CN117126296B - 一种car-t细胞及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及细胞生物技术领域，具体公开了一种CAR‑T细胞及其构建方法和应用。本申请利用AQP3作为全新抗癌靶点，AQP3不仅在肿瘤细胞中高表达，在肿瘤基质细胞亦高表达，同时介导水和甘油的转运，可能有助于打破肿瘤存在的物理屏障，促使CAR‑T细胞更好地浸润进肿瘤中，对肿瘤进行杀伤。本申请的嵌合抗原受体融合蛋白(融合蛋白包含：包含单链可变片段scFv，其中scFv针对AQP3肿瘤抗原，所述scFv氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，铰链区，跨膜区，胞内刺激信号区)可应用于治疗AQP3阳性的恶性肿瘤，特别是在治疗非小细胞肺癌中的应用效果显著，并且治疗肺癌过程中对正常的组织损伤较小，安全性较高。

Description

一种CAR-T细胞及其构建方法和应用
技术领域
本申请涉及细胞生物技术领域，尤其是涉及一种CAR-T细胞及其构建方法和应用。
背景技术
随着肿瘤免疫疗法的兴起，采用“工程化”的嵌合抗原受体T细胞(Chimericantigen receptor T cell,CAR-T)疗法特异性靶向肿瘤细胞进行肿瘤杀伤的技术已经取得了较大的进展。CAR-T疗法在血液恶性肿瘤的治疗中取得了显著的效果。在实体瘤的治疗中也取得了一定的突破，但由于实体瘤存在的多种抑制因素以及CAR-T本身存在的如细胞因子风暴等副作用均大大限制了CAR-T疗法对实体瘤的治疗效果及应用。特异性肿瘤抗原的缺乏成为限制CAR-T疗法进一步发展的重要因素。因此克服实体瘤复杂的微环境以及寻找特异性的肿瘤抗原及靶标至关重要。
肺癌的治疗仍以常规的手术为主，辅以放化疗，近些年兴起的免疫治疗以及靶向治疗也为肺癌的治愈带来了曙光。尽管针对肺癌的各种新药物、新方法层出不穷，但是切实有效的仍然不多，而针对CAR-T肿瘤疗法的广泛研究有望为肺癌治疗带来新的希望。在目前针对肺癌的CAR-T疗法中，多数由于肺癌没有显著特异的抗原降低了CAR-T细胞的靶向性，同时由于实体瘤存在复杂的环境，多数CAR-T细胞难以进入肿瘤内发挥作用。因此，寻找特异性的肺癌抗原来“武装”T细胞，同时增加CAR-T细胞的肿瘤浸润以及活性对肺癌的治疗至关重要。
随着CAR-T肿瘤免疫疗法研究如火如荼的开展，目前CAR-T细胞疗法已经更新至第五代。CAR-T细胞在构建时，需要对T细胞修饰的复杂程度和CAR-T实际应用中发挥功能进行综合考虑。根据临床试验显示，第二代和第三代CAR-T具有较稳定和较高效的作用。目前关于肺癌的CAR-T疗法，有多项临床前和临床试验获批开展中。但由于实体瘤存在多种抑制因素导致CAR-T的治疗疗效远未达到预期，如实体瘤的存在的免疫抑制微环境，使得T细胞进入肿瘤微环境后杀伤能力被抑制同时也无法持续性发挥作用、在肿瘤发生发展中，抗原逃逸现象使得CAR-T的靶向能力减弱，肿瘤杀伤作用降低、肿瘤相关成纤维细胞的存在等液大大限制CAR-T细胞的实体瘤浸润等。目前CAR-T治疗非小细胞肺癌的临床前研究和临床试验虽然层出不穷，但是针对实体瘤的CAR-T细胞治疗效果仍十分有限，缺乏攻克肺癌组织里既有细胞外基质又含有肿瘤相关成纤维细胞的特殊物理屏障的有效且具备特异性的靶点。因此，打破实体瘤免疫抑制微环境，寻找特异性肿瘤抗原作为CAR-T肿瘤治疗靶点是目前亟需解决的科学难题。
水通道蛋白3(AQP3)的作用是重吸收水和甘油，位置分布在肾脏髓质集合管的底外侧细胞膜。AQP3可通过水和甘油运输形成伪足而促进细胞的迁移,并通过维持细胞内高水平的甘油以生成ATP和脂类，从而导致细胞增殖。多项研究表明，上调AQP3的表达，可促进肿瘤的发生。据报道，AQP3在肺腺癌中高表达，并且和预后密切相关，可通过介导活性氧的跨膜转运调控肺癌细胞的自噬从而影响肺癌的进程。同时，AQP3在诸如乳腺癌，肾癌以及胃肠肿瘤中亦存在高表达的现象。因此针对这一靶点，有望解决更为广泛的肿瘤类型。目前未见将AQP3作为肿瘤新靶点用于肿瘤免疫治疗的研究。
发明内容
本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种CAR-T细胞及其构建方法和应用，本申请通过寻找高亲和力的AQP3抗体作为CAR-T的胞外识别区域，构建了第二代CAR-T系统，将其用于肺癌的治疗研究。AQP3高表达于肺癌细胞表面和基质细胞且调控细胞的水和甘油转运，以此为靶点可以通过瓦解肿瘤的屏障的同时杀伤肿瘤细胞，从而增加CAR-T细胞的疗效。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
第一目的，本申请提供了一种嵌合抗原受体融合蛋白，所述融合蛋白从N-末端到C-末端包含：
(i)包含单链可变片段scFv，其中scFv针对AQP3肿瘤抗原，所述scFv氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，
(ii)铰链区，
(iii)跨膜区，
(iv)胞内刺激信号区。
本申请创新性地利用AQP3作为全新抗癌靶点，AQP3不仅在肿瘤细胞中高表达，在肿瘤基质细胞亦高表达，同时介导水和甘油的转运，可能有助于打破肿瘤存在的物理屏障，对肿瘤进行杀伤。本申请制备的嵌合抗原受体融合蛋白可应用于治疗AQP3阳性的恶性肿瘤，特别是在治疗非小细胞肺癌中的应用效果显著，并且治疗肺癌过程中对正常的组织损伤较小，安全性较高。
作为本申请所述嵌合抗原受体融合蛋白的优选实施方式，所述铰链区为CD8α铰链区；所述跨膜区为CD8α跨膜区；所述胞内刺激信号区为4-1BB-CD3ζ。
作为本申请所述嵌合抗原受体融合蛋白的优选实施方式，所述胞外识别区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
作为本申请所述嵌合抗原受体融合蛋白的优选实施方式，所述嵌合抗原受体融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述嵌合抗原受体融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：4所示。
第二目的，本申请提供了一种编码所述的嵌合抗原受体融合蛋白的核酸分子。
第三目的，本申请提供了一种载体，所述的载体含有上述核酸分子。
作为本申请所述载体的优选实施方式，所述载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体或其组合，优选地，所述载体为慢病毒载体。所述载体还可以为本领域中常规使用的载体，只要能实现本申请的技术效果即可。
作为本申请所述载体的优选实施方式，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的嵌合抗原受体融合蛋白通过同源重组方式连接于慢病毒载体上。
第四目的，本申请提供了一种表达上述嵌合抗原受体融合蛋白的CAR-T细胞(即AQP3-CAR-T细胞)。
所述CAR-T细胞中CAR分子包括依次串联的胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内刺激信号域，所述的胞外识别区为AQP3蛋白结合位点，胞内刺激信号域为4-1BB，构建得到的CAR-T细胞在体内外可以显著杀伤肺癌细胞，可以治疗AQP3阳性的恶性肿瘤，特别是在治疗非小细胞肺癌中的应用效果显著，同时所述CAR-T细胞治疗肺癌过程中对正常的组织损伤较小，安全性较高，值得进一步研究和推广。
本申请所述的CAR-T细胞治疗的胞外识别区利用了非小细胞肺癌特异性抗原AQP3作为肿瘤免疫治疗靶点，并且胞外识别区选用了与AQP3具有高亲和力的抗体。AQP3不仅在肺癌组织的肿瘤细胞上表达同时也表达在非肿瘤细胞的肿瘤基质细胞等成分上，介导水分和甘油转运，可能促使CAR-T细胞更好地浸润进肿瘤中，该靶点与目前CAR-T治疗肺癌的靶点而言，具有更加有效的理论基础。
第五目的，本申请提供了一种表达上述嵌合抗原受体融合蛋白的CAR-T细胞的构建方法，包括以下步骤：将所述的核酸分子或所述的载体转导入T细胞内，从而获得所述CAR-T细胞，所述CAR-T细胞的胞外识别区为AQP3蛋白结合位点。
CAR-T细胞的构建方法，具体步骤为：
I、构建嵌合抗原受体融合蛋白：依次连接CD8α的信号肽、胞外识别区(包含单链可变片段scFv，其中scFv针对AQP3肿瘤抗原，所述scFv氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)、CD8α胞外区、CD8α的跨膜区，得到的嵌合抗原受体融合蛋白；所述嵌合抗原受体融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述嵌合抗原受体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
II、构建慢病毒载体和包装慢病毒：将上述的嵌合抗原受体融合蛋白通过同源重组方式连接于慢病毒载体上，经过二代测序确定过表达片段的准确性。然后通过质粒中提纯化后，将质粒与慢病毒包装质粒按比例转染293FT细胞，72小时后收集上清经浓缩后获取病毒液，最后检测滴度后保存于-80℃超低温冰箱。
III、T细胞的分离和扩增培养：收集健康成年人外周静脉血，利用Ficoll分离法获取PBMC，再经过CD3阳性磁珠从中分离出T细胞进行扩增培养；采用步骤II中制得的慢病毒对上述培养得到的T细胞进行转染并扩增培养，获得AQP3-CAR-T细胞。
第六目的，本申请提供了一种上述的嵌合抗原受体融合蛋白、核酸分子、所述的载体、CAR-T细胞的用途，用于制备预防和/或治疗肿瘤药物或制剂。
本申请制备的嵌合抗原受体融合蛋白、CAR-T细胞可以应用于治疗AQP3阳性的恶性肿瘤，特别是在治疗非小细胞肺癌中的应用效果显著。在体内外实验中，本申请制备的CAR-T细胞(即AQP3-CAR-T细胞)可以显著杀伤肺癌细胞，为非小细胞肺癌的治疗提供了新的靶标。同时AQP3-CAR-T治疗肺癌过程中对正常的组织损伤较小，安全性较高，值得进一步研究和推广。
作为本申请所述用途的优选实施方式，所述肿瘤为AQP3阳性的恶性肿瘤。
作为本申请所述用途的优选实施方式，所述AQP3阳性的恶性肿瘤为非小细胞肺癌。
作为本申请所述用途的优选实施方式，所述AQP3阳性的恶性肿瘤包括非小细胞肺癌系H460和A549。
在体外实验中，本申请构建的CAR-T细胞也展示了有效的治疗作用，CAR-T治疗AQP3高表达的肺癌细胞系H460，可见在Normal T无明显作用下，CAR-T展现出强劲的杀伤肿瘤细胞的作用。在T细胞和肿瘤细胞共孵育一定时间后，IFN-γ的分泌与T细胞的杀伤能力是呈正比的对应关系，在AQP3 CAR-T杀伤H460细胞组的分泌量明显高于其他组，具有显著性差异。同时在体内实验中，AQP3 CAR-T细胞可显著杀伤肺癌H460形成的皮下移植瘤。病理切片显示CAR-T细胞治疗组肿瘤组织出现明显的大面积细胞坏死等。
本申请还提供了一种制剂，所述制剂含有本申请第一目的所述的嵌合抗原受体融合蛋白、本申请第二目的所述的核酸分子、本申请第三目的所述的载体、或本申请第四目的所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。
在另一优选例中，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×107个细胞/ml。
与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
本申请创新性地利用AQP3作为全新抗癌靶点，AQP3不仅在肿瘤细胞中高表达，在肿瘤基质细胞亦高表达，同时介导水和甘油的转运，可能有助于打破肿瘤存在的物理屏障，促使CAR-T细胞更好地浸润进肿瘤中，对肿瘤进行杀伤。本申请制备的嵌合抗原受体融合蛋白可应用于治疗AQP3阳性的恶性肿瘤，特别是在治疗非小细胞肺癌中的应用效果显著，并且治疗肺癌过程中对正常的组织损伤较小，安全性较高。
在肺癌中，AQP3高表达于肿瘤细胞表面。选择AQP3作为CAR-T治疗的靶点，弥补了CAR-T治疗非小细胞肺癌缺乏有效特异性靶点、CAR-T难以克服肿瘤基质细胞屏障的缺点，并且还能抑制AQP3发挥促进肿瘤进展的作用，是一个具备多项优点的治疗方向。
本申请的AQP3-CAR-T细胞也给其他AQP3阳性的肿瘤类型带来了治疗的方向，在肺癌这AQP3高表达肿瘤上已经取得了体内外实验的有益结果，AQP3-CAR依赖AQP3表达而发挥作用的治疗机制具备广泛的应用价值。本申请弥补了肺癌治疗靶点单一的缺点，为肺癌治疗提供新的靶点和思路，值得进一步研究和推广。
附图说明
图1所示为AQP3-CAR的构建的示意图；
图2为AQP3-CAR转染T细胞效率结果图；
图3为在非小细胞肺癌细胞系H460中AQP3表达量的检测结果图；
图4为在靶细胞：效应细胞的比例为1:3和1:5的条件下检测CAR-T和Normal T杀伤肿瘤细胞的作用结果图；
图5为AQP3 CAR-T+H460(5：1)、Normal T+H460(5：1)、H460细胞的共培养24小时后，撤去T细胞再培养一周后肿瘤细胞平板克隆形成图；
图6为在靶细胞：效应细胞的比例为1:3和1:5的条件下，使用ELISA方法检测了AQP3 CAR-T+H460/A549、Normal T+H460/A549、Normal T细胞、H460/A549的IFN-γ的分泌量对比图；
图7为NSG皮下成瘤后，尾静脉注射1×107APQ3-CAR-T/Normal T细胞治疗10天后收取的肿瘤，以及记录的肿瘤生长曲线及肿瘤重量图；
图8为实施例3中收取的肿瘤经固定切片和H&E染色后观察肿瘤的病理改变图；
图9为收取的注射AQP3-CAR-T细胞后第10天收取小鼠的主要脏器切片H&E染色观察病理变化，以评价CAR-T细胞对小鼠的主要脏器的毒性评价结果图。
具体实施方式
为更好的说明本申请的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本申请作进一步说明。
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
在本申请中，具体的分散、搅拌处理方式没有特别限制。
本申请所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域起作用的任何寡肽或多肽。
如本文所用，“域”或“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。
如本文所用，“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。
如本文所用，“单链可变区片段(scFv)”是指源自抗体的单链多肽，其保留了结合抗原的能力。scFv的实例包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔序列连接。制备scFv的各种方法是本领域技术人员所熟知的。
在CAR的胞外识别区和跨膜区之间可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜区连接至多肽链的胞外识别区作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向AQP3的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。
本申请的嵌合抗原受体(CAR)包括依次串联的引导序列、胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内刺激信号区。胞外识别区包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达AQP3抗原的抗体，较佳地为单链抗体。在本申请中，scFv针对AQP3肿瘤抗原，所述scFv氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
本申请提供了嵌合抗原受体(CAR)融合蛋白，所述嵌合抗原受体(CAR)融合蛋白从N-末端到C-末端包含：(i)包含单链可变片段scFv，其中scFv针对AQP3肿瘤抗原，所述scFv氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，(ii)铰链区，(iii)跨膜区，(iv)胞内刺激信号区。其还包含了引导序列，所述引导序列为CD8α的信号肽，所述铰链区为CD8α铰链区；所述跨膜区为CD8α跨膜区；所述胞内刺激信号区为4-1BB-CD3ζ。本申请的嵌合抗原受体(CAR)融合蛋白的胞外识别区选择了高亲和力的AQP3抗体位点，连接了CD8α的一部分胞外区和全部跨膜区作为连接结构，4-1BB、CD3ζ的胞内区顺次连接，并且在不同的连接部分使用5个linker氨基酸片段作为连接，如图1所示。
本申请还提供了靶向AQP3肿瘤抗原的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞在体内外可以显著杀伤肺癌细胞，可以治疗AQP3阳性的恶性肿瘤，特别是在治疗非小细胞肺癌中的应用效果显著，同时所述CAR-T细胞治疗肺癌过程中对正常的组织损伤较小，安全性较高，值得进一步研究和推广。
SEQ ID NO：1：
GAGGTGAAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGACCTGGTGAAGCCCGGCGGCAGC
CTGAAGATCAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGGCATGA
GCTGGGTGAGGCAGACCCCCGACAAGAGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAG
CAGGAGGAGCACCTACACCTACTACCCCGACAGCGTGCAGGGCAGGTTCACC
ATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGA
AGAGCGAGGACACCGCCATGTACTACTGCGCCAGGCTGAGCCTGTACGACTA
CGACGGCGCCAGGTACACCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACC
GTGAGCAGCGACATCAAGATGACCCAGAGCCCCAAGTTCATGAGCACCAGCG
TGGGCGACAGGGTGAGCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACGTGGGCACCGC
CGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTAC
TGGGCCAGCACCAGGCACACCGGCGTGCCCGACAGGTTCACCGGCAGCGGCA
GCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAACGTGCAGAGCGAGGACCTGGC
CGACTACTTCTGCCAGCAGTACAGCAGCTACCACACCTTCGGCGCCGGCACCA
AGCTGGAGATCAAG
SEQ ID NO：2：
gctggctaggtaagcttgatgctagccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgc
caggccgGAGGTGAAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGACCTGGTGAAGCCCGGCGG
CAGCCTGAAGATCAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGGC
ATGAGCTGGGTGAGGCAGACCCCCGACAAGAGGCTGGAGTGGGTGGCCACCA
TCAGCAGGAGGAGCACCTACACCTACTACCCCGACAGCGTGCAGGGCAGGTT
CACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAGCAGC
CTGAAGAGCGAGGACACCGCCATGTACTACTGCGCCAGGCTGAGCCTGTACG
ACTACGACGGCGCCAGGTACACCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGT
GACCGTGAGCAGCggtggtggtggttctggcggcggcggctccggtggtggtggttctggcggcggcggctccG
ACATCAAGATGACCCAGAGCCCCAAGTTCATGAGCACCAGCGTGGGCGACAG
GGTGAGCATCACCTGCAAGGCCAGCCAGGACGTGGGCACCGCCGTGGCCTGG
TACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCA
CCAGGCACACCGGCGTGCCCGACAGGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGA
CTTCACCCTGACCATCAGCAACGTGCAGAGCGAGGACCTGGCCGACTACTTCT
GCCAGCAGTACAGCAGCTACCACACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGAT
CAAGaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccaga
ggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttg
g
SEQ ID NO：3：
EVKLVESGGDLVKPGGSLKISCAASGFTFSSYGMSWVRQTPDKRLEWVATISRRS
TYTYYPDSVQGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARLSLYDYDGARY
TMDYWGQGTSVTVSSDIKMTQSPKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAWYQQ
KPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSY
HTFGAGTKLEIK
SEQ ID NO：4：
AGVSLMLATMALPVTALLLPLALLLHAARPEVKLVESGGDLVKPGGSLKISCAAS
GFTFSSYGMSWVRQTPDKRLEWVATISRRSTYTYYPDSVQGRFTISRDNAKNTLY
LQMSSLKSEDTAMYYCARLSLYDYDGARYTMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGG
GSGGGGSGGGGSDIKMTQSPKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAWYQQKPG
QSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSYHTF
GAGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPL。
实施例1、一种AQP3-CAR-T细胞及其构建方法
本实施例提供了一种AQP3-CAR-T细胞的构建方法，包括以下步骤：
I、确定第二代嵌合抗原受体的过表达序列：通过CD8α的信号肽顺次连接CD8α胞外区50个氨基酸(所述胞外识别区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，胞外识别区中的scFv氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)和CD8α的跨膜区和4-1BB及CD3ζ的胞内区共刺激信号，基本设计思路符合第二代CAR-T，但是各个独立分子之间存在一部分除了胞内区以外的5个氨基酸长度的序列作为连接，构成嵌合抗原受体融合蛋白，所述嵌合抗原受体融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述嵌合抗原受体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。嵌合抗原受体融合蛋白合成后用于慢病毒主质粒的构建。
II、构建慢病毒载体和包装慢病毒：将合成的嵌合抗原受体融合蛋白的DNA序列(AQP3-CAR)通过T4连接酶连接于过表达慢病毒质粒(pLenti-EF1α-puro，addgene，114444)上，经过质粒测序鉴定确定质粒的准确性。将慢病毒质粒与病毒包装质粒(按照目的质粒：PMD2G：PSPAX2＝3:2:3比例)共转染至293FT细胞，转染后8h换成新培养基，72h收取病毒上清液。按照上清液：浓缩液(Takara，631231)3：1比例加入浓缩液于4℃过夜浓缩。经3000转/min 4度离心30min后，去除上清，得到慢病毒颗粒，最后检测滴度后保存于-80℃超低温冰箱。AQP3-CAR转染T细胞效率结果如图2所示。
III、T细胞的分离培养及慢病毒转染：
(1)收集健康成年人外周静脉血，使用PBS 1：1稀释外周血，然后每35mL外周血加入15mL Ficoll(Cytiva，17544652)。利用Ficoll密度梯度离心法取中间白膜层得到单个核细胞；
(2)通过梯度离心分离得到人外周血单个核细胞后，使用PBS洗涤两次后进行计数。然后使用CD3阳性(美天旎，130-097-043)磁珠(108细胞/100μL磁珠)进行四度孵育30min，再使用PBS洗涤两遍后，进行过柱分离出T细胞。培养时，加入CD3/CD28(与T细胞比例为1：1)磁珠激活后，使用含IL2(proteintech，HZ-1015)RPMI-1640培养基培养扩增；
(3)转染时，将T细胞铺于24孔板，加入500μL培养基，使用感染系数MOI＝20进行病毒感染24小时，换成新鲜培养基，培养48小时后，使用Protein-L检测CAR的表达效率，高于50％后方可使用，最终获得AQP3-CAR-T细胞；
(4)将AQP3-CAR-T细胞继续培养至一周左右，进行体内外实验。
实施例2、AQP3-CAR-T细胞对肺癌细胞系H460细胞的杀伤实验
AQP3高表达于多种肿瘤细胞系，在非小细胞肺癌细胞系H460和A549中均表达较高。在此，本身申请使用AQP3表达量更高的非小细胞肺癌细胞系H460作为靶细胞进行体内外实验探究。
将AQP3-CAR-T细胞与H460细胞按照1：3与5：1的比例进行混合铺板于24孔板中(非小细胞肺癌细胞系H460细胞量为3×104个)，同时使用Normal T细胞按上述同样方式作为对照，共培养24小时后，收取上清液用作ELISA法检测IFN-γ含量。然后使用PBS洗去T细胞，剩下的肿瘤细胞继续培养一周后，使用4％多聚甲醛固定后，结晶紫染色，拍照并统计面积。
如图3可以观察到在AQP3-CAR-T的作用下，H460细胞死亡明显(5:1比例下)，而同比例Normal T对H460细胞无明显杀伤作用，说明AQP3-CAR-T具有特异杀伤H460的功能。
同时如图4，可见AQP3-CAR-T作用后，上清中的IFN-γ显著增高。而靶细胞：效应细胞＝1：5的比例，也符合其应用的实际情况。
参考图5，其为将AQP3 CAR-T+H460(5：1)、Normal T+H460(5：1)、H460细胞的共培养24小时后，撤去T细胞再培养一周后肿瘤细胞平板克隆形成图。
实施例3、AQP3-CAR-T细胞对于肺癌细胞系H460细胞皮下移植瘤的杀伤实验在经过实施例2的体外杀伤作用评价后，对体内的杀伤作用进行了探究。
在此，将2×106的H460细胞移植入免疫缺陷小鼠NSG皮下。待皮下肿瘤体积至100mm3时，将小鼠随机分为两组，AQP-CAR-T组和Normal T组，每组六只。经尾静脉注射107AQP3 CAR-T或Normal T细胞，每两天记录小鼠体积变化情况。待注射后第10天，麻醉处死小鼠，取皮下肿瘤，进行拍照，称重，固定和切片染色等。同时取小鼠主要脏器器官，福尔马林固定后备用。
如图6为在靶细胞：效应细胞的比例为1:3和1:5的条件下，使用ELISA方法检测了AQP3 CAR-T+H460/A549、Normal T+H460/A549、Normal T细胞、H460/A549的IFN-γ的分泌量对比图。结果：与Normal T组对比，经AQP3-CAR-T治疗后小鼠皮下移植瘤生长减缓，肿瘤重量减轻。而对肿瘤组织切片和H&E染色中可见经AQP3-CAR-T治疗后，肿瘤组织出现大面积坏死和炎性浸润，这些结果充分展示了AQP3-CAR-T细胞在体内治疗肺癌的潜力。
如图7，当NSG皮下成瘤后，尾静脉注射1×107APQ3-CAR-T/Normal T细胞治疗10天后收取的肿瘤，以及记录的肿瘤生长曲线及肿瘤重量图。当肿瘤经固定切片和H&E染色后，观察肿瘤的病理改变，如图8所示。
实施例4、安全性检测
安全性时CAR-T治疗时必须关注的一个问题，安全有效的CAR-T细胞才能被应用于后续的治疗研究中。在此，本申请人也在小鼠体内对AQP3-CAR-T细胞的安全性进行了初步研究，通过实施例3中收取的主要组织器官进行固定和切片以及H&E染色后，通过病理学观察其影响，如图9所示。
如图9所示，与Normal T相比较，AQP3 CAR-T组只要组织器官(心、肝、脾、肺和肾)无明显损伤，也没有明显的免疫细胞浸润。同时，各组织器官结构无明显改变。因此，可初步判断制备的AQP3 CAR-T细胞较安全。
综上所述，本申请创新性地利用AQP3作为全新抗癌靶点，AQP3不仅在肿瘤细胞中高表达，在肿瘤基质细胞亦高表达，同时介导水和甘油的转运，可能有助于打破肿瘤存在的物理屏障，促使CAR-T细胞更好地浸润进肿瘤中，对肿瘤进行杀伤。本申请制备的嵌合抗原受体融合蛋白可应用于治疗AQP3阳性的恶性肿瘤，特别是在治疗非小细胞肺癌中的应用效果显著，并且治疗肺癌过程中对正常的组织损伤较小，安全性较高。在肺癌中，AQP3高表达于肿瘤细胞表面。选择AQP3作为CAR-T治疗的靶点，弥补了CAR-T治疗非小细胞肺癌缺乏有效特异性靶点、CAR-T难以克服肿瘤基质细胞屏障的缺点，并且还能抑制AQP3发挥促进肿瘤进展的作用，是一个具备多项优点的治疗方向。
本申请的AQP3-CAR-T细胞也给其他AQP3阳性的肿瘤类型带来了治疗的方向，在肺癌这AQP3高表达肿瘤上已经取得了体内外实验的有益结果，AQP3-CAR依赖AQP3表达而发挥作用的治疗机制具备广泛的应用价值。本申请弥补了肺癌治疗靶点单一的缺点，为肺癌治疗提供新的靶点和思路，值得进一步研究和推广。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本申请技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，所述嵌合抗原受体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.一种编码权利要求1所述的嵌合抗原受体融合蛋白的核酸分子。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
4.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求2或3所述的核酸分子。
5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为慢病毒载体。
6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，如权利要求3所述的核酸分子通过同源重组方式连接于慢病毒载体上；
所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
7.一种表达如权利要求1所述的嵌合抗原受体融合蛋白的CAR-T细胞。
8.一种表达如权利要求1所述的嵌合抗原受体融合蛋白的CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体转导入T细胞内，从而获得所述CAR-T细胞，所述CAR-T细胞的胞外识别区为AQP3蛋白结合位点。
9.一种如权利要求1所述的嵌合抗原受体融合蛋白、权利要求2或3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体或权利要求7所述的CAR-T细胞的用途，用于制备预防和/或治疗AQP3阳性的非小细胞肺癌的药物或制剂。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述AQP3阳性的非小细胞肺癌为非小细胞肺癌系H460和A549。
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