CN115850519B - 一种靶向MAGE-A1且自分泌CD47 scFv的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物医药技术领域，提供一种具有自分泌功能的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞及其制备方法和应用。本申请公开了一种靶向MAGE‑A1且自分泌CD47scFv的嵌合抗原受体，本申请的嵌合抗原受体修饰的T细胞在自身活化的情况下，还可特异杀伤MAGE‑A1高表达的肿瘤细胞，并自分泌CD47scFv抗体，减弱肿瘤微环境的免疫抑制作用，促进自体免疫细胞对肿瘤的杀伤作用。

Description

一种靶向MAGE-A1且自分泌CD47 scFv的嵌合抗原受体及其 应用

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种具有自分泌功能的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞及其制备方法和应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞疗法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy,CAR-T)经过30多年的发展，已逐渐成为肿瘤治疗的新趋势。CAR-T细胞，即利用基因工程技术构建嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)，通过病毒(逆转录病毒或慢病毒)或非病毒方法，高效转染T淋巴细胞。CAR-T细胞可以以MHC非限制性方式特异性地识别肿瘤相关抗原，通过释放一些细胞因子(如穿孔素、颗粒酶、干扰素)以及诱导细胞凋亡等方式杀伤肿瘤细胞。完整的CAR结构包括抗原结合区、跨膜链接区和胞内信号区三个部分。经过数年研究，CAR结构经历了五代发展。第一代CAR的胞内区仅含有CD3ζ，缺乏共刺激信号，不能有效地活化T细胞且存活时间很短。第二代CAR在胞内区增加一个免疫共刺激分子如CD28、CD27或CDB7等，以增强效应T细胞的活化和增殖。第三代CAR包含CD3ζ和两个共刺激分子(如CD27、CD28、41BB、ICOS和OX-40等)，进一步增强其杀死肿瘤细胞的能力。第四代CAR增加了一个活化T细胞核因子(NFAT)域，诱导形成白细胞介素(IL)-12、IL-15等细胞因子，调节肿瘤微环境，从而提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性。第五代CAR为通用型。

CAR-T技术在血液系统肿瘤治疗方面获得重大突破，但是在实体瘤的治疗中进展缓慢。其中主要原因有两点：1.实体肿瘤缺乏肿瘤特异性抗原(TSA)，导致一系列靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞因脱靶概率增加而疗效欠佳；2.实体肿瘤内部免疫微环境可招募或诱导免疫抑制细胞，并释放大量免疫抑制因子，使得CAR-T细胞增殖减慢，耗竭加快，浸润受限，大大削弱了CAR-T细胞的杀伤效果。因此，筛选并验证更加适宜的靶抗原以降低CAR-T细胞脱靶率、减少肿瘤免疫微环境中免疫抑制作用是增强CAR-T细胞对实体瘤治疗效果的两大关键因素。

癌睾抗原(cancer/testis antigen，CTA)是一类可在恶性肿瘤组织中异常表达，而在睾丸外的正常组织中低表达或不表达的蛋白。因其肿瘤表达特异性，CTA也成为肿瘤免疫治疗的关注热点。黑色素瘤抗原A1(MAGE-A1)属于CTA中MAGE-A亚家族，是已知的致癌驱动因子，可促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等，在肿瘤的形成和发展过程中发挥重要作用。MAGE-A1在各类肿瘤组织中差异性表达并可诱导自身CTL产生特异性免疫应答，是肿瘤免疫治疗的理想靶点。肿瘤微环境(TME)由复杂异质性群体组成，包含肿瘤细胞、浸润性免疫细胞、间质细胞、内皮细胞和癌症相关的成纤维细胞等。实体肿瘤TME存在大量负性免疫抑制因子，可招募或诱导免疫抑制细胞包括肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、肿瘤相关中性粒细胞(TANs)、骨髓源性抑制细胞(MDSCs)、调节性T细胞(Tregs)和肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)。TAMs是TME中浸润性免疫细胞的主要群体，具有高度可塑性，并显示多种表型，包括M1和M2。参与抑制巨噬细胞抗肿瘤活性的一个主要抑制信号是CD47，CD47广泛表达于多种细胞表面，几乎所有肿瘤细胞均高表达CD47，CD47高表达与多种恶性肿瘤的不良预后相关。CD47是免疫球蛋白超家族的一种糖蛋白，它有一个胞外N端IgV结构域，5个跨膜螺旋和一个胞质C端短剪接尾。CD47与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α(SIRPα)结合，通过CD47-SIRPα信号通路逃逸巨噬细胞的免疫监视。多项临床前及临床研究显示：针对CD47-SIRPα通路的CD47抗体可产生良好的抑瘤作用，其机制包括影响巨噬细胞极化、增强巨噬细胞吞噬作用、提高树突状细胞抗原递呈能力等。近年来，CD47受到广泛关注，靶向CD47的免疫检查点抑制剂成为治疗人类癌症的一种新的免疫治疗策略。

目前针对肿瘤抗原MAGE-A1及同时将免疫检查点抑制剂整合入CAR结构，使其自分泌抗CD47 scFv抗体从而构建而成的分泌型CAR-T细胞及相关免疫疗法尚未有研究报道。

发明内容

本申请的研究目的是制备一种靶向MAGE-A1且能够分泌抗CD47 scFv的特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。本发明所得的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞可以特异性识别并杀伤MAGE-A1阳性的肿瘤细胞，同时自分泌CD47 scFv，增强了CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。本发明的目的之二，在于制备可靶向MAGE-A1且自分泌CD47 scFv的嵌合抗原受体的重组慢病毒载体。本发明的目的之三，在于利用上述第二点所获得的慢病毒制备可靶向MAGE-A1且自分泌CD47 scFv的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。本发明的目的之四，在于将第三点中所制备的可靶向MAGE-A1且自分泌CD47 scFv的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞应用到肿瘤免疫治疗中。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本申请的第一方面，提供一种靶向MAGE-A1且自分泌CD47 scFv的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为由CD8α信号肽(CD8αSP)、MAGE-A1抗体重链可变区(MAGE-A1 scFv-VH)、Linker区、MAGE-A1抗体轻链可变区(MAGE-A1 scFv-VK)、人CD8α铰链区(CD8αHinge)、人CD8α跨膜区(CD8αTM)、CD137、免疫受体酪氨酸活化基序CD3ζ、T2A自剪切肽(T2A)、VH3-3信号肽(VH3-3)、CD47抗体重链可变区(CD47 scFv-VH)、Linker区、CD47抗体轻链可变区(CD47 scFv-VK)和HAtag串联组成。所述的嵌合抗原受体CD8αSP—MAGE-A1 Vh—MAGE-A1Vk—CD8αHinge—CD137—CD3ζ—T2A—VH3-3—CD47 scFv—HAtag的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

优选的，所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中表达。

优选的，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞。

优选的，所述病毒载体为质粒载体和/或慢病毒载体和/或逆转录病毒载体和/或腺病毒载体。

本申请的第二方面，提供一种重组慢病毒，包括如前述方案中任一项所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pSPAX2和pMD2G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

优选的，所述哺乳细胞为293T细胞。

本申请的第三方面，提供一种组合物，所述组合物包括如前述方案中任一项所述的嵌合抗原受体和/或前述方案中任一方案所述的重组慢病毒。

本申请的第四方面，提供前述方案中任一项所述的嵌合抗原受体和/或前述方案中任一方案所述的重组慢病毒或前述方案中所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞及其在制备肿瘤疾病治疗药物中的应用。

优选的，所述肿瘤疾病为胃癌、肺癌、头颈部癌、乳腺癌、胰腺癌或卵巢癌。

有益效果：

本发明可靶向MAGE-A1且自分泌CD47 scFv抗体的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞(简称命名为MsC CAR-T细胞)，可以特异性识别和杀伤MAGE-A1阳性的肿瘤细胞，同时自分泌CD47 scFv进入到肿瘤微环境中，选择性地减少肿瘤免疫抑制，恢复肿瘤免疫监视，增强了CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用；而且分泌型CD47scFv可以避免现有CD47抗体对红细胞、血小板的误伤而造成的贫血和血小板减少症。本发明将现阶段肿瘤免疫治疗中的两大手段CAR-T细胞疗法与免疫检查点抑制剂相结合，将为肿瘤的免疫治疗提供新的研究思路。

附图说明

图1为一具体实施方案中CAR的结构示意图；

图2为一具体实施方案中CAR质粒的核酸电泳图；

图3为一具体实施方案中CAR质粒的表达验证图；

图4为一具体实施方案中CAR质粒表达后可分泌抗CD47 scFv检测图；

图5为一具体实施方案中CAR质粒分泌的CD47 scFv与CD47人类重组蛋白结合检测图；

图6为一具体实施方案中CAR质粒分泌的CD47 scFv与肿瘤细胞表面CD47特异性结合；

图7为一具体实施方案CAR-T细胞的感染效率的流式细胞检测图；

图8为一具体实施方案CAR-T细胞表型的流式细胞检测图；

图9为一具体实施方案CAR-T细胞对不同靶细胞的杀伤作用；

图10为一具体实施方案CAR-T细胞与不同靶细胞共培养后的IL-2和IFN-γ细胞因子的分泌情况；

图11为一具体实施方案CAR-T细胞治疗后荷瘤小鼠瘤重检测；

图12为一具体实施方案CAR-T细胞治疗后荷瘤小鼠增殖的影响；

图13为一具体实施方案CAR-T细胞治疗后荷瘤小鼠肿瘤组织分离后HE及IHC染色。

具体实施方式

下面结合具体实施方式及附图详细阐述本发明。以下实施方式用于说明本发明，不用于限制本发明的范围。本领域技术人员在不违背本发明内涵的情况下可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样在本申请所附权利要求书所限范围。

实施例1：CAR表达基因的合成

本发明提供的嵌合抗原受体，由CD8α信号肽(CD8αSP)、MAGE-A1 scFv、CD8跨膜区(CD8αHinge)、CD137胞内信号区、CD3ζ胞内信号区、T2A自剪切序列、VH3-3信号肽、CD47scFv和HA tag串联而成，结构如图1所示；抗MAGE-A1 scFv及CD47scFv基因序列来自本实验室所构建的单克隆抗体序列并进行了密码子优化，各基因或氨基酸序列信息如SEQ IDNO.1～24所示。

本发明中，SEQ ID NO.1～24分别为：

编码的嵌合抗原受体氨基酸序列为SEQ ID NO.1；编码嵌合抗原受体的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；CD8α信号肽(CD8αSP)的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.3；MAGE-A1 scFvVh的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.4；linker的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.5；MAGE-A1scFv Vk的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.6；CD8α跨膜区(CD8αHinge)的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.7；CD137胞内信号区的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.8；CD3ζ的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.9；T2A的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.10；VH3-3的氨基酸残基序列为SEQID NO.11；CD47 scFv的氨基酸残基序列为SEQ IDNO.12；HA tag的氨基酸残基序列为SEQID NO.13；编码CD8α信号肽(CD8αSP)的核苷酸残基序列为SEQ ID NO.14；编码MAGE-A1 Vh的核苷酸序列为SEQ ID NO.15；编码linker的核苷酸序列为SEQ ID NO.16；编码MAGE-A1scFv Vk的核苷酸序列为SEQ ID NO.17；编码CD8跨膜区(CD8αHinge)的核苷酸序列为SEQID NO.18；编码CD137胞内信号区的核苷酸序列为SEQ ID NO.19；编码CD3ζ的核苷酸序列为SEQ IDNO.20；编码T2A的核苷酸序列为SEQ ID NO.21；编码VH3-3的核苷酸序列为SEQIDNO.22；编码CD47 scFv的核苷酸序列为SEQ ID NO.23；编码HAtag的核苷酸序列为SEQ IDNO.24。

实施例2：CAR质粒的构建

采用Infusion PCR完成实施例1中CAR各核苷酸结构片段的拼接，获得CAR_MsC、CAR_m及CAR_Un(CD19 CAR)，如图1所示。

在上述三种CAR结构的5’端添加Xba I酶切位点，3’端添加Not I酶切位点，T2A5’端添加EcoR I酶切位点。慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1a-CopGFP用Xba I/Not I进行双酶切，然后采用In-fusion PCR方式分别将CAR_MsC片段、CAR_m及对照CAR_Un片段分别与PCDH-CMV-MCS-EF1a-CopGFP载体连接。

将连接所得产物分别转化E.coli(DH5α)感受态，挑取单克隆培养后，提取质粒并进行测序，获得pCDH-CAR_MsC、pCDH-CAR_m及pCDH-CAR_Un质粒,CAR_MsC质粒的核酸电泳图见图2，结果提示CAR_MsC质粒构建成功。

实施例3：分泌型特异性CAR的结合能力及外源性CD3ζ表达鉴定

用10cm培养皿培养Lenti-X^TM293T细胞，当密度为80％左右可进行转染，转染前24h更换为不含抗生素的DMEM培养基(含有10％FBS)。

分别将pCDH-CAR_MsC、pCDH-CAR_m及pCDH-CAR_Un质粒转染至Lenti-X^TM293T细胞，每皿转染的质粒量均为15ug，未转染的Lenti-X^TM293T细胞作为阴性对照。于转染48h后用荧光显微镜观察GFP荧光表达情况，转染72h后收集293T细胞及培养上清，并提取细胞总蛋白。Western Blot法检测外源性CD3ζ表达，如图3所示，各CAR质粒均有外源性CD3ζ表达，结果表明所制备的CAR质粒可以成功在细胞内表达。

实施例4：分泌型特异性CAR分泌CD47 scFv的检测。

收集实施例3中的细胞培养上清，1000r/min离心5min去掉细胞沉淀，通过抗HAtag磁珠进行免疫沉淀，富集细胞培养上清中的CD47 scFv-HA，收集洗脱产物进行WesternBlot实验以检测上清中HA tag的存在，进而验证分泌型特异性CAR可以分泌CD47 scFv。结果显示，仅在pCDH-CAR_MsC中检测到了HA tag的表达(如图4)，pCDH-CAR_m及pCDH-CAR_Un未见标签蛋白表达，表明分泌型特异性CAR可以分泌出CD47scFv。

实施例5：检测CD47 scFv对CD47蛋白的识别及结合能力

用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释rhCD47蛋白至2μg/mL，包被ELISA板。将实施例4中收集的抗CD47 scFv-HA按1:2倍比稀释，起始浓度为32μg/ml。采用ELISA方法以检测分泌型特异性CAR分泌的CD47 scFv与rhCD47蛋白的结合能力，如图5所示。

制备经检测为MAGE-A1高表达的NCI-H1299单细胞悬液，细胞数在5×10^5个/组，每组分别加入100μL实施例4中收集的抗CD47 scFv-HA、CD47兔单克隆抗体和PBS，抗体浓度为40μg/ml。流式细胞仪检测结果表明，分泌型CAR分泌的CD47 scFv可特异性识别人肿瘤细胞表面的CD47抗原，见图6。

实施例6：慢病毒的包装、浓缩与滴度测定

慢病毒的包装：转染前24h将2×10⁶个Lenti-X^TM293T细胞接种于10cm细胞培养皿中，用不含抗生素的DMEM培养基(含有10％FBS)培养，待细胞密度达到80％左右即可进行转染。

分别将pCDH-CAR_MsC、pCDH-CAR_m及pCDH-CAR_Un质粒和包装质粒pSPAX2、pMD2.G共转染至Lenti-X^TM293T细胞制备慢病毒，pMD2.G和psPAX2、重组表达质粒的质量比为1:3:4。转染48h后用荧光显微镜观察GFP表达情况，分别于转染48h和72h后收集细胞培养上清，3000rpm离心10min，然后用0.45μm滤器过滤，分别获得pCDH-CAR_MsC、pCDH-CAR_m及pCDH-CAR_Un病毒原液。

慢病毒的浓缩:将病毒上清置于Amicon Ultra 100kD的超滤管中，4℃，4000rpm离心30min，取1：100的DMEM溶解慢病毒沉淀，分装并于-80℃储存，得慢病毒浓缩液。

慢病毒滴度测定：预先将Lenti-X^TM293T细胞接种至96孔板，每孔1×10⁴cells，培养过夜。第二天将病毒浓缩液按照1:10倍比稀释，共准备9个浓度梯度的病毒稀释液，吸掉96孔板中的培养基，将病毒稀释液依次加入第1至第9个孔，每孔100μL，第10孔为空白对照组，加入100μL DMEM完全培养基，并向每孔加入polybrene(终浓度为10μg/mL)。培养48小时后用荧光显微镜观察荧光表达情况，使用LASER法进行病毒滴度的计算。

实施例7：T细胞的分离培养、CAR慢病毒转导

用淋巴细胞分离液从健康志愿者外周血中分离PBMCs。将PBMCs接种于预包被抗人CD3、CD28抗体的24孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。将慢病毒浓缩液按MOI＝20感染活化培养的人T细胞，然后加入IL-2、7和15继续培养。感染72h后通过流式细胞仪检测T细胞表面GFP的表达,结果见图7。感染120h后通过流式细胞仪检测CAR-T细胞表型，结果见图8。

实施例8：分泌型特异性CAR-T细胞体外杀伤活性检测

将人神经胶质瘤细胞U87、人卵巢癌细胞SKOV3、人前列腺癌细胞PC-3、人喉表皮样癌细胞Hep-2及人胃癌高转移细胞MKN-28以3×10³个/孔接种于96孔板，设置3个复孔，待细胞贴壁后按效靶比为20:1、10:1、5:1及2:1加入各组CAR-T细胞。共培养18h后，采用LDH释放法检测CAR-T细胞特异性杀伤作用(见图9)。

1)靶细胞(T)：消化U87、SKOV3、PC-3、Hep-2、MKN-28细胞，进行细胞计数，调

整细胞浓度为6×10⁴个/ml，吸取50μL细胞悬液接种至平底96孔板中，过夜培养。2)效应细胞(E)：取制备好的MsC CAR及其他组CAR-T细胞，调整效应细胞浓度分

别为1.2×10⁶个/ml(20:1)、6×10⁵个/ml(10:1)、3×10⁵个/ml(5:1)、1.2×10⁵个/ml(2:1)。

3)吸掉96孔板中的培养基，更换为FBS为5％的1640培养基。在样品组及样品Blank组中，分别加入50ul各浓度的效应细胞悬液，共培养18h。

4)向高对照孔及高对照Blank孔中加入10μl Lysis Buffer，在5％CO₂，37℃培养箱内培养30min。

5)向每孔加入100μl Working Solution，避光孵育15min。

6)每孔加入50μl Stop Solution，检测490nm的吸光度。

7)杀伤值计算：A(样品孔-样品Blank孔)、B(高对照孔-高对照Blank孔)和C(低对照孔-背景Blank孔)。公式如下：细胞杀伤率(％)＝[(A-C)/(B-C)]×100％。

实施例9：CAR-T细胞与不同靶细胞共培养后的IL-2和IFN-γ分泌量测定

将U87、SKOV3、PC-3、Hep-2、MKN-28细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后按效靶比为10:1分别加入各组CAR-T细胞。共培养24h后收取上清，采用ELISA法检测各组上清中IL-2和IFN-γ含量(见图10)。

1)靶细胞：消化U87、SKOV3、PC-3、Hep-2、MKN-28肿瘤细胞，调整细胞浓度至

1x10⁵个/ml，吸取100μL细胞悬液铺96孔板，设置3个复孔，培养过夜。

2)效应细胞：将各组CAR-T细胞进行细胞计数，调整细胞密度为1×10⁶个/ml，吸取100μl各组CAR-T细胞分别加入相应孔中，共培养24h后收取细胞培养上清，1000rpm/min离心5min去掉沉淀。

3)使用1×Coating Buffer将Capture Antibody稀释，每孔加入100ul，封口膜密封，4℃过夜。

4)吸弃液体，每孔加入250μL PBST，浸泡1min，吸弃液体，吸水纸吸干残余液体，共漂洗3次。

5)每孔加入200μl 1×ELISA/ELISPOT Diulent封闭，室温孵育1h。

6)吸弃ELISA/ELISPOT Diulent，PBST溶液清洗3遍。

7)溶解标准品并用1×Diulent按1:2倍比稀释，共准备8个浓度梯度，每孔加入100μl，每组设3个复孔，室温避光孵育2h。

8)吸弃液体，PBST洗5次。96孔板中每孔加入100μL稀释好的Detection Antibody，室温孵育1h。

9)PBST洗5次，每孔加入稀释好的Avidin-HRP，100μl/孔，室温孵育30min。

10)重复第4步，每次浸泡2min，清洗6次。

11)向96孔板中加入1×TMB,100μL/孔，室温孵育15min。

12)打开酶标仪，每孔加入100μL Stop Solution，检测450nm吸光度。

实施例10：分泌型CAR-T细胞对荷瘤小鼠的杀伤作用

裸鼠皮下注射PC-9细胞2周后，肿瘤体积达到200～300mm³，进行动物实验。随机将小鼠分为四组，在成瘤后第0、3、6天分别注射自尾静脉注射MsC CAR-T细胞、mCAR-T细胞、UnCAR-T细胞、Actived T细胞。在注射后第0、3、6、9、12天进行瘤体大小的测量。治疗后15天，处死荷瘤小鼠，检测瘤体负荷重量。将解剖获得的肿瘤样本进行IHC和HE染色检测，评估抑瘤效果。

结果表明，MsC CAR-T细胞和mCAR-T细胞能显著抑制HepG2移植瘤的生长(图11)(P＜0.05)，经MsC CAR-T细胞治疗后小鼠的肿瘤负荷最低，比mCAR-T细胞具有更明显的抑瘤肿作用(图12)(P＜0.05)，Un CAR-T细胞和Actived T细胞治疗的小鼠，肿瘤呈持续生长趋势未见异常。

HE及IHC检测表明，MsC CAR-T细胞和mCAR-T细胞均能抑制肺癌细胞生长，MsCCAR-T细胞的抑制作用优于mCAR-T细胞，治疗后的肿瘤组织炎症减少，浸润性T细胞增多(图13)。

上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

说明书中所涉及序列如下所示：

SEQ ID NO.1嵌合抗原受体氨基酸序列为：

MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADPVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLIHDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRKTPHTFGQGTKVEIKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRPEFPGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYSMSWVRQAPGKGLEWVASISSSSGYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATWPVTTARVGYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDVNSYLHWYQQKPGQAPRLLIKSASNRISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKYPYDVPDYA

SEQ ID NO.2嵌合抗原受体核苷酸序列为：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCA

GCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAT

TCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCT

ATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAA

TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGA

AACTGATTCATGATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCA

GGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC

ATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATC

AGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCGGGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA

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AACTTACTACTGTCAACAGAGTAGGAAGACTCCTCATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAT

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TTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGG

GCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCA

GAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGC

TGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGA

CGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACG

ATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAA

GGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCG

CCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCC

TTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCCCGGAATTCCCGGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACA

TGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTT

AAAAGGTGTCCAGTGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGA

GACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGGGTATAGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG

AAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCTCCATTAGTAGTAGTAGTGGTTACATATACTATGCAGACTCTGTGAAGGG

CCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGG

ACACGGCTGTGTATTACTGTGCGACCTGGCCGGTGACTACGGCGAGGGTCGGCTACTGGGGCCAAGGAACC

CTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGG

TGGTTCGGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCT

CCTGCAGGGCCAGTCAGGACGTTAACAGCTACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGG

CTCCTCATCAAATCAGCATCCAACAGGATTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGAC

AGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACAGCATTATA

CTACCCCTCCTACTTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAATACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTSEQ ID NO.3CD8α信号肽(CD8αSP)的氨基酸残基序列为：MALPVTALLLPLALLLHAARP

SEQ ID NO.4MAGE-A1 scFv Vh的氨基酸残基序列为：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADPVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLIHDFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.5linker的氨基酸残基序列为：

GGGGSGGGGSGGGGST

SEQ ID NO.6MAGE-A1 scFv Vk的氨基酸残基序列为：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRASALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSRKTPHTFGQGTKVEIK

SEQ ID NO.7CD8跨膜区(CD8αHinge)的氨基酸残基序列为：

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

SEQ ID NO.8CD137胞内信号区的氨基酸残基序列为：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

SEQ ID NO.9CD3ζ的氨基酸残基序列为：

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO.10T2A的氨基酸残基序列为:

PEFPGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP

SEQ ID NO.11VH3-3的氨基酸残基序列为:

MEFGLSWLFLVAILKGVQC

SEQ ID NO.12CD47 scFv的氨基酸残基序列为：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYSMSWVRQAPGKGLEWVASISSSSGYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCATWPVTTARVGYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDVNSYLHWYQQKPGQAPRLLIKSASNRISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK

SEQ ID NO.13HA tag的氨基酸残基序列为：

YPYDVPDYA

SEQ ID NO.14编码CD8α信号肽(CD8αSP)的核苷酸残基序列为：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG

SEQ ID NO.15编码MAGE-A1 VH的核苷酸序列为：

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACTGATTCATGATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC

SEQ ID NO.16编码Linker的核苷酸序列为：

GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGACG

SEQ ID NO.17编码MAGE-A1 Vk的核苷酸序列为：

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATCGGGCATCCGCTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTAGGAAGACTCCTCATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

SEQ ID NO.18编码CD8跨膜区(CD8αHinge)的核苷酸序列为：

TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC

SEQ ID NO.19编码CD137胞内信号区的核苷酸序列为：

AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG

SEQ ID NO.20编码CD3ζ的核苷酸序列为：

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

SEQ ID NO.21编码T2A的核苷酸序列为：

CCGGAATTCCCGGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT

SEQ ID NO.22编码VH3-3的核苷酸序列为：

ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGC

SEQ ID NO.23编码CD47 scFv的核苷酸序列为:

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGGGTATAGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCTCCATTAGTAGTAGTAGTGGTTACATATACTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGACCTGGCCGGTGACTACGGCGAGGGTCGGCTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCGGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGGACGTTAACAGCTACTTACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCAAATCAGCATCCAACAGGATTTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACAGCATTATACTACCCCTCCTACTTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

SEQ ID NO.24编码HA TAG的核苷酸序列为:

TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCT。

Claims (9)

1.一种靶向MAGE-A1且自分泌CD47 scFv的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为CD8αSP-MAGE-A1 Vh-MAGE-A1 Vk-CD8αHinge-CD137-CD3ζ-T2A-VH 3-3-CD47 scFv-HA tag；

所述的嵌合抗原受体CD8αSP-MAGE-A1 Vh-MAGE-A1 Vk-CD8αHinge-CD137-CD3ζ-T2A-VH3-3-CD47 scFv-HA tag的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体通过将编码其的核苷酸序列转染到T细胞中表达。

4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞。

5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述病毒载体为质粒载体和/或慢病毒载体和/或逆转录病毒载体和/或腺病毒载体。

6.一种重组慢病毒，其特征在于，包括如权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pSPAX2和pMD2G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

7.根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述哺乳细胞为293T细胞。

8.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体和/或如权利要求6或7任一项所述的重组慢病毒。

9.权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体在制备经检测MAGE-A1基因表达阳性的胃癌、肺癌或卵巢癌的治疗药物中的应用。

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