CN111363046A

CN111363046A - 靶向nkg2d的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111363046A
Application number: CN202010168618.4A
Authority: CN
Inventors: 刘茂玄; 许晨光; 黎琴子
Original assignee: Shenzhen Bindebio Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Bindebio Technology Co ltd
Priority date: 2020-03-11
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2020-07-03
Also published as: WO2021179353A1

Abstract

本发明提供了一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体，其氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向NKG2D的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种包括靶向NKG2D的的嵌合抗原受体的CAR‑T细胞及其制备，以及它们在制备预防、诊断、治疗肝癌、宫颈癌和胰腺癌等恶性肿瘤中的应用。

Description

靶向NKG2D的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)技术是一种新型免疫细胞疗法，它是将经过CAR改造的T细胞回输至人体，激活人体自身免疫系统，持续性对靶向肿瘤细胞进行杀伤，被认为是目前最有效的恶性肿瘤的治疗方式之一。

NKG2D是一种凝集素样的II型跨膜糖蛋白，其在NK细胞、CD8+T细胞、活化的巨噬细胞和肿瘤浸润的γδT细胞表面均有表达，且NKG2D配体的表达是细胞处于“应激状态”的一个指标，例如当细胞受到病毒感染和恶性转化时，但很少会出现在健康细胞的表面。而NKG2D配体几乎在人体所有组织来源的肿瘤细胞上有不同程度的表达，例如肝癌、卵巢癌、胰腺癌等。

尽管NKG2D配体为肿瘤的免疫治疗提供了一个更为精确的靶点，但目前靶向NKG2D的CAR-T细胞的研究较少，且在实际应用中不能长效持久地发挥高杀伤肿瘤细胞的能力。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备、包含靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因的重组载体，以及它们在预防、诊断和治疗具有NKG2D配体的恶性肿瘤中的应用。

具体地，第一方面，本发明提供了一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体CAR-NKG2D，所述CAR-NKG2D的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向NKG2D的的单链抗体包括如SEQID NO：1所示的氨基酸序列。

所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向NKG2D的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。

其中，所述靶向NKG2D的单链抗体为人源化单链抗体，可以避免引起人机体的免疫反应，具有较高的安全性。可选地，所述靶向NKG2D的单链抗体的编码基因包括如SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列。

本发明中，所述胞外铰链区用于促进所述靶向NKG2D的单链抗体与肿瘤上的表达的FGFR4结合。可选地，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。

本发明中，所述跨膜区用于固定所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体CAR-NKG2D。可选地，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。

本发明中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。可选地，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。

在本发明一实施方式中，所述胞外铰链区为CD8α铰链区；所述跨膜区为CD8跨膜区；所述胞内信号区包括从氨基端到羧基端顺次连接的4-1BB信号区和CD3ζ信号区。即，所述CAR-NKG2D的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的氨基酸序列。

可选地，所述CAR-NKG2D的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步可选地，所述CAR-NKG2D的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

进一步地，所述CAR-NKG2D的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向NKG2D的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因。其中，所述靶向NKG2D的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列。

可选地，所述CAR-NKG2D的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。与SEQID NO：3所示的核苷酸序列相比，SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列中多了信号肽的编码基因。

其中，所述信号肽的编码基因可较好地指导所述CAR-NKG2D表达到细胞表面，但在嵌合抗原受体CAR-NKG2D表达到T细胞表面时，信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。因此，在翻译成的CAR-NKG2D的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)中并未带有信号肽的氨基酸序列。

可选地，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。可选地，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

本发明第一方面提供的所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体CAR-NKG2D可以专一性地靶向表达NKG2D配体的肿瘤细胞，在CAR-NKG2D与NKG2D配体结合后，可以使T细胞的胞内信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，并高效且特异性地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞几乎不会造成损伤，且能够持久地维持其自我更新能力和肿瘤杀伤力。

第二方面，本发明提供了一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞，包括第一方面所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体。

本发明第二方面提供的靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞可以专一性地靶向表达NKG2D的肿瘤细胞，在CAR-FGFR4与FGFR4结合后，该CAR-T细胞的胞内信号区被激活，促进其在患者体内的扩增，长效持久地发挥高效且特异性杀伤肿瘤细胞的能力，而对正常细胞几乎不会造成损伤。

第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包括如第一方面所述的靶向FGFR4的嵌合抗原受体CAR-NKG2D的编码基因。

可选地，所述重组载体中的所述载体为病毒载体和非病毒载体中的至少一种。

其中，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。优选为慢病毒载体，例如pWPXLD载体、pLEX-MCS载体、pSico载体和pCgpV载体中的至少一个，但不限于此。

其中，所述非病毒载体包括质粒载体和噬菌体载体。具体地，所述质粒载体可以但不限于为真核质粒载体、原核质粒载体、微环DNA、转座子等。当所述载体为微环DNA时，可以将插入靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因的重组微环DNA直接转染CD3阳性T淋巴细胞，制得靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞。

本发明第三方面提供的重组载体安全高效，可以稳定高效地将CAR-NKG2D的编码基因导入宿主细胞中或复制，并可以用于制备靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞，使所述T细胞持续、稳定地发挥靶向、杀伤效力。

第四方面，本发明提供了一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：

(1)提供靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向NKG2D的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向NKG2D的单链抗体的编码基因包括如SEQID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；

(2)将所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因插入到基因传递载体中，得到重组基因传递载体；

(3)将所述重组基因传递载体进行包装并转染宿主细胞，得到重组慢病毒；

(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞。

可选地，将所述重组基因传递载体进行包装并转染宿主细胞，得到重组慢病毒，包括：将所述重组基因传递载体与包膜质粒和包装质粒共同转染宿主细胞，得到所述重组慢病毒。所述重组慢病毒的包装可采用三质粒系统或四质粒系统，包膜质粒、包装质粒为本领域常用的物质。

可选地，所述宿主细胞可以包括HEK293T细胞、293细胞、293T细胞、293FT细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞或COS7细胞等，但不限于此。

在本发明一实施方式中，所述基因传递载体可以为上述质粒载体，例如为pWPXLd质粒。此时，所得重组基因传递载体(可称为“重组质粒载体”)中，CAR-NKG2D的编码基因位于pWPXLD载体的BamHⅠ酶切位点和EcoRⅠ酶切位点之间。

在本发明一实施方式中，所述包膜质粒为PMD2G，所述包装质粒为psPAX2，所述宿主细胞为HEK293T细胞。

可选地，步骤(4)中，所述CD3阳性T淋巴细胞是从人源外周血单个核细胞中分离获得。

其中，所述人源外周血单个核细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。进一步可选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

第五方面，本发明提供了如第一方面所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体、如第二方面所述的或如第四方面所述的制备方法制得的靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组载体在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

在本发明一实施方式中，所述应用的具体形式可以为：提供了一种试剂盒。

其中，所述恶性肿瘤为高表达NKG2D配体的肿瘤，如肝癌、宫颈癌和胰腺癌等。

在应用中，给药方式可以但不限于为静脉注射、肿瘤原位注射、皮下注射等。具体应用时选择的剂量、次数等根据实际需要进行选择，对此不做限定。

第六方面，本发明提供了一种药物组合物，用于预防、诊断和治疗恶性肿瘤，所述药物组合物包括如第一方面所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体、如第二方面所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞或如第四方面所述的制备方法制得的靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞、如第三方面所述的重组载体中的至少一种。

其中，第二方面提供的所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞为优选组成。

可选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

其中，所述药学上可接受的载体包括水、生理盐水及其他非水性溶剂、白蛋白、血红蛋白、磷脂等。

其中，所述辅料包括稀释剂、赋形剂和稳定剂中的一种或多种。

可选地，所述药物组合物包括汤剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服剂和颗粒剂中的一种或多种。所述药物的形式取决于在实际中的应用。

可选地，所述药物组合物通过口服或注射的方式施用。进一步的，所述注射通过腹膜内注射、皮下注射、肌肉注射或静脉注射的方式施用。

可选地，所述药物组合物还包括其他具有或治疗恶性肿瘤的活性成分。例如，化疗剂。

本发明第六方面提供的所述药物组合物中，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体及T细胞能够自我复制繁殖，半衰期长，并形成记忆细胞，起到持续的靶向作用。可以特异性地结合肿瘤细胞，并对肿瘤细胞产生持久的强杀伤效果，且对正常细胞不会造成损伤。

附图说明

图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-NKG2D重组质粒的质粒图谱。

图2为本发明实施例提供的带CAR-NKG2D编码基因的重组慢病毒感染T细胞后表达嵌合抗原受体CAR-NKG2D的流式检测结果图；其中，使用anti-CD3-FITC标记T细胞，用anti-NKG2D-APC抗体标记CAR-NKG2D，图中UTD代表未经病毒感染的T细胞，CAR-T代表表达CAR-NKG2D的CAR-T细胞。

图3为本发明实施例提供的靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)和未经病毒感染的T淋巴细胞(UTD)的体外杀伤Huh7肝癌细胞的效果图。

图4为本发明实施例提供的靶向NKG2D的CAR-T细胞和未经病毒感染的T淋巴细胞(UTD)的体外杀伤Panc-1胰腺癌细胞的效果图。

图5为本发明实施例提供的靶向NKG2D的CAR-T细胞和未经病毒感染的T淋巴细胞(UTD)的体外杀伤Hela宫颈癌细胞的效果图。

图6为本发明实施例提供的靶向NKG2D的CAR-T细胞的体内治疗荷瘤小鼠(接种了宫颈癌细胞的小鼠)的效果图；其中，左图为CAR-T细胞注射荷瘤鼠40天后取出的肿瘤的图片，右图为对各处理组小鼠的瘤重数据。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

实施例1

靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞的制备，具体包括以下步骤：

(1)制备靶向NKG2D的嵌合抗原受体CAR-NKG2D的基因序列

分别制备信号肽、靶向NKG2D的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，通过PCR的方法将上述信号肽、靶向NKG2D的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到CAR-NKG2D的编码基因，该CAR-NKG2D的编码基因如SEQ ID NO：4所示。其中，所述信号肽的编码基因序列如SEQ ID NO：7所示，靶向NKG2D的单链抗体的编码基因序列如SEQ ID NO：2所示。

(2)构建pWPXLd-CAR-NKG2D重组质粒

将上述CAR-NKG2D的编码基因插入到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的延伸因子1α(EF1α)之后，以EF1α为启动子。所述CAR-NKG2D的编码基因插入到pWPXLD载体时，在所述CAR-NKG2D的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建如图1所示的pWPXLd-CAR-NKG2D重组质粒。

将所获得的表达质粒与包膜质粒和包装质粒(psPAX2，pMD2.G)通过脂质体转染试剂Lipofectamine3000共转染HEK293T包装细胞中，48小时后离心收获重组慢病毒。然后将所述重组慢病毒感染经CD3/CD28磁珠刺激的CD3阳性T淋巴细胞，获得NKG2D CAR-T细胞。

(3)重组慢病毒构建

将上述获得的pWPXLd-CAR-NKG2D重组质粒与包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者通过脂质体转染试剂Lipofectamine3000共转染培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，于-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并后一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×10⁸个/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到带CAR-NKG2D编码基因的重组慢病毒。

(4)靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞的制备

a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离

PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。

b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞

取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。

c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞

取b)中经免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的步骤3)中的所述重组慢病毒进行培养。

培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×10⁶个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，同时经过流式细胞仪检测靶向NKG2D的嵌合抗原受体CAR-NKG2D的表达，结果如图2所示。经检测，经上述重组慢病毒感染的T细胞中，CAR-NKG2D的阳性率约为70％。这表明成功制得得到靶向NKG2D的CAR-T细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中，以供患者回输用。

效果实施例

为了评估本发明所描述的上述方法制备的靶向NKG2D的CAR-T细胞在杀伤肿瘤细胞方面的效果，进行如下效果实施例。

体外评价：

采用实时细胞分析仪(xCElligence RTCASP)进行肿瘤细胞杀伤实验。首先在该仪器配套的E-Plate 96孔板中加入5000个肿瘤靶细胞(Huh7肝癌细胞、Panc-1胰腺癌细胞、Hela宫颈癌细胞)的完全培养基进行培养，培养24小时后，按照不同效靶比(E:T)分别加入相应数量的两组效应细胞(即，NKG2D CAR-T细胞和只经磁珠刺激、未加病毒感染的T细胞(简写为UTD细胞，即，实施例1步骤(4b)中的CD3阳性T淋巴细胞)，随后共培养一段时间(≥24小时)。使用实时细胞分析仪的细胞指数(cell index)值对细胞杀伤效果进行分析。

图3-图5分别为本发明实施例提供的靶向NKG2D的CAR-T细胞体外杀伤Huh7肝癌细胞、Panc-1胰腺癌细胞、Hela宫颈癌细胞的效果图。从图3-图5可以看出，本发明提供的靶向NKG2D的CAR-T细胞对体外肝癌细胞、胰腺癌细胞、宫颈癌细胞均具有非常强的杀伤能力，且杀伤能力远远高于阴性对照组和空白对照组，这表明本发明提供的靶向NKG2D的CAR-T细胞在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中具有非常可观的应用前景。

体内评价：

向每只小鼠尾静脉注射1×10⁶个肿瘤细胞(具体为Hela宫颈癌细胞)，得到荷瘤小鼠模型。然后向荷瘤小鼠体内分别注射本发明提供的靶向NKG2D的CAR-T细胞、只经磁珠刺激、未加病毒感染的T淋巴细胞(简写为UTD组)及以及生理盐水(空白对照组)，注射40天后，取出各处理组的小鼠内的肿瘤进行观察，并进行瘤重统计，结果如图6所示。其中，UTD组和NKG2D CAR-T高剂量组的T细胞个数均为3.5×10⁶个，NKG2D CAR-T低剂量组的T细胞个数为0.85×10⁶个。

从图6可以看出，NKG2D CAR-T高剂量组与空白对照组和UTD组相比，具有显著性的差异(P<0.01)，显示出较强的抑瘤效果。图6的结果表明，本方法制备的靶向NKG2D的CAR-T细胞能够更好地保护小鼠免于因肿瘤导致的死亡。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳宾德生物技术有限公司

<120> 靶向NKG2D的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln

1 5 10 15

Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile

20 25 30

Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp

35 40 45

Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys

50 55 60

Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr

65 70 75 80

His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp

85 90 95

Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met

100 105 110

Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile

115 120 125

Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val

130 135 140

<210> 2

<211> 367

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln

1 5 10 15

Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile

20 25 30

Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp

35 40 45

Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys

50 55 60

Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr

65 70 75 80

His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp

85 90 95

Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met

100 105 110

Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile

115 120 125

Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val

130 135 140

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

145 150 155 160

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

165 170 175

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

180 185 190

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

195 200 205

Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

210 215 220

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

225 230 235 240

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

245 250 255

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln

260 265 270

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

275 280 285

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

290 295 300

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

305 310 315 320

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

325 330 335

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

340 345 350

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

355 360 365

<210> 3

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atatggagtg ctgtattcct aaactcatta ttcaaccaag aagttcaaat tcccttgacc 60

gaaagttact gtggcccatg tcctaaaaac tggatatgtt acaaaaataa ctgctaccaa 120

ttttttgatg agagtaaaaa ctggtatgag agccaggctt cttgtatgtc tcaaaatgcc 180

agccttctga aagtatacag caaagaggac caggatttac ttaaactggt gaagtcatat 240

cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt ggcagtggga agatggctcc 300

attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga agggagactg tgcactctat 360

gcctcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc caaatacgta catctgcatg 420

caaaggactg tgaccactac cccagcaccg aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc 480

tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat 540

acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc tggtacttgc 600

ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg 660

ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc 720

tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc 780

cgcagcgcag atgctccagc ctacaagcag gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat 840

cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg 900

ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat 960

aagatggcag aagcctatag cgagattggt atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc 1020

cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc gccaccaagg acacctatga cgctcttcac 1080

atgcaggccc tgccgcctcg g 1101

<210> 4

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 60

atatggagtg ctgtattcct aaactcatta ttcaaccaag aagttcaaat tcccttgacc 120

gaaagttact gtggcccatg tcctaaaaac tggatatgtt acaaaaataa ctgctaccaa 180

ttttttgatg agagtaaaaa ctggtatgag agccaggctt cttgtatgtc tcaaaatgcc 240

agccttctga aagtatacag caaagaggac caggatttac ttaaactggt gaagtcatat 300

cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt ggcagtggga agatggctcc 360

attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga agggagactg tgcactctat 420

gcctcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc caaatacgta catctgcatg 480

caaaggactg tgaccactac cccagcaccg aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc 540

tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat 600

acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc tggtacttgc 660

ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg 720

ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc 780

tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc 840

cgcagcgcag atgctccagc ctacaagcag gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat 900

cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg 960

ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat 1020

aagatggcag aagcctatag cgagattggt atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc 1080

cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc gccaccaagg acacctatga cgctcttcac 1140

atgcaggccc tgccgcctcg g 1161

<210> 5

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atatggagtg ctgtattcct aaactcatta ttcaaccaag aagttcaaat tcccttgacc 60

gaaagttact gtggcccatg tcctaaaaac tggatatgtt acaaaaataa ctgctaccaa 120

ttttttgatg agagtaaaaa ctggtatgag agccaggctt cttgtatgtc tcaaaatgcc 180

agccttctga aagtatacag caaagaggac caggatttac ttaaactggt gaagtcatat 240

cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt ggcagtggga agatggctcc 300

attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga agggagactg tgcactctat 360

gcctcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc caaatacgta catctgcatg 420

caaaggactg tg 432

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His

1 5 10 15

Ala Ala Arg Pro

20

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 60

Claims

1.一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向NKG2D的的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

4.一种靶向NKG2D嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，其表面表达如权利要求1-3任一项所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体。

5.一种重组载体，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的靶向NK G2D的嵌合抗原受体的编码基因。

6.一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：

(1)提供靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向NKG2D的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因，其中，所述靶向NKG2D的单链抗体的编码基因包括如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列；

7.如权利要求1-3任一项所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体、如权利要求4所述的或如权利要求6所述的制备方法制得的靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞、如权利要求5所述的重组载体在制备预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤为高表达NKG2D配体的肿瘤，包括肝癌、宫颈癌和胰腺癌。

9.一种预防、诊断和治疗恶性肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1-3任一项所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体、如权利要求4所述的或如权利要求6所述的制备方法制得的靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞、如权利要求5所述的重组载体。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。