CN111518836A - 一种用于体内基因表达蛋白系统的转染剂及其体外转染的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供利用体内基因表达蛋白系统的转染剂进行体外转染的方法，包括如下步骤：第一步，对细胞进行接种，加完全培养基培养过夜；第二步，以体积比为1：3的比例将具有待表达的蛋白基因序列质粒和壳聚糖多聚赖氨酸聚合物混合，充分混匀；第三步，向第二步的混合液中加入培养基，充分混匀；第四步，将第三步中的混合液加入到第一步中细胞培养体系中，培养24h；第五步，更换培养基，持续观察48h至培养完毕。本发明的有益效果是：利用壳聚糖和多聚赖氨酸两者的特性，设计出来壳聚糖多聚赖氨酸共聚物，可以将DNA的细胞转染效率维持在80％左右，并且细胞保持一定的活率(98％)，转染试剂效率高，毒性小。
Description
技术领域
本发明涉及体内基因表达蛋白系统领域，更具体地说涉及一种用于体内基因表达蛋 白系统的转染剂及其体外转染的方法。
背景技术
非病毒转染并被细胞有效的吸附到细胞内部，达到基因转染的效果。该方法简单实 用，且对细胞的伤害比较低，转染效率较高，其中利用不同的阳性离是将外源基因导入到真核细胞中，促使细胞能够表达特异性基因，具有安全性和已修改的特性。转染方法 可分为两种：物理介导和化学介导。物理方法主要是依靠外界帮助将细胞膜刺穿把基因 导入细胞内，其中包括电穿孔法，显微注射等；化学介导法，如磷酸钙共沉淀法、脂质 体转染方法、和阳离子物质(如：指聚醚酰亚胺：Polyetherimide，PEI)介导的技术。 其中以阳离子聚合物为载体的转染方法是利用其自身的阳性电荷结合DNA磷酸基团所携 带的阴性电荷并相互作用并生成配合体，促使其与细胞膜结合(细胞膜电势为负极)， 多聚物作为转染媒介得到了广泛的应用。壳聚糖(Chitosan)是一种天然多糖(Beta-[1f —4]-2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose)，甲壳素的滋生产品。自然界中含量相对较 多(例如动物的甲壳)，具有生物官能性、相容性、血液相容性、安全性、降血脂、降 血糖以及微生物降解等特性，被广泛应用于食品，医学，生物工程学以及组织再生学等 诸多方面。同时壳聚糖由于带游离的氨基还是一种阳离子聚合物，并具有良好的生物相 容性，已被开发成DNA转染载体，但因其带正电荷数较少，转染效率较低。
多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)是一种可降解的含阳离子的多肽，具有强阳离子的性质能够很好的与DNA相结合，但是转染效率较差。
发明内容
本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种用于体内基因表达蛋白系统的转染剂 及其体外转染的方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
一种用于体内基因表达蛋白系统的转染剂，由具有待表达的蛋白基因序列质粒和壳 聚糖多聚赖氨酸聚合物以体积比为1：3的比例混合组成。
用于如权利要求1所述的体内基因表达蛋白系统的转染剂的荧光质粒的制备方法， 包括如下步骤：
步骤一，构建基因载体；
步骤二，将待表达的蛋白基因序列插入到所述步骤一构建的基因载体中。
进一步，所述步骤一中，载体采用环状质粒载体为基础，以环状质粒中的CMV为启动子，含有Poly(A)。
进一步，所述步骤二中在所述步骤一构建的基因载体上所述CMV启动子与所述Poly (A)之间插入待表达的蛋白基因序列。
用于如权利要求1所述的体内基因表达蛋白系统的转染剂的壳聚糖多聚赖氨酸聚合 物的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将Sigma的低分子量壳聚糖进行高温高压处理，分两次120度40分钟，目的是得到分子量更低的壳聚糖，反应后，壳聚糖原液成深黄色；
步骤二，将所述步骤一种得到的所述壳聚糖和EDC/NHS混合后再加入多聚赖氨酸，所述壳聚糖、所述EDC/NHS、所述多聚赖氨酸的摩尔比例为1：1.5：1，利用磁力搅拌仪 搅拌，加速聚合反应，反应时间为48小时；
步骤三，对所述步骤二种含有聚合物的液体进行透析提纯，利用100Ka的透析袋，将反应物置于透析袋中，室温下至于超纯水中，每12小时更换一次，持续透析4天；
步骤四，将所述步骤三得到的透析产物进行进一步提纯，利用Millipore的超滤杯， 在100Ka超滤膜下进行超滤浓缩，得到最终产物壳聚糖多聚赖氨酸聚合物。
利用如权利要求1所述的体内基因表达蛋白系统的转染剂进行体外转染的方法，包 括如下步骤：
第一步，对细胞进行接种，加完全培养基培养过夜；
第二步，以体积比为1：3的比例将具有待表达的蛋白基因序列质粒和壳聚糖多聚赖 氨酸聚合物混合，充分混匀；
第三步，向所述第二步的混合液中加入培养基，充分混匀；
第四步，将所述第三步中的混合液加入到所述第一步中细胞培养体系中，培养24h；
第五步，更换培养基，持续观察48h至培养完毕。
进一步，所述第三步加入的培养基为100μl的OMEM和20μl的DMSO。
进一步，所述第三步加入的培养基为100μl的OMEM和20μl的50％的PEG3350。
本发明的有益效果为：
多聚赖氨酸的结构轻便很利于修改，与其他多聚体形成聚合物以增强效能，利用壳 聚糖和多聚赖氨酸两者的特性，设计出来壳聚糖多聚赖氨酸共聚物，以壳聚糖为骨架将多聚赖氨酸聚合到上面，形成旁支的新型转染试剂，可以将DNA的细胞转染效率维持在80％左右，并且细胞保持一定的活率(98％)，转染试剂效率高，毒性小，在对细胞转染 时无需更换成无血清培养基，可在正常情况添加10％血清的情况下进行转染，有效的减少 了工作环节。同时由于其毒性低，可利用基因编辑技术将目的片段取代EGFP基因，从而 形成特殊的环状DNA，利用该聚合物实现在动物或者人体内，侵入到细胞中，并实现目的 蛋白的表达；
该系统主要的目的是在不改变宿主的基因结构条件下，将环状DNA导入到动物或者 人体内的细胞中，可以有效表达目标蛋白，比如细胞因子，或者疫苗抗原蛋白等，达到治疗或者可以进行疫苗接种；
采用环状DNA为介质，该方法可以将目标蛋白的序列编辑完后，直接嵌合到环状DNA 上，可以在不影响细胞本身的基因结构下，表达目标蛋白，另外环状DNA可以在细胞中存活一段时间，然后慢慢消失，因此可以通过该系统在体内一段时间内稳定表达目标蛋白。
附图说明
图1是构建基因载体含Poly(A)的示意图；
图2是荧光质粒构建示意图；
图3是壳聚糖多聚赖氨酸聚合物的化学结构；
图4是实施例1中24小时后转染结果；
图5是实施例1中48小时后转染结果；
图6是实施例1利用琼脂凝胶电泳技术对比结果；
图7是实施例2中24小时后转染结果；
图8是实施例2中48小时后转染结果；
图9是实施例2利用琼脂凝胶电泳技术对比结果；
图10是实施例3中ELISA实验结果；
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
一种用于体内基因表达蛋白系统的转染剂，由具有待表达的蛋白基因序列质粒和壳 聚糖多聚赖氨酸聚合物以体积比为1：3的比例混合组成。
其中具有待表达的蛋白基因序列质粒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，构建基因载体，如图1所示载体采用环状质粒载体为基础，环状质粒载体的序列为序列表1所示，以环状质粒中的CMV(CMV enhancer+CMV promoter)为启动 子，含有Poly(A)，环状质粒载体的序列如序列表1所示，总长度为1293bp；
步骤二，在所述步骤一构建的基因载体上所述CMV启动子与所述Poly(A)之间插入待表达的蛋白基因序列，以插入荧光蛋白基因片段为例，其结构如图2所示，基因序列 如序列2所示。
用于如权利要求1所述的体内基因表达蛋白系统的转染剂的壳聚糖多聚赖氨酸聚合 物的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，将Sigma的低分子量壳聚糖进行高温高压处理，分两次120度40分钟，目的是得到分子量更低的壳聚糖，反应后，壳聚糖原液成深黄色；
步骤二，将所述步骤一种得到的所述壳聚糖和EDC/NHS混合后再加入多聚赖氨酸，所述壳聚糖、所述EDC/NHS、所述多聚赖氨酸的摩尔比例为1：1.5：1，利用磁力搅拌仪 搅拌，加速聚合反应，反应时间为48小时；
步骤三，对所述步骤二种含有聚合物的液体进行透析提纯，利用100Ka的透析袋，将反应物置于透析袋中，室温下至于超纯水中，每12小时更换一次，持续透析4天；
步骤四，将所述步骤三得到的透析产物进行进一步提纯，利用Millipore的超滤杯， 在100Ka超滤膜下进行超滤浓缩，得到最终产物壳聚糖多聚赖氨酸聚合物如图3所示。
实施例1
一、体外转染，以293T细胞为例：
第一步，在6孔细胞培养板中进行转染，将细胞按照5X105细胞/孔进行接种，加2-5ml 完全培养基(培养基+10％血清)，培养过夜；
第二步，取5μg的荧光质粒/孔，以体积比为1：3的比例和壳聚糖多聚赖氨酸聚合物混合，充分混匀；
第三步，再加入100μl的OMEM培养基，充分混匀；
第四步，再加入20μl的50％的PEG3350，充分混匀；
第五步，将混合物加入到六孔板的细胞培养体系中；
第六步，24小时后更换培养基；
第七步，持续观察48小时。
如图4所示，293T细胞经过转染后，24小时后观察，细胞表达荧光效率为30％左右，如图5所示，48小时后，细胞表达荧光效率可达到90％；
二、利用RT-PCR技术，检测细胞内部的EGFP的表达情况
提取转染后的细胞和未经过转染的细胞(阴性对照)中的总mRNA，反应的正向引物为5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC 3’(序列3)，反向引物为5’TTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAG 3’(序列4)。每个反应管中加入10ul的mRNA提取物， 混匀，离心后置入普通PCR仪器上进行扩增，扩增条件为表1所示：
表1扩增条件
如图6所示，利用琼脂凝胶电泳技术对比结果：永道1，阴性培养24小时，永道2， 加入质粒24小时；永道3，阴性培养48小时，永道4，加入质粒48小时。
两个流程结果显示，加入质粒转染的细胞，产生了EGFP目标蛋白的mRNA，结合细胞荧光实验结果，可以断定该方法可以把环状DNA导入到在体外培养的条件下的细胞中。
实施例2
一、体外转染，以293T细胞为例：
第一步，在6孔细胞培养板中进行转染，将细胞按照5X105细胞/孔进行接种，加2-5ml 完全培养基(培养基+10％血清)，培养过夜；
第二步，取5μg的荧光质粒/孔，以体积比为1：3的比例和壳聚糖多聚赖氨酸聚合物混合，充分混匀；
第三步，再加入100μl的OMEM培养基，充分混匀；
第四步，再加入20μl的DMSO，充分混匀；
第五步，将混合物加入到六孔板的细胞培养体系中；
第六步，24小时后更换培养基；
第七步，持续观察48小时。
如图7所示，293T细胞经过转染后，24小时后观察，细胞表达荧光效率为30％左右，如图8所示，48小时后，细胞表达荧光效率可达到70％。
二、利用RT-PCR技术，检测细胞内部的EGFP的表达情况
提取转染后的细胞和未经过转染的细胞(阴性对照)中的总mRNA，反应的正向引物为5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC 3’(序列3)，反向引物为5’TTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAG 3’(序列4)。每个反应管中加入10ul的mRNA提取物， 混匀，离心后置入普通PCR仪器上进行扩增，扩增条件如表2所示：
表2扩增条件
如图9所示，利用琼脂凝胶电泳技术对比结果：道1，阴性培养24小时，永道2， 加入质粒24小时；永道3，阴性培养48小时，永道4，加入质粒48小时。
两个流程结果显示，加入质粒转染的细胞，产生了EGFP目标蛋白的mRNA，结合细胞荧光实验结果，可以断定该方法可以把环状DNA导入到在体外培养的条件下的细胞中。
通过以上两种不同的缓冲液的配方的方法，可以将DNA的细胞转染效率维持在80％ 左右，并且细胞保持一定的活率(98％)。转染试剂效率高，毒性小，在对细胞转染时无需更换成无血清培养基，可在正常情况添加10％血清的情况下进行转染，有效的减少了工作环节。同时由于其毒性低，可利用基因编辑技术将目的片段取代EGFP基因，从而形成 特殊的环状DNA，利用该聚合物实现在动物或者人体内，侵入到细胞中，并实现目的蛋白 的表达。
实施例3
一、体内实验：
第一步，选用正常小鼠10只，进行培养；
第二步，9只按照质粒与体重比例的1ug/100mg的注射量，准备足够量的荧光质粒载 体；其中1只不注射，作为阴性对照。
第三步，将质粒与1ml的壳聚糖多聚赖氨酸聚合物混合，充分混匀；
第四步，将混合物从小鼠尾静脉注射入体内；
第五步，随后正常培养并进行观察；
第六步，分别于注射前，注射后3天，7，15天，30天后提取小鼠外周血
第七步，将提取出来的小鼠血液提取出来，并分离出血请，然后经过ELISA反应检测血清中EGFP的IgG抗体
三、EGFP蛋白表达实验：
利用Pet32表达系统，采用大肠杆菌BL21进行EGFP蛋白表达，并利用分子筛进行纯化，纯化后的蛋白在-80度冷冻保存，用于后期ELISA实验。
四、ELISA实验：
1、包被EGFP蛋白：用包被缓冲液稀释已准备好的EGFP蛋白至最适浓度(0.1～10ug/ml)，每凹孔加0.3ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。
2、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
3、每凹孔加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的含IgG抗体的被检小鼠血清，37℃作用1～ 2小时。
4、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
5、加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性识别小鼠IgG的FC片段的抗体溶液，37℃作用1～2小时或由预试实验确定作用时间。
6、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟。
7、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟(另作一空白对照，0.4ml底物加0.1ml终止剂)。
8、加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2M柠檬酸0.05ml。
9、观察记录结果：目测或用酶标比色计测定(OPD用492nm)OD值。
五、ELISA实验结果
如图10所示，图中横轴：T0：注射前；T3:注射后3天；T7:注射后7；T15：注射后 15天；T30：注射后30天
Negatif：阴性对照品，未注射小鼠血清IgG值；Positif：9只注射后小鼠血清IgG平均值
纵轴：检测出血清中的IgG含量，单位是ug/ml
实验结果如图10，未注射的小鼠，直到30天后，仍未检测出抗EGFP抗体，说明小 鼠免疫系统在无EGFP刺激下，无法启动产生相应的抗体。其他9只注射后的老鼠，在第 7天，就产生了抗EGFP的IgG抗体，随着时间的推移，在注射后的30天可以达到3.6ug/ml， 证明了含有EGFP基因片段的质粒载体，可以有效的表达目标蛋白，并同时可以刺激免疫 系统释放相关抗体。
可以将宠物传染性疾病(犬类：犬细小病毒，猫弓形虫，狂犬病，犬瘟热，犬钩端 螺旋体病，犬传染性肝炎，犬传染性支气管炎，犬副流感病等。猫科：猫泛白细胞减少 症，猫疱疹病毒感染，卡里西病毒感染，猫白血病，猫免疫缺陷病毒病，猫支气管炎博 德特菌感染，猫披衣菌感染，猫传染性腹膜炎等)，家禽传染性疾病(伪狂犬病病毒， 猪流感病毒，猪呼吸与繁殖综合征病毒，口蹄疫病毒，猪瘟病毒，牛呼吸道合胞体病毒， 牛病毒性腹泻病毒，新城疫病毒，鸡传染性喉气管炎病毒，禽流感病毒)，人传染性疾 病(例如：疟疾，白喉，脑膜炎，痢疾，登哥热，冠状病毒等)的特殊抗原通过基因编 辑技术嵌入到本发明的闭环双链DNA载体中，再利用壳聚糖多聚赖氨酸聚合物实现在目 标体内表达，从而形成诱导机体产生免疫应答，并最终成为一种新型的DNA疫苗。
同时也可以将功能性蛋白质的DNA序列(例如：人白介素-II，人白介素-10，干扰素，PD-1抑制抗体等其他蛋白药物)嵌入到本发明的闭环双链DNA载体中，再利用壳聚 糖多聚赖氨酸聚合物实现在目标体内(动物，人)表达，从而实现了该蛋白药物在体内 的释放和治疗相关适应症。
以上对本发明的两个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等， 均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 天津诺威百奥科技有限公司
<120> 一种用于体内基因表达蛋白系统的转染剂及其体外转染的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 1293
<212> DNA
<213> 载体环状质粒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattctgc 960
agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 1020
gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1080
ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 1140
cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 1200
gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag 1260
gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tat 1293
<210> 2
<211> 2067
<212> DNA
<213> 荧光质粒(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattctgc 960
agatatccag cacagtggcg gccgctcgag gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt 1020
gacgtggagg agaatcccgg ccctatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 1080
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gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 1200
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gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 1620
cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 1680
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agaaccagct ggggctctag ggggtat 2067
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 正向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
atggtgagca agggcgagga gctgttc 27
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 反向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
ttgtacagct cgtccatgcc gagag 25
Claims (8)
1.一种用于体内基因表达蛋白系统的转染剂，其特征在于：由具有待表达的蛋白基因序列质粒和壳聚糖多聚赖氨酸聚合物以体积比为1：3的比例混合组成。
2.用于如权利要求1所述的体内基因表达蛋白系统的转染剂的具有待表达的蛋白基因序列质粒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一，构建基因载体；
步骤二，将待表达的蛋白基因序列插入到所述步骤一构建的基因载体中。
3.根据权利要求2具有待表达的蛋白基因序列质粒的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，载体采用环状质粒载体为基础，以环状质粒中的CMV为启动子，含有Poly(A)。
4.根据权利要求3具有待表达的蛋白基因序列质粒的制备方法，其特征在于：所述步骤二中在所述步骤一构建的基因载体上所述CMV启动子与所述Poly(A)之间插入待表达的蛋白基因序列。
5.用于如权利要求1所述的体内基因表达蛋白系统的转染剂的壳聚糖多聚赖氨酸聚合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一，将Sigma的低分子量壳聚糖进行高温高压处理，分两次120度40分钟，目的是得到分子量更低的壳聚糖，反应后，壳聚糖原液成深黄色；
步骤二，将所述步骤一种得到的所述壳聚糖和EDC/NHS混合后再加入多聚赖氨酸，所述壳聚糖、所述EDC/NHS、所述多聚赖氨酸的摩尔比例为1：1.5：1，利用磁力搅拌仪搅拌，加速聚合反应，反应时间为48小时；
步骤三，对所述步骤二种含有聚合物的液体进行透析提纯，利用100Ka的透析袋，将反应物置于透析袋中，室温下至于超纯水中，每12小时更换一次，持续透析4天；
步骤四，将所述步骤三得到的透析产物进行进一步提纯，利用Millipore的超滤杯，在100Ka超滤膜下进行超滤浓缩，得到最终产物壳聚糖多聚赖氨酸聚合物。
6.利用如权利要求1所述的体内基因表达蛋白系统的转染剂进行体外转染的方法，其特征在于：包括如下步骤：
第一步，对细胞进行接种，加完全培养基培养过夜；
第二步，以体积比为1：3的比例将具有待表达的蛋白基因序列质粒和壳聚糖多聚赖氨酸聚合物混合，充分混匀；
第三步，向所述第二步的混合液中加入培养基，充分混匀；
第四步，将所述第三步中的混合液加入到所述第一步中细胞培养体系中，培养24h；
第五步，更换培养基，持续观察48h至培养完毕。
7.根据如权利要求6所述的转染表达系统进行体外转染的方法，其特征在于：所述第三步加入的培养基为100μl的OMEM和20μl的DMSO。
8.根据如权利要求6所述的转染表达系统进行体外转染的方法，其特征在于：所述第三步加入的培养基为100μl的OMEM和20μl的50％的PEG3350。
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| CN111518836A true CN111518836A (zh) | 2020-08-11 |
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| CN202010196888.6A Pending CN111518836A (zh) | 2020-03-19 | 2020-03-19 | 一种用于体内基因表达蛋白系统的转染剂及其体外转染的方法 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106589391A (zh) * | 2016-12-16 | 2017-04-26 | 天津商业大学 | 壳聚糖/聚赖氨酸树状大分子核壳纳米粒及其制备方法 |
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2020
- 2020-03-19 CN CN202010196888.6A patent/CN111518836A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106589391A (zh) * | 2016-12-16 | 2017-04-26 | 天津商业大学 | 壳聚糖/聚赖氨酸树状大分子核壳纳米粒及其制备方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
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