CN116726197A - 多肽-脂质体纳米复合颗粒及制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多肽‑脂质体纳米复合颗粒及制备方法及应用,多肽‑脂质体纳米复合颗粒的制备方法为：将多肽溶于乙醇水溶液中，得到多肽溶液；将脂质体溶于乙醇水溶液中，得到脂质体溶液；将多肽溶液加入脂质体溶液中，孵育，得到多肽‑脂质体纳米复合颗粒；本发明的多肽‑脂质体纳米复合颗粒具有生物安全性高、转染效率高等优点，与已知的PEI等阳离子聚合物和商用的脂质体相比，本发明的多肽‑脂质体纳米复合颗粒细胞毒性低，价格低廉。本发明的多肽‑脂质体纳米复合颗粒通过相对简单混合的方式与siRNA、质粒DNA或mRNA等核酸药物分子自组装成尺寸均匀的纳米颗粒，以此实现有效地基因递送。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种多肽-脂质体纳米复合颗粒及制备方法及应用。
背景技术
核酸药物(包括：siRNA、DNA、mRNA)作为一种新型生物药物，受到了极大的关注。与小分子化药和抗体药物相比，核酸类药物不是通过结合生物体靶点蛋白质，而是直接作用于突变基因并对其进行调节，并且具有高特异性、强效性、低毒性、易于设计和不具有耐药性等优点。1998年，美国食品药品监督管理局批准上市了首个核酸药物VitraveneTM，此后多个核酸药物相继获准进入临床试验，自此掀起了核酸药物研究的热潮。此外，2019年以来，mRNA疫苗在全球防治新型冠状病毒方面发挥着重要作用，其机理在于将mRNA递送到细胞内，在人体内表达相应蛋白，从而激活体内免疫系统，提高免疫能力。mRNA疫苗与传统灭活疫苗、减毒疫苗相比，生产时间短，安全性高。
但是核酸药物在实际应用过程中也存在一些问题，例如稳定性较差、易受RNA酶降解、难以直接穿过细胞屏障发挥活性。因此，研发安全高效的核酸递送系统成为一种必然的趋势。研究人员已经致力于研究和开发多功能核酸药物递送载体，希望利用载体技术提高核酸药物的稳定性和细胞摄取率，以达到基因药物在特定部位发挥功效的目的。病毒载体能够有效地感染宿主细胞，成为基因治疗的热门选择，因此，病毒载体(例如腺病毒)在基因核酸治疗领域取得许多进展，然而病毒本身存在较高的细胞毒性，具有免疫原性，容易引发炎症，价格昂贵等缺陷，又进一步阻碍了其发展。非病毒基因递送系统由于低免疫原性，具有被大规模生产的潜力，故作为病毒方法的替代方案被广泛研究。非病毒载体递送系统包括脂质体、多肽、阳离子聚合物等。脂质体是最为普遍应用的非病毒递送载体，它可以通过静电作用与核酸药物中带负电的磷酸基团结合，形成纳米颗粒，并将核酸药物递送到相应的部位，但存在细胞毒性较高、靶向性差等缺点。多肽分子由天然氨基酸构成，具有低毒性，生物兼容性高，结构可调等优点，展现出作为基因载体的应用前景，但是单纯多肽分子递送核酸药物的效率普遍较低。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种生物相容性高、细胞毒性低、安全性高的多肽-脂质体纳米复合颗粒。
本发明的第二个目的是提供一种多肽-脂质体纳米复合颗粒的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种多肽-脂质体纳米复合颗粒在制备核酸递送系统的应用。
本发明的技术方案概述如下：
多肽-脂质体纳米复合颗粒的制备方法，包括如下步骤：将多肽溶于乙醇水溶液中，得到浓度为0.1-1mg/ml的溶液为多肽溶液；将脂质体溶于乙醇水溶液中，得到浓度为0.1-1mg/ml的溶液为脂质体溶液；将多肽溶液加入脂质体溶液中，30℃-45℃下孵育20-40min，得到多肽-脂质体纳米复合颗粒；
多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
优选地，乙醇水溶液的浓度为30％-98％。
优选地，脂质体为(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)、二油酰丙基氯化三甲铵(DOTMA)、双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
优选地，多肽溶液和脂质体溶液的体积比为17：(2-6)。
上述制备方法制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒。
上述多肽-脂质体纳米复合颗粒在制备核酸递送系统的应用。
上述应用包括如下步骤：将多肽-脂质体纳米复合颗粒与核酸混合，在室温下组装反应30-45min，得到核酸递送系统。
核酸为siRNA、质粒DNA或mRNA。
本发明的优点:
(1)本发明的多肽-脂质体纳米复合颗粒具有生物安全性高、转染效率高等优点，与市场上广泛应用的PEI等阳离子聚合物和商用的脂质体相比，本发明的多肽-脂质体纳米复合颗粒细胞毒性低，价格低廉。
(2)本发明的多肽-脂质体纳米复合颗粒通过相对简单混合的方式与siRNA、质粒DNA或mRNA等核酸药物分子自组装成尺寸均匀的纳米颗粒，以此实现有效地基因递送。
附图说明
图1为实施例1、2和3中多肽的质谱图。
图2为实施例1、2和3中多肽的液相色谱图。
图3为实施例1,2和3制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒在不同N/P(N/P为2、6、10、15、20)下包裹pEGFP-N1质粒的核酸凝胶电泳图。
图4为实施例4获得的核酸递送系统的纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)图片。
图5为实施例4、5和6中制备的基于多肽-脂质体纳米复合颗粒的核酸递送系统1、2和3转染HEK 293T细胞的倒置荧光显微镜图。
图6为实施例4、5和6中制备的基于多肽-脂质体纳米复合颗粒的核酸递送系统1、2和3在转染HEK 293T细胞后的流式细胞图，横坐标表示绿色荧光蛋白强度，纵坐标表示细胞数量。
图7为实施例1制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒的细胞毒性分析图。
具体实施方式
下面各实施例中的多肽序列委托吉尔生化(上海)有限公司生产制备。
分别使用美国布鲁克道尔顿公司的miorOTOF-QII型液相色谱-高分辨四极杆飞行时间串联质谱联用和美国Agilent公司的1200型液相色谱仪测试多肽的纯度，
图1中显示相对分子质量与理论相对分子质量吻合。
图2中显示多肽纯度分别为96.18％，98.89％和98.82％，表明合成的多肽满足实验需求。
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。对本发明内容所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
脂质体选用广泛应用的商业化脂质体如：(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)、二油酰丙基氯化三甲铵(DOTMA)、双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)或脂质体二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
多肽-脂质体纳米复合颗粒的制备方法，包括如下步骤：
将多肽(SEQ ID NO.1)溶于体积浓度75％的乙醇水溶液中，得到浓度为1mg/ml的溶液为多肽溶液；将脂质体(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)溶于体积浓度75％的乙醇水溶液中，得到浓度为1mg/ml的溶液为脂质体溶液；按体积比为17：3的比例将多肽溶液加入脂质体溶液中，37℃下孵育35min，得到多肽-脂质体纳米复合颗粒；
多肽的氨基酸序列为KKKKHHHHLLLLLL(SEQ ID NO.1)，其中的KKKK为阳离子多肽片段；HHHH为协助内含体逃逸片段，LLLLLL为疏水片段。见图1a、图2a。
实施例2
多肽-脂质体纳米复合颗粒的制备方法，包括如下步骤：
将多肽(SEQ ID NO.2)溶于体积浓度75％的乙醇水溶液中，得到浓度为1mg/ml的溶液为多肽溶液；将脂质体(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)溶于体积浓度75％的乙醇水溶液中，得到浓度为1mg/ml的溶液为脂质体溶液；按体积比为17：5的比例将多肽溶液加入脂质体溶液中，37℃下孵育35min，得到多肽-脂质体纳米复合颗粒；
多肽的氨基酸序列为KKKKHHHHFFFFFF(SEQ ID NO.2)其中的KKKK为阳离子多肽片段；HHHH为协助内含体逃逸片段，FFFFFF为疏水片段。见图1b、图2b。
实施例3
多肽-脂质体纳米复合颗粒的制备方法，包括如下步骤：
将多肽(SEQ ID NO.3)溶于体积浓度75％的乙醇水溶液中，得到浓度为1mg/ml的溶液为多肽溶液；将脂质体(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)溶于体积浓度75％的乙醇水溶液中，得到浓度为1mg/ml的溶液为脂质体溶液；按体积比为17：5的比例将多肽溶液加入脂质体溶液中，37℃下孵育35min，得到多肽-脂质体纳米复合颗粒；
多肽的氨基酸序列为KKKKLLLLLLHHHH(SEQ ID NO.3)其中的KKKK为阳离子多肽片段；HHHH为协助内含体逃逸片段，LLLLLL为疏水片段。见图1c、图2c。
实施例4
多肽-脂质体纳米复合颗粒在制备核酸递送系统的应用，包括如下步骤：
将实施例1制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒与浓度为500ng/μL核酸药物pEGFP-N1质粒(绿色荧光蛋白基因质粒)混合，使多肽-脂质体纳米复合颗粒中多肽质子化氮与核酸药物中的磷酸基团的摩尔比(N/P)为15；在室温下组装反应40min，得到核酸递送系统1。
pEGFP-N1质粒(绿色荧光蛋白基因质粒)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，购自于美国Clontech公司，来源于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DH-5α。
实施例5
多肽-脂质体纳米复合颗粒在制备核酸递送系统的应用，包括如下步骤：
将实施例1制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒与浓度为20μM核酸药物(羧基荧光素(FAM)标记的siRNA)(溶剂为无核酸酶水)混合，N/P＝15；在室温下组装反应30min，得到核酸递送系统2。
羧基荧光素(FAM)标记的siRNA，以无核酸酶水为溶剂，配成浓度为20μM的溶液具体步骤为：将0.5OD的羧基荧光素(FAM)标记的siRNA在4000转/分钟的转速下离心1分钟，加入75ul的无核酸酶水振荡溶解，即得。
siRNA序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，购自于上海吉玛制药技术有限公司。
实施例6
多肽-脂质体纳米复合颗粒在制备核酸递送系统的应用，包括如下步骤：
将实施例1制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒混合与浓度为1μg/μL核酸药物EGFPmRNA(增强型绿色荧光蛋白信使RNA)混合，使N/P＝15；在室温下组装反应45min，得到核酸递送系统3。
EGFP mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，人工合成，购自美国TriLinkBioTechnologies公司。
实施例7
多肽-脂质体纳米复合颗粒在制备核酸递送系统的应用，包括如下步骤：
实施例2制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒与浓度为500ng/μL核酸药物pEGFP-N1质粒(绿色荧光蛋白基因质粒)混合，使N/P＝20；在室温下组装反应40min，得到核酸递送系统4。
本实施例制备的核酸递送系统4的转染效率所实施例4制备的核酸递送系统1的转染效率相似。
实施例8
多肽-脂质体纳米复合颗粒在制备核酸递送系统的应用，包括如下步骤：
实施例3制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒与浓度为500ng/μL核酸药物pEGFP-N1质粒(绿色荧光蛋白基因质粒)混合，使使N/P＝20；在室温下组装反应40min，得到核酸递送系统5。
本实施例制备的核酸递送系统5的转染效率所实施例4制备的核酸递送系统1的转染效率相似。
实施例9
利用核酸凝胶电泳仪探究多肽-脂质体纳米复合颗粒与核酸的结合能力
(1)将1μL(500ng/μL)的pEGFP-N1质粒溶液与不同N/P摩尔比实施例1制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒，混匀，加入无核酸酶水稀释至终体积为50μL，25℃下静置40min。
(2)称取0.8g琼脂糖置于三角瓶中，加入80mL的1×TAE缓冲液，加热至完全溶解，配制1％的凝胶溶液.待液体冷却至50℃左右，加入5μL溴化乙锭(EtBr，EB)，充分混合后倒入插好梳子的模具制胶。当凝胶完全凝固后，小心取下琼脂糖凝胶并放入电泳槽中，使槽中的TAE缓冲液刚好没过胶面，然后向40μL基于(1)中加入5μL的6×loading buffer，混合均匀后加入到凝胶的样品孔中，并加入裸DNA作为对照。凝胶电泳仪在125V的电压运行25min，取出凝胶后在紫外光照射下对凝胶进行可视化成像。结果见图3a。从图3a上可以看出N/P比可以选2、6、10、15、20。
实施例10
利用核酸凝胶电泳仪探究多肽-脂质体纳米复合颗粒与核酸的结合能力
(1)将1μL(500ng/μL)的pEGFP-N1质粒溶液与不同N/P摩尔比实施例2制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒，混匀，加入无核酸酶水稀释至终体积为50μL，25℃下静置40min。
(2)同实施例9中的步骤(2)，结果见图3b。
实施例11
利用核酸凝胶电泳仪探究多肽-脂质体纳米复合颗粒与核酸的结合能力
(1)将1μL(500ng/μL)的pEGFP-N1质粒溶液与不同N/P摩尔比实施例3制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒，混匀，加入无核酸酶水稀释至终体积为50μL，25℃下静置40min。
(2)同实施例9中的步骤(2)，结果见图3c。
实施例12
实施例4制备的核酸递送系统1的表征：
利用场发射透射电子显微JEM-2100F原位观察核酸递送系统1的形貌结构。使用移液枪吸取10μL核酸递送系统1，滴在300目铜网(碳膜载网)表面，静置2min，然后用滤纸除去铜网表面粘附的液体，在25℃下自然干燥。用质量浓度1％的磷钨酸水溶液(pH＝6.5)负染处理后，在加速电压为80kV的透射电子显微镜下观察，从图4中可以看到核酸递送系统1，直径大小在200nm左右。
用核酸递送系统2、3、4、5、6、7分别替代本实施例中的核酸递送系统1，其它同本实施例，在加速电压为80kV的透射电子显微镜下观察，核酸递送系统2、3、4、5、6、7直径大小在200nm左右。
实施例13
实施例4制备的核酸递送系统1的转染效率：
(1)将HEK 293T细胞(市售)用含10％胎牛血清和1％双抗(青霉素和链霉素的混合溶液)的DMEM高糖培养基在5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养，直到细胞对数生长期。将处于对数生长期的状态良好的细胞用上述DMEM高糖培养基重悬，按5×104个/孔的细胞密度接种到12孔板内，在5％CO2、37℃的细胞培养箱中过夜，待细胞密度约为70％-80％时才能进行转染。转染前，吸去培养基，用PBS(1×，pH＝7.4)洗两次，然后每孔加入900μL的Opti-MEM培养基。
(2)转染方法如下：将浓度为500ng/μL核酸药物pEGFP-N1质粒(绿色荧光蛋白基因质粒)加入实施例1制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒混合，使多肽-脂质体纳米复合颗粒中多肽质子化氮与核酸药物中的磷酸基团的摩尔比为15；在室温下组装反应40min，得到核酸递送系统1，加入无核酸酶水稀释到终体积为40μL，在室温下静置35min后加入到含900μLOpti-MEM培养基的培养孔中，轻轻摇动细胞培养板，使其混合均匀。4h后将Opti-MEM培养基吸走，加入上述DMEM高糖培养基培养24h；
(3)在倒置荧光显微镜下观察，实验结果见图5a。
(4)设置空白与实验组，不处理空白组细胞，实验组细胞用(2)方法转染。用PBS反复清洗三次，接着进行细胞处理计数，用细胞洗液(含2％BSA的PBS)重悬细胞，使细胞浓度为1×107/mL。取100-200μL细胞重悬液，用流式细胞仪(FACSCalibur)检测细胞内荧光强度，见图6a。
实施例14
实施例5制备的核酸递送系统2的转染效率：
(1)同实施例13步骤(1)；
(2)转染方法如下：将20μM核酸药物羧基荧光素(FAM)标记的siRNA加入实施例1制备的一种多肽-脂质体纳米复合颗粒中，使多肽质子化氮与核酸药物中的磷酸基团的摩尔比为15；在室温下组装反应30min，得到核酸递送系统2，加入无核酸酶水稀释到终体积为40μL，在室温下静置35min后加入到含900μL Opti-MEM培养基的培养孔中，轻轻摇动细胞培养板，使其混合均匀。4h后将Opti-MEM培养基吸走；
(3)在倒置荧光显微镜下观察，实验结果见图5b。
(4)设置空白与实验组，不处理空白组细胞，实验组细胞用(2)方法转染。用PBS反复清洗三次，接着进行细胞处理计数，用细胞洗液(含2％BSA的PBS)重悬细胞，使细胞浓度为1×107/mL。取100-200μL细胞重悬液，用流式细胞仪(FACSCalibur)检测细胞内荧光强度，见图6b。
实施例15
实施例6制备的核酸递送系统3的转染效率：
(1)同实施例13步骤(1)；
(2)转染方法如下：将浓度1μg/μL核酸药物EGFP mRNA(增强型绿色荧光蛋白信使RNA)加入实施例1制备的一种多肽-脂质体纳米复合颗粒中，使多肽质子化氮与核酸药物中的磷酸基团的摩尔比为15；在室温下组装反应45min，得到核酸递送系统3，加入无核酸酶水稀释到终体积为40μL，在室温下静置35min后加入到含900μL Opti-MEM培养基的培养孔中，轻轻摇动细胞培养板，使其混合均匀。4h后将Opti-MEM培养基吸走，加入上述DMEM高糖培养基培养24h；
(3)在倒置荧光显微镜下观察，实验结果见图5c。
(4)设置空白与实验组，不处理空白组细胞，实验组细胞用(2)方法转染。用PBS反复清洗三次，接着进行细胞处理计数，用细胞洗液(含2％BSA的PBS)重悬细胞，使细胞浓度为1×107/mL。取100-200μL细胞重悬液，用流式细胞仪(FACSCalibur)检测细胞内荧光强度，见图6c。
实施例16
CCK8细胞毒性实验：
将HEK 293T细胞用含10％胎牛血清和1％双抗(青霉素和链霉素混合溶液)的DMEM高糖培养基在5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养至对数生长期。将对数生长期的细胞用上述培养基重悬，按5×104个/孔的细胞密度接种到96孔板内，在5％CO2、37℃的细胞培养箱中过夜，在细胞贴壁之后，将其与不同浓度的实施例1制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒，在37℃下孵育24小时。然后将10μl Cell Counting Kit-8溶液添加到每个孔中。1小时后，使用酶标仪在25℃下测量450nm处的吸光度。对每个样品进行五次重复测定，见图7，发现多肽-脂质体纳米复合颗粒细胞毒性低，生物相容性较好。
如上述实验步骤，实施例2和实施例3制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒的细胞毒性与实施例1的毒性相似。
实施例17
多肽-脂质体纳米复合颗粒的制备方法，包括如下步骤：
将多肽(SEQ ID NO.1)溶于体积浓度30％的乙醇水溶液中，得到浓度为0.1mg/ml的溶液为多肽溶液；将脂质体二油酰丙基氯化三甲铵(DOTMA)溶于体积浓度30％的乙醇水溶液中，得到浓度为0.1mg/ml的溶液为脂质体溶液；按体积比为17：2的比例将多肽溶液加入脂质体溶液中，30℃下孵育40min，得到多肽-脂质体纳米复合颗粒。
用本实施例制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒替代实施例4中的实施例1制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒，其它同实施例4，制备获得核酸递送系统6。
本实施例制备的核酸递送系统6的转染效率与实施例4制备的核酸递送系统1的转染效率相似。
实施例18
多肽-脂质体纳米复合颗粒的制备方法，包括如下步骤：
将多肽(SEQ ID NO.1)溶于体积浓度98％的乙醇水溶液中，得到浓度为0.5mg/ml的溶液为多肽溶液；将脂质体二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(也可以用双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB))溶于体积浓度98％的乙醇水溶液中，得到浓度为0.5mg/ml的溶液为脂质体溶液；按体积比为17：6的比例将多肽溶液加入脂质体溶液中，45℃下孵育20min，得到多肽-脂质体纳米复合颗粒；
用本实施例制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒替代实施例4中的实施例1制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒，其它同实施例4，制备获得核酸递送系统7。
本实施例制备的核酸递送系统7的转染效率与实施例4制备的核酸递送系统1的转染效率相似。
序列表
<110> 天津大学
<120> 多肽-脂质体纳米复合颗粒及制备方法及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Lys Lys Lys Lys His His His His Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Lys Lys Lys His His His His Phe Phe Phe Phe Phe Phe
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Lys Lys Lys Lys Leu Leu Leu Leu Leu Leu His His His His
1 5 10
<210> 4
<211> 2048
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 4
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600
ccggactcag atctcgagct caagcttcga attctgcagt cgacggtacc gcgggcccgg 660
gatccaccgg tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 720
atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 780
gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 840
cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 900
taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 960
caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag 1020
ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac 1080
ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 1140
gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 1200
ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 1260
ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 1320
aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 1380
gacgagctgt acaagtaaag cggccgcgac tctagatcat aatcagccat accacatttg 1440
tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa 1500
tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 1560
atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 1620
ccaaactcat caatgtatct taaggcgtaa attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc 1680
gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 1740
ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 1800
agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 1860
gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 1920
gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 1980
aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 2040
gtagcggt 2048
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggcccagat ctcagtggat ataaattcaa gagatttata tccactgaga tcttttttga 60
attc 64
<210> 6
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaattcaaaa aagatctcag tggatataaa tctcttgaat ttatatccac tgagatctgg 60
gccc 64
<210> 7
<211> 720
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
auggugagca agggcgagga gcuguucacc gggguggugc ccauccuggu cgagcuggac 60
ggcgacguaa acggccacaa guucagcgug uccggcgagg gcgagggcga ugccaccuac 120
ggcaagcuga cccugaaguu caucugcacc accggcaagc ugcccgugcc cuggcccacc 180
cucgugacca cccugaccua cggcgugcag ugcuucagcc gcuaccccga ccacaugaag 240
cagcacgacu ucuucaaguc cgccaugccc gaaggcuacg uccaggagcg caccaucuuc 300
uucaaggacg acggcaacua caagacccgc gccgagguga aguucgaggg cgacacccug 360
gugaaccgca ucgagcugaa gggcaucgac uucaaggagg acggcaacau ccuggggcac 420
aagcuggagu acaacuacaa cagccacaac gucuauauca uggccgacaa gcagaagaac 480
ggcaucaagg ugaacuucaa gauccgccac aacaucgagg acggcagcgu gcagcucgcc 540
gaccacuacc agcagaacac ccccaucggc gacggccccg ugcugcugcc cgacaaccac 600
uaccugagca cccaguccgc ccugagcaaa gaccccaacg agaagcgcga ucacaugguc 660
cugcuggagu ucgugaccgc cgccgggauc acucucggca uggacgagcu guacaaguaa 720
Claims (8)
1.多肽-脂质体纳米复合颗粒的制备方法，其特征是包括如下步骤：将多肽溶于乙醇水溶液中，得到浓度为0.1-1mg/ml的溶液为多肽溶液；将脂质体溶于乙醇水溶液中，得到浓度为0.1-1mg/ml的溶液为脂质体溶液；将多肽溶液加入脂质体溶液中，30℃-45℃下孵育20-40min，得到多肽-脂质体纳米复合颗粒；
所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征是所述乙醇水溶液的浓度为30％-98％。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征是所述脂质体为(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、二油酰丙基氯化三甲铵、双十八烷基二甲基溴化铵或二油酰磷脂酰乙醇胺。
4.根据权利要求1、2或3所述制备方法，其特征是所述多肽溶液和脂质体溶液的体积比为17：(2-6)。
5.权利要求1-4之一的制备方法制备的多肽-脂质体纳米复合颗粒。
6.权利要求5的多肽-脂质体纳米复合颗粒在制备核酸递送系统的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征是包括如下步骤：将多肽-脂质体纳米复合颗粒与核酸混合，在室温下组装反应30-45min，得到核酸递送系统。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征是所述核酸为siRNA、质粒DNA或mRNA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210707113.XA CN116726197A (zh) | 2022-06-21 | 2022-06-21 | 多肽-脂质体纳米复合颗粒及制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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