CN112961219B - 重组腺相关病毒、其突变体及其构建方法和应用 - Google Patents

重组腺相关病毒、其突变体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了重组腺相关病毒、其突变体及其构建方法和应用。本发明首先提供了包含rep cassette、cap cassette和ITRs cassette的重组腺相关病毒载体。本发明进一步将腺相关病毒的rep cassette进行单位点突变、双位点突变或多位点突变得到包装效率显著提高的系列突变体。本发明进一步提供了包含所述rep cassette的突变体的重组腺相关病毒载体以及构建方法。本发明所提供的重组腺相关病毒表达效率高，用这种病毒粒子向细胞中呈递基因比传统的病毒粒子更高，能够将目的基因高效呈递至细胞和脊椎动物体内，可作为基因呈递载体用于制备基因治疗药物。

Description

重组腺相关病毒、其突变体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及腺相关病毒，尤其涉及重组腺相关病毒、突变体及其构建方法，本发明进一步涉及它们在基因治疗中的应用，属于重组腺相关病毒及其应用领域。
背景技术
腺相关病毒是一种单链DNA病毒，属于细小病毒家族的依赖病毒属。1965年作为腺病毒制备物中的一种污染成分首次被发现。作为一种缺陷型病毒，通常需要腺病毒或单纯疱疹病毒等才产生毒性感染，在可在哺乳动物细胞中长期潜伏感染。
野生型AAV可以被改造成为重组载体，并能够携带外源基因，只需将病毒基因组两端的ITRs 保留，rep和cap可以被外源基因所替代，通过其它方法携带rep和cap基因，从而反式提供这两种蛋白的功能，目前包装rAAV的方式主要有三种，质粒转染、构建稳定的细胞系和通过杆状病毒表达系统来包装。杆状病毒表达系统因其启动子可以对表达的蛋白进行加工修饰、且能够扩大生产规模，很早就被用来进行rAAV的生产，被EMA批准进入欧洲市场的Glybera就是用该系统生产的，常用AcNPV表达系统和BmNPV表达系统。早在几十年前，BEVS已被用于工业中大量生产重组蛋白，是一种较为经济可行的平台，可以用于生产rAAV病毒颗粒。即便如此，上述 AcNPV-sf9细胞表达系统由于细胞培养的成本偏高，而导致病毒载体制备的价格昂贵。第一个商品化的AAV产品Glybera，它的单次治愈剂量的标价最初高达160万美元；美国获批的AAV产品Luxturna的销售定价为85万美元。所以生产成本是限制AAV作为基因治疗载体的关键因素之一。从生产成本看，据报道，仅用5个蚕蛹的外源蛋白的表达量相当于1升昆虫细胞的表达量，在家蚕幼虫的血淋巴中各类基因的表达量分别是sf细胞表达量的几十甚至上百倍。生产成本比细胞低几百倍，而且昆虫细胞培养的成本远远高于家蚕饲养成本。从安全性来看，家蚕作为鳞翅目昆虫，已经列入食品目录，僵蚕作为我国传统的名贵中药，已经被列入卫生部中药名录，这些都表明用家蚕杆状病毒表达系统生产rAAV的安全性是有保证的，且已成功利用三杆状病毒表达系统包装出rAAV，经过验证，具有感染哺乳动物并驱动目的基因表达的能力，不仅具有AcNPV-sf 系统的优点，而且表达量更高，生产成本低几百倍，所以BmNPV-家蚕杆状病毒表达系统是一个潜力巨大的rAAV生产系统，其安全性和生产成本较低使其成为比较理想的rAAV生产系统，但其后续产品纯化技术还需进一步摸索，应用家蚕杆状病毒表达系统生产rAAV为解决目前因生产成本过高而限制AAV载体在基因治疗中应用的问题提供一种新思路，构建各型AAV的生产平台，能快速、高效地生产含各种目的基因的rAAV，这对rAAV更好的应用于基因治疗具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种包含rep cassette、cap cassette或ITRscassette的重组腺相关病毒载体；
本发明的目的之二是将腺相关病毒的rep cassette进行单位点突变、双位点突变或多位点突变得到包装效率显著提高的重组腺相关病毒系列突变体；
本发明的目的之三提供包含所述rep cassette的突变体的重组腺相关病毒载体；
本发明的目的之四是提供所述重组腺相关病毒载体的构建方法；
本发明的目的之五是将所述重组腺相关病毒载体作为基因呈递载体应用于制备基因治疗药物。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：
本发明首先提供了一种重组腺相关病毒载体，包括rep cassette，cap cassette以及ITRs cassette；
其中，所述rep蛋白属于Ⅱ型腺相关病毒，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；
所述的cap cassette的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；
本发明所提供的重组腺相关病毒的ITRs cassette的核苷酸序列为NC_001401.2所示，为了后期检测方面，将荧光素酶编码基因、绿色荧光蛋白编码基因和脂蛋白脂肪酶编码基因插入至ITRs 序列中间，其中荧光素酶的核苷酸序列为MN519522.1所示，氨基酸序列为QKR72420.1所示；绿色荧光蛋白编码基因的核苷酸序列为JQ064510.1所示，氨基酸序列为AFA52654.1所示；脂蛋白脂肪酶编码基因为NM_000237.3所示，其氨基酸序列为NP_000228.1所示；其中，ITRs-Luc cassette的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。
具体的，本发明人分析了商品化腺相关病毒的序列，选择NCBI中登录号为NC_001401.2的Ⅱ型血清型的腺相关病毒序列，作为腺相关病毒的rep、cap和ITR cassette，在此基础上，本发明进一步在rep序列的5‘端加上BglⅡ序列和Kozak序列，在rep基因530位处加入intron序列，3’端加上HSV poly A序列，终止密码子和XbaⅠ序列，即得rep cassette；在cap序列5’端插入家蚕polh 启动子序列、kozak序列和Bam H I，在cap基因25位处加入intron序列，在3‘端加入终止密码子、BGH polyA和EcoRⅠ序列，即得cap cassette；为后期方便检测所获得腺相关病毒的完整性和表达效率，选择Luciferase、EGFP和LPL基因作为目的基因，并在ITR序列中间插入CMV启动子和多克隆位点，尾部插入SV40 polyA，在ITR序列两端插入EcoRV和BglⅡ序列，即得ITRs-Luc cassette、ITRs-EGFP cassette和ITRs-LPLcassette；最终，按照上述的方法得到的rep cassette的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所述，cap cassette的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，ITRs cassette的核苷酸序列为SEQID NO.5所示。
本发明将SEQ ID NO.1所述的rep cassette，SEQ ID NO.2所示的cap cassette和SEQ ID NO.3 所示的ITRs cassette克隆进pVL1393载体中制备重组转移载体，得到三种重组杆状病毒。
本发明将上述三种重组杆状病毒等比例混合感染家蚕细胞或宿主，得到包装良好的重组腺相关病毒。
本发明为了提高重组腺相关病毒的表达效率，进一步将SEQ ID NO.1所示的repcassette进行单位点突变，双位点突变或多位点突变以提高其表达效率。本发明以重组腺相关病毒载体中rep cassette的基因序列为模板，设计多对引物对rep序列进行定点突变：
将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照W29G、F63S、P163T、P281C、A313Y、P440T、F458C、 V486G、V508W或L569T的氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体；本发明将突变后的这些单位点突变体在家蚕表达系统中进行表达，根据qPCR结果可见：将SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列按照F63S、P281C、F458C、V486G的氨基酸单位点突变方式获得的4个突变体的病毒拷贝数显著提升。
本发明所述的氨基酸单位点突变“V486G”表示将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列的第 486位氨基酸由缬氨酸(V)突变成甘氨酸(G),其余的单位点突变的表述依此类推。
基于所确定的部分单位点的突变是有效突变，可以达到提高重组腺相关病毒载体的表达效率的目的。考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构并决定着蛋白质的高级结构，且上述进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置可能是相互关联的，本发明进一步进行氨基酸双位点突变。本发明将可以提高表达量的单突变位点F63S、P281C、F458C、V486G两两组合进行双位点突变，具体如下：将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照F63S-P281C、F63S-F458C、 F63S-V486G、P281C-F458C、P281C-V486G、F458C-V486G的氨基酸双位点突变方式获得6个双位点突变体；本发明将获得的6个双位点突变体分别在家蚕表达系统中进行表达，根据qPCR结果可见：将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照F63S-P281C、P281C-V486G的氨基酸双位点突变方式获得的2个位点突变体的目的基因的拷贝数显著提升，其中，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸按照P281C-V486G氨基酸双位点突变获得的突变体的目的基因拷贝数提升最为显著。
本发明所述的氨基酸双位点突变“P281C-V486G”表示将氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示序列的第281位氨基酸由脯氨酸(P)突变成半胱氨酸(C)同时将第486位氨基酸由由缬氨酸(V) 突变成甘氨酸(G)；其余的双位点突变的表述依此类推。
鉴于部分双位点突变能够有效提升表达量后效价，考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构，并决定着蛋白质的高级结构，推测可能是由于进行的氨基酸单位点突变有部分突变点的位置相互靠近彼此关联的，本发明进一步尝试进行氨基酸多位点突变。本发明通过分析糖基化位点，得出6个单突变位点能有效提高目的基因的表达量，因此多位点突变是基于上述获得有效的双位点突变序列的基础之上，通过融合PCR的方法进行多突变位点的定点突变，具体突变方式如下：
将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照F63S-P281C-V486G氨基酸多位点突变方式获得多位点突变体；本发明将获得的多位点突变体在家蚕表达系统中进行表达，根据qPCR结果可见：所得的多位点突变体目的基因的拷贝数相比上述单突变体、双突变体的表达量均有显著提升；
如果突变发生在相应的转录和编码蛋白质内，理论上应牵涉到所有涉及到突变的相应蛋白质，以下不作一一说明。
本发明将上述多位点突变的rep cassette和SEQ ID NO.2所述的cap cassette分别插入至Bm NPV的p10和egt位点，制备包含rep cassette和cap cassette的rBmBac-rep-cap，与pVL1393-ITRs 共转染家蚕细胞获得重组杆状病毒；
本发明将上述重组杆状病毒感染家蚕细胞或宿主获得包装良好的重组腺相关病毒。本发明将获得重组腺相关病毒进行纯化，采用电镜观察，观察结果可见产物大小与预期符合的纳米离子，直径约为20nm。
本发明将含有荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因和脂蛋白脂肪酶基因的重组腺相关病毒载体呈递至HEK293t细胞中，结果发现该重组腺相关病毒感染后的HEK293t细胞的光量子数远远高于空白细胞对照和野生型腺相关病毒感染的HEK293t细胞；被重组腺相关病毒感染后的HEK293t 细胞可明显观察到绿色荧光，空白细胞对照和野生型腺相关病毒感染的HEK293t细胞则无法观察到明显的绿色荧光；被重组腺相关病毒感染后的HEK293t细胞内的脂蛋白脂肪酶的含量远远高于空白细胞对照和野生型腺相关病毒感染的HEK293t细胞。
本发明将含有荧光素酶基因、增强型绿色荧光蛋白基因和脂蛋白脂肪酶基因的重组腺相关病毒载体呈递至小鼠体中，结果发现该重组腺相关病毒感染后的小鼠的血液中的光量子数远远高于空白细胞对照和野生型腺相关病毒感染的小鼠；被重组腺相关病毒感染后的小鼠的血液中可检测到增强型绿色荧光蛋白，空白细胞对照和野生型腺相关病毒感染的小鼠则无法检测到明显的增强型绿色荧光蛋白；被重组腺相关病毒感染后的小鼠的血液中的脂蛋白脂肪酶的含量远远高于空白细胞对照和野生型腺相关病毒感染的小鼠。
因此，本发明所提供的重组腺相关病毒可应用于基因治疗向HEK293t细胞中呈递目的基因，其应用方法包括：
(Ⅰ)将所述的rep cassette、cap cassette和ITRs-Luc cassette通过家蚕三杆状病毒表达系统包装重组腺相关病毒；克隆至pVL1393载体中构建成为重组转移载体，通过共转染获得三种重组杆状病毒，等比例混合感染家蚕细胞或宿主获得包装良好的重组腺相关病毒，经过纯化后可用于向 HEK293t细胞和小鼠体内呈递目的基因；
作为参考，所述的重组腺相关病毒采用家蚕三杆状病毒表达系统进行表达的方法包括以下步骤：
(a)分别将rep cassette、cap cassette和ITRs-Luc cassette克隆进杆状病毒转移载体中，获得重组转移载体；
(b)通过共转染获得三种重组杆状病毒；
(c)将三种重组杆状病毒等比例混合感染家蚕细胞或宿主，培养被感染的昆虫细胞或宿主表达产物，纯化，即得包装良好的重组腺相关病毒。
(Ⅱ)将所述的rep cassette、cap cassette和ITRs cassette利用家蚕单杆状病毒表达系统包装重组腺相关病毒；
作为参考，所述的重组腺相关病毒采用家蚕单杆状病毒表达系统进行表达的方法包括以下步骤：
(a)将rep cassette、cap cassette和ITRs cassette克隆进转移载体pP10、pEGT和pVL1393中，获得重组转移载体；
(b)利用重组酶系统和FRT-FLT系统将rep cassette和cap cassette插入至BmNPV的p10、egt 基因位点，获得rBmBac-rep-cap；
(c)将所得rBmBac-rep-cap和pVL1393-ITRs转染家蚕细胞获得重组杆状病毒；
(d)将所得重组杆状病毒感染家蚕细胞或宿主，培养被感染的家蚕细胞或宿主产物，纯化，即得重组腺相关病毒。
(Ⅲ)还可将所述的重组腺相关病毒呈递至HEK293t细胞和小鼠体内，并诱导细胞和小鼠体内产生目的蛋白。
(Ⅳ)利用LPL检测试剂盒(BC2440，北京索莱宝科技有限公司)检测细胞和小鼠体内的LPL 的表达量。
本发明提供了一种重组腺相关病毒及其突变体和应用，所述重组腺相关病毒的表达效率高，有针对性的解决了在基因治疗中腺相关病毒的需求量过高而导致其价格昂贵的问题。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、本发明利用家蚕杆状病毒表达系统表达重组腺相关病毒，该病毒制备过程不涉及到活的有害病毒，相比传统的AcMNPV-sf9系统操作更加安全、简便，适合进行快速大规模生产；
2、本发明提供的重组腺相关病毒表达效率更高，为大规模制备重组腺相关病毒打下基础。
3、本发明提供的重组腺相关病毒，用这种病毒粒子向细胞中呈递基因比传统的病毒粒子更高。
附图说明
图1rAAV-rep-O-F63S-P281C-V486G-Luc-单、rAAV-rep-O-F63S-P281C-V486G-EGFP-单和rAAV-rep-O-F63S-P281C-V486G-LPL-单在家蚕单杆状病毒表达系统中表达产物的SDS-PAGE图。
图2rAAV-rep-O-F63S-P281C-V486G-Luc-单、rAAV-rep-O-F63S-P281C-V486G-EGFP-单和 rAAV-rep-O-F63S-P281C-V486G-LPL-单在家蚕单杆状病毒表达系统中表达产物的的透射电镜图。
图3rAAV-rep-O-F63S-P281C-V486G-Luc-单在家蚕单杆状病毒表达系统中表达产物在 HEK293t细胞中的光量子数对比图。
图4rAAV-rep-O-F63S-P281C-V486G-EGFP-单在家蚕单杆状病毒表达系统中表达产物在 HEK293t细胞中的绿色荧光图；A空白细胞对照，B被rAAV-EGFP感染后的HEK293t细胞。
图5重组杆状病毒的p10位点(插入rep基因)测序图；A重组杆状病毒p10位点上游序列； B重组杆状病毒p10位点下游序列；黑色为杆状病毒基因组序列，红色为同源臂序列，绿色为rep 基因序列。
图6重组杆状病毒的egt位点(插入cap基因)测序图；A重组杆状病毒egt位点上有序列； B重组杆状病毒egt位点下游序列；黑色为杆状病毒基因组序列，红色为同源臂序列，绿色为cap 基因序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、试验材料与试剂
(1)菌株、病毒株与载体：转移载体pVL1393、家蚕细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株 BmBacmid、家蚕品种JY1均为中国农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存；
(2)腺相关病毒的cap cassette序列和rep cassette序列，ITRs cassette序列送至金斯瑞公司合成，并克隆到原核表达载体pUC57载体上。
(3)酶与试剂：限制性内切酶、T4 DNA连接酶及所对应的缓冲液均购自Promega公司；LA Taq 聚合酶及缓冲液购自TaKaRa公司；各种规格的DNA和蛋白质分子量标准为TranGen Biotech公司产品；2K PlusⅡDNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；DEPC、M-MLV-Rtase(逆转录酶)购自Promega公司；
(4)生化试剂：Tris、Ampicillin、Kanamycin、IPTG、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylene diamine)、过硫酸铵(Ammonium Persulfate)、卡那霉素 (Kanamycin)购自Sigma公司；bisacrylamide、acrylamide、X-Gal购自Promega公司；琼脂糖为Sunbiotech公司产品；酵母抽提物(Yeast Extract)、胰蛋白胨均购自英国OXOID公司；0.2um、 0.45um滤器购自Gelman Sciences公司；Ni-NTA Agarose、ProteinaseK、胎牛血清购自Invitrogen 公司；牛血清白蛋白购自罗氏公司；其它均为国产或进口分析纯试剂。引物合成与基因测序均由北京擎科新业生物技术有限公司完成。
(5)培养基：家蚕昆虫细胞培养基为TC-100购自AppliChem公司；
2、实验方法中用于定点突变的融合PCR方法
参照邝翡婷等人(一种载体构建的新方法：重组融合PCR法，基因组学与应用生物学，2012 年，第31卷，第6期，第634-639页)所描述的方法进行。
实施例1通过家蚕杆状病毒表达系统包装重组腺相关病毒
1有关溶液和培养基的配置
有关溶液和培养基的配置方法参照相关工具书(Joseph et al.,分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯，等人，精编分子生物学指南，1998)。
2腺相关病毒的cap cassette、rep cassette和ITRs-Luc cassette的合成
为了使重组腺相关病毒能够更好地通过家蚕杆状病毒表达系统包装，在NC_001401.2登录号的Ⅱ型AAV序列的基础上，通过家蚕密码子偏好性对密码子进行优化，并优化序列GC含量以延长mRNA的半衰期，将rep基因的CAI从0.86升级到0.94，cap基因的CAI从0.87优化到0.95。
在此基础上，本发明在rep序列的5‘端加上BglⅡ序列和Kozak序列，在rep基因530位处加入intron序列，3’端加上HSV poly A序列，终止密码子和XbaⅠ序列，即得repcassette；在cap 序列5’端插入家蚕polh启动子序列、kozak序列和BamHⅠ序列，在cap基因25位处加入intron序列，在3‘端加入终止密码子、BGH polyA和EcoRⅠ序列，即得capcassette；为后期方便检测所获得腺相关病毒的完整性和表达效率，选择Luciferase、EGFP和LPL基因作为目的基因，并在ITR 序列中间插入CMV启动子和多克隆位点，尾部插入SV40polyA，即得ITRs-Luc cassette，最终，按照上述的方法得到的rep的氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所述，cap的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4 所示，ITRs-Luc的氨基酸序列为NCBI所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。
将上述所设计的重组腺相关病毒相关序列交由相关生物科技有限公司合成。
3AAV的rep cassette、ITRs-Luc cassette和cap cassette的构建
3.1腺相关病毒的cap cassette、rep casete和ITRs-Luc cassette的PCR扩增
具体实验方法见上述实验方法2。
3.1.1家蚕表达系统中表达质粒的PCR扩增
PCR扩增rep cassette：以质粒pUC57-rep为模板
F1 5’-GGATCCAACATGCCGGGGTT-3’
R1 5’-GAATTCTGGCTATGGCAGGGC-3’
PCR扩增cap cassette：以pUC57-cap为模板
F2 5’-GGATCCACAATAAAACAATTATA-3’
R2 5’-TATAATTGTTTTATTGTGGATCC-3’
PCR扩增ITRs-Luc cassette：以pUC57-ITRs-Luc为模板
F1 5’-GATATCTTGGCCACTCCCTCTCTG-3’
R2 5’-AGATCTTTGGCCACTCCCT-3’
PCR反应体系为表1：
表1 PCR反应体系
Figure BDA0002950475730000071
PCR参数设置：
Figure BDA0002950475730000081
3.2玻璃奶纯化回收DNA片段
配置1％(w/v)琼脂糖凝胶，对PCR扩增的产物进行电泳；将琼脂糖凝胶置于紫外灯下，快速切下含有单一的目的核酸条带的凝胶，放入1.5mL的离心管中，称重，加三倍体积的6M NaI，放于37℃恒温培养箱中融化；向已经完全融化的溶液中加8μL Glassmilk，混匀，冰浴5min，中间摇匀两次；8000rpm离心10s，弃掉上清；加800μL New Wash洗涤，轻轻弹起后离心，重复 2次；弃去上清，将离心管放37℃恒温培养箱干燥2～3min；干燥后加20μL 0.1×TE溶解，混合充分溶解DNA，12000rpm离心5min，取上清立即用于连接，其余放-20℃保存。
3.3目的基因PCR产物酶切处理
将PCR产物跑胶，胶回收正确的rep cassette、cap cassette用限制性内切酶BamHI和EcoR I 进行双酶切反应获得目的片段rep cassette和cap cassette片段。ITRs-Luccassette片段用限制性内切酶EcoRⅴ和BglⅡ进行双酶切反应获得目的片段ITRs-Luccassette，酶切体系如下表2所示：
表2酶切体系
Figure BDA0002950475730000082
3.4感受态细胞的小量制备
制备大肠杆菌Top10感受态细胞，－80℃保存。
3.5目的基因与载体的连接与转化
3.5.1酶切处理pVL1393载体
用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、EcoR V和BglⅡ对转移载体pVL1393进行双酶切，65℃灭活20min，保存于－20℃备用。
3.5.2连接
酶切回收的目的片段与经双酶切处理后的转移载体pVL1393的连接。用T4 DNA连接酶，16℃，连接过夜。连接体系如下表3所示：
表3连接体系
Figure BDA0002950475730000091
3.5.3转化
取-80℃保存的感受态细胞，快速融化一半，加入上述连接产物3μL，冰上放置半小时；42℃恒温水浴锅中放置90s，迅速置于冰上3～5min；向管中加入适量的1mL LB培养基，37℃恒温培养箱中静置培养60min；离心，弃去大部分上清，留200μL涂布于LB平板(100μg/mL Amp)上， 37℃恒温培养箱正置培养30min，后倒置培养过夜。
3.6核酸快速抽提法粗筛阳性克隆
挑取LB平板上的单菌落，接种于LB液体培养基(100μg/mL Amp)中，置于37℃恒温震荡培养器中，设置转速为220rpm，过夜培养；取500μL菌液于离心管内，收集菌体；加入30μL Loading Buffer和20μL酚/氯仿(1:1)，用涡旋震荡器充分混匀，使菌体重悬；12000rpm离心3min，取 8μL上清进行琼脂糖凝胶电泳，同时以同样方法处理的空载体作为对照。凝胶成像系统的紫外灯下观察条带，选取质粒带明显退后的菌液提取质粒。
3.7SDS碱裂解法提取质粒DNA
收集3mL菌液于离心管中，SDS碱裂解法提取质粒DNA，-20℃保存备用。
3.8阳性克隆的酶切与测序鉴定
酶切体系如下表4所示：
表4酶切体系
Figure BDA0002950475730000092
37℃反应2h后，取7μL用1％的琼脂糖进行电泳检测。酶切检测正确的质粒DNA，送北京擎科新业生物技术有限公司测序，结果和目的基因一致，得到的重组质粒命名为pVL1393-rep、 pVL1393-cap、pVL1393-ITRs-Luc。
4重组腺相关病毒在家蚕真核表达系统中表达
4.1家蚕核型多角体病毒BmBacmid亲本株的制备
参照张志芳等人的专利(表达多外源基因的昆虫生物反应器及其构建方法和应用，CN 102286534B)所描述的方法构建杆状病毒穿梭质粒，BmBacmid。
按AppliChem公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2M NaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养家蚕细胞BmN。用家蚕核型多角体病毒感染对数生长期的细胞约50mL，3～4d后收集病毒感染液，10000rpm离心10min，除去沉淀，上清用25000 rpm离心1小时，除上清，用1mL病毒DNA抽提液(1L中含Tris 12.1g，EDTA 33.6g，KCl 14.1 g，pH 7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5mL离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml， 50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，分别用等体积的饱和酚、苯酚:氯仿(1:1)、氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3 M NaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，－20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10 分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μL TE Buffer中，放4℃保存备用。
4.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-rep cassette、PPH-cap cassette、PPH-ITRs-Luc cassette) 的构建和获得
接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5mL无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmBacmid DNA(专利号为：ZL201110142492.4)和重组家蚕杆状病毒rBmBacmid-cap DNA， 2μg重组转移质粒pVL1393-rep cassette、pVL1393-cap cassette或pVL1393-ITRs-Luc cassette和5 μL脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5ml无血清培养基和300μL FBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒rBmBacmid(PPH-rep cassette、PPH-capcassette、PPH-ITRs-Luc cassette)的筛选。接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1mL共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含 20％FBS)混合均匀，每平皿加4mL胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-rep cassette、PPH-cap cassette、PPH-ITRs-Luc cassette)。
4.3重组病毒rBmBacmid(PPH-rep cassette、PPH-cap cassette、PPH-ITRs-Luccassette)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-rep cassette、PPH-cap cassette、PPH-ITRs-Luc cassette) 感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid (PPH-rep cassette、PPH-cap cassette、PPH-cap-ITRs-Luc)。
4.4重组病毒的鉴定
利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μL，加入150μL(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μL的TE溶解DNA。
取上述病毒基因组DNA 1μL进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃1min、58℃ 1min、72℃3min，30个循环，最后72℃延伸10min。取15μL反应产物电泳分析，结果证明获得了重组病毒。
4.5重组腺相关病毒在家蚕体和蚕蛹中的表达
所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的家蚕及结茧七天后平均体重相同的15粒蚕蛹，每头蚕蛹和蚕接种约1.0×105pfurBmBacmid (PPH-rep cassette、PPH-cap cassette、PPH-ITRs-Luc cassette等比例混合样品)，4～5d后收集发病蚕蛹和取蚕血，-20℃冻存以进行后续AAV病毒完整性和活力检测。
5 AAV病毒的纯化
将得到的蚕血淋巴在-80℃和37℃间反复冻融四次破碎细胞，10000xg离心10min后，收集上清，60℃加热30min，加入十分之一体积氯仿，置于37℃摇床中剧烈振荡一小时，利用氯仿变性杂蛋白使其沉淀，加入固体氯化钠至终浓度1mol/L，振荡溶解，4℃，12,000xg离心十五分钟，取出上层水相，弃氯仿和沉淀，加PEG8000至终浓度10％(W/V)，振荡溶解后冰浴放置1h，11, 000xg离心15min，弃上清，用5ml PBS缓冲液将各离心管管底和管壁上的沉淀吹打洗脱下来合并，将其分装至1.5mL Ep管中，加入DNA酶和RNA酶至终浓度1-2μg/mL，室温下消化30min，加等体积的氯仿抽提，除去杂蛋白，4℃，11,000g离心5分钟，将纯化的病毒液装入Milipore 浓缩柱(3KD)中，6000-7000转/分钟离心，浓缩为500uL，即为纯化病毒。
6、qPCR鉴定
提取纯化得到的rAAV病毒粒子的基因组DNA，用含Luciferase基因的质粒作为病毒滴度测定的标准品，标准品成十倍梯度稀释，与提取的病毒DNA样品一起进行荧光定量PCR，根据 Luciferase基因设计引物测定每毫升蚕血中重组腺相关病毒目的基因的拷贝数。
表5 rAAV-rep-O表达产物中的目的基因拷贝数
组别 目的基因拷贝数(copies/mL)
rAAV-rep-O 5×10<sup>8</sup>
实施例2腺相关病毒的rep蛋白进行氨基酸单位点突变后的重组腺相关病毒粒子的表达效率和活力检测
1实验方法
1.1 rep氨基酸序列单位点突变体基因的构建
基于实施例1的结果，本发明获得了Rep-C突变体，以Rep-C突变体密码子优化后的基因序列为模板，设计多对引物对保守序列进行定点突变，定点突变是利用融合PCR的方法进行，融合 PCR的方法见实施例1。
突变位点分别W29G、F63S、P163T、P281C、A313Y、P440T、F458C、V486G、V508W、L569T。所得突变体命名为Rep-C-M(W29G、F63S、P163T、P281C、A313Y、P440T、F458C、 V486G、V508W、L569T)。
rAAV的rep蛋白质进行氨基酸单位点突变所需引物：
rAAV-rep-C-M单位点突变体:
(1)两侧上下游引物
F:5’-GGATCCAACATGCCGGGGTT-3’
R:5’-GAATTCTGGCTATGGCAGGGC-3’
(2)中间上下游引物
1、
F:TTCTGACAGCTTTGTGAACGGGGTGGCCGAGAAGGAATGGG
R:CCCATTCCTTCTCGGCCACCCGGTTCACAAAGCTGTCAGAA
2、
F:CGAGAAGCTGCAGCGCGACTCCCTGACGGAATGGCGCCGT
R:ACGGCGCCATTCCGTCAGGGAGTCGCGCTGCAGCTTCTCG
3、
F:TGCTCCCCAAAACCCAGACGGAGCTCCAGTGGGCGTGGAC
R:GTCCACGCCCACTGGAGCTCCGTCTGGGTTTTGGGGAGCA
4、
F:GAGCCTGACTAAAACCGCCTGCGACTACCTGGTGGGCCAG
R:CTGGCCCACCAGGTAGTCGCAGGCGGTTTTAGTCAGGCTC
5、
F:TACGATCCCCAATATGCGTACTCCGTCTTTCTGGGATGG
R:CCATCCCAGAAAGACGGAGTACGCATATTGGGGATCGTA
6、
F:GACCTTCGAACACCAGCAGACGTTGCAAGACCGGATGTTCAA
R:TTGAACATCCGGTCTTGCAACGTCTGCTGGTGTTCGAAGGTC
7、
F:CGCCGTCTGGATCATGACTGCGGGAAGGTCACCAAGCA
R:TGCTTGGTGACCTTCCCGCAGTCATGATCCAGACGGCG
8、
F:GGTGGAGCATGAATTCTACGGAAAAAAGGGTGGAGCCAAGAA
R:TTCTTGGCTCCACCCTTTTTTCCGTAGAATTCATGCTCCACC
9、
F:ATAAGTGAGCCCAAACGGAACCGCGAGTCAGTTGCGCAGC
R:GCTGCGCAACTGACTCGCGGTTCCGTTTGGGCTCACTTAT
10、
F:CGGACAGAAAGACTGTACGGAGTGCTTTCCCGTGTCA
R:TGACACGGGAAAGCACTCCGTACAGTCTTTCTGTCCG
2rAAV-rep-O单位点突变体的质粒构建
具体实验方法见实施例1。
3重组质粒的转化与鉴定
具体实验方法见实施例1。
4重组腺相关病毒在家蚕表达系统中表达与纯化
4.1家蚕核型多角体病毒BmBacmid亲本株的繁殖及病毒DNA的制备
具体方法同实施例1。
4.2重组家蚕杆状病毒的构建和获得
具体方法同实施例1。
4.3重组杆状病毒在家蚕细胞中的扩增
具体实验方法见实施例1。
4.4重组杆状病毒的鉴定
具体实验方法见实施例1。
4.5 rAAV-rep-O单位点突变体在家蚕体和蚕蛹中的表达
具体方法同实施例1。
5 qPCR结果鉴定
具体方法同实施例1。
表6 rAAV-rep-O单位点突变体表达产物的qPCR结果鉴定
组别 目的基因拷贝数(copies/mL)
rAAV-rep-O 5×10<sup>8</sup>
rAAV-rep-O-W29G 2×10<sup>7</sup>
rAAV-rep-O-F63S 1×10<sup>9</sup>
rAAV-rep-O-P163T 1×10<sup>8</sup>
rAAV-rep-O-P281C 1×10<sup>9</sup>
rAAV-rep-O-A313Y 5×10<sup>8</sup>
rAAV-rep-O-P440T 1×10<sup>6</sup>
rAAV-rep-O-F458C 1×10<sup>9</sup>
rAAV-rep-O-V486G 1.5×10<sup>9</sup>
rAAV-rep-O-V508W 2×10<sup>7</sup>
rAAV-rep-O-L569T 5×10<sup>8</sup>
从表6数据可以看出在腺相关病毒rep序列(NC_001401.2)的基础上进行氨基酸单位点突变，所得突变体有4个单突变体(F63S、P281C、F458C、V486G)的表达产物中目的基因的拷贝数有了明显提高。
实施例3腺相关病毒的衣壳rep蛋白进行氨基酸双位点突变后的重组腺相关病毒粒子的表达和活力鉴定
鉴于实施例2的结果，确定部分位点的突变是有效突变，可以达到提高rAAV-rep-O-M突变体表达量的目的。考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构，并决定着蛋白质的高级结构，且实施例2中进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置可能是相互关联的，故尝试进行氨基酸双位点突变。本发明将可以提高表达量的单突变位点F63S、P281C、F458C、V486G两两组合，进行双位点突变，双位点突变是在实施例2获得的单位点突变序列的基础之上，以其 (rAAV-rep-O-M)作为模板，利用相应的引物，通过融合PCR的方法进行第二位的定点突变，从而获得双位点突变的目的片段，融合PCR的方法见实施例1。
双突变位点为rAAV-rep-O-D：F63S-P281C、F63S-F458C、F63S-V486G、P281C-F458C、 P281C-V486G、F458C-V486G共6种组合，所获得的突变体命名为rAAV-O-D(F63S-P281C、 F63S-F458C、F63S-V486G、P281C-F458C、P281C-V486G、F458C-V486G)突变体。
1有关溶液和培养基的配置
有关溶液和培养基的配置方法同实施例1。
2 rAAV-rep-O-D突变体的质粒构建
具体实验方法见实施例1。
3重组质粒的转化与鉴定
具体实验方法见实施例1。
4重组腺相关病毒在家蚕表达系统中表达与纯化
4.1家蚕核型多角体病毒BmBacmid亲本株的繁殖及病毒DNA的制备
具体方法同实施例1。
4.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid的构建和获得
具体方法同实施例1。经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid。
4.3重组病毒rBmBacmid(PPH-rAAV-rep-O-D)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-rAAV-rep-O-D)感染正常生长的BmN细胞，培养3 天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(PPH-rAAV-rep-O-D)。
4.4重组病毒的鉴定
具体方法同实施例1。
4.5 rAAV-rep-O-D在家蚕体和蚕蛹中的表达
具体方法同实施例1。
5 qPCR结果鉴定
具体方法同实施例1。
表7 rAAV-rep-O-D表达产物中目的基因的拷贝数
组别 目的基因拷贝数(copies/mL)
rAAV-rep-O-M 1.5×10<sup>9</sup>
rAAV-rep-O-F63S-P281C 3×10<sup>9</sup>
rAAV-rep-O-F63S-F458C 5×10<sup>8</sup>
rAAV-rep-O-F63S-V486G 2×10<sup>7</sup>
rAAV-rep-O-P281C-F458C 1×10<sup>9</sup>
rAAV-rep-O-P281C-V486G 5×10<sup>9</sup>
rAAV-rep-O-F458C-V486G 1×10<sup>9</sup>
从表7数据可以看出在腺相关病毒rep序列(AF043303)的基础上进行氨基酸双位点突变，所得突变体有2个单突变体(F63S-P281C、P281C-V486G)的表达产物中目的基因的拷贝数有了明显提高。
实施例4腺相关病毒的衣壳rep蛋白进行氨基酸多位点突变后的重组腺相关病毒粒子的表达和活力鉴定
1有关溶液和培养基的配置
有关溶液和培养基的配置方法同实施例1。
2rAAV-rep-O-M6突变体的质粒构建
具体实验方法见实施例1。
3重组质粒的转化与鉴定
具体实验方法见实施例1。
4重组腺相关病毒在家蚕表达系统中表达与纯化
4.1家蚕核型多角体病毒BmBacmid亲本株的繁殖及病毒DNA的制备
具体方法同实施例1。
4.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid的构建和获得
具体方法同实施例1。经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid。
4.3重组病毒rBmBacmid(PPH-rAAV-rep-O-M6)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(PPH-rAAV-rep-O-M6)感染正常生长的BmN细胞，培养3 天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(PPH-rAAV-rep-O-M6)。
4.4重组病毒的鉴定
具体方法同实施例1。
4.5 rAAV-rep-O-M6在家蚕体和蚕蛹中的表达
具体方法同实施例1。
5 qPCR结果鉴定
具体方法同实施例1。
表8 rAAV-rep-O-M6表达产物中目的基因的拷贝数
组别 目的基因拷贝数(copies/mL)
rAAV-rep-O-D 5×10<sup>9</sup>
rAAV-rep-O-F63S-P281C-V486G 2×10<sup>10</sup>
从表8数据可以看出在腺相关病毒rep序列(AF043303)的基础上进行氨基酸多位点突变，所得突变体有1个多位点突变体(F63S-P281C-V486G)的表达产物中目的基因的拷贝数有了明显提高。
实施例5利用家蚕单杆状病毒表达系统包装rAAV-rep-O-M6病毒粒子
1有关溶液和培养基的配置
有关溶液和培养基的配置方法同实施例1。
2 rAAV的pP10-rep cassette、pEGT-cap cassette、pVL1393-EGFP和pVL1393-LPL的构建
具体实验方法见实施例1。
3重组质粒的转化与鉴定
具体实验方法见实施例1。
4重组腺相关病毒在家蚕表达系统中表达与纯化
4.1家蚕核型多角体病毒BmBacmid-cap-rep的获得、繁殖及病毒DNA的制备
具体方法见专利CN201110142492.4所示。
4.2重组家蚕杆状病毒rBmBacmid的构建和获得
具体方法同实施例1和具体方法见专利CN201110142492.4所示。。
经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmBacmid-Luc、rBmBacmid-EGFP和 rBmBacmid-LPL。
其中，重组杆状病毒在p10和egt位点的测序结果如图5、图6所示。
4.3重组病毒rBmBacmid在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rBmBacmid(rAAV-rep-O-M6-Luc、rAAV-rep-O-M6-EGFP、rAAV-rep-O-M6-LPL)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rBmBacmid(rAAV-rep-O-M6-Luc、rAAV-rep-O-M6-EGFP、rAAV-rep-O-M6-LPL)。
4.4重组病毒的鉴定
具体方法同实施例1。
4.5 rAAV-rep-O-M6-Luc、rAAV-rep-O-M6-EGFP和rAAV-rep-O-M6-LPL在家蚕体和蚕蛹中的表达
具体方法同实施例1。
5 SDS-PAGE检测
将家蚕表达的蚕血淋巴纯化处理之后，取10μL加入5×loading buffer，混匀后，在100℃的金属浴中加热10min，12000rpm离心5min，取上清，将制好的聚丙烯酰胺胶正确缓慢地放置到电泳槽中，缓慢匀速地将梳子拔下，将上述制好的样品用移液枪逐个加入凝胶中，设置为两步电泳，第一步80V，待溴酚蓝跑入分离胶后进行下一步，第二步设置为120V，电泳2h。加入染色液2h后，倒入脱色液过夜，观察蛋白条带，其结构蛋白的比例是否符合1:1:10。SDS-PAGE结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品中可检测到三种结构蛋白，如图所示，且比例符合1：1： 10。
6电镜观察
首先将普通滤纸剪成2×3cm备用，对碳膜铜网进行亲水处理，将家蚕表达的蚕血淋巴纯化之后得到的rAAV病毒粒子进行稀释，取1μL滴在铜网上，1min后，用滤纸吸走铜网上的样品液滴，用ddH2O洗一遍，随后在铜网上滴加醋酸双氧铀进行负染，作用1min后，吸走染液，待铜网完全干后，放在TEM菱形盒中，用透射电子显微镜进行观察，结果如图所示，可观察到大小均匀为20nm左右的rAAV病毒粒子。
7 qPCR结果鉴定
具体方法同实施例1。
表9 rAAV-rep-O-M6-Luc-单表达产物中目的基因的拷贝数
组别 目的基因拷贝数(copies/mL)
rAAV-rep-O-F63S-P281C-V486G 2×10<sup>10</sup>
rAAV-rep-O-F63S-P281C-V486G-单 9×10<sup>10</sup>
从表9数据可以看出在多位点突变的基础上，利用家蚕单杆状病毒表达系统包装的重组腺相关病毒的目的基因的拷贝数有了明显提高。
8、活力鉴定
在六孔板中每孔铺1×105个HEK293细胞，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h，取100μL 纯化后的rAAV-Luc、rAAV-EGFP和rAAV-LPL病毒粒子加入到铁壁的HEK293细胞，待24h-48 h之后，利用光量子仪测定被rAAV-Luc感染后的HEK293t细胞的光量子数，结果如图3所示；利用荧光显微镜观察被rAAV-EFGFP感染后HEK293t细胞的荧光量，结果如图4所示，利用LPL 检测试剂盒检测细胞中LPL的含量，在被rAAV-LPL感染后HEK293t细胞中可明显检测到LPL。
9、动物实验
将纯化之后的重组腺相关病毒通过肌肉注射进小鼠体内，取血，检测目的蛋白Luciferase、 EGFP、LPL的表达量，发现注射过重组腺相关病毒的小鼠体内均能检测到目的蛋白，说明通过家蚕系统表达得到的重组腺相关病毒能够介导目的基因在动物体内的呈递。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 重组腺相关病毒、其突变体及其构建方法和应用
<130> BJ-2002-210209A
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 621
<212> PRT
<213> adeno-associated virus
<400> 1
Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp
1 5 10 15
Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu
20 25 30
Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile
35 40 45
Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu
50 55 60
Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val
65 70 75 80
Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu Val Glu
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Asn Lys Val Val Asp Glu Cys Tyr Ile Pro Asn Tyr Leu Leu Pro Lys
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Leu Thr His Val Ser Gln Thr Gln Glu Gln Asn Lys Glu Asn Gln Asn
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210 215 220
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Gln Trp Ile Gln Glu Asp Gln Ala Ser Tyr Ile Ser Phe Asn Ala Ala
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Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ala Ala Leu Asp Asn Ala Gly Lys
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Ile Met Ser Leu Thr Lys Thr Ala Pro Asp Tyr Leu Val Gly Gln Gln
275 280 285
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305 310 315 320
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485 490 495
Pro Ser Asp Ala Asp Ile Ser Glu Pro Lys Arg Val Arg Glu Ser Val
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Phe Thr His Gly Gln Lys Asp Cys Leu Glu Cys Phe Pro Val Ser Glu
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Ser Gln Pro Val Ser Val Val Lys Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Cys Tyr
580 585 590
Ile His His Ile Met Gly Lys Val Pro Asp Ala Cys Thr Ala Cys Asp
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Leu Val Asn Val Asp Leu Asp Asp Cys Ile Phe Glu Gln
610 615 620
<210> 2
<211> 2460
<212> DNA
<213> adeno-associated virus
<400> 2
agatctaaca tgccggggtt ttacgagatt gtgattaagg tccccagcga ccttgacgag 60
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ttctttgtgc aatttgagaa gggagagagc tacttccaca tgcacgtgct cgtggaaacc 300
accggggtga aatccatggt tttgggacgt ttcctgagtc agattcgcga aaaactgatt 360
cagagaattt accgcgggat cgagccgact ttgccaaact ggttcgcggt cacaaagacc 420
agaaatggcg ccggaggcgg gaacaaggtg gtggatgagt gctacatccc caattacttg 480
ctccccaaaa cccagcctga gctccagtgg gcgtggacta atatggaaca gtatttaagg 540
taagtactcc ctatcagtga tagagatcta tcatggagat aattaaaatg ataaccatct 600
cgcaaataaa taagtatttt actgttttcg taacagtttt gtaataaaaa aacctataaa 660
tattccggat tattcatacc gtcccaccat cgggcgcgaa gggggagacc tgtagtcaga 720
gcccccgggc agcacacact gacatccact cccttcctat tgtttcagcg cctgtttgaa 780
tctcacggag cgtaaacggt tggtggcgca gcatctgacg cacgtgtcgc agacgcagga 840
gcagaacaaa gagaatcaga atcccaattc tgatgcgccg gtgatcagat caaaaacttc 900
agccaggtac atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca 960
gtggatccag gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc 1020
ccaaatcaag gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc 1080
cgactacctg gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat 1140
tttggaacta aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac 1200
gaaaaagttc ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac 1260
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tctgatgctg tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt 1920
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<210> 3
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<212> PRT
<213> adeno-associated virus
<400> 3
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Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
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Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
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Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
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580 585 590
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gccaaagatc t 1211

Claims (7)

1.腺相关病毒rep cassette的突变体，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸按照V486G所示的氨基酸单位点突变获得的突变体。
2.腺相关病毒rep cassette的突变体，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸按照F63S-V486G、P281C-V486G或F458C-V486G所示的任何一种氨基酸双位点突变获得的突变体。
3.腺相关病毒rep cassette的突变体，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的氨基酸按照F63S-P281C-V486G所示的氨基酸多位点突变获得的突变体。
4.权利要求1-3任何一项所述的突变体在构建重组腺相关病毒载体中的用途。
5.一种重组腺相关病毒载体，包括rep cassette、cap cassette和ITRs cassette，其特征在于，所述的rep cassette的氨基酸序列是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸按照V486G所示的氨基酸单位点突变获得的突变体；或者是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸按照F63S-V486G、P281C-V486G或F458C-V486G所示的任何一种氨基酸双位点突变获得的突变体；或者是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸按照F63S-P281C-V486G所示的氨基酸多位点突变获得的突变体。
6.一种构建权利要求5所述重组腺相关病毒载体的方法，其特征在于，包括：将所述的rep cassette、cap cassette以及ITRs cassette的编码基因分别克隆到杆状病毒转移载体中获得重组转移载体；将重组转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，分别获得三种重组杆状病毒；将三种重组杆状病毒混合感染昆虫宿主或者细胞，培养被感染的昆虫细胞或宿主获得重组腺相关病毒载体；
或者将所述的rep cassette的编码基因以及cap cassette的编码基因分别连接到转移载体pP10和pEGT载体中，获得重组转移载体pP10-rep和pEGT-cap；通过red重组酶系统和FLP-FRT系统获得rBmBac-rep-cap；将所述的ITRs cassette的编码基因与pVL1393连接构建得到重组转移载体pVL1393-ITRs；将所得的rBmBac-rep-cap与重组转移载体pVL1393-ITRs共转染获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫细胞，培养被感染的昆虫细胞获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染昆虫细胞或宿主，培养被感染的昆虫细胞或宿主获得重组腺相关病毒载体。
7.权利要求5所述重组腺相关病毒载体作为基因呈递载体或者作为制备基因治疗药物中的用途。
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