CN112011571A - 一种用于治疗脊髓性肌萎缩的基因治疗药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含衣壳蛋白变体的腺相关病毒(AAV)载体，从其构建的携带有基因表达盒的基因表达载体，生成此类腺相关病毒载体或基因表达载体的方法，以及此类腺相关病毒载体和基因表达载体在疾病治疗方面的用途。

Description

一种用于治疗脊髓性肌萎缩的基因治疗药物

技术领域

本发明涉及基因工程和基因治疗领域，具体地，本发明涉及一种包含衣壳蛋白变体的腺相关病毒(AAV)载体，从其构建的携带有基因表达盒的基因表达载体，生成和使用此类腺相关病毒载体或基因表达载体的方法，以及此类腺相关病毒载体和基因表达载体在脊髓性肌萎缩治疗方面的用途。

序列表

本申请包含序列表，其通过提述并入本文。

背景技术

脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy，SMA)是一类由脊髓前角运动神经元变性导致肌无力、肌萎缩的遗传性疾病，是遗传性婴儿致死类遗传病中的一种。SMA主要是由于SMN1(survival motor neuron1)基因突变导致的常染色体隐性疾病，人群中SMN1基因突变携带率为1/50，发病率大约为1/6000到1/10000。临床上SMA根据发病和存活时间将SMA分为1-4型。其中I型SMA大约占所有SMA病例的50％～60％，发病期在出生后6个月以内，一般生存不会超过两年；II型SMA发病时间大约在出生后6～18个月，能够独立坐起；III型SMA在出生后18个月发病，随着年龄增长，逐渐表现出症状；IV型SMA为晚发型，成年期发病，基本不影响寿命。

大约95％的SMA致病原因是由于SMN1基因的纯合缺失，导致SMN蛋白表达量降低。SMN蛋白是一个32KDa的蛋白，在所有细胞中表达，在RNP(ribonucleoprotein)合成过程中有重要作用。虽然在人细胞中，能够表达SMN蛋白的基因还有另外一个拷贝，SMN2，但是由于SMN2基因7号外显子5’端的一个碱基突变，导致外显子跳跃，完整SMN蛋白表达量只有10％。SMN蛋白缺失影响包括泛素稳态、线粒体功能等神经元稳态相关细胞通路，最终导致神经元变性。

I型SMA的治疗药物，主要针对SMN蛋白表达量减少而开发。其中包括使用靶向SMN2基因的ASO(antisense oligonucleotides)或者小分子提高SMN2表达完整SMN蛋白表达量的方法，以及使用AAV或者其他载体，递送正常SMN1基因提高SMN蛋白表达量的方法等。目前已上市药物Spinraza为靶向SMN2剪切的ASO药物，Zolgensma为使用AAV9为载体递送SMN1基因的在体基因治疗药物。相较于需要多次给药的ASO药物或者小分子药物，单次给药的在体基因治疗更具有前景。

在SMA的基因治疗研究中，常用载体有慢病毒载体(LV，lentiviral vector)、AAV(adeno-associated virus)载体等。其中LV是最早用于SMA在体基因治疗研究的载体，但是在SMA疾病小鼠模型上的治疗效果并不理想，仅能延长SMA小鼠3-5天的寿命。相较于慢病毒载体，AAV载体具有长效表达、免疫原性低、安全等特点，更适合用于在体基因治疗。2010年Brain Kaspar等人使用scAAV9(self-complementary AAV9)为载体，递送SMN1基因到SMA疾病模型鼠中，有效延长了模型鼠寿命，并以此研究为基础开发了药物Zolgensma。而Zolgensma为静脉注射全身性用药，临床使用剂量为1.1*10¹⁴vg/kg，目前生产难度较大。2017年，Viviana Gradinaru团队在AAV9的基础上进行筛选改造，获得了对神经系统感染效率更强的变体AAV-PHP.eB，有望降低基因治疗药物使用剂量。

本领域中需要新的针对SMA的基因治疗药物和方法。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒(AAV)载体，其包含：

(a)衣壳蛋白变体或其功能性片段，所述衣壳蛋白变体或其功能性片段的氨基酸序列包含DGTLAVPFK；和

(b)编码异源基因产物的异源多核苷酸。

在一些实施方案中，本发明的所述衣壳蛋白变体包含与亲本或野生型AAV衣壳蛋白相比，具有DGTLAVPFK肽的氨基酸序列，所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白选自AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13野生型衣壳蛋白以及包含与所述亲本或野生型衣壳蛋白的氨基酸序列有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

在一些实施方案中，本发明的所述衣壳蛋白变体相比于野生型AAV9衣壳蛋白，包含DGTLAVPFK。

在一些实施方案中，所述衣壳蛋白变体的氨基酸序列在对应于野生型AAV9衣壳蛋白的氨基酸序列的第586位和第589位之间插入DGTLAVPFK或者用DGTLAVPFK替换原有氨基酸。在一些实施方案中，所述原有氨基酸为AQ。

在一些实施方案中，所述衣壳蛋白变体包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，所述异源多核苷酸位于所述重组腺相关病毒载体的基因组中的5’ITR序列下游，且替换了部分或全部的Rep基因和Cap基因序列。

在一些实施方案中，所述重组腺相关病毒载体的基因组为选自以下的AAV载体的基因组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13。

在一些实施方案中，所述重组腺相关病毒载体的基因组为AAV9载体或AAV2载体的基因组。

在一些实施方案中，所述异源基因是选自以下的至少一种：在神经系统中表达的基因、要递送至神经系统的基因、用于基因编辑的相关基因和可选择标记基因。所述神经系统可以是中枢神经系统或外周神经系统，优选中枢神经系统。

在一些实施方案中，所述在神经系统中表达的基因是SMN1基因。

在一些实施方案中，所述用于基因编辑的相关基因选自基因编辑酶的编码基因和靶向特定位点的导向RNA(gRNA)。所述基因编辑酶可以为选自以下的至少一种：巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶、CRISPR-Cas系统、碱基编辑器和prime编辑系统。

在一些实施方案中，所述异源多核苷酸还包含选自以下的至少一种：启动子、增强子、内含子、Kozak序列、和poly A。

在一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如本文公开的任一种重组腺相关病毒载体。

在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本文公开的任一种重组腺相关病毒载体和药学上可接受的载体/赋形剂。

在一个方面，本发明提供了一种制备本文所述的基因表达载体的方法，其包括将表达目的基因的表达盒可操作地连接到AAV载体中，从而获得如本文所述的重组AAV载体。

在一个方面，本发明提供了一种对神经细胞进行感染的方法，其包括用本文所述的重组AAV载体对神经细胞进行感染，其中所述重组AAV变体含有编码如本发明所述的病毒衣壳蛋白变体。

在一个方面，本发明提供了一种载体，所述载体含有如本文所述的多核苷酸。所述载体可以选自表达载体、穿梭载体、和整合载体。

在一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本文所述的载体，或其基因组中整合有如本文所述的多核苷酸。所述宿主可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，所述原核细胞是大肠杆菌。在一些实施方案中，所述真核细胞可选自下组：酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、人细胞(如HEK293T细胞)，或其组合。

在一个方面，本发明提供了如本文公开的重组腺相关病毒载体或药物组合物在制备用于预防、减轻或治疗受试者中神经系统疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述神经系统疾病为涉及受试者的运动功能的运动神经元疾病。

在一些实施方案中，所述运动神经元疾病选自脊髓性肌萎缩(SMA)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑共济失调、原发性侧索硬化(PLS)和外伤性脊髓损伤。在一些具体的实施方案中，所述运动神经元疾病为脊髓性肌萎缩(SMA)。

在一些实施方案中，所述受试者是患有SMA病的患者，包括I型、II型、III型和IV型SMA病患者，例如新生的或未成年的患有SMA病的患者。

在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含如本文公开的任一种重组腺相关病毒载体。

以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和用途和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。

附图说明

图1显示了AAV-PHP.eB衣壳蛋白氨基酸序列与AAV9衣壳蛋白氨基酸序列的差异部分的比对。

图2显示了组装本发明的重组AAV-PHP.eB载体所采用的三质粒系统。

图3显示了分别用两种AAV载体给药或未用AAV载体治疗的SMN1缺陷小鼠的生存率随时间的变化。

图4显示了正常小鼠、低剂量scAAV-PHP.eB-hSMN1给药、高剂量scAAV9-hSMN1给药和未用AAV载体给药的SMN1缺陷小鼠的体重。

图5显示了正常小鼠、低剂量scAAV-PHP.eB-hSMN1给药、高剂量scAAV9-hSMN1给药和未用AAV载体给药的SMN1缺陷小鼠的翻正反射结果。

具体实施方式

本发明涉及一种包含衣壳蛋白变体或其功能性片段的重组AAV载体，及其在基因治疗中的用途。具体地，所述衣壳蛋白变体或其功能性片段的氨基酸序列包含DGTLAVPFK肽，从而对神经系统有增强的感染能力。所述重组AAV载体可以含有源自不同血清型的AAV的基因，并在基因组中插入表达目的基因产物的异源多核苷酸。所述异源多核苷酸可以例如编码在神经系统中表达的治疗基因。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸编码SMN1基因(优选人SMN1基因)。

本发明中提供的重组AAV载体能够有效地将SMN1基因转染到受试者的神经细胞中，以治疗与SMN1基因突变或缺失显著相关的疾病(例如脊髓性肌萎缩病)。此外，所述重组AAV载体还可以与药学上可接受的载体/赋形剂一起配制成药物组合物。

包含衣壳蛋白变体的AAV载体

腺相关病毒(AAV)，也称为腺伴随病毒，属微小病毒科依赖病毒属。AAV病毒颗粒由两部分组成：首先是二十面体样的蛋白质衣壳，衣壳内包裹着单链的病毒基因组DNA。AAV的基因组是长约4.7-6kb的单链DNA分子，基因组的两端都含有约145bp的反向末端重复序列(ITR)，可形成T型的发夹结构，以及含有DNA复制起始和病毒颗粒包装所需的顺式作用元件。基因组中间含有两个开放阅读框(ORF)，从左往右依次为Rep基因和Cap基因。Rep基因编码4个非结构蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，主要负责病毒基因组的复制、转录调控、位点特异性整合等。Cap基因编码3个结构蛋白VP1、VP2和VP3，由p40启动子负责转录，构成AAV的衣壳。单个AAV病毒颗粒含有60个拷贝的三种结构蛋白(VP1、VP2、VP3的比例约为1:1:10)。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。

如本文所用，术语“AAV”可用于指天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。除以其它方式需要以外，所述术语涵盖所有亚型、血清型和假型，以及天然存在和重组形式。如本文中所使用，术语“血清型”是指基于与既定抗血清的衣壳蛋白质反应性而鉴别并且与其它AAV区分的AAV，例如存在于灵长类动物AAV的8种血清型，AAV-1到AAV-8。举例来说，血清型AAV2用于指病毒的衣壳由AAV2的cap基因编码的衣壳蛋白质构成。

自然界中存在多种血清型的AAV，例如从人类细胞中分离的有AAV2、3、5、6，从非人类动物细胞中分离的有AAV1、4和7-12，自然界中分离得到的AAV突变型已达100多种。不同血清型AAV的衣壳蛋白识别细胞表面的受体不同，因而对不同组织细胞的感染效率差异很大，表现出一定的器官靶向特异性。利用这个特点，可以实现特定血清型AAV对特定类型细胞组织特异性的高效转导。

目前的研究显示，AAV的组织亲嗜性及细胞转化效率主要由其衣壳决定。不同种类的衣壳，决定了不同的AAV具有不同的组织亲嗜性及转化效率。特别是衣壳上三倍轴区域的氨基酸，与AAV和细胞表面受体的结合密切相关。该区域氨基酸的微小变化，也可能导致亲嗜性或转化效率的显著改变(Wu，Asokan等人，J Virol.2006；80(22):11393–11397；Excoffon，Koerber等人，ProcNatlAcadSciUSA.2009；106(10):3865–3870)。AAV衣壳上其他区域的一些氨基酸的微小变化，会显著影响病毒的包装能力(Bleker，Pawlita等人，JVirol.2006；80(2):810–820)。因此，通过人工进化的方法对AAV衣壳蛋白Cap基因进行定向突变改造，可以筛选到具有高转导效率和不同感染特性的AAV载体，极大增加了AAV的应用潜力。

在一些实施方案中，本发明提供了一种包含DGTLAVPFK肽的AAV衣壳蛋白变体或其功能性片段。所述AAV衣壳蛋白变体包含与亲本或野生型AAV衣壳蛋白相比，具有DGTLAVPFK的氨基酸序列，所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白可以选自AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13野生型衣壳蛋白的氨基酸序列以及包含与所述氨基酸序列有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

在一些具体的实施方案中，所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白为野生型AAV9衣壳蛋白(例如如SEQ ID No:3所示)。所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白还可以是其他血清型的野生型衣壳蛋白或包含其同源氨基酸序列的蛋白质。

在一些实施方案中，所述衣壳蛋白变体可以在对应于野生型AAV9衣壳蛋白氨基酸序列第586位和第589位之间的氨基酸位置处用DGTLAVPFK肽替换原有氨基酸(例如AQ)。在一些实施方案中，所述衣壳蛋白变体可以在对应于上述氨基酸以外的其他位置处包含DGTLAVPFK肽。在一些例示性实施方案中，如上文描述的亲本或野生型AAV衣壳蛋白为如SEQID No:3所示的野生型AAV9衣壳蛋白，且所述衣壳蛋白变体包含与该野生型AAV9衣壳蛋白相比，在对应于其氨基酸序列第586位和第589位之间的氨基酸位置处用DGTLAVPFK肽替换AQ的氨基酸序列。

下表A中汇总了不同血清型AAV衣壳蛋白氨基酸序列中对应于AAV-9衣壳蛋白氨基酸序列的第586位至第589位氨基酸的氨基酸位置序列。

表A.使用MUSCLE(多序列比对)完成的序列比对结果

在一些具体的实施方案中，所述衣壳蛋白变体可以包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列或由其组成；所述功能性片段可以为所述AAV衣壳蛋白突变体的N端截短的功能性片段。例如，所述功能性片段可以是对应于野生型AAV9衣壳蛋白氨基酸序列第1-137位或第1-202位的氨基酸缺失的片段。在一些实施方案中，所述功能性片段为SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第1-137位或第1-202位的氨基酸缺失的片段。

如本文所用的，“功能性片段”是指多肽分子(例如衣壳蛋白)的一部分，其含有多肽全长(例如SEQ ID NO:1等)的至少80％、90％、95％或更多，且保留了全长多肽的功能。即，在本发明中所述的功能性片段能够成功组装成AAV病毒载体，而且基本保留了含有SEQID NO:1的衣壳蛋白变体对神经系统的感染效率。在一些实施方案中，所述功能性片段包含DGTLAVPFK肽。

此外，本发明还涵盖包含与SEQ ID No:1所示的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的衣壳蛋白变体，以及包含此类衣壳蛋白变体或其功能性片段的AAV载体。

在本发明中，序列比对、确定序列同一性百分比和对应序列位置可以根据本领域中已知的一些软件进行，例如BLAST程序、CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)、MULTALIN(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)或MUSCLE(Multiple Sequence Alignment)，以这些网站指示的缺省参数来探查(例如比对)获得的序列。如本文使用的，当关于比对氨基酸序列的特定对使用时，术语“同一性”、“同源性”或“百分比同一性”指氨基酸序列同一性百分比，其通过计数在比对中的相同匹配数目，并且将这样的相同匹配数目除以比对序列的长度来获得。

例如，可以通过Needleman-Wunsch总体比对和评分算法(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3):443-453)计算同一性，如通过作为EMBOSS软件包的部分分配的“针”程序执行的(Rice，P.等人(2000)EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite，Trends in Genetics 16(6):276-277，在其他资源中，可在embnet.org/resource/emboss和emboss.sourceforge.net处从EMBnet获得的版本6.3.1)，使用默认缺口罚分和评分矩阵(用于蛋白质的EBLOSUM62和用于DNA的EDNAFULL)。也可以使用等价程序。“等价程序”指任何序列比较程序，

另外的数学算法是本领域中已知的并且可以用于比较两个序列。参见例如Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264的算法，如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中改动。这种算法被引入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序内。可以用BLASTP程序(针对蛋白质序列搜索的蛋白质查询)执行BLAST蛋白质搜索，以获得与AAV衣壳蛋白同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)可以如Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389中所述利用。可替代地，PSI-Blast可以用于执行迭代搜索，其检测分子之间的遥远关系。参见Altschul等人(1997)同上。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如BLASTX和BLASTN)的默认参数。比对也可以通过检查手动执行。

当使用限定的氨基酸取代矩阵(例如，BLOSUM62)、缺口存在罚分和缺口延伸罚分，以便获得对于该对序列可能的最高评分，对两个序列就相似性评分进行比对时，它们是“最佳比对的”。氨基酸取代矩阵及其在量化两个序列之间的相似性中的用途是本领域众所周知的，并且在例如Dayhoff等人(1978)“A model of evolutionary change in proteins.”In“Atlas of Protein Sequence and Structure,”第5卷，Suppl.3(编辑M.O.Dayhoff)，第345-352页.Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.和Henikoff等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919中描述。BLOSUM62矩阵经常被用作序列比对方案中的缺省评分取代矩阵。对于在比对的序列之一中引入单个氨基酸缺口而施加缺口存在罚分，对于插入已经开放的缺口内的每个另外的空氨基酸位置施加缺口延伸罚分。由比对在每种序列上开始和结束的氨基酸位置、并且任选地通过在一个或两个序列中插入缺口或多个缺口、以便达到最高的可能评分来确定比对。尽管可以手动完成最佳比对和评分，但通过使用计算机执行的比对算法来促进该过程，所述算法例如缺口BLAST2.0，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述的，并且在美国国家生物技术信息中心网站(National Center for Biotechnology Information Website)(www.ncbi.nlm.nih.gov)上可公开获得。最佳比对(包括多重比对)可以使用例如PSI-BLAST来制备，所述PSI-BLAST可通过www.ncbi.nlm.nih.gov获得，其如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402所述。

关于与参考序列最佳比对的氨基酸序列，氨基酸残基“对应于”在比对中与残基配对的参考序列中的位置。“位置”由数目指示，该数目基于其相对于N末端的位置依次鉴定参考序列中的每个氨基酸。由于在确定最佳比对时必须考虑的缺失、插入、截短、融合等，一般而言，如通过从N末端简单计数确定的测试序列中的氨基酸残基数目不一定与参考序列中其对应位置的数目相同。例如，在其中比对的测试序列中存在缺失的情况下，在缺失位点处没有氨基酸对应于参考序列中的位置。当比对的参考序列中存在插入时，该插入将不对应于参考序列中的任何氨基酸位置。在截短或融合的情况下，在参考序列或比对序列中可以存在不对应于相应序列中的任何氨基酸的氨基酸段。

如本文所述的AAV载体可以具有不同血清型的AAV载体的基因组，即可以将各种AAV载体(包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13等)的基因组包装到所述衣壳蛋白变体中。在一些实施方案中，所述AAV载体包含AAV2的基因组，其中包含源自AAV2的ITR序列，且其中部分或全部Rep和Cap基因可进一步被异源多核苷酸替换。

重组AAV载体

由于目前尚未发现AAV与人类的任何疾病相关，因此AAV病毒可以被改造成一种高效的外源基因转移工具，即用作基因表达载体。迄今已进行的所有以AAV载体为基因导入工具的临床试验中，均未发现有与AAV载体相关的、显著的副作用。因此，AAV载体已成为目前安全性最好的基因治疗及基因疫苗用的载体之一。

在基因治疗领域，已经开发出众多基于AAV载体的基因治疗药物，例如，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera、先天性黑蒙症基因治疗药物Luxturna、脊髓性肌萎缩症基因治疗药物Zolgensma等，均取得较好的临床试验效果。

如本文所用，术语“重组AAV载体”、“重组AAV”、“重组AAV病毒”、“重组AAV病毒粒”、“重组AAV病毒颗粒”或“AAV基因表达载体”在本文中可以互换使用，其意指AAV病毒衣壳包裹的基因组DNA中含有异源多核苷酸。该载体可以剔除基因组中的Rep和Cap基因，而代之以表达目的基因的异源多核苷酸，通过感染、转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、内含子、kozak序列、治疗基因、polyA序列、选择元件和报道基因。另外，载体还可以包含复制起点。

在本发明的一些实施方案中，采用了包含工程化的衣壳蛋白变体的重组AAV载体(在本说明书中又称为AAV-PHP.eB载体)。AAV-PHP.eB载体可以是ssAAV-PHP.eB载体或scAAV-PHP.eB载体，优选scAAV-PHP.eB载体。在如图1所例示的一个实施方案中，相比于AAV9衣壳蛋白氨基酸序列，该载体的衣壳蛋白变体包含DGTLAVPFK肽。此类载体对神经系统的感染效率相比于野生型AAV病毒显著提高。

如本文所用，“单链的AAV载体”或“ssAAV载体”是指与野生型AAV一样，包含呈单链DNA的基因组的AAV载体。“自身互补的AAV载体”或“scAAV载体”是指包含呈互补双链DNA的基因组的AAV载体，当单链AAV基因组两端有一个ITR发生突变或者缺失时，在病毒复制的过程中AAV的rep蛋白不能识别和切割ITR区域的trs(terminal resolution site)，因此形成互补的双链DNA。此类载体由于包装折叠成双链DNA的反向重复基因组，而不需要DNA合成或多个载体基因组之间碱基配对，从而能够增加AAV介导的基因转移效率。相比之下，非自身互补的AAV载体在表达编码的转基因前需要将单链DNA基因组转变成双链DNA。关于自身互补的AAV载体的更详细的说明，可参见例如McCarty D.M,Molec.Ther.(2008)16:1648-1656。

重组AAV病毒的组装必须依赖于三种成分，即：转移载体，由转基因表达读框以及两侧的野生型AAV的ITR区(可以为完整的ITR，也可以为不完整的ITR)组成；AAV的cap和rep编码序列；辅助病毒功能。AAV载体具有相对成熟的组装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体组装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，三质粒转染组装系统因安全性高，是应用最为广泛的AAV载体组装系统，也是目前国际上主流的生产系统。具体而言，三质粒转染组装系统一般包含三种质粒：重组AAV转移质粒，其中仅保留基因组两端的ITR序列(可以为完整的ITR，也可以为不完整的ITR)，剔除了野生型AAV的Rep及Cap基因，而代之以表达目的基因的异源多核苷酸；重组AAV辅助质粒，其为克隆的ITR缺失的野生型AAV的基因组，以反式方式提供Rep和Cap基因编码蛋白的功能；以及AdV辅助病毒质粒，其中包含起辅助功能的基因E2a、E4orf6和VA RNA。E1a和E1b55k可由所要转染的细胞，例如HEK293细胞提供。

针对不同的治疗用途，本文中所述的异源多核苷酸(也可称为“目的多核苷酸”)可以编码多种基因产物(也可称为“目的基因产物”)。典型地，这类异源多核苷酸位于重组AAV载体内，由反向末端重复(ITR)区域侧接。本发明中可使用多种异源多核苷酸产生重组AAV载体以用于多种不同应用。这类异源多核苷酸包括但不限于，例如(i)适用于基因疗法以减轻由结构蛋白质或功能性蛋白的缺失、缺陷或次最佳含量引起的缺陷的多核苷酸，例如编码在神经系统中表达的基因的多核苷酸；(ii)转录到反义分子中的多核苷酸；(iii)转录到结合转录或转译因子的诱饵中的多核苷酸；(iv)编码细胞调节剂(如细胞激素)的多核苷酸；(v)可使受体细胞对特定药物(如疱疹病毒胸苷激酶基因)敏感的多核苷酸；(vi)用于癌症疗法的多核苷酸，如用于治疗多种癌症的E1A肿瘤抑制基因或p53肿瘤抑制基因；和(vii)编码基因编辑工具的多核苷酸。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸编码恢复人或动物的携带有基因突变的基因的蛋白质功能的cDNA。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸编码调节具有运动神经元疾病的受试者运动功能的蛋白质。在一些具体的实施方案中，所述异源多核苷酸编码SMN1基因，优选人SMN1基因(氨基酸序列例如如SEQ ID No:2所示)。

为了实现受体宿主细胞中目的基因产物的表达，该多核苷酸可以可操作地连接到启动子(其自有的或异源启动子)。本领域中已知许多适合的启动子，其选择取决于所需目的多核苷酸的表达水平；是否需要组成性表达、诱导性表达、细胞特异性或组织特异性表达等。在一些实施方案中，所述启动子为CBH启动子。在一些实施方案中，所述重组AAV载体还可以包含使得该载体适合于在真核生物中复制和整合的其他序列。在一些实施方案中，所述重组AAV载体还可以包含另外的转录和翻译起始序列，如增强子；以及另外的转录和翻译终止子，如poly A信号。此外，所述重组AAV载体还可以含有可选择标记。

重组AAV载体可以包含AAV的5’ITR、3’ITR、启动子和启动子下游的编码一种或多种基因产物的异源多核苷酸，其中启动子和异源多核苷酸位于5’ITR的下游和3’ITR的上游。在一些实施方案中，AAV载体包含位于5’ITR下游且位于3’ITR上游的转录后调控元件。在一些实施方案中，所述重组AAV载体可以用作AAV转移载体，其携带编码目的基因产物的异源多核苷酸，从而可以在宿主细胞中表达目的基因产物。

AAV ITR的核苷酸序列是本领域已知的。在本发明的载体中使用的AAV ITR不必须具有野生型核苷酸序列，而且可以进行修饰或改变(例如通过核苷酸的插入、缺失、或被替换)。另外，AAV ITR可以衍生自几个AAV血清型的任何一个，包括但不限于，AAV1-13等。而且，在AAV表达载体中在插入异源多核苷酸序列的两侧的5’和3’ITR不需要一定是相同的或来自于相同的AAV血清型或分离群，只要其功能能够从宿主细胞基因组或载体切除和挽救目标序列。

可以使用本领域已知的任何合适的基因工程技术来实现病毒载体的生成，其包括但不限于DNA同源重组、限制性内切核酸酶消化、连接、转化、质粒纯化和DNA测序的标准技术，例如Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press,N.Y.(1989))所述的技术。

通过感染、转化、转导或转染入宿主细胞后，所述重组AAV载体的基因组序列可以留在宿主细胞中，以获得期望的活性。

针对神经系统疾病的重组AAV载体

由于AAV载体具有较低的毒性和免疫原性特征，且有些血清型的AAV能够高效率地感染神经细胞，并且能够介导在中枢神经系统中的长效表达，AAV载体被认为可用于CNS基因治疗。例如，所述重组AAV载体可以携带编码调节多种神经元疾病相关的蛋白质的多核苷酸。在一些实施方案中，所述神经元疾病可以是涉及受试者的运动功能的运动神经元疾病，包括但不限于，脊髓性肌萎缩(SMA)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑共济失调、原发性侧索硬化(PLS)或外伤性脊髓损伤等。

过去的研究表明，95％的脊髓性肌萎缩(不管是哪种类型)都由染色体5q13上的SMN1基因的纯合突变所致。在人类中，SMN基因存在两种形式：SMN1(survival motorneuron 1，运动神经元存活基因1)和SMN2。SMN1基因的转录产生编码SMN蛋白的全长mRNA。SMN2基因与SMN1基因高度同源，在整个DNA水平仅有5个碱基不同，在编码区仅有两个碱基不同，在SMN2外显子7的C至T突变最为关键，因为其导致了SMN2外显子7跳跃，所得的蛋白质中有大约90％是截短蛋白质，而截短的蛋白质无功能且在体内被快速降解。一般而言，大部分正常个体都有2份拷贝的SMN1基因与2份拷贝的SMN2基因，SMN2基因发生外显子7的跳跃，只有少量的全长SMN mRNA。如果某个人两份拷贝的SMN1基因都失去功能的话就会患病，只有一份SMN1基因起作用的个体为携带者。在SMN1基因都失去功能的情况下，SMN2基因拷贝数数目会影响患者的发病时间与疾病严重程度。

在一个方面，本发明涉及使用AAV-PHP.eB载体(例如scAAV-PHP.eB载体)作为递送载体来投递SMN1基因。为此，将编码SMN1基因的多核苷酸插入载体基因组中，具体地是插入载体中的两个ITR之间。所述编码SMN1基因的多核苷酸(可以称为“SMN1表达框”)还可以包含CBH启动子、Kozak序列、polyA等。

在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码全长SMN蛋白的核苷酸序列，所述全长SMN蛋白可以是天然的全长SMN蛋白或经修饰的全长SMN蛋白。所述全长SMN蛋白可以源自哺乳动物例如啮齿动物、灵长类动物等，如人、小鼠、大鼠、猿、猴、黑猩猩等。

如实施例所验证的，在SMA疾病模型小鼠中，使用低剂量的本发明的scAAV-PHP.eB载体能够达到甚至优于高剂量scAAV9载体的治疗效果。同时，低剂量scAAV-PHP.eB-hSMN1与高剂量scAAV9-hSMN1一样，能够有效恢复患有SMA疾病的小鼠的运动能力(图4)。

SMN1基因

如本文所用，“SMN1基因”或其编码的SMN蛋白涵盖与天然存在的人源SMN1序列具有至少90％或更高同源性的核苷酸序列或其功能片段。同源性指两条序列之间比对的序列％保守(例如天然存在的人SMN1蛋白可包括SMN1的任意合适变体，包括但不限于功能性片段，包含插入、缺失、取代的序列，假片段，假基因，剪接变体或人工优化序列)。在一些实施方案中，“SMN1基因”可以与天然存在的人SMN1基因序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，“SMN1蛋白”可以与天然存在的人SMN1蛋白的氨基酸序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同同源。

药物组合物

本发明还涉及一种药物组合物，其包含：(i)如本文所述的重组AAV载体；和(ii)药学上可接受的载体和/或赋形剂。

如本文所用，术语“药学上可接受”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于pH调节剂、表面活性剂、佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体，凝胶或固体载体，水性介质，非水性介质，抗微生物剂，等渗剂，缓冲剂，抗氧化剂，麻醉剂，悬浮/分散剂，螯合剂，稀释剂，佐剂，赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的各种组分的组合或更多。

在一些实施方案中，重组AAV载体占所述药物组合物总重量的0.1-99.9wt％，优选10-99.9wt％，更优选70-99wt％。

在一些实施方案中，所述药物组合物被配制为液体制剂，例如注射剂。在一些实施方案中，所述药物组合物配制为用于鞘内注射的注射剂。在一些实施方案中，组分(ii)为注射剂用载体，优选地，是选自下组的一种或多种：生理盐水、葡萄糖盐水、或其组合。

治疗方法

本发明还提供了一种预防、减轻或治疗哺乳动物受试者中的神经系统疾病的方法，其中包括将如本文公开的重组腺相关病毒载体或药物组合物施用于所述哺乳动物受试者。所述受试者可以选自人、猴、猿、黑猩猩、猫、狗、牛、马、小鼠、大鼠、兔等。

所述神经系统疾病可以为涉及受试者的运动功能的运动神经元疾病，例如选自脊髓性肌萎缩(SMA)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑共济失调、原发性侧索硬化(PLS)和外伤性脊髓损伤。具体地，所述运动神经元疾病为脊髓性肌萎缩(SMA)。

给药方式、剂量

确定最有效途径和治疗有效剂量的方法是本领域技术人员熟知的，并随着载体、治疗组合物、靶细胞和被治疗受试者的不同而不同。

目前，本领域中已经研究了使用各种给药途径来投递AAV载体。例如，鞘内给药、脑室内给药、脑实质内给药以及静脉内给药等。

AAV载体的静脉内给药具有将基因非侵入性地转移至整个CNS并且更均匀分布的潜力。迄今为止，静脉内给药在I型SMA婴儿中是成功的，其中非常适度水平的转基因表达可能足以获得治疗益处。但静脉注射使AAV暴露于预先感染天然AAV的受试者，具有抗体中和的潜在风险。目前，通过衣壳工程修饰衣壳表面表位可以更好地逃避中和抗体的识别。对于年龄较大的儿童和成人进行CNS疾病的给药，还需要考虑所需的高剂量。

本发明提供了通过鞘内给药将重组AAV载体投递到受试者的方法和组合物。通过鞘内注射给药到脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)，AAV载体随脑脊液自然循环到达蛛网膜下腔各脑池中，并弥散在整个脑室系统，感染中枢神经系统细胞，然后转基因得到表达。鞘内注射相对静脉注射有如下优点：1.鞘内注射直接将AAV注射至脑脊液中,帮助AAV更好地扩散和感染脊髓和脑；2.鞘内注射使用的病毒剂量比静脉注射低很多，但是可以达到一样甚至更好的治疗效果；3.鞘内注射可以减少AAV被血液中存在的AAV中和抗体中和；4.跟静脉注射相比,鞘内注射也不易诱导出中和抗体的产生。因此，鞘内给药比静脉内给药能更好地感染脊髓中的运动神经元细胞。

在一些实施方案中，本发明的重组AAV载体的单次给药剂量不超过4*10¹³vg/kg，例如，不超过3*10¹³vg/kg、不超过2*10¹³vg/kg、不超过1*10¹³vg/kg、或不超过6*10¹²vg/kg。如实施例所验证的，本发明的重组AAV载体的低剂量给药能够达到不弱于AAV9载体高剂量给药的治疗效果。

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

实施例1：实验材料和方法

1.AAV载体结构设计

PHP.eB衣壳蛋白变体的设计如下：基于野生型AAV9衣壳蛋白氨基酸序列，将第587和588位的“AQ”氨基酸替换为“DGTLAVPFK”肽(如图1所示)，所得衣壳蛋白变体的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。将相应的核苷酸序列作为PHP.eB Cap基因用于随后的质粒(质粒2)构建。

2.病毒包装

使用如图2所示的三质粒系统转染293T细胞来包装AAV病毒，其中质粒1是重组AAV转移质粒，其中包含AAV基因组5’端的ITR序列且包含表达SMN1的表达盒，该表达盒包含CBH启动子序列、Kozak序列、SMN1转基因(氨基酸序列如SEQ ID No:2所示)、SV40Poly A和3’端缺失了D区/trs的ITR；质粒2是重组AAV辅助质粒，其以反式方式提供AAV2 Rep基因和PHP.eB Cap基因；以及pHelper辅助病毒质粒，其中包含起辅助功能的基因E2a、E4和VA。3种质粒均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

HEK293T细胞使用10％FBS培养基(DMEM(Gibco，11965-02)、10％胎牛血清(FBS，Gibco)、2mM谷氨酰胺(Gibco)、1％青霉素/链霉素(ThermoFisherScientific)和0.1mM非必需氨基酸(Gibco))，在5％CO₂、37℃条件下进行培养。三质粒系统转染293T细胞后4-6h进行换液。收集第四天上清和细胞，上清使用PEG沉淀过夜，以4200rpm，4℃离心30min，再以4400rpm离心10min，弃上清。沉淀用1xGB溶解，细胞使用液氮反复冻融三次。上清和细胞均加入benzonase、5MNaCl消化30min。消化后，3000g离心10min，取上清。之后使用密度梯度超速离心，68000rpm，18℃，离心1h25min。取层加PBS稀释，再使用超滤管进行浓缩。浓缩后的AAV病毒使用qPCR的方法进行滴度测定。所得AAV病毒在本文中称为scAAV-PHP.eB-hSMN1。

使用相同的三质粒组装方法产生scAAV9-hSMN1病毒作为对照，该病毒衣壳蛋白为AAV9衣壳蛋白，基因组中包含的表达SMN1的表达盒与scAAV-PHP.eB-hSMN1中相同。

3.小鼠

本发明使用的SMA模型小鼠为SMNdelta7(购自Jax#005025)，分为疾病鼠和非病鼠。疾病鼠基因型为SMN^-/-、hSMN2^+/+、hSMN2Δ7^+/+，称为三纯合delta7病鼠，这种患病小鼠的平均存活时间为～17.7天；非病鼠的基因型为SMN^+/-、hSMN2^+/+、hSMN2Δ7^+/+或SMN^+/+、hSMN2^+/+、hSMN2Δ7^+/+。所有小鼠饲养在12h/12h的光周期中，食物和水充足，饲养符合动物伦理委员会规定。

4.手术

在幼鼠出生当天，剪取组织裂解并通过PCR鉴定出其中的三纯合delta7病幼鼠(SMN^-/-)，其余幼鼠为非病幼鼠(SMN^+/-或SMN^+/+)。将三纯合delta7病幼鼠分为三组，在出生当天分别施用scAAV-PHP.eB-hSMN1(组1)、scAAV9-hSMN1(组2)、或不给药(组3)。对非病幼鼠不给药(组4)。

给药通过鞘内注射方式进行，其中scAAV-PHP.eB-hSMN1给药剂量为5.4*10¹²vg/kg，scAAV9-hSMN1给药剂量为4*10¹³vg/kg，给药体积为3ul。

5.行为测定

4组幼鼠从出生后第四天开始，每天进行体重测量，测量至出生后60天。在出生后第4天、第9天和第14天检测其翻正反射。人为将小鼠背部朝下开始计时，记录其翻正所需时间，少于60s记录实际时间，超过60s记为60s，每只小鼠每次记录3遍，取平均值。

6.结果

如图3所示，在26只scAAV-PHP.eB-hSMN1给药的delta7病鼠中，有21只小鼠寿命得到了延长，有11只小鼠生存时间超过了2个月，寿命最长的小鼠生存时间超过了283天(组1)。在21只scAAV9-SMN1给药的delta7病鼠中，有15只小鼠的寿命得到了延长，有9只小鼠的生存时间超过了2个月，寿命最长的小鼠生存时间为168天(组2)。而未给药的13只delta7病鼠，寿命分布在6～18天(组3)。

如图4所示，低剂量scAAV-PHP.eB-hSMN1注射小鼠体重与高剂量scAAV9-hSMN1注射小鼠体重接近，低于非病鼠体重，但相比于不给药的病鼠体重明显更高。

如图5所示，注射scAAV-PHP.eB-hSMN1与注射scAAV9-hSMN1的delta7病鼠在出生后第14天能够恢复翻正反射，表明两组小鼠的运动能力得到了恢复显著优于未给药的病鼠组。

也就是说，使用低剂量scAAV-PHP.eB载体能够达到甚至优于高剂量scAAV9载体的治疗效果(组1小鼠中～81％寿命得到延长，最长寿命超过283天；组2小鼠中～71％寿命得到延长，最长寿命为168天)。并且存活小鼠体重虽然相较于非病鼠较轻，但是两种不同药物治疗的小鼠体重并无显著差异。同时，低剂量scAAV-PHP.eB-hSMN1与高剂量scAAV9-hSMN1一样，能够有效恢复病鼠运动能力。

以上结果说明，scAAV-PHP.eB-hSMN1能够有效延长SMA疾病模型小鼠寿命，并且AAV-PHP.eB相较于AAV9有更好的感染效率，在SMA治疗效果中更有效。

本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

序列表

<110> 辉大（生物）上海科技有限公司

<120> 一种用于治疗脊髓性肌萎缩的基因治疗药物

<130> IDC206006

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 743

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

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370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu

405 410 415

Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Arg Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser

450 455 460

Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser

565 570 575

Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Asp Gly Thr Leu Ala Val

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Pro Phe Lys Ala Gln Ala Gln Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile

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645 650 655

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675 680 685

Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro

690 695 700

Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe

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Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr

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Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

740

<210> 2

<211> 294

<212> PRT

<213> 人

<400> 2

Met Ala Met Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Pro Glu Gln Glu

1 5 10 15

Asp Ser Val Leu Phe Arg Arg Gly Thr Gly Gln Ser Asp Asp Ser Asp

20 25 30

Ile Trp Asp Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Tyr Asp Lys Ala Val Ala

35 40 45

Ser Phe Lys His Ala Leu Lys Asn Gly Asp Ile Cys Glu Thr Ser Gly

50 55 60

Lys Pro Lys Thr Thr Pro Lys Arg Lys Pro Ala Lys Lys Asn Lys Ser

65 70 75 80

Gln Lys Lys Asn Thr Ala Ala Ser Leu Gln Gln Trp Lys Val Gly Asp

85 90 95

Lys Cys Ser Ala Ile Trp Ser Glu Asp Gly Cys Ile Tyr Pro Ala Thr

100 105 110

Ile Ala Ser Ile Asp Phe Lys Arg Glu Thr Cys Val Val Val Tyr Thr

115 120 125

Gly Tyr Gly Asn Arg Glu Glu Gln Asn Leu Ser Asp Leu Leu Ser Pro

130 135 140

Ile Cys Glu Val Ala Asn Asn Ile Glu Gln Asn Ala Gln Glu Asn Glu

145 150 155 160

Asn Glu Ser Gln Val Ser Thr Asp Glu Ser Glu Asn Ser Arg Ser Pro

165 170 175

Gly Asn Lys Ser Asp Asn Ile Lys Pro Lys Ser Ala Pro Trp Asn Ser

180 185 190

Phe Leu Pro Pro Pro Pro Pro Met Pro Gly Pro Arg Leu Gly Pro Gly

195 200 205

Lys Pro Gly Leu Lys Phe Asn Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro

210 215 220

Pro Pro His Leu Leu Ser Cys Trp Leu Pro Pro Phe Pro Ser Gly Pro

225 230 235 240

Pro Ile Ile Pro Pro Pro Pro Pro Ile Cys Pro Asp Ser Leu Asp Asp

245 250 255

Ala Asp Ala Leu Gly Ser Met Leu Ile Ser Trp Tyr Met Ser Gly Tyr

260 265 270

His Thr Gly Tyr Tyr Met Gly Phe Arg Gln Asn Gln Lys Glu Gly Arg

275 280 285

Cys Ser His Ser Leu Asn

290

<210> 3

<211> 736

<212> PRT

<213> AAV9

<400> 3

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

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35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Leu Glu Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly Lys

145 150 155 160

Lys Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Glu Glu Asp Thr

165 170 175

Gly Ala Gly Asp Gly Pro Pro Glu Gly Ser Asp Thr Ser Ala Met Ser

180 185 190

Ser Asp Ile Glu Met Arg Ala Ala Pro Gly Gly Asn Ala Val Asp Ala

195 200 205

Gly Gln Gly Ser Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys

210 215 220

Asp Ser Thr Trp Ser Glu Gly Lys Val Thr Thr Thr Ser Thr Arg Thr

225 230 235 240

Trp Val Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Leu Arg Leu Gly Thr

245 250 255

Thr Ser Ser Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Tyr

260 265 270

Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln

275 280 285

Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Leu Arg Pro Lys Ala Met Arg Val

290 295 300

Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Ser Asn Gly Glu

305 310 315 320

Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Ile Phe Ala Asp

325 330 335

Ser Ser Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Met Asp Ala Gly Gln Glu Gly Ser

340 345 350

Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr

355 360 365

Cys Gly Ile Val Thr Gly Glu Asn Gln Asn Gln Thr Asp Arg Asn Ala

370 375 380

Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn

385 390 395 400

Asn Phe Glu Met Ala Tyr Asn Phe Glu Lys Val Pro Phe His Ser Met

405 410 415

Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Leu Asp

420 425 430

Gln Tyr Leu Trp His Leu Gln Ser Thr Thr Ser Gly Glu Thr Leu Asn

435 440 445

Gln Gly Asn Ala Ala Thr Thr Phe Gly Lys Ile Arg Ser Gly Asp Phe

450 455 460

Ala Phe Tyr Arg Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Val Lys Gln Gln

465 470 475 480

Arg Phe Ser Lys Thr Ala Ser Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Ala Ser Gly

485 490 495

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Trp Ser Asn Ile Ala Pro Gly Pro Pro Met Ala Thr Ala Gly Pro Ser

515 520 525

Asp Gly Asp Phe Ser Asn Ala Gln Leu Ile Phe Pro Gly Pro Ser Val

530 535 540

Thr Gly Asn Thr Thr Thr Ser Ala Asn Asn Leu Leu Phe Thr Ser Glu

545 550 555 560

Glu Glu Ile Ala Ala Thr Asn Pro Arg Asp Thr Asp Met Phe Gly Gln

565 570 575

Ile Ala Asp Asn Asn Gln Asn Ala Thr Thr Ala Pro Ile Thr Gly Asn

580 585 590

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625 630 635 640

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645 650 655

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660 665 670

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675 680 685

Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Tyr Gly Asn

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Gln Ser Ser Met Leu Trp Ala Pro Asp Thr Thr Gly Lys Tyr Thr Glu

705 710 715 720

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725 730

<210> 15

<211> 742

<212> PRT

<213> AAV12

<400> 15

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Lys Gln Leu Glu Gln Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Gln Arg Leu Ala Thr Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

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145 150 155 160

Ala Pro Ala Lys Lys Lys Gln Lys Asp Gly Glu Pro Ala Asp Ser Ala

165 170 175

Arg Arg Thr Leu Asp Phe Glu Asp Ser Gly Ala Gly Asp Gly Pro Pro

180 185 190

Glu Gly Ser Ser Ser Gly Glu Met Ser His Asp Ala Glu Met Arg Ala

195 200 205

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210 215 220

Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Ser Glu Gly

225 230 235 240

Arg Val Thr Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Thr Tyr Asn

245 250 255

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260 265 270

Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

275 280 285

Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

290 295 300

Gly Leu Arg Pro Lys Ser Met Arg Val Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val

305 310 315 320

Lys Glu Val Thr Thr Ser Asn Gly Glu Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu

325 330 335

Thr Ser Thr Val Gln Ile Phe Ala Asp Ser Thr Tyr Glu Leu Pro Tyr

340 345 350

Val Met Asp Ala Gly Gln Glu Gly Ser Phe Pro Pro Phe Pro Asn Asp

355 360 365

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370 375 380

Asn Gln Asn Gln Thr Asp Arg Asn Ala Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

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405 410 415

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545 550 555 560

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565 570 575

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595 600 605

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690 695 700

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Pro Asp Asn Ala Gly Asn Tyr His Glu Leu Arg Ala Ile Gly Ser Arg

725 730 735

Phe Leu Thr His His Leu

740

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<212> PRT

<213> AAV13

<400> 16

Met Thr Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser Glu

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Gly Val Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly

35 40 45

Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val

50 55 60

Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Gln

65 70 75 80

Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp

85 90 95

Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn

100 105 110

Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro Leu

115 120 125

Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro

130 135 140

Val Glu Gln Ser Pro Ala Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly Lys

145 150 155 160

Ser Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly

165 170 175

Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro Ala

180 185 190

Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly Ala

195 200 205

Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser Ser

210 215 220

Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr

225 230 235 240

Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr

245 250 255

Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Thr Asn Asp Asn His Tyr Phe

260 265 270

Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys

275 280 285

His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly

290 295 300

Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys

305 310 315 320

Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr

325 330 335

Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val

340 345 350

Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val

355 360 365

Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln

370 375 380

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Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu Asp

405 410 415

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580 585 590

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595 600 605

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His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro

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660 665 670

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Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys

690 695 700

Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu

705 710 715 720

Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730

Claims (24)

1.一种重组腺相关病毒载体，其包含：

(a)衣壳蛋白变体或其功能性片段，所述衣壳蛋白变体或其功能性片段的氨基酸序列包含DGTLAVPFK肽；和

(b)编码异源基因产物的异源多核苷酸。

2.权利要求1的重组腺相关病毒载体，其中所述衣壳蛋白变体包含与亲本或野生型AAV衣壳蛋白相比，具有DGTLAVPFK肽的氨基酸序列，所述亲本或野生型AAV衣壳蛋白选自AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13野生型衣壳蛋白以及包含与所述亲本或野生型衣壳蛋白的氨基酸序列有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

3.权利要求2的重组腺相关病毒载体，其中所述衣壳蛋白变体的氨基酸序列在对应于如SEQ ID No:3所示的野生型AAV9衣壳蛋白的氨基酸序列的第586位和第589位之间用DGTLAVPFK肽插入或者替换原有氨基酸，例如AQ。

4.权利要求3的重组腺相关病毒载体，其中所述衣壳蛋白变体包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列或由其组成。

5.权利要求1-4中任一项的重组腺相关病毒载体，其中所述异源多核苷酸插入到所述重组腺相关病毒载体的基因组中的5’ITR序列下游，且替换了部分或全部的Rep基因和Cap基因序列。

6.权利要求5的重组腺相关病毒载体，其中所述重组腺相关病毒载体的基因组为选自以下的AAV载体的基因组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13。

7.权利要求6的重组腺相关病毒载体，其中所述重组腺相关病毒载体的基因组为AAV9载体或AAV2载体的基因组。

8.权利要求1-7中任一项的重组腺相关病毒载体，其中所述异源基因是选自以下的至少一种：在神经系统中表达的基因、要递送至神经系统的基因、用于基因编辑的相关基因和可选择标记基因。

9.权利要求8的重组腺相关病毒载体，其中所述在神经系统中表达的基因是SMN1基因。

10.权利要求8的重组腺相关病毒载体，其中所述用于基因编辑的相关基因选自基因编辑酶编码基因和靶向特定位点的导向RNA(gRNA)。

11.权利要求10的重组腺相关病毒载体，其中所述核酸酶为选自以下的至少一种：巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶、CRISPR-Cas系统、碱基编辑器和prime编辑系统。。

12.权利要求1-11中任一项的重组腺相关病毒载体，其中所述异源多核苷酸还包含选自以下的至少一种：启动子、增强子、内含子、Kozak序列、和poly A。

13.一种宿主细胞，其包含权利要求1-12中任一项的重组腺相关病毒载体。

14.一种药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项的重组腺相关病毒载体和药学上可接受的载体/赋形剂。

15.权利要求14的药物组合物，其为适合鞘内施用的注射剂形式。

16.权利要求1-12中任一项的重组腺相关病毒载体或权利要求14的药物组合物在制备用于预防、减轻或治疗受试者中神经系统疾病的药物中的用途。

17.权利要求16的用途，其中所述神经系统疾病为涉及受试者的运动功能的运动神经元疾病。

18.权利要求16或17的用途，其中所述运动神经元疾病选自脊髓性肌萎缩(SMA)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑共济失调、原发性侧索硬化(PLS)和外伤性脊髓损伤。

19.权利要求18的用途，其中所述运动神经元疾病为脊髓性肌萎缩(SMA)。

20.权利要求19的用途，其中所述受试者选自人、猴、猿、黑猩猩、猫、狗、牛、马、小鼠、大鼠、兔。

21.权利要求19或20的用途，其中所述受试者是患有SMA病的患者。

22.一种试剂盒，其包含权利要求1-12中任一项的重组腺相关病毒载体。

23.一种治疗哺乳动物受试者中的神经系统疾病例如SMA的方法，其中包括将权利要求1-12中任一项的重组腺相关病毒载体施用于所述哺乳动物受试者。

24.权利要求23的方法，其中所述施用通过鞘内注射进行。

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