JP6767483B2 - 遺伝子療法のための、改変されたフリードライヒ運動失調症遺伝子およびベクター - Google Patents
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Description
組換えウイルスベクターを対象に、改変されたFXN遺伝子が、治療有効量のフラタキシンを対象の心臓組織および/または神経組織中にもたらすレベルで発現するような条件下で投与するステップと
を含む、方法。
宿主細胞に、フラタキシンペプチドまたはその機能性断片をコードする改変されたFXN遺伝子をトランスフェクトすること、および宿主細胞を、フラタキシンペプチドを発現するのに十分な生物学的条件下で維持すること
を含む、プロセス。
実施形態1〜12、23および25〜28のいずれか1つに記載の改変されたFXN遺伝子を含む少なくとも1つの組換えウイルスベクターを提供するステップと、組換えウイルスベクターを対象に、改変されたFXN遺伝子が、治療有効量のフラタキシンを対象の心臓組織および/または神経組織中にもたらすレベルで発現するような条件下で投与するステップと
を含む、方法。
宿主細胞を、フラタキシンペプチドを発現するのに十分な生物学的条件下で維持すること
を含む、プロセス。
(a)AAV2の末端反復(TR)、
(b)配列番号26の核酸配列を含むCBhプロモーター、
(c)配列番号3〜9からなる群から選択される核酸配列を含む、FXNをコードする改変された核酸、
(d)配列番号25の配列を有するCSS、
(e)配列番号27の配列を有するbGHポリAシグナル配列、および
(f)AAV2のTR
を含む核酸をさらに含む、rAAVベクター。
(a)AAV2のTR、
(b)配列番号26の核酸配列を含むCBhプロモーター、
(c)配列番号3〜9からなる群から選択される核酸配列を含む、FXNをコードする改変された核酸、
(d)配列番号25の配列を有するCSS、
(e)配列番号27の配列を有するbGHポリAシグナル配列、および
(f)AAV2のTR
を含む核酸をさらに含む、rAAVベクター。
(a)AAV2のTR、
(b)配列番号26の核酸配列を含むCBhプロモーター、
(c)配列番号3〜9からなる群から選択される核酸配列を含む、FXNをコードする改変された核酸、
(d)配列番号25の配列を有するCSS、
(e)配列番号27の配列を有するbGHポリAシグナル配列、および
(f)AAV2のTR
を含む核酸をさらに含む、rAAVベクター。
別段の定義がない限り、本明細書で使用する科学技術用語は全て、本発明が属する技術に関わる当業者が一般に理解する意味を有する。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を記載するためのものに過ぎず、そうした用語により、本発明を制限する意図はない。単数の形の「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、本発明および添付の特許請求の範囲の記載において使用する場合、そうでないことが文脈から明らかに示されない限り、複数の形も含むことが意図される。以下の用語は、ここに示す意味を有する。
本発明は、フラタキシンをコードする改変されたヌクレオチド配列を提供する。改変されたヌクレオチド配列は、1つまたは複数の改変を含む、野生型またはネイティブのFXN遺伝子の配列を含む。
特定の実施形態では、本発明による使用するベクターは、非ウイルス性のベクターである。典型的には、非ウイルス性のベクターは、改変されたFXN遺伝子またはそのバリアントを示す核酸配列を含むプラスミドであり得る。
改変されたFXN遺伝子の配列はまた、パッケージングされたウイルスベクターの構成成分としても提供することができる。一般に、パッケージングされたウイルスベクターは、キャプシド中にパッケージングされているウイルスベクターを含む。ウイルスベクターおよびウイルスのキャプシドについては、以下のセクションで論じる。rAAVベクター中にパッケージングする核酸は、一本鎖(ss)、自己相補性(sc)または二本鎖(ds)であり得る。
典型的には、導入遺伝子を担持するウイルスベクターを、導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、適切な調節エレメント、および細胞への形質導入を媒介するウイルスタンパク質を生成するのに必要なエレメントからアセンブルする。ウイルスベクターの例として、これらに限定されないが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルス(AAV)のベクターが挙げられる。
パッケージングされたウイルスベクターのウイルスのキャプシド構成成分は、パルボウイルスのキャプシドであり得る。AAVのCapおよびキメラのキャプシドが好ましい。パルボウイルスの適切なキャプシド構成成分の例が、パルボウイルス科、例として、自律的パルボウイルスまたはディペンドウイルスに由来するキャプシド構成成分である。例えば、ウイルスのキャプシドは、AAVのキャプシド(例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAVrh10、AAVrh74、RHM4−1(WO2015/013313の配列番号5)、AAV2−TT、AAV2−TT−S312N、AAV3B−S312N、AAV−LK03、ヘビのAAV、トリのAAV、ウシのAAV、イヌのAAV、ウマのAAV、ヒツジのAAV、ヤギのAAV、エビのAAV、および現在公知のまたは後に発見される任意のその他のAAVであり得る。例えば、Fieldsら、VIROLOGY、volume 2、chapter 69(4th ed.、Lippincott−Raven Publishers)を参照されたい。キャプシドは、米国特許第7,906,111号;Gaoら、2004、J.Virol.78:6381;Morisら、2004、Virol.33:375;WO2013/063379;WO2014/194132に開示されている、AAVのいくつかの血清型に由来し得、WO2015/121501に開示されている真性タイプのAAV(AAV−TT)のバリアント、ならびにWO2015/013313に開示されているRHM4−1、RHM15−1〜RHM15−6およびそれらのバリアントを含むことができ、当業者であれば、同じまたは類似の機能を有する、まだ同定されていないその他のバリアントがある可能性が高いことを認識していると予想され、2つ以上のAAVキャプシドに由来する構成成分を含めることもできる。AAVのCapタンパク質の完全な相補体は、VP1、VP2およびVP3を含む。AAVのVPキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むORFは、完全な相補体よりも少ない、AAVのCapタンパク質を含んでもよく、またはAAVのCapタンパク質の完全な相補体をもたらしてもよい。
本発明は、パッケージング細胞を含み、これらを培養して、本発明のパッケージングされたウイルスベクターを生成することができ、パッケージング細胞は、「宿主細胞」により包含される。本発明のパッケージング細胞は一般に、異種の(1)ウイルスベクター機能、(2)パッケージング機能、および(3)ヘルパー機能を有する細胞を含む。以下のセクションで、構成成分のこれらの機能のそれぞれについて論じる。
本発明のパッケージング細胞は、ウイルスベクター機能を、パッケージング機能およびベクター機能と一緒に含む。ウイルスベクター機能は典型的には、パルボウイルスのゲノムの一部、例として、AAVのゲノムの一部を含み、こうしたゲノムにおいては、repおよびcapが欠失しており、改変されたFXN配列およびそれに関連する発現制御配列により交換されている。パッケージングのためのウイルスベクター機能は、ウイルスベクターの複製が生じるのに十分な発現制御配列を含む。典型的には、ウイルスベクターは、パルボウイルスのゲノムの一部、例として、repおよびcapが欠失しており、導入遺伝子およびそれに関連する発現制御配列により交換されているAAVのゲノムを含む。典型的には、導入遺伝子に、欠失したウイルスのrepおよびcapのORFの代わりに、2つのAAVのTRが隣接する。適切な発現制御配列、例として、導入遺伝子が標的細胞中で組織特異的に発現するのを促進する点で、使用するのに適切な組織に特異的なプロモーターおよびその他の調節配列が含まれる。導入遺伝子は典型的には、発現して、治療用ポリペプチドまたはマーカーのポリペプチドを生成することができる核酸配列である。
パッケージング機能は、ウイルスベクターの複製およびパッケージングのための遺伝子を含む。したがって、例えば、パッケージング機能は、ウイルス遺伝子の発現、ウイルスベクターの複製、組入れ状態からのウイルスベクターのレスキュー、ウイルスベクターのウイルス遺伝子の発現、およびウイルスベクターのウイルス粒子内へのパッケージングに必要な機能を、必要に応じて含むことができる。パッケージング機能は、一緒にしてかまたは別個に、遺伝子構築物、例として、プラスミドもしくはアンプリコン、バキュロウイルスもしくはHSVのヘルパー構築物を使用して、パッケージング細胞に供給することができる。パッケージング機能は、パッケージング細胞内で染色体外に存在させることができるが、好ましくは、細胞の染色体DNA内へ組み入れる。例として、AAVのRepタンパク質およびCapタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
ヘルパー機能は、パッケージング細胞の活性な感染を確立するのに必要なヘルパーウイルスエレメントを含み、活性な感染の確立は、ウイルスベクターのパッケージングを開始するのに必要である。例として、ウイルスベクターのパッケージングをもたらすのに十分な、アデノウイルス、バキュロウイルスおよび/またはヘルペスウイルスに由来する機能が挙げられる。例えば、アデノウイルスのヘルパー機能は典型的には、アデノウイルス構成成分であるE1a、E1b、E2a、E4およびVA RNAを含むと予想される。パッケージング機能は、パッケージング細胞に必要なウイルスを感染させることによって供給することができる。パッケージング機能は、一緒にしてかまたは別個に、遺伝子構築物、例として、プラスミドまたはアンプリコンを使用して、パッケージング細胞に供給することができる。例えば、Rabinowitzら、2002、J.Virol.76:791に記載されているpXRヘルパープラスミド、およびGrimmら、1998、Human Gene Therapy 9:2745〜2760に記載されているpDGプラスミドを参照されたい。パッケージング機能は、パッケージング細胞内で染色体外に存在させることができるが、好ましくは、細胞の染色体DNA内へ組み入れる(例えば、HEK293細胞中のE1またはE3)。
当技術分野で公知の任意の適切な、寛容な細胞またはパッケージング細胞を、パッケージングされたウイルスベクターを生成する場合に利用することができる。哺乳動物細胞または昆虫細胞が好ましい。本発明の実行においてパッケージング細胞を生成するのに有用な細胞の例として、例えば、ヒト細胞株、例として、VERO、WI38、MRC5、A549、HEK293細胞(EK293細胞は、構成的プロモーターの制御下で、アデノウイルスの機能性のE1を発現する)、B−50または任意のその他のHeLa細胞、HepG2、Saos−2、HuH7およびHT1080細胞系が挙げられる。一態様では、パッケージング細胞は、懸濁培養物中で増殖することが可能であり、より好ましくは、細胞は、血清を含有しない培養物中で増殖することが可能である。一実施形態では、パッケージング細胞は、血清を含有しない培地中で懸濁状態をとって増殖するHEK293である。別の実施形態では、パッケージング細胞は、米国特許第9,441,206号に記載されており、ATCC番号PTA13274として寄託されているHEK293細胞である。これらに限定されないが、WO2002/46359に開示されているものを含めて、rAAVのパッケージング細胞系が多数、当技術分野で公知である。
rAAVベクターは、当技術分野の標準的な方法、例として、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配により精製することができる。rAAVベクターを精製するための方法は、当技術分野で公知であり、Clarkら、1999、Human Gene Therapy 10(6):1031〜1039;SchenppおよびClark、2002、Methods Mol.Med.69:427〜443;米国特許第6,566,118号、ならびにWO98/09657に記載されている方法を含む。
フリードライヒ運動失調症関連障害、例として、フリードライヒ運動失調症と関連がある、神経筋の変性障害および/または心筋症の遺伝子療法のために、改変されたFXN遺伝子を使用することができる。個体が、遺伝子療法を必要とする場合があり、その理由は、FXN遺伝子のコード配列における1つまたは複数の突然変異の結果として、FXNが、不適切に発現し、例えば、誤ったアミノ酸配列を有するか、または間違った組織中でもしくは間違った時期に発現するか、または過小発現するからである。本発明の改変されたFXN遺伝子を、遺伝子療法として使用して、タンパク質のフラタキシンの生成を増強し、それにより、ミトコンドリアにおけるエネルギーの発生を増加させることができる。例えば、米国特許第9,066,966号を参照されたい。
特定の実施形態では、本発明は、フラタキシンの発現の減少が媒介するかまたはフラタキシンの発現の減少と関連がある疾患または状態、例えば、フリードライヒ運動失調症を予防または治療するための医薬組成物を提供する。組成物は、改変されたFXN遺伝子を含むベクターを治療有効量含み、この量により、判定においてFXNの発現レベルを増加させることができる。組成物は、FXNをコードする核酸であって、改変された、例えば、最適化された核酸を含むベクターを含み、この場合、組成物は、薬学的に許容できる担体および/またはその他の薬用物質、医薬物質、担体、アジュバント、希釈剤等をさらに含む。注射剤の場合には、担体は典型的には液体であると予想される。注射剤用の媒体として、注射用溶液に通常用いる添加剤、例として、安定化剤、塩を含有する水、または生理食塩水および/もしくは緩衝液を使用するのが好ましい。
明細書の上記の記載内容は、本開示の当業者による実行を可能にするのに十分であると考えている。上記の記載、および実施例により、本開示の特定の例示的な実施形態を詳述する。しかし、いかに詳細に上記の記載が書かれているように見えようとも、本開示は、多くの様式で実行することができること、ならびに本開示は、添付の特許請求の範囲、およびその中の請求項の任意の均等物に従って解釈すべきであることが理解されると予想される。
以下の実験実施例を参照することによって、本発明をさらに、詳細に記載する。これらの実施例は、例証の目的で提供するに過ぎず、別段の特定がない限り、本発明を制限するものではない。したがって、本発明は、いかなる場合であっても、以下の実施例に限定されると解釈すべきではなく、しかし、むしろ本明細書に提供する教示の結果として明らかになる、あらゆる変更形態を包含すると解釈すべきである。
自己相補性rAAV−FXN構築物の生成
材料および方法
ベクターの構築
自己相補性AAVゲノムをコードするpTRs−KS−CBh−EGFP−bGHポリA構築物(その図を、図3に示す)を、導入遺伝子発現構築物の骨格として使用した(Grayら、2011、Human Gene Therapy 22:1143〜1153)。pUC57中への2つのコドン最適化FXN遺伝子挿入体、すなわち、GenscriptおよびGenscript(低CpG)を、GenScriptに発注し、これらを使用して、骨格ベクター中のEGFPを交換した。Genscript(配列番号6)およびGenscript(低CpG)(配列番号7)により改変されたFXN遺伝子をそれぞれ、CBhプロモーターに作動可能に連結し、これを図3に示す。GenScript FXN(配列番号6および7)構築物は、N末端にAgeI部位、FXN終止コドンの下流にコラーゲン安定性配列(CSS)(5’−CCCAGCCCACTTTTCCCCAA−3’)、CSSの下流にウシ成長ホルモン(BGH)ポリA配列、およびBGHポリAの下流にMluI部位を含み、これらはいずれも、図2E(Genscript)および図2F(Genscript(低CpG))に示されている。pTRs−KS−CBh−FXN−bGHポリA構築物内に挿入した例示的な挿入体を、図2A〜図2Fに示し、表8に記載する。より具体的には、野生型フラタキシン遺伝子(WT FXN;配列番号2)をクローニングして、pTRs−KS−CBh−WT FXN−bGHpolyA(図2A)を得;改変されたFXN遺伝子IDT1(配列番号11)をクローニングして、pTRs−KS−CBh−IDT1−bGHポリA(図2B)を得;低発現体である改変されたFXN遺伝子をコードする核酸IDT3(配列番号8)をクローニングして、pTRs−KS−CBh−IDT3−bGHポリA(図2C)を得;改変されたFXN遺伝子IDT4(配列番号12)をクローニングして、pTRs−KS−CBh−IDT4−bGHポリA(図2D)を得;改変されたFXN遺伝子Genscript(対照)(配列番号6)をクローニングして、pTRs−KS−CBh−Genescript−bGHポリA(図2E)を得;改変されたFXN遺伝子Genscript(低CpG)(配列番号7)をクローニングして、pTRs−KS−CBh−Genescript(低CpG)−bGHポリA(図2F)を得た。FXN遺伝子をコードする各挿入体をクローニングして、ベクターを得、その遺伝子には、5’側上にAgeI部位、および3’側上にAvrII切断部位が隣接し、それに、AvrII部位後にCSS配列、CSS後にSpeI切断部位、SpeI切断部位後にbGHポリAシグナル配列、およびポリAシグナル配列後にMluI切断部位が続いた。
HEK293細胞(ATCC:CRL−1573)およびHeLa細胞(ATCC:CCL−2)を、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Gibco)中に維持した。細胞増殖培地に、9%のウシ胎仔血清(FBS、Gibco)、3.4mMのl−グルタミン、100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシン(Gibco)を補充した。細胞を、5%のCO2雰囲気下、37℃で保った。ディップスティックアッセイ:細胞を、24ウエルプレート中に、24時間(h)時におよそ60%のコンフルエンスに達するように播種し、次いで、模擬処置を細胞に対して行うか、または三つ組で、scAAV−FXN(交換可能に、本明細書では「rAAV−FXN」または「rAAV−FXN−HA」と呼ぶ)を、10,000(VG/細胞)のMOIで、細胞に感染させた。形質導入後の60時間時(60hp.t.)に、細胞は、Frataxin Protein Quantity Dipstick Assay(Abcam、ab109881)についての製造元のプロトコールに従った。データを、ImageJを使用して処理した。
細胞を、6ウエルプレート中に、24時間時におよそ60%のコンフルエンスに達するように播種し、次いで、模擬処置を細胞に対して行うか、またはscAAV−FXNを10,000(VG/細胞)のMOIで細胞に感染させた。形質導入後の60時間時に、細胞溶解緩衝液(0.0625Mのトリス−HCl、pH6.8、10%のグリセロール、2%のSDS、5%の2−メルカプトエタノール、0.02%(w/v)のブロモフェノールブルー)を用いて、細胞を溶解させた。15μlのHeLaタンパク質溶解液を、15〜4%のTGXゲル上でゲル電気泳動により分離し、タンパク質を、ニトロセルロースメンブレン(NCM)にエレクトロブロットした。PBS−T中の5%の脱脂粉乳を使用して、NCMをブロックした。抗フラタキシン抗体(Abcam、18A5DB1)を、5%のミルクを有するPBS−T中で使用した。5%のミルクを有するPBS−T中の西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート化二次抗体を使用して、抗フラタキシンの存在を検出した。WesternBright ECL Western Blotting Detectionキット(Advansta、K−12045−D50)を使用し、製造元の使用説明に従って検出を行った。
フリードライヒ運動失調症マウスモデルにおけるin vivoでの治療
当該技術分野において認識されているFRDAマウスモデル(Perdominiら、2014、Nature Med.20(5):542)を使用して、FXN遺伝子療法が媒介するrAAVの潜在的な効能を評価した。換言すると、3つの群のマウス、すなわち、未治療Mck陽性対照マウス(Mck−Cre×FXN L3/WT)、未治療Mck突然変異マウス(Mck−Cre×FXN L3/L−)、およびFXN遺伝子を含むrAAVの1回用量を投与した、治療Mck突然変異マウスを調べ、この場合、改変されたFXN遺伝子は、配列番号7の核酸配列(GenScript(低CpG))を含み、上記の記載に従って、FXN遺伝子を、pTRs−KS−CBh−EGFP−BGH構築物中にクローニングして、pTRs−KS−CBh−Genscript(低CpG)−bGHポリAをもたらした。
方法
血漿中のガレクチン−3およびH−FABPの測定
5週齢時(治療の2週間後)および8週齢時(治療の5週間後)に、イソフルラン麻酔の後の後眼窩穿刺により、血液を収集した。
屠殺時に、心臓を収集し、各群4匹のマウスの心臓の半分を、SDH活性の測定のために急速凍結した。
屠殺時に、心臓(半分)、骨格筋(腓腹筋)および肝臓組織を収集し、フラタキシンの測定のために急速凍結した。
小脳(歯状核を含む)、性腺、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋(腓腹筋およびヒラメ筋)、脾臓、ならびに頚椎、胸椎および腰椎を、ホルマリン固定した。次いで、椎骨を、EDTA溶液を使用して脱灰した。全ての臓器をパラフィン包埋して、5μmの厚さの切片を得、椎骨(脊髄および後根神経節の両方を含む)ならびに心臓については、横切片を得た。全ての臓器を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、心臓の線維症を、マッソントリクローム染色を使用して評価した。
麻酔(イソフルラン、1〜2%)を施したマウスにおいて、Vevo−2100 Visual Sonics音波検査器上で30MHzのリニアプローブ(MS400)を用いることによって経胸壁心エコー像を得た。
a)心臓形態および心室収縮機能(短軸、SAX):左心室拡張末期直径(LVEDD)および左心室収縮末期直径(LVESD)、左心室中隔厚(SW)および左心室後壁厚(PW)、左室心筋重量(LVM=1.055×[(EDD+SW+PW)3−EDD3)])、駆出率および内径短縮率、ならびに心拍出量;
b)血行動態プロファイル:心内圧変化(AoVおよびRVの機能)を検出するための、肺動脈血流速度および大動脈血流速度ならびに肺動脈圧および大動脈圧。
温度および湿度が制御されている動物施設において、マウスを、12時間の明暗サイクルで、水および標準的なげっ歯類用固形飼料(D03、SAFE、Villemoisson−sur−Orge、フランス)を自由に与えて飼育した。動物の手順および実験は全て、地域の倫理委員会(Comite d’Ethique en Experimentation Animale IGBMC−ICS)により、動物の飼育および使用について(Com’Eth 2011−007)承認を得た。
見込みのあるバイオマーカーの同定
多様なバイオマーカーのレベルを、3つの群のマウス、すなわち、未治療Mck陽性対照、未治療Mck突然変異マウス、および治療Mck突然変異マウスにおいて決定した;これらのマウスに、FXN遺伝子を含み、HAタグペプチドをコードする核酸をさらに含むrAAV2i8(AAV−FXN−HA)の1回用量を投与した。
5週齢時(治療Mck突然変異マウスについては、AAV治療の2週間)、および8週齢時(治療Mck突然変異マウス群については、rAAV治療の5週間)に、イソフルラン麻酔の後の後眼窩穿刺により、血液を収集し、ガレクチン−3およびH−FABPのレベルを、標準的な方法を使用して測定した。
5週齢時には、ガレクチン−3のレベルは、未治療Mck陽性対照群および治療Mck突然変異マウス群において、未治療Mck突然変異マウス群と比較してより高くなる傾向があるとしても、3つの群間で同等であった。
検出の標準的な方法を使用して、同じサンプル群内のマウス間で、H−FABPレベルの大きな変動が観察された。
研究の終了時(8週齢時、治療突然変異マウス群においては、AAV治療の5週間)に収集した心臓から得られた心臓ホモジネート中で、SDH活性を、標準的な方法を使用して測定した。各群を、4匹のマウスで構成した。
屠殺時に収集した心臓、骨格筋および肝臓から、ヒトフラタキシンタンパク質のレベルを、標準的な方法を使用して測定し、これを、表6に示す。
未治療Mck陽性対照雄マウスは、未治療Mck突然変異動物および治療Mck突然変異AAV動物と比較して有意により長かった(9.39cm対8.89cm[+5.62%]、P=0.011[t検定])。その他の顕著な、眼に見える病変は観察されず、とりわけ、雄および雌の両方の心臓重量においては、眼に見える病変も顕著な変化も観察されなかった。
心臓
最低限の間質線維症が、1匹の未治療Mck陽性対照動物(58番)において観察された。未治療Mck陽性対照群のその他の3匹の心臓は全て、正常であった。
全ての群において、複数の髄質尿細菅の管腔中に、顕著な石灰化が頻繁に観察された。頻度は、未治療Mck陽性対照動物については、4/4であり(とはいえ、これらはCre導入遺伝子を発現する)、未治療Mck突然変異動物については、3/4であり、rAAV−FXNの1回用量を投与した治療Mck突然変異動物については、2/4であった。石灰化の重症度は、rAAV治療Mck突然変異群においては、未治療Mck陽性対照群および未治療Mck突然変異群と比較して減少しているように見えた。尿細管の好塩基球増加(再生)が、未治療Mck陽性対照群の4匹中2匹の動物において、未治療Mck突然変異群の4匹中3匹の動物において、およびAAV治療Mck突然変異群の1匹の動物において観察された。
肝臓:1匹の未治療Mck陽性対照動物(38番)において、最低限の門脈周囲の炎症が観察された。
肺:1匹の未治療Mck突然変異動物(41番)において、若干の気管支周囲の炎症が観察された。
治療の前の基礎表現型
心エコーの測定により、未治療Mck突然変異雄マウスにおいて、未治療Mck陽性対照と比較して、左心室機能の低下が示された。心臓のこの機能低下は、左心室(LV)の収縮性(内径短縮率および駆出率)の減少、ならびに収縮期および拡張期の両方におけるLV体積の増加により特徴付けられる。その段階では、未治療Mck突然変異雌マウスにおいて、心臓の表現型は観察されなかった。
FRDA心筋症の治療のための遺伝子療法のアプローチの可能性を検討するために、3週齢の突然変異マウスに、AAV.FXN−HAの単回静脈内注射を1×1013vg/kgの用量で投与した(治療Mck突然変異群)。注射の14日後(5週齢時)に、治療Mck突然変異雄において、心エコーの測定により、心臓の血行動態(心拍出量)の改善、およびほぼ正常な形態学的発育(収縮性、LV筋重量)が示された。対照的に、未治療Mck突然変異マウスにおいては、心臓の機能低下が依然として観察された。驚くべきことに、雌の場合には、治療マウスであれ、未治療マウスであれ、全てのMck突然変異マウスにおいて、心臓の収縮性の欠陥が観察された。
rAAV治療の28日後(7週齢時)に、治療Mck突然変異雄および治療Mck突然変異雌は、完全に正常化し、それらのマウス間でも未治療Mck陽性対照マウスとも区別できなくなった。治療Mck突然変異マウスにおいて、このこと、すなわち、心臓疾患の完全な矯正(雄)および予防(雌)が示された。対照的に、未治療Mck突然変異マウスにおいては、左心室内径短縮率および心拍出量の著しい減少ならびに左心室肥大を伴って、心臓の機能低下が迅速に進行した。
心エコーの結果
この研究では、検出可能な赤血球凝集素タグ(HA)を任意選択でさらに含むrAAV−FXNベクター(これを、本明細書ではrAAV−FXN−HAと呼ぶ)の効能を、1×1013vg/kgの用量で評価した。この用量は、同じMckマウス心臓特異的フリードライヒ運動失調症マウスモデルにおいて、野生型FXNをコードするrrhAAV10ベクターを使用して以前に記載した用量よりもおよそ5倍少なかった(Perdominiら、2014、Nature Medicine 20(5):542)。
フリードライヒ運動失調症マウスモデルにおけるrAAV−FXNのin vivoでの投与の組織学的研究
研究デザイン
C57BL6/Nの雄および雌のマウス、8週齢、24匹を評価して、組織病理学的分析を行った。
屠殺時に、全ての動物から、体重、身長、ならびに心臓、脾臓、腎臓、副腎および肝臓の重量を記録した。1群当たり4匹の動物から、副腎、小脳、頚椎、胸椎および腰椎、性腺(精巣および卵巣)、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、雄の前立腺、骨格筋(腓腹筋およびヒラメ筋)、脾臓、ならびに胸腺を、病理学的評価およびELISAアッセイのために収集した。
小脳(歯状核を含む)、性腺、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋(腓腹筋およびヒラメ筋)、脾臓、ならびに頚椎、胸椎および腰椎を、ホルマリン固定した。次いで、椎骨を、EDTA溶液を使用して脱灰した。全ての臓器をパラフィン包埋して、5μmの厚さの切片を得、椎骨(脊髄および後根神経節の両方を含む)ならびに心臓については、横切片を得た。全ての臓器を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。心臓の線維症を、マッソントリクローム染色を使用して評価した。
収集の直後に、心臓の半分、肝臓の右葉、ならびにヒラメ筋および腓腹筋を急速凍結した。
肉眼所見
Mck陽性対照雄マウスは、未治療Mck突然変異マウスおよび治療Mck突然変異マウスと比較して有意により長かった(9.39cm対8.89cm[+5.62%]、P=0.011[t検定])。その他の顕著な、眼に見える病変は観察されず、とりわけ、雄および雌の両方の心臓重量においては、眼に見える病変も顕著な変化も観察されなかった。
心臓
Mck−Cre×FXN L3/WT:最低限の間質線維症が、1匹のMck陽性対照動物(58番)において観察された。その他の3匹の陽性対照マウスの心臓は全て、正常であった。
3つの群全てにおいて、複数の髄質尿細菅の管腔中に、顕著な石灰化が頻繁に観察された。石灰化の頻度は、Mck陽性対照動物については、4/4であり、未治療Mck突然変異動物については、3/4であり、rAAV−FXN治療Mck突然変異動物については、2/4であった。石灰化の重症度は、rAAV−FXN治療Mck突然変異群においては、Mck陽性対照群および未治療Mck突然変異群と比較して減少しているように見えた。尿細管の好塩基球増加(再生)が、Mck陽性対照マウスの4匹中2匹の動物において、未治療Mck突然変異群の4匹中3匹の動物において、およびrAAV−FXN治療Mck突然変異群の1匹の動物において観察された。
肝臓:1匹のMck陽性対照動物(38番)において、最低限の門脈周囲の炎症が観察された。
肺:1匹の未治療Mck突然変異動物(41番)において、若干の気管支周囲の炎症が観察された。
組織学的検査については、未治療Mck突然変異マウスの心筋細胞中で観察されたフクロウの目の核、腫大および空砲形成は全て、心臓の変性についての目印である。マクロファージの炎症に関連する間質線維症は、心筋細胞の細胞死に対応し得る。したがって、未治療Mck突然変異マウスの心筋細胞が変性し、このことは、細胞が機能の低下を経験し、病態が進化し、細胞死、およびそれに続く、心不全が生じることを意味する。
要するに、本明細書に提示したデータは、改変されたFXN遺伝子をコードするrAAVの投与は、全身投与でさえ、フラタキシンの減少または不在と関連がある作用の治療(予防および/または逆転)を行うことができることを示している。したがって、rAAVが媒介するフラタキシンの、それを必要とする細胞および対象における発現は、フラタキシンの欠如もしくは欠損と関連があるか、またはフラタキシンの欠如もしくは欠損により媒介される疾患または障害、例として、これに限定されないが、フリードライヒ運動失調症の治療を行う有用な治療手段となり得ることを、データは裏付けている。
Claims (37)
- 配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むフラタキシン(FXN)をコードする改変された核酸であって、これ以外には同一の細胞中で配列番号2の野生型FXNの核酸配列の発現レベルと比較してより高いレベルで発現され、改変された核酸が配列番号5〜7に記載の配列からなる群から選択される核酸配列を含み、かつ当該改変された核酸が、
(a)少なくとも0.76、少なくとも0.86、少なくとも0.95、または少なくとも0.98のコドン適応指標(CAI)、
(b)少なくとも55%、少なくとも57%、少なくとも61%、または少なくとも69%であるGC含有量、
(c)124以下であるCpGジヌクレオチドの数、
からなる群から選択される少なくとも1つの特徴を含む、
改変された核酸。 - FXNをコードする改変された核酸であって、これ以外には同一の細胞中で配列番号2の野生型FXNの核酸配列の発現レベルと比較してより高いレベルで発現され、改変された核酸が配列番号7に記載の核酸配列を含み、かつ、当該改変された核酸が少なくとも55%のGC含有量であり、CpGジヌクレオチドの数が117以下であり、CAIが少なくとも0.86である、改変された核酸。
- 配列番号5または7の核酸配列を含む、請求項1に記載の改変された核酸。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の改変された核酸を含むベクター。
- ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターである、請求項4に記載のベクター。
- 改変された核酸が、自己相補的である、請求項5に記載のベクター。
- rAAVベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVrh74、RHM4−1、RHM15−1、RHM15−2、RHM15−3/RHM15−5、RHM15−4、RHM15−6、AAV Hu.26、AAV1.1、AAV2.5、AAV6.1、AAV6.3.1、AAV9.45、AAV2i8、AAV2G9、AAV2i8G9、AAV2−TT、AAV2−TT−S312N、AAV3B−S312NおよびAAV−LK03のキャプシドからなる群から選択されるキャプシドをさらに含む、請求項6に記載のベクター。
- キャプシドが、AAV2i8、AAV9、AAV−LK03およびAAV2−TT−S312Nのキャプシドからなる群から選択される、請求項7に記載のベクター。
- 改変された核酸が、少なくとも1つの組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)の末端反復配列、エンハンサー、プロモーター、コラーゲン安定化配列(CSS)、終止コドン、およびポリ−アデニル化(ポリA)シグナル配列からなる群から選択される少なくとも1つのエレメントをさらに含む、請求項7または8に記載のベクター。
- ベクターが、2つのAAVの末端反復配列、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリベータアクチン(CBh)プロモーターをコードする配列、およびウシ成長ホルモンのポリ−アデニル化シグナル配列(bGHポリA)を含む、請求項9に記載のベクター。
- 5’から3’に、
(a)AAV2の末端反復、
(b)配列番号26の核酸配列を含むCBhプロモーター、
(c)配列番号5〜7に記載の配列からなる群から選択される核酸配列を含むFXNをコードする請求項2に記載の改変された核酸、
(d)配列番号27の配列を含むbGHポリAシグナル配列、および
(e)AAV2の末端反復
を含む核酸を含む、請求項9に記載のベクター。 - キャプシドが、AAV2i8、AAV9、AAV−LK03およびAAV2−TT−S312Nのキャプシドからなる群から選択される、請求項11に記載のベクター。
- VP1が配列番号29のアミノ酸配列を含むAAV2−TT−S312Nのキャプシドをさらに含み、5’から3’に、
(a)AAV2の末端反復、
(b)配列番号26の核酸配列を含むCBhプロモーター、
(c)配列番号5、6または7の配列を含む、FXNをコードする改変された核酸、
(d)配列番号27の配列を含むbGHポリAシグナル配列、および
(e)AAV2の末端反復
を含む、請求項12に記載のベクター。 - VP1が配列番号33のアミノ酸配列を含むAAV2−TT−S312Nのキャプシドをさらに含み、5’から3’に、
(a)AAV2の末端反復、
(b)配列番号26の核酸配列を含むCBhプロモーター、
(c)配列番号5、6または7の配列を含む、FXNをコードする改変された核酸、
(d)配列番号27の配列を含むbGHポリAシグナル配列、および
(e)AAV2の末端反復
を含む、請求項12に記載のベクター。 - ベクターがAAV9のキャプシドを含み、5’から3’に、
(a)AAV2の末端反復、
(b)配列番号26の核酸配列を含むCBhプロモーター、
(c)配列番号5、6または7の配列を含む、FXNをコードする改変された核酸、
(d)配列番号27の配列を含むbGHポリAシグナル配列、および
(e)AAV2の末端反復
を含む、請求項12に記載のベクター。 - ベクターがAAV−LK03のキャプシドを含み、5’から3’に、
(a)AAV2の末端反復、
(b)配列番号26の核酸配列を含むCBhプロモーター、
(c)配列番号5、6または7の配列を含む、FXNをコードする改変された核酸、
(d)配列番号27の配列を含むbGHポリAシグナル配列、および
(e)AAV2の末端反復
を含む、請求項12に記載のベクター。 - FXNをコードする配列の直後に配列番号25の核酸配列を含むCSSを含む、請求項11〜16のいずれか一項に記載のベクター。
- AAV9のキャプシドを含み、核酸配列の5’から3’に、
(a)AAV2の末端反復、
(b)配列番号26の核酸配列を含むCBhプロモーター、
(c)配列番号7の配列を含む、FXNをコードする改変された核酸、
(d)配列番号25の核酸配列を含むCSS、
(e)配列番号27の配列を含むbGHポリAシグナル配列、および
(f)AAV2の末端反復
を含み、ベクターがrAAVベクターである、ベクター。 - フリードライヒ運動失調症(FRDA)の治療を、それを必要とする患者において行うために使用する請求項11〜18のいずれか一項に記載のベクター。
- フリードライヒ運動失調症(FRDA)の治療を、それを必要とする患者において行うためのrAAVベクターであって、FXNをコードする請求項2に記載の改変された核酸を含む、rAAVベクター。
- 請求項4〜18のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項20に記載のrAAVベクターを含む医薬組成物。
- 請求項4〜18のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項20に記載のrAAVベクターを含む、FRDA治療剤。
- 前記rAAVベクターが、全身に、心臓への直接的な投与により、または頭蓋内への投与により投与される、請求項22に記載の治療剤。
- rAAVベクターが頭蓋内に投与される、請求項23に記載の治療剤。
- rAAVベクターが心臓内に直接投与される、請求項23に記載の治療剤。
- 全身投与が静脈内投与である、請求項23に記載の治療剤。
- 請求項4〜18のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項20に記載のrAAVベクターを含む、FXNのレベルの減少により媒介される疾患、障害または状態の治療剤。
- FXNをコードする請求項1〜3のいずれか一項に記載の改変された核酸を含む宿主細胞であって、請求項4〜18のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項20に記載のrAAVベクターを含む、宿主細胞。
- VERO、WI38、MRC5、A549、HEK293細胞、B−50またはB−50以外のHeLa細胞、HepG2、Saos−2、HuH7およびHT1080からなる群から選択される、請求項28に記載の宿主細胞。
- 懸濁培養物中で増殖するように適合させたHEK293細胞である、請求項29に記載の宿主細胞。
- ATCC番号PTA13274を有するHEK293細胞である、請求項29に記載の宿主細胞。
- 複製(Rep)タンパク質、キャプシド(Cap)タンパク質、アデノウイルス初期領域1a(E1a)タンパク質、E1bタンパク質、E2aタンパク質、E4タンパク質からなる群から選択される少なくとも1つのタンパク質、およびウイルス関連(VA) RNAをコードする少なくとも1つの核酸を含む、請求項31に記載の宿主細胞。
- 細胞中のFXNのレベルの増加に使用するための、FXNをコードする請求項1〜3のいずれか一項に記載の改変された核酸。
- 細胞中のFXNのレベルの増加に使用するための、FXNをコードする請求項2に記載の改変された核酸。
- 対象におけるFRDAの治療に使用するための、請求項20に記載のrAAVベクター。
- 対象におけるFRDAの治療薬を製造するための、請求項4〜18のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項20に記載のrAAVベクターの使用。
- 対象におけるFRDAの治療薬を製造するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載のFXNをコードする改変された核酸の使用。
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