CN111378624B - 一种靶向性抗肿瘤t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向性抗肿瘤T细胞，包括靶向CEA的嵌合抗原受体CAR‑CEA和靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR‑MUC1，该T细胞能同时识别两种不同的肝癌靶点CEA及MUC1，对肿瘤细胞的靶向识别性广且强，可避免肿瘤细胞出现靶点逃逸，扩大了其广谱杀伤性，提升了肿瘤杀伤能力，增强了免疫细胞的体内持久性。本发明还提供了该靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法和应用。

Description

一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内排位第五位的最常见的恶性肿瘤。在我国，每年由于肝癌死亡的人数超过十万。而嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigen Receptor T-Cell，CAR-T)作为当前最新的免疫细胞技术之一，因其治疗肿瘤具有特异性强、几乎无毒副作用的巨大优势而弥补了传统疗法的弊端，受到了广泛的关注和研究。它是将经过CAR改造的T细胞回输至人体，激活自身免疫系统，对肿瘤细胞进行杀伤，以达到清除恶性肿瘤细胞的目的，被认为最有可能彻底清除肿瘤细胞的方法。
但目前CAR-T技术的应用还局限于白血病、骨髓瘤、淋巴瘤等血液系统肿瘤，在诸如肝癌等实体肿瘤中的应用较少，且在复杂的肿瘤微环境中(如多种肿瘤抗原同时出现的情况)，CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别、杀伤能力大大降低，限制了其临床应用。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种针对肝癌的靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用。该T细胞可高效靶向至肝癌细胞的两个肿瘤靶点，对肝癌细胞的靶向性高、识别性较广且强，可避免肿瘤细胞出现靶点逃逸，具有较强的肝癌细胞杀伤性。
第一方面，本发明提供了一种靶向性抗肿瘤T细胞，所述靶向性抗肿瘤T细胞为带靶向CEA的嵌合抗原受体CAR-CEA和带靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1的双靶点嵌合抗原受体T细胞，或者为带所述CAR-CEA的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-MUC1的嵌合抗原受体T细胞的混合，或者为带所述CAR-CEA的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-MUC1的嵌合抗原受体T细胞的一种或多种与带所述CAR-CEA和所述CAR-MUC1的双靶点嵌合抗原受体T细胞的混合；其中，所述CAR-CEA包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CEA的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-MUC1包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向MUC1的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，所述靶向CEA的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向MUC1的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
其中，当所述靶向性抗肿瘤T细胞为带CAR-CEA和CAR-MUC1的双靶点CAR-T时，嵌合抗原受体CAR-CEA和CAR-MUC1的分布位置不作限定，可以是交替分布(例如ABAB…，AABABB…)或依次分布(例如AAAA…BBB…)，但两者之间并无共价连接，此时它们相应的CEA单链抗体和MUC1单链抗体之间也并无共价连接，这样可使它们保持较好的识别能力。
上述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向CEA的单链抗体或所述靶向MUC1的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
上述提及的CEA(癌胚抗原，carcinoembryonic antigen)是一种具有人类胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，在大肠癌、胃癌、肝癌等恶性肿瘤中含量较高，它是一种广谱肿瘤标志物，其在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测、疗效评价等方面有重要临床价值。粘蛋白1(MUC1)是广泛研究的粘蛋白家族成员之一，其在乳腺癌、肝癌等多种肿瘤中异常表达，且由于糖基化不全，导致MUC1多肽骨架上的抗原决定簇暴露出来，成为肿瘤主动性免疫治疗的靶点。而本发明上述靶向性抗肿瘤T细胞带有CAR-CEA和CAR-MUC1，能同时识别两种不同的肝癌细胞靶点CEA及MUC1，有效避免肝癌细胞出现免疫逃逸。
优选地，所述靶向性抗肿瘤T细胞为CAR-CEA和带CAR-MUC1的双靶点嵌合抗原受体T细胞。这种情况下可降低在临床免疫治疗中所需要的T细胞数目。
可选地，所述靶向CEA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述靶向MUC1的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。本发明所述靶向CEA的单链抗体保留有对CEA抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有CEA抗原的肿瘤细胞。类似地，所述靶向MUC1的单链抗体也保留有对MUC1抗原的亲和活性，能够高效识别表面表达有MUC1抗原的B系恶性淋巴细胞。
可选地，所述靶向CEA的单链抗体的氨基酸序列的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，保护范围还应该包括与SEQ ID NO:3具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。所述靶向MUC1的单链抗体的氨基酸序列的编码基因同样应该考虑简并碱基。
本发明中，所述CAR-CEA中的胞外铰链区用于促进所述靶向CEA的单链抗体与肿瘤细胞上的CEA抗原结合。所述CAR-MUC1中的胞外铰链区的作用与之类似。
可选地，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。
进一步可选地，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。可选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。可选地，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。
可选地，所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:10具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:9。
本发明中，所述CAR-CEA中的跨膜区用于固定所述靶向CEA的嵌合抗原受体CAR-CEA；类似地，所述CAR-MUC1中的跨膜区用于固定所述靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1。
可选地，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。
进一步可选地，所述跨膜区为CD8跨膜区。可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。可选地，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ IDNO：12所示的核苷酸序列。
可选地，所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的编码基因还应该包括与SEQ ID NO:12具有碱基简并性质的核苷酸序列。
本发明中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。
可选地，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。
在本发明一实施方式中，所述胞内信号区为从氨基端到羧基端顺次连接的4-1BB信号区和CD3ζ信号区。相应地，所述胞内信号区的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的4-1BB信号区的编码基因和CD3ζ信号区的编码基因。
其中，CD3ζ信号区为胞内信号传导结构域(第一信号区)，4-1BB信号区为共刺激结构域，在它们的共同作用下，T细胞在识别抗原后被完全活化。进一步可选的，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述4-1BB信号区的氨基酸序列的氨基端相连，所述4-1BB信号区的氨基酸序列的羧基端与所述CD3ζ信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
可选地，所述4-1BB信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。可选地，所述4-1BB信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。
可选地，所述4-1BB信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的编码基因还应该包括与SEQ ID NO:14具有碱基简并性质的核苷酸序列。
可选地，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。可选地，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。所述CD3ζ信号区的编码基因应该考虑简并碱基，其还应该包括与SEQ ID NO:16具有碱基简并性质的核苷酸序列。
需要说明的是，本发明中，所述CAR-CEA中的胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，与所述CAR-MUC1中对应的胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区对应的氨基酸序列可以相同，也可以不同。
在本发明一实施方式中，所述CAR-CEA的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。可选地，所述CAR-CEA的编码基因包括如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-CEA的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的编码基因还应该包括与SEQ ID NO:17具有碱基简并性质的核苷酸序列。
在本发明一实施方式中，所述CAR-MUC1的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。可选地，所述CAR-MUC1的编码基因包括如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-MUC1的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编码基因还应该包括与SEQ ID NO:18具有碱基简并性质的核苷酸序列。
本发明第一方面提供的靶向性抗肿瘤T细胞，包括靶向CEA的嵌合抗原受体CAR-CEA和靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1，能同时识别两种不同的肝癌靶点，增强了对肝癌细胞的识别，有效避免肝癌细胞出现免疫逃逸。具体地，当CAR-CEA和CAR-MUC1与肝癌细胞上相应的抗原蛋白结合后，所述靶向性抗肿瘤T细胞的胞内信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性地杀伤肿瘤细胞(具体为表达CEA和/或MUC1的肝癌细胞)，治疗效果较好。此外因所述CEA和MUC1的单链抗体为人源化单链抗体，这使得该抗肿瘤T细胞避免引起人机体的免疫反应，具有持久的在体维持能力，如活性和杀伤力。
第二方面，本发明提供了一种重组病毒载体，包括如第一方面所述的靶向性抗肿瘤T细胞中所述CAR-CEA和/或CAR-MUC1的编码基因。
可选地，当所述重组病毒载体含有CAR-CEA的编码基因和CAR-MUC1的编码基因时，在所述重组病毒载体上所述CAR-CEA的编码基因和所述CAR-MUC1的编码基因之间，还包括一特殊序列，该特殊序列用于使所述CAR-CEA编码基因和所述CAR-MUC1的编码基因在转录翻译后可以得到两个独立的蛋白CAR-CEA和CAR-MUC1。在采用这样的重组病毒载体转染CD3阳性T淋巴细胞后，所得的靶向性抗肿瘤T细胞为带CAR-CEA和CAR-MUC1的双靶点嵌合抗原受体T细胞。进一步可选地，所述特殊序列可以是RBS序列、IRES序列、T2A序列或其他蛋白酶序列等。
可选地，所述重组病毒载体带有所述CAR-CEA的编码基因，或者带有所述CAR-MUC1的编码基因。优选采用CAR-CEA编码基因的重组病毒载体与带CAR-MUC1编码基因的重组病毒载体分开或同时地共同感染T淋巴细胞，可得到如本发明第一方面所述的靶向性抗肿瘤T细胞，且所述重组病毒载体的感染效率较高，所得靶向性抗肿瘤T细胞能较充分地表达CAR-CEA和/或CAR-MUC1。
可选地，所述CAR-CEA的编码基因包括如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。
优选地，所述CAR-CEA的编码基因包括如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列。如SEQID NO：19所示的核苷酸序列与如SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列相比，多了下文所述的连接肽的编码基因。所述信号肽的编码基因可以较好地指导所述嵌合抗原受体CAR-CEA表达到细胞表面。
可选地，所述CAR-MUC1的编码基因包括如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列。
优选地，所述CAR-MUC1的编码基因包括如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列。SEQID NO：20所示的核苷酸序列与SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列相比，多了所述连接肽的编码基因。信号肽的编码基因可以较好地指导所述嵌合抗原受体CAR-MUC1达到细胞表面。
可选地，所述重组病毒载体中的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。进一步可选地，所述病毒载体为慢病毒载体。在本发明第四方面提供的制备方法的步骤(1)-(3)示出了所述重组病毒载体的制备过程。
本发明第二方面提供的所述重组病毒载体具有较高的感染效率以及转录效率，其中的CAR-CEA和/或CAR-MUC1的编码基因片段能通过基因重组插入宿主基因组，得到上述靶向性抗肿瘤T细胞，使其持续、稳定地发挥靶向、杀伤效力。
第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，包含如第二方面所述的重组慢病毒载体。
本发明第三方面提供的所述宿主细胞用于组装上述重组病毒载体，使其具有感染性。
可选地，所述宿主细胞包括但不限于HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、COS1细胞和COS7细胞。
第四方面，本发明提供了一种靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，包括：
(1)分别提供靶向CEA的嵌合抗原受体CAR-CEA的编码基因和靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1的编码基因；
所述CAR-CEA的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向CEA的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-MUC1的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向MUC1的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；
其中，所述靶向CEA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述靶向MUC1的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-CEA的编码基因和所述CAR-MUC1的编码基因分别插入到pWPXLd载体中，得到pWPXLd-CAR-CEA重组质粒和pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒；
(3)分别对所述pWPXLd-CAR-CEA重组质粒和所述pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒进行包装，得到带CAR-CEA编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-MUC1编码基因的第二重组慢病毒；
(4)将所述第一重组慢病毒与所述第二重组慢病毒分开或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向性抗肿瘤T细胞。
以CAR-CEA的编码基因为例，上述“从5’端到3’端顺次连接”具体为：所述信号肽的编码基因的3’端与所述靶向CEA的单链抗体的编码基因的5’端相连，所述靶向CEA的单链抗体的编码基因的3’端与所述胞外铰链区编码基因的5’端相连，所述胞外铰链区的编码基因的3’端与所述跨膜区的编码基因的5’端相连，所述跨膜区的编码基因的3’端与所述胞内信号区的编码基因的5’端相连。
本发明中，所述信号肽用于指导所述嵌合抗原受体CAR-CEA或CAR-MUC1表达到细胞表面，所述信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。而CAR-CEA的编码基因中信号肽与所述CAR-MUC1的编码基因中信号肽的氨基酸序列可以相同，也可以不同，也可以是它们的信号肽的氨基酸序列相同，而核苷酸序列不同。
可选地，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。
可选地，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列。
可选地，所述信号肽的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的编码基因还应该包括与SEQ ID NO:22具有碱基简并性质的核苷酸序列。
对于所述胞外铰链区、跨膜区、胞内信号区的具体选择及相应的编码基因序列，可参见本发明第一方面所述，这里不再赘述。
可选地，所述CAR-CEA的编码基因包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-CEA的编码基因包括如SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列。当然，所述CAR-CEA的编码基因也可包括与SEQ ID NO：19的序列具有碱基简并性质的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-MUC1的编码基因包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列。可选地，所述CAR-MUC1的编码基因包括如SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列。所述CAR-MUC1的编码基因也可包括与SEQ ID NO：20的序列有碱基简并性质的核苷酸序列。
以CAR-CEA为例，SEQ ID NO：19与SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列相比，多了连接肽的编码基因，但在嵌合抗原受体CAR-CEA表达到T细胞表面时，信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。因此，在翻译成的嵌合抗原受体CAR-CEA的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)中并未带有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。CAR-MUC1的情况与之类似。
以CAR-CEA为例，所述CAR-CEA的编码基因序列插入到pWPXLd载体中BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLd载体的延伸因子1α(EF1α)之后，以EF1α为启动子。所述CAR-CEA的编码基因序列插入到pWPXLd载体时，所述CAR-CEA的基因序列的5’端还可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLd载体中BamH1酶切位点相连，3’端还可加入终止密码子与pWPXLd载体中EcoR1酶切位点相连。CAR-MUC1的情况与之相同。
可选地，步骤(3)中，所述“分别对所述pWPXLd-CAR-CEA重组质粒和所述pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒进行包装，得到带CAR-CEA编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-MUC1编码基因的第二重组慢病毒”，包括：将所述pWPXLd-CAR-CEA重组质粒与包膜质粒和包装质粒共转染宿主细胞，得到第一重组慢病毒；将所述pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒与包膜质粒和包装质粒共转染宿主细胞，得到第二重组慢病毒。
采用本发明所述的方式制备重组质粒及包装病毒，其中，所述pWPXLd-CAR-CEA重组质粒和pWPXLd-CAR-MUC重组质粒上，CAR-CEA和CAR-MUC的编码基因经过了密码子优化，且分子量适宜，重组慢病毒的包装效率高，同时通过宿主细胞制得的病毒的浓度较高。相应地，采用第一重组慢病毒和第二重组慢病毒来联合转染CD3阳性T淋巴细胞时，这两种重组慢病毒的用量较低，可降低实验成本。
本发明一实施方式中，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。其中，所述包膜质粒PMD2G编码水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳，所述水疱性口炎病毒糖蛋白衣壳可以协助重组慢病毒向细胞膜粘附，并保持重组慢病毒的感染性。
可选地，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞的获得过程如下：先将外周血单个核细胞按一定比例加入CD3/CD28免疫磁珠，并孵育一段时间后，放入磁铁进行筛选，得到免疫磁珠包被的CD3阳性T淋巴细胞，去除磁珠后，获得CD3阳性T淋巴细胞。
其中，步骤(4)中，将所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒分开或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，包括：先采用所述第一重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞后，再采用所述第二重组慢病毒进行转染；或先采用所述第二重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞后，再采用所述第一重组慢病毒进行转染；或采用所述第一重组慢病毒和所述第二重组慢病毒同时地转染CD3阳性T淋巴细胞。这里“联合转染”是指针对同一组细胞进行。
进一步地，步骤(4)中，第一重组慢病毒与第一重组慢病毒的病毒滴度之比是1：(0.5-2)。
本发明步骤(4)中所得到的靶向性抗肿瘤T细胞，如本发明第一方面所述。
此时，靶向性抗肿瘤T细胞的表面具有两个独立的、未共价结合的嵌合抗原受体(也即是有两个独立的单链抗体)，不影响它们对各自靶标的识别、结合，能同时、高效地识别肝癌细胞上的CEA和MUC1靶标。所述靶向性抗肿瘤T细胞对表达CEA和MUC1中一种或两种的肿瘤细胞均能识别和杀伤，可避免肿瘤细胞出现靶点逃逸，提高了其靶向识别的广度和强度，以及杀伤广谱性，在复杂的肿瘤微环境下也具有较强的肿瘤杀伤能力。
在本发明另一实施方式中，当所需靶向性抗肿瘤T细胞为带所述CAR-CEA的嵌合抗原受体T细胞和带所述CAR-MUC1的嵌合抗原受体T细胞的混合时，也可以采用以下方式制得：采用上述第一重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，得到带所述CAR-CEA的嵌合抗原受体T细胞；采用上述第二重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，得到带所述CAR-MUC1的嵌合抗原受体T细胞；然后将这两种嵌合抗原受体T细胞进行混合。
本发明第四方面提供的靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法中，采用带CAR-CEA编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-MUC1编码基因的第二重组慢病毒分别或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，可使得制得的靶向性抗肿瘤T细胞上嵌合抗原受体CAR-CEA和CAR-MUC1的表达效率更高，以具有较好的肿瘤识别、杀伤能力。
第五方面，本发明提供了一种如本发明第一方面所述的靶向性抗肿瘤T细胞、如本发明第二方面所述的重组病毒载体、如本发明第三方面所述的宿主细胞或如本发明第四方面所述的制备方法制得的靶向性抗肿瘤T细胞在制备诊断和/或治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
特别地，适用于表达CEA和/或MUC1的恶性肿瘤(例如肝癌等)的诊断和治疗。可选地，在制备诊断和治疗肝癌的药物中的应用。
所述应用可以具体为：提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的靶向性抗肿瘤T细胞或采用如第二方面所述的重组病毒载体转染得到的靶向性抗肿瘤T细胞或采用如第四方面所述的制备方法所制得的靶向性抗肿瘤T细胞，如本发明第二方面所述的重组病毒载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞中的一种或多种。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-CEA重组质粒的质粒图谱。
图2为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒的质粒图谱。
图3为本发明实施例提供的靶向性抗肿瘤T细胞(图3中(b))与阴性对照组(图3中(a))的CAR-CEA/CAR-MUC1的阳性率比较。
图4为本发明实施例提供的靶向性抗肿瘤T细胞的体外肿瘤细胞杀伤效果图。
图5为本发明实施例提供的靶向性抗肿瘤T细胞治疗肿瘤小鼠的效果图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例一一种靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备靶向CEA的嵌合抗原受体CAR-CEA的基因
分别制备信号肽、靶向CEA的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述CAR-CEA中，信号肽的编码基因如SEQ ID NO：22所示，靶向CEA的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：3所示，CD8α铰链区的编码基因如SEQ ID NO：10所示，所述CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO：12所示，所述4-1BB信号区的编码基因如SEQ IDNO：14所示，所述CD3ζ信号区的编码基因如SEQ ID NO：16所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向CEA的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接，得到CAR-CEA的编码基因，序列如SEQ ID NO：19所示。
(2)制备靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1的基因
分别制备信号肽、靶向MUC1的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因；其中，靶向MUC1的单链抗体的编码基因如SEQ ID NO：4所示，其他区段的编码基因如上所述。通过PCR的方法将上述信号肽、靶向MUC1的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到CAR-MUC1的编码基因，该CAR-MUC1的编码基因如SEQ ID NO：20所示。
(3)构建pWPXLd-CAR-CEA重组质粒和pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒
将CAR-CEA的编码基因插入到pWPXLd载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，并在pWPXLd载体EF1α之后，以EF1α为启动子(当所述CAR-CEA的编码基因插入到pWPXLd载体时，所述CAR-CEA的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLd载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLd载体中EcoRⅠ酶切位点相连)。然后将其转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建如图1所示的pWPXLd-CAR-CEA重组质粒，并将该重组质粒放置于-80℃下保存。
按与上述类似的方法，将CAR-MUC1的编码基因构建成如图2所示的pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒，并将该重组质粒放置于-80℃下保存。
(4)重组慢病毒构建
将pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并在一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清采用荧光法测定滴度，将病毒按照100μL、2×108TU/mL分装，保存于-80℃的超低温冰箱，得到带CAR-CEA的第一重组慢病毒。
按与上述类似的方法，将pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞，得到带CAR-MUC1的第二重组慢病毒。
(5)靶向性抗肿瘤T细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的X-VIVO15基础培养基(Lonza公司，货号：04-744Q)，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠(CD3/CD28CTSTM磁珠，赛默飞世尔公司，货号：40203D)，室温孵育1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)病毒转染法制备靶向性抗肿瘤T淋巴细胞
取上述经过免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，同时加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的带CAR-CEA的第一重组慢病毒和带CAR-MUC1的第二重组慢病毒进行共同培养，其中第一重组慢病毒与第二重组慢病毒的用量(滴度)之比是1：1。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向性抗肿瘤T细胞，然后将其保存在回输专用的细胞冻存液中。
实施例二一种靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，包括：
按照实施例一中的方法制备得到带CAR-CEA的第一重组慢病毒和带CAR-MUC1的第二重组慢病毒，将带CAR-CEA的第一重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，按照实施例一中相同的培养条件和时间进行培养，收集得到靶向CEA的嵌合抗原受体T细胞。再将带CAR-MUC1的第二重组慢病毒转染所述靶向CEA的嵌合抗原受体T细胞，培养到第9-11天，收集细胞，得到所述靶向性抗肿瘤T细胞，然后将其保存在回输专用的细胞冻存液中。
实施例三
一种靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，其与实施例二的区别在于：先用带CAR-MUC1的第二重组慢病毒进行转染，然后用带CAR-CEA的第一重组慢病毒进行转染。
效果实施例
效果实施例一：评估本发明所制备的靶向性抗肿瘤T细胞的阳性率
将经本发明实施例一制备的靶向性抗肿瘤T细胞(实验组)与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)，使用流式细胞仪检测CAR-CEA、CAR-MUC1的阳性率，结果如图3所示，其中图3中(a)为阴性对照组，图3中(b)为实验组。由图3中(a)与(b)比较可得到，经本发明实施例一的方法制备的T细胞中，表达CAR-CEA的单阳性率为8.4％，表达CAR-MUC1的单阳性率为3.17％，表达CAR-CEA和CAR-MUC1的双阳性率为6.35％；而阴性对照组几乎均为0％。
效果实施例二：评估本发明靶向性抗肿瘤T细胞的体外肿瘤细胞杀伤情况
取本发明实施例一制得的靶向性抗肿瘤T细胞(实验组，这里具体选用带CAR-CEA和CAR-MUC1的双靶点嵌合抗原受体T细胞)与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)、具有单独的CAR-CEA的T细胞(CEA CAR-T单独组)以及具有单独的CAR-MUC1的T细胞(MUC1CAR-T单独组)，在体外将上述四组效应细胞与靶细胞(HepG2细胞)按数量比为1:10、1:3、1:1、3:1和10:1的比例，在37℃、5％CO2下进行共培养，在培养后的第15-18小时，收集细胞，进行流式染色，检测细胞杀伤情况，结果如图4所示。从图4中可看出，本发明提供的靶向性抗肿瘤T细胞具有超强的肿瘤杀伤能力。
效果实施例三，评估本发明靶向性抗肿瘤T细胞对小鼠体内肿瘤细胞杀伤情况
取上述四组T细胞，在小鼠肝癌模型中，给每只小鼠尾静脉注射1×106个每组T细胞(n＝9)，得到小鼠的生存曲线。从图5的结果可以看出，本发明提供的靶向性抗肿瘤T细胞在注入小鼠体内50天后，仍能使小鼠的存活率稳定在高达65％，远远超过阴性对照组和以上两个单独组。这表明提供的靶向性抗肿瘤T细胞能够更好地保护小鼠免于因肝癌导致的死亡。
序列表
<110> 深圳市第三人民医院
<120> 一种靶向性抗肿瘤T细胞及其制备方法和应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
1 5 10 15
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Thr Ser Ser Ser
20 25 30
Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser
85 90 95
Tyr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro
130 135 140
Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Ile Ser
145 150 155 160
Ser Gly Tyr Ser Trp His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Gln Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro
180 185 190
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
195 200 205
Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Tyr His Trp Tyr Phe Asp Val Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Thr Val
245 250
<210> 2
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu
130 135 140
Val Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Thr Phe Thr Asp His Ala Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Glu Gln
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Thr Asp Ile Lys
180 185 190
Tyr Asn Asp Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser
195 200 205
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
210 215 220
Ala Val Tyr Phe Cys Lys Thr Ser Thr Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
245
<210> 3
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtgtccact ccgacatcca gatgacccag agcccaagca gcctgagcgc cagcgtgggt 60
gacagagtga ccatcacctg tagtaccagc tcgagtgtaa gttacatgca ctggtaccag 120
cagaagccag gtaaggctcc aaagctgctg atctacagca catccaacct ggcttctggt 180
gtgccaagca gattcagcgg tagcggtagc ggtaccgact tcaccttcac catcagcagc 240
ctccagccag aggacatcgc cacctactac tgccatcagt ggagtagtta tcccacgttc 300
ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgt ggaggcggag gatctggcgg cggaggaagt 360
ggcggagggg gatctggggg aggcggaagc caggtccaac tgcaggagag cggtccaggt 420
cttgtgagac ctagccagac cctgagcctg acctgcaccg tgtctggctt caccatcagc 480
agtggttata gctggcactg ggtgagacag ccacctggac gaggtcttga gtggattgga 540
tacatacagt acagtggtat cactaactac aacccctctc tcaaaagtag agtgacaatg 600
ctggtagaca ccagcaagaa ccagttcagc ctgagactca gcagcgtgac agccgccgac 660
accgcggtct attattgtgc aagagaagac tatgattacc actggtactt cgatgtctgg 720
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<210> 4
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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atcagctccg tgcaggccga ggacctggcc gtgtattact gccagaacga ctacagctac 300
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ggaggaagtg gcggaggggg atctggggga ggcggaagcc aggtgcagct gcagcagtct 420
gatgccgagc tcgtgaagcc tggcagcagc gtgaagatca gctgcaaggc cagcggctac 480
accttcaccg accacgccat ccactgggtc aagcagaagc ctgagcaggg cctggaatgg 540
atcggccact tcagccccgg caacaccgac atcaagtaca acgacaagtt caagggcaag 600
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cagggcacaa ccctgacagt gtctagc 747
<210> 5
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
1 5 10 15
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Thr Ser Ser Ser
20 25 30
Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser
85 90 95
Tyr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro
130 135 140
Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Ile Ser
145 150 155 160
Ser Gly Tyr Ser Trp His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Gln Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro
180 185 190
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
195 200 205
Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Tyr His Trp Tyr Phe Asp Val Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
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Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
275 280 285
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
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Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
305 310 315 320
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
325 330 335
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
340 345 350
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
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Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
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Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
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Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
405 410 415
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
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Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
435 440 445
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
450 455 460
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 6
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
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Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu
130 135 140
Val Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Thr Phe Thr Asp His Ala Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Glu Gln
165 170 175
Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Thr Asp Ile Lys
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Tyr Asn Asp Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser
195 200 205
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
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Ala Val Tyr Phe Cys Lys Thr Ser Thr Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
245 250 255
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
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275 280 285
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385 390 395 400
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
405 410 415
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
420 425 430
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
435 440 445
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
450 455 460
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 7
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
20 25 30
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser
35 40 45
Thr Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His
100 105 110
Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
145 150 155 160
Leu Val Arg Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
165 170 175
Phe Thr Ile Ser Ser Gly Tyr Ser Trp His Trp Val Arg Gln Pro Pro
180 185 190
Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Gln Tyr Ser Gly Ile Thr
195 200 205
Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr
210 215 220
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
225 230 235 240
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Tyr His Trp Tyr
245 250 255
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Thr Val Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 8
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr
20 25 30
Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser
145 150 155 160
Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys
165 170 175
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Ala Ile His Trp Val Lys Gln
180 185 190
Lys Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Phe Ser Pro Gly Asn
195 200 205
Thr Asp Ile Lys Tyr Asn Asp Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr
210 215 220
Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr
225 230 235 240
Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Lys Thr Ser Thr Phe Phe Phe
245 250 255
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325 330 335
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
340 345 350
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
355 360 365
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435 440 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450 455 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465 470 475 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 9
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 10
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 11
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 12
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 13
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 14
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 17
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggtgtccact ccgacatcca gatgacccag agcccaagca gcctgagcgc cagcgtgggt 60
gacagagtga ccatcacctg tagtaccagc tcgagtgtaa gttacatgca ctggtaccag 120
cagaagccag gtaaggctcc aaagctgctg atctacagca catccaacct ggcttctggt 180
gtgccaagca gattcagcgg tagcggtagc ggtaccgact tcaccttcac catcagcagc 240
ctccagccag aggacatcgc cacctactac tgccatcagt ggagtagtta tcccacgttc 300
ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgt ggaggcggag gatctggcgg cggaggaagt 360
ggcggagggg gatctggggg aggcggaagc caggtccaac tgcaggagag cggtccaggt 420
cttgtgagac ctagccagac cctgagcctg acctgcaccg tgtctggctt caccatcagc 480
agtggttata gctggcactg ggtgagacag ccacctggac gaggtcttga gtggattgga 540
tacatacagt acagtggtat cactaactac aacccctctc tcaaaagtag agtgacaatg 600
ctggtagaca ccagcaagaa ccagttcagc ctgagactca gcagcgtgac agccgccgac 660
accgcggtct attattgtgc aagagaagac tatgattacc actggtactt cgatgtctgg 720
ggtcaaggca gcctcgtcac agtcacagtc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 780
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 840
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 900
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa 960
cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 1020
actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 1080
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag 1140
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1200
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1260
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1320
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1380
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1419
<210> 18
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gaactcgtga tgacccagag ccccagctct ctgacagtga cagccggcga gaaagtgacc 60
atgatctgca agtcctccca gagcctgctg aactccggcg accagaagaa ctacctgacc 120
tggtatcagc agaaacccgg ccagcccccc aagctgctga tcttttgggc cagcacccgg 180
gaaagcggcg tgcccgatag attcacaggc agcggctccg gcaccgactt taccctgacc 240
atcagctccg tgcaggccga ggacctggcc gtgtattact gccagaacga ctacagctac 300
cccctgacct tcggagccgg caccaagctg gaactgaagg gaggcggagg atctggcggc 360
ggaggaagtg gcggaggggg atctggggga ggcggaagcc aggtgcagct gcagcagtct 420
gatgccgagc tcgtgaagcc tggcagcagc gtgaagatca gctgcaaggc cagcggctac 480
accttcaccg accacgccat ccactgggtc aagcagaagc ctgagcaggg cctggaatgg 540
atcggccact tcagccccgg caacaccgac atcaagtaca acgacaagtt caagggcaag 600
gccaccctga ccgtggacag aagcagcagc accgcctaca tgcagctgaa cagcctgacc 660
agcgaggaca gcgccgtgta cttctgcaag accagcacct tctttttcga ctactggggc 720
cagggcacaa ccctgacagt gtctagcacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 780
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 840
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 900
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 960
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 1020
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 1080
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 1140
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1200
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1260
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1320
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1380
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 1416
<210> 19
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60
ggtgtccact ccgacatcca gatgacccag agcccaagca gcctgagcgc cagcgtgggt 120
gacagagtga ccatcacctg tagtaccagc tcgagtgtaa gttacatgca ctggtaccag 180
cagaagccag gtaaggctcc aaagctgctg atctacagca catccaacct ggcttctggt 240
gtgccaagca gattcagcgg tagcggtagc ggtaccgact tcaccttcac catcagcagc 300
ctccagccag aggacatcgc cacctactac tgccatcagt ggagtagtta tcccacgttc 360
ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgt ggaggcggag gatctggcgg cggaggaagt 420
ggcggagggg gatctggggg aggcggaagc caggtccaac tgcaggagag cggtccaggt 480
cttgtgagac ctagccagac cctgagcctg acctgcaccg tgtctggctt caccatcagc 540
agtggttata gctggcactg ggtgagacag ccacctggac gaggtcttga gtggattgga 600
tacatacagt acagtggtat cactaactac aacccctctc tcaaaagtag agtgacaatg 660
ctggtagaca ccagcaagaa ccagttcagc ctgagactca gcagcgtgac agccgccgac 720
accgcggtct attattgtgc aagagaagac tatgattacc actggtactt cgatgtctgg 780
ggtcaaggca gcctcgtcac agtcacagtc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 840
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 900
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 960
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa 1020
cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 1080
actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 1140
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag 1200
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1260
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1320
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1380
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1440
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1479
<210> 20
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60
gaactcgtga tgacccagag ccccagctct ctgacagtga cagccggcga gaaagtgacc 120
atgatctgca agtcctccca gagcctgctg aactccggcg accagaagaa ctacctgacc 180
tggtatcagc agaaacccgg ccagcccccc aagctgctga tcttttgggc cagcacccgg 240
gaaagcggcg tgcccgatag attcacaggc agcggctccg gcaccgactt taccctgacc 300
atcagctccg tgcaggccga ggacctggcc gtgtattact gccagaacga ctacagctac 360
cccctgacct tcggagccgg caccaagctg gaactgaagg gaggcggagg atctggcggc 420
ggaggaagtg gcggaggggg atctggggga ggcggaagcc aggtgcagct gcagcagtct 480
gatgccgagc tcgtgaagcc tggcagcagc gtgaagatca gctgcaaggc cagcggctac 540
accttcaccg accacgccat ccactgggtc aagcagaagc ctgagcaggg cctggaatgg 600
atcggccact tcagccccgg caacaccgac atcaagtaca acgacaagtt caagggcaag 660
gccaccctga ccgtggacag aagcagcagc accgcctaca tgcagctgaa cagcctgacc 720
agcgaggaca gcgccgtgta cttctgcaag accagcacct tctttttcga ctactggggc 780
cagggcacaa ccctgacagt gtctagcacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 840
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 900
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 960
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 1020
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 1080
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 1140
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 1200
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1260
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1320
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1380
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1440
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 1476
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro
20
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60

Claims (9)

1.一种靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述靶向性抗肿瘤T细胞为带靶向CEA的嵌合抗原受体CAR-CEA和带靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1的双靶点嵌合抗原受体T细胞；其中，所述CAR-CEA包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向CEA的单链抗体、CD8α胞外铰链区、CD8跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，所述CAR-MUC1包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向MUC1的单链抗体、CD8α胞外铰链区、CD8跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；其中，胞内信号区为顺次连接的4-1BB信号区和CD3ζ信号区；
其中，所述靶向CEA的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向MUC1的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述靶向CEA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述靶向MUC1的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述CAR-CEA的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述CAR-MUC1的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
4.一种重组病毒载体，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的靶向性抗肿瘤T细胞中所述CA R-CEA和CAR-MUC1的编码基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求4所述的重组病毒载体。
6.一种靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)分别提供靶向CEA的嵌合抗原受体CAR-CEA的编码基因和靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR-MUC1的编码基因；
所述CAR-CEA的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向CEA的单链抗体的编码基因、CD8α胞外铰链区的编码基因、CD8跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述CAR-MUC1的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接信号肽的编码基因、靶向MUC1的单链抗体的编码基因、CD8α胞外铰链区的编码基因、CD8跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述胞内信号区为顺次连接的4-1BB信号区和CD3ζ信号区；
其中，所述靶向CEA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列，所述靶向MUC1的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-CEA的编码基因和所述CAR-MUC1的编码基因分别插入到pWPXLd载体中，得到pWPXLd-CAR-CEA重组质粒和pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒；
(3)分别对所述pWPXLd-CAR-CEA重组质粒和所述pWPXLd-CAR-MUC1重组质粒进行包装，得到带CAR-CEA编码基因的第一重组慢病毒以及带CAR-MUC1编码基因的第二重组慢病毒；
(4)将所述第一重组慢病毒与所述第二重组慢病毒分开或同时地联合转染CD3阳性T淋巴细胞，经分离获得靶向性抗肿瘤T细胞；其中，所述靶向性抗肿瘤T细胞为带所述CAR-CEA和所述CAR-MUC1的双靶点嵌合抗原受体T细胞。
7.如权利要求6所述的靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，其特征在于，所述CAR-CEA的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，所述CAR-MUC1的编码基因包括如SEQ IDNO：8所示的核苷酸序列。
8.如权利要求6所述的靶向性抗肿瘤T细胞的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述第一重组慢病毒与第一重组慢病毒的病毒滴度之比是1：(0.5-2)。
9.如权利要求4所述的重组病毒载体、如权利要求5所述的宿主细胞、如权利要求1-3任一项所述的靶向性抗肿瘤T细胞或如权利要求6-8任一项所述的制备方法制得的靶向性抗肿瘤T细胞在制备诊断和/或治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
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