CN107759701A - 嵌合抗原受体、其修饰的NK细胞、编码DNA、mRNA、表达载体、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了嵌合抗原受体、其修饰的NK细胞、编码DNA、mRNA、表达载体、制备方法和应用。所述嵌合抗原受体包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域，其特征在于，所述抗原结合结构域来自NKG2D的配体结合区，所述胞内结构域来自DAP12的胞内信号区。用本发明的嵌合抗原受体修饰的工程化NKG2D配体靶向性的NK细胞为治疗NKG2D配体阳性肿瘤患者提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。

Description

嵌合抗原受体、其修饰的NK细胞、编码DNA、mRNA、表达载体、制 备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及嵌合抗原受体、其修饰的NK细胞、编码DNA、mRNA、表达载体、制备方法和应用。
背景技术
近几年随着对免疫机制的了解，导致了继手术治疗、化疗、放射性治疗之后又一治疗癌症的新技术的产生，即免疫治疗。癌症的免疫治疗被《Science》杂志评为2013年世界年度科技突破。嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是经人工改造的受体，因此可将任意的特异性受体嫁接到免疫效应细胞上。通常，这些受体的用于识别抗原的胞外特异性部分来自抗体的序列。由于这种受体的不同部分有不同的来源，因此被称为嵌合受体。CAR修饰的免疫细胞即表达嵌合性抗原受体(CAR)的免疫细胞，是现在最有效，最有希望的肿瘤细胞免疫治疗产品。
自然杀伤细胞(NK)是机体重要的免疫细胞，在外周血单个核细胞组成中占10％左右，是人体抗肿瘤、抗病毒感染的第一道防线。NK细胞与T细胞不同，不会产生自分泌生长因子如IL-2，而且相比T细胞，在遇到特异性抗原时不会增值过快，寿命较短，不需要装备自杀基因，也能限制CAR毒性。除此以外，NK细胞对肿瘤的杀伤不依赖于MHC呈递的特异性抗原，因此，在异体NK细胞的免疫治疗应用上，不会产生免疫排斥作用，是一种比T细胞更为安全的免疫治疗候选细胞。理论上，CAR可以避开NK细胞内抑制性信号通路，同时NK细胞自身可表达激活型受体，还能利用抗体介导的细胞毒作用(ADCC)，因此，CAR表达的NK细胞在肿瘤治疗上更优于T细胞，有着更为广阔的应用前景。
CAR包括胞外部分、跨膜区和胞内部分。对于携带CAR的免疫细胞而言，CAR的胞外部分和胞内部分的选择、及其与免疫细胞种类的配合极为重要，这与对肿瘤的特异性杀伤能力密切相关。目前在肿瘤的免疫治疗中，仍然需要开发出可供选择的新型且效果良好的CAR-免疫细胞药物。
发明内容
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了嵌合抗原受体、其修饰的NK细胞、编码DNA、mRNA、表达载体、制备方法和应用。
具体而言，本发明提供了：
(1)一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域，其特征在于，所述抗原结合结构域来自NKG2D的配体结合区，所述胞内结构域来自DAP12的胞内信号区。
(2)根据(1)所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域的氨基酸序列与NKG2D的第X位-第216位氨基酸序列一致，且73≤X≤83。
(3)根据(1)或(2)所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
(4)根据(1)所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域的氨基酸序列选自DAP12的第62-113位氨基酸；优选地，所述胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
(5)根据(1)所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔区来自CD8α的铰链区，所述跨膜区来自CD8α的跨膜区。
(6)根据(1)或(5)所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔区和跨膜区构成间隔跨膜区，并且其中所述间隔跨膜区的氨基酸序列与CD8α的第Y位-第210位氨基酸序列一致，且118≤Y≤128。
(7)根据(6)所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔跨膜区的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。
(8)根据(1)所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
(9)一种分离的、编码嵌合抗原受体的DNA，该DNA包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域编码元件、间隔区编码元件、跨膜区编码元件和胞内结构域编码元件，其特征在于，所述抗原结合结构域编码元件来自NKG2D的配体结合区编码DNA，所述胞内结构域编码元件来自DAP12的胞内信号区编码DNA。
(10)根据(9)所述的DNA，其中所述抗原结合结构域编码元件的核苷酸序列编码所述抗原结合结构域的氨基酸序列，所述抗原结合结构域的氨基酸序列与NKG2D的第X位-第216位氨基酸序列一致，且73≤X≤83。
(11)根据(9)或(10)所述的DNA，其中所述抗原结合结构域编码元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
(12)根据(9)所述的DNA，其中所述胞内结构域编码元件编码所述胞内结构域的氨基酸序列，所述胞内结构域的氨基酸序列选自DAP12的第62-113位氨基酸；优选地，所述胞内结构域编码元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
(13)根据(9)所述的DNA，其中所述间隔区编码元件来自CD8α的铰链区编码DNA，所述跨膜区编码元件来自CD8α的跨膜区编码DNA。
(14)根据(9)或(13)所述的DNA，其中所述间隔区编码元件和所述跨膜区编码元件构成间隔跨膜区编码元件，所述间隔跨膜区编码元件的核苷酸序列编码所述间隔跨膜区的氨基酸序列，所述间隔跨膜区的氨基酸序列与CD8α的第Y位-第210位氨基酸序列一致，且118≤Y≤128。
(15)根据(14)所述的DNA，其中所述间隔跨膜区编码元件的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示。
(16)根据(9)所述的DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
(17)一种分离的、由根据(9)-(16)中任一项所述的DNA转录的mRNA。
(18)一种重组表达载体，其含有与启动子有效连接的根据(9)-(16)中任一项所述的DNA。
(19)根据(18)所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体在根据(9)-(16)中任一项所述的DNA之前依次包含CMV启动子、T7启动子、具有kozak序列的5’UTR和GM-CSFα链信号肽编码序列；并且在根据(9)-(16)中任一项所述的DNA之后包含具有PolyA信号的α球蛋白的3’UTR。
(20)一种嵌合抗原受体修饰的NK细胞，该NK细胞的表面被(1)-(8)中任一项所述的嵌合抗原受体修饰。
(21)一种制备根据(20)所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞的方法，包括以下步骤：
1)提供NK细胞；
2)提供编码根据(1)-(8)中任一项所述的嵌合抗原受体的核酸；
3)将所述核酸转染入所述NK细胞中。
(22)根据(21)所述的方法，其中步骤1)所述的NK细胞由外周血单个核细胞制备。
(23)根据(21)所述的方法，其中所述转染通过冷冻电穿孔技术或慢病毒载体进行。
(24)根据(21)所述的方法，其中步骤2)所述的核酸为根据(9)-(16)中任一项所述的DNA、或根据(17)所述的mRNA。
(25)根据(20)所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
(26)根据(25)所述的用途，其中所述肿瘤和/或癌症是NKG2D配体阳性的。
(27)根据(20)所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞在制备用于检测宿主的肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
(28)一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据(20)所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞，及可药用辅料。
(29)根据(28)所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含每人每个疗程总剂量范围为1×106-1×1011个的所述嵌合抗原受体修饰的NK细胞。
(30)根据(28)所述的药物组合物，其中所述药物组合物的给药方式包括静脉给药或局部给药。
(31)一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括对肿瘤和/或癌症患者施用根据(20)所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞。
(32)根据(31)所述的方法，其中所述嵌合抗原受体修饰的NK细胞的施用剂量为每人每个疗程总剂量范围为1×106-1×1011个细胞。
(33)根据(31)所述的方法，其中所述嵌合抗原受体修饰的NK细胞的给药方式包括静脉给药或局部给药。
(34)根据(31)所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症是NKG2D配体阳性的。
(35)一种工具载体，该工具载体依次包含可操作地连接的CMV启动子、T7启动子、具有kozak序列的5’UTR、GM-CSFα链信号肽编码序列、和具有PolyA信号的α球蛋白的3’UTR。
(36)根据(35)所述的工具载体，其中所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述具有kozak序列的5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述GM-CSFα链信号肽编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，所述具有PolyA信号的α球蛋白的3’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
本发明的嵌合抗原受体能够使被其修饰的NK细胞(也称为“工程化NKG2D配体靶向性NK细胞”)对多种NKG2D配体表达阳性的肿瘤具有强烈且特异的靶向杀伤活性，本发明的临床前研究已充分证明该修饰的NK细胞可以明显减小甚至消除动物体内的肿瘤负荷，延长动物的存活时间。
用本发明的工程化NKG2D配体靶向性NK细胞治疗肿瘤时，可有效避免采用CAR-T治疗时所引起的细胞因子风暴和免疫排斥反应。
本发明的工程化NKG2D配体靶向性的NK细胞为治疗NKG2D配体阳性肿瘤患者提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。
附图说明
图1为示出本发明一个实施方案的嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12的构建示意图，其中“CMV”表示CMV启动子序列，“T7”表示T7启动子序列，“5’UTR”表示具有Kozak序列的5’UTR，“SP”表示GM-CSFα链信号肽编码序列，“NKG2D”表示NKG2D的配体结合区的编码序列，“CD8”表示CD8α的铰链区和跨膜区编码序列，“DAP12”表示DAP12的胞内信号区编码序列，“α球蛋白3’UTR”表示具有PolyA信号的α球蛋白的3’UTR，“pA150”表示polyA(多聚腺苷酸)，其中包含150个A。
图2为示出本发明一个实施方案的表达载体pFastbac1-CD8-DAP12经限制性内切酶SphI和SalI双酶切的鉴定片段的电泳图；其中泳道1为DNA分子量标记，泳道2为鉴定片段。
图3为示出本发明一个实施方案的表达载体pFastbac1-NKG2D-CD8-DAP12经限制性内切酶SphI和NheI双酶切的鉴定片段的电泳图；其中泳道1为DNA分子量标记，泳道2为鉴定片段。
图4为示出本发明一个实施方案的嵌合型抗原受体的重组DNA载体pFastbac1-NKG2D-CD8-DAP12的结构示意图；其中，顺时针序列为正向基因片段，逆时针为反向基因片段。其中“CMV”表示CMV启动子序列，“T7”表示T7启动子序列，“5’UTR”表示具有Kozak序列的5’UTR，“GM-CSFα”表示GM-CSFα链信号肽编码序列，“NKG2D”表示NKG2D的配体结合区的编码序列，“CD8”表示CD8α的铰链区和跨膜区编码序列，“DAP12”表示DAP12的胞内信号区编码序列，“α球蛋白3’UTR”表示具有PolyA信号的α球蛋白的3’UTR。
图5示出流式细胞术对NK细胞表型的分析结果。图5A示出从外周血单个核细胞扩增17天时NK细胞的纯度。横坐标表示CD3表达强度，纵坐标表示CD56表达强度；图5B示出从外周血单个核细胞扩增17天时NK细胞内源NKG2D和CD16的表达强度，横坐标表示NKG2D表达强度，纵坐标表示CD16表达强度。
图6示出体外合成的嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12线性化DNA模板的电泳图；其中泳道1为DNA分子量标记，泳道2为线性化DNA模板。
图7示出体外合成的嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12的mRNA的电泳图；其中泳道1为分子量标记，泳道2为NKG2D-CD8-DAP12的mRNA。
图8示出流式细胞术对嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12mRNA电转NK细胞效率的检测结果。图8A示出NK细胞内源表达NKG2D的强度(其中左侧峰为阴性对照曲线，右侧峰为NK细胞NKG2D表达强度曲线)；图8B示出电转染后NK细胞表达NKG2D的强度(其中左侧峰为阴性对照曲线，右侧峰为NK细胞电转NKG2D-CD8-DAP12mRNA之后NKG2D的表达强度曲线)；图8C示出NK细胞内源表达和电转染后表达NKG2D的强度的比较(即，将图8A和8B合并在一起)(其中左侧峰为阴性对照曲线，中间峰为NK细胞NKG2D表达强度曲线，右侧峰为NK细胞电转NKG2D-CD8-DAP12mRNA之后NKG2D的表达强度曲线)。图中横坐标表示NKG2D表达强度，纵坐标表示相对细胞数。横坐标中“NKG2D荧光强度”表示用带荧光的NKG2D抗体检测时，流式细胞仪所显示的荧光读数。
图9示出本发明实施例的嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12修饰的NK(NKG2D-CAR-NK)细胞与人肿瘤细胞混合培养后，释放IFN-γ的Elispot分析结果。图中“mGFP-CAR-NK”表示mGFP-CAR修饰的NK细胞组(对照组)，“NKG2D-CAR-NK”表示嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12(即NKG2D-CAR)修饰的NK细胞组。图中横坐标表示肿瘤细胞组别，纵坐标表示相对IFN-γ数量(以每2.5×104个NK细胞中的斑点数表示)。
图10A-G分别示出本发明实施例的NKG2D-CAR-NK对肿瘤细胞HCT116(A)、SKOV3(B)、Fadu(C)、Detroit(D)、HepG2(E)、MCF7(F)、KG1(G)的杀伤活力检测结果；其中纵坐标表示肿瘤细胞被杀伤后裂解的比例；横坐标表示效应细胞和肿瘤细胞的比例；实线即“NKG2D-CAR-NK”示出嵌合抗原受体NKG2D-CAR修饰的NK细胞组的结果；虚线即“mGFP-CAR-NK”示出嵌合抗原受体mGFP-CAR修饰的NK细胞组(对照组)的结果。
图11示出过继回输NKG2D-CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用；虚线示出嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12修饰NK细胞组的结果(图中示为“NKG2D-CAR-NK(6次注射)”)；实线示出未进行NK细胞回输组的结果(图中示为“PBS对照组”)。图中横坐标表示接种肿瘤后的天数，纵坐标表示活体成像仪记录的动物体内肿瘤细胞荧光强度，其中纵坐标中所示辐射率(单位为“p/秒/cm2/sr”，即，photons/sec/cm2/steradian)指单位时间、单位面积、单位弧度从动物体表发出的光子数。
图12A-C分别示出嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12修饰的NK细胞和嵌合抗原受体NKG2D-CD8-CD3Z修饰的NK细胞分别对肿瘤细胞SKOV3(A)、Detroit(B)、HCT116(C)的杀伤活力的检测结果比较。图中“mGFP-CAR-NK”表示mGFP-CAR修饰的NK细胞组，“NKG2D-DAP12-CAR-NK”表示NKG2D-DAP12-CAR修饰的NK细胞组，“NKG2D-CD3Z-CAR-NK”表示NKG2D-CD3Z-CAR修饰的NK细胞组。图中横坐标表示效应细胞和肿瘤细胞的比例，纵坐标表示肿瘤细胞被杀伤后裂解的比例。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
在本发明中，词语“肿瘤”、“癌症”、“肿瘤细胞”、“癌细胞”涵盖本领域通常认为的含义。
CAR包括胞外部分、跨膜区和胞内部分。胞外部分又包括用于识别和结合抗原的抗原结合结构域、以及用于间隔抗原结合结构域和跨膜区的间隔区；胞内部分主要包括用于信号传递的胞内结构域。对于携带CAR的免疫细胞而言，CAR的功能性部分的选择、及其与免疫细胞种类的配合极为重要，这与对肿瘤的特异性杀伤能力密切相关。本发明的发明人通过理论研究和实验摸索，针对NK细胞选择了特定的抗原结合结构域和胞内结构域的组合，并将由此开发的CAR成功地应用于了NK细胞，使该NK细胞发挥了强烈的靶向杀瘤活性，由此开发出在肿瘤免疫治疗中可供选择的新型且效果良好的工程化NKG2D配体靶向性的NK细胞。
本发明所述术语“抗原结合结构域”、“间隔区”、“跨膜区”、“胞内结构域”的定义可参考“《免疫学导论》，于善谦，高等教育出版社，2008”；以及“《Immunobiology》，第七版，Kenneth Murphy,Paul Travers,Mark Walport等”。
具体而言，本发明提供了一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域，其特征在于，所述抗原结合结构域来自NKG2D的配体结合区，所述胞内结构域来自DAP12的胞内信号区。
NKG2D是调节NK细胞杀伤活性的重要受体，NKG2D的配体主要表达于肿瘤细胞和应激细胞表面，很少表达甚至不表达于正常细胞表面，大量的肿瘤细胞如结直肠癌细胞、卵巢癌细胞、头颈癌细胞、淋巴癌细胞、神经胶质瘤细胞等都有大量NKG2D的配体的表达。
本发明进一步发现，所述抗原结合结构域的氨基酸序列优选与NKG2D的第X位-第216位氨基酸序列一致，且73≤X≤83，X为整数。其中，NKG2D的氨基酸序列可为NCBI(即，美国国立生物技术信息中心，网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov)的Genbank中编号为NP_031386.2的氨基酸序列。也就是说，所述抗原结合结构域的氨基酸序列优选选自NKG2D的第73-216位氨基酸、并且包含第83-216位氨基酸。例如，所述抗原结合结构域的氨基酸序列如以下氨基酸序列组中任一氨基酸序列所示：NKG2D的第73-216位氨基酸、第74-216位氨基酸、第75-216位氨基酸、第76-216位氨基酸、第77-216位氨基酸、第78-216位氨基酸、第79-216位氨基酸、第80-216位氨基酸、第81-216位氨基酸、第82-216位氨基酸、或第83-216位氨基酸。更优选地，所述抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
胞内结构域起到信号传递从而活化NK细胞的作用。最初用于T细胞的CAR的胞内结构域只有一个信号分子，通常为免疫球蛋白E的受体相关FcεRIγ(与IgE有高亲和力的受体的一个亚基)或T细胞抗原受体信号的基础传导分子DAP12；有的胞内结构域包含由一种或几种T细胞活化基序组成的T细胞活化结构域。本发明发现，将上述来自NKG2D的配体结合区的抗原结合结构域与来自DAP12的胞内信号区进行组合，可得到能够使NK细胞发挥强烈的靶向杀瘤活性的CAR。优选地，所述胞内结构域的氨基酸序列选自DAP12的第62-113位氨基酸，所述胞内结构域的氨基酸序列更优选如SEQ ID NO:5所示。其中，DAP12的氨基酸序列的Genbank编号为NP_003323.1。
本发明更进一步选择了间隔区和跨膜区，从而获得了具有抗原结合结构域-间隔区-跨膜区-胞内结构域的特定组合的CAR。间隔区连接识别和结合抗原的抗原结合结构域和跨膜区，这一区域的结构应该是易弯曲的，这样可以使抗原结合结构域适应不同的方向，以促进抗原的识别和结合。形式最简单的间隔区是免疫球蛋白IgGl的铰链区(hinge)，也可以是免疫球蛋白CH2CH3区的一部分。跨膜区一般是跨越细胞膜的疏水性α螺旋。通过研究和实验摸索，本发明发现，所述间隔区优选来自CD8α的铰链区，所述跨膜区优选来自CD8α的跨膜区。CD8为跨膜的糖基化膜蛋白，由α和β两个亚基组成，与T细胞表面受体共同作用使T细胞与特定抗原结合，CD8特异性结合MHC I，介导细胞毒性T细胞的杀伤作用。
更优选地，所述间隔区和跨膜区构成间隔跨膜区，并且其中所述间隔跨膜区的氨基酸序列与CD8α的第Y位-第210位氨基酸序列一致，且118≤Y≤128，Y为整数。其中，CD8α的氨基酸序列的Genbank编号可为NP_001139345.1。也就是说，所述间隔跨膜区的氨基酸序列优选选自CD8α的第118-210位氨基酸、并且包含第128-210位氨基酸。例如，所述间隔跨膜区的氨基酸序列如以下氨基酸序列组中任一氨基酸序列所示：CD8α的第118-210位氨基酸、第119-210位氨基酸、第120-210位氨基酸、第121-210位氨基酸、第122-210位氨基酸、第123-210位氨基酸、第124-210位氨基酸、第125-210位氨基酸、第126-210位氨基酸、第127-210位氨基酸、或第128-210位氨基酸。
更优选地，所述间隔跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在本发明的嵌合抗原受体中，抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域是依次串联的；抗原结合结构域和间隔区之间、间隔区和跨膜区之间、跨膜区和胞内结构域之间是可操作地连接的，例如可以采用接头连接，也可以不采用接头而直接连接。在本发明一个实施方案中，抗原结合结构域和间隔区之间采用接头连接(所述接头(例如)为-Ala-Ser-)，而间隔区和跨膜区之间、跨膜区和胞内结构域之间未采用接头而直接连接。
在本发明一个优选的实施方案中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在本发明另一个优选的实施方案中，所述嵌合抗原受体具有在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中替换、删除、和/或添加一个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列；例如，所述嵌合抗原受体具有与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少90％、优选至少95％、更优选至少99％的一致性。
本发明还提供了一种分离的、编码本发明所述的嵌合抗原受体的DNA，该DNA包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域编码元件、间隔区编码元件、跨膜区编码元件和胞内结构域编码元件，其特征在于，所述抗原结合结构域编码元件来自NKG2D的配体结合区编码DNA，所述胞内结构域编码元件来自DAP12的胞内信号区编码DNA。
所述抗原结合结构域编码元件的核苷酸序列编码所述抗原结合结构域的氨基酸序列，优选地，所述抗原结合结构域的氨基酸序列与NKG2D的第X位-第216位氨基酸序列一致，且73≤X≤83，X为整数。例如，所述抗原结合结构域的氨基酸序列如以下氨基酸序列组中任一氨基酸序列所示：NKG2D的第73-216位氨基酸、第74-216位氨基酸、第75-216位氨基酸、第76-216位氨基酸、第77-216位氨基酸、第78-216位氨基酸、第79-216位氨基酸、第80-216位氨基酸、第81-216位氨基酸、第82-216位氨基酸、或第83-216位氨基酸。优选地，所述抗原结合结构域编码元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
所述胞内结构域编码元件的核苷酸序列编码所述胞内结构域的氨基酸序列，优选地，所述胞内结构域的氨基酸序列选自DAP12的胞内信号区的第62-113位氨基酸。优选地，所述胞内结构域编码元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
优选地，所述间隔区编码元件来自CD8α的铰链区编码DNA，所述跨膜区编码元件来自CD8α的跨膜区编码DNA。
所述间隔区编码元件和所述跨膜区编码元件构成间隔跨膜区编码元件，所述间隔跨膜区编码元件的核苷酸序列编码所述间隔跨膜区的氨基酸序列，优选地，所述间隔跨膜区的氨基酸序列与CD8α的第Y位-第210位氨基酸序列一致，且118≤Y≤128，Y为整数。例如，所述间隔跨膜区的氨基酸序列如以下氨基酸序列组中任一氨基酸序列所示：CD8α的第118-210位氨基酸、第119-210位氨基酸、第120-210位氨基酸、第121-210位氨基酸、第122-210位氨基酸、第123-210位氨基酸、第124-210位氨基酸、第125-210位氨基酸、第126-210位氨基酸、第127-210位氨基酸、或第128-210位氨基酸。优选地，所述间隔区编码元件的核苷酸序列包含SEQ ID NO:7所示的序列。
在本发明一个优选的实施方案中，所述分离的、编码本发明所述的嵌合抗原受体的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明所述的NKG2D、DAP12和CD8α均优选来源于人，其全长氨基酸序列和核苷酸序列均为已知的，可以由本领域常用的公开数据库查询到。
本发明还提供了一种分离的、由本发明所述的编码嵌合抗原受体的DNA转录得到的mRNA。
本发明还提供了一种重组表达载体，其含有与启动子有效连接的根据本发明所述的编码嵌合抗原受体的DNA。
优选地，所述重组表达载体在根据本发明所述的编码嵌合抗原受体的DNA之前依次包含CMV启动子、T7启动子、具有kozak序列的5’UTR和GM-CSFα链信号肽编码序列；并且在根据本发明所述的编码嵌合抗原受体的DNA之后包含具有polyA信号的α球蛋白的3’UTR。
本发明的重组表达载体的上述作用元件的组合能够促进DNA的转录和翻译，并增强mRNA的稳定性。本发明还对上述各作用元件的结构作了如下优化，从而更好地发挥其应有的功能。
优选地，在本发明中，CMV启动子序列为TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATC(SEQ ID NO:22)。CMV启动子功能为使下游的DNA序列开始转录。
优选地，在本发明中，T7启动子序列为TAATACGACTCACTATAG(SEQ ID NO:17)。T7启动子功能为使下游的DNA序列开始转录。
优选地，在本发明中，具有kozak序列的5’UTR的序列为AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACCATG(SEQ ID NO:18)，其中下划线所示序列为kozak序列。具有kozak序列的5’UTR的功能为增强mRNA的翻译效率。
优选地，在本发明中，GM-CSFα链信号肽编码序列的序列为ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCA(SEQ ID NO:19)，由此得出的氨基酸序列为MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO:20)。GM-CSFα链信号肽是将本发明的CAR靶向至分泌途径的前导序列，其编码序列首先与CAR一起在细胞内被翻译成蛋白质，引导合成的蛋白进入胞内分泌途径。在细胞表面表达CAR前信号肽已被去除。
优选地，在本发明中，α球蛋白的3’UTR序列为GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATA AAGCCTGAGTAGGAAGT(SEQ ID NO:21)，其中下划线所示序列为polyA信号。其作用是增强mRNA的稳定性。
在一个具体实施方案中，所述重组表达载体的基本骨架为市售可得的pFastbac1载体，然后在其中插入上述各元件。
由于本发明优化了3’UTR和5’UTR结构，因此可以例如应用Tail-PCR技术由所述重组表达载体合成其中正链带有PolyA、反链带有对应的PolyT的DNA双链模板，这样降低了DNA模板的不稳定性，进而可在体外合成mRNA。所述的正链中所带有的PolyA中的A的个数范围(或者其反链中对应的PolyT中的T的个数范围)为140-170个，优选为150-170个，更优选为150个左右(例如150个)。
本发明还提供了一种嵌合抗原受体修饰的NK细胞，该NK细胞的表面被本发明所述的嵌合抗原受体修饰。
本文所用的术语“修饰”是指，NK细胞表达有本发明所述的嵌合抗原受体，即，所述嵌合抗原受体的跨膜区锚定在所修饰的NK细胞的细胞膜上，抗原结合结构域位于细胞表面，胞内结构域位于细胞质内。
所述NK细胞可以为已知的各种类型的NK细胞，并且可以通过常规的生物学方法得到。NK细胞(自然杀伤细胞)是人体内的一种非特异性的先天免疫细胞，来源于骨髓，在体内几乎所有器官中都有存在，是非特异性免疫系统的重要组成部分,表型为CD3阴性CD56阳性的单一细胞，主要有CD16阴性CD56bright(亮)和CD16阳性CD56dim(暗)两种亚型，分别有免疫调节和肿瘤杀伤的体内功效。由于NK细胞作用是非MHC-限制性，使用上没有必要与病人个体的组织相容性复合物相匹配，也就是NK细胞可用于异体病人细胞治疗，具有广泛的临床应用价值。
本发明还提供了一种制备根据本发明所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞的方法，包括以下步骤：
1)提供NK细胞；
2)提供编码根据本发明所述的嵌合抗原受体的核酸；
3)将所述核酸转染入所述NK细胞中。
步骤1)所述的NK细胞可以由外周血单个核细胞制备。本发明方法中NK细胞的纯度可为≥70％，优选为≥80％。NK细胞纯度指NK细胞在总细胞群体中所占比例。步骤2)所述的核酸为根据本发明所述的编码所述嵌合抗原受体的DNA、或由该DNA转录得到的mRNA。步骤3)所述的转染可通过冷冻电穿孔技术或慢病毒载体进行。采用冷冻电穿孔技术进行的转染可采用本领域常用的方式进行，如文献“Nakazawa Y,Matsuda K,Kurata T,Sueki A,Tanaka M,Sakashita K,Imai C,Wilson MH,Koike K.Anti-proliferative effects of Tcells expressing a ligand-based chimeric antigen receptor against CD116onCD34(+)cells of juvenile myelomonocytic leukemia.J Hematol Oncol.2016Mar.”所述。采用慢病毒载体进行的转染可采用本领域常用的方式进行，如文献“JamesN.Kochenderfer,Steven A.Feldman,Yangbing Zhao,Hui Xu,Mary A.Black,RichardA.Morgan,Wyndham H.Wilson,Ψand Steven A.Rosenberg.Construction and Pre-clinical Evaluation of an Anti-CD19Chimeric Antigen Receptor.2009JImmunother.2009Sep；32(7):689–702.”和文献“Cooper LJ,Topp MS,Serrano LM,Gonzalez S,Chang WC,Naranjo A,Wright C,Popplewell L,Raubitschek A,Forman SJ,Jensen MC.T-cell clones can be rendered specific for CD19:toward theselective augmentation of the graft-versus-B-lineage leukemiaeffect.Blood.2003Feb15；101(4):1637-44.”所述。
在本发明一个具体实施方案中，通过PCR由PBMC cDNA文库扩增得到人NKG2D蛋白的第83-216位氨基酸对应的DNA、人CD8α的第128-210位氨基酸对应的DNA、人DAP12的第62-113位氨基酸对应的DNA。将扩增得到的三种序列连接，然后通过分子克隆技术连接到pFastbac1载体上，得到pFastbac1-NKG2D-CD8-DAP12重组表达载体。然后合成NKG2D-CD8-DAP12对应序列的mRNA。再利用高效冷冻电穿孔技术将mRNA电转进入体外扩增培养的NK细胞，获得工程化NKG2D配体靶向性的NK细胞。
所述嵌合抗原受体的各部分也可由静脉血中单个核细胞的基因组cDNA扩增得到。
本发明还提供了根据本发明所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
所述肿瘤和/或癌症是NKG2D配体阳性的，包括结直肠癌、卵巢癌、头颈癌、骨髓瘤、肝癌、乳腺癌、血液瘤、宫颈癌、神经胶质瘤等。
本发明还提供了根据本发明所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞在制备用于检测宿主的肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
所述肿瘤和/或癌症是NKG2D配体阳性的，包括结直肠癌、卵巢癌、头颈癌、骨髓瘤、肝癌、乳腺癌、血液瘤、宫颈癌、神经胶质瘤等。
在本发明的一个实施方案中，可将从宿主取出的肿瘤和/或癌症细胞的样本与本发明所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞以一定浓度进行接触，根据二者的反应程度可以判断所述肿瘤和/或癌症是NKG2D配体阳性的还是NKG2D配体阴性的。
本发明还提供了一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据本发明所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞，及可药用辅料。
所述药物组合物优选包含每人每个疗程总剂量范围为1×106-1×1011个的所述嵌合抗原受体修饰的NK细胞。优选的是，每个疗程3周共21天，每周施用1-2次。可以根据实际情况和需要对患者进行一个或多个疗程的治疗。
所述药物组合物可通过合适的给药途径给药，其给药方式包括静脉给药(例如静脉滴注给药或静脉注射给药)或局部给药(例如局部滴注给药或局部注射给药)。
本发明还提供了一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括对肿瘤和/或癌症患者施用根据本发明所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞。
所述肿瘤和/或癌症是NKG2D配体阳性的，包括结直肠癌、卵巢癌、头颈癌、骨髓瘤、肝癌、乳腺癌、血液瘤、宫颈癌、神经胶质瘤等。
所述嵌合抗原受体修饰的NK细胞的施用剂量优选为每人每个疗程总剂量范围为1×106-1×1011个细胞。优选的是，每个疗程3周共21天，每周施用1-2次。可以根据实际情况和需要对患者进行一个或多个疗程的治疗。
所述嵌合抗原受体修饰的NK细胞可通过合适的给药途径给药，其给药方式包括静脉给药(例如静脉滴注给药或静脉注射给药)或局部给药(例如局部滴注给药或局部注射给药)。
本发明还提供了一种工具载体，该工具载体依次包含可操作地连接的CMV启动子、T7启动子、具有kozak序列的5’UTR、GM-CSFα链信号肽编码序列、和具有polyA信号的α球蛋白的3’UTR。
术语“工具载体”是指基因工程应用中，用于插入外源DNA片段的空载体。
在插入外源DNA片段时，将外源DNA片段插入到所述工具载体的GM-CSFα链信号肽编码序列与具有polyA信号的α球蛋白的3’UTR之间(GM-CSFα链信号肽编码序列与具有polyA信号的α球蛋白的3’UTR之间可以具有多克隆位点)。
优选地，所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述具有kozak序列的5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述GM-CSFα链信号肽编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，所述具有PolyA信号的α球蛋白的3’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。
本发明的工具载体能够促进插入DNA的转录和翻译，并增强mRNA的稳定性。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
例子
以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用生物工程领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。
以下除非特别说明，否则各试剂的百分浓度(％)均指该试剂的体积百分浓度(％(v/v))。
以下例子中所用人类卵巢癌细胞SKOV3、人类结直肠癌细胞HCT116和SW480、人类头颈癌细胞Fadu和Detroit、人类肝癌细胞HepG2、人类神经胶质瘤细胞U87、人类乳腺癌细胞MCF7、和人类骨髓瘤细胞KG1购自ATCC。
以下例子中所用PBS购自Lonza，货号为BW17-517Q。
制备例1：嵌合抗原受体质粒构建
1)静脉血单个核细胞(PBMCs)cDNA的制备
取人静脉血于含肝素的真空管中。采用淋巴细胞分离液，密度梯度离心方法分离获得单个核细胞(PBMCs)。
离心沉淀上述PBMCs，用总RNA提取试剂盒RNAiso Reagent(购自LifeTechnologies)提取细胞的总RNA，-80℃保存备用。提取的总RNA用逆转录试剂盒RevertAicTFirst Strand cDNASynthesis Kit(购自Life Technologies)逆转录得PBMCs的cDNA，-20℃保存备用。
2)嵌合抗原受体的重组DNA载体pFastbac1-NKG2D-CD8-DAP12的构建
以步骤1)中单个核细胞cDNA为模板，用引物P1(SEQ ID NO:9)、P2(SEQ ID NO:10)进行PCR扩增，获得其中包含长度为402bp的NKG2D蛋白的胞外结构域对应的DNA编码序列(核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示)的片段，其两端分别具有Sphl和NheI酶切位点和保护碱基。利用引物P3(SEQ ID NO:11)、P4(SEQ ID NO:12)进行PCR扩增，获得其中包含长度为249bp的CD8α基因的铰链(hinge)区和跨膜区(核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示)的片段。利用引物P5(SEQ ID NO:13)、P6(SEQ ID NO:14)进行PCR扩增得到其中包含长度为156bp的DAP12的胞内信号结构域(核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示)的片段。各步PCR扩增反应体系相同，PCR反应条件参照KAPA HiFiHotStart ReadyMix(2X)(购自Kapa Biosystems)的说明书，各反应体系(50μL)如下:
双蒸水：21.5μL
2×KAPA HiFiHotStart Uracil+ReadyMix：25μL
上游引物(10μM)：1.5μL
下游引物(10μM)：1.5μL
单个核细胞cDNA模板(120ng/ul)：0.5μL
将上述PCR产物用1％(w/v)的琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自Omega Bio Tek)进行DNA片段回收。将回收片段中包含长度为402bp的NKG2D蛋白的胞外结构域DNA的片段进行Sphl和NheI双酶切反应，酶切产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行DNA片段回收备用。
按照图1的顺序，将商业化载体pFastbac1(Life Technologies)加入一个CMV启动子，T7启动子，一个拥有Kozak序列的5’UTR，一个GM-CSFα链信号肽的编码序列(图1中的SP)，和一个具有polyA信号的阿尔法球蛋白的3’UTR来构建pFastbac1基本骨架载体。将pFastbac1基本骨架载体进行SphI和SalI双酶切反应，酶切产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行DNA片段回收，然后与之前PCR回收的CD8、DAP12片段通过SeamlessCloning and Assembly Kit(购自Life Technologies)进行连接，连接产物转化OneChemically Competent TOP10化学感受态细胞(购自Life Technologies)，37℃培养18小时后挑取单克隆，37℃，250rpm培养6小时后用质粒小提试剂盒(购自Omega Bio Tek)提取质粒。提取的质粒经限制性内切酶SphI和SalI双酶切鉴定，鉴定电泳图见图2；其中，泳道1：1000kb DNA分子量标记；泳道2：质粒pFastbac1-CD8-DAP12的酶切片段，载体骨架5276bp，CD8-DAP12片段405bp。将鉴定正确的质粒送AITbiotech公司对插入的融合基因片段进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pFastbac1-CD8-DAP12。
将载体pFastbac1-CD8-DAP12进行SphI和NheI双酶切反应，酶切产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行DNA片段回收，然后与之前回收的NKG2D蛋白的胞外结构域片段通过T4DNA连接酶连接，连接产物转化OneChemically Competent TOP10化学感受态细胞，37℃培养18小时后挑取单克隆，37℃，250rpm培养6小时后用质粒小提试剂盒提取质粒。提取的质粒经限制性内切酶SphI和NheI双酶切鉴定，鉴定电泳图见图3；其中，泳道1：1000kb DNA分子量标记；泳道2：质粒pFastbac1-NKG2D-CD8-DAP12的酶切片段，载体骨架5682bp，NKG2D片段402bp。将鉴定正确的质粒送AITbiotech公司对插入的融合基因片段进行测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pFastbac1-NKG2D-CD8-DAP12，其质粒图谱示意图见图4。
制备例2：NK细胞的制备
将细胞数为20×106个的PBMCs细胞和2mL NK细胞活化剂I(购自深圳达科为，DKW35-CYT-NK001)均匀混合于400ml NK培养液(NK培养液为AIM培养基(购自LifeTechnologies)+1％人类血清(购自Valley Biomedical，货号HP1022HI)中，接种于一个G-Rex100细胞培养器(购自Wilson Wolf)，加入IL2(终浓度：50IU/ml)，放置于37℃细胞培养箱中，每隔一天补充全液体积的IL2(终浓度：50IU/ml)，培养10天，收集细胞计数，计数完毕取出收集细胞中的20×106个细胞与另外的2mL NK细胞活化剂I均匀混合于400ml NK培养液中，接种回G-Rex100细胞培养器，相同条件继续培养7天。上述第10天时的剩余细胞冻存备用，第17天时的细胞收集计数，取出2×106个细胞用于流式细胞仪(购自BD，型号C6Samplar)进行细胞表型分析。结果显示，用该方法培养出来的NK细胞平均纯度高达90％，见图5。图5A所示结果说明CD3阴性且CD56阳性的NK细胞比例为90.2％，图5B所示结果说明NK细胞表面受体NKG2D和CD16双阳性的比例为96.4％。
制备例3：制备嵌合抗原受体修饰的NK细胞
1)嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12mRNA的体外合成
优化了3’UTR和5’UTR结构，其序列如上文所述。应用Tail-PCR技术大剂量合成其中正链带有PolyA、反链带有对应的PolyT的DNA双链模板用来进行试管内RNA合成，减少了DNA模板的不稳定性。嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12编码序列以上述pFastbac1-NKG2D-CD8-DAP12载体作为DNA模板进行Tail-PCR扩增，用以合成编码嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12序列的线性化DNA模板，Tail-PCR反应条件参照KAPA HiFiHotStartReadyMix(2X)的说明书，反应体系(50μL)如下:
双蒸水(nuclease free)：25μL
2X KAPA HiFiHotStart Uracil+ReadyMix：25μL
P7(SEQ ID NO:15)(100μM)：0.15μL
P8(SEQ ID NO:16)(100μM)：0.15μL
pFastbac1-NKG2D-CD8-DAP12载体DNA模板(500ng/μL)：0.5μL
将上述PCR产物用1％(w/v)的琼脂糖凝胶进行分离鉴定，见图6。鉴定正确的产物用于嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12mRNA的体外合成。用mRNA体外合成试剂盒合成戴帽的mRNA，试剂盒为mMESSAGEmMACHINE T7ULTRA转录试剂盒(可得自美国Invitrogen公司)或者mScriptTM RNA system(可得自美国Epicentre公司)。按照试剂盒的说明，并用试剂盒提供的试剂进行合成即可。
将体外合成的嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12mRNA产物用1％(w/v)的琼脂糖凝胶进行分离鉴定，见图7。鉴定正确的mRNA存放于-80℃保存备用。
2)对NK细胞进行嵌合抗原受体修饰
将制备例2制备的NK细胞(1×107个)与4μg NKG2D-CD8-DAP12mRNA混合于电转液P3(产品名称“P3Primary Cell 4D-X Kit L”,Lonza，货号V4XP-3012)，置于100μl NucleocuvetteTM管(P3Primary Cell 4D-X Kit L,Lonza，货号V4XP-3012)，并进行冰浴冷冻5分钟。然后使用4D-NucleofectorTM电转仪(得自瑞士Lonza公司)，选择其自带的NK细胞电转程序进行电转。电转后，将细胞取出置于制备例2所述NK培养液中，加入IL2 50IU/mL和0.5μg/mL的DNase，置于37℃，5％CO2孵箱中恢复过夜。24小时后，收集细胞，使用流式细胞仪对电转细胞进行鉴定，见图8。图8所示结果说明转染NKG2D-CARmRNA后，NKG2D的表达强度明显增加。符合要求的细胞(NKG2D-CAR NK细胞)可用于对相关肿瘤的治疗。
试验例1：NKG2D-CAR NK细胞对人肿瘤细胞体外杀伤能力的检测分析
1)对NKG2D-CAR NK细胞杀伤性细胞因子IFN-γ的释放能力的检测
为了评价肿瘤细胞杀伤效率，进行了ELISPOT实验来检测IFNγ的分泌，因为IFN-γ的分泌与过继细胞免疫治疗时NKG2D-CAR NK细胞的抗肿瘤活性成正相关。
mGFP-CAR NK细胞(转染mGFP-CD8-DAP12mRNA的NK细胞)的制备方法与NKG2D-CARNK细胞(转染NKG2D-CD8-DAP12mRNA的NK细胞)的制备方法相同，只是载体构建时胞外结构域使用无抗原结合功能的mGFP序列(其Genbank编号为YP_002302326.1)，以此作为阴性对照。
转染NKG2D-CD8-DAP12mRNA的NK细胞的制备如制备例3所示。
将转染NKG2D-CD8-DAP12mRNA或者mGFP-CD8-DAP12mRNA的NK细胞分别与人类卵巢癌细胞SKOV3、人类结直肠癌细胞HCT116和SW480、人类头颈癌细胞Detroit、人类肝癌细胞HepG2和人类神经胶质瘤细胞U87共培养于ELISPOT检测板，上述NK效应细胞与靶标细胞的数量比例为5:1。每组实验重复3次。经过24小时的共培养后，显影并使用软件immunospot进行ELISPOT点计数。结果显示，NKG2D-CD8-DAP12mRNA转染的NK细胞与mGFP-CD8-DAP12mRNA转染的NK细胞相比，产生了更多更强的IFN-γ(通过ELISPOT检测试剂盒检测，购自Mabtech，货号为3420-4HST-1)，统计后发现NKG2D-CD8-DAP12mRNA转染的NK细胞产生的ELISPOT点显著高于对照组，见图9。
2)对NKG2D-CAR NK细胞溶解肿瘤细胞能力的检测
将转染NKG2D-CD8-DAP12mRNA或者mGFP-CD8-DAP12mRNA的NK细胞分别与人类结直肠癌细胞HCT116、人类卵巢癌细胞SKOV3、人类头颈癌细胞Fadu和Detroit、人类肝癌细胞HepG2、人类乳腺癌细胞MCF7、和人类骨髓瘤细胞KG1共培养于U型96孔板，上述NK效应细胞与靶标细胞的个数比例范围为由2.5:1到10:1。每组实验重复3次。经过2小时的共培养后，用DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒(得自美国的PerkinElmer公司)检测NKG2D-CAR NK细胞溶解肿瘤细胞的能力，杀伤效果用如下公式计算：
％特异性裂解＝((实验组释放(读数)-空白组释放(读数))/(最大释放(读数)-空白组释放(读数)))×100
结果显示，NKG2D-CAR修饰的NK细胞具有广泛并且强烈的杀瘤活性。如，当结直肠癌细胞HCT116、卵巢癌细胞SKOV3、头颈癌细胞Fadu和Detroit、肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF7、以及骨髓瘤细胞KG1作为靶标时，NKG2D-CAR修饰的NK细胞的杀伤效果在10:1时均已显著高于对照组的杀伤效果，见图10。以上结果充分说明了NKG2D-CAR NK对肿瘤杀伤的普遍性和高效性。
试验例2：NKG2D-CAR NK细胞对人肿瘤细胞体内杀伤能力的检测分析
进一步利用植入人体肿瘤的小鼠模型测试了NKG2D-CAR NK细胞的体内杀瘤效果。实验用小鼠为非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷/IL-2Rγcnull(NSG)小鼠(6-8周，雌性)，每只小鼠被植入1×107个卵巢癌细胞SKOV3-Luc。肿瘤植入7天后，利用活体生物成像技术(BLI)，在IVIS Spectrum成像平台观测到了肿瘤的生长，并用成像仪(得自美国PerkinElmer公司)拍照记录肿瘤的生长情况。拥有相似BLI强度(BLI强度指的是活体成像仪记录的小鼠体内肿瘤细胞荧光强度)的小鼠被随机分为2组，分别为：磷酸盐缓冲液(PBS)组，和NKG2D-CAR NK细胞组，每组5只小鼠。NKG2D-CAR NK细胞组以每只小鼠每次1×107细胞数腹腔注射按制备例3所示方法制备的NKG2D-CAR修饰的NK细胞，PBS组每只小鼠每次腹腔注射100μL量的PBS。细胞注射方案为：每周二、五注射，总共注射三周(即，每组共6次注射)。密切地观察小鼠的行为和生存情况，并将肿瘤的发展状况由BLI记录。所有的光信号和图片都由Xenogen活体成像软件v2.5记录分析。如图11所示，肿瘤植入后第28天，肿瘤生长状况显示PBS组小鼠肿瘤生长迅速，光信号强度增长约为第7天的10倍，而NKG2D-CAR NK细胞组的全部5只小鼠肿瘤生长不但被抑制，而且原有肿瘤消除明显，光信号强度下降到第7天的约10％。由此可见，NKG2D-CAR修饰的NK细胞能够有效杀死体内肿瘤。
试验例3：不同嵌合抗原受体的比较
用嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12修饰的NK细胞和嵌合抗原受体NKG2D-CD8-CD3Z修饰的NK细胞分别对肿瘤细胞进行实验，比较杀伤活力。
将转染NKG2D-CD8-DAP12mRNA、NKG2D-CD8-CD3z mRNA、或者mGFP-CD8-DAP12mRNA的NK细胞分别与人类结直肠癌细胞HCT116、人类卵巢癌细胞SKOV3、和人类头颈癌细胞Detroit共培养于U型96孔板，上述NK细胞与靶标细胞的个数比例范围为由2.5:1到10:1。每组实验重复3次。经过2小时的共培养后，用DELFIA EuTDA细胞毒性试剂盒(得自美国的PerkinElmer公司)检测NKG2D-CAR NK细胞溶解肿瘤细胞的能力，杀伤效果的计算应用如下公式：
％特异性裂解＝((实验组释放(读数)-空白组释放(读数))/(最大释放(读数)-空白组释放(读数)))×100
结果显示，在人类结直肠癌细胞HCT116、人类卵巢癌细胞SKOV3、和人类头颈癌细胞Detroit的杀瘤实验中，NKG2D-CD8-DAP12mRNA修饰的NK细胞的杀瘤活性明显强于NKG2D-CD8-CD3z mRNA修饰的NK细胞。说明本发明所创建的具有所述特定构成单元组合的嵌合抗原受体NKG2D-CD8-DAP12具有显著的疗效和良好的商业化前景。
上述NKG2D-CD8-CD3z修饰的NK细胞的制备方法与NKG2D-CD8-DAP12修饰的NK细胞的制备方法相同，只是载体构建时胞内信号结构域使用CD3z(全长氨基酸序列的Genbank编号为：NP_932170.1)的胞内信号序列(如SEQ ID NO:23所示)。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州优善生物科技有限公司
<120> 嵌合抗原受体、其修饰的NK细胞、编码DNA、mRNA、表达载体、制备方法和应用
<130> FI-172854-59:52/C
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro
1 5 10 15
Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe
20 25 30
Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln
35 40 45
Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr
65 70 75 80
Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu
85 90 95
Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser
100 105 110
Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile
115 120 125
Cys Met Gln Arg Thr Val Ala Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala
130 135 140
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
145 150 155 160
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
165 170 175
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
180 185 190
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
195 200 205
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Tyr Phe Leu Gly Arg
210 215 220
Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln
225 230 235 240
Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg
245 250 255
Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys
260 265 270
<210> 2
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 2
ttcaaccaag aagttcaaat tcccttgacc gaaagttact gtggcccatg tcctaaaaac 60
tggatatgtt acaaaaataa ctgctaccaa ttttttgatg agagtaaaaa ctggtatgag 120
agccaggctt cttgtatgtc tcaaaatgcc agccttctga aagtatacag caaagaggac 180
caggatttac ttaaactggt gaagtcatat cattggatgg gactagtaca cattccaaca 240
aatggatctt ggcagtggga agatggctcc attctctcac ccaacctact aacaataatt 300
gaaatgcaga agggagactg tgcactctat gcctcgagct ttaaaggcta tatagaaaac 360
tgttcaactc caaatacgta catctgtatg caaaggactg tggctagctt cgtgccggtc 420
ttcctgccag cgaagcccac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 480
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 540
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 600
acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaacca caggaactac 660
ttcctgggcc ggctggtccc tcgggggcga ggggctgcgg aggcagcgac ccggaaacag 720
cgtatcactg agaccgagtc gccttatcag gagctccagg gtcagaggtc ggatgtctac 780
agcgacctca acacacagag gccgtattac aaa 813
<210> 3
<211> 134
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 3
Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro
1 5 10 15
Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe
20 25 30
Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln
35 40 45
Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu
50 55 60
Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr
65 70 75 80
Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu
85 90 95
Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser
100 105 110
Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile
115 120 125
Cys Met Gln Arg Thr Val
130
<210> 4
<211> 83
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 4
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
50 55 60
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
65 70 75 80
His Arg Asn
<210> 5
<211> 52
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 5
Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala
1 5 10 15
Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu
20 25 30
Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg
35 40 45
Pro Tyr Tyr Lys
50
<210> 6
<211> 402
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 6
ttcaaccaag aagttcaaat tcccttgacc gaaagttact gtggcccatg tcctaaaaac 60
tggatatgtt acaaaaataa ctgctaccaa ttttttgatg agagtaaaaa ctggtatgag 120
agccaggctt cttgtatgtc tcaaaatgcc agccttctga aagtatacag caaagaggac 180
caggatttac ttaaactggt gaagtcatat cattggatgg gactagtaca cattccaaca 240
aatggatctt ggcagtggga agatggctcc attctctcac ccaacctact aacaataatt 300
gaaatgcaga agggagactg tgcactctat gcctcgagct ttaaaggcta tatagaaaac 360
tgttcaactc caaatacgta catctgtatg caaaggactg tg 402
<210> 7
<211> 249
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 7
ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 60
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 120
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 180
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac 240
cacaggaac 249
<210> 8
<211> 156
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 8
tacttcctgg gccggctggt ccctcggggg cgaggggctg cggaggcagc gacccggaaa 60
cagcgtatca ctgagaccga gtcgccttat caggagctcc agggtcagag gtcggatgtc 120
tacagcgacc tcaacacaca gaggccgtat tacaaa 156
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 9
gcgcgcatgc cttcaaccaa gaagttcaaa ttcc 34
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 10
acgaagctag ccacagtcct ttgcatacag atgtacgtat ttggag 46
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 11
cccaggcgcg catgcgctag cttcgtgccg gtcttcctg 39
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 12
ggaagtagtt cctgtggttg cagtaaag 28
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 13
acaggaacta cttcctgggc cggctggtc 29
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 14
ggcagcaagc ttgggtcgac cggttcattt gtaatacggc ctct 44
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 15
ctggtttagt gaaccgtcag atcgaattct 30
<210> 16
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 16
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tcttcctact caggctttat tcaaagacca 180
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 17
taatacgact cactatag 18
<210> 18
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 18
aaataagaga gaaaagaaga gtaagaagaa atataagagc caccatg 47
<210> 19
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 19
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 20
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 20
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 21
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 21
gctgccttct gcggggcttg ccttctggcc atgcccttct tctctccctt gcacctgtac 60
ctcttggtct ttgaataaag cctgagtagg aagt 94
<210> 22
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 22
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
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acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatc 589
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 23
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
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Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110

Claims (36)

1.一种嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域、间隔区、跨膜区和胞内结构域，其特征在于，所述抗原结合结构域来自NKG2D的配体结合区，所述胞内结构域来自DAP12的胞内信号区。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域的氨基酸序列与NKG2D的第X位-第216位氨基酸序列一致，且73≤X≤83。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域的氨基酸序列选自DAP12的第62-113位氨基酸；优选地，所述胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔区来自CD8α的铰链区，所述跨膜区来自CD8α的跨膜区。
6.根据权利要求1或5所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔区和跨膜区构成间隔跨膜区，并且其中所述间隔跨膜区的氨基酸序列与CD8α的第Y位-第210位氨基酸序列一致，且118≤Y≤128。
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其中所述间隔跨膜区的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。
8.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
9.一种分离的、编码嵌合抗原受体的DNA，该DNA包括可操作地连接的、依次串联的抗原结合结构域编码元件、间隔区编码元件、跨膜区编码元件和胞内结构域编码元件，其特征在于，所述抗原结合结构域编码元件来自NKG2D的配体结合区编码DNA，所述胞内结构域编码元件来自DAP12的胞内信号区编码DNA。
10.根据权利要求9所述的DNA，其中所述抗原结合结构域编码元件的核苷酸序列编码所述抗原结合结构域的氨基酸序列，所述抗原结合结构域的氨基酸序列与NKG2D的第X位-第216位氨基酸序列一致，且73≤X≤83。
11.根据权利要求9或10所述的DNA，其中所述抗原结合结构域编码元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
12.根据权利要求9所述的DNA，其中所述胞内结构域编码元件编码所述胞内结构域的氨基酸序列，所述胞内结构域的氨基酸序列选自DAP12的第62-113位氨基酸；优选地，所述胞内结构域编码元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
13.根据权利要求9所述的DNA，其中所述间隔区编码元件来自CD8α的铰链区编码DNA，所述跨膜区编码元件来自CD8α的跨膜区编码DNA。
14.根据权利要求9或13所述的DNA，其中所述间隔区编码元件和所述跨膜区编码元件构成间隔跨膜区编码元件，所述间隔跨膜区编码元件的核苷酸序列编码所述间隔跨膜区的氨基酸序列，所述间隔跨膜区的氨基酸序列与CD8α的第Y位-第210位氨基酸序列一致，且118≤Y≤128。
15.根据权利要求14所述的DNA，其中所述间隔跨膜区编码元件的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示。
16.根据权利要求9所述的DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
17.一种分离的、由根据权利要求9-16中任一项所述的DNA转录的mRNA。
18.一种重组表达载体，其含有与启动子有效连接的根据权利要求9-16中任一项所述的DNA。
19.根据权利要求18所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体在根据权利要求9-16中任一项所述的DNA之前依次包含CMV启动子、T7启动子、具有kozak序列的5’UTR和GM-CSFα链信号肽编码序列；并且在根据权利要求9-16中任一项所述的DNA之后包含具有PolyA信号的α球蛋白的3’UTR。
20.一种嵌合抗原受体修饰的NK细胞，该NK细胞的表面被权利要求1-8中任一项所述的嵌合抗原受体修饰。
21.一种制备根据权利要求20所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞的方法，包括以下步骤：
1)提供NK细胞；
2)提供编码根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合抗原受体的核酸；
3)将所述核酸转染入所述NK细胞中。
22.根据权利要求21所述的方法，其中步骤1)所述的NK细胞由外周血单个核细胞制备。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述转染通过冷冻电穿孔技术或慢病毒载体进行。
24.根据权利要求21所述的方法，其中步骤2)所述的核酸为根据权利要求9-16中任一项所述的DNA、或根据权利要求17所述的mRNA。
25.根据权利要求20所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞在制备用于治疗或预防肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述肿瘤和/或癌症是NKG2D配体阳性的。
27.根据权利要求20所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞在制备用于检测宿主的肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
28.一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据权利要求20所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞，及可药用辅料。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含每人每个疗程总剂量范围为1×106-1×1011个的所述嵌合抗原受体修饰的NK细胞。
30.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述药物组合物的给药方式包括静脉给药或局部给药。
31.一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括对肿瘤和/或癌症患者施用根据权利要求20所述的嵌合抗原受体修饰的NK细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述嵌合抗原受体修饰的NK细胞的施用剂量为每人每个疗程总剂量范围为1×106-1×1011个细胞。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述嵌合抗原受体修饰的NK细胞的给药方式包括静脉给药或局部给药。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症是NKG2D配体阳性的。
35.一种工具载体，该工具载体依次包含可操作地连接的CMV启动子、T7启动子、具有kozak序列的5’UTR、GM-CSFα链信号肽编码序列、和具有PolyA信号的α球蛋白的3’UTR。
36.根据权利要求35所述的工具载体，其中所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述具有kozak序列的5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，所述GM-CSFα链信号肽编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，所述具有PolyA信号的α球蛋白的3’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。
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