CN110724199A - Nkg2d car-t细胞及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种融合蛋白，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原NKG2D配体，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活T细胞。本发明提供的融合蛋白和能够表达该融合蛋白的NKG2D CAR‑T细胞，其以NKG2D配体为靶抗原，利用NKG2D CAR‑T细胞特异性地杀伤肿瘤细胞。其可作为肿瘤类疾病的治疗药物，用于NKG2D分子的配体高表达的肿瘤的治疗，为肿瘤的预防和治疗提供了新的方法。

Description

NKG2D CAR-T细胞及其制备和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及NKG2D CAR-T细胞及其制备和应用。
背景技术
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，缩写CAR)修饰的免疫细胞使用遗传工程手段修饰免疫细胞使其表达外源性针对肿瘤的基因。CAR基因主要包括细胞外识别域和细胞内信号转导结构域：前者用于识别肿瘤表面特异性分子和后者用于启动识别肿瘤表面分子后的免疫细胞应答，发挥细胞毒作用。
T细胞是淋巴细胞的一种，在细胞介导的免疫性中起重要作用。其与其他淋巴细胞(诸如B细胞及自然杀手细胞(NK细胞))的区别在于细胞表面上存在T细胞受体(TCR)。T辅助细胞，亦称为CD4+T或CD4T细胞，在其表面上表达CD4糖蛋白。辅助T细胞在暴露于由MHC(主要组织相容复合体)II 类分子呈递之肽抗原时活化。一旦活化，此类细胞快速增殖且分泌可调节免疫反应的细胞因子。细胞毒性T细胞，亦称为CD8+T细胞或CD8T细胞，在细胞表面上表达CD8糖蛋白。CD8+T细胞在暴露于由MHC I类分子呈递的肽抗原时活化。记忆T细胞是一T细胞亚群，长期存在且响应于相关抗原，因此向免疫系统提供针对过去感染及/或肿瘤细胞的记忆。
经基因改造后，T细胞可在其表面产生嵌合抗原受体。CAR为允许T 细胞识别肿瘤细胞上的特定蛋白(抗原)的蛋白。经基因工程改造的CAR T细胞能实验室中生长直至其数目达到数十亿。然后可将扩增的CART细胞输注至患者中。
自然杀伤(natural killer，缩写NK)细胞是非特异性免疫系统的重要组成部分，先天免疫系统反应的关键性介质细胞。NK细胞是一种广谱免疫细胞，具有快速发现和摧毁异常细胞(如癌症或病毒感染的细胞)的特异功能，而且不需要提前致敏或HLA配型，即可展示强大的溶解异常细胞的活性。使用免疫细胞(包括NK细胞)来治疗癌症是近年来新趋势，这种新疗法有望为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治愈希望。
NKG2D是NK细胞的活化型受体，可识别MHC-I类分子，在天然免疫中发挥着重要的作用。NKG2D参与病毒感染细胞的识别及NK对肿瘤细胞的杀伤。NKG2D属于C型凝集素样受体家族，由于这个基因编码的受体存在于NKG2(natural killer group 2)复合体中。NKG2基因复合体位于人的12 号染色体上。NKG2D是II型跨膜蛋白，NKG2D需要通过跨膜区域的带电残基结合一些转接蛋白(adaptor proteins)完成信号转导。人NKG2D都能结合 10kDa的DNAX活化蛋白(DAP10)。DAP10在胞浆内含有YXXM基序 (Tyr-X-X-Meth)能够招募磷脂酰肌醇三羟基激酶(PI3K)和生长因子受体结合蛋白-2。所有的NK细胞、大多数NKT细胞、巨噬细胞都表达NKG2D。另外，NKG2D也存在于CD8+T细胞表面。在正常条件下，人和小鼠CD4+T 细胞不表达NKG2D。但是，在患者体内，表达NKG2D的CD4+T细胞比例有明显上升。NKG2D可与许多不同的配体结合，这些配体属于主要组织相容性复合体I类(MHC-I)相关蛋白。人的NKG2D配体的另一家族是MIC-A 和MIC-B。MIC-A和MIC-B都具有多态性。目前，MIC-A有61个等位基因，MIC-B有30个等位基因。NKG2D分子的配体在正常细胞中不表达或者表达量非常少，但是当细胞受到感染或者发生癌变时，这些配体的表达量会大幅度上升。
Celyad公司利用NKG2D对MICA、MICB的识别作用，将NKG2D受体与CD3ζ融合，构建了NKG2D CAR(NKR-2)。当NKR-2转染的NK细胞或者CD8+T细胞，接触到肿瘤细胞上的NKG2D配体，就会被激活，进而杀死肿瘤细胞。2017年10月Celyad宣布在接受NKR-2治疗的复发难治性 AML患者中，出现第一个CR(完全缓解)。NKR-2CART的技术优势包括：1) NKG2D来源于人体，形成的NKG2D CAR-T免疫原性非常低，延长了NKR-2 的药效周期；2)NKG2D受体可以识别在大多数血液瘤和实体瘤细胞表面表达的8种不同的配体(MICA，MICB和ULBP1-6)，使NKR-2在肿瘤治疗中的广谱性；3)Celyad的临床I期试验结果表明NKR-2在AML和MM患者的治疗过程中安全性和耐受性表现良好，说明尽管NKG2D的配体种类广泛，但无明显脱靶效应。
尽管NKR-2效果良好，但其也存在一些不足：1)NKG2D主要在NK细胞上表达，但在肿瘤病人的血液中NK细胞数目少，扩增困难，生产制备 NKG2D CAR-NK难度大；2)NKG2D在CD8+T上表达水平低，病毒转染可以促进其在CD8+T上的表达，但无论是NKG2D的表达，还是在与配体结合后对T细胞的激活，都依赖细胞内DAP10的浓度，一定程度上会影响 NKR-2CAR-T的药效；3)CD4+T的细胞数目约占T细胞总数的50％，但由于NKG2D和DAP10在CD4+T上都不表达，NKR-2不适用于CD4+T细胞。
发明内容
针对这些问题，本发明对NKR-2进行了优化和改进。改进型NKG2D CAR-T(NKG92)仅保留了NKG2D受体的胞外92-216区域(配体结合区)，并通过其C216末端与跨膜结构域和共刺激信号传导区连接形成融合蛋白。示例性地，本发明通过将CD8a的hinge-transmembrane(TM)区域、4-1BB 共刺激区域、CD3zeta的信号区域连接形成融合蛋白。数据显示，NKG92转染能够在CD4+T细胞(NKG2D阴性)和CD4+T细胞(NKG2D低表达) 中都显著增加细胞膜表面NKG2D 92-216的表达；NKG92转染的T细胞，能够显著的杀死多种肿瘤细胞，包括血液瘤和实体瘤。有鉴于此，本发明提供了一种融合蛋白及能够表达该融合蛋白的NKG2D CAR-T细胞及其制备和应用，该细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤，具有更高效的肿瘤杀伤活性。
本发明一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原NKG2D配体，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活T 细胞。
示例性地，所述NKG2D配体选自主要组织相容性复合体I类(MHC-I) 分子、MIC-A和MIC-B中的一种或多种。
任选地，本发明所述的NKG2D受体的胞外92-216区域为SEQ ID NO： 3(优选地，其编码序列为SEQ ID NO：4)，且任选地所述胞外92-216区域被替换为该配体结合区的同源性序列。
示例性地，所述的跨膜结构域选自：CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154 中的一种或多种的跨膜结构域；优选地，所述的跨膜结构域为CD8跨膜结构域；和/或，
所述的共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述的共刺激分子选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、 CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB 和OX40中的一种或多种；优选地，所述的共刺激信号传导区包含4-1BB和 CD3ζ胞内结构域。
示例性地，所述融合蛋白的结构为NKG2D(92-216)-CD8α hinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ，该融合蛋白能够特异性识别NKG2D配体。
在本发明的一个具体实施方式中，所述NKG2D(92-216)-CD8α hinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示或其同源序列等。
示例性地，所述同源序列与原序列的同源性约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、 82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。
本发明另一方面提供一种表达上述融合蛋白的核苷酸序列。
示例性地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示或其简并序列等。
示例性地，所述简并序列与原序列的同源性约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、 82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。
本发明另一方面提供一种NKG2D CAR-T细胞，所述NKG2D CAR-T 细胞能够表达上述融合蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中，所述融合蛋白和/或所述NKG2D CAR-T细胞能够有效地杀伤和/或杀死肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、乳腺癌细胞和肺癌细胞等。
优选地，本发明的CART细胞为CD4+T细胞或包含CD4+T细胞和 CD8+T细胞的细胞混合物。
本发明另一方面还提供了上述NKG2D CAR-T细胞的制备方法，其包括如下步骤：
(1)合成和扩增NKG2D-CD8αhinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因，将所述NKG2D-CD8αhinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因克隆到慢病毒表达载体上；
(2)利用慢病毒包装质粒和步骤(1)得到的慢病毒表达载体质粒感染 293T细胞，包装和制备慢病毒；和
(3)利用步骤(2)得到的慢病毒感染NK-92细胞，得到CAR-T细胞。
本发明还提供上述融合蛋白和/或NKG2D CAR-T细胞在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。
示例性地，融合蛋白和/或NKG2D CAR-T细胞在制备治疗高表达 NKG2D配体的肿瘤及相关疾病的药物中的应用。
示例性地，所述癌症为血癌、淋巴癌、乳腺癌、宫颈、结肠癌或肺癌等。
本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述NKG2D CAR-T细胞，以及任选地，药学上可接受的辅料。
本发明提供的一种融合蛋白和能够表达该融合蛋白的NKG2D CAR-T 细胞。该融合蛋白能够特异性结合肿瘤特异性抗原NKG2D配体，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活该T细胞。该NKG2D CAR-T细胞是通过将NKG2D受体用于CAR-T细胞所构建。融合蛋白和能够表达该融合蛋白的NKG2D CAR-T细胞以NKG2D配体为靶抗原，能够特异性地杀伤肿瘤细胞，其可作为肿瘤类疾病的治疗药物，用于NKG2D配体高表达的肿瘤的治疗，为肿瘤的预防和治疗提供了新的方法。
附图说明
图1所示为本发明实施例提供的NKG92-CART结构中CAR的结构示意图，其中A为包含通过CD8a铰链-跨膜(TM)域和4-1BB共刺激结构域与CD3ζ信号传导区融合的NKG2D 92-216的NKG92-CAR构建体结构示意图；B为NKG2D 92-216同型二聚体的结构；C为通过CD8a铰链结构域中的保守半胱氨酸在转导的T细胞表面上形成的NKG92同型二聚体。
图2A-2B所示为本发明实施例提供的NKG2D CAR-NK流式检测CAR 细胞阳性率的结果图，其中，图2A为对照组；图2B为实验组。
图3A-3B为在用NKG2D-CAR编码的慢病毒载体转导T细胞后5天的细胞表面NKG2D表达的FACS分析，其中A为绘图，B为直方图。
图4为本发明实施例提供的NKG2D CAR-T细胞杀伤不同肿瘤细胞的实验结果图，其中(从左至右)分别为针对髓性白血病细胞K562、淋巴瘤raji、乳腺癌细胞MDA-MB-231、肺癌细胞A549、乳腺癌BT474细胞和宫颈癌 Hela的实验结果。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
具体而言，本发明所述的编码NKG2D-CD8αhinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸的序列是任何能够编码该融合蛋白的任何DNA序列，优选地，该序列为SEQ ID NO：2或其互补序列。另一方面，本发明所述的编码 NKG2D-CD8αhinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸的序列可为在严紧条件下与由SEQ ID NO：2的核苷酸序列进行杂交、且编码该融合蛋白的多核苷酸或其互补序列；
本文所述的“严紧条件”，可以为低严紧条件、中严紧条件、高严紧条件中的任一种，优选为高严紧条件。示例性地，“低严紧条件”可为30℃、5×SSC、 5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“中严紧条件”可为40℃、5×SSC、 5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“高严紧条件”可为50℃、5×SSC、 5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件。本领域技术人员应当理解温度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本领域技术人员可以选择影响杂交的严紧度的温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素形成的综合结果来实现相应的严紧度。
除此之外可杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件用系统设定的默认参数进行计算时，与编码序列号6的多核苷酸具有约 60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、 99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸。
核苷酸序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的算法规则BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873，1993)来确定。基于BLAST算法规则的程序BLASTN、BLASTX已被开发(A1tschul SF，et al：JMol Biol 215：403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，如使参数为score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列时，如使参数为score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的系统可设定默认参数值。
除非另有规定，“编码核苷酸”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质的核苷酸序列可包括内含子。
术语“慢病毒”指的是逆转录病毒科的属，其能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞；它们可传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，以便它们是基因传递载体的最有效的方法之一。
术语“启动子”被定义为开始多核苷酸序列的特异性转录需要的，由细胞的合成机器识别或引导合成机器的DNA序列。
术语“特异性结合”指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样本中的其他分子。
术语“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等等。
术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其他部分。各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌结肠直肠癌、肝癌、肺癌等等。
如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。
本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。
本文中出现的英文名称不区分大小写；NKG2D CAR-T、nkg2D-car T代表的含义相同，表示表达NKG2D分子的CAR-T细胞；CD8TM表示跨膜结构域。
为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。
实施例1慢病毒载体的制备
基因合成NKG2D-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合基因序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因序列如SEQ ID NO：2所示，其结构示意图见图1A、图1B和图1C)，通过酶切，将NKG2D-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合基因序列转化连接到PWPXLD-kana载体中，基因上游为EF-1α启动子。将所述载体转化至大肠杆菌菌株Stbl3，卡那霉素筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，获得目的基因转染载体，即含CAR 基因片段的PWPXLD质粒载体。将慢病毒包装辅助质粒psPax2和 PMD2.0G分别转化DH5a，氨苄青霉素筛选，并提取质粒。
实施例2慢病毒的制备
接种3x 105个/ml的293T细胞10ml于新的10cm培养皿中，24h后配制如下溶液：
CaCl2：2.5M；
2×BBS：50mM BES，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4；
质粒体系：含CAR基因片段的PWPXLD质粒载体：9μg；psPax2：9 μg；和PMD2.0G：4.5μg。
将质粒体系中的质粒加入到0.45mL的无菌ddH2O中，加入50μL CaCl2溶液；逐滴加入500μL 2×BBS并保持溶液涡旋混合；室温放置 15-30分钟。
将混合后的液体加入至培养基中，轻柔混匀培养基，使转染体系均匀分布，18h后更换2％FBS DMEM培养基。48小时后收取培养上清，将上清1000xg离心10min后除去细胞碎片，用0.45μm滤器过滤。过滤后的病毒液加入病毒液三分之一体积的TAKR慢病毒浓缩试剂concentrator，颠倒混匀后4℃静置过夜。过夜后的病毒液4℃1500g 45min离心，弃上清，PBS重悬分装，-80℃保存。
实施例3 NKG2D CAR-T细胞的制备
1.预先准备与外周血等体积Ficol I-Paque Plus置于离心管内，室温静置；
2.【Day 0】外周血采集；
3.即时将采集后的外周血沿管壁小心加入该离心管。20℃，840g离心20 分钟；升降速设置为最慢一档；
4.吸取血浆成分置于新的无菌试管，56℃灭活30分钟；
5.PBMC用生理盐水洗涤两次，20℃，500g离心7分钟；
6.灭活血浆离心，4000rpm，20℃，6min，转移，4℃保存；
7. 4ml生理盐水重悬PBMC计数，4℃，400g离心7分钟；
8.配置分选缓冲液：40mM EDTA(1ml)，PBS(38ml)，20％BSA(1ml)；置于 4℃预冷；
9.弃上清，40μL/107个细胞加缓冲液，10μL/107个细胞加Antibody Cocktail，混匀4℃，孵育5min；
10. 30μL/107个细胞加缓冲液和20μL/107个细胞加Microbead Cocktail，混匀4℃孵育10min；
11.T细胞培养基配制：培养基(MACS)；细胞因子(IL-2(200U/ml))；血浆(5％灭活)；
12.架LS柱于磁力分选器，加缓冲液3mL；
13.PBMC过LS柱，3mL缓冲液洗，收集未结合余液；
14. 300g，7min，离心；
15.弃上清，培养基重悬，计数，计算回收率；
16. 1×106个/ml加入12孔板中；
17.加入T细胞刺激因子(去除缓冲液的dynabeads磁珠)，细胞：磁珠＝1： 2；
18. 37℃，5％CO2条件下培养；血样和细胞培养液细菌培养检测；
19.预铺12孔板，加入生理盐水稀释的fibronectin溶液，至终浓度为5 μg/cm2，4℃过夜；
20.【Day 1】慢病毒感染T淋巴细胞；
21.配制封闭液：20％BSA+生理盐水＝2％BSA；
22.弃孔板中fibronectin溶液，用封闭液封闭30分钟；
23.生理盐水清洗板子1次；
24.配制病毒液：750μl/4.5cm2，铺板；
25. 37℃，静置4-6小时；
26.取T细胞，1x106/mL加入孔板中；37℃，5％CO2培养；
27.【Day 3】记录T细胞状态，调节T细胞浓度至5×105/ml，全部更换新鲜培养基；
28.【Day 5】记录T细胞状态，调节T细胞浓度至5×105/ml，用FACS分析检测CAR-T细胞CAR表达情况(见图3A和图3B)；
29.LDH体外细胞毒性实验铺板；
30.细胞培养液细菌，真菌，内毒素，支原体检测实验；
31.【Day 6】记录T细胞状态，调节T细胞浓度至5×105/ml；
32.LDH体外细胞毒性实验结果检测及数据分析；
33.【Day 8】记录T细胞状态，调节T细胞浓度至5×105/ml，用FACS分析检测CAR-T细胞表面的CD4+T和CD8+T细胞数，见图2，其中图2A 和2B分别是慢病毒感染前(day 0)和感染后(day 8)的CD4+T和CD8+ T的细胞数。
实施例4 NKG2D CAR-T细胞对体外肿瘤杀伤效果的评估
LDH实验方法
以下提到的“培养基”成分均为MACS+200U/mL细胞因子白介素-2， LDH＝乳酸脱氢酶，专用反应试剂均来自Promega生产的GytoTox96试剂盒。
1：各取4mL靶细胞和生长至Day 5以后的CAR T细胞，分别加入到5mL 流式管中，离心300g，3min，20℃；
2：弃去上清，4mL培养基重悬细胞，离心300g，3min，20℃；重复一次
3：弃去上清，4mL培养基重悬细胞，计数，用培养基调节靶细胞浓度到2 ×105/mL，调节CAR T细胞到4×105/mL；
4：设置200微升培养基为空白组，100微升CAR T细胞+100微升培养基为自发组A，取靶细胞100微升+100微升培养基为自发组B，100微升CAR T细胞+100微升靶细胞为实验组；另设置200微升培养基为体积校正组，靶细胞100微升+100微升培养基为最大释放组；每组3个平行数据点；分别置于96孔U型板中，37℃，5％CO2孵育24小时；
5：检测最大释放：向最大释放组和体积校正组中每孔分别加入20微升LDH 最大释放试剂，37℃，5％CO2，孵育45min；
6：LDH检测试剂配制：取LDH缓冲液，37℃充分溶解后取12ml加入到LDH 检测试剂瓶中，避光充分混匀；
7：取出96孔U型板，混匀各孔，500g，3min离心；
8：取ELISA检测96孔板，避光加入LDH检测试剂50微升/孔；
9：取离心好的96孔U型板中50微升/孔加入相对应的ELISA检测96孔板中；(不要吸到细胞)(避光)；
10：将ELISA检测96孔板放入酶标仪中，摇晃混匀30min；
11：避光向ELISA检测96孔板中加入LDH反应终止试剂50微升/孔；
12：将ELISA检测96孔板放入酶标仪中，摇晃10s后检测波长492nm，排除620nm以上，读数记录；
13：计算杀伤率：杀伤率＝(实验组-自发组A-自发组B+空白组)/(最大释放值-体积校正值-自发组B+空白组)
14：作图分析，如附图4所示。
从图4可以明显看出，本发明的CART可以对髓性白血病、乳腺癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌具有显著的疗效或抑制作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 成都盛世君联生物技术有限公司
成都盛世锐科生物技术有限公司
<120> NKG2D CAR-T细胞及其制备和应用
<130> LJH002
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N92 CAR 氨基酸序列
<400> 1
Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys
1 5 10 15
Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser
20 25 30
Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser
35 40 45
Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met
50 55 60
Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly
65 70 75 80
Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly
85 90 95
Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys
100 105 110
Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Glu Phe Thr
115 120 125
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
130 135 140
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
145 150 155 160
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
165 170 175
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
180 185 190
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
195 200 205
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
210 215 220
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
225 230 235 240
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
245 250 255
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
260 265 270
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
275 280 285
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
290 295 300
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
305 310 315 320
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
325 330 335
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
340 345 350
<210> 2
<211> 1050
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N92 CAR DNA序列
<400> 2
accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa aactggatat gttacaaaaa taactgctac 60
caattttttg atgagagtaa aaactggtat gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat 120
gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca 180
tatcattgga tgggactagt acacattcca acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc 240
tccattctct cacccaacct actaacaata attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc 300
tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa aactgttcaa ctccaaatac atacatctgc 360
atgcaaagga ctgtggaatt caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 420
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 480
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccctggcc 540
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 600
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 660
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 720
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 780
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 840
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 900
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 960
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1020
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1050
<210> 3
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N92 (NKG2D 92-216) 氨基酸序列
<400> 3
Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys
1 5 10 15
Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser
20 25 30
Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser
35 40 45
Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met
50 55 60
Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly
65 70 75 80
Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly
85 90 95
Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys
100 105 110
Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val
115 120 125
<210> 4
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> N92 (NKG2D 92-216) DNA序列
<400> 4
accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa aactggatat gttacaaaaa taactgctac 60
caattttttg atgagagtaa aaactggtat gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat 120
gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca 180
tatcattgga tgggactagt acacattcca acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc 240
tccattctct cacccaacct actaacaata attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc 300
tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa aactgttcaa ctccaaatac atacatctgc 360
atgcaaagga ctgtg 375

Claims (14)

1.融合蛋白，其特征在于，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原NKG2D配体，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活T细胞，其中所述的抗原结合结构域包含或为NKG2D(92-216)或其同源序列。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述NKG2D配体选自主要组织相容性复合体I类(MHC-I)分子、MIC-A和MIC-B。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述的跨膜结构域选自：CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种的跨膜结构域；优选地，所述的跨膜结构域为CD8跨膜结构域；和/或，
所述的共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述的共刺激分子选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的一种或多种；优选地，所述的共刺激信号传导区包含4-1BB和CD3ζ胞内结构域；和/或，
NKG2D(92-216)的氨基酸的序列包含或为SEQ ID NO：3所示的序列或其同源序列。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，其结构为NKG2D-CD8αhinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ，其中所述的NKG2D能够特异性结合肿瘤特异性的NKG2D配体，优选地，所述NKG2D配体为主要组织相容性复合体I类(MHC-I)分子、MIC-A和MIC-B中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，所述NKG2D-CD8TMαhinge-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸的序列包含或为SEQ ID NO：1所示的序列或其同源序列。
6.编码权利要求1-5中任一项所述融合蛋白的核苷酸序列。
7.如权利要求6所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示或其简并序列。
8.分离的NKG2D CAR-T细胞，其特征在于，所述NKG2D CAR-T细胞能够表达特异性结合肿瘤特异性抗原NKG2D配体的NKG2D(92-216)或其同源序列(优选地，所述NKG2D(92-216)的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示；更优选地，其编码序列包含或由SEQ ID NO：4所示的序列组成)，或表达权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，或表达权利要求6或7中所述核苷酸序列所编码的融合蛋白，优选地，所述NKG2D CAR-T细胞为为CD4+T细胞或包含CD4+T细胞和CD8+T细胞的细胞混合物，其中所述细胞混合物中CD4+T细胞与CD8+T细胞的比例为1∶2-2∶1，优选为1∶1.5-1.5∶1，更优选为1∶1。
9.权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，和/或权利要6或7所述核苷酸序列所编码的融合蛋白，和/或权利要求8所述的NKG2D CAR-T细胞，其能够有效地杀伤和/或杀死肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、淋巴癌细胞和/或肺癌细胞。
10.权利要求8所述NKG2D CAR-T细胞的制备方法，其包括如下步骤：
(1)合成和扩增编码权利要求4或5或7中任一项所述的NKG2D-CD8αhinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸，并将所述核苷酸克隆到慢病毒表达载体上；
(2)利用慢病毒包装质粒和步骤(1)得到的慢病毒表达载体质粒感染细胞，包装和制备慢病毒；和
(3)利用步骤(2)得到的慢病毒感染T-92细胞，得到CAR-T细胞。
11.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，和/或权利要求6-7中所述的核苷酸序列所编码的融合蛋白，和/或权利要求8所述的NKG2D CAR-T细胞，和/或权利要求10所制备的NKG2D CAR-T细胞。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其还包括药学可接受的辅料。
13.权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，和/或权利要求6-7中所述的核苷酸序列所编码的融合蛋白，和/或权利要求8所述的NKG2D CAR-T细胞，和/或权利要求10所制备的NKG2D CAR-T细胞在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途；优选的，所述的癌症为高表达NKG2D的配体的肿瘤及相关疾病。
14.根据权利要求13所述的用途，所述癌症为肺癌、乳腺癌、血癌、淋巴癌、宫颈癌、或结肠癌。
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