CN111349148A - 一种腺相关病毒载体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种AAV衣壳蛋白突变体、包含编码所述AAV衣壳蛋白突变体的核酸序列的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体以及包含所述载体的宿主细胞。本发明还涉及包含所述AAV衣壳蛋白突变体的腺相关病毒(AAV)载体，从其构建的携带有基因表达盒的重组腺相关病毒粒，生成此类腺相关病毒载体或病毒粒的方法，以及此类腺相关病毒载体和病毒粒在疾病治疗方面的用途。

Description

一种腺相关病毒载体及其用途
技术领域
本发明涉及基因工程和基因治疗领域，具体地，本发明涉及一种AAV衣壳蛋白突变体，包含所述衣壳蛋白突变体的腺相关病毒(AAV)载体，从其构建的携带有基因表达盒的AAV病毒粒，生成和使用此类腺相关病毒载体或病毒粒的方法，以及此类腺相关病毒载体和病毒粒在疾病治疗方面的用途。
序列表
本申请包含序列表，其通过提述并入本文。
背景技术
内耳的耳蜗是我们的外周声音感知器官。耳蜗的听觉细胞在我们感知外周声音的过程中扮演着非常重要的角色，它把外界的声波信号转化为电生理信号，然后通过内耳螺旋神经节细胞逐步传递到大脑听觉中枢。
先天遗传性或者后天各种创伤引起的毛细胞死亡均可以引起不同程度的听力损伤，甚至终身性耳聋。根据世界卫生组织(WHO)的调查，0.3％的新生儿、5％的45岁以前的人群和50％的70岁以上的人群患有不同程度的听力损伤。听力损伤不仅仅影响听力本身，而且也能引起不同程度的社交障碍。其中，遗传性耳聋是由于内耳中某些基因的突变所导致的。
目前已知的导致耳聋的基因已经多达100多个。其中比例最高的是GJB2突变，约占遗传性耳聋的50％，该基因表达于支持细胞；其次是SLC26A4基因突变，约占遗传性耳聋的15％。Myo15A和OTOF基因则是表达于毛细胞，分别占遗传性耳聋的5～8％。
基因治疗是听力丧失等遗传性疾病的最有希望的治疗方法，但它依赖于基因表达载体的使用。研究表明内耳细胞的基因导入效率低下，这不仅影响了内耳基因功能的研究，而且阻碍了遗传性耳聋的基因治疗。因此，筛选出可以高效转导进内耳细胞，尤其是内耳支持细胞的载体是非常重要的。
腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)在人类基因治疗领域有着广阔的应用前景，由于其具有长时程的基因表达能力，且无致病性，在各种研究中被广泛应用于肝、肌、心、脑、眼、肾等组织。
但是，已经发现的能高效感染内耳细胞，尤其是内耳支持细胞的AAV载体并不多。已有的研究发现，AAV1-AAV9等各种血清型的AAV对内耳支持细胞几乎不感染；PHP.eB为AAV9的变体，也几乎不感染内耳支持细胞；另一种AAV：Anc80L65可以感染支持细胞，感染效率为40％左右，但非常难以获得，包病毒时出毒率很低；AAV2.7m8病毒虽然能感染支持细胞，但感染效率不到20％，而且需要较高的滴度才能达到20％左右的感染效率；AAV-DJ能感染支持细胞，且易于生产，但对内耳支持细胞的感染能力仍待改进。
泛素-蛋白酶体降解机制被认为是AAV感染的主要障碍。其中，病毒衣壳蛋白(cap)的特异位点的点突变是最简单、最普遍的方法，可以使病毒载体避开细胞内的磷酸化和随后的泛素化以及蛋白酶体介导的降解。有文献报道在AAV2和AAV8型病毒的特异性酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸或赖氨酸的点突变可以显著提高载体在肝脏中的感染效率(NishanthGabriel等人,HUMAN GENE THERAPY METHODS,24:80-93,2013)。
腺相关病毒(AAV)载体介导的基因治疗已经在美国被批准用于治疗罕见的遗传性眼病和遗传性中枢神经系统疾病，但尚未鉴定出能够靶向内耳细胞的安全且有效的载体。因此，本领域中需要新的在内耳细胞中，尤其是内耳支持细胞中感染效率高的AAV载体。
发明内容
本发明涉及一种新的AAV衣壳蛋白突变体，其氨基酸序列与亲本或野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列相比发生了突变，从而能够更好地靶向内耳的支持细胞。
本发明还涉及一种包含所述AAV衣壳蛋白突变体的AAV病毒粒，其易生产、安全性好，并且靶向性高，在内耳的支持细胞(例如顶端、中间和基底支持细胞)中感染效率很高。该病毒粒可用于由于支持细胞内基因缺陷导致的听觉障碍疾病的基因治疗。该AAV病毒粒可直接携带缺陷基因或其他治疗序列，进入内耳支持细胞，表达并发挥治疗效果；也可以通过携带基因编辑的工具进入内耳支持细胞，将基因组上的缺陷基因修复、对缺陷基因的转录本进行修复或者提供新的、正确的基因序列。
因此，在一个方面，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，所述AAV衣壳蛋白突变体包含与亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在与SEQ IDNO:1所示亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白氨基酸序列中的第491位、第500位和第666位氨基酸位置对应的至少一个位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，其中所述AAV衣壳蛋白突变体包含与AAV-DJ、AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV13的亲本或野生型衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID NO:1的第491位、第500位和第666位中一个或多个的氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。所述AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV13的亲本或野生型衣壳蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6-19所示。
在一些实施方案中，所述功能性片段为所述AAV衣壳蛋白突变体的N端截短的功能性片段。在一些具体的实施方案中，所述功能性片段为与SEQ ID NO:1所示亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白氨基酸序列中的第1-137位对应的位置处的氨基酸缺失的片段。在一些其他的实施方案中，所述功能性片段为与SEQ ID NO:1所示亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白氨基酸序列中的第1-202位对应的位置处的氨基酸缺失的片段。
在一些实施方案中，所述氨基酸突变为选自下组的一个或多个氨基酸突变：在对应于SEQ ID NO:1中第491位、第500位、和第666位的氨基酸位置处的氨基酸突变。所述突变可以是缺失或取代，所述取代可以是将丝氨酸取代为其他氨基酸，例如不易被磷酸化修饰的氨基酸，包括例如酸性氨基酸、碱性氨基酸、非极性氨基酸、或除酪氨酸外的芳香族氨基酸，或者除苏氨酸外的小氨基酸。在一些具体的实施方案中，所述氨基酸突变为将丝氨酸取代为丙氨酸。
在一些实施方案中，所述病毒衣壳蛋白突变体包含相比于如SEQ ID NO:1所示的亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白而言具有选自下组的一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列：第491位的丝氨酸(S)取代为丙氨酸(A)(S491A)，第500位的丝氨酸(S)取代为丙氨酸(A)(S500A)，和第666位的丝氨酸(S)取代为丙氨酸(A)(S666A)。
在一些例示性实施方案中，相比于如SEQ ID NO:1所示的亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白，所述病毒衣壳蛋白突变体的第491位的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，所得氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。在一些例示性实施方案中，相比于如SEQ ID NO:1所示的亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白，所述病毒衣壳蛋白突变体的第500位的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，所得氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。在一些例示性实施方案中，相比于如SEQ ID NO:1所示的亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白，所述病毒衣壳蛋白突变体的第666位的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，所得氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在一些实施方案中，所述病毒衣壳蛋白突变体具有促进AAV突变体感染内耳细胞，特别是支持细胞的活性。
在又一个方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒粒(又称为重组腺相关病毒载体)，其包含：
(a)衣壳蛋白突变体，该衣壳蛋白突变体包含相比于相应的亲本或野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列而言，在对应于如SEQ ID NO:1所示亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白的氨基酸序列中第491位、第500位和第666位氨基酸的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列；和
(b)编码异源基因产物的异源多核苷酸。
在一些实施方案中，所述突变为取代，例如丝氨酸到丙氨酸的取代。
在一些实施方案中，所述异源多核苷酸在5’和3’端具有AAV ITR序列，并且所述ITR序列可以是完整或不完整的ITR序列。在一些实施方案中，ITR可以是不完整的，例如缺失D或D’或trs或B或B’或C或C’或A或A’区域，或者缺失上述序列的任意组合。
在一些实施方案中，所述病毒衣壳蛋白突变体包含相比于如SEQ ID NO:1所示的亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白而言具有选自下组的一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列：第491位的丝氨酸(S)取代为丙氨酸(A)(S491A)，第500位的丝氨酸(S)取代为丙氨酸(A)(S500A)，和第666位的丝氨酸(S)取代为丙氨酸(A)(S666A)。
在一些例示性实施方案中，相比于如SEQ ID NO:1所示的亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白，所述病毒衣壳蛋白突变体的第491位的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，所得氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。在一些例示性实施方案中，相比于如SEQ ID NO:1所示的亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白，所述病毒衣壳蛋白突变体的第500位的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，所得氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。在一些例示性实施方案中，相比于如SEQ ID NO:1所示的亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白，所述病毒衣壳蛋白突变体的第666位的丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，所得氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在一些实施方案中，所述异源基因是选自以下的至少一种：听力相关基因、用于基因编辑的相关基因和可选择标记基因。具体地，所述听力相关基因可以是在内耳毛细胞和/或支持细胞中表达的基因，例如，是选自下组的至少一种：GJB2、SLC26A4、MYO6、CLDN14、ESRRB、TPRRPN、GJB3、MYO15A、CDH23、12SrRNA、MYO15A、OTOF、TMC1、CDH23、TMPRSS3、POU3F4、USH2A、MYO1F、MYO7A、TRIOBP、KCNQ4、ADGRV1、PAX3、MITF、OTOA、PDZD7、TECTA、GPR98、KCNQ1和Brn4。
在一些实施方案中，所述用于基因编辑的相关基因选自基因编辑酶的编码基因和靶向特定位点的导向RNA(gRNA)。例如，所述基因编辑酶可以为选自以下的至少一种：巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶、CRISPR-Cas系统、碱基编辑器和prime编辑系统。
在又一个方面，本发明涉及一种多核苷酸，其编码如本文公开的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段。所述多核苷酸可以是DNA序列、RNA序列、或其组合。在一些实施方案中，所述多核苷酸编码如SEQ ID No:2、3或4所示的氨基酸序列或其功能性片段，例如N端截短的片段。相比于如SEQ ID No:5所示的编码亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白的核苷酸序列，所述多核苷酸可以在对应于第491位、第500位和第666位氨基酸的一个或多个位置处将相应的氨基酸密码子用编码丙氨酸的密码子(例如GCC)取代。
在又一个方面，本发明涉及一种载体，其中包含本文所述的编码AAV衣壳蛋白突变体的核酸序列。在一些实施方案中，所述载体可以选自表达载体、穿梭载体、和整合载体。
在又一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本文所述的载体，或其基因组中整合有如本文所述的多核苷酸。所述宿主可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，所述原核细胞是大肠杆菌。在一些实施方案中，所述真核细胞可选自下组：酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、人细胞(如HEK293T细胞)，或其组合。
在又一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含如本文公开的重组腺相关病毒粒(组分i)和药学上可接受的载体/赋形剂(组分ii)。在一些实施方案中，组分i占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％，优选10-99.9wt％，更优选70-99wt％。在一些实施方案中，所述药物组合物配制为液体制剂，例如剂型为注射剂。在一些实施方案中，所述药物组合物配制为用于耳蜗内注射的注射剂。在一些实施方案中，组分ii为注射剂用赋形剂，优选地，是选自下组的赋形剂：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。
在一个方面，本发明提供了如本文公开的重组腺相关病毒粒在制备用于感染哺乳动物受试者内耳细胞的药物中的用途。在一些实施方案中，所述内耳细胞为支持细胞。在本发明中，哺乳动物可以是人、猴、猿、黑猩猩、猫、狗、牛、马、小鼠、大鼠、兔等。
在一个方面，本发明提供了如本文公开的重组腺相关病毒粒在制备用于减轻、改善或治疗受试者中的听觉障碍疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，所述受试者是患有听觉障碍疾病的患者。所述听觉障碍疾病可以选自下组：遗传性耳聋、非遗传性耳聋、或其组合。其中，所述遗传性耳聋可包括由选自下组的因素引起的耳聋：基因突变、基因缺失、或其组合；所述非遗传性耳聋可包括由选自下组的因素引起的耳聋：使用药物、外伤、感染、衰老、或其任意组合。所述受试者可以是遗传性耳聋患者或非遗传性耳聋患者。在一些实施方案中，所述受试者是内耳支持细胞中发生基因突变所导致的听觉障碍疾病患者。
在一些实施方案中，所述重组腺相关病毒粒可单独使用，或者例如与其他治疗听觉障碍疾病的药物联合使用。所述其他治疗听觉障碍疾病的药物包括但不限于，抗感染的抗生素类药物、神经营养因子类药物、离子通道调节剂类药物、维生素类药物等，或其组合。
在又一个方面，本发明提供了一种治疗听觉障碍疾病的方法，其包括给有此需要的受试者施用如本文所述的重组腺相关病毒粒或药物组合物。所述施用的方式优选为耳蜗内注射。在一些实施方案中，所述听觉障碍疾病的病因是表达于内耳支持细胞的听觉相关基因发生突变。
在一个方面，本发明提供了一种制备本文所述的基因表达载体的方法，其包括将用于治疗听觉障碍的治疗基因的表达盒可操作地连接到AAV载体中，从而获得如本文所述的重组AAV载体。
在一个方面，本发明提供了一种体外对听觉相关细胞进行感染的方法，其包括用本文所述的重组AAV突变体对所述听觉相关细胞进行感染，其中所述重组AAV突变体含有如本发明第一方面所述的病毒衣壳蛋白突变体。在一些实施方案中，所述听觉相关细胞为内耳支持细胞，例如顶端、中间或基底部分。
以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和用途和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。
附图说明
图1A显示了分别使用AAV-DJ及其突变体对小鼠支持细胞感染的筛选实验设计。图1B显示了三质粒系统中AAV-rep/cap突变体质粒的结构。
图2A-2C分别显示了AAV-DJ及其突变体对小鼠耳蜗顶端部分(A)、中间部分(B)和基底部分(C)支持细胞的感染结果。“DJ”代表AAV-DJ，S491A、S500A和S666A分别代表相应的3种AAV-DJ突变体。
图3显示了AAV-DJ及其突变体对小鼠耳蜗支持细胞感染的统计分析结果。
具体实施方式
本发明涉及可以高效感染内耳支持细胞的AAV载体及其在基因治疗中的用途。具体地，本发明人针对亲本或野生型AAV-DJ的cap序列进行改造(例如对特异性丝氨酸位点进行突变，优选取代)，获得了能够显著提高在内耳支持细胞中的感染效率的AAV载体。所述AAV载体可用于构建携带多种异源多核苷酸的基因表达载体(即重组AAV载体)，以用于各种用途。此外，所述AAV载体或基因表达载体还可以与药学上可接受的载体/赋形剂一起配制成药物组合物。
包含衣壳蛋白突变体的AAV病毒
腺相关病毒(AAV)，也称为腺伴随病毒，属微小病毒科依赖病毒属。AAV病毒颗粒由两部分组成：首先是二十面体样的蛋白质衣壳，衣壳内包裹着单链的病毒基因组DNA。AAV的基因组是长约4.7-6kb的单链DNA分子，基因组的两端都含有约145bp的反向末端重复序列(ITR)，可形成T型的发夹结构，以及含有DNA复制起始和病毒颗粒包装所需的顺式作用元件。基因组中间含有两个开放阅读框(ORF)，从左往右依次为Rep基因和Cap基因。Rep基因编码4个非结构蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，主要负责病毒基因组的复制、转录调控、位点特异性整合等。Cap基因编码3个结构蛋白VP1、VP2和VP3，由p40启动子负责转录，构成AAV的衣壳。单个AAV病毒颗粒含有60个拷贝的三种结构蛋白(VP1、VP2、VP3的比例约为1:1:10)。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。
如本文所用，术语“AAV”可用于指天然存在的亲本或野生型病毒本身或其衍生物。除以其它方式需要以外，所述术语涵盖所有亚型、血清型和假型，以及天然存在和重组形式。如本文中所使用，术语“血清型”是指基于与既定抗血清的衣壳蛋白质反应性而鉴别并且与其它AAV区分的AAV，例如存在于灵长类动物AAV的八种血清型，AAV1到AAV8。举例来说，血清型AAV2用于指病毒的衣壳由AAV2的cap基因编码的衣壳蛋白质构成。
自然界中存在多种血清型的AAV，例如从人类细胞中分离的有AAV2、3、5、6，从非人类动物细胞中分离的有AAV1、4和7-12，自然界中分离得到的AAV突变型已达100多种。不同血清型AAV的衣壳蛋白识别细胞表面的受体不同，因而对不同组织细胞的感染效率差异很大，表现出一定的器官靶向特异性。利用这个特点，可以实现特定血清型AAV对特定类型细胞组织特异性的高效转导。
目前的研究显示，AAV的组织亲嗜性及细胞转化效率主要由其衣壳决定。不同种类的衣壳，决定了不同的AAV具有不同的组织亲嗜性及转化效率。特别是衣壳上三倍轴区域的氨基酸，与AAV和细胞表面受体的结合密切相关。该区域氨基酸的微小变化，也可能导致亲嗜性或转化效率的显著改变(Wu，Asokan等人，J Virol.2006；80(22):11393–11397；Excoffon，Koerber等人，ProcNatlAcadSciUSA.2009；106(10):3865–3870)。AAV衣壳上其他区域的一些氨基酸的微小变化，会显著影响病毒的包装能力(Bleker，Pawlita等人，JVirol.2006；80(2):810–820)。因此，通过人工进化的方法对AAV衣壳蛋白Cap基因进行定向突变改造，可以筛选到具有高转导效率和不同感染特性的AAV载体，极大增加了AAV的应用潜力。
AAV-DJ拥有一种合成的新的AAV衣壳蛋白(由AAV2、AAV8和AAV9重组而来)，与其他血清型的AAV相比，AAV-DJ在多种细胞系中具有更高的转导效率。在本发明中，为了筛选出可以高效感染内耳细胞的AAV载体，对AAV-DJ的Cap基因序列(编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其功能性片段)进行了基因改造。
因此，在一个方面，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，所述AAV衣壳蛋白突变体包含与AAV亲本或野生型衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于如SEQID NO:1所示亲本或野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中第491位、第500位和第666位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或者与其有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在另一些实施方案中，所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白来自AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV13。例如，所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白具有选自SEQ ID NO:6-19的氨基酸序列或者与其有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在本发明中，序列比对、确定序列同一性百分比和对应序列位置可以根据本领域中已知的一些软件进行，例如BLAST程序、CLUSTALW(http:// www.ebi.ac.uk/clustalw/)、MULTALIN(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)或MUSCLE(Multiple Sequence Alignment)，以这些网站指示的缺省参数来探查(例如比对)获得的序列。如本文使用的，当关于比对氨基酸序列的特定对使用时，术语“同一性”或“百分比同一性”指氨基酸序列同一性百分比，其通过计数在比对中的相同匹配数目，并且将这样的相同匹配数目除以比对序列的长度来获得。
例如，可以通过Needleman-Wunsch总体比对和评分算法(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3):443-453)计算同一性，如通过作为EMBOSS软件包的部分分配的“针”程序执行的(Rice，P.等人(2000)EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite，Trends in Genetics 16(6):276-277，在其他资源中，可在embnet.org/resource/emboss和emboss.sourceforge.net处从EMBnet获得的版本6.3.1)，使用默认缺口罚分和评分矩阵(用于蛋白质的EBLOSUM62和用于DNA的EDNAFULL)。也可以使用等价程序。“等价程序”指任何序列比较程序，
另外的数学算法是本领域中已知的并且可以用于比较两个序列。参见例如Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264的算法，如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中改动。这种算法被引入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序内。可以用BLASTP程序(针对蛋白质序列搜索的蛋白质查询)执行BLAST蛋白质搜索，以获得与AAV衣壳蛋白同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)可以如Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389中所述利用。可替代地，PSI-Blast可以用于执行迭代搜索，其检测分子之间的遥远关系。参见Altschul等人(1997)同上。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如BLASTX和BLASTN)的默认参数。比对也可以通过检查手动执行。
当使用限定的氨基酸取代矩阵(例如，BLOSUM62)、缺口存在罚分和缺口延伸罚分，以便获得对于该对序列可能的最高评分，对两个序列就相似性评分进行比对时，它们是“最佳比对的”。氨基酸取代矩阵及其在量化两个序列之间的相似性中的用途是本领域众所周知的，并且在例如Dayhoff等人(1978)“A model of evolutionary change in proteins.”In“Atlas of Protein Sequence and Structure,”第5卷，Suppl.3(编辑M.O.Dayhoff)，第345-352页.Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.和Henikoff等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919中描述。BLOSUM62矩阵经常被用作序列比对方案中的缺省评分取代矩阵。对于在比对的序列之一中引入单个氨基酸缺口而施加缺口存在罚分，对于插入已经开放的缺口内的每个另外的空氨基酸位置施加缺口延伸罚分。由比对在每种序列上开始和结束的氨基酸位置、并且任选地通过在一个或两个序列中插入缺口或多个缺口、以便达到最高的可能评分来确定比对。尽管可以手动完成最佳比对和评分，但通过使用计算机执行的比对算法来促进该过程，所述算法例如缺口BLAST2.0，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述的，并且在美国国家生物技术信息中心网站(National Center for Biotechnology Information Website)(www.ncbi.nlm.nih.gov)上可公开获得。最佳比对(包括多重比对)可以使用例如PSI-BLAST来制备，所述PSI-BLAST可通过www.ncbi.nlm.nih.gov获得，其如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402所述。
关于与参考序列最佳比对的氨基酸序列，氨基酸残基“对应于”在比对中与残基配对的参考序列中的位置。“位置”由数目指示，该数目基于其相对于N末端的位置依次鉴定参考序列中的每个氨基酸。由于在确定最佳比对时必须考虑的缺失、插入、截短、融合等，一般而言，如通过从N末端简单计数确定的测试序列中的氨基酸残基数目不一定与参考序列中其对应位置的数目相同。例如，在其中比对的测试序列中存在缺失的情况下，在缺失位点处没有氨基酸对应于参考序列中的位置。当比对的参考序列中存在插入时，该插入将不对应于参考序列中的任何氨基酸位置。在截短或融合的情况下，在参考序列或比对序列中可以存在不对应于相应序列中的任何氨基酸的氨基酸段。
在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与如SEQ IDNO:1所示的AAV亲本或野生型衣壳蛋白的氨基酸序列相比，具有至少一个丝氨酸位点处的突变的氨基酸序列。所述衣壳蛋白突变体相比于亲本或野生型衣壳蛋白能够提高AAV病毒载体在哺乳动物内耳细胞中的感染效率。
如本文所用，“氨基酸突变”指预定氨基酸序列的氨基酸序列中的变化。例示性的突变包括添加、取代和删除。“氨基酸取代”指预定氨基酸序列中的现有氨基酸残基用另一种不同氨基酸残基置换。置换的残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基。优选地，在本发明中，对亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白氨基酸序列中的丝氨酸位点进行了突变。
“氨基酸添加”指将一个或多个氨基酸残基导入预定氨基酸序列中。氨基酸添加可包含“肽添加”，在这种情况中将包含两个或多个通过肽键相连接的氨基酸残基的肽导入预定氨基酸序列中。若氨基酸插入牵涉肽的添加，则所添加的肽可通过随机诱变来生成，使得它具有自然界中不存在的氨基酸序列。
在一些示例性实施方案中，进行突变的丝氨酸位点包括选自以下的至少一个：S491、S500和S666(位置编号参照SEQ ID NO:1)。所述突变可以是氨基酸的取代、缺失、或添加等。优选地，所述突变是丝氨酸到任何其他氨基酸的取代，例如不易被磷酸化修饰的氨基酸，例如酸性氨基酸、碱性氨基酸、非极性氨基酸、或除酪氨酸外的芳香族氨基酸，或者除苏氨酸外的小氨基酸。更优选所述突变是丝氨酸到丙氨酸的取代。
在一些具体的实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与如SEQ ID NO:1所示的亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白的氨基酸序列相比具有S491A取代的氨基酸序列或其功能性片段。例如，所述衣壳蛋白突变体可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2组成；所述功能性片段可以是N末端截短的功能性片段，例如第1-137位处的氨基酸缺失或者第1-202位处的氨基酸缺失的功能性片段。
在一些具体的实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与如SEQ ID NO:1所示的亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白的氨基酸序列相比具有S500A取代的氨基酸序列或其功能性片段。例如，所述衣壳蛋白突变体可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:3组成；所述功能性片段可以是N末端截短的功能性片段，例如第1-137位处的氨基酸缺失或者第1-202位处的氨基酸缺失的功能性片段。
在一些具体的实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与如SEQ ID NO:1所示的亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白的氨基酸序列相比具有S666A取代的氨基酸序列或其功能性片段。例如，所述衣壳蛋白突变体可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:4组成；所述功能性片段可以是N末端截短的功能性片段，例如第1-137位处的氨基酸缺失或者第1-202位处的氨基酸缺失的功能性片段。
如本文所用的，“功能性片段”是指多肽分子(例如衣壳蛋白)的一部分，其含有多肽(例如SEQ ID NO:2、3或4)全长的至少80％、90％、95％、或更多，且保留了全长多肽的功能。即，在本发明中所述的功能性片段能够成功组装成AAV病毒载体，而且相比于原AAV-DJ衣壳蛋白，也能够显著提高AAV病毒载体在哺乳动物内耳细胞中的感染效率。在一些实施方案中，所述功能性片段可以是SEQ ID No:1、2、3或4的N末端截短的片段，例如第1-137位处的氨基酸缺失或者第1-202位处的氨基酸缺失的功能性片段。
本发明中的衣壳蛋白突变体不限于AAV-DJ衣壳蛋白突变体，其可以是AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13亲本或野生型衣壳蛋白(分别为SEQ ID NO:6-19)或它们的任一突变体中的任一种。类似地，所述突变体在对应于如SEQ ID NO:1所示的亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白的第491位、第500位和第666位氨基酸的一个或多个位置处具有氨基酸突变，例如氨基酸缺失或取代。
下表A中汇总了不同血清型AAV衣壳蛋白氨基酸序列中对应于AAV-DJ衣壳蛋白氨基酸序列的第491位、第500位和第666位氨基酸的氨基酸位置。
表A.使用MUSCLE(多序列比对)完成的序列比对结果
Figure BDA0002411374700000151
Figure BDA0002411374700000161
因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与相应的如SEQ ID NO:6所示的亲本或野生型AAV1衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV1衣壳蛋白的氨基酸序列中第490位和第499位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与相应的如SEQ ID NO:7所示的亲本或野生型AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列中第489位和第498位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与相应的如SEQ ID NO:8所示的亲本或野生型AAV3A衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV3A衣壳蛋白的氨基酸序列中第490位和第499位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与相应的如SEQID NO:9所示的亲本或野生型AAV3B衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV3B衣壳蛋白的氨基酸序列中第490位和第499位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与相应的如SEQ ID NO:10所示的亲本或野生型AAV4衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV4衣壳蛋白的氨基酸序列中第484位和第498位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与相应的如SEQ ID NO:11所示的亲本或野生型AAV5衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV5衣壳蛋白的氨基酸序列中第485位的氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与相应的如SEQ ID NO:12所示的亲本或野生型AAV6衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV6衣壳蛋白的氨基酸序列中第490位和第499位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与相应的如SEQ ID NO:13所示的亲本或野生型AAV7衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV7衣壳蛋白的氨基酸序列中第492位和第501位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与相应的如SEQ ID NO:14所示的亲本或野生型AAV8衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV8衣壳蛋白的氨基酸序列中第492位、第501位和第667位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与相应的如SEQ ID NO:15所示的亲本或野生型AAV9衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV9衣壳蛋白的氨基酸序列中第490位和第499位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与相应的如SEQ ID NO:16所示的亲本或野生型AAV10衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV10衣壳蛋白的氨基酸序列中第492位和第501位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与相应的如SEQ ID NO:17所示的亲本或野生型AAV11衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV11衣壳蛋白的氨基酸序列中第483位的氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与相应的如SEQ ID NO:18所示的亲本或野生型AAV12衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV12衣壳蛋白的氨基酸序列中第492位的氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，其包含与相应的如SEQ ID NO:19所示的亲本或野生型AAV13衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV13衣壳蛋白的氨基酸序列中第487位和第496位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
同样地，所述突变可以为缺失或取代。所述取代可以是将丝氨酸取代为其他氨基酸，例如不易被磷酸化修饰的氨基酸，例如酸性氨基酸、碱性氨基酸、非极性氨基酸、或除酪氨酸外的芳香族氨基酸，或者除苏氨酸外的小氨基酸。氨基酸的分类是本领域已知的，其中：碱性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸；酸性氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸；极性氨基酸包括谷氨酰胺、天冬酰胺；疏水氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸；小氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸。
在一些具体的实施方案中，所述氨基酸突变为将丝氨酸取代为丙氨酸。在一些具体的实施方案中，将本发明中公开的衣壳蛋白突变体氨基酸序列的第491位、第500位和第666位处的丝氨酸分别取代为丙氨酸。
此外，本发明中还涵盖将衣壳蛋白突变体氨基酸序列的第491位、第500位和/或第666位处的突变进行任意组合，即不限于单位置突变，可以是两个或三个氨基酸位置处发生突变。例如，在第491位和第500位，第500位和第666位，第491位和第666位，或者第491位、第500位和第666位氨基酸处发生突变。
重组AAV载体(即AAV基因表达载体)
由于目前尚未发现AAV与人类的任何疾病相关，因此AAV病毒可以被改造成一种高效的外源基因转移工具，即用作基因表达载体。迄今已进行的所有以AAV载体为基因导入工具的临床试验中，均未发现有与AAV载体相关的、显著的副作用。因此，AAV载体已成为目前安全性最好的基因治疗及基因疫苗用的载体之一。
如本文所用，术语“重组AAV载体”、“重组AAV”、“重组AAV病毒”、“重组AAV病毒粒”、“重组AAV病毒颗粒”或“AAV基因表达载体”在本文中可以互换使用，其意指AAV病毒衣壳包裹的基因组DNA中含有异源核酸。该载体可以剔除基因组中的Rep和Cap基因，而代之以表达目的基因的异源多核苷酸，通过感染、转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、内含子、kozak序列、治疗基因、polyA序列、选择元件和报道基因。另外，载体还可以包含复制起点。
重组AAV病毒的组装必须依赖于三种成分，即：转移载体，由转基因表达读框以及两侧的AAV的ITR区(可以为完整的ITR，也可以为不完整的ITR)组成；AAV的cap和rep编码序列；辅助病毒功能。AAV载体具有相对成熟的组装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体组装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，三质粒转染组装系统因安全性高，是应用最为广泛的AAV载体组装系统，也是目前国际上主流的生产系统。具体而言，三质粒转染组装系统一般包含三种质粒：重组AAV转移质粒，其中仅保留基因组两端的ITR序列(可以为完整的ITR，也可以为不完整的ITR)，剔除了亲本或野生型AAV的Rep及Cap基因，而代之以表达目的基因的异源多核苷酸；重组AAV辅助质粒，其为克隆的ITR缺失的亲本或野生型AAV的基因组，以反式方式提供Rep和Cap基因编码蛋白的功能；以及AdV辅助病毒质粒，其中包含起辅助功能的基因E2a、E4orf6和VA RNA。E1a和E1b55k可由所要转染的细胞，例如HEK293细胞提供。
针对不同的治疗用途，本文中所述的异源多核苷酸(也可称为“目的多核苷酸”)可以编码多种基因产物(也可称为“目的基因产物”)。典型地，这类异源多核苷酸位于重组AAV载体内，由反向末端重复(ITR)区域侧接。本发明中可使用多种异源多核苷酸产生重组AAV载体以用于多种不同应用。这类异源多核苷酸包括但不限于，例如(i)适用于基因疗法以减轻由结构蛋白质或功能性蛋白的缺失、缺陷或次最佳含量引起的缺陷的多核苷酸，例如编码听觉缺陷相关基因的多核苷酸；(ii)转录到反义分子中的多核苷酸；(iii)转录到结合转录或转译因子的诱饵中的多核苷酸；(iv)编码细胞调节剂(如细胞激素)的多核苷酸；(v)可使受体细胞对特定药物(如疱疹病毒胸苷激酶基因)敏感的多核苷酸；(vi)用于癌症疗法的多核苷酸，如用于治疗多种癌症的E1A肿瘤抑制基因或p53肿瘤抑制基因；和(vii)编码基因编辑工具的多核苷酸。为了实现受体宿主细胞中目的基因产物的表达，该多核苷酸可以可操作地连接到启动子(其自有的或异源启动子)。本领域中已知许多适合的启动子，其选择取决于所需目的多核苷酸的表达水平；是否需要组成性表达、诱导性表达、细胞特异性或组织特异性表达等。重组AAV载体还可以含有可选择标记。
在基因治疗领域，已经开发出众多基于AAV载体的基因治疗药物，例如，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera、先天性黑蒙症基因治疗药物Luxturna、脊髓性肌萎缩症基因治疗药物Zolgensma等，均取得较好的临床试验效果。
针对听觉障碍疾病的重组AAV载体/基因表达载体
过去的研究表明，AAV病毒载体在内耳细胞的基因导入效率低下，这不仅影响了内耳基因功能的研究，而且阻碍了遗传性耳聋的基因治疗。因此，筛选出可以高效转导进内耳细胞的AAV载体是非常重要的。
内耳中的毛细胞(HC)和支持细胞(SC)都可以作为基因治疗的目标。有两种类型的感觉HC：外部HC(OHC)，其放大声音，和内部HC(IHC)，其将声波转换为电信号。SC位于内部和外部HC之间，并将感觉上皮锚定到基底层，保护HC并保持其环境。感觉神经性听力损失的一半是由于HC和SC的基因突变引起的。一些关键耳聋基因主要在SC中表达并具有功能，如GJB2，它影响SC的间隙连接，是最常见的遗传性耳聋基因。
在本发明中，分别设计了多种不同的AAV-DJ衣壳蛋白突变体，包装成表达tdTomato的AAV-DJ载体，并注射到小鼠的耳蜗中。注射后三周对耳蜗细胞的免疫荧光分析结果表明，包含含有S491A、S500A和/或S666A取代的AAV-DJ衣壳蛋白突变体的AAV-DJ载体能够显著提高在内耳支持细胞的感染效率。这为针对支持细胞的基因功能研究以及基因治疗策略提供了非常巨大的帮助。当然，本发明的AAV衣壳蛋白突变体不限于AAV-DJ衣壳蛋白突变体，如前文所述，其涵盖了AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13衣壳蛋白或它们的任一突变体中的任一种，所述突变体在对应于如SEQ ID NO:1所示的亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白的第491位、第500位和第666位氨基酸的一个或多个位置处具有氨基酸突变，例如缺失或取代，优选为丝氨酸到丙氨酸的取代。
用于预防、改善、或治疗听觉障碍疾病的目的基因包括但不限于，正常个体中表达的听力相关基因(即亲本或野生型的听力相关基因)，和/或用于基因编辑的相关基因。所述听力相关基因可以是在内耳支持细胞中表达的基因，例如，可以是选自下组的至少一种：GJB2、SLC26A4、MYO6、CLDN14、ESRRB、TRPN、GJB3、MYO15A、CDH23、12SrRNA、MYO15A、OTOF、TMC1、CDH23、TMPRSS3、POU3F4、USH2A、MYO1F、MYO7A、TRIOBP、KCNQ4、ADGRV1、PAX3、MITF、OTOA、PDZD7、TECTA、GPR98、KCNQ1和Brn4等，或其任意组合；所述用于基因编辑的相关基因可以是选自下组的至少一种：基因编辑酶(包括巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶、CRISPR-Cas系统、碱基编辑器和prime编辑系统等)和靶向特定位点的导向RNA(gRNA)。
药物组合物
本发明还涉及一种药物组合物，其包含：(i)如本文所述的重组AAV载体或重组AAV病毒粒；和(ii)药学上可接受的载体和/或赋形剂。
如本文所用，术语“药学上可接受”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于pH调节剂、表面活性剂、佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体，凝胶或固体载体，水性介质，非水性介质，抗微生物剂，等渗剂，缓冲剂，抗氧化剂，麻醉剂，悬浮/分散剂，螯合剂，稀释剂，佐剂，赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的各种组分的组合或更多。
在一些实施方案中，重组AAV载体或重组AAV病毒粒占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％，优选10-99.9wt％，更优选70-99wt％。
在一些实施方案中，所述药物组合物被配制为液体制剂，例如注射剂。在一些实施方案中，所述药物组合物配制为用于耳蜗内注射的注射剂。在一些实施方案中，组分(ii)为注射剂用载体，优选地，是选自下组的一种或多种：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。
本发明的药物组合物可以用于治疗哺乳动物受试者的各种疾病，例如耳部疾病，更具体地听觉障碍疾病。所述听觉障碍疾病可以选自下组：遗传性耳聋、非遗传性耳聋、或其组合。其中，所述遗传性耳聋可包括由选自下组的因素引起的耳聋：基因突变、基因缺失、或其组合；所述非遗传性耳聋可包括由选自下组的因素引起的耳聋：使用药物、外伤、感染、衰老、或其任意组合。所述受试者可以是遗传性耳聋患者或非遗传性耳聋患者。在一些实施方案中，所述受试者是内耳支持细胞中发生基因突变所导致的听觉障碍疾病患者。
可以通过多种途径施用于哺乳动物受试者，包括例如全身性或局部性注射或输注，例如静脉内注射或输注，特别是耳蜗内注射或输注。
治疗方法
本发明还提供了一种治疗哺乳动物耳部疾病的方法，其中包括将本发明所述的重组AAV载体或重组AAV病毒粒施用于所述哺乳动物。在一个具体实施方案中，所述重组AAV载体或重组AAV病毒粒通过全身性或局部性注射或输注进行施用，例如通过静脉内注射或输注、特别是耳蜗内注射或输注进行施用。所述耳部疾病可以是例如听觉障碍疾病。优选地，所述听觉障碍疾病可以选自下组：遗传性耳聋、非遗传性耳聋、或其组合。其中，所述遗传性耳聋可包括由选自下组的因素引起的耳聋：基因突变、基因缺失、或其组合；所述非遗传性耳聋可包括由选自下组的因素引起的耳聋：使用药物、外伤、感染、衰老、或其任意组合。所述受试者可以是遗传性耳聋患者或非遗传性耳聋患者。在一些实施方案中，所述受试者是内耳支持细胞中发生基因突变所导致的听觉障碍疾病患者。
有益效果
在一些方面，本文所公开的包含AAV-DJ衣壳蛋白突变体的AAV载体或AAV病毒粒提供了如下有益效果：
1)效率高：本发明的AAV载体或AAV病毒粒对内耳支持细胞(尤其是基底支持细胞)的感染效率高。
2)易生产：本发明的AAV载体或AAV病毒粒出毒率高，稳定性也高，在生产过程中容易获得高滴度高质量的AAV病毒颗粒。
3)安全性好：AAV是FDA批准用于临床治疗的载体，并且本发明的AAV载体对内耳组织无损伤。
4)靶向性高：相对于小分子药物，本发明的AAV载体或AAV病毒粒具有组织和细胞特异性感染的特性，可以靶向特定的细胞类型。
实施例
通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。
实验材料和方法
小鼠
ICR小鼠(P1，购自上海灵畅生物科技有限公司)被用于AAV病毒注射。动物的使用和照料都在动物伦理委员会的指导下完成。
细胞培养和感染
HEK293T细胞用10％FBS培养基，成分为DMEM(Gibco，11965-02)、10％胎牛血清(FBS)(Gibco)、2mM谷氨酰胺(Gibco)、1％青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific)和0.1mM非必需氨基酸(Gibco)。所有细胞都在5％CO2、37℃下培养。
HEK293T细胞用AAV感染后48小时，通过荧光显微镜观察tdTomato表达情况。
AAV病毒包装
采用包含AAV-rep/cap突变体质粒(具体构建见实施例1)、pHelper质粒(从中科院神经科学研究所获得)和包含tdTomato荧光标记基因的AAV-转基因质粒(从中科院神经科学研究所获得)的三质粒系统转染293T细胞，转染4-6h后换液。收集第四天上清和细胞。上清用PEG沉淀过夜，4200rpm，4℃离心30min，再4400rpm离心10min，弃上清。用1xGB溶解。细胞用液氮反复冻融三次。上清及细胞都加benzonase、5M NaCl消化30min。消化完后，3000g离心10min，取上清。密度梯度超速离心，68000rpm 18℃1h 25min。取层，加PBS稀释后用超滤管浓缩。
AAV病毒注射
ICR P0小鼠，雌雄不限，按照不同的AAV突变体随机分组，每组4只小鼠。在体式显微镜下，以眼科剪于耳后沟2mm处剪开皮肤，稍分离皮下组织。可见面神经，听泡后壁以及二腹肌后腹。用玻璃微电极刺破耳蜗侧壁韧带并将1微升病毒注射至小鼠耳蜗。注射完毕后轻轻拔出玻璃电极，缝合切口。注射3周后取材分析表型。
免疫染色分析
免疫染色实验中，小鼠用戊巴比妥钠(50mg/Kg，Sigma)麻醉后，通过蠕动泵(Gilson)用0.9％生理盐水和4％多聚甲醛进行心脏灌流，然后在4％多聚甲醛中4℃固定过夜。第二天组织在10％EDTA中脱钙处理。在脱钙完成后，在解剖显微镜下分离出基底膜，并剪成三段(顶端、中间和基底部分)。分离后的基底膜用0.1M磷酸缓冲液(PB)洗三遍，然后用5％NGS稀释的一抗在4℃孵育过夜。第二天，切片用PB洗三遍，然后在回转式摇床上用二抗室温孵育两小时。最后切片用DAPI复染20分钟，在载玻片上用SlowFade DiamondAntifadeMountant(Life)进行封片。
抗体
支持细胞：一抗：山羊抗Sox2(Santa Cruz Biotechnology，sc-17320)；二抗：Alexa
Figure BDA0002411374700000261
488AffiniPure驴抗山羊IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch，705-545-003)
毛细胞：一抗：兔抗肌球蛋白VI多克隆(Proteus Biosciences，25-6791)；二抗：CyTM5 AffiniPure驴抗兔IgG(H+L)(Jackson Immuno Research，711-175-152)
数据统计分析及软件
对支持细胞和毛细胞内的感染效率进行量化，通过统计随机100微米视野内支持细胞中mCherry+细胞比例来说明感染效率。结果从至少3只小鼠中获得，并且以平均值±标准差表示。＊P<0.05，＊＊＊P<0.001，不配对T检验。
Snapgene:用于质粒图谱构建设计
Excel:原始数据处理
ImageJ:实验图片处理
Adobe photoshop CS6:实验图片处理
Adobe Illustrator CS4:实验图片处理
实施例1：AAV-DJ突变体筛选实验设计
对AAV-DJ(中科院神经所，参见Grimm D等人，J Virol.2008Jun；82(12):5887-911)的cap序列(SEQ ID No:1)进行基因改造，以筛选出可以高效感染支持细胞的AAV载体。具体地，本发明人设计了3种AAV-DJ衣壳蛋白突变体，分别包含以下取代：S491A、S500A和S666A，通过PCR扩增得到相应的多核苷酸(突变位点的丙氨酸都是由GCC编码，其余位置处核苷酸与AAV-DJ cap基因序列相同)，然后构建相应的AAV-rep/cap突变体质粒(参见图1B)。使用三质粒系统分别包装AAV-DJ及其突变体(3种)的病毒粒，然后注射到P0 ICR小鼠的耳蜗中，2-3周后取材对支持细胞的感染情况进行荧光观察和表型分析(参见图1A)。
结果显示S491A、S500A和S666A突变体能有效地提高DJ在支持细胞的感染能力(参见图2)，尤其是对基底支持细胞和中间支持细胞的感染能力，因此将这3种突变体用于后续实验。
实施例2：在小鼠耳蜗中的感染效率
将AAV-DJ及其突变体病毒分别注射至P0 ICR小鼠的耳蜗。每只小鼠注射4×109vgAAV病毒。同样的在注射3周后，对小鼠的耳蜗基底膜进行剥离并且染色，分别统计顶端、中间以及基底三个部分的支持细胞中Tdtomato阳性细胞比例。
实验结果显示，AAV-DJ突变体(S491A、S500A和S666A)在顶端部分的支持细胞(sox2阳性)中分别有55.7％、51.42％和45.0％的细胞为Tdtomato阳性，高于AAV-DJ的39.6％，但无显著性差异(图2A、图3)。
AAV-DJ突变体(S491A、S500A和S666A)在中间部分的支持细胞(sox2阳性)中分别有64.4％、41.9％和49.2％的细胞为Tdtomato阳性，显著高于AAV-DJ的32.0％(图2B、图3)。
AAV-DJ突变体(S491A、S500A和S666A)在基底部分的支持细胞(sox2阳性)中分别有48.0％、53.1％和45.9％的细胞为Tdtomato阳性，显著高于AAV-DJ的12.9％(图2C、图3)。
通过统计随机100微米视野内顶端、中间和基底部分支持细胞中mCherry+细胞比例来说明感染效率。结果从至少3只小鼠中获得，并且以平均值±标准差表示。＊P<0.05，＊＊＊P<0.001，不配对T检验。
以上实验结果表明，在支持细胞中，AAV-DJ的突变体(S491A、S500A和S666A)可以显著提高支持细胞的感染效率，尤其是基底细胞的感染率。
本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。
序列表
<110> 一种腺相关病毒载体及其用途
<120> 辉大（生物）上海科技有限公司
<130> IDC206005
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 737
<212> PRT
<213> AAV-DJ
<400> 1
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160
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165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
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275 280 285
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325 330 335
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Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr His Glu Leu Arg Ala Ile Gly Ser Arg
725 730 735
Phe Leu Thr His His Leu
740
<210> 19
<211> 733
<212> PRT
<213> AAV13
<400> 19
Met Thr Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser Glu
1 5 10 15
Gly Val Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly
35 40 45
Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val
50 55 60
Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Gln
65 70 75 80
Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp
85 90 95
Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn
100 105 110
Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro Leu
115 120 125
Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro
130 135 140
Val Glu Gln Ser Pro Ala Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly Lys
145 150 155 160
Ser Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly
165 170 175
Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly Ala
195 200 205
Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser
210 215 220
Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr
225 230 235 240
Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr
245 250 255
Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Thr Asn Asp Asn His Tyr Phe
260 265 270
Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys
275 280 285
His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly
290 295 300
Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys
305 310 315 320
Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr
325 330 335
Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val
340 345 350
Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val
355 360 365
Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln
370 375 380
Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln
385 390 395 400
Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu Asp
405 410 415
Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu
420 425 430
Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr Gln
435 440 445
Thr Ala Ser Gly Thr Gln Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser Gln Ala Gly
450 455 460
Pro Thr Ser Met Ser Leu Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys
465 470 475 480
Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Gln Ala Asn Asp Asn Asn Asn Ser
485 490 495
Asn Phe Pro Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp
500 505 510
Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp Asp Lys
515 520 525
Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Thr Leu Ile Phe Gly Lys Glu Gly
530 535 540
Thr Asn Ala Asn Asn Ala Asp Leu Glu Asn Val Met Ile Thr Asp Glu
545 550 555 560
Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Thr
565 570 575
Val Ser Asn Asn Leu Gln Asn Ser Asn Ala Gly Pro Thr Thr Gly Thr
580 585 590
Val Asn His Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp
595 600 605
Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly
610 615 620
His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro
625 630 635 640
Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Pro
645 650 655
Thr Asn Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser
660 665 670
Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn
675 680 685
Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys
690 695 700
Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu
705 710 715 720
Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730

Claims (33)

1.一种AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，所述AAV衣壳蛋白突变体包含与AAV亲本或野生型衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于如SEQ ID NO:1所示亲本或野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中第491位、第500位和第666位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，其中所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或者与其有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，其中所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白来自AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV13，优选地，所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白具有选自SEQ ID NO:6-19的氨基酸序列或者与其有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，其中所述AAV衣壳蛋白突变体包含：
与SEQ ID NO:1所示的亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白的氨基酸序列中第491位、第500位和第666位中一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列；
与SEQ ID NO:7所示的亲本或野生型AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列中第489位和第498位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列；
与SEQ ID NO:14所示的亲本或野生型AAV8衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV8衣壳蛋白的氨基酸序列中第492位、第501位和第667位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列；或
与SEQ ID NO:15所示的亲本或野生型AAV9衣壳蛋白的氨基酸序列相比，在对应于亲本或野生型AAV9衣壳蛋白的氨基酸序列中第490位和第499位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，其中所述突变导致该AAV衣壳蛋白突变体具有增加的靶向受试者内耳的支持细胞例如顶端、中间和基底支持细胞的活性。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，其中所述氨基酸突变是氨基酸缺失或氨基酸取代。
7.根据权利要求6所述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，其中所述氨基酸取代是取代为不易被磷酸化修饰的氨基酸，例如取代为酸性氨基酸、碱性氨基酸、非极性氨基酸、或除酪氨酸外的芳香族氨基酸或者除苏氨酸外的小氨基酸，优选取代为丙氨酸。
8.根据权利要求7所述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，其包含在对应于如SEQID NO:1所示亲本或野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中第491位、第500位和第666位的一个或多个位置处具有选自下组的一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列：S491A、S500A、和S666A。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，其中所述功能性片段为N端氨基酸缺失的片段。
10.根据权利要求1所述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，其中所述功能性片段为与SEQ ID NO:1所示亲本或野生型AAV-DJ衣壳蛋白氨基酸序列中的第1-137位或第1-202位对应的位置处的氨基酸缺失的片段。
11.根据权利要求1所述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段，其中所述AAV衣壳蛋白突变体具有SEQ ID NO:2-4中的任一序列。
12.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-11中任一项所述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段的核酸序列。
13.一种载体，其中包含权利要求12所述的分离的多核苷酸。
14.根据权利要求13所述的载体，其选自表达载体、穿梭载体、和整合载体。
15.一种宿主细胞，其中包含权利要求13或14所述的载体或者权利要求12所述的多核苷酸。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其是原核细胞例如大肠杆菌，或者真核细胞例如酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、人细胞(如HEK293T细胞)。
17.一种重组腺相关病毒载体，其中包含权利要求1-11中任一项所述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段。
18.一种重组腺相关病毒粒，其包含：
(a)根据权利要求1-11中任一项所述的AAV衣壳蛋白突变体或其功能性片段；和
(b)编码异源基因产物的异源多核苷酸。
19.根据权利要求18所述的重组腺相关病毒粒，其中所述异源多核苷酸在5’和3’端具有AAV ITR序列，所述ITR序列为完整或不完整的ITR。
20.根据权利要求18或19所述的重组腺相关病毒粒，其中所述异源基因是选自以下的至少一种：听力相关基因、用于基因编辑的相关基因和可选择标记基因。
21.根据权利要求20的重组腺相关病毒粒，其中所述听力相关基因是在内耳毛细胞和/或支持细胞中表达的基因。
22.根据权利要求21的重组腺相关病毒粒，其中所述基因是选自下组的至少一种：GJB2、SLC26A4、MYO6、CLDN14、ESRRB、TRPN、GJB3、MYO15A、CDH23、12SrRNA、MYO15A、OTOF、TMC1、CDH23、TMPRSS3、POU3F4、USH2A、MYO1F、MYO7A、TRIOBP、KCNQ4、ADGRV1、PAX3、MITF、OTOA、PDZD7、TECTA、GPR98、KCNQ1和Brn4。
23.根据权利要求22的重组腺相关病毒粒，其中所述用于基因编辑的相关基因选自基因编辑酶的编码基因和/或靶向特定位点的导向RNA(gRNA)。
24.根据权利要求23的重组腺相关病毒粒，其中所述基因编辑酶为选自以下的至少一种：巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶、CRISPR-Cas系统、碱基编辑器和prime编辑系统。
25.根据权利要求19的重组腺相关病毒粒，其中所述ITR序列可来自于任何AAV，优选是源自AAV2的ITR序列。
26.根据权利要求18的重组腺相关病毒粒，其中所述异源多核苷酸还包含选自以下的至少一种：启动子序列、转录起始序列、增强子序列、内含子、kozak序列、polyA序列、选择元件和报道基因。
27.一种制备权利要求18-26中任一项的重组腺相关病毒粒的方法，其包括将编码异源基因产物的异源多核苷酸可操作地连接到包含权利要求1-11中任一项所述的AAV衣壳蛋白突变体的AAV载体的基因组中。
28.一种药物组合物，其包含权利要求18-26中任一项的重组腺相关病毒载体和药学上可接受的载体/赋形剂。
29.根据权利要求18-26中任一项所述的重组腺相关病毒粒在制备用于感染哺乳动物内耳细胞的药物中的用途。
30.根据权利要求29的用途，其中所述内耳细胞为支持细胞。
31.根据权利要求29或30的用途，其中所述哺乳动物为人、猴、猿、黑猩猩、猫、狗、牛、马、小鼠、大鼠、兔等。
32.根据权利要求18-26中任一项的重组腺相关病毒粒在制备用于减轻、改善或治疗受哺乳动物受试者中听觉障碍疾病的药物中的用途。
33.一种治疗哺乳动物受试者中的耳部疾病例如听觉障碍疾病的方法，其中包括将权利要求18-26中任一项的重组腺相关病毒粒施用于所述哺乳动物受试者。
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