物或其药学上可接受的盐的剂量可相对于该化合物或其药学上可接受的盐的第一剂量维持癌症生长的抑制。
在本文中所述的剂量递减实施方案的其他实施方案中，可以约1百万个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞至约40百万个表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的剂量施用表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞。在仍其他实施方案中，可每周一次或两次施用于该化合物或其药学上可接受的盐的第一剂量后施用的化合物或其药学上可接受的盐的剂量。
在本文中所述的剂量递减实施方案的仍其他实施方案中，该方法还可包括对患者施用叶酸类化合物、包含叶酸类化合物的缀合物(其中该包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分)或抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的活化的药剂的步骤。在另一个实施方案中，对患者施用抑制表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的活化的药剂且该药剂为阻断表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞结合至化合物或其药学上可接受的盐，但是不结合至癌症的药剂，且该药剂为荧光素胺、荧光素钠或荧光素。在另一个实施方案中，该药剂为荧光素钠。
在另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体且其中在施用包含CAR T细胞(其中所述CAR T细胞包含CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)的CAR T细胞组合物之前至少约一个小时，对该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐，ii)然后对该患者施用一个剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，及iii)然后对该患者施用第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐。在此预处理实施方案的各种实施方案中，可在施用CAR T细胞组合物之前至少约两小时、在施用CAR T细胞组合物之前至少约四小时、在施用CAR T细胞组合物之前至少约八小时、在施用CAR T细胞组合物之前至少约十二小时、在施用CAR T细胞组合物之前至少约十六小时、在施用CAR T细胞组合物之前至少约二十小时、或在施用CAR T细胞组合物之前至少约二十四小时，对该患者施用该化合物或其药学上可接受的盐的第一剂量，在各个情况下，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，所述CAR T细胞包含CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在此预处理实施方案的各种实施方案中，可在施用CAR T细胞组合物后至少约二十四小时、在施用CAR T细胞组合物后至少约二十小时、在施用CAR T细胞组合物后至少约十八小时、在施用CAR T细胞组合物后至少约十六小时、在施用CAR T细胞组合物后至少约十四小时、在施用CAR T细胞组合物后至少约十二小时、在施用CAR T细胞组合物后至少约十小时、在施用CAR T细胞组合物后至少约八小时、在施用CAR T细胞组合物后至少约六小时、在施用CAR T细胞组合物后至少约四小时、或在施用CAR T细胞组合物后至少约两小时，对该患者施用第二剂量的该化合物或其药学上可接受的盐，在各个情况下，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，所述CAR T细胞包含CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
在本文所述的任一实施方案中，其中叶酸类化合物为通过接头连接至靶向部分的配体，可在利用本文中所述方法治疗之前，使患者接受叶酸缺乏饮食，或可在饮食中对患者施用叶酸。在对患者施用叶酸的实施方案中，剂量范围可为例如约50 nmol/kg至约3000nmol/kg患者体重、约50 nmol/kg至约2000 nmol/kg、约50 nmol/kg至约1000 nmol/kg、约50 nmol/kg至约900 nmol/kg、约50 nmol/kg至约800 nmol/kg、约50 nmol/kg至约700nmol/kg、约50 nmol/kg至约600 nmol/kg、约50 nmol/kg至约500 nmol/kg、约50 nmol/kg至约400 nmol/kg、约50 nmol/kg至约300 nmol/kg、约50 nmol/kg至约200 nmol/kg、约50nmol/kg至约100 nmol/kg、约100 nmol/kg至约300 nmol/kg、约100 nmol/kg至约500nmol/kg、约100 nmol/kg至约1000 nmol/kg、约100 nmol/kg至约2000 nmol/kg患者体重。在其他实施方案中，剂量可为约100 nmol/kg、约150 nmol/kg、约200 nmol/kg、约250nmol/kg、约300 nmol/kg、约350 nmol/kg、约400 nmol/kg、约450 nmol/kg、约500 nmol/kg、约600 nmol/kg、约700 nmol/kg、约800 nmol/kg、约900 nmol/kg、约1000 nmol/kg、约2000 nmol/kg、或约3000 nmol/kg患者体重。在此类实施方案中，“kg”为患者体重的千克数。一方面，可例如每日、每周、每两周、每周三次或使用施用叶酸的任何适宜方案施用叶酸。
在本文中所述的各种实施方案中，在CAR T细胞施用后，所述CAR T细胞可以维持提高数量的循环CAR T细胞中长达约10天、长达约15天、长达约20天、长达约25天、长达约30天、长达约35天、长达约40天、长达约45天、长达约50天、长达约55天、长达约60天、长达约65天、长达约70天、长达约75天、或长达约80天。
在本文中所述的各种实施方案中，该化合物或其药学上可接受的盐的半最大有效浓度(EC50)可为约1 pM至约2 nM、约1 pM至约5 nM、约1 pM至约10 nM、约1 pM至约20 nM、约1 pM至约30 nM、约1 pM至约40 nM、约1 pM至约50 nM、约1 pM至约60 nM、约1 pM至约70nM、约1 pM至约80 nM、约1 pM至约90 nM、约1 pM至约100 nM、约1 pM至约200 nM、约1 pM至约300 nM、约1 pM至约400 nM、约1 pM至约500 nM、约1 pM至约600 nM、约1 pM至约700 nM、约1 pM至约800 nM、约1 pM至约900 nM、约1 pM至约1 nM、约1 pM至约900 pM、约1 pM至约800 pM、约1 pM至约700 pM、约1 pM至约600 pM、约1 pM至约500 pM、约1 pM至约400 pM、约1 pM至约300 pM、约1 pM至约200 pM、约1 pM至约100 pM、约1 pM至约90 pM、约1 pM至约80pM、约1 pM至约70 pM、约1 pM至约60 pM、约1 pM至约50 pM、约1 pM至约40 pM、约1 pM至约30 pM、约1 pM至约20 pM、约1 pM至约10 pM、或约1 pM至约5 pM。
在本文中所述的各种实施方案中，该化合物或其药学上可接受的盐与CAR T细胞的结合的Kd可为约1 nM至约100 nM、约1 nM至约200 nM、约1 nM至约300 nM、约1 nM至约400 nM、约1 nM至约500 nM、约1 nM至约600 nM、约1 nM至约700 nM、约1 nM至约800 nM、约1 nM至约900 nM、约100 nM至约500 nM、约100 nM至约400 nM、约100 nM至约300 nM、约100nM至约200 nM、约100 nM至约150 nM、或约130 nM。
在本文中所述的各种说明性实施方案中，可在CAR T细胞之前或之后约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10天或在CAR T细胞之前或之后的任何适宜天，第一次对患者施用该化合物或其药学上可接受的盐。
在本文中所述的各种实施方案中，可使用经EGFRt分选或未经分选的CAR T细胞。在另一个实施方案中，可使用具有低分化谱的CAR T细胞的“临床传真”批次。在另一个实施方案中，可使用CAR T细胞的“研究批次”。所述“临床传真”批次(约39% EGFRt+)可包含约66% TSCM及约32% TCM的CD4+子集及约95% TSCM及约3% TCM的CD8子集。该研究批次(约23%EGFRt+)可包含约32% TSCM、约53% TCM、约11% TEM及约3.7% TEFF的CD4子集及约44% TSCM、约0.28% TCM、约3.4% TEM及约52% TEFF的CD8子集。
在此预处理实施方案的各种额外实施方案中，不发生导致患者中的脱靶毒性的细胞因子释放，但是患者中表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞对癌症的毒性发生或脱靶组织毒性不发生，但是表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞对癌症的毒性发生，或该癌症包括肿瘤，及患者的肿瘤大小减少，但是脱靶毒性不发生，或在施用包含CAR T细胞(包含CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段)的CAR T细胞组合物之前，患者的肿瘤大小的减少大于未用化合物或其药学上可接受的盐预处理的患者。技术人员应了解，所述“靶”可为癌症(例如，肿瘤)。
在另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体，及ii)向该患者施用CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞且其中所述CAR T细胞包含CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段，且其中该小分子配体为PSMA配体及该靶向部分为FITC。在此实施方案中，通过接头连接至靶向部分的小分子配体可具有下式
Figure 364477DEST_PATH_IMAGE019
。
在又另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物包括通过接头连接至靶向部分的小分子配体，及ii)向该患者施用CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞且其中所述CAR T细胞包括包含E2抗荧光素抗体片段的CAR，且其中该小分子配体为CAIX配体及该靶向部分为FITC。在此实施方案中，通过接头连接至靶向部分的小分子配体可具有下式
Figure 716961DEST_PATH_IMAGE020
。
在仍另一个实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包括i)向患者施用第一化合物或其药学上可接受的盐，其中该第一化合物或其药学上可接受的盐包括通过接头连接至FITC的PSMA配体，ii)向该患者施用第二化合物或其药学上可接受的盐，其中该第二化合物或其药学上可接受的盐包括通过接头连接至FITC的CAIX配体，及iii)向该患者施用CAR T细胞组合物，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞且其中所述CAR T细胞包含CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。在此实施方案中，该第一化合物可具有下式
Figure 721826DEST_PATH_IMAGE021
及该第二化合物可具有下式
Figure 159760DEST_PATH_IMAGE022
。
在本文中所述方法的一个实施方案中，在对患者施用化合物或其药学上可接受的盐之前，或在对患者施用CAR T细胞组合物之前，将癌症成像，其中该CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，所述CAR T细胞包含CAR，该CAR包含E2抗荧光素抗体片段。在一个说明性实施方案中，成像经由PET成像发生。在其他说明性实施方案中，成像经由MRI成像或SPECT/CT成像发生。成像方法可为本领域中已知的任何适宜成像方法。在一个实施方案中，成像方法可涉及使用本文中所述的小分子配体，但是该配体连接至适用于本文中所述的成像类型的成像剂。
在本文所述的任一实施方案中，导致患者中的脱靶毒性的细胞因子释放可不发生，即使对表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的癌症的毒性发生。在本文所述的任何实施方案中，患者中脱靶组织毒性可不发生，即使对表达E2抗荧光素抗体片段的CAR T细胞的癌症的毒性发生。在本文所述的任何实施方案中，癌症可包括肿瘤，及患者的肿瘤大小可减少，但脱靶毒性不发生。在本文所述的任一实施方案中，可减少或预防CRS及该方法可导致患者的肿瘤体积的减少。在本文所述的任何实施方案中，由于可减少或预防由于CRS的体重损失。在本文所述的任何实施方案中，癌症可包括肿瘤及可获得对肿瘤的完全反应。
在本文中所述方法的另一实施方案中，可单独使用本文中所述方法中的任一者，或本文中所述方法中的任一者可本文所述与任何其他一种方法或多种方法组合使用。
实施例
实施例1
EC17剂量递减可降低疗法相关毒性
研究EC17剂量递减对CAR-T疗法的抗肿瘤活性及毒性(体重变化)的影响。使用两种不同抗荧光素scFv用于CAR构建体(图1)。CAR的第一构建体含有下列结构域：抗FL(FITC-E2)scFv-IgG4铰链(CH2 (L235D，N297Q)-CH3)-CD28 TM-4-1BB-CD3z-T2A-EGFRt。CAR的第二构建体含有下列结构域：抗FL(FITC-4M5.3)scFv-IgG4铰链(CH2 (L235D，N297Q)-CH3)-CD28TM-4-1BB-CD3z-T2A-EGFRt。各构建体的CAR的核酸序列及氨基酸序列如SEQ ID NOS: 1至4所示。将人类T细胞分离，活化及用携带适宜CAR基因的慢病毒载体转导。将具有CAR修饰的CD4+ T细胞及具有CAR修饰的CD8+ T细胞分离及在体外单独培养约7天。在用于动物研究的i.v.施用之前，将CD4+ CAR-T细胞及CD8+ CAR-T细胞以1:1比率混合。
将荷MDA-MB-231肿瘤(150至250 mm3)的小鼠用于体内研究以评价E2-CAR-T细胞。在研究的第一部分中，施用10或20百万个E2-CAR-T细胞，及在CAR-T施用后，将500 nmol/kgEC17在第2天、第9天、第16天、第23天等每周静脉内给药(如图2A中所示)。施用20百万个E2-CAR-T细胞的小鼠在第二EC17剂量后显示严重CRS且不得不用6 μmol/kg荧光素钠(NaFL)救援。10百万个及20百万个CAR-T组均在第三及第四EC17剂量后显示严重CRS且不得不用NaFL救援(如图5A及5B中所指示)。这两组均在E2-CAR-T疗法期间显示严重体重损失(约20%)，指示10或20百万个E2 CAR-T / EC17 500 nmol/kg SIW疗法具有严重毒性。(虽然单独的20百万个E2-CAR-T细胞亦显示抗肿瘤活性(图5A，空心圆圈)，但这可能由通常在体外培养较短时间的“年轻”T细胞中发现的同种异体HLA错配的TCR造成)。
在研究的第二部分中，将使用的E2-CAR-T细胞体外培养约2周。施用30百万个E2-CAR-T细胞及将EC17给药修改为递减。如图2B中所示，在CAR-T施用后2天，将500 nmol/kgEC17给药，然后每周(在CAR-T施用后第9天、第16天、第23天等)施用EC17的较低剂量(5、20或100 nmol/kg)。如图3A中所示，所有三个EC17递减组达成完全反应，指示桥递减不影响CAR-T的抗肿瘤活性。更重要的是，这三个EC17递减组无一显示任何严重CRS。如图3B中所示，所有递减组显示非常轻微体重损失，虽然相较于研究的第一部分(10或20百万个CAR-T细胞)施用更多CAR-T细胞(30百万个)。此类数据指示桥递减(一个高水平负荷剂量(loading dose)，接着降低水平的维持剂量)可降低毒性，同时维持CAR-T细胞的良好抗肿瘤活性。
亦评价第二构建体4M5.3-CAR (抗FL(FITC-4M5.3) scFv-IgG4铰链(CH2 (L235D，N297Q)-CH3)-CD28 TM-4-1BB-CD3z-T2A-EGFRt)。使用荷MDA-MB-231肿瘤(150至250 mm3)的小鼠用于体内研究以评价4M5.3-CAR-T细胞。在研究的第一部分中，施用10或20百万个4M5.3-CAR-T细胞，及在CAR-T施用后，将500 nmol/kg EC17在第2天、第9天、第16天、第23天等每周静脉内给药(如图2A中所示)。施用10或20百万个4M5.3-CAR-T细胞的小鼠在施用EC17剂量后没有显示严重CRS或体重损失(图6B)，但是其肿瘤全部减少且最终消失(图6A)。20百万个CAR-T细胞(上线)显示较10百万个CAR-T细胞(中线)更佳的抗肿瘤活性。
在研究的第二部分中，将使用的4M5.3-CAR-T细胞体外培养约2周。施用30百万个4M5.3-CAR-T细胞及将EC17给药修改为递减。如图2B中所示，在CAR-T施用后2天，将500nmol/kg EC17给药，然后每周(在CAR-T施用后第9天、第16天、第23天等)施用EC17的较低剂量(5、或20或100 nmol/kg)。如图4A中所示，100 nmol/kg EC17递减组显示最佳抗肿瘤活性且所有肿瘤都治愈(底线)，然而5 nmol/kg EC17组(从顶部第二线)或20 nmol/kg EC17组(从顶部第三线)都没有显示对CAR-T疗法的完全反应。数据指示CAR-T活性受针对递减使用的EC-17剂量控制。此外，如图4B中所示，三个递减组中的小鼠的体重损失亦取决于EC17剂量。100 nmol/kg EC17剂量递减组显示较利用5或20 nmol/lg EC17的其他两组更多体重损失。此类数据指示桥递减(一个高水平负荷剂量，接着降低水平的维持剂量)可控制CAR-T疗法的抗肿瘤活性及毒性二者。
E2-CAR与4M5.3-CAR之间的唯一差异为使用的scFv序列。经由以相同条件比较这两个CAR，当测试EC17剂量递减(5、或20或100 nmol/kg)时，发现10百万个E2-CAR-T细胞较10百万个4M5.3-CAR-T细胞具有更佳的抗肿瘤活性；30百万个E2-CAR-T细胞亦显示较30百万个4M5.3-CAR-T细胞更佳的抗肿瘤活性。
如本文中所用，“SEQ ID NO: 4”意指以加下划线“gac”密码子开始及用加下划线“ggc”密码子终止的序列。较长序列的此部分编码示例性4M5.3 CAR。将CAR插入T细胞膜。较长序列的其他部分包括不是插入该膜的CAR的部分且作为嵌合抗原受体起作用的信号肽、EGFRt结构域等的编码序列。如本文中所用，“SEQ ID NO: 3”意指以加下划线“D”开始及用加下划线“G”终止的序列。较长序列的此部分为插入T细胞膜的CAR的氨基酸序列。较长序列的其他部分包括不是插入该膜的CAR的部分且作为嵌合抗原受体起作用的信号肽、EGFRt结构域等的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，SEQ ID NO: 3可包含人源化或人类氨基酸序列或由人源化或人类氨基酸序列组成。SEQ ID NO: 3及4如上所述。将较长核酸序列的开始及终止密码子加下划线及该较长序列为可用于转导T细胞以制备4M5.3 CAR的示例性序列。
SEQ ID NO: 3 [4M5.3-CAR氨基酸序列(插入物)]
Figure 580377DEST_PATH_IMAGE023
Figure 115264DEST_PATH_IMAGE024
SEQ ID NO: 4 [4M5.3-CAR核酸序列(插入)]
Figure 228713DEST_PATH_IMAGE025
Figure 153944DEST_PATH_IMAGE027
实施例2
在输注至NSG小鼠中之前，CAR T细胞分化表型的表征
使用多色流式细胞术测定待输注至荷瘤小鼠中的CAR T细胞产品的表型。使用如图7A中所示的表面标记物的特定组合分析CD4+及CD8+子集的分化状态。未经分选的E2临床传真CAR T细胞产品主要由自我更新的Tscm/Tcm表型制成(图7B)。在图7B中，最高条为“Tscm”及较低条为“Tcm”。除了图8A中所示的CD8:CD4比率的差异外，目前E2临床传真CAR T细胞与先前经分选的E2/4M5.3 CAR-T细胞及早期GFP+ 4M5.3 CAR T体内研究制剂不同(如图8B中的饼状图所概述的)。在图8A中，在自左至右的10个组中，所述条表示下列– 1 (高条Tscm，较低条Tcm)，2 – (高条Tscm，较低条Tcm)，3 – (高条Teff，较低条Tem)，4 – (高条Tem，较低条Teff，最低条Tcm)，5 – (高条Teff，较低条Tem)，6 – (高条Tem，较低条Teff，最低条Tcm)，7 – (高条Teff，较低条Tscm)，8 – (高条Teff，较低条Tem)，9 – (高条Teff，较低条Tscm)，10 – (高条Teff，较低条Tsm，下个较低条Tem，最低条Tcm)。因此，当与过去具有更分化的Tem/Teff表型的CAR T制剂相比时，预期主要Tscm/Tcm表型的CAR T细胞具有较好抗肿瘤表型。出于相同原因，考虑相同EC17给药方案，对于目前CAR-T制剂的sCRS较先前CAR-T制剂更晚出现。
冷冻保存后CAR T细胞的恢复
将冷冻保存的CAR T细胞在37℃水浴中快速解冻，然后立即放入T细胞恢复培养基(补充有2%人类AB血清的含有谷氨酰胺的TexMACS™培养基(Miltenyi Biotec编号130-097-196))及50U/mL重组人类IL2中并在体外培养约3至5天用于T细胞恢复。
流式细胞术分析
将CAR T细胞从体外恢复培养基中收获及经由400g下离心5分钟沉淀。然后将所述T细胞再悬浮于补充有抗小鼠FcγIII/II受体(CD16/CD32)嵌段[克隆2.4G2；BD Bioscience，目录号553142以1:100 (v/v)稀释]及抗人类Fc嵌段[BD Biosciences，目录号564220以1:50 (v/v)稀释]二者的流式细胞术染色溶液[1%牛血清白蛋白、50mg/mL人类IgG (EquitechBio，目录号SLH56-0001)、含0.9%叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水，pH=7.4]中。利用在冰上于黑暗中添加至各样品(历时20分钟添加)的下列荧光染料缀合的单克隆抗体进行表面标记物染色：抗人类CD45RA-APCeF780 [克隆HI100，ThermoFisher编号47-0458-42以1:20 (v/v)稀释]、抗人类CD45RO-eF450 [克隆UCHL1，Thermofisher编号48-0457-42以1:20 (v/v)稀释]、抗人类CD8α-PECy7 [克隆RPA-T8，BD Bioscience，目录号557746以1:20 (v/v)稀释]、抗人类CD4-Percpe710 [克隆SK3，eBioscience目录号46-0047-42以1:20 (v/v)稀释]、生物素化的抗人类EGFR (西妥昔单抗(Cetuximab)；R&D Systems编号FAB9577B-100以1:10(v/v)接着PE缀合的抗生物素(BioLegend编号53-9895-82以1:400(v/v))。在表面标记物染色后，将T细胞用PBS洗涤及再悬浮于含有3 µM碘化丙锭的冷PBS中并转移至流式细胞术收集管中。在Gallios流式细胞术(Beckman Coulter，Brea, CA)上收集流式细胞术数据，其中收集最少20,000个事件及使用Kaluza v1.5软件分析数据。
实施例3
E2抗FITC抗体不与任何人类正常组织结合
使用具有与E2抗FITC CAR构建体中的那些相同的可变片段序列的E2抗FITC IgG抗体测试E2抗体是否具有与人类正常组织的任何结合。重组人类E2抗FITC IgG1 λ1于HEK293细胞中表达及使用蛋白质A亲和管柱纯化。经由使用SEC-HPLC分析，抗体的纯度超过98%。使用Mix-N-Stain DIG抗体标记试剂盒(Biotium)将抗体用地高辛(digoxigenin，DIG)标记。通过FACS测量DIG标记的E2抗体对FITC固定化珠的结合亲和力。在室温下，将各种浓度的DIG-E2 IgG与FITC固定化珠培育30分钟。洗涤后，添加单克隆抗DIG Ab及与珠培育30分钟。添加缀合eF660的抗小鼠二级抗体及与经洗涤的珠培育。针对eF660信号，经由FACS分析经洗涤的珠。将PE固定化珠用作阴性对照珠。将eF660的荧光强度对添加经DIG标记的E2-IgG的浓度作图及示于图9中。经由使用PRISM软件计算经DIG标记的E2抗体对FITC的结合亲和力。如图9B插入物中所示，Kd为约0.66 nM，指示经DIG标记的E2抗FITC抗体具有对FITC的高结合亲和力及可用于评价E2与人类正常组织结合。
开发IHC测定以测试E2抗体与人类组织的结合。将含有经FITC标记的KB细胞的琼脂块的福尔马林固定的石蜡包埋(FFEP)的组织切片用作阳性对照，而将未经标记的KB细胞的FFPE组织切片用作阴性对照。将组织切片去石蜡化及再水合，然后经由在91℃下，将组织切片用抗原修复缓冲液(pH 6.0)培育24分钟进行抗原修复，然后将DIG-E2抗体与再水合的组织切片培育及最后进行抗DIG IHC染色。简言之，添加单克隆抗DIG抗体及培育，随后为氧化物酶标记的抗小鼠二级抗体。如图10A中所示，经FITC标记的KB细胞显示阳性染色，指示E2抗体结合这些标记的KB细胞上的FITC。未标记的KB细胞不显示任何染色(图10B)。
将经DIG标记的E2抗体用人类多器官正常组织微阵列(FDA999，US Biomax, Inc)培育及使用相同IHC程序利用上述相同条件评价E2抗体与人类正常组织的结合。此多器官正常组织微阵列具有带有28种正常人类器官的99个核心，包括肾上腺(图11)、骨髓(图12)、乳腺(图13)、小脑组织(图14)、子宫颈(图15)、结肠(图16)、食道(图17)、眼睛(图18)、心脏(图19)、脑垂体(图20)、肾(图21)、喉(图22)、肝(图24)、肺(图25)、淋巴结(图26)、神经(图27)、卵巢(图28)、胰脏(图29)、前列腺(图30)、皮肤(图31)、小肠(图32)、脾(图23)、胃(图33)、横纹肌(图34)、睾丸(图35)、胸腺(图36)、舌头(图37)及子宫(图38)。在微阵列小组中包括取自至少3个正常人类个体的器官。如图11至38中所示，所测试的此类28种正常人类器官中的任一者中未发现阳性IHC染色，指示E2抗FITC抗体不具有与正常人类器官组织的任何结合。一些浆细胞在用DIG-E2抗体预培育的测试切片及未用DIG-E2抗体预培育的阴性对照切片二者中显示某些水平的染色强度，指示此弱染色是非特异性的。
总之，E2抗FITC抗体不与任何测试的人类正常器官组织结合，指示E2抗FITC CAR-T细胞自身不应结合至及攻击体内的任何人类正常组织。
实施例4
FITC-叶酸的合成
Figure 440569DEST_PATH_IMAGE028
在无水二甲亚砜(DMF)中，在四甲基胍及二异丙胺的存在下，将叶酸-γ-乙二胺偶合至异硫氰酸荧光素(FITC)异构体I (Sigma-Aldrich)。将粗产物装载在Xterra RP18制备型HPLC管柱(Waters)上及用梯度条件(以99% 5 mM磷酸钠(流动相A，pH 7.4)及1%乙腈(流动相B)开始及在10分钟内以20 mL/min的流率达到90% A及10% B)洗脱。在此类条件下，FITC-叶酸主峰通常在27至50分钟时洗脱。通过具有UV检测器的分析型逆相HPLC监测FITC-叶酸洗脱份的品质。将大于98.0%纯度(LCMS)的级分冻干以获得最终FITC-叶酸产物。如本领域中所知，亦将具有此结构的化合物称作EC17。
实施例5
FITC-PEG12-叶酸的合成
Figure 564383DEST_PATH_IMAGE029
将通用聚乙二醇(PEG) Nova TagTM树脂(0.2 g)装载至肽合成容器中及用异丙醇(i-PrOH) (3 x 10 mL)及二甲基甲酰胺(DMF，3 x 10mL)洗涤。使用含20%哌啶的DMF (3 x 10mL)进行9-芴基甲氧羰基(Fmoc)去保护。进行Kaiser测试以评估反应进展。然后向该容器中引入含Fmoc-L-谷氨酸5-叔丁酯(Fmoc-Glu-(O-t-Bu)-OH) (23.5 mg)的DMF溶液、N,N-二异丙基乙胺(i-Pr2NEt) (4当量)、及苯并三唑-1-基-氧基三吡咯啶膦六氟磷酸盐(PyBOP) (2当量)。使用含20%哌啶的DMF (3 x 10 mL)进行Fmoc去保护。然后向该容器中引入N10-TFA-Pte-OH (22.5 mg)、DMF、i-Pr2NEt (4当量)及PyBOP (2当量)的溶液。将氩气鼓泡2小时，及将树脂用DMF (3 x 3 mL)及i-PrOH (3 x 3 mL)洗涤。在树脂于二氯甲烷(DCM)中溶胀后，添加含1M羟基苯并三唑(HOBT)的DCM/三氟乙烷(TFE) (1:1) (2 x 3 mL)的溶液。将氩气鼓泡1小时，移除溶剂，及将树脂用DMF (3 x 3 mL)及i-PrOH (3 x 3 mL)洗涤。在树脂于DMF中溶胀后，添加含Fmoc-NH-(PEG)12-COOH (46.3 mg)的DMF溶液、i-Pr2NEt (4当量)及PyBOP(2当量)。将氩气鼓泡2小时，及将树脂用DMF (3 x 3 mL)及i-PrOH (3 x 3 mL)洗涤。使用含20%哌啶的DMF (3 x 10 mL)进行Fmoc去保护。进行Kaiser测试以评估反应进展。然后向该容器中引入含FITC (Life Technologies 21.4 mg)的DMF及i-Pr2NEt (4当量)的溶液，然后将氩气鼓泡2小时，及将树脂用DMF (3 x 3 mL)及i-PrOH (3 x 3 mL)洗涤。然后向该容器中添加含2% NH2NH2的DMF (2 x 2mL)。使用TFA:H2O:三异丙基硅烷(TIS) (95:2.5:2.5) (裂解液)将最终化合物自树脂裂解及在真空下浓缩。将浓缩产物在Et2O中沉淀及在真空下干燥。使用制备型RP-HPLC (流动相：A = 10 mM乙酸铵pH = 7，B = ACN；方法：0% B至30% B在30分钟内以13 mL/min)将粗产物纯化。汇集纯净级分并冻干，提供FITC-PEG12-叶酸。
实施例6
FITC-PEG20-叶酸的合成
Figure 848734DEST_PATH_IMAGE030
将乙二胺、聚合物结合(200至400目)的树脂(50 mg)装载至肽合成容器中及用DCM (3mL)接着DMF (3 mL)溶胀。然后向该容器中引入含于DMF中的Fmoc-PEG20-COOH溶液(131 mg，1.0当量)、i-Pr2NEt (6.0当量)及PyBOP (4.0当量)。将氩气鼓泡6小时，将偶合溶液排空，及将树脂用DMF (3 x 10 mL)及i-PrOH (3 x 10 mL)洗涤。进行Kaiser测试以评估反应进展。在各氨基酸偶合之前，使用含20%哌啶的DMF (3 x 10 mL)进行Fmoc去保护。重复以上顺序以完成与Fmoc-Glu-OtBu (72 mg，2.0当量)的反应及Tfa.喋酸(41 mg，1.2当量)偶合步骤。将树脂用含2%肼的DMF 3 x 10 mL洗涤(5分钟)以使喋酸上的三氟乙酰基保护基裂解及用i-PrOH (3 x 10 mL)接着DMF (3 x 10mL)洗涤。将树脂在氩气下干燥30分钟。使用裂解液将叶酸-肽自树脂裂解。引入10 mL裂解混合物及将氩气鼓泡1.5小时。将裂解混合物排入干净烧瓶中。将树脂用更多裂解混合物洗涤3次。将合并的混合物在减压下浓缩至更小体积(约5 mL)及在乙醚中沉淀。
经由离心收集沉淀，用乙醚洗涤(3次)及在高真空下干燥。在室温下，将经干燥的叶酸-PEG20-EDA (1.0当量)用含FITC (50 mg，1.5当量)的DMSO及DIPEA处理。经由LCMS监测反应进展。8小时后，消耗起始物质以得到产物。将粗制反应混合物经由制备型HPLC (流动相A = 10 mM乙酸铵，pH = 7；有机相B =乙腈；方法：0% B至30% B在35分钟内以13 mL/min)纯化及得到60%产率的FITC-PEG20-叶酸。
实施例7
FITC-PEG108-叶酸的合成
Figure 261260DEST_PATH_IMAGE031
将乙二胺、聚合物结合(200至400目)的树脂(50 mg)装载至肽合成容器中及用DCM (3mL)接着DMF (3 mL)溶胀。然后向该容器中引入含于DMF中的Fmoc-PEG36-COOH溶液(161 mg，1.0当量)、i-Pr2NEt (6.0当量)及PyBOP (4.0当量)。将氩气鼓泡6小时，将偶合溶液排空，及将树脂用DMF (3 x 10 mL)及i-PrOH (3 x 10 mL)洗涤。进行Kaiser测试以评估反应进展。在各氨基酸偶合之前，使用含20%哌啶的DMF (3 x 10 mL)进行Fmoc去保护。重复以上顺序以完成与2X Fmoc-PEG36-COOH (161 mg，1.0当量)、Fmoc-Glu-OtBu (72 mg，2.0当量)的反应及Tfa.喋酸(41 mg，1.2当量)偶合步骤。最后，将树脂用含2%肼的DMF 3 x 10 mL洗涤(5分钟)以使喋酸上的三氟乙酰基保护基裂解及用i-PrOH (3 x 10 mL)接着DMF (3 x10mL)洗涤。将树脂在氩气下干燥30分钟。使用裂解液将叶酸-肽自树脂裂解。引入10 mL裂解混合物及将氩气鼓泡1.5小时。将裂解混合物排入干净烧瓶中。将树脂用更多裂解液洗涤3X。将合并的混合物在减压下浓缩至更小体积(约5 mL)及在乙醚中沉淀。
经由离心收集沉淀，用乙醚洗涤(3X)及在高真空下干燥。在室温下，将经干燥的叶酸-PEG108-EDA (1.0当量)用含FITC (50 mg，1.5当量)的DMSO及DIPEA处理。经由LCMS监测反应进展。10小时后，消耗起始物质以得到产物。将粗制反应混合物经由制备型HPLC (流动相A = 10 mM乙酸铵，pH = 7；有机相B =乙腈；方法：0% B至30% B在35分钟内以13 mL/min)纯化及得到64%产率的FITC-PEG108-叶酸。
实施例8
FITC-DUPA的合成
Figure 289259DEST_PATH_IMAGE032
如下经由固相法合成DUPA-FITC。将通用Nova TagTM树脂(50 mg，0.53 mM)用DCM (3mL)接着DMF (3 mL)溶胀。将含20%哌啶的DMF (3 × 3 mL)溶液添加至该树脂，及将氩气鼓泡5分钟。将树脂用DMF (3 × 3 mL)及异丙醇(i-PrOH，3 × 3 mL)洗涤。在树脂于DMF中溶胀后，添加含DUPA-(OtBu)-OH (1.5当量)、HATU (2.5当量)及i-Pr2NEt (4.0当量)的DMF溶液。将氩气鼓泡2小时，及将树脂用DMF (3 × 3 mL)及i-PrOH (3 × 3 mL)洗涤。在树脂于DCM中溶胀后，添加含1M HOBt的DCM/TFE (1:1) (2 × 3 mL)的溶液。将氩气鼓泡1小时，移除溶剂及将树脂用DMF (3 × 3 mL)及i-PrOH (3 × 3 mL)洗涤。在树脂于DMF中溶胀后，添加含Fmoc-Phe-OH (2.5当量)、HATU (2.5当量)及DIPEA (4.0当量)的DMF溶液。将氩气鼓泡2小时，及将树脂用DMF (3 × 3 mL)及i-PrOH (3 × 3 mL)洗涤。重复以上顺序用于2个另外偶合的步骤，以添加8-氨基辛酸及异硫氰酸荧光素或异硫氰酸罗丹明B。使用裂解液将最终化合物自树脂裂解及在真空下浓缩。将浓缩产物于乙醚中沉淀及在真空下干燥。使用制备型RP-HPLC [λ = 488 nm；溶剂梯度：1% B至80% B在25分钟内，80% B洗涤30分钟运行；A = 10 mM NH4OAc，pH = 7；B =乙腈(ACN)]将粗产物纯化。在真空下移除ACN，及将经纯化的级分冻干以得到呈棕黄色固体的FITC-DUPA。RP-HPLC：tR = 8.0分钟(A = 10 mMNH4OAc，pH = 7.0；B = ACN，溶剂梯度：1% B至50% B在10分钟内，80% B洗涤15分钟运行)。1HNMR (DMSO-d6/D2O)：δ 0.98-1.27 (ms, 9H); 1.45 (b, 3H); 1.68-1.85 (ms, 11H);2.03 (m, 8H); 2.6-3.44 (ms, 12H); 3.82 (b, 2H); 4.35 (m, 1H); 6.53 (d, J =8.1 Hz, 2H), 6.61 (dd, J = 5.3, 3.5 Hz, 2H); 6.64 (s, 2H); 7.05 (d, J = 8.2Hz, 2H), 7.19 (m, 5H); 7.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 8.38 (s, 1H)。HRMS (ESI) (m/z)：(M + H)+针对C51H59N7O15S计算值1040.3712，实测值1040.3702。UV/vis：λ max = 491nm。
实施例9
FITC-PEG12-DUPA的合成
Figure 533159DEST_PATH_IMAGE033
将1,2-二氨基乙烷三苯甲基树脂(0.025 g)装载至肽合成容器中及用i-PrOH (3 x 10mL)，接着DMF (3 x 10mL)洗涤。然后向该容器中引入含Fmoc-NH-(PEG)12-COOH (42.8 mg)的DMF溶液、i-Pr2NEt (2.5当量)及PyBOP (2.5当量)。将所得溶液用Ar鼓泡1小时，将偶合溶液排空，及将树脂用DMF (3 x 10 mL)及i-PrOH (3 x 10 mL)洗涤。进行Kaiser测试以评估反应进展。使用含20%哌啶的DMF (3 x 10 mL)进行Fmoc去保护。重复此程序以完成所有偶合步骤(在其各自偶合步骤中使用2 x 1.5当量的Fmoc-Phe-OH及1.5当量的8-氨基辛酸及1.2当量的DUPA)。DUPA偶合后，将树脂用DMF (3 x 10 mL)及i-PrOH (3 x 10 mL)洗涤及在减压下干燥。使用裂解液将肽自肽合成容器中的树脂裂解。将15 mL裂解液添加至肽合成容器中，及将反应在Ar下鼓泡15分钟。将树脂用两个额外10 mL量的裂解液各处理5分钟。将裂解混合物浓缩至约5 mL及用乙醚沉淀。经由离心收集沉淀，用乙醚洗涤(3X)，及在高真空下干燥，产生粗物质的回收。在室温下，向经搅拌的含粗制DUPA-(PEG)12-EDA (10 mg)及FITC (5.6 mg)的二甲亚砜(DMSO，1 mL)溶液中添加i-Pr2NEt (5当量)及在氩气下搅拌6小时。经由LCMS监测反应及经由制备型HPLC (流动相：A = 10 mM乙酸铵pH = 7，B = ACN；方法：0% B至50% B在30分钟内以13 mL/min)纯化。汇集经纯化的级分及冻干，得到FITC-PEG12-DUPA。
实施例10
FITC-PEG11-NK1的合成
Figure 722832DEST_PATH_IMAGE034
在室温下，在氩气下，向经搅拌的含于干燥CH2Cl2中的NK-1 (0.02 g，0.0433 mmol，1.0 eq.)、O-(2-氨基乙基)-O'-[2-(Boc-氨基)乙基]十甘醇(BocNH-PEG11-NH2) (Sigma，0.0336 g，0.0521 mmol，1.2 eq.)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯啶基膦六氟磷酸盐(PyBOP)(0.027 g，0.0521 mmol，1.2 eq.)的溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA) (0.076 mL，0.4338 mmol，10 eq.)。经由LCMS监测反应进展及经由制备型RP-HPLC (Waters，XBridgeTMPrep C18，5 μm；19 × 100 mm管柱，流动相A = 20 mM乙酸铵缓冲液，pH 7，B =乙腈，梯度10至100% B在30分钟内，13 mL/min，λ = 220 nm，254 nm)纯化。收集纯净级分，蒸发所有有机溶剂及将样品冻干48小时以得到NK1-PEG11-NHBoc。产率：40.13 mg (97%)。向含NK1-PEG11-NHBoc (0.0165 g，0.015 mmol)的干燥DCM中添加三氟乙酸(TFA，20 eq.)及将反应混合物在室温下搅拌4小时。移除过量TFA，及将剩余溶液用水稀释及使用CH2Cl2 (3 x 5 mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)及浓缩。将获得的残余物在真空下干燥及用于下个步骤无需进一步纯化。在室温下，在氩气下，将经搅拌的含于干燥二甲亚砜(DMSO，0.3 mL)中的NK1-PEG11-NH2 (0.008 g，0.0081 mmol，1.0 eq.)、异硫氰酸荧光素(FITC)(Sigma，0.0037 g，0.0097 mmol，1.2 eq.)的溶液添加至二异丙基乙胺(0.0028 mL，0.0162mmol，2.0 eq.)中。经由LCMS监测反应进展及将产物经由制备型RP-HPLC (Waters，XBridgeTM Prep C18，5 μm；19 × 100 mm管柱，流动相A = 20 mM乙酸铵缓冲液，pH 7，B =乙腈，梯度10至100% B在30分钟内，13 mL/min，λ = 280 nm)纯化。收集纯净级分，蒸发所有有机溶剂及将样品冻干48小时以得到8.54 mg (77%)产率的FITC-PEG11-NK1。
*注释：经由两步程序自碱性配体开始合成NK-1化合物，该碱性配体经由使用文献中的程序制备。(参考：DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEUROKININ-1 RECEPTOR-BINDINGAGENT DELIVERY CONJUGATES，申请号：PCT/US2015/44229；其通过引用并入本文中)。
实施例11
FITC-PEG2-CA9的合成
Figure 622654DEST_PATH_IMAGE035
在50 mL圆底烧瓶中，使用Teflon磁性搅拌棒将CA9配体(53.6 mg)溶解于DMF (2至3mL)中。使用真空移除环境空气及用氮气置换，这在三个循环中完成。将圆底烧瓶保持在恒定氮气下。向该烧瓶中添加28.9 mg N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，接着21.6 mg 1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)及18.9 μL Boc-PEG2-NH2 (SigmaAldrich)。添加5.4 μL三乙胺(TEA)及将反应搅拌过夜。将反应混合物使用HPLC纯化及用UHPLC-MS证实(目标m/z 831)。使用高真空旋转蒸发移除乙腈及将产物冻干。将化合物与1:1 TFA:DCM混合30分钟。使用高真空旋转蒸发移除TFA/DCM，接着在高真空下30分钟。然后将化合物溶解于DMF中及与5摩尔当量的i-Pr2Net、16 mg异硫氰酸荧光素(LifeTechnologies)组合并搅拌1小时。将反应混合物经由HPLC纯化及将目标化合物用UHPLC-MS证实(目标m/z 1120)。将样品冻干及在-20℃下储存。
实施例12
FITC-DUPA
如下经由固相法合成DUPA-FITC。将通用Nova Tag树脂(50 mg，0.53 mM)用二氯甲烷(DCM) (3 mL)接着二甲基甲酰胺(DMF，3 mL)溶胀。将含20%哌啶的DMF (3 × 3 mL)溶液添加至该树脂，及将氩气鼓泡5分钟。将树脂用DMF (3 × 3 mL)及异丙醇(i-PrOH, 3 × 3mL)洗涤。在树脂于DMF中溶胀后，添加含DUPA-(OtBu)-OH (1.5当量)、HATU (2.5当量)及DIPEA (4.0当量)的DMF溶液。将氩气鼓泡2小时，及将树脂用DMF (3 × 3 mL)及i-PrOH (3× 3 mL)洗涤。在树脂于DCM中溶胀后，添加含1 M HOBt的DCM/三氟乙烷(TFE) (1:1) (2× 3 mL)的溶液。将氩气鼓泡1小时，移除溶剂及将树脂用DMF (3 × 3 mL)及i-PrOH (3× 3 mL)洗涤。在树脂于DMF中溶胀后，添加含Fmoc-Phe-OH (2.5当量)、HATU (2.5当量)及DIPEA (4.0当量)的DMF溶液。将氩气鼓泡2小时，及将树脂用DMF (3 × 3 mL)及i-PrOH (3× 3 mL)洗涤。重复以上顺序用于2个另外偶合的步骤，以添加8-氨基辛酸及异硫氰酸荧光素或异硫氰酸罗丹明B。使用三氟乙酸(TFA):H2O:三异丙基硅烷混合物(95:2.5:2.5)将最终化合物自树脂裂解及在真空下浓缩。将浓缩产物于乙醚中沉淀及在真空下干燥。使用制备型RP-HPLC [λ = 488 nm；溶剂梯度：1% B至80% B在25分钟内，80% B洗涤30分钟运行；A= 10 mM NH4OAc，pH = 7；B =乙腈(ACN)]将粗产物纯化。在真空下移除ACN，及将纯净级分冻干以得到呈棕黄色固体的DUPA-FITC。RP-HPLC：tR = 8.0分钟(A = 10 mM NH4OAc，pH =7.0；B = ACN，溶剂梯度：1% B至50% B在10分钟内，80% B洗涤15分钟运行)。1H NMR (DMSO-d6/D2O)：δ 0.98-1.27 (ms, 9H); 1.45 (b, 3H); 1.68-1.85 (ms, 11H); 2.03 (m,8H); 2.6-3.44 (ms, 12H); 3.82 (b, 2H); 4.35 (m, 1H); 6.53 (d, J = 8.1 Hz,2H), 6.61 (dd, J = 5.3, 3.5 Hz, 2H); 6.64 (s, 2H); 7.05 (d, J = 8.2 Hz, 2H),7.19 (m, 5H); 7.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 8.38 (s, 1H)。HRMS (ESI) (m/z)：(M + H)+针对C51H59N7O15S计算值1040.3712，实测值1040.3702。UV/vis：λ max = 491 nm。
Figure 251082DEST_PATH_IMAGE036
实施例13
FITC-CA9
在50 mL圆底烧瓶中，使用Teflon磁性搅拌棒将CA9配体(53.6 mg，实验室中合成)溶解于所需量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF) (2至3mL)中。使用真空移除环境空气及用氮气置换，这在三个循环中完成。然后将圆底烧瓶保持在恒定氮气下。向该烧瓶中添加28.9 mg N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，接着21.6 mg 1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)及18.9 μL Boc-PEG2-NH2 (购自Sigma Aldrich)。最后添加5.4 μL三乙胺(TEA)及允许将反应搅拌过夜。将反应混合物使用HPLC纯化及用UHPLC-MS证实(目标m/z 831)。使用高真空旋转蒸发移除乙腈及放在冷冻干燥机上48小时。利用1:1 TFA:DCM进行Boc的去保护持续30分钟。使用高真空旋转蒸发移除TFA/DCM，接着在高真空下30分钟。然后将化合物溶解于DMF中及与5摩尔当量的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)组合。将16 mg异硫氰酸荧光素(购自Life Technologies)添加至溶液中并搅拌1小时。将反应混合物经由HPLC纯化及将目标化合物用UHPLC-MS证实(目标m/z 1120)。将样品放在冷冻干燥机上48小时及在-20℃下储存。
Figure 552750DEST_PATH_IMAGE037
实施例14
FITC-NK1R
在室温下，在氩气下，向经搅拌的含于干燥CH2Cl2中的NK-1 (0.02 g，0.0433 mmol，1.0 eq.)、O-(2-氨基乙基)-O'-[2-(Boc-氨基)乙基]十甘醇(BocNH-PEG11-NH2) (Sigma，0.0336 g，0.0521 mmol，1.2 eq.)、苯并三唑-1-基-氧基三吡咯啶基膦六氟磷酸盐(PyBOP)(0.027 g，0.0521 mmol，1.2 eq.)的溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA) (0.076 mL，0.4338 mmol，10 eq.)。经由LCMS监测反应进展及经由制备型RP-HPLC (Waters，XBridgeTMPrep C18，5 μm；19 × 100 mm管柱，流动相A = 20 mM乙酸铵缓冲液，pH 7，B =乙腈，梯度10至100% B在30分钟内，13 mL/min，λ = 220 nm，254 nm)纯化。收集纯净级分，蒸发所有有机溶剂及将样品冻干48小时以得到NK1-PEG11-NHBoc。产率：40.13 mg (97%)。向含NK1-PEG11-NHBoc (0.0165 g，0.015 mmol)的干燥CH2Cl2中添加三氟乙酸(TFA，20 eq.)及将反应混合物在室温下搅拌4小时。移除过量TFA，用水稀释及使用CH2Cl2 (3 x 5 mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)及浓缩。将获得的残余物在真空下干燥及用于下个步骤无需进一步纯化。在室温下，在氩气下，将经搅拌的含于干燥二甲亚砜(DMSO，0.3 mL)中的NK1-PEG11-NH2 (0.008 g，0.0081 mmol，1.0 eq.)、异硫氰酸荧光素(FITC) (Sigma，0.0037 g，0.0097 mmol，1.2 eq.)的溶液添加至二异丙基乙胺(0.0028 mL，0.0162 mmol，2.0 eq.)中。经由LCMS监测反应进展及经由制备型RP-HPLC (Waters，XBridgeTM Prep C18，5 μm；19 × 100 mm管柱，流动相A = 20 mM乙酸铵缓冲液，pH 7，B =乙腈，梯度10至100% B在30分钟内，13 mL/min，λ = 280 nm)纯化。收集纯净级分，蒸发所有有机溶剂及将样品冻干48小时以得到NK1-PEG11-FITC (5)。产率：8.54 mg (77%)。
经由两步程序自碱性配体开始合成NK-1化合物，该碱性配体经由使用文献程序制备。(参考：DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEUROKININ-1 RECEPTOR-BINDING AGENTDELIVERY CONJUGATES，申请号：PCT/US2015/44229；其全文通过引用并入本文中)。
实施例15
体外共培养物E2 CAR T活化及靶细胞杀死测定
在0.5百万至2百万个T细胞/毫升T细胞生长培养基(TexMACS培养基+ 2%人类AB血清+50 U/mL重组人类IL2)的细胞密度，将E2 CAR T细胞解冻并从低温保存恢复4天。亦将表达不同水平的表面叶酸受体的靶细胞解冻及在生长培养基(叶酸缺乏RPMI1640 + 10% FCS +盘尼西林/链霉素(pen/strep)持续4天)中从低温保存恢复。
在第1天，将100,000个靶细胞铺板于12孔组织培养板的2 ml生长培养基/孔中以允许靶细胞粘附及恢复。在第0天，将接受EC17桥分子的孔在组织培养培育器中用100 nM的EC17处理30分钟。之后，洗掉所有培养基及用无叶酸及EC17的新鲜生长培养基置换。在EC17培育期间，收获T细胞，计数及在EC17处理完成后，将100,000个E2 CAR T细胞以1:1 (E:T)的比率直接添加至含于总共3 ml生长培养基中的靶细胞的各孔及在37℃，5% CO2的标准组织培养湿度条件下，培育1及2天。使用一天共培养条件以测定经由靶细胞的E2 CAR T细胞活化及使用两天培育以测定靶细胞死亡。
为测定与具有不同水平的表面叶酸受体的靶细胞一天共培养后的E2 CAR T细胞活性水平，收获及汇集漂浮细胞与剩余粘附细胞，其中使用5分钟0.25%胰蛋白酶消化从组织培养板移除所述粘附细胞。将汇集的漂浮及粘附细胞用400 x重力离心步骤沉淀5分钟，然后再悬浮于流式细胞术染色溶液中。经由流式细胞术的用于E2 T细胞识别的表面标记物染色包括抗人类EGFR及抗人类CD3，而经由流式细胞术的CAR T细胞活化的检测利用抗人类CD137染色。将E2 CAR T细胞识别为EGFR+ CD3+，而经活化的CAR T细胞还共表达CD137 (参见流式细胞术方法)。
为测定在两天共培养后，具有不同水平的表面叶酸受体表达的靶细胞的E2 CAR T细胞杀死的功效，将汇集及粘附细胞以与以上一天共培养测定相同的方式沉淀，然后对E2CAR T标记物EGFR及CD3染色，然后洗涤，且通过将经流动抗体染色的样品与Alexa Fluor647缀合的重组膜联蛋白(Annexin) V (Invitrogen目录号A23204在提供的1X膜联蛋白染色缓冲液中以1:50稀释)和3 µM碘化丙锭再悬浮，对细胞凋亡标记物膜联蛋白V染色。
E2 CAR T细胞活化取决于靶细胞的EC17染色
为努力了解活化E2 CAR T细胞必需的叶酸受体的水平，进行与表达变化水平的表面叶酸受体(FR)的靶细胞一天共培养(图39)。将在一天共培养后活化的E2 CAR T细胞的百分比绘制在y-轴上，同时将测定时靶细胞的FR表达水平绘制在x-轴上。重要的是，在使用相同靶细胞进行测定的同一天，获得FR表达水平数据，将所述靶细胞用EC17处理，但是在无CAR T细胞下培养以避免FR高表达细胞的任何伪影经由CAR T细胞剔除。表达广泛范围叶酸受体的五种靶细胞系中的四种活化CAR T细胞至相似水平。有趣的是，表达低FR的细胞系OV90(下三角)表达如SKOV3细胞(菱形)的约50%的FR及活化如SKOV3细胞的约50%的CAR T细胞。这些数据显示广泛范围的EC17将活化E2 CAR T细胞至相似水平，表明存在结合至靶细胞的EC17的某个阈值，需要该阈值以得到E2 CAR T细胞的完全活化。此外，还表明存在将提供次佳E2 CAR T反应的FR表达的阈值。
E2 CAR T细胞的靶细胞杀死
为证实E2 CAR T细胞活化亦转变成靶细胞的成功杀死，我们进行两天共培养测定，然后经由流式细胞术观察靶细胞(EGFR- CD3-)事件及测定利用细胞凋亡表面标记物染色(膜联蛋白V染色)的靶细胞%。在图40中，将如所示(如x-轴上所标记)的相同五种靶细胞各自在三种不同条件(显示为三个不同条)下培养两天。各组中的第一个条表示靶细胞凋亡的基础水平，如为用EC17处理但是在 E2 CAR T细胞不存在下培养的靶细胞的那些。各组中的第二个条表示无靶细胞的任何先前EC17处理的CAR T加上靶细胞共培养物，而各组中的第三个条表示CAR T加上经EC17预处理的靶细胞。y-轴显示细胞凋亡(膜联蛋白V+)的靶细胞的百分比。从这些数据发现针对三个最高叶酸受体表达者(MDAMB231、HOS-FRα及IGROV1)，CAR T细胞活化良好转变成靶细胞杀死。然而，针对具有第四最低FR表达的SKOV3细胞(图39，x-轴)，相似E2 CAR T活化未转变成相似靶细胞杀死(图40)。SKOV 3细胞中的CAR T细胞活化与靶细胞凋亡之间的这种脱节可能不是低叶酸受体表达的结果。如先前所述，每种癌细胞可进化其自身抗细胞凋亡机制及可能如SKOV3细胞(但是在不同癌细胞系中)的FR表达水平可足够用于更高水平的靶细胞凋亡。
总之，来自图39及图40的数据证明需要结合至癌细胞的EC17用于细胞杀死。这些数据还表明在靶细胞结合的EC17的某个阈值以下，存在表面结合的EC17与E2 CAR T活化及杀死之间的线性关系。
实施例16
3H-叶酸结合测定
将所有肿瘤细胞系在含有10%经热灭活的胎牛血清的无叶酸的RPMI培养基中接种过夜。在第二天，将细胞在冰上用含有及不含有10 μM冷叶酸的100 nM 3H-叶酸培育15分钟。在利用冷1X PBS冲洗3次后，经全细胞裂解及将总细胞相关放射性在闪烁计数器中计数。通过减去叶酸竞争样品的计数测定3H-叶酸的FR特异性结合及使用3H-叶酸的比活性计算为分子数目/细胞。
图41证明这些细胞系中的各种水平的FR表达。FR水平顺序为：IGROV1 > MDA-MB-231、HOS-FRα > OV90、SKOV3。
实施例17
在具有及不具有皮下植入MDA-MB-231肿瘤的NSG小鼠中的EC17/E2-CAR T-细胞疗法
肿瘤植入
在37℃下，在5% CO2湿度氛围下，使MDA-MB-231肿瘤细胞在含有5至10% FBS的叶酸缺乏的RPMI 1640中生长。将MDA-MB-231肿瘤细胞以2.5 x 106个细胞/动物皮下接种。仅将42/66小鼠接种及使剩余22只小鼠保持无肿瘤。
CAR-T细胞施用
将经EGFRt分选的抗FITC E2 scFv-CAR T细胞在T-细胞冷冻培养基中冷冻。将经冷冻的CAR-T细胞的小瓶立即在-80℃下储存。将所述CAR-T细胞在37℃下快速解冻，用PBS洗涤两次及用于以10百万存活EGFRt+ E2 CAR-T细胞(CD4/CD8约1:1)/动物的动物注射。在输注当天取得小等分试样用于E2-CAR T-细胞表型的流式细胞术分析。
人类/小鼠细胞因子分析
将小鼠血液样品处理成血浆及在-20℃下储存直至使用。使用人类TH1细胞因子组(Biolegend，目录号740009)及人类造血干细胞细胞因子组(Biolegend，目录号740610)检测小鼠血液中的人类细胞因子。使用小鼠13-重(13-plex)炎性细胞因子组(Biolengend，编号740150)检测小鼠细胞因子。按照制造商的说明进行所有分析。
流式细胞术分析
全血细胞分析：血浆取自预定体积的经EDTA处理的全血，及将RBC用RBC裂解液裂解。然后将白血球沉淀再悬浮于流式细胞术染色溶液(1%牛血清白蛋白、50mg/mL人类IgG(Equitech Bio，目录号SLH56-0001)、含0.9%叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水，pH=7.4)中及使用下列抗体进行白血球表面标记物染色：抗人类CD45 [克隆HI30，eBioscience #47-0459-42在1:20 (v/v)稀释下]、抗人类CD137 [克隆4B4-1，BD Bioscience #564092在1:20 (v/v)稀释下]、抗人类CD8α [克隆RPA-T8，BD Bioscience，目录号557746在1:20 (v/v)稀释下]、抗人类CD4 [克隆SK3，eBioscience目录号46-0047-42在1:20 (v/v)稀释下]、抗人类EGFR [R&D systems，克隆Hu1，目录号FAB9577B在1:10(v/v)下]、抗人类PD1 [BDBiosciences，克隆EH12.1，目录号562511在1:20 (v/v)下]、抗人类LAG3 [BDBiosciences，克隆T47-530，目录号565616在1:20 (v/v)下]、抗人类TIM3 [BDBiosciences，克隆7D3，目录号565558在1:20(v/v)下]、抗人类CD3ε [BD Biosciences，克隆SK7，目录号557832在1:20 (v/v)下]。在白血球染色后，将细胞用PBS洗涤及再悬浮于含有53,000个CountBrightTM珠(Invitrogen目录号C36950)的冷PBS中及转移至流式细胞术收集管中。在Gallios流式细胞仪(Beckman Coulter，Brea，CA)上收集流式细胞术数据。根据Invitrogen的说明计算各血液样品中的CAR T细胞的浓度的测定。CAR T细胞经识别为人类CD3ε + EGFRt+事件且容易区分及使用KaluzaTM流式细胞术软件计数。然后将各经输注小鼠的循环中的CAR T细胞的数目在图表上表示为CAR T细胞的总数目/ 100 µL所分析的全血。通过利用不成对、双尾学生t-测试测定统计显著性，其中显著性设置为p<0.05。
肿瘤及组织分析：收获实体肿瘤(100至1000 mm3)，称重及切碎成小片，然后转移至50 mL含有20 mL肿瘤消化混合物的管中。该酶促肿瘤消化混合物由含0.5 mg/mL胶原酶IV (Sigma-Aldrich，目录号C5138)、0.5 mg/mL透明质酸酶(Sigma-Aldrich，目录号H3506)及0.1 mg/mL DNase I (Sigma-Aldrich，目录号DN25)的补充有抗生素的无血清及叶酸缺乏RPMI1640培养基组成。将肿瘤片段在37℃下在水平振荡器上以300 rpm消化1小时。之后，将肿瘤消化物以400 x g离心5分钟，及然后将经历红细胞裂解步骤的肿瘤细胞沉淀用经冷磷酸盐缓冲的盐水(PBS，pH 7.4)洗涤及最后通过40 µm尼龙细胞滤器过滤。
E2-CAR-T表型及体内增殖
已报导CAR T细胞在血液中的扩增及持久性与对临床研究中的CD19特异性CAR T疗法的反应相关。应合理假设，在我们体内模型中，具有E2 CAR T的循环血的较大池将允许对EC17定向的对FR+肿瘤的攻击的更大反应。作为E2 CAR T细胞疗法对EC17反应的测量，我们定量循环E2 CAR T细胞的数目/ 100 uL全血及观察到当相较于不接受EC17的群(群1及6)时，接受EC17刺激的群(群2、3、4及5)在循环中具有至少大于10倍的增加。重要的是，血液内的循环CAR T细胞的这种扩增符合抗原依赖性方式的CAR T细胞扩增。此外，我们还观察到在CAR T细胞输注后，循环CAR T细胞的升高数量持续长达54天及当与不接受EC17的群1及6比较时，CAR T持久性再次取决于EC17 (群2、3、4及5)。
肿瘤相对于无肿瘤小鼠
如图42中所示，将10百万个E2 CAR-T细胞静脉内注射至无肿瘤的初始NSG小鼠或荷MDA-MB-231肿瘤的NSG小鼠中。在CAR-T注射后第2天及第10天，将500 nmol/kg EC17静脉内给药，及在第二EC17剂量(第11天)后20小时将小鼠安乐死用于器官评价及血液分析。立即从血液分离血浆样品及在-20℃下储存直至细胞因子分析。在CAR-T注射后第12天，收获动物的分离组用于如上所述的FACS分析。
如图43中所示，荷瘤小鼠中的细胞因子减少是EC17依赖性的。相对于无EC17给药的那些，包括IL2、IFN-Ɣ、IL-10的细胞因子的水平在含有EC17的荷瘤小鼠中全部增加。在无肿瘤的初始小鼠中，在利用EC17给药的那些小鼠中亦观察到细胞因子产生的上调，但是无肿瘤小鼠中的增加相较于具有MDA-MB-231肿瘤的那些小鼠低得多(例如，针对IFN-γ，低23倍)。
荷瘤小鼠较无肿瘤小鼠具有高约23倍的IFN-γ产生。虽然在EC17 SIW500 x 2剂量后，无肿瘤小鼠(FD饮食持续约2个月)显示一些细胞因子产生，但是无经由FACS可检测的CAR-T细胞扩增。
实施例18
体外使用人源化抗FITC scFv E2-CAR构建体及经CAR修饰的T细胞证明的靶特异性活性
细胞系：除非另有指明，否则将所有细胞系维持在补充有2 mM L-谷氨酰胺(Cellgro)、25 mM HEPES (Irvine Scientific)及10%经热灭活的FBS (Hyclone)的RPMI 1640(Irvine Scientific)中。K562靶细胞系由Stanley Riddell博士(FHCRC)惠赠。K562 OKT3细胞系通过使用含有OKT3转基因的慢病毒转导产生。OKT3为栓系靶向CD3ε的scFv的膜。MDA-MB-231由Endocyte提供且在无叶酸DMEM中培养。经由与亚利桑那大学遗传学核心(University of Arizona Genetics Core)的DSMZ数据库匹配的STR谱鉴定所有细胞系。
细胞毒性及细胞因子分泌：进行四小时铬释放测定。简言之，将靶细胞用51Cr(PerkinElmer)标记过夜，在PBS中洗涤三次，及在96孔板中，在RPMI中以5x103个细胞/孔与T细胞以各种效应子对靶标(E:T)比率一式三份培育。收获S上清液用于γ-计数及计算特异性裂解。针对细胞因子分泌，将5x105个T-细胞与靶细胞以2:1的E:T比率在96孔板中一式三份铺板24小时，及根据制造商的说明使用Bio-Plex人类细胞因子组(Bio-Rad)经由细胞计数珠阵列分析上清液。针对经EC17标记的靶标，在铺板之前，将细胞在黑暗中在室温下用含100 nM EC17的PBS培育1小时。当使用EC17时，将细胞在测定期间用无叶酸RPMI培育。
细胞因子释放测定：
将CD4+ T细胞以2:1的T-细胞与靶标比率共培养24小时，且然后针对效应细胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α的存在分析上清液。一式三份运行测定及数据显示为平均值± SE。如图44中所示，我们观察到模拟物(Mock)及抗FLCAR T-细胞对与阳性对照细胞系K562-OKT3共培养反应，定量产生相似水平的细胞因子产生。与K562共培养后，模拟物或抗FLCAR T-细胞未产生细胞因子。细胞因子释放取决于EC17与MDA-MB-231细胞系的先前培育，并且抗FLCART-细胞是唯一能够引起针对EC17标记的MDA-MB-231的细胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α分泌的细胞。
铬释放测定：
将CD8+ T细胞与靶细胞以30:1、10:1、3:1或1:1比率共培养。描述一式三份孔的裂解百分比(平均值± SE)。如图45中所示，抗FLCAR T-细胞没有展示针对阴性对照(K562)或未经标记的MDA-MB-231细胞系的细胞毒性。然而，模拟物转导的细胞及抗FLCAR T-细胞均能诱导相似水平的针对阳性对照K562-OKT3细胞系的特异性裂解。此外，EC17标记的MDA-MB-231细胞被抗FLCAR T-细胞有效识别并裂解，然而模拟物T-细胞不能产生裂解。
实施例19
CAR-T细胞适体的结构
图46至49显示CAR-T细胞实验中使用的桥的结构及体外测定的其与针对桥的细胞类型的亲和力(例如，叶酸-FITC对表达叶酸受体的癌细胞)。图50显示桥与肿瘤细胞的结合(通过FACS分析)，所述肿瘤细胞用于体内模型中且表达对应于该桥的小分子配体的受体。
针对实施例20至30——参见图55至63。
实施例20
细胞系及试剂
除非另有指明，否则将所有FR+及FR-阴性癌细胞系维持在补充有10%经热灭活的胎牛血清的不含有(FFRPMI)或含有(RPMI) 2.4 μM叶酸(FA)的RPMI-1640培养基(Gibco BRL)中。将KB (具有HeLa标记物的表达FRα的人宫颈癌)及CHO-β (利用人类FRβ转染的中国仓鼠卵巢细胞)分别作为FRα及FRβ的来源用于放射性配体结合测定。MDA-MB-231代表人类三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系的FRα的亚克隆。针对AML研究，提供表达绿色荧光蛋白质(GFP)的FRβ-阳性(THP1-FRβ)及FR-阴性(THP1-FG12)细胞系的同基因对。二者自THP-1 (ATCC，TIB-202) (一种用于研究小儿科AML的常用细胞模型)建立，该AML最初源自患有单核细胞白血病的1岁男婴。针对骨肉瘤研究，通过具有编码人类FRα的FOLR1基因的FR-阴性HOS-143b(ATCC，CRL8303)的慢病毒转导建立HOS-FRα。HOS-143b最初系自13岁白种女士的原发肿瘤建立及在NSG小鼠中具高度致瘤性。用慢病毒萤火虫荧光素酶转导表达GFP的FR+ HOS-FRαfLuc及FR-阴性HOS-143bfLuc的生物发光对。
LEGENDplexTM人类细胞因子组购自BioLegend (San Diego, CA)。基于乳酸脱氢酶(LDH)的CytoTox 96®非放射活性细胞毒性测定试剂盒购自Promega (Madison，WI)。用于多色流式细胞术的可商购的抗人类抗体为：来自Thermo Fisher Scientific (Waltham，MA)的CD45RA (克隆HI100)、CD45RO (克隆UCHL1)、CD4 (克隆SK3)及CD69 (克隆FN50)；来自BDBioscience (San Jose, CA)的CD3ε (克隆SK7)、CD8α (克隆RPA-T8)、CD137/4-1BB (克隆4B4-1)、CD25 (克隆M-A251)、PD1 (克隆EH12.1)、LAG3 (克隆T47-530)及TIM3 (克隆7D3)；来自R&D systems (Minneapolis, MN)的经生物素化的抗人类EGFR (西妥昔单抗，克隆Hu1)；及来自BioLegend (San Diego, CA)的FRα (克隆LK26)。荧光团缀合的抗生物素也购自BioLegend。APC缀合的抗FITC小鼠IgG2a/κ抗体(克隆NAWESLEE)、CountBrightTM珠(Invitrogen)、膜联蛋白V染色缓冲液及AlexaFluor-647缀合的膜联蛋白V购自ThermoFisher Scientific。针对肿瘤组织的酶促消化，胶原酶IV、透明质酸酶及DNase I均购自Sigma-Aldrich (St. Louis，MO)。
在Endocyte合成EC17或叶酸-FITC [FA-(γ)-乙二胺-FITC]。3H-EC17购自Moravek biochemicals (Brea，CA)，具有约0.952 Ci/mmol的比活性或在Endocyte，通过FITC与3H-FA-(γ)-乙二胺(由ViTrax (Placentia，CA)制造)缀合制备，具有约1.2 Ci/mmol的比活性。3H-FA亦购自ViTrax，具有59 Ci/mmol的比活性。针对CRS救援，将荧光素钠给药溶液自AK-FLUOR® 25% (荧光素注射，USP)稀释，该AK-FLUOR®购自Purdue Pharmacy(NDC 17478-250-25)。
实施例21
人源化CAR构建体及经CAR修饰的T细胞
先前研究使用含有CD8α的铰链及跨膜序列及4-1BB/CD3ζ信号结构域(即，FITC-4M5.3-scFv-CD8α铰链-CD8αtm-4-1BB/CD3ζ)的GFP+第二代抗-FITC scFv (克隆4M5.3) CAR。为了转变至人类第一次测试，开发第二代全人类FITC-特异性(克隆E2) CAR构建体(本文中称作E2) (图55，上图)。经CAR修饰的T细胞示于图55，下饼状图中。
本文中所述的构建体为包括以下的FITC-特异性CAR构建体：(1)全人类抗FITCscFv (克隆E2，Kd = 0.75 nM)，(2)融合至CD28-跨膜结构域的IgG4铰链-CH2(L235D,N297Q)-CH3间隔子，(3)第二代4-1BB/CD3ζ-内域，及(4)细胞表面人类EGFRt标签(图55，上图) (SEQ ID NOS:1及2分别为核酸及氨基酸序列)。为产生经CAR修饰的T细胞，在利用编码CAR的epHIV7慢病毒载体共转染的293T细胞中产生慢病毒。供体CD4+及CD8+ T细胞经由免疫磁性选择纯化及分开或以约50:50比率转导。总之，进行仅一轮的CD3/CD28珠活化，接着一或两轮的快速体外扩增。针对临床前评价，使用若干批次的经EGFRt分选的CD4、CD8及未经分选的CD4/CD8 CAR-T细胞。在冷冻保存之前及在解冻后分析所有CAR-T细胞制剂以经由流式细胞术测定EGFRt表达及CD4/CD8比率。使用表面标记物的组合，分析在输注当天CD4+及CD8+ CAR-T细胞子集的分化状态并定义为TN，CD45RA+ CD45RO- CD62L+ CD95-初始T细胞；TSCM，CD45RA+ CD45RO- CD62L+ CD95+干细胞记忆T细胞；TCM，CD45RA- CD45RO+ CD62L+CD95+中枢记忆T细胞；TEM，CD45RA- CD45RO+ CD62L- CD95+效应记忆细胞；及TEFF，CD45RA+CD45RO- CD62L- CD95+效应T细胞。针对以下所述的临床前测试，研究包括两个批次的经EGFRt分选的纯CD4及CD8子集(在约1:1比率混合后)及若干批次的未经分选的约1:1 EGFRt+ CD4/CD8混合物，该混合物包含具有低分化特性的“临床传真”制剂。
在合成及评价的一系列不同CAR构建体中，选择全人类抗FITC scFv (FITC-E2)CAR作为临床前开发(图55)。此第二代全人类CAR由抗FITC scFv (克隆E2)、具有CH2区中的双突变(L235D及N297Q)以减少与FcγR的结合的IgG4-Fc间隔子/铰链、CD28跨膜结构域及经由T2A核糖体跳跃序列附加至细胞表面EGFRt标签的4-1BB/CD3ζ信号结构域组成(即，FITC-E2-scFv-IgG4铰链-CD28tm-4-1BB/CD3ζ-T2A-EGFRt)。针对临床前研究，以约1:1CD4/CD8比率制备经EGFRt分选及未经分选的E2 CAR-T细胞二者，及针对各体内实验，在CART细胞输注(第0天)时，经由流式细胞术常规进行T细胞亚型表型分析。经EGFRt分选的CAR-T细胞的典型表达模式包括约42% TSCM、10% TCM、12% TEM及34% TEFF的CD4及CD8子集二者(图55，左边饼状图)。仅将经EGFRt分选的CAR-T细胞用于共培养(图53、54、56、58、59及61)及药物动力学研究(图62)。针对肿瘤疗法，使用具有低分化特性的“临床传真”批次(图55，右边饼状图)及亦将此“临床批次”用于MDA-MB-231研究(图63)，及将研究批次用于THP1-FRβ及HOS-FRα研究(图57)。所述“临床传真”批次(约39% EGFRt+)包括约66% TSCM及约32% TCM的CD4+子集及约95% TSCM及3% TCM的CD8子集。该研究批次(约23% EGFRt+)更分化且包括32%TSCM、53% TCM、11% TEM及3.7% TEFF的CD4子集及44% TSCM、0.28% TCM、3.4% TEM及52% TEFF的CD8子集。
实施例22
EC17 CAM的双特异性亲和力
在基于细胞的放射性配体结合测定中，使用3H-EC17评估EC17 CAM的双特异性亲和力。对于与FR+靶的结合，将KB及CHO-β细胞预先接种于24孔组织培养盘中过夜及用含0.1、0.5、1、5、10、20及40 nM 3H-EC17的FFRPMI在37℃下培育2小时。之后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)冲洗及用1%十二烷基硫酸钠裂解。通过标准Pierce BCA蛋白质测定，量化全细胞裂解物的放射活性及细胞蛋白质含量的水平。计算每个细胞结合的3H-EC17分子的数目以分别测定FRα (KB)及FRβ (CHO-β)的解离常数(Kd) (图56)。
CAM控制的CAR T细胞疗法的主要组分：CAR-T细胞疗法的基本组分涉及作为假肿瘤抗原的FITC、高亲和力EC17 CAM (CAM等效于本申请中的桥或“化合物”)及经合理设计的抗FITC CAR及经CAR修饰的T细胞。出于免疫疗法及光学成像目的，已在临床中测试EC17。为直接定量其双特异性结合亲和力，合成3H-EC17及在分别代表FRα+及FRβ+靶细胞的KB及CHO-β细胞系上及在代表效应细胞的未经分选的EGFRt CAR-T细胞上进行放射性配体结合测定。当结合至其靶时，EC17展示对FRα及FRβ二者的相似亲和力，分别具有1.7 nM及0.8 nM的低Kd值(图56，图A)。结合至未经分选的E2-CAR-T细胞(约24% EGFRt+，约95:5 CD8/CD4比率)后，Kd值估计为约130 nM (图56，图B)。
实施例23
肿瘤模型
根据NIH指导方针及遵从由普渡大学动物使用及照料委员会(Purdue UniversityAnimal Use and Care Committee)批准的协议进行所有动物照料及使用。雌性4至5周大NOD/SCID γ (NSGTM)小鼠(备案号：005557)购自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。除非明确指明，否则在到达后及整个研究中，将所有动物维持在FA缺乏饮食下(TestDiet，St.Louis, MO)。为建立皮下异种移植，将MDA-MB-231及HOS-FRα分别以2.5 x 106及1 x 106个细胞/动物植入右胁腹区。针对静脉内异种移植，将THP1-FRβ细胞以5 x 106个细胞/动物接种。每周利用测径器测量皮下肿瘤2至3次及使用椭球体公式(长度x宽度2)/2计算。每个研究设计或当(i)动物具有≥20%的体重损失或接近垂死状态，(ii)皮下肿瘤大小达到≥1500mm3，或(iii)动物显示腹部肿胀及严重窘迫(即，THP1-FRβ)征兆时，进行安乐死。所有动物剂量(CAR-T细胞、EC17、荧光素钠)静脉内给予。
实施例24
肿瘤疗法
在治疗设置中，理论上可在CAR-T细胞注射之前或之后给予EC17 CAM。如本文中所述，在CAR-T细胞后2至3.5天施用EC17的第一剂量以允许荷瘤小鼠中的人类T细胞的观察期。使用两个批次的未经分选的E2 CAR-T细胞(23%或39% EGFRt+，1:1 CD4/CD8)用于体内研究。在各实验输注的当天(第0天)，将经冷冻的CAR-T细胞在37℃下快速解冻，用Dulbecco's 1XPBS (pH 7.4)洗涤及以所需EGFRt+ E2-CAR-T细胞剂量注射入尾静脉中。此外，通过流式细胞术分析CAR-T细胞的小等分试样的CD4对CD8比率及CAR-T细胞的分化状态。在EC17给药的第一天，根据荷瘤动物的肿瘤大小或静脉内植入(即，THP1-FRβ)后相同天数，将其随机分配至组。
实施例25
毒性及CRS救援
取决于CAR-T细胞剂量及如何施用EC17，接受FITC-特异性CAR-T细胞的荷瘤小鼠可经历严重CRS及不同程度的体重损失。因此，开发CRS分级系统(0至5量级)以从动物总体形态及社会行为经验地评估CRS毒性，以允许更好地选择CRS救援的时机。级别0及5分别指示正常(无CRS)或死亡(由于严重CRS)，而认为级别1、2及3至4为轻微、轻至中度及严重CRS (图57 A，表描述)。此外，有意地将所有EC17剂量在任何给定天结束时给予，以允许潜在CRS症状发展过夜。在紧随各EC17剂量的翌日，对动物评分及使用救援剂(诸如荧光素钠、叶酸及甲酰四氢叶酸)减轻CRS毒性。在此特殊情况下，在第0天，将具有高EGFRt+ CD4/CD8比率(约93:7)的一批E2 CAR-T细胞以约2.5百万CD8及约33百万CD4的混合物提供给荷HOS-FRα瘤小鼠(图57A，示意图)。当在第3、10及12天，分别将EC17以500、100及500 nmol/kg给药时，在第4及11天记录到低CRS (等级1至2)，但是在第13天记录到高CRS (等级3)。为减轻严重CRS毒性，在第13天早上以约96 mg/kg静脉内施用荧光素钠及在6小时后收集小鼠血浆样品用于分析CRS相关的细胞因子。
为仔细检查利用荧光素钠的CRS救援能力，开发CRS评分系统，该系统能在EC17施用后捕获严重CRS (等级3/4)的发作(图57A)。如由荷HOS-FRα瘤小鼠中的快速CRS发作(由于35百万总CAR-T细胞(93:7 CD4/CD8)的极高剂量)的挑战性情况所示，以人类等效剂量(在小鼠中，约95 mg/kg)的静脉内荧光素钠极迅速作用以减少源自CAR-T细胞的人类细胞因子(图57B)。
实施例26
统计
使用计算机程序GraphPad Prism (GraphPad Software Inc.，San Diego, CA)进行统计分析。使用学生t-测试或单因子ANOVA分析数据。若可适用，则进一步使用适宜的多重比较事后检验跨处理组分析数据。在所有测试中，认为* = p <0.05是统计上显著的。
实施例27
共培养实验
为研究EC17 CAM体外作用，将纯的EGFRt分选的CD4及CD8 CAR-T细胞以1:1比率混合且每个实验设计包括匹配经模拟物转导的T细胞。除了AML及骨肉瘤细胞系的FR+/-同基因对外，添加KB、MDA-MB-231及OV90以代表不同组织学肿瘤类型及FR表达水平。对所有FR+靶细胞系进行直接3H-FA结合测定以定量结合的FR分子的数目/细胞(图58；图例从上至下 = 从左至右的条)。在共培养实验之前，允许经冷冻保存的CAR-T细胞在T细胞培养基中恢复2至3天。将所有效应细胞及靶细胞用FFRPMI预先洗涤以移除可与EC17竞争的任何外源FA。在不添加任何外源细胞因子的FFRPMI中进行≤ 3天的短期共培养研究。
针对EC17剂量反应研究(图59，图A及B)，在10倍增量的0.1 pM至100 μM范围的EC17的存在下，将FR+细胞系(KB、MDA-MB-231、HOS-FRα、THP1-FRβ、OV90)与经EGFRt分选的E2-CAR-T细胞以1:1的效应子对靶标(E/T)比率共培养。在共培养24小时后，收获上清液以测定肿瘤细胞杀死。为研究体外T细胞活化的动力学及FR相关性(图60，图A至E)，在10 nMEC17的连续存在下，在FR+/-细胞系中以变化E/T比率(1:27、1:9、1:3、1:1、3:1)进行共培养。在共培养16及48小时后，将肿瘤细胞杀死的动力学定量。同时，在共培养44小时后取得一部分上清液用于测量IFNγ、IL-2及TNFα。使用Promega的 CytoTox 96® LDH测定试剂盒，将靶细胞杀死定量并表示为特异性裂解(%)，将该裂解%归一化至在限定的E/T比率的EC17的存在下的基础水平。使用LEGENDplexTM人类Th1细胞因子组(BioLegend，San Diego, CA)测定源自CAR-T细胞的细胞因子。
为了研究在FR+肿瘤细胞靶的存在下CAR-T细胞活化(图53)，最初利用MDA-MB-231、THP1-FRβ及HOS-FRα进行共培养实验。在暴露于含有100 nM EC17的培养基中30分钟后，将所有靶细胞洗涤及然后用经EGFRt分选的E2-CAR-T细胞(1:1 CD4/CD8)或经模拟物转导的对照T细胞以1:1 E/T比率培育。在共培养24小时后，经由流式细胞术分析T细胞活化标记物CD69、CD137 (4-1BB)及PD1的表面表达。针对T细胞耗尽研究(图54)，将FR+ (KB、MDA-MB-231、HOS-FRαfLuc、THP1-FRβ)及FR-阴性(HOS-143bfLuc、THP1-FG12)肿瘤细胞系用作靶标。此处，在第0天，在37℃下，将靶细胞不用或用0.1及10 nM EC17培育30分钟及通过使用抗FITC抗体复染细胞表面EC17来评估EC17“预负载”的状态(图61，图A)。三天后，分析共培养CAR-T细胞上的PD1、LAG3及TIM3抑制剂受体的表面表达及认为双阳性及三阳性细胞的更高频率接近耗尽的表型。因为此研究中使用的肿瘤细胞显示倍增时间的可变性，在共培养2天后，测量作为膜联蛋白V+的靶细胞凋亡(%)，并且针对在相同条件下，在T细胞不存在下培养的靶细胞的凋亡的背景水平归一化(图61，图B)。
功能FR评估
此类功能FR评估可适用于本文中所述的若干实例。除了用FRα (HOS-FRα)及FRβ(THP1-FRβ)转染的小儿科癌细胞系外，还包含不同组织学及FR表达水平的癌细胞系(图58)。如由放射性配体结合测定(100 nM 3H-FA，在37℃下1小时)所评估，此类细胞系上的总可得FR的排列顺序为：9 x 104个(OV90，表达低FR的卵巢癌细胞系)、1.9 x 105个(THP1-FRβ)、2.4 x 105个(HOS-FRαfLuc)、7 x 105 个(HOS-FRα)、2.1 x 106个(MDA-MB-231)及4.8 x106个(KB) FA分子/细胞。还包括作为FR-阴性对照的HOS-143b(fLuc)及THP1-FG12亲本细胞系。因此，共培养的FR+癌细胞系上的功能FR表达的一般排序为：KB > MDA-MB-231 > HOS-FRα > HOS-FRαfLuc > THP1-FRβ (AML) > OV90。
FR水平与靶细胞裂解及细胞因子产生的相关性
为分析FR依赖性，将5种FR+ (MDA-MB-231、KB、HOS-FRα、THP1-FRβ、OV90)及1种FR-阴性(HOS-143b)细胞系在10 nM EC17的连续存在下与E2-CAR-T细胞以变化E/T比率(1:27、1:9、1:3、1:1及3:1)共培养。在共培养16及48小时后，将特异性裂解(%)定量，及在共培养44小时后，测量培养基中的Th1细胞因子(IFNγ、IL-2、TNFα)。虽然特异性裂解的发作(约16小时)在不同肿瘤中变化，但是针对所有FR+癌细胞系，在48小时观察到特异性细胞裂解的增加(图60，图A)。一般花费更长时间(48小时)及更高E/T比率(≥1:1)看到表达最低FR的OV90细胞的显著活性(图60，图A)。表达高FR的KB细胞极慢反应及亦需要更高E/T比率(≥1:3)及更长暴露时间以造成显著细胞死亡(图60，图B，左图)。当足够效应细胞存在(≥ 1:1 E/T比率)时，所有FR+癌细胞在共培养48小时后反应。应注意的是，仅FR-阴性HOS-143b细胞基本上未受伤害(图60，图B，右图)。
为建立体外CAR-T细胞活性与FR表达的相关性，将16小时特异性裂解的值以1:1的E/T比率对肿瘤细胞上发现的功能FR水平作图(图58)。排除开始显示异常抗性的KB细胞，FR表达与细胞裂解发作之间存在强的半对数相关性，具有0.98的R值(图60，图C)。相似地，在与E2-CAR-T细胞以1:1的E/T比率共培养44小时后，所有(除了FR-阴性HOS-143b)肿瘤细胞都触发高水平的IFNγ、IL-2及TNFα产生(图60，图D)。针对Th1细胞因子产生，亦利用包含的所有细胞系观察到半对数相关性，R值分别为0.88 (IFNγ)、0.89 (IL-2)及0.89 (TNFα)(图60，图E)。在短期共培养中，发现MDA-MB-231对经由CAR-T细胞的杀死最敏感，但是HOS-FRα骨肉瘤及THP1-FRα AML亦以FR水平依赖性方式快速反应(图60，图C)。
EC17 CAM在体外效应子/靶细胞接合中的高效力
以其游离形式(即，每个FA配体一个FITC)的单价EC17不自动活化抗FITC CAR-T细胞。为研究CAR-T细胞活化的稳健性，以1:1的E/T比率使用5种FR+细胞系(KB、MDA-MB-231、HOS-FRα、THP1-FRβ、OV90)连同广泛范围的EC17浓度(0.1 pM至100 μM) (图59，图A及B)。在共培养24小时后，经由Promega的LDH细胞毒性测定试剂盒定量特异性裂解(%)。在所有细胞系中，EC17依赖性细胞裂解遵循具有稍微宽浓度平台(约0.1 nM至1 μM)的钟形剂量反应(图59，图A)。当将剂量反应曲线拟合至顶点(至多100 nM)时，分别在4.5 pM (MDA-MB-231)、5.3 pM (KB)、15 pM (THP1-FRβ)、30 pM (HOS-FRα)及418 pM (OV90)下获得半最大有效浓度(EC50)。然而，针对各细胞系获得的最大裂解在45% (MDA-MB-231)、27% (THP1-FRβ)、18%(HOS-FRα)、15% (OV90)及11% (KB)下不同排列(图59，图B)。低EC50值一般而言表明EC17在经由活化的E2-CAR-T细胞触发FR-特异性靶细胞裂解中是高度强效的。
体外EC17/FR-依赖性CAR-T细胞活化及耗尽
为检查抗原依赖性CAR-T细胞活化，将MDA-MB-231、THP1-FRβ及HOS-FRα细胞用100 nMEC17历时30分钟预负载。将细胞洗涤及然后与经EGFRt分选的E2-CAR-T细胞(1:1 CD4/CD8)或经模拟物转导的对照T细胞以1:1 E/T比率培育。在共培养24小时后，我们测量T细胞活化标记物CD69、CD137 (4-1BB)及PD1的表面表达(图53)。预负载EC17的MDA-MB-231及HOS-FRα为我们CAR-T细胞的强活化剂。表达相较于MDA-MB-231细胞低11-倍FR的THP1-FRβ细胞的确触发CAR-T细胞活化，但是在较低水平。重要的是，在此类条件下，模拟物对照T细胞没有活化。一些FR+肿瘤类型(例如，KB)显示对经由EC17指导的CAR T细胞的杀死的天然抗性(图56、58、59及60)，我们研究T细胞活化相对于耗尽作为EC17 CAM作用机理。出于此目的，选择FR+ (KB、MDA-MB-231、HOS-FRαfLuc、THP1-FRβ)及FR-阴性(HOS-143bfLuc、THP1-FG12)肿瘤细胞系二者。HOS-FRαfLuc表达比其亲本HOS-FRα低约5.6x水平的功能FR，且HOS-143bfLuc类似于HOS-143b是FR-阴性的(图59，图A)。此处，将无或利用EC17预负载(0.1或10 nM，在37℃下30分钟脉冲)的FR+ 及FR-阴性肿瘤细胞与经EGFRt分选的CAR-T细胞(1:1 CD4/CD8)以1:2的E/T比率培育(图54及图61，图B)。在第0天，利用缀合APC的抗FITC抗体(克隆NAWESLEE)复染膜结合的EC17，证实EC17剂量依赖性预负载(图61，图A)。三天后，针对T细胞活化/耗尽标记物PD1、LAG3及TIM3的上调及共表达，测量共培养的CAR-T细胞。在不存在靶细胞的情况下，E2-CAR-T细胞在与低频率双阳性或三阳性细胞培养中经历低级分化。有趣地是，肿瘤细胞单独(不具有EC17预负载)的存在似乎使CAR-T细胞“放松”至各种程度。但是当遇到预负载EC17的 FR+ (但是非FR-阴性)肿瘤细胞靶时，E2-CAR-T细胞经历显著分化与增加的耗尽标记物的共表达。基于三阳性及双阳性细胞的增加的频率，更耗尽的表型以KB > HOS-FRαfLuc> THP1-FRβ > MDA-MD-231的顺序出现在经共培养的CAR-T细胞上。虽然在第2天在所有FR+肿瘤细胞系中都看到EC17剂量依赖性细胞凋亡(膜联蛋白V+)，但是表达高FR的KB细胞再次不相称地显示低细胞凋亡(图61，图B)。
实施例28
CAR-T细胞扩增及肿瘤摄取的动力学
为研究CAR-T细胞体内扩增，分析以具有在第0天注射的约4.8百万经EGFRt分选的E2-CAR-T细胞(1:1 CD4/CD8)的15只荷MDA-MB-231瘤小鼠开始(图62，图A)。当在第2天肿瘤大小平均在约350 ± 60 mm3时，在第2、9、16、23及30天，给予至多6次500 nmol/kg的EC17的每周剂量。针对离体分析，在第9、16、23及30天在下个EC17剂量之前对3只动物取样，进行总共4次收集。对于比较，对在第2天具有约4.4x更大肿瘤大小(约1555 ± 79 mm3)的3只CAR-T小鼠给予相同EC17剂量。针对每次收集，经由流式细胞术分析新鲜血液及肿瘤样品(若可得)以确定人类CD3ε+ EGFRt+ CAR-T细胞的存在。此外，分析循环中的E2-CAR-T细胞的表型变化(TSCM、TCM、TEM及TEFF)及肿瘤浸润的CAR-T细胞(即，CD137/4-1BB、PD1)的活化状态。
EC17介导的体内CAR-T细胞扩增及肿瘤摄取
使用MDA-MB-231肿瘤模型进一步分析体内EC17与CAR-T细胞之间的动态相互作用，先前发现该模型是表达最高FR的肿瘤，在使用基于3H-FA的放射性配体结合测定在103 ± 15pmol/mg膜蛋白。在此研究中，在接受约4.8百万经EGFRt分选的E2-CAR-T细胞的荷瘤小鼠中研究CAR-T细胞扩增的动力学(图62，图A)。在单一EC17剂量七天后(即，研究第9天)，在小鼠血液中检测人类CD3ε+ EGFRt+ CAR-T细胞，其中在荷较大肿瘤的小鼠中以升高数量的循环(图62，图B)。除了趋向更高体内扩增外，此类由血液携带的CAR-T细胞在具有较大肿瘤的小鼠中也展示更分化特性(图62，图B，2504 ± 441 mm3相对于422 ± 16 mm3)。具有更小尺寸肿瘤的小鼠继续研究以接受总共5次的500 nmol/kg的每周EC17剂量。如图62，图C中所示，在第二EC17剂量后，MDA-MB-231肿瘤开始反应。在EC17施用后，小鼠的确经历轻微体重损失，尤其在第三剂量后。因为循环CAR-T细胞在第15天左右达到高峰且持续至多30天(经由流式细胞术最后分析)，观察到肿瘤浸润CAR-T细胞中的稳定增加(图62，图D，上图，虚线)。此外，CAR-T细胞经历血液中动态表型变化，从第9天的显著TSCM表型至利用连续EC17处理以后日子的更分化特性(图62，图D，底部条形图)。因此，此类肿瘤浸润CAR-T细胞经活化并表达早期(CD137/4-1BB)以及晚期(PD1) T细胞活化标记物(图 62，图E)。CD137/4-1BB表达在第9天左右达到高峰，而PD1表达自第9天至以后保持高。因此，EC17 CAM给药驱动体内CAR-T细胞活化，扩增及肿瘤摄取，导致稳健抗肿瘤免疫。
实施例29
离体流式细胞术
针对循环中的CAR-T细胞分析，从收集至含有乙二胺四乙酸抗凝剂的管中的预定体积的全血取出血浆。在裂解红细胞后，将白血球沉淀再悬浮于包含1%牛血清白蛋白、50 mg/mL人类IgG (Equitech Bio)及0.9%叠氮化钠的流式细胞术染色溶液中。将样品进行人类白血球表面标记物(CD3ε、CD4、CD8α、CD45RA、CD62L)及生物素化抗人类EGFR (西妥昔单抗)染色，接着缀合荧光团的抗生物素二级抗体染色。对于肿瘤浸润CAR-T细胞的分析，将预先称重的新鲜肿瘤片段精细切碎及用消化混合物酶促消化，该消化混合物由在37℃下用力振荡1小时的无血清FFRPMI中的0.5 mg/mL胶原酶IV、0.5 mg/mL透明质酸酶及0.1 mg/mL DNaseI组成。之后，肿瘤细胞沉淀经历红细胞裂解步骤，用冷PBS洗涤及通过40 µm尼龙细胞滤器过滤。将所得单细胞悬浮液进行EGFRt及人类白血球标记物(CD137/4-1BB及PD1)染色。在Gallios流式细胞仪上收集最少20,000个碘化丙锭阴性活细胞事件及用Kaluza软件，版本2.1 (Beckman Coulter，Brea, CA)分析。将小鼠血液中的CAR-阳性T细胞识别为人类CD3ε+EGFRt+事件及使用添加至各样品的相等数目的CountBrightTM珠(Invitrogen，Carlsbad,CA)计算绝对数目/血液体积。将肿瘤浸润CD3ε+ EGFRt+ CAR-T细胞的数目表示为分析的总活肿瘤细胞%。
实施例30
肿瘤疗法
为研究高饮食叶酸(图63，图A至D)的影响，在到达后，将两组NSG小鼠置于FA充足饮食(4 mg/kg，Envigo，Indianapolis, IN)或FA-缺乏饮食(TestDiet，St. Louis，MO)。在第0天，两组小鼠接受约10百万个相同“临床传真”CAR-T细胞，接着从第3天开始的无EC17或500nmol/kg 的EC17 SIW。在EC17施用的第一天，MDA-MB-231肿瘤大小在FA-充足小鼠中，平均大致约549 ± 184 mm3 (280至918 mm3)，及在FA-缺乏小鼠中，约559 ± 165 mm3 (356至961 mm3)。
高叶酸饮食对CRS及抗肿瘤活性的影响
先前，显示FA或FA配体的施用帮助降低荷MDA-MB-231瘤小鼠的CRS的严重度。为测试饮食叶酸的长期影响，将小鼠维持在限定饮食持续~73天及当其肿瘤在FA-充足小鼠中达到约549 ± 184 mm3 (280至918 mm3)及在FA-缺乏小鼠中约559 ± 165 mm3 (356至961 mm3)时使用(图63，图A至D)。在第0天，所有小鼠接受约10百万的相同E2-CAR-T细胞的“临床传真”，及经EC17处理的群从第2天(FA-充足)或第3天(FA-缺乏)开始接受8次的500 nmol/kg的每周剂量。如先前所见，EC17的第一全剂量一般是安全的且不造成任一饮食的小鼠中的任何CRS或体重损失。事实上，FA-充足动物在整个EC17治疗中都没有显示CRS症状，然而FA-缺乏动物在随后的每次EC17剂量都经历的2至3等级CRS及体重损失(至多约11.4%) (图63，图A，下图)。在EC17治疗的相同持续时间中，当相较于FA-充足饮食小鼠(在第59天，0.027至4.3 x 103/100 μL血液)时，在FA-缺乏饮食小鼠(在第52天，1.6至20.4 x 104/100 μL血液)中发现高得多水平的CD3ε+ EGFRt+ CAR-T细胞(图63，图B至C)。重要的是，在没有接受EC17治疗的FA-缺乏动物中未检测到CAR-T细胞扩增(图63，图C)。
因为我们以较先前研究更大尺寸的MDA-MB-231肿瘤开始，由于此10百万“临床传真”CAR-T细胞剂量的同种异体反应性的肿瘤消退不明显(图63，图A，上行)。FA-充足小鼠中的对照肿瘤(无EC17)似乎具有相较于FA-缺乏小鼠中的对照肿瘤更快生长动力学；但是总体上，在接受EC17的FA-充足小鼠中存在2/5治愈、2/5完全反应及1/5部分反应(图63，图A，上左图)。在FA-缺乏饮食小鼠中看到更稳健体内T细胞扩增及导致5/5治愈，虽然此类动物的健康在各CRS发作期恶化(图63，图A，上右图)。
在酶促消化后，使用抗人类EGFR (克隆Hu1)识别小鼠肿瘤团块内的MDA-MB-231癌细胞，我们分析从尽管连续EC17治疗仍经历复发的FA-充足饮食小鼠回收的三种肿瘤中的FRα蛋白质表达(克隆LK26)。经由流式细胞术检测，自最小肿瘤(21 mg)分离的EGFR+癌细胞表达FRα，而自两种更大肿瘤(90 mg及363 mg)分离的EGFR+癌细胞完全失去其FRα表达(图63，图D)。使用3H-FA的定量放射性配体结合测定，证实获自这些肿瘤的组织匀浆上的功能FR水平的损失(约2.1 pmol/mg结合蛋白质相对于来自未经治疗的动物的肿瘤中约103pmol/mg)。因此，FA-缺乏可导致增强的活性及CRS毒性；而非生理FA摄入预防CRS及连续消耗可导致降低的活性。

Claims (45)

1.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
i) 向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体；
ii) 向所述患者施用第一剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向所述靶向部分的CAR且其中所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段；和
iii) 向所述患者施用第二剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向所述靶向部分的CAR且其中所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
2.如权利要求1的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐不是抗体，且不包含抗体片段。
3.如权利要求1的方法，其中所述靶向部分不包含肽表位。
4.如权利要求1的方法，其中所述癌症为表达叶酸受体的癌症。
5.如权利要求1的方法，其中降低或预防CRS且所述方法导致所述患者的肿瘤体积减少。
6.如权利要求1的方法，其中所述CAR T细胞具有中枢记忆/效应记忆表型。
7.如权利要求1的方法，其中所述CAR T细胞的CD8:CD4比率为约1:1。
8.如权利要求1的方法，其中降低或预防因为CRS所致的体重损失。
9.如权利要求1的方法，其中所述癌症包括肿瘤且其中获得对所述肿瘤的完全反应。
10.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体；和
ii)向所述患者施用CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CAR T细胞包含指向所述靶向部分的CAR，其中所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段，且其中所述CAR T细胞组合物包含所述CAR T细胞和非转化T细胞的混合物。
11.如权利要求10的方法，其中所述CAR T细胞组合物包含选自以下比率的所述CAR T细胞和非转化T细胞的混合物：约1:5的所述CAR T细胞对非转化T细胞、约1:4的所述CAR T细胞对非转化T细胞、约1:3的所述CAR T细胞对非转化T细胞、约1:2的所述CAR T细胞对非转化T细胞、及约1:1的所述CAR T细胞对非转化T细胞。
12.如权利要求10的方法，其中所述CAR T细胞组合物包含所述CAR T细胞与非转化T细胞的混合物，其中所述CAR T细胞与非转化T细胞的比率为约1:1至约1:5。
13.如权利要求10的方法，其中在约10百万个所述CAR T细胞与约40百万个非转化T细胞的混合物中，施用CAR T细胞。
14.如权利要求10的方法，其中在以约15百万个所述CAR T细胞与约35百万个非转化T细胞的混合物中，施用CAR T细胞。
15.如权利要求10的方法，其中在以约20百万个所述CAR T细胞与约30百万个非转化T细胞的混合物中，施用CAR T细胞。
16.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体；
ii)向所述患者施用CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞组合物包含CAR T细胞，其中所述CAR T细胞包含指向所述靶向部分的CAR且其中所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段；和
iii)向所述患者施用叶酸类化合物；包含叶酸类化合物的缀合物，其中所述包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分；或抑制CAR T细胞的活化的药剂。
17.如权利要求16的方法，其中施用叶酸类化合物，并且所述叶酸类化合物是叶酸或甲酰四氢叶酸。
18.如权利要求16的方法，其中施用包含叶酸类化合物的缀合物，其中所述包含叶酸类化合物的缀合物不包括靶向部分。
19.如权利要求16的方法，其中施用抑制CAR T细胞的活化的药剂且所述药剂为阻断CAR T细胞结合至所述化合物或其药学上可接受的盐，但是不结合至所述癌症的药剂。
20.如权利要求16的方法，其中施用抑制CAR T细胞的活化的药剂。
21.如权利要求19的方法，其中所述药剂为荧光素胺、FITC或荧光素钠。
22.如权利要求16的方法，其中施用抑制CAR T细胞的活化的药剂且当CRS等级达到3或4时，施用所述抑制CAR T细胞的活化的药剂。
23.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
i)向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，且其中所述化合物或其药学上可接受的盐以约10 nmol/kg患者体重至约2500 nmol/kg患者体重的剂量施用，和
ii)向所述患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段，且其中所述CAR T细胞的剂量为约1百万个CAR T细胞至约15百万个CAR T细胞。
24.如权利要求23的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐以约10 nmol/kg患者体重至约100 nmol/kg患者体重的剂量施用。
25.如权利要求23的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐以约10 nmol/kg患者体重至约50 nmol/kg患者体重的剂量施用。
26.如权利要求23的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐以约10 nmol/kg患者体重至约20 nmol/kg患者体重的剂量施用。
27.如权利要求23的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐以约10 nmol/kg患者体重至约600 nmol/kg患者体重的剂量施用。
28.如权利要求23的方法，其中所述化合物或其药学上可接受的盐以约200 nmol/kg患者体重至约600 nmol/kg患者体重的剂量施用。
29.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
i) 向患者连续施用化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体，ii) 向所述患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段，和iii) 终止所述化合物或其药学上可接受的盐的连续施用，以抑制或预防患者的细胞因子释放综合征。
30.如权利要求29的方法，其中向所述患者连续施用所述化合物或其药学上可接受的盐持续至少一小时。
31.如权利要求29的方法，其中向所述患者连续施用所述化合物或其药学上可接受的盐持续至少四小时。
32.如权利要求29的方法，其中向所述患者连续施用所述化合物或其药学上可接受的盐持续至少六小时。
33.如权利要求29的方法，其中每周三次向所述患者施用所述化合物或其药学上可接受的盐。
34.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
i) 向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体，其中向所述患者施用至少第一剂量和第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述第一剂量与所述第二剂量是不同的，其中所述第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约2倍至约15000倍；和
ii) 向所述患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向所述靶向部分的CAR且其中所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
35.如权利要求34的方法，其中向所述患者施用至少第一剂量、第二剂量和第三剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中所述第一剂量、所述第二剂量和所述第三剂量是不同的，其中所述第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约2倍至约750倍，且其中所述第三剂量化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约800倍至约10000倍。
36.如权利要求34的方法，其中向所述患者施用至少第一剂量、第二剂量、第三剂量和第四剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中所述第一剂量、所述第二剂量、所述第三剂量和所述第四剂量是不同的，其中所述第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约2倍至约750倍，其中所述第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约800倍至约7500倍，且其中所述第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约8000倍至约15000倍。
37.如权利要求34的方法，其中所述第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约100倍，其中所述第三剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约1000倍，且其中所述第四剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐多约10000倍。
38.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
i) 向患者施用第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物包括经由接头连接至靶向部分的小分子配体；
ii) 向所述患者施用至少第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中所述第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约50%；和
iii) 向所述患者施用一个剂量的包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含指向所述靶向部分的CAR且其中所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
39.如权利要求38的方法，其中所述第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约60%。
40.如权利要求38的方法，其中所述第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约70%。
41.如权利要求38的方法，其中所述第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约80%。
42.如权利要求38的方法，其中所述第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约90%。
43.如权利要求38的方法，其中所述第二剂量的化合物或其药学上可接受的盐的量比所述第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐低至少约95%。
44.提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
i) 向患者施用第一剂量的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体且其中在施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物之前，向所述患者施用所述化合物或其药学上可接受的盐，其中所述CAR T细胞包含指向靶向部分的CAR，
ii) 然后向所述患者施用一个剂量的所述CAR T细胞组合物，和
iii) 然后向所述患者施用第二剂量的所述化合物或其药学上可接受的盐，其中所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
45.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：
i) 向患者施用化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物包含通过接头连接至靶向部分的小分子配体且其中每周一次向所述患者施用所述化合物或其药学上可接受的盐，和
ii) 向所述患者施用包含CAR T细胞的CAR T细胞组合物，其中所述CAR T细胞包含CAR，其中所述CAR包含E2抗荧光素抗体片段。
CN201980021107.5A 2018-01-22 2019-01-22 Car t细胞的使用方法 Pending CN112055595A (zh)

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862620414P 2018-01-22 2018-01-22
US62/620414 2018-01-22
US201862620706P 2018-01-23 2018-01-23
US62/620706 2018-01-23
US201862656233P 2018-04-11 2018-04-11
US62/656233 2018-04-11
US201862724171P 2018-08-29 2018-08-29
US62/724171 2018-08-29
US201862735627P 2018-09-24 2018-09-24
US62/735627 2018-09-24
US201862736727P 2018-09-26 2018-09-26
US62/736727 2018-09-26
PCT/US2019/014472 WO2019144091A1 (en) 2018-01-22 2019-01-22 Methods of use for car t cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112055595A true CN112055595A (zh) 2020-12-08

Family

ID=67299784

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980020371.7A Pending CN112292138A (zh) 2018-01-22 2019-01-22 Car t细胞的使用方法
CN201980021107.5A Pending CN112055595A (zh) 2018-01-22 2019-01-22 Car t细胞的使用方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980020371.7A Pending CN112292138A (zh) 2018-01-22 2019-01-22 Car t细胞的使用方法

Country Status (11)

Country Link
US (4) US11779602B2 (zh)
EP (2) EP3740217A4 (zh)
JP (2) JP7417542B2 (zh)
CN (2) CN112292138A (zh)
AU (2) AU2019209428A1 (zh)
BR (1) BR112020014913A2 (zh)
CA (2) CA3089319A1 (zh)
IL (1) IL276131A (zh)
SG (1) SG11202006886VA (zh)
TW (1) TW201940182A (zh)
WO (2) WO2019144095A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116376828A (zh) * 2023-06-02 2023-07-04 成都云测医学生物技术有限公司 一种诱导CD4+T细胞生成Treg细胞的方法及应用

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110612119A (zh) 2017-02-07 2019-12-24 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 磷脂醚(ple)car t细胞肿瘤靶向(ctct)剂
EP3589295A4 (en) 2017-02-28 2020-11-04 Endocyte, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF T CAR LYMPHOCYTE THERAPY
WO2019144095A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Methods of use for car t cells
EP3749695A4 (en) * 2018-02-06 2021-12-29 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) Fluorescein-specific cars exhibiting optimal t cell function against fl-ple labelled tumors
US20210346431A1 (en) * 2018-02-23 2021-11-11 Endocyte, Inc. Sequencing method for car t cell therapy
WO2022099153A1 (en) * 2020-11-09 2022-05-12 St. Jude Children's Research Hospital Novel vhl small molecule probes
CA3200076A1 (en) * 2020-11-30 2022-06-02 Purdue Research Foundation Combinations of small molecule drug conjugate and car-expressing cytotoxic lymphocytes and methods of treating cancer using the same
EP4032910A1 (en) * 2021-01-22 2022-07-27 ETH Zurich Bispecific binding agent that binds to cd3 and a fluorophore
WO2023115049A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Umoja Biopharma, Inc. Cytotoxic innate lymphoid cell and uses thereof
WO2023240282A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Umoja Biopharma, Inc. Engineered stem cells and uses thereof
CN117659205A (zh) * 2023-12-05 2024-03-08 北京同立海源生物科技有限公司 一种分选激活磁珠的偶联方法及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014100615A1 (en) * 2012-12-20 2014-06-26 Purdue Research Foundation Chimeric antigen receptor-expressing t cells as anti-cancer therapeutics
CN105814083A (zh) * 2013-10-15 2016-07-27 加州生物医学研究所 嵌合抗原受体t细胞开关和其用途
CN106132436A (zh) * 2014-02-21 2016-11-16 Ibc药品公司 通过诱导对trop‑2表达细胞的免疫应答的疾病疗法
JP2017507919A (ja) * 2014-01-13 2017-03-23 スティーブン・ジェイ・フォルマン Ｆｃスペーサー領域に変異を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びそれらの使用方法
WO2017177149A2 (en) * 2016-04-08 2017-10-12 Purdue Research Foundation Methods and compositions for car t cell therapy

Family Cites Families (393)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR870700095A (ko) 1985-01-28 1987-02-28 원본미기재 AraB 프로모터 및 미생물학적 방법에 의해 세크로핀을 포함한 폴리펩타이드를 제조하는 방법
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
IN165717B (zh) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US6004781A (en) 1988-01-22 1999-12-21 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding Ig-CD4 fusion proteins
US5906936A (en) 1988-05-04 1999-05-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Endowing lymphocytes with antibody specificity
IL86278A (en) 1988-05-04 2003-06-24 Yeda Res & Dev Endowing cells with antibody specificity using chimeric t cell receptor
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US6406697B1 (en) 1989-02-23 2002-06-18 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5216132A (en) 1990-01-12 1993-06-01 Protein Design Labs, Inc. Soluble t-cell antigen receptor chimeric antigens
US20020004052A1 (en) 1990-05-08 2002-01-10 David Berd Composition comprising a tumor cell extract and method of using the composition
US5914109A (en) 1990-06-15 1999-06-22 New York University Heterohybridomas producing human monoclonal antibodies to HIV-1
KR100246529B1 (ko) 1990-12-14 2000-04-01 스티븐 에이. 서윈. 엠.디. 수용체 관련된 신호 변환 경로를 위한 키메라 사슬
US6319494B1 (en) 1990-12-14 2001-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US20020111474A1 (en) 1990-12-14 2002-08-15 Capon Daniel J. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US6407221B1 (en) 1990-12-14 2002-06-18 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
IE920716A1 (en) 1991-03-07 1992-09-09 Gen Hospital Corp Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US5912170A (en) 1991-03-07 1999-06-15 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by protein-tyrosine kinase chimeras
US7049136B2 (en) 1991-03-07 2006-05-23 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US5851828A (en) 1991-03-07 1998-12-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
US5843728A (en) 1991-03-07 1998-12-01 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US6004811A (en) 1991-03-07 1999-12-21 The Massachussetts General Hospital Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras
US6753162B1 (en) 1991-03-07 2004-06-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
WO1992015671A1 (en) 1991-03-08 1992-09-17 Cytomed, Inc. Soluble cd28 proteins and methods of treatment therewith
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
ES2150424T3 (es) 1991-10-21 2000-12-01 Cell Genesys Inc Terapias celulares e inmunosupresivas combinadas.
US8211422B2 (en) 1992-03-18 2012-07-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
US5372930A (en) 1992-09-16 1994-12-13 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Sensor for ultra-low concentration molecular recognition
US7105159B1 (en) 1992-11-05 2006-09-12 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Antibodies to prostate-specific membrane antigen
EP1757695A3 (en) 1992-11-05 2008-02-27 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen
US6953668B1 (en) 1992-11-05 2005-10-11 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen
US5861156A (en) 1993-01-08 1999-01-19 Creative Biomolecules Methods of delivering agents to target cells
AU695869B2 (en) 1993-04-06 1998-08-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Chimeric cytokine receptors in lymphocytes
US5834256A (en) 1993-06-11 1998-11-10 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
US6051427A (en) 1993-06-11 2000-04-18 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
US5525503A (en) 1993-09-28 1996-06-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Signal transduction via CD28
US5935818A (en) 1995-02-24 1999-08-10 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecule encoding alternatively spliced prostate-specific membrane antigen and uses thereof
AU694222B2 (en) 1994-05-02 1998-07-16 Bernd Groner Bifunctional protein, preparation and use
US7354587B1 (en) 1994-07-06 2008-04-08 Immunomedics, Inc. Use of immunoconjugates to enhance the efficacy of multi-stage cascade boosting vaccines
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US5716614A (en) 1994-08-05 1998-02-10 Molecular/Structural Biotechnologies, Inc. Method for delivering active agents to mammalian brains in a complex with eicosapentaenoic acid or docosahexaenoic acid-conjugated polycationic carrier
EP0787188A1 (en) 1994-11-01 1997-08-06 Targeted Genetics Corporation Chimeric receptors for the generation of selectively-activatable t h?-independent cytotoxic t cells
US5837544A (en) 1995-02-02 1998-11-17 Cell Genesys, Inc. Method of inducing a cell to proliferate using a chimeric receptor comprising janus kinase
US5712149A (en) 1995-02-03 1998-01-27 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals
US6103521A (en) 1995-02-06 2000-08-15 Cell Genesys, Inc. Multispecific chimeric receptors
CA2212846A1 (en) 1995-02-24 1996-08-29 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Prostate-specific membrane antigen and uses thereof
US5830755A (en) 1995-03-27 1998-11-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services T-cell receptors and their use in therapeutic and diagnostic methods
WO1997004752A1 (en) 1995-07-26 1997-02-13 Duramed Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions of conjugated estrogens and methods for their use
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
US6451995B1 (en) 1996-03-20 2002-09-17 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Single chain FV polynucleotide or peptide constructs of anti-ganglioside GD2 antibodies, cells expressing same and related methods
US6261787B1 (en) 1996-06-03 2001-07-17 Case Western Reserve University Bifunctional molecules for delivery of therapeutics
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
US20020018783A1 (en) 1997-03-20 2002-02-14 Michel Sadelain Fusion proteins of a single chain antibody and cd28 and uses thereof
JP2002504827A (ja) 1997-06-11 2002-02-12 ニューヨーク ユニバーシティ プレニルシステインカルボキシルメチルトランスフェラーゼ、これをコード化するｄｎａ、およびその阻害剤のためのスクリーニング方法
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
US20090011984A1 (en) 1998-02-23 2009-01-08 Seppo Yla-Herttuala Biotin-binding receptor molecules
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
EA200001216A1 (ru) 1998-05-19 2001-06-25 Авидекс Лимитед Растворимый т-лимфоцитный рецептор
WO2000014257A1 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Fusion receptors specific for prostate-specific membrane antigen and uses thereof
WO2000023573A2 (en) 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies
DK1124568T3 (da) 1998-10-21 2008-01-02 Altor Bioscience Corp Polyspecifikke bindingsmolekyler og anvendelser deraf
US7217421B1 (en) 1998-11-03 2007-05-15 Cell Genesys, Inc. Cancer-associated antigens and methods of their identification and use
WO2000052184A1 (en) 1999-03-01 2000-09-08 Cell Genesys, Inc. Anti-neoplastic compositions and uses thereof
AU4418900A (en) 1999-04-16 2000-11-02 Celltech Therapeutics Limited Synthetic transmembrane components
US6699972B1 (en) 1999-06-25 2004-03-02 Academia Sinica Chimeric protein and method of controlling tumor growth using the protein
WO2001049318A1 (en) 2000-01-03 2001-07-12 Tr Associates, L.L.C. Novel chimeric proteins and methods for using the same
ES2286104T3 (es) 2000-02-14 2007-12-01 The Regents Of The University Of California Vacuna contra tumores especificos del riñon dirigida contra el antigeno g-250 del tumor de riñon.
US6770749B2 (en) 2000-02-22 2004-08-03 City Of Hope P53-specific T cell receptor for adoptive immunotherapy
WO2001074382A1 (en) 2000-03-31 2001-10-11 Purdue Research Foundation Method of treatment using ligand-immunogen conjugates
WO2001091625A2 (en) 2000-04-21 2001-12-06 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods and compositions for the diagnosis of schizophrenia
US6524572B1 (en) 2000-06-26 2003-02-25 Rainbow Therapeutic Company Targeting recombinant virus with a bispecific fusion protein ligand in coupling with an antibody to cells for gene therapy
DE60133287T2 (de) 2000-07-31 2009-03-26 Green Peptide Co., Ltd., Kurume Tumorantigen
US7666424B2 (en) 2001-10-17 2010-02-23 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Methods of preparing and using single chain anti-tumor antibodies
WO2002077029A2 (en) 2000-11-07 2002-10-03 City Of Hope Cd19-specific redirected immune cells
US20020132983A1 (en) 2000-11-30 2002-09-19 Junghans Richard P. Antibodies as chimeric effector cell receptors against tumor antigens
US7723111B2 (en) 2001-03-09 2010-05-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Activated dual specificity lymphocytes and their methods of use
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US7514537B2 (en) 2001-04-30 2009-04-07 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human gliomas
AU2002256390B2 (en) 2001-04-30 2007-08-30 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
US7939059B2 (en) 2001-12-10 2011-05-10 California Institute Of Technology Method for the generation of antigen-specific lymphocytes
US20070031438A1 (en) 2001-12-10 2007-02-08 Junghans Richard P Antibodies as chimeric effector cell receptors against tumor antigens
US20030170238A1 (en) 2002-03-07 2003-09-11 Gruenberg Micheal L. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
EP2181595A1 (en) 2002-08-16 2010-05-05 Yeda Research And Development Company Ltd. Tumor associated antigen, peptides thereof, and use of same as anti-tumor vaccines
US8809504B2 (en) 2002-09-03 2014-08-19 Vit Lauermann Inhibitor which is deactivatable by a reagent produced by a target cell
DE10244457A1 (de) 2002-09-24 2004-04-01 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Verfahren zur rationalen Mutagenese von alpha/beta T-Zell Rezeptoren und entsprechend mutierte MDM2-Protein spezifische alpha/beta T-Zell Rezeptoren
US20060018878A1 (en) 2003-03-11 2006-01-26 City Of Hope Dual antigen specific T cells with trafficking ability
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050113564A1 (en) 2003-11-05 2005-05-26 St. Jude Children's Research Hospital Chimeric receptors with 4-1BB stimulatory signaling domain
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
US20130266551A1 (en) 2003-11-05 2013-10-10 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric receptors with 4-1bb stimulatory signaling domain
US8652484B2 (en) 2004-02-13 2014-02-18 Immunomedics, Inc. Delivery system for cytotoxic drugs by bispecific antibody pretargeting
US7196062B2 (en) 2004-02-18 2007-03-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for treating glaucoma
ATE437657T1 (de) 2004-03-02 2009-08-15 Cellectar Inc Phospholipid-analoga für die behandlung von krebs
EP2112162B1 (en) 2004-07-10 2015-01-14 Fox Chase Cancer Center Genetically modified human natural killer cell lines
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
WO2006036445A2 (en) 2004-09-24 2006-04-06 Trustees Of Dartmouth College Chimeric nk receptor and methods for treating cancer
WO2007037780A2 (en) 2004-10-08 2007-04-05 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy with enhanced t lymphocyte survival
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
WO2007044033A2 (en) 2004-12-07 2007-04-19 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Therapeutic and diagnostic cloned mhc-unrestricted receptor specific for the muc1 tumor associated antigen
US20070036773A1 (en) 2005-08-09 2007-02-15 City Of Hope Generation and application of universal T cells for B-ALL
CA2632094C (en) 2005-12-02 2015-01-27 Wayne A. Marasco Carbonic anhydrase ix (g250) antibodies and methods of use thereof
US7919079B2 (en) 2006-03-31 2011-04-05 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Cancer immunotherapy compositions and methods of use
MX2008015524A (es) 2006-06-12 2009-01-13 Trubion Pharmaceuticals Inc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
US20080051380A1 (en) 2006-08-25 2008-02-28 Auerbach Alan H Methods and compositions for treating cancer
EP1900752A1 (en) 2006-09-15 2008-03-19 DOMPE' pha.r.ma s.p.a. Human anti-folate receptor alpha antibodies and antibody fragments for the radioimmunotherapy of ovarian carcinoma
WO2008045437A2 (en) 2006-10-09 2008-04-17 The General Hospital Corporation Chimeric t-cell receptors and t-cells targeting egfrviii on tumors
US9334330B2 (en) 2006-10-10 2016-05-10 Universite De Nantes Use of monoclonal antibodies specific to the O-acetylated form of GD2 ganglioside for the treatment of certain cancers
EP2087337A4 (en) 2006-11-03 2010-09-08 Purdue Research Foundation METHOD AND DEVICE FOR EX-VIVO FLOW CYTOMETRY
CA2667414C (en) 2006-11-13 2015-12-29 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of the human glucocorticoid receptor locus
US20080131415A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Riddell Stanley R Adoptive transfer of cd8 + t cell clones derived from central memory cells
US8748405B2 (en) 2007-01-26 2014-06-10 City Of Hope Methods and compositions for the treatment of cancer or other diseases
EP2123754B1 (en) 2007-01-30 2011-04-06 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. CHIMERIC Fc GAMMA RECEPTOR AND METHOD FOR DETERMINATION OF ADCC ACTIVITY BY USING THE RECEPTOR
LT2126054T (lt) 2007-01-31 2016-10-10 Yeda Research And Development Company Limited Peradresuotos, genetiškai modifikuotos t reguliavimo ląstelės ir jų naudojimas autoimuninės ir uždegiminės ligos slopinimui
WO2008097926A2 (en) 2007-02-02 2008-08-14 Yale University Transient transfection with rna
US8865169B2 (en) 2007-02-20 2014-10-21 Tufts University Methods and systems for multi-antibody therapies
HUE038506T2 (hu) 2007-03-30 2018-10-29 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Kostimuláló ligand konstitutív expressziója adoptív módon átvitt T-limfocitákon
JPWO2009020094A1 (ja) 2007-08-09 2010-11-04 第一三共株式会社 疎水性分子で修飾した抗体
WO2009091826A2 (en) 2008-01-14 2009-07-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car)
US20110070191A1 (en) 2008-03-19 2011-03-24 Wong Hing C T cell receptor fusions and conjugates and methods of use there of
DK2279253T3 (en) 2008-04-09 2017-02-13 Maxcyte Inc Construction and application of therapeutic compositions of freshly isolated cells
SI2132228T1 (sl) 2008-04-11 2011-10-28 Emergent Product Dev Seatle CD37 imunoterapevtik in kombinacija z njegovim bifunkcionalnim kemoterapevtikom
US20090324630A1 (en) 2008-04-21 2009-12-31 Jensen Michael C Fusion multiviral chimeric antigen
EP4032552B1 (en) 2008-08-26 2023-10-04 City of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
US8546425B2 (en) 2008-09-17 2013-10-01 Purdue Research Foundation Folate receptor binding conjugates of antifolates
EP4335932A2 (en) 2008-11-07 2024-03-13 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of monitoring conditions by sequence analysis
EP3936122A1 (en) 2008-11-24 2022-01-12 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for localized agent delivery
US20110178279A1 (en) 2009-08-03 2011-07-21 Williams John C Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects: application to anti-egfr antibodies
US8877199B2 (en) 2009-05-15 2014-11-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services B cell surface reactive antibodies
US20100322909A1 (en) 2009-06-17 2010-12-23 The University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Th1-associated micrornas and their use for tumor immunotherapy
AU2010301042B2 (en) 2009-10-01 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-vascular endothelial growth factor receptor-2 chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
WO2011053223A1 (en) 2009-10-27 2011-05-05 Immunicum Ab Method for proliferation of antigen-specific t cells
US9273283B2 (en) 2009-10-29 2016-03-01 The Trustees Of Dartmouth College Method of producing T cell receptor-deficient T cells expressing a chimeric receptor
WO2011059836A2 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient t cell compositions
SI2496698T1 (sl) 2009-11-03 2019-07-31 City Of Hope Skrajšan epiderimalni receptor faktorja rasti (EGFRt) za selekcijo transduciranih T celic
US8956860B2 (en) 2009-12-08 2015-02-17 Juan F. Vera Methods of cell culture for adoptive cell therapy
CN102762719A (zh) 2009-12-08 2012-10-31 威尔森沃尔夫制造公司 用于过继细胞疗法的细胞培养的改进方法
BR112012018899A2 (pt) 2010-01-28 2015-09-15 Philadelphia Children Hospital "método para purificar partículas de vetor de vírus adeno-associado."
WO2011097477A1 (en) 2010-02-04 2011-08-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Icos critically regulates the expansion and function of inflammatory human th17 cells
CN102844442B (zh) 2010-02-12 2016-09-07 昂考梅德药品有限公司 用于鉴定和分离表达多肽的细胞的方法
SA111320200B1 (ar) 2010-02-17 2014-02-16 ديبيوفارم اس ايه مركبات ثنائية الحلقة واستخداماتها كمثبطات c-src/jak مزدوجة
WO2011130491A2 (en) 2010-04-14 2011-10-20 Roger Williams Medical Center Methods and compositions for treating hiv
EP2566954B2 (en) 2010-05-04 2022-11-02 Yeda Research and Development Co. Ltd. Immunotherapy using redirected allogeneic cells
US9089520B2 (en) 2010-05-21 2015-07-28 Baylor College Of Medicine Methods for inducing selective apoptosis
US9242014B2 (en) 2010-06-15 2016-01-26 The Regents Of The University Of California Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ROR1) single chain Fv antibody fragment conjugates and methods of use thereof
US9163258B2 (en) 2010-07-23 2015-10-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method for the treatment of obesity
DE102010036122A1 (de) 2010-09-01 2012-03-01 Nora Systems Gmbh Bodenbelag
EP2614151B1 (en) 2010-09-08 2019-07-24 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Interleukin 15 as selectable marker for gene transfer in lymphocytes
US9212229B2 (en) 2010-09-08 2015-12-15 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Chimeric antigen receptors with an optimized hinge region
WO2012033885A1 (en) 2010-09-08 2012-03-15 Baylor College Of Medicine Immunotherapy of cancer using genetically engineered gd2-specific t cells
US9345748B2 (en) 2010-09-21 2016-05-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-SSX-2 T cell receptors and related materials and methods of use
US9267164B2 (en) 2010-09-26 2016-02-23 Da Yu Enterprises, L.L.C. Method of recombinant macromolecular production
US9845362B2 (en) 2010-10-08 2017-12-19 The University Of North Carolina At Charlotte Compositions comprising chimeric antigen receptors, T cells comprising the same, and methods of using the same
WO2012054825A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-mage-a3 t cell receptors and related materials and methods of use
WO2012076059A1 (en) 2010-12-09 2012-06-14 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Immune restricted peptides with increased efficacy
JP5947311B2 (ja) 2010-12-09 2016-07-06 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 癌を治療するためのキメラ抗原受容体改変ｔ細胞の使用
CA2821080C (en) 2010-12-14 2021-02-02 University Of Maryland, Baltimore Universal anti-tag chimeric antigen receptor-expressing t cells and methods of treating cancer
US9402865B2 (en) 2011-01-18 2016-08-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer
EP2673300B1 (en) 2011-02-11 2016-08-24 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Hla-restricted, peptide-specific antigen binding proteins
MX359513B (es) 2011-03-23 2018-10-01 Hutchinson Fred Cancer Res Metodo y composiciones para inmunoterapia celular.
EP2502934B1 (en) 2011-03-24 2018-01-17 Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Single chain antigen recognizing constructs (scARCs) stabilized by the introduction of novel disulfide bonds
SG193956A1 (en) 2011-04-01 2013-11-29 Sloan Kettering Inst Cancer T cell receptor-like antibodies specific for a wt1 peptide presented by hla-a2
PL2694549T3 (pl) 2011-04-08 2019-01-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeryczne receptory antygenowe anty-wariant III receptora czynnika wzrostu naskórka i ich zastosowanie do leczenia raka
EP2696894B1 (en) 2011-04-13 2017-11-01 Immunicum AB Method for priming of t cells
CN103502439B (zh) 2011-04-13 2016-10-12 因缪尼卡姆股份公司 用于抗原特异性t细胞增殖的方法
US9206257B2 (en) 2011-04-19 2015-12-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies specific for glypican-3 and use thereof
GB201108236D0 (en) 2011-05-17 2011-06-29 Ucl Business Plc Method
AU2012290342A1 (en) 2011-07-29 2014-01-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Switch costimulatory receptors
EP2747781B1 (en) 2011-08-23 2017-11-15 Roche Glycart AG Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
US9833476B2 (en) 2011-08-31 2017-12-05 The Trustees Of Dartmouth College NKP30 receptor targeted therapeutics
PT3392270T (pt) 2011-09-15 2020-11-24 Us Health Recetores de células t que reconhecem mage restrito a hlaa1 ou hla-cw7
US10421960B2 (en) 2011-09-16 2019-09-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA engineered T cells for the treatment of cancer
WO2013040371A2 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
US9708384B2 (en) 2011-09-22 2017-07-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Universal immune receptor expressed by T cells for the targeting of diverse and multiple antigens
JP6053688B2 (ja) 2011-10-07 2016-12-27 国立大学法人三重大学 キメラ抗原受容体
US9868774B2 (en) 2011-10-20 2018-01-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-CD22 chimeric antigen receptors
JP6074435B2 (ja) 2011-10-26 2017-02-01 ナショナル キャンサー センター 変異ｃｔｌａ４遺伝子移入ｔ細胞及びこれを含む抗がん免疫治療用組成物
WO2013063019A1 (en) 2011-10-28 2013-05-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for enhancing the therapeutic effect of anti-tumor t cells
WO2013063419A2 (en) 2011-10-28 2013-05-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania A fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting
US9422351B2 (en) 2011-11-03 2016-08-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Isolated B7-H4 specific compositions and methods of use thereof
WO2013070468A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3-specific antibody and uses thereof
CN107011426B (zh) 2011-11-11 2021-05-14 弗雷德哈钦森癌症研究中心 针对癌症的靶向细胞周期蛋白a1的t细胞免疫疗法
BR112014014105B1 (pt) 2011-12-16 2023-10-10 Targetgene Biotechnologies Ltd Método para modificar um sítio-alvo predeterminado no interior de um ácido nucleico genômico ou organelar alvo em uma célula hospedeira eucariótica por um complexo núcleoproteína
EP2794653B1 (en) 2011-12-23 2019-03-13 Pfizer Inc Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
US20140370012A1 (en) 2012-01-27 2014-12-18 Gliknik Inc. Fusion proteins comprising igg2 hinge domains
EP2814846B1 (en) 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
WO2013126726A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use
EP4275699A3 (en) 2012-02-22 2024-01-03 The Trustees of the University of Pennsylvania Use of the cd2 signaling domain in second-generation chimeric antigen receptors
CN104159917A (zh) 2012-02-22 2014-11-19 宾夕法尼亚大学董事会 使用icos基cars增强抗肿瘤活性和car持久性
EP3421489B1 (en) 2012-03-23 2021-05-05 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Anti-mesothelin chimeric antigen receptors
CA2869562C (en) 2012-04-11 2023-09-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
US9156915B2 (en) 2012-04-26 2015-10-13 Thomas Jefferson University Anti-GCC antibody molecules
NZ702108A (en) 2012-05-03 2016-09-30 Hutchinson Fred Cancer Res Enhanced affinity t cell receptors and methods for making the same
ES2719495T3 (es) 2012-05-07 2019-07-10 Dartmouth College Anticuerpo dirigido contra b7-h6, proteínas de fusión, y métodos de uso de los mismos
PT2852613T (pt) 2012-05-22 2019-05-20 Us Health Recetores de célula t anti-ny-eso-1 murinos
WO2013177224A1 (en) 2012-05-22 2013-11-28 Genentech, Inc. N-substituted benzamides and their use in the treatment of pain
PL2855667T3 (pl) 2012-05-25 2024-03-25 Cellectis Sposoby uzyskiwania metodami inżynierii allogenicznych i opornych na immunosupresję limfocytów t do immunoterapii
WO2013181543A1 (en) 2012-06-01 2013-12-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services High-affinity monoclonal antibodies to glypican-3 and use thereof
WO2013183786A1 (ja) 2012-06-08 2013-12-12 学校法人近畿大学 トランスポーターに対する抗体およびその用途
JP5863585B2 (ja) 2012-07-11 2016-02-16 三菱電機株式会社 大信号等価回路モデルを用いたトランジスタ特性計算装置
MX370495B (es) 2012-07-13 2019-12-13 Univ Pennsylvania Métodos para evaluar la conveniencia de células t transducidas para administración.
JP2015524255A (ja) 2012-07-13 2015-08-24 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 二重特異性抗体を共導入することによってｃａｒｔ細胞の活性を強化する方法
HUE053556T2 (hu) * 2012-07-13 2021-07-28 Univ Pennsylvania CAR-ok tumorellenes hatásának toxicitás-menedzsmentje
SG11201408398UA (en) 2012-07-13 2015-02-27 Univ Pennsylvania Compositions and methods for regulating car t cells
CN102775500A (zh) 2012-08-03 2012-11-14 郑骏年 嵌合抗原受体iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ及其用途
RU2700765C2 (ru) 2012-08-20 2019-09-19 Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер Способ и композиции для клеточной иммунотерапии
AU2013306076B2 (en) 2012-08-21 2018-01-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mesothelin domain-specific monoclonal antibodies and use thereof
KR102141259B1 (ko) 2012-09-04 2020-08-05 셀렉티스 멀티―체인 키메라 항원 수용체 및 그것의 용도들
WO2014043441A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services T cell receptors recognizing mhc class ii-restricted mage-a3
AU2013324049B2 (en) 2012-09-27 2017-09-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mesothelin antibodies and methods for eliciting potent antitumor activity
WO2014055442A2 (en) 2012-10-01 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
EP3597215A1 (en) 2012-10-02 2020-01-22 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Compositions and methods for immunotherapy
US9598489B2 (en) 2012-10-05 2017-03-21 The Trustees Of The Univeristy Of Pennsylvania Human alpha-folate receptor chimeric antigen receptor
US10117896B2 (en) 2012-10-05 2018-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
ES2824024T3 (es) 2012-10-10 2021-05-11 Sangamo Therapeutics Inc Compuestos modificadores de células T y usos de los mismos
US20140120136A1 (en) 2012-10-12 2014-05-01 The Babraham Institute Mir-155 enhancement of cd8+ t cell immunity
UY35103A (es) 2012-10-29 2014-05-30 Glaxo Group Ltd Compuestos de cefem 2-sustituidos
WO2014099671A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptors and immune cells targeting b cell malignancies
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
EP2948544A4 (en) 2013-01-28 2016-08-03 St Jude Childrens Res Hospital CHIMERIC RECEPTOR WITH NKG2D SPECIFICITY FOR CELL THERAPY AGAINST CANCER AND INFECTION DISEASES
CN105101803A (zh) 2013-02-06 2015-11-25 人类起源公司 具有改进特异性的修饰的t淋巴细胞
JO3529B1 (ar) 2013-02-08 2020-07-05 Amgen Res Munich Gmbh مضاد التصاق خلايا الدم البيض من أجل التخفيف من الاثار السلبية الممكنة الناتجة عن مجالات ارتباط cd3- المحدد
ES2868247T3 (es) 2013-02-15 2021-10-21 Univ California Receptor de antígeno quimérico y métodos de uso del mismo
WO2014130635A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells
DK2958943T3 (da) 2013-02-20 2019-12-09 Univ Pennsylvania Behandling af cancer ved anvendelse af humaniseret anti-EGFRvIII kimær antigenreceptor
US9434935B2 (en) 2013-03-10 2016-09-06 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Modified caspase polypeptides and uses thereof
EP3721902A1 (en) 2013-03-14 2020-10-14 The Scripps Research Institute Targeting agent antibody conjugates and uses thereof
US9499855B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Elwha Llc Compositions, methods, and computer systems related to making and administering modified T cells
JP6541639B2 (ja) 2013-03-14 2019-07-10 ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｔ細胞増殖をコントロールするための方法
US9402888B2 (en) 2013-03-14 2016-08-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
US9587237B2 (en) 2013-03-14 2017-03-07 Elwha Llc Compositions, methods, and computer systems related to making and administering modified T cells
EP3623380A1 (en) 2013-03-15 2020-03-18 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
US9561291B2 (en) 2013-03-15 2017-02-07 Imre Kovesdi Methods of targeting T-cells to tumors
US9657105B2 (en) 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
US9393268B2 (en) 2013-03-15 2016-07-19 Thomas Jefferson University Cell-based anti-cancer compositions with reduced toxicity and methods of making and using the same
CN105518018B (zh) 2013-03-15 2020-04-03 细胞基因公司 修饰的t淋巴细胞
US9446105B2 (en) 2013-03-15 2016-09-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimeric antigen receptor specific for folate receptor β
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
WO2014160627A1 (en) 2013-03-25 2014-10-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-cd276 polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors
KR102238226B1 (ko) 2013-05-14 2021-04-09 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 가공된 키메라 항원 수용체 (ｃａｒ) ｔ-세포의 인간 적용
WO2014186585A2 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
US9701758B2 (en) 2013-05-24 2017-07-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-CD19 scFv (FMC63) polypeptide
ES2883131T3 (es) 2013-05-29 2021-12-07 Cellectis Métodos para la modificación de células T para inmunoterapia utilizando el sistema de nucleasa CAS guiado por ARN
DK3004337T3 (da) 2013-05-29 2017-11-13 Cellectis Fremgangsmåde til konstruktion af T-celler til immunoterapi ved brug af RNA-guidet Cas nuklease-system
AU2014274916B2 (en) 2013-06-05 2019-10-31 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing partial apoptosis using caspase polypeptides
WO2014200891A1 (en) 2013-06-11 2014-12-18 THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTEMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES Her2-specific monoclonal antibodies and conjugates thereof
CA3098741A1 (en) 2013-06-25 2014-12-31 Vaccinex, Inc. Use of semaphorin-4d inhibitory molecules in combination with an immune modulating therapy to inhibit tumor growth and metastases
AU2014312119B2 (en) 2013-08-30 2019-09-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Administration of kynurenine depleting enzymes for tumor therapy
US20150073154A1 (en) 2013-09-11 2015-03-12 Equip, Llc Discrete PEG Based Dyes
CA3178299A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Tem8 antibodies and their use
AU2014337367B2 (en) 2013-10-15 2020-04-30 The Scripps Research Institute Peptidic chimeric antigen receptor T cell switches and uses thereof
US10144770B2 (en) 2013-10-17 2018-12-04 National University Of Singapore Chimeric receptors and uses thereof in immune therapy
BR112016009898A2 (pt) 2013-10-31 2017-12-05 Hutchinson Fred Cancer Res células-tronco/progenitoras hematopoiéticas e efetoras não-t modificadas e usos das mesmas
WO2015107075A1 (en) 2014-01-14 2015-07-23 Cellectis Chimeric antigen receptor using antigen recognition domains derived from cartilaginous fish
US9694033B2 (en) 2014-01-24 2017-07-04 The Cleveland Clinic Foundation IL-9 secreting CD8+ Tc9 cells and methods of treating cancer
CA2939093A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Immune Design Corp. Immunotherapy of cancer through combination of local and systemic immune stimulation
AU2015218396A1 (en) 2014-02-14 2016-08-11 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for activating T cells using an inducible chimeric polypeptide
JP2017513812A (ja) 2014-02-28 2017-06-01 ザ ロイヤル インスティチューション フォー ジ アドヴァンスメント オブ ラーニング／マギル ユニヴァーシティ 免疫療法用のａｐｃ活性剤としてのｔｃ−ｐｔｐ阻害剤
GB201403875D0 (en) 2014-03-05 2014-04-16 Cantargia Ab Novel antibodies and uses thereof
KR101605421B1 (ko) 2014-03-05 2016-03-23 국립암센터 B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도
EP3114217A4 (en) 2014-03-07 2017-09-20 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Caspase polypeptides having modified activity and uses thereof
ES2857226T3 (es) 2014-03-15 2021-09-28 Novartis Ag Receptor de antígeno quimérico regulable
MY191608A (en) 2014-04-07 2022-07-01 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-cd19 chimeric antigen receptor
US20170029531A1 (en) 2014-04-09 2017-02-02 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Inhibition of lactate dehydrogenase 5 (ldh-5) binding, incorporation, internalization and/or endocytosis to immune cells
US10865242B2 (en) 2014-04-10 2020-12-15 Seattle Children's Hospital Method and compositions for cellular immunotherapy
AU2015249655B2 (en) 2014-04-23 2021-01-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptors (CAR) for use in therapy and methods for making the same
GB2540694A (en) 2014-04-29 2017-01-25 Seattle Children's Hospital (Dba Seattle Children's Res Institute) CCR5 disruption of cells expressing anti-hiv chimeric antigen receptor (CAR) derived from broadly neutralizing antibodies
EP3155018A4 (en) 2014-06-06 2018-01-10 The California Institute for Biomedical Research Constant region antibody fusion proteins and compositions thereof
WO2015191874A1 (en) 2014-06-12 2015-12-17 Children's National Medical Center Generation of broadly-specific, virus-immune cells targeting multiple hiv antigens for preventive and therapeutic use
CN107109419B (zh) 2014-07-21 2020-12-22 诺华股份有限公司 使用cd33嵌合抗原受体治疗癌症
CN106687483B (zh) 2014-07-21 2020-12-04 诺华股份有限公司 使用人源化抗-bcma嵌合抗原受体治疗癌症
AR101829A1 (es) 2014-07-21 2017-01-18 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno cll-1
EP3177640B1 (en) 2014-08-08 2020-05-06 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University High affinity pd-1 agents and methods of use
WO2016025322A1 (en) 2014-08-09 2016-02-18 Purdue Research Foundation Design and development of neurokinin-1 receptor-binding agent delivery conjugates
WO2016025454A2 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Anthrogenesis Corporation Car-t lymphocytes engineered to home to lymph node b cell zone, skin, or gastrointestinal tract
JP7084138B2 (ja) 2014-08-19 2022-06-14 ノバルティス アーゲー 癌処置に使用するための抗ｃｄ１２３キメラ抗原受容体（ｃａｒ）
CA2959168A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Costimulation of chimeric antigen receptors by myd88 and cd40 polypeptides
CA2961654A1 (en) 2014-09-19 2016-03-24 City Of Hope Costimulatory chimeric antigen receptor t cells targeting il13r.alpha.2
WO2016054520A2 (en) 2014-10-03 2016-04-07 The California Institute For Biomedical Research Engineered cell surface proteins and uses thereof
WO2016057850A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Seattle Children' S Hospital (Dba Seattle Children' S Research Institute) Long poly (a) plasmids and methods for introduction of long poly (a) sequences into the plasmid
KR20230004907A (ko) 2014-10-14 2023-01-06 립타이드 바이오사이언스, 인코포레이티드 항-염증 특성을 갖는 펩타이드
EP3212772A4 (en) 2014-10-31 2018-10-03 Massachusetts Institute of Technology Delivery of biomolecules to immune cells
CN107207615A (zh) * 2014-11-05 2017-09-26 得克萨斯州大学系统董事会 基因修饰的免疫效应细胞和用于扩增免疫效应细胞的工程化细胞
US9879087B2 (en) 2014-11-12 2018-01-30 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
CN113897285A (zh) 2014-11-14 2022-01-07 麻省理工学院 化合物和组合物向细胞中的破坏和场实现的递送
PT3229810T (pt) 2014-11-17 2020-08-27 Cellectar Biosciences Inc Análogos de éter fosfolipídico como veículos de medicamentos direcionados para o cancro
CN107709353A (zh) 2014-12-02 2018-02-16 普拉斯派克特查特凯尔Rwmc有限责任公司 治疗癌症的方法和组合物
CN107429253B (zh) 2014-12-05 2021-11-05 希望之城公司 Cs1靶向性嵌合抗原受体修饰的t细胞
CA3008162A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20
JP6720176B2 (ja) 2014-12-15 2020-07-08 ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 治療用細胞のコントロールされた活性化または排除のための方法
WO2016100236A2 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlled elimination of therapeutic cells
US20190054117A1 (en) 2014-12-19 2019-02-21 Novartis Ag Dimerization switches and uses thereof
PT3560953T (pt) 2014-12-24 2024-03-26 Autolus Ltd Célula
EP3240803B1 (en) 2014-12-29 2021-11-24 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3240551A4 (en) 2014-12-31 2018-08-08 Anthrogenesis Corporation Methods of treating hematological disorders, solid tumors, or infectious diseases using natural killer cells
US9765330B1 (en) 2015-01-09 2017-09-19 Nant Holdings Ip, Llc Compositions and methods for reduction of allograft recognition and rejection
IL303543A (en) 2015-02-18 2023-08-01 Enlivex Therapeutics Rdo Ltd Combined immunotherapy and cytokine control therapy for cancer treatment
WO2016138034A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 The Regents Of The University Of California Binding-triggered transcriptional switches and methods of use thereof
WO2016138846A1 (en) 2015-03-02 2016-09-09 Shanghai Sidansai Biotechnology Co., Ltd Reducing immune tolerance induced by pd‐l1
CN107708710A (zh) 2015-03-17 2018-02-16 嵌合体生物工程公司 Smart CAR装置,DE CAR多肽,Side CAR及其使用
CA2984624A1 (en) 2015-03-18 2016-09-22 Baylor College Of Medicine Her2/erbb2 chimeric antigen receptor
US9717745B2 (en) 2015-03-19 2017-08-01 Zhejiang DTRM Biopharma Co. Ltd. Pharmaceutical compositions and their use for treatment of cancer and autoimmune diseases
WO2016154628A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Xiuli Wang Bi-specific targeted chimeric antigen receptor t cells
WO2016154621A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 The California Institute For Biomedical Research SWITCHABLE NON-scFv CHIMERIC RECEPTORS, SWITCHES, AND USES THEREOF
GB201505305D0 (en) 2015-03-27 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors
WO2016168769A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 The California Institute For Biomedical Research Chimeric receptor t cell switches for her2
US11091546B2 (en) 2015-04-15 2021-08-17 The Scripps Research Institute Optimized PNE-based chimeric receptor T cell switches and uses thereof
PL3294764T3 (pl) 2015-05-15 2021-06-28 City Of Hope Kompozycje chimerycznego receptora antygenowego
AU2016264363B2 (en) 2015-05-19 2019-07-25 Morphogenesis, Inc. Cancer vaccine comprising mRNA encoding a M-like-protein
EP3851110A1 (en) 2015-05-28 2021-07-21 Kite Pharma, Inc. Methods of conditioning patients for t cell therapy
JP2018522833A (ja) 2015-06-12 2018-08-16 イミューノメディクス、インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ， Ｉｎｃ． キメラ抗原受容体（ｃａｒ）コンストラクト、及びｃａｒコンストラクトを発現するｔ細胞（ｃａｒ−ｔ）またはｎｋ細胞（ｃａｒ−ｎｋ）による疾患治療
US9663756B1 (en) 2016-02-25 2017-05-30 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic separation of cellular supporting materials from cultured cells
WO2016210447A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 University Of Southern California Masking chimeric antigen receptor t cells for tumor-specific activation
GB201514328D0 (en) 2015-08-12 2015-09-23 Sigmoid Pharma Ltd Compositions
GB201514874D0 (en) 2015-08-20 2015-10-07 Autolus Ltd Cell
GB201514875D0 (en) 2015-08-20 2015-10-07 Autolus Ltd Receptor
WO2017035362A1 (en) 2015-08-26 2017-03-02 Achillion Pharmaceuticals, Inc. Use of complement pathway inhibitor compounds to mitigate adoptive t-cell therapy associated adverse immune responses
WO2017044487A1 (en) 2015-09-09 2017-03-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Genetic engineering of macrophages for immunotherapy
US9790467B2 (en) 2015-09-22 2017-10-17 Qt Holdings Corp Methods and compositions for activation or expansion of T lymphocytes
CN108601821B (zh) 2015-10-05 2023-09-19 精密生物科学公司 包含经修饰的人T细胞受体α恒定区基因的经遗传修饰的细胞
US11466097B2 (en) 2015-10-06 2022-10-11 City Of Hope Chimeric antigen receptors targeted to PSCA
GB201518816D0 (en) 2015-10-23 2015-12-09 Autolus Ltd Receptor
GB201518817D0 (en) 2015-10-23 2015-12-09 Autolus Ltd Cell
US20180320133A1 (en) 2015-11-05 2018-11-08 City Of Hope Methods for preparing cells for adoptive t cell therapy
US20180327781A1 (en) 2015-11-09 2018-11-15 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Novel rna-based vector system for transient and stable gene expression
TWI734715B (zh) 2015-11-19 2021-08-01 美商卡默森屈有限公司 趨化因子受體調節劑
TWI724056B (zh) 2015-11-19 2021-04-11 美商卡默森屈有限公司 Ｃｘｃｒ２抑制劑
JP2019506143A (ja) 2015-12-14 2019-03-07 ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 治療用細胞の活性化及び排除のための二重コントロール
US9849092B2 (en) 2015-12-21 2017-12-26 Gholam A. Peyman Early cancer detection and enhanced immunotherapy
MX2018008416A (es) 2016-01-08 2019-11-11 Univ California Polipéptidos heterodímericos condicionalmente activos y métodos para su uso.
IL304088A (en) 2016-01-11 2023-08-01 Univ Leland Stanford Junior Systems containing chimeric proteins and their uses for controlling gene expression
EP3402509A4 (en) 2016-01-14 2019-07-10 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) TUMOR SPECIFIC IFNA SECRETION BY CAR T CELLS FOR RESTORING SOLID TUMOR MICRO ENVIRONMENT
IL287889B2 (en) 2016-02-05 2024-03-01 Hope City Administration of transgenic T cells for the treatment of central nervous system cancer
GB201602563D0 (en) 2016-02-12 2016-03-30 Autolus Ltd Signalling system
GB201602571D0 (en) 2016-02-12 2016-03-30 Autolus Ltd Signalling system
AU2017219859A1 (en) 2016-02-16 2018-08-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Immunotherapy compositions and methods
WO2017143150A1 (en) 2016-02-19 2017-08-24 City Of Hope Bi-specific aptamer
US11111505B2 (en) 2016-03-19 2021-09-07 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
US10596274B2 (en) 2016-03-19 2020-03-24 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulated expansion thereof
EP3433276B1 (en) 2016-03-22 2021-12-22 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) Early intervention methods to prevent or ameliorate toxicity
EP3443001A4 (en) 2016-04-11 2020-04-29 Obsidian Therapeutics, Inc. REGULATED BIOCIRCUIT SYSTEMS
IL308798A (en) 2016-06-06 2024-01-01 Univ Texas Modified T cells - BAFF-R targeted chimeric antigen receptor
WO2017214170A2 (en) 2016-06-06 2017-12-14 City Of Hope Baff-r antibodies and uses thereof
GB201610512D0 (en) 2016-06-16 2016-08-03 Autolus Ltd Chimeric antigen receptor
GB201610515D0 (en) 2016-06-16 2016-08-03 Autolus Ltd Cell
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
US11555177B2 (en) 2016-07-13 2023-01-17 President And Fellows Of Harvard College Antigen-presenting cell-mimetic scaffolds and methods for making and using the same
RU2757002C2 (ru) 2016-08-09 2021-10-08 Сити Оф Хоуп Композиции химерного поксвируса и их применение
US9642906B2 (en) 2016-09-16 2017-05-09 Baylor College Of Medicine Generation of HPV-specific T-cells
WO2018075813A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 City Of Hope Use of endogenous viral vaccine in chimeric antigen receptor t cell therapy
EP3529353A4 (en) 2016-10-19 2020-05-13 City of Hope USE OF THE CMV TRIPLEX VACCINE IN T-CARBY LYMPHOCYTE THERAPY
KR20230172612A (ko) 2016-10-19 2023-12-22 더 스크립스 리서치 인스티튜트 인간화된 표적화 모이어티 및/또는 최적화된 키메라 항원 수용체-상호작용 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체 효과기 세포 스위치 및 이의 용도
US10617720B2 (en) 2016-10-20 2020-04-14 Miltenyi Biotech, GmbH Chimeric antigen receptor specific for tumor cells
CN117568334A (zh) 2016-10-31 2024-02-20 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 用具有工程化稳定的内源性foxp3基因表达的cd4 t细胞治疗自身免疫疾病的方法
WO2018102761A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 City Of Hope Methods for manufacturing and expanding t cells expressing chimeric antigen receptors and other receptors
EP3551197B1 (en) 2016-12-12 2023-11-22 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) Chimeric transcription factor variants with augmented sensitivity to drug ligand induction of transgene expression in mammalian cells
EP3555296A4 (en) 2016-12-13 2020-07-29 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) METHODS OF EXOGENOUS DRUG ACTIVATION OF CHEMICAL-INDUCED SIGNALING COMPLEXES EXPRESSED IN MODIFIED CELLS IN VITRO AND IN VIVO
EP3336107A1 (en) 2016-12-15 2018-06-20 Miltenyi Biotec GmbH Immune cells expressing an antigen binding receptor and a chimeric costimulatory receptor
JP7078937B2 (ja) 2016-12-21 2022-06-01 ダンマークス テクニスク ユニバーシテット 免疫細胞を操作するための抗原提示足場
CN110612119A (zh) 2017-02-07 2019-12-24 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 磷脂醚(ple)car t细胞肿瘤靶向(ctct)剂
CA3053534A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Purdue Research Foundation Targeted ligand-payload based drug delivery for cell therapy
EP3589295A4 (en) * 2017-02-28 2020-11-04 Endocyte, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF T CAR LYMPHOCYTE THERAPY
US20200405881A1 (en) 2017-03-06 2020-12-31 University Of Washington Cell based methods and compositions for therapeutic agent delivery and treatments using same
US20200276318A1 (en) 2017-03-06 2020-09-03 University Of Washington Engineered cells and agent compositions for therapeutic agent delivery and treatments using same
US11939594B2 (en) 2017-03-16 2024-03-26 Seattle Children's Hospital Engraftable cell-based immunotherapy for long-term delivery of therapeutic proteins
BR112019019606A2 (pt) 2017-03-20 2020-04-14 Hope City células t modificadas pelo receptor de antígeno quimérico direcionado a cs1
CN110913871B (zh) 2017-05-17 2024-02-23 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 生成哺乳动物t细胞活化诱导型合成启动子(syn+pro)以改善t细胞疗法
WO2019028190A1 (en) 2017-08-01 2019-02-07 City Of Hope ANTI-IL1RAP ANTIBODIES
US20200181264A1 (en) 2017-08-11 2020-06-11 City Of Hope Bispecific antigen-binding molecule
WO2019144095A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Methods of use for car t cells
EP3749695A4 (en) 2018-02-06 2021-12-29 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) Fluorescein-specific cars exhibiting optimal t cell function against fl-ple labelled tumors
US20210346431A1 (en) 2018-02-23 2021-11-11 Endocyte, Inc. Sequencing method for car t cell therapy
WO2019200056A2 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Vivo-Til Therapeutics Inc. Viral vectors and packaging cell lines
KR20210016353A (ko) 2018-04-27 2021-02-15 시애틀 칠드런즈 호스피탈 디/비/에이 시애틀 칠드런즈 리서치 인스티튜트 라파마이신 내성 세포
EP3833363A4 (en) 2018-08-06 2022-05-11 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) METHODS AND COMPOSITIONS FOR STIMULATING CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T-CELLS WITH HAPTEN-TAGGED CELLS
US20210308267A1 (en) 2018-08-07 2021-10-07 Purdue Research Foundation Rejuvenation of car t cell
WO2020106992A1 (en) 2018-11-21 2020-05-28 Umoja Biopharma, Inc. Multicistronic vector for surface engineering lentiviral particles
EP3993814A4 (en) 2019-07-05 2023-06-28 Purdue Research Foundation Design and efficient synthesis of lipid-fluorescein conjugates for car-t cell therapy
EP4031184A4 (en) 2019-09-17 2023-12-06 Purdue Research Foundation AUG FIBROBLAST ACTIVATION PROTEIN (FAP) DIRECTED IMAGING AND THERAPY OF CANCER AND OTHER FIBROTIC AND INFLAMMATORY DISEASES
CN114981441A (zh) 2019-10-16 2022-08-30 优莫佳生物制药股份有限公司 用于通用受体疗法的逆转录病毒载体
EP4096707A1 (en) 2020-01-30 2022-12-07 Umoja Biopharma, Inc. Bispecific transduction enhancer
US20230068879A1 (en) 2020-02-04 2023-03-02 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Anti-dinitrophenol chimeric antigen receptors
KR20220164474A (ko) 2020-02-04 2022-12-13 시애틀 칠드런즈 호스피탈 디/비/에이 시애틀 칠드런즈 리서치 인스티튜트 키메라 항원 수용체 t 세포를 합텐 표지된 세포로 자극하기 위한 방법 및 조성물
CN115551555A (zh) 2020-03-06 2022-12-30 普渡研究基金会 用于修饰car-t细胞活性的方法、化合物和组合物
CN116323656A (zh) 2020-07-16 2023-06-23 优莫佳生物制药股份有限公司 门控衔接子靶向受体
WO2022109162A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Umoja Biopharma, Inc. Vector system for delivery of multiple polynucleotides and uses thereof
WO2022164935A1 (en) 2021-01-27 2022-08-04 Umoja Biopharma, Inc. Lentivirus for generating cells expressing anti-cd19 chimeric antigen receptor

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014100615A1 (en) * 2012-12-20 2014-06-26 Purdue Research Foundation Chimeric antigen receptor-expressing t cells as anti-cancer therapeutics
CN105814083A (zh) * 2013-10-15 2016-07-27 加州生物医学研究所 嵌合抗原受体t细胞开关和其用途
JP2017507919A (ja) * 2014-01-13 2017-03-23 スティーブン・ジェイ・フォルマン Ｆｃスペーサー領域に変異を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びそれらの使用方法
CN106132436A (zh) * 2014-02-21 2016-11-16 Ibc药品公司 通过诱导对trop‑2表达细胞的免疫应答的疾病疗法
WO2017177149A2 (en) * 2016-04-08 2017-10-12 Purdue Research Foundation Methods and compositions for car t cell therapy

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENGCHENG ZHANG等: "Phase I Escating-Dose of CAR-T Therapy Targeting CEA+ Metastatic Colorectal Cancers", 《MOLECULAR THERAPY》 *
桑秀莉;史策;周晋;: "CAR-T细胞治疗在血液系统恶性肿瘤中的研究进展", 实用肿瘤学杂志 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116376828A (zh) * 2023-06-02 2023-07-04 成都云测医学生物技术有限公司 一种诱导CD4+T细胞生成Treg细胞的方法及应用
CN116376828B (zh) * 2023-06-02 2023-08-11 成都云测医学生物技术有限公司 一种诱导CD4+T细胞生成Treg细胞的方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019209432A1 (en) 2020-08-06
TW201940182A (zh) 2019-10-16
US11779602B2 (en) 2023-10-10
US20240075069A1 (en) 2024-03-07
EP3743082A1 (en) 2020-12-02
EP3740217A4 (en) 2021-11-10
AU2019209428A1 (en) 2020-07-30
WO2019144091A1 (en) 2019-07-25
CA3089051A1 (en) 2019-07-25
US20190255109A1 (en) 2019-08-22
JP7417542B2 (ja) 2024-01-18
SG11202006886VA (en) 2020-08-28
CN112292138A (zh) 2021-01-29
US20220257652A1 (en) 2022-08-18
CA3089319A1 (en) 2019-07-25
US11311576B2 (en) 2022-04-26
US20190224237A1 (en) 2019-07-25
BR112020014913A2 (pt) 2020-12-08
EP3740217A1 (en) 2020-11-25
JP2021512147A (ja) 2021-05-13
IL276131A (en) 2020-08-31
EP3743082A4 (en) 2021-11-03
WO2019144095A1 (en) 2019-07-25
JP2021511826A (ja) 2021-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240075069A1 (en) Methods of use for car t cells
US11759480B2 (en) Compositions and methods for CAR T cell therapy
JP7282521B2 (ja) Ｃａｒ ｔ細胞療法のための方法および組成物
US20210346431A1 (en) Sequencing method for car t cell therapy
EP4114471A1 (en) Methods, compounds, and compositions for modifying car-t cell activity
RU2792653C2 (ru) Способы и композиции для car-t-клеточной терапии
WO2024086563A1 (en) Therapeutic methods with target-linked small molecules and anti-target car t cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination