BR112019019606A2 - células t modificadas pelo receptor de antígeno quimérico direcionado a cs1 - Google Patents
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Abstract
métodos para o tratamento da amiloidose al utilizando receptores de antígeno quiméricos direcionados a cs1 são descritos.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para CÉLULAS T MODIFICADAS PELO RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO DIRECIONADO A CS1.
ANTECEDENTES [0001] A amiloidose de cadeia leve (amiloidose AL) é caracterizada por uma população clonal de células plasmáticas na medula óssea que produzem cadeias leves monoclonais de restrição capa ou lambda. As cadeias leves amiloidogênicas se dobram de forma imprópria, formando assim lâminas beta-pregueadas que combinam para formar fibrilas. Estas fibrilas amiloides depositam-se em tecidos e órgãos incluindo o coração, rins e nervos periféricos, onde elas interferem progressivamente com a estrutura e função (Falk et al. 1997 N Engl J Med 337: 898-909). Sem tratamento, o prognóstico é fraco com uma sobrevivência mediana de apenas 8 meses (Kyle et al. 1997 N Engl J Med 336:1202-120). O tratamento para amiloidose AL é focado principalmente no direcionamento do clone de célula plasmática subjacente para deter a produção de fibrilas amiloides e leva em conta a recuperação do órgão. Opções para o tratamento incluem regimes de quimioterapia adotados a partir daqueles utilizados para tratar mieloma múltiplo assim como melfalano em dose elevada seguido por transplante autólogo de células tronco. Embora os pacientes com amiloidose AL tenham se beneficiado da grande quantidade de avanços feitos para o tratamento de doenças de células plasmáticas em geral, o tratamento é complicado pela natureza frágil da população devido à disfunção do órgão relacionado com a amiloide e a necessidade de se obter uma resposta rápida, profunda, para evitar que um clone residual cause outra deposição de fibrila. Embora remissões de longo prazo sejam possíveis tanto com o transplante de células tronco quanto com agentes mais novos incluindo os inibidores de proteassoma e fármacos imunomoduladores, novos tratamentos
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2/31 bem tolerados e eficazes são necessários.
SUMÁRIO [0002] São descritos nesta invenção métodos para o tratamento de amiloidose AL utilizando receptores de antígenos quiméricos (CARs) direcionados a CS1, uma glicoproteína da superfície celular que é um membro da família de receptores de molécula de ativação de linfócitos de sinalização (SLAM). São descritos abaixo os resultados de estudos que avaliam as amostras de medula óssea de pacientes com doenças de células plasmáticas. Os pacientes tiveram avaliações clínicas completas para um diagnóstico de mieloma múltiplo (MM) ou amiloidose AL, incluindo a caracterização do clone hematológico assim como o envolvimento do órgão. Análise de citometria de fluxo multicolorida foi utilizada para diferenciar entre células plasmáticas malignas e normais através da análise das relações aberrantes de cadeias capa/lambda intracelulares. Uma relação de capa e lambda altamente assimétrica é um indicador confiável de clone maligno de amiloidose AL. As populações clonais de células plasmáticas foram então avaliadas quanto à expressão de Antígeno de Maturação de Células B (BCMA) e expressão de CS1. Estes estudos demonstraram que a CS1 é expressa nas células plasmáticas clonais de pacientes com amiloidose AL e que o BCMA não é significativamente expresso nas células plasmáticas em pacientes com amiloidose AL. Isto está em contraste com o/ MM, onde o BCMA é considerado de ser ubiquamente expresso. Estudos adicionais descritos abaixo mostram que um CAR direcionado por CS1 pode efetivamente eliminar as células de expressão de CS1 em um modelo de murino.
[0003] É aqui descrito um método para o tratamento de amiloidose de cadeia leve compreendendo a administração a um paciente com sua necessidade de uma população de células T humanas submetidas à transdução por um vetor que compreende um cassete de expressão
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3/31 que codifica um receptor de antígeno quimérico, em que o receptor de antígeno quimérico compreende: um scFv de CS1; uma região espaçadora; um domínio da transmembrana; um domínio de cossinalização; e um domínio de sinalização CD3 ζ.
[0004] Em várias modalidades: o receptor de antígeno quimérico compreende: um scFv de CS1; uma região espaçadora; um domínio da transmembrana CD28; um domínio de cossinalização CD28; e um domínio de sinalização CD3 ζ; o receptor de antígeno quimérico compreende: um scFv de CS1; uma região espaçadora; um domínio da transmembrana CD4; um domínio de cossinalização 4-1 BB; e um domínio de sinalização CD3 ζ; o receptor de antígeno quimérico compreende: scFv de CS1; uma região espaçadora compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID Nos: 2 a 5 e 9 a 12; um domínio da transmembrana CD4; um domínio de cossinalização 4-1 BB; e um domínio de sinalização CD3 ζ; o receptor de antígeno quimérico compreende: um scFv de CS1; uma região espaçadora compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID Nos: 2 a 5 e 9 a 12; um domínio da transmembrana CD28; um domínio de cossinalização CD28; e um domínio de sinalização CD3 ζ; o receptor de antígeno quimérico compreende: um scFv de CS1; um espaçador que compreende uma sequência de aminoácido selecionada da SEQ ID Nos: 2 a 5 e 9 a 12; domínio da transmembrana CD4; um domínio de cossinalização 41BB; e domínio de sinalização CD3 ζ; o receptor de antígeno quimérico compreende: um espaçador que compreende uma sequência de aminoácids selecionada da SEQ ID Nos: 2 a 5 e 9 a 12; um domínio da transmembrana CD28; um Domínio de cossinalização CD28; e um domínio de sinalização CD3 ζ; o receptor de antígeno quimérico compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada das: SEQ
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ID NOs: 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 e 45; o receptor de antígeno quimérico compreende uma sequência de aminoácidos idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada de: SEQ ID NOs: 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 e 45; o receptor de antígeno quimérico compreende uma sequência de aminoácido idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada de: SEQ ID NOs: 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 e 45, cada uma com não mais do que 5 substituições de aminoácido únicas; pelo menos 20%, 30% ou 40% das células T humanas submetidas à transdução são células T da memória central; pelo menos 30% das células T humanas submetidas à transdução são CD4+ e CD62L+ ou CD8+ e CD62L+; a população de células T humanas são autólogas ao paciente; e a população de células T humanas é alogênica ao paciente.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0005] A FIGURA 1A-C representa os resultados de estudos que mostram que a célula plasmática neoplásica em amiloidose AL Expressa preferencialmente a CS1. (A) Células mononucleares da medula óssea foram isoladas de pacientes com amiloidose AL diagnosticada e mieloma múltiplo e marcadas com anticorpos contra CS1 e BCMA, seguido por coloração intracelular de κ/λ. A expressão de CS1 e BCMA foi analisada na cadeia leve κ dominante ativada. As porcentagens de células positivas de CS1 e BCMA nos clones dominantes de amiloidose AL são apresentadas (N = 14). (C) As porcentagens de células positivas de CS1 e BCMA nos clones dominantes de mieloma múltiplo são apresentadas (N = 10).
[0006] A FIGURA 2A-D representa os resultados de estudos utilizando células T do CAR direcionado por CS1 que mostram que elas são citotóxicas contra células positivas a CS1 e induzem a regressão de tumor durável em camundongos. (A) Esquemáticos de
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5/31 construções do CAR de CS1, cada um inclui um scFv específico do antígeno, uma região de dobradiça de lgG4, e um domínio coestimulador CD28 assim como um domínio de sinalização CD3 ζ. A região de dobradiça de lgG4 foi encurtada através da supressão da parte de CH2. A sequência de CAR é seguida por uma sequência de salto ribossômico T2A e depois a sequência de codificação para o gene de rastreamento/suicida EGFRt. (B) Células T de memória central purificadas (Tcm) foram ativadas e submetidas à transdução com um vetor lentiviral que codifica o CAR de CS1. A expressão de CAR foi detectada através da coloração das células com anticorpo contra EGFR cetuximab. (C) A citotoxicidade das células T de CAR de CS1 propagadas foi avaliada utilizando ensaios de liberação de 51 Cr de 4 horas após a cocultura com células alvo positivas a CS1 marcadas por 51Cr, MM.1S. As LCLs de expressão de OKT3 foram utilizadas como controle positivo e a leucemia mieloide KG1A foi utilizada como controle negativo. As células T simuladas não submetidas à transdução eram células efetoras negativas. (D) 2 x 106 fflucGFP MM.1S que foram planejadas para expressar luciferase (ffluc) e células de proteína de fluorescência verde (GFP) foram por via intratibial (i.t.) injetados em camundongos NOD/Scid ΙΙ_2γΟηυΙΙ (NSG). Cinco dias após a inoculação do tumor, os camundongos foram injetados i.v. com 1 x 106 células T do CAR de CS1 e células simuladas não submetidas à transdução foram infundidas em camundongos de controle. Os sinais de tumor foram monitorados com a formação de imagem Xenogen uma vez por semana.
[0007] A FIGURA 3 é uma representação esquemática de um vetor lentiviral de expressão de CAR de CS1 (CS1scFv-lgG4(HL-CH3)CD28gg-Zeta(CO)-T2A-EGFRt_epHIV7). A construção de CAR de CS1 inclui: uma sequência de sinal de GMCSF, um scFv de CS1, uma região de dobradiça de lgG4, conector, domínio de CH3, um domínio
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6/31 coestimulador CD28 e domínio de sinalização CD3 ζ. A construção de CAR é seguida por uma sequência de salto ribossômico T2A, e depois a sequência de codificação do gene suicida EGFRt. As moléculas de CAR e EGFRt são expressas a partir de uma única transcrição.
[0008] A FIGURA 4 representa a sequência de aminoácido de um CAR de CS1 que inclui um peptídeo de sinal, uma sequência de salto ribossômico e um EGFRt (SEQ ID NO: 29).
[0009] A FIGURA 5 representa a sequência de aminoácido de CS1scFv-lgG4(HL-CH3)-CD4tm-41 BB-Zeta-T2A-EGFRt (SEQ ID NO: 32).
[0010] A FIGURA 6 representa a sequência de aminoácido de CS1scFv-lgG4(L235E, N297Q)-CD4tm-41 BB-Zeta-T2A-EGFRt (SEQ ID NO: 35).
[0011] A FIGURA 7 representa a sequência de aminoácido de CS1 scFv-lgG4(L235E, N297Q)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-EGFRt (SEQ ID NO: 38).
[0012] A FIGURA 8 representa a sequência de aminoácido de CS1scFv-Conector-CD4tm-41 BB-Zeta-T2A-EGFRt (SEQ ID NO: 41).
[0013] A FIGURA 9 representa a sequência de aminoácido de CS1scFv-Conector-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-EGFRt (SEQ ID NO: 44).
DESCRIÇÃO DETALHADA
Exemplo 1: Expressão de CS1 e BCMA na amiloidose AL e Mieloma Múltiplo [0014] Quatorze pacientes com amiloidose AL foram estudados. A análise de expressão de CS1 e BCMA sobre as células plasmáticas neoplásicas destes pacientes revelam que as células preferencialmente expressam CS1, mas não BCMA. Resumidamente, células mononucleares da medula óssea foram isoladas de pacientes diagnosticados com amiloidose AL e marcadas com anticorpos contra
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CS e BCMA seguido pela coloração para capa/lambda. Um exemplo de obstrução na população clonal de células plasmáticas em um paciente com doença capa restrita seguido pela análise da expressão de CS1 é mostrado na FIGURA 1A. Todas as amostras de amiloidose AL expressaram altos níveis de CS1 (76,5 ± 4,7%), mas foram negativas ou demonstraram expressão muito baixa de BCMA (4,9 ± 0,8%) (FIGURA 1B).
[0015] Para comparação, amostras de medula óssea de 10 pacientes MM foram testadas durante o mesmo período de tempo utilizando a mesma metodologia (FIGURA 1C). As células plasmáticas clonais de pacientes com MM expressam CS1 similarmente àquela vista em AL; no entanto, o BCMA é de maneira comparativa muito mais frequentemente expresso. De forma interessante, a falta de expressão de BCMA nas células plasmáticas em pacientes com AL sugere que a célula plasmática clonal em AL é única em comparação com as células do mieloma.
Exemplo 2: Morte Celular através do CAR direcionado por CS1 [0016] Para explorar a utilidade da CS1 como um alvo para a terapia de células T do CAR para amiloidose AL, testamos uma segunda geração de CAR de CS1 (FIGURA 2A), contendo um domínio coestimulador CD28gg, a sequência T2A de salto ribossômico, e a sequência do receptor de EGF truncada (EGFRt) como uma seleção, rastreamento, e molécula de ablação e incorporado em um vetor lentiviral SIN, descrito com maiores detalhes abaixo. As células T de memória central purificadas (Tcm) foram ativadas e submetidas à transdução com um vetor lentiviral que codifica o CAR de CS1 e expandidas na presença de IL-2 50U/ml e IL-15 0,5 nNg/ml durante 3 semanas. A expressão de CAR foi monitorada através da coloração das células com cetuximab-biotina e estreptavidina (SA) (FIGURA 2B). A citotoxicidade das células T do CAR de CS1 expandidas foi avaliada
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8/31 utilizando ensaios de liberação de 51Cr de 4 horas após o cocultivo com células alvo de CS1+ marcadas por 51Cr (MM.1S) (FIGURA 20).
[0017] Camundongos NOD/Scid IL2RvCnull de seis a dez semanas de idade foram injetados por via intratibial (i.t.) com 2 x 106 fflucGFP MM.1S que foram planejados para expressar luciferase (ffluc) e proteína fluorescente verde (GFP). Cinco dias após a inoculação do tumor, os camundongos foram injetados por via intravenosa (i.v.) com 1 x 106 células T de CAR de CS1, e células simuladas não submetidas à transdução foram infundidas nos camundongos de controle. Os camundongos anestesiados foram fotografados semanalmente utilizando um sistema da série Xenogen IVIS 100 (Xenogen, Alameda, CA). Os fótons de xenoenxertos de tumor ffl_uc+ foram quantificados utilizando-se o programa de software Living Image (Xenogen), e o sinal de bioluminescência foi medido como fluxo de fóton total normalizado com relação ao tempo de exposição e área de superfície e expresso em unidades de fótons por segundo por cm2 por esteradiano.
[0018] Para testar a atividade antitumoral, MM.1S foram inoculados em camundongos NSG através de injeção intratibial. Assim que o enxerto de tumor foi confirmado, 1 x 106 células T do CAR de CS1 foram infundidas em camundongos contendo tumor por via intravenosa. As células T do CAR de CS1 apresentam morte específica e eficiente de células positivas a CS1 (MM.1S) (FIGURA 2C). Estudos antitumor no modelo animal mostraram que as células T do CAR de CS1 induziram uma remissão significativa do tumor em comparação com os camundongos tratados com células T simuladas (FIGURA 2D).
[0019] Estas descobertas sustentam o uso de terapia de células T de CAR direcionadas por CS1 para pacientes com amiloidose AL. A AL é uma configuração ideal para explorar a terapia mediada por CAR.
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O número relativamente baixo de células malignas a serem direcionadas apresenta uma oportunidade com relação à erradicação bem-sucedida do clone pequeno, mas destrutivo, assim como um risco mínimo de complicações relacionadas com a síndrome de liberação de citocinas. Além do mais, o perfil relativamente seguro do anticorpo de direcionamento de CS1 elotuzumab indica que as células T do CAR de CS1 podem igualmente produzir resultados favoráveis a este respeito. Nosso trabalho representa uma nova aplicação de células T direcionadas por CS1 enquanto revela que, ao contrário da experiência pré-clínica com MM, o BCMA não seria um alvo adequado. Com nossos dados pré-clínicos que mostram a eficácia de nossas células T direcionadas por CS1, planejamos seguir em frente com um teste clínico utilizando células T do CAR de CS1 para AL.
Exemplo 3: CAR Direcionado por CS1 [0020] O CAR direcionado por CS1 adequado para uso no tratamento de amiloidose AL inclui o CAR que compreendem um domínio extracelular, um domínio da transmembrana e um domínio de sinalização intracelular. O domínio extracelular inclui uma região de scFv específica de CS1 ou uma variante desta e um espaçador que compreende, por exemplo, uma parte do domínio Fc humano. O domínio extracelular permite que o CAR, quando expresso na superfície de uma célula T, direcione a atividade de células T para as células que expressam CS1. O domínio da transmembrana inclui, por exemplo, um domínio da transmembrana CD4, um domínio da transmembrana CD8, um domínio da transmembrana CD28 ou um domínio da transmembrana CD3. O domínio de sinalização intracelular inclui o domínio de sinalização da cadeia zeta do complexo CD3 humano (CD3<) e um ou mais domínios coestimuladores, por exemplo, um domínio coestimulador 4-1BBA. A inclusão de um domínio coestimulador, tal como o domínio coestimulador 4-1 BB (CD137) em
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10/31 série com CD3< na região Intracelular permite que a célula T receba sinais coestimuladores. As células T, por exemplo, células T autólogas específicas do paciente, podem ser planejadas para expressar os CARs aqui descritos, e as células planejadas podem ser expandidas e utilizadas terapeuticamente. Vários subconjuntos de células T, incluindo tanto as células T alfa beta quanto as células T gama delta, podem ser utilizados. Além disso, o CAR pode ser expresso em outras células imunes tais como células NK. Onde um paciente é tratado com uma célula imune que expressa um CAR descrito nesta invenção, a célula pode ser uma célula T autóloga ou uma célula T alogênica. Em alguns casos, as células utilizadas são uma população celular que inclui ambas as células T de memória central CD4+ e CD8+ (Tcm), que são CD62L+, CCR7+, CD45RO+ e CD45RA-. A população celular pode incluir outros tipos de células T igualmente. Vários CAR de direcionamento de CS1 são descritos com detalhes na WO 2016/090369.
scFv de Direcionamento de CS-1 [0021] O CAR direcionado por CS1 descrito nesta invenção inclui um scFv de direcionamento de CS1 (por exemplo, um scFv que inclui a sequência:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGL EWIGEINPDSSTINYAPSLKDKFIISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCARPDGNYWYFDVWGQGTLVTVSSGSTSGGGSGGGSGGGGSSD IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGIAVAWYQQKPGKVPKLLIY WASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSSYP YTFGQGTKVEIK; SEQ ID NO: 1) ou uma variante desta tendo 1 a 5 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácido (por exemplo, substituições).
[0022] O CAR de CS1 útil consiste ou compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 31,34, 37, 40, 43 e 46
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11/31 (CAR maduro que carece de uma sequência de sinal) ou o CAR de CS1 consiste ou compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 33, 36, 39, 42 e 45 (CAR imaturo tendo uma sequência de sinal GMCSFRa). O CAR pode ser expresso em uma forma que inclui uma sequência de sinal, por exemplo, uma sequência de sinal alfa do receptor de GM-CSF humano (MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP; SEQ ID NO: 26). O CAR pode ser expresso com sequências adicionais que são úteis para monitorar a expressão, por exemplo, de uma sequência de salto T2A e um EGFRt truncado. Assim, o CAR pode compreender ou consistir da sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID Nos: 29 a 46 ou pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma das SEQ ID Nos: 29 a 46. O CAR pode compreender ou consistir da sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID Nos: 29 a 46 com até 1, 2, 3, 4 ou 5 alterações de aminoácido (preferivelmente alterações de aminoácido conservativas).
Região Espacadora [0023] O CAR aqui descrito pode incluir um espaçador localizado entre o domínio de direcionamento de CS1 (isto é, um ScFv de CS1 ou sua variante) e o domínio da transmembrana. Uma variedade de espaçadores diferentes pode ser utilizada. Algumas deles incluem pelo menos uma parte de uma região Fc humana, por exemplo, uma parte de dobradiça de uma região Fc humana ou um domínio CH3 ou suas variantes. A Tabela 1 abaixo fornece vários espaçadores que podem ser utilizados nos CARs aqui descritos.
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Tabela 1: Exemplos de Espaçadores
| Nome | Compri’ mento | Sequência |
| a3 | 3 aa | AAA |
| articulador | 10 aa | GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 2) |
| dobradiça de lgG4 (S^P) (S228P) | 12 aa | ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 3) |
| dobradiça de lgG4 | 12 aa | ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 4) |
| dobradiça de lgG4 (S228P)+ articulador | 22 aa | ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 5) |
| dobradiça CD28 | 39 aa | IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 6) |
| dobradiça CD8-48aa | 48 aa | AKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVH TRGLDFACD (SEQ ID NO: 7) |
| dobradiça CD8-45aa | 45aa | TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRG LDFACD (SEQ ID NO: 8) |
| lgG4(HL-CH3) (inclui S228P na dobradiça) | 129 aa | ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQ EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 9) |
| lgG4(L235E,N297Q) | 229 aa | ESKYGPPCPSCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHQAKTKPREE QFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 10) |
| lgG4(S228P, L235E.N297Q) | 229 aa | ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHQAKTKPREE QFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRL TVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 11) |
| lgG4(CH3) | 107 aa | GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 12) |
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13/31 [0024] Algumas regiões espaçadoras incluem toda ou parte de uma região de dobradiça da imunoglobulina (por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4), isto é, a sequência que cai entre os domínios CH1 e CH2 de uma imunoglobulina, por exemplo, uma dobradiça Fc de LgG4 ou uma dobradiça CD8. Algumas regiões espaçadoras incluem um domínio CH3 de imunoglobulina ou tanto um domínio CH3 quanto um domínio CH2. As sequências derivadas de imunoglobulina podem incluir um ou mais modificações de aminoácido, por exemplo, 1,2, 3, 4 ou 5 substituições, por exemplo, substituições que reduzem a ligação fora-alvo.
[0025] A região de dobradiça/conector também pode compreender uma região de dobradiça de LgG4 Tendo a sequência ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 4) ou ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 3).
[0026] A região de dobradiça/conector também pode compreender a sequência ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 3) seguida pela sequência de conector GGGSSGGGSG (SEQ ID NO: 2) seguido pela sequência CH3 de lgG4
GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 12). Assim, a região aglutinante/espaçador inteira pode compreender a sequência: ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:11). Em alguns casos, o espaçador possui 1, 2, 3, 4 ou 5 alterações de aminoácido único (por exemplo, alterações conservadoras) em comparação com a SEQ ID NO: 11. Em alguns casos, a região de dobradiça/conector Fc de lgG4 que é submetida à mutação em duas posições (L235E; N297Q) de uma maneira que
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14/31 reduz a ligação através dos receptores Fc (FcRs).
Domínio da Transmembrana [0027] Uma variedade de domínios da transmembrana pode ser utilizada nos CARS. A Tabela 2 inclui exemplos de domínios da transmembrana adequados. Onde uma região espaçadora está presente, o domínio da transmembrana é localizado no terminal carbóxi da região espaçadora.
Tabela 2: Exemplos de Domínios da Transmembrana
| Nome | Acesso | Comprimento | Sequência |
| CD3z | J04132.1 | 21 aa | LCYLLDGILFIYGVILTALFL (SEQ ID NO: 13) |
| CD28 | NM 006139 | 27aa | FWVLWVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 14) |
| CD28(M) | NM 006139 | 28aa | MFWVLWVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 15) |
| CD4 | M35160 | 22aa | MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF (SEQ ID NO: 16) |
| CD8tm | NM 001768 | 21 aa | IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO: 17) |
| CD8tm2 | NM 001768 | 23aa | IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY (SEQ ID NO: 18) |
| CD8tm3 | NM 001768 | 24aa | IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 19) |
| 41 BB | NM 001561 | 27aa | IISFFLALTSTALLFLLFF LTLRFSW (SEQ ID NO: 20) |
Domínio Coestimulador [0028] O domínio coestimulador pode ser qualquer domínio que seja adequado para uso com um domínio de sinalização CD3<. Em alguns casos, o domínio coestimulador é um domínio coestimulador CD28 que inclui uma sequência que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% idêntica ou idêntica a: RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 23; dupla alteração de aminoácido LL a GG sublinhada). Em alguns casos, o domínio de cossinalização CD28 possui 1,2, 3, 4 de 5 alterações de aminoácido (preferivelmente conservative e de
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15/31 preferência não na sequência GG sublinhada em comparação com a SEQ ID NO: 23. Em alguns casos, o domínio de cossinalização é um domínio de cossinalização 4-1 BB que inclui uma sequência que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% idêntica ou idêntica a: KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 24). Em alguns casos, o domínio de cossinalização 4-1 BB possui 1, 2, 3, 4 de 5 alterações de aminoácido (preferivelmente conservativas) em comparação com a SEQ ID NO: 24.
[0029] Os domínios coestimuladores estão localizados entre o domínio da transmembrana e o domínio de sinalização Οϋ3ζ. A Tabela 3 inclui exemplos de domínios coestimuladores adequados, juntamente com a sequência do domínio de sinalização CD3<.
Tabela 3: Domínio Οϋ3ζ e Exemplos de Domínios Coestimuladores
| Nome | Acesso | Comprimento | Sequência |
| CD3C | J04132.1 | 113 aa | RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEY DVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQK DKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTA TKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 21) |
| CD28 | NM 006139 | 42aa | RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAP PRDFAAYRS (SEQ ID NO: 22) |
| CD28gg* | NM 006139 | 42aa | RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAP PRDFAAYRS (SEQ ID NO: 23) |
| 41 BB | NM 001561 | 42 aa | KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFP EEEEGGCEL (SEQ ID NO: 24) |
| 0X40 | 42 aa | ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQA DAHSTLAKI (SEQ ID NO: 25) |
0030] Em várias modalidades: o domínio coestimulador é selecionado do grupo que consiste em: um domínio coestimulador representado na Tabela 3 ou uma variante deste tendo de 1 a 5 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos um domínio coestimulador CD28 ou uma variante deste tendo de 1 a 5 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácido, um domínio
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16/31 coestimulador 4-1 BB ou sua variante tendo 1 a 5 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácido e um domínio coestimulador 0X40 ou sua variante tendo de 1 a 5 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácido. Em certas modalidades, o domínio coestimulador 4-1 BB ou uma variante deste tendo de 1 a 5 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácido no presente. Em algumas modalidades existem dois domínios coestimuladores, por exemplo, um domínio coestimulador CD28 ou uma variante deste tendo de 1 a 5 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácido (por exemplo, substituições) e um domínio coestimulador 4-1 BB ou uma variante deste tendo de 1 a 5 (por exemplo, 1 ou 2) modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições). Em várias modalidades, as modificações de aminoácido de 1 a 5 (por exemplo, 1 ou 2) são substituições. O domínio coestimulador é o amino terminal para o domínio de sinalização CD3< e, em alguns casos, um conector curto que consiste em 2 a 10, por exemplo, 3 aminoácidos (por exemplo, GGG) é posicionado entre o domínio coestimulador e o domínio de sinalização de CD3<.
Domínio de Sinalização CD3£ [0031] O domínio de sinalização CD3< pode ser qualquer domínio que seja adequado para uso com um domínio de sinalização CD3<. Em alguns casos, o domínio de sinalização CD3< inclui uma sequência que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% idêntica ou idêntica a:
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEM GGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 21). Em alguns casos, a sinalização CD3< possui 1, 2, 3, 4 de 5 alterações de aminoácido (preferivelmente conservadoras) em comparação com a SEQ ID NO:
21.
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EGFR Truncado [0032] O domínio de sinalização CD3< pode ser seguido por uma sequência de salto ribossômico (por exemplo, LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR; SEQ ID NO: 27) e um EGFR truncado tendo uma sequência que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% idêntica ou idêntica a: LVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSI SGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENR TDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIIS GNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCS PEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECI QCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGE NNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIAT GMVGALLLLLVVALGIGLFM (SEQ ID NO: 28). Em alguns casos, o EGFR truncado possui 1, 2, 3, 4 de 5 alterações de aminoácido (preferivelmente conservativas) em comparação com a SEQ ID NO: 28.
[0033] Um paciente que sofre de amiloidose AL pode ser ministrado uma população de células T humanas submetidas à transdução por um vetor que compreende um cassete de expressão que codifica um receptor de antígeno quimérico de CS1 aqui descrito (por exemplo, um CAR que compreende ou consiste na sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID Nos: 29 a 46 ou uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma das SEQ ID Nos: 29 a 46 ou a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID Nos: 29 a 46 com até 1, 2, 3, 4 ou 5 modificações de aminoácido (preferivelmente alterações de aminoácido conservativas). Em várias modalidades: a população de células T humanas são células T de memória central (Tcm), por exemplo, Tcm CD8+/CD4+.
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18/31 [0034] Uma modificação de aminoácido refere-se a uma substituição, inserção e/ou supressão de aminoácido em uma sequência de proteína ou peptídeo. Uma substituição de aminoácido ou substituição refere-se à substituição de um aminoácido em uma posição particular em uma sequência de peptídeo ou proteína de origem com outro aminoácido. Uma substituição pode ser feita para alterar um aminoácido na proteína resultante de uma maneira não conservative (isto é, através da alteração do códon de um aminoácido que pertence a um agrupamento de aminoácidos tendo um tamanho ou característica particular a um aminoácido que pertence a outro agrupamento) ou de uma maneira conservative (isto é, mediante a alteração do códon de um aminoácido que pertence a um agrupamento de aminoácidos tendo um tamanho ou característica particular a um aminoácido que pertence ao mesmo agrupamento). Uma tal mudança conservative geralmente leva a menos alteração na estrutura e função da proteína resultante. O que se segue são exemplos de vários agrupamentos de aminoácidos: 1) aminoácidos com grupos R não polares: Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina, Prolina, Fenilalanina, Triptofano, Metionina; 2) aminoácidos com grupos R polares não carregados: Glicina, Serina, Treonina, Cisteína, Tirosina, Asparagina, Glutamina; 3) aminoácidos com grupos R polares carregados (carregados negativamente em pH 6,0): ácido aspártico, ácido glutâmico; 4) aminoácidos básicos (carregados positivamente em pH 6,0) Lisina, Arginina, Histidina (em pH 6,0). Outro agrupamento pode ser aqueles aminoácidos com grupos de fenila: Fenilalanina, Triptofano e Tirosina.
[0035] O CAR de CS1 pode incluir uma sequência que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% idêntica ou idêntica à sequência de aminoácidos representada nas FIGURAS 4 a 9 (SEQ ID Nos: 29 a 46, incluindo ou excluindo a sequência de sinal GMCSFRa e
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19/31 incluindo ou excluindo a sequência de salto ribossômico T2A e o EGFRt truncado).
[0036] Uma variedade de CAR de direcionamento de CS-1 é descrita na WO 2016/090369, e estes CAR podem ser úteis para o tratamento da amiloidose AL.
[0037] Entre os CAR que direcionam CS1 aqui descritos encontram-se aquelas resumidos na Tabela 4 na qual a região espaçadora, o domínio da transmembrana e os domínios coestimuladores para cada CAR são indicados.
Tabela 4: Exemplos de CAR que direciona CS1
| Nome | SEQ ID | FIG | Espaçador | TM | Domínios Coestimuladores |
| CS1scFv-lgG4(HL-CH3)CD28tm-CD28gg-Zeta-T2AEGFRt. | 29//30//31 | 4 | lgG4(HL-CH3) | CD28 | CD28GG |
| CS1scFv-lgG4(HL-CH3)- CD4tm-41 BB-Zeta-T2AEGFRt. | 32//33//34 | 5 | lgG4(HL-CH3) | CD4 | 4-IBB |
| CSIscFvlgG4(L235E,N297Q)-CD4tm41BB-Zeta-T2A-EGFRt. | 35//36//37 | 6 | lgG4(L235E,N297Q) | CD4 | 4-IBB |
| CS1scFv-lgG4(L235E, N297Q)-CD28tm-CD28gg- Zeta-T2A-EGFRt | 38//39//40 | 7 | lgG4(L235E,N297Q) | CD28 | CD28GG |
| CS1 scFv-Articulador-CD4tm- 41BB-Zeta-T2A-EGFRt. | 41//42//43 | 8 | L | CD4 | 4-IBB |
| CS1 scFv-Articulador- CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A- EGFRt | 44//45//46 | 9 | L | CD28 | CD28GG |
*SEQ ID NOs para: a sequência inteira incluindo a sequência de sinal GMCSFRa, T2A e EGFRt // a sequência incluindo a sequência de sinal GMCSFRa, mas excluindo T2A e EGFRt // a sequência excluindo a sequência de sinal GMCSFRa, T2A E EGFRt.
[0038] Em alguns casos, o CAR de CS1 pode ser produzido
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20/31 utilizando um vetor no qual a estrutura de leitura aberta do CAR é seguida por uma sequência de salto de ribossômico T2A e um EGFR truncado (EGFRt) que carece da cauda de sinalização citoplásmica. Nesta disposição, a coexpressão de EGFRt fornece um marcador de superfície inerte não imunogênico que leva em conta a medição precisa das células modificadas pelo gene, e permite a seleção positiva de células modificadas pelo gene, assim como o rastreamento eficiente da célula das células T terapêuticas in vivo após a transferência adotiva. O controle eficiente da proliferação para evitar a agitação da citocina e toxicidade fora do alvo é um obstáculo importante para o sucesso da imunoterapia de células T. O EGFRt incorporado no vetor lentiviral CS1CAR pode atuar como gene suicida para remover as células T de CAR+ em casos de toxicidade relacionada ao tratamento.
[0039] O CAR descrito nesta invenção pode ser produzido por qualquer meio conhecido na técnica, embora preferivelmente seja produzido utilizando técnicas de DNA recombinante. Ácidos nucleicos que codificam as várias regiões do receptor quimérico podem ser preparados e montados em uma sequência de codificação completa por técnicas padrão de clonagem molecular conhecida na especialidade (triagem de biblioteca genômica, PCR sobreposta, ligação auxiliada por iniciador, mutagênese dirigida ao sítio, etc.) como é conveniente. A região de codificação resultante é de preferência inserida em um vetor de expressão e utilizada para transformar uma linhagem celular hospedeira de expressão adequada, preferivelmente uma linhagem celular de linfócitos T, e o mais preferível uma linhagem celular de linfócitos T autóloga.
[0040] Vários subconjuntos de células T isolados do paciente podem ser submetidos à transdução com um vetor para a expressão de CAR. As células T da memória central são um subgrupo de células
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T útil. A célula T da memória central pode ser isolada de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) através da seleção de células CD45RO+/CD62L+, utilizando, por exemplo, o dispositivo CliniMACS® para selecionar imunomagneticamente as células que expressam os receptores desejados. As células enriquecidas para células T da memória central podem ser ativadas com anti-CD3/CD28, submetidas à transdução com, por exemplo, um vetor lentiviral que direciona a expressão de um CAR de CS1, assim como um marcador de superfície não imunogênico para detecção in vivo, ablação e seleção potencial ex vivo. As células T da memória central da CS1 ativadas/geneticamente modificadas podem ser expandidas in vitro com IL-2/IL-15 e depois crioconservadas.
Exemplo 4: Construção e Estrutura de epHIV7 utilizada para Expressão de CAR específico da CS1 [0041] O plasmídeo pHIV7 é um plasmídeo de origem do qual os vetores clínicos que expressam um CAR de CS1 podem ser derivados. O vetor epHIV7 utilizado para a expressão do CAR foi produzido a partir do vetor pHIV7 (Wang et al. 2011 Blood 118:1255). De forma importante, este vetor utiliza o promotor EF1 humano para acionar a expressão do CAR. Ambas as sequências 5' e 3' do vetor foram derivadas de pv653RSN conforme anteriormente derivado do pró-vírus HXBc2. As sequências do retalho de DNA do trato de polipurina (cPPT) foram derivadas da cepa do HIV-1 pNL4-3 do NIH AIDS Reagent Repository.
[0042] A construção de pHIV7 foi realizada como se segue. Resumidamente, pv653RSN, contendo 653 bp de repetições de terminal longo 5' e 3' acrescidas de gag-pol (LTRs) com um gene de SL3-neomicina fosfotransferase interveniente (Neo), foi subclonado em pBluescript, como se segue: na Etapa 1, as sequências da LTR 5' para o elemento ver-responsivo (RRE) produziram p5'HIV-1 51, e então a
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LTR 5' foi modificada através da remoção de sequências a montante da caixa TATA, e ligada em primeiro lugar a um intensificador de CMV e depois à origem SV40 de replicação (p5'HIV -2). Na Etapa 2, após a clonagem da LTR 3' em pBluescript para produzir o p3'HIV-1, uma supressão de 400 bp no intensificador/promotor de LTR3' foi produzida para remover os elementos reguladores cis em HIV U3 e formar p3'HIV-2. Na Etapa 3, fragmentos isolados do p5’HIV-3 e p3'HIV-2 foram ligados para produzir pHIV-3. Na Etapa 4, o p3'HIV-2 foi ainda modificado através da remoção de sequências de HIV extra a montante para gerar o p3’HIV-3 e um fragmento BamHI-Sall de 600 bp contendo WPRE foi adicionado ao p3'HIV-3 para produzir o p3’HIV-4. Na Etapa 5, o pHIV-3 RRE foi reduzido em tamanho por PCR e ligado a um fragmento 5' de pHIV-3 (não mostrado) e ao p3’HIV-4, para produzir pHIV-6. Na Etapa 6, um fragmento BglIl-BamHI de 190 bp contendo a sequência de retalho de DNA cPPT de HIV-1 pNL4-3 (55) foi amplificado a partir de pNL4-3 e colocado entre as sequências RRE e WPRE no pHIV6 para produzir pHIV-7. Este plasmídeo de origem pHIV7-GFP (GFP, proteína fluorescente verde) foi utilizado para acondicionar o vetor de origem utilizando um sistema de quatro plasmídeos.
[0043] Um sinal de acondicionamento, psi ψ, é requerido para o acondicionamento eficiente do genoma viral no vetor. As RRE e WPRE intensificam o transporte e expressão do transcrito de RNA do transgene. A sequência de retalho, em combinação com WPRE, demonstrou melhorar a eficiência de transdução do vetor lentiviral em células de mamíferos.
[0044] As funções auxiliares, necessárias para a produção do vetor viral, são divididas em três plasmídeos separados para reduzir a probabilidade de geração de lentivírus competente de replicação através da recombinação: 1) pCgp codifica a proteína gag/pol
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23/31 requerida para a montagem do vetor viral; 2) pCMV-Rev2 codifica a proteína Rev, que atua sobre a sequência RRE para auxiliar no transporte do genoma viral para o acondicionamento eficiente; e 3) pCMV-G codifica a glicoproteína do vírus da vesículo-estomatite (VSV), que é requerida com relação à possibilidade de contaminação do vetor viral.
[0045] Existe homologia de sequência de DNA mínima entre o genoma do vetor codificado de pHIV7 e os plasmídeos auxiliares. As regiões de homologia incluem uma região de sinal de acondicionamento de aproximadamente 600 nucleotídeos, localizada na sequência gag/pol do plasmídeo auxiliar pCgp; uma sequência promotora de CMV em todos os três plasmídeos auxiliares; e uma sequência RRE no plasmídeo auxiliar pCgp. É altamente improvável que o vírus recombinante competente de replicação possa ser gerado devido à homologia nestas regiões, já que requerería múltiplos eventos de recombinação. Adicionalmente, quaisquer recombinantes resultantes estariam faltosos das sequências LTR e tat funcionais necessárias para a replicação lentiviral.
[0046] O promotor de CMV foi substituído pelo promotor de EF1aHTLV (EF1p), e o novo plasmídio foi denominado epHIV7. O EF1p possui 563 bp e foi introduzido em epHIV7 utilizando Nrul e Nhel, depois que o promotor de CMV foi cortado.
[0047] O genoma lentiviral, excluindo gag/pol e rev que são necessários para a patogenicidade do vírus do tipo silvestre e que são requeridos para a infecção produtiva de células alvo, foi removido deste sistema. Além disso, a construção do vetor de epHIV7 não contém um promotor de 3' LTR intacto, de modo que o genoma próviral de DNA expressão e transcrito reverso resultante nas células direcionadas terá LTRs inativos. Como um resultado deste projeto, nenhuma sequência derivada de HIV-I será transcrita a partir do pró
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24/31 vírus e apenas as sequências terapêuticas serão expressas a partir de seus respectivos promotores. A remoção da atividade promotora de LTR no vetor SIN é esperada de reduzir significativamente a possibilidade de ativação involuntária dos genes hospedeiros. A Tabela 5 resume os vários elementos reguladores presentes em epHIV7.
[0048] A FIGURA 1 é uma representação esquemática do CAR de CS1 (CS1 scFv-lgG4(HL-CH3)-CD28gg-Zeta(CO)-T2AEGFRt_epHIV7), um vetor lentiviral que contém a construção de CAR composta de região de scFv de CS1, região da dobradiça de lgG4, conector, um domínio coestimulatório CD28 e domínio de sinalização CD3<. A construção de CAR é seguida por uma sequência de salto ribossômico T2A, e depois a sequência de codificação do gene EGFRt suicida. As moléculas do CAR e EGFRt são expressas de uma única transcrição. A Tabela 5 apresenta a posição de vários elementos do vetor.
| Tabela 5: Elementos funcionais de um CAR_epHIV7 | ||
| Elementos Reguladores e Genes | Localização (Números de Nucleotídeo) | Observações |
| U5 | 87 a 171 | Sequência única 5’ |
| psi | 233 a 345 | Sinal de acondicionamento |
| RRE | 957 a 1289 | Elemento responsive Ver |
| Retalho | 1290 a 1466 | Contém a sequência de rastreamento de polipurina e sequência terminal central para facilitar a importação nuclear do complexo de pré-integração |
| Promotor de EF1p | 1524 a 2067 | Sequência de Promotor Eucariótico EF1-alfa que aciona a expressão de CD19Rop |
| 2084 a 4963 | Inserção terapêutica | |
| WPRE | 5011 a 5611 | Elemento regulador derivado do vírus da hepatite da marmota para melhorar o transporte de RNA viral |
| delU3 | 5626 a 5730 | 3 'U3 com exclusão para gerar o vetor SIN |
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| Tabela 5: Elementos funcionais de um CAR_epHIV7 | ||
| Elementos Reguladores e Genes | Localização (Números de Nucleotídeo) | Observações |
| R | 5731 a 5811 | Sequência de repetição dentro de LTR |
| U5 | 5812 a 5925 | Sequência 3’ U5 em LTR |
| AmpR | 6761 a 7619 | Gene de resistência a ampicilina |
| CoE1 ori | 7682 a 8563 | Origem de replicação do plasmídeo |
| SV40 ori | 8860 a 9059 | Origem de replicação de SV40 |
| Promotor de CMV | 9073 a 9672 | Promotor de CMV para gerar RNA do genoma viral |
| R | 9728 a 86 | Sequência de repetição dentro de LTR |
Exemplo 5: Produção de Vetores para a Transdução de Células T do Paciente [0049] Para cada plasmídeo (CS1 CAR_epHIV7; ppgp; pCMV-G; e pCMV-Rev2) um banco de sementes é gerado, o qual é utilizado para inocular o fermentador para produzir quantidades suficientes de DNA de plasmídeo. O DNA de plasmídeo é testado com relação à identidade, esterilidade e endotoxina antes de seu uso na produção do vetor lentiviral.
[0050] Em resumo, as células são expandidas da célula de trabalho 293T (WCB), que foi testada para confirmar a esterilidade e a ausência da contaminação viral. Um frasco de células 293T da WCB 293T é descongelado. As células são cultivadas e expandidas até que existam números suficientes de células para plaquear um número apropriado de fábricas de células de 10 camadas (CFs) para a produção de vetor e manutenção do sistema de células. Um único sistema de células pode ser utilizado para produção.
[0051] O vetor lentiviral foi produzido em sub-bateladas de até 10
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CFs. Duas sub-bateladas podem ser produzidas na mesma semana que levam à produção de aproximadamente 20 L de sobrenadante lentiviral/semana. O material produzido a partir de todas as subbateladas foi agrupado durante a fase de processamento a jusante, a fim de produzir um lote de produto. Células 293T foram plaqueadas em CFs no meio 293T (DMEM com FBS a 10%). As fábricas foram colocadas em uma incubadora a 37 Ό e niveladas horizontalmente a fim de obter uma distribuição uniforme das células em todas as camadas da CF. Dois dias depois, as células foram transfectadas com os quatro plasmídeos lentivirais descritos acima utilizando o método de CaPO4, que envolve uma mistura de Tris:EDTA, 2M CaCI2, 2X HBS, e os quatro plasmídeos de DNA. Dia 3 após a transfecção, o sobrenadante contendo vetores lentivirais secretados foi coletado, purificado e concentrado. Depois que o sobrenadante foi removido das CFs, Células finais de produção foram coletadas de cada CF. As células foram tripsinizada de cada fábrica e coletadas por centrifugação. As células foram colocadas novamente em suspensão em meio de congelamento e crioconservadas. Estas células foram posteriormente utilizadas para o teste de lentivírus de replicaçãocompetente (RCL).
[0052] Para purificar e formular vetores, o sobrenadante bruto foi clarificado por filtração por membrana para remover os detritos celulares. O DNA de células hospedeiras e o DNA de plasmídeo residual foram degradados pela digestão de endonuclease (Benzonase®). O sobrenadante viral foi clarificado de detritos celulares utilizando um filtro de 0,45 pm. O sobrenadante clarificado foi coletado em um recipiente pré-pesado no qual o Benzonase® é adicionado (concentração final de 50 U/ml). A digestão de endonuclease para DNA de plasmídeo residual e DNA genômico hospedeiro conforme executado a 37 Ό durante 6 h. A concentração de ul trafiltração do
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27/31 fluxo tangencial inicial (TFF) do sobrenadante tratado com endonuclease foi utilizada para remover componentes residuais de baixo peso molecular do sobrenadante bruto, enquanto concentra o vírus ~20 vezes. O sobrenadante viral tratado com endonuclease clarificado foi circulado através de um cartucho de fibra oca com um NMWCO de 500 kD em uma taxa de fluxo projetada para manter a taxa de cisalhamento em -4000 seg-1 ou menos, enquanto que maximiza a taxa de fluxo. A diafiltração do sobrenadante tratado com nuclease foi iniciada durante o processo de concentração para sustentar o desempenho do cartucho. Uma taxa de substituição de permeado a 80% foi estabelecida, utilizando lactose 4% em PBS como o tampão de diafiltração. O sobrenadante viral foi levado ao volume alvo, o que representa uma concentração de 20 vezes do sobrenadante bruto, e a diafiltração continuou para 4 volumes de troca adicionais, com a taxa de substituição de permeado em 100%.
[0053] A concentração adicional do produto viral foi executada utilizando uma técnica de centrifugação de alta velocidade. Cada subbatelada do lentivírus foi granulada utilizando uma centrífuga Sorvall RC-26 plus em 6000 RPM (6088 RCF) a 6 Ό durante 16 a 20 h. O grânulo viral de cada sub-batelada foi então reconstituído em um volume de 50 ml com lactose 4% em PBS. O grânulo reconstituído neste tampão representa a formulação final para a preparação do vírus. O processo de concentração de vetor inteiro resultou em uma redução de volume de 200 vezes, aproximadamente. Após a conclusão de todas as sub-bateladas, o material foi então colocado a 80 Ό, enquanto que as amostras de cada sub-batelada foram testadas quanto à esterilidade. Após a confirmação da esterilidade da amostra, as sub-bateladas foram rapidamente descongeladas a 37 Ό com agitação frequente. O material foi então agrupado e manualmente dividido no gabinete de biosegurança Class II Type A/B3 no conjunto
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28/31 de programas de vetor viral. Uma configuração de carga de 1 ml do lentivírus concentrado em classe USP estéril 6, frascos criogênicos de anel O externamente abertos com rosca foram utilizados. O Center for Applied Technology Development (CATD)’s Quality Systems (QS) em COH liberou todos os materiais de acordo com as Policies and Standard Operating Procedures para o CBG e em conformidade com as Boas Práticas de Fabricação atuais (cGMPs).
[0054] Para garantir a pureza da preparação do vetor lentiviral, é testado com relação aos contaminantes residuais do DNA hospedeiro, e a transferência do hospedeiro residual e do DNA de plasmídeo. Entre outros testes, a identidade do vetor é avaliada por RT-PCR para garantir que o vetor correto esteja presente. Todos os critérios de liberação são alcançados para o vetor destinado ao uso neste estudo. Exemplo 6: Preparação de Células Tcm adequadas para a Expressão de CAR de CS-1 [0055] Linfócitos T são obtidos de um paciente por leucaferese, e o subconjunto de células T alogênicas ou autólogas apropriadas, por exemplo, Células T da Memória Central (Tcm), é geneticamente alterado para expressar o CAR, depois administrados ao paciente por qualquer meio clinicamente aceitável, para obter a terapia anticâncer.
[0056] As Tcm que são CD8+ são isoladas essencialmente conforme descrito em Wang et al. (J Immunology 35:689, 2012). Resumidamente, no dia de leucaferese, as PBMC foram isoladas por centrifugação de gradiente por densidade sobre Ficoll-Paque seguido por duas lavagens em PBS/ED TA. As PBMC foram então lavadas uma vez em PBS, colocadas novamente em suspensão em meio X Vivo15 contendo soro de bezerro fetal (FCS) a 10%, transferidas para uma bolsa de transferência de 300 cm3, e armazenadas em um rotor
3-D durante a noite em temperatura ambiente (RT). No dia seguinte, até 5 x 109 PBMC foram incubadas em uma bolsa de transferência de
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300 cm3 com anti-CD4 de grau clínico (2,5 ml), anti-CD14 (1,25 ml) e microglóbulos anti-CD45RA (2,5 ml) (Miltenyi Biotec) durante 30 minutos em RT com X Vivo15 contendo FCS a 10%. As células CD4+, CD14+ e CD45RA+ foram então imediatamente esgotadas utilizando o modo de depleção CliniMACS™ de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec). Após a centrifugação, a fração negativa não marcada de células foi colocada novamente em suspensão em tampão CliniMACS™ PBS/EDTA (Miltenyi Biotec) contendo 0,5% de albumina de soro humano (HSA) e em seguida marcada com DREG56 mAb biotinilado de grau clínico (COHNMC CBG) em 0,1 mg/106 células durante 30 minutos na RT. As células foram então lavadas e colocadas novamente em suspensão em um volume final de 100 ml de CliniMACS™ PBS/EDTA contendo HSA 0,5% e transferidas para uma nova bolsa de transferência de 300 cm3. Após uma incubação de 30 minutos com 1,25 ml de microglóbulos anti-biotina (Miltenyi Biotec), a fração CD62L+ de PBMC (Tcm CD8+) foi purificada com seleção positiva em CliniMACS™ de acordo com as instruções do fabricante, e colocada novamente em suspensão em X Vivo15 contendo FCS 10%. [0057] Tcm que são CD8+/CD4+ são preparadas utilizando uma modificação do processo anterior através da modificação da seleção de CD4+, CD14+ e CD45RA+ para uma seleção de CD14+ e CD45RA+. O método utiliza um processo de duas etapas no dispositivo CliniMACS™ para em primeiro lugar esgotar as células CD14+ e CD45RA+, depois para positivamente selecionar as células CD6L+. Esta plataforma modificada gera 50 χ 106 Tcm em volume a partir de uma leucaferese única.
[0058] Após o enriquecimento, as células Tcm são formuladas em X-Vivo15 completo acrescido de 50 ILJ/ml de IL-2 e 0,5 ng/ml de IL-15 e transferidas para uma bolsa de cultura de células de Teflon, onde elas são estimuladas com glóbulos Dynal ClinEx™ Vivo CD3/CD28.
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Até cinco dias após a estimulação, as células são submetidas à transdução com vetor lentiviral que codifica o CAR de CS1 em uma multiplicidade de infecção (MOI) ao redor de 3. As culturas são mantidas durante até 42 dias com a adição de X-Vivo15 e citocina de IL-2 e IL-15 completas conforme requerido para a expansão celular (mantendo a densidade da célula entre 3 x 105 e 2 x 106 células viáveis/ml, e suplementação de citocina a cada segunda-feira, quartafeira e sexta-feira de cultura). As células tipicamente se expandem até aproximadamente 109 células sob estas condições dentro de 21 dias. No final do período de cultura, as células são colhidas, lavadas duas vezes e formuladas em meio de crioconservação de grau clínico.
[0059] Nos dias de infusão de células T, o produto crioconservado e liberado será congelado, lavado e formulado para reinfusão. Os frascos crioconservados contendo o produto celular liberado serão removidos do armazenamento de nitrogênio líquido, descongelados, esfriados e lavados com um tampão de lavagem de PBS/albumina de soro humano 2% (HSA). Após a centrifugação, o sobrenadante será removido e as células colocadas novamente em suspensão em uma solução salina normal livre de conservante (PFNS)/diluente de infusão de HSA a 2%. As amostras serão removidas para o teste de controle de qualidade.
Exemplo 7: Sequência de Aminoácido de CAR de CS1 (CSIscFvlgG4(HL-CH3)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-EGFRt) [0060] A sequência de aminoácido completa de CS1 scFv-lgG4(HLCH3)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-EGFRt é representada na FIGURA
4. A sequência inteira (SEQ ID NO: 29) inclui: um peptídeo de sinal GMCSF de 22 aminoácidos (SEQ ID NO: 26), uma sequência de scFv de CS1 (SEQ ID NO: 1); uma sequência de dobradiça de lgG4 (SEQ ID NO: 3; com substituições de aminoácidos S a P sombreadas); um conector de 10 aminoácidos (SEQ ID NO: 2); sequência CH3 ed de
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31/31 lgG4 (SEQ ID NO: 12); uma sequência de domínio da transmembrana CD28 de 28 aminoácidos (SEQ ID NO: 14); uma sequência de domínio coestimulador CD28gg (SEQ ID NO: 23; alterações de aminoácido LL a GG hibridizadas); um conector de 3 aminoácidos Gly; uma sequência CD3< de 112 aminoácidos (SEQ ID NO: 21); uma sequência de salto T2A de 24 aminoácidos (SEQ ID NO: 27); e sequência de EGFRt (SEQ ID NO: 28).
Claims (14)
- REIVINDICAÇÕES1. Método para tratamento de amiloidose de cadeia leve, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um paciente com sua necessidade de uma população de células T humanas submetidas à transdução por um vetor que compreende um cassete de expressão que codifica um receptor de antígeno quimérico, em que o receptor de antígeno quimérico compreende: um scFv de CS1; uma região espaçadora; um domínio da transmembrana; um domínio de cossinalização; e domínio de sinalização CD3 ζ.
- 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende: um scFv de CS1; uma região espaçadora; um domínio da transmembrana CD28; um domínio de cossinalização CD28; e um domínio de sinalização CD3 ζ.
- 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende: um scFv de CS1; uma região espaçadora; um domínio da transmembrana CD4; um domínio de cossinalização 4-1 BB; e um domínio de sinalização CD3 ζ.
- 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende: um scFv de CS1; uma região espaçadora que compreende uma sequência de aminoácido selecionada das SEQ ID Nos: 2 a 5 e 9 a 12; um domínio da transmembrana CD4; um domínio de cossinalização 41 BB; e um domínio de sinalização CD3 ζ.
- 5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende: um scFv de CS1; uma região espaçadora compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada das SEQ ID Nos: 2 a 5 e 9 a 12; um domínio da transmembrana CD28; um domínio de cossinalizaçãoPetição 870190101807, de 10/10/2019, pág. 37/542/3CD28; e um domínio de sinalização CD3 ζ.
- 6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende: um scFv de CS1; um espaçador que compreende uma sequência de aminoácido selecionada das SEQ ID Nos: 2 a 5 e 9 a 12; domínio da transmembrana CD4; um domínio de cossinalização 4-1 BB; e domínio de sinalização CD3 ζ.
- 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende: um espaçador que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada das SEQ ID Nos: 2 a 5 e 9 a 12; um domínio da transmembrana CD28; um domínio de cossinalização CD28; e um domínio de sinalização CD3 ζ.
- 8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada de: SEQ ID NOs: 30, 31, 33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 e 45.
- 9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende uma sequência de aminoácido idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada de: SEQ ID NOs: 30, 31,33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 e 45.
- 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende uma sequência de aminoácido idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada de: SEQ ID NOs: 30, 31,33, 34, 36, 37, 39, 40, 42, 43, 44 e 45, cada uma com não mais do que 5 substituições únicas de aminoácido.
- 11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadoPetição 870190101807, de 10/10/2019, pág. 38/543/3 pelo fato de que pelo menos 20%, 30% ou 40% das células T humanas submetidas à transdução são células T da memória central.
- 12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos 30% das células T humanas submetidas à transdução são CD4+ e CD62L+ ou CD8+ e CD62L+.
- 13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população de células T humanas é autóloga para o paciente.
- 14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população de células T humanas é alogênica para o paciente.
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